專利名稱：：葫蘆烷型三萜皂苷化合物、其藥物組合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域，更具體而言，涉及一類從苦瓜中提取的葫,烷型三碎皂苷化合物、其藥物組合物及其制備方法和在預(yù)防/治療糖尿病、肥胖和高血脂中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：世界上糖尿病患者已超過1.5億，預(yù)計到2025年將達(dá)3億。而其中主要為II型糖尿病患者(T2D)。由于II型糖尿病的主要代謝異常表現(xiàn)為胰島素抵抗，因此，胰島素增敏劑，即通過改善胰島素抵抗而達(dá)到治療糖尿病藥物，是目前糖尿病藥物研究的熱點(diǎn)之一?，F(xiàn)有兩條藥理學(xué)途徑可以改善胰島素4氐抗一是通過過氧化物酶體增生物激活受體(PPARs),或者通過一磷酸腺苷激活蛋白激酶激活劑(AMPK)。目前常用的兩類藥物為噻唑烷二酮類(TZDs)和雙胍類藥物。p塞唑烷二酮類雖被廣泛使用但是有許多不良反應(yīng)，如肥胖、液體渚留和心衰等。雙胍類的二曱雙胍不引起肥胖，但因其主要作用于肝臟，而不是肌肉，所以它并不是一個令人滿意的治療糖尿病的方法。尋找更理想的胰島素增敏劑是當(dāng)前世界上糖尿病藥物研究的熱點(diǎn)。目前，世界上有超過IO億的成人超重，其中的3億人為肥胖—患者，而且呈急劇上升的趨勢，同時也導(dǎo)致肥胖相關(guān)疾病(如n型糖尿病、心臟病、中風(fēng)和高血壓等)發(fā)病率的不斷升高。造成超重和肥胖的主要原因是高脂高熱飲食、缺乏運(yùn)動和城市化進(jìn)程地加快。目前市場上只有兩個批準(zhǔn)上市可長期使用的減肥藥物一是奧利司他，為特異性胃腸道脂肪酶抑制劑，但其具有非常普遍的胃腸道不良反應(yīng)；二是西布曲明，為單胺再攝取的抑制劑，但其會升高血壓和加快心率。因此，尋找安全和有效的減肥藥物是當(dāng)前迫切需要解決的問題?？喙?Afomorafcac/iara""aL.)為葫蘆科苦瓜屬才直物。長期以來，我國民間將苦瓜廣泛應(yīng)用于清熱解毒、明目解毒、健胃消渴、緩瀉、驅(qū)蟲等疾病?？喙现谢瘜W(xué)成分包括三萜皂苷、腦苷、蛋白質(zhì)等。關(guān)于苦瓜降血糖作用的報道非常廣泛。國際專利申請WO0061619報道了苦瓜多肽K具有降低血糖、降低血脂、緩解疼痛和炎癥、降低血壓以及增加免疫力的作用。W09843484報道了苦瓜多肽MC6及其衍生物具有口服P爭糖作用。它們報道的均是苦瓜中所含多肽化合物的活性。中國專利CN1069534C《天然苦瓜素降糖藥及其制備方法》中沒有說明天然苦瓜素降糖藥的化學(xué)成分，并且沒有明確其胰島素增敏作用；CN1098858C《苦瓜素的提取工藝》中沒有確定苦瓜素的結(jié)構(gòu)，并且沒有明確其對于I、II型糖尿病的活性。中國專利申請CN1528785A《一種苦瓜降血糖提取物(KGE)的樹脂制備方法》中所獲得的提取物KGE成分復(fù)雜，而沒有闡明其化學(xué)成分。中國專利申請CN1520838A《苦瓜提取物植物胰島素；苦瓜皂甙的新用途》中所述制作工藝復(fù)雜，并且所獲得的提取物成分多而雜，同時也沒有明確該提取物的組成。中國專利CN1209155C《含降血糖活性成分的苦瓜制品的制備》中所述用苦瓜汁做成的不同劑型的苦瓜制品，其所含成分極為復(fù)雜，同時專利中提供的多酚氧化酶、蛋白質(zhì)電泳檢測、薄層層析等方法也不足以說明其活性成分以及進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量控制。綜上所述，在現(xiàn)有技術(shù)中都沒有涉及具有預(yù)防/治療糖尿病、肥胖和高血脂生物活性的從苦瓜中提取的葫,烷型三碎皂苷具體化合物、其化學(xué)結(jié)構(gòu)及其藥理學(xué)數(shù)據(jù)。
發(fā)明內(nèi)容針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明的一個目的是提供一類從苦瓜中提取的具有預(yù)防/治療糖尿病、肥胖和高血脂活性的葫F烷型三碎皂苷化合物。本發(fā)明的又一目的是提供一種含有治療有效量的上述三萜皂苷類化合物的藥物組合物。本發(fā)明的還一目的是提供一種從苦瓜中提取和分離上述三辟皂苷類化合物及其藥物組合物的制備方法。本發(fā)明的再一目的是提供上述三萜皂苦類化合物及其藥物組合物在制備預(yù)防/治療糖尿病、肥胖和高血脂藥物中的應(yīng)用。上述的葫蘆烷型三碎皂苷類化合物在制備預(yù)防和治療糖尿病藥物的應(yīng)用中為肌肉和脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取促進(jìn)劑、胰島素增敏劑、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)上膜促進(jìn)劑、一磷酸腺苷激活蛋白激酶激活劑、脂肪酸氧化代謝促進(jìn)劑或胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下的葡萄糖耐受性改善劑。上述的葫^"烷型三萜皂苷類化合物在制備預(yù)防和治療肥胖藥物的應(yīng)用中為一磷酸腺苷激活蛋白激酶激活劑或脂肪酸氧化代謝促進(jìn)劑。上述的葫，烷型三辟皂苷類化合物在制備預(yù)防和治療高血脂藥物的應(yīng)用中為血漿甘油三酯和游離脂肪酸水平降低劑或脂代謝紊亂狀態(tài)下的脂耐量改善劑。本發(fā)明提供的一類具有預(yù)防/治療糖尿病、肥胖和高血脂活性的從苦瓜中提取的三碎急苷類化合物，其具有如下結(jié)構(gòu)式I所示的結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>其中，R!為氫、(3-D-葡萄吡喃糖基、(3-D-阿洛吡喃糖基、卩-D-葡萄吡喃糖基(1—6)-卩-D-葡萄吡喃糖基或卩-D-木敗喃糖基(1—4)-[(3-D-葡萄吡喃糖基(1—6)]-卩-D-葡萄吡喃糖基；R2為羥基、氫或卩-D-葡萄吡喃糖氧基；R3為羥基或氫；R4為羥基、氫、p-D-葡萄吡喃糖氧基或p-D-阿洛吡喃糖氧基；Rs為羥基或氫；Re為羥基、卩-D-葡萄吡喃糖氧基或氫；R7為甲基或醛基；或可選擇地，C5和C6、C6和C7、C22和C23、C23和C24、C24和C25、C25和C27形成雙鍵；且在R3、R4、Rs為羥基的情況下，C22、C23、C24的手性為S、S、R構(gòu)型；在R4、Rs為羥基以及R3為氫的情況下，C23、C24的手性為S、S構(gòu)型；在R3為羥基，R4為卩-D-葡萄吡喃糖氧基情況下，C22和C23為S,S構(gòu)型；在R7為甲基的情況下，C5和C19可以由氧橋相連；且當(dāng)R,為氫、卩-D-葡萄吡喃糖基(1—6)-卩-D-葡萄吡喃糖基或(3-D-木吡喃糖基(1—4)-[卩-D-葡萄吡喃糖基(1—6)]-|3-D-葡萄吡喃糖基，R2為氫，R3、R4、R5、R6為羥基，C5和C6形成雙鍵時，R不為甲基；當(dāng)R2、Re為羥基，Ri、R3、R4、Rs為氫，且C5和C6、C23和C24形成雙鍵時，R7不為醛基；當(dāng)Ri為卩-D-葡萄吡喃糖基或卩-D-阿洛吡喃糖基，R2、R5、為氫，Rg為羥基，R7為曱基，且C6和C7、C24和C25形成雙鍵，C5和C19由氧橋相連時，R4不為P-D-阿洛吡喃糖氧基。本發(fā)明提供的一種預(yù)防/治療糖尿病、肥胖和高血脂的藥物組合物，該組合物包含治療有效量的上述結(jié)構(gòu)式I所示的從苦瓜中分離得到的三萜皂苷化合物中的一種或多種。此外，該組合物可進(jìn)一步包含已知化合物大豆腦苷I(soya-cerebrosideI)、苦瓜腦苦(momor-cerebroside)、三碎3,7,25-三鞋基葫蘆烷-5，23(五)-二烯-19-醛、22(S),23,24,25-四羥基葫蘆烷-5-歸、三碎急苦momordicosideA、momordicosideB、momordicosideM或momordicosideN(MagneticResonanceInChemistry,2007,63,615-621)中的一種或多種，它們的具體結(jié)構(gòu)式分別為三辟3，7,25-三幾基葫,烷-5,23(￡)-二烯-9-醛三路皂苦momordicosideA22(S)，23(W),24(W)，25-四羥基葫蘆烷-5-烯三萜皂苷momordicosideBmomordicosideMmomordicosideN。本發(fā)明提供的上述預(yù)防/治療糖尿病、肥胖和高血脂的藥物組合物，所述的化合物來自苦瓜活性部位的提取物，該提取物通過如下步驟制得(制備流程圖如圖1所示)(a)用醇、水或其混合物浸泡苦瓜樣品，過濾后得到提取液；其中所述的醇為曱醇或乙醇；(b)將得到的提取液中的溶劑蒸發(fā)形成漿狀物；(c)將水加入到該漿狀物中，得到總提取物的水混懸液；(d)用氯仿、二氯曱烷或其混合物對上述混懸液進(jìn)行液液萃取，得到氯仿、二氯甲烷或其混合物的萃取物；然后，進(jìn)一步用正丁醇進(jìn)行萃取，得到正丁醇萃取物；(e)將正丁醇萃取物濃縮后，進(jìn)行大孔樹脂層析，分別用純水、體積比為30:70醇/純水混合物、體積比為95:5醇/純水混合物進(jìn)行洗脫；其中所述的醇為甲醇或乙醇；(f)將體積比為95:5醇/純水混合物洗脫得到的洗脫液蒸發(fā)至干，即得活性部位提取物KG8。上述得到的苦瓜活性部位提取物KG8，經(jīng)過層析分離后，可以制得本發(fā)明的三萜皂苷類化合物。上述三碎皂苷類化合物在制備肌肉和脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取、促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)上膜、增加一磷酸腺普激活蛋白激酶(AMPK)活性、促進(jìn)脂肪酸氧化代謝、改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下的葡萄糖耐受性、降低血漿甘油三酯和游離脂肪酸水平或改善脂代謝紊亂狀態(tài)下脂耐量藥物中的應(yīng)用。上述三萜皂苷類化合物具有促進(jìn)肌肉和脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取和胰島素增敏作用，對于I型和II型糖尿病均具有穩(wěn)定的降血糖活性，并能夠預(yù)防/治療肥胖和高血脂。因此，本發(fā)明的上述的葫,烷型三薛皂苷化合物及其藥物組合物為肌肉和脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取促進(jìn)劑、促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)上膜激動劑、一磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)激活劑、促進(jìn)脂肪酸氧化代謝、改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下的葡萄糖耐受性、降低血漿甘油三酯和游離脂肪酸水平、改善脂代謝紊亂狀態(tài)下脂耐量的藥物。3T3-L1脂肪細(xì)胞實驗中，KG8對脂肪細(xì)胞短期和長期都有刺激葡萄糖攝取的作用，說明KG8能夠增加胰島素的敏感性。在I型糖尿病模型四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠中，KG8在25mg/kg的給藥水平即有明顯的降血糖效果。在Ob/Ob小鼠糖尿病模型中，KG8能長期穩(wěn)定的降低小鼠血糖。實驗證明KG8具有明顯的胰島素增壽文的作用，并且對I型和II型糖尿病均有較好的降血糖作用。在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下的小鼠葡萄糖耐受性實驗中，KG8和化合物F能明顯改善葡萄糖不耐受。在化合物對葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)上膜活性測試實驗中，化合物能顯著促進(jìn)肌肉和脂肪細(xì)胞內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)上膜。在一磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)活性實驗中，化合物A和F能顯著增強(qiáng)AMPK激酶活性。在小鼠葡萄糖利用實驗中，化合物F能顯著促進(jìn)小鼠葡萄糖利用。本發(fā)明的化合物具有促進(jìn)肌肉和脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取和胰島素增敏作用而降低血糖的活性。在小鼠能量消耗和脂肪酸氧化代謝急性影響中，KG8和化合物F能顯著促進(jìn)小鼠急性脂肪酸氧化代謝和整體能量消耗而具有治療肥胖的效果。對高脂飲食誘導(dǎo)肥胖(DIO)小鼠胰島素敏感性和脂代謝的影響實驗中，KG8能明顯改善DIO小鼠的脂耐量，降低血漿甘油三酯、游離脂肪酸水平。KG8對Ob/Ob小鼠的糖尿病治療作用，KG8能夠顯著降低小鼠血漿和肝臟甘油三酯水平。本發(fā)明化合物的組合物能夠通過降低甘油三酯、游離脂肪酸水平從而治療高脂血癥。圖1是KG8的制備流程圖。圖2是化合物A-I的分離流程圖。圖3是KG8對3T3-U細(xì)胞葡萄糖攝取的影響圖。圖4是KG8對Ob/Ob小鼠血漿甘油三酯的影響圖。圖5是KG8對Ob/Ob小鼠肝臟甘油三脂的影響圖。圖6是KG8改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下的葡萄糖耐受性實驗圖。圖7是KG8對HF小鼠脂肪酸氧化代謝影響圖。圖8是KG8對DIO小鼠脂耐量的影響圖。圖9是KG8對DI0小鼠血漿甘油三酯的影響圖。圖10是KG8對DI0小鼠血漿游離脂肪酸的影響圖。圖11是KG8對DIO小鼠口服糖耐量的影響圖(血漿葡萄糖濃度)。圖12是KG8對DIO小鼠口服糖耐量的影響圖(血漿胰島素濃度)。圖13是KG8對DIO小鼠胰島素耐量的影響圖(血漿葡萄糖濃度)。圖14是KG8對DIO小鼠胰島素耐量的影響圖(血糖下降百分率)。圖15是化合物對葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)上膜活性測試圖。圖16是化合物A、F對一磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)活性測試圖。圖17是化合物F對小鼠能量消耗和脂肪酸氧化代謝急性影響圖。圖18是化合物F對小鼠葡萄糖利用圖。具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但不作為對本發(fā)明的限定。I、概要本發(fā)明提供從苦瓜中分離獲得的三萜皂苷類化合物及其藥物組合物，其制備方法以及在糖尿病、肥胖和高血脂的預(yù)防和治療中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的預(yù)防/治療糖尿病、肥胖和高血脂活性指的是能夠促進(jìn)肌肉及脂肪細(xì)胞葡萄糖吸收、抵抗及降低空腹和餐后高血糖濃度、具有胰島素類似物樣作用以及胰島素增敏作用、促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)上膜、增加一磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)活性、促進(jìn)脂肪酸氧化代謝、改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下的葡萄糖耐受性、降低血漿甘油三酯和游離脂肪酸水平和改善脂代謝紊亂狀態(tài)下脂耐量。II、化合物本發(fā)明提供一類從苦瓜中提取的具有預(yù)防/治療糖尿病、肥胖和高血脂活性的三碎皂香類化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難理解，本發(fā)明涉及擁有不對稱碳原子(手性中心)或雙4建的一些化合物，以及含有這些化合物的消旋物，這些化合物的非對映體、對映體、幾何異構(gòu)體。本發(fā)明的三萜皂苷類化合物具有如下結(jié)構(gòu)式I所示的結(jié)構(gòu)2829其中，R!為氫、卩-D-葡萄吡喃糖基、p-D-阿洛吡喃糖基、卩-D-葡萄吡喃糖基(1—6)-(3-D-葡萄吡喃糖基或p-D-木吡喃糖基(1—4)-[P_D-葡萄吡喃糖基(1—6)]-|3-D-葡萄吡喃糖基；R2為羥基、氫或卩-D-葡萄吡喃糖氧基；R3為羥基或氫；R4為羥基、氫、(3-D-葡萄吡喃糖氧基或(3-D-阿洛吡喃糖氧基；115為羥基或氫；R6為羥基、P-D-葡萄吡喃糖氧基或氫；R7為曱基或醛基；或可選4爭地，C5和C6、C6和C7、C22和C23、C23和C24、C24和C25、C25和C27形成雙鍵；且在R3、R4、Rs為羥基的情況下，C22、C23、C24的手性為S、S、R構(gòu)型；在R4、R5為羥基以及R3為氫的情況下，C23、C24的手性為S、S構(gòu)型；在Rs為羥基，R4為(3-D-葡萄吡喃糖氧基情況下，C22和C23為S,S構(gòu)型；在R7為甲基的情況下，C5和C19可以由氧橋相連；且當(dāng)R,為氫、p-D-葡萄吡喃糖基(1—6)-J3-D-葡萄吡喃糖基或卩-D-木吡喃糖基(1—4)-[卩-D-葡萄吡喃糖基(1—6)]-卩-D-葡萄吡喃糖基，R2為氫，R3、R4、R5、R6為羥基，C5和C6形成雙鍵時，R不為甲基；當(dāng)R2、Re為羥基，R。R3、R4、Rs為氫，且C5和C6、C23和C24形成雙鍵時，R7不為醛基；當(dāng)R,為卩-D-葡萄吡喃糖基或p-D-阿洛吡喃糖基，R2、R5、R6為氫，R3為羥基，R7為甲基，且C6和C7、C24和C25形成雙鍵，C5和C19由氧橋相連時，R4不為(3-D-阿洛吡喃糖氧基。本發(fā)明的化合物為天然產(chǎn)物，在一個優(yōu)選的實施方案中，通式I的化合物為具有如下結(jié)構(gòu)式Ia的化合物R3R5其中，R!為p-D-葡萄吡喃糖基或(3-D-阿洛吡喃糖基或氬；R3為羥基或氫；R4為羥基、氫、13-D-葡萄吡喃糖氧基或l3-D-阿洛吡喃糖氧基；Rs為羥基或氫；R6為羥基、p-D-葡萄吡喃糖氧基或氫；或可選擇地，C22和C23、C23和C24、C24和C25、C25和C27形成雙鍵；且在R3、Rt、Rs為羥基的情況下，C22、C23、C24的手性為S、S、R構(gòu)型；在R4、R5為羥基以及R3為氬的情況下，C23、C24的手性為S、S構(gòu)型；且當(dāng)R,為卩-D-葡萄吡喃糖基或卩-D-阿洛吡喃糖基，R5、&為氫，R3為羥基，且C24和C25形成雙鍵時，R4不為P-D-阿洛吡喃糖氧基。在本發(fā)明又一優(yōu)選的實施方案中，通式I的化合物為具有如下結(jié)構(gòu)式Ib的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>其中，R,為氫、(3-D-葡萄吡喃糖基、(3-D-阿洛吡喃糖基、卩-D-葡萄吡喃糖基(1—6)-卩-D-葡萄吡喃糖基或卩-D-木吡喃糖基(1—4)-[p-D-葡萄吡喃糖基(1—6)]-J3-D-葡萄吡喃糖基；R2為羥基、氫或卩-D-葡萄吡喃糖氧基；Rs為羥基或氫；R4為羥基、氫或P-D-葡萄吡喃糖氧基；Rs為羥基或氫；Re為羥基、(3-D-葡萄吡喃糖氧基或氫；R7為曱基或醛基；或可選擇地，C22和C23、C23和C24、C24和C25、C25和C27形成雙鍵；且在R3、R4、Rs為羥基的情況下，C22、C23、C24的手性為S、S、R構(gòu)型；且在R3為羥基，R4為P-D-葡萄吡喃糖氧基的情況下，C22和C23為S,S構(gòu)型；且當(dāng)R,為氫、卩-D-葡萄吡喃糖基(1—6)-卩-D-葡萄他喃糖基或J3-D_木吡喃糖基(1—4)-[卩-D-葡萄吡喃糖基(1—6)]-卩-D-葡萄吡喃糖基，112為氫，R3、R4、R5、Re為羥基時，R7不為甲基；當(dāng)R2、R6為羥基，R!、R3、R4、Rs為氫，且C23和C24形成雙4建時，117不為醛基。下述的表l中列出了本發(fā)明最優(yōu)選的具體化合物，即化合物A、B、C、D、F、G、H、I。表l化合物A、B、C、D、F、G、H、I結(jié)構(gòu)式<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>R(為(3-D-木吡喃糖基(1—4)-[p-D-葡萄吡喃糖基(1—6)]-p-D-葡萄吡喃糖基；R2為氫；!^為羥基;R4為P-D-葡萄吡喃糖氧基;Re為氛；R7為曱基;C24和C25形成雙4走；C22和C23為S,S構(gòu)型。R,為氫；R2為卩-D-葡萄吡喃糖氧基;R3為氫R4為氫Rs為氫R6為氫R為醛基；HOAO—G'cC23和C24，C25和C27之間形成雙鍵。_^_下面具體地描述本發(fā)明上述化合物的制備方法，由上述得到的苦瓜活性部位提取物KG8，經(jīng)過層析分離后，可以制得上述化合物A、B、C、D、F、G、H、I和化合物momordicosideM、momordicosideN,該方法包括將活性部位提取物KG8用100-200目硅膠進(jìn)行柱層析，依次用體積比為40:3:1、20:3:1、10:3:1和65:35:10的氯仿曱醇:水的下層液體洗脫，通過TLC板檢測，展開劑可用體積比為10:1、6:1、4:1的氯仿:甲醇的下層液體或者體積比為10:3:1、65:35:10的氯仿:曱醇:水的下層液體，5%石克酸-香蘭醛顯色，沖艮據(jù)TLC板顯示，將相似組分合并并濃縮，根據(jù)Rf值在0.60.2之間從大到小獲得l-9九個組分；將組分3進(jìn)行硅膠柱層析，用體積比為10:1的氯仿:曱醇洗脫，通過TLC板檢測，展開劑為體積比為8:1的氯仿:曱醇，5%硫酸-香蘭醛顯色，將根據(jù)TLC板顯示Rf值約等于0.4的斑點(diǎn)的洗脫液合并并濃縮，得化合物I;將組分4用MCI柱層析，體積比為50:5090:10曱醇:水洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，所得70:30曱醇:水洗脫液組分再進(jìn)行硅膠柱層析，用體積比為9:1氯仿:曱醇進(jìn)行洗脫，通過TLC板檢測，展開劑為體積比為5:1的氯仿:曱醇，5%硫酸-香蘭醛顯色，將根據(jù)TLC板顯示Rf值分別約等于0.3、0.4的斑點(diǎn)的洗脫液合并并濃縮，得化合物A以及化合物B;將組分5用MCI柱層析，體積比為30:70-80:20的曱醇:水洗脫劑梯度洗脫，所得60:40的曱醇:水洗脫液組分再進(jìn)行硅膠柱層析，體積比為20:3:1的氯仿:甲醇:水下層液體洗脫，通過TLC板檢測，展開劑為體積比為4:1的氯仿:曱醇，5%硫酸-香蘭醛顯色，將根據(jù)TLC板顯示Rf值分別約等于0.3的斑點(diǎn)的洗脫液合并并濃縮，得化合物momordicosideM;將組分6用MCI柱層析，體積比為30:7080:20的曱醇:水洗脫劑梯度洗脫，所得60:40的曱醇:水洗脫液組分再進(jìn)行RP-18柱層析，體積比為40:6060:40的甲醇:水梯度洗脫，通過TLC板檢測，展開劑為體積比為10:3:1的氯仿:曱醇:水下層液體，5%硫酸-香蘭醛顯色，將根據(jù)TLC板顯示Rf值約等于0.4的斑點(diǎn)的洗脫液合并并濃縮，得化合物momordicosideN;將組分7用MCI柱層析，體積比為30:7080:20的甲醇:水洗脫劑梯度洗脫，所得50:50的曱醇:水洗脫液組分再進(jìn)行RP-18柱層析，體積比為40:60~60:40的曱醇:水梯度洗脫，通過TLC板檢測，展開劑為體積比為8:3:1的氯仿:曱醇:水下層液體，5%硫酸-香蘭醛顯色，將根據(jù)TLC板顯示Rf值約等于0.4的斑點(diǎn)的洗脫液合并并濃縮，得化合物C;將組分8用MCI柱層析，體積比為30:7070:30的曱醇:水洗脫劑梯度洗脫，所得40:60的曱醇:水洗脫液組分再進(jìn)行RP-18柱層析，體積比為30:7060:40的甲醇:水梯度洗脫，通過TLC板;險測，展開劑為體積比為8:3:1的氯仿:曱醇:水下層液體，5%硫酸-香蘭醛顯色，將根據(jù)TLC板顯示Rf值約等于0.3的斑點(diǎn)的洗脫液合并并濃縮，得化合物H;將組分9用MCI柱層析，體積比為20:8060:40的甲醇:水洗脫劑梯度洗脫，所得40:60的曱醇:水洗脫液組分再進(jìn)行硅膠柱層析，體積比為10:3:1的氯仿:甲醇:水下層液體洗脫，通過TLC板檢測，展開劑為體積比65:45:1的氯仿:甲醇:水下層液體，5%硫酸-香蘭醛顯色，將根據(jù)TLC板顯示Rf值分別約等于0.3、0.4的斑點(diǎn)的洗脫液合并并濃縮，得化合物F以及化合物G;將化合物A在室溫0.5M鹽酸水溶液下水解7天，將所得反應(yīng)物進(jìn)行制備薄層層析，展開劑為氯仿:曱醇6:1，收集Rf值0.5-0.6部分并用氯仿:曱醇8:2洗脫、濃縮即為化合物D。III、藥物組合物本發(fā)明提供一種預(yù)防/治療糖尿病、肥胖和高血脂的藥物組合物，該組合物包含治療有效量的上述結(jié)構(gòu)式I所示的從苦瓜中分離得到的三碎皂苦化合物中的一種或多種。另外，該組合物可進(jìn)一步包含從苦瓜中提取的已知化合凈勿大豆月鹵苦I(soya-cerebrosideI)、苦瓜"畝脊(momor畫cerebroskie)、三碎3,7,25-三羥基葫蘆烷-5,23(￡)-二烯-19-醛、22(S)，23(i),24(i),25誦四輕基葫，烷-5曙烯、三碎急香momordicosideA、momordicosideB、momordicosideM或momordicosideN中的一種或多種。此夕卜，該組合物還可包含藥學(xué)上常規(guī)的輔料，例如藥學(xué)上常用的各種溶劑。所述的組合物可采用藥學(xué)上常規(guī)的制備方法制得。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明提供的上述預(yù)防/治療糖尿病、肥胖和高血脂的藥物組合物，所述的化合物來自苦瓜活性部位的提取物。在上述制備方法中，所述的苦瓜植物為葫,科(CwcwA/toce"e)苦瓜屬(MoworAc")植物，或者更具體的說為葫，科苦瓜屬植物苦瓜(MowoW/cactera油'a)。所述苦瓜活性部位提取物可包括三薛皂苷的天然產(chǎn)物，例如具有結(jié)構(gòu)式Ia、Ib的化合物、大豆腦苷I(soya-cerebrosideI)、苦瓜腦普(momor-cerebroside)、三薛3，7，25-三羥基葫，烷-5，23(￡)-二烯-19-醛、22(S),23(iO，24(iO,25-四羥基葫,烷-5-烯、三碎皂苷momordicosideA、momordicosideB、momordicosideM和momordicosideN中任意一個或多個化.合物的混合物，更具體的，是表1中描述的化合物中任意一個或多個化合物的混合物。具體實施例使用儀器樣品在曱醇溶液中的旋光度用Perkin-Elmer341旋光計測定。ESI-MS(電噴霧質(zhì)i普)用FinneganLCQ-DECA儀器測定。&和13CNMR核磁共振(在氖代吡啶中測量)由VarianINOVA500型和BrukerAM-400型核磁共振儀測定?；瘜W(xué)位移S(ppm)以TMS為內(nèi)標(biāo)，耦合常數(shù)(J)以Hz給出。薄層層析(TLC)硅膠板及柱層析用硅膠(200~300目)由青島海洋化工廠生產(chǎn)；薄層層析斑點(diǎn)用石克酸香蘭醛乙醇溶液噴霧顯色。在本文中，除非特別說明，涉及溶劑比例均為體積比。實施例1如圖l所示，取鮮苦瓜850kg，低溫冷凍干燥后稱重得85kg，粉碎，用體積比為卯％乙醇水溶液常溫下浸泡三次，每次3天，乙醇水溶液用量為生藥重的10倍。將三次所得乙醇溶液合并后減壓蒸餾，濃縮，獲得乙醇總提物。將乙醇總提物加水(50L)稀釋后與二氯曱烷(20L)液液分配，得二氯曱烷部位和水溶液。再將其水溶液與正丁醇(20L)進(jìn)行液液分配，得正丁醇部位800g。將800g正丁醇部位與500gAB-8型大孔樹脂(來自天津骨膠廠)拌樣，將拌有樣品的樹脂加入裝有3kgAB-8樹脂的層析柱上。分別用12L純水、30:70醇/純水(體積比)、95:5醇/純水(體積比)洗脫，分別得到部位KG6600g，KG760g，KG880g。實施例2圖2說明了采用層析分離化合物A-I。將上述實施例1得到的活性部位提取物KG880g用2kg100-200目硅膠進(jìn)行柱層析，依次用體積比為40:3:1、20:3:1、10:3:1和65:35:10的氯仿:曱醇:水的下層液體10L洗脫，每500ml濃集為一餾分，通過TLC板檢測，展開劑可用體積比為10:1、6:1、4:1的氯仿甲醇的下層液體或者體積比為10:3:1、65:35:10的氯仿:甲醇:水的下層液體，5%硫酸-香蘭醛顯色，根據(jù)TLC板顯示，將相似組分合并并濃縮，根據(jù)Rf值在0.60.2之間從大到小獲得l-9九個組分；將組分3進(jìn)行硅膠柱層析，用體積比為10:1的氯仿:曱醇1L洗脫，每20ml濃集為一餾分，通過TLC板檢測，展開劑為體積比為8:1的氯仿:曱醇，5%硫酸-香蘭醛顯色，將根據(jù)TLC板顯示Rf值約等于0.4的斑點(diǎn)的洗脫液合并并濃縮，得化合物I9mg;將組分4用MCI柱層析，體積比為50:5090:10甲醇:水洗脫劑各1L進(jìn)行梯度洗脫，所得70:30曱醇:水洗脫液組分再進(jìn)行硅膠柱層析，用體積比為9:1氯仿:曱醇進(jìn)行洗脫，每10ml濃集為一餾分，通過TLC板檢測，展開劑為體積比為5:1的氯仿:甲醇，5%硫酸-香蘭醛顯色，將根據(jù)TLC板顯示Rf值分別約等于0.3、0.4的斑點(diǎn)的洗脫液合并并濃縮，得化合物A180mg以及化合物B90mg;將組分5用MCI柱層析，體積比為30:7080:20的曱醇:水洗脫劑各1L梯度洗脫，所得60:40的曱醇:水洗脫液組分再進(jìn)行硅膠柱層析，體積比為20:3:1的氯仿:曱醇:水下層液體1.5L洗脫，每20ml濃集為一餾分，通過TLC板檢測，展開劑為體積比為4:1的氯仿甲醇，5%硫酸-香蘭醛顯色，將根據(jù)TLC板顯示Rf值分別約等于0.3的斑點(diǎn)的洗脫液合并并濃縮，得化合物momordicosideM230mg;將組分6用MCI柱層析，體積比為30:7080:20的曱醇:水洗脫劑各1L梯度洗脫，所得60:40的曱醇:水洗脫液組分再進(jìn)行RP-18柱層析，體積比為40:6060:40的曱醇:水各500ml梯度洗脫，通過TLC板檢測，展開劑為體積比為10:3:1的氯仿:甲醇:水下層液體，5%硫酸-香蘭醛顯色，將根據(jù)TLC板顯示Rf值約等于0.4的斑點(diǎn)的洗脫液合并并濃縮，得化合物momordicosideN21mg',將組分7用MCI柱層析，體積比為30:7080:20的曱醇:水洗脫劑各1L梯度洗脫，所得50:50的曱醇:水洗脫液組分再進(jìn)行RP-18柱層析，體積比為40:6060:40的曱醇:水各500ml梯度洗脫，每20m]濃集為一餾分，通過TLC板檢測，展開劑為體積比為8:3:1的氯仿:甲醇:水下層液體，5%硫酸-香蘭醛顯色，將根據(jù)TLC板顯示Rf值約等于0.4的斑點(diǎn)的洗脫液合并并濃縮，得化合物C25mg;將組分8用MCI柱層析，體積比為30:7070:30的甲醇:水洗脫劑各1L梯度洗脫，所得40:60的甲醇:水洗脫液組分再進(jìn)行RP-18柱層析，體積比為30:7060:40的甲醇:水各500ml梯度洗脫，每20ml濃集為一餾分，通過TLC板檢測，展開劑為體積比為8:3:1的氯仿:甲醇:水下層液體，5°/。硫酸-香蘭酪顯色，將根據(jù)TLC板顯示Rf值約等于0.3的斑點(diǎn)的洗脫液合并并濃縮，得化合物H30mg;將組分9用MCI柱層析，體積比為20:8060:40的曱醇:水洗脫劑各1L梯度洗脫，所得40:60的曱醇:水洗脫液組分再進(jìn)行硅膠柱層析，體積比為10:3:1的氯仿:曱醇:水下層液體500ml洗脫，每20ml濃集為一餾分，通過TLC板檢測，展開劑為體積比65:45:1的氯仿:甲醇:水下層液體，5%疏酸-香蘭醛顯色，將根據(jù)TLC板顯示Rf值分別約等于0.3、0.4的斑點(diǎn)的洗脫液合并并濃縮，得化合物F60mg以及化合物G110mg;將化合物A在室溫0.5M鹽酸水溶液下水解7天，將所得反應(yīng)物進(jìn)行制備薄層層析，展開劑為氯仿:曱醇6:1，收集Rf值0.5-0.6部分并用氯仿:甲醇8:2洗脫、濃縮即得化合物D10mg?；衔顰、B、C、D、F、G、H、I的特性如下化合物A無定形粉末；[a]2D3=-75(c0.094，MeOH);IRv讓(KBr)3421，2949，2873，1637，1470,1377，1153，1086,1032cm";^謹(jǐn)R和13C畫R數(shù)據(jù)見表2和表3;HRESIMSm/z675.4064(計算值C36H6。01()Na[M+Na]+,675.4084)?；衔顱無定形粉末；[a]L3=-76(c0.1600，MeOH);IRvmax(KBr)3396,3165,2935,2783,1612，1514，1454,1417，1277,1263，1223，1165,1122，1039,814，689cm";)HNMR和13CNMR數(shù)據(jù)見表2和表3;HRESIMSm々675.4113(計算值C36H6。01()Na[M+Na]+,675.4084)?；衔顲無定形粉末；M2D3=-64(c0.188,MeOH);IRvmax(KBr)3415，2928，2874，1643，1466,1377，1155,1082,1032cm";NMR和13CNMR數(shù)據(jù)見表2和表3;HRESIMSm/z6837.4632(計算值C42H7。015Na[M+Na]+,837.4612)?；衔顳無定形粉末；NMR和"CNMR數(shù)據(jù)見表2和表3;LRESIMS附/z513([M+Na]+)?；衔颋無定形粉末；["]2D3=-8(c0.2245，MeOH);IRv職(KBr)3406,2933,2873，1646,1551，1452,1383,1306，1076,1038,534cm";NMR和13CNMR數(shù)據(jù)見表2和表3;HRESIMS附々1001.5253(計算值C48H82O20Na[M+Na]+，1001.5297)?；衔颎無定形粉末；[a〗2D3=-l(c0.1385,MeOH);IRv歸(KBr)3408，2931,2857,1639,1468,1381,1308,1163,1076，1039cm";'HNMR和"CNMR數(shù)據(jù)見表2和表3;HRESIMSm/z1113.6025(計算值C54H94023Na[M+Na]+，1113.6048)?；衔颒無定形粉末；["]-;3=-5.0(c0.3425,MeOH);IRvmax(KBr)3415,2931，2874，1637,1551,1460，1381,1306,1163，1076,1040,534cm";!HNMR和13CNMR數(shù)據(jù)見表2和表3;HRESIMSm/z1099.5618(計算值C53H88022Na[M+Na]+，1099.5665)。化合物I無定形粉末；M2。3=+39.8(c0.3425,MeOH);IRvmax(KBr)3404，2928，2875,1709,1662,1454,1385,1306，1076，1041,966,534cm";}HNMR和13CNMR數(shù)據(jù)見表2和表3。HRESIMSw/z639.3816(計算值C36H5608Na[M+Na]+，639.3873)。表2本發(fā)明化合物的13CNMR譜(C5D5N,ppm)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>3"78.578.478.478.44"71.571.571.471.65"78.078.378.478.56"62.562.662.662.7l"'97.6105.1105.12'"'75.175.075.278.478.478.371.470.870.9v，78.767.167.26'〃62.61,〃'97.6106.22'〃'75.275.978.478.44'〃'71.471.6〃'78.778.86""62.662.8表3本發(fā)明化合物的&NMR譜(C5D5N，ppm)ABcDFGHI11.31,1.761.30，1.781.31,1.721.31,1.761.52,1.781.46,1.781.47,1.781.7221.74,2.331.76,2.361.74,2.321.94,2.031》0,2.501.20,2.381.62,2.321.94,2.0533.64brs3.70brs3.64brs3.80brs3.53brs3.66brs3.57brs3.80brs66.17d6.21d6.14dd6.17d5.37d5.42d5.48d6.17d(5.0)75.52dd5.54dd5.5dd5.52dd1.62,2.181.70,2.241.68,2.234.6brs82.262.252.262.261.58.661.622.55s102.262.252.242.262.162.222.232.65111.30,1.561.30,1.581.29,1.581.30,1.561.28,1.521.34,1.561.34,1.581.58,2.62121.50,1.541.52,1.561.44，1.541.50，1.541.46,1.541.52，1.601.42，1.541.56151.09,1.13U0,U51.09，1.141.09,1.131.04,1.141.12,1.221.06,1.181.54,1.62161.38,1.881.38,1.921.36，1.86.38，1.881.48,2.341.56,2.421.36，1.921.34，1.92171.471.481.441.471.952.001.921.53180.75s0.77s0.74s0.75s0.82s0.83s0.80s0.86s193.54d,3.73d3.57d,3.7d3.56d,3.74d3.54d,3.73d0.80s0.81s0.86s10.5s202.062.092.042.062.142.202.151.5421U0dU2d1.06dl.lOd1.38d1.37d1.20d0.93d(5.4)221.21,2.341.22,2.381.14,2.261.21,2.344.59d4,664.071.87,2.28234.554.594.484.554.184.244.735.75243.523.563.613.524.284.365.52brs6.31d261.62s1.65s1.72s1.62s1.81s1.82s1.88s4.98s，5.04s271.64s1.67s1.73s1.64s1.70s1.71s1.60s1.90s281.45s1.56s1.45s1.45s1.43s1.44s1.48sU4s290.87s0.87s0.86s0.87s1.00s1.03s1.02s1.44s300.83s0.93s0.83s0.83s0.78s0.78s0.77s0.76s1，5.40d4.955.34d4.75d4.71d4.72d5.00d(7.5)(8.1)(7.8)(7.8)(7.8)(7.8)(7.8)2,3.934.023.923.844.124.114,023,4.684.034.673.893.813.88楊4,4.194.254.144.054.284.304.265,4.464.0264.444.02楊4.004.286,4.39，4.524.45,4,584.32,4.504.24,4.764.62,4.844.63,4.804.42,4.641"5.21d5.12d5.29d5.34d(7.8)(7.4)(6.6)(7.8)2"3.963.984.003.793"4.223.903.963.944"4.164.184.144.185"3.934.184.184.206"4.32,4.524.30,4.474.34,4.544.30,4.46l"'5.09d5.30d5.37d(7.3)(7.2)(7.8)2'"楊3.944.38q〃.3.794.244.224'〃3.914.164.134.103.85,4.173.84,4.166"'4.20,4.401'〃'5.10d5.21d(7.8)(7.8)2""楊4.063.843.884.144.22v'4.164.226""4.28,4.464.32,4.46試驗實施例試驗實施例1測試KG8對3T3-Ll細(xì)胞葡萄糖攝取的影響(圖3)3T3-L1細(xì)胞完全分化為脂肪細(xì)胞后，換以含0.5。/。BSA的無血清DMEM培養(yǎng)16小時后，力口入KG8(終濃度20(ig/ml)處理4天，空白對照組加入等體積的DMSO，然后用37。C預(yù)溫的lxPBS清洗細(xì)胞兩遍，加入不含或含胰島素的0.5%BSA的Krebs緩沖液(NaCl140mM，KC15mM，MgS042.5mM,CaCl2lmM，HEPES20mM,pH7.4),37。C孵育40分鐘后，加入2-[1，2-3H(N)〗-脫氧-D-葡萄糖溶液(終濃度為0.5^iCi/ml),37。C作用5分鐘，用水浴的lxPBS洗3遍終止反應(yīng)，之后加入0.15ml0.1o/。Triton裂解細(xì)胞，液閃計數(shù)，用蛋白量校正CPM值后計算3T3-L1細(xì)胞的葡萄糖攝取量。結(jié)果顯示KG8對3T3-Ll細(xì)胞處理4天后(圖3)，可使細(xì)胞在基礎(chǔ)水33平和lnM及100nM胰島素刺激的葡萄糖攝取明顯增加。數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤(X士SE)(n-3)。與相應(yīng)條件下的空白對照組比較*P<0.05，**P<0.01;與各自基礎(chǔ)水平下的葡萄糖攝取比較卞P0.05,竹PO.Ol,忖卞PO.OOl。試驗實施例2KG8對四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠空腹血糖的影響(表4)將ICR雄性小鼠(30-35克)經(jīng)尾靜脈注射現(xiàn)配制的四氧嘧啶溶液60mg/kg，于7天后，禁食6小時，眼眥取血，分離血漿，采用葡萄糖氧化酶法測定其血糖。選耳又預(yù)測血糖值在11.1-30.0mmol/L的小鼠為實驗糖尿病小鼠。將選出的糖尿病小鼠禁食6小時后測空腹血糖，每組8只。給藥組小鼠口服給予25mg/kg的KG8,陽性對照組給予150mg/kg鹽酸二曱雙胍，空白對照組給予1%CMC。各組小鼠連續(xù)給藥21天，于給藥后第7天、14天和21天測定小鼠空腹血糖。結(jié)果顯示ICR小鼠在四氧嘧啶注射后，小鼠空腹血糖值顯著升高，說明造模成功。KG8組的空腹血糖值較模型對照組都明顯下降，說明KG8有降低四氧嘧啶小鼠模型血糖的作用。表4KG8對四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠空腹血糖的影響~~~"劑量給藥前血糖給藥后血糖(mmo1/1)zmg/kg(mmo1/1)第7天第14天第21天空白對照—4.61±1.63***4.72±0.30***4.83±0.19***4.72±0.16***才莫型3于照一28.20±1.7026.67±0.6830.84±1.6330.54±0.95二甲雙胍15027.90±1.8217.45±1.61**18.86±1.91***18.98±1.52**KG82527.90±0.3421.20±1.60**27.39±1.6621.74±1.37*注數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤(X士SE)表示(n=8)。與空白對照組比較*PO.05,**P<0.01,***P<0.001。試驗實施例3KG8對Ob/Ob小鼠的糖尿病治療作用(表5,圖4、5)。Ob/Ob小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)二周后，稱體重并測隨機(jī)血糖，禁食5小時后測空腹血糖。同時考慮隨機(jī)血糖的標(biāo)準(zhǔn)，將Ob/Ob小鼠分為3組，每組8只，雌雄各半，分別給予50mg/kgKG8、1%CMC和150mg/kg二曱雙胍。同時以同窩的C57小鼠作為正常對照。各組小鼠連續(xù)給藥21天，于給藥后第7、14和21天測定空腹血糖。于給藥后最后一天，取血測定血漿甘油三酯和肝臟甘油三酯含量。與Ob/Ob小鼠比較，*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001。結(jié)果顯示Ob/Ob小鼠在給予50mg/kgKG8后，血糖水平較給藥前明顯下降；給藥21天后，小鼠血漿(圖4)和肝臟(圖5)甘油三酯水平與對照組相比顯著下降。表5KG8對Ob/Ob小鼠的降血糖作用SS劑量給藥前血森給藥后血糖(mmo1/1)mg/kg~~(mmo1/1)第7天第14天第21天C57對照一4.87±0.16Ob/Ob對照一9.63±0.24Ob/Ob-二曱雙胍1509.63±0.29Ob/Ob-KG8509.69±0.284.96±0.305.70±0.455.40±0.219.06±1.639.80±0.888.14±1.386.38±0.48***6.40±0.31***6.34±0.36***8.13±0.87**7.03±0.34***6.93±0.50***注數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤(X±SE)(11=8)表示。與給藥前血糖水平比較，*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001。試驗實施例4KG8改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下的葡萄糖耐受性實驗(圖6)C57BL/6J雄性小鼠(8-10周齡)，高脂飼料喂養(yǎng)8周，使小鼠產(chǎn)生胰島素抵抗(表現(xiàn)出葡萄糖不耐受)。最后二周，將高脂飼料加入KG8(每日100mg/kg)或者降糖藥二甲雙胍(Met,每日200mg/kg)。通過測定禁食5-7小時后的葡萄糖耐量(腹腔注射2.0g/kg葡萄糖)來評價胰島素敏感性。正常對照組普通飼料喂食的葡萄糖耐量正常小鼠(對胰島素敏感)。高脂模型組:高脂飼料喂食(未加藥物)的葡萄糖耐量受損的對照小鼠。高脂二曱雙胍組加入二曱雙胍的高脂飲食小鼠。高脂KG8組加入KG8的高脂飲食小鼠。數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤(X士SE)表示(11=6-9只/組)，*P<0.05，**P<0.01。實驗結(jié)果顯示KG8能明顯改善葡萄糖不耐受，進(jìn)而可以治療糖尿病。試驗實施例5KG8對HF小鼠脂肪酸氧化代謝影響(圖7)。高脂飲食(HF)小鼠長期口服KG8后能通過減少呼吸交換率(RER)來影響小鼠脂肪酸氧化代謝。從上午IO點(diǎn)整開始，將小鼠放置在代謝籠中24小時。測定前的2個星期，將KG8(100mg/kg)加入食物中。食物本身作為溶劑對照(Veh)。數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤(X士SE)(n=5-6)表示。與KG8溶劑啦支對照*P<0.05,**P<0.01。實驗結(jié)果圖A表明KG8能顯著促進(jìn)小鼠脂肪酸氧化代謝；圖B表明KG8在白天(10點(diǎn)至18點(diǎn))能顯著促進(jìn)小鼠脂肪酸氧化代謝。實驗表明KG8可以治療肥胖疾病。試驗實施例6KG8對高脂飲食誘導(dǎo)肥胖(DIO)小鼠胰島素敏感性和脂代謝的影響。(圖8，9,10,li，12，13,14)C57BL/6J雄性小鼠(3-4周齡)，高脂飼料喂養(yǎng)12-16周后，形成飲食誘導(dǎo)肥胖(DIO)小鼠模型，該模型同時呈現(xiàn)明顯胰島素抵抗和脂代謝紊亂狀態(tài)。DI0小鼠根據(jù)體重和血糖分為4組，分別每日給予KG8(50、100mg/kg)、二曱雙胍(Met,250mg/kg)或模型對照(1%CMC)，連續(xù)給藥32天。給藥后第20天，進(jìn)行禁食過夜后小鼠口服脂耐量試驗(口服中長鏈脂肪酸10ml/kg);給藥后32天，測定小鼠禁食6小時后的血漿甘油三酯、游離脂肪酸水平，以此評價KG8對脂代謝的調(diào)節(jié)作用。給藥后第24天，進(jìn)行禁食6小時后小鼠胰島素耐量試驗(腹腔注射胰島素0.5U/kg);給藥后第28天，進(jìn)行禁食6小時后小鼠口服糖耐量試驗(口服2.5g/kg葡萄糖)，以此評價KG8對胰島素抵抗的改善作用。實驗結(jié)果顯示KG8能明顯改善DIO小鼠的脂耐量(圖8),降低血漿甘油三酯(圖9)、游離脂肪酸水平(圖10)。KG8能明顯改善DIO小鼠的口服糖耐量(圖ll,12)和胰島素耐量(圖13，14),提示其對DIO小鼠的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)有明顯的改善作用，進(jìn)而可以治療糖尿病。數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤(X士SE)表示(n=9)。與模型對照比較*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001。試驗實施例7化合物對葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子GLUT4轉(zhuǎn)位活性測試(圖15)化合物對GLUT4從細(xì)胞漿到細(xì)胞膜(PM)轉(zhuǎn)位的影響。圖15A表示對L6肌肉細(xì)胞的影響(n=3);圖15B表示對3T3-L脂肪細(xì)胞的影響(n=3)。胰島素組lOOnM的胰島素(陽性對照)。各化合物lO^iM處理細(xì)胞2小時。未標(biāo)示標(biāo)準(zhǔn)誤時，標(biāo)準(zhǔn)誤在柱狀圖內(nèi)。數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤(X士SE)表示(n=3)。與溶劑對照組比較:*P<0.05,**P<0.01。實驗表明化合物能夠促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，從而使葡萄糖被細(xì)胞攝取。試驗實施例8化合物A、F對一磷酸腺苦激活蛋白激酶(AMPK)活性測試(圖16)?；衔飳MPK通路的影響。3T3-L1脂肪細(xì)胞在10jiM化合物A、F，lmM5-氨基-4-咪唑曱酰胺核苷酸(AICAR，陽性對照)或DMSO溶劑對照(Veh)條件下孵浴60min,100nM胰島素處理2min或25min，然后通過相應(yīng)的抗體來測定細(xì)胞裂解液中的蛋白pAS160,pACC和pAMPK。用14-3-3總蛋白量作為上樣量質(zhì)控。結(jié)果顯示化合物A和F能明顯激活A(yù)MPK信號通路，進(jìn)一步對糖尿病和肥胖有治療作用。試驗實施例9化合物F對小鼠能量消耗和脂肪酸氧化代謝急性影響(圖17)?；衔颋對普通飲食老鼠急性作用后，可影響機(jī)體能量消耗(vo2)和脂肪氧化(可由減少呼吸交換率RER測定)。小鼠在上午九點(diǎn)整放置在代謝籠中，兩小時后，分別給小鼠皮下注射化合物F(100mg/kg)、5-氨基-4-咪唑曱酰胺核苦酸(AICAR)(250mg/kg，陽性對照藥)和生理鹽水溶劑對照組。凌t據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(X士SE)表示(n=6-8)。與溶劑對照組比較*P<0.05,**P<0.01;F與溶劑對照組比較:卞P0.05，卞卞PO.Ol。實驗表明化合物F通過促進(jìn)小鼠急性脂肪酸氧化代謝和機(jī)體能量消耗而具有治療肥胖的效果。試驗實施例10化合物F對小鼠葡萄糖利用(圖18)化合物F對正常飲食小鼠血糖的急性影響。小鼠腹腔注射化合物F或者生理鹽水(對照組)60分鐘后，再給小鼠注入葡萄糖，然后在給定時間測定血糖。數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤(X士SE)表示(n=6)。*P<0.05，**P<0.01。實驗表明化合物F能顯著促進(jìn)糖耐量小鼠的葡萄糖利用。權(quán)利要求1、一類葫蘆烷型三萜皂苷類化合物，其具有如下結(jié)構(gòu)式I所示的結(jié)構(gòu)其中，R1為氫、β-D-葡萄吡喃糖基、β-D-阿洛吡喃糖基、β-D-葡萄吡喃糖基(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖基或β-D-木吡喃糖基(1→4)-[β-D-葡萄吡喃糖基(1→6)]-β-D-葡萄吡喃糖基；R2為羥基、氫或β-D-葡萄吡喃糖氧基；R3為羥基或氫；R4為羥基、氫、β-D-葡萄吡喃糖氧基或β-D-阿洛吡喃糖氧基；R5為羥基或氫；R6為羥基、β-D-葡萄吡喃糖氧基或氫；R7為甲基或醛基；或可選擇地，C5和C6、C6和C7、C22和C23、C23和C24、C24和C25、C25和C27形成雙鍵；且在R3、R4、R5為羥基的情況下，C22、C23、C24的手性為S、S、R構(gòu)型；在R4、R5為羥基以及R3為氫的情況下，C23、C24的手性為S、S構(gòu)型；在R3為羥基，R4為β-D-葡萄吡喃糖氧基情況下，C22和C23為S、S構(gòu)型；在R7為甲基的情況下，C5和C19可以由氧橋相連；且當(dāng)R1為氫、β-D-葡萄吡喃糖基(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖基或β-D-木吡喃糖基(1→4)-[β-D-葡萄吡喃糖基(1→6)]-β-D-葡萄吡喃糖基，R2為氫，R3、R4、R5、R6為羥基，C5和C6形成雙鍵時，R7不為甲基；當(dāng)R2、R6為羥基，R1、R3、R4、R5為氫，且C5和C6、C23和C24形成雙鍵時，R7不為醛基；當(dāng)R1為β-D-葡萄吡喃糖基或β-D-阿洛吡喃糖基，R2、R5、R6為氫，R3為羥基，R7為甲基，且C6和C7、C24和C25形成雙鍵，C5和C19由氧橋相連時，R4不為β-D-阿洛吡喃糖氧基。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征是，所述的化合物具有如下結(jié)構(gòu)式Ia所示的結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中，R!為卩-D-葡萄吡喃糖基或卩-D-阿洛吡喃糖基或氫；R:5為羥基或氫；R4為羥基、氫、卩-D-葡萄吡喃糖氧基或卩-D-阿洛吡喃糖氧基；Rs為羥基或氫；R^為羥基、卩-D-葡萄吡喃糖氧基或氫；或可選沖奪地，C22和C23、C23和C24、C24和C25、C25和C27形成雙鍵；且在R3、R4、Rs為羥基的情況下，C22、C23、C24的手性為S、S、R構(gòu)型；在R4、Rs為羥基以及R3為氫的情況下，C23、C24的手性為S、S構(gòu)型。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其特征是，所述的化合物為具有如下取代基和構(gòu)型的化合物A:R,為(3-D-阿洛吡喃糖基；R3為氫；R4為羥基；Rs為羥基；R6為羥基；C23,C24的手性為S,S構(gòu)型；或所述的化合物為具有如下取代基和構(gòu)型的化合物B:R,為卩-D-葡萄吡喃糖基；R3為氬；R4為羥基；Rs為羥基；R6為羥基；C23,C24的手性為S,S構(gòu)型；或所述的化合物為具有如下取代基和構(gòu)型的化合物C:為卩-D-阿洛吡喃糖基；&為氫；R4為羥基；Rs為羥基；R6為卩-D-葡萄吡喃糖氧基；C23,C24的手性為S，S構(gòu)型；或所述的化合物為具有如下取代基和構(gòu)型的化合物D:Ri為氫；Rg為氫；R4為羥基；Rs為羥基；Re為羥基；C23,C24的手性為S，S構(gòu)型。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征是，所述的化合物具有如下結(jié)構(gòu)式Ib所示的結(jié)構(gòu)其中，Ri為氫、卩-D-葡萄吡喃糖基、卩-D-阿洛吡喃糖基、P-D-葡萄吡喃糖基(1—6)-p-D-葡萄吡喃糖基或(3-D-木吡喃糖基(1—4)-[卩-D-葡萄吡喃糖基(1—6)]-卩-D-葡萄吡喃糖基；R2為羥基、氫或P-D-葡萄吡喃糖氧基；Ro為羥基或氫；R4為羥基、氫或(3-D-葡萄吡喃糖氧基；R5為羥基或氫；Re為羥基、(3-D-葡萄吡喃糖氧基或氫；R7為曱基或醛基；或可選擇地，C22和C23、C23和C24、C24和C25、C25和C27形成雙鍵；且在R3、R4、Rs為羥基的情況下，C22、C23、C24的手性為S、S、R構(gòu)型；在R3為羥基，R4為卩-D-葡萄吡喃糖氧基情況下，C22和C23為S,SR3R5構(gòu)型。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的化合物，其特征是，所述的化合物為具有如下取代基和構(gòu)型的化合物F:Ri為P-D-葡萄吡喃糖基(1—6)-p-D-葡萄吡喃糖基；R2為氫；R3為羥基；R4為羥基；Rs為羥基；&為卩-D-葡萄吡喃糖氧基；R7為甲基；C22，C23，C24的手性為S,S,R構(gòu)型；或所述的化合物為具有如下取代基和構(gòu)型的化合物G:R為卩-D-木吡喃糖基(1—4)-[p-D-葡萄吡喃糖基(1—6)]-(3-D-葡萄吡喃糖基；R2為氫；R3為羥基；R4為羥基；Rs為羥基；Re為卩-D-葡萄吡喃糖氧基；R7為曱基；C22，C23，C24的手性為S，S，R構(gòu)型；或所述的化合物為具有如下取代基、雙鍵和構(gòu)型的化合物H:R！為卩-D-木吡喃糖基(1—4)-[(3-D-葡萄吡喃糖基(1—6)]-(3-D-葡萄吡喃糖基；R2為氫；R;為羥基；R4為卩-D-葡萄吡喃糖氧基；Rs為氫；Re為氫;R7為甲基；C24和C25形成雙4建；C22和C23為S，S構(gòu)型；或所述的化合物為具有如下取代基和雙鍵的化合物I:R,為氫;R2為卩-D-葡萄吡喃糖氧基；Rs為氫；R4為氫；Rs為氫；R6為氫；R7為醛基；C23和C24,C25和C27之間形成雙鍵。6、一種權(quán)利要求3或5所述化合物的制備方法，其特征是，該方法包括用醇、水或其混合物浸泡苦瓜樣品，過濾后得到提取液，其中所述的醇為甲醇或乙醇；將得到的提取液中的溶劑蒸發(fā)形成漿狀物；將水加入到該漿狀物中，得到總提取物的水混懸液；用氯仿、二氯甲烷或其混合物對上述混懸液進(jìn)行液液萃取，得到氯仿、二氯曱烷或其混合物的萃取物；然后，進(jìn)一步用正丁醇進(jìn)行萃取，得到正丁醇萃取物；將正丁醇萃取物濃縮后，進(jìn)行大孔樹脂層析，分別用純水、體積比為30:70醇/純水混合物、體積比為95:5醇/純水混合物進(jìn)行洗脫，其中所述的醇為曱醇或乙醇；將體積比為95:5醇/純水混合物洗脫得到的洗脫液蒸發(fā)至干，得活性部位提取物KG8;將活性部位提取物KG8用100-200目硅膠進(jìn)行柱層析，依次用體積比為40:3:1、20:3:1、10:3:1和65:35:10的氯仿曱醇:水的下層液體洗脫,通過TLC板檢測，展開劑可用體積比為10:1、6:1、4:1的氯仿:曱醇的下層液體或者體積比為10:3:1、65:35:10的氯仿:甲醇:水的下層液體，5%石危酸-香蘭醛顯色，根據(jù)TLC板顯示，將相似組分合并并濃縮，根據(jù)Rf值在0.60.2之間從大到小獲得1-9九個組分；將組分3進(jìn)行硅膠柱層析，用體積比為10:1的氯仿:曱醇洗脫，通過TLC板檢測，展開劑為體積比為8:1的氯仿:甲醇，5°/。硫酸-香蘭醛顯色，將根據(jù)TLC板顯示Rf值約等于0.4的斑點(diǎn)的洗脫液合并并濃縮，得化合物I;將組分4用MCI柱層析，體積比為50:50-90:10曱醇:水洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，所得70:30曱醇:水洗脫液組分再進(jìn)行硅膠柱層析，用體積比為9:1氯仿:甲醇進(jìn)行洗脫，通過TLC板檢測，展開劑為體積比為5:1的氯仿:曱醇，5%硫酸-香蘭醛顯色，將根據(jù)TLC板顯示Rf值分別約等于0.3、0.4的斑點(diǎn)的洗脫液合并并濃縮，得化合物A以及化合物B;將組分7用MCI柱層析，體積比為30:7080:20的甲醇:水洗脫劑梯度洗脫，所得50:50的曱醇:水洗脫液組分再進(jìn)行RP-18柱層析，體積比為40:6060:40的甲醇:水梯度洗脫，通過TLC板檢測，展開劑為體積比為8:3:1的氯仿:曱醇:水下層液體，5%硫酸-香蘭醛顯色，將根據(jù)TLC板顯示Rf值約等于0.4的斑點(diǎn)的洗脫液合并并濃縮，得化合物C;將組分8用MCI柱層析，體積比為30:7070:30的曱醇:水洗脫劑梯度洗脫，所得40:60的曱醇:水洗脫液組分再進(jìn)行RP-18柱層析，體積比為30:7060:40的曱醇:水梯度洗脫，通過TLC板檢測，展開劑為體積比為8:3:1的氯仿:甲醇:水下層液體，5%硫酸-香蘭醛顯色，將根據(jù)TLC板顯示Rf值約等于0.3的斑點(diǎn)的洗脫液合并并濃縮，得化合物H;將組分9用MCI柱層析，體積比為20:8060:40的曱醇:水洗脫劑梯度洗脫，所得40:60的甲醇:水洗脫液組分再進(jìn)行硅膠柱層析，體積比為10:3:1的氯仿曱醇:水下層液體洗脫，通過TLC板檢測，展開劑為體積比65:45:1的氯仿:曱醇:水下層液體，5%硫酸-香蘭醛顯色，將根據(jù)TLC板顯示Rf值分別約等于0.3、0.4的斑點(diǎn)的洗脫液合并并濃縮，得化合物F以及化合物G;將化合物A在室溫0.5M鹽酸水溶液下水解，將所得反應(yīng)物進(jìn)行制備薄層層析，展開劑為氯仿:曱醇6:1，收集Rf值0.5-0.6部分并用氯仿:甲醇8:2洗脫、濃縮即得化合物D。7、一種具有預(yù)防/治療糖尿病、肥胖和高血脂活性的藥物組合物，其特征是，所述的組合物包含治療有效量的權(quán)利要求1至5中任意一項所述的化合物中的一種或多種。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的具有預(yù)防/治療糖尿病、肥胖和高血脂活性的藥物組合物，其特征是，所述的化合物來自苦瓜活性部位提取物，該提取物通過如下步驟制得(a)用醇、水或其混合物浸泡苦瓜樣品，過濾后得到提取液；其中所述的醇為曱醇或乙醇；(b)將得到的提取液中的溶劑蒸發(fā)形成漿狀物；(c)將水加入到該漿狀物中，得到總提取物的水混懸液；(d)用氯仿、二氯曱烷或其混合物對上述混懸液進(jìn)行液液萃取，得到氯仿、二氯曱烷或其混合物的萃取物；然后，進(jìn)一步用正丁醇進(jìn)行萃取，得到正丁醇萃取物；(e)將正丁醇萃取物濃縮后，進(jìn)行大孔樹脂層析，分別用純水、體積比為30:70醇/純水混合物、體積比為95:5醇/純水混合物進(jìn)行洗脫；其中所述的醇為甲醇或乙醇；(f)將體積比為95:5醇/純水混合物洗脫得到的洗脫液蒸發(fā)至千，即得活性部位提取物KG8。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的具有預(yù)防/治療糖尿病、肥胖和高血脂活性的藥物組合物，其特征是，所述的苦瓜為葫，科苦瓜屬植物苦瓜(MowoWc<3)。10、權(quán)利要求1至5中任意一項所述的葫，烷型三辟皂苷類化合物在制備預(yù)防/治療糖尿病、肥胖和高血脂藥物中的應(yīng)用。11、根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征是，所述的葫蘆烷型三碎急苷類化合物在制備預(yù)防和治療糖尿病藥物的應(yīng)用中為肌肉和脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取促進(jìn)劑、胰島素增敏劑、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4上膜促進(jìn)劑、一磷酸腺苦激活蛋白激酶激活劑、脂肪酸氧化代謝促進(jìn)劑或胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下的葡萄糖耐受性改善劑。12、根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征是，所述的葫聲烷型三萜急苦類化合物在制備預(yù)防和治療肥胖藥物的應(yīng)用中為一磷酸腺苦激活蛋白激酶激活劑或脂肪酸氧化代謝il進(jìn)劑。13、根據(jù)權(quán)利要求IO所述的應(yīng)用，其特征是，所述的葫F烷型三萜急苷類化合物在制備預(yù)防和治療高血脂藥物的應(yīng)用中為血漿甘油三酯和游離脂肪酸水平降低劑或脂代謝紊亂狀態(tài)下的脂耐量改善劑。全文摘要本發(fā)明屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體公開了一類從苦瓜中提取的葫蘆烷型三萜皂苷化合物、其藥物組合物及其制備方法和在制備預(yù)防/治療糖尿病、肥胖和高血脂藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明公開的皂苷類化合物的結(jié)構(gòu)式如上式I所示。文檔編號C07J71/00GK101450963SQ20071017148公開日2009年6月10日申請日期2007年11月30日優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日發(fā)明者穎馮,穎冷,筱劉,陽葉,葉冀明,大衛(wèi)·E·詹姆斯,李希強(qiáng),柯昌強(qiáng),譚敏佳,彤陳申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所;澳大利亞伽爾文醫(yī)學(xué)研究所