專利名稱：一種重組奧曲肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種重組奧曲肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小分子多肽因其受體專一性強(qiáng)、易于合成和修飾、免疫反應(yīng)少、易穿透組織和血液 清除快等特性，近年來已成為核素靶向診斷和治療研究的熱點[1—3]。生長抑素 (somatostatin, SST)是一種在體內(nèi)循環(huán)的神經(jīng)肽，它作為一種腦神經(jīng)遞質(zhì)能夠抑制多 種激素的釋放[4—5]，如生長激素、胰島素、胰高血糖素、胃泌素等。生長抑素及其類似 物是迄今為止使用較成熟的一種小分子多肽，通過抵制信號傳導(dǎo)發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖作 用，奧曲肽(Octreotide)是生長抑素的類似物，是對天然生長抑素分子進(jìn)行修飾人工合 成的8肽，具有抑制神經(jīng)內(nèi)分泌功能[4—5，其生理活性較天然生長抑素高，其分子結(jié)構(gòu) 為D-苯丙氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-D-色氨酰-L-賴氨酰-L-蘇氨酰-L-半胱氨酰-L-蘇氨醇(2—7)環(huán)二硫化物(SEQIDNO.l)， 1,4位為D型氨基酸，8位為氨基醇，不 易被蛋白酶迅速水解，半衰期較天然生長抑素延長了30倍，約為1.7小時[6]，它主要抑 制生長激素、促甲狀腺素、胃腸道和胰腺分泌激素的病理性分泌過多，對實體腫瘤亦有 一定的抑制作用。腫瘤組織高表達(dá)生長抑素受體(SSTR)并且與Octreotide有著高度親 和力，使得小分子多肽介導(dǎo)核素靶向診斷和治療腫瘤發(fā)揮了潛能。
小分子多肽介導(dǎo)放射性核素靶向治療一方面可利用其多肽與腫瘤表面特異性受體 結(jié)合起到了抑制腫瘤生長的作用，另一方面可發(fā)揮核素的射線殺傷作用。目前已報導(dǎo)此 小分子多肽(Octreotide)在對非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、乳腺癌等的臨床研 究中取得了較好的抑瘤效果[7—1<3]。本課題組已采用99mTC-0Ctretide對胰腺癌、乳腺癌進(jìn) 行了顯像研究并和生長抑素受體表達(dá)水平作了相關(guān)性研究，結(jié)果表明99mTc-0Ctre0tide 對肺癌、胰腺癌、乳腺癌有較好的靶向顯像作用，腫瘤組織有較高的受體表達(dá)水平[11—14]。 但"mTc-Octreotide僅用于顯像，不能實現(xiàn)靶向性近距離照射腫瘤細(xì)胞的目的，因此不能 用于制備靶向治療的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組奧曲肽。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述重組奧曲肽的應(yīng)用。 本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)措施實現(xiàn)的
一種重組奧曲肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
編碼所述重組奧曲肽的核苷酸序列。
放射性同位素1311標(biāo)記的上述重組奧曲肽。
所述的重組奧曲肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
編碼所述的重組奧曲肽的核苷酸序列在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
所述的重組奧曲肽在制備靶向診斷試劑中的應(yīng)用。
編碼所述的重組奧曲肽的核苷酸序列在制備耙向診斷試劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明有益效果
本發(fā)明將奧曲肽分子中第三位上的L-苯丙氨酸置換為酪氨酸(簡寫為Tyr -Octreotide,下同)，所得的重組奧曲肽藥理作用與天然激素相似，其腫瘤靶向結(jié)合抑制 作用仍較強(qiáng)[6]，但便于多肽的碘化。觀察其在正常小鼠體內(nèi)的生物分布，了解藥物分布 及代謝動力學(xué)測定，進(jìn)行非小細(xì)胞肺癌荷瘤鼠模型SPECT顯像。SPECT核素顯像示腫 瘤部位有明顯的較高的放射性聚集，較對側(cè)正常肌肉組織放射性高，證實 131I-Tyr-Octreotide對腫瘤組織有著較高親和力。
本發(fā)明提供的"I-Tyr-Octreotide在小鼠體內(nèi)主要經(jīng)肝、腎系統(tǒng)代謝，血液清除快， 對腫瘤組織具有較好的親和力，可用于制備優(yōu)良的以生長抑素介導(dǎo)的生物靶向診斷和治 療的分子藥物。
本發(fā)明采用Ch-T氧化法將碘化物(Nal)氧化成碘分子，與酪氨酸殘基的羥基鄰位 發(fā)生碘化反應(yīng)，得到高效穩(wěn)定的放射性小分子多肽131I-Tyr-Octreotide,無需進(jìn)一步純化。 Ch-T法標(biāo)記率高，重復(fù)性好，方法簡便、迅速，試劑便宜易得，是目前使用較多的碘 標(biāo)記方法。


圖1是標(biāo)記不同量Tyr- Octreotide的膠體含量。 圖2是不同含量Tyr- Octreotide的標(biāo)記率。 圖3是pH值對標(biāo)記率的影響。 圖4是13lI-Tyr- Octreotide的體外穩(wěn)定性。
圖5是血藥濃度-時間曲線。其中方框內(nèi)的數(shù)據(jù)為血液中放射性藥物清除速度，顯 示速度快，背景干擾小。
圖6是1311- Tyr- Octreotide顯像示腫瘤部位放射性聚集。A-F依次為注射0.2mCi 131I-octreotide后ld、 2d、 4d、 6d、 8d、 2W非小細(xì)胞肺癌荷瘤鼠模型顯像，隨著時間的 延長腫瘤部位的放射性濃聚程度逐漸減低。箭頭所示為腫瘤部位。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。
一般性說明
氯胺T、 Na2S205由天津科密歐化學(xué)試劑公司提供，牛血清白蛋白由上海生物化學(xué) 研究院提供，131I由北京原子高科股份有限公司提供，顯像儀器為GE Millennium VG Hawkeye雙探頭SPECT儀，"/井型計數(shù)器為Perkin Elmer Wizard 1470， y放射免疫計數(shù) 器GC1200購自科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司，非小細(xì)胞肺癌模型由上海腫瘤研究 所提供。
實施例1:制備重組Tyr-Octreotide
根據(jù)提供的序列SEQ ID NO.2采用公知的技術(shù)合成小分子多肽是本領(lǐng)域普通技術(shù) 人員熟知的技術(shù)，本發(fā)明中將苯丙氨酸置換成酪氨酸的Tyr-Octreotide由北京華大基因 研究中心制備，制備的小分子蛋白Tyr-Octreotide進(jìn)行了高效液相色譜(HPLC)分析， 經(jīng)過分子量的確定，為所需蛋白，純度>95%。測序分析為SEQIDN0.2。
實施例2:制備131I - Tyr-Octreotide
131I-Tyr-Octreotide的標(biāo)記取0.2mol/L NaH2P04禾口 0.2mol/L Na2H 04配置成 0.2mol/L PB;分別稱取0.3g的Ch-T、 Na2S205配置為30嗎&L的反應(yīng)液；配置濃度為 lmg/ml的Tyr -Octreotide 。在25。C下取150^iL的PB，依次加入Octreotide 10pL、 Na131I(0.15mCi)0.1 ml、 Ch-T 4pL反應(yīng)3min并迅速振蕩混勻，之后加入Na2S205 5jiL， 標(biāo)記條件①磷酸緩沖液的pH值從6.0到9.2;②Tyr-Octreotide的量分別為l叱、5|ig 、 10昭、15嗎、20jig;③反應(yīng)溫度25°C，④反應(yīng)時間為2-3min。標(biāo)記數(shù)分鐘即得 l31I-Tyr-Octreotide。
測定制備的mi-Tyr-Octreotide放化純度及體外穩(wěn)定性采用兩個體系體系1采用 新華l號層析紙作為固定相，以生理鹽水作為展開劑，131I-Tyr-Octreotide和膠體比移值 (Rf)為0， ulIRf=0.7-0.8;體系2以2.5。/。牛血清白蛋白浸泡過自然晾干的新華l號層
析紙作為固定相，以乙醇氨水水(2: 1: 5 v/v)作為展開劑展開測定膠體含量，膠
體RiN)，而mI-Tyr-Octreotide及1311的RfK).7-0.8。分別測定標(biāo)記完成后室溫放置30min、 1、 2、 4、 6、 8、 15、 20、 24h標(biāo)記產(chǎn)物的放化純度。標(biāo)記率^"I-Tyr-Octreotide放射性 計數(shù)率值/ (131I-Tyr-Octreotide放射性計數(shù)率值+1311的放射性計數(shù)率值)xl00%。
結(jié)果顯示，采用紙層析系統(tǒng)測定各不同反應(yīng)條件下標(biāo)記產(chǎn)物放化純度，最高標(biāo)記率 可達(dá)97%，室溫放置8h仍保持在81X，最低膠體含量為1.0%。室溫放置30min、 1、 2、 4、 6、 8、 15、 20、 24h產(chǎn)物放化純度、標(biāo)記不同蛋白量產(chǎn)物的膠體含量、不同pH值和 蛋白量的標(biāo)記率見(圖1-4)。
實施例3: 131I - Tyr-Octreotide在正常小鼠機(jī)體組織中的分布
昆明種小鼠30只(20-25g,)，隨機(jī)分為6組，每組5只。尾靜脈注射131I-Tyr-Octreotide 0.15mL(3.7MBq)，于給藥后30min, 4、 8、 12、 24、 48h進(jìn)行顯像，之后摘眼球取血處 死小鼠。取重要組織器官，包括心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、胃、小腸(距胃lcm)、 大腸、胰腺、股骨、肌肉、腦、甲狀腺等13個組織器官，稱重并測放射性計數(shù)，計算 %ID/g (每克組織放射性計數(shù)/注射入小鼠體內(nèi)總放射性計數(shù)><100%)。以時間為橫坐標(biāo)， 放射性計數(shù)為縱坐標(biāo)繪制血液清除曲線，用Origin5.0軟件擬合，計算、分析其在正常 小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)。
尾靜脈注射后，不同時間點測定其在正常小鼠體內(nèi)各臟器分布。腎臟對1311-Tyr-Octreotide的攝取最高，且清除較快，其次是肝臟、肺、胃腸、脾臟，而腦基本不攝 取(見表l)， ^I-Tyr-Octreotide在各臟器清除迅速。根據(jù)血液中隨時間變化的放射性計 數(shù)，用Origin5.0軟件擬合化，繪制血藥濃度-時間曲線，結(jié)果顯示血藥濃度-時間符合三 室模型特征，清除相半衰期(T1/2)為141.12min，血藥濃度-時間曲線見圖5。
表1: 131I-Tyr- Octreotide不同時相各臟器的放射性攝取分?jǐn)?shù)(％ID/g)
器官30min4h8h12h24h48h
血4.9963±0.27990.9561 ±0.17410.7454±0.15650.6502±0.24930.2840±0.07010.0877±0.0328
心2.2074±0.78880.7834±0.13080.7106±0.16440.5964±0.08510.4797±0.10460.1874±0.0511
肝4.5004±0.44721.2710±0.26151麓9±0.27931.3852±0.28920.7493±0.17830.1984±0.0479
脾6.0733±0.94351.6980±0.43001.2957±0.2991.2855±0.40280.9863±0.28630.2977±0.0486
肺7.4302±1.87142.6782±0.82992.143±0.50081.8033±0.39841.8759±0.55380.3535±0.1173
腎14.0932±2.503815.5710±1.894210.2692±1.4817.9603±0.60763.8325±0.69930.671±0.2246
胃3.8361±0.74661.3198±0.15681.0041±0.22361.5062±0.41030.7677±0.17480.1890±0.0286
小腸3.8648±0.60530.945U0.10130.8270±0.24260.9077±0.36270.4923±0.川70.1475±0.0456
大腸8.0051±0.61305.1325±0.20191.3151±0.95960.8571±0.26880.6108±0.18090.168U0.0462
胰腺5.1720±0.47231.2227±0.29610.8109±0.17570.6784±0.20410.4915±0.20370.1536±0.0525
股骨2.2906±0.05410.8543±0.16320.7421±0.47880.6737±0.24100.4596±0.2320.4487±0.2164肌肉 2.19576±0.6134 0.3742±0.1557 腦 0.%26±0.5998 0.1556±0扁1
甲狀腺 3.0727±0.2889 0.9035±0.3781
(%ID/g=X±S, N=5)
實施例4: 131I - Tyr-Octreotide在腫瘤組織中的分布。
將標(biāo)記藥物131I-Tyr-Octreotide經(jīng)尾靜脈注射于荷瘤鼠體內(nèi)，注射劑量為0.2mL (3.7MBq)，將其取俯臥位固定于板上，使四肢充分伸展，避免肢體重疊，采用高能低分辨 針孔準(zhǔn)直器，于注射后4h進(jìn)行圖像采集，采集時間為10min。
注射后4h可見心臟、肝臟、腎臟、脾等各器官的放射性攝取分布與正常小鼠體內(nèi) 放射性生物分布相同，腫瘤部位有明顯的較高的放射性聚集，較對側(cè)正常肌肉組織放射 性高，可見1311-Tyr-Octreotide對腫瘤組織有著較高親和力，見圖6。
0.3421 ±0.2456 0.0867±0.0391 0.5778±0.2736
0.2908±0.1357 0.0678±0.0272 0.4654±0.1539
0.1599±0.0862
0.0408±0.007
0.2369±0.0525
0.0946±0.0453
0.0328±0.008
0.1144±0.0375 <110〉王自正王峰杜同信李少華瞿衛(wèi)
〈120〉一種重組奧曲肽及其應(yīng)用
〈160〉 2
<210〉 1 〈211〉 8 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <220〉
〈223〉重組人內(nèi)皮抑制素 <德1
Phe Cys Phe Trp Lys Thr Cys Thr 1 5
〈210〉 2 <211〉 8 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈220〉
〈223〉重組人內(nèi)皮抑制素 <400> 2
Phe Cys Tyr Trp Lys Thr Cys Thr 1 權(quán)利要求
1、一種重組奧曲肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2、 編碼權(quán)利要求l所述重組奧曲肽的核苷酸序列。
3、 放射性同位素1311標(biāo)記的權(quán)利要求1所述重組奧曲肽。
4、 權(quán)利要求1或3所述重組奧曲肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
5、 權(quán)利要求2所述重組奧曲肽的核苷酸序列在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
6、 權(quán)利要求1或3所述重組奧曲肽在制備靶向診斷試劑中的應(yīng)用。
7、 權(quán)利要求2所述重組奧曲肽的核苷酸序列在制備靶向診斷試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，公開了一種重組奧曲肽及其應(yīng)用。本發(fā)明針對目前奧曲肽不能實現(xiàn)靶向性近距離照射腫瘤細(xì)胞，不能用于制備靶向治療的藥物的問題，提出了一種重組奧曲肽，該重組奧曲肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。該重組奧曲肽利于放射性同位素¹³¹I標(biāo)記，可用于制備抗腫瘤藥物或靶向診斷試劑。
文檔編號C07K7/06GK101182349SQ20071013284
公開日2008年5月21日 申請日期2007年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月8日
發(fā)明者李少華, 杜同信, 峰 王, 王自正, 衛(wèi) 瞿 申請人:王自正;王 峰;杜同信;李少華;瞿 衛(wèi)