專利名稱：一種異黃酮類化合物、制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種異黃酮類化合物。本發(fā)明還涉及該化合物的制備方法，以及該類化合物的醫(yī)藥用途。

背景技術(shù)：
金雀異黃素(genistein，GEN)是一種來源于豆類植物的異黃酮，化學(xué)名為5，7，4’-三羥基異黃酮。GEN的化學(xué)結(jié)構(gòu)見式(II)
金雀異黃素(5，7，4’-三羥基異黃酮)結(jié)構(gòu)特征為在分子的相對兩極帶有兩個酚羥基，結(jié)構(gòu)類似于17-β-雌二醇，系典型植物雌激素，分子量為270，能低親和力地結(jié)合雌激素受體，介導(dǎo)雌激素樣作用[1，2]。研究表明，GEN對ERβ的親和力高于ERα，故GEN僅影響部分雌激素受體。金雀異黃素亦是經(jīng)典酪氨酸蛋白激酶抑制劑，生物活性廣泛，特別是具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和拮抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡活性[3]，但因其在腸道吸收甚少或者完全不吸收而導(dǎo)致活性較低[4]。
近年，越來越多的證據(jù)表明，GEN這種天然成分對惡性腫瘤[5，6]，絕經(jīng)后癥候群，骨質(zhì)疏松癥[7，8]及心血管疾病具有預(yù)防和治療作用[9，10]。
血管內(nèi)皮細(xì)胞(Vascular Endothelial Cell)具有多種生理功能，參與機(jī)體的凝血、免疫、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和生物活性物質(zhì)釋放等生命活動。血管內(nèi)皮損傷是許多心血管疾病的病理基礎(chǔ)。在許多病理情況下，如動脈粥樣硬化[11]，高血壓[12]，心肌梗死[13]等均可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能改變，并且內(nèi)皮細(xì)胞在相應(yīng)病理過程的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。目前被普遍接受的Ross[14]修正的“損傷反應(yīng)”學(xué)說認(rèn)為，內(nèi)皮細(xì)胞損傷和內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是動脈粥樣硬化形成早期的始動環(huán)節(jié)。血管內(nèi)皮損傷和功能紊亂與機(jī)體和局部組織抗氧化能力降低，自由基產(chǎn)生增多而氧化滅活一氧化氮有關(guān)[15，16]。研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可能是動脈硬化過程中的重要早期事件。大量研究證明氧化應(yīng)激能夠?qū)е录?xì)胞凋亡，多種致血管內(nèi)皮受損和血管內(nèi)皮功能不全的因素如低密度脂蛋白(LDL)、溶血性磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine，LPC)、高糖、高半胱氨酸等均能增加細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成和誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。在病理情況下，如缺氧、高脂血癥、缺血再灌注等因素可引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，破壞內(nèi)皮結(jié)構(gòu)，使內(nèi)皮功能出現(xiàn)異常，加速血小板、粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附、聚集，誘發(fā)血栓形成甚至堵塞血管。此外，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡還與高血壓、糖尿病等疾病密切相關(guān)，并加重這些疾病的心血管病變。
低密度脂蛋白(LDL)的氧化是動脈粥樣斑塊形成的基礎(chǔ)性因素，高度氧化的LDL具有細(xì)胞毒性，輕度氧化的LDL則具有促有絲分裂作用，能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖[17-20]。除氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)外，內(nèi)源性氧離子和氧自由基，外源性過氧化氫能活化Ras蛋白激酶和ERK1/2，調(diào)節(jié)c-fos的表達(dá)，促進(jìn)VSMC增殖[21，22]。另外細(xì)胞內(nèi)外過氧化氫濃度的小幅度增加也產(chǎn)生促血管內(nèi)皮細(xì)胞和VSMC增殖作用，若過量則會產(chǎn)生細(xì)胞毒性[23，24]。作為一種抗氧化劑genistein具有緩解和消除與過氧化產(chǎn)物所導(dǎo)致的增殖和損傷反應(yīng)作用[25，26]。
動脈粥樣硬化病灶的發(fā)生發(fā)展是動脈壁細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、血液成分、環(huán)境及遺傳等諸多因素相互作用的結(jié)果，其中由黏附分子介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞和白細(xì)胞的黏附是動脈粥樣硬化早期特征和關(guān)鍵步驟[27-29]。在內(nèi)皮損傷期脂質(zhì)代謝紊亂、高血壓、糖尿病、吸煙等諸多危險因素使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損[30-32]，活化的內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)大量的黏附分子，主要有P-selectin、E-selectin、ICAM-1、VCAM-1、PECAM-1等。Sakai等[33]研究發(fā)現(xiàn)，新西蘭兔及遺傳性高脂血癥兔(WHHL)VCAM-1、P-selectin等黏附分子的表達(dá)隨著血脂水平升高逐漸增加，并且早于單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)斑塊內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM-1、VCAM-1和P-selectin，表達(dá)程度與內(nèi)膜下單核-巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞密度密切相關(guān)[34-36]。
黏附分子是一類介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互作用的膜表面糖蛋白，廣泛分布于體內(nèi)，他們在胚胎的發(fā)育和分化、炎癥與免疫應(yīng)答、凝血與血栓形成及腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移等多種生理、病理過程中均具有重要作用[37-39]。內(nèi)皮細(xì)胞選擇素(endothelium-selectin，E-selectin)，它的表達(dá)局限于受到刺激后活化的內(nèi)皮細(xì)胞，因而能更可靠地反映內(nèi)皮細(xì)胞的激活或損傷狀態(tài)[40-41]。合理調(diào)控黏附分子的表達(dá)可望成為預(yù)防和治療動脈粥樣硬化的有效措施之一。
現(xiàn)有技術(shù)中文獻(xiàn)[42]公開了由6取代，4’取代黃酮合成溴代黃酮，見如下的反應(yīng)式，
其中，R1取自H，OCH3，和F、Cl、Br；R2取自H，CH3，OCH3，SCH3，SO2CH3，F(xiàn)，Br。另一文獻(xiàn)[43]公開了下列的化合物。



發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供具有如下結(jié)構(gòu)式(I)的化合物
其中R選自C1-C10烷基，芳基，C7-C12芳烷基，R`為HCF2，R``選自HCF2，C1-C10烷基，芳基，C7-C12芳烷基。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，其中R優(yōu)選自CH3，C2H5，n-C3H7，C6H5CH2，n-C7H15，n-C8H17，n-C10H21，iso-C4H9；R``優(yōu)選自HCF2，CH3，C2H5，n-C3H7，C6H5CH2，n-C7H15，n-C8H17，n-C10H21，iso-C4H9。
最優(yōu)選R，R``均為甲基。
上述化合物按如下式表示合成路線制備。

具體的說，是化合物(II)和化合物(III)在反應(yīng)溫度為0℃～70℃；反應(yīng)時間為6～36小時的條件下，生成7-二氟甲基-5，4’-二羥基異黃酮(IV)；再將化合物(IV)的羥基甲醚化得到7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮(I)，反應(yīng)溫度在40℃～140℃；反應(yīng)時間在4～24小時。
中間產(chǎn)物7-二氟甲基-5，4’-二羥基異黃酮(化合物IV)的合成 這步反應(yīng)為酚羥基的烷基化，烷化劑HCF2Cl為氣體，實(shí)驗(yàn)過程中反應(yīng)瓶的密閉狀態(tài)、堿的用量、溶劑和溫度對反應(yīng)的影響較大。
我們的目的主要是合成7-二氟甲基-5，4’-二羥基異黃酮，為了避免5，4’-取代物的產(chǎn)生，摸索了在敞口常壓和密閉反應(yīng)裝置下金雀異黃素與堿氫氧化鈉的摩爾比對反應(yīng)的影響。
在敞口常壓反應(yīng)裝置下，金雀異黃素與堿氫氧化鈉的摩爾比為1∶1或1∶2時，反應(yīng)很難發(fā)生(36hr仍沒有反應(yīng))；摩爾比為1∶3時，反應(yīng)發(fā)生很慢(8hr)，收率很低，反應(yīng)產(chǎn)物中7-取代物和7，4’-二取代物的比例相當(dāng)，分別為8％和8％；摩爾比為1∶4或1∶5時，反應(yīng)較快發(fā)生(0.5hr)，收率較好，7-取代物和7，4’-二取代物的分別為收率31％和23％；氫氧化鈉的量再提高，收率也沒有明顯提高，金雀異黃素的氧化加劇。反應(yīng)溫度在0℃～30℃反應(yīng)速度較慢；在30℃～40℃反應(yīng)速度有所加快；在40℃以上反應(yīng)時，HCF2Cl氣體在反應(yīng)液中停留時間太短，不利于反應(yīng)的進(jìn)行。反應(yīng)溶劑以直接用水做溶劑效果最好。
在密閉反應(yīng)裝置下，由于HCF2Cl氣體可以保持較高濃度，金雀異黃素與氫氧化鈉的摩爾比為1∶2～1∶3時，反應(yīng)較快發(fā)生(0.5hr)，收率較好，7-取代物和7，4’-二取代物的分別為收率42％和27％；堿的量再提高，7-取代物的收率沒有明顯提高，只提高了7，4’-二取代物的收率。反應(yīng)溶劑以水與水溶性溶劑二氧六環(huán)、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)或丙酮組成的混合溶劑(體積比1∶1)較好。反應(yīng)溫度以接近反應(yīng)溶劑的回流溫度較好，如體積比1∶1的水與二氧六環(huán)混合溶劑的反應(yīng)溫度以70℃最佳。
堿為去酸劑，為強(qiáng)堿，無機(jī)堿去酸劑為NaOH、KOH；有機(jī)堿為甲醇鈉、乙醇鈉、三乙胺。
在反應(yīng)體系中可以加入反應(yīng)促進(jìn)劑為碘化鉀、碘化鈉、堿金屬碘化物。
7-二氟甲基-5，4’-二羥基異黃酮(化合物IV)的5，4’-烷氧基化反應(yīng)。
化合物IV和鹵代烷基，如碘甲烷、溴乙烷、溴丙烷等在丙酮、四氫呋喃、苯、甲苯、二甲苯、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、乙二醇二乙醚或二氧六環(huán)等溶劑中用無機(jī)堿去酸劑為NaOH、KOH、K2CO3、Na2CO3；有機(jī)堿為甲醇鈉、乙醇鈉、三乙胺、吡啶做脫酸劑很順利地合成化合物Ia、Ib、Ic；但化合物Id，Ie，If，Ig，Ih的合成相對困難些，去酸劑的用量要適當(dāng)增大(化合物IV∶去酸劑＝1∶5)，反應(yīng)時間要延長到20小時以上才能使反應(yīng)收率提高。
與金雀異黃素相比，本發(fā)明所制備的化合物具有更強(qiáng)的生理活性。
本發(fā)明利用過氧化氫誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型，以抗氧化經(jīng)典代表藥維生素E(vit E)和先導(dǎo)化合物Genistein作為陽性對照，分別檢測了本發(fā)明提供的9個含二氟甲基異黃酮類化合物抗血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷的活性。發(fā)現(xiàn)(1)在先導(dǎo)化合物(5，7，4’-三羥基異黃酮)基本結(jié)構(gòu)上，C-7位引入二氟亞甲基獲得的7-二氟甲基-5，4’-二羥基異黃酮較先導(dǎo)化合物抗血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷活性有一定程度的提高。(2)全部供試品中以7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮抗血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷活性最高，按等摩爾濃度折算，本發(fā)明提供的化合物降低乳酸脫氫酶(LDH)活性的效價強(qiáng)度為先導(dǎo)化合物genistein的100倍和陽性對照藥Vit E的50倍。(3)隨C-5位和C-4’位取代烷氧基碳鏈延長所獲得的類似物抗血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷活性未發(fā)現(xiàn)有規(guī)律性改變。
因此，本發(fā)明提供的化合物，包括中間體化合物可以用于制備治療血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷性疾病藥物。
本發(fā)明實(shí)施例結(jié)果表明，氧化應(yīng)激損傷內(nèi)皮細(xì)胞使血管內(nèi)皮-單核細(xì)胞的粘附率顯著增高，7-二氟甲基-5，4’-二甲烷氧基異黃酮(Ia)和先導(dǎo)化合物genistein及抗氧化劑Vit E均能有效抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮-單核細(xì)胞粘附?；衔颕a(0.3μmol/L)與genistein(100μmol/L)和Vit E(50μmol/L)的抑制強(qiáng)度相當(dāng)。說明化合物I a抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮-單核細(xì)胞粘附作用的效價強(qiáng)度高于genistein和Vit E。
我們通過ELISA法檢測培養(yǎng)液上清中黏附分子E-Selectin、ICAM-1的濃度進(jìn)一步證實(shí)過氧化氫處理血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子E-Selectin、ICAM-1的釋放增加，化合物I a具有抑制氧化應(yīng)激損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)的E-Selectin、ICAM-1釋放作用。說明化合物I a是通過抑制E-Selectin、ICAM-1的釋放發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞-單核細(xì)胞粘附作用。
因此，特別地，本發(fā)明提供的化合物，包括中間體化合物可以用于制備治療動脈粥樣硬化性疾病的藥物。



圖1 7-二氟甲基-5，4’-取代烷氧基異黃酮類供試品對血管內(nèi)皮氧化損傷模型LDH活性的影響(圖中Ia、Ib、Ic、Id、Ie、If、Ig、Ih、IV、V的濃度均為1.0μmol/L)＊＊P＜0.01 vs H2O2損傷組； 圖2 7-二氟甲基-5，4’-取代烷氧基異黃酮類供試品對血管內(nèi)皮氧化損傷模型細(xì)胞凋亡的影響(圖中Ia、Ib、Ic、Id、Ie、If、Ig、Ih、IV、V的濃度均為1.0μmol/L)＊＊P＜0.01 vs H2O2損傷組； 圖3 7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮對HUVEC-12、THP-1細(xì)胞釋放LDH的影響，＊＊P＜0.01 vs H2O2損傷組； 圖4 7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮對HUVEC-12細(xì)胞增殖活性的影響(I a的濃度從左至右分別為0.1、0.3、1.0、3.0、10μmol/L) 圖5 7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮對氧化損傷HUVEC-12細(xì)胞生長的影響(I a的濃度從左至右分別為10、3.0、1.0、0.3、0.1μmol/L)； 圖6 7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮對氧化誘導(dǎo)HUVEC-12細(xì)胞凋亡的影響(I a的濃度從左至右分別為10、3.0、1.0、0.3、0.1μmol/L)＊＊P＜0.01 vs H2O2損傷組； 圖7 7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮對氧化誘導(dǎo)HUVEC-12細(xì)胞凋亡的影響； 圖8吖啶橙染色熒光顯微鏡觀察7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮對氧化誘導(dǎo)HUVEC-12細(xì)胞凋亡的影響(10×20倍)； 圖9 7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮對氧化誘導(dǎo)HUVEC-12細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響(I a的濃度從左至右分別為10、3.0、1.0、0.3、0.1μmol/L)； 圖10 7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮對氧化誘導(dǎo)HUVEC-12細(xì)胞活性氧形成的影響(I a的濃度從左至右分別為10、3.0、1.0、0.3、0.1μmol/L)＊＊P＜0.01 vsH2O2損傷組； 圖11熒光顯微鏡下觀察7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮對氧化誘導(dǎo)HUVEC-12細(xì)胞活性氧形成的影響(10×20倍)； 圖12熒光分光光度計檢測7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮對氧化誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞粘附的影響(I a的濃度從左至右分別為0.1、0.3、1.0、3.0、10μmol/L，A示洗脫血管內(nèi)皮細(xì)胞或單核細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，B示單核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附率(％))＊＊P＜0.01 vs H2O2損傷組，＊P＜0.05 vs H2O2損傷組 圖13 ELISA法檢測7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮對氧化誘導(dǎo)HUVEC-12細(xì)胞E-Selectin釋放的影響(I a的濃度從左至右分別為0.1、0.3、1.0、3.0、10μmol/L)； 圖14ELISA法檢測7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮對氧化誘導(dǎo)HUVEC-12細(xì)胞ICAM-1釋放的影響(I a的濃度從左至右分別為0.1、0.3、1.0、3.0、10μmol/L)。

具體實(shí)施例方式 下面是本發(fā)明所述7-二氟甲基-5，4’-烷氧基異黃酮(I)的制備的具體實(shí)施例，所述的實(shí)施例只是用來說明本發(fā)明，而不是用來限定本發(fā)明。
實(shí)施例1 7-二氟亞甲基-5，4’-二羥基異黃酮(化合物IV，V)的合成 在一個100mL的三口瓶中，加入5.4g(0.02mol)金雀異黃素(即化合物II)、40mL10％的NaOH水溶液，加熱到40℃時通入HCF2Cl(即化合物III)氣體，TLC跟蹤反應(yīng)(展開劑乙酸乙酯∶石油醚＝1∶4)，反應(yīng)24小時后，原料斑點(diǎn)不再變淺，放冷，用10％的鹽酸溶液調(diào)節(jié)至pH至5～6，用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯萃取液用無水硫酸鈉干燥，回收乙酸乙酯，殘余物用柱層析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶5)分離得到化合物IV(收率31％)和化合物V(收率23％)。
實(shí)施例2 7-二氟亞甲基-5，4’-二羥基異黃酮(化合物IV，V)的合成 將27g(0.1mol)化合物l、100mL 10％的NaOH水溶液與200mL二氧六環(huán)混合后加入一個密閉的反應(yīng)釜，通入HCF2Cl氣體并密閉反應(yīng)釜，加熱到70℃攪拌反應(yīng)，TLC跟蹤，反應(yīng)10小時后，原料基本消失，放冷，倒入水中，過濾，水層用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯萃取液無水Na2SO4干燥，回收乙酸乙酯，殘余物用柱層析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶5)分離得到化合物IV(收率42％)和化合物V(收率27％)。
化合物IV；
m.p.194-195℃.MS(EI，70ev)m/z320(M+，100.00)，319(27.42)，203(22.57)，118(18.14)，321(17.72)，202(7.10)，89(5.25)，51(4.90)；IRυmax(cm-1，KBr)1448，1519，1662(C＝O)，3319，3528(OH)；1H NMR(300MHz，CDCl3)6.599(1H，d，J＝2.4Hz)，6.820(2H，d，J＝12.0Hz)，6.867(1H，d，J＝2.4Hz)，7.371(2H，d，J＝12.0Hz)，7.427(1H，t，J＝72.9Hz)，8.244(1H，s)，9.550(1H，s)，12.994(1H，s)；19F NMR(282MHz)-84.372(d，J＝72.9Hz).Anal.Calcd.for C16H10F2O5C，60.08，H，3.15；Found C，60.07，H，2.94. 化合物V
m.p.103-106℃.MS(EI，70ev)m/z370(M+，100.00)，253(50.40)，369(26.68)，202(22.67)，371(18.52)，118(11.40)，155(10.85)，174(10.81)；IR υmax(cm-1，KBr)1430，1448，1498，1653(C＝O)，3074(OH)；1H NMR(300MHz，CDCl3)6.561(1H，t，J＝73.8Hz)，6.590(1H，d，J＝2.4Hz)，6.638(1H，t，J＝72.3Hz)，6.684(1H，d，J＝2.4Hz)，7.229(2H，d，J＝9.0Hz)，7.551(2H，d，J＝9.0Hz)，7.975(1H，s)；19FNMR(282MHz)-80.953(d，J＝73.8Hz)，-82.414(d，J＝72.3Hz).Anal.Calcd.for C17H10F4O5C，55.31，H，2.74；Found C，55.40，H，2.53. 實(shí)施例3 7-二氟亞甲基-5，4’-二甲氧基金雀異黃素(化合物I a)的合成 在一個100mL的園底燒瓶中，加入320mg(1mmol)7-二氟亞甲基金雀異黃素(化合物IV)、710mg(5mmol)CH3I與414mg(3mmol)碳酸鉀混合，加入丙酮50ml，回流反應(yīng)，TLC跟蹤反應(yīng)(展開劑乙酸乙酯∶石油醚＝1∶7)，反應(yīng)8小時后，原料斑點(diǎn)消失，放冷，過濾，回收丙酮，殘余物用柱層析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶7)分離得到化合物Ia，收率92.7％。
實(shí)施例4 7-二氟亞甲基-5，4’-二甲氧基金雀異黃素(化合物I a)的合成 在一個100mL的園底燒瓶中，加入100mg(0.3mmol)7-二氟亞甲基金雀異黃素(化合物IV)、450mg(5mmol)CH3Br與690mg(5mmol)K2CO3混合，加入丙酮50mL，回流反應(yīng)12小時，過濾，回收丙酮，殘余物用柱層析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶7)分離得到化合物I a，收率84.2％。
實(shí)施例5 7-二氟亞甲基-5，4’-二甲氧基金雀異黃素(化合物I a)的合成 在一個100mL的燒杯中，加入960mg(3mmol)7-二氟亞甲基金雀異黃素(化合物IV)和50mL 5％的氫氧化鈉溶液，攪拌溶解，再加入1.3g(10mmol)硫酸二甲酯，室溫攪拌反應(yīng)24小時，有油狀物生成，用乙酸乙脂提取有機(jī)產(chǎn)物，乙酸乙脂提取液用無水硫酸鈉干燥，過濾，回收乙酸乙脂，殘余物用柱層析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶7)分離純化得到化合物I a，收率91.3％。
化合物I a
m.p.136-138℃.MS(EI，70ev)m/z348(M+，100.00)，347(41.07)，302(25.34)，349(19.45)，132(18.11)，319(15.70)，317(13.69)，331(11.19)；IR υmax(cm-1，KBr)1430，1469，1512，1580，1612，1637(C＝O)；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ3.84(3H，s)，3.97(3H，s)，6.55(1H，d，J＝2.0Hz，)，6.65(1H，t，J＝72.4Hz)，6.73(1H，d，J＝2.0Hz)，6.94(2H，d，J＝8.8Hz)，7.47(2H，d，J＝8.8Hz)，7.82(1H，s，)；19FNMR(282MHz)-82.150(d，J＝72.3Hz). 實(shí)施例6 7-二氟亞甲基-5，4’-二乙氧基金雀異黃素(化合物Ib)的合成 在一個100mL的園底燒瓶中，加入320mg(1mmol)7-二氟亞甲基金雀異黃素(化合物IV)、500mg(5mmol)CH3CH2Br與414mg(3mmol)碳酸鉀混合，加入丙酮50ml，回流反應(yīng)，TLC跟蹤反應(yīng)(展開劑乙酸乙酯∶石油醚＝1∶7)，反應(yīng)10小時后，原料斑點(diǎn)消失，放冷，過濾，回收丙酮，殘余物用柱層析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶7)分離得到化合物I b，收率76.5％。
化合物I bm.p.96-97℃.IRυmax(cm-1，KBr)1431，1476，1581，1613(C＝O)，1645，2874，2984；1H NMR(300MHz，CDCl3)1.386-1.572(6H，m)，4.023-4.181(4H，m)，6.525(1H，d，J＝2.4Hz)，6.628(1H，t，J＝72.6Hz)，6.699(1H，d，J＝2.4Hz)，6.931(2H，d，J＝8.4Hz)，7.436(2H，d，J＝8.4Hz)，7.780(1H，s)； 實(shí)施例7 7-二氟亞甲基-5，4’-二正丙氧基金雀異黃素(化合物I c)的合成 在一個100mL的園底燒瓶中，加入320mg(1mmol)7-二氟亞甲基金雀異黃素(化合物IV)、560mg(5mmol)CH3CH2CH2Br與414mg(3mmol)碳酸鉀混合，加入丙酮50ml，按實(shí)施例6方法操作，得到化合物I c，收率81.2％。
化合物IcIRυmax(cm-1，KBr)1436，1469，1513，1581，1614，1651(C＝O)，2880，2968；1H NMR(300MHz，CDCl3)0.972-1.120(4H，m)，1.157(3H，t，J＝7.5Hz)，1.223(3H，t，J＝7.5Hz)，3.987-4.164(4H，m)，6.643(1H，d，J＝2.4Hz)，6.761(1H，t，J＝72.6Hz)，6.807(1H，d，J＝2.4Hz)，7.053(2H，d，J＝9.0Hz)，7.547(2H，d，J＝9.0Hz)，7.886(1H，s)； 實(shí)施例8 7-二氟亞甲基-5，4’-二苯甲氧基金雀異黃素(化合物I d)的合成 在一個100mL的園底燒瓶中，加入320mg(1mmol)7-二氟亞甲基金雀異黃素(化合物IV)、513mg(3mmol)C6H5CH2Br與414mg(3mmol)無水碳酸鉀混合，加入甲苯50ml，回流反應(yīng)，TLC跟蹤反應(yīng)(展開劑乙酸乙酯∶石油醚＝1∶6)，反應(yīng)20小時后，原料斑點(diǎn)基本消失，放冷，過濾，回收甲苯，殘余物用柱層析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶6)分離得到化合物Id，收率86.1％。
化合物IdIRυmax(cm-1，KBr)1454，1513，1579，1614，1647(C＝O)，2926；1H NMR(300MHz，CDCl3)4.636(4H，s)，7.314-7.342(18H，m)； 實(shí)施例9 7-二氟亞甲基-5，4’-二正庚氧基金雀異黃素(化合物I e)的合成 取一個100mL的園底燒瓶，安裝電磁攪拌、回流冷凝管和干燥管，加入320mg(1mmol)7-二氟亞甲基金雀異黃素(化合物IV)、537mg(3mmol)1-溴正庚烷(C7H15Br)與204mg(3mmol)乙醇鈉，再加入干燥的二甲基甲酰胺50ml，100~110℃攪拌反應(yīng)，TLC跟蹤反應(yīng)(展開劑乙酸乙酯∶石油醚＝1∶6)，反應(yīng)24小時后，原料斑點(diǎn)基本消失，放冷，回收溶劑，殘余物用柱層析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶6)分離得到化合物Ie，收率72.4％。
化合物IeIRυmax(cm-1，KBr)1433，1469，1581，1614，1652(C＝O)，2859，2956；1H NMR(300MHz，CDCl3)0.906-2.016(26H，m)，3.950(2H，t，J＝6.6Hz)，4.047(2H，t，J＝6.6Hz)，6.512(1H，d，J＝2.1Hz)，6.648(1H，d，J＝2.1Hz)，6.764(1H，t，J＝72.9Hz)，6.893(2H，d，J＝9.0Hz)，7.412(2H，d，J＝9.0Hz)，7.759(1H，s)； 實(shí)施例10 7-二氟亞甲基-5，4’-二正辛氧基金雀異黃素(化合物If)的合成 取一個100mL的園底燒瓶，安裝電磁攪拌、回流冷凝管和干燥管，加入320mg(1mmol)7-二氟亞甲基金雀異黃素(化合物IV)、573mg(3mmol)1-溴正辛烷(C8H17Br)與204mg(3mmol)乙醇鈉，再加入干燥的二甲基甲酰胺50ml，100~110℃攪拌反應(yīng)，TLC跟蹤反應(yīng)(展開劑乙酸乙酯∶石油醚＝1∶6)至原料斑點(diǎn)基本消失，放冷，回收溶劑，殘余物用柱層析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶6)分離得到化合物If，收率69.5％。
化合物IfIRυmax(cm-1，KBr)1435，1467，1512，1569，1611，1651(C＝O)，2858，2929；1H NMR(300MHz，CDCl3)0.860-1.218(30H，m)，3.985-4.064(4H，m)，6.378(1H，d，J＝2.1Hz)，6.423(1H，d，J＝2.1Hz)，6.531(1H，t，J＝74.1Hz)，7.155(2H，d，J＝8.7Hz)，7.543(2H，d，J＝8.7Hz)，7.748(1H，s)； 實(shí)施例11 7-二氟亞甲基-5，4’-二正癸氧基金雀異黃素(化合物Ig)的合成 取一個100mL的園底燒瓶，安裝電磁攪拌、回流冷凝管和干燥管，加入320mg(1mmol)7-二氟亞甲基金雀異黃素(化合物IV)、573mg(3mmol)1-溴正癸烷(C10H21Br)與204mg(3mmol)乙醇鈉，再加入干燥的二甲基甲酰胺50ml，按照實(shí)施例10操作，得到化合物Ig，收率62.9％。
化合物Ig；m.p.60-62℃.IRυmax(cm-1，KBr)1658(C＝O)；1H NMR(300MHz，CDCl3)0.848-1.783(38H，m)，3.966(2H，t，J＝6.6Hz)，4.040(2H，t，J＝6.6Hz)，6.513(1H，d，J＝2.1Hz)，6.627(1H，t，J＝72.3Hz)，6.674(1H，d，J＝2.1Hz)，6.925(2H，d，J＝8.4Hz)，7.423(2H，d，J＝8.4Hz)，7.753(1H，s) 實(shí)施例12 7-二氟亞甲基-5，4’-二異丁氧基金雀異黃素(化合物Ih)的合成 在一個100mL的園底燒瓶中，加入320mg(1mmol)7-二氟亞甲基金雀異黃素(化合物IV)、548mg(4mmol)(CH3)2CHCH2Br與690mg(5mmol)無水碳酸鉀混合，加入丙酮50ml，吡啶3~5滴，回流反應(yīng)，TLC跟蹤反應(yīng)(展開劑乙酸乙酯∶石油醚＝1∶7)，反應(yīng)18小時后，原料斑點(diǎn)基本消失，放冷，過濾，回收丙酮，殘余物用柱層析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶7)分離得到化合物I h，收率79.2％。
化合物IhIRυmax(cm-1，KBr)1439，1472，1513，1579，1628，1650，2876，2963；1H NMR(300MHz，CDCl3)0.809-11.057(12H，m)，2.176-2.198(2H，m)，3.759(2H，d，J＝6.6Hz)，3.783(2H，d，J＝6.6Hz)，6.568(1H，d，J＝2.4Hz)，6.627(1H，t，J＝72.9Hz)，6.656(1H，d，J＝2.4Hz)，6.984(2H，d，J＝9.0Hz)，7.446(2H，d，J＝9.0Hz)，7.941(1H，s)。
下述實(shí)施例中人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelialcells，HUVEC-12，編號CRL-2480)引自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所(來源于ATCC細(xì)胞庫)。人單核細(xì)胞(THP-1)購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。
實(shí)施例13 7-二氟甲基-5，4’-取代烷氧基異黃酮對血管內(nèi)皮氧化損傷模型LDH活性的影響 7-二氟甲基-5，4’-取代烷氧基異黃酮類化合物的不同濃度組(10、1.0、0.1μmol/L)分別處理細(xì)胞24h后，用全自動生化儀測定H2O2(1.0mmol/L)孵育細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活性。結(jié)果顯示，H2O2孵育的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性明顯增高，由正常時的36.67±1.528U/L升高到110.67±4.041U/L，在所有的供試品中，7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮(Ia)降低H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞LDH活性增高最明顯，其抗血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷作用效價強(qiáng)度為先導(dǎo)物Genistein的100倍，且其呈劑量依賴性(見圖1)。
7-二氟甲基-5，4’-取代烷氧基異黃酮對血管內(nèi)皮氧化損傷模型細(xì)胞凋亡的影響。
表1、本發(fā)明化合物對血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷模型內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響(x±s)
＊＊P＜0.01 vs H2O2損傷組 PI染色流式細(xì)胞分析術(shù)結(jié)果顯示，H2O2孵育的內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率明顯增高，由正常時的3.64％增高到14.0％。所有供試品中，7-二氟甲基-5，4-二甲氧基異黃酮(Ia)降低H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用最明顯，Ia(0.1、1、10μmol/L)依次使細(xì)胞凋亡率降低到3.7％、3.37％、2.6％。其效果與Genistein(100μmol/L)相似(見表1，圖2)。
實(shí)施例14 7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷保護(hù)作用研究材料與方法 1.1材料 1.1.1藥品與試劑 RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基 美國Gibco公司 新生牛血清 中國杭州四季青生物工程材料有限公司 胰蛋白酶美國Amresco公司 過氧化氫(H2O2) 中國廣州金華大化學(xué)試劑有限公司 二甲基亞砜(DMSO)美國Amresco公司 維生素E(VitE) 美國Sigma公司 四甲基偶氮鹽(MTT) 美國Sigma公司 臺盼藍(lán) 美國Amresco公司 吖啶橙(AO) 美國Amresco公司 活性氧檢測試劑盒中國碧云天生物技術(shù)研究所 金雀異黃素(Genistein)，7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮由湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系合成和鑒定。
1.1.2儀器 超凈工作臺 中國蘇州凈化設(shè)備公司，YJ-875型 倒置顯微鏡 日本Olympus公司 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國SHEL-LAB公司 超低溫冰箱 日本SANYO公司 高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司，5804型 低溫高速離心機(jī) 中國上海安亭科學(xué)儀器廠 Heto-Holten冷水循環(huán)儀 丹麥Gyde Vomg 17-19 3450 Allerod Eppendorf加樣器德國Eppendorf公司 HANGPINC JA1003型皿式分析電子天平 上海天平儀器廠 全自動生化分析儀 日本日立公司 流式細(xì)胞儀 美國Beckerman counter EPICS-XL 酶聯(lián)免疫檢測儀 美國Bio-Tek公司，ELX-800型 熒光顯微鏡 日本Olympus公司 熒光分光光度計 美國PerkinElmer公司，LS45型 去離子水純化儀 德國USF E1GA公司 1.1.3細(xì)胞 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC-12，編號CRL-2480)引自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所(來源于ATCC細(xì)胞庫)。
人單核細(xì)胞(THP-1)購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。
1.2方法 1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC-12)，培養(yǎng)于含有10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO2及飽合濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25％胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，1-2天傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
人單核細(xì)胞(THP-1)，培養(yǎng)于含有10％新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO2及飽合濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3天傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 1、空白對照組棄原培養(yǎng)基并重新加入含1％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基 2、H2O2損傷組在含1％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中加入1mmol/L H2O2 3、溶媒對照組在加入1mmol/L H2O2前30min加入終濃度為0.01％的DMSO 4、先導(dǎo)化合物組在加入1mmol/L H2O2前30min加入100μmol/L genistein5、7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮組在加入1mmol/L H2O2前30min分別加入10、3.0、1.0、0.3、0.1μmol/L 7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮 6、陽性藥物對照組在加入1mmol/L H2O2前30min加入50μmol/L VitE 1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)活性測定 培養(yǎng)HUVEC-12至細(xì)胞融合率達(dá)80％左右時，棄原培養(yǎng)基，換含1％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)基中分別加入0、0.1、0.3、1.0、2.0、3.0mmol/L H2O2，孵育HUVEC-12細(xì)胞24h，收集培養(yǎng)液(每個樣本收集1ml置于EP管內(nèi))，用全自動生化分析儀測定LDH含量。
1.2.4PI染色FCM檢測細(xì)胞凋亡率 培養(yǎng)HUVEC-12至細(xì)胞融合率達(dá)80％左右時，棄原培養(yǎng)基，換含1％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)基中分別加入0、0.1、0.3、1.0、2.0、3.0mmol/L H2O2，孵育HUVEC-12細(xì)胞24h。收集細(xì)胞，0.25％胰蛋白酶消化后，用含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基吹打，制成單細(xì)胞懸液，1000rp/min，4℃離心5min。棄上清液，冷PBS重懸再離心，1000rp/min，4℃離心5min，如此重復(fù)兩次。用50ulPBS將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，移入冷70％乙醇1ml中固定，PI染色上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。
1.2.5MTT比色法測定血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期的HUVEC-12細(xì)胞，以6×104/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加180μL單細(xì)胞懸液，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，待細(xì)胞貼壁后按上述實(shí)驗(yàn)分組二處理細(xì)胞，每組設(shè)三個復(fù)孔，孵育24h，每孔加入MTT(5mg/mL)20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止，小心吸棄培養(yǎng)基上清，每孔加入DMSO100μL，震蕩10min使藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀(ELX-800型)在570nm波長處測定吸光度值(OD值)，并根據(jù)OD值，計算細(xì)胞增殖抑制率(IR)＝(空白組均值-實(shí)驗(yàn)組均值/空白組均值)×100％。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
1.2.6臺盼藍(lán)染色細(xì)胞計數(shù)法測定血管內(nèi)皮細(xì)胞成活率 取對數(shù)生長期的HUVEC-12細(xì)胞，以1×105/mL的密度接種于24孔培養(yǎng)板，每孔加1mL單細(xì)胞懸液，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，待細(xì)胞貼壁后按上述實(shí)驗(yàn)分組二處理細(xì)胞，每組設(shè)三個復(fù)孔。孵育24h后終止，用0.25％胰蛋白酶消化后，用DMEM培養(yǎng)基配成單細(xì)胞懸液，取9滴單細(xì)胞懸液與1滴0.4％的臺盼藍(lán)染液均勻混合后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞所呈現(xiàn)的顏色，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞由于其細(xì)胞膜完整，對臺盼藍(lán)拒染而不著色，折光性好。用10×物鏡觀察計數(shù)板四個大方格中的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞數(shù)＝四個大方格之和/4×104。按細(xì)胞成活率(％)＝實(shí)驗(yàn)組活細(xì)胞數(shù)/空白組活細(xì)胞數(shù)×100％，評價細(xì)胞活力。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
1.2.7吖啶橙染色熒光顯微鏡觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡 取對數(shù)生長期的HUVEC-12細(xì)胞，以1×105/mL接種于24孔培養(yǎng)板，每孔加1mL單細(xì)胞懸液，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，待細(xì)胞貼壁后按上述實(shí)驗(yàn)分組二處理細(xì)胞，每組設(shè)三個復(fù)孔。孵育24h后終止，用0.25％胰蛋白酶消化后，用DMEM培養(yǎng)基配成單細(xì)胞懸液，取25μL細(xì)胞懸液與2μL吖啶橙儲存液(0.1g/L吖啶橙/PBS)混勻，在室溫下孵育5min。再取10μL滴于載玻片上鋪勻，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的改變，并計數(shù)200個細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)，計算凋亡指數(shù)(％)＝凋亡細(xì)胞數(shù)/200×100％。
1.2.8活性氧的測定 培養(yǎng)HUVEC-12至細(xì)胞融合率達(dá)80％左右時，棄原培養(yǎng)基，換含1％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，同時按上述實(shí)驗(yàn)分組二處理細(xì)胞，繼續(xù)孵育24h。收集細(xì)胞，0.25％胰蛋白酶消化后，用無血清的DMEM培養(yǎng)基吹打，制成單細(xì)胞懸液，1000rp/min，離心5min。棄上清液，用1mL無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)入1mLEP管中，再用1000rp/min，離心5min。棄上清液，用稀釋好的DCFH-DA重懸細(xì)胞，每支EP管加入1mL，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106-2×107/ml，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20min后用無血清的DMEM培養(yǎng)基洗滌三次，然后上流式細(xì)胞儀檢測。其中作為陽性對照的EP管內(nèi)加入1μL陽性對照(Rosup，50mg/mL)，刺激30min后上流式細(xì)胞儀檢測。
2結(jié)果 2.17-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮對氧化誘導(dǎo)HUVEC-12細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放的影響 圖3可見H2O2孵育的血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性明顯增高，7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮呈濃度依賴性的降低H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞LDH的釋放，表明，7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮能夠拮抗過氧化氫對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。而對于單核細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性的測定結(jié)果表明，各組間無顯著性變化。
2.2MTT比色法測定血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制率 MTT比色法結(jié)果顯示，H2O2孵育24h的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性明顯下降，細(xì)胞相對抑制率高達(dá)73％，7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮能呈濃度依賴性的降低H2O2處理的細(xì)胞抑制率，其0.1、0.3、1.0、3.0、10μmol/L 7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮使H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞抑制率分別降低到67.9％、57.8％、50.7％、47.0％、39.3％，按等摩爾濃度計算，其作用強(qiáng)度為Genistein的100倍(見表3-1，圖4)。
表3-1、7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮對HUVEC-12細(xì)胞增殖活性的影響(x±s)

2.3臺盼藍(lán)染色細(xì)胞計數(shù)法測定7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮對氧化誘導(dǎo)HUVEC-12細(xì)胞生長的影響 圖5示，以空白對照組的成活率為100％作為對照，H2O2孵育細(xì)胞24h后，細(xì)胞成活率僅為7.89％。不同濃度的7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮與H2O2共同孵育細(xì)胞，呈濃度依賴性的提高H2O2孵育內(nèi)皮細(xì)胞成活率，0.1、0.3、1.0、3.0、10μmol/L7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮使其細(xì)胞成活率分別提高到39.47％、47.37％、52.63％、53.95％、78.95％。
2.4PI染色FCM檢測7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮對氧化誘導(dǎo)HUVEC-12細(xì)胞凋亡的影響 PI染色FCM檢測結(jié)果顯示，H2O2(1.0mmol/L)與內(nèi)皮細(xì)胞孵育24h后，明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(43.37±20.97％ vs 5.48±1.32％，p＜0.01)，7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮(0.1、0.3、1.0、3.0、10μmol/L)依次降低氧化誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其細(xì)胞凋亡率分別為22.33±7.97％、18.77±7.25％、15.81±12.07％、14.73±5.13％、5.35±0.89％，按等摩爾濃度計算，其作用強(qiáng)度為Genistein的10倍(見圖6、圖7)。
2.5吖啶橙染色熒光顯微鏡觀察7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮對氧化誘導(dǎo)HUVEC-12細(xì)胞凋亡的影響 吖啶橙染色熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)未經(jīng)H2O2處理的空白對照組細(xì)胞形態(tài)正常，胞核發(fā)出黃綠色均勻熒光，而H2O2損傷組細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變，可見核固縮、核碎裂及凋亡小體。7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮預(yù)處理后，凋亡細(xì)胞明顯減少，其凋亡指數(shù)呈濃度依賴性的降低，效果好于先導(dǎo)物Genistein(見圖8、圖9)。
2.6 7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮對氧化誘導(dǎo)HUVEC-12細(xì)胞活性氧形成的影響DCFH-DA激活熒光FCM測定結(jié)果表明，未經(jīng)H2O2處理的空白對照組細(xì)胞內(nèi)活性氧含量低，平均熒光強(qiáng)度只有6.57±1.07，而H2O2(1mmol/L)損傷24h后，細(xì)胞內(nèi)的活性氧急劇增加，平均熒光強(qiáng)度達(dá)13.00±1.90。7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮能有效降低氧化損傷內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量，其作用呈濃度依賴性(圖10、11)。
3.討論 許多研究顯示活性氧(reactiveosygenspecies，ROS)，即氧自由基及其衍生物與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[44，45，15，16]。例如，一定濃度的過氧化氫能誘導(dǎo)某些類型的細(xì)胞(如血管內(nèi)皮細(xì)胞、HL60細(xì)胞)凋亡，氧化的低密度脂蛋白可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，過氧亞硝基自由基可誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞凋亡等。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮(Ia)對過氧化氫與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共孵育24h后，ROS的增高和凋亡增加有顯著抑制作用，呈濃度依賴性。Ia(0.1μmol/L)的作用效果與先導(dǎo)化合物genistein(100μmol/L)相當(dāng)。說明Ia能通過其更強(qiáng)的抗氧化作用保護(hù)血管內(nèi)皮的氧化應(yīng)激損傷。
過氧化氫作為氧化應(yīng)激源處理細(xì)胞，低濃度就可引起細(xì)胞通透性增加，屏障功能低下和細(xì)胞增殖，但本實(shí)驗(yàn)MTT法和臺盼藍(lán)染色細(xì)胞計數(shù)法檢測結(jié)果證實(shí)1.0mmol/L過氧化氫處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24h后，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長和增殖表現(xiàn)為抑制效應(yīng)。Ia能有效地降低氧化應(yīng)激損傷模型血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長增殖抑制作用，并與降低活性氧的程度平行。說明Ia能通過降低活性氧機(jī)制拮抗過度氧化應(yīng)激損傷所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制。
乳酸脫氫酶(LDH)活性是反映細(xì)胞功能的一個經(jīng)典指標(biāo)，LDH活性增高表明細(xì)胞功能受到損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)Ia能降低氧化應(yīng)激損傷血管內(nèi)皮LDH活性增高，提示Ia對血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用。
本實(shí)驗(yàn)通過MTT比色法和臺盼藍(lán)染色細(xì)胞計數(shù)法測定7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮(Ia)對氧化應(yīng)激損傷HUVEC增殖活性的影響，通過測定培養(yǎng)液上清乳酸脫氫酶活性，評價Ia對氧化應(yīng)激HUVEC細(xì)胞功能損傷的保護(hù)作用。采用吖啶橙染色熒光顯微鏡觀察和PI染色流式細(xì)胞計分析Ia對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)HUVEC凋亡的拮抗作用，激活熒光流式細(xì)胞計分析Ia對氧化應(yīng)激內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)活性氧的抑制作用。系統(tǒng)地研究候選藥物體外抗血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷作用。充分肯定7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮對血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用，呈濃度依賴性，其效價強(qiáng)度高于先導(dǎo)化合物genistein。
4.結(jié)論 1)7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮具有顯著抗氧化作用。
2)7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮對血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。
實(shí)施例15 7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮對氧化誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞-單核細(xì)胞粘附抑制作用研究 1方法 1.1細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC-12)，培養(yǎng)于含有10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO2及飽合濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25％胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，1-2天傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
人單核細(xì)胞(THP-1)，培養(yǎng)于含有10％新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO2及飽合濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3天傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
1.2實(shí)驗(yàn)分組 1、空白對照組棄原培養(yǎng)基并重新加入含1％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基 2、H2O2損傷組在含1％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中加入1mmol/L H2O2 3、溶媒對照組在加入1mmol/L H2O2前30min加入終濃度為0.01％的DMSO 4、先導(dǎo)化合物組在加入1mmol/L H2O2前30min加入100μmol/L genistein 5、7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮組在加入1mmol/LH2O2前30min分別加入10、3.0、1.0、0.3、0.1μmol/L7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮 6、陽性藥物對照組在加入1mmol/L H2O2前30min加入50μmol/L VitE 1.3熒光分光光度計檢測單核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附 取生長狀態(tài)良好的HUVEC-12細(xì)胞，以1×105/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加200μl單細(xì)胞懸液，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后棄原培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，每孔加入100μlTHP-1單細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為1×106/mL)，同時按上述實(shí)驗(yàn)分組二處理細(xì)胞，每組設(shè)三個復(fù)孔。置細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24h后，用100μL PBS洗孔三次，以除去未粘附細(xì)胞。將未粘附細(xì)胞收集于10mL離心管中，1000rp/min，離心5min，加入500μLPBS，每支離心管內(nèi)再加入40μL吖啶橙(25μl∶2μL)，室溫下孵育5min。1000rp/min，離心5min，PBS洗3遍，加2.5mlPBS重懸，上熒光分光光度計測定熒光強(qiáng)度，并計算粘附率(％)＝(純HUVEC-12細(xì)胞組熒光值+純THP-1細(xì)胞組熒光值-實(shí)驗(yàn)組熒光值)/(純HUVEC-12細(xì)胞組熒光值+純THP-1細(xì)胞組熒光值)×100％。
1.4ELISA法檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞E-Selectin、ICAM-1的表達(dá) 取對數(shù)生長期的HUVEC-12細(xì)胞，以1×104/mL接種于24孔培養(yǎng)板，每孔加1mL單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24h細(xì)胞融合率達(dá)80％左右時，棄原培養(yǎng)基，換無血清DMEM培養(yǎng)基，同時按上述實(shí)驗(yàn)分組二處理細(xì)胞。置細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，在無菌條件下將細(xì)胞培養(yǎng)液吸至1mL EP管內(nèi)，10000rp/min，4℃離心15min，再吸取上清液至另一新1mLEP管內(nèi)備用。根據(jù)ELISA試劑盒的檢測步驟逐步操作，再根據(jù)測定的樣品OD值繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，在曲線圖上查出相應(yīng)的E-Selectin、ICAM-1的含量。
2.結(jié)果 2.1熒光分光光度計檢測7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮對氧化誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞粘附的影響 熒光分光光度計檢測結(jié)果顯示，H2O2(1mmol/L)孵育血管內(nèi)皮細(xì)胞24h后，能顯著增加單核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，H2O2損傷組粘附率為80.92％，空白對照組的粘附率只有35.02％。7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮能有效抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的單核細(xì)胞-血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附，其粘附率呈濃度依賴性的降低(見圖12)。
2.2 ELISA法檢測7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮對氧化誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞E-Selectin、ICAM-1釋放的影響 圖13、14可見，血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)H2O2(1mmol/L)處理24h后，其E-Selectin、ICAM-1的釋放均較空白對照組有明顯增高，7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮對氧化誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞E-Selectin、ICAM-1的釋放有抑制作用，且其作用呈濃度依賴性。
3.討論 黏附分子是一類介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互作用的膜表面糖蛋白，廣泛分布于體內(nèi)，他們在胚胎的發(fā)育和分化、炎癥與免疫應(yīng)答、凝血與血栓形成及腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移等多種生理、病理過程中均具有重要作用[16，17]。動脈粥樣硬化病灶的發(fā)生發(fā)展是動脈壁細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、血液成分、環(huán)境及遺傳等諸多因素相互作用的結(jié)果，其中由黏附分子介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞和白細(xì)胞的黏附是動脈粥樣硬化早期特征和關(guān)鍵步驟。脂質(zhì)代謝紊亂、高血壓、糖尿病、吸煙等諸多危險因素使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，活化的內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)大量的黏附分子，主要有P-selectin、E-selectin、ICAM-1、VCAM-1、PECAM-1等。Sakai等[7]研究發(fā)現(xiàn)，新西蘭兔及遺傳性高脂血癥兔(WHHL)VCAM-1、P-selectin等黏附分子的表達(dá)隨著血脂水平升高逐漸增加，并且早于單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)斑塊內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM-1、VCAM-1和P-selectin，表達(dá)程度與內(nèi)膜下單核-巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞密度密切相關(guān)。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氧化應(yīng)激損傷內(nèi)皮細(xì)胞使血管內(nèi)皮-單核細(xì)胞的粘附率顯著增高，7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮(GEN-1)和先導(dǎo)化合物genistein及抗氧化劑Vit E均能有效抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮-單核細(xì)胞粘附。GEN-1(0.3μmol/L)與genistein(100μmol/L)和Vit E(50μmol/L)的抑制強(qiáng)度相當(dāng)。說明GEN的抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮-單核細(xì)胞粘附作用的效價強(qiáng)度高于genistein和Vit E。
我們通過ELISA法檢測培養(yǎng)液上清中黏附分子E-Selectin、ICAM-1的濃度進(jìn)一步證實(shí)過氧化氫處理血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子E-Selectin、ICAM-1的釋放增加，I a具有抑制氧化應(yīng)激損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)的E-Selectin、ICAM-1釋放作用。說明I a是通過抑制E-Selectin、ICAM-1的釋放發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞-單核細(xì)胞粘附作用。
4.結(jié)論 1)7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮(Ia)能有效抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮-單核細(xì)胞粘附。
2)7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基異黃酮(Ia)通過抑制E-Selectin、ICAM-1的表達(dá)和釋放發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞-單核細(xì)胞粘附作用。
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權(quán)利要求
1.具有如下結(jié)構(gòu)式(I)的化合物
其中R選自C1-C10烷基，芳基，C7-C12芳烷基，R`為HCF2，R``選自HCF2，C1-C10烷基，芳基，C7-C12芳烷基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R選自CH3，C2H5，n-C3H7，C6H5CH2，n-C7H15，n-C8H17，n-C10H21，iso-C4H9；R``選自HCFX，CH3，C2H5，n-C3H7，C6H5CH2，n-C7H15，n-C8H17，n-C10H21，iso-C4H9。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其中R，R``均為甲基。
4.制備權(quán)利要求1至3之一化合物的方法
1)將金雀異黃素(II)與化合物一氯二氟甲基(III)反應(yīng)生成7-二氟甲基-5，4’-二羥基異黃酮(IV)；
2)再將(IV)的羥基醚化得到7-二氟甲基-5，4’-二取代烷氧基異黃酮(化合物I)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于第1)步中溶劑為水溶性溶劑，并在堿性條件下進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于水溶性溶劑選自水，二氧六環(huán)、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、丙酮或其混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所用的堿為強(qiáng)堿，與反應(yīng)物金雀異黃素的比例為2～5∶1。
8.根據(jù)權(quán)利要求4至7之一中所述的制備方法，其特征在于第2)步在堿性條件下進(jìn)行，溶劑為惰性溶劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求5、6、7、8之一所述的制備方法，其特征在于所說的堿選自無機(jī)堿NaOH、KOH、K2CO3、Na2CO3，有機(jī)堿為甲醇鈉、乙醇鈉、三乙胺、吡啶。
10.根據(jù)權(quán)利要求4至9之一所述的制備方法，其特征在于羥基醚化劑選自溴甲烷、碘甲烷或硫酸二甲酯。
11.根據(jù)權(quán)利要求4至10之一所述的制備方法，其特征在于合成化合物IV的反應(yīng)溫度為0℃～70℃；反應(yīng)時間為6～36小時的條件；合成目標(biāo)化合物I的反應(yīng)溫度在40℃～140℃；反應(yīng)時間在4～24小時。
12.具有如下結(jié)構(gòu)的化合物，
其中R`為HCF2，R和R``為H原子。
13.權(quán)利要求1至3以及12之一的化合物在制備抗血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷藥物中的應(yīng)用。
14.權(quán)利要求1至3以及12之一的化合物在制備治療動脈粥樣硬化性疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種異黃酮類化合物。本發(fā)明還涉及該化合物的制備方法，以及該類化合物的醫(yī)藥用途。本發(fā)明提供具有如右結(jié)構(gòu)式(I)的化合物其中R選自C1-C10烷基，芳基，C7-C12芳烷基，R′為HCF2，R″選自HCF2，C1-C10烷基，芳基，C7-C12芳烷基。該化合物可以用于制備治療血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷性疾病以及動脈粥樣硬化的藥物。
文檔編號C07D311/34GK101225081SQ200710104389
公開日2008年7月23日 申請日期2007年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月17日
發(fā)明者符曉華, 曹建國, 向紅琳 申請人:湖南師范大學(xué)