專利名稱：一種攜帶神經(jīng)營養(yǎng)因子穿過血腦屏障的融合蛋白及其編碼基因與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)營養(yǎng)因子融合蛋白，尤其涉及含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的神經(jīng)營養(yǎng)因子融合 蛋白的制備、其編碼核苷酸序列、含有它們的表達載體、宿主細胞，以及它們的用途。
背景技術(shù)：
神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophins， NTs)是指機體產(chǎn)生的能夠促進神經(jīng)細胞存活、生長、 分化的一類蛋白質(zhì)因子，為一類低分子量蛋白的家族。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中,那些獲得了 充分神經(jīng)營養(yǎng)作用的細胞得以存活,而另一些則自然死亡,神經(jīng)細胞的死亡伴隨著神經(jīng)系統(tǒng) 的發(fā)育而發(fā)生。神經(jīng)細胞的非自然死亡(例如一些退行性神經(jīng)病變),可以通過獲取外界神經(jīng) 營養(yǎng)因子而得以緩解。神經(jīng)營養(yǎng)因子已成為當(dāng)前神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域最激動人心的研究熱點之一。哺乳動物的NTs包括神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF )、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3 (neirotrophin 3, NT-3 )、和神經(jīng) 營養(yǎng)蛋白4/5 (neurotrophin4/5， NT-4/5)。家族中每一個成員形成分子間二聚體后，與各自 特定的受體結(jié)合，使得受體二聚體化和自體磷酸化，激活多種下游效應(yīng)分子和信號傳導(dǎo)途 徑鏈，從而產(chǎn)生對神經(jīng)元的生長和生存的營養(yǎng)作用(Zweifei LS，et al.Function and mechanisms of retrograde neurotrophin signaling. Nature Review Neuroscience. 2005;6:615-625 )。從結(jié)構(gòu)上看，神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員間具有許多共同的特點，包括具有相似的分子量(13.2-15.9千道爾頓(kDa)); —級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列同源性接近或超過50%;等電點為9-10; 在相同的位點上有6個半胱氨酸殘基并形成三個分子間的二硫鍵。在NTs前體蛋白的N末端疏 水區(qū)信號肽后，含有連續(xù)的堿性氨基酸殘基。氨基酸序列分析表明，所有NTs家族成員的成熟 區(qū)蛋白都由分子量為31-35kDa的前體蛋白，經(jīng)前體蛋白轉(zhuǎn)化酶切割成為成熟蛋白而發(fā)揮生理 功能。由于NTs為生物多肽類分子，經(jīng)外周血管途徑給藥后，不能穿過由腦血管單層內(nèi)皮細胞 間緊密連接形成的血腦屏障(blood-brainbarrier, BBB)，或穿過的量達不到生理作用濃度， 因此只有在動物腦缺血區(qū)或腦脊液中直接注射給藥，NTs才能發(fā)揮神經(jīng)保護功能。然而，在 臨床上采用這種給藥方式，不僅增加了醫(yī)護人員的技術(shù)要求，該給藥方法可帶來新的創(chuàng)傷，
而且病人也是不愿接受的。因此，尋找新的給藥方法和途徑是NTs進入臨床使用的前提條件 (Miller G. Breaking down barriers. Science.2002;297:l 116-1118)。使藥物通過BBB到達大腦發(fā)揮生理功能，最先采用的方法是利用高滲糖水溶液使得BBB 上的內(nèi)皮細胞瞬時性脫水而收縮，從而打開內(nèi)皮細胞間的緊密連接，使得藥物通過BBB進入 腦實質(zhì)。這種方法使目的藥物通過B:BB的同時，也可使血液中的其他成分通過，包括血液中 的有毒成分，因此目前還不能進行大規(guī)模的臨床試驗(Miller G. Breaking down barriers. Science. 2002;297:1116- 1118)。有研究人員利用BBB上特異性的蛋白轉(zhuǎn)運受體作為靶點，如轉(zhuǎn)鐵蛋 白受體或胰島素受體，研制出抗這些受體的單克隆抗體-NTs的偶聯(lián)物或融合蛋白，經(jīng)外周血 管給藥后，其中的單克隆抗體能特異性結(jié)合于BBB血液表面的受體而被其內(nèi)吞，經(jīng)細胞內(nèi)轉(zhuǎn) 運，從BBB腦實質(zhì)面的受體離開，進入大腦(與轉(zhuǎn)運轉(zhuǎn)鐵蛋白的機理相同)，從而使偶聯(lián)物 中的NTs也同時通過了BBB。但這種方法中的偶聯(lián)物不穩(wěn)定，通過基因工程方法得到的融合 蛋白產(chǎn)量低，成本高，難以大量臨床應(yīng)用(Zhang Y, et al.。Neuroprotection in transient focal brain ischemia after delayed intravenous administration of brain-derived neurotrophic factor conjugated to a blood-brain barrier drug targeting system. Stroke. 2001;32:1378-1384)。發(fā)明內(nèi)容針對現(xiàn)有技術(shù)的缺點，木發(fā)明提供一種神經(jīng)營養(yǎng)因子融合蛋白、及其核苷酸序列的制 備方法和用途，解決了偶聯(lián)物不穩(wěn)定、融合蛋白產(chǎn)量低和高滲溶液易將血液中有毒成分帶 入腦實質(zhì)中的問題。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于攜帶神經(jīng)營養(yǎng)肉子穿過血腦屏障的融合蛋白，包括與神經(jīng)營養(yǎng)因子成熟區(qū)蛋白的氨基酸序列有至少75%同源性的第一區(qū)；與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo) 結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列有至少70%同源性的第二區(qū)；其中，所述第二區(qū)位于所述第一區(qū)的羧 基末端。在一個優(yōu)選實施方式中，所述第一區(qū)與祌經(jīng)營養(yǎng)因子成熟區(qū)蛋白的氨基酸序列有至少85%的同源性；所述第二區(qū)與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列有至少85%的同源性。在一個特別優(yōu)選實施方式中，所述第一區(qū)為人神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3或神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4/5。在另一個實施方式中，所述第二區(qū)為來源于果蠅的同源異型蛋白Antp、來源于小鼠血管內(nèi)皮細胞I型膜蛋白Cadherin中的pVEC或來源于人類I型免疫缺陷病毒的轉(zhuǎn)錄激活蛋白Tat。在另一個實施方式中，所述第二區(qū)緊鄰所述第一區(qū)或通過間隔氨基酸與所述第一區(qū)相連。在另一個實施方式中，所述第一區(qū)為人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；所述第二區(qū)為來源于果 蠅的同源異型蛋白Antp，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO: 1所示。在另一個實施方式中，所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示或其互補序列。本發(fā)明還提供一種表達載體，其含有如SEQIDNO: 2所示的序列或其互補序列的核 苷酸序列。本發(fā)明還提供一種宿主表達系統(tǒng)，其含有所述的表達載體。本發(fā)明還提供所述融合蛋白在制備治療神經(jīng)營養(yǎng)因子相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個實施方式中，還提供在不改變所述融合蛋白特性的前提下，對融合蛋 白個別氨基酸殘基的取代、缺失或加入而得到的功能等同物。本發(fā)明還提供的編碼本發(fā)明融合蛋白的核苷酸序列，能夠編碼具有PTD和NTs各自生 物學(xué)活性的序列；包括等位基因和物種同系物，還包括突變體和變異體。本發(fā)明所述的"蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域"(protein transduction domain, PTD)是一類能夠?qū)⑴c其 物理或化學(xué)連接的化合物、蛋白質(zhì)或核酸類分子，帶過血腦屏障或細胞膜進入細胞漿，甚 至胞核內(nèi)發(fā)揮各自的生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)域，其富含正電荷。PTD介導(dǎo)的連接物通過細胞膜 進入胞體不需要能量和受體幫助(Wadia JS，et al. Transducible TAT-HA fiisogenic peptides enhances escape TAT-fiision proteins after lipid raft macropinocytosis. Nature Medicine. 2004; 10(3):310-315)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種PTD，如來自果蠅的同源異型蛋白Antp (Eiriksdottir E， et al. Cellular uptake of cell-penetrating peptides. Drug Design. Online 1. 2004;161-173),.來源于d、 鼠血管內(nèi)皮細胞I型膜蛋白Cadherin中的pVEC (Elmquist A， et al. VE-cadherin derived cell-penetrating peptide, pVEC, with carrier functions. Exp. Cell Res. 2001;269:237-244)，及來 源于人類I型免疫缺陷病毒的轉(zhuǎn)錄激活蛋白(Trans-activator transcription, Tat)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點是將所述第二區(qū)置于所述第一區(qū)的羧基端(C端)，使 得神經(jīng)營養(yǎng)因子的氨基端(N端)裸露出來，維持了正確的N端立體構(gòu)象，從而發(fā)揮神經(jīng) 營養(yǎng)因子的生物活性。


圖1為人NTs-PTD/Antp核酸結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為BDNF-PTD/Antp融合蛋白表達載體的限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析； 圖3為BDNF-PTD/Antp融合蛋白表達的SDS-PAGE分析圖4為表達產(chǎn)物BDNF-PTD/Antp的Western blot分析圖；圖5為BDNF-Antp給藥后，小鼠腦組織的Westernblot分析圖；圖6為不同濃度的BDNF-PTD/Antp與BDNF的生物學(xué)活性比較；圖7為重組BDNF蛋白和重組BDNF-PTD/Antp融合蛋白通過BBB后在腦組織中的分 布圖；圖8為不同結(jié)構(gòu)形式的BDNF-PTD/Antp融合蛋白的功能性比較； 圖9為沙頭鼠腦缺血模型經(jīng)腹腔途徑給予BDNF-Antp，斷頭處死后的TTC染色圖； 圖10為圖9所述TTC染色后的灰度掃描圖；圖11為經(jīng)腹腔途徑給予BDNF-PTD/Antp后小鼠黑質(zhì)酪氨酸羥化酶免疫組化圖。
具體實施方式
在Antp蛋白分子內(nèi)部的高度堿性區(qū)(氨基酸41-59)，富含較多的正電荷，與跨膜密切有 關(guān)，即所謂的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Snyder EL and Dowdy SF.Cell penetrating peptides in drug delivery. Pharm Res.2004;21(3):389-393.)。在本發(fā)明中把來源于Antp的PTD簡稱為PTD/Antp， 下同。PTD/Antp可與多種全長蛋白質(zhì)或多肽類形成融合蛋白，這些蛋白質(zhì)的分子量可為 10-120kDa，包括卵血清蛋白(ovalbumin)、辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase, HRP)， 細胞周期蛋白激酶抑制劑p27Kipl等(Ryu J, et al. Enhanced uptake of a heterologous protein w池 an HIV陽l tat protein transduction domains(PTD) at both termini, Mol Cells. 2003;16(3):385-391)。 另外，PTD/Antp不僅能攜帶蛋白質(zhì)進入動物體內(nèi)組織細胞，而且可保證所攜帶蛋白質(zhì)的生物 活性(Asoh S, et al. Protection against ischemic brain injury by protein therapeutics.尸roc. Ato/. 爿cm/.5W.2002;99:17107-17112)。把PTD/Antp置于蛋白質(zhì)的氨基(N)端或羧基(C)端，皆可使所攜帶的目的蛋白質(zhì)通過 細胞膜。在設(shè)計融合蛋白時，可根據(jù)實際情況需要設(shè)計合適的融合方式。PTD/Antp介導(dǎo)的蛋 白質(zhì)可穿過由腦血管內(nèi)皮細胞組成的BBB，使所攜帶蛋白進入大腦發(fā)揮生理作用，.而這些蛋 白在正常情況下是不能通過BBB的。本發(fā)明是基于發(fā)明人的意外發(fā)現(xiàn)而做出的。本發(fā)明制備的融合蛋白中，PTD位于NTs的C 端，獲得了比PTD位于NTs的N端更好的效果。推測可能的原因，NTs的N端含蛋白前導(dǎo)區(qū)(prepro-)的全長神經(jīng)營養(yǎng)因子，通過分子間的二硫鍵形成二聚體后，優(yōu)先結(jié)合于其特異性 受體p75，引起下游途徑的信號傳導(dǎo)，可能誘導(dǎo)神經(jīng)元的死亡和凋亡(LuB,etal.Theyinand yang of neurotrophin action. 7V她re 7V"ewms"'e"ce. 2005;6:603-614; Teng HK， et al.ProBDNF induces neuronal apoptosis via activation of a NTR receptor complex of p75 and sortilin. Jo/Wwrasc/e"ce. 2005;25(22):5455-5463)。神經(jīng)營養(yǎng)因子執(zhí)行神經(jīng)營養(yǎng)生理功能時需要切割 前體蛋白，裸露N端的成熟蛋白區(qū)可形成分子間的二硫鍵，新形成的二聚體和其特異性的酪 氨酸蛋白激酶(trK)受體家族成員結(jié)合，誘導(dǎo)下游途徑信號傳導(dǎo)，發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)功能OVfl似w i evz'ews^ewrascz'e"ce. 2005;6:603-614)。若PTD結(jié)合在全長神經(jīng)營養(yǎng)因子的N端，則可能誘導(dǎo) 神經(jīng)元的死亡和凋亡，而若全長神經(jīng)營養(yǎng)因子切割前體蛋白，則連同結(jié)合在其N端的PTD—同 切割，導(dǎo)致切割后的成熟蛋白不能穿過血腦屏障；若PTD結(jié)合在成熟蛋白的N端，則導(dǎo)致成熟 蛋白的N端不能裸露出來，故不能形成二聚體而與特異性受體結(jié)合，從而發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)功能。 所以說，裸露的N末端結(jié)構(gòu)，對維持神經(jīng)營養(yǎng)因子成熟蛋白區(qū)發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)功能時的正確立 體構(gòu)象(僅與trK受體結(jié)合，而不與p75受體結(jié)合)起重要作用。PTD序列優(yōu)選緊鄰NTs，也可以通過間隔氨基酸殘基序列和NTs相連。間隔氨基酸序列的 長度可以是l-20個氨基酸或者更長，例如1-10個，特別優(yōu)選柔性氨基酸殘基。在NTs成熟蛋白 區(qū)前，直接連接甲硫氨酸作為起始氨基酸。PTD經(jīng)或不經(jīng)間隔氨基酸與NTs連接后，PTD需能 夠發(fā)揮穿過細胞膜，或BBB的能力，二則要求PTD和間隔氨基酸(如果經(jīng)間隔氨基酸連接) 不影響NTs的空間立體構(gòu)像和活性二聚體的形成，保證了NTs的神經(jīng)營養(yǎng)功能。編碼NTs和PTD的核苷酸序列可以是天然的或合成的序列，包括等位基因和物種同系物， 還包括突變體和變異體?？梢詫Ts和PTD的編碼核苷酸進行適當(dāng)更換，例如增加、替換、缺 失一個或多個核苷酸，而仍保留其編碼蛋白質(zhì)的能力。用本領(lǐng)域周知的方法，如PCR (Saiki， etal. Science,239:487-491,1988)、 RT-PCR方法、人工合成的方法和構(gòu)建篩選cDNA文庫等方法 可獲得NTs和PTD的核苷酸序列。用作PCR模板和用于構(gòu)建cDNA文庫的mRNA或cDNA可來源 于任何含有相應(yīng)mRNA或cDNA的組織、細胞及文庫等。如編碼NGF的核苷酸序列可用PCR方 法從含有NGF cDNA的文庫中獲得；編碼BDNF核苷酸序列可用RT—PCR方法從腦組織中提取 RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA為模板得到；而編碼PTD的核苷酸序列可用人工合成方法獲得。 人工合成時可選用宿主偏愛的密碼子，這樣往往可以提高產(chǎn)物的表達。如利用大腸桿菌偏愛 的密碼子設(shè)計出，Antp蛋白中的PTD的一個示范性編碼核苷酸序列和對應(yīng)的氨基酸序列如下ATGC-3，SGRQIKIWFQNRRMKWKKC若需要，可用本領(lǐng)域公知的方法對多聚核苷酸序列進行突變、缺失、插入和與其他核苷 酸序列連接等。編碼NTs和PTD的核苷酸序列的融合，在保持各自閱讀框架不變的前提下，可 以用本領(lǐng)域周知的各種方法，如通過PCR的方法，在擴增編碼序列的兩端引物上引入限制性內(nèi)切酶識別位點，經(jīng)酶切、連接后獲得編碼融合蛋白的基因。融合蛋白的核酸序列經(jīng)測序驗
證正確性后，可用本領(lǐng)域公知的方法把含編碼融合蛋白序列的核酸克隆到各種表達載體中去。 所用的標(biāo)準(zhǔn)分子克隆過程見J.Sambrook等的敘述(J. Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratry Manual. Cold Spring Harbor Lab(CSHL)， 2001 )?？稍诙喾N不同的表達系統(tǒng)中進行本發(fā)明的NTs-PTD融合蛋白的表達。本發(fā)明中融合蛋白 的基因序列，連接在原核生物細胞表達載體中，得到pNTs-PTD，可在大腸桿菌中表達融合蛋 白。該融合蛋白的基因序列，同樣可連接到酵母菌表達載體中，并在到酵母菌中表達得到該 融合蛋白；或者，該融合蛋白的基因序列，可連接到動植物細胞表達載體內(nèi)，并在動植物細 胞中表達得到該融合蛋白。需要的表達載體和其對應(yīng)的宿主可從公司購得，如大腸桿菌pET 載體系列可從Novagen公司，酵母菌表達載體pPIC系列及哺乳動物細胞表達載體pcDNA系列 可從Invitrogen公司購買。不同的宿主系統(tǒng)表達蛋白有其特定的優(yōu)點，如大腸桿菌宿主易操作， 蛋白表達量高；哺乳動物細胞能使所表達的蛋白進行正確的翻譯后糖基化修飾，但表達水平 低；而酵母菌介于二者之間。在本發(fā)明中，所表達的融合蛋白不需要翻譯后糖基化修飾，復(fù) 性后的融合蛋白即可形成分子間的二硫鍵，因此選擇大腸桿菌宿主系統(tǒng)。轉(zhuǎn)化含NTs-PTD編碼核酸的表達載體至宿主細胞去可用本領(lǐng)域公知的方法，如化學(xué)轉(zhuǎn)化 或電穿孔等。成功轉(zhuǎn)化的細胞可通過裂解細胞后PCR法鑒定，也可提取質(zhì)粒DNA后酶切或測 序鑒定?？赏ㄟ^培養(yǎng)含有本發(fā)明核酸序列的宿主，如重組細菌、重組酵母、重組真核細胞等獲得 大量的NTs-PTD融合蛋白。如用搖瓶培養(yǎng)含有本發(fā)明重組原核載體的大腸桿菌BL21 (DE3)， 經(jīng)由實驗優(yōu)化的培養(yǎng)條件進行融合蛋白的大量表達，并運用液相層析和色譜技術(shù)對融合蛋白 進行純化。在一個實施例中，純化得到的BDNF-PTD/Antp融合蛋白，在體外細胞培養(yǎng)中，能明顯 促進神經(jīng)細胞PC12/trkB的增生，說明該融合蛋白保留了BDNF的神經(jīng)營養(yǎng)活性。在另一個實 施例中，BDNF-PTD/Antp融合蛋白經(jīng)小鼠尾靜脈給藥后4個小時，經(jīng)本專業(yè)領(lǐng)域技術(shù)人員理 解的方法，能在大腦中檢測到該融合蛋白。NTs有許多臨床疾病的治療前景，尤其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)退行性疾病。但外周血管或 肌肉途徑直接注射給藥NTs不能通過BBB而進入大腦發(fā)揮作用。本發(fā)明制備的NTs-Antp融合蛋 白因具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，能將NTs經(jīng)血管途徑給藥后帶過BBB，因而，本發(fā)明制備的NTs-Antp 可經(jīng)外周途徑給藥進入腦實質(zhì)而發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)功能。含蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域的NTs可經(jīng)外周途徑給藥進入腦實質(zhì)而發(fā)揮療效，大大拓寬了NTs治療臨床疾病的適應(yīng)癥，如腦外傷性中樞神經(jīng)損傷、腦血管中樞神經(jīng)損傷、帕金森病、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不良所致神經(jīng)系統(tǒng)先天性疾病、腦萎縮、腦炎后遺癥、新生兒缺氧性腦病、神經(jīng)衰弱和神經(jīng)性頭疼、癜癇病、血管性癡呆、早老年性癡呆癥、脊損傷、神經(jīng)再植、多發(fā)性神經(jīng)炎、糖 尿病性外周神經(jīng)病變、神經(jīng)斷裂及退行性變、座骨神經(jīng)損傷、面神經(jīng)麻痹、視神經(jīng)病變等。 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例一BDNF-PTD/Antp融合蛋白結(jié)構(gòu)的設(shè)計請參閱圖l， ATG為編碼甲硫氨酸的核苷酸，PTD為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，NTs為人神經(jīng)營 養(yǎng)因子家族成員編碼成熟區(qū)蛋白的核苷酸序列，TER為核酸的終止密碼子。在腦源性神經(jīng)營 養(yǎng)因子成熟區(qū)前增加甲硫氨酸，PTD/Antp位于BDNF的C端，通過間隔氨基酸谷氨酸與BDNF 相連接，得到BDNF-PTD/Antp融合蛋白的結(jié)構(gòu)。實施例二 BDNF-PTD/Antp融合蛋白基因的擴增和原核表達載體的構(gòu)建根據(jù)基因庫報導(dǎo)的編碼BDNF成熟區(qū)蛋白的核苷酸序列，和上述BDNF-PTD/Antp 融合蛋白的結(jié)構(gòu)，設(shè)計擴增BDNF-PTD/Antp融合蛋白基因的引物如下 引物I如SEQ ID NO:3所示5，陽GCCATATGCACTCTGACCCTGCCCGCCGA-3，(下劃線為Ndel位點) 弓物1I如SEQIDNO:4所示GTCTGCCGGATCCCCTTTTAATGGTCAATGTACATAC-3 ，(下劃線為Xhol位點) 用PCR法，以含人BDNF全長cDNA質(zhì)粒popeMPBDNF(美國ATCC)為摸板，擴增 BDNF-PTD/Antp基因。PCR反應(yīng)參數(shù)為94。C預(yù)變性3min， 94。C變性45sec， 58。C退火lmin， 72'C延伸lmin，共35個循環(huán)，最后72'C延伸10min。 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物，按 DNA片段回收試劑盒提供方法，回收目的基因片段。利用PCR產(chǎn)物兩端的NdeI和XhoI位點， 將其克隆于原核細胞表達載體pET30(a)(美國Novagen公司)。連接、轉(zhuǎn)化均按《分子克隆》進 行。請參閱圖2，用限制性內(nèi)切酶進行分析，得到載體和目的基因片段，圖中，泳道1和3分別 為低和高分子量核酸標(biāo)準(zhǔn)，泳道2中紅色箭頭為表達載體質(zhì)粒片段，箭頭為表達 BDNF-PTD/Antp融合蛋白的核酸片段。質(zhì)粒酶切鑒定后送上海生工生物技術(shù)有限公司測序， 經(jīng)序列測定，BDNF-PTD/Antp的基因是由如SEQ ID NO: 2的核酸組成，說明獲得的目的基 因序列是正確的。實施例三BDNF-PTD/Antp融合蛋白的誘導(dǎo)表達將經(jīng)酶切和核酸測序分析正確的pBDNF-PTD/Antp重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)表達菌株 BL21(DE3)plys，涂布于含50mg/mL卡那霉素，34mg/mL氯霉素的平皿中。隨機分別挑取單個 陽性單克隆，接種到200mL含有卡那霉素(50mg/mL)和氯霉素(34mg/mL)的LB培養(yǎng)基試管 中，37"C培養(yǎng)過夜后，再轉(zhuǎn)至1000mL含相同抗生素的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)l小時，至006()()=0.6 時，加入IPTG至終濃度為0.1mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)5個小時,5000prm/min，4r離心15min，棄上清收 集菌體。實施例四BDNF-PTD/Antp融合蛋白的純化與Westem blot鑒定將誘導(dǎo)表達后收集的菌體按10g/ml (V: M)裂解于裂解液(8M尿素、0.1MNaH2PO4、 0.01MTris-Cl(PH8.0))中，超聲破菌，4。C10000xg離心30min，取上清。經(jīng)過Q-Sepharose離子 交換柱后，再用Sephacryl凝膠過濾柱純化。純化得到的融合蛋白純度達到99.5%以上。純化 后的蛋白用含0.1M精氨酸的PBS (O.IM磷酸鹽緩沖液)溶液透析和復(fù)性。BDNF-PTD/Antp融合蛋白的鑒定請參閱圖3，進行SDS-PAGE電泳和考馬氏亮藍染色后可 看到，與誘導(dǎo)前菌液相比，菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后，在分子量為18kD位置上明顯出現(xiàn)條帶， 位置與預(yù)期目的蛋白大小一致，純化后在同一位置上得到單一條帶。圖3中，l為蛋白質(zhì)分子 量標(biāo)準(zhǔn)，2為誘導(dǎo)前工程菌菌體裂解液的上清液，3為誘導(dǎo)后工程菌菌體裂解液的上清液，與 誘導(dǎo)前相比，明顯具有箭頭所示的表達蛋白條帶，4中箭頭所示為純化后的融合蛋白。將純化 后的蛋白轉(zhuǎn)至尼龍膜上，以兔抗人BDNF抗體進行Westemblot分析，結(jié)果請參閱圖4。圖4中， l為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2為誘導(dǎo)前菌體上清液；3為誘導(dǎo)后菌體上清液；4為純化后蛋白。在 約18kD位置上出現(xiàn)了特異條帶，與考馬氏亮藍染色的蛋白表達條帶位置相同，說明表達并經(jīng) 純化后產(chǎn)物為含BDNF的蛋白。另外，將純化蛋白經(jīng)小鼠尾靜脈給藥4小時后取腦組織進行 Westemblot分析，BDNF-Antp融合蛋白處理組動物腦中能明顯檢測至UBDNF蛋白，見下圖5。 圖中，A代表BDNF-Antp處理組；B代表BDNF處理組。實驗時，小鼠(25克)尾靜脈分別給 予4pgBDNF-Antp和BDNF， 4小時后，取腦蛋白進行實驗。與對照組相比，可見BDNF-Antp 給藥組動物腦中有高含量的BDNF。實施例五BDNF-PTD/Antp融合蛋白的促細胞增殖活性用MTT法對BDNF-PTD/Antp融合蛋白的生物學(xué)活性進行了檢測。在嗜鉻細胞瘤細胞系PC12/trkB的培養(yǎng)液中，加入復(fù)性后基因重組蛋白BDNF-PTD/Antp和陽性對照的基因重組蛋白BDNF，與陰性對照(不加神經(jīng)營養(yǎng)因子)相比，加入不同濃度基因重組BDNF-PTD/Antp和無PTD的基因重組BDNF，均能促進細胞的增生，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析具有顯著的差異。而且，BDNF-PTD/Antp與BDNF相比，前者的生物學(xué)活性更好，結(jié)果見圖6，說明將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域置 于BDNF的C末端，不影響B(tài)DNF蛋白N末端的空間結(jié)構(gòu)和二聚體的形成，從而保留甚至增強 了BDNF的生物活性。實施例六BDNF-PTD/Antp融合蛋白的體內(nèi)透過BBB實驗在20 25克小鼠尾靜脈中分別注射給予4u g基因重組BDNF-PTD/Antp蛋白和對照基 因重組BDNF蛋白，4小時后處死，取全腦，冰凍切片，用兔抗人BDNF抗體進行免疫組 織化學(xué)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BDNF組中可見部分區(qū)域呈陽性表達，與文獻報道的內(nèi)源性BDNF 組織分布位置一致，說明外周血管途徑給予外源性BDNF不能通過BBB進入大腦；而 BDNF-PTD/Antp組動物的腦中多個部位有強陽性表達，尤其是海馬和紋狀體皮層，結(jié)果見 圖7，說明經(jīng)PTD修飾后的BDNF可發(fā)揮PTD的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域功能，使BDNF通過了 BBB 。NTs-PTD中含有蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域，大大擴展了NTs的應(yīng)用范圍，特別是，NTs-PTD可經(jīng)外周 途徑，包括外周血管途徑給藥后透過BBB進入大腦，所以NTs可治療CNS神經(jīng)退行性疾病，還 包括周圍神經(jīng)退行性疾病。實施例七PTD分別結(jié)合在BDNF的羧基端和氨基端的效果比較將PTD/Antp置于BDNF的氨基端，同實施例二-實施例四的方法制備Antp-BDNF。用MTT 法對BDNF-Antp和Antp-BDNF融合蛋白的生物學(xué)功能活性進行了比較。在嗜鉻細胞瘤細胞系 PC12/trkB的培養(yǎng)液中，加入復(fù)性后基因重組BDNF-Antp、 Antp-BDNF融合蛋白和陽性對照的 基因重組蛋白BDNF，與陰性對照(不加神經(jīng)營養(yǎng)因子)相比，加入不同濃度基因重組 BDNF-Antp和無PTD的基因重組BDNF，均能促進細胞的增生，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析具有顯著的差異； 而Antp-BDNF組促細胞增生能力，與陰性對照組相比，無顯著性差異。結(jié)果見圖8，圖中橫坐 標(biāo)表示不同結(jié)構(gòu)形式BDNF的濃度(nM);縱坐標(biāo)表示神經(jīng)元樣陽性細胞百分比(％)。說明 N-末端裸露的BDNF能更有效促進PC12-trkB細胞增生，且BDNF的N-末端可能是其促細胞增 生的功能結(jié)構(gòu)域。實施例八BDNF-Antp具有恢復(fù)腦卒中后神經(jīng)元功能的應(yīng)用前景實驗步驟制備沙頭鼠腦缺血模型，不同時間點經(jīng)腹腔途徑給予BDNF-Antp，斷頭處死后用TTC染色(結(jié)果見圖9)、及染色后的灰度掃描(結(jié)果見圖IO)。圖9顯示BDNF-Antp能保護鼠腦前腦缺血后神經(jīng)元的壞死。外周途徑給予BDNF-Antp后，經(jīng)TTC染色后的灰度掃描，及統(tǒng)計學(xué)分析表明，BDNF-Antp給藥組與生理鹽水對照組之間有明顯差異。其中A是沙土鼠前腦缺血注射生理鹽水組；B是沙土鼠前腦缺血前2h注射BDNF-Antp組；C是沙土鼠前腦缺血 Oh注射BDNF-Antp組；D是沙土鼠前腦缺血lh注射BDNF-Antp組；E是正常腦組。圖10是TTC 染色后灰度比較。正常腦組及缺血后，各時間點用藥組，與缺血后不用藥組之間TTC染色后 灰度比較，有顯著性差異，說明BDNF-Antp通過BBB能保護缺血后神經(jīng)元的壞死。其中l(wèi)組沙 土鼠前腦缺血注射生理鹽水組；2組:沙土鼠前腦缺血0h注射BDNF-Antp組；3組沙土鼠前腦 缺血lh注射BDNF-Antp組；4組沙土鼠前腦缺血前2h注射BDNF-Antp組；5組正常腦組。實驗結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析表明，BDNF-Antp能夠逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元的缺血性死亡，保護程度與 缺血前后不同時間點給藥密切相關(guān)。該結(jié)果說明BDNF-Antp具有治療臨床上腦中風(fēng)后神經(jīng)元 功能恢復(fù)的應(yīng)用前景。實施例9: BDNF-Antp具有治療帕金森氏癥的應(yīng)用前景。實驗步驟及結(jié)果MPTP誘導(dǎo)小鼠帕金森氏癥模型后，用BDNF-Antp治療，與模型組相比， BDNF-Antp治療組能明顯減少MPTP對多巴胺神經(jīng)元的損傷，結(jié)果見下圖ll。圖11表示C57BL 小鼠腦中黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(多巴氨神經(jīng)元的陽性標(biāo)記)免疫組化。其中A為正常對照組，腦黑 質(zhì)有正常的多巴氨神經(jīng)元;B為模型組(腹腔注射MPTP)，腦黑質(zhì)的多巴氨神經(jīng)元明顯減少； C為BDNF-Antp融合蛋白給藥組(注射MPTP前2小時腹腔注射BDNF-Antp， 5ug/25克小鼠)，與 模型B組相比，腦黑質(zhì)的多巴氨神經(jīng)元數(shù)量明顯增加。該結(jié)果說明，BDNF-Antp具有治療帕 金森氏癥的應(yīng)用前景。實施例10: Antp-PTD突變體(與Antp-PTD有70。/。同源性)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能隨機突變編碼Antp-PTD氨基酸的核苷酸，用實施例2中的PCR方法克隆了編碼BDNF-Antp/PTD突變體(其中Antp/PTD突變體與Antp/PTD有70。/。氨基酸同源性)的基因，用實施例 3及實施例4中的方法，制備該突變體。用實施例6的方法研究該BDNF-Antp/PTD突變體(其 中Antp/PTD突變體與Antp/PTD有70。/。氨基酸同源性)體內(nèi)通過BBB進入大腦的能力。結(jié)果表 明，與BDNF-Antp/PTD原蛋白一樣，BDNF-Antp/PTD突變體(其中Antp/PTD突變體與 Antp/PTD有70。/。氨基酸同源性)組經(jīng)尾靜脈給藥后，在動物的腦中多個部位有強陽性表達， 尤其是海馬和紋狀體皮層，說明與Antp/PTD有70。/。氨基酸同源性的Antp/PTD突變體，同樣具 有PTD的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域功能，使BDNF通過了BBB 。在另一個實施例中，所述Antp/PTD突 變體與Antp/PTD有85。/。氨基酸同源性，經(jīng)實驗證實，同樣具有PTD的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域功能。實施例ll: BDNF突變體(與BDNF的氨基酸有70。/。同源性)蛋白的促細胞增殖活性隨機突變編碼BDNF蛋白的核苷酸，用實施例2中的PCR方法克隆了該突變體的基因，用
實施例3及實施例4中的方法，制備BDNF突變體(與BDNF70n/。同源性)蛋白。用實施例5的 方法對BDNF突變體(與BDNF70。/。同源性)蛋白的生物學(xué)活性進行了檢測。在嗜鉻細胞瘤 細胞系PC12/trkB的培養(yǎng)液中，加入復(fù)性后基因重組BDNF-PTD突變體蛋白(與BDNF70。/。同 源性)和陽性對照的基因重組蛋白BDNF，與陰性對照(不加神經(jīng)營養(yǎng)因子)相比，加入不 同濃度基因重組BDNF-PTD突變體蛋白和陽性對照基因重組BDNF,均能促進細胞的增生，經(jīng) 統(tǒng)計學(xué)分析具有顯著的差異，說明與BDNF7(P/。同源性的突變體蛋白同樣具有BDNF的生物活 性。在另一個實施例中，所述BDNF突變體與BDNF的氨基酸有85M的同源性，經(jīng)實驗證實， 同樣具有BDNF的生物活性。實施例12: BDNF (突變體)-/01中/ 丁0突變體融合蛋白的生物學(xué)活性按實施例IO及實施例11的方法，制備BDNF (突變體)-AntpZPTD突變體融合蛋白， 其中BDNF突變體與BDNF有70%氨基酸同源性，Antp/PTD突變體與Antp/PTD有70%氨 基酸同源性。實驗結(jié)果表明，所制備的BDNF (突變體)-Antp/PTD突變體融合蛋白能夠逆 轉(zhuǎn)神經(jīng)元的缺血性死亡，保護程度與缺血前后不同時間點給藥密切相關(guān)。該結(jié)果說明BDNF (突變體)-Antp/PTD突變體融合蛋白同樣具有治療臨床上腦中風(fēng)后神經(jīng)元功能恢復(fù)的應(yīng)用 前景。在另一個實施例中，其中BDNF突變體與BDNF有85y。氨基酸同源性，Antp/PTD突 變體與Antp/PTD有85y。氨基酸同源性，得到的融合蛋白，經(jīng)實驗證實，同樣具有治療臨床 上腦中風(fēng)后祌經(jīng)元功能恢復(fù)的應(yīng)用前景。
序列表<110>南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院<120>—種攜帶神經(jīng)營養(yǎng)因子穿過血腦屏障的融合蛋白及其編碼基因與用途<150>CN200610122393.9<151>2006-09-25<160>4<210> 1 <211> 138 <212> PRT<213>大腸桿菌種(E. coli) <400> 1Met His Ser Asp Pro Arg Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser15 10 15lie Ser Glu Tip Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met1 5 10 15Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly15 10 15Gin Leu Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr15 10 15Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly lie Asp Lys Arg His Tip Asn Ser Gin1 5 10 15Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys1 5 10 15Lys Arg He Gly Trp Arg Phe lie Arg lie Asp Thr Ser Cys Val Cys15 10 15Thr Leu Thr lie Lys Arg Gly Ser Gly Arg Gin He Lys lie Trp Phe15 10 15Gin Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Cys1 5 10<210>2 <211>417 <212> DNA<213>大腸桿菌種(E. coli) <400> 2 atgcactctg accctgcccg ccgaggggag ctgagcgtgt gtgacagUt tagtgagtgg 60gtaacggcgg cagacaaaaa gactgcagtg gacatgtcgg gcgggacggt cacagtcctt 120gaaaaggtcc ctgtatcaaa aggccaactg aagcaatact tctacgagac caagtgcaat 180cccatgggtt acacaaaaga aggctgcagg ggcatagaca aaaggcattg gaactcccag 240tgccgaacta cccagtcgta cgtgcgggcc cttaccatgg atagcaaaaa gagaattggc 300tggcgattca taaggataga cacttcttgt gtatgtacat tgaccattaa aaggggatcc 360ggcagacaaa tctggttcca attccaaaac aggaggatga agtggaaaaa atgctag 417<210>3 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>根據(jù)核苷酸序列設(shè)計，用作擴增融和蛋白基因的引物 <400> 3gccatatgca ctctgaccct gcccgccga<210>4 <211>95 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>根據(jù)核苷酸序列設(shè)計，用作擴增融和蛋白基因的引物 <400> 4gcctcgagct agcatttttt ccacttcatc ctcctgtttt ggaattggaa ccagatttgt 60 ctgccggatc cccttttaat ggtcaatgta catac 9權(quán)利要求
1.一種攜帶神經(jīng)營養(yǎng)因子穿過血腦屏障的融合蛋白，包括與神經(jīng)營養(yǎng)因子成熟區(qū)蛋白的氨基酸序列有至少75％同源性的第一區(qū)；與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列有至少70％同源性的第二區(qū)；其中，所述第二區(qū)位于所述第一區(qū)的羧基末端。
2. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一區(qū)與神經(jīng)營養(yǎng)因子成熟區(qū)蛋白的氨基酸 序列有至少85%的同源性；所述第二區(qū)與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列有至少85%的同源 性。
3. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一區(qū)為人神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營 養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3或神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4/5。
4. 權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中所述第二區(qū)為來源于果蠅的同源異型蛋白Antp、 來源于小鼠血管內(nèi)皮細胞I型膜蛋白Cadherin中的pVEC或來源于人類I型免疫缺陷病毒的 轉(zhuǎn)錄激活蛋白Tat。
5. 權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中所述第二區(qū)緊鄰所述第一區(qū)或通過間隔氨基酸與所 述第一區(qū)相連。
6. 權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一區(qū)為人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；所述第二 區(qū)為來源于果蠅的同源異型蛋白Antp，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO: 1所示。
7.—種編碼權(quán)利要求6所述融合蛋白的核苷酸序列，其堿基序列如SEQIDNO: 2所示或其互補序列。
8.—種表達載體，其含有權(quán)利要求7所述的核苷酸序列。
9.一種宿主表達系統(tǒng)，其含有權(quán)利要求8所述的表達載體。
10.權(quán)利要求1所述的融合蛋白在制備治療神經(jīng)營養(yǎng)因子相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了含蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域的神經(jīng)營養(yǎng)因子融合蛋白基因的克隆，蛋白質(zhì)的表達和純化，融合蛋白的生物學(xué)活性，及其生物體內(nèi)穿過細胞膜，特別是血腦屏障的功效。該融合蛋白包括與神經(jīng)營養(yǎng)因子至少75％序列同源的第一區(qū)，和與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列至少75％同源的第二區(qū)，所述第二區(qū)位于所述第一區(qū)的羧基端；可以在不改變?nèi)诤系鞍滋匦缘那疤嵯拢M行氨基酸殘基的取代、缺失或加入。該融合蛋白可用作藥物，經(jīng)外周途徑給藥治療多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)退行性疾病和周圍神經(jīng)病變。
文檔編號C07K19/00GK101157730SQ20071014739
公開日2008年4月9日 申請日期2007年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月25日
發(fā)明者靚 孫, 季愛民, 張忠義, 李曉東, 王秉鈞, 丹 蘇, 甌 車, 馬翰章, 馬蕾蕾 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院