專利名稱：一種三磷酸腺苷的晶膠吸附層析分離方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種三磷酸腺苷的晶膠吸附層析分離方法，尤其是一種利用超大孔連續(xù)床晶膠吸附層析技術從發(fā)酵液中分離三磷酸腺苷(ATP)的方法。
背景技術：
ATP是生物細胞內(nèi)的高能物質(zhì)，是機體能量利用和儲存的中心，參與體內(nèi)脂肪、蛋白質(zhì)、糖類和核酸等的代謝，其二鈉鹽在臨床上廣泛用于心肌疾病、腦溢血、肌肉萎縮、肝炎等疾病的輔助治療。
ATP可通過葉綠體光合磷酸化法轉(zhuǎn)化、酵母或產(chǎn)氨短菌等微生物發(fā)酵、酶轉(zhuǎn)化以及從動物組織提取等方式進行制備。微生物發(fā)酵法是目前工業(yè)上生產(chǎn)ATP的主要方法。其主要工藝過程包括培養(yǎng)發(fā)酵、菌體過濾、雜蛋白沉淀、活性炭吸附、陰離子交換層析、去熱原、結晶精制、干燥等多個步驟，工藝過程復雜，成本高。特別是，ATP吸附層析分離過程常用陰離子交換樹脂，而常規(guī)粒狀陰離子交換樹脂介質(zhì)的孔隙尺寸在納米或亞微米范圍，ATP的吸附主要通過擴散傳質(zhì)，達到吸附平衡需要的時間長。因而，料液在工業(yè)吸附層析柱內(nèi)停留的時間常常長達數(shù)天至十多天，增大了過程成本。另外，環(huán)境溫度較高時(如高于25～30℃的夏季)，料液很容易變質(zhì)，導致生產(chǎn)操作無法順利進行，嚴重影響了生產(chǎn)效率和ATP產(chǎn)品的質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用超大孔連續(xù)床晶膠吸附層析技術(Supermacroporous Cryogel Chromatography，簡稱晶膠層析)迅速高效地分離ATP的新方法。
為達到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術方案是一種三磷酸腺苷的晶膠吸附層析分離方法，所述方法如下(1)將含有三磷酸腺苷的混合液調(diào)pH為酸性，以0.1～30cm/min流速上超大孔連續(xù)床晶膠介質(zhì)床柱，進行吸附；所述晶膠介質(zhì)為陰離子交換晶膠介質(zhì)，所述陰離子交換晶膠介質(zhì)的孔徑為5～400μm、孔隙率為50～98％、功能基團為胺基或其衍生基團；(2)以去離子水或pH值1～6的稀酸溶液為沖洗液沖洗床柱，除去晶膠介質(zhì)內(nèi)殘留的混合液；(3)用洗脫液進行洗脫，收集含三磷酸腺苷的洗脫峰，得到所述的三磷酸腺苷，所述的洗脫液為含有0.001～3M堿金屬鹽的稀酸溶液。
陰離子交換超大孔晶膠介質(zhì)的制備可通過結晶致孔、聚合反應和孔內(nèi)接枝方法實現(xiàn)。首先，將聚合物單體、交聯(lián)劑、催化劑的水溶液裝入層析柱(如常規(guī)層析玻璃柱)，在冷凍條件下進行結晶致孔，得到超大孔晶膠基質(zhì)。然后，將帶有陰離子交換功能基團的接枝單體溶液注入晶膠基質(zhì)，在催化劑作用下進行孔內(nèi)接枝聚合反應，得到陰離子交換超大孔連續(xù)床晶膠介質(zhì)。晶膠基質(zhì)的制備方法可參照文獻中介紹的方法(Yao et al.，Chem.Eng.Sci.61，6701-6708，2006)；基質(zhì)孔內(nèi)接枝聚合反應也可參照文獻(Savina et al.，J.Chromatogr.A 1092，199-205，2005)。具體過程見后面的實例。
所述陰離子交換晶膠介質(zhì)優(yōu)選為叔胺或季胺型陰離子交換晶膠介質(zhì)。
所述胺基或其衍生基團優(yōu)選為下列之一①-N+(CH3)3、②-N(CH3)2、③-N(C2H5)2。
所述步驟(2)中沖洗液流速0.1～20cm/min。
所述步驟(3)中的洗脫為梯度洗脫，洗脫液流速0.1～20cm/min，步驟如下先用含堿金屬鹽0.001～0.06M、pH1～6的稀酸溶液I進行洗脫，再用含堿金屬鹽0.1～3M、pH1～6的稀酸溶液II進行洗脫，收集含三磷酸腺苷的洗脫峰，得到所述的三磷酸腺苷。
所述稀酸溶液、稀酸溶液I、稀酸溶液II各自獨立為下列之一①鹽酸溶液、②硫酸溶液、③乙酸溶液、④檸檬酸溶液。
所述堿金屬鹽優(yōu)選為NaCl或KCl。
所述步驟(1)中含有三磷酸腺苷的混合液為啤酒酵母發(fā)酵液。
具體的，所述方法如下(1)將含有三磷酸腺苷的啤酒酵母發(fā)酵液調(diào)pH為2～3，以2～10cm/min流速上超大孔連續(xù)床晶膠介質(zhì)床柱，進行吸附；所述晶膠介質(zhì)為陰離子交換晶膠介質(zhì)，所述陰離子交換晶膠介質(zhì)的孔徑為5～400μm、孔隙率為50～98％、功能基團為下列之一①-N+(CH3)3、②-N(CH3)2、③-N(C2H5)2；(2)用沖洗液以2～10cm/min流速沖洗床柱，除去晶膠介質(zhì)內(nèi)殘留的混合液；所述沖洗液為下列之一①去離子水、②pH2～4的鹽酸溶液、③pH2～4的硫酸溶液、④pH2～4的乙酸溶液、⑤pH2～4的檸檬酸溶液；(3)用洗脫液以2～10cm/min流速進行梯度洗脫先用含NaCl或KCl 0.001～0.06M、pH1～6的稀酸溶液I進行洗脫，再用含NaCl或KCl 0.1～3M、pH1～6的稀酸溶液II進行洗脫，收集含三磷酸腺苷的洗脫峰，得到所述的三磷酸腺苷；所述稀酸溶液I、稀酸溶液II各自獨立為下列之一①鹽酸溶液、②硫酸溶液、③乙酸溶液、④檸檬酸溶液。
與現(xiàn)有ATP分離技術相比，本發(fā)明提供的方法的特色是利用晶膠層析實現(xiàn)了ATP的直接分離。晶膠層析方法是2002年出現(xiàn)的新型生物分離技術，可在高流速下從含有微生物細胞的復雜料液系統(tǒng)中直接分離目標物。晶膠介質(zhì)為整體狀介質(zhì)，與常規(guī)粒狀介質(zhì)不同。晶膠介質(zhì)內(nèi)有很多尺寸在數(shù)十至數(shù)百微米的超大孔隙，可允許發(fā)酵液中的微生物細胞順利通過，而料液中的目標物則吸附在孔隙內(nèi)表面，進而實現(xiàn)層析分離。其吸附主要利用對流傳遞，傳質(zhì)阻力小，吸附和層析分離十分迅速。該方法將離心、過濾、濃縮和層析分離等幾個步驟集成為一步實現(xiàn)，可減化傳統(tǒng)分離步驟，縮短處理時間，降低過程成本。本方法將現(xiàn)有ATP分離過程中的菌體過濾、沉淀、活性碳吸附、陰離子交換層析等多個步驟簡化為通過晶膠吸附層析一步實現(xiàn)，處理流速高，料液在柱內(nèi)停留時間短。
本發(fā)明方法的有益效果主要體現(xiàn)在工藝簡單，分離迅速，處理量大，得到的ATP純度高，分離過程成本低。另外，本發(fā)明提供的ATP分離方法中，操作壓力低(優(yōu)選操作條件下柱內(nèi)壓降梯度在0.001～0.02atm/cm左右)，規(guī)模化生產(chǎn)十分容易；而且，晶膠介質(zhì)可方便地進行再生，重復使用，進一步降低了成本。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例1用0.05M的鹽酸，將含有ATP的啤酒酵母發(fā)酵液(以腺苷一磷酸、葡萄糖、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鎂、硫酸銨等為底物，用啤酒酵母發(fā)酵所得，菌體濃度約10g/L，濕重，下同)的pH調(diào)為1，作為待分離用的料液，其OD600值為0.32，ATP含量12mg/mL。料液溶質(zhì)中，ATP占總溶質(zhì)的46％(重量百分比)，腺苷二磷酸(ADP)占28％(重量百分比)，腺苷一磷酸(AMP)占16％(重量百分比)，其它可溶性雜質(zhì)占10％(重量百分比)，下同。選擇內(nèi)徑26mm、高150mm的陰離子交換晶膠層析柱(孔徑5～80μm，孔隙率50％，功能基團-N(CH3)2，聚丙烯酰胺基晶膠骨架，自制)。晶膠介質(zhì)的制備如下將9g丙烯酰胺、2g甲雙叉丙烯酰胺、0.5g過硫酸銨、0.3g四甲基乙二胺溶于75mL水，裝入層析柱，在冷凍條件下(-20℃)進行結晶致孔和聚合反應(48h)，得到超大孔晶膠基質(zhì)。然后，將50mL 0.5M的接枝單體CH2＝CHCO2(CH2)2N(CH3)2注入晶膠基質(zhì)，于63℃下反應24h，得到陰離子交換晶膠介質(zhì)。
用鹽酸溶液(pH1)平衡晶膠床柱，將410mL料液以5cm/min流速上入晶膠床柱，用流動式紫外檢測器監(jiān)測層析過程(UV 254nm)。在5cm/min流速下用400mL去離子水沖洗床柱，沖出柱內(nèi)的發(fā)酵液和未吸附的雜質(zhì)。然后，用1000mL含有0.001M NaCl的鹽酸溶液(pH1)進行洗脫，以除去吸附在晶膠介質(zhì)中的雜質(zhì)，洗脫流速2cm/min；以150mL含有0.5M NaCl的鹽酸溶液(pH1)進行洗脫，收集ATP洗脫峰，洗脫流速2cm/min。
用高效液相色譜(HPLC，5μm、4.6mm×250mm的WatersSymmetryShield RP C18分析柱，柱溫25℃，流動相為50mM的磷酸鉀緩沖液，pH6.5，流速1mL/min，紫外檢測波長259nm，進樣量20μL，外標法定量)對收集的ATP進行分析，ATP收率91％，純度95.5％。
實施例2用0.1M的檸檬酸，將含有ATP的啤酒酵母發(fā)酵液的pH調(diào)為3，作為待分離用的料液(OD600為0.21，ATP含量8mg/mL)。用檸檬酸溶液(pH3)，對內(nèi)徑55mm、高100mm的晶膠床柱(孔徑20～150μm，孔隙率74％，功能基團-N(C2H5)2，聚丙烯酰胺基晶膠骨架，自制)進行平衡。晶膠介質(zhì)的制備如下將10g丙烯酰胺、0.5g甲雙叉丙烯酰胺、1.2g過硫酸銨、1g四甲基乙二胺溶于230mL水，裝入層析柱，在冷凍條件下(-30℃)進行結晶致孔和聚合反應(60h)，得到超大孔晶膠基質(zhì)。然后，將200mL 0.2M的接枝單體CH2＝C(CH3)CO2CH2CH2N(C2H5)2，注入晶膠基質(zhì)，于53℃下反應12h，得到陰離子交換晶膠介質(zhì)。
將280mL料液以2cm/min流速上入晶膠床柱。于2cm/min流速下用600mL檸檬酸溶液(pH3)沖洗床柱后，依次用2L含0.02M KCl的檸檬酸溶液(pH3)、300mL含3M KCl的乙酸溶液(pH3)進行洗脫，收集ATP洗脫峰，洗脫流速2cm/min。ATP收率92％，純度94.1％。
實施例3用0.01M的鹽酸，將含有ATP的啤酒酵母發(fā)酵液的pH調(diào)為5，作為待分離用的料液(OD600為0.26，ATP含量9.7mg/mL)。用鹽酸溶液(pH5)，對內(nèi)徑100mm、高200mm的晶膠柱(孔徑80～400μm，孔隙率98％，功能基團-N+(CH3)3，聚丙烯酰胺基晶膠骨架，自制)進行平衡。晶膠介質(zhì)的制備如下將40g丙烯酰胺、10g甲雙叉丙烯酰胺、6g過硫酸銨、10g四甲基乙二胺溶于1.5L水，裝入層析柱，在冷凍條件下(-55℃)進行結晶致孔和聚合反應(64h)，得到超大孔晶膠基質(zhì)。然后，將2L 0.5M的接枝單體CH2＝C(CH3)CO2CH2CH2N(CH3)3Cl，注入晶膠基質(zhì)，于52℃下反應7h，得到陰離子交換晶膠介質(zhì)。
將2L料液以6cm/min流速上入晶膠床柱，在8cm/min流速下用4L去離子水沖洗后，依次用6L含0.01M NaCl的鹽酸溶液(pH5)、2.5L含0.5MNaCl的鹽酸溶液(pH5)進行洗脫，收集ATP洗脫峰，洗脫流速6cm/min。ATP收率84％，純度89.2％。
實施例4用0.01M的鹽酸，將含有ATP的啤酒酵母發(fā)酵液的pH調(diào)為2，作為待分離用的料液(OD600為0.18，ATP含量7.2mg/mL)。用鹽酸溶液(pH2)，對內(nèi)徑150mm、高500mm的晶膠柱(孔徑20～150μm，孔隙率83％，功能基團-N+(CH3)3，聚丙烯酰胺基晶膠骨架，自制)進行平衡。晶膠介質(zhì)的制備如下將380g丙烯酰胺、40g甲雙叉丙烯酰胺、30g過硫酸銨、70g四甲基乙二胺溶于8L水，裝入層析柱，在冷凍條件下(-48℃)進行結晶致孔和聚合反應(72h)，得到超大孔晶膠基質(zhì)。然后，將9L 1M的接枝單體CH2＝C(CH3)CO2CH2CH2N(CH3)3Cl，注入晶膠基質(zhì)，于57℃下反應12h，得到陰離子交換晶膠介質(zhì)。
將15L料液以10cm/min流速上入晶膠床柱，在10cm/min流速下用25L去離子水沖洗后，依次用40L含0.01M NaCl的鹽酸溶液(pH2)、15L含2M NaCl的鹽酸溶液(pH2)進行洗脫，收集ATP洗脫峰，洗脫流速10cm/min。ATP收率90％，純度98.2％。
實施例5用0.01M的鹽酸，將含有ATP的啤酒酵母發(fā)酵液的pH調(diào)為3，作為待分離用的料液(OD600為0.12，ATP含量5.9mg/mL)。用鹽酸溶液(pH3)對內(nèi)徑150mm、高300mm的晶膠床柱(孔徑50～250μm，孔隙率87％，功能基團-N(C2H5)2，聚丙烯酰胺基晶膠骨架，自制)進行平衡。晶膠介質(zhì)的制備如下將200g丙烯酰胺、32g甲雙叉丙烯酰胺、17g過硫酸銨、22g四甲基乙二胺溶于5L水，裝入層析柱，在冷凍條件下(-53℃)進行結晶致孔和聚合反應(36h)，得到超大孔晶膠基質(zhì)。然后，將5L 1.5M的接枝單體CH2＝C(CH3)CO2CH2CH2N(C2H5)2，注入晶膠基質(zhì)，于65℃下反應12h，得到陰離子交換晶膠介質(zhì)。
將10L料液以7cm/min流速上入晶膠床柱，在3cm/min流速下用15L鹽酸溶液(pH 3)沖洗床柱，依次用20L含0.04M NaCl的鹽酸溶液(pH3)、8L含0.1M NaCl的鹽酸溶液(pH3)進行洗脫，收集ATP洗脫峰，洗脫流速4cm/min。ATP收率93％，純度97.5％。
實施例6用0.02M的硫酸，將含有ATP的啤酒酵母發(fā)酵液的pH調(diào)為4，作為待分離用的料液(OD600為0.45，ATP含量18mg/mL)。用稀硫酸溶液(pH4)，對晶膠床柱(內(nèi)徑16mm、高60mm，孔徑30～300μm，孔隙率91％，功能基團-N(CH3)2，聚丙烯酰胺基晶膠骨架，自制)進行平衡。晶膠介質(zhì)的制備如下將0.55g丙烯酰胺、0.09g甲雙叉丙烯酰胺、0.089g過硫酸銨、0.064g四甲基乙二胺溶于11mL水，裝入層析柱，在冷凍條件下(-25℃)進行結晶致孔和聚合反應(24h)，得到超大孔晶膠基質(zhì)。然后，將15mL 0.2M的接枝單體CH2＝CHCO2(CH2)2N(CH3)2注入晶膠基質(zhì)，于62℃下反應4h，得到陰離子交換晶膠介質(zhì)。
將15mL料液以30cm/min流速上入晶膠床柱，在30cm/min流速下用90mL稀硫酸溶液(pH4)沖洗后，依次用200mL含0.06M KCl的硫酸溶液(pH4)、20mL含0.8M KCl的硫酸溶液(pH4)進行洗脫，收集ATP洗脫峰，洗脫流速20cm/min。ATP收率71％，純度86.0％。
實施例7用0.01M的乙酸，將含有ATP的啤酒酵母發(fā)酵液的pH調(diào)為6，作為待分離用的料液(OD600為0.1，ATP含量4.6mg/mL)。用乙酸溶液(pH6)，對內(nèi)徑10mm、高100mm的晶膠床柱(內(nèi)徑10mm、高100mm，孔徑10～90μm，孔隙率83％，功能基團-N+(CH3)3，聚丙烯酰胺基晶膠骨架，自制)進行平衡。晶膠介質(zhì)的制備如下將0.8g丙烯酰胺、0.1g甲雙叉丙烯酰胺、0.07g過硫酸銨、0.06g四甲基乙二胺溶于10mL水，裝入層析柱，在冷凍條件下(-15℃)進行結晶致孔和聚合反應(72h)，得到超大孔晶膠基質(zhì)。然后，將10mL 0.5M的接枝單體CH2＝C(CH3)CO2CH2CH2N(CH3)3Cl，注入晶膠基質(zhì)，于58℃下反應15h，得到陰離子交換晶膠介質(zhì)。
將20mL料液以0.1cm/min流速上入晶膠床柱，于0.1cm/min流速下用120mL去離子水沖洗床柱。然后，依次用280mL含0.03M KCl的乙酸溶液(pH6)、20mL含0.1M KCl的乙酸溶液(pH6)進行洗脫，收集ATP洗脫峰，洗脫流速0.1cm/min。ATP收率81％，純度88.0％。
權利要求
1.一種三磷酸腺苷的晶膠吸附層析分離方法，所述方法如下(1)將含有三磷酸腺苷的混合液調(diào)pH為酸性，以0.1～30cm/min流速上超大孔連續(xù)床晶膠介質(zhì)床柱，進行吸附；所述晶膠介質(zhì)為陰離子交換晶膠介質(zhì)，所述陰離子交換晶膠介質(zhì)的孔徑為5～400μm、孔隙率為50～98％、功能基團為胺基或其衍生基團；(2)以去離子水或pH值1～6的稀酸溶液為沖洗液沖洗床柱，除去晶膠介質(zhì)內(nèi)殘留的混合液；(3)用洗脫液進行洗脫，收集含三磷酸腺苷的洗脫峰，得到所述的三磷酸腺苷，所述的洗脫液為含有0.001～3M堿金屬鹽的稀酸溶液。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述陰離子交換晶膠介質(zhì)為叔胺或季胺型陰離子交換晶膠介質(zhì)。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述胺基或其衍生基團為下列之一①-N+(CH3)3、②-N(CH3)2、③-N(C2H5)2。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(3)中的洗脫為梯度洗脫，洗脫液流速0.1～20cm/min，步驟如下先用含堿金屬鹽0.001～0.06M、pH1～6的稀酸溶液I進行洗脫，再用含堿金屬鹽0.1～3M、pH1～6的稀酸溶液II進行洗脫，收集含三磷酸腺苷的洗脫峰，得到所述的三磷酸腺苷。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于所述稀酸溶液、稀酸溶液I、稀酸溶液II各自獨立為下列之一①鹽酸溶液、②硫酸溶液、③乙酸溶液、④檸檬酸溶液。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于所述堿金屬鹽為NaCl或KCl。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中含有三磷酸腺苷的混合液為啤酒酵母發(fā)酵液。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)將含有三磷酸腺苷的啤酒酵母發(fā)酵液調(diào)pH為2～3，以2～10cm/min流速上超大孔連續(xù)床晶膠介質(zhì)床柱，進行吸附；所述晶膠介質(zhì)為陰離子交換晶膠介質(zhì)，所述陰離子交換晶膠介質(zhì)的孔徑為5～400μm、孔隙率為50～98％、功能基團為下列之一①-N+(CH3)3、②-N(CH3)2、③-N(C2H5)2；(2)用沖洗液以2～10cm/min流速沖洗床柱，除去晶膠介質(zhì)內(nèi)殘留的混合液；所述沖洗液為下列之一①去離子水、②pH2～4的鹽酸溶液、③pH2～4的硫酸溶液、④pH2～4的乙酸溶液、⑤pH2～4的檸檬酸溶液；(3)用洗脫液以2～10cm/min流速進行梯度洗脫先用含NaCl或KCl0.001～0.06M、pH1～6的稀酸溶液I進行洗脫，再用含NaCl或KCl0.1～3M、pH1～6的稀酸溶液II進行洗脫，收集含三磷酸腺苷的洗脫峰，得到所述的三磷酸腺苷；所述稀酸溶液I、稀酸溶液II各自獨立為下列之一①鹽酸溶液、②硫酸溶液、③乙酸溶液、④檸檬酸溶液。
全文摘要
用超大孔連續(xù)床晶膠吸附層析技術(Supermacroporous CryogelChromatography，簡稱晶膠層析)迅速高效地分離ATP的方法。所述方法是首先將微生物發(fā)酵液的pH值調(diào)為酸性，用陰離子交換型超大孔連續(xù)床晶膠介質(zhì)床柱進行吸附，然后用沖洗液沖洗床柱，除去晶膠介質(zhì)內(nèi)殘留的發(fā)酵液和雜質(zhì)，用洗脫液分步洗脫，得到高純度的ATP。本發(fā)明提供的方法將現(xiàn)有ATP分離工藝過程中的菌體過濾、沉淀、活性炭吸附、陰離子交換層析等多個步驟簡化為通過晶膠吸附層析一步實現(xiàn)，工藝簡單，料液在柱內(nèi)停留時間短，分離迅速，處理流速高，分離過程成本低，得到的ATP純度高，規(guī)?；a(chǎn)分離十分方便。
文檔編號C07H1/06GK101085797SQ20071006981
公開日2007年12月12日 申請日期2007年6月29日 優(yōu)先權日2007年6月29日
發(fā)明者贠軍賢, 沈紹傳, 姚克儉 申請人:浙江工業(yè)大學