專利名稱：羊毛脂烷型三萜化合物海蓮酸、其衍生物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體是一類從中國(guó)南海紅樹(shù)林植物海
蓮(5n/gw/erawxawgM/a)中分離得到的新的羊毛脂烷型三辟化合物海 蓮酸(sexangulic acid )、其書(shū)f生物及其制備方法和用途。該類化合物對(duì) 兩種腫瘤細(xì)胞抹A-549人肺腺癌細(xì)胞抹和HL-60人白血病細(xì)胞林具有 顯著的抑制作用，可作為一類研制新的抗腫瘤藥物的先導(dǎo)化合物，也 可作為治療各種臨床常見(jiàn)多發(fā)癌癥的藥物。
背景技術(shù)：
紅樹(shù)林是包括紅樹(shù)科及一 些其它不同科屬但專一生長(zhǎng)于熱帶和亞 熱帶海岸潮間帶的植物。由于生長(zhǎng)環(huán)境的特殊性，紅樹(shù)林植物中富含 結(jié)構(gòu)新穎、具有生物活性的化合物，有很高的藥用價(jià)值。紅樹(shù)林植物 中的單寧有收斂、止血等作用，可用作治療燒傷、腹瀉、外傷等；許 多紅樹(shù)林植物可用于消炎解毒，如正紅樹(shù)、老鼠勒可用于治療蛇傷； 此外， 一些紅樹(shù)林植物，如正紅樹(shù)、木欖等，也都發(fā)現(xiàn)含有抗癌作用 的活性成分。因此，開(kāi)發(fā)利用紅樹(shù)林植物的收斂止血藥物、消石利尿 藥物和抗肺瘤藥物前景較為樂(lè)觀。
海蓮5n/gw'era ^xa"gw/a是紅樹(shù)科木欖屬植物，中國(guó)特有種，僅 在海南有分布。我國(guó)民間用海蓮的樹(shù)葉水煮熬汁口服治療瘧疾。文獻(xiàn) 報(bào)道海蓮樹(shù)皮中的單寧類成分能有效地抑制兩種類型的腫瘤肉瘤180 (sarcoma 180)和劉易其斤月申癌(Lewis lung carcinaoma )。 4旦是，在i見(jiàn)有 文獻(xiàn)中，未見(jiàn)海蓮酸及其衍生物以及其活性方面的任何報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
在開(kāi)發(fā)利用我國(guó)的海洋生物資源，從中尋找具有生物活性及藥用 前景的海洋天然產(chǎn)物的過(guò)程中，本發(fā)明研究人員發(fā)現(xiàn)，紅樹(shù)林植物海
蓮的乙酸乙酯粗提物在體外抗腫瘤篩選實(shí)驗(yàn)中對(duì)A-549人肺腺癌細(xì)胞 抹及HL-60人白血病細(xì)胞抹均顯示良好的抑制活性。進(jìn)一步的生物活 性跟蹤研究，導(dǎo)致了羊毛脂烷型三碎化合物海蓮酸的發(fā)現(xiàn)。
海蓮酸是高度氧化、結(jié)構(gòu)新穎的羊毛脂烷型三碎化合物。體外抗 腫瘤生物活性篩選實(shí)驗(yàn)表明，海蓮酸及其衍生物對(duì)A-549人肺腺癌細(xì) 胞抹及HL-60人白血病細(xì)胞抹顯示明顯的細(xì)胞毒性。
本發(fā)明的 一個(gè)目的在于提供一 類從我國(guó)紅樹(shù)林植物海蓮中提取分 離得到的新的羊毛脂烷型三碎化合物海蓮酸及其衍生物。
本發(fā)明的另 一 目的是提供上述海蓮酸及其衍生物的制備方法。
本發(fā)明的還一 目的是提供上述羊毛脂烷型三碎化合物海蓮酸及其 衍生物在制備治療癌癥藥物中的應(yīng)用，尤其是在制備治療肺癌和/或白 血病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的羊毛脂烷型三萜化合物海蓮酸及其衍生物具有如下的化 學(xué)結(jié)構(gòu)式
<formula>formula see original document page 5</formula>
其中
R,為氫、C1 C6的烷基或C2 C6的烷?；?
R2為氫或C1 C6的烷基。
優(yōu)選的，R為氫、C1 C4的烷基或C2 C4的烷?；?
R2為氫或C1 C4的烷基。
更優(yōu)選的，
&為氫、曱基或乙?；?；
R2為氫或曱基。
具體的，可以為下述化合物
海蓮酸 、 海蓮酸甲酯^ 3-乙酰氧基海蓮酸
上述C1 C6的烷基是指含有1~6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烷基， 例如曱基、乙基、丙基、2-曱基丙基、2-乙基丙基、丁基、2-曱基丁 基、3-乙基丁基、戊基、4-甲基戊基或己基等；優(yōu)選含有l(wèi)-4個(gè)碳原子 的直鏈或支鏈的烷基，更優(yōu)選曱基。
上述烷?；侵负?~6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烷?；?乙酰基、丙酰基、2-曱基丙?；蚨□；?；優(yōu)選含有2 4個(gè)碳原子的 直鏈或支鏈的烷酰基；更優(yōu)選乙?；?。
本發(fā)明提供的海蓮酸及其衍生物的制備方法，包括如下步驟
海蓮用醇滲漉提取，減壓濃縮提取液得粗浸膏；將該粗浸膏溶于 NaCl溶液，混懸均勻后用乙酸乙酯萃取，濃縮乙酸乙酯萃取液得到乙 酸乙酯浸膏；
乙酸乙酯浸膏經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，后經(jīng)凝膠Sephadex LH-20純化 得到羊毛脂烷型三碎化合物海蓮酸。
具體為海蓮用醇滲漉提取，減壓濃縮提取液得粗浸膏。將該粗 浸膏溶于0.7 1.5NNaCl溶液，混懸均勻后用乙酸乙酯萃取，濃縮乙
6酸乙酯萃取液得到乙酸乙酯浸膏；乙酸乙酯浸膏經(jīng)200-300目硅膠柱層 析，分別以石油醚/乙酸乙酯體積比為100:0—90:10—80:20—50:50 —20:80—10:90—0:100梯度洗脫；將其中體積比石油醚/乙酸乙酯10:90 洗脫部分經(jīng)200-300目硅膠柱層析，分別以氯仿/曱醇體積比為 100:0—95:5—卯:10梯度洗脫；再將其中體積比氯仿/曱醇95:5洗脫部 分經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱層析，以體積比氯仿/曱醇1:1洗脫并純化， 得到海蓮酸。
進(jìn)一步的，海蓮酸通過(guò)酯化反應(yīng)、烷基化反應(yīng)或成醚反應(yīng)，得到 其相應(yīng)的書(shū)于生物。
其中，所述的醇為曱醇或乙醇。
本發(fā)明對(duì)羊毛脂烷型三萜化合物海蓮酸及其衍生物進(jìn)行了抗腫瘤 活性測(cè)試，表明上述化合物具有明顯的抗腫瘤作用?？捎糜谥苽渲委?癌癥和/或腫瘤的藥物。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明。
&、 "CNMR用Varianlnova400型核磁共振儀測(cè)定；MS ( ESIMS 及HRESIMS)用Q-TOF Micro LC-MS-MS型質(zhì)譜儀測(cè)定；所使用的 硅膠均為青島海洋化工廠生產(chǎn)；各種溶劑均由國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司 生產(chǎn)，均為分析純。
如無(wú)特殊說(shuō)明，以下實(shí)施例中涉及到的液/液之間比值均為體積百 分比。
實(shí)施例1:
羊毛脂烷型三薛化合物海蓮酸的制備
(1)提取中國(guó)紅樹(shù)林植物海蓮干重3.1 kg,用曱醇5 L滲漉提 取4次，提取液合并后減壓濃縮，所得流浸膏混懸于1000ml 1NNaCl溶液，以乙S臾乙酯1000ml反復(fù)萃取該混懸液3次，所得萃取液合并后 減壓濃縮得到乙酸乙酯浸膏41 g。
(2 )分離乙酸乙酯浸膏41 g經(jīng)200-300目硅月交柱層析，以石油 醚/乙酸乙酯100:0—90:10—80:20—50:50—20:80—10:90—0:100梯度 洗脫，每個(gè)梯度用量1000ml;其中石油醚/乙酸乙酯10:90洗脫部分421 mg,經(jīng)200-300目珪膠柱層析，以氯仿/曱醇100:0—95:5—90:10梯度 洗脫，每個(gè)梯度用量200 ml;其中氯仿/曱醇95:5洗脫部分107 mg， 經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱層析，以氯仿/曱醇1:1洗脫并純化，得到海 蓮酸20 mg。
海蓮酸的理化性狀如下白色固體，光學(xué)活性
022 + 38.7。(c, 0.60, CHC13) ;IRi普中顯示3423 (OH) ， 1724 (COOH) ， 1639 (共軛二烯)， 1375， 1076, 806cm"等吸收峰；正離子模式電噴霧質(zhì)語(yǔ)給出準(zhǔn)分子離 子峰w/z 495 [M+Na]+和967 [2M+Na]+，高分辨正離子模式電噴霧質(zhì)語(yǔ) 顯示其分子式為C30H48O4 {m/z 495.3445 [M+Na]+， △ = -0.5 mmu}。 與 。CNMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。同時(shí)，通過(guò)測(cè)定二維H-H相關(guān)譜(DQF-COSY)、 H-C相關(guān)i普(HMQC )、 H-C遠(yuǎn)程相關(guān)譜(HMBC )以及H-H核空間 偶極相關(guān)鐠(ROESY )，確定了所有碳原子和氫原子的信號(hào)歸屬及該化 合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
表1 海蓮酸的核磁共振波i普數(shù)據(jù)表No.5h, m， >/ in Hz5c, mcHMBC (H-C)COSYROESY
la2.14， m36.4, t3， 5， 9， 192a, 2b
lb1.73,m3,5,9,192a, 2b
2a1.66, m31.8，t4, 10la， lb, 3
2b1.37， m4, 10la, lb, 3
34.72， dd, 10.2， 6.075.5, d1,5， 28, 292a， 2b5
453.9,s
52.42, m46.4, d3， 7， 19， 28, 296a3,30
62.06， m28.4, t4,85,7
75.52， m120.6， d5,9, 146a， 6b
8143.2, s
89146.0, s
1037.4, s
115.49， min.i，d8， 10, 1312a， 12b
12a2.27, m38.1，t9, 14, 1811
12b2.14， m9, 14, 1811
1344.1，s
1450.7， s
15a1.97, m28.1,t17,3016
15b1.32， m17, 3016
161.32, m30.1， t13,2015a, 15b
171.62， m51.3,d18， 2116, 2030
180.69， s16.0， q12， 14, 1719,20
191.18, s23.5, q1,5,918, 29
201.48,m36.6, d13,2117,2118
210.99， d, 6.618.8， q17, 2220
22a1.51,m37.3, t2120, 23
22b1.16， m2120， 23
231.75， m21.6, t2522, 24
24a1,73,m45.3, t26, 2723
24b1.64, m26, 2723
2569.6, s
261.43， s30.4， q25,27
271.43， m29.9， q25,26
28181.3, s
291.77， s12.4, q3,4, 2819
300.91，s25.7， q8， 14, 155， 17
注aVarian Inova 400 MHz;溶劑C5D5N,化學(xué)位移單位ppm, ，H-NMR和 BC-NMR分別以溶劑中殘存的吡啶(5 7.20,7.57, 8.73 ppm)和氘代吡啶內(nèi)標(biāo)(5C 123.6， 135.5, 149.9 ) ; b核磁共振信號(hào)的歸屬是在HMQC、 HMBC等二維譜基礎(chǔ)上 完成的/由DEPT諳完成信號(hào)歸屬。 實(shí)施例2:
海蓮酸衍生物的制備
1、 海蓮酸甲酯(R,為氫、R2為甲基)的制備
稱取海蓮酸2.0 mg于25 mL圓底燒瓶中，加入溶有1 mg CH2N2 的乙醚溶液2mL，室溫反應(yīng)18h,減壓除去乙醚和CH2N2，得海蓮酸 曱酯(R! = H、 R2 = CH3)。
2、 3-乙酰氧基海蓮酸(Ri為Ac、 112為氫)的制備 稱取海蓮酸2.0 mg于25 mL圓底燒瓶中，加入無(wú)水吡咬和乙酸酑各1.5mL,室溫反應(yīng)18h,減壓除去吡咬和乙酸酐，得3-乙酰氧基海 蓮酸(Ri-Ac、 R2 = H)。 試驗(yàn)性實(shí)施例
羊毛脂烷型三碎化合物海蓮酸的抗腫瘤活性測(cè)試
測(cè)試原理MTT法活細(xì)胞的線粒體中存在與NADP相關(guān)的脫氫
酶，可將黃色的MTT ( 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl
tetrazolium bromide )還原為不溶性的藍(lán)紫色曱臢(Formazan)，死細(xì)胞
此酶消失，MTT不被還原。用三聯(lián)液溶解曱臢后可用酶標(biāo)儀在570nm
處檢測(cè)光密度值。光密度值與活細(xì)胞數(shù)成正比。
對(duì)照組OD值-治療組OD值
腫瘤抑制率=-^-X 100%
對(duì)照組OD值
實(shí)驗(yàn)方法MTT法按不同腫瘤生成速率，將一定數(shù)量處于對(duì)數(shù)生 長(zhǎng)期的A-549, HL-60腫瘤細(xì)胞90 nl/孔分別接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培 養(yǎng)24小時(shí)后加入藥液10 iil/孔(即海蓮酸溶解于培養(yǎng)基中)，對(duì)每個(gè)細(xì) 胞抹，每個(gè)濃度均為三個(gè)復(fù)孔。腫瘤細(xì)胞在37。C、 5。/。C02條件下培養(yǎng) 48小時(shí)后，加MTT (Sigma)液5 mg/ml用生理鹽水配制20 pl/孑L; 繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，加入三聯(lián)液(10。/。SDS-5。/。異丁醇-0.01 mol/LHCl) 50pl/孔，于C02培養(yǎng)箱中過(guò)夜。然后在570nm用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。
表2抗腫瘤活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)結(jié)果
對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率(％)
羊毛脂烷型三碎A-549 HL-60
10"4 10'5it)-6 10-7 10-8 10-4 10-5 l(T6 10-7
M MM M M M M M MM
海蓮酸95.9 95.995.7 90.0 84.3 72.8 44.2 65.2 46.627.0
10經(jīng)多次體外抗腫瘤活性實(shí)'驗(yàn)表明，海蓮酸具有顯著的抗肺瘤作用。 因此，可以用來(lái)治療癌癥，尤其是肺癌和白血病。
權(quán)利要求
1、結(jié)構(gòu)式如下的羊毛脂烷型三萜化合物海蓮酸或其衍生物其中，R1為氫、C1～C6的烷基或C2～C6的烷酰基；R2為氫或C1～C6的烷基。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的海蓮酸或其衍生物，其特征在于， 其中，Rq為氫、C1 C4的烷基或C2 C4的烷?；?R2為氫或C1 C4的烷基。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的海蓮酸或其衍生物，其特征在于， 其中，R為氫、曱基或乙?；?；R2為氫或曱基。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的海蓮酸或其衍生物，其特征在于，具體<formula>formula see original document page 2</formula>或<formula>formula see original document page 2</formula>海蓮酸 ' 海蓮酸甲酯 一^ 3-乙酰氧基海蓮酸
5、權(quán)利要求1所述的羊毛脂烷型三碎化合物海蓮酸或其衍生物的 制備方法，其特征在于，包括以下步驟海蓮用醇滲漉提取，減壓濃縮提取液得粗浸膏；將該粗浸膏溶于 NaCl溶液，混懸均勻后用乙酸乙酯萃取，濃縮乙酸乙酯萃取液得到乙 酸乙酯浸膏；乙酸乙酯浸膏經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，后經(jīng)凝膠Sephadex LH-20純化 得到羊毛脂烷型三碎化合物海蓮酸；進(jìn)一步，海蓮酸通過(guò)酯化反應(yīng)、烷基化反應(yīng)或成醚反應(yīng)，得到其 相應(yīng)的書(shū)f生物。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的海蓮酸或其衍生物的制備方法，其特征 在于，所述醇為曱醇或乙醇。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的海蓮酸或其衍生物的制備方法，其特征 在于，所述NaCl溶液的當(dāng)量為0.7~ 1.5N。
8、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的海蓮酸或其衍生物的制備方法，其特征 在于，其中的乙酸乙酯浸膏經(jīng)200-300目硅膠柱層析，分別以石油醚/ 乙酸乙酯體積比為100:0—90:10—80:20—50:50—20:80—10:90 —0:100 梯度洗脫；將其中體積比石油醚/乙酸乙酯IO:卯洗脫部分經(jīng)200-300 目硅膠柱層析，分別以氯仿/甲醇體積比為100:0—95:5—90:10梯度洗 脫；再將其中體積比氯仿/曱醇95:5洗脫部分經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱 層析，以體積比氯仿/甲醇1:1洗脫并純化，即得海蓮酸。
9、 權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)所述羊毛脂烷型三萜化合物海蓮酸或 其衍生物在制備治療腫瘤和/或癌癥藥物中的應(yīng)用。
10、 權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)所述的羊毛脂烷型三碎化合物海蓮 酸或其衍生物在制備治療肺癌和/或白血病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一類從中國(guó)紅樹(shù)林植物海蓮(Bruguiera sexangula)中提取、分離獲得的羊毛脂烷型三萜化合物海蓮酸(sexangulic acid)、其衍生物及其制備方法和用途。本發(fā)明的海蓮酸、其衍生物結(jié)構(gòu)式如下所示，當(dāng)R₁和R₂同時(shí)為氫時(shí)，即為海蓮酸。該化合物及其衍生物經(jīng)多次體外抗腫瘤活性測(cè)試具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞活性，可望在制備抗癌癥藥物中應(yīng)用。本發(fā)明可為研制新的治療各種常見(jiàn)多發(fā)癌癥藥物提供先導(dǎo)化合物，對(duì)開(kāi)發(fā)利用中國(guó)的海洋生物資源具有重要意義。
文檔編號(hào)C07J9/00GK101463058SQ200710172510
公開(kāi)日2009年6月24日 申請(qǐng)日期2007年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月18日
發(fā)明者波 馮, 亮 李, 王國(guó)飛, 郭躍偉, 黃才國(guó) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所