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      人巨細胞病毒重組蛋白質(zhì)及其制備方法

      文檔序號:3538465閱讀:442來源:國知局

      專利名稱::人巨細胞病毒重組蛋白質(zhì)及其制備方法
      技術領域
      :本發(fā)明涉及基因工程技術和診斷試劑、疫苗研制領域,特別是涉及一種人巨細胞病毒重組蛋白質(zhì)及其制備方法。
      背景技術
      :人巨細胞病毒(HumanCytomegalovirus,簡稱HCMV)屬皰疹病毒fi亞科,是一種DNA病毒,其感染在人群中廣泛存在,我國人群中巨細胞病毒感染相當嚴重。婦女在妊娠初期受CMV原發(fā)感染是引起胎兒宮內(nèi)感染和發(fā)育缺損的重要原因,在孕期原發(fā)性感染HCMV的胎兒和新生兒中,80%可導致智力低下、畸形和死亡[MiddeldorpJM.JongsmaJ,HaarAT,etal.DetectionofimmunoglobulinMandGantibodiesagainstcytomegalovirusearlyandlateantigendbyenzyme-linkedimmunosorben1:assay.JClin.Microbiol,1984;20(4):763-771.]。HCMV也是器官移植失敗和艾滋病病人并發(fā)感染死亡的主要原因之一。對非免疫缺陷者常導致長期隱性感染,甚至引起感染細胞的轉(zhuǎn)化、畸變或癌變等[HuangES.ThepathogenicityofHumanCytomegalovirus.Springer-Vellag.Berin,1993,1-45]。因此快速準確的診斷HCMV病毒感染具有十分重要的意義。目前巨細胞病毒感染診斷方法有脫落細胞及組織病理檢查、病毒分離、分子雜交試驗和血清學檢查,但由于前三種方法技術設備要求高,檢測周期長的局限性,無法廣泛使用,而血清學檢查具有簡便快速的特性使其在臨床上得到廣泛應用,目前大多檢測試劑采用盒用的HCMV蛋白質(zhì)抗原主要是來源于病毒培養(yǎng)物或是重組表達的單一蛋白片段,或者由于蛋白質(zhì)抗原純度低及特異性差,造成假陽性而降低檢測特異性;或者由于單一片段抗原蛋白所含抗原決定簇較少,所識別的抗體相應較少,易造成假陰性而降低檢測敏感性,雖然多種單一片段組合制備檢測試劑也可以避免上述問題,但必然要求多次進行提取純化過程,而且小分子蛋白質(zhì)或多肽的提純技術要求更高,工作效率太低。另外,在全球范圍內(nèi),目前缺乏有效治療病毒感染藥物的情況下,通過接種疫苗預防病毒感染成為一種重要的醫(yī)學干預手段,HCMV疫苗的研制也是進行HCMV研究的重要領域之一,而疫苗研究的一個重要前提是其所用蛋白質(zhì)抗原應具有高特異性、強免疫原性和盡量完整的抗原決定簇,因此開發(fā)一種多抗原決定簇串聯(lián)的重組蛋白質(zhì)技術是十分必要的。
      發(fā)明內(nèi)容鑒于以上問題,本發(fā)明的主要目的在于提供一種人巨細胞病毒重組蛋白質(zhì)及其制備方法,該發(fā)明利用重組聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction,簡稱PCR)技術構建出含有高度特異性和強免疫原性的多抗原決定簇串聯(lián)的人巨細胞病毒(H咖anCytomegalovirus,簡稱HC匿)重組蛋白質(zhì)。為達到以上目的,本發(fā)明提供的人巨細胞病毒重組蛋白質(zhì),其如氨基酸殘基序列SEQIDNo.1所示所述的重組蛋白質(zhì)從N-末端到C-末端依次含有HCMVgp52從N-末端第261位到第380位的120個氨基酸、ppl50從N-末端第587位到第640位的54個氨基酸、pp65從N-末端第361位到425位的65個氨基酸、gB從N-末端第200位到243位的44個氨基酸及pp28從N-末端第95位到128位的34個氨基酸。其中上述重組蛋白質(zhì)的DNA序列如SEQIDNo.2所示,所述的gp52目的肽段DNA序列是gp52第781位到第1140位核苷酸,ppl50目的肽段DNA序列是第1759位到第1920位核苷酸,pP65目的肽段DNA序列是第1081位到第1275位核苷酸,gB目的肽段DNA序列是第598位到第729位核苷酸,pp28目的肽段DNA序列是第283位到第384位核苷酸。本發(fā)明提供的人巨細胞病毒重組蛋白質(zhì)制備方法,其基因重組及純化過程包括以下步驟(1)設計用于擴增gp52目的DNA片段的PCR引物對(pl,p2)、用于擴增ppl50目的DNA片段的PCR引物對(p3,p4)、用于擴增pp65目的DNA片段的PCR引物對(p5,p6)、用于擴增gB目的DNA片段的PCR引物對(p7,p8)和用于擴增pp28目的DNA片段的PCR引物對(p9,pl0),引物pl和plO分別帶有Ndel和XhoI的酶切位點,引物p2和p3順序互補,并共同對應于gp52上述片段的3'末端和ppl50上述片段的5,末端序列,引物p4和p5順序互補,并共同對應于卯150上述片段的3,末端和pp65上述片段的5,末端序列,引物p6和p7順序互補,并共同對應于卯65上述片段的3,末端和gB上述片段的5'末端序列,引物p8和p9順序互補,并共同對應于gB上述片段的3,末端和pp28上述片段的5,末端序列;(2)以病毒培養(yǎng)物為模板,以引物Pl和P2擴增gp52片段,以引物P3和P4擴增ppl50片段,以引物P5和P6擴增pp65片段,以引物P7和P8擴增gB片段,以引物P9和P10擴增pp28片段;再以第一輪PCR擴增得到的gp52片段和ppl50片段為模板,加入引物Pl和P4,擴增gp52ppl50片段,以第一輪PCR擴增得到的pp65片段和gB片段為模板,加入引物P5和P8,擴增卯65gB片段;然后以第二輪PCR擴增得到的gp52卯150和pp65gB片段為模板,加入引物Pl和P8,擴增gp52ppl50pp65gB;最后以擴增得到的片段gp52ppl50pp65gB和pp28為模板,加入引物Pl和PIO,擴增gp52卯150卯65gBpp28,得到串聯(lián)的目的基因重組片段gp52ppl50pp65gB卯28;(3)將pET28a載體與PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)Ndel和Xhol雙酶切,產(chǎn)物純化后經(jīng)T4DNA連接酶連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài),涂布于含卡那霉素的LB平板上,37。C倒置培養(yǎng)過夜,次日挑選生長的菌落,進行PCR和DNA測序鑒定,得到正確的陽性轉(zhuǎn)化子;(4)提取陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒,用化學轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入BL21系列中的DE3感受態(tài)菌,在含卡那霉素的LB平板上370C倒置培養(yǎng)過夜,次日挑選平板上生長的菌落用含卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng),用IPTG誘導LB培養(yǎng)的表達菌株,誘導表達后收獲菌體,經(jīng)超聲破菌、組氨酸親和柱和離子交換柱層析得到純化的重組蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的人巨細胞病毒重組蛋白質(zhì)具有高特異性、強免疫原性蛋白質(zhì)序列,可提高檢測試劑的敏感性和特異性,避免采用單一片段抗原蛋白質(zhì)時造成的假陰性而降低檢測敏感性問題,且該重組蛋白質(zhì)采取了多抗原決定簇串聯(lián)的重組蛋白質(zhì)技術,可以簡化提純過程,提高工作效率。另外,本發(fā)明提供的該重組蛋白質(zhì)在人巨細胞病毒疫苗研制領域也具有很好的實用價值。本發(fā)明所述的人巨細胞病毒重組蛋白質(zhì)的氨基酸殘基序列(SEQIDNo.1):NH3-FAVENFLTEEPFQRGDPFDKNYVGNSGKSRGGGGGGGSLSSLANAGGLHDDGPGLDNDLMNEPMGLGGLGGGGGGGGKKHDRGGGGGSGTRKMSSGGGGGDHDHGLSSKEKYEQHKITSYAGAGAAITPTPVNPSTAPAPAPTPTFAGTQTPVNGNSPWAPTAPPGDMNPANPQYSEHPTFTSQYRIQGKLEYRHTWDRHDEGAAQGDDDVWTSGSDSDEELVTTERKTPRVTGGGAAYHRDSYENKTMOMPDDYSNTHSTRYVTVKDQWHSRGSTWLYRRSTFREDKAPKPSKQSKKKKKPSKHHHHQQSSIM—C00H本發(fā)明所述的人巨細胞病毒重組蛋白質(zhì)的DNA序列(SEQIDNo.2):TTCGCCGTGGAGAATTTTCTCACCGAGGAACCTTTCCAGCGTGGCGATCCCTTCGACAAAMTTACGTCGGGAACAGCGGCAAGTCGCGTGGCGGCGGCGGTGGTGGCGGCAGCCTCTCTTCGCTGGCCAATGCCGGCGGTCTGCATGACGACGGCCCGGGTCTGGATAACGATCTCATGAACGAGCCCATGGGTCTCGGCGGTCTGGGAGGAGGTGGCGGCGGTGGCGGCAAGAAGCACGACCGCGGTGGCGGCGGTGGTTCCGGTACGCGGAAMTGAGCAGCGGTGGCGGCGGCGGTGATCACGACCACGGTCTTTCCTCCAAGGMAAATACGAGCAGCACAAGATCACCAGCTACGCTGGCGCCGGCGCTGCCATCCTCACGCCGACGCCTGTCAATCCTTCCACGGCCCCCGCTCCGGCCCCGACACCTACCTTCGCGGGTACCCAAACCCCGGTCAACGGTAACTCGCCCTGGGCTCCGACGGCGCCGTTGCCCGGGGATATGAACCCCGCCAACCCTCAGTACAGCGAGCACCCCACCTTCACCAGCCAGTATCGCATCCAGGGCAAGCTTGAGTACCGACACACCTGGGACCGGCACGACGAGGGTGCCGCCCAGGGCGACGACGACGTCTGGACCAGCGGATCGGACTCCGACGAAGAACTCGTAACCACCGAGCGCAAGACGCCCCGCGTCACCGGCGGCGGCGCCGCTTATCATAGGGACAGCTATGAAAACMMCCATGCAATTAATGCCCGACGATTATTCCAACACCCACAGTACCCGTTACGTGACGGTCAAGGATCAATGGCACAGCCGCGGCAGCACCTGGCTCTATCGTCGCTCGACGTTTCGCGAGGACAAGGCTCCGAAACCGAGCAAGCAGTCAAAAAAGAAAAAGAAACCCTCAAAACATCACCACCATCAGCAAAGCTCCATTATG具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述,但不作為對本發(fā)明的限定。人巨細胞病毒重組蛋白質(zhì)及其制備l.重組前的準備根據(jù)目的片段的DNA序列,即HCMVgp52、ppl50、pp65、gB和pp28上目的肽段的cDNA序列和質(zhì)粒上的酶切位點,設計五對PCR引物(P1,P2)、(P3,P4)、(P5,P6)、(P7,P8)和(P9,PIO)。pl和p2用于擴增gp52第781位到第1140位核苷酸,p3和p4用于擴增ppl50第1759位到第1920核苷酸,p5和p6用于擴增pp65第1081位到第1275核苷酸,p7和p8用于擴增gB第598位到第729核苷酸,p9和p10用于擴增PP28第283位到第384核苷酸;引物pl和p10分別帶有Ndel和Xhol的酶切位點,引物p2和p3順序互補,并共同對應于gp52上述片段的3'末端和ppl50上述片段的5'末端序列,引物p4和p5順序互補,并共同對應于ppl50上述片段的3,末端和pp65上述片段的5,末端序列,引物p6和p7順序互補,并共同對應于pp65上述片段的3'末端和gB上述片段的5'末端序列,引物p8和p9順序互補,并共同對應于gB上述片段的3,末端和pp28上述片段的5'末端序列。2.目的DNA片段PCR重組第一輪PCR擴增以人巨細胞病毒培養(yǎng)物為模板,以引物P1和P2擴增gp52目的DNA片段,以引物P3和P4擴增ppl50目的DNA片段,以引物P5和P6擴增pp65目的DNA片段,以引物P7和P8擴增gB目的DNA片段,以引物P9和P10擴增pp28目的DNA片段。第二輪PCR擴增以第一輪PCR擴增得到的gp52目的DNA片段和ppl50目的DNA片段為模板,加入引物Pl和P4,擴增gp52ppl50目的DNA片段。以第一輪PCR擴增得到的卯65目的DNA片段和gB目的DNA片段為模板,加入引物P5和P8,擴增pp65gB目的DNA片段。第三輪PCR擴增以第二輪PCR擴增得到的gp52ppl50和卯65gB目的DNA片段為模板,加入引物P1和P8,擴增gp52ppl50pp65gB目的DNA片段。第四輪PCR擴增以第三輪擴增得到的gp52ppl50pp65gB目的DNA片段和第一輪擴增得到的pp28目的DNA片段為模板,加入引物Pl和PIO,擴增gp52ppl50pp65gBpp28目的DNA片段。得到完整的目的DNA重組片段gp52ppl50pp65gBpp28。3.重組DNA片段插入表達質(zhì)粒pET28a載體與PCR擴增產(chǎn)物gp52ppl50pp65gBpp28目的DNA片段經(jīng)Ndel和Xhol雙酶切,產(chǎn)物純化后經(jīng)T4DNA連接酶與載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入克隆菌株ToplO,涂布于含卡那霉素的LB平板上37°C倒置培養(yǎng)過夜,次日挑選平板上生長的菌落進行PCR及DNA測序鑒定重組子。4.在大腸桿菌中表達重組抗原蛋白正確的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)后提質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達BL21系列中的DE3菌株,涂布于含氨芐青霉素的LB平板上37°C倒置培養(yǎng)過夜,次日挑選平板上生長的菌落用含卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng),用IPTG誘導表達5小時,收集菌體經(jīng)超聲破菌、組氨酸親和柱和離子交換柱層析得到純化的重組蛋白。5.重組蛋白Western-blot驗證為驗證重組HCMV蛋白質(zhì)與抗HCMV抗血清反應性及重組目的基因獲得表達并具有抗原性,用Western-blot法進行了測試。陽性血清為10份用HCMV病毒培養(yǎng)物免疫兔子收獲的兔抗HCMV抗體陽性血清和30份人抗HCMV抗體陽性血清(經(jīng)ELISA法檢測證實)。陰性血清為10份對照正常兔血清和30份人抗HCMV抗體陰性血清(經(jīng)ELISA法檢測證實)。測試結(jié)果如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結(jié)果顯示,用HCMV病毒培養(yǎng)物免疫兔子所得的10份兔抗HCMV抗體陽性血清和30份人抗HCMV抗體陽性血清全部與表達抗原產(chǎn)生陽性反應,10份對照正常兔血清和30份人抗HCMV抗體陰性血清與表達抗原均產(chǎn)生陰性反應。結(jié)果提示重組目的基因獲得表達,重組HCMV蛋白質(zhì)與全病毒蛋白質(zhì)有明顯的交叉反應性,并具有很強的特異性,具有實際應用意義。權利要求1.一種人巨細胞病毒重組蛋白質(zhì),其特征在于,含有SEQIDNo.1所示的氨基酸殘基序列,所述的重組蛋白質(zhì)從N-末端到C-末端依次含有人巨細胞病毒gp52從N-末端第261位到第380位的120個氨基酸、pp150從N-末端第587位到第640位的54個氨基酸、pp65從N-末端第361位到425位的65個氨基酸、gB從N-末端第200位到243位的44個氨基酸及pp28從N-末端第95位到128位的34個氨基酸。2.根據(jù)權利要求1所述的人巨細胞病毒重組蛋白質(zhì),其特征在于,所述重組蛋白質(zhì)的DNA序列如SEQIDNo.2所示,其中,gp52目的肽段DNA序列是gp52第781位到第1140位核苷酸,ppl50目的肽段DNA序列是第1759位到第1920位核苷酸,pp65目的肽段DNA序列是第1081位到第1275位核苷酸,gB目的肽段DNA序列是第598位到第729位核苷酸,pp28目的肽段DNA序列是第283位到第384位核苷酸。3.—種如權利要求1所述的人巨細胞病毒重組蛋白質(zhì)的制備方法,其特征在于,包括以下步驟(1)分別將人巨細胞病毒中gp52、ppl50、pp65、gB和pp28中目的DNA片段擴增,重組,得到gp52ppl50pp65gBpp28重組片段;(2)將pET28a載體與PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)Ndel和Xhol雙酶切,連接后轉(zhuǎn)化,測序鑒定重組子;(3)轉(zhuǎn)入表達菌株進行誘導培養(yǎng),處理菌體收獲重組蛋白,經(jīng)純化后得到人巨細胞病毒重組蛋白。4.根據(jù)權利要求3所述的人巨細胞病毒重組蛋白質(zhì)的制備方法,其特征在于,其步驟(1)具體包括以下內(nèi)容(a)設計用于擴增gp52目的DNA片段的PCR引物對(pl,p2)、用于擴增ppl50目的DNA片段的PCR引物對(p3,p4)、用于擴增卯65目的DNA片段的PCR引物對(p5,p6)、用于擴增gB目的DNA片段的PCR引物對(p7,p8)和用于擴增pp28目的DNA片段的PCR引物對(p9,pl0),引物pl和plO分別帶有Ndel和XhoI的酶切位點,引物p2和p3順序互補,并共同對應于gp52上述片段的3'末端和卯150上述片段的5'末端序列,引物p4和p5順序互補,并共同對應于卯150上述片段的3'末端和pp65上述片段的5'末端序列,引物p6和p7順序互補,并共同對應于卯65上述片段的3,末端和gB上述片段的5'末端序列,引物p8和p9順序互補,并共同對應于gB上述片段的3,末端和pp28上述片段的5,末端序列;(b)以人巨細胞病毒培養(yǎng)物為模板,以引物Pl和P2擴增gp52片段,以引物P3和P4擴增ppl50片段,以引物P5和P6擴增pp65片段,以引物P7和P8擴增gB片段,以引物P9和P10擴增卯28片段;再以第一輪PCR擴增得到的gp52片段和ppl50片段為模板,加入引物Pl和P4,擴增gp52ppl50片段,以第一輪PCR擴增得到的卯65片段和gB片段為模板,加入引物P5和P8,擴增pp65gB片段;然后以第二輪PCR擴增得到的gp52ppl50和pp65gB片段為模板,加入引物Pl和P8,擴增gp52ppl50pp65gB;最后以擴增得到的片段gp52ppl50pp65gB和pp28為模板,加入引物Pl和PIO,擴增gp52ppl50pp65gBpp28片段,得到串聯(lián)的目的基因重組片段gp52ppl50pp65gBpp28。5.根據(jù)權利要求3所述的人巨細胞病毒重組蛋白質(zhì)的制備方法,其特征在于,其步驟(2)具體為將pET28a載體與PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)NdeI和XhoI雙酶切,產(chǎn)物純化后經(jīng)LDNA連接酶連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài),涂布于含卡那霉素的LB平板上,37。C倒置培養(yǎng)過夜,次日挑選平板上生長的菌落,進行PCR和DNA測序鑒定,得到正確的陽性轉(zhuǎn)化子。6.根據(jù)權利要求3所述的人巨細胞病毒重組蛋白質(zhì)的制備方法,其特征在于,其步驟(3)具體為提取陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒,用化學轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入BL21系列中的DE3感受態(tài)菌,在含卡那霉素的LB平板上37°C倒置培養(yǎng)過夜,次日挑選平板上生長的菌落用含卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng),用IPTG誘導LB培養(yǎng)的表達菌株,誘導表達后收獲菌體,經(jīng)超聲破菌、組氨酸親和柱和離子交換柱層析得到純化的重組蛋白質(zhì)。全文摘要本發(fā)明提供一種人巨細胞病毒重組蛋白質(zhì)及其制備方法,涉及基因工程技術和診斷試劑、疫苗研制領域。本發(fā)明提供的重組蛋白質(zhì)是從N-末端到C-末端依次含有HCMVgp52從N-末端第261位到第380位的120個氨基酸、pp150從N-末端第587位到第640位的54個氨基酸、pp65從N-末端第361位到425位的65個氨基酸、gB從N-末端第200位到243位的44個氨基酸及pp28從N-末端第95位到128位的34個氨基酸。該人巨細胞病毒重組蛋白質(zhì)具有高特異性、強免疫原性蛋白質(zhì)序列,可提高檢測試劑的敏感性和特異性,且該重組蛋白質(zhì)采取了多抗原決定簇串聯(lián)的重組蛋白質(zhì)技術,可以簡化提純過程,提高工作效率。文檔編號C07K14/045GK101220085SQ200710176610公開日2008年7月16日申請日期2007年10月31日優(yōu)先權日2007年10月31日發(fā)明者孔詳菊,張秀杰,健王,王志新,陳廷友申請人:北京英諾特生物技術有限公司
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