專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種與抗砷相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一種與抗砷相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：砷自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)就以其毒性而聞名。砷是環(huán)境常見(jiàn)污染物之一，砷可能通過(guò)抑制DNA修復(fù)并發(fā)突變(Lieta7.，1989)，并且可以誘導(dǎo)姊妹單體交換(JhaefW.，1992)、基因擴(kuò)增(RossmanandWolosin，1992)、非整倍性(Gurreta厶1993)和染色體畸變(Jha"W.，1992)。砷在水生生物中易富集，使得水產(chǎn)品中的砷含量往往比陸生動(dòng)植物高幾倍到幾十倍，人等動(dòng)物若攝入過(guò)多的砷則會(huì)引起癌變，因此，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注砷對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品的安全性問(wèn)題，水產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易往來(lái)中對(duì)砷的檢測(cè)要求也越來(lái)越高。砷中毒對(duì)動(dòng)物和人類(lèi)的毒性危害已受到廣泛關(guān)注，但其中作用機(jī)理仍不十分清楚，尤其對(duì)魚(yú)類(lèi)毒性機(jī)制更是處于非常薄弱的環(huán)節(jié)。隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，鼠和人體分離到一些抗砷基因片段，還很難進(jìn)行砷抗性綜合性分析，抗(耐)砷機(jī)制的研究逐步深化(RomachWa7，2000)。在生物進(jìn)化的過(guò)程中，許多生物產(chǎn)生了抗(耐)砷的生理機(jī)制。水環(huán)境中生活的魚(yú)類(lèi)體內(nèi)很容易富集砷，它們只有產(chǎn)生應(yīng)答砷毒的抗性機(jī)能，才能不被環(huán)境淘汰。而鲇魚(yú)生活在水體底部，各類(lèi)有害物質(zhì)的綜合富集量一般高于其它水生生物，具有掠食性特征的鲇魚(yú)應(yīng)該只有進(jìn)化出比其它魚(yú)類(lèi)抗(耐)砷毒能力更強(qiáng)的應(yīng)答機(jī)制才能夠很好的生存和繁衍，因此鲇魚(yú)可能具有比其他植食性和雜食性魚(yú)類(lèi)更強(qiáng)的抗(耐)砷能力。但是砷對(duì)鲇魚(yú)的毒作用機(jī)理與抗(耐)砷基因的研究未見(jiàn)報(bào)道，因此加強(qiáng)該方面的研究工作具有理論意義和實(shí)際意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種蛋白，該蛋白的表達(dá)能增加魚(yú)類(lèi)的抗砷能力。本發(fā)明所提供的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與抗重金屬相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種編碼上述蛋白的基因。本發(fā)明所提供的編碼上述蛋白的基因?yàn)槿缦耹)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種含有上述任一種基因的重組表達(dá)載體。所述重組表達(dá)載體具體為在表達(dá)載體pGEX-4T-1的Aco^/和5"W/位點(diǎn)間插入序列表中序列1所示的核苷酸序列得到的重組表達(dá)載體pGEX-^WA5;所述重組表達(dá)載體還可為在表達(dá)載體pCMVnramp的fcoy/和5"a7/酶切位點(diǎn)間插入序列表中序列1所示的核苷酸序列得到的重組表達(dá)載體pCMVnramp-5^7A5"。含有上述任一種基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育抗重金屬魚(yú)的方法。本發(fā)明所提供的培育抗重金屬魚(yú)的方法,是將上述任一種重組表達(dá)載體導(dǎo)入魚(yú)的受精卵細(xì)胞中，培養(yǎng)得到抗重金屬魚(yú)。其中，重金屬可為砷、鎘等。魚(yú)具體可為鲇魚(yú)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pCMVnra卿-57^I5"鲇魚(yú)與轉(zhuǎn)入空載體pCMVnra即鲇魚(yú)相比，其肌肉和肝臟代謝砷的能力顯著增強(qiáng)，腦和鰓代謝砷的能力增強(qiáng)更顯著。因此本發(fā)明的抗砷相關(guān)蛋白及其編碼基因，以及培育抗砷魚(yú)的方法將對(duì)改善水生生物抗砷等其它重金屬的表現(xiàn)特征方面具有重要意義，在魚(yú)的育種中有巨大的應(yīng)用前景。圖1為鲇魚(yú)^TA5"基因在大腸桿菌中的體外表達(dá)鑒定。圖2力57W5"基因在鲇魚(yú)基因組中的拷貝數(shù)分析。圖3為鲇魚(yú)5YW5"基因在砷脅迫條件下的表達(dá)特征。圖4轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pC匿nramp-57W5"鲇魚(yú)與轉(zhuǎn)入空載體pCMVnramp鲇魚(yú)各組織中砷含量測(cè)定結(jié)果。圖5為在砷脅迫下的轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pCMVnramp-A7AS"鲇魚(yú)和轉(zhuǎn)入空載體pCMVnramp鲇魚(yú)表型。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l、蘭州鲇(577wiAs7朋z力owe/2^;9)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建、SiRAS基因cDNA克隆及序列分析以0.lmg/LNaAs(U秀導(dǎo)蘭州鲇(577"/t/s7朋z力o"e/sA)幼苗15天，采用SuperscriptPlasmidSystemwithGatewayTechnologyforcDNASynthesisandCloning(Invitrogen)構(gòu)建魚(yú)占魚(yú)cDNA文庫(kù)，按照InvitrogenLifeTechnologiesInstructionManual操作。首先禾偶RNAgentsTotalRNAIsolationSystem(Promega)提取鲇魚(yú)幼苗總RNA，利用PolyATtractmRNAIsolationSystems(Promega)分離出mRNA，然后在含有/位點(diǎn)的Oligo(dT)錨定引物作為反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA第一鏈以及cDNA第二鏈，在cDNA第一鏈末端連接&7/接頭，然后定向插入載體中，插入DNA片段大于1Kb。鲇魚(yú)幼苗cDNA文庫(kù)的庫(kù)容為1X106個(gè)克隆，重組率達(dá)97%，構(gòu)建成鲇魚(yú)cDNA文庫(kù)。以鼠ars2cDNA(源于#^/jwascw7m,注冊(cè)號(hào)為BC066831)為探針篩選了2.5乂105未擴(kuò)增斑得到2個(gè)陽(yáng)性斑，其插入片段為2718bp，具有完整的閱讀框(其核苷酸序列如序列表中序列1所示)，編碼由906個(gè)氨基酸殘基組成的多肽(其氨基酸序列如序列表中序列2所示)。實(shí)施例2、SiRAS基因在大場(chǎng)桿菌中的體外表達(dá)鑒定(一)SiRAS基因的獲得提取實(shí)施例1中用0.lmg/LNaAs(U秀導(dǎo)蘭州鲇(67hrws〗朋z力owe7幻's)幼苗的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。設(shè)計(jì)擴(kuò)增SiRAS基因的引物，并使引物含有限制性?xún)?nèi)切酶^o;/和5^/的識(shí)別位點(diǎn)，設(shè)計(jì)的引物序列如下(5YjA5^F):5，—ACAAGAATTCGAGTTCCTICTGTCTCTG—3，，(57錯(cuò)一R)5，-AAC牟TCGA爭(zhēng)TCTCAGGCAIAGITGG-3，。以上述反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用上述設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果得到2700bp左右的DNA片段，回收純化PCR產(chǎn)物，對(duì)該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，得到的PCR產(chǎn)物具有序列表序列1的核苷酸序列。該核苷酸序列編碼序列表中序列2的SiRAS蛋白。(二)SiRAS基因在大腸桿菌中表達(dá)用限制性?xún)?nèi)切酶fc^/和5^7/雙酶切純化后的PCR產(chǎn)物，并將酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化；同樣，用限制性?xún)?nèi)切酶^^/和5^/酶切pGEX-4T-l質(zhì)粒(Promega)，獲得線(xiàn)狀載體片段；通過(guò)T4DNA連接酶將酶切后的PCR產(chǎn)物及線(xiàn)狀載體進(jìn)行連接，得到含有SiRAS基因的重組表達(dá)載體pGEX-57/AS";經(jīng)鑒定，pGEX-57tA在fco^/禾卩&7/位點(diǎn)插入了SiRAS基因(序列表序列l(wèi))。將重組表達(dá)載體pGEX-^724S"轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(￡sc/eWch'acoh')XL1-Blue菌株，篩選轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pGEX-^TA5"的陽(yáng)性重組體，在重組體中，目的SiRAS基因整合到GST末端，表達(dá)產(chǎn)物與GST形成融合蛋白。IPTG誘導(dǎo)蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明該基因能夠在大腸桿菌中進(jìn)行體外翻譯表達(dá)(圖1)。泳道1為Marker;泳道2為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，未轉(zhuǎn)入&7AS"基因的pGEX-4T-1質(zhì)粒中GST基因在大腸桿菌中表達(dá)；泳道3為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，重組表達(dá)載體pGEX-57W6"中融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)；泳道4為未誘導(dǎo)的pGEX-57yAS"在大腸桿菌中沒(méi)有蛋白條帶出現(xiàn)。實(shí)施例3、5YyAS"基因在鲇魚(yú)基因組中的拷貝數(shù)分析利用CTAB法提取鲇魚(yú)基因組DNA，通過(guò)0.8%瓊脂糖凝膠檢測(cè)提取的鲇魚(yú)基因組DNA，選擇完整、純的基因組DNA樣品。利用經(jīng)同位素ct-32p標(biāo)記的&7A5"cDNA編碼區(qū)為探針，與經(jīng)三種限制性?xún)?nèi)切酶(HindIII、Sall、Xhol)消化的20pg鲇魚(yú)基因組DNA，通過(guò)毛細(xì)管作用被原封不動(dòng)地轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Nylon+)上，進(jìn)行Southern雜交分析，并經(jīng)過(guò)高嚴(yán)謹(jǐn)度洗膜(高嚴(yán)謹(jǐn)度的條件是0.5XSSC，0.1XSDS，65°C)。結(jié)果如圖2所示通過(guò)HindIII、Sall、XhoI3種酶消化，產(chǎn)生了清晰的雜交帶。在5^7必cDNA中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)HindIII、SalI、XhoI酶切位點(diǎn)，說(shuō)明577A5"在鲇魚(yú)基因組DNA是以單拷貝數(shù)存在。實(shí)施例4、鲇魚(yú)SiRAS基因在砷脅迫條件下的表達(dá)特征提取經(jīng)O.lmg/LNaAs(U秀導(dǎo)的鲇魚(yú)幼苗不同組織中的總RNA，取相同質(zhì)量(20yg)的各樣品在變性1.2%瓊脂糖凝膠中分離，將RNA分別轉(zhuǎn)移至帶正電荷的尼龍膜上(Nylon+)，利用經(jīng)同位素a-32P標(biāo)記的5"j7AS"cDNA編碼區(qū)為探針(Takaralabelinganddetectionkit,TakaraBioTech(dalian)Co.Ltd)，提取的總RNA與ATPAScDNA探針進(jìn)行Northern雜交分析。結(jié)果如圖3所示，其中腦、心臟、腎、肝臟、鰓、骨骼肌肉都有表達(dá)，但在不同組織中5^7S^mRNA累積量不同。^TA5"基因在腎中轉(zhuǎn)錄水平高，腦、肝臟、鰓轉(zhuǎn)錄水平低于腎。^VA9基因在骨骼肌肉中只能檢測(cè)到痕量轉(zhuǎn)錄水平。實(shí)施例5、培育抗砷轉(zhuǎn)基因鲇魚(yú)的方法(一)重組表達(dá)載體的構(gòu)建將pCMVnra卿質(zhì)粒表達(dá)載體(Promega)用限制性?xún)?nèi)切酶&^/和5"a7/進(jìn)行酶切；以實(shí)施例2中構(gòu)建的重組表達(dá)載體pGEX-^'7AS為模板，以(TF):5'-ACCAGAATTCATGGGTGACAGTGATGATGA-3，(TR)5'-AACAJGTCGAC^TCCACATCATCAGGTGCGT-3、為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到57W堪因，并用Aco//和5"37/限制性?xún)?nèi)切酶酶切A7A5基因；將酶切后的577AS基因插入到表達(dá)載體pCMVnra即的^bo7/和5^/酶切位點(diǎn)，得到重組表達(dá)載體pCMVnramp-&7AS"。(二)培育轉(zhuǎn)基因魚(yú)苗采用顯微注射法進(jìn)行鲇魚(yú)轉(zhuǎn)化。蘭州鲇(677w27/s^3/7Wowe/7w\s0親魚(yú)來(lái)自寧夏水產(chǎn)研究所繁殖實(shí)驗(yàn)基地，肌肉注射激素，用LHRH-A人工催產(chǎn)。采集高質(zhì)量成熟卵子和精子，干法受精獲得大量鲇魚(yú)受精卵，加水激活后取上層優(yōu)質(zhì)浮卵于10-14'C條件下培養(yǎng)，取l-2細(xì)胞期的胚胎用于顯微注射。顯微注射DNA溶液的配置用限制性?xún)?nèi)切酶&7/將重組表達(dá)載體pCMVnramp-5YMS"線(xiàn)性化，并將其溶解于Tris-HC1(pH:7.6)溶液中，使其終濃度為100ng/叱，再將其用0.02Wn濾器過(guò)濾除菌，得到的溶液即為顯微注射DNA溶液。采用Nikon公司的拉針儀和磨針儀，制成針尖約為4-9Mm注射針，針尖要求尖銳，能夠刺穿受精卵膜，并用Nikon公司的顯微注射儀將轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體射入魚(yú)單細(xì)胞期受精卵動(dòng)物極細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。每卵注射50pL上述顯微注射DNA溶液(濃度為50ng/wL)。篩選出產(chǎn)生綠色熒光的轉(zhuǎn)基因胚胎，檢測(cè)&7A5基因在體內(nèi)的整合和表達(dá)，證實(shí)SiRAS基因能夠在蘭州鲇胚胎內(nèi)超表達(dá)。將顯微注射受精卵置于培養(yǎng)皿中，用Danieau，s液培養(yǎng)(1.74mol/LNaCl，21腦1/LKC1，12mmol/LMgS04，18,1/LCaCl2,150mmol/LHEPES，pH:7.6)，每5小時(shí)換培養(yǎng)液。孵化后轉(zhuǎn)入無(wú)菌的暴氣自來(lái)水中培養(yǎng)。得到轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pCMVnramp-^7^5的仔魚(yú)，仔魚(yú)孵化3天后開(kāi)始飼喂。按照上述方法，將空載體pCMVnra即用限制性?xún)?nèi)切酶5"W/線(xiàn)性化后，轉(zhuǎn)入魚(yú)中，培育得到轉(zhuǎn)入空載體pCMVnramp的仔魚(yú)，作為對(duì)照。(三)轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pCMVnramp-&72^鲇魚(yú)的砷代謝特征檢測(cè)取轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pCMVnramp-5"i/AS"的鲇魚(yú)苗和轉(zhuǎn)入空載體pCMVnramp的鲇魚(yú)苗，其體長(zhǎng)均5cm，體重均45g。餌料為水蚯蚓。飼養(yǎng)魚(yú)苗采用過(guò)濾自來(lái)水，水質(zhì)參數(shù)為pH:7.3±0.27，堿度186.65±22.4mg/L，Cr<13mg/L，K+、Na+〈24.3mg/L，Ca2+〈29.5mg/L，P〈0.01mg/L，H2S、Hg、As未檢出。水溫2226。C。實(shí)驗(yàn)用水族箱規(guī)格為200cmX100cmX75cm，整體并聯(lián)lkw羅磁鼓風(fēng)機(jī)增氧設(shè)備一套。每一水族箱配置日生外置式CY-165水質(zhì)過(guò)濾器一臺(tái)。實(shí)驗(yàn)前14d，將魚(yú)苗投放到水族箱以適應(yīng)環(huán)境。取4只水族箱，分別加入1200L水，再分別加入NaAs02至終濃度為1.288mg/L。向其中的2只水族箱分別放入50尾上述轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體口0^^虹31^-&7^5"的魚(yú)苗，另外2只水族箱分別放入50尾上述轉(zhuǎn)入空載體pCMVnramp的魚(yú)苗。每24h換一次含有1.288mg/LNaAs02的水。培養(yǎng)21天以后，撤離NaAs02，改用無(wú)NaAs02的無(wú)菌清水飼養(yǎng)。其中，在培養(yǎng)第4d、7d、14d、21d、28d、35d和42d分別各采集5尾轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pCMVnramp-5Y7AS和轉(zhuǎn)入空載體pCMVnramp的魚(yú)的腦、鰓、肝臟、肌肉，進(jìn)行砷含量測(cè)定。砷含量測(cè)定分別稱(chēng)取上述組織樣品0.5000g置于高壓消解罐中，加入7mL濃HN03和lmL濃HC104，在微波消解系統(tǒng)中消解。溫度下降后，樣品用滅菌去離子水轉(zhuǎn)移至100mL燒杯，置電熱板上，170。C趕酸至消解液剩約lmL，冷卻后，用5%鹽酸轉(zhuǎn)移至25mL比色管中，加入5%抗壞血酸和5%硫脲各5mL，用5%鹽酸定容至25mL，混勻，放置30min后上機(jī)測(cè)定。儀器測(cè)定條件還原試劑1%NaBH4溶液+0.3y。NaOH溶液；載流2%鹽酸；載氣Ar(99.99%)，流量0.4L/min;屏蔽氣Ar(99.99%)，流量0.8L/min;負(fù)高壓260V;燈電流50mA;原子化器高度12mm。輸入?yún)?shù)樣品質(zhì)量(g)、稀釋體積(mL)、位置號(hào)、樣品空白，并選擇mg/kg濃度單位，逐步將爐溫升至所需溫度，穩(wěn)定后測(cè)量，連續(xù)用標(biāo)準(zhǔn)空白進(jìn)樣，待讀數(shù)穩(wěn)定后，在轉(zhuǎn)入試樣測(cè)量之前，先進(jìn)行試劑空白消化液進(jìn)樣，空白測(cè)定，儀器自動(dòng)扣除空白值。測(cè)定樣品。樣品中砷含量按下式計(jì)算X=(d-C。)V/1000m(其中X—試樣中砷的含量(mg/kg)，d—試樣消化液測(cè)定濃度(ng/mL)，C。一試劑空白液測(cè)定濃度(ng/mL)，V—試樣消化液的總體積(mL)，m—試樣質(zhì)量(g)。)兩種魚(yú)中不同組織的含砷量結(jié)果見(jiàn)表1。表l相同濃度的各待測(cè)樣品在相同條件下測(cè)得的含砷量(mg/kg)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結(jié)果表明被NaAs02染毒的轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pCMVnramp-6"iWS的鲇魚(yú)和轉(zhuǎn)入空載體pCMVnramp的鲇魚(yú)的腦、鰓、肝臟、肌肉都表現(xiàn)為對(duì)砷有富集，分布規(guī)律是鰓>肌肉>腦>肝臟(圖4)。轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pCMVnramp-67yAS"鲇魚(yú)與轉(zhuǎn)入空載體pCMVnramp鲇魚(yú)相比，其肌肉和肝臟代謝砷的能力顯著增強(qiáng)，腦和鰓代謝砷的能力增強(qiáng)更顯著(圖4，其中a為轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pCMVnramp-^z7AS"魚(yú)的腦、鰓、肝臟、肌肉砷含量，b為轉(zhuǎn)入載體pCMVnramp魚(yú)的腦、鰓、肝臟、肌肉砷含量)。轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pC匿nramp-5YW6"鲇魚(yú)各組織的抗砷次序?yàn)楦闻K〉腦〉肌肉〉鰓。在砷脅迫下的轉(zhuǎn)基因鲇魚(yú)和未轉(zhuǎn)基因鲇魚(yú)見(jiàn)圖5。廳夕u衣<160〉2<210>1<211>2718<212>DNA<213〉鲇屬蘭州鲇(5^7wr〃s7朋z力o〃朋w-s)<400>18tgggtgElC3gtgatgstg3gtacgatcggCggCgC3gggataagttccggcggg卿gg60agtgactacgatcggtcacgagagcgagaagaccggcgcagagacgactggsgcgatcgg120cggccgtcggcacggg犯tggg織gcggg3ggg3g3ggCggagtcgtggagagtaccgt180gagtacg卿gaggacggagagagagattctC3CC3CCCCga_c3cga_ca_tgagcccacag240cagaaacgcatg鄉(xiāng)鄉(xiāng)g3ctgggatgatC3tggaggagacccgtatcatggaggttat300gatttgggtt3tggtgg3ggtggtggaggtggaggacccagttatgcaccccctcagccc360tggggtcaccctgatatccatctcatgcagccacaccatgctatccccatccaggccagg420ttgggg犯gatccatgacctgaatctgggtCCtCCCCC3Ccggtgatgaagacctttaaa■gagttcctgctgtctctggatgactccgtggatg卿ccga_a_tctgtcaa_acgctacaac540gagtataagattgacttcag3cggcagcagatgcaggactcgctccataaaggagaagag600tggttccgctctaaatatcaccctgatgagtcggggaaaccggaaggccgacgcccacgc660cgctctgcag33CCgCtg犯cgcgttccagtacttaatggagaacagctggttcgataac720atcaccatggacatcgaccgtgcaccacag8tCCtg3gg3tcctcgacgctgcggtaata780aagatgg鄉(xiāng)gaggggccgagtacgatctgcgcatcctcgagcagcccattg3ggatgag840gatg卿g觀agagaccgacgCCCgg3gg3ccgccgtctgacgtgacgag■acc卿ggsgCCg3g3tCgElgcgc犯3gtgtctgtca^geiaggatgtcaaggaggg卿g960actggagatgttggsgtaB61a_g3tgcaga_tgctgaagcaggaagtg肌3g3gaca^cct1020gataatgaagctccacctgaggagatatcgg3gccg犯geiagatgagtaagaag￡igga_ag1080agggiagcax:61gcggtgacagtgaggatgaggcgagcgcctcagagagcgagtcagactcc1140gactccgactcgaactctcactcctcagaga^accc3cgga_gagacagaggg鄉(xiāng)cggag1200ggag肌gg昭a(bǔ)tatggaggg卿aggggatggtggEt肌tga卿agg,卿gaaggag1260gatga卿ggaag叫g(shù)agggtga卿tgtg卿ggg卿aagga卿gaagc鄉(xiāng)gtgag1320鄧gg卿aagg肌ga^3gteieiaggatgatcagcctcctaaacctcggccg1380ctccacatgacgtgctccctgtttatgaggagcatcgctccgaccatctctaaagcagag1440atcgtggctctgtgtcgtcgttttcctggattcatgcgtgtatgtttgtctgaaccacaa1500ccggagcgcaggttcttcaggcgatgctgggtgacctttgaccgaggtgtcaacatcaaa1560gagatctgctggaacctacactgcgtgactgtgagttagctcccggagtg1620aatcgagatttagcgcggcgtgtgaga33cgtt33CggC3tcacgcagca1680ctt3gaascgacatcaaactgtccgctaaactcatacacgcgctggacgagagggagggg1740ctgtggggtc3CCg3g3CgCacacactgctgagcttccagctcagaaccccattctcaaa1800aacatcacagattacctcattgaggaagtaagtgctgagg3gg鄉(xiāng)8gCtactgggaaat丄加ugtgggcggggttgacttggagg3Cggg認(rèn)aaagaaggcaatccceictgagatcaccgtg1920gag卿geicgagaaacttgtc犯ggtgttggatcgtctgttgttctacctgcg犯ttgtt1980cattctattgattattataaceitgtgtgaatacacgagtgaggatgagatgcccaaccgc2040tgtgggatcatccatgtccgcggacccattccaccgaaccgcatcacacacagggaggta2100agtgactgggagaagacgttctcggccccttgttcagcgtgaaggaaacc2160ctgtctgaggaggaagccattaaaatgggtcggaaagatccggaacaggaagtgg卿ag2220tttgtgtctgcgei3C3cgc3ggagctcggga^ggsca^gtggctgtgtcctctcagtggg2280aagaagttcaagggtccggagtttgtg肌gaaacacatcctgaacaaacatggagataaa23403tcg鄧gaggtg￡iaga_aggaagtagagttcttcsacaacttcctgatggatgccaaaaga2400ccatctatccctgagataaagcccctccctcctccaggccccacccctggtgtgatgtct2460cctggtggtcctccattccaccctcagggtcctcaggtcttgctggg8tttgggcagccc2520agacctccagtg3tggg3t3tggaggtcctccatatcctcctaaccagtatggtggagga2580aa呵gggg3tttccgtggtcagggtggttatcctgcaaaacccagaaac2640aaccggatgatgcgcggtgatcctcgtaacatcatcgagtatcgtgacctggacgcacct2700gatgatgtggatttcttt2718<210〉2<211>906<212〉PRT〈213〉鲇屬蘭州鲇(&7wr〃s7a/2z力o〃e/2W's)〈400>2MetGlyAspSerAspAspGluTyrAspArgArgArgArgAspLysPhe151015ArgArgGluArgSerAspTyrAspArgSerArgGluArgGluAspArg202530ArgArgAspAspTrpSerAspArgArgProSerAlaArgGluTrpAsp354045ArgGlyArgGluArgArgSerArgGlyGluTyrArgGluTyrGluArg505560GlyArgArgGluArgPheSerProProArgHisAspMetSerProGin65707580GinLysArgMetArgArgAspTrpAspAspHisGlyGlyAspProTyr859095HisGlyGlyTyrAspLeuGlyTyrGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGly100105110ProSerTyrAlaProProGinProTrpGlyHisProAsplieHisLeu115120125MetGinProHisHisAlalieProlieGinAlaArgLeuGlyLyslie130135140HisAspLeuAsnLeuGlyProProProProValMetLysThrPheLys145150155160GluPheLeuLeuSerLeuAspAspSerValAspGluThrGluSerVal165170175LysArgTyrAsnGluTyrLyslieAspPheArgArgGinGinMetGin180185190AspSerLeuHisLysGlyGluGluTrpPheArgSerLysTyrHisPro195200205AspGluSerGlyLysProGluGlyArgArgProArgArgSerAlaGlu210215220ProLeuAsnAlaPheGinTyrLeuMetGluAsnSerTrpPheAspAsn225230235240lieThrMetAsplieAspArgAlaProGinlieLeuArglieLeuAsp245250255AlaAlaVallieLysMetGluGlyGlyAlaGluTyrAspLeuArglie260265270LeuGluGinProlieGluAspGluAspGluArgGluArgProThrPro275280285GlyGlyProProSerGluThrGinLysArgAspGluThrArgGlyAla290295300GlulieGluArgLysValSerValLysLysAspValLysGluGlyGlu305310315320ThrGlyAspValGlyValLysAspAlaAspAlaGluAlaGlySerGlu325330335ArgAspLysProAspAsnGluAlaProProGluGlulieSerGluPro340345350LysLysMetSerLysLysArgLysArgLysHisSerGlyAspSerGlu355360365AspGluAlaSerAlaSerGluSerGluSerAspSerAspSerAspSer370375380AsnSerHisSerSerGluLysProThrGluArgGinArgGluAlaGlu385390395400GlyGluGlyAspMetGluGlyGluGlyAspGlyGlyAsnGluGluGly405410415GluGluLysGluAspGluGluGluGluGluGlyGluAspValLysGly420425430ArgLysGluGluLysGinSerGluArgGluLysGluLysGluGluLys435440445LysValLysAspAspGinProProLysProArgProLeuHisMetThr450455460CysSerLeuPheMetArgSerlieAlaProThrlieSerLysAlaGlu465470475480lieValAlaLeuCysArgArgPheProGlyPheMetArgValCysLeu485490495SerGluProGinProGluArgArgPhePheArgArgCysTrpValThr500505510PheAspArgGlyValAsnlieLysGlulieCysTrpAsnLeuGinAsn515520525lieArgLeuArgAspCysGluLeuAlaProGlyValAsnArgAspLeu530535540AlaArgArgValArgAsnValAsnGlylieThrGinHisLysGinVal545550555560LeuArgAsnAsplieLysLeuSerAlaLysLeulieHisAlaLeuAsp565570575GluArgGluGlyLeuTrpGlyHisArgAspAlaHisThrAlaGluLeu580585590ProAlaGinAsnProlieLeuLysAsnlieThrAspTyrLeulieGlu595600605GluValSerAlaGluGluGluGluLeuLeuGlyAsnValGlyGlyVal610615620AspLeuGluAspGlyAsnLysGluGlyAsnProThrGlulieThrVal625630635640GluArgAspGluLysLeuValLysValLeuAspArgLeuLeuPheTyr645650655LeuArglieValHisSerlieAspTyrTyrAsnMetCysGluTyrThr660665670SerGluAspGluMetProAsnArgCysGlylielieHisValArgGly675680685ProlieProProAsnArglieThrHisArgGluValSerAspTrpGlu690695700LysThrPheGluGluLysLeuGlyProLeuPheSerValLysGluThr705710715720LeuSerGluGluGluAlalieLysMetGlyArgLysAspProGluGin725730735GluValGluLysPheValSerAlaAsnThrGinGluLeuGlyLysAsp740745750LysTrpLeuCysProLeuSerGlyLysLysPheLysGlyProGluPhe755760765ValLysLysHislieLeuAsnLysHisGlyAspLyslieGluGluVal770775780LysLysGluValGluPhePheAsnAsnPheLeuMetAspAlaLysArg785，m■ProSerlieProGlulieLysProLeuProProProGlyProThrPro805810815GlyValMetSerProGlyGlyProProPheHisProGinGlyProGin820825830ValLeuLeuGlyPheGlyGinProArgProProValMetGlyTyrGly835840845GlyProProTyrProProAsnGinTyrGlyGlyGlyLysArgGlyAsn850855860TyrAspSerPheArgGlyGinGlyGlyTyrProAlaLysProArgAsn865870875880AsnArgMetMetArgGlyAspProArgAsnlielieGluTyrArgAsp885890895LeuAspAlaProAspAspValAspPhePhe90090權(quán)利要求1、一種蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與抗重金屬相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述蛋白編碼基因?yàn)槿缦?)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子。4、含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為在pGEX-4T-1的^co//和/位點(diǎn)間插入序列表中序列1所示的核苷酸序列得到的重組表達(dá)載體pGEX-^7AS"。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為在表達(dá)載體pCMVnramp的fc^/和&7/酶位點(diǎn)間插入序列表中序列1所示的核苷酸序列得到的重組表達(dá)載體pCMVnramp-ATPAS;7、含有權(quán)利要求2或3所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。8、一種培育抗重金屬魚(yú)的方法，是將權(quán)利要求4、5或6所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入魚(yú)的受精卵細(xì)胞中，培養(yǎng)得到抗重金屬魚(yú)。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述重金屬為砷。10、根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述魚(yú)為鲇魚(yú)。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種與抗砷相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該抗砷相關(guān)的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與抗重金屬相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的抗砷相關(guān)蛋白及其編碼基因?qū)?duì)改善水生生物抗砷以及抗重金屬等表現(xiàn)特征具有重要意義，在魚(yú)的育種中有巨大的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C07K14/46GK101186641SQ20071017835公開(kāi)日2008年5月28日申請(qǐng)日期2007年11月29日優(yōu)先權(quán)日2007年11月29日發(fā)明者侯士聰,侯玉霞,吳旭東,奇張,龔玉梅申請(qǐng)人:寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所;中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)