專利名稱：：一種山豆根的有效組分及其制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種治療腫瘤疾病的中藥提取物，具體地說涉及從山豆根中提取的有效組分，制劑及其制備方法與用途。
背景技術(shù)：
：腫瘤是一種常見病、多發(fā)病，其中惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴重的一類疾病。目前業(yè)內(nèi)對惡性腫瘤的治療主要還是以手術(shù)、放療、化療為主，但許多化學抗癌藥物在作用于靶細胞時往往累及正常細胞，造成嚴重的副反應。植物藥的遺傳毒性不明顯，中草藥在抗癌抗突變方面有獨特的優(yōu)勢和廣闊的應用前景，而且中藥在對腫瘤的輔助治療中也起到不容忽視的作用。紫杉醇即是典型的從植物中獲得的具有良好抗癌活性的天然化合物，現(xiàn)已開發(fā)為抗腫瘤藥物。目前我國危害性最為嚴重的腫瘤為肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大腸癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、白血病及淋巴瘤等。特別是肝癌的發(fā)生率近年來有所增加。值得重視，這些腫瘤的病因?qū)W、發(fā)病學及其防治，均為我國腫瘤研究的重點。尋找高效低毒的抗癌藥物以及抗癌輔助藥物是當前腫瘤研究的重要內(nèi)容。我國藥用生物資源十分豐富，其生理活性物質(zhì)是研究和發(fā)現(xiàn)新藥先導化學物，開發(fā)新藥的天然寶庫。目前，我國從天然產(chǎn)物中提取活性物質(zhì)，用于開發(fā)成治療腫瘤疾病、安全性好、毒性低的新藥還很少，從天然產(chǎn)物中提取活性物質(zhì)，開發(fā)成具有抗腫瘤療效的新藥，具有重要應用價值和廣闊發(fā)展前景。山豆根為一清熱藥，別名廣豆根、苦豆根、山大豆根，藥用部位根，性味歸經(jīng)寒；苦；歸肺、胃經(jīng)，其功能主治為清熱解毒，消腫利咽。用于火毒蘊結(jié)，咽喉腫痛，齒齦腫痛。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種山豆根的有效組分。本發(fā)明的另一目的在于提供上述山豆根有效組分的制備方法。本發(fā)明還提供含有上述山豆根有效組分的制劑及該組分的用途。本發(fā)明的山豆根有效組分，其制備過程包括以下步驟步驟1:用乙酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對山豆根進行提取，步驟2:提取液經(jīng)過色譜柱層析得洗脫液；步驟3:用制備液相色譜梯度洗脫得到的洗脫液，流動相為水和乙腈，收集36.0-40.0分鐘洗脫液得到有效組分(或稱為C09)。其中步驟l中所述乙酸乙酯和乙醇的混合物，兩者的比例為乙酸乙酯乙醇=1-5:1-5，優(yōu)選為乙酸乙酯乙醇=1-2:1-2，最優(yōu)選為乙酸乙酯乙醇=1:1。所述步驟中，步驟l具體為取山豆根藥材，以乙酸乙酯乙醇=1-5:1-5為溶劑，回流提取，將提取液與藥渣分離，分離后得到的提取液為提取物l，步驟2具體為將提取物l過正相硅膠柱，先用石油醚乙酸乙酯=47-53:1作為流動相洗脫，然后改換氯仿甲醇8-13:1作為流動相，得洗脫液，步驟3具體為用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的洗脫液，流動相為水-A和乙腈-B，進行梯度洗脫，流速為9-11ml/min，柱溫為室溫，收集36.0-40.0分鐘洗脫液得到有效組分。步驟3中所述梯度洗脫程序如下表1洗脫梯度表Time—)_A(%)_B(%)08020480201950505459564595流速為10ml/min，柱溫為室溫；樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時間段36.0-40.0分鐘收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。本發(fā)明優(yōu)選的山豆根有效組分制備方法，包括下列步驟將山豆根藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1:0.8-1.2)，加熱回流0.8-1.2小時，提取1-3次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(47-53:l)作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇(8-13:1)作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為9-11ml/min，柱溫為室溫。本發(fā)明最優(yōu)選的山豆根有效組分制備方法，包括下列步驟將山豆根藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(l:l)，加熱回流l小時，提取2次，合并濾液得提取液；將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(50:1)作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇(10:1)作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱(ZorbaxSB-C18;2L2mmx250國)，流動相為水(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序如下<table>complextableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>流速為10ml/min，柱溫為室溫；樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時間段36.0-40.0分鐘收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。本發(fā)明36.0-40.0分鐘收集的有效組分成分如下表表2成分表<table>complextableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本發(fā)明還提供用本發(fā)明的中藥有效組分作為藥物活性成分制備成的藥物組合物，本發(fā)明的藥物組合物，包括有效組分，根據(jù)需要該組合物還可以加入藥物可接受的載體。本發(fā)明的組合物，是單位劑量的藥物制劑形式，所述單位劑量形式是指制劑的單位，如片劑的每片，膠囊的每粒膠囊，口服液的每瓶，顆粒劑每袋等。本發(fā)明的組合物其中的有效組分，其在制劑中所占重量百分比可以是0.1-99.9%，其余為藥物可接受的載體。本發(fā)明的組合物，通過將上述有效組分和藥物可接受的載體混合制備得到。本發(fā)明的組合物，其藥物制劑形式可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液齊U、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、貼劑。本發(fā)明的制齊U，優(yōu)選的是口服劑型，如膠囊劑、片劑、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑、丹劑、膏劑等。本發(fā)明的組合物，其口服給藥的制劑可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調(diào)味劑和濕潤劑，必要時可對片劑進行包衣。適用的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類似的填充劑。適宜的崩解劑包括淀粉、聚乙烯吡咯垸酮和淀粉衍生物，例如羥基乙酸淀粉鈉。適宜的潤滑劑包括，例如硬脂酸鎂。適宜的藥物可接受的濕潤劑包括十二垸基硫酸鈉?？赏ㄟ^混合，填充，壓片等常用的方法制備固體口服組合物。進行反復混合可使活性物質(zhì)分布在整個使用大量填充劑的那些組合物中?？诜后w制劑的形式例如可以是水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑，或者可以是一種在使用前可用水或其它適宜的載體復配的干燥產(chǎn)品。這種液體制劑可含有常規(guī)的添加劑，諸如懸浮劑，例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨醇一油酸酯或阿拉伯膠；非水性載體(它們可以包括食用油)，例如杏仁油、分餾椰子油、諸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐劑，例如對羥基苯甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常規(guī)的香味劑或著色劑。對于注射劑，制備的液體單位劑型含有本發(fā)明的活性物質(zhì)和無菌載體。根據(jù)載體和濃度，可以將此化合物懸浮或者溶解。溶液的制備通常是通過將活性物質(zhì)溶解在一種載體中，在將其裝入一種適宜的小瓶或安瓿前過濾消毒，然后密封。輔料例如一種局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑也可以溶解在這種載體中。為了提高其穩(wěn)定性，可在裝入小瓶以后將這種組合物冰凍，并在真空下將水除去。本發(fā)明的組合物，在制備成藥劑時可選擇性的加入適合的藥物可接受的載體，所述藥物可接受的載體選自甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素C、EDTA二鈉、EDTA鈣鈉，一價堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、e—環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。本發(fā)明的組合物在使用時根據(jù)病人的情況確定用法用量，可每日服三次，每次1-20劑，如1-20袋或?；蚱?。本發(fā)明還提供本發(fā)明的中藥有效組分和藥物組合物在抗腫瘤方面的應用。以下為抗腫瘤藥理實驗的數(shù)據(jù)對36.0-40.0分鐘段組分的活性篩選，在細胞水平上檢測有效組分對多種腫瘤細胞的生長抑制作用?；钚院Y選在細胞水平上檢測有效組分對多種腫瘤細胞的生長抑制作用。細胞株HL-60腫瘤細胞樣品配制根據(jù)所稱量的藥品的重量，加入相應體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心?？蓛Υ?20。C。細胞培養(yǎng)使用RPMI1640(Gibco)[添加2g/L碳酸氫鈉]90%，胎牛血清(四季青)10n/。混合培養(yǎng)HL60細胞，密度需低于106個/mL。實驗方法1種板(1)計算需要細胞總量NT=pcellTnL-lxVT(p=2x104個/mL)，其中VT=0.1mLx孔數(shù)+細胞槽剩余量。(2)吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取10mL，加10pL胎盤藍稀釋，計算計數(shù)板上活細胞數(shù)總數(shù)NL，則離心管中的細胞數(shù)N為:NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。(3)離心(900rad/min,10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液VImL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2-NT/NxVl。(4)在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入150pL。(5)種板后選取4孔加入200/iL培養(yǎng)液作為空白對照，剩余孔加入200/iLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。a)加藥在新的96孔板中加入220AiL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88/iL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入50/iL,此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50ng/mL。孵育48h。每個濃度設4個平行復孔，每板設陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200/iL的培養(yǎng)液，將吸取0.88/xLDMSO加入混勻)，及陽性對照組(順鉬終濃度4pg/mL)。b)SRB染色細胞培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)板，每孔加入40%(質(zhì)量/體積)的三氯乙酸(TCA)100uL固定細胞，室溫放置5min，4'C冰箱中放置1h。培養(yǎng)板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA。在空氣中干燥后，每孔加0.4%的SRB100uL(1%色譜純乙酸溶解)，室溫下放置20min，棄去各孔內(nèi)液體后用1%乙酸洗滌5遍，去除未結(jié)合的染料，空氣中干燥后用10mmol/LTrisl50nL/孔溶解，振蕩5min，使用酶標儀(ELx800)測定，所用波長為490nm。4抑制率的計算抑制率按如下公式計算鵬摔(％)=藥物歸-空白歸x濕陰性對照組」值一空白組^值藥效結(jié)果見表3。根據(jù)HL-60腫瘤細胞抑制率結(jié)果，山豆根C09有效組分對抑制HL-60腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。表3，HL-60腫瘤細胞抑制率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>細胞株K562腫瘤細胞樣品配制根據(jù)所稱量的藥品的重量，加入相應體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心?？蓛Υ?20°<:。細胞培養(yǎng)使用RPMI1640(Gibco)[添加2g/L碳酸氫鈉]90。/。，小牛血清(賽樂)10%,非必需氨基酸(Gibco)ln/?；旌吓囵B(yǎng)K562細胞。實驗方法1種板(1)計算需要細胞總量NT二pcellnnL-lxVT0^8xi03個/mL)，其中VT=0.1mLx孔數(shù)+細胞槽剩余量。(2)吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取10pL，加10pL胎盤藍稀釋，計算計數(shù)板上活細胞數(shù)總數(shù)NL，則離心管中的細胞數(shù)N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。(3)離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液VImL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2-NT/NxVl。(4)在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100pL，孵育24h。(5)種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對照，剩余孔加入100pLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。2加藥(1)96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150/iL。(2)在新的96孔板中加入220/iL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88/iL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入50/iL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50jug/mL。孵育48h。每個濃度設4(2)個平行復孔，每板設陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200/xL的培養(yǎng)液，將吸取0.88mLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿霉素終濃度4ptg/mL)。3SRB染色細胞培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)板，每孔加入40。/。(質(zhì)量/體積)的三氯乙酸(TCA)70uL固定細胞，4'C冰箱中放置1h。培養(yǎng)板各孔用去離子水洗潘5遍，以去除TCA。在空氣中干燥后，每孔加0.4%的SRB100uL(1%色譜純乙酸溶解)，室溫下放置20min，棄去各孔內(nèi)液體后用1%乙酸洗滌5遍，去除未結(jié)合的染料，空氣中干燥后用1Ommol/LTrisl50uL/孔溶解，振蕩5min，使用酶標儀(ELx800)測定，所用波長為490nm。4抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=藥畫-空畫x醒陰性對照組力值一空白組/(值藥效結(jié)果見表4。根據(jù)K562腫瘤細胞抑制率結(jié)果，山豆根C09有效組分對抑制K562腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。表4，K562腫瘤細胞抑制率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>藥理模型MCF-7腫瘤細胞細胞培養(yǎng)與種板細胞培養(yǎng)使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，小牛血清(賽樂)10%，非必需氨基酸(Gibco)1%混合培養(yǎng)MCF-7細胞。計算需要細胞總量NT-pcellnnL-lxVT(p=2xl03個/mL)，其中VT=0.1mLx孔數(shù)+細胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取10mL，加10ML胎盤藍稀釋，計算計數(shù)板上活細胞數(shù)總數(shù)NL,則離心管中的細胞數(shù)N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液VlmL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2二NT/NxVl。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100/iL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對照，剩余孔加入100/xLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案山豆根C09有效組分根據(jù)所稱量的藥品的重量，加入相應體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心?？蓛Υ?20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150/iL。在新的96孔板中加入220/xL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88/iL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入50piL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50pg/mL。孵育48h。每個濃度設4(2)個平行復孔，每板設陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200/xL的培養(yǎng)液，將吸取0.88/xLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿霉素終濃度4pg/mL)。MTT比色法測定取出培養(yǎng)板，去處每孔上清，加入培養(yǎng)液一MTT混合溶液(培養(yǎng)液MTT溶液二10:1)100^L，孵育4h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150/iL的DMSO，振蕩10min，550nm酶標儀(Ebc800)測定。抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=藥物歸-空白歸x靈陰性對照組^值一空白組^值藥效結(jié)果見表5。根據(jù)MCF-7腫瘤細胞抑制率結(jié)果，山豆根C09有效組分對抑制MCF-7腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>藥理模型KB腫瘤細胞細胞培養(yǎng)與種板細胞培養(yǎng)使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，小牛血清(賽樂)10%，非必需氨基酸(Gibco)1。/?；旌吓囵B(yǎng)KB細胞。計算需要細胞總量NT-pcell'mL-lxVT(/^2xl03個/mL)，其中VTM).lmLx孔數(shù)+細胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取10pL，加10ML胎盤藍稀釋，計算計數(shù)板上活細胞數(shù)總數(shù)NL，則離心管中的細胞數(shù)N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min),吸去上清液，加入培養(yǎng)液VlmL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2二NT/NxVl。在細胞槽中再加入vt-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，毎孔加入100mL,孵育24h。種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對照，剩余孔加入100;uLPBS,以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案山豆根C09有效組分根據(jù)所稱量的藥品的重量，加入相應體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心?？蓛Υ?2(TC。96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150/xL。在新的96孔板中加入220pL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88^iL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入50/iL，此時藥物稀釋IOOO倍，即終濃度為50/xg/mL。孵育48h。每個濃度設4(2)個平行復孔，每板設陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200/iL的培養(yǎng)液，將吸取0.88/iLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿霉素終濃度4Mg/mL)。MTT比色法測定取出培養(yǎng)板，去處每孔上清，加入培養(yǎng)液一MTT混合溶液(培養(yǎng)液MTT溶液-10:1)100pL,孵育4h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150/iL的DMSO,振蕩10min，550nm酶標儀(Elx800)測定。抑制率的計算抑制率按如下公式計算鵬摔(％)=藥物歸-空白鍾督/0陰性對照組^4值一空白組j值藥效結(jié)果見表6。根據(jù)KB腫瘤細胞抑制率結(jié)果，山豆根C09有效組分對抑制KB腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。表6，KB腫瘤細胞抑制率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>藥理模型HepG2腫瘤細胞細胞培養(yǎng)與種板細胞培養(yǎng)使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，胎牛血清(四季青)10%,非必需氨基酸(Gibco)1。/?；旌吓囵B(yǎng)HepG2細胞。計算需要細胞總量NT-pcellnnL-lxVT(/^2x103個/mL)，其中VT=0.1mLx孔數(shù)+細胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取10pL，加10ML胎盤藍稀釋，計算計數(shù)板上活細胞數(shù)總數(shù)NL，則離心管中的細胞數(shù)N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液VImL,吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2-NT/NxVl。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，毎孔加入100mL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對照，剩余孔加入100mLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案山豆根C09有效組分根據(jù)所稱量的藥品的重量，根據(jù)所稱量的藥品的重量，加入相應體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心。可儲存-20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150/iL。在新的96孔板中加入220^17孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88AtL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔毎孔加入50mL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50/ig/mL。孵育48h。每個濃度設4(2)個平行復孔，每板設陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200mL的培養(yǎng)液，將吸取0.88mLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿霉素終濃度4/xg/mL)。MTT比色法測定取出培養(yǎng)板，去處每孔上清，加入培養(yǎng)液一MTT混合溶液(培養(yǎng)液MTT溶液=10:1)IOOaiL，孵育4h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150/iL的DMSO，振蕩10min，550nm酶標儀(Elx800)測定。抑制率的計算抑制率按如下公式計算鵬摔(％)=藥物歸-空白組難督/0陰性對照組力值一空白組4直藥效結(jié)果見表7。根據(jù)HepG2腫瘤細胞抑制率結(jié)果，山豆根C09有效組分對抑制H印G2腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。表7，Hepg2腫瘤細胞抑制率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>本發(fā)明的有益效果為1.本發(fā)明的提取分離工藝中使用了正相硅膠柱，能有效地除去糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等雜質(zhì)，提高有效成分的含量，同時采用了制備色譜，能快速準確的得到有效成分。2.本發(fā)明提供的山豆根有效組分化學成分簡單明確，在藥理研究上更易于闡明其作用機制，在生產(chǎn)中更易于藥物的質(zhì)量控制。本發(fā)明提供的方法首次從山豆根藥材中得到含有C09有效組分，并首次將其在多種腫瘤細胞株上進行藥效篩選，由于成分確切，含量明確，制備工藝便捷，活性好，適宜開發(fā)成抗腫瘤中藥新藥。圖1為本發(fā)明山豆根有效組分的HPLC分析圖。具體實施例方式下面將結(jié)合本發(fā)明的實施例進一步詳細說明本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容，該實施例僅用于說明本發(fā)明而對本發(fā)明并沒有限制。實施例l山豆根有效組分的制備取山豆根藥材250g，將其粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(l:l)，加熱回流l小時，提取2次，濾液合并得提取液。將提取液濃縮成浸膏得9.8g,將浸膏和硅膠拌樣，用正相硅膠柱進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(50:1)作為流動相，得洗脫液I,然后改換氯仿和甲醇(10:1)作為流動相，得洗脫液II，濃縮干燥后得1.5g樣品。用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品。制備色譜的分離條件色譜柱為Agient制備柱(ZorbaxSB-U;21.2ramx250mm)，流動相為水(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序如下<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>流速為10ml/min，柱溫為室溫。樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時間段36.0-40.0分鐘收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分組分0.03g。實施例2山豆根有效組分的分析對實施例1的山豆根有效組分的HPLC-ELSD聯(lián)用分析色譜條件色譜柱AgilentZorbaxSB-C18柱(4.6mmX150mm,5um);采用梯度洗脫，流動相A相為0.2呢冰醋酸水溶液，流動相B相為含0.2y。冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序如下O分鐘時，流動相A為90%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為10%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；10分鐘時，流動相A為50%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為50。/。的0.2。/。冰醋酸的乙腈溶液；30分鐘時，流動相A為5%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為95%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；35分鐘時，流動相A為5%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為95%的0.2%冰醋酸的乙腈。溶液流速0.5mL*min—';檢測波長全波長；柱溫30°C;ELSD條件漂移管溫度105°C;氮氣流速2.0L/min供試品溶液的制備稱取本發(fā)明有效組分，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。測定方法精密吸取供試品溶液，注入液相色譜儀，測定。實施例3山豆根有效組分制劑取實施例1的山豆根有效組分0.5g與10.5g聚乙二醇-6000混合均勻，加熱熔融，化料后移至滴丸滴灌中，藥液滴至6-8'C液體石蠟中，除油，制得滴丸400粒。實施例4山豆根有效組分制劑取實施例1的山豆根有效組分0.5g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸鈉0.9g和蒸餾水lml，上述組分混合均勻后，冷凍干燥，分裝500支，即得。實施例5山豆根有效組分制劑取降香油1.5g，加入到13ml飽和的羥丙基e-環(huán)糊精中，攪拌溶解，濾過，濾葉低溫干燥，的降香油和羥丙基e-環(huán)糊精的包合物粉末。除上述降香油合羥丙基e-環(huán)糊精的包合物粉末外，再取實施例i的山豆根有效組分o.5g、甘露醇5.5g、依地酸鈣鈉0.9g和蒸餾水2ml，上述組分混勻后，冷凍干燥，分裝300支，即得。實施例6山豆根有效組分的制備操作步驟同實施例l，條件改為乙酸乙酯和乙醇(1:5)，正相硅膠柱分離，首先用石油醚和乙酸乙酯47:l作為流動相，得洗脫液I，然后改換氯仿和甲醇(8:1)作為流動相。實施例7山豆根有效組分的制備操作步驟同實施例l，條件改為乙酸乙酯和乙醇(5:1)，正相硅膠柱分離，首先用石油醚和乙酸乙酯53:l作為流動相，得洗脫液I，然后改換氯仿和甲醇(13:1)作為流動相。實施例8山豆根有效組分的制備操作步驟同實施例l，條件改為乙酸乙酯和乙醇(1:2)，正相硅膠柱分離，首先用石油醚和乙酸乙酯47:l作為流動相，得洗脫液I，然后改換氯仿和甲醇(8:1)作為流動相。實施例9山豆根有效組分的制備操作步驟同實施例l，條件改為乙酸乙酯和乙醇(2:1)，正相硅膠柱分離，首先用石油醚和乙酸乙酯53:l作為流動相，得洗脫液I，然后改換氯仿和甲醇(13:1)作為流動相。權(quán)利要求1、一種山豆根有效組分，其特征在于，其制備過程包括以下步驟步驟1用乙酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對山豆根進行提取，步驟2提取液經(jīng)過色譜柱層析得洗脫液；步驟3用制備液相色譜梯度洗脫得到的洗脫液，流動相為水和乙腈，收集36.0-40.0分鐘洗脫液得到有效組分。2、權(quán)利要求1的有效組分，其特征在于，步驟1中所述乙酸乙酯和乙醇的混合物，兩者的比例為乙酸乙酯乙醇=1-5:1-5。3、權(quán)利要求1的有效組分，其特征在于，步驟1中所述乙酸乙酯和乙醇的混合物，兩者的比例為乙酸乙酯乙醇=1-2:1陽2。4、權(quán)利要求1的有效組分，其特征在于，步驟1中所述乙酸乙酯和乙醇的混合物，兩者的比例為乙酸乙酯乙醇=1:1。5、權(quán)利要求l的有效組分，其特征在于，所述步驟中，步驟l為取山豆根藥材，以乙酸乙酯:乙醇=1-5:1-5為溶劑，回流提取，將提取液與藥渣分離，分離后得到的提取液為提取物l，步驟2為將提取物l過正相硅膠柱，先用石油醚乙酸乙酯=47~53:1作為流動相洗脫，然后改換氯仿甲醇8~13:1作為流動相，得洗脫液，步驟3為用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的洗脫液，流動相為水-A和乙腈-B，進行梯度洗脫。6、權(quán)利要求5的有效組分，其特征在于，所述梯度洗脫程序如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>流速為10ml/min，柱溫為室溫；樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時間段36.0-40.0分鐘收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。7、含有權(quán)利要求l-6任何一項有效組分的藥物組合物。8、權(quán)利要求1的有效組分的制備方法，其特征在于，其制備過程包括以下步驟:步驟1:用乙酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對山豆根進行提取，步驟2:提取液經(jīng)過色譜柱層析得洗脫液；步驟3:用制備液相色譜梯度洗脫得到的洗脫液，流動相為水和乙腈，收集28.1~33.9分鐘洗脫液得到有效組分。9、權(quán)利要求8的有效組分的制備方法，其特征在于，所述步驟中，步驟l為取山豆根藥材，以乙酸乙酯:乙醇=1-5:1-5為溶劑，回流提取，將提取液與藥渣分離，分離后得到的提取液為提取物l，步驟2為將提取物l過正相硅膠柱，先用石油醚乙酸乙酯=4753:1作為流動相洗脫，然后改換氯仿甲醇8~13:1作為流動相，得洗脫液，步驟3為用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的洗脫液，流動相為水-A和乙腈-B,梯度洗脫程序如下Time(min)_A(%)_B(%)08020480201950505459564595流速為10ml/min，柱溫為室溫；樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時間段36.0-40.0分鐘收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。10、權(quán)利要求9的有效組分的制備方法，其特征在于，步驟如下將山豆根藥材粉碎后加入乙酸乙酯乙醇=1:1，加熱回流l小時，提取2次，合并濾液得提取液；將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚乙酸乙酯=50:1作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿甲醇=10:1作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱ZorbaxSB-C18;21.2mmx250mm，流動相為水A和乙腈B，梯度洗脫程序如下_Time(min)_A(%)_B(%)_080204802019505054595_^_^_^_流速為10ml/min，柱溫為室溫；樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時間段36.0-40.0分鐘收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。全文摘要本發(fā)明涉及一種山豆根的有效組分及其制備方法與用途，本發(fā)明的山豆根有效組分，其制備過程包括以下步驟步驟1用乙酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對山豆根進行提取，步驟2提取液經(jīng)過色譜柱層析得洗脫液；步驟3用制備液相色譜梯度洗脫得到的洗脫液，流動相為水和乙腈，收集36.0-40.0分鐘洗脫液得到有效組分。文檔編號C07D311/36GK101347497SQ200710123268公開日2009年1月21日申請日期2007年7月20日優(yōu)先權(quán)日2007年7月20日發(fā)明者靂劉,強史,水文波,程翼宇,靜竇,葛志偉,慶賀,陽霍申請人:天津天士力制藥股份有限公司