專利名稱：：提取蜈蚣酸性蛋白的方法及其用該方法提取的蜈蚣酸性蛋白在制備治療心臟病藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種從動物中提取酸性蛋白的方法和所提取的酸性蛋白的應用，具體地說是提取蜈蚣酸性蛋白的方法和用該方法提取的蜈松酸性蛋白在制備治療心臟病藥物中的應用
背景技術：
蜈蚣為節(jié)肢動物門唇足綱整形目蜈蚣科動物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。中國傳統(tǒng)醫(yī)藥學認為，蜈蚣其性味辛，溫，有毒；具有熄風止痙，解毒散結，通絡止痛的功效。在傳統(tǒng)醫(yī)學應用中，蜈蚣常常用于治療小兒驚風、破傷風、風癬、瘡瘍、腫毒、燙傷等疾病。近年來對蜈蚣的研究頗多，其藥理活性主要表現(xiàn)為抗衰老作用；抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌作用；改善心肌缺血、微循環(huán)，降低血壓；增強消化功能；抗驚厥；抗腫瘤；(韓雙紅.蜈蚣的研究進展.天津藥學.2002.14(5)13)。目前尚未發(fā)現(xiàn)蜈蚣用于預防心力衰竭以及抑制心肌纖維化、抑制心肌肥厚的文獻報道。而心肌纖維化是冠心病、心肌梗死、高血壓、心肌病等多種常見心臟疾病向終末期心臟病發(fā)展的一個必然過程，如何阻止和逆轉心肌纖維化越來越受到人們關注。另外，在實際臨床應用中，蜈蚣極少被單獨使用，究其原因可能與蜈蚣的應用方法有關。目前，在臨床應用中，蜈蚣通常是采用干燥全蟲入藥，也有采用干燥全蟲經(jīng)水煎提取或醇提取后入藥的。事實上無論是采用蜈蚣的干燥全蟲還是蜈蚣的水提液或醇提液，其所應用的實際是蜈蚣所有化學成分的混合物?，F(xiàn)代藥學研究表明，蜈蚣的水煎提取物和醇提取物中含有多種氨基酸、小分子肽、淄醇等。蜈蚣體內油脂物中含有大量的脂肪酸。采用電泳和薄層法還可分離出磷脂、膽淄醇、游離脂肪酸、三甘油酯、膽腦垸酯、沙烯、酯酶、生物堿、茶胺等多種成分。(多棘蜈蚣化學成分研究.中國藥學雜志.1997.32(4):202)。在蜈蚣眾多的化學成分中，如何篩選、分離、提取出最具藥理活性的有效成分已成為人們研究的熱點和重點。曾紅等人曾將蜈蚣脫脂處理后，經(jīng)sephadexG-25sephadexG-150兩次柱層析，分離出8種具有抗癌活性的組分，并經(jīng)藥理實驗表明其中的El、E6兩種組分抗癌活性最強。(沈陽藥科大學制藥工程學院.曾紅.蜈蚣中抗癌活性成分的提取.湖南中醫(yī)雜志.2004.20(5).57)。許鳴鏑等人將少棘巨蜈蚣經(jīng)95%乙醇脫脂后的水提液低溫旋轉濃縮,凍干，后經(jīng)過SephadexG-25柱，等電聚焦制備電泳，再經(jīng)SephadexG-150柱,SephadexG-lOO柱，最后經(jīng)HPLC制備得到一個命名為SSmp-d.純的堿性蛋白。其分子量為24.64kD，正F-HPCE顯示其等電點為9.27，氨基酸分析表明SSmp-d含較多的Arg、Lys等堿性氨基酸。藥理實驗表明IC50=20~30Lgml時,蜈蚣總堿性蛋白對人口腔上皮細胞鱗癌(KB細胞)和人結腸癌細胞(HCT細胞)有明顯的抑制作用，且活性穩(wěn)定。(許鳴鏑.柳雪枚.蜈蚣堿性蛋白SSmp-d的分離純化及其部分理化性質的鑒定.生物化學雜志.1997.13(5):586)。由此可見，不同的提取方法可以從蜈蚣中提取出具有不同藥理活性的有效成分。因此，許多研究人員都在對此進行積極的探索。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的就是提供一種分離提取蜈蚣酸性蛋白的方法以及該酸性蛋白在制備心臟病藥物中的應用。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明方法包括有以下步驟a、將蜈蚣細粉，加入無水乙醇脫脂，在冰水浴中超聲波振蕩1530分鐘，過濾，留取濾渣；b、取濾渣，加入磷酸鹽緩沖液，在冰水浴中超聲波振蕩1.52.5小時后，在一105"C滲漉提取1214小時，滲漉液在24。C下用離心機離心獲取上清液，上清液經(jīng)紙漿濾餅過濾，留取濾液；c、將濾液置于半透膜中，放在置有重蒸餾水的容器中，濃縮透析1014小時，每12小時更換一次水；濃縮液用磷酸溶液調節(jié)pH值至偏酸性后，于4(TC下真空濃縮；d、將濃縮液在06TM氏溫下緩慢加入無水乙醇至醇濃度達4050%，放置1014小時后，在04"C用離心機離心獲取半固體狀沉淀，該沉淀用中性磷酸鹽緩沖液溶解后，冷藏。本發(fā)明方法中優(yōu)選的工藝參數(shù)是a步驟中所說的超聲波振蕩時間為30分鐘；b步驟中所說的超聲波振蕩時間為2小時；c步驟中所說的磷酸溶液的濃度為lmol/L2mol/L，濃縮透析時間為12小時；d步驟中所說的至醇濃度為40W。本發(fā)明方法可有效分離、提取出蜈蚣中所含的酸性蛋白，且用該方法所分離、提取的蜈蚣酸性蛋白質雜質少、純度高。一般用該方法提取的蜈虼酸性蛋白生藥濃度可達0.4840.580g/ml，酸性蛋白含量可達15.817.8mg/ml。蜈蚣酸性蛋白的紫外光譜吸收峰的測定方法是精密吸取1%蛋白標準液lmL(取20%白蛋白溶液0.5ml，置10ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，為1%蛋白標準液)，加入雙縮脲試劑4mL(稱取硫酸銅0.6g，酒石酸鉀鈉1.8g，碘化鉀l.Og，氫氧化鈉4.8g，加入200ml水，搖勻即得)，搖勻放置10min;以重蒸水為空白，利用島津公司的UV-240進行，量程lcm，從500700nm進行掃描測定。蜈蚣酸性蛋白質的含量測定對照溶液的制備取lml1%蛋白標準液至試管，加入雙縮脲試劑4ml，搖勻，室溫放置10min,待測。樣品溶液的制備取lml蜈蚣蛋白提取液至試管，加入雙縮脲試劑4ml，搖勻，室溫放置10min，待測。以重蒸水為空白在560mn波長處測定上述2種溶液的吸收度，按下列公式計算。C娛訟蛋白-(A娛松蛋白一A空白)承G蛋白標準液/(A蛋白標準液-A空白)本發(fā)明方法提取的蜈蚣酸性蛋白，可用于制備治療各種心臟疾病的藥物，如制備用于治療動脈硬化、心肌性缺血等疾病的藥物。除此之外，本發(fā)明方法所提供的蜈蚣酸性蛋白在進一步的藥理實驗中還發(fā)現(xiàn)其在抗急性心力衰竭、抑制心肌纖維化、抑制心肌肥厚方面具有人們意想不到的效果。由此本發(fā)明完成了蜈蚣酸性蛋白在制備預防心衰的藥物、制備抑制心肌纖維化及抑制心肌肥厚藥物中的應用。本發(fā)明方法所提取的蜈蚣酸性蛋白所具有的良好藥理活性，通過以下試驗(實施例13)得到了驗證。具體實施例方式實施例1蜈蚣酸性蛋白對急性心力衰竭大鼠心功能的影響材料與方法1.1試驗動物純種清潔級SD大鼠60只，體重200-240g，雌雄兼用，購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心。1.2實驗用藥物蜈蚣酸性蛋白(centipedeacidicprotein,CAP)，采用少棘巨蜈蚣(購自石家莊市樂仁堂藥店，經(jīng)河北醫(yī)科大學中醫(yī)學院中藥系鑒定為正品)按照本發(fā)明方法提取制備，其生藥濃度0.484g/ml，酸性蛋白含量15.8mg/ml。蜈船水提取物(艮卩centipedeaqueousextract,CAE),采用少棘巨蜈蚣(購自石家莊市樂仁堂藥店，經(jīng)河北醫(yī)科大學屮醫(yī)學院中藥系鑒定為正品)實驗前將蜈蚣粉碎，加水煮沸30min濾出水提取液，殘渣再用水煮沸30min，合并兩煎水提取液,濃縮制成lg生藥/ml的蜈蚣水提物，4'C冰箱r:存?zhèn)溆?。注射用阿霉?浙江海正藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，10rng/ml，批號050803)1.3模型制備實驗動物常規(guī)觀察1周后隨機分為4組，每組各15只。分別為空白對照組、模型對照組、CAP組(1.0g/Kg)、CAE組(1.0g/kg)。各組大鼠稱重后，空白對照組及模型對照組每天腹腔注射生理鹽水lml/100g，CAP組、CAE組分別腹腔注射l.Og/kg,連續(xù)3天。后除空白組外其余各組于第4天一次性腹腔注射阿霉素10mg/kg，復制大鼠急性心衰模型，24h后模型形成。1.4檢測指標1.4.1血流動力學指標心率(服)、左室收縮壓峰值(LVSP)、左室舒張壓峰值(LVDP)、左室舒張末期壓(LVEDP)、心室內壓變化時間(t-dp/dt_)、左室內壓上升速率最大值(lv+dp/dt_)、左室內壓下降速率最大值(lv-dp/dtj。1.4.2心臟重量指數(shù)心室重量指數(shù)(左室重/體重)、心臟重量指數(shù)(心臟重/體重)。1..4.3病理學指標光鏡觀察心肌病理學變化。1.5檢測方法造模成功后取各組前9只進行血流動力學檢測，具體方法為25%烏拉坦4ml/kg腹腔麻醉，仰臥固定，分離右側頸總動脈做一倒T形切口，插入直徑0.2測已充滿肝素UU/ml)的心導管，心導管經(jīng)壓力換能器連接MS4000U-1C型生物信號記錄分析系統(tǒng)，緩慢推進密切觀察，當波型提示導智已進入左心室時停止推進；描記手術穩(wěn)定后10分鐘的圖形，并記錄之后約5分鐘的數(shù)據(jù)。然后迅速取出心臟，用濾紙吸干水分，稱心臟重，去右心室，稱左室重(包括室間隔)，計算心室重量指數(shù)、心臟重量指數(shù)。1.6統(tǒng)計處理實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準差(；±s)表示，使用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。2結果2.1CAP對急性心衰大鼠心臟質量措數(shù)的影響組間兩兩比較，各組大鼠體重、心室重量指數(shù)、心臟承:量指數(shù)均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳細結果見表1。表1各組大鼠心臟重量指數(shù)結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.2CAP對急性心衰大鼠血流動力學的影響模型對照組較空白對照組，HR加快，LVSP及l(fā)v+dp/dt_明顯降低；CAP組與模型對照組相比，LVSP明顯升高(P〈0.05),lv+dp/dU,,顯著加快(P<005);而同等劑量的CAE無明顯效果。詳細結果見表2。表2各組大鼠血流動力學指標結果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>與空白對照組比較-*P<0.05;與模型對照組比較#P<0.05現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，心力衰竭時心臟功能變化主要表現(xiàn)為心臟收縮功能下降，心室舒張功能及心室順應性改變，心泵功能降低與泵功能儲備下降，出現(xiàn)相應的血流動力學指標異常。"±(^/"_—定程度上反映室壁張力的變化速率，是評價心肌收縮性能的常用指標，對各種變力性干預十分敏感，但在一定程度上受心率及前后負荷的影響并與其呈」卜:相關。當心率及前、后負荷不變或降低時，lv+dp/dt^上升或不變則表示心肌收縮性能增強。前、后負荷升高時可結合t-clp/dt^判斷，lv+dp/dU,.上升同時伴t-dp/dt^縮短提示心肌收縮性能加強。Fl前汄為，根據(jù)lv+dp/dU,pt-dp/dt^指標來綜合判斷心肌收縮性能較為全面。lv-dp/dt,是心肌舒張參數(shù)，是作為評價心室舒張功能的指標之一。LVSP代表等容收縮期左心室內壓力的最高值，當心肌收縮力加強或前后負荷升高時LVSP上升。在變力因素作用下lv+dp/dt^與t-dp/dU,變化方向相反，而負荷狀態(tài)改變時變化方向相同。t-dp/dU"與外周阻力呈正相關，t-dp/dt^縮短除心肌收縮力加強和心率加快外還可因外周阻力降低引起。本實驗結果顯示，CAP組與模型組比較LVSP、lv+dp/dt^和lv-dp/dU,增高明顯(P〈0.05);說明CAP干預后阿霉素對心肌造成的損害明顯減輕，表明CAP可降低心臟后負荷，從而改善心功能，而同等劑量的CAE無明顯效果。2.3病理學結果本實驗病理學顯示心肌細胞病變明顯減輕。正常對照組心肌細跑形態(tài)正常，胞漿紋理清晰；模型對照組部分心肌細胞水腫明顯，可見脂肪變性、核固縮，間質無明顯增生，可見出血；而間質無明顯增生，加之心臟重量指數(shù)無明顯變化(P〉0.05)，說明阿霉素引起的急性心衰不存在心室重構。CAP組心肌細胞形態(tài)基本正常，排列整齊，胞核呈橢圓形深染，胞漿紋理清晰，無明顯變性壞死。表明CAP可以減輕阿霉素對心肌細胞的毒性作用，心肌細胞的變性壞死明顯改善，從而改善了心肌的收縮功能，而同等劑量的CAE無明顯效果。上述試驗表明，本發(fā)明所提供的蜈蚣酸性蛋白可明顯改善急性心衰大鼠心功能，減輕脂質過氧化損傷,對心肌具有保護作用。提示蜈蚣酸性蛋白可用于制備預防心力衰竭的藥物。實施例2蜈蚣酸性蛋白對心肌成纖維細胞增殖和膠原合成的影響(即蜈蚣酸性蛋白對血管緊張素-II(AngII)誘導培養(yǎng)心肌成纖維細胞(CFb)增殖和膠原合成的影響)。1、材料實驗用蜈蚣酸性蛋白(即CAP)、蜈蚣水提取物(即CAE),與實施例1相同。胎牛血清(民海生物公司)；胰蛋白酶(華美生物公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基、膠原酶、AngII、噻唑藍、二甲基亞楓、DEPC均為美國Sigma公司生產(chǎn)；羥脯氨酸試劑盒(南京建成生物公司)。SABC試劑盒(北京中山生物試劑公司)；大鼠抗波形蛋白單克隆抗體、纖維連接蛋白單克隆抗體(美國SantaCruz公司)Trizol試劑(Invitrogen公司)；RTReagents試劑、PCRReagents試劑、DNAMarker即標準DNA(TaKaRa公司)；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。2、方法2.1心肌成纖維細胞的培養(yǎng)與鑒定取l-3d齡的SD大鼠，無菌開胸，剪取心室，用預冷D-Hanks液清洗，剪碎，用0.25%胰酶反復消化(37'C恒溫搖床搖動10-15min)，分別收集每次消化上清液，加等量20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，離心，棄上清液，取沉淀加10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基制成細胞懸液，接種培養(yǎng)瓶中，置37°C、5%C02培養(yǎng)箱中，差速貼壁40min，去除心肌細胞，待心肌成纖維細胞生長接近融合時以1:3傳代，實驗采用3-5代細胞。按SABC法免疫組化染色進行細胞鑒定，所培養(yǎng)的細胞抗波形蛋白、抗纖維連接蛋白抗體陽性、抗a-肌動蛋白單克隆抗體染色陰性，符合成纖維細胞的染色特征，純度達98%以上。2.2MTT比色法檢測細胞增殖取對數(shù)生長期CFb5xl(^個細胞接種于96孔板中，37°C、5%(202及飽和濕度下培養(yǎng)24h后換無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，使細胞進入生長靜止期。吸棄各孔培養(yǎng)基，分別加不同濃度的CAP，繼續(xù)培養(yǎng)48h。實驗分組(各組DMEM培養(yǎng)基中均含1%胎牛血清)空白對照組(無血清培養(yǎng)液)；AngII模型組(10-7mo1L");CAP組(AngIIl(T7molL"+CAP4.8mgl/1)組CAE組(Ang詣-7mo卜L/'+CAE0.48mgL')，各組藥物刺激44h后，每孔加入MTT溶液20^il(5g'L")，繼續(xù)孵育4h,小心吸棄孔內上清液，每孔加入150nlDMSO,振蕩10min，使結晶物完全溶解。選擇490nm波K，酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔吸光度值(A49()值)。2.3羥脯氨酸測定分組同2.2，換用24孔培養(yǎng)板，藥物作用48h后收集各孔培養(yǎng)液上清，嚴格按試劑盒要求操作。2.4統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準差(；±^)表示，使用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析。3實驗結果3.1CAP對AngII誘導CFb增殖的影響MTT結果顯示，AngII作用48h后可顯著提高CFb對MTT的代謝率，MTT的A值明顯升高，與空白對照組相比差異有顯著性(PO.0p，表明AiigII對心肌成纖維細胞有促增殖作用。CAP作用后，CAP組MTT的A值明顯降低，與AngII模型組相比差異有顯著性(P<0.01)，表明CAP能完全逆轉AngII的作用，說明CAP有抑制成纖維細胞增殖的作用，而同等劑量的CAE無明顯效果。詳細結果見表3。表3CAP對AngII誘導CFb增殖的影響(；±、n=12)組別__抑制率/%空白對照組0.2648±0.1000AngII模型組0.6702±0.1104**CAP組0.4306±0.1610A35.75CAE纟且0.6237±0.17436.94與空白對照組比較**P<0.01;與AngII模型組比較AP<0.05本實驗結果顯示，AngII顯著促進心肌成纖維細胞的增殖及膠原的合成，具有促纖維化作用，而CAP能明顯抑制AngII的上述作用，而同等劑量的CAE無明顯效果。3.2羥脯氨酸測定結果AngII模型組的CFb培養(yǎng)液羥脯氨酸含量較空白對照組明顯升高(P<0.01)，CAP組的CFb培養(yǎng)液經(jīng)脯氨酸含量較AngII模型組明顯降低(PO.05)，提示CAP可逆轉AngII的這作ffl，而同等劑量的CAE無明顯效果。見表4。表4CAP對AngII誘導CFb^:'原合成的影響(5±"n=12)_^_羥脯氨酸含量gml'空白對照組0.36±0.17AngII模型組0.85±0.06*CAP組0.72±0.13*厶CAE組0.81±0.11*與空白對照組比較*P<0.05;與AngII模型組比較APO.05心肌纖維化是指心肌膠原濃度顯著升高或心肌膠原容積分數(shù)高于正常值。由于羥脯氨酸在膠原蛋白中所占的比例比較恒定，所以心肌組織內羥脯氨酸的濃度可代表膠原的水平，即心肌纖維化的病變程度。本實驗結果顯示，CAP能明顯抑制Angn的促進心肌成纖維細胞的增殖及膠原的合成，具有抗心肌纖維化作用。實施例3蜈蚣酸性蛋白對壓力超負荷性心肌肥厚的干預作用1.1試驗藥物實驗用蜈蚣酸性蛋白(即CAP)、蜈蚣水提取物(S卩CAE)，與實施例l相同；卡托普利(常州制藥廠有限公司生產(chǎn)，批號0602281)。1.2試驗動物健康雄性SD大鼠50只，體重220280g，購于河北醫(yī)科大學實驗動物中心。1.3試劑與儀器FA2004型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)。722光柵分光光度計(上海第三儀器廠)。N-IOOI型EYELA旋轉蒸發(fā)儀、SB-2000型EYELA水浴鍋，(上海愛郎儀器有限公司)。FJ-2021型Y-放射免疫計數(shù)器()西安二六二廠。Humalyzer2000型半自動生化儀(德國豪邁公司)。1.4試驗方法大鼠隨機分為5組假手術組、模型對照組、卡托普利組、CAP干預組，CAE干預組，每組10只。壓力負荷性心肌肥厚模型的復制用20g/L戊巴比妥40mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，打開腹腔，在腎動脈分支以上，鈍性分離暴露腹主動脈。用5號醫(yī)用絲線將S徑約0.6mm的6號去尖注射針頭與腹主動脈一起平行結扎，抽出針頭，即可形成腹主動脈狹窄。假手術組問樣分離腹主動脈，但不結扎。手術后第6周起，假手術組、模型對照組每天生理鹽水腹腔注射lml/100g;卡托普利組給予卡托普利灌胃30mg/kg;CAP干預組腹腔注射CAP1.0g/kg，CAE干預組腹腔注射CAEl.Og/kg。第8周時用25%烏拉坦4ml/kg麻醉后稱重，股動脈取血，放免法測定血漿AngII、內皮素(ET)、醛固酮(ALD)、心房鈉尿肽(ANP)含量；血淸生化檢測NO、一氧化NOS、SOD含量；取心臟，稱心臟重量及心室重，計算心臟重量指數(shù)(心臟重/體重)、心室重量指數(shù)(心室重/體重)。2結果2.1實驗動物數(shù)量參加實驗50只大鼠，在實驗期間模型對照組大鼠因急性心衰死亡2只，卡托普利組因急性心衰死亡l只、慢性心衰死亡l只；CAP干預組、CAE干預組因急性心衰各死亡1只，假手術組大鼠沒有死亡。在實驗觀察終點時，存活大鼠共45只。2.2各組大鼠體質量、心臟重量指數(shù)、心室重量指數(shù)比較各組大鼠體質量比較，差異無顯著意義(P〉0.05)，模型組心臟重量指數(shù)、心室重量指數(shù)較假手術組明顯增加(P〈0.01)，說明模型組大鼠心肌明顯肥厚。卡托普利組與CAP干預組心臟重量指數(shù)、心室重量指數(shù)較模型組明顯降低(P〈0.01)，而同等劑量的CAE無明顯效果。見表5。表5各組大鼠的體質量、心臟重量指數(shù)、心室重量指數(shù)比較(丁土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>與假手術組比較*p<0.05:與模型對照組比較Ap<0.05。2.3各組大鼠血漿生化指標比較模型對照組與假手術組比較，AngII、ALD、ET、ANP顯著升高?？ㄍ衅绽M、CAP干預組分別與模型對照組比較，AngII、ALD、ET、ANP顯著降低。見表6。表6各組大鼠血漿指標比較(x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2.4各組大鼠血清生化指標比較模型對照組與假手術組比較，NOS、N0、S0D顯著降低?？ㄍ衅绽M、CAP干預組分別與模型對照組比較，N0S、N0、S0D顯著升高。見表7。表7各組大鼠血清生化指標比較(1T±s)指標假手術組模型對照組卡托普利組cAP+頂ajCAP十預組N0S(U/n")21.52±0.6417.87±0.20*20.57±I.56A20.32±1.54*18.21±1.19*N0(畫]7U297.75±54.3184.26±7.08*226.31±29.32*153.89士62.60'104.58±8.83*S0D(U/n")55.44±1.4743.80±3.75*48.84±3.92A47.74±45.12±4.87'與假手術組比較*p<0.05;與模型對照組比較<0.05本實驗結果顯示，模型組心臟重量指數(shù)較假手術組明顯增加，說明模型組大鼠心肌明顯肥厚，復制模型成功。而經(jīng)卡托普利、CAP干預后心肌肥厚明顯減輕。心肌肥大是心肌細胞對持續(xù)性負荷增加的一種適應性反應。初期的心肌肥大有一定代償意義，但心肌肥大引起的心肌肥厚及心肌重構最終可導致心力衰竭，因此防止心肌肥厚有重要的意義?，F(xiàn)代醫(yī)學研究證實，許多因子或合成系統(tǒng)(腎素-血管緊張素-醛同酮系統(tǒng)(RAAS)、兒茶酚胺類、N0合成系統(tǒng))直接誘導或是介入了心肌肥厚的發(fā)牛和發(fā)展過程，向時各系統(tǒng)之間并非孤立而是緊密相關的。如RAAS和NO合成系統(tǒng)之間通過血管緊張素轉化酶(ACE)和緩激肽相互影響，是心肌肥厚發(fā)生的決定因素。本次實驗結果顯示，壓力負荷后AngII、ALD顯著升高，表明RAAS被激活，引起心肌肥厚?？ㄍ衅绽麑儆谘芫o張素轉換酶抑制劑(ACEI)，可明顯抑制AngII、ALD的上升，進而改善心肌肥厚。CAP也具有類似的作用。ANP為胚胎期表達的基因，出生后在正常心肌組織中表達量很低。如果檢測到ANP含量明顯增加，則屬于胚胎期基因重演，為病理性心肌肥大的可靠指標。本實驗結果顯示，伴隨心肌肥厚的發(fā)生，ANP顯著升高，而經(jīng)藥物干預后ANP含量下降，說明CAP在抑制RAAS并改善心肌肥厚的同時也影響著ANP的表達。ET是一種21個氨基酸組成的縮血管活性肽，具有多種生物學活性，包括促血管平滑肌增殖、纖維化、炎癥等，是一種潛在的心肌細胞生長因子和肥厚因子。N0在心肌肥厚中發(fā)揮拮抗ET等縮血管物質的作用。本實驗結果顯示伴隨心肌肥厚的產(chǎn)生，ET升高顯著，而N0、N0S顯著降低。實驗表明，在心肌肥厚發(fā)生后的病理狀態(tài)下，舒縮血管活性物質之間的平衡狀態(tài)被打破，發(fā)生調節(jié)紊亂。而經(jīng)卡托普利、CAP干預后，使這一平衡狀態(tài)有所恢復。本次實驗中，CAP干預組大鼠SOD明顯高于模型組，進一步說明CAP可阻止氧自由基對細胞膜的攻擊，減輕脂質過氧化損傷，從而改善心肌肥厚。本發(fā)明方法所提供的蜈蚣酸性蛋白所表現(xiàn)的生物活性進一步證明了本發(fā)明方法可以更好地分離提取出蜈蚣的有效成分。用本發(fā)明方法提取的蜈蚣酸性蛋白制備成藥物后，可經(jīng)口服或非口服給藥，給藥量可因藥物劑型不同而各有不同，對成年人來說，每天250500mg比較合適。通常在制備口服藥物劑型時，以木發(fā)明方法提取的蜈蚣酸性蛋白為活性成分，采用常規(guī)的制劑技術將其與藥用輔劑如賦形劑、崩解劑、黏合劑、潤滑劑、抗氧化劑、包衣劑、著色劑、芳香劑、表面活性劑等混合，制成顆粒劑、膠囊劑、片劑的等口服劑型。也可按照常規(guī)技術制備成注射液、輸液劑或栓劑等非口服劑型。采用本發(fā)明方法提取的蜈蚣酸性蛋白制備成藥物后在臨床上可以用于抑制各種原因所致的心肌纖維化，如心力衰竭性及纖維化、風濕病心臟病性及纖維化、心肌梗死后心肌纖維化等等。也可以用于預防急性心衰和抑制心肌肥厚。實施例4:蜈蚣酸性蛋白的提取制備酸性蛋白蛋白的提取蜈蚣用粉碎機制成50目粉，精密稱取約6g，加50ml無水乙醇脫脂，冰水浴超聲波振蕩0.5小時，過濾，得殘渣。殘渣在冰水浴中，用50ml濃度為0.06mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)超聲提取2h,繼續(xù)在4"C滲漉提取(按照常規(guī)的滲漉提取)12h，在4'C下3000r.min"離心10min，得綠色上清液，用紙漿鋪成濾餅過濾。過濾后用10ml磷酸鹽緩沖液沖洗濾餅，抽濾至干，合并濾液。酸性蛋白的純化和分離所得濾液裝入10kMWCO半透膜，置于盛有重蒸水的燒杯中，濃縮透析12h，每2h換一次水，以除去無機離子及有機小分子。濃縮液用lmol/L的磷酸溶液調節(jié)pH值至4.4后，于40'C下真空濃縮至20ml。4。C低溫下緩慢滴加無水乙醇至醇濃度達40%。放置10h后，4°C3000r.min"離心10min，得到半固體狀沉淀即為蜈蚣藥材的酸性蛋白粗提物。沉淀用0.06mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)10ml溶解，4'C保存。經(jīng)測定，以生藥濃度為0.484g/ml，酸性蛋白含量可達15.8mg/nil。該實施例只是為了更詳細地說明本發(fā)明方法，但它不以任何形式限制本發(fā)明。在本發(fā)明方法所述的參數(shù)范圍內，均可提取分離出本發(fā)明所述的蜈松酸性蛋白。下面是以本發(fā)明方法提取的蜈蚣酸性蛋白為活性成分的藥劑實施例。實施例5按照本領域已知的方法制備片劑，每片含有下述成分蜈蚣酸性蛋白250mg乳糖70mg硬脂酸鎂3mg聚乙烯比咯烷酮130mg實施例6按照本領域已知的方法制備膠囊劑，每個膠囊中含有下述成分:蜈蚣酸性蛋白500mg乳糖70mg玉米淀粉25mg硬脂酸鎂lmg聚乙烯比咯垸酮130mg以上實施例是為了更詳細地說明本發(fā)明，但它不以任何形式限制本發(fā)明。權利要求1、一種提取蜈蚣酸性蛋白的方法，其特征在于它包括有以下步驟a、將蜈蚣細粉，加入無水乙醇脫脂，在冰水浴中超聲波振蕩15～30分鐘，過濾，留取濾渣；b、取濾渣，加入磷酸鹽緩沖液，在冰水浴中超聲波振蕩1.5～2.5小時后，在-10～5℃滲漉提取12～14小時，滲漉液在2～4℃下用離心機離心獲取上清液，上清液經(jīng)紙漿濾餅過濾，留取濾液；c、將濾液置于半透膜中，放在置有重蒸餾水的容器中，濃縮透析10～14小時，每1～2小時更換一次水；留取濃縮液；用磷酸溶液調節(jié)濃縮液的pH值至偏酸性后，于40℃下真空再次濃縮；d、將濃縮液在0～6℃低溫下緩慢加入無水乙醇至醇濃度達40～50％，放置10～14小時后，在0～4℃用離心機離心獲取半固體狀沉淀，該沉淀用中性磷酸鹽緩沖液溶解后，冷藏。2、根據(jù)權利要求l所述的提取蜈蚣酸性蛋白的方法，其特征在于a步驟中所說的超聲波振蕩時間為30分鐘；c步驟中所說的磷酸溶液的濃度為lmol/L2mol/L。3、根據(jù)權利要求l或2所述的提取蜈蚣酸性蛋白的方法，其特征在于b步驟中所說的超聲波振蕩時間為2小時；c步驟中所說的的濃縮透析時間為12小時；(1步驟中所說的至醇濃度為40%。4、蜈蚣酸性蛋白在制備預防心力衰竭藥物中的應用。5、蜈蚣酸性蛋白在制備抑制心肌纖維化藥物中的應用。6、蜈蚣酸性蛋白在制備抑制心肌肥厚藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種提取蜈蚣酸性蛋白的方法，它包括有以下步驟a.將蜈蚣細粉，加入無水乙醇脫脂，在冰水浴中超聲波振蕩，過濾；b.取濾渣，加入磷酸鹽緩沖液，在冰水浴中超聲波振蕩，滲漉提取，滲漉液離心獲取上清液，上清液過濾；c.將濾液置于半透膜中，濃縮透析留取濃縮液；用磷酸溶液調節(jié)濃縮液的pH值至偏酸性后，真空再次濃縮；d.將濃縮液加入無水乙醇至醇濃度達40～50％，離心獲取半固體狀沉淀，該沉淀用中性磷酸鹽緩沖液溶解后，冷藏。本發(fā)明方法提取的蜈蚣酸性蛋白藥理活性高。本發(fā)明同時公開了用本發(fā)明方法提取蜈蚣酸性在制備預防心力衰竭藥物中的應用；在制備抑制心肌纖維化藥物中的應用。在制備抑制心肌肥厚藥物中的應用。文檔編號C07K14/435GK101113162SQ20071006225公開日2008年1月30日申請日期2007年7月6日優(yōu)先權日2007年7月6日發(fā)明者司秋菊,立楚,王菊素,曄蔣,趙志國申請人:河北醫(yī)科大學