專利名稱：利用結(jié)晶工序凈化5′-肌苷酸發(fā)酵液的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種5'-肌苷酸二鈉(IMP2Na)的凈化方法。具體地說，涉及一 種利用結(jié)晶工序從5'-肌苷酸(IMP)發(fā)酵液中凈化5'-肌苷酸二鈉鹽的方法。
背景技術(shù)：
IMP之類的嘌呤衍生物核苷酸在醫(yī)藥方面常被用作代謝障礙的預(yù)防治療 劑、生長促進劑、抗癌劑等的原料，在食品方面，常被用作調(diào)料等食品添加劑 的重要物質(zhì)。特別是，IMP作為食品的呈味成份，是一種天然存在于肉類、魚 類等食物中的物質(zhì)，可以通過魚肉提取法，RNA酶分解法，微生物發(fā)酵法， 發(fā)酵法與合成法的組合，RNA化學分解與合成的組合等方法生產(chǎn)。但，不論 是通過何種方法生產(chǎn)，其制品中都會含有色素類，糖類，氨基酸類，有機 酸類，無機鹽類等成份，因此，為了能夠獲得可用作食品添加劑的5'-肌苷酸 二鈉，就必須對其進行凈化，以將其中的不純物清除。
到目前為止，我們所知道的凈化方法有活性炭處理法，離子交換膜處理法， 電滲析法，沉淀法，強堿性陰離子交換樹脂法，強酸性陽離子交換樹脂法，強 酸性陽離子交換樹脂和弱堿性陰離子交換樹脂的混合法等。
根據(jù)原有技術(shù)，從微生物發(fā)酵液中凈化IMP的普遍的方法是，將發(fā)酵液 或者是通過薄膜過濾工序除去發(fā)酵液中的菌體的過濾液通過離子交換樹脂塔 除去離子性雜質(zhì)，然后，通過利用活性炭的脫色工序及結(jié)晶工序從而生成最終 的制品。但是，這種方法具有產(chǎn)生較多廢水/廢液，管理及操作比較復(fù)雜等缺 點。為了將其運用于產(chǎn)業(yè)規(guī)模上，需要從經(jīng)濟性及生產(chǎn)性的方面加以改進。
因此，本發(fā)明的發(fā)明人為了克服上述缺點，通過反復(fù)進行對根據(jù)離子交換 樹脂塔工序的IMP凈化工序進行改進的實驗，最終使工業(yè)方面的管理變得簡
單，并發(fā)現(xiàn)可以利用廢水/廢液產(chǎn)生量較少的結(jié)晶工序從而凈化發(fā)酵液中 IMP2Na，從而完成本發(fā)明。
發(fā)明所要實現(xiàn)的技術(shù)課題
本發(fā)明的目的在于提供一種5'-肌苷酸二鈉的凈化方法，即為了凈化IMP 生產(chǎn)微生物的發(fā)酵液中所包含的IMP，用結(jié)晶工序代替根據(jù)原有技術(shù)所使用的 離子交換樹脂工序，以使在凈化過程中廢水/廢液的產(chǎn)生量及酸、堿之類的化 學藥品的使用量大幅減少。

發(fā)明內(nèi)容
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種從微生物發(fā)酵液中凈化5'-肌苷酸二 鈉的方法，上述方法包括如下幾個歩驟
培養(yǎng)5'-肌苷酸生產(chǎn)菌株，然后將菌體去除，從而獲得含有5'-肌苷酸的發(fā) 酵液的步驟；
向上述發(fā)酵液中添加親水性有機溶媒，從而使5'-肌苷酸二鈉結(jié)晶化的步
驟；
將上述晶體再溶解，然后利用活性炭使其脫色的步驟；以及 將上述活性炭除去，然后將所得的過濾液結(jié)晶化的歩驟。 對于本發(fā)明來說，只要是用于發(fā)酵的菌株是生產(chǎn)IMP的菌株，則任何一 種菌株都可使用。優(yōu)選地，是頻繁用于IMP發(fā)酵的棒狀桿菌(Corynebacterium) 屬菌株。微生物的發(fā)酵條件并沒有特別的限制，優(yōu)選地，可以利用如下構(gòu)成的 培養(yǎng)基及發(fā)酵條件
以1L為標準，在包含葡萄糖46g，果糖30g，酵母提取物10g， KH2PCU 18g， K2HPO4 42g， 尿素6g， MgS04'7H20 10g，生物素30 /€，硫胺素 -HC1 5mg， pH在6 8的培養(yǎng)基18L中，培養(yǎng)溫度為30-32°C ，培養(yǎng)140小時 左右。
在根據(jù)本發(fā)明的一個實施例中，首先培養(yǎng)棒狀桿菌(Corynebacterium)屬菌 株，然后就可以獲得大約包含5%至10。/。的IMP的發(fā)酵液以供使用。 在培養(yǎng)5'-肌苷酸生產(chǎn)菌株之后，將菌體去除，從而獲得含有5'-肌苷酸的 發(fā)酵液。從微生物發(fā)酵液中除去菌體的歩驟可以從過濾，離心分離，以及熱處 理等工序中選擇而進行。
在根據(jù)本發(fā)明的一個實施例中，發(fā)酵液是通過薄膜過濾工序過濾后獲得 的。通過這種過濾工序，發(fā)酵液就被分離成為過濾液和菌體沉淀物。所使用的 薄膜過濾器只要是能夠?qū)⒕w從發(fā)酵液中分離的裝置，則任意一種過濾設(shè)備都 可使用。薄膜過濾器的工作條件也可以由相關(guān)操作人員按照能夠?qū)⒕w從發(fā)酵 液中分離的方式簡單地進行條件的設(shè)定。例如，可以事先將發(fā)酵液加熱到大約 40 50 'C，然后在發(fā)酵液的溫度大約為40 50°C，薄膜之間的壓力為(TMP) 1.2 1.5 atm的條件下進行。所使用的薄膜的孔隙(pore)的大小也可以由相關(guān)操 作人員簡單地進行選擇。
對于根據(jù)本發(fā)明的一個實施例來說，要將通過薄膜過濾工序所獲得的過濾 液進行干燥處理，以使其IMP的含量達到15 30%。這種干燥處理的過程是， 使過濾液中的水分的含量減少，從而使過濾液的整體體積減小的同時，使IMP 的含量相對增加的工序。干燥工序在相關(guān)行業(yè)內(nèi)是廣為熟知的。在干燥工序的 實例中包括減壓干燥。
在濃縮過程完成之后，向除去菌體后的發(fā)酵液中添加親水性有機溶媒，在 執(zhí)行結(jié)晶工序之前，對濃縮后的發(fā)酵液的pH進行調(diào)整。結(jié)晶析出是在生成5'-肌苷酸二鈉鹽的范圍，即，在pH 6 10的條件下生成。因此，就將發(fā)酵液的 pH調(diào)整到這一范圍內(nèi)。優(yōu)選地，將除去菌體后的發(fā)酵液的pH調(diào)整到7.5 9.5。
親水性有機溶媒，可以使用甲醇，乙醇，丙醇，異丙醇，或者是它們 的混合物。優(yōu)選地，使用可以使獲得理想的結(jié)晶形狀最適合于固液分離的甲醇。 另外，雖然也可以將所使用的有機溶媒用水進行稀釋后使用，但是，隨著稀釋 的比例的增加，溶媒的添加量也就隨之增加。從而在工業(yè)領(lǐng)域上，優(yōu)選地，將 溶媒的濃度范圍控制在80 100容積％。
在注入添加有機溶媒的過程中，可將溫度設(shè)定在50 80°C，優(yōu)選地，將 其設(shè)定在65il0'C。另外，在注入添加有機溶媒的過程中，可同時實施冷卻操 作等溫度變化。
當有機溶媒注入添加完成之后，雖然也可以立即實施固液分離操作，但是， 為了提高其收率，可以再包含冷卻歩驟。
在結(jié)晶析出時的液體狀態(tài)下，有機溶媒所占的比例(濃度)雖然可以為40 80容積％的范圍，但是，在工業(yè)領(lǐng)域上，為了確保其收率，優(yōu)選地，保持在 50容積％以上。
通過上述工序所獲得的結(jié)晶與原有技術(shù)的凈化肌苷酸二鈉方法一樣，根據(jù) 結(jié)晶質(zhì)量的不同，通過1次或者2次以上使用活性炭的脫色工序及結(jié)晶工序附 加，最終獲得肌苷酸二鈉制品，在這種情況下，結(jié)晶工序既可以使用親水性 有機溶媒，也可以利用濃縮/冷卻結(jié)晶法。
利用活性炭的脫色工序為，使通過上述結(jié)晶過程所獲得的結(jié)晶再溶解，然 后向其溶液投入活性炭，并攪拌一定的時間，當色素成份被活性炭吸附之后， 再將活性炭分離。
當投入活性炭之后，在對色素成份進行吸附期間，雖然可以將其溫度設(shè)定 在30 80°C，但是，最好是在50 7(TC的條件下進行操作。
使除去活性炭之后所獲得的過濾液結(jié)晶化的工序與上述結(jié)晶化過程一樣， 既可以使用親水性有機溶媒，也可以利用濃縮結(jié)晶法。
根據(jù)本發(fā)明的方法所獲得的IMP2Na最終結(jié)晶具有如下特性相對干燥重 量，IMP2Na含量為97.0 102.0%，水分為28.5%以下，pH (5%溶液)7.0 8.5。
具體實施例方式
下面，將通過本發(fā)明的實施例進行更加詳細的說明。但是，以下這些實施 例只是為對本發(fā)明進行詳細說明而列舉的示例，本發(fā)明的范圍并不只是局限于 這些實施例。
實施例l:利用通過親水性有機溶媒進行結(jié)晶化(l次 3次)的方法
在本實施例中，將含有IMP的發(fā)酵液6,000ml加熱至40°C，然后，在薄 膜之間的壓力(TMP)為0.5 3.0 atm的條件下，通過薄膜過濾器(Ceramic Filter Pilot :孔隙大小為0.1 /^1，面積為1.0 m。進行過濾，分離成菌體沉淀物與過濾 液。然后，將上述過濾液在真空度為680 mmHg，容器溫度為55 'C的條件下 進行減壓干燥，從而獲得IMP含量為25 %的濃縮液1,950 W，在將濃縮液的 pH調(diào)整到7.5之后，再將其注入到結(jié)晶析出管內(nèi)。然后，將95容積％甲醇水 溶液3,120^注入6個小時，在開始注入甲醇時，結(jié)晶析出管的溫度為70°C， 當甲醇注入添加完成時，結(jié)晶析出管的溫度為4CTC。當甲醇注入添加結(jié)束后， 再次將上述溶液冷卻至3(TC，然后，將結(jié)晶分離(第l次)。
將分離出來的結(jié)晶按照IMP濃度為30y。的比例再次溶解到去離子水(DIW: deionized water)中，然后，添加活性炭，并在保持其溫度為60°C的條件下攪拌 1小時，然后，將活性炭分離出來。
在將除去活性炭的過濾液2,190 ^注入到結(jié)晶析出管內(nèi)之后，保持其溫度 為55°C，然后，將95容積％甲醇水溶液1,752 n^注入3個小時。當甲醇注入 添加完成之后，將最終溶液冷卻至25t:，然后，將晶體分離出來(第2次)。
將分離出來的結(jié)晶按照IMP濃度為30%的比例再次溶解到去離子水中， 然后，再向其中添加活性炭，并在保持溫度為6(TC的條件下攪拌1小時，然 后，再將活性炭分離出來。
在將除去活性炭的過濾液866 mi注入到結(jié)晶析出管內(nèi)之后，保持其溫度為 60°C，然后，將95容積％甲醇水溶液866 W注入3個小時。當甲醇注入添加 結(jié)束之后，再將溶液冷卻至3(TC，并將結(jié)晶分離出來，然后，進行干燥處理(第 3次)。
在本實施例中最終所獲得的IMP2Na結(jié)晶，IMP含量為99.5%,水分為 22.7%， pH為7.6 (5%水溶液)，總重量為369.5g。
實施例2:利用通過親水性有機溶媒進行結(jié)晶化(1 2次)+濃縮/結(jié)晶化(3次)
的方法
在本實施例中，將含有IMP的發(fā)酵液3,卯0ml加熱至50°C，然后，在薄 膜之間的壓力(TMP)為0.5 3.0 atm的條件下，通過薄膜過濾器(Ceramic Filter Pilot :孔隙大小為0.1 "m，面積為1.0 nf)進行過濾，并將菌體沉淀物與過濾液 進行分離。然后，將上述過濾液在真空度為680 mmHg，容器溫度為55 °C的 條件下進行減壓干燥，從而獲得IMP含量為20 %的濃縮液2,430 ^，在將濃 縮液的pH調(diào)整到8.0之后，將其注入到結(jié)晶析出管內(nèi)。在開始注入甲醇時， 結(jié)晶析出管的溫度為65°C，當甲醇注入添加完成時，結(jié)晶析出管的溫度為 3(TC。當甲醇注入添加結(jié)束之后，將上述溶液冷卻至20°C，然后，再將晶體 分離出來(第1次)。
將分離出來的結(jié)晶按照IMP濃度為30%的比例再次溶解到去離子水中， 然后，再向其中添加活性炭，并在保持溫度為6(TC的條件下攪拌1小時，然 后，將活性炭分離出來。
在將除去活性炭的過濾液2,190 W注入到結(jié)晶析出管內(nèi)之后，保持其溫度 為45°C，然后，將95容積％甲醇水溶液1,970 r^注入3個小時。當甲醇注入 添加結(jié)束之后，再將溶液冷卻至3(TC，將結(jié)晶分離出來(第2次)。
將分離出來的晶體按照IMP濃度為30%的比例再次溶解到去離子水中， 然后，再向其中添加活性炭，并在保持溫度為6(TC的條件下攪拌1小時，然 后，將活性炭分離出來。
將除去活性炭的過濾液866 ^在真空度為680 mmHg，容器溫度為55 °C 的條件下進行減壓干燥處理，在將IMP濃度濃縮至68%之后，再將其注入到 結(jié)晶析出管內(nèi)，然后，以5個小時將其溫度冷卻至15'C，并將結(jié)晶分離出來， 然后，進行干燥處理(第3次)。
在本實施例中最終所獲得的IMP2Na結(jié)晶，IMP含量為101.0%，水分為 20.4 %，pH為7.9 (5%水溶液)，總重量為255.8g。
實施例3 :通過利用親水性有機溶媒進行結(jié)晶化(l次)+濃縮/結(jié)晶化(2 3 次)的方法
在本實施例中，將含有IMP的發(fā)酵液4,600ml加熱至5CTC，然后，在薄 膜之間的壓力(TMP)為0.5 3.0 atm的條件下，通過薄膜過濾器(Ceramic Filter Pilot:孔隙大小為0.1 /"m，面積為1.0 m0進行過濾，并將菌體沉淀物與過濾液 分離。然后，將上述過濾液在真空度為680 mmHg，容器溫度為55 'C的條件 下進行減壓干燥，從而獲得IMP含量為30 %的濃縮液1,010 ^，在將濃縮液 的pH調(diào)整到8.5之后，將其注入到結(jié)晶析出管內(nèi)。然后，將95容積％甲醇水 溶液1,515 W注入4個小時，在開始注入甲醇時，結(jié)晶析出管的溫度為75°C， 當甲醇注入添加完成時，結(jié)晶析出管的溫度為35°C。當甲醇注入添加結(jié)束之 后，再將上述溶液冷卻至25'C，將結(jié)晶分離出來(l次)。
將分離出來的結(jié)晶按照IMP濃度為30%的比例再次溶解到去離子水中， 然后，添加活性炭，并在保持溫度為6(TC的條件下攪拌1小時后，將活性炭 分離出來。
將除去活性炭的過濾液1,270 ^在真空度為680 mmHg，容器溫度為55 °C 的條件下進行減壓干燥處理，在將IMP濃度濃縮至68%之后，將其注入到結(jié) 晶析出管內(nèi)，然后，在4小時內(nèi)將其溫度冷卻至15C后，將晶體分離出來(第 2次)。
將分離出來的結(jié)晶按照IMP濃度為30%的比例再次溶解到去離子水中， 然后，添加活性炭，并在保持溫度為60。C的條件下攪拌1小時后，將活性炭 分離出來。
將除去活性炭的過濾液633 W在真空度為680 mmHg，容器溫度為55 °C 的條件下進行減壓干燥處理，在將IMP濃度濃縮至68%之后，將其注入到結(jié) 晶析出管內(nèi)，然后，以5個小時將其溫度冷卻至12°C，并將結(jié)晶分離出來， 然后，進行干燥處理(3次)。
在本實施例中最終所獲得的IMP2Na結(jié)晶，IMP含量為99.9%，水分為 16.8%， pH為7.8(5%水溶液)，總重量為179.7g。 有益效果
根據(jù)本發(fā)明從微生物發(fā)酵液中凈化IMP的方法，不需要進行離子交換樹 脂塔工序，僅通過結(jié)晶工序就可以生產(chǎn)出能夠作為食品添加劑使用的IMP2Na 制品，由于沒有經(jīng)過離子交換樹脂塔工序，從而可以使在凈化工序中廢液/廢 水的產(chǎn)生量及作為溶離劑/再生劑使用的酸、堿之類的化學藥品的使用量大幅 減少。
權(quán)利要求
1、一種從菌株發(fā)酵液中凈化5′-肌苷酸二鈉的方法，包括如下幾個步驟培養(yǎng)5′-肌苷酸生產(chǎn)菌株，然后將菌體去除，從而獲得含有5′-肌苷酸的發(fā)酵液的步驟；向上述發(fā)酵液中添加親水性有機溶媒，從而使5′-肌苷酸二鈉結(jié)晶化的步驟；將上述晶體再溶解，然后利用活性炭使其脫色的步驟；以及將上述活性炭除去，然后將所得的過濾液結(jié)晶化的步驟。
2、 如權(quán)利要求1所述的從菌株發(fā)酵液中凈化5'-肌苷酸二鈉的方法，其特征在于，上述除去菌體的步驟可以從過濾，離心分離，以及熱處理 等工序中選擇。
3、 如權(quán)利要求1所述的從菌株發(fā)酵液中凈化5'-肌苷酸二鈉的方法， 其特征在于，將上述除去菌體后的發(fā)酵液的pH調(diào)整到6 10。
4、 如權(quán)利要求3所述的從菌株發(fā)酵液中凈化5'-肌苷酸二鈉的方法， 其特征在于，上述去除菌體后的發(fā)酵液的pH被調(diào)整到7.5 9.5。
5、 如權(quán)利要求1所述的從菌株發(fā)酵液中凈化5'-肌苷酸二鈉的方法， 其特征在于，上述親水性有機溶媒可以從甲醇，乙醇，丙醇，異丙醇以 及它們的混合物中選擇一種以上的溶媒。
6、 如權(quán)利要求1所述的從菌株發(fā)酵液中凈化5'-肌苷酸二鈉的方法， 其特征在于，上述親水性有機溶媒為甲醇。
7、 如權(quán)利要求1所述的從菌株發(fā)酵液中凈化5'-肌苷酸二鈉的方法， 其特征在于，上述親水性有機溶媒的添加是在50 80。C的條件下進行的。
8、 如權(quán)利要求1所述的從菌株發(fā)酵液中凈化5'-肌苷酸二鈉的方法，其特征在于，當添加上述有機溶媒之后，還包括冷卻的步驟。
9、 如權(quán)利要求1所述的從菌株發(fā)酵液中凈化5'-肌苷酸二鈉的方法， 其特征在于，利用上述活性炭進行脫色步驟是在30 8(TC的條件下進行的。
10、 如權(quán)利要求1所述的從菌株發(fā)酵液中凈化5'-肌苷酸二鈉的方法， 其特征在于，利用上述活性炭進行脫色的步驟需要實施2次以上。
11、 如權(quán)利要求1所述的從菌株發(fā)酵液中凈化5'-肌苷酸二鈉的方法， 其特征在于，在除去上述活性炭之后對獲得的過濾液結(jié)晶化的步驟可以 利用有機溶媒或利用濃縮的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從通過微生物發(fā)酵生成的5′-肌苷酸(IMP)發(fā)酵液中凈化5′-肌苷酸二鈉(IMP2Na)的方法。本發(fā)明對原有凈化工序進行了改進，用結(jié)晶工序代替原來的離子交換樹脂塔工序，從而可以使廢水/廢液的產(chǎn)生量及酸、堿之類的化學藥品的使用量大幅減少。
文檔編號C07H1/06GK101109017SQ20071012948
公開日2008年1月23日 申請日期2007年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月19日
發(fā)明者俞載憲, 尹太相, 樸南燮, 李允宰, 李恩碩, 洪淳源, 金庾贐, 韓勝宇 申請人:Cj株式會社