專利名稱：：格爾德霉素的新衍生物Gdm-CT-1-1及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及利用基因工程技術改造制備抗生素的新衍生物，具體而言，涉及利用基因工程技術獲得格爾德霉素的新衍生物CT-1-1及其制備方法。技術背景吸水鏈霉菌17997(S加;towyc^/^gracopicws17997)是中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所從我國土壤中分離到的，經(jīng)鑒定其可以產(chǎn)生格爾德霉素(geldanamycin,Gdm)。Gdm具有抗原蟲、抗腫瘤、抗病毒以及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學活性[SasakiK""/.JAntibiot(Tokyo)1979,32(8):849-51];[陶佩珍等，中國抗生素雜志，1997,22:368-372]。根據(jù)最近報道，Gdm還具有調(diào)節(jié)上皮氮氧合酶活性以及抗炎等作用[Mu卬hyPWJournalofNeuroscienceResearch,2002,67(4):461-470]。經(jīng)研究證實，格爾德霉素的特異性作用靶點是熱休克蛋白卯(heatshockprotein90,Hsp卯)。Hsp卯是許多信號蛋白的伴侶分子，Gdm通過對Hsp90的抑制，可以間接影響細胞內(nèi)信號蛋白的功能，因此，有望成為一種頗具潛力的抗腫瘤和抗病毒藥物。但是Gdm還存在毒性大及水溶性差等缺點，水溶性差會影響其生物利用度，這些缺陷將限制其開發(fā)成為有效藥物。所以，尋找一種毒性低、水溶性好的衍生物，已成為其深入研究的主要目標。目前，已有兩個在C17位進行取代的Gdm衍生物17—AAG和17—DMAG,相繼在美國進行II期和I期臨床試驗[GoetzMPetalJClinOncol,2005，23(6):1078-1087];[GlazeER"a/.,CancerChemotherPharmacol.2005,56(6):637-647〗。Gdm的生物合成，是以3—氨基—5—羥基苯甲酸為起始物，2C單位為延伸單位，包括l個丙二酰，4個甲基丙二酰和2個甲氧基丙二酰，在荷載域和7個聚酮合酶(polyketidesynthase,PKS)模塊，順序進行碳鏈的延伸反應形成聚酮鏈骨架，再經(jīng)過酰胺合酶的環(huán)化，形成格爾德霉素前體原Gdm。然后通過后修飾過程，包括C17位的羥基化及氧甲基化、C21位的氧化、C7位的氨甲?；虲4，5位的氧化，最終形成Gdm。為了實現(xiàn)對Gdm生物學方法的改造，本實驗室從Streptomyceshygroscopicus17997基因文庫中克隆了與Gdm生物合成相關的基因簇[高群杰等，中國抗生素雜志，2002，27(1):13-27];[赫衛(wèi)清，王以光，中國生物工程學報，2006,22:卯2-906]。通過阻斷吸水鏈霉菌17997中的格爾德霉素生物合成基因一氨甲?；D(zhuǎn)移酶基因(gc/mW)的方法，獲得一種新的格爾德霉素衍生物4,5-雙氫一7—氧一脫氨甲?；?—羥基一19一甘氨酰格爾德霉素(4，5-dihydro-7-0-descarbamoyl-7-hydroxy-19-glycylgeldanamycin)，命名為Gdm-CT-l-l。Gdm-CT-l-l水溶性比Gdm增加了500多倍。本發(fā)明所述通過基因工程技術在C19位進行修飾獲得Gdm新衍生物Gdm-CT-l-l及其制備方法，為制備水溶性好的Gdm衍生物提供了新的途徑。利用生物學方法在GdmC19位進行修飾獲得新衍生物的研究，迄今為止，尚未見有國內(nèi)外的相關報道。本發(fā)明提供了格爾德霉素的新衍生物Gdm-CT-1-1，其結(jié)構如式(1)所示:本發(fā)明還提供了新衍生物Gdm-CT-l-l的制備方法，具體步驟包括1、Gdm生物合成阻斷變株的構建采用具有氨芐青霉素抗性(AmpR)和硫鏈絲菌素抗性(TsrR)的大腸桿菌和鏈霉菌的穿梭載體pGH112構建基因阻斷載體，以吸水鏈霉菌17997基因組為模板進行PCR，分別獲得與^/miV基因同源的兩個片段，在其中間以相應的酶切位點插入阿普拉霉素(apramydn，Am)抗性基因，并與pGH112載體進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，獲得用于目的基因阻斷的重組載體；
發(fā)明內(nèi)容:將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ET12567/pUZ8002中，獲得轉(zhuǎn)化子，將其與吸水鏈霉菌17997的新鮮孢子共培養(yǎng)，通過接合轉(zhuǎn)移，將重組載體導入吸水鏈霉菌中。接合轉(zhuǎn)移子進行傳代培養(yǎng)，篩選出An^和Ts一的突變株CT-1。利用PCR方法鑒定確認，gcfmiV基因阻斷變株是通過同源雙交換在其中插入Am抗性基因的結(jié)果。2、格爾德霉素新衍生物Gdm-CT-1-1的獲得將CT-1變株進行發(fā)酵培養(yǎng)，用等量乙酸已酯萃取發(fā)酵液上清，乙酸已酯萃取液經(jīng)薄膜濃縮獲得粗品，在硅膠柱用二氯甲垸洗脫，分部收集，以TLC或HPLC進行檢測，再經(jīng)制備型HPLC獲得格爾德霉素新衍生物Gdm-CT-1-1純品。3、格爾德霉素新衍生物Gdm-CT-1-1的結(jié)構鑒定及水溶性測定經(jīng)高分辨質(zhì)譜確定Gdm-CT-l-l的分子量和分子式，經(jīng)"H和UCNMR分析，并通過化學結(jié)構解析，確定Gdm-CT-1-1的結(jié)構為4,5-雙氫-7-氧-脫氨甲?；?7-羥基-19-氧-甘氨酰格爾德霉素。測試結(jié)果表明，Gdm-CT-1-1的水溶性比Gdm提高500倍。發(fā)明效果本發(fā)明通過同源基因雙交換阻斷技術，破壞吸水鏈霉菌17997中的格爾德霉素生物合成基因gafe/^，在其變株發(fā)酵液中直接獲得Gdm在C19位進行修飾的新衍生物Gdm-CT-l-l，且其水溶性比格爾德霉素高出500倍，為提供臨床療效更好的藥物奠定了基礎。-圖l:^加/V基因阻斷載體的構建其中All^—阿普拉霉素抗性基因；tsr—硫鏈絲菌素抗性基因；Amp—氨芐青霉素抗性基因；B—;Bg—彭II;E—fco/I;Pi"I;S—SacIsX—版I。圖2:PCR產(chǎn)物電泳其中M—入HindIII;1—17997原株；2—CT-1。圖3:g血;V變株發(fā)酵產(chǎn)生的Gdra-CT-1-1HPLC檢測圖其中A—吸水鏈霉菌17997;保留時間為24.863分鐘，B—Gdm-CT-1-1，保留時間為12.925分鐘。圖4:Gdm-CT-1-1高分辨質(zhì)譜圖譜圖5:Gdm-CT-1-11H氫譜圖6:Gdm-CT-1-113C碳i普實施方案以下所列實施例是為幫助本領域技術人員更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。<實施例1>gc/wiV基因阻斷重組載體的構建根據(jù)gdwiV基因序列(GenbankDQ914285)設計引物(N1-N4)，提取吸水鏈霉菌17997(中國微生物菌種保藏委員會藥學微生物菌種保藏中心，保藏號CPHCC200178)基因組DNA，以此作為模板進行常規(guī)PCR。在本實驗中采用以下引物及設計的酶切位點，但不限于所說的引物序列和酶切位點。上游引物(N1):5，-CCGGAATTCACGGCCTTGGCCAGATCC-3'帶有五coRI酶切位點；下游弓I物(N2):5，-CGCGGATCCATCCACCCCGCCTCGCAC國3，帶有5謡HI酶切位點；擴增949bp片段l。上游引物(N3):5，-AAAACTGCAGGCCGTTGAGGCTGGAGTT陽3，帶有戶M酶切位點；下游引物(N4):5，-CTAGTCTAGACCGACTGGTTTGGGTGAT-3，帶有酶切位點；擴增963bp片段2?；厥誔CR產(chǎn)物片段1和2，在其中間以5amHI-PWl酶切位點插入Am抗性基因，[來源于質(zhì)粒載體pKC1139(KieserT.etal.practicalStreptomycesgenetics.Norwich:JohnInnesFoundation.2000)]，并以五coRI-力al酶切位點與攜帶硫鏈絲菌素抗性的pGH112載體(莫宏波等生物工程學報，2004;20:662-666)相應酶切位點進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ot，提取轉(zhuǎn)化子DNA，經(jīng)酶切證明，獲得基因阻斷重組載體pGHEX-gdmN(圖1)。<實施例2>gdmiV變株的基因鑒定gdmiV變株的篩選按照文獻[赫衛(wèi)清等中國抗生素雜志，2006，31(3):168一171]進行。將構建的基因阻斷重組載體pGHEX-gdmN通過能與吸水鏈霉菌進行接合轉(zhuǎn)移的大腸桿菌，如大腸桿菌ET12567/pUZ8002[KieserT.etal.practicalStreptomycesgenetics.Norwich:JohnInnesFoundation.2000〗導入到吸水鏈霉菌17997中，并在MY培養(yǎng)基[赫衛(wèi)清等中國抗生素雜志，2006，31(3):168—171]中傳34代后，再進行單克隆分離，篩選獲得AmK、TsrsgdmiV變株。對gc/miV變株(CT-1)在基因整合水平進行PCR驗證。以原株和CT-1變株的基因組為模板，選取g"mW基因兩翼外測序列設計引物Prl和Pr2(圖l)進行PCR。結(jié)果表明，使用引物Prl和Pr2原株基因組PCR產(chǎn)物大小約3.1kb左右，而在CT-1變株中擴增出將近4.5kb特異性條帶(圖2)。Prl上游引物5'CCCAAGCTTCTCGTGGACGGGTTGCT3'(iZ/wcflll)Pr2下游弓l物5'CTAGTCTAGATCGAACGCCTCCACCTC3，CY&fll)PCR結(jié)果揭示，在同源基因片段之間，插入了1.5kb左右的Am抗性基因，符合預期結(jié)果。g^mJV變株在不加藥連續(xù)傳代中，Am抗性表型很穩(wěn)定，說明該變株中確實發(fā)生了DNA同源重組雙交換所造成的Am抗性基因插入，并使g^niV基因由于阻斷而受到破壞。<實施例3>Gdm-CT-1-1的制備gc/miV變株在MY固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，接種種子培養(yǎng)基50ml于250ml三角瓶，28。C搖床200rpm振蕩培養(yǎng)2天，以5—10%接種量轉(zhuǎn)種發(fā)酵培養(yǎng)基50ml(500ml三角瓶)或1000ml(5000ml)28。C搖床200rpm振蕩培養(yǎng)3天[赫衛(wèi)清等中國抗生素雜志，2006，31(3):168—171]。發(fā)酵液過濾后，用濾液二分之一體積的乙酸乙酯提取，薄膜濃縮后上硅膠柱，以二氯甲垸甲醇19一1進行洗脫，分部收集洗脫液，用島津LC-10Avp高壓液相色譜儀，SPD-M10AvP二極管陣列檢測器，CLASS-VP工作站，以254nm進行HPLC檢測(圖3)，匯總含Gdm-CT-l-l化合物部分洗脫液，濃縮后用制備型HPLC，ODS-C18柱(柱體積150x20毫米)，甲醇水14:ll(v/v)，流量每分鐘5毫升，獲得Gdm-CT-l-l純品。<實施例4>Gdm-CT-l-l結(jié)構的確定Gdm-CT-l-l純品經(jīng)高分辨質(zhì)譜分析，結(jié)果見圖4，確定其分子量為615.2896(含鈉)，實際分子量為592，分子式為C3QH44N2014。^和13CNMR數(shù)據(jù)見表1，圖譜見圖5，圖6。表lGdm-CT-1-1化合物的111和13CNMR數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>化學解析結(jié)果表明，Gdm-CT-l-l的結(jié)構如式(1)所示:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula><實施例5>Gdm-CT-l-l的水溶性測定分別將Gdm-CT-l-l和Gdm在50mM，pH7.0的磷酸鈉緩沖液中溶解，在室溫閉光的情況下攪拌12小時，測定它們的溶解度。結(jié)果表明,Gdm的溶解度為每毫升0.007毫克,而Gdm-CT-l-l的溶解度為每毫升4.02毫克，化合物Gdm-CT-l-l比Gdm的水溶性高500多倍。權利要求1、一種格爾德霉素的新衍生物Gdm-CT-1-1，其結(jié)構如式(1)所示。2、制備權利要求1所述新衍生物Gdm-CT-l-l的方法，具體包括以下步驟A.Gdm生物合成阻斷變株的構建；B.Gcto生物合成阻斷變株的發(fā)酵及Gdm-CT-1-1的提取和純化。3、如權利要求2所述的方法，其特征是，所說阻斷變株的構建，是根據(jù)g^2iV基因序列(GenbankDQ914285)設計引物，以吸水鏈霉菌17997基因組為模板，進行PCR，分別獲得與gc/miV基因同源的兩個片段，在其中間以相應的酶切位點插入選擇性標記基因，并與可轉(zhuǎn)入吸水鏈霉菌17997的質(zhì)粒載體進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，獲得用于目的基因阻斷的重組載體；將重組載體導入吸水鏈霉菌中；根據(jù)選擇性標記篩選轉(zhuǎn)化子；利用PCR方法鑒定確認gctoV基因序列插入了選擇性標記基因，使g血iV基因遭到破壞，從而獲得Gdm生物合成阻斷變株CT-1-1。4、如權利要求2所述的方法，其特征是，新衍生物Gdm-CT-1-1的制備是將CT-1變株直接進行發(fā)酵培養(yǎng)，用等量乙酸已酯萃取發(fā)酵液上清，乙酸已酯萃取液經(jīng)薄膜濃縮獲得粗品，在硅膠柱上用二氯甲烷洗脫，分部收集，以TLC或HPLC進行檢測，再經(jīng)制備型HPLC得到格爾德霉素新衍生物Gdm-CT-l-l純品。5、格爾德霉素新衍生物Gdm-CT-l-l作為先導化合物在開發(fā)制備有效藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及利用基因工程技術改造制備抗生素的新衍生物，具體而言，涉及利用基因工程技術獲得格爾德霉素C19位進行修飾的新衍生物4，5-雙氫-7-氧-脫氨甲酰基-7-羥基-19-氧-甘氨酰格爾德霉素(Gdm-CT-1-1)及其制備方法，通過同源基因雙交換阻斷技術，破壞吸水鏈霉菌17997中的格爾德霉素生物合成基因gdmN，在其變株發(fā)酵液中直接獲得Gdm新衍生物，其水溶性比格爾德霉素高500倍，為研制臨床療效更好的藥物奠定了基礎。文檔編號C07D225/06GK101239948SQ20071016634公開日2008年8月13日申請日期2007年11月7日優(yōu)先權日2007年11月7日發(fā)明者李永海,王以光,赫衛(wèi)清,邵榮光申請人:中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所