專利名稱：一種融合蛋白及其編碼基因和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種融合蛋白及其編碼基因和 用途，尤其涉及透明顫菌血紅蛋白基因和菠菜乙醇酸氧化酶基因融合的方法 及其融合蛋白的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
丙酮酸(Pyruvic acid)和乙醛酸(Glyoxyl ic acid)是兩種重要的有機(jī)中 間體，在日用化工、香料、醫(yī)藥、農(nóng)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。目前丙酮酸 和乙醛酸主要由L-乳酸和乙醇酸通過(guò)化學(xué)法或酶法催化來(lái)生產(chǎn)的。相比于 化學(xué)法，酶法生產(chǎn)丙酮酸和乙醛酸，具有工藝簡(jiǎn)單、高效、低能耗、無(wú)污染 及產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，在經(jīng)濟(jì)和保護(hù)環(huán)境上均有較大的竟?fàn)巸?yōu)勢(shì)，也符合 科學(xué)發(fā)展觀。
近年來(lái)國(guó)外對(duì)酶法生產(chǎn)丙酮酸和乙醛酸進(jìn)行全面和系統(tǒng)地研究，主要涉 及到乳酸氧化酶(Lactate oxidase, L0D)和乙醇酸氧化酶(Glycolate oxidase, G0)兩種酶。前者只能催化L-乳酸生成丙酮酸；后者底物選擇性 廣，不僅能夠氧化L-乳酸生成丙酮酸，而且也能催化乙醇酸生成乙醛酸。 目前，乙醇酸氧化酶酶法生產(chǎn)丙酮酸和乙醛酸的技術(shù)在國(guó)夕卜已經(jīng)工業(yè)化，而 國(guó)內(nèi)仍普遍采用化學(xué)法。因此加快酶法生產(chǎn)丙酮酸和乙醛酸自主技術(shù)的研究 開(kāi)發(fā)，滿足國(guó)內(nèi)需求和提升產(chǎn)品市場(chǎng)竟?fàn)幜σ哑仍诿冀蕖?br> 乙醇酸氧化酶是一種典型的黃素蛋白(輔酶為黃素單核苷酸，F(xiàn)MN),它 廣泛存在于植物和微生物中，如菠菜、煙葉和酵母等，其中以菠菜葉子中的 乙醇酸氧化酶活性最高。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程方法實(shí)現(xiàn)酶的 生產(chǎn)與改造已成為普遍選擇的策略。本發(fā)明的發(fā)明人提取菠菜葉子總RM, 經(jīng)RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄PCR)得到菠菜乙醇酸氧化酶的基因。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建基因
工程菌BL21(DE3)/pET-GO (其物理圖譜見(jiàn)圖1),并實(shí)現(xiàn)GO在大腸桿菌中表 達(dá)。
乙醇酸氧化酶是需氧酶，在催化過(guò)程中需要氧氣的參與而02的傳輸效率 往往是制約需氧酶催化效率的重要因素，特別是在高密度發(fā)酵(或高濃度產(chǎn) 物的酶催化)生產(chǎn)化工產(chǎn)品的過(guò)程中供氧矛盾尤為突出。因此從促進(jìn)重組菌 BL21(DE3)/pET-G0的生長(zhǎng)、提高GO催化效率的角度考慮，有必要引入一種 更有效的氧氣輸送機(jī)制。
透明顫菌(W是一種革蘭氏陰性專性好氧菌，它在^f敫氧條件 下能夠合成一種類似于血紅蛋白的胞內(nèi)可溶物質(zhì)——透明顫菌血紅蛋白 (P7","./h Hemoglobin, VHb) 。 VHb能夠從分子水平上提高VHb重組菌 對(duì)氧氣的利用率、促進(jìn)重組菌生長(zhǎng)、提高重組需氧酶催化效率，從而提高發(fā) 酵過(guò)程中的產(chǎn)物的產(chǎn)量和收率。到目前為止，VHb已經(jīng)在a-淀粉酶、青霉素 ?；负蚉HB等多種生化產(chǎn)品的發(fā)酵中成功應(yīng)用。透明顫菌血紅蛋白促進(jìn)重 組菌生長(zhǎng)及催化的積極作用為乙醇酸氧化酶催化過(guò)程中供氧的問(wèn)題提供一 條有效的解決途徑。
近年來(lái)結(jié)構(gòu)生物學(xué)與基因工程技術(shù)的快速發(fā)展使得改造酶分子得以有 效進(jìn)行，甚至能夠針對(duì)性地設(shè)計(jì)自然界不存在的新酶，改善其催化性能或賦 予其新的功能，其中融合基因即是的一個(gè)重要的研究方向。所謂融合基因， 即將兩個(gè)或多個(gè)基因的開(kāi)放閱讀框(Open reading frame, ORF)首尾相連，
置于同一套調(diào)控序列(包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合序列、終止子等) 控制之下構(gòu)成的嵌合基因。DN A重組技術(shù)的發(fā)展使得不同基因或基因片段的 融合可以方便地進(jìn)行，融合基因經(jīng)由適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)表達(dá)后，即可獲得由不 同功能蛋白拼合在一起的新型多功能蛋白，稱為融合蛋白(Fusion protein)。融合蛋白分子中各組成蛋白分子的編碼序列若能完整地保留且在 表達(dá)過(guò)程中正確折疊，則融合蛋白能保留各蛋白分子的活性，而且往往由于 "近鄰效應(yīng)"(proximity effect)的存在使得融合蛋白的酶活和穩(wěn)定性都得
到明顯提高。
因此，無(wú)論從基礎(chǔ)理論研究還是工業(yè)應(yīng)用來(lái)看，融合蛋白都具有重要的 研究?jī)r(jià)值，是生物技術(shù)領(lǐng)域大有發(fā)展前景的研究方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有透明顫菌血紅蛋白特性同時(shí)菠菜乙醇酸 氧化酶活性也得到提高的融合蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的融合蛋白，是具有序列表中SEQ ID No:6氨基酸殘基序 列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID No: 6的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基 酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID No: 6的氨基酸殘基序列相同活性的 由SEQ ID No:6衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID No:6是由525個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。
一種上述融合蛋白的編碼基因，是下列核苷酸序列之一
1 )序列表中SEQ ID No: 5的DNA序列；
2) 編碼序列表中SEQ ID No:6蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；
3) 與序列表中SEQ ID No: 5限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編 碼相同功能蛋白質(zhì)的DM序列。
序列表中序列5的DNA序列由1578個(gè)堿基組成，該基因的開(kāi)放閱讀框 為自5'端第1位到第1578位堿基。
含有該融合蛋白編碼基因的表達(dá)載體和細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍，利用現(xiàn)有分子生物學(xué)的方法可以得到不同的表達(dá)載體和工程菌，如重組 表達(dá)載體 pET-VHb-GO (其物理圖譜見(jiàn)圖2 )和工程菌 A co7/ BL21 (DE3)/pET-VHb-GO。
本發(fā)明的融合蛋白VHb-GO不但保留了透明顫菌血紅蛋白特性而且使得 菠菜乙醇酸氧化酶的活力得到明顯的提高，同時(shí)VHb基因的引入也明顯促進(jìn) 重組菌BL21(DE3)/pET-VHb-GO誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中菌體的生長(zhǎng)。本發(fā)明能夠從 分子水平上提高需氧酶的氧氣輸送和利用效率，進(jìn)而提高需氧酶活性同時(shí)也
能促進(jìn)重組菌生成，因此具有重要的理論和實(shí)際意義


圖1為含菠菜乙醇酸氧化酶編碼基因的重組質(zhì)粒pET-GO的構(gòu)建示意圖 圖2為含融合蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒pET-VHb-GO的構(gòu)建示意圖 圖3為BL21 (DE3) /pET-GO和pET-VHb-GO誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖 圖4為BL21 (DE3) /pET-GO和pET-VHb-GO菌體干重和比酶活的對(duì)比 圖5為重組蛋白GO和VHb-GO純化樣品的SDS-PAGE電泳圖
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)血紅蛋白和乙醇酸氧化酶融合蛋白VHb-GO的構(gòu)建及 其應(yīng)用的方法進(jìn)行詳細(xì)的闡述。 實(shí)施例1
帶GO基因的重組質(zhì)粒pET-GO的構(gòu)建過(guò)程如圖l所示，具體步驟如下 1 )菠菜總RNA的提取
取0. lg研磨過(guò)的菠菜葉子，加0. 5mL提取試劑(4°C),振蕩混勻；平放 離心管室溫;故置5分鐘；4。C 12000rpm離心1分鐘，將上清轉(zhuǎn)入新的無(wú)RNase 離心管；加入0. lmL 5M NaCl溫和混勻；接著加入0. 3mL氯仿上下顛倒混勻； 4°C 12000rpm離心10分鐘，取上層水相轉(zhuǎn)入新的無(wú)RNase離心管；加入與 所得液相等體積的異丙醇混勻室溫放置10分鐘；4°C 12000rpm離心10分 鐘棄掉上清，再加入lmL 75°/ 乙醇；4°C 5000rpm離心3分鐘倒出液體，室 溫晾千；加50laL無(wú)RNase水，充分溶解RNA，直4^用于反轉(zhuǎn)錄或-2(TC保存。
2) RT-PCR擴(kuò)增GO基因
用DEPC處理過(guò)的槍頭分別取lpL dNTPs, lpL MMLV, 4pL 5xMMLV的反 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液，lpL Olig(dT) 16和0. 4pL Rnas in到無(wú)菌離心管混勻以上 試劑；加入10|iL菠菜總RNA再用ddH20補(bǔ)足20jal;在PCR擴(kuò)增儀中3丌C恒 溫放置2h,最后再95。C熱變性5min,立即取出樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增乙醇 酸氧化酶基因。
以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA樣品為模板，以序列表中序列1和序列2為引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，序列表中序列1由25個(gè)核香酸殘基組成，序列2由23個(gè)核 苷酸殘基組成。在已滅菌的0. 2mL PCR薄壁管中，依次加入18. 5pLddH20、 2. 5pL擴(kuò)增緩沖液、0. 5jaL dNTPs(四種脫氧核苷酸，10mM,上海生工生物 工程技術(shù)服務(wù)有限公司)、0. 5 jaL引物1 (終濃度50pmo1) 、 0. 5 jli L引物2 (終 濃度50pmo1) 、 4 m L菠菜總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA樣品、0. 5 y L pfu DNA 聚合酶(5U/jaL，北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)，將離心管置于PCR擴(kuò)增儀 中。在PCR反應(yīng)中，PCR反應(yīng)溫度的變化過(guò)程為先升溫到94。C，保持5分 鐘，接著按以下溫度變化程序循環(huán)25次升溫至94°C,保持30秒，降溫 至52。C，保持30秒，升溫至72。C，保持2分鐘，最后于72。C保持10分鐘， 結(jié)束擴(kuò)增反應(yīng)。用0. 7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否擴(kuò)增出G0基因，若在相應(yīng) 位置有明顯條帶則進(jìn)行切膠純化，得到上游帶I酶切位點(diǎn)，下游帶 III酶切位點(diǎn)的G0基因
將純化得到的G0基因和表達(dá)質(zhì)粒pET-28a (+)分別用I和111 進(jìn)行酶切，用0. 7°/ 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并對(duì)相應(yīng)位置的條帶進(jìn)行切膠純化。
純化產(chǎn)物用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，連接樣品轉(zhuǎn)化Aco// TOP10(購(gòu) 自TIANGEN公司，相關(guān)性狀有F-mcrA △ (mrr-hsdRMS-mcrBC) cp80 lacZ AM15AlacX74 recAl deoR araD139A(ara-leu) 7697 galU galK rpsL(StrR) endAlnupG)感受.態(tài)細(xì)胞。在含有5(Vg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng) 15h后，采用菌落PCR篩選出帶GO基因的重組質(zhì)粒pET-GO,其物理圖譜見(jiàn) 圖1,它是雙鏈環(huán)狀DNA,長(zhǎng)度為6414bp，其相關(guān)性狀為Kanr, T7 promoter, lac operator, GO基因。
提取重組質(zhì)粒pET-G0并轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞A co// BL21 (DE3)(購(gòu)自P圍ega 公司，相關(guān)性狀有M15 Tnl0(ter0 HsdS gal(入clts857 indl Sam7 nin5 lacUV5-T7 Genel))，得到基因工程菌A co7/ BL21 (DE3)/PET-G0。
實(shí)施例2
帶VHb-GO融合基因的重組質(zhì)粒pET-VHb-GO的構(gòu)建過(guò)程如圖2所示，具 體步驟如下
1) 乙醇酸氧化酶基因的克隆
以帶有GO基因的重組質(zhì)粒pET-GO (其相關(guān)性狀為Kan、 T7 pr。mot。r, lac operator, GO基因；其物理圖譜見(jiàn)圖1)為模板，以序列表中序列l(wèi)和序歹'J 2 為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，序列表中序列1由25個(gè)核苷酸殘基組成，序列2由 23個(gè)核苷酸殘基組成。在已滅菌的0. 2mLPCR薄壁管中，依次加入19. 5juL ddH20、 2.5juL擴(kuò)增緩沖液、0. 5 m L dNTPs (四種脫氧核苦酸，lOmM,上海 生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)、0. 5pL引物1(終濃度50pmo1)、 0. 5 p L 引物2(終濃度50pmo1) 、 ljuL質(zhì)粒pET-GO溶液(濃度為50ng/ML)、 0. 5 y L pfu DNA聚合酶(5U/ ju L，北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)，將離心管置于PCR 擴(kuò)增儀中。在PCR反應(yīng)中，PCR反應(yīng)溫度的變化過(guò)程為先升溫到"。C，保 持5分鐘，接著按以下溫度變化程序循環(huán)25次升溫至94。C,保持30秒， 降溫至52°C，保持30秒，升溫至72。C,保持2分鐘，最后于72。C保持10 分鐘，結(jié)束擴(kuò)增反應(yīng)。用0. 7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否擴(kuò)增出GO基因，若 在相應(yīng)位置有明顯條帶則進(jìn)行切膠純化，得到上游帶vWel酶切位點(diǎn)，下游 帶"'/ cT III酶切位點(diǎn)的G0基因。
2) 帶有連接肽序列的透明顫菌血紅蛋白基因的克隆 以帶有透明顫菌血紅蛋白基因的重組質(zhì)粒pBR322_VH.b (其相關(guān)性狀為
Ampr， VHb基因；VHb基因序列在NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)的序列編號(hào)為M27061;其 物理圖譜見(jiàn)圖2)為模板，以序列表中序列3和序列4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 序列表中序列3由25個(gè)核苷酸殘基組成，序列4由59個(gè)核苷酸殘基組成。 在已滅菌的0. 2mLPCR薄壁管中，依次加入19. 5pL ddH20、 2. 5jxL擴(kuò)增緩沖 液、0. 5pLdNTPs(四種脫氧核苷酸，10mM，上海生工生物工程技術(shù)月l務(wù)有限 公司)、0. 5pL引物3(終濃度50pmo1)、 0. 5pL引物4 (終濃度50pmo1) 、 lpL 質(zhì)粒pBR322-VHb溶液(濃度為50ng/pL)、 0. 5pL pfu DNA聚合酶(5U/^L,北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)，將離心管置于PCR擴(kuò)增儀中。在PCR反應(yīng)中， PCR反應(yīng)溫度的變化過(guò)程為先升溫到94""C，保持5分鐘，接著按以下溫度 變化程序循環(huán)25次升溫至94。C,保持30秒，降溫至55。C,保持30秒， 升溫至72°C，保持1分鐘，最后于72。C保持10分鐘，結(jié)束擴(kuò)增反應(yīng)。用 0. 7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否擴(kuò)增出VHb基因，若在相應(yīng)位置有明顯條帶則 進(jìn)行切膠純化，得到上游帶I酶切位點(diǎn)，下游引入一段對(duì)應(yīng)(Gly-Ser)5 的連接肽編碼序列GGA TCT GGA TCT GGA TCT GGA TCT GGA TCT的VHb基 因。
引入(Gly-Ser)5連接肽是為了增加兩個(gè)蛋白分子間的距離，減小它們的 空間位阻，使融合蛋白最大限度地保持其原有生物學(xué)活性。而且擴(kuò)增得到的 VHb基因被去除了終止密碼子TAA，融合基因在翻譯到透明顫菌血紅蛋白C 端時(shí)不會(huì)終止，而會(huì)繼續(xù)翻譯連接肽和菠菜乙醇酸氧化酶基因，從而表達(dá)成 一個(gè)完整的融合蛋白。
3) VHb-GO融合基因的克隆
以純化得到的G0基因和VHb基因?yàn)槟０?，以序列表中序?和序列3 為引物進(jìn)行Overlap-PCR(重疊PCR)擴(kuò)增，序列表中序列2由23個(gè)核苷酸殘 基組成，序列3由25個(gè)核苷酸殘基組成。在已滅菌的0. 2mLPCR薄壁管中， 依次加入18. 5jiL ddH20、 2. 5|iL擴(kuò)增緩沖液、0. 5jiL dNTPs (四種脫氧核苷酸， 10mM，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)、0. 5pL引物3(終濃度50pmo1)、 0. 5pL引物2(終濃度50pmo1)、 lpL純化的GO基因溶液、lpL純化的VHb基 因溶液(濃度為50ng/pL)、 0.5^L pfu DNA聚合酶(5U/pL，北京賽百盛基因 技術(shù)有限公司)，將離心管置于PCR擴(kuò)增儀中。在PCR反應(yīng)中，反應(yīng)溫度的 變化過(guò)程為先升溫到94°C，保持5分鐘，接著按以下溫度變化程序循環(huán) 30次升溫至94。C,保持30秒，降溫至40。C，保持30秒，升溫至7^C, 保持3分鐘，最后于72。C保持IO分鐘，結(jié)束擴(kuò)增反應(yīng)。用0. 7%瓊脂糖凝膠 電泳檢測(cè)是否擴(kuò)增出VHb-GO融合基因，若在相應(yīng)位置有明顯條帶則進(jìn)行切
膠純化，得到上游帶酶切位點(diǎn)，下游帶的酶切位點(diǎn)的VHb-G0 融合基因。
將純化得到的VHb-G0融合基因和表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)分別用I和 #//7d III進(jìn)行酶切，用0. 7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并對(duì)相應(yīng)位置的條帶進(jìn)行 切膠純化。
純化產(chǎn)物用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，連接樣品轉(zhuǎn)化A cW/' T0P1G感受 態(tài)細(xì)胞。在含有50pg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)15h后，采用菌 落PCR篩選出帶VHb基因和GO基因的重組質(zhì)粒pET-VHb-GO，其物理圖譜見(jiàn) 圖2，它是雙鏈環(huán)狀DNA,長(zhǎng)度為6885bp,其相關(guān)性狀為Kan、 T7 promoter, lac operator, VHb-G0融合基因。經(jīng)此法構(gòu)建的融合蛋白基因序列和氨基 酸序列如序列表中序列5和序列6所示。
實(shí)施例3
將重組質(zhì)粒pET-VHb-G0轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞A co// BL21 (DE3)，得到基因工 程菌ABL21 (DE3) /pET-VHb-G0。
將重組菌BL21 (DE3) /pET-G0和BL21 (DE3) /pET-VHb-GO接種于LB液體 培養(yǎng)基中(LB培養(yǎng)基組成胰蛋白胨1%、酵母粉O. 5%、 NaCl l°/ ， pH7. 0), 37。C搖床培養(yǎng)過(guò)夜，再以1%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有15mL LB培養(yǎng)基的50mL錐 形瓶中，繼續(xù)37。C培養(yǎng)2. 5hr，加入終濃度0. ImM的IPTG或5mM的乳糖于 2(TC進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)18h后離心收集菌體，用去離子水洗一遍后用 0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7. O)重懸菌體后進(jìn)行超聲破碎，離心取上清用 于SDS-PAGE電泳，如圖3所示。圖中各泳道分別是，泳道l為IPTG誘導(dǎo)前 的重組菌BL21(DE3)/pET-G0樣品，泳道2為IPTG誘導(dǎo)后的重組菌 BL21(DE3)/pET-GO樣品，泳道3為標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品(其分子量從上到下分別 為94、67、43和31kD),泳道4為IPTG誘導(dǎo)后的重組菌BL21 (DE3)/pET-VHb-GO 樣品，泳道5為IPTG誘導(dǎo)前的重組菌BL21(DE3)/pET-VHb-G0樣品。從圖中 看出相比于未誘導(dǎo)的重組菌，泳道2和泳道3 (箭頭所指位置)都有明顯的特
異蛋白條帶，說(shuō)明重組菌BL21 (DE3)/pET-G0和BL21 (DE3)/pET-VHb-GO都表 達(dá)出各自的重組蛋白，分別是38kD的GO和54kD的融合蛋白VHb-GO。 實(shí)施例4
將重組菌BL21 (DE3) /pET-GO和BL21 (DE3) /pET-VHb-GO接種于LB液體 培養(yǎng)基中，37。C搖床培養(yǎng)過(guò)夜，再以1°/ 的接種量轉(zhuǎn)接到裝有15mL LB培養(yǎng) 基的50mL錐形瓶中，繼續(xù)37。C培養(yǎng)2， 5hr,加入終濃度0. lmM的IPTG于 2(TC進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，并對(duì)不同誘導(dǎo)時(shí)間的菌體干重和酶活進(jìn)行測(cè)定，如圖4 所示。從圖中看出誘導(dǎo)過(guò)程中重組菌BL21 (DE3)/pET-VHb-GO的菌體干重始 終比重組菌BL21 (DE3) /pET-GO大，兩者分別在誘導(dǎo)18h和21h干重達(dá)到最 大。_餘導(dǎo)18h兩者的菌體干重分別是0. 91mg/mL菌液和0. 67mg/mL菌液，重 組菌BL21(DE3)/pET-VHb-GO的菌體生長(zhǎng)量提高了 36%,而此時(shí)兩者的酶活 分別是1319u/g干菌和685u/g干菌，即酶活提高92.6%。由此看出，通過(guò) 融合VHb基因不但促進(jìn)重組菌BL21(DE3)/pET-VHb-GO的生長(zhǎng)而且需氧菠菜 乙醇酸氧化酶的酶活也得到顯著的提高。本發(fā)明中重組菌的酶活與此前國(guó)內(nèi) 文獻(xiàn)報(bào)道值相比有很大的提高，特別是重組菌 A co//' BL21 (DE3)/pET-VHb-G0的酶活。
實(shí)施例5
重組蛋白GO和VHb-GO的純化及用于乙醇酸和L-乳酸的催化 重組菌BL21 (DE3) /pET-G0和BL21 (DE3) /pET-VHb-GO接種于LB培養(yǎng)基 (50pg/mL卡那霉素)37。C培養(yǎng)12h,再以1%接種量轉(zhuǎn)接到裝有l(wèi)OOmL新鮮LB 培養(yǎng)基的300mL錐形瓶，37。C培養(yǎng)至OD600為1. 2時(shí)加入終濃度5mmol/L的 乳糖，分別在25。C和2(TC下誘導(dǎo)21h和18h后，收集菌體置于-20。C待用。 在構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-GO和pET-VHb-GO時(shí)，GO基因和VHb-GO融合 基因被插入在表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)的(His)6-Tag標(biāo)簽的下游。因此重組蛋 白GO和VHb-GO都帶有(His) 6標(biāo)簽，本研究采用德國(guó)QIAGEN公司的Ni-NTA Superflow Cartridge試劑盒純化GO和VHb-GO,具體實(shí)'瞼操作過(guò)程如下將收集并存放在-20。C保藏的菌體取出并在冰上解凍15min,再按每克濕菌 體2-5mL的比例加入Binding buffer重懸菌體；在冰水浴條件下石皮碎菌體， (破碎條件200W,破碎3s，間隙3s )直到菌體變清亮為止；8000r/min， 4。C離心20-30min,耳又出上清液用于SDS-PAGE ^r測(cè)或進(jìn)行下一步的蛋白質(zhì) 純化；準(zhǔn)備好蛋白純化柱(配上合適的流量調(diào)節(jié)器，合適流速lmL/min)取 lOmL的Binding buf f er上柱平衡蛋白純化柱；將菌體破碎離心收集的上清 液上柱，控制好流速；耳又10mL的Wash buffer上柱洗去雜蛋白和細(xì)胞碎片， 流速與上面一致；取5-10mL的Elution buffer上柱將目標(biāo)蛋白洗脫下來(lái)， 流速與上面一樣，即為純化的GO和VHb-GO蛋白樣品并用SDS-PAGE檢測(cè)，如 圖5所示。從圖中看出，重組菌BL21(DE3)/pET-GO和BL21(DE3)/pET-VHb-GO 表達(dá)出相應(yīng)的38kD和54KD的蛋白條帶，而且一步純化后GO和VHb-GO的蛋 白純度超過(guò)80%。同時(shí)利用Bradford比色法測(cè)定GO和VHb-GO的蛋白濃度 分別是1. 56mg/mL和1. 81mg/mL,可得到兩者的比酶活分別是2. 97U/mg和 4. 13U/mg，即VHb-GO的比酶活比GO的比酶活大39%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明 VHb基因和GO基因融合確實(shí)能夠大大提高GO的比酶活，這是非常有意義的 結(jié)果。
重組蛋白GO和VHb-GO可以用于乙醇酸或L-乳酸的催化，分別得到產(chǎn) 物乙醛酸或丙酮酸。重組純化蛋白GO和VHb-GO催化乙醇酸和L-乳酸時(shí)酶 活如下表l所示。 、
表1 GO和VHb-GO催化乙醇酸和L-乳酸
純化的重組蛋白酶活(IU/mg重組蛋白)
底物乙醇酸 底物L(fēng)-乳酸
GO2.97 3.47
VHb-GO4.13 5.29
從表中看出，對(duì)底物乙醇酸和L-乳酸，融合了透明顫菌血紅蛋白基因 的乙醇酸氧化酶VHb-GO的催化活性比GO都有了明顯提高。這個(gè)結(jié)果對(duì)采用 乙醇酸氧化酶重組菌催化生產(chǎn)乙醛酸或丙酮酸具有重要意義。
序列表
<110> 北京科技大學(xué)
<120> —種融合蛋白及其編碼基因和用途
<160> 6 <210〉 1 <211> 25 〈212> DNA <213〉人工序列 <220〉 〈223〉 〈400> 1
ggaataccat atggagatca caaat 25
<210> 2
〈211〉 23
<212>腿
<213>人工序列
<220>
<223〉
<400> 2
cacaagctta t.aatctggca aca 23
〈210〉 3
<211> 25
〈212〉 DNA
<213>人工序列
〈220〉
〈223〉
〈400> 3
ggaataccat atgttagacc agcaa 25
〈210〉 4
<211> 59
<212> DNA
〈213〉人工序列
〈220>
〈223>
<400〉 4
atttgtgatc tccatagatc cagatccaga tccagatcca gatccttcaa ccgcttgag 59
〈210> 5
<211> 1578
<212〉腿
〈213>人工序列
〈220〉
〈223〉
〈400〉 5
atgttagaccagcaaaccataaagccactgttcctgtattgaaggagcat1
ggcgttaccattaccacgactttttat￡L￡L￡L61
cctttgtttgatatgggtcgcceiagaatctttggagcagcctaaggctttggCg3tg3Cg121
gtsttggcggcagcgc犯aattgccagctattttgcctgcggtcaa肌aa181
attgcagtcaaacattgtcaagcaggcgtggcagcagcgcattatccgattgtcggtc犯241
g犯ttgttgggtgcgattaaagaagtattgggcgatgccgcaa<ccg￡Ltg￡LcEtttttggac301
gcgtggggcaaggcttatggcgtgattgcagatgtgtttattcaagtggetagcagatttg361
tacgctc犯gcggttgaaggatctggatctggatctggatctggatctatggagatcaca421
aatgtg肌cgagtatgaggcC2lttgC8Laagcag犯attgccaaagatggtgtatgactac481
tatgcatctggtgc卿,ccagtggactcttgctgagaacaga肌tgctttctccagg541
atcctgtttcgcccacgtatccttattgatgt肌ccaacatcgac3tgactacaacta/tc601
ttgggattcaagatctceiatgcctatcatgatagccccaaCtgCC3tgC8aaagatggca661
caccctgaaggggagtatgcgactgccagagcagcatcagcagctggaac721
ctgtcctcatgggctacatcaagtgtggaagaggttgcttc肌c3gga^cc781
tttttccagctctatgtatac犯ggacagg3atgt3gttgctcaacttgtg，卿gct841
gagagggctgggttcaaggctattgcccttactgttgacacaccccgatt901
g肌gctga^gtttgttttaccaccttttctaacattgaagaa_ctttg￡Lg961
ggtattgacctgggcaagatggacaaagcaaatgactctggcctttcctcatatgtcgct1021
ggtc卿ttgatcgatccctg柳tgg卿gatgttgcgtggcttcaigacaatcaccagc1081
ctccccatccttgtg肌gggtgtaattacagctgaggatgcaagactggccgttcaacat1141
ggggcagctggeiattattgtatccaaccatggagctcgcc肌Cttgatt6Ltgttcctgct1201
actataatggCtcttg38g￡Lggttgtca肌gcagcacaaggtcgcattcctgttttcttg1261
gatggtggtgttcgtcgtggaactgacgttttcaaagcattggcattgggtgcagctgga1321
gtatttattgg犯ggcccgtggtgttttccctggctgcag犯gg卿ggctggtgttaag1381
aaagtccttc,tgatgcgcg3tg3atttgagctgacaatggcattgagtggttgtcgt1441
tccctcaaagaaatctcgcgcagccacattgctgctgactg卿cggccctagttctcgt1501
gctgttgcca1578
〈210〉 6
<211〉 525
〈212〉 PRT
<213>人工序列
〈220>
<223>
<400> 6
MetLeuAspGinGinThrlieAsnlielieLysAlaThrValProValLeu LysGluHis
15101520
GlyValThrlieThrThrThrPheTyrLysAsnLeuPheAlaLysHisProGluValArg
25303540
ProLeuPheAspMetGlyArgGinGluSerLeuGluGinProLysAlaLeuAlaMetThr
45505560
ValLeuAlaAlaAlaGinAsnlieGluAsmLeuProAlalieLeuProAlaValLysLys
65707580
lieAlaValLysHisCysGinAlaGlyValAlaAlaAlaHisTyrProlieValGlyGin
859095100
GluLeuLeuGlyAlalieLysGluValLeuGly AspAiaAlaThrAspAsplieLeuAsp
105110115120
AlaTrpGlyLysAlaTyrGlyVallieAlaAspValPhelieGinValGluAlaAsp Leu
Tyr Ala Gin Ala Val Glu Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
Asn Val Asn Glu Tyr Glu Ala lie Ala Lys Gin Lys Uu
Tyr Ala Ser Gly Ala Glu Asp Gin Trp Thr Leu Ala Glu
lie Leu Phe Arg Pro Arg lie Leu lie Asp Val Thr Asn
Leu Gly Phe Lys lie Ser Met Pro lie Met lie Ala Pro
His Pro Glu Gly Glu Tyr Ala Thr Ala Arg Ala Ala Ser Ala Ala Gly Thr lie
Leu Ser Ser Trp Ala Thr Ser Ser Val Glu Glu Val Ala
125 Val 145 Ty 165 Ala 185 Pro 205 lie 225 Glu 245 Ala 265 Tyr 285 Phe 305 Lys 325 Gly 345 Arg 365 Val 385 lie 405 Leu 425 Arg 445
Phe Phe Gin Leu Tyr Val Tyr Lys Asp Arg Asn Val Val Ala Gin Uu Val Arg
Glu Arg Ala Gly Phe Lys Ala lie Ala Leu Thr Val Asp Thr Pro Arg Leu Gly
Glu Ala Asp lie Lys Asn Arg Phe Val Leu Pro Pro Phe
Gly lie Asp Leu Gly Lys Met Asp Lys Ala Asn Asp Ser
Gly Gin lie Asp Arg Ser Leu Ser Trp Lys Asp Val Ala Trp L卯Gin Thr lie
Leu Pro lie Leu Val Lys Gly Val lie Thr Ala Glu Asp
Gly Ala Ala Gly lie lie Val Ser Asn His Gly Ala Arg Gin Leu Asp Tyr Val
Thr lie Met Ala Leu Glu Glu Val Val Lys Ala Ala Gin
Asp Gly Gly Val Arg Arg Gly Thr Asp Val Phe Lys Ala LeuLeu Gly Ala
130 Ser 150 Lys 170 Thr 190 Asp 210 Met 230 Arg 250 Glu 270 Arg 290 Leu 310 Leu 330 Ala 350 Lys 370 Thr 390 His 410 Lys 430 Val 450
135 Ser Gly 155 Pro Lys 175 Asn Arg 195 lie Asp 215 Thr Ala 235 Ala Ala 255 Ser Thr 275 Ala Gin 295 Thr Pro 315 Leu Thr 335 Gly Leu 355 Trp L卯 375 Ala Arg 395 Gin Leu 415 Gly Arg 435 Leu AlA 455
Ser Met Glu
Met Val Tyr
Asn Ala Phe
Met Thr Thr
Met Gin Lys
Gly Pro Gly
Leu
Ser
Lys Asn Ser Tyr
Leu Ala Val
lie Pro Val
140 lie Thr
160 Asp Tyr
180 Ser Arg
200 Thr lie
220 Met Ala
240 Met Thr
260 lie Arg
280 Arg Ala
300 Arg Arg
320 Phe Glu
340 Val Ala
360 Thr Ser
380 Gin His
400 Pro Ala
420 Phe Leu
440 Ala Gly
460
Val Phe lie Gly Arg Pro Val Val Phe Ser Leu Ala Ala Glu Gly Glu Ala Gly Val Lys
465 470 475 480
Lys Val Leu Gin Met Met Arg Asp Glu Phe Glu Leu Thr Met Ala Leu Ser Gly Cys Arg
485 490 495 500
Ser Leu Lys Glu lie Ser Arg Ser His lie Ala Ala Asp Trp Asp Gly Pro Ser Ser Arg
505 510 515 520
Ala Val Ala Arg Leu***
52權(quán)利要求
1、一種融合蛋白，其特征是具有序列表中SEQ ID No6氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID No6的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID No6的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ IDNo6衍生的蛋白質(zhì)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白是序列 表中的SEQ ID No: 6。
3、 一種融合蛋白的編碼基因，其特征是下列核苷酸序列之一1) 序列表中SEQ ID No:5的DNA序列;2) 編碼序列表中SEQ ID No:6蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3) 與序列表中SEQ ID No: 5限定的DM序列具有90%以上同源性，且編 碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的融合蛋白的編碼基因，其特征在于所述融合 蛋白的編碼基因的DNA序列是序列表中的SEQ ID No: 5。，
5、 含有權(quán)利要求3所述的融合蛋白的編碼基因的表達(dá)載體。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體為 pET-VHb-GO。
7、 含有權(quán)利要求3所述的融合蛋白的編碼基因的細(xì)胞系。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)胞系，其特征在于所述細(xì)胞系為五.co7/ BL21 (DE3)/pET-VHb-G0。
9、 一種生產(chǎn)丙酮酸和乙醛酸的方法，其特征是由融合蛋白催化L-乳酸和 乙醇酸生產(chǎn)丙酮酸和乙醛酸。
10、 權(quán)利要求1所述融合蛋白在生產(chǎn)丙酮酸和乙醛酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了融合蛋白及其編碼基因和用途。本發(fā)明所提供的融合蛋白，是具有序列表中SEQ ID No6的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID No6的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID No6的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID No6衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了融合蛋白的編碼基因、含有所述編碼基因的細(xì)胞系、以及用于催化生產(chǎn)丙酮酸和乙醛酸的方法和用途。本發(fā)明的融合蛋白能提高需氧酶的氧氣輸送和利用效率，為解決氧氣制約需氧酶催化效率、提高需氧酶活性提供了一種具有理論和實(shí)際意義的方法。
文檔編號(hào)C07K14/415GK101186639SQ20071017739
公開(kāi)日2008年5月28日 申請(qǐng)日期2007年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月16日
發(fā)明者于慧敏, 常雁紅, 杜翠鳳, 沈忠耀, 紀(jì)欽洪, 暉 羅 申請(qǐng)人:北京科技大學(xué)