專利名稱：從發(fā)酵清液直接捕獲蛋白質(zhì)的疏水電荷誘導(dǎo)色譜介質(zhì)及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從發(fā)酵清液中直接捕獲蛋白質(zhì)的疏水電荷誘導(dǎo)色譜介質(zhì)及其制備方法，屬于生化工程領(lǐng)域中的蛋白質(zhì)色譜分離技術(shù)。
背景技術(shù)：
生物技術(shù)的發(fā)展使許多具有重要療效蛋白質(zhì)可以借助于基因工程方法在大腸桿菌等宿主細(xì)胞中大量生產(chǎn)以服務(wù)于人類健康的需求。這些以可溶或包含體形式存在于細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)物往往與宿主細(xì)胞的蛋白共存，同時通過高密度發(fā)酵而實(shí)現(xiàn)的蛋白質(zhì)規(guī)?；a(chǎn)也使原料液中目標(biāo)蛋白處于一種較高的離子強(qiáng)度下(一般為0.1-0.4mol/L)。在這種離子強(qiáng)度下，生物分離中通常使用的離子交換色譜或疏水性相互作用色譜的優(yōu)勢均無法得以發(fā)揮，由此產(chǎn)物的捕獲趨于復(fù)雜化。
在色譜操作中，介質(zhì)對蛋白質(zhì)等目標(biāo)產(chǎn)物的捕獲通常需要在一定的離子強(qiáng)度下才能獲得較高的吸附量，如離子交換色譜一般在低離子強(qiáng)度(＜0.10mol/L)下具有較高的吸附能力；而疏水性相互作用色譜則需在較高的離子強(qiáng)度(＞0.8mol/L)的條件下進(jìn)行。因此，產(chǎn)物捕獲前離子強(qiáng)度的調(diào)節(jié)(脫鹽、稀釋或者加鹽)是必不可少的步驟，從而導(dǎo)致操作步驟和時間的增加，生產(chǎn)能力的降低；另外，無機(jī)鹽濃度的改變，特別是無機(jī)鹽的加入有可能破壞目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定、引起蛋白質(zhì)沉淀、干擾后續(xù)的分離操作。提高產(chǎn)物的捕獲效率成為了生物大分子色譜技術(shù)中一個有待解決的關(guān)鍵問題。Porath等人提出了以巰基乙醇為配基的親硫色譜方法(Porath et al.FEBS Letters，1985，185306)，但該方法同樣需在較高的離子強(qiáng)度下進(jìn)行。Biosepra公司1998年公布了以含巰基的雜環(huán)化合物為配基的色譜方法(US Patent5,719,269)。雖然該介質(zhì)在較寬的離子強(qiáng)度范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對抗體的捕獲，但這種捕獲是通過巰基參與的特異性吸附實(shí)現(xiàn)的，因此缺乏普適性。
1998年，Burton和Harding提出了疏水電荷誘導(dǎo)色譜(HCIC)的方法，由配基與蛋白之間疏水作用捕獲的產(chǎn)物在靜電排斥作用下得以洗脫，其中靜電排斥作用通過對溶液PH的調(diào)節(jié)而獲得(Burton SC and Harding DRK.J Chromatogr A，1998，81471)。在此基礎(chǔ)上，Burton等人公布了混合模式色譜分離方法，采用羰基二咪唑活化方法將含吡啶和咪唑基團(tuán)的配基偶聯(lián)于纖維素介質(zhì)表面(US Patent 5,945,520A1)。該介質(zhì)的吸附容量與離子強(qiáng)度無關(guān)。但羰基二咪唑活化方法自身存在著一些缺點(diǎn)(蔣中華，張津輝著.《生物分子固定化技術(shù)及應(yīng)用》)，由此限制了其廣泛地應(yīng)用。近來，GE Healthcare公司推出了一種以苯甲酰胺為配基的Direct CST-1膨脹床色譜介質(zhì)，該介質(zhì)在電導(dǎo)率超過30mS/cm的高鹽環(huán)境下操作。但據(jù)報道，吸附于介質(zhì)上產(chǎn)物的洗脫條件異?？量蹋?.2mol/L氫氧化鈉濃度下也僅有60％的蛋白質(zhì)被洗脫。目前疏水電荷誘導(dǎo)色譜雖然取得了很大的發(fā)展，初步實(shí)現(xiàn)了無論離子強(qiáng)度高低的條件下均有較好的產(chǎn)物吸附容量，但產(chǎn)物的洗脫回收仍然需要在較強(qiáng)的酸性或堿性條件下進(jìn)行，苛刻的洗脫條件往往造成的產(chǎn)物的失活。另一方面，配基中某些強(qiáng)疏水性基團(tuán)也使得蛋白質(zhì)洗脫變得更加困難。因此，在色譜過程中，具有適當(dāng)疏水性的配基的引入對于開發(fā)商業(yè)化色譜分離技術(shù)具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于開發(fā)一種可從發(fā)酵清液中直接捕獲蛋白質(zhì)的疏水電荷誘導(dǎo)色譜介質(zhì)及其制備方法。所述的色譜介質(zhì)不僅有較高的吸附容量，而且適用在生理的環(huán)境進(jìn)行洗脫。所述的制備方法過程簡單。
本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)的。一種從發(fā)酵清液中直接捕獲蛋白質(zhì)的疏水電荷誘導(dǎo)色譜介質(zhì)，其特征在于環(huán)氧基間隔臂末端偶聯(lián)吲哚化合物X， 吲哚化合物X結(jié)構(gòu)式如下， 其中R1-R6中的一個基團(tuán)必為氨基或甲基氨，其余的基團(tuán)為氫原子，剩余的基團(tuán)為含有1～4個碳原子的短鏈烷烴。
上述的色譜介質(zhì)制備方法包括介質(zhì)的活化、配基的偶聯(lián)和介質(zhì)的還原過程。其特征在于，將平均粒徑介于30-300μm的瓊脂糖凝膠介質(zhì)經(jīng)體積比為20％、50％和70％二甲基亞砜的水溶液依次清洗并抽干后，倒入二甲基亞砜溶液中，二甲基亞砜的體積為凝膠介質(zhì)體積的0.5-10倍；繼而向該懸浮液中加入凝膠體積0.2-6倍的環(huán)氧氯丙烷并混合均勻；向混合后的反應(yīng)體系中加入濃度為0.1-2.0mol/L氫氧化鈉溶液，溶液體積為混合液體積的0.1-5倍；上述溶液置于溫度為15-60℃的水浴中反應(yīng)0.3-10小時；反應(yīng)后的瓊脂糖凝膠介質(zhì)用去離子水沖洗至無游離的環(huán)氧基團(tuán)后，抽干水分的介質(zhì)懸浮于含有吲哚化合物的二甲基亞砜溶液中，吲哚類化合物的濃度為0.02-10mmol/g濕介質(zhì)，二甲基亞砜體積為凝膠介質(zhì)的0.5-10倍；溶液混合并置于水浴中在25-70℃下保溫；用NaO小時溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至8.0-13.0后，通過2-20小時的偶聯(lián)反應(yīng)將吲哚類化合物鍵合到凝膠介質(zhì)表面；所得介質(zhì)經(jīng)去離子水清洗后懸浮于0.2-1.0g/L硼氫化鈉中于室溫下反應(yīng)12小時還原介質(zhì)表面殘留的環(huán)氧基團(tuán)，從而得到最終產(chǎn)物。
上述的吲哚化合物包括5-氨基吲哚、4-氨基吲哚、6-氨基吲哚、吲哚-5-甲基氨、5-氨基-2-甲基吲哚和5-氨基-4-甲基吲哚。
上述優(yōu)化條件為二甲基亞砜的體積為凝膠介質(zhì)體積的1-5倍；環(huán)氧氯丙烷的體積為凝膠介質(zhì)體積的0.4-4倍，氫氧化鈉濃度為0.4-1.4mol/L，體積為混合液體積的0.4-2倍；活化反應(yīng)溫度為30-50℃，反應(yīng)時間為1-4小時；配基偶聯(lián)過程中，吲哚類化合物的濃度為0.2-5mmol/g濕介質(zhì)，偶聯(lián)反應(yīng)在pH值10-12、溫度為35-60℃下進(jìn)行，反應(yīng)時間為4-10小時；所得介質(zhì)在0.3-0.8g/L硼氫化鈉中反應(yīng)還原介質(zhì)表面殘留的環(huán)氧基團(tuán)。
本發(fā)明提供了一種直接捕獲發(fā)酵清液中蛋白質(zhì)色譜介質(zhì)材料，該色譜介質(zhì)具有如下顯著特點(diǎn)色譜介質(zhì)偶聯(lián)的配基屬非鹽依賴性配基，從而保證了介質(zhì)可以在高鹽或低鹽濃度下直接用于料液中蛋白質(zhì)的捕獲而不需預(yù)處理；相對于常規(guī)的疏水相互作用以及離子交換色譜介質(zhì)具有更溫和的洗脫條件，為蛋白保持活性提高了良好的環(huán)境，避免了蛋白的凝聚、變性；偶聯(lián)高密度配基的介質(zhì)可以對稀料液進(jìn)行直接處理，在提高分離效率的同時降低了生產(chǎn)成本；介質(zhì)清洗、除菌簡便，易再生，在蛋白等生物大分子分離純化中將有廣闊的應(yīng)用前景。
下面對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)有七點(diǎn)首先是配基功能基團(tuán)的選擇，疏水性介于吡啶和苯基間的吲哚基團(tuán)作為疏水電荷誘導(dǎo)色譜的配基，同時吲哚基團(tuán)的弱電離特性也提高了蛋白質(zhì)的選擇性；其次是在介質(zhì)活化反應(yīng)中引入親水性有機(jī)溶劑二甲基亞砜，促進(jìn)了環(huán)氧氯丙烷在反應(yīng)體系中溶解和均相反應(yīng)體系的形成；再者，活化反快速的進(jìn)入瓊脂糖介質(zhì)內(nèi)部，而隨后催化劑氫氧化鈉的加入則能夠有力的提高環(huán)程而導(dǎo)致環(huán)氧基團(tuán)的水解；關(guān)鍵之五在于配基偶聯(lián)過程中溫度的選擇及反應(yīng)時間的確定，從而提高環(huán)氧基團(tuán)的活性；關(guān)鍵之六是配基偶聯(lián)步驟中反應(yīng)體積的控制，從而得到高配基修飾密度的介質(zhì)；最后是采用適當(dāng)?shù)倪€原步驟處理殘留的環(huán)氧基團(tuán)，避免其對后續(xù)其它操作的影響。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)例將對本發(fā)明提供的方法予以進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例1在50ml三角瓶中稱取1.0g經(jīng)沙濾漏斗沖洗抽干、平均粒徑為87μm的瓊脂糖凝膠介質(zhì)SePHarose CL-6B，依次用含20％、50％和70％二甲基亞砜的水溶液清洗，每次清洗后均抽干清洗液；然后按順序加入2ml的二甲基亞砜和0.5ml環(huán)氧氯丙烷，混合均勻后，再加入1.5ml 0.8mol/L的氫氧化鈉溶液；凝膠介質(zhì)懸浮液置于空氣浴搖床中在40℃和170rpm下反應(yīng)2.5小時，即可得到環(huán)氧基活化的SePHarose CL-6B瓊脂糖凝膠介質(zhì)?；罨橘|(zhì)在砂漏中經(jīng)反復(fù)沖洗除去游離的環(huán)氧氯丙烷后，測定凝膠介質(zhì)的環(huán)氧基修飾密度為115.2μmol/ml濕介質(zhì)。
稱取1.0g活化介質(zhì)置于2.5ml二甲基亞砜中，溶液中含0.6mmol 5-氨基吲哚；用0.5mol/L氫氧化鈉將溶液pH值調(diào)節(jié)到13，置于49℃恒溫空氣浴中反應(yīng)20小時；得到的介質(zhì)依次用0.1mol/L氫氧化鈉、20％(v/v)乙醇和蒸餾水徹底沖洗干凈后，加入0.5g/L硼氫化鈉溶液在室溫下還原凝膠介質(zhì)表面的環(huán)氧基團(tuán)，即可得到產(chǎn)物，介質(zhì)產(chǎn)物中5-氨基吲哚的偶聯(lián)密度為85μmol/ml。
實(shí)施例2實(shí)施例1中環(huán)氧氯丙烷的體積為1.5ml，1.6mol/L氫氧化鈉的體積為4.5ml，其它條件不變，所得到活化介質(zhì)中環(huán)氧基修飾密度為142.7μmol/ml濕介質(zhì)。偶聯(lián)反應(yīng)加入5-氨基吲哚的濃度為2.0mmol，介質(zhì)產(chǎn)物中5-氨基吲哚的偶聯(lián)密度為102μmol/ml。
實(shí)施例3在50ml三角瓶中稱取1.0g經(jīng)沙濾漏斗沖洗抽干、平均粒徑為87μm的瓊脂糖凝膠介質(zhì)SePHarose CL-6B，依次用含30％和65％二甲基亞砜的水溶液清洗，每次清洗后均抽干清洗液；然后按順序加入3ml的二甲基亞砜和2ml環(huán)氧氯丙烷，混合均勻后，再加入4.0ml 1.5mol/L的氫氧化鈉溶液；凝膠介質(zhì)懸浮液置于空氣浴搖床中在45℃和170rpm下反應(yīng)4小時，即可得到環(huán)氧基活化的SePHarose CL-6B瓊脂糖凝膠介質(zhì)?；罨橘|(zhì)在砂漏中經(jīng)反復(fù)沖洗除去游離的環(huán)氧氯丙烷后，測定凝膠介質(zhì)的環(huán)氧基修飾密度為132.2μmol/ml濕介質(zhì)。
稱取1.0g活化介質(zhì)置于2.5ml二甲基亞砜中，溶液中含1.0mmol 4-甲基-5-氨基吲哚；用0.5mol/L氫氧化鈉將溶液pH值調(diào)節(jié)到12，置于55℃恒溫空氣浴中反應(yīng)10小時；得到的介質(zhì)依次用0.1mol/L氫氧化鈉、20％(v/v)乙醇和蒸餾水徹底沖洗干凈后，加入1.0g/L硼氫化鈉溶液在室溫下還原凝膠介質(zhì)表面的環(huán)氧基團(tuán)，即可得到產(chǎn)物，介質(zhì)產(chǎn)物中4-甲基-5-氨基吲哚的偶聯(lián)密度為93μmol/ml。
實(shí)施例4實(shí)施例1所制備的介質(zhì)在含有不同濃度氯化鈉(20、50、100、200、500和700mmol/L)的0.01mol/L Tris-小時Cl緩沖液(pH 7.10)中平衡后，經(jīng)沙濾漏斗抽干去除多余的溶液；分別稱取上述抽干介質(zhì)0.1g加入到10ml含有不同溶菌酶濃度(0.0-2.0mg/ml)的平衡緩沖液中；上述懸浮液在25℃恒溫空氣浴中反應(yīng)過夜后，離心后收集的上清液在280nm下測定吸光值，確定介質(zhì)的吸附量；在0.02-0.7mol/L氯化鈉濃度下，介質(zhì)的靜態(tài)飽和吸附量介于40-48mg/ml濕介質(zhì)。
實(shí)施例5實(shí)施例1所制備的介質(zhì)在電導(dǎo)率為20mS/cm的0.05mol/L醋酸鹽緩沖液pH 3.0-9.0)中平衡后，經(jīng)沙濾漏斗抽干去除多余的溶液；分別稱取上述抽干介質(zhì)0.1g加入到10ml含有不同溶菌酶濃度(0.0-2.0mg/ml)的平衡緩沖液中；上述懸浮液在25℃恒溫空氣浴中反應(yīng)過夜后，離心后收集的上清液在280nm下測定吸光值，確定介質(zhì)的吸附量；在PH 3.0、4.0、5.0、7.0和9.0條件下，介質(zhì)的靜態(tài)飽和吸附量分別為8.0、9.0、36、45和49mg/ml濕介質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種從發(fā)酵清液中直接捕獲蛋白質(zhì)的疏水電荷誘導(dǎo)色譜介質(zhì)，其特征在于，該介質(zhì)為環(huán)氧基間隔臂末端偶聯(lián)吲哚化合物X， 吲哚化合物X結(jié)構(gòu)式如下， 其中R1-R6中的一個基團(tuán)必為氨基或甲基氨，其余的基團(tuán)為氫原子，剩余的基團(tuán)為含有1～4個碳原子的短鏈烷烴。
2.按權(quán)利要求1所述的從發(fā)酵清液中直接捕獲蛋白質(zhì)的疏水電荷誘導(dǎo)色譜介質(zhì)，其特征在于，吲哚化合物包括5-氨基吲哚、4-氨基吲哚、6-氨基吲哚、吲哚-5-甲基氨、5-氨基-2-甲基吲哚和5-氨基-4-甲基吲哚。
3.一種按權(quán)利要求1所述的從發(fā)酵清液中直接捕獲蛋白質(zhì)的疏水電荷誘導(dǎo)色譜介質(zhì)制備方法，其特征在于包括以下過程，將平均粒徑介于30-300μm的瓊脂糖凝膠介質(zhì)經(jīng)體積比為20％、50％和70％二甲基亞砜的水溶液依次清洗并抽干后，倒入二甲基亞砜溶液中，二甲基亞砜的體積為凝膠介質(zhì)體積的0.5-10倍；繼而向該懸浮液中加入凝膠體積0.2-6倍的環(huán)氧氯丙烷并混合均勻；向混合后的反應(yīng)體系中加入濃度為0.1-2.0mol/L氫氧化鈉溶液，溶液體積為混合液體積的0.1-5倍；上述溶液置于溫度為15-60℃的水浴中反應(yīng)0.3-10小時；反應(yīng)后的瓊脂糖凝膠介質(zhì)用去離子水沖洗至無游離的環(huán)氧基團(tuán)后，抽干水分的介質(zhì)懸浮于含有吲哚化合物的二甲基亞砜溶液中，吲哚類化合物的濃度為0.02-10mmol/g濕介質(zhì)，二甲基亞砜體積為凝膠介質(zhì)的0.5-10倍；溶液混合并置于水浴中在25-70℃下保溫；用NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至8.0-13.0后，通過2-20小時的偶聯(lián)反應(yīng)將吲哚類化合物鍵合到凝膠介質(zhì)表面；所得介質(zhì)經(jīng)去離子水清洗后懸浮于0.2-1.0g/L硼氫化鈉中于室溫下反應(yīng)12小時還原介質(zhì)表面殘留的環(huán)氧基團(tuán)，從而得到最終產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從發(fā)酵清液中直接捕獲蛋白質(zhì)的疏水電荷誘導(dǎo)色譜介質(zhì)的制備方法，其特征在于二甲基亞砜的體積為凝膠介質(zhì)體積的1-5倍；環(huán)氧氯丙烷的體積為凝膠介質(zhì)體積的0.4-4倍，氫氧化鈉濃度為0.4-1.4mol/L，體積為混合液體積的0.4-2倍；活化反應(yīng)溫度為30-50℃，反應(yīng)時間為1-4小時；配基偶聯(lián)過程中，吲哚類化合物的濃度為0.2-5mmol/g濕介質(zhì)，偶聯(lián)反應(yīng)在pH值10-12、溫度為35-60℃下進(jìn)行，反應(yīng)時間為4-10小時；所得介質(zhì)在0.3-0.8g/L硼氫化鈉中反應(yīng)還原介質(zhì)表面殘留的環(huán)氧基團(tuán)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可從發(fā)酵清液中直接捕獲蛋白質(zhì)的疏水電荷誘導(dǎo)色譜介質(zhì)的制備方法，屬于生化工程領(lǐng)域中的蛋白質(zhì)色譜分離技術(shù)。該色譜介質(zhì)為間隔臂末端偶聯(lián)吲哚化合物作為色譜配基。其制備方法為將瓊脂糖凝膠介質(zhì)中依次加入二甲基亞砜、環(huán)氧氯丙烷和氫氧化鈉溶液后活化介質(zhì)；活化后的介質(zhì)在堿性的二甲基亞砜溶液中與吲哚化合物配基偶聯(lián)；最后介質(zhì)表面殘余的環(huán)氧基經(jīng)還原后得到所需的色譜介質(zhì)。該色譜介質(zhì)偶聯(lián)的配基屬非鹽依賴性配基，可直接用于料液中蛋白質(zhì)的捕獲而不需預(yù)處理，同時介質(zhì)具有更溫和的洗脫條件；介質(zhì)在提高分離效率的同時降低了生產(chǎn)成本；介質(zhì)清洗、除菌簡便，易再生，在蛋白等生物大分子分離純化中將有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C07K1/22GK101036877SQ20071005659
公開日2007年9月19日 申請日期2007年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月25日
發(fā)明者孫彥, 彭冠英, 史清洪, 董曉燕, 白姝 申請人:天津大學(xué)