專利名稱：一種胡蘿卜子轉(zhuǎn)脂多肽制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物抗菌多肽類化合物的提取、分離、純化方法， 尤其是胡蘿卜子轉(zhuǎn)脂多肽制備方法，并通過該方法獲得的胡蘿卜子轉(zhuǎn) 脂多肽作為藥品、保健食品、食品、抗氧化劑、藥品增效劑，藥品配 方等及植物轉(zhuǎn)基因抗病原體研究和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗菌肽是一類具有廣譜高效殺菌活性的堿性多肽類物質(zhì)，含有
10 100個(gè)氨基酸殘基，成熟的抗菌肽來源于前體蛋白的水解，大多
數(shù)抗菌多肽由于富含堿性氨基酸而帶凈正電荷。由于最初被發(fā)現(xiàn)的是
其抗細(xì)菌功能，因而被命名為抗菌肽(antibacterial p印tides， AMPs)。根據(jù)植物多肽抗生素的氨基酸序列及二級(jí)結(jié)構(gòu)，可將植物多 肽抗生素分為9類，包括硫素(thionins)、植物防御素(plant defensins)、轉(zhuǎn)月旨蛋白(lipid transfer proteins, LTPs)、橡膠素 (heveins)、打結(jié)素(knottins)、鳳仙花素(lb-AMPs)和新近發(fā)現(xiàn) 的薺菜素(sh印herdins)、蛻皮素(snakins)、環(huán)肽(cyclotides) 等。它們共同特點(diǎn)是具有廣泛的抗真菌、細(xì)菌、抗HIV、抑制a淀粉 酶活性、抗氧化和緊縮子宮等作用?？咕嚯淖鳛榈钟饨缥⑸锏?第一道防線，有著強(qiáng)大而廣泛的抗菌功能，是動(dòng)物尤其是昆蟲非特異 性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。隨著研究的不斷深人，人們發(fā)現(xiàn)某些抗 菌肽還對(duì)部分真菌、原蟲、病毒甚至癌細(xì)胞具有明顯的殺傷作用，是 一類具有重要潛在應(yīng)用價(jià)值的活性物質(zhì)。盡管抗菌多肽作為古老的天 然抗微生物的物質(zhì)，擔(dān)負(fù)了極其重要的免疫功能，可是受到的關(guān)注也 比較少。目前，抗生素濫用導(dǎo)致的病原菌產(chǎn)生耐受力是困擾許多國(guó)家的一 個(gè)難題。尋找合適的活性物質(zhì)來替代抗生素是解決這一 問題最有效的 途徑?？咕木哂兴苄院?、熱穩(wěn)定、廣譜抗菌及不易引起病原產(chǎn)生 耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，是理想的抗生素替代品。植物，特別是植物種子在生 長(zhǎng)過程中常會(huì)受到微生物侵襲，抗菌肽是直接參與^制微生物繁衍、 生長(zhǎng)、繁殖的重要化學(xué)防御工具之一，因此在植物中尋找具有活性的 抗菌肽具有重要的理論及應(yīng)用價(jià)值。
轉(zhuǎn)脂蛋白(LTPs: Lipid transfer protein):是具有在兩個(gè)細(xì)胞膜之 間轉(zhuǎn)移磷脂功能的多肽。它是由60 90個(gè)氨基酸組成的小分子量的 蛋白質(zhì)，它的結(jié)構(gòu)是四個(gè)二硫的橋鍵結(jié)合中間形成水性隧道成結(jié)構(gòu)。
胡蘿卜的入藥部位是全草，種子和根。胡蘿卜富含3胡蘿卜素， P胡蘿卜素是一種抗氧化劑，可防止細(xì)胞變性，放慢老齡化的進(jìn)程。 胡蘿卜種子是驅(qū)風(fēng)劑，興奮劑，對(duì)脹氣，多風(fēng)絞痛，呃逆，痢疾， 慢性咳嗽有一定療效，它還具有抗細(xì)菌和抗真菌特性。胡蘿卜子油有 助于控制發(fā)癢的頭皮，并提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)頭發(fā)的生長(zhǎng)。
大量文獻(xiàn)檢索所知，目前國(guó)內(nèi)外沒有任何有關(guān)芹菜子、蒔蘿子、 胡蘿卜子等藥食用植物資源活性多肽類化合物的研究報(bào)道。在國(guó)內(nèi)植 物多肽類化合物的研究尚處于初始階段，研究范圍小，研究主要集中 在藥理、基因表達(dá)研究和綜述等方面，對(duì)于多肽類化合物的化學(xué)研究 文獻(xiàn)很有限，而且使用的方法中植物多肽類化合物回收低，不適用于 大規(guī)模制備，這很大程度上限制了多肽類活性化合物的應(yīng)用和工業(yè)化 生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于，提供一種胡蘿卜子轉(zhuǎn)脂多肽制備方法，采用提 取、分離、純化方法從胡蘿卜子中制備轉(zhuǎn)脂多肽，通過該方法獲得的 胡蘿卜子轉(zhuǎn)脂多肽通過液相色譜分離得到分子量為9624的抗棉花枯 萎病的轉(zhuǎn)脂多肽；通過Edman降解法確定其部分N-端氨基酸序列為
N-異亮氨酸-絲氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-纈氨酸-蘇氨酸-絲
氨酸-絲氨酸-異亮氨酸，該序列與煙草、大米、玉米轉(zhuǎn)脂蛋白的氨基
酸序列具有高度一直性；并具有很好的水溶性、熱穩(wěn)定性和具有很強(qiáng)
的抗棉花枯萎病活性?？勺鳛橹苽渌幤?、保健食品、食品、食品添加 劑或藥品增效劑的應(yīng)用。同時(shí)還可作為制備植物轉(zhuǎn)基因抗病原體的應(yīng) 用，是轉(zhuǎn)基因研究培育增強(qiáng)抗病植物的最佳物質(zhì)基礎(chǔ)。為利用新疆傘 形科屬維藥多肽類化合物的新藥開發(fā)研究提供可行實(shí)驗(yàn)方法。
本發(fā)明所述的一種胡蘿卜子轉(zhuǎn)脂多肽制備方法，該方法采用提 取、分離、純化方法從胡蘿卜子中制備轉(zhuǎn)脂多肽，具體操作按下列步
驟進(jìn)行；
a、 將胡蘿卜子用液氮冰凍研磨進(jìn)行細(xì)胞破碎；
b、 利用pH 6. 8-8. 5磷酸鈉緩沖溶液提取胡蘿卜子總蛋白、脫鹽、 剃度季氨鹽沉淀、離心得到胡蘿卜子總多肽，提取溫度為0-15°C， 時(shí)間30 min-5 h;
c、 將胡蘿卜子總多肽進(jìn)行熱處理，溫度50—IO(TC的水浴中處 理5—50分鐘，得到熱穩(wěn)定性多總肽； '
d、 胡蘿卜子總多肽應(yīng)用陰離子交換層析方法分離總陰離子多肽；
e、 胡蘿卜子總陰離子應(yīng)用陽離子交換柱得到總陽離子多肽；
f、 胡蘿卜子總陽離子多肽脫鹽，冷凍干燥得到總多肽粉。 步驟b胡蘿卜子總蛋白質(zhì)利用分子量限制在1000 Da透析袋進(jìn)行脫鹽。
步驟b利用低溫離心機(jī)離心除去沉淀，專速為200-12000prm ， 4 。C，離心l-60分鐘。
步驟d利用纖維素二乙基氨乙基-SN-23陰離子交換柱層析，在 pH 7. 1-9. 0緩沖溶液分離陰離子性多肽。
步驟e利用羧甲基纖維素TSK-650M陽離子交換柱層析，在pH 4.0-6.8緩沖溶液得到胡羅卜子總陽離子多肽。
通過液相色譜分離得到分子量為9624的抗棉花枯萎病的轉(zhuǎn)脂多 肽。 .
通過Edman降解法確定其部分N-端氨基酸序列為N-異亮氨酸-絲氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-纈氨酸-蘇氨酸-絲氨酸-絲氨酸 -異亮氨酸。
所述的制備方法獲得的胡蘿卜子轉(zhuǎn)脂多肽作為制備藥品、保健食 品、食品、抗氧化劑或藥品增效劑的用途。
所述的制備方法獲得的胡蘿卜子轉(zhuǎn)脂多肽作為制備植物轉(zhuǎn)基因 抗病原體的用途。
本發(fā)明所述的方法實(shí)驗(yàn)步聚為
1. 取胡蘿卜子粉用液氮冰凍破碎胡蘿卜子細(xì)胞。
2. 液氮處理過的胡蘿卜子粉在緩沖溶液中在4。C攪拌提取2h， 并冷凍離心機(jī)離心取上層溶液，冷凍干燥得到總蛋白質(zhì)；
3. 胡蘿卜子總蛋白質(zhì)在85。C水浴上熱處理15分鐘，并冷凍離 心去熱變性高分子量蛋白質(zhì)，并離心取上清液；
依次相對(duì)飽和度為1 30%的硫酸氨沉淀蛋白質(zhì)提取溶液，并4 'C下放置12小時(shí)，梯度沉淀3次，取上清液；
4. 將取上清液低溫離心機(jī)離心，取上清液用飽和度為30 80% 的硫酸氨沉淀，并4'C下放置12小時(shí)梯度沉淀3次，低溫離心機(jī)離 心得到胡羅卜子總多肽，并低溫干燥機(jī)干燥得到粉末胡羅卜子總多 肽；
5. 取胡蘿卜子豆總多肽加蒸餾水至完全溶解，并利用分子量限 制在IOOO Da透析袋用pH 8.9的NH4Ac緩沖液透析過夜；
6. 將透析袋過pH 8.9的MUc緩沖液平衡5次的纖維素二乙 基氨乙基-SN-23陰離子交換樹脂柱，并收集與陰離子柱子未結(jié)合的 餾分收集、合并；
7. 陰離子交換柱子未結(jié)合的溶液中在攪拌下滴加醋酸(HAc)，
調(diào)節(jié)調(diào)溶液pH6.0，并過pH6.0的NH4Ac緩沖液平衡5次的陽離子 羧甲基纖維素TSK-650M柱子，被填料吸附的陽離子多肽,利用0-1M剃 度濃度的NaCl在pH 6. 0的NH4Ac緩沖液洗脫，并收集280nm有自外 吸收的洗脫液合并，用交聯(lián)葡聚糖-G-15層析柱子脫鹽，得到陽性胡 羅卜子總多肽成分，冷凍干燥得到粉末總多肽.
8.總多肽利用碳十八柱子反相高效液相，在以下剃度溶劑系統(tǒng) 分離得到單體多肽類化學(xué)成分。高效液相溶劑系統(tǒng)為溶劑A: TFA (0.1%); B: CH3CN;流速1 ml/min;紫外吸收波長(zhǎng)226 nm;剃度 (%/min) : 0-5%/0-5 min， 5-60%/5. 1-35 min; 60%/35. 1-40 min; 60-5%/40. 1-45 min。
本發(fā)明所述方法獲得的胡蘿卜子轉(zhuǎn)脂多肽，通過Edman降解法確 定其部分N-端氨基酸序列為N-異亮氨酸-絲氨酸-半胱氨酸-甘氨酸 -谷氨酰胺-纈氨酸-蘇氨酸-絲氨酸-絲氨酸-異亮氨酸。該序列與其他 來源轉(zhuǎn)脂蛋白部分N-端序列一直性比較見表 . 表本發(fā)明胡蘿卜子轉(zhuǎn)脂蛋白部分N-端序列與其他來源轉(zhuǎn)脂蛋白部
分N-端序列一直性比較
非專一性轉(zhuǎn)脂多 肽(nsLTP)的來源殘基數(shù)N-段序列同一性，％
胡羅卜籽10ISCGqVTSSI100
玉米10ISCGQVASAI90
大米10ISCGQVMSY^70
煙草10I工CGQVTSML" 70
橙子1060
菠菜籽10I工CGMVSSKL50


圖1為本發(fā)明胡蘿卜子中轉(zhuǎn)脂蛋白的液質(zhì)聯(lián)用色譜(LC-MS)圖
具體實(shí)施例方式
實(shí)驗(yàn)材料
磷酸鈉緩沖溶液的配制用歸P。4 (10 mM)， NaH2P04 (15 mM)， KC1 (100 mM)，EDTA(1.5 mM)，和(PVP)聚乙烯吡咯烷酮(1. 5%)攪拌 溶解成pH 7. 3溶液.此緩沖溶液在4°C攪拌2 h并分別加硫脲和 PMSF溶解在異丙醇至最終濃度分別達(dá)到2和l mM即可待用.
,0.05M ， pH8. 9的HAc/MUc緩沖液的配制稱取3. 75克NH4Ac 在攪拌下用酸度計(jì)來滴加氨水至溶液pH 7. 1-9.0。
0.05M ， pH6.0的HAc/NH4Ac緩沖液的配制稱取3. 75克NH4AC 在攪拌下用酸度計(jì)來滴加醋酸至溶液pH 4.0-6.8。
陰離子交換柱準(zhǔn)備纖維素二乙基氨乙基-SN-23柱子利用 0. 05M ， pH 7.1-9.0的HAc/NH4Ac緩沖液平衡5次。
陽離子交換柱的準(zhǔn)備:羧甲基纖維素TSK-650M柱子利用0. 05M ， pH 4. 0-6. 8的HAc/歸c緩沖液平衡5次。
實(shí)施例1
取新鮮胡蘿卜子清洗，用液氮冷凍粉碎，粉碎樣品用pH 7.3磷 酸鈉緩沖溶液在溫度4"C攪拌提取2 h，將提取液冷凍離心取上層溶 液，冷凍干燥得到總蛋白質(zhì)； '
將胡蘿卜子總蛋白質(zhì)在85'C水浴上熱處理15分鐘，冷凍離心取 上清液；
將上清液分別用飽和度為1-10%的硫酸氨4。C下放置12小時(shí)， 10-20%的硫酸氨4。C下放置12小時(shí)，20-30%的硫酸氨4。C下放置12 小時(shí)進(jìn)行梯度沉淀3次，取上清液，離心；
將離心后的上清液分別用飽和度為30-50%的硫酸氨4"C下放置 12小時(shí)，50-60%的硫酸氨4'C下放置12小時(shí)，60-80%的硫酸氨4°C 下放置12小時(shí)進(jìn)行梯度沉淀3次，低溫離心，溫度4'C，轉(zhuǎn)速12000 prm，時(shí)間1分鐘，得到胡蘿卜子總多肽，并低溫干燥得到粉末胡蘿 卜子總多肽；
取胡蘿卜子總多肽加蒸餾水至完全溶解，并利用分子量限制在
1000 Da透析袋用pH 7.1的NH4Ac緩沖液，采用截流分子量為1 kD 的透析膜對(duì)緩沖溶液透析24小時(shí)；
將透析袋用0. 05M ， pH 7. 1的HAc/MUc緩沖液平衡5次的纖維 素二乙基氨乙基-SN-23陰離子交換樹脂柱層析，并收集與陰離子柱
子未結(jié)合的餾分收集、合并；
將陰離子交換柱子未結(jié)合的溶液再用0.05M ，pH4.0的HAc/MUc 緩沖液平衡5次的羧甲基纖維素TSK-650M陽離子交換樹脂柱層析， 得到陽離子多肽；
將陽離子多肽用0-1M剃度濃度的NaCl在pH 6. 0的NH4Ac緩沖液 洗脫，并收集280nm有自外吸收的洗脫液合并，用交聯(lián)葡聚糖-G-15層 析柱子脫鹽，得到陽性胡羅卜子總多肽成分，冷凍干燥得到粉末總多 肽；
將總多肽利用碳十八柱子反相高效液相，在剃度溶劑系統(tǒng)分離得 到單體多肽類化學(xué)成分；高效液相溶劑系統(tǒng)為溶劑A: TFA (0. 1%); B: CH3CN;流速1 ml/min;紫外吸收波長(zhǎng)226 nm;剃度(％/min): 0-5%/0-5 min， 5-60%/5. 1-35 min; 60o/Q/35. 1-40 min; 60_5%/40. 1-45 miru
通過本發(fā)明所述方法獲得的胡蘿卜子轉(zhuǎn)脂多肽，經(jīng)過反相高效液 相色譜分離得到，并液質(zhì)聯(lián)用色譜確定其分子量為'9624的抗棉花枯 萎病的轉(zhuǎn)脂多肽。同時(shí)經(jīng)Edman降解法確定其部分N-端氨基酸序列 為N-異亮氨酸-絲氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-纈氨酸-蘇氨酸 -絲氨酸-絲氨酸-異亮氨酸。該胡蘿卜子轉(zhuǎn)脂多肽作為制備藥品、保 健食品、食品、食品添加劑、抗氧化劑或藥品增效劑的應(yīng)用，同時(shí)也 可作為制備植物轉(zhuǎn)基因抗病原體的應(yīng)用。
實(shí)施例2
取新鮮胡蘿卜子清洗，用液氮冷凍粉碎，粉碎樣品用pH 6.8磷 酸鈉緩沖溶液在溫度0。C攪拌提取30分鐘，將提取液冷凍離心取上 層溶液，冷凍干燥得到總蛋白質(zhì)；
將胡蘿卜子總蛋白質(zhì)在5(TC水浴上熱處理5分鐘，冷凍離心取 上清液；
將上清液分別用飽和度為1-10%的硫酸氨4"C下放置12小時(shí)， 10-20%的硫酸氨4。C下放置12小時(shí)，20-30%的硫酸氨4"C下放置12 小時(shí)進(jìn)行梯度沉淀3次，取上清液，離心；
將離心后的上清液分別用飽和度為30-50%的硫酸氨4'C下放置 12小時(shí)，50-60%的硫酸氨4。C下放置12小時(shí)，60-80%的硫酸氨4°C 下放置12小時(shí)進(jìn)行梯度沉淀3次，低溫離心，溫度4'C，轉(zhuǎn)速200 prm， 時(shí)間60分鐘，得到胡蘿卜子總多肽，并低溫干燥得到粉末胡蘿卜子 總多月太；
取胡蘿卜子總多肽加蒸餾水至完全溶解，并利用分子量限制在 1000 Da透析袋用pH 8.0的NH4Ac緩沖液，采用截流分子量為1 kD 的透析膜對(duì)緩沖溶液透析24小時(shí)；
將透析袋用0. 05M ， pH 8. 0的HAc/NH4Ac緩沖液平衡5次的纖維 素二乙基氨乙基-SN-23陰離子交換樹脂柱層析，并收集與陰離子柱 子未結(jié)合的餾分收集、合并；
將陰離子交換柱子未結(jié)合的溶液再用0. 05M ， pH 5. 0的HAc/NH4Ac 緩沖液平衡5次的羧甲基纖維素TSK-650M陽離子交換樹脂柱層析， 得到陽離子多肽；
將陽離子多肽用0-1M剃度濃度的NaCl在pH 6. 0的NH4Ac緩沖液 洗脫，并收集280nm有自外吸收的洗脫液合并,用交聯(lián)葡聚糖-G-15層 析柱子脫鹽，得到陽性胡羅卜子總多肽成分，冷凍干燥得到粉末總多 肽；
將總多肽利用碳十八柱子反相高效液相，在剃度溶劑系統(tǒng)分離得
到單體多肽類化學(xué)成分；高效液相溶劑系統(tǒng)為溶，A:TFA(O. 1%); B: CH3CN;流速1 ml/min;紫外吸收波長(zhǎng)226 nm;剃度(％/min): 0—5%/0—5 min， 5—600/0/5. 1—35 min; 60%/35. 1—40 min; 60—5%/40. 1-45 min。
通過本發(fā)明所述方法獲得的胡蘿卜子轉(zhuǎn)脂多肽，經(jīng)過反相高效液 相色譜分離得到，并液質(zhì)聯(lián)用色譜確定其分子量為9624的抗棉花枯 萎病的轉(zhuǎn)脂多肽。同時(shí)經(jīng)Edman降解法確定其部分N-端氨基酸序列 為N-異亮氨酸-絲氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-纈氨酸-蘇氨酸 -絲氨酸-絲氨酸-異亮氨酸。該胡蘿卜子轉(zhuǎn)脂多肽作為制備藥品、保 健食品、食品、食品添加劑、抗氧化劑或藥品增效劑的應(yīng)用，同時(shí)也 可作為制備植物轉(zhuǎn)基因抗病原體的應(yīng)用。
實(shí)施例3
取新鮮胡蘿卜子清洗，用液氮冷凍粉碎，粉碎樣品用pH 8.0磷 酸鈉緩沖溶液在溫度1(TC攪拌提取3h，將提取液冷凍離心取上層溶 液，冷凍干燥得到總蛋白質(zhì)；
將胡蘿卜子總蛋白質(zhì)在75t水浴上熱處理35分鐘，冷凍離心取 上清液；
將上清液分別用飽和度為卜10%的硫酸氨4t:下放置12小時(shí)， 10-20%的硫酸氨4'C下放置12小時(shí)，20-30%的硫酸氨4"下放置12 小時(shí)進(jìn)行梯度沉淀3次，取上清液，離心；
將離心后的上清液分別用飽和度為30-50%的硫酸氨4'C下放置 12小時(shí)，50-60%的硫酸氨4。C下放置12小時(shí)，60-80%的硫酸氨4°C 下放置12小時(shí)進(jìn)行梯度沉淀3次，低溫離心，溫度4°C ，轉(zhuǎn)速1000 prm， 時(shí)間10分鐘，得到胡蘿卜子總多肽，并低溫干燥得到粉末胡蘿卜子 總多肽；
取胡蘿卜子總多肽加蒸餾水至完全溶解，并利用分子量限制在 1000 Da透析袋用pH 8.5的NH4Ac緩沖液，采用截流分子量為1 kD 的透析膜對(duì)緩沖溶液透析24小時(shí)；
將透析袋用0. 05M ， pH 8. 5的HAc/MUc緩沖液平衡5次的纖維 素二乙基氨乙基-SN-23陰離子交換樹脂柱層析，并收集與陰離子柱 子未結(jié)合的餾分收集、合并；
將陰離子交換柱子未結(jié)合的溶液再用0.05M ，pH'6.0的HAc/MUc 緩沖液平衡5次的羧甲基纖維素TSK-650M陽離子交換樹脂柱層析， 得到陽離子多肽；
將陽離子多肽用0-1M剃度濃度的NaCl在pH 6. 0的N仏Ac緩沖液 洗脫，并收集280nm有自外吸收的洗脫液合并,用交聯(lián)葡聚糖-G-15層 析柱子脫鹽，得到陽性胡羅卜子總多肽成分，冷凍干燥得到粉末總多 肽；
將總多肽利用碳十八柱子反相高效液相，在剃度溶劑系統(tǒng)分離得 到單體多肽類化學(xué)成分；高效液相溶劑系統(tǒng)為溶劑A:TFA(O. 1%); B: C腦;流速1 ml/min;紫外吸收波長(zhǎng)226 nm;剃度(％/min): 0-5%/0-5min， 5-60%/5. 1-35 min; 60%/35. 1-40min; 60-5%/40. 1-45 min0
通過本發(fā)明所述方法獲得的胡蘿卜子轉(zhuǎn)脂多肽，經(jīng)過反相高效液 相色色譜分離得到，并液質(zhì)聯(lián)用色譜確定其分子量為9624的抗棉花 枯萎病的轉(zhuǎn)脂多肽。同時(shí)經(jīng)Edman降解法確定其部分N-端氨基酸序 列為N-異亮氨酸-絲氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-纈氨酸-蘇氨 酸-絲氨酸-絲氨酸-異亮氨酸。該胡蘿卜子轉(zhuǎn)脂多肽作為制備藥品、 保健食品、食品、食品添加劑、抗氧化劑或藥品增效劑的應(yīng)用，同時(shí) 也可作為制備植物轉(zhuǎn)基因抗病原體的應(yīng)用。
實(shí)施例4
取新鮮胡蘿卜子清洗，用液氮冷凍粉碎，粉碎樣品用pH 8. 5磷 酸鈉緩沖溶液在溫度15'C攪拌提取5h，將提取液冷凍離心取上層溶 液，冷凍干燥得到總蛋白質(zhì)；
將胡蘿卜子總蛋白質(zhì)在IO(TC水浴上熱處理50分鐘，冷凍離心 取上清液；
將上清液分別用飽和度為1-10%的硫酸氨4。C下放置12小時(shí)， 10-20%的硫酸氨4。C下放置12小時(shí)，20-30%的硫酸氨4。C下放置12 小時(shí)進(jìn)行梯度沉淀3次，取上清液，離心；
將離心后的上清液分別用飽和度為30-50%的硫酸氨4"C下放置 12小時(shí)，50-60%的硫酸氨4。C下放置12小時(shí)，60-80%的硫酸氨4°C 下放置12小時(shí)進(jìn)行梯度沉淀3次，低溫離心，溫度4°G，轉(zhuǎn)速2000 prm， 時(shí)間40分鐘，得到胡蘿卜子總多肽，并低溫干燥得到粉末胡蘿卜子 總多肽；
取胡蘿卜子總多肽加蒸餾水至完全溶解，并利用分子量限制在 1000 Da透析袋用pH 9. 0的NH4Ac緩沖液，采用截流分子量為1 kD 的透析膜對(duì)緩沖溶液透析24小時(shí)；
將透析袋用0. 05M ， pH 9. 0的HAc/麗4Ac緩沖液平衡5次的纖維 素二乙基氨乙基-SN-23陰離子交換樹脂柱層析，并收集與陰離子柱 子未結(jié)合的餾分收集、合并；
將陰離子交換柱子未結(jié)合的溶液再用0.05M ，pH'6.8的HAc/MUc 緩沖液平衡5次的羧甲基纖維素TSK-650M陽離子交換樹脂柱層析， 得到陽離子多肽；
將陽離子多肽用0-1M剃度濃度的NaCl在pH 6. 0的NH4Ac緩沖液 洗脫，并收集280nm有自外吸收的洗脫液合并，用交聯(lián)葡聚糖-G-15層 析柱子脫鹽，得到陽性胡羅卜子總多肽成分，冷凍干燥得到粉末總多 肽；
將總多肽利用碳十八柱子反相高效液相，在剃度溶劑系統(tǒng)分離得 到單體多肽類化學(xué)成分；高效液相溶劑系統(tǒng)為溶，jA:TFA(O. 1%); B: CH3CN;流速1 ml/min;紫外吸收波長(zhǎng)226 nm;剃度(。/。/min): 0-5%/0-5min， 5-60%/5.卜35min; 60%/35. 1-40 min; 60_5%/40. 1-45miru
通過本發(fā)明所述方法獲得的胡蘿卜子轉(zhuǎn)脂多肽，經(jīng)過反相高效液 相色色譜分離得到，并液質(zhì)聯(lián)用色譜確定其分子量為9624的抗棉花 枯萎病的轉(zhuǎn)脂多肽。同時(shí)經(jīng)Edman降解法確定其部分N-端氨基酸序 列為N-異亮氨酸-絲氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-纈氨酸-蘇氨 酸-絲氨酸-絲氨酸-異亮氨酸。該胡蘿卜子轉(zhuǎn)脂多肽作為制備藥品、 保健食品、食品、食品添加劑、抗氧化劑或藥品增效劑的應(yīng)用，同時(shí) 也可作為制備植物轉(zhuǎn)基因抗病原體的應(yīng)用。
權(quán)利要求
1、一種胡蘿卜子轉(zhuǎn)脂多肽的制備方法，其特征在于采用提取、分離、純化從胡蘿卜子中制備轉(zhuǎn)脂多肽，具體操作按下列步驟進(jìn)行；a、將胡蘿卜子用液氮冰凍研磨進(jìn)行細(xì)胞破碎；b、利用pH 6.8-8.5磷酸鈉緩沖溶液提取胡蘿卜子總蛋白、離心，剃度季氨鹽沉淀、離心，脫鹽、離心得到胡蘿卜子總多肽，提取溫度為0-15℃，時(shí)間30min-5h；c、將胡蘿卜子總多肽進(jìn)行熱處理，溫度50-100℃的水浴中處理5-50分鐘，離心分離熱不穩(wěn)定的多肽，得到熱穩(wěn)定性總多肽；d、胡蘿卜子總多肽應(yīng)用陰離子交換色譜方法分離總陰離子多肽；e、胡蘿卜子總陰離子應(yīng)用陽離子交換色譜方法得到總陽離子多肽；f、胡蘿卜子總陽離子多肽脫鹽，冷凍干燥得到總多肽粉。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟b胡蘿卜 子總蛋白質(zhì)利用分子量限制在1000 Da透析袋進(jìn)行脫鹽。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟b利用低 溫離心機(jī)離心除去沉淀，專速為200-12000prm ， 4°C，離心1-60分鐘。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟d利用纖 維素二乙基氨乙基-SN-23陰離子交換柱層析，在pH7. 1-9.0緩沖溶液分離陰離子性多肽。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟e利用羧 甲基纖維素TSK-650M陽離子交換柱層析，在pH 4.0-6.8緩沖溶液得到胡羅卜子總陽離子多肽。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法獲得的胡蘿卜子轉(zhuǎn)脂多肽， 其特征在于通過高效液相色譜分離得到分子量為9624的抗棉花枯萎病的轉(zhuǎn)脂多肽。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法獲得的胡蘿卜子轉(zhuǎn)脂多肽， 其特征在于通過Edman降解法確定其部分N-端氨基酸序列為N-異 亮氨酸-絲氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-纈氨酸-蘇氨酸-絲氨酸 -絲氨酸-異亮氨酸。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法獲得的胡蘿卜子轉(zhuǎn)脂多肽作 為制備藥品、保健食品、食品、抗氧化劑或藥品增效劑的用途。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法獲得的胡蘿卜子轉(zhuǎn)脂多肽作 為制備植物轉(zhuǎn)基因抗病原體的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種胡蘿卜子轉(zhuǎn)脂多肽制備方法和應(yīng)用，采用提取、分離、純化方法從胡蘿卜子中制備轉(zhuǎn)脂多肽，通過該方法獲得的胡蘿卜子轉(zhuǎn)脂多肽經(jīng)液相色譜分離得到分子量為9624的抗棉花枯萎病的轉(zhuǎn)脂多肽；經(jīng)Edman降解法確定其部分N-端氨基酸序列為N-異亮氨酸-絲氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-纈氨酸-蘇氨酸-絲氨酸-絲氨酸-異亮氨酸；該序列與煙草、大米、玉米轉(zhuǎn)脂蛋白的氨基酸序列具有高度一直性；并具有很好的水溶性、熱穩(wěn)定性和具有很強(qiáng)的抗棉花枯萎病活性。可作為制備藥品、保健食品、食品、食品添加劑、抗氧化劑或藥品增效劑的應(yīng)用。同時(shí)還可作為制備植物轉(zhuǎn)基因抗病原體的應(yīng)用，是轉(zhuǎn)基因研究培育增強(qiáng)抗病植物的最佳物質(zhì)基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07K14/415GK101200494SQ200710180048
公開日2008年6月18日 申請(qǐng)日期2007年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月18日
發(fā)明者呂俏瑩, 阿不力米提·伊力, 阿吉艾克拜爾·艾薩 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所