專利名稱：一種c端特異的人tp53i3多肽及其抗體制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以抗體為特征的體外試驗(yàn)用的生物制品，具體是一種C端 特異的人TP53I3多肽及其抗體制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
TP53I3 (tumor protein p53 inducible protein 3)與氧化還原酶相似，它 可以被腫瘤基因p53誘導(dǎo)并參與p53介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。在其分子的啟動(dòng)子區(qū) 包含有一個(gè)p53結(jié)合區(qū)域，下游有五個(gè)核苷酸組成的微衛(wèi)星序列。研究表明， p53通過(guò)與其下游的微衛(wèi)星序列相互作用而轉(zhuǎn)錄激活TP53I3基因。微衛(wèi)星序 列具有多態(tài)性，因p53轉(zhuǎn)錄激活的豐度不同而有不同的五個(gè)核苷酸重復(fù)，提 示微衛(wèi)星多態(tài)性可能與機(jī)體腫瘤易感性的不同有關(guān)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是為解決通過(guò)免疫實(shí)驗(yàn)特異性檢測(cè)人TP53I3的表達(dá)與天然存 在，并建立相應(yīng)體外免疫分析所需基本生物制品的問(wèn)題，而提供的一種能 特異性針對(duì)人TP53I3的C端的合成多肽、相應(yīng)抗體及其制備方法。本發(fā)明還可同時(shí)解決目前使用的類似抗體價(jià)格高，親和力低，抗體結(jié)合蛋白的位置不特異且抗原性較差等問(wèn)題。本發(fā)明所述的抗人TP53I3合成多肽、相應(yīng)抗體，按照以下步驟制備抗原表位分析與拮抗位置確定利用多種表位預(yù)測(cè)軟件，如DNAstar， OMIGA， UWGCG等進(jìn)行綜合分析，主要考量指標(biāo)包括親水性結(jié)構(gòu)、抗 原指數(shù)、表面可及性等，再結(jié)合我們己有實(shí)際制備抗體的驗(yàn)證經(jīng)驗(yàn)，最終 確定第255到第269位為該抗體的耙標(biāo)，其氨基酸序列為 LFKRGSLITSLLRSR。多肽的合成耙標(biāo)多肽采用全自動(dòng)多通道多肽合成儀合成，柱層析純化，然后通過(guò)HPLC，用每分鐘1。/。的標(biāo)準(zhǔn)乙晴梯度來(lái)檢測(cè)純度。多肽與載體蛋白交聯(lián)由于本合成多肽分子量太小，在動(dòng)物體內(nèi)不能 誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，因此將多肽與載體蛋白交聯(lián)后才能進(jìn)行免疫，選擇鑰 孔嘁血藍(lán)素進(jìn)行交聯(lián)，能顯著增加抗原的大小和免疫原性，從而制備出人 工免疫原。免疫動(dòng)物所述的制備方法，其抗原肽-交聯(lián)載體蛋白做為免疫原，免 疫家兔制備抗體。選取適齡免疫用新西蘭兔，經(jīng)過(guò)適應(yīng)性詞養(yǎng)后進(jìn)行多點(diǎn) 注射免疫。反復(fù)加強(qiáng)免疫，至取血測(cè)抗體效價(jià)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)時(shí)停止免疫?？贵w純化達(dá)到要求的免疫動(dòng)物放血，標(biāo)準(zhǔn)方法收集抗血清，依次使 用辛酸-硫酸銨方法和親和層析過(guò)柱純化方法，進(jìn)行抗血清純化，通過(guò)SDS-PAGE和HPLC驗(yàn)證純度，得到目標(biāo)抗體。本發(fā)明制備的高質(zhì)量多肽抗體效價(jià)高、親和力強(qiáng)，可與天然人TP5313分子發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。用多肽制備抗體的成本較常規(guī)的重組抗原制備 抗體方法低，抗體特異性好，經(jīng)親和層析純化后可以用于各種酶免檢測(cè)和WB試驗(yàn)要求，可用于建立體外免疫分析。該合成肽抗體的制備，為人 TP53I3分子的研究及其相關(guān)疾病的研究(如診斷策略的制定，流行病學(xué) 調(diào)查、預(yù)防和控制)提供了一個(gè)重要的工具，以及在生物醫(yī)學(xué)研究中對(duì)相 應(yīng)靶蛋白的特性、含量的測(cè)定、分布情況的分析和蛋白的確證等方面都具 有重要作用。


圖1是液相色譜鑒定合成多肽純度結(jié)果圖。 圖2是質(zhì)譜鑒定合成多肽分子量結(jié)果圖。圖3是通過(guò)間接ELISA方法鑒定純化抗體相對(duì)親和常數(shù)結(jié)果圖。圖1表明經(jīng)過(guò)HPLC對(duì)合成的多肽進(jìn)行純化后，液相色譜鑒定純度 為88.2%。圖2表明多肽分子量理論值為1849.3，質(zhì)譜鑒定實(shí)測(cè)值M+H+為 1849.5。圖3中ELISA檢測(cè)制備的多抗和多肽抗原親和常數(shù)為106-107L/mol。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:人TP53I3抗原肽的合成。用DNAstar， OMIGA， UWGCG等蛋白分析軟件，對(duì)人TP53I3氨基 酸序列進(jìn)行親水性結(jié)構(gòu)(hydrophilicity)、抗原指數(shù)(antigenicity)、表面可及 性(surface probability)以及同源性(homology)等分析，再結(jié)合我們己有實(shí) 際制備抗體的驗(yàn)證經(jīng)驗(yàn)，最終確定第255到第269位為靶標(biāo)，其氨基酸 序列為L(zhǎng)FKRGSLITSLLRSR。在全自動(dòng)多肽合成儀上由固定羧基向氨基 端遞減合成后獲得粗品。經(jīng)30%乙睛溶解后，進(jìn)行高壓液相色譜(HPLC) 分析，計(jì)算主峰面積并收集，經(jīng)冷凍真空抽干后純化合成肽，質(zhì)譜鑒定。實(shí)施例2:合成多肽與載體的偶聯(lián)。載體蛋白選擇KLH (Keyhole limpet hemocya'nin)，用雙功能試劑 順丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(MBS)連接法將KLH與合成肽進(jìn)行偶聯(lián) 取KLH5mg (0.11|jmol，含賴氨酸2.2|jmol)，溶于Q.75mL偶聯(lián)緩沖液 1 (50mmol/L硼酸鹽緩沖液，pH8.5) ; 3mg MBS (11|jmo)溶于75pL 二甲酰胺(DMF)。將MBS溶液分3次加入KLH溶液，旋轉(zhuǎn)混勻，室溫 作用30分鐘。迅速離心后，將反應(yīng)混合物(約0.8mL)加入預(yù)先用偶聯(lián) 緩沖液2(0.1mol/L磷酸鹽，0.15mol/LNaCL， 0.01mol/LNa2EDTA， pH7.0) 平衡的PD-10柱。用偶聯(lián)緩沖液2洗脫，收集洗脫液(即MBS-KLH溶 液)。溶解1.5mg合成多肽于0.15mL偶聯(lián)緩沖液2，加入MBS-KLH緩 沖液0.56，室溫下旋轉(zhuǎn)混合，'作用2小時(shí)后置4。C過(guò)夜，將反應(yīng)混合物 (約0.7mL)加入預(yù)先用磷酸緩沖液平衡的PD-10柱，磷酸緩沖液洗脫，收集流出液。將KLH、 MBS-KLH和偶聯(lián)物進(jìn)行SDS-KLH和偶聯(lián)物進(jìn)行 SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝膠電泳)鑒定偶聯(lián)效率。實(shí)施例3:抗多肽抗體的制備。取偶聯(lián)的KLH-多肽500ijg，溶于500|jL磷酸緩沖液，加等體積完全 福氏佐劑。免疫選取適齡免疫用新西蘭兔(體重標(biāo)準(zhǔn)為2-2.5公斤)，經(jīng) 過(guò)適應(yīng)性飼養(yǎng)后，背部皮內(nèi)不少于15點(diǎn)注射。2周后抗原量減半(250ijg)， 加等體積的不完全福氏佐劑，第一次加強(qiáng)免疫。2周后進(jìn)行第二次加強(qiáng)免 疫，方法同前。再2周后耳緣靜脈少量采血，用合成多肽(1|jg/mL)包 被酶標(biāo)板，間接ELISA法檢測(cè)免疫血清效價(jià)。反復(fù)加強(qiáng)免疫，至取血測(cè)抗 體效價(jià)達(dá)到1: 16萬(wàn)時(shí)停止免疫，采用頸動(dòng)脈放血收集抗體。實(shí)施例4:親和層析純化抗多肽抗體。① 人TP53I3合成多肽親和層析柱的制備稱取1.5g CNBr活化 S印harose4B，用1mmol/L鹽酸充分浸洗膨脹凝膠后，再用偶聯(lián)緩沖液 洗2次，迅速與溶于5mL偶聯(lián)緩沖液的合成多肽500ijg混合，室溫下旋 轉(zhuǎn)混合2小時(shí)。加入0.2mol/L甘氨酸4mL終止反應(yīng)，室溫下旋轉(zhuǎn)混合1 小時(shí)。用偶聯(lián)緩沖液和甘氨酸緩沖液交替洗凝膠各2次，再用50mL磷酸 鹽緩沖液洗凝膠，按終止?jié)舛?.02%加疊氮鈉(NaN3)，置4。C保存。② 親和層析純化抗多肽抗體:將20mL兔抗多肽血清與1.6mL多肽偶 聯(lián)的S印harose4B共同加入50mL離心管，4。C旋轉(zhuǎn)混合6小時(shí)。將凝 膠加入層析柱，棄去流出液，用15mL磷酸鹽緩沖液沖洗凝膠。每次加 0.8mLpH2.9， 0.1mol/L甘氨酸緩沖液洗脫，共8次，洗脫液分別加入8支預(yù)先加入80|JL 2mol/L Tris-HCL緩沖液(pH7.5) ， 20mL磷酸鹽緩沖 液洗凝膠。上述全部操作過(guò)程在4。C下完成。每管取洗脫液2pL，稀釋 50倍后測(cè)280nm的OD值，計(jì)算蛋白質(zhì)含量并繪制洗脫曲線。實(shí)施例5:抗體的鑒定，使用間接ELISA方法檢測(cè)抗體相對(duì)親和常數(shù)。用合成肽交聯(lián)BSA，分別以5 pg/mL和10 ug/mL的濃度，在4 度下包被ELISA檢測(cè)板過(guò)夜，10%的山羊血清室溫封閉2小時(shí)后加入倍 比稀釋的已知蛋白濃度的純化后的抗體，再加入HRP標(biāo)記的羊抗兔lgG 二抗0.1mL， TMB顯色測(cè)定A450。以抗體濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以曲線 達(dá)到水平時(shí)的A45。值為100%，以其他相對(duì)于該濃度的百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)作 圖，求出A50即50% A值對(duì)應(yīng)的抗體濃度。按照Kaff=(n-1)/2(n[Ab'] t-2[Ab] t)算出抗體相對(duì)親和常數(shù)，其中[Ab' ]t 、 [Ab]t指的是A5o時(shí)即包被抗原 分別為5 p g/mL和10 u g/mL時(shí)抗體半飽和時(shí)抗體的摩爾濃度，[Ag] t、 [Ag'] t指的是包被的抗原濃度本實(shí)驗(yàn)中即指10y g禾B 5 " g， n=[Ag] t/[Ag'] t，本實(shí)驗(yàn)中n-2。試驗(yàn)效果1人TP53I3合成多肽HPLC純化后，使用液相色譜鑒定純度為 88.2%。多肽分子量理論值為1849.3，質(zhì)譜鑒定實(shí)測(cè)值M+H+
為1849.5。2.多肽與載體的偶聯(lián)效率SDS-PAGE電泳鑒定偶聯(lián)效率與樣品回 收率大致相符，大于80%。3. 抗體效價(jià)多只家兔得到的抗血清效價(jià)均在1:10萬(wàn)以上。4. 抗體親和力相對(duì)親和常數(shù)為106-107L/mol。5. 抗體的應(yīng)用以上技術(shù)指標(biāo)的實(shí)現(xiàn)保證該抗體完全可以應(yīng)用于蛋白印跡和各種酶免實(shí)驗(yàn)，以及建立相應(yīng)體外免疫分析試劑。<formula>formula see original document page 10</formula><213>人 <400> 2LFKRGSLITSLLRSR
權(quán)利要求
1.一種C端特異的人TP53I3多肽，其特征在于多肽的氨基酸序列為L(zhǎng)FKRGSLITSLLRSR。
2. —種特異的抗人TP5313 C端合成多肽抗體，其特征在于該抗體效價(jià)在l: 100000以上， 特異性強(qiáng)，親和力高達(dá)106_107L/mol。
3. —種特異的抗人TP53I3C端合成多肽抗體的制備方法，其特征在于以人TP53I3氨基酸序 列中第255到第269位的LFKRGSLITSLLRSR肽段序列作為抗原肽合成人TP53I3抗原 肽；純化的抗原肽與蛋白載體偶聯(lián)，經(jīng)柱層析純化后；制備出人工免疫原，免疫動(dòng)物，制 備多肽抗體，并經(jīng)親和層析純化而成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于載體蛋白為鑰孔嘁血藍(lán)素。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于偶聯(lián)的KLH —多肽加福氏佐劑免疫后收集 抗體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于抗原肽與載體蛋白偶聯(lián)作為免疫原，免疫家 兔制備兔抗人TP53I3合成多肽抗體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于合成多肽偶聯(lián)Sepharose4B，制備親和層析 柱，用于純化抗多肽抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種C端特異的人TP53I3多肽及其抗體的制備方法，屬于以抗體為特征的體外試驗(yàn)用的生物制品。C端特異的人TP53I3多肽的氨基酸序列為L(zhǎng)FKRGSLITSLLRSR?？谷薚P53I3多肽抗體按以下方法制備(1)人TP53I3抗原表位的分析；(2)人TP53I3 C端多肽的合成；(3)合成多肽與載體蛋白交聯(lián)；(4)制備兔抗人TP53I3多肽抗體；(5)收集、分離得到含有抗體的血清，純化抗體，即得到抗人TP53I3多肽抗體。本發(fā)明制備的C端特異的抗人TP53I3合成多肽抗體效價(jià)高、親和力強(qiáng)、特異性好，可與天然人TP53I3發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)；制備成本低；純化后的抗體可完全用于免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，以及建立體外免疫分析方法。該抗體為研究TP53I3與p53以及腫瘤易感性的關(guān)系提供了有用的工具。
文檔編號(hào)C07K16/18GK101319000SQ200710100200
公開(kāi)日2008年12月10日 申請(qǐng)日期2007年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月6日
發(fā)明者杜宏武, 王德仙, 陳光宇, 陳吾奇 申請(qǐng)人:北京意宏安生物科技有限公司