專利名稱：：抗血栓劑的制作方法抗血栓劑此案是申請(qǐng)日為2000年10月5日、中國(guó)申請(qǐng)?zhí)枮?0819723.7、發(fā)明名稱為"抗血栓劑，，的發(fā)明申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及與人凝固因子或輔因子相結(jié)合的單克隆抗體(mAbs)和其作為血栓形成抑制劑的用途。發(fā)明背景在正常情況下，血管內(nèi)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，無論損傷大小，將通過通常稱為凝血"級(jí)聯(lián)反應(yīng)(cascade)"的一系列事件而觸發(fā)止血反應(yīng)。該級(jí)聯(lián)反應(yīng)以使可溶性纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白而達(dá)到極點(diǎn)，不溶性纖維蛋白與血小板一起形成局部血凝塊或者血栓，血凝塊或血栓阻止血液組分外滲。然后，隨著血凝塊溶解和血管完整性修復(fù)以及血流恢復(fù)而出現(xiàn)傷口愈合。在受傷和血凝塊形成之間發(fā)生的事件，受到一系列反應(yīng)的精細(xì)調(diào)節(jié)和聯(lián)接。簡(jiǎn)言之，大量以無活性酶原形式的血漿凝血蛋白和輔因子在血液中循環(huán)著?；钚悦笍?fù)合物在受損傷位點(diǎn)裝配起來，繼而激活絲氨酸蛋白酶，伴隨有各個(gè)連續(xù)的絲氨酸蛋白酶催化后續(xù)酶原成為活化蛋白酶。此酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致每一步驟均放大后繼步驟的效應(yīng)。關(guān)于凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的概述，參見"ThombosisandHemorrhage",J.Loscalzo和A.Schafer,編著,BlackwellScientificPublications,Oxford,England(1994)—書的第一章。雖然有效的血凝限制了損傷部位的血液損失，但血栓在靜脈或動(dòng)脈的不適當(dāng)形成是殘障和死亡的常見原因。異常凝血活性可以導(dǎo)致和/或源自病理或治療，諸如心肌梗塞、不穩(wěn)定型心絞痛、房性纖顫、中風(fēng)、腎臟損害、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)、播散性血管內(nèi)凝血、敗血癥、肺栓塞和深靜脈血栓形成。血凝塊在人造器官、分流器和假體如人工心臟瓣膜外表面的形成也是成問題的。中風(fēng)，是導(dǎo)致死亡的主要原因，是造成永久性殘廢的常見原因。導(dǎo)致中風(fēng)神經(jīng)缺陷的急性灶性腦缺血，最頻見于由血栓栓塞引起。血栓可由心源性病變和動(dòng)脈粥樣斑產(chǎn)生。原位血栓形成可發(fā)生于大的、腦外的腦供血血管。研究提示，腦動(dòng)脈閉塞后存在一個(gè)有限時(shí)間間期，超過該間期，貝'J發(fā)生明顯的不可逆的神經(jīng)元損傷和持久的神經(jīng)缺陷。參見StrokeT7zera/^:5as7.c，尸rec/z'm'ca/，C7z'm.ca/D/re"/o/ts'ed.L.P.Miller,Wiley-Liss,Inc.(1999)一書的第14章第355-381頁(yè)。目前，批準(zhǔn)用于這些病理和其它血栓形成性及栓子性病癥治療的抗凝劑，包括硫酸化雜多糖肝素和低分子量(LMW)肝素。這些藥物經(jīng)胃腸外給藥，通過激活凝血酶抑制劑、抗凝血酶m并使全部凝血因子失活而引起快速、完全的凝血抑制反應(yīng)。然而，由于潛伏期的存在，肝素和LMW肝素有其缺點(diǎn)。作為單純壓迫動(dòng)作和伴隨的與物理物體接觸結(jié)果的失控性出血或者在手術(shù)部位的失控性出血，是主要的并發(fā)癥，并在1~7%接受連續(xù)輸液患者和8~14%接受間斷快速濃注的患者中觀察到了并發(fā)癥。為了使這些風(fēng)險(xiǎn)降至最小，不斷地采集血液樣本以便能夠持續(xù)監(jiān)測(cè)體外凝血時(shí)間，這在實(shí)質(zhì)上增加了治療成本并且給患者帶來不便。另外，達(dá)到所需有效水平而不置患者于冒出血風(fēng)險(xiǎn)境地的治療目標(biāo)范圍是狹窄的。該治療范圍是大約1至小于3(g肝素/ml血漿，它導(dǎo)致激活的部分凝血激酶時(shí)間(aPTT)測(cè)定時(shí)間約35至約100秒。將肝素濃度提高至超過目標(biāo)范圍3(g/ml和濃度大于4(g/ml,則測(cè)不到凝血活性。因此，必須給予密切關(guān)注以保證患者的血漿濃度在治療范圍之內(nèi)。另一獲得批準(zhǔn)的具有緩慢和長(zhǎng)效作用的抗凝劑是華法令(warfarin),是一種香豆素衍生物。華法令通過與凝血酶原維生素K依賴性翻譯后修飾和其它維生素K-依賴性凝血因子竟?fàn)幎l(fā)揮作用。在抗凝作用的一般情形下，對(duì)于華法令、肝素及LMW肝素來說，在稍高于治療范圍的濃度時(shí)，可以見到血液表現(xiàn)為不凝結(jié)。在急性心肌梗塞(MI)時(shí)，溶栓治療的主要目標(biāo)包括梗塞血管的早期和持久再灌注。急性MI的現(xiàn)行療法，既包括纖溶酶原激活物如組織纖溶酶原激活物(tPA)或鏈激酶，也包括抗凝劑如未分級(jí)肝素、低分子量肝素或直接凝血酶抑制劑或者抗血小板劑如阿司匹林或血小板糖蛋白Ilb/IIIa阻斷劑。參見Topol,Jm/,"6,S66-S68(1998)。這些治療的聯(lián)合，是基于這樣的觀察凝塊形成和溶解是動(dòng)態(tài)過程，而凝血酶活性和生成在閉塞性血栓形成之后以及在凝塊溶解期間和之后仍在繼續(xù)。見Granger等，《/Co〃C"W/o/，3/，497-505(1998)。治療急性MI的最適策略依然難以捉摸，可利用的制劑和治療方案則顯示出正負(fù)兩方面的特性。舉例來說，纖維蛋白-結(jié)合的凝血酶對(duì)于肝素所致的抑制作用不敏感(Becker等，"ChemistryandBiologyofSerpins",PlenumPress,NewYork(1997)—書的第6章)，而停止肝素治療后凝血酶活性則表現(xiàn)出反彈性增加，于是觀察到中止肝素后24小時(shí)內(nèi)再梗塞增加。見Watkins等，Ca^7efen'za//owCaWovoscw/orD/ag"owX44，257-264(1998)andGranger,CV/rw/加'w7,97,1929-1935(1995)。而且，抗血小板劑可能伴發(fā)出血或血小板減少癥。再有，大量臨床試驗(yàn)業(yè)已證實(shí)，高劑量溶栓劑導(dǎo)致血漿止血標(biāo)志(hemostaticmarker)顯著改變。見Rao等，/C7/"/wveW，10-14(1988);Bovill等，爿朋Me《7",256-265(1991);Neuhaus等，/力wCo〃Car&o/,/9,885-891(1992)。盡管提高tPA濃度造成血凝塊溶解增加，但是這些止血標(biāo)志的改變反映出溶栓治療不利之處的增大，特別是嚴(yán)重出血的發(fā)生。在血栓栓塞性中風(fēng)的情況下，在出現(xiàn)中風(fēng)癥狀的早期(3小時(shí)內(nèi))實(shí)施溶栓治療以預(yù)防不可逆損害。目前許可用于局部缺血和/或梗塞組織再灌注的溶栓劑，包括纖溶酶原激活物tPA、尿激酶和鏈激酶。然而，溶栓治療與嚴(yán)重的出血傾向有關(guān)，在血栓栓塞性中風(fēng)的溶栓治療中，主要擔(dān)心的是治療將通過誘發(fā)出血而使局部缺血性損傷惡化。很顯然，存在著對(duì)在控制栓塞性病癥中有效、同時(shí)又保持止血功能的抗血栓劑的需求。發(fā)明概述本發(fā)明一方面，是治療動(dòng)物血栓栓塞后誘發(fā)的局部缺血的方法，包括施用抗-因子IX抗體或抗體片段。本發(fā)明另一方面，是治療動(dòng)物血栓栓塞后誘發(fā)的局部缺血的方法，包括聯(lián)合施用抗-因子IX抗體或抗體片段和纖溶酶原激活物。本發(fā)明的再一方面，是在動(dòng)物血栓栓塞后誘發(fā)局部缺血的治療中降低所需溶栓劑劑量的方法，包括聯(lián)合施用抗-因子IX抗體或抗體片段和溶栓劑。本發(fā)明還一方面，是預(yù)防動(dòng)物血栓栓塞性中風(fēng)的方法，包括對(duì)具有發(fā)生血栓栓塞性中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)的動(dòng)物施用抗-因子IX抗體或抗體片段。附圖簡(jiǎn)述圖1是描述含有鼠抗-因子IXmAbsBC1和BC2的正常人血漿滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。圖2是描述含鼠抗-因子IXmAbs9E4(2)F4和11G4(1)B9的正常人血漿滴定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。圖3是描述含鼠抗-因子XmAbsHFXHC和HFXLC以及鼠抗-因子XImAbHFXI的正常人血漿滴定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。圖4是描述在大鼠頸動(dòng)脈血栓形成模型中肝素、乙酰水楊酸和鼠因子IXmabs于60分鐘時(shí)對(duì)激活的部分凝血激酶時(shí)間(aPTT)影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直方圖。圖5是描述在大鼠頸動(dòng)脈血栓形成模型中肝素、乙酰水楊酸和鼠因子IXmabs于60分鐘時(shí)對(duì)凝血酶原時(shí)間影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直方圖。圖6是描述大鼠頸動(dòng)脈血栓形成模型中肝素、乙酰水楊酸和鼠因子IXmabs對(duì)頸動(dòng)脈血流的閉塞影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直方圖。圖7是描述在大鼠頸動(dòng)脈血栓形成模型中肝素、乙酰水楊酸和鼠因子IXmabs對(duì)血栓重量影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直方圖。圖8是描述在大鼠頸動(dòng)脈血栓形成模型中肝素、鼠因子IXmabBC2、嵌合因子IXmab和人源化因子IXmAbs于60分鐘時(shí)對(duì)aPTT影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直方圖。圖9是描述在大鼠頸動(dòng)脈血栓形成模型中肝素、鼠因子IXmabBC2、嵌合因子IXmab和人源化因子IXmAbs對(duì)血栓重量影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直方圖。圖10是描述抗-因子IXmab和肝素對(duì)tPA-介導(dǎo)的再灌注影響的實(shí)^r結(jié)果的直方圖。圖ll描述抗-因子IXmab和肝素對(duì)頸動(dòng)脈脈管開放作用(patency)影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直方圖。圖12是描述抗-因子IXmab和肝素對(duì)恢復(fù)血流時(shí)間影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直方圖。圖13描述tPA對(duì)止血參數(shù)、纖維蛋白原、纖溶酶原和抗纖溶酶的影響。圖14描述tPA、肝素和抗-因子IXmab對(duì)aPTT的影響。圖15描述在血栓栓塞性中風(fēng)中tPA、SB249417、tPA與SB249417聯(lián)合對(duì)合計(jì)的(aggregate)平均梗塞體積的影響。發(fā)明詳述在本說明書中引證的所有出版物，包括但不限于專利和專利申請(qǐng)，均如前面那樣引入本文作為參考。本發(fā)明提供針對(duì)凝血因子的多種抗體、改變的抗體及其片段，它們以自限性中和活性(self-limitingneutralizingactivity)為特征。優(yōu)選地，凝血因子來自固有的或普通的凝血途徑。更優(yōu)選，抗-凝血因子抗體是抗-因子IX、抗-因子IXa、抗-因子X、抗-因子Xa、抗-因子XI、抗-因子XIa、抗-因子VIII、抗-因子VIIIa、抗-因子V、抗-因子Va、抗-因子VII、抗-因子VIIa、抗凝血酶或抗-凝血酶原。尤其優(yōu)選的是抗-因子IX抗體。例舉的抗-凝血因子抗體，是針對(duì)人因子IX的人源化單克隆抗體SB249413、SB249415、SB249416、SB249417、SB257731和SB257732,針對(duì)人因子IX的嵌合單克隆抗體chocFIX、針對(duì)人因子IX和/或因子IXa的鼠單克隆抗體BC1、BC2、9E4(2)F4，和11G4(1)B9,或者分別針對(duì)人因子X和XI的小鼠單克隆抗體HFXLC和HFXI。尤其優(yōu)選的是抗-人因子IX單克隆抗體SB249417。通過慣常的雜交瘤技術(shù)、噬菌體展示組合文庫(kù)、免疫球蛋白鏈改組和人源化技術(shù)以產(chǎn)生新的自限性中和抗體，可以制備本發(fā)明抗體。還包括在內(nèi)的是具有自限性中和活性的全長(zhǎng)人mAbs。這些產(chǎn)物對(duì)于與下述有關(guān)的血栓性和栓子性病癥的治療和藥物組合物非常有用心肌梗塞、不穩(wěn)定型心絞痛、房性纖顫、中風(fēng)、腎臟損害、肺栓塞、深靜脈血栓形成、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀血管成形術(shù)、播散性血管內(nèi)凝血、敗血癥、人造器官、分流器或假體。本文所用術(shù)語(yǔ)"自限性中和活性"，是指能與人凝血因子、優(yōu)選是來自固有和普通途徑的凝血因子相結(jié)合并以使得產(chǎn)生凝血的有限調(diào)變(limitedmodulation)之方式抑制血栓形成的抗體的活性，所述凝血因子包括因子IX/IXa、X/Xa、Xl/XIa、Vlll/VIIIa和V/Va、VlI/VIIa和凝血酶/凝血酶原。"凝血的有限調(diào)變"定義為凝血時(shí)間增加(通過激活的部分凝血激酶時(shí)間(activatedpartialthromboplastintime，aPTT)延長(zhǎng)測(cè)得)，盡管單克隆抗體濃度增加血漿卻保持aPTT達(dá)到其最大值的可凝性。凝血的此種有限調(diào)變，與增加肝素濃度時(shí)血漿呈現(xiàn)不凝性并顯示無限aPTT的情形形成對(duì)照。優(yōu)選地,本發(fā)明方法的最大aPTT值落入肝素治療范圍之內(nèi)。最優(yōu)選地，最大aPTT在約35秒至約100秒范圍內(nèi)，此相當(dāng)于正常對(duì)照aPTT值的約1.5~約3.5倍。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，aPTT延長(zhǎng)而沒有顯著的凝血酶原時(shí)間(PT)延長(zhǎng)。術(shù)語(yǔ)"聯(lián)合"，是指單個(gè)療程中一種治療劑在施用另一種治療劑之前、之后或者與之一同施用。"改變的抗體"，是指由改變了的免疫球蛋白編碼區(qū)編碼的蛋白，它可以通過在一個(gè)選擇的宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)而獲得。此類改變的抗體是基因工程抗體(例如，嵌合的或人源化抗體)或者缺少全部或部分免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體片段，辨如Fv、Fab、Fab'或F(ab'、等。"改變的免疫球蛋白編碼區(qū)"，是指編碼本發(fā)明改變的抗體的核苷酸序列。當(dāng)改變的抗體是CDR-移植的或人源化抗體時(shí)，將編碼非-人免疫球蛋白免疫球蛋白互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)的序列插入到含有人可變框架區(qū)序列的第一個(gè)免疫球蛋白配偶體(partner)中。任選地，第一個(gè)免疫球蛋白配偶體可操作地與第二個(gè)免疫球蛋白配偶體相連接。"第一個(gè)免疫球蛋白配偶體"，是指編碼人框架區(qū)或者人免疫球蛋白可變區(qū)的核苷酸序列，在所述區(qū)中，天然(或天然發(fā)生的)CDR-編碼區(qū)被供體抗體的CDR-編碼區(qū)所替換。人可變區(qū)可以是免疫球蛋白重鏈、輕鏈(或者重、輕二鏈)、其類似物或功能片段。此類位于抗體(免疫球蛋白)可變區(qū)內(nèi)的CDR區(qū)，可以用本領(lǐng)域已知的方法予以測(cè)定。譬如，Kabat等在"SequencesofProteinofImmunologicalInterest",4thEd"U.S.DepartmentofHealthand人Services,NationalInstitutesofHealth(1987)中，公開了尋找CDRs的原則。另外，已知計(jì)算機(jī)程序?qū)τ诖_定CDR區(qū)/結(jié)構(gòu)非常有用。"第二個(gè)免疫球蛋白配偶體"，是指編碼蛋白或肽的另一核苷酸序列，第一個(gè)免疫球蛋白配偶體就是與該第二個(gè)免疫球蛋白配偶體在框架融合或者通過任選的傳統(tǒng)的接頭序列相融合(伊，可操作地聯(lián)接)。優(yōu)選地，它是免疫球蛋白基因。第二個(gè)免疫球蛋白配偶體可包括編碼相同(即同源的，第一和第二改變的抗體來源相同)或另一(即異源的)目的(interest)抗體整個(gè)恒定區(qū)的核苷酸序列。它可以是免疫球蛋白重鏈或輕鏈(或者作為單個(gè)多肽一部分的重、輕二鏈)。第二個(gè)免疫球蛋白配偶體并不局限于具體免疫球蛋白種類或者同種型。而且，第二個(gè)免疫球蛋白配偶體可包括免疫球蛋白恒定區(qū)的一部分，諸如在Fab,或F(ab)2(即，適當(dāng)人恒定區(qū)或框架區(qū)的不連續(xù)部分)中發(fā)現(xiàn)的那些。此免疫球蛋白配偶體也可包括編碼暴露在宿主細(xì)胞外表面的膜內(nèi)在蛋白的序列(例如作為噬菌體展示文庫(kù)的一部分)，或編碼分析或診斷檢測(cè)所用蛋白的序列(例如辣根過氧化物酶、P-半乳糖苷酶)等。術(shù)語(yǔ)Fv、Fc、Fd、Fab、Fab'或F(ab')2使用其標(biāo)準(zhǔn)含義，參見Harlow等,in"Antibody:ALaboratoryManual",ColdSpringHarborLaboratory,(1988)。如本文所用的那樣，"基因工程抗體"描述一類改變的抗體，即全長(zhǎng)合成抗體(例如與抗體片段相對(duì)的嵌合或人源化抗體)，其中所選受體抗體的輕鏈和/或重鏈可變域的一部分被來自一個(gè)或多個(gè)供體抗體的類似部分替換，所述供體抗體對(duì)所選抗原表位具有特異性。舉例來說，此類分子可包括以人源化重鏈與未修飾輕鏈(或嵌合輕鏈)結(jié)合(或反之亦然)為特征的抗體。基因工程抗體也可以改變編碼受體抗體輕《連和/或重《連可變域框架區(qū)的核香酸序列以便保持供體的抗體結(jié)合特異性為特征。這些抗體可包括用來自本文所述供體抗體的CDRs替換來自受體抗體的一個(gè)或多個(gè)或CDRs(優(yōu)選所有CDRs)。"嵌合抗體"，是指一類含有與源自受體抗體輕鏈和重鏈恒定區(qū)相結(jié)合的源自供體抗體的天然存在可變區(qū)(輕鏈和重鏈)的基因工程抗體。"人源化抗體"，是指一類具有源自非-人供體免疫球蛋白CDRs、分子的其余免疫球蛋白衍生部分來自一種或多種人免疫球蛋白的基因工程抗體。另夕卜，框架支持殘基可以改變以保存結(jié)合親合性。參見例如Queen等，尸raciV""Jc^/10029-10032(1989),Hodgson等，^0/7fec/7"o/o^'9，421(1991)。術(shù)語(yǔ)"供體抗體"，是指為第一免疫球蛋白配偶體貢獻(xiàn)其可變區(qū)、CDRs或其功能片段或其類似物的核苷酸序列，以便提供改變的免疫球蛋白編碼區(qū)并導(dǎo)致表達(dá)具有供體抗體的抗原特異性和中和活性的改變抗體的單克隆或重組抗體。適用于本發(fā)明的一個(gè)供體抗體是命名為BC2的鼠自限性中和單克隆抗體。其它適宜供體抗體包括命名為BC1、9E4(2)F4、11G4(1)B9、HFXLC和HFXI的鼠自限性中和單克隆抗體。術(shù)語(yǔ)"受體抗體"，是指與供體抗體異源的的單克隆或重組抗體，它為第一免疫球蛋白配偶體提供編碼其重鏈和/或輕鏈框架區(qū)和/或其重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)的全部或部分的核苷酸序列。優(yōu)選地，人抗體是受體抗體。"CDRs"定義為抗體互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸序列，它們是免疫球蛋白重鏈和輕《連的超變區(qū)。參見例嗦口Kabat等，"SequencesofProteinofImmunologicalInterest",4thEd"U.S.DepartmentofHealthandhumanServices,NationalInstitutesofHealth(1987)。在免疫球蛋白的可變部分，有3個(gè)重鏈和3個(gè)輕鏈CDRs或CDR區(qū)。因此，本文中"CDRs"是指所有3個(gè)重鏈CDRs,或所有3個(gè)輕鏈CDRs或者所有的重鏈和輕鏈CDRs，如果合適的話。CDRs為抗體與抗原或者抗原表位結(jié)合提供大多數(shù)接觸殘基。本發(fā)明目標(biāo)CDRs來自于供體抗體可變重鏈和輕鏈序列，并包括天然存在CDRs的異性和/或中和能力。"具有抗原結(jié)合特異性或者中和能力"，是指例如，盡管mAbBC2以一定水平的自限性中和活性為特征，但是由適宜結(jié)構(gòu)環(huán)境中BC2核苷酸序列編碼的CDR可以具有低的或者高的活性。預(yù)計(jì)BC2的CDRs在該環(huán)境中仍然與BC2—樣識(shí)別相同的表位(一個(gè)或多個(gè)表位)。"功能片段"是保持與所來自的抗體相同抗原結(jié)合特異性和/中和活性的部分重鏈或輕鏈可變序列(例如，免疫球蛋白可變區(qū)氨基或羧基末端d、的缺失)。"類似物"是由至少一個(gè)氨基酸修飾的氨基酸序列，其中所述修飾可以是化學(xué)修飾或者是少數(shù)氨基酸(即不超過10個(gè)氨基酸)取代或重排，所述修飾允許氨基酸序列保持未修飾序列的生物學(xué)特性，例如抗原特異性和高親合性。例舉的類似物包括通過取代建構(gòu)，從而在CDR-編碼區(qū)內(nèi)或編碼區(qū)附近產(chǎn)生一定的核酸內(nèi)切酶限制性酶切位點(diǎn)的沉默突變。類似物也可以等位變異(allelicvariations)的方式出現(xiàn)。"等位變異或^f奮飾"是編碼本發(fā)明氨基酸或肽序列的核苷酸序列的改變。此變異或修飾可以緣于遺傳密碼的簡(jiǎn)并或者是特意進(jìn)行工程改造的，以提供所需的特性。這些變異或修飾可以致使或者不致使任何編碼的氨基酸序列發(fā)生改變。術(shù)語(yǔ)"效應(yīng)劑"，是指非-蛋白載體分子，所迷改變的抗體、和/或天然或合成的供體抗體輕鏈或重鏈或供體抗體的其它片段通過常規(guī)手段與之結(jié)合。此類非-蛋白載體可包括診斷領(lǐng)域中使用的常規(guī)載體，例如聚苯乙烯或其它塑料珠，多糖，例如BIAcore(Pharmacia)系統(tǒng)中所用的，或者在醫(yī)療領(lǐng)域中有用的和對(duì)人與動(dòng)物施用安全的其它非-蛋白物質(zhì)。其它效應(yīng)劑可包括螫合重金屬原子或放射性同位素的大環(huán)化合物(macrocycle)。此類效應(yīng)劑對(duì)增加改變的抗體的半衰期是有用的，例如聚乙二醇。為用于構(gòu)建本發(fā)明抗體、改變抗體及片段，可使用非-人種屬如牛、羊、猴、雞、嚙齒類(例如鼠和大鼠)以產(chǎn)生通過人凝血因子，優(yōu)選因子IX/IXa、X/Xa、Xl/XIa、VlII/VIIIa、V/Va、VlI/VIIa或凝血酶/凝血酶原或來自它們的肽表位進(jìn)行呈遞所需的免疫球蛋白。使用常規(guī)的雜交瘤技術(shù)以提供將非-人mAb分泌為各自的凝血因子的雜交瘤細(xì)胞抹。然后，如實(shí)施例部分所描述的那樣，使用包被96-孔板的因子IX/IXa、X/Xa、Xl/XIa、VlII/VIIIa、V/Va、VlI/VIIa或凝血酶/凝血酶原，或者使用與抗生蛋白鏈菌素包被的板相結(jié)合的生物素酰化因子IX/IXa、X/Xa、Xl/XIa、VlII/VIIIa、V/Va、VlI/VIIa或凝血酶/凝血酶原，進(jìn)行此類雜交瘤的結(jié)合篩選?；蛘撸帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知或本發(fā)明所用的技術(shù)產(chǎn)生全長(zhǎng)人mAbs。本發(fā)明一示范性、自限性中和mAb是mAbBC2，它是一種可用于發(fā)展嵌合或人源化分子的鼠抗體。BC2mAb以對(duì)凝血時(shí)間的自限性抑制活性為特征。如aPTT試驗(yàn)測(cè)定的那樣，BC2mAb對(duì)凝血時(shí)間的作用顯示出約100秒的最大值。BC2mAb也結(jié)合因子IXa,抑制因子IX向IXa轉(zhuǎn)變并抑制因子IXa活性。二價(jià)金屬輔因子是活性所需的，mAb對(duì)于Ca"顯示出較Mn"更大的偏愛。在aPTT試驗(yàn)中，觀察到的IC5o為約50nM。BC2mAb顯示出與大鼠的種屬-交叉反應(yīng)性而且是IgG2a同位型。其它所需供體抗體是鼠mAbs，BCl、9E4(2)F4和11G4(1)B9。這些mAbs以對(duì)凝血時(shí)間的自限性抑制活性為特征。如aPTT試驗(yàn)中測(cè)得的那樣，這些mAbs對(duì)凝血時(shí)間作用顯示出的最大值為對(duì)9E4(2)F4約卯~100秒，對(duì)11G4(1)B9約80秒。BClmAb也結(jié)合因子IXa,抑制因子IXa活性但是不抑制因子IX向IXa的轉(zhuǎn)變。其活性不需要金屬輔因子。在aPTT試驗(yàn)中觀察到BC1的IC5o為約35nM。BC1mAb是IgGl同位型。另一種以對(duì)凝血時(shí)間自限性抑制活性為特征的所需的供體抗體是鼠mAbHFXLC。如aPTT試驗(yàn)測(cè)得的那樣，HFXLCmAb對(duì)凝血時(shí)間的作用顯示出約50~60秒的最大值。HFXLCmAb結(jié)合因子X輕鏈，并抑制因子X/Xa活性。aPTT試驗(yàn)中觀察到的IC50是約20nM。另一種以對(duì)凝血時(shí)間自限性抑制活性為特征的所需的供體抗體是小鼠mAb,HFXI。如aPTT試—驗(yàn)測(cè)得的那樣，HFXImAb對(duì)凝血時(shí)間的作用顯示出約1OO秒的最大值。HFXLCmAb結(jié)合因子XI并抑制因子XI/XIa活性。在aPTT試驗(yàn)中觀察到的IC5o是約30nM。盡管不意欲受到有關(guān)作用機(jī)理的任何具體理論的限制，但是這些mAbs看起來通過非竟?fàn)幮曰蛘咦儤?gòu)機(jī)理來調(diào)節(jié)凝血，因而僅達(dá)到了部分抑制作用。本發(fā)明不限于使用BC1、BC2、9E4(2)F4、11G4(1)B9、HFXLC、HFXI或它們的超變(即CDR)序列。因而，任何其它以自限性中和活性為特征的適合的高親和力抗體和相應(yīng)的CDRs可被替換。在下面描述中，將BC1、BC2、9E4(2)F4、11G4(1)B9、HFXLC或HFXI通稱為供體抗體，這樣做只是為了使說明和描述簡(jiǎn)明。Fab片段或F(ab')2片段。這些片段作為抗凝血因子，優(yōu)選抗因子IX/IXa、X/Xa、Xl/XIa、VlII/VIIIa、V/Va、VlI/VIIa或凝血酶/凝血酶原的具有自限性中和活性的試劑是非常有用的。Fab片段包含整個(gè)輕鏈和重鏈的氨基末端部分。F(ab')2片段由通過二硫鍵結(jié)合在一起的2個(gè)Fab片段所形成。mAbsBC1、BC2、9E4(2)F4、11G4(1)B9、HFXLC和HFXI以及其它類似的高親和力抗體，提供可用常規(guī)方法得到的Fab片段和F(ab')2片段，所述常規(guī)方法例如用適當(dāng)?shù)牡鞍姿饷?，木瓜蛋白酶?或胃蛋白酶裂解mAb,或采用重組方法。這些Fab和F(ab')2片段本身作為治療劑、預(yù)防劑或診斷劑非常有用，并且作為包括對(duì)于形成本文所述重組或人源化抗體有用的可變區(qū)和CDR序列的序列供體是非常有用的。通過組合謹(jǐn)菌體文庫(kù)(參見例如Winter等，AnnRevImmunol12,433-455(1994》或通過免疫球蛋白鏈改組(參見例如Marks等,Bio/Technology,10,779-783(1992)(涉及到的這兩篇文獻(xiàn)以其全部在此引入作為參考)，可以構(gòu)建Fab和F(ab')2片段，其中使來自選擇抗體(例如BC2)的Fd或vh免疫球蛋白與輕鏈免疫球蛋白的所有組成成分vl(或Vk)相結(jié)合，以形成新的Fabs。相反，使來自選擇抗體的輕鏈免疫球蛋白與重鏈免疫球蛋白的所有組成成分vh(或Fd)結(jié)合，以形成新的Fabs。通過使mAbBC2的Fd與輕鏈免疫球蛋白的所有組成成分結(jié)合，可以得到自限性中和因子IXFabs。因此，人們能夠從鏈改組技術(shù)中回收(recover)具有獨(dú)特序歹ll(核苷酸和氨基酸)的中和Fabs。上述mAbBC2或其它抗體可以捐獻(xiàn)序列，如可變重^t連和/或輕鏈肽序列、框架序列、CDR序列、功能片段和它們的類似物，以及編碼它們的在設(shè)計(jì)和得到以供體抗體抗原結(jié)合特異性為特征的各種改變抗體中有用的核苷酸序列。本發(fā)明編碼可變輕鏈和重鏈肽序列的核苷酸序列或其或片段，對(duì)于在編碼CDRs或框架區(qū)的核苷酸序列內(nèi)特異性變化的誘變引入，和對(duì)于使產(chǎn)生的修飾或融合的核苷酸序列整合入表達(dá)質(zhì)粒中是非常有用的。例如，框架和CDR-編碼區(qū)核苦酸序列的沉默取代，可用于產(chǎn)生便利于插入誘變的CDR和/或框架區(qū)的限制性酶切位點(diǎn)。這些CDR-編碼區(qū)可用于構(gòu)建本發(fā)明的人源化抗體。BC2重鏈可變區(qū)的核酸和氨基酸序列列于SEQIDNO:5和7。來自此區(qū)的CDR序列列于SEQIDNO:8、9和10。BC2輕鏈可變區(qū)的核酸和氨基酸序列列于SEQIDNOs:6和11。來自該區(qū)的CDR序列列于SEQIDNOs:12、13和14。把遺傳密碼的筒并考慮進(jìn)來，可以構(gòu)建編碼本發(fā)明可變重鏈和輕鏈氨基酸序列和CDR序列以及它們的功能片段和具有相同的供體抗體抗原結(jié)合特異性的類似物的各種編碼序列。編碼可變鏈肽序列或CDRs的本發(fā)明分離的核香酸序列或其片段，可用于產(chǎn)生改變的抗體，例如本發(fā)明嵌合或人源化抗體或當(dāng)與第二個(gè)免疫球蛋白配偶體可操作地結(jié)合時(shí)的其它基因工程抗體。應(yīng)當(dāng)指出的是，除了編碼本文所述改變抗體和抗體部分的核苷酸序列外，其它這樣的核苷酸序列也在本發(fā)明考慮之中，諸如那些與天然CDR-編碼序列互補(bǔ)的或與CDR-編碼區(qū)附近修飾的人框架區(qū)互補(bǔ)的核苷酸序列。有用的DNA序列包括那些在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與該DNA序列雜交的序列，見T.Maniatis等，"MolecularCloning:ALaboratoryManual",ColdSpringHarborLaboratory(1982),pp.387-389。此種嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的一個(gè)實(shí)例是，65。C4XSSC,接著于65。C用O.lXSSC洗滌l小時(shí)?；蛘撸痉缎缘膰?yán)謹(jǐn)雜交條件是，50%曱酰胺，42°C4XSSC。優(yōu)選地，這些雜交DNA序列長(zhǎng)度上至少約18個(gè)核苷酸，即大約CDR的大小。改變的免疫球蛋白分子可編碼改變的抗體，后者包括基因工程抗體如嵌合抗體和人源化抗體。一種所期望的改變的免疫球蛋白編碼區(qū)，包含編碼具有因子IX/IXa、X/Xa、Xl/XIa、VlII/VIIIa、V/Va、VlI/VIIa或凝血酶/凝血酶原抗體，優(yōu)選如本發(fā)明提供的高親和力抗體的抗原特異性的肽的CDR-編碼區(qū)，所述編碼區(qū)插入到第一免疫球蛋白配偶體諸如人框架或人免疫球蛋白可變區(qū)。優(yōu)選地，第一免疫球蛋白配偶體可操作地與第二免疫球蛋白配偶體連接。第二個(gè)免疫球蛋白配偶體定義同上，并可包括編碼有關(guān)第二抗體區(qū)的序列，例如Fc區(qū)。第二免疫球蛋白配偶體也可包括編碼另一免疫球蛋白的序列，輕鏈或重鏈恒定區(qū)在讀框內(nèi)或者通過聯(lián)結(jié)子序列而與所述另一免疫球蛋白序列融合。針對(duì)凝血因子的功能片段或類似物的基因工程抗體，也可被設(shè)計(jì)引出與相同抗體的結(jié)合性增強(qiáng)。第二個(gè)免疫球蛋白配偶體也可與上述定義的包括非-蛋白載體的效應(yīng)劑結(jié)合，第二個(gè)免疫球蛋白配偶體可以通過常規(guī)方式可操作地與效應(yīng)劑相連接。第二個(gè)免疫球蛋白配偶體(例如抗體序列)和效應(yīng)劑之間的融合或連接可通過任何適宜方法來完成，例如通過常規(guī)的共價(jià)或離子鍵、蛋白質(zhì)融合或異-雙功能交聯(lián)劑如碳二亞胺、戊二醛等。此類技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知并描述在常用化學(xué)和生物化學(xué)課文中。另外，只是為第二個(gè)免疫球蛋白配偶體和效應(yīng)劑之間提供所需空間量的常規(guī)接頭序列也可構(gòu)建在改變的免疫球蛋白編碼區(qū)中。此類聯(lián)結(jié)子的設(shè)計(jì)也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。此外，可用本領(lǐng)域已知的技術(shù)修飾本發(fā)明分子的信號(hào)序列以增強(qiáng)表達(dá)。優(yōu)選的改變的抗體包含具有mAbBC2的抗原結(jié)合特異性的可變重鏈和/或輕鏈肽或蛋白序列，例如VH和VL鏈。本發(fā)明還期望的另一改變的抗體，是以含有鼠抗體分子BC2重鏈和/或輕鏈可變區(qū)至少一個(gè)，優(yōu)選全部CDRs的氨基酸序列為特征的抗體，所述鼠抗體分子BC2的其余序列來自人來源或是其功能片段或類似物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明改變的抗體已經(jīng)附著上其它試劑。譬如，重組DNA技術(shù)用于產(chǎn)生本發(fā)明的改變的抗體，其中完全抗體分子的Fc片段或CH2CH3結(jié)構(gòu)域已被酶或其它可檢測(cè)分子替換(即多肽效應(yīng)子或者才艮導(dǎo)分子(reportermolecular))。第二個(gè)免疫球蛋白配偶體也可以可操作地與異源于含CDR序列的非-免疫球蛋白肽、蛋白或其片段相連接，所述含CDR序列對(duì)凝血因子，優(yōu)選因子IX/IXa、X/Xa、Xl/XIa、VlII/VIIIa、V/Va、VlI/VIIa或凝血酶/凝血酶原具有抗原特異性。產(chǎn)生的蛋白顯示出非-免疫球蛋白抗原特異性和表達(dá)特征(characteristic)。融合配偶體特征可以是例如功能性特征，如另一結(jié)合或受體結(jié)構(gòu)域，或治療特征，如果融合配偶體本身是治療性蛋白的話，或另外的抗原特征。本發(fā)明另一期望的蛋白可包括完整抗體分子、具有全長(zhǎng)重鏈和輕鏈或者它們的任何不連續(xù)片段如Fab或F(ab')2片段、重鏈二聚體或它們的任何小的重組片段如Fv、或者單鏈抗體(SCA)或者任何與所選供體mAb(例如mAbBCl、BC2、9E4(2)F4、11G4(1)B9、HFXLC或HFXI)具有相同特異性的其它分子。此類蛋白可以改變的抗體形式使用或者以其未融合形式使用。每當(dāng)?shù)诙庖咔虻鞍着渑俭w來自不同于供體抗體的抗體時(shí)，例如免疫球蛋白框架或恒定區(qū)的任何同位型或種類(class)，就產(chǎn)生基因工程抗體?；蚬こ炭贵w可包括來自一個(gè)來源(例如受體抗體)的免疫球蛋白(Ig)恒定區(qū)和可變框架區(qū)，來自供體抗體的一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選所有的)CDRs，例如本文所述的抗畫因子IX/IXa、X/Xa、Xl/XIa、VlII/VIIIa、V/Va、VlI/VIIa或凝血酶/凝血酶原抗體。另外，可以進(jìn)行對(duì)受體mAb輕鏈和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域框架區(qū)在核酸或氨基酸水平或者供體CDR區(qū)的改變，例如缺失、取代或添加，以保持供體抗體抗原結(jié)合特異性。此類基因工程抗體設(shè)計(jì)使用凝血因子mAb(任選地如前所述進(jìn)行修飾)可變重鏈和/或輕鏈的一個(gè)(或者二者均用)或者一個(gè)或多個(gè)重鏈或輕鏈CDRs。本發(fā)明基因工程抗體顯示出自限性中和活性。此基因工程抗體可包括人源化抗體或嵌合抗體，所述人源化抗體包含選擇的人免疫球蛋白或亞型的框架區(qū)，所述嵌合抗體含有與凝血因子抗體功能片段融合的人重鏈和輕鏈恒定區(qū)。適合的人(或其它動(dòng)物)受體抗體可以通過與供體抗體的核苷酸和氨基酸序列同源性而選自常規(guī)數(shù)據(jù)庫(kù)例如KABAT數(shù)據(jù)庫(kù)、LosAlamos數(shù)據(jù)庫(kù)和Swiss蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。以與供體抗體框架區(qū)同源性(基于氨基酸)為特征的人抗體，可能適宜于為插入供體CDRs提供重鏈可變框架區(qū)?？砂凑疹愃品绞竭x擇能夠貢獻(xiàn)輕鏈可變框架區(qū)的適宜受體抗體。應(yīng)當(dāng)指出，受體抗體重鏈和輕鏈并非必需來自相同的受體抗體。優(yōu)選地，異源框架和恒定區(qū)選自人免疫球蛋白類(class)和同位型，如IgG(亞型l至4)、IgM、IgA和IgE。然而，受體抗體不必要僅包含人免疫球蛋白蛋白序列。舉例來說，可以購(gòu)建這樣一個(gè)基因，其中編碼人免疫球蛋白鏈一部分的DNA序列與編碼非-免疫球蛋白氨基酸序列如多肽效應(yīng)子或報(bào)導(dǎo)分子的DNA融合。特別優(yōu)選的人源化抗體包含插入到選擇的人抗體序列框架區(qū)上的BC2s的CDRs。為中和人源化抗體，來自因子IX抗體重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的一個(gè)、兩個(gè)或優(yōu)選三個(gè)CDRs被插入到選擇的人抗體序列的框架區(qū)中，取代后者抗體的天然CDRs。優(yōu)選地，在人源化抗體中，人重鏈和輕鏈的可變域均已經(jīng)通過一個(gè)或多個(gè)CDR替換而被基因工程改造。使用全部6個(gè)CDRs或小于6個(gè)CDRs的各種組合是可能的。優(yōu)選6個(gè)CDRs被全部替換。使用來自人受體抗體未修飾的輕鏈作為輕鏈，僅僅在人重鏈替換CDRs是可能的。而且，依靠常用抗體數(shù)據(jù)庫(kù)，相容性輕鏈還可以選自另一個(gè)人的抗體?；蚬こ炭贵w的其余部分可來自任何適宜的受體人免疫球蛋白。具有對(duì)于有效治療應(yīng)用而言所需的結(jié)合特性，所述治療例如治療人血栓性和才全子性疾病。最優(yōu)選地，人源化抗體具有SEQIDNO:31、52、或89所列出的重鏈氨基酸序列。也最優(yōu)選的是，人源化抗體具有SEQIDNO:44、57、62、74、78或99所示輕鏈氨基酸序列。特別優(yōu)選人源化抗體SB249413，其重鏈具有SEQIDNO:31所示的氨基酸序列而其輕鏈具有SEQIDNO:44所示氨基酸序列。也特別優(yōu)選人源化抗體SB249415,其重鏈具有SEQIDNO:52所示氨基酸序列而其輕鏈SEQIDNO:57所示氨基酸序列。還特別優(yōu)選人源化抗體SB249416,其重鏈具有SEQIDNO:52所示氨基酸序列而輕鏈具有SEQIDNO:62所示氨基酸序列。還特別優(yōu)選人源化抗體SB249417,其重鏈具有SEQIDNO:52所示氨基酸序列和輕鏈具有SEQIDNO:74所示氨基酸序列。還特別優(yōu)選人源化抗體SB257731，其重鏈具有SEQIDNO:52所示氨基酸序列和輕鏈具有SEQIDNO:78所示氨基酸序列。還特別優(yōu)選人源化抗體SB257732，其重鏈具SEQIDNO:89所示氨基酸序列和輕鏈具有SEQIDNO:99所示氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)懂得，不必影響供體抗體(即類似物(analog))特異性和高親和力，通過改變可變域氨基酸，可將基因工程抗體進(jìn)一步修飾?？梢灶A(yù)見，重鏈和輕鏈氨基酸可被可變域框架或CDRs或者框架和CDRs供。另外，可改變恒定區(qū)以增強(qiáng)或降低本發(fā)明分子的選擇特性。譬如，二聚化，與Fc受體結(jié)合，或結(jié)合并激活補(bǔ)體的能力(參見例如，Angal等，Mo//ww,o/'30,105-108(1993),Xu等，j5/0/CTzem,2卯，3469-3474(1994),Winter等，EP307434-B)。改變的抗體是嵌合抗體的話，它有別于前述人源化抗體，因?yàn)樗峁┤康姆?人供體抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)，包括框架區(qū)，與重鏈和輕鏈的人免疫球蛋白恒定區(qū)相結(jié)合?？梢灶A(yù)見到，相對(duì)于本發(fā)明人源化抗體而言保留了另外的非-人序列的嵌合抗體將會(huì)在人體引發(fā)顯著的免疫應(yīng)答。此類抗體在預(yù)防和治療下面討論的血栓和栓子性病癥中特別有用。優(yōu)選地，通過下述過程，可變輕鏈和/或重鏈序列和mAbBC2或其它適宜供體mAbs(如BC1、9E4(2)F4、11G4(1)B9、HFXLC、HFXI)的CDRs以及它們的編碼核苷酸序列，用于構(gòu)建本發(fā)明的改變的抗體，優(yōu)選人源化抗體。也使用相同或類似的技術(shù)以產(chǎn)生本發(fā)明的其它實(shí)施方案。按照常規(guī)克隆產(chǎn)生選擇供體mAb(例如小鼠抗體BC2)的雜交瘤，通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)獲得重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA,例如Sambrook等在"MolecularCloning:ALaboratoryManual",2ndedition,ColdSpringHarborLaboratory(1989)中描述的技術(shù)。使用多聚核苷酸引物和反轉(zhuǎn)錄酶，得到含有至少CDR-編碼區(qū)的BC2的可變重鏈和輕鏈區(qū)和為保持供體mAb結(jié)合特異性以及保持來自人免疫球蛋白抗體鏈的免疫球蛋白-來自部分所需的受體mAb輕鏈和/或重鏈可變域框架區(qū)。使用已知數(shù)據(jù)庫(kù)通過與其它抗體比較來鑒定CDR-編碼區(qū)。接著，制備小鼠/人嵌合抗體并分析結(jié)合能力。此嵌合抗體包含與人Ig兩條鏈恒定區(qū)結(jié)合的全部非-人供體抗體Vh和Vl區(qū)。使用計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)(例如KABAT⑧)鑒定來自人抗體重鏈可變區(qū)的同源性框架區(qū)，并選擇與BC2具有同源性的人抗體作為受體抗體。采用在框架區(qū)中任選核苦酸取代以整合入限制性酶切位點(diǎn)的手段，設(shè)計(jì)人抗體框架內(nèi)含有BC2CDR-編碼區(qū)的合成的重鏈可變區(qū)序列。然后，使用長(zhǎng)的合成寡聚體來合成設(shè)計(jì)的序列。或者，設(shè)計(jì)的序列通過重疊寡核苷酸來合成、通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增并且矯正錯(cuò)誤?？砂搭愃品绞皆O(shè)計(jì)適宜的輕鏈可變框架區(qū)。人源化抗體可來自嵌合抗體，或優(yōu)選地，通過將來自重鏈和輕鏈的供體mAbCDR-編碼區(qū)適當(dāng)?shù)夭迦脒x擇的重鏈和輕鏈框架內(nèi)而合成得到?；蛘?，使用標(biāo)準(zhǔn)誘變技術(shù)來制備本發(fā)明人源化抗體。因此，產(chǎn)生的人源化抗體含有人框架區(qū)和供體mAbCDR-編碼區(qū)。接著可進(jìn)行框架殘基的操作。產(chǎn)生的人源化抗體可在重組宿主細(xì)胞例如COS、CHO或骨髓瘤細(xì)胞中表達(dá)。對(duì)其它適宜的因子IX-特異性或其它凝血因子-特異性、自限性、中和、高親和力、3^-人抗體使用該項(xiàng)技術(shù)，可以制得其它人源化抗體。通過把改變抗體的編碼序列與常規(guī)調(diào)節(jié)控制序列可操作地結(jié)合，產(chǎn)生常規(guī)的表達(dá)載體或重組質(zhì)粒，所述常規(guī)調(diào)節(jié)控制序列能夠控制在宿主細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)，和/或由宿主細(xì)胞的分泌。調(diào)節(jié)序列包括啟動(dòng)子序列(例如CMV啟動(dòng)子)和信號(hào)序列(可以來自其它已知抗體)。類似地，可以產(chǎn)生具有編碼互補(bǔ)性抗體輕鏈或重鏈的DNA序列的第二個(gè)表達(dá)載體。優(yōu)選地，為盡可能確保每一個(gè)多肽鏈被功能性表達(dá)，除有關(guān)的編碼序列和選擇標(biāo)志之外,此第二個(gè)表達(dá)載體與第一個(gè)表達(dá)載體完全相同?；蛘?，改變的抗體的重鏈和輕鏈編碼序列存在于單個(gè)載體中。使用常規(guī)技術(shù)，將選擇的宿主細(xì)胞與第一和第二載體共轉(zhuǎn)染(或僅用一個(gè)載體轉(zhuǎn)染)以產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，其同時(shí)包含重組或合成的輕鏈和重鏈。然后，用常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞來產(chǎn)生本發(fā)明的基因工程抗體。通過適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)，例如ELISA或RIA，把包括重組重鏈和/或輕鏈相結(jié)合的人源化抗體從培養(yǎng)物中篩選出來。類似的常規(guī)技術(shù)可用于構(gòu)建其它本發(fā)明的改變抗體和分子。本發(fā)明方法和組分構(gòu)建物中使用的適于克隆和亞克隆步驟的載體，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員加以選擇。譬如，可使用pUC克隆載體系列，如pUC19,可自供應(yīng)商商購(gòu)得到，所述供應(yīng)商如Amersham或Pharmacia。另夕卜，能夠迅速?gòu)?fù)制、具有豐富克隆位點(diǎn)和選擇性基因(例如抗生素抗性)并容易操縱的任何載體，均可用于克隆。因此，在本發(fā)明中，克隆載體的選擇并不是限制因素。類似地，用于表達(dá)本發(fā)明基因工程抗體的載體，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員從任何常規(guī)載體中予以選擇。載體也含有指導(dǎo)異源DNA序列在選擇的宿主細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)的選擇的調(diào)節(jié)序列(如CMV啟動(dòng)子)。這些載體含有上述DNA序列，其編碼基因工程抗體或改變的免疫球蛋白編碼區(qū)。另外，載體可以整合選擇的為便于操作通過插入所需限制性酶切位點(diǎn)而修飾的免疫球蛋白序列。表達(dá)載體也以適于擴(kuò)增表達(dá)異源DNA序列的基因?yàn)樘卣?例如哺乳動(dòng)物二氫葉酸還原酶基因(DHFR))。其它優(yōu)選的載體序列包括聚腺苦酸信號(hào)序列，如來自牛生長(zhǎng)激素(BGH)和(3球蛋白啟動(dòng)子序列(betagl叩ro)。可用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)合成對(duì)于本發(fā)明有用的表達(dá)載體。通過已知的引導(dǎo)重組DNA產(chǎn)物在選^^宿主中表達(dá)和/或分泌所用的方法，可以從商業(yè)或天然來源或合成得到此類載體的組分，例如復(fù)制子、選擇基因、增強(qiáng)子、啟動(dòng)子，信號(hào)序列等。為了此目的，也可選擇其它無數(shù)類型的為本領(lǐng)域所知的用于哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、昆蟲、酵母和真菌表達(dá)的適宜表達(dá)載體。本發(fā)明也包括用含有基因工程抗體或其改變的免疫球蛋白分子編碼序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染了的細(xì)胞系。對(duì)于此類克隆載體克隆和其它操作有用的宿主細(xì)胞，也是常規(guī)的。然而，最期望來自各種大腸桿菌抹的細(xì)胞用于本發(fā)明構(gòu)建改變的抗體中的克隆載體的復(fù)制和其它步驟。表達(dá)本發(fā)明基因工程抗體或改變的抗體的適宜的宿主細(xì)胞或細(xì)胞系，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS(纖維母細(xì)胞(辨如3T3))和髓樣細(xì)胞，更加優(yōu)選CHO或髓樣細(xì)胞?？梢允褂萌思?xì)胞，這樣使得分子被用人糖基化模式予以修飾。或者，可以使用其它真核細(xì)胞系。適宜哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的選擇，以及轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、擴(kuò)增、篩選、產(chǎn)物生產(chǎn)和純化的方法，均為本領(lǐng)域所已知。參見例如Sambrook等，出處同上。證明細(xì)菌細(xì)胞作為適宜表達(dá)本發(fā)明重組Fabs的宿主細(xì)胞是非常有用的(參見例如，Pliickthun，A.,/www"o/i^v,"0,151-188(1992))。然而，由于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的蛋白呈未折疊或不適當(dāng)?shù)恼郫B形式或呈非-糖基化形式的傾向，因此在細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生的任何重組Fab將不得不進(jìn)行保留抗原結(jié)合能力的篩選。如果由細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)的分子以正確折疊的形式呈現(xiàn)，那么該細(xì)菌細(xì)胞則是所需的宿主。譬如，表達(dá)所用各種Eco//抹作為宿主細(xì)胞是生物工程領(lǐng)域眾所周知的。也可使用各種枯草芽孢桿菌抹、鏈霉菌屬、其它細(xì)菌等。如果需要，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的酵母抹以及昆蟲細(xì)胞(例如果蠅屬(Drasop/zZ/a)和鱗翅類(丄ep/c/c^era》和病毒性表達(dá)系統(tǒng)也可用作宿主細(xì)胞。參見例如Miller等，Ge""/c五"g/"een'wg，S，277-298，PlenumPress(1986)并在此引入作為參考。構(gòu)建本發(fā)明載體的一般方法、產(chǎn)生本發(fā)明宿主細(xì)胞所需的轉(zhuǎn)染方法和從該宿主細(xì)胞產(chǎn)生本發(fā)明改變的抗體所需的培養(yǎng)方法，均是常規(guī)技術(shù)。同樣，本發(fā)明改變的抗體一旦產(chǎn)生，則可以按照本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)而從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化出來，所述技術(shù)包括硫酸銨沉降、親和柱、柱層析、凝膠電泳等。這些技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)人員掌握范圍之內(nèi)并且不限制本發(fā)明。另一表達(dá)人源化抗體的方法，可利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的表達(dá)，例如美國(guó)專利4,873,316所描述的方法。該方法涉及使用動(dòng)物酪蛋白啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)，所述酪蛋白啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因性地整合進(jìn)哺乳動(dòng)物中，使雌性動(dòng)物在其乳汁中產(chǎn)生所需的重組蛋白?；蚬こ炭贵w一旦由所需方法產(chǎn)生，接著就要使用適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)檢測(cè)抗體的體外活性。目前，傳統(tǒng)的ELISA試驗(yàn)?zāi)Ｊ接糜诙ㄐ院投吭u(píng)定基因工程抗體與因子IX或與其它適合凝血因子的結(jié)合。另外，其它體外試驗(yàn)也用于證實(shí)中和效力，繼之后，進(jìn)行人臨床研究評(píng)價(jià)基因工程抗體在體內(nèi)的持久性(不管通常的清除機(jī)制)。按照所述的由BC2制備人源化抗體的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可由本文所述其它供體抗體、可變區(qū)序列和CDR肽構(gòu)建人源化抗體。可以產(chǎn)生具有潛在可能性地被基因工程抗體受體識(shí)別為"自身"可變區(qū)框架的基因工程抗體。對(duì)可變區(qū)框架小的修飾，可以引起抗原結(jié)合的大的增加，而對(duì)受體沒有可估量的增加的免疫原性。此類基因工程抗體可優(yōu)選治療人凝血因子-介導(dǎo)的病癥。此類抗體對(duì)于診斷這些病癥也是非常有用的。本發(fā)明也涉及抑制動(dòng)物特別是人血栓形成的方法，方法包括聯(lián)合施用有效劑量的具有自限性中和活性的抗-凝血因子單克隆抗體與纖溶酶原激活物。聯(lián)合治療增加亞-最適濃度纖溶酶原激活物時(shí)的血栓溶解，減少恢復(fù)血流的時(shí)間和增加血管再灌注的頻率和總持續(xù)時(shí)間。與肝素相反，聯(lián)合治療不顯著擾亂正常的止血功能和節(jié)約(spare)纖維蛋白原、纖溶酶原和oc-2-抗纖溶酶水平。因此，本發(fā)明也涉及減少在治療動(dòng)物血栓形成中所需溶栓劑劑量的優(yōu)選地，凝血因子來自固有的或普通的凝血途徑。最優(yōu)選地，抗-凝血因子單克隆抗體是抗-因子IX、抗-因子IXa、抗-因子X、抗-因子Xa、抗-因子XI、抗-因子XIa、抗-因子vm、抗-因子VIIIa、抗-因子V、抗-因子Va、抗-因子VII、抗-因子VIIa、抗凝血酶或抗-凝血酶原。MAb可包括一種或多種本文所述基因工程抗體或改變的抗體或者它們的片段。優(yōu)選地，纖溶酶原激活物是tPA、鏈激酶、尿激酶。特別優(yōu)選的是tPA。也優(yōu)選在例如TachiasandMadison,J"說o/C/^w，272，14580-14585(1997);Fujise等，C,腦/""o",95，715-722(1997);Coombs等，/脂C/z纖，273，4323-4328(1998);VandeWerf等，Z/eaWJ，"7,786-791(1999)描述的tPA變體，和鏈激酶與尿激酶變體，如單鏈尿激酶纖溶酶原激活物、?；睦w溶酶原鏈激酶激活劑復(fù)合物、葡萄球菌激酶和吸血蝠來源的纖溶酶原激活物?；蛘?，乙酰水楊酸與抗-凝血因子單克隆抗體聯(lián)合施用。某些情況下,聯(lián)合治療降低抗-凝血因子單克隆抗體的治療有效量。通過與各自凝血因子結(jié)合并且繼之自限性抑制凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而產(chǎn)生使用本發(fā)明分子而誘發(fā)的治療反應(yīng)。因此，以適于治療用的制劑和配制品形式存在的本發(fā)明分子，是易于患有或者體驗(yàn)過與下述疾病(但不限于此)有關(guān)的異常凝血活性的人群所高度期望的心肌梗塞、不穩(wěn)定型心絞痛、房性纖顫、中風(fēng)、腎臟損害、肺栓塞、深靜脈血栓形成和人工器官以及假體性植入物。特別優(yōu)選在心肌梗塞中使用。另一優(yōu)選的用途是在治療血栓栓塞后誘發(fā)的局部缺血中使用。因此，本發(fā)明也涉及治療動(dòng)物血栓栓塞后誘發(fā)的局部缺血的方法，包括施用抗-因子IX抗體或抗體片段。該抗體或片段可在栓子后施用，即在無論起源于脈管系統(tǒng)何處的血凝塊已經(jīng)進(jìn)入腦脈管系統(tǒng)并滯留、阻斷和/或減少血流且引起局部缺血之后再施用?？贵w或片段也可在中風(fēng)后施用，即在個(gè)體或觀察者識(shí)別到由栓子形成造成了神經(jīng)功能損害后施用。而且，本發(fā)明涉及治療動(dòng)物血栓栓塞后誘發(fā)的局部缺血的方法，包括聯(lián)合施用抗-因子IX抗體或抗體片段與纖溶酶原激活物?？贵w或片段和纖溶酶原激活物在栓子后或中風(fēng)后施用。這些治療方法導(dǎo)致側(cè)枝血管的持續(xù)灌注。本發(fā)明的損傷后治療方法緩解延長(zhǎng)局部缺血的后果，所述局部缺血如局部缺血床(bed)中持續(xù)性病理性血栓形成，后者可以造成梗塞組織擴(kuò)大和神經(jīng)缺損增大。另外，本發(fā)明涉及在動(dòng)物血栓栓塞后誘發(fā)的局部缺血治療中減少所需溶栓劑劑量的方法，包括聯(lián)合施用抗-因子IX抗體與溶栓劑。另一優(yōu)選的用途是向易于患血栓栓塞性中風(fēng)的動(dòng)物預(yù)防性給藥。因此，本發(fā)明也涉及預(yù)防動(dòng)物血栓栓塞性中風(fēng)的方法，包括向具有血栓栓塞中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)的動(dòng)物施用抗-因子IX抗體。具有血栓栓塞中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體包括但不限于易患心房顫動(dòng)或者接受外科手術(shù)或其它pro-促凝劑侵襲性技術(shù)的患者。本發(fā)明改變的抗體、抗體及其片段也用于與其它抗體聯(lián)接，特別是與負(fù)責(zé)本發(fā)明基因工程抗體所針對(duì)的病癥標(biāo)志物(表位)發(fā)生反應(yīng)的其它人mAbs。據(jù)信，本發(fā)明治療劑治療異常凝血病癥需要約1天至約3周，或者根據(jù)需要而定。這較目前使用的抗凝劑肝素和華法令顯示出相當(dāng)大的優(yōu)越性。劑量和治療期間涉及本發(fā)明分子在人循環(huán)中的相對(duì)持續(xù)時(shí)間，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)受治病癥和患者的一^:健康狀況而加以調(diào)整。本發(fā)明治療劑的給藥模式可以是將治療劑投放給宿主的任何適宜途徑。本發(fā)明的改變的抗體、抗體、基因工程抗體及其片段、纖溶酶原激活物、藥物組合物，特別適于非胃腸給藥，即皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或者鼻內(nèi)給藥。本發(fā)明治療劑可配制成在可藥用載體中含有有效量本發(fā)明基因工程(例如人源化)抗體和纖溶酶原激活物作為活性成分的藥物組合物。或者，本發(fā)明藥物組合物也可含有乙酰水楊酸。在本發(fā)明的預(yù)防藥中，優(yōu)選的是含有基因工程抗體、呈備用(readyfor)注射形式的含水懸浮液或者溶液，懸浮液或溶液優(yōu)選在生理pH緩沖。非胃腸給藥的組合物一般含有本發(fā)明基因工程抗體溶液或者基因工程抗體溶解在可藥用載體優(yōu)選含水載體中的混合物?？墒褂枚喾N載體，例如0.4%鹽液，0.3%甘氨酸等。這些溶液無菌并且一般不含微粒物。這些溶液可用常規(guī)的、眾所周知的滅菌技術(shù)(例如過濾)進(jìn)行滅菌。組合物可含有為接近生理?xiàng)l件所需的可藥用輔劑，如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑等。藥物制劑中本發(fā)明抗體濃度可以差異很大，即從小于約0.5%:通常為或至少約1%至高達(dá)15或20%重量，而且將依所選具體給藥模式主要根據(jù)液體體積、粘度等加以選擇。因此，本發(fā)明肌內(nèi)注射用的藥物組合物可制成含有l(wèi)mL無菌緩沖水和約1ng至約100mg(例如約50ng至約30mg或更多)、優(yōu)選地約5mg至約25mg本發(fā)明基因工程抗體。類似地，本發(fā)明靜脈輸注用藥物組合物可制成含有約250ml無菌Ringer's溶液和約1mg至約30mg、優(yōu)選5mg至約25mg本發(fā)明基因工程抗體。配制非胃腸給藥組合物的實(shí)際方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知或者對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯然的，并且表述在"Remington'sPharmaceuticalScience",15thed.,MackPublishingCompany,Easton,Pennsylvania中。優(yōu)選本發(fā)明治療劑在作為藥品制劑時(shí)是呈單位劑量形式。合適的治療有效量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員很方便地決定。為有效治療人或動(dòng)物的血栓或栓子性病癥，應(yīng)當(dāng)非胃腸道施用單劑量大約0.1mg至約20mg/kg體重的本發(fā)明蛋白或抗體，優(yōu)選靜脈輸注或者肌內(nèi)注射。如果需要，在血栓響應(yīng)期間可按照臨床醫(yī)師選擇的適當(dāng)?shù)拈g歇重復(fù)施用此劑量。為了貯存并于使用前在適宜載體中重懸，可以將本文描述的抗體、改變的抗體或其片段冷凍干燥。該項(xiàng)技術(shù)已被證實(shí)對(duì)于常規(guī)的免疫球蛋白是有效的，可以使用本領(lǐng)域熟知的冷凍干燥和重懸技術(shù)。現(xiàn)在，參照下列具體但非限制性實(shí)施例來描述本發(fā)明。實(shí)施例1制備和篩選抗-因子IX單克隆抗體給雌性Balb/C小鼠注射按照J(rèn)enny,R.等歷oc/zem，M，227-245(1986)所述方法純化的人因子IX。通常，每只小鼠接受的初始注射劑量為溶解在0.15mL磷酸緩沖鹽液(PBS)中并與0.15mL完全Freund's佐劑相混合的lOO(g蛋白。在2-3月的期間，每?jī)芍芤淮巫⑸淙苡?.15mLPBS和0.15mL不完全Freimd's佐劑中的50(g蛋白，以加強(qiáng)免疫。最后一次加強(qiáng)注射后，在脾/骨髓瘤細(xì)胞融合前3天小鼠接受溶于PBS的50(g因子IX。從免疫的小鼠中分離出脾細(xì)胞，并按照Oi，V.T.等在"SelectedMethodsinCellularImmunology,"Mishell,B.B.andShigii,S.M.,eds.,FreemanPress,SanFrancisco—書中描述的方法，使用聚乙二醇使脾細(xì)胞與NS-1骨髓瘤細(xì)胞融合(Kohler，G,等，￡"rJ7/www"o/，6,292-295(1976))。融合后，細(xì)胞重懸于含有10%胎牛血清的RPMI1640介質(zhì)中，將等量份的介質(zhì)加到含有0.5mL腹腔灌洗細(xì)胞-條件培養(yǎng)介質(zhì)的4塊24-孔板的每一個(gè)孔中。第二天，每孔接受1.0mL溶于含10%胎牛血清RPMI1640介質(zhì)中的2xl(T4M次黃噤呤、8x1(T7M氨蝶呤和3.2x1(T5M胸苷。每3-4天去除一半的介質(zhì)并代之以含有1x10"M次黃噤呤和1.6x1(T5M胸苷的新鮮介質(zhì)，由此營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。大約2周后，從每個(gè)孔中取出1.0mL雜交瘤介質(zhì)，使用Jenny,R丄爭(zhēng)在MeA￡"z>wo/，222,400-416(1993)中所述的ELISA試驗(yàn)4全測(cè)抗-因子IX抗體。簡(jiǎn)要講，將因子IX固定到96-孔微滴定板的塑料孔上，接著，在孔中孵育雜交瘤上清液或純化抗體的稀釋液。洗滌孔，并用與辣根過氧化物酶和生色物質(zhì)o-聯(lián)茴香胺(dianisidine)相偶合的山羊抗-鼠免疫球蛋白第二抗體來檢測(cè)抗體-抗原復(fù)合物的存在。通過有限稀釋將含有抗-因子IX抗體的孔亞克隆，并在96-孔板中生長(zhǎng)。通過上述ELISA測(cè)定從克隆的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中篩選因子IX的抗體，將來自陽(yáng)性雜交瘤的細(xì)胞擴(kuò)展(expand)、冷凍、貯于液氮中，然后在小鼠中作為腹水腫瘤生長(zhǎng)。實(shí)施例2抗-凝血因子抗體在凝血中的自限性作用在使用Baxter參考程序LIB0293-J,3/93版(BaxterScientific,Edison,NewJersey)的fibrometer(Becton-DickinsonMicrobiologySystems,Cockeysville,Maryland)中，測(cè)定增加抗-凝血因子抗體濃度對(duì)于人血漿激活的部分凝血激酶時(shí)間(aPTT)的影響。開始本試驗(yàn)之前，盛有2~3mL0.02MCaCl2的5mL試管放入fibrometer的加熱室中。人血漿樣本，要么來自新鮮采集血液并水浴保存，要么才姿照制造商的介紹而由HemostasisReferencePlasma(AmericanDiagnostics,Greenwich,Connecticut)重商己。來自豬腸粘膜的未分級(jí)的肝素(SigmaChemical,St.Louis,Missouri),來自腸豐占膜的4氐分子量肝素(Lovenox,enoxaparinsodium,Rhone畫PoulencRorerPharmaceuticals,Collegeville,Pennsylvania)或mAb4元凝劑，均酉己制成大約50iuM的儲(chǔ)備溶液，并系列稀釋直接成為檢測(cè)血漿。含有血漿而不含抗凝劑的空白管作為對(duì)照。兩個(gè)fibroTubefibrometer杯分別充滿含有抗凝劑的100(1檢測(cè)血漿和含有125|il肌動(dòng)蛋白激活的cephaloplastinreagent(肌動(dòng)蛋白試劑，來自鞣花酸中的兔腦腦磷脂，購(gòu)自BaxterScientific)的100|il檢測(cè)血漿，將兩個(gè)杯子放入到37°C的fibrometer井中。l分鐘后，將lOOial肌動(dòng)蛋白試劑轉(zhuǎn)移到含有血漿的杯中，用吸量管混合內(nèi)容物It次。孵育3分鐘后，使用AutomaticPipette/Timer-trigger(Becton-Dickinson)將預(yù)熱到37。C的100|ilCaCl2加入到血漿-肌動(dòng)蛋白試劑混合物中。記錄凝血時(shí)間，結(jié)果以凝血時(shí)間作為在300W總試驗(yàn)體積中抗凝劑終濃度的函數(shù)而呈示于圖1。試驗(yàn)中因子IX表觀濃度(nominalconcentration)是30-40nM。圖1所示結(jié)果描述增加鼠抗-因子IXmAbsBC1和BC2濃度對(duì)aPTT凝血時(shí)間的影響。兩種mAbs均通過延長(zhǎng)aPTT而抑制凝血，并且兩種mAbs均達(dá)到對(duì)aPTT的終極飽和效應(yīng)。BC1和BC2分別為~35nM和~50nM時(shí)，IC5。值類似，但是兩種抗體在最大響應(yīng)方面的差異是顯著的。飽和濃度的BC1增加aPTT約50%,達(dá)到~40秒。另一方面，BC2增加aPTT3.5倍，達(dá)到約90秒。在使用肝素的抗凝治療中所用的治療靶范圍是突出的。結(jié)果表明這兩種mAbs落入肝素治療的aPTT范圍。mAbsBCl和BC2的特性總結(jié)于表I。每一個(gè)BCmAbs識(shí)別酶原、因子IX以及活性蛋白酶、因子IXa,但只有BC2能夠阻斷酶原激活和蛋白酶活性。發(fā)現(xiàn)BC1和BC2與Cynomologous猴因子IX有交叉反應(yīng)。另外，BC2與大鼠因子IX也有交叉反應(yīng)。表I.抗-因子IXmAbs體外特性總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>圖2所示結(jié)果描述增加抗-因子IXmAbs9E4(2)F4和11G4(1)B9濃度對(duì)aPTT凝血時(shí)間的影響。將試驗(yàn)用血漿稀釋到正常濃度的一半，得到起始aPTT為45秒。兩種mAbs均通過延長(zhǎng)aPTT而抑制凝血，兩種mAbs均達(dá)到對(duì)aPTT的終極飽和效應(yīng)。9E4(2)F4和11G4(1)B9的飽和濃度增加aPTT，對(duì)于9E4(2)F4aPTT增加到~90至100秒，而11G4(1)B9增加至~80秒。結(jié)果表明兩種mAbs均處于肝素治療aPTT范圍的上末端。圖3所示結(jié)果描述增加抗-因子XmAbsHFXLC(相對(duì)輕鏈表位)，HFXHC(相對(duì)重鏈表位)和抗-因子XImabHFXI的濃度對(duì)aPTT凝血時(shí)間的影口向。這些mAbs得自EnzymeResearchLaboratories(SouthBend,IN)。mAbsHFXLC和HFXI通過延長(zhǎng)aPTT而抑制凝血，兩種mAbs均達(dá)到對(duì)aPTT的終極飽和效應(yīng)。HFXLC的IC5Q值是~40nM;飽和濃度增加aPTT至~60秒。HFXI的ICso值是20nM;飽和濃度增加aPTT至100秒。結(jié)果表明，HFXLC落入肝素治療aPTT范圍，而HFXI落入肝素治療范圍的上末端。mAbHFXHC對(duì)于aPTT凝血時(shí)間無影響。用因子VIII的抗體、因子IXa的輔因子，也觀察到aPTT的自限性延長(zhǎng)。例如，購(gòu)自A伍nityBiologicals，Inc.的抗-人因子VIII抗體、SAF8C-IQ增加aPTT至最大約65秒。用約100nM抗體，達(dá)到aPTT最大延長(zhǎng)的一半。實(shí)施例3鼠因子IXmAbs在大鼠血栓模型的效力為了評(píng)價(jià)抗-因子IX抗體在預(yù)防動(dòng)脈血栓形成中的效力，采用了Schumacher等在■/CaW/o尸/zam2,22，526-533(1993)中報(bào)道的大鼠頸動(dòng)脈血栓形成模型。該模型是如下構(gòu)成的將FeCl3溶液產(chǎn)生的氧自由基(oxygenradicals)施用在頸動(dòng)脈表面上，從而對(duì)頸動(dòng)脈內(nèi)皮造成局部(segmental)損傷。簡(jiǎn)而言之，用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，頸靜脈插套管以便進(jìn)行靜脈內(nèi)注射，左股動(dòng)脈插套管以便監(jiān)測(cè)血壓和心率。通過頸部手術(shù)切口無菌操作分離頸動(dòng)脈，并裝備上;茲性流動(dòng)探頭以便測(cè)量血流。穩(wěn)定一段時(shí)間后，建立下列各項(xiàng)變量的基線參數(shù)頸動(dòng)脈血流、動(dòng)脈壓、心率、激活的部分凝血激酶時(shí)間(aPTT)和凝血酶原時(shí)間(PT)。此后，4巴用50%FeCl3溶液濕透的預(yù)測(cè)(premeasured)Whatman濾紙放到頸動(dòng)脈上15分鐘，以徹底損傷下面的內(nèi)皮細(xì)胞。移走FeCl3浸濕的濾紙后，經(jīng)過60分鐘完成實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)?zāi)?，從頸動(dòng)脈中取出頸動(dòng)脈血栓并稱重。所有試藥均在開始頸動(dòng)脈損傷前15分鐘施用。檢驗(yàn)下列治療，并與因子IXmAbBC2進(jìn)行比較。1.肝素15、30、60或120U/kg快速濃注，接著在60分鐘內(nèi)分別輸注0.5、1、2或4U/kg/min。2.乙酰水楊酸(ASA,阿司匹林)5mg/kg快速濃注。3.抗-因子IXmAbBC2:1、3或6mg/kg快速濃注，隨后60分鐘時(shí)間內(nèi)分別車t注0.3、1或2(ig/kg/min。4.肝素30U/kg快速濃注+1U/kg/min+5mg/kg的ASA。5.抗-因子IXmAbBC2:1mg/kg+0.3(ig/kg/min+5mg/kg的ASA。圖4和5通過顯示肝素、ASA和因子IXmAbBC2對(duì)aPTT(圖4)和PT(圖5)的影響而描述抗-凝血?jiǎng)?血栓形成樣本的比較藥理學(xué)。出血素質(zhì)關(guān)鍵指數(shù)-aPTT，用作評(píng)價(jià)本研究所用抗-凝血?jiǎng)?血栓形成劑對(duì)出血傾向效力的主要標(biāo)準(zhǔn)。圖4的結(jié)果證實(shí)，肝素使aPTT劑量依賴性延長(zhǎng)，在兩個(gè)較高劑量時(shí)凝血時(shí)間最大延長(zhǎng)，超出檢測(cè)限。單獨(dú)的ASA不顯著增加aPTT,但與肝素聯(lián)合時(shí)，觀察到明顯的協(xié)同效應(yīng)。因子IXmAbs對(duì)于aPTT具有中度作用，即使是最高劑量，凝血時(shí)間的增加也不超過臨床實(shí)踐所用標(biāo)準(zhǔn)抗-凝血?jiǎng)┑?倍界限。最顯著的是，低劑量因子IXmAbBC2與ASA聯(lián)合并不改變aPTT。圖5中，數(shù)據(jù)表明肝素在兩個(gè)高劑量時(shí)和ASA+肝素聯(lián)合時(shí)也使PT顯著延長(zhǎng)，但任何劑量的因子IXmAb單獨(dú)時(shí)或者與ASA聯(lián)合時(shí)均不使PT延長(zhǎng)。肝素、ASA和因子IXmAb對(duì)頸動(dòng)脈閉塞的作用示于圖6。結(jié)果表明，所有載體-治療動(dòng)物的頸動(dòng)脈因?qū)p傷發(fā)生響應(yīng)而閉塞。肝素劑量依賴性地抑制頸動(dòng)脈的閉塞。在最高劑量時(shí)，肝素完全預(yù)防頸動(dòng)脈閉塞；然而，該劑量時(shí)不能引發(fā)凝血。單獨(dú)ASA對(duì)于頸動(dòng)脈閉塞僅有微小的作用。ASA與肝素聯(lián)合也不能完全預(yù)防頸動(dòng)脈閉塞。因子IXmAb在兩個(gè)高劑量時(shí)完全中止頸動(dòng)脈閉塞，而這兩個(gè)劑量并不使凝血延長(zhǎng)超過臨床所需的目標(biāo)。單獨(dú)使用很多情況下不能保證開放的低劑量因子IXmAb,當(dāng)與ASA聯(lián)合給藥時(shí)，完全抑制頸動(dòng)脈閉塞。肝素、ASA和因子IXmAb對(duì)血栓重量的影響示于圖7。肝素劑量依賴性減小頸動(dòng)脈血栓塊。然而，盡管完全阻斷凝血，但是仍在頸動(dòng)脈中發(fā)現(xiàn)了一些殘余的血栓。ASA單獨(dú)使用或者與肝素(30U/kg給藥方案)聯(lián)合給藥僅部分影響血栓重量。因子IXmAb劑量依賴性減小血栓塊，高劑量確實(shí)完全預(yù)防血栓形成。而且，低劑量抗-因子IXmAb和ASA聯(lián)合，一個(gè)完全預(yù)防頸動(dòng)脈閉塞而對(duì)凝固指標(biāo)無不利影響的給藥方案，完全預(yù)防血栓形成。在大鼠頸動(dòng)脈血栓形成模型進(jìn)行的該項(xiàng)研究清楚地證明，因子IXmAb在高度形成血栓的動(dòng)脈損傷模型中預(yù)防血栓形成的效力。最為突出的是，證實(shí)了因子IXmAb的效力落在aPTT限定的所期望的治療抗凝目標(biāo)內(nèi)。而且,肝素-現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)抗凝劑，僅在嚴(yán)重影響凝固達(dá)到產(chǎn)生不可凝固血液程度的劑量時(shí)才能獲得與因子IXmAb堪比的效力。有趣的是，觀察到的ASA與肝素聯(lián)合治療所達(dá)到的提高效力的作用和協(xié)同作用，在ASA與抗-因子IXmAb聯(lián)合給藥時(shí)也得到了證實(shí)。然而，與肝素和ASA聯(lián)合導(dǎo)致抗-血栓形成和抗-凝血?jiǎng)┳饔镁鰪?qiáng)不同，因子IXmAb和ASA聯(lián)合導(dǎo)致抗-血栓形成效力提高而與對(duì)體外血液凝固參數(shù)沒有持續(xù)作用。一起考慮，數(shù)據(jù)顯示，因子IXmAb卓越的抗血栓形成能力比得上肝素、ASA或肝素與ASA的聯(lián)合。實(shí)施例4大鼠血栓形成模型的掃描電鏡應(yīng)用氯化鐵后15分鐘，從假性對(duì)照(sham)、單用氯化鐵、氯化鐵+6mg/kg因子IX抗體的模型中采集大鼠頸動(dòng)脈(3/組)片段。通過曱醛灌注并且結(jié)扎損傷區(qū)域的上下兩端而固定動(dòng)脈。將固定動(dòng)脈脫水，六曱基二硅氮烷中溫育并在干燥器中干燥。將干燥的動(dòng)脈縱向切開，放置在掃描電鏡(SEM)的支柱上并用金濺射涂膜。假性對(duì)照動(dòng)脈的SEM顯示基本正常的內(nèi)皮，伴有零星分散的血小板。內(nèi)皮中有少數(shù)破裂處，可能是手術(shù)期間機(jī)械損傷的結(jié)果，下面的基底膜覆蓋有一層血小板。在模型大鼠中未觀察到血栓形成的證據(jù)。用氯化鐵處理的動(dòng)脈SEM顯示占據(jù)管腔大部分的大的壁血栓。血栓由聚集的血小板、紅細(xì)胞和無定形及纖維性蛋白性材料。蛋白性材料由纖維蛋白組成。動(dòng)脈內(nèi)皮大部分被大的血栓遮蓋?？梢钥吹?，用氯化鐵處理過的區(qū)域下的內(nèi)皮被無數(shù)附著的血小板和無定形蛋白性物質(zhì)所覆蓋。取自大鼠的用氯化鐵處理、也用因子IX抗體處理過的動(dòng)脈的SEM，顯示大部分管腔沒有血栓。用氯化鐵處理過區(qū)域下的內(nèi)皮顯示出廣泛損傷，且一些區(qū)域被附著的血小板所覆蓋和血小板聚集，但是沒有或者很少有蛋白性物質(zhì)。實(shí)施例5抗-因子IXmAbBC2重鏈和輕鏈cDNA序列分析使用TriReagent(MolecularResearchCenter,Inc.,Cincinnati,OH)按照制造商的指導(dǎo)純化總RNA。用異丙醇沉淀RNA并溶于0,5%SDS以及以0.5MNaCl調(diào)整。按照制造商的指導(dǎo)，使用Dynabeads01igo(dT)25(DynalA.S.,LakeSuccess,NY)分離聚腺苦酸化RNA。從珠粒中洗脫聚腺苷酸化RNA并將后者重懸于TE緩沖液。根據(jù)制造商的說明書(BoehringerMannheimCat.No.1483-188),以dT寡聚物起始采用RT-PCR試劑盒將12等量份的100ngRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。對(duì)于重鏈，使用鼠IgG2a鉸鏈引物(SEQIDNO:l)和重鏈信號(hào)序列引物(SEQIDNO:2)，將6RNA/DNA雜化物進(jìn)行25輪PCR擴(kuò)增。類似地，對(duì)于輕鏈，使用小鼠k引物(SEQIDNO:3)和簡(jiǎn)并輕鏈信號(hào)序列引物(SEQIDNO:4)，將6RNA/DNA雜化物進(jìn)行25輪PCR擴(kuò)增。將12份擴(kuò)增物中的每一份PCR產(chǎn)物聯(lián)接PCR2000載體(TAcloningKit,Invitrogen,Cat.No.K2000-01)。隨機(jī)挑選重組克隆的集落，使用Birnboim和Doly在M/c/.爿d^7，1513(1979)中所述的堿性提取方法，小量制備質(zhì)粒DNA。用五coRI消化分離的質(zhì)粒DNA,并在0.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析。通過改進(jìn)的Sanger法，對(duì)雙鏈cDNA的適宜大小的插入片段(即對(duì)于重鏈?zhǔn)莮700bp而對(duì)于輕鏈?zhǔn)?00bp)測(cè)序。比較所有12份產(chǎn)物的重鏈和輕鏈的序列，得到共有的BC2重鏈可變區(qū)序列(SEQIDNO:5)和共有的BC2輕鏈可變區(qū)序列(SEQIDNO:6)。BC2重鏈可變區(qū)cDNA的序列分析揭示了編碼121氨基酸序列的363核苷酸開放閱讀框架(SEQIDNO:7)。重鏈CDR1、2和3序列分別列于SEQIDNOs:8、9和10。BC2輕鏈可變區(qū)cDNA的序列分析揭示了編碼107氨基酸序列的321核苷酸開放讀框(SEQIDNO:11)。輕鏈CDR1、2和3序列分別列于SEQIDN012、13和14。實(shí)施例6人源化抗體將稱為SB249413、SB249415、SB249416、SB249417、SB257731和SB257732的6個(gè)人源化抗體設(shè)計(jì)為在人抗體框架中含有上述鼠CDRs。SB249413SB249413含有重鏈F9HZHC1-0和輕鏈F9HZLC1-0。使用得自免疫球蛋白R(shí)P-TS3'CL的重鏈的前3個(gè)框架區(qū)(Capra,J.D.等，《/C7/"./"veW.<56，1320-1328(1990)在Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)識(shí)為Kabpro:HhclOw)和前述BC2重鏈CDRs,設(shè)計(jì)合成的可變區(qū)人源化重4連F9HZHCl-0。不進(jìn)行影響CDR呈遞的框架氨基酸取代。產(chǎn)生四個(gè)重疊的合成寡核苷酸(SEQIDNOs:15、16、17和18),后者在退火和延伸時(shí)，編碼代表重鏈可變區(qū)并包括CDR3(SEQIDNOs:19和20)的氨基酸。然后，使用PCR引物(SEQIDNOs:21和22)擴(kuò)增該合成的基因，將該基因聯(lián)接于pCR2000載體(TAcloningKit,Invitrogen,Cat.No.K2000-01)并從5^el、《;"I限制性消化中分離。使用2個(gè)引物(SEQIDNOs:26和27)經(jīng)PCR擴(kuò)增編碼人源化抗-呼吸道合病毒重鏈(SEQIDNO:25)的構(gòu)建物的適當(dāng)區(qū)域，并用限制性內(nèi)切酶&oRI和6^I進(jìn)行消化，得到編碼包括可變區(qū)(SEQIDNOs:23和24)前5個(gè)氨基酸的campath信號(hào)序列的第二個(gè)DNA片段。產(chǎn)生的2個(gè)片段聯(lián)接進(jìn)五coRl、消化的含有人共有框架4和IgGl恒定區(qū)的pFHZHC2-6pCD哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體。含有單個(gè)氨基酸突變載體的pFHZHC2-3pCD載體描述在公布的國(guó)際專利申請(qǐng)WO94/05690中。用和￡coR5消化pFHZHC2-3pCD并插入得自2個(gè)合成的寡核苷酸(SEQIDNOs:28和29)的聯(lián)接子，使框架2最后的殘基(殘基49)由絲氨酸突變?yōu)楸彼?。F9HZHCl-O插入物的序列示于SEQIDNOs:30和31。使用得自免疫球蛋白LS8'CL(Carmack等，J五:cp.M9，163l-1643(1989)在Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)識(shí)為Kabpro:Hkl318)的人輕鏈的框架區(qū)和前述BC2輕鏈CDRs，設(shè)計(jì)合成的可變區(qū)人源化輕鏈F9HZLC1-0。不進(jìn)行可能影響CDR呈遞的框架氨基酸取代。產(chǎn)生了兩個(gè)重疊的合成的寡核苷酸(SEQIDNOs:32和33),當(dāng)后者退火和延伸時(shí)，編碼代表輕鏈可變區(qū)(SEQIDNOs:34和35)的氨基酸。然后，使用PCR引物(SEQIDNOs:36和37)擴(kuò)增該合成的基因，將該基因聯(lián)接進(jìn)pCR2000載體(TAcloningKit，Invitrogen,Cat.No.K2000-01)并從&al、&cll限制性消化中分離。使用2個(gè)引物(SEQIDNOs:26和40)經(jīng)PCR擴(kuò)增編碼人源化抗-呼吸道合病毒重鏈(SEQIDNO:25)的構(gòu)建物的適當(dāng)區(qū)域，并用限制性內(nèi)切酶五coRI和Seal進(jìn)行消化，得到編碼包括可變區(qū)(SEQIDNOs:38和39)頭2個(gè)氨基酸的campath信號(hào)序列的第二個(gè)DNA片段。將產(chǎn)生的2個(gè)片段聯(lián)接進(jìn)EcoRl、5*acII消化的含有人框架4和K恒定區(qū)的pFHzLCl-2pCN哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體中。含有單個(gè)氨基酸突變的載體的pFHZLCl-lpCN載體描述在7>布的國(guó)際專利申請(qǐng)WO94/05690中。通過用Swal和A/"l消化pFHZLCl-pCN并插入得自2個(gè)合成的寡核苷酸(SEQIDNOs:41和42)的聯(lián)接子，使框架2的一個(gè)殘基由絲氨酸突變?yōu)楦彼帷9HZLCl-0插入物的序列示于SEQIDNOs:43和44。SB249415SB249415含有重鏈F9HZHC1-1和輕鏈F9HZLC1-1。這些重鏈和輕鏈構(gòu)建物分別基于F9HZHCl-0和F9HZLC1-0,然而，它們具有影響CDR呈遞的框架氨基酸取代。F9HZHCl-l具有可能影響CDR呈遞的3個(gè)框架氨基酸取代。產(chǎn)生兩個(gè)重疊的合成寡核苷酸(SEQIDNOs:45和46)，當(dāng)后者退火和延伸時(shí)，編碼代表重鏈可變區(qū)的可變部分的氨基酸發(fā)生改變(SEQIDNOs:47和48)。然后，使用PCR引物(SEQIDNOs:49和50)擴(kuò)增合成的基因，將基因聯(lián)接進(jìn)pCR2000載體(TAcloningKit,Invitrogen,Cat.No.K2000-01)并從EcoNI、《/wi限制性消化中分離。將該片段聯(lián)接進(jìn)五coM、a:/"i消化的F9HZHC1-0(SEQIDNO:30)載體中。F9HZHC1-1插入物的序列示于SEQIDNOs:51和52。F9HZLC1-1具有影響CDR呈遞的4個(gè)框架氨基酸取代。產(chǎn)生兩個(gè)合成的寡核苷酸(SEQIDNOs:53和54)，當(dāng)后者退火時(shí)，具有《jwl和BawHI粘性末端，并編碼代表輕鏈可變區(qū)(SEQIDNO:55)改變部分的氨基酸。用限制性內(nèi)切酶和5amHI消化F9HZLCl-0(SEQIDNO:43)并與合成的DNA聯(lián)接。F9HZLC1-1插入物的序列示于SEQIDNOs:56和57。sb249416SB249416含有重鏈F9HZHCl-l(上述)(SEQIDNO:52)和輕鏈F9HZLC1-2。輕鏈構(gòu)建物基于F9HZLC1-1,然而，它具有影響CDR呈遞的另外一個(gè)框架氨基酸取代。產(chǎn)生了兩個(gè)合成的寡核苷酸(SEQIDNOs:58和59)，當(dāng)退火時(shí)，具有5amHI和Z&al粘性末端并編碼代表輕鏈可變區(qū)可變部分的氨基酸(SEQIDNO:60)。用限制性內(nèi)切酶^wffl和Wal消化F9HZLC1-l(SEQIDNO:56)載體并與合成的DNA相聯(lián)接。F9HZLCl-2插入物序列示于SEQIDNOs:61和62。sb249417SB249417含有重鏈F9HZHCl-l(上述)(SEQIDNO:52和輕鏈F9HZLC2-0。寸吏用得自免疫J求蛋白R(shí)EI(PalmandHilschmann,ZP/zj^/o/.C/zem.354，1651-1654(1973)在Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)識(shí)為Kabpro:HKLlll)的人輕鏈框架區(qū)和前述BC2輕鏈CDRs，設(shè)計(jì)F9HZLC2-0合成的可變區(qū)人源化輕鏈。引入5個(gè)氨基酸共有人取代基。進(jìn)行影響CDR呈遞的6個(gè)框架氨基酸鼠取代。產(chǎn)生兩個(gè)重疊的合成寡核苷酸(SEQIDNOs:63和64)當(dāng)后者退火并延伸時(shí)，編碼代表輕鏈可變區(qū)的氨基酸(SEQIDNOs:65和66)。然后，使用PCR引物(SEQIDNOs:67和68)擴(kuò)增該合成的基因，將該基因聯(lián)接進(jìn)pCR2000載體(TAcloningKit,Invitrogen,Cat.No.K2000-01)并從Scal、SacII限制性消化中分離。使用2個(gè)引物(SEQIDNOs:26和69)經(jīng)PCR擴(kuò)增編碼人源化抗-呼吸道合病毒重鏈(SEQIDNO:25)的構(gòu)建物的適當(dāng)片段，并用限制性內(nèi)切酶五coRI和5bal消化，得到編碼包括可變區(qū)(SEQIDNO:38)頭2個(gè)氨基酸的campath信號(hào)序列的第二個(gè)DNA片段。通過退火2個(gè)合成的寡頁(yè)核苷酸(SEQIDNOs:71和72),產(chǎn)生編碼人框架4(SEQIDNO:70)并具有和7VwI粘性末端的第三個(gè)DNA片段。用限制性內(nèi)切酶五coRI和Warl消化F9HZLCl-O(SEQIDNO:43)，并聯(lián)接到3個(gè)DNA片段。F9HZLC2-0插入物的序列示于SEQIDNOs:73和74。SB257731SB257731含有重鏈F9HZHCl-l(SEQIDNO:52)和輕鏈F9HZLC1-3,F9HZLC1-2(SEQIDNO:62)的單個(gè)氨基酸突變。用2個(gè)引物(SEQIDNOs:26和69)經(jīng)PCR擴(kuò)增F9HZLC1-2，并用限制性內(nèi)切酶￡coRI和5bd進(jìn)行消化。分離出94bp片萃更(SEQIDNOs:75和76)。將該片,爻if關(guān)接進(jìn)五coRI、Seal消化的F9HZLC1-2載體中產(chǎn)生輕鏈構(gòu)建體F9HZLC1-3。F9HZLC1-3插入物的序列示于SEQIDNOs:77和78。SB257732SB257732含有合成的可變區(qū)人源化重鏈F9HZHC3-和輕鏈F9HZLC3—0。產(chǎn)生4個(gè)重疊的合成寡核香酸(SEQIDNOs:79、80、81和82),當(dāng)后者退火并延伸時(shí)，編碼代表被改變的重鏈可變區(qū)的氨基酸(SEQIDNOs:83和84)。然后，使用PCR引物(SEQIDNOs:85和86)擴(kuò)增該合成的基因，將基因聯(lián)接進(jìn)pCR2000載體(TAcloningKit,Invitrogen,Cat.No.K2000-01)中，并從5VmI、《;"I限制性消化中分離。將分離的片段聯(lián)接進(jìn)&wl、《;wl消化的F9HZHC1-1(SEQIDNO:52)載體。然后，用五coRl、Spel消化該載體以除去信號(hào)序列。使用2個(gè)引物(SEQIDNOs:26和87)經(jīng)PCR擴(kuò)增F9HZHC1-0并用限制性內(nèi)切酶五coRI和S/el消化，得到編碼含有可變區(qū)頭5個(gè)氨基酸的信號(hào)序列(SEQIDNO:23)的DNA片段。將產(chǎn)生的片段聯(lián)接進(jìn)載體中。F9HZHC3-0插入物的序列示于SEQIDNOs:88和89。產(chǎn)生了4個(gè)重疊的合成寡核苷酸(SEQIDNOs:卯、91、92和93),當(dāng)它們退火并延伸時(shí)，編碼代表輕鏈可變區(qū)(SEQIDNOs:94和95)的氨基酸。然后，使用PCR引物(SEQIDNOs:96和97)擴(kuò)增該合成的基因，將基因聯(lián)接進(jìn)pCR2000載體(TAcloningKit,Invitrogen,Cat.No.K2000-01)并從5bal、限制性消化物中分離。將分離的片段聯(lián)接進(jìn)&"1、iV"rl消化的F9HZLC1-3(SEQIDNO:77)載體中。F9HZLC3-0插入物的序列示于SEQIDNOs:98和99。人源化抗-因子IXmAbs在CHO細(xì)胞表達(dá)。將適合在不含血清的介質(zhì)中懸浮生長(zhǎng)的DG-44細(xì)胞系接種到盛在250ml—次性無菌埃倫邁爾燒瓶(Corning)中的不含蛋白但含有IX核苷酸和0.05%F68的100ml介質(zhì)中，所述埃倫邁爾燒瓶;改在37°C5%C02、95%空氣潮濕培養(yǎng)箱的Innova2100型150rpm平臺(tái)振動(dòng)器(NewBrunswickScientific)上。這些細(xì)胞以4X105細(xì)胞/ml每周兩次進(jìn)行傳代。通過用iVo/l消化，每15嗎的pCN-Lc-輕鏈和pCD-Hc-重鏈載體線性化，無菌條件下共沉淀并重懸于50ulIXTE緩沖液(10mMTris,ImMEDTA,pH7.5)中。使用Hensley等在/C/zem.269,23949-23958(1994)中所述技術(shù)，利用Bio-RadGenePulser(Bio畫RadLaboratories)將DNA電傳孔進(jìn)Acc-098細(xì)胞中。1.2X107細(xì)胞在12.5ml冰浴PBS蔗糖溶液(PBS，272mM蔗糖，7mMpH7.4磷酸鈉，ImMMgCl2)中洗滌一次，重懸于0.8mlPBS，加入50ulDNA溶液并在水上培養(yǎng)15min。于380V和25微法脈沖(pulse)細(xì)胞，然后在水上培養(yǎng)10min。篩選前24hr，將細(xì)胞以在維持介質(zhì)中5X105細(xì)胞/板的密度鋪板到96孔培養(yǎng)板中。在維持介質(zhì)中，通過對(duì)400pg/mlG418(Geneticin，LifeTechnologies,Inc.)的抗性來篩選細(xì)胞。測(cè)定前24hr,用150|iil維持介質(zhì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)法在Origen分析器(IGEN,Inc.)上測(cè)定來自各個(gè)集落的條件培養(yǎng)基，參見Yang等，/2,193-194(1994)。進(jìn)行測(cè)定(測(cè)定緩沖劑)和操作分析器(細(xì)胞清潔劑)所需的所有溶液均來自IGEN。使用TAG-NHS-酯(IGEN,Inc.)按照TAG:蛋白為7:1的摩爾比標(biāo)記抗體(抗-人IgG(g-鏈特異性)，Sigma化學(xué)品和人IgG(H+L)的F(ab')2片段,Kirkegaard&PerryLaboratoriesInc.),同時(shí)用生物素-LC-Sulfo-NHS-酯(IGEN,Inc.)以生物素:蛋白為20:1的摩爾比對(duì)蛋白A(Sigma)加以標(biāo)記，兩種標(biāo)記均按照IGEN'的推薦進(jìn)行?？股鞍祖溇?涂層的磁珠(M-280)購(gòu)自Dynal。使用下述步驟進(jìn)行免疫測(cè)定每份樣本，5(^1抗生蛋白鏈菌素-涂層的磁珠(用吐溫1.25%稀釋成在pH7.8PBS中的終濃度為600(g/ml)與50^1生物素-蛋白A(用1.25。/。吐溫在pH7.8PBS中稀釋為終濃度1^ig/ml)混合，并于室溫?cái)嚢锠顟B(tài)下孵育15分鐘，加入50|iilTAG抗體(終濃度1.25(g/ml人IgG(H+L)的F(ab')2片段與用1.25%吐溫在pH7.8PBS中稀釋的0.25(g/ml抗-人IgG(g-鏈特異性)的混合物)，然后，將溶液加入到5(Hil條件培養(yǎng)介質(zhì)中，于室溫?cái)嚢锠顟B(tài)下孵育1hr。200|iil測(cè)定緩沖液加入到反應(yīng)混合物中，在OrigenI型分析器上分析樣本以測(cè)定ECL。結(jié)果表明，約20-37%的被測(cè)定集落分泌超過15ng/ml的抗體，平均表達(dá)約150ng/ml。使用ProcepA捕獲步驟(step)接著進(jìn)行離子交換色語(yǔ)以減少DNA負(fù)擔(dān)，從條件培養(yǎng)介質(zhì)中純化人源化抗-因子IXmAbs。ProcepA吸著劑材料(BioprocessingLtd.,Durham,England)用于制備直徑與高度比為1:1的柱。把澄清的條件培養(yǎng)介質(zhì)以150cm/hr的速度裝載到柱上。用磷酸緩沖鹽液(PBS)、含有1MNaCl的PBS、最后用PBS順次洗柱。結(jié)合的物質(zhì)用0.1M乙酸洗脫液收獲。將洗脫液調(diào)整至pH5.5并用水稀釋(1:4)。以80cm/hr的速度將稀釋液裝載到預(yù)先用pH5.520mM乙酸鈉平衡過的S-瓊脂糖凝膠柱(2.5x13cm)上。用乙酸緩沖液洗柱直至得到穩(wěn)定的基線，并用pH7.4的20mM磷酸鈉以25cm/hr速度洗脫結(jié)合的蛋白。洗脫下來的物質(zhì)用0.4孩i米的膜過濾并貯于4°c。實(shí)施例7小鼠-人嵌合抗體按照制造商(BoehringerMannheimCat.No.1483-188)的指示，使用dT寡聚物引發(fā)，用RT-PCR試劑盒對(duì)100ngBC2RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用合成的ScflI(SEQIDNO:IOO)和A^rl(SEQIDNO:IOI)引物擴(kuò)增PCR，以產(chǎn)生帶有&al、？Varl末端(SEQIDNOs:102和103)的BC2輕鏈可變區(qū)。該DNA聯(lián)接進(jìn)&al、Warl消化的F9HZHC1-3(SEQID77)中，并用&"I、A^rl進(jìn)行消化以產(chǎn)生小鼠-人嵌合輕鏈F9CHLC(SEQIDNOs:104和105)。按照制造商(BoehringerMannheimCat.No.1483-188)的指示，使用dT寡聚物作為引物，用RT-PCR試劑盒對(duì)100ngBC2RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用合成的S/el(SEQIDNO:106)和MzeI(SEQIDNO:107)引物擴(kuò)增PCR,以產(chǎn)生帶有Spel、Mzel末端(SEQIDNOs:108和109)的BC2重鏈可變區(qū)。用五coRI(SEQID26)和S/el(SEQID87)引物從RSVHZ19重鏈(SEQIDNO:25)中PCR擴(kuò)增campath信號(hào)序列。把這兩個(gè)DNA片段聯(lián)接進(jìn)五coRI、Mzel消化的公布的國(guó)際專利申請(qǐng)WO95/07301所述的IL4CHHCpcd載體中，用BC2因子IX小鼠可變區(qū)代替IL4可變區(qū)，從而產(chǎn)生小鼠-人嵌合的重鏈F9CHHC(SEQIDNos:110和111)。按照上述人源化構(gòu)建物的共轉(zhuǎn)染和純化方法，完成小鼠-人嵌合抗體chaFIX的共轉(zhuǎn)染和純化。實(shí)施例8人源化因子IXmAbs在大鼠血栓模型的效力為了評(píng)價(jià)人源化抗-因子IX抗體預(yù)防動(dòng)脈血栓形成的效力，使用了實(shí)施例3所述的大鼠頸動(dòng)脈血栓形成模型。建立頸動(dòng)脈血流、動(dòng)脈壓、心率、血管開放和激活的部分凝血激酶時(shí)間(aPTT)的基線參數(shù)。此后15分鐘，損傷頸動(dòng)脈10分鐘。發(fā)生頸動(dòng)脈損傷后60分鐘，測(cè)定這些參數(shù)。也從頸動(dòng)脈中取出頸動(dòng)脈血栓并稱重。所有試藥均在發(fā)生頸動(dòng)脈損傷前15分鐘經(jīng)靜脈施用。檢驗(yàn)下述治療并與抗-因子IXmAbBC2進(jìn)行比較。1.載體2.chaFIX:3mg/kg快速濃注3.SB249413:3mg/kg快速濃注4.SB249415:3mg/kg快速濃注5.SB249416:3mg/kg快速濃注6.SB249417:3mg/kg快速濃注7.SB257731:3mg/kg快速濃注8.肝素60units/kg快速濃注+2單位/kg/min輸注aPTT用作評(píng)價(jià)本研究所用抗-凝血?jiǎng)?血栓劑效力對(duì)出血傾向的主要標(biāo)準(zhǔn)。圖8的結(jié)果證實(shí)，人源化因子IXmAbsSB249413、SB249415、SB249416、SB249417和SB257731在3,0mg/kg時(shí)對(duì)aPTT具有中度的作用，所用劑量在臨床可接受范圍之內(nèi)。因子IXmAbs對(duì)血栓塊的作用示于圖9。結(jié)果表明，所有人源化mAbs在減小血栓塊方面同等有效。該項(xiàng)在大鼠頸動(dòng)脈血栓形成模型進(jìn)行的研究清楚地證明，人源化因子IXmAbs在高度形成血栓的動(dòng)脈損傷模型中預(yù)防血栓形成的效力。最突出的是,所有人源化因子IXmAbs的效力落入所期望的由aPTT限定的治療抗凝目標(biāo)范圍之內(nèi)。實(shí)施例9抗體的生物化學(xué)和生物物理學(xué)特性用MALD-MS測(cè)定SB249417的分子質(zhì)量為148，000Da。SB249417的分析性超速離心得到完全相同的值。在因子IX和Ca2+存在時(shí)，得自BC2沉淀的抗體具有248，000Da的質(zhì)量，相當(dāng)于mAb和兩個(gè)因子IX合起來的質(zhì)量。存在或不存在因子IX時(shí)，未觀測(cè)到更高數(shù)量級(jí)聚集物的證據(jù)。用與固定的蛋白A表面相結(jié)合的抗體，使用BIAcore分析法評(píng)定了因子IX與SB249417結(jié)合的動(dòng)力學(xué)。使用49nM重組人因子IX(rhFIX，GeneticsInstitute)并在5mMCa+存在條件下進(jìn)行測(cè)定。相互作用以快速結(jié)合和相對(duì)緩慢的解離速度為特征，結(jié)合kass二2.0x105M-ls-1,而解離kdiss=4.1x10_4s-l。計(jì)算出因子IX結(jié)合的Kd為1.9nM。表1總結(jié)SB249417的生物物理學(xué)特性。表1SB249417的生物物理學(xué)特性總結(jié)同位型IgGl,kappa由SDS-PAGE的純度>95%(還原條件下)分子量質(zhì)譜觀情法分析性超速離心法148,000Da148,000Da因子IX結(jié)合的化學(xué)計(jì)量學(xué)等溫滴定測(cè)熱法1.5摩爾因子IX:l摩爾mAb因子IX結(jié)合親合性等溫滴定測(cè)熱法生物傳感器Kd=4nM,25。CKd=2nM因子IX結(jié)合動(dòng)力學(xué)生物傳感器kass=2.0x105M-ls-lkdiss=4X10-4s-l表2總結(jié)本發(fā)明mAbs的因子IX結(jié)合特性。計(jì)算的解離常數(shù)基本上相同，在試驗(yàn)誤差之內(nèi)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>用滴定微量量熱法描述rhFIX和SB249417,BC2和其它人源化構(gòu)建物之間相互作用的特征，微量量熱法測(cè)量溶液中來自結(jié)合固有熱的結(jié)合相互作用。將106(MFIX9次注射入含有2(iMmAbSB249417的熱量計(jì)中。以發(fā)出的熱量檢測(cè)頭4次注射的結(jié)合。最后5次注射時(shí)，用FIX飽和mAb結(jié)合位點(diǎn)，僅僅觀測(cè)到混合的基礎(chǔ)(background)熱量。結(jié)果表明，如預(yù)期的那樣，等位點(diǎn)發(fā)生在FIX/mAb的摩爾結(jié)合比接近2。非線性最小平方分析這些數(shù)據(jù)得到結(jié)合親合力。在34-44。C溫度范圍內(nèi)，在pH7.4的10mMHEPES、10mMCaCl2、150mMNaCl中，測(cè)定mAbs的rhFIX親和力。這些數(shù)據(jù)使得直接測(cè)定37°C的親和力，從van'tHoff方程中計(jì)算25°C時(shí)的親和力。表3中的數(shù)據(jù)表明，SB249417、BC2和它的其它人源化構(gòu)建物的親和力相同，在誤差之內(nèi)(因子2)。表3抗-FIXmAbs滴定測(cè)熱法的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>通過差式掃描測(cè)熱法測(cè)定，mAbsSB249413、SB249415、SB249417和SB257732均顯示出極類似的熱穩(wěn)定性。它們的未折疊(unfolding)Tms范圍為70-75°C，表明對(duì)抗熱誘導(dǎo)變性的高穩(wěn)定性。實(shí)施例10抗體-介導(dǎo)的抑制因子IX的機(jī)制構(gòu)建由因子IX序列剪接進(jìn)同源蛋白因子VII框架而構(gòu)成的嵌合構(gòu)建物文庫(kù)，并用于繪制因子IXBC2mAb的表位。見Cheung等，77zram6.朋，419-427(1995)。使用BiaCore2000表面胞質(zhì)團(tuán)共振裝置，測(cè)定結(jié)合。BC2抗體利用NHS/EDC反應(yīng)直接與芯片(chip)偶合。在pH7.4，25mMMOPS、0.15MNaCl、5mMCaCl2中，以20|LiL/min的量與200nM每種給定構(gòu)建物進(jìn)行接觸，接觸兩分鐘測(cè)定結(jié)合。使用相同但不含蛋白質(zhì)的緩沖液，監(jiān)測(cè)3分鐘的解離情況。在存在50mMEDTA的條件下，未;f企測(cè)到野生型構(gòu)建物。數(shù)據(jù)示于表4。200710141110.X說明書第38/104頁(yè)表4因子IX構(gòu)建物與BC2抗體結(jié)合的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>這些數(shù)據(jù)表明，下列構(gòu)建物表現(xiàn)出與BC2結(jié)合含有因子IX輕鏈和因子VII重鏈(IXLC/VIIHC)的構(gòu)建物;含有因子IXgla和芳族堆疊結(jié)構(gòu)域(IX-A/VII)的構(gòu)建物;含有在因子VIIgla結(jié)構(gòu)域(VIIgla(IX3-ll)/IX)之內(nèi)的因子IXgla結(jié)構(gòu)域的殘基3-11的構(gòu)建物；和含有在殘基5(IXK5A)處具有賴氨酸取代為丙氨酸的因子IX的構(gòu)建物。VIIgla(IX3-11)/IX構(gòu)建物顯示出等同于野生型因子IX(血漿IXaandr-IX)的BC2結(jié)合性。因此，BC2抗體與含在因子IXgla結(jié)構(gòu)域殘基3-11之內(nèi)的表位相結(jié)合。實(shí)施例11用抗-因子IX抗體和組織纖溶酶原激活物治療動(dòng)脈血栓形成在頸動(dòng)脈完全閉塞后開始施用tPA，伴有或不伴有輔助治療。持續(xù)監(jiān)測(cè)動(dòng)脈的血流。用戊巴比妥鈉(55mg/kg，i.p.)麻醉體重300-490gm的雄性Sprague-Dawley大鼠(CharlesRiver,Raleigh,NC)。把大鼠仰4立置于加熱的(37°C)手術(shù)板上，在頸部制造切口；分離氣管，用PE-240Intramedictube進(jìn)行氣管插管。然后分離左頸動(dòng)脈和頸靜脈。將ParafilmM墊(4mm2,AmericanNationalCan)放置在頸動(dòng)脈下，在動(dòng)脈上放置電磁血流探針(CarolinaMedical)以測(cè)量血流。為了給藥，將插管(Tygon,0.02"x0.04",NortonPerformancePlastics)插入頸靜脈中。接下來，分離左股動(dòng)脈并進(jìn)行插管以測(cè)量血壓和采集血液樣本。按照實(shí)施例3的方法，把用FeCl3溶液(50%)飽和過的直徑6.5mm的玻璃微濾紙環(huán)狀片放置在頸動(dòng)脈流速探針下游10分鐘，引發(fā)頸動(dòng)脈中的血栓形成。在該特性得到清楚描述的模型中，血栓通常在15分鐘內(nèi)完全形成?？?因子IX抗體、SB249415以快速濃注方式施用而與tPA(Genentech，SouthSanFrancisco,CA)聯(lián)合給藥，而以快速濃注方式施用肝素(Elkins-SinnInc.,CherryHill，NJ),然后輸注。所有藥物輸注持續(xù)到實(shí)驗(yàn)期間末-自血管閉塞時(shí)間起60分鐘。于0、30和60min(實(shí)驗(yàn)?zāi)?時(shí)自股動(dòng)脈采集血液樣本1mL,加入3.8%檸檬酸溶液并離心，用于aPTT和PT測(cè)定。用帶有標(biāo)準(zhǔn)程序的fibrometer(BBlL，BaxterDade或MLAElectra800自動(dòng)凝固計(jì)時(shí)器)監(jiān)測(cè)aPTT和凝血酶原時(shí)間(PT)。實(shí)驗(yàn)?zāi)r(shí)，從頸動(dòng)脈取出血栓并稱重。所有數(shù)據(jù)用平均組值(SEM表示以表明各組大鼠的只數(shù)。組間分析使用多項(xiàng)比較目的的ANOVA和Bonferoni檢驗(yàn)，p<0.05則認(rèn)為有顯著性。通過將FeCl3處理過的片敷貼到大鼠頸動(dòng)脈而造成動(dòng)脈開始損傷后約15min,發(fā)生閉塞血栓形成。如圖10所示，單用tPA,在60min實(shí)驗(yàn)方案期間，僅在施用劑量為9mg/kgtPA后67%受治療血管顯示出重新得到血流時(shí)才觀察到閉塞血管再灌注。該劑量的tPA,包括60U/kg肝素或3mg/kg抗-因子IX抗體，SB249415,不會(huì)導(dǎo)致再灌注發(fā)生率的進(jìn)一步增加，提示在FeCl3損傷模型中大約30%血栓對(duì)于溶解而言是難治療的。圖10的結(jié)果表明，低劑量tPA,再灌注發(fā)生率顯著依賴于與溶栓劑一同給藥的抗凝劑。當(dāng)施用60U/kg肝素時(shí)，顯示再灌注的血管百分比急劇下降，用3和6mg/kgtPA時(shí)，分別僅觀察到12.5%和40%再灌注。然而，當(dāng)3mg/kgSB249415與tPA—同給藥時(shí)，3mg/kgtPA達(dá)到大于60%再灌注，6mg/kgtPA時(shí)，大于79。/。再灌注。因此，抗-因子IX抗體顯著位移溶栓劑量響應(yīng)曲線，使得低劑量溶栓劑即可再灌注。血栓溶解和血凝塊形成是動(dòng)態(tài)過程，有時(shí)觀察到再閉塞后的開放期間。既然在60min實(shí)驗(yàn)方案期間持續(xù)監(jiān)測(cè)頸動(dòng)脈血流，那么也就可能定量頸動(dòng)脈開放(patency)的總時(shí)間。如圖11所示，血管開放的總期間大體上因3mg/kg抗-因子IX抗體和tPA的聯(lián)合施用而增加。這在最低劑量和中等劑量tPA即分別為3和6mg/kg時(shí)尤為明顯。聯(lián)合施用劑量為3mg/kgSB249415和3mg/kgtPA時(shí)，總開放時(shí)間為30.6±9.2min,與之相對(duì)，聯(lián)合施用60U/kg肝素和3mg/kgtPA時(shí)，總開放時(shí)間為7.1士7.1min。單用3mg/kgtPA，開放時(shí)間為O。劑量為6mg/kg的tPA與肝素聯(lián)合施用，僅使開放時(shí)間輕微增加至12.9±6.0min。而與tPA-SB249415聯(lián)合，則達(dá)到最大開放時(shí)間38.7±8.4min。僅在最高劑量tPA(9mg/kg)時(shí)，與肝素的聯(lián)合才接近與SB249415聯(lián)合時(shí)達(dá)到的開放時(shí)間，分別為31.9土4.8min和38.0±8.4min。動(dòng)脈梗塞后血流的快速恢復(fù)對(duì)于使局部缺血組織的損害降至最小而言是決定性的。圖12的結(jié)果表明，抗-因子IX抗體與tPA聯(lián)合相對(duì)于單用tPA或者肝素加用tPA來說，使再灌注時(shí)間減少，使用低劑量tPA即可達(dá)到這一效果。當(dāng)3mg/kgSB249415與3mg/kgtPA聯(lián)合施用來造成血栓溶解時(shí)，血栓溶解時(shí)間是29.4±9.2min。單用3mg/kgtPA，未觀察到再灌注。用60U/kg肝素與3mg/kgtPA聯(lián)合，血栓溶解時(shí)間是52.8±7.1min。更高劑量的tPA,6和9mg/kg，抗體與tPA聯(lián)合治療方案取得分別在19.4±6.3和20.8±8.7min開始血栓溶解的效果。在不加抗凝劑的情況下，6和9mg/kgtPA的血栓溶解時(shí)間分別是60min(即實(shí)驗(yàn)方案的界限)和27.5±6.4min。加入60U/kg肝素，相應(yīng)的血栓溶解時(shí)間是44.0士7.1和27.0±4.9min。因此，使用SB249415總是能夠較肝素或者單用tPA更早取得再灌注。實(shí)施例12抗-因子IX抗體對(duì)止血功能的影響在用單獨(dú)tPA、tPA與肝素聯(lián)合以及tPA與SB249415聯(lián)合對(duì)大鼠治療的治療期末，通過監(jiān)測(cè)纖維蛋白原、纖溶酶原和a-2-抗纖溶酶的水平測(cè)定了抗-因子IX或作為輔助劑的肝素對(duì)維持止血功能的影響，并與使用載體治療動(dòng)物的結(jié)果進(jìn)行比較。如圖13所示，增加tPA的劑量導(dǎo)致每一種所測(cè)止血標(biāo)志物的水平下降。隨著tPA劑量增加至9mg/kg,a-2-抗纖溶酶水平從未用tPA治療動(dòng)物的約90%降至約20%。在9mg/kg治療組，纖溶酶原水平從未用tPA治療的約100%平均值降至約40%。類似地，在高劑量tPA組，纖維蛋白原水平從約150mg/dL降至約90mg/dL。有趣的是，輔劑的選擇并不顯著影響其中的任何一種標(biāo)志物。在施用載體、30或60U/kg肝素或者1或3mg/kgSB249415的動(dòng)物中，每一劑量的TPA均觀察到相似水平的a-2-抗纖溶酶、纖溶酶原和纖維蛋白原；觀察到的止血標(biāo)志物的降低只是溶栓劑劑量，tPA的函數(shù)，而且這些降低特別是纖維蛋白原的降低，似乎在tPA劑量大于6mg/kg，即在最高劑量組9mg/kg時(shí)尤其明顯。也監(jiān)測(cè)了不同治療方案對(duì)標(biāo)準(zhǔn)aPTT凝固試驗(yàn)aPTT的影響(圖14)。隨著tPA劑量增加，aPTT分別由對(duì)使用載體和9mg/kgtPA的19.3s±0.6s增至30.0s土1.6s。施用3mg/kgSB249415，對(duì)照動(dòng)物aPTT的有限增加，增至49.6s±6.4s。當(dāng)SB249415與tPA聯(lián)合給藥時(shí)，觀察到aPTT稍有增加，并取決于tPA劑量。SB249415與3mg/kgtPA聯(lián)合時(shí)，aPTT為58.3s±5.2s，而SB249415與9mg/kgtPA聯(lián)合，則使aPTT增至77.3s±19.7s。施用30U/kg或60U/kg劑量的肝素，導(dǎo)致aPTT大幅度增加。沒有tPA時(shí)，30和60U/kg劑量的肝素，其aPTT分別為約300s到600s。tPA治療的動(dòng)物，aPTT為約800s。肝素提高aPTT，特別是與干擾止血參數(shù)的藥劑配伍時(shí)，由于需要高劑量tPA以達(dá)到有效再灌注，因而很容易造成出血傾向。相反，SB249415并不虧1起aPTT明顯提高并且能夠使用低劑量tPA，從而帶來在心肌梗塞和中風(fēng)的溶栓治療中的顯著優(yōu)勢(shì)。實(shí)施例13SB249417提高中風(fēng)時(shí)組織纖溶酶原激活物的溶解的潛力在這些研究中使用的大鼠血栓栓塞中風(fēng)模型基本上如Busch等在Bra/wWe化arc/z，77&16-24(1997)中所描述的那樣。按照模型的三個(gè)主要步驟進(jìn)行制備栓子，栓子形成后準(zhǔn)備大鼠，進(jìn)行藥理干預(yù)。將取自供體大鼠的全血盛入檸檬酸化的空白管(vacutainertube)中。將檸檬酸化(citrated)的血液(500ul)快速地加入含有1單位人凝血酶和5pl1MCaCl2測(cè)試管中，CaCl2終濃度為10mM。5-10秒鐘內(nèi)，將小部分的混合物取出裝入15cm長(zhǎng)的PE50導(dǎo)管中，使之在室溫下凝結(jié)1小時(shí)。1小時(shí)結(jié)束時(shí)，從管中擠出凝塊放入盛有鹽水的佩氏培養(yǎng)皿中，切成1.5mm長(zhǎng)的切片。將12塊切片(血凝塊)轉(zhuǎn)移到含有0.04mg/ml大鼠白蛋白的鹽溶液中，并以~60fil體積灌回PE50導(dǎo)管中。在導(dǎo)管中首尾相接的血凝塊用于大鼠的栓子形成。對(duì)體重350-400g的雄性SpragueDawley大鼠進(jìn)行手術(shù)，以備接受皮下劑量的阿托品(0.5mg/kg)，然后用5%異氟烷麻醉，維持劑量使用2%異氟烷。體溫保持在37-38°C。在無菌條件下，在頸部制造saggital正中切口，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，右側(cè)內(nèi)端頸動(dòng)脈(ICA)，右側(cè)外端的頸動(dòng)脈(ECA),以及翼腭動(dòng)脈。給翼腭動(dòng)脈打結(jié)(tiedoff)。分離出一段ECA后結(jié)扎并切斷。用血管鉗夾住CCA和ICA,將含有栓子的PE50導(dǎo)管插入ECA殘端并延伸到分叉處。去除ICA的血管鉗，在松開CCA血管鉗的同時(shí)將血栓緩慢注入ICA。在栓子形成后5分鐘，開始通過尾靜脈輸注載體(鹽液)、SB249417(2.0mg/kg)和/或t-PA(5.0mg/kg)。SB249417以單一快速濃注劑量輸注，而t-PA的5mg/kg劑量則以10%快速濃注，接著在30分鐘時(shí)間內(nèi)將剩余的90%輸注。閉合手術(shù)切口，使大鼠蘇醒。血栓形成后24小時(shí)，麻醉并處死大鼠。取出腦，并從前腦干開始切出每個(gè)2mm厚的7個(gè)4黃斷面切片。在1%2，3，5-氯三苯四唑中溫育20分鐘，接著進(jìn)行甲醛固定。對(duì)染色的腦切片攝像，使用圖象分析系統(tǒng)(OptimusInc.,Bothell,Wash)進(jìn)行分析。由不知實(shí)驗(yàn)情況的操作者通過描計(jì)計(jì)算機(jī)屏幕上的梗塞來計(jì)算以mn^為單位的梗塞面積。每種處理情況下合起來的平均梗塞示于圖15(對(duì)照(n二20)，tPA(n二7)和SB249417(n=6》。對(duì)全塞后給大鼠施用tPA(5.0mg/kg)使平均梗塞體積減少~33%。單獨(dú)施用SB249417使梗塞體積減少~70%。tPA(5.0mg/kg)和SB249417(2.Omg/kg)聯(lián)合施用，提供進(jìn)一步的保護(hù)作用，使平均梗塞體積減少~88%(P=0.126)。該模型中，梗塞以類似頻率出現(xiàn)在紋狀體和新皮質(zhì)。基于梗塞組織的部位，閉塞最頻發(fā)生部位是大腦中腦動(dòng)脈(MCA)。盡管頻率小，但是證據(jù)提示脈絡(luò)膜、大腦前動(dòng)脈和大腦腦后動(dòng)脈也偶爾發(fā)生閉塞。通過冠狀切面(未提供數(shù)據(jù))觀察時(shí)，在治療基礎(chǔ)上出現(xiàn)的梗塞體積減少大部分在中央MCA灌注區(qū)域。治療后，幾乎不改變梗塞組織分布。結(jié)果表明，栓塞后施用抗-因子IX抗體如SB249417作為單劑治療或者作為溶栓劑如tPA的輔劑時(shí)，可以減少梗塞腦組織的形成。期望抗-因子IX抗體如SB249417作為單劑藥物或者作為溶栓劑的輔劑在治療血栓栓塞中風(fēng)中具有臨床實(shí)用性。聯(lián)合治療使得溶栓劑劑量減小并由此而減少了促發(fā)出血性中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明可以其它并不背離本發(fā)明精神或者基本特性的具體形式實(shí)施，因此，表明本發(fā)明保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)參照本發(fā)明權(quán)利要求書而不是前述的說明書。序列表(1)一般信息(i)申;貪人邁克爾，布萊克本(Blackburn,Michael)喬拉，福伊爾斯坦(Feuerstein，Giora)弗蘭克.C.巴龍(Barone,FrankC.)約翰.R.圖米(Toomey,JohnR.)(ii)發(fā)明名稱抗血栓劑(iii)序列數(shù)量111(iv)相關(guān)地址(A)地址史密絲克萊恩比徹姆公司(SmithKlineBeechamCorporation)(B)街道709SwedelandRoad(C)城市KingofPrussia(D)州PA(E)國(guó)家USA(F)ZIP:19406(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型磁盤(B)計(jì)算機(jī)IBM相容機(jī)(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEQVersion1,5(vi)現(xiàn)申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)栁粗?B)申請(qǐng)?jiān)黄趆erewith(C)分類(vii)優(yōu)先權(quán)項(xiàng)(A)申請(qǐng)?zhí)?9/571,434(B)申請(qǐng)日期15-5-2000(viii)代理人/代理信息(A)姓名Baumeister,Kirk(B)登記號(hào)33,833(C)參考/文檔號(hào)碼P5(M38-2(ix)聯(lián)系信息:(A)電話610-270-5096(B)傳真610-270-5090(C)TELEX:(2)序列信息SEQIDNO:1:(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQIDNO:1:CATCCTAGAGTCACCGAGGA20(2)序列信息SEQIDNO:2:(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDM(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQIDNO:2:AGCTGCCCAAAGTGCCCAAGC21(2)序列信息SEQIDNO:3:(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQIDNO:3:CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG36(2)序列信息SEQIDNO:4:(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)對(duì)(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQIDNO:4:GATTTTCARGTGCAGATTTTC(2)序列信息SEQIDNO:5:(i)序列特征(A)長(zhǎng)度363個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型(vi)來源(xi)序列描述SEQIDNO:5CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGTCCTGCAAGGCTTCTGGGTACACCTTCACACCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGGTTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTTGCAGATCGACAACCTCAAAGATGAGGACAATATGGATGGTTACTTCCCTTTTACTTACGCA(2)序列信息SEQIDNO:6:(i)序列特征(A)長(zhǎng)度321個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性CTGAAGAAGCAACTATGGAAATAAACACCATCTTTGGAAAACGGCTACATTGGGGCCAAGCTGGAGAGACAGTCAAGATC60TGAACTGGGTGAAGCAGGCT120GAAATGGAAAGTCAACATAT180GCTCTGCCAGCACTGCCAAT240ATTTCTGTACAAGAGAAGGG300GGACTCTGGTCACTGTCTCT360(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片段類型:(vi)來源(xi)序列描述SEQIDNO:6:CAAATTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACA60ATGACTTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAATTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGA120TCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGC180TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAA240GATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTATTAACCCACGGACGTTCGGTGGAGGC300ACCAAGCTGGAAATCAAACGG321(2)序列信息SEQIDNO:7:U)序列特征(A)長(zhǎng)度121氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片^a類型內(nèi)部的(vi)來源Gin1ThrGlyGlyLys65Leu(xi)序列描述SEQIDlieGinLeuValGinSerValMetTrp50GlyGinThrArgGinGlyLysAsn35lieArglieGluThr115lie20TrpAsnPheAspGly100LeuVal5SerValThrAlaAsn85AsnValCysLysLysGinArgAsn55PheSer70LeuLysMetAspThrValNO:7:GlyProGluIxuLysLys10AlaSerGlyTyrThrPhe25AlaProGlyLysGlyLeu4045GlyLysSerThrTyrVal60LeuGluSerSerAlaSer75AspGluAspThrAlaThr90GlyTyrPheProPheThr105SerAla120ProGlyGlu15ThrAsnTyr30LysTrpAspAspThrAlaTyrPhe95TyrTrp110MetPheAsn80CysGly(2)序列信息SEQIDNO:8:G)序列特征(A)長(zhǎng)度5氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(U)分子類型肽(m)假擬無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部的(vi)來源(xi)序列描述SEQIDNO:8:AsnTyrGlyMetAsn15(2)序列信息SEQIDNO:9:(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬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