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      一種n端特異的人dbf4b多肽及其抗體制備方法

      文檔序號(hào):3559729閱讀:212來源:國知局
      專利名稱:一種n端特異的人dbf4b多肽及其抗體制備方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及以抗體為特征的體外試驗(yàn)用的生物制品,具體是一種N端 特異的人DBF4B多肽及其抗體制備方法,屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
      背景技術(shù)
      DBF4B (DBF4homologBisoform2)是CDC-7類似蛋白1的調(diào)控因 子,它是一種參與細(xì)胞周期調(diào)控和基因組復(fù)制的絲氨酸一蘇氨酸激酶。 DBF4B定位于細(xì)胞核,其表達(dá)受到細(xì)胞周期的調(diào)控。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明是為解決通過免疫實(shí)驗(yàn)特異性檢測(cè)人DBF4B的表達(dá)與天然存 在,并建立相應(yīng)體外免疫分析所需基本生物制品的問題,而提供的一種能 特異性針對(duì)人DBF4B的N端的合成多肽、相應(yīng)抗體及其制備方法。本發(fā) 明還可同時(shí)解決目前使用的類似抗體價(jià)格高,親和力低,抗體結(jié)合蛋白的 位置不特異且抗原性較差等問題。本發(fā)明所述的抗人DBF4B合成多肽、 相應(yīng)抗體,按照以下步驟制備抗原表位分析與拮抗位置確定利用多種表位預(yù)測(cè)軟件,如DNAstar, OMIGA, UWGCG等進(jìn)行綜合分析,主要考量指標(biāo)包括親水性結(jié)構(gòu)、抗 原指數(shù)、表面可及性等,再結(jié)合我們已有實(shí)際制備抗體的驗(yàn)證經(jīng)驗(yàn),最終 確定第38到第52位為該抗體的靶標(biāo),其氨基酸序列為 KNSPGARKHPFSGKS。
      多肽的合成靶標(biāo)多肽采用全自動(dòng)多通道多肽合成儀合成,柱層析純
      化,然后通過HPLC,用每分鐘1。/。的標(biāo)準(zhǔn)乙晴梯度來檢測(cè)純度。
      多肽與載體蛋白交聯(lián)由于本合成多肽分子量太小,在動(dòng)物體內(nèi)不能 誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng),因此將多肽與載體蛋白交聯(lián)后才能進(jìn)行免疫,選擇鑰 孔嘁血藍(lán)素進(jìn)行交聯(lián),能顯著增加抗原的大小和免疫原性,從而制備出人
      工免疫原。
      免疫動(dòng)物所述的制備方法,其抗原肽-交聯(lián)載體蛋白做為免疫原,免 疫家兔制備抗體。選取適齡免疫用新西蘭兔,經(jīng)過適應(yīng)性飼養(yǎng)后進(jìn)行多點(diǎn) 注射免疫。反復(fù)加強(qiáng)免疫,至取血測(cè)抗體效價(jià)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)時(shí)停止免疫。
      抗體純化達(dá)到要求的免疫動(dòng)物放血,標(biāo)準(zhǔn)方法收集抗血清,依次使 用辛酸-硫酸銨方法和親和層析過柱純化方法,進(jìn)行抗血清純化,通過
      SDS-PAGE和HPLC驗(yàn)證純度,得到目標(biāo)抗體。
      本發(fā)明制備的高質(zhì)量多肽抗體效價(jià)高、親和力強(qiáng),可與天然人DBF4B 分子發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。用多肽制備抗體的成本較常規(guī)的重組抗原制備 抗體方法低,抗體特異性好,經(jīng)親和層析純化后可以用于各種酶免檢測(cè)和 WB試驗(yàn)要求,可用于建立體外免疫分析。該合成肽抗體的制備,為人DBF4B分子的研究及其相關(guān)疾病的研究(如診斷策略的制定,流行病學(xué)
      調(diào)查、預(yù)防和控制)提供了一個(gè)重要的工具,以及在生物醫(yī)學(xué)研究中對(duì)相 應(yīng)靶蛋白的特性、含量的測(cè)定、分布情況的分析和蛋白的確證等方面都具 有重要作用。


      圖1是液相色譜鑒定合成多肽純度結(jié)果圖。
      圖2是質(zhì)譜鑒定合成多肽分子量結(jié)果圖。
      圖3是通過ELISA方法鑒定純化抗體相對(duì)親和常數(shù)結(jié)果圖。
      圖1表明經(jīng)過HPLC對(duì)合成的多肽進(jìn)行純化后,液相色譜鑒定純度 為95.5%。
      圖2表明多肽分子量理論值為1700,質(zhì)譜鑒定實(shí)測(cè)值M+H+為 1701.4。
      圖3中間接ELISA檢測(cè)制備的多抗和多肽抗原親和常數(shù)為 109-1010L/mol。
      具體實(shí)施例方式
      實(shí)施例1:人DBF4B抗原肽的合成。用DNAstar, OMIGA, UWGCG等蛋白分析軟件,對(duì)人DBF4B氨基 酸序列進(jìn)行親水性結(jié)構(gòu)(hydrophilicity)、抗原指數(shù)(antigenicity)、表面可及 性(surface probability)以及同源性(homology)等分析,再結(jié)合我們己有實(shí) 際制備抗體的驗(yàn)證經(jīng)驗(yàn),最終確定第38到第52位為靶標(biāo),其氨基酸序列 為KNSPGARKHPFSGKS。在全自動(dòng)多肽合成儀上由固定羧基向氨基端 遞減合成后獲得粗品。經(jīng)30。/。乙睛溶解后,進(jìn)行高壓液相色譜(HPLC) 分析,計(jì)算主峰面積并收集,經(jīng)冷凍真空抽干后純化合成肽,質(zhì)譜鑒定。
      實(shí)施例2:合成多肽與載體的偶聯(lián)。
      載體蛋白選擇KLH (Keyhole limpet hemocyanin),用雙功能試劑 順丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(MBS)連接法將KLH與合成肽進(jìn)行偶聯(lián) 取KLH5mg (0.11|jmol,含賴氨酸2.2|jmol),溶于0.75mL偶聯(lián)緩沖液 1 (50mmol/L硼酸鹽緩沖液,pH8.5) ; 3mg MBS (11|jmo)溶于75|jL 二甲酰胺(DMF)。將MBS'溶液分3次加入KLH溶液,旋轉(zhuǎn)混勻,室溫 作用30分鐘。迅速離心后,將反應(yīng)混合物(約0.8mL)加入預(yù)先用偶聯(lián) 緩沖液2(0.1mol/L磷酸鹽,0.15mol/LNaCL, 0.01mol/LNa2EDTA, pH7.0) 平衡的PD-10柱。用偶聯(lián)緩沖液2洗脫,收集洗脫液(即MBS-KLH溶 液)。溶解1.5mg合成多肽于0.15mL偶聯(lián)緩沖液2,加入MBS-KLH緩 沖液0.56,室溫下旋轉(zhuǎn)混合,作用2小時(shí)后置4。C過夜,將反應(yīng)混合物 (約0.7mL)加入預(yù)先用磷酸緩沖液平衡的PD-10柱,磷酸緩沖液洗脫, 收集流出液。將KLH、 MBS:KLH和偶聯(lián)物進(jìn)行SDS-KLH和偶聯(lián)物進(jìn)行 SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝膠電泳)鑒定偶聯(lián)效率。取偶聯(lián)的KLH-多肽500pg,溶于500|jL磷酸緩沖液,加等體積完全 福氏佐劑。免疫選取適齡免疫用新西蘭兔(體重標(biāo)準(zhǔn)為2-2.5公斤),經(jīng) 過適應(yīng)性詞養(yǎng)后,背部皮內(nèi)不少于15點(diǎn)注射。2周后抗原量減半(25CHjg), 加等體積的不完全福氏佐劑,第一次加強(qiáng)免疫。2周后進(jìn)行第二次加強(qiáng)免 疫,方法同前。再2周后耳緣靜脈少量采血,用合成多肽(1|jg/mL)包 被酶標(biāo)板,間接ELISA法檢測(cè)免疫血清效價(jià)。反復(fù)加強(qiáng)免疫,至取血測(cè)抗 體效價(jià)達(dá)到1: 16萬時(shí)停止免疫,采用頸動(dòng)脈放血收集抗體。
      實(shí)施例4:親和層析純化抗多肽抗體。
      ① 人DBF4B合成多肽親和層析柱的制備稱取1.5g CNBr活化 S印harose4B,用1mmol/L鹽酸充分浸洗膨脹凝膠后,再用偶聯(lián)緩沖液 洗2次,迅速與溶于5mL偶聯(lián)緩沖液的合成多肽500ijg混合,室溫下旋 轉(zhuǎn)混合2小時(shí)。加入0.2mol/L甘氨酸4mL終止反應(yīng),室溫下旋轉(zhuǎn)混合1 小時(shí)。用偶聯(lián)緩沖液和甘氨酸緩沖液交替洗凝膠各2次,再用50mL磷酸 鹽緩沖液洗凝膠,按終止?jié)舛?.02%加疊氮鈉(NaN3),置4。C保存。
      ② 親和層析純化抗多肽抗體:將20mL兔抗多肽血清與1.6mL多肽偶 聯(lián)的S印harose4B共同加入50mL離心管,4。C旋轉(zhuǎn)混合6小時(shí)。將凝 膠加入層析柱,棄去流出液,用15mL磷酸鹽緩沖液沖洗凝膠。每次加 0.8mLpH2.9, 0.1mol/L甘氨酸緩沖液洗脫,共8次,洗脫液分別加入8 支預(yù)先加入80|jL 2mol/L Tris-HCL緩沖液(pH7.5) , 20mL磷酸鹽緩沖 液洗凝膠。上述全部操作過程在4。C下完成。每管取洗脫液2)JL,稀釋 50倍后測(cè)280nm的OD值,計(jì)算蛋白質(zhì)含量并繪制洗脫曲線。
      實(shí)施例5:抗體的鑒定,使用間接ELISA方法檢測(cè)抗體相對(duì)親和常數(shù)。用合成肽交聯(lián)BSA,分別以5 ug/mL和10 ug/mL的濃度,在4 度下包被ELISA檢測(cè)板過夜,10%的山羊血清室溫封閉2小時(shí)后加入倍 比稀釋的已知蛋白濃度的純化后的抗體,再加入HRP標(biāo)記的羊抗兔lgG 二抗0.1mL, TMB顯色測(cè)定A45(j。以抗體濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),以曲線 達(dá)到水平時(shí)的A450值為100%,以其他相對(duì)于該濃度的百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)作 圖,求出A50即50% A值對(duì)應(yīng)的抗體濃度。按照Kaff=(n-1 )/2(n[Ab , ] t-2[Ab] t)算出抗體相對(duì)親和常數(shù),其中[Ab' ]t 、 [Ab]t指的是A5o時(shí)即包被抗原 分別為5 u g/mL和10 u g/mL時(shí)抗體半飽和時(shí)抗體的摩爾濃度,[Ag] t、 [Ag' ] t指的是包被的抗原濃度本實(shí)驗(yàn)中S卩指10 " g禾卩5 ii g, n=[Ag] t/[Ag ,] t,本實(shí)驗(yàn)中n=2。
      試驗(yàn)效果
      1. 人DBF4B合成多肽HPLC純化后,使用液相色譜鑒定純度為 95.5%。多肽分子量理論值為1700,質(zhì)譜鑒定實(shí)測(cè)值M+H+
      為1701.4。
      2. 多肽與載體的偶聯(lián)效率SDS-PAGE電泳鑒定偶聯(lián)效率與樣品回 收率大致相符,大于80%。
      3. 抗體效價(jià)多只家兔得到的抗血清效價(jià)均在1:100萬以上。
      4. 抗體親和力相對(duì)親和常數(shù)為109-101()L/mol。
      5. 抗體的應(yīng)用以上技術(shù)指標(biāo)的實(shí)現(xiàn)保證該抗體完全可以應(yīng)用于蛋
      白印跡和各種酶免實(shí)驗(yàn),以及建立相應(yīng)體外免疫分析試劑。序列表
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      MSEPGKGDDCLELESSMAESRLRAPDLGVSRCLGKCQKNSPGARK HPFSGKSFYLDLPAGKNLQFLTGAIQQLGGVIEGFLSKEVSYIVSSRREVK AESSGKSHRGCPSPSPSEVRVETSAMVDPKGSHPRPSRKPVDSVPLSR GKELLQKAIRNQVSWGKMGQSRWSPA
      <210>2
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      KNSPGARKHPFSGKS
      權(quán)利要求
      1.一種N端特異的人DBF4B多肽,其特征在于多肽的氨基酸序列為KNSPGARKHPFSGKS。
      2. —種特異的抗人DBF4BN端合成多肽抗體,其特征在于該抗體效價(jià)在1: 1000000以上, 特異性強(qiáng),親和力高達(dá)109—101()1711101。
      3. —種特異的抗人DBF4B N端合成多肽抗體的制備方法,其特征在于以人DBF4B氨基酸 序列中第38到第52位的KNSPGARKHPFSGKS肽段序列作為抗原肽合成人DBF4B抗原 肽;純化的抗原肽與蛋白載體偶聯(lián),經(jīng)柱層析純化后;制備出人工免疫原,免疫動(dòng)物,制 備多肽抗體,并經(jīng)親和層析純化而成。
      4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法,其特征在于載體蛋白為鑰孔"戚血藍(lán)素。
      5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法,其特征在于偶聯(lián)的KLH—多肽加福氏佐劑免疫后收集 抗體。
      6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法,其特征在于抗原肽與載體蛋白偶聯(lián)作為免疫原,免疫家 兔制備兔抗人DBF4B合成多肽抗體。
      7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法,其特征在于合成多肽偶聯(lián)Sepharose4B,制備親和層析 柱,用于純化抗多肽抗體。
      全文摘要
      本發(fā)明公開了一種N端特異的人DBF4B多肽及其抗體的制備方法,屬于以抗體為特征的體外試驗(yàn)用的生物制品。N端特異的人DBF4B多肽的氨基酸序列為KNSPGARKHPFSGKS。抗人DBF4B多肽抗體按以下方法制備(1)人DBF4B抗原表位的分析;(2)人DBF4B N端多肽的合成;(3)合成多肽與載體蛋白交聯(lián);(4)制備兔抗人DBF4B多肽抗體;(5)收集、分離得到含有抗體的血清,純化抗體,即得到抗人DBF4B多肽抗體。本發(fā)明制備的N端特異的抗人DBF4B合成多肽抗體效價(jià)高、親和力強(qiáng)、特異性好,可與天然人DBF4B發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng);制備成本低;純化后的抗體可完全用于免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn),以及建立體外免疫分析方法。該抗體為DBF4B在細(xì)胞周期和基因組復(fù)制中的生物學(xué)作用研究提供了有用的工具。
      文檔編號(hào)C07K16/18GK101319001SQ20071010020
      公開日2008年12月10日 申請(qǐng)日期2007年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月6日
      發(fā)明者杜宏武, 王德仙, 陳光宇, 陳吾奇 申請(qǐng)人:北京意宏安生物科技有限公司
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