專利名稱：改進(jìn)的疫苗的制作方法
改進(jìn)的疫苗本申請(qǐng)是基于申請(qǐng)?zhí)枮?00480007042.2申請(qǐng)日為2004年3月22 日，發(fā)明名稱為"改進(jìn)的疫苗"的中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及改進(jìn)的疫苗，尤其是病毒疫苗以及制造它們的方法。 針對(duì)入侵病原體的宿主保護(hù)包括細(xì)胞和體液效應(yīng)子并且由非適應(yīng) 性(先天)和適應(yīng)性(后天)免疫的協(xié)調(diào)作用產(chǎn)生。后者基于受體介 導(dǎo)的特異性免疫識(shí)別，是免疫系統(tǒng)新近的獲得，且只存在于脊推動(dòng)物 之中。在適應(yīng)性免疫發(fā)展之前就進(jìn)化的前者，由分布在整個(gè)生物體中任務(wù)是控制潛在病原體的各種各樣的細(xì)胞和分子組成。B和T淋巴細(xì)胞是獲得性抗原特異性適應(yīng)性免疫的介導(dǎo)物，包括 免疫記憶的發(fā)展，它是產(chǎn)生成功疫苗的主要目標(biāo)?？乖f呈細(xì)胞(APC) 是高度特化的細(xì)胞，它們能夠處理抗原并且在細(xì)胞表面呈現(xiàn)它們的經(jīng) 過(guò)處理的片段以及淋巴細(xì)胞激活必需的分子。這意味著APC對(duì)于特異性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)非常重要。對(duì)于T淋巴細(xì)胞的激活主要的APC是樹(shù)突細(xì)胞(DC )、巨噬細(xì)胞 和B細(xì)胞，而對(duì)于B細(xì)胞主要的APC是濾泡樹(shù)突細(xì)胞。通常，就刺激 靜止幼稚和記憶B和T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答之啟動(dòng)而言，DC是最強(qiáng)的 APC。外周APC (例如DC或朗格漢氏細(xì)胞)天然的任務(wù)是捕獲和處理抗 原，因此一旦被激活它們就開(kāi)始表達(dá)淋巴細(xì)胞共刺激分子，遷移到淋 巴器官，分泌細(xì)胞因子并將抗原遞呈到不同的淋巴細(xì)胞群，啟動(dòng)抗原 特異性免疫應(yīng)答。它們不僅激活淋巴細(xì)胞，在某些環(huán)境下，它們也使 T細(xì)胞對(duì)抗原耐受。T淋巴細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別是主要組織相容性復(fù)合物(MHC)限制的。 只有在肽結(jié)合于特別的MHC分子時(shí)特定的T淋巴細(xì)胞才識(shí)別抗原。通 常，T淋巴細(xì)胞只在自身MHC分子存在下而被刺激，抗原只在肽結(jié)合 于自身MHC分子時(shí)而被識(shí)別。就4支識(shí)別的抗原而言以及就結(jié)合其肽片 段的MHC分子而言，MHC限制定義了 T淋巴細(xì)胞的特異性。就識(shí)別和適當(dāng)?shù)膽?yīng)答而言，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外抗原向免疫系統(tǒng)提出了非常不同的挑戰(zhàn)。將抗原遞呈到T細(xì)胞由兩個(gè)截然不同種類的分子 I類MHC (MHC-I)和II類固C (MHC-II)介導(dǎo)，它們利用截然不同的 抗原處理途徑。主要是一個(gè)能夠區(qū)別已經(jīng)進(jìn)化的兩個(gè)主要抗原處理途 徑。來(lái)源自細(xì)胞內(nèi)抗原的肽由I類MHC分子遞呈到CD8+T細(xì)胞，它們 實(shí)際上在所有的細(xì)胞上表達(dá)，而細(xì)胞外抗原來(lái)源的肽由II類MHC分子 遞呈到CD4+T細(xì)胞。然而，這個(gè)兩分法有某些例外。 一些研究顯示由MHC-I分子上。所以，位于外周、高效捕獲和處理細(xì)胞外抗原并在MHC-I 分子上將它們遞呈到T淋巴細(xì)胞的APC (象樹(shù)突細(xì)胞)是體外和體內(nèi) 用抗原細(xì)胞外脈沖處理(pulsing)它們的引人注目的靶點(diǎn)，APC重要并獨(dú)特的作用(包括對(duì)不同類型白細(xì)胞的刺激活性)反 映了它們作為開(kāi)發(fā)成功疫苗適當(dāng)策略的靶點(diǎn)的中心位置。理論上，可 以如此進(jìn)行的一個(gè)路線是增強(qiáng)或刺激它們天然的任務(wù)，抗原的攝取。 一旦用疫苗所指向的適當(dāng)抗原脈沖處理(pulse) , APC應(yīng)當(dāng)開(kāi)始處理 攝取的抗原，因此一旦被激活，APC就表達(dá)淋巴細(xì)胞共刺激分子，遷 移至淋巴器官，分泌細(xì)胞因子并將抗原遞呈到不同的淋巴細(xì)胞群因此 啟動(dòng)免疫應(yīng)答。激活的T細(xì)胞通常以高度調(diào)節(jié)的方式分泌許多效應(yīng)細(xì)胞因子，例 如白細(xì)胞介素2 ( IL-2) 、 IL-4、 IL-5、 IL-10和干擾素-y ( IFN-g )。 普遍地用ELISpot試驗(yàn)(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn))監(jiān)測(cè)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞 對(duì)特異性抗原(例如胂瘤抗原，通常在疫苗中給予的抗原)應(yīng)答的功 能檢測(cè)，所述BUSpot試驗(yàn)是在單個(gè)細(xì)胞水平分析細(xì)胞因子的產(chǎn)生的技術(shù)。本發(fā)明中對(duì)于促進(jìn)細(xì)胞因子IFN-Y的細(xì)胞免疫(l型免疫應(yīng)答)， 使用ELISpot試驗(yàn)監(jiān)測(cè)成功的抗原特異性T細(xì)胞激活。此外，測(cè)定細(xì) 胞因子IL-4，作為通常參與促進(jìn)強(qiáng)體液應(yīng)答的2型應(yīng)答的指示劑。另 外，體液免疫應(yīng)答用ELISA測(cè)定(IgGl作為2型應(yīng)答的指示劑，IgG2 作為1型應(yīng)答的指示劑)。先前顯示聚陽(yáng)離子有效地增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)I類MHC匹配的肽的攝取，被稱為"轉(zhuǎn)裝載(TRANSloading)"肽或蛋白質(zhì)脈沖處理過(guò)程。 此外，已經(jīng)顯示聚陽(yáng)離子在體內(nèi)以及體外能夠?qū)㈦幕虻鞍踪|(zhì)"轉(zhuǎn)裝載 (TRANSload)"到抗原遞呈細(xì)胞內(nèi)。另外，在小鼠模型中，聚-L-精 氨酸或聚-L-賴氨酸和適當(dāng)肽的混合物作為疫苗的共注射保護(hù)動(dòng)物避 免腫瘤的生長(zhǎng)。這個(gè)化學(xué)定義的疫苗能夠誘導(dǎo)許許多多的抗原/肽特異 性T細(xì)胞。誘導(dǎo)至少部分可歸于聚陽(yáng)離子介導(dǎo)的APC對(duì)肽增加的攝取 表明，APC在體內(nèi)用抗原脈沖處理，能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)給予抗 原的免疫。與特征在于應(yīng)答高特異性但是相對(duì)緩慢的適應(yīng)性免疫相反，先天免疫是基于微生物組分與宿主在結(jié)構(gòu)上的差異所觸發(fā)的效應(yīng)子機(jī)制。 這些機(jī)制能發(fā)動(dòng)(mount )相當(dāng)快的初始應(yīng)答，它們主要導(dǎo)致有害物的 中和。先天免疫的反應(yīng)是較低等門(mén)的生物唯一的防御策略并且在脊推 動(dòng)物已經(jīng)保留為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)動(dòng)員前的第一線宿主防御。在較高等的脊推動(dòng)物中，先天免疫的效應(yīng)細(xì)胞是嗜中性粒細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞以及還可能是樹(shù)突細(xì)胞，而這個(gè)途徑中體液 組分是補(bǔ)體級(jí)聯(lián)和各種不同的結(jié)合蛋白。先天免疫快速且有效的組成是長(zhǎng)度通常在大約十二至大約一百個(gè) 之間的氨基酸殘基之多種多樣的殺微生物(microbicidal )肽的產(chǎn)生。幾百個(gè)不同的抗菌肽由范圍從海綿、昆蟲(chóng)到動(dòng)物和人的多種生物體中 分離，這指出了這些分子的廣泛分布。抗菌肽也可作為抵抗竟?fàn)幧?的拮抗物質(zhì)而由細(xì)菌產(chǎn)生。CD4+細(xì)胞的兩個(gè)主要亞型(T輔助1 (Thl)和T輔助2 (Th2))基于它們分泌的不同細(xì)胞因子譜和它們不同的效應(yīng)子功能，在小鼠和 人中已經(jīng)鑒別出來(lái)。Thl細(xì)胞主要參與所謂1型免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，它 一般特征在于遲發(fā)型超敏反應(yīng)的誘導(dǎo)、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、免疫球蛋白 種類轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG2a/IgG2b和尤其是干擾素-y的分泌。相反，Th2細(xì)胞 參與所謂2型免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，它特征在于激活B細(xì)胞誘導(dǎo)體液免疫， 導(dǎo)致包括種類轉(zhuǎn)變?yōu)镮gGl和IgE的抗體的產(chǎn)生。2型應(yīng)答特征也在于 如下細(xì)胞因子的分泌IL-4、 IL-5、 IL-6和IL-10。在多數(shù)情形下，誘導(dǎo)的應(yīng)答類型(1型或2型)對(duì)疫苗的保護(hù)效 能有顯著的影響。替代的佐劑趨向于促成特異類型的應(yīng)答。然而，佐 劑的選擇因?yàn)楣δ艿牟豢深A(yù)測(cè)性以及商業(yè)約束和可用性而復(fù)雜化，流行性感冒病毒的感染屬于最重要并且頻繁的感染，具有顯著的 死亡率，尤其是對(duì)于年長(zhǎng)的人或有免疫系統(tǒng)缺陷的人。目前，市場(chǎng)上 有很多的流行性感冒疫苗；然而，不是所有的疫苗接種導(dǎo)致對(duì)流行性 感冒感染的保護(hù)性。所以，存在為了擴(kuò)大保護(hù)效能改進(jìn)目前的流行性 感冒疫苗的需要。此外，因?yàn)榇蠖鄶?shù)目前的疫苗幾乎都專門(mén)地引發(fā)2型應(yīng)答，所以 提供改進(jìn)疫苗的需要是存在的，所述疫苗顯示了針對(duì)1型的免疫應(yīng)答 或除了 2型應(yīng)答也允許顯著1型免疫應(yīng)答。此外，已經(jīng)可以利用的疫 苗應(yīng)當(dāng)提供為允許誘導(dǎo)1型應(yīng)答的改進(jìn)的形式。所以，本發(fā)明提供了針對(duì)(病毒)感染的改進(jìn)的疫苗，包含抗原， 式R廣XZXZJZX-R2的肽和含有脫氧肌苷和/或脫氧尿苷殘基的免疫刺激 性脫氧核酸。根據(jù)本發(fā)明過(guò)程中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，這兩個(gè)類型的免疫物(I咖unizer ) 的組合顯示了對(duì)抗原的協(xié)同作用。對(duì)于共同的流行性感冒抗原(尤其 是血凝素和神經(jīng)氨酸酶)和肝炎病毒抗原尤其顯示出協(xié)同作用。尤其 對(duì)于病毒抗原的協(xié)同作用不是由這些物質(zhì)類型已知的特性可誘導(dǎo)的， 盡管已知這兩個(gè)物質(zhì)類型的每一個(gè)都具有良好的免疫刺激特性(W0 02/32451， W0 01/93905和PCT/EP02/05448 )，對(duì)病毒病原體，尤其 是對(duì)流行性感冒和肝炎病毒抗原的聯(lián)合作用，顯著地優(yōu)于能從這些單 個(gè)效能簡(jiǎn)單加和所期盼的作用。由于本發(fā)明，只是通過(guò)額外地提供根據(jù)本發(fā)明的兩種類型免疫物 質(zhì)的聯(lián)合可顯著地改進(jìn)已經(jīng)可得的或市售的病毒疫苗，尤其是流行性 感冒或甲、乙或丙型肝炎疫苗。所以本發(fā)明提供了預(yù)防病毒感染的疫苗，包含-抗原，尤其是病毒抗原，-包含序列RrXZXZNXZX-R2的肽，其中N是3至7之間的整數(shù)，優(yōu)選地是5，X是帶正電荷的天然和/或非天然的氨基酸殘基，Z是選自L、 V、 I 、 F和/或W的氨基酸殘基，、和R2相互獨(dú)立地選自-H、 -NH2、 -C0CH" -COH至多達(dá)20個(gè)氨基酸殘基的肽或者肽反應(yīng)基團(tuán)或者帶有或不帶有 肽的肽連接子；X-Rz可以是所述肽(在下面也稱為"肽A")羧基末 端氨基酸殘基的酰胺、酯或硫酯以及-具有根據(jù)式(I)結(jié)構(gòu)的免疫刺激性寡聚核酸分子(0DN)，
<formula>formula see original document page 8</formula>
其中R選自次黃噪呤和尿嘧啶， 任一X是0或S，任一NMP是2，脫氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，選自脫氧腺苷-、 脫氧鳥(niǎo)苷-、脫氧肌苷-、脫氧胞嘧啶-、脫氧尿苷-、脫氧胸苷-、2-甲基-脫氧肌苷-、5-甲基-脫氧胞苷-、脫氧假尿苷-、脫氧核糖嘌呤-、 2-氨基-脫氧核糖嘌呤-、6-S-脫氧鳥(niǎo)嘌呤-、2-二甲基-脫氧鳥(niǎo)苷-或者 N-異戊烯基-脫氧腺苷-一磷酸或-一硫代磷酸，NUC是2，脫氧核苷，選自脫氧腺苷-、脫氧鳥(niǎo)苷-、脫氧肌苷-、 脫氧胞嘧啶-、脫氧肌苷-、脫氧胸苷-、2-曱基-脫氧尿苷-、5-甲基-脫氧胞嘧啶-、脫氧假尿苷-、脫氧核糖嘌呤-、2-氨基-脫氧核糖嘌呤-、 6-S-脫氧鳥(niǎo)嘌呤-、2-二甲基-脫氧鳥(niǎo)苷-或者N-異戊烯基-脫氧腺苷，a和b是從0至IOO的整數(shù)，前提是a+b在4至150之間，且B和E是核酸分子5，或3，末端的共有基團(tuán)(在下面稱為<formula>formula see original document page 9</formula>當(dāng)然，本疫苗可進(jìn)一步地含有其它的物質(zhì)，例如合適的藥學(xué)可接 受的稀釋劑或載體、緩沖劑或穩(wěn)定物質(zhì)等等。根據(jù)本發(fā)明的疫苗可進(jìn)一步地含有額外的佐劑，尤其是A1(0H)3 佐劑(Alum)。Alum如此處所指包括用于人和動(dòng)物醫(yī)藥及研究的所有形式的基 于A1"的佐劑。尤其是，它包括如Rompp，第10版，139/140頁(yè)定義 的所有形式的氫氧化鋁，它們的凝膠形式，磷酸鋁等等。這個(gè)對(duì)于已經(jīng)面市并含有這樣的Al (OH) 3佐劑的疫苗是特別優(yōu)選 的.在這樣的情況下，根據(jù)本發(fā)明的免疫物的組合可以簡(jiǎn)單地加入到 這樣的現(xiàn)有疫苗中。本抗原優(yōu)選地是病毒抗原。如果顯著的(或?qū)ｉT(mén)的)Thl 1型應(yīng) 答應(yīng)當(dāng)是特別必需的，優(yōu)選的T細(xì)胞抗原決定簇(見(jiàn)上面的引言)作 為抗原。所述抗原優(yōu)選地是病毒抗原。在實(shí)施例部分，本發(fā)明在原理 上證明對(duì)流行性感冒和肝炎病毒抗原特別有效，也就是對(duì)根據(jù)本發(fā)明 優(yōu)選的抗原乙型肝炎表面抗原和丙型肝炎抗原有效。當(dāng)然，依賴于期望的免疫應(yīng)答，藥物制備也可包含兩個(gè)或多個(gè)抗 原。可以對(duì)抗原進(jìn)行修飾以進(jìn)一步地增強(qiáng)免疫應(yīng)答。源自病毒或細(xì)菌病原體、源自真菌或寄生蟲(chóng)的蛋白質(zhì)或肽，以及 腫瘤抗原(癌癥疫苗)或在自身免疫疾病中有假定作用的抗原可以用 作抗原(包括衍生化的抗原，象糖基化的、脂質(zhì)化的、糖脂化的或羥 基化的抗原)。此外，碳水化合物、脂質(zhì)或糖脂本身可用作抗原。衍 生化過(guò)程可包括源自病原體的特定蛋白質(zhì)或肽的純化、病原體的失活 以及這樣的蛋白質(zhì)或肽的水解或化學(xué)衍生作用或穩(wěn)定化?；蛘?，病原 體本身也可用作抗原?？乖瓋?yōu)選地是肽或蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)、 糖脂或它們的混合物。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，T細(xì)胞表位被用作抗原?；蛘?，T細(xì)胞表位 B細(xì)胞表位的聯(lián)合也是優(yōu)選的。當(dāng)然根據(jù)本發(fā)明也可能使用不同抗原的混合物。優(yōu)選地，分離自病毒或細(xì)菌病原體或真菌或寄生蟲(chóng)(或它們的重組對(duì)應(yīng)物)的蛋白質(zhì) 或肽被用作這樣的抗原(包括衍生化抗原或糖基化或脂質(zhì)化抗原或多 糖或脂質(zhì))?？乖牧硪粋€(gè)優(yōu)選來(lái)源是腫瘤抗原，優(yōu)選的病原體選自人類免疫缺陷性病毒(HIV)、甲型和乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒(HCV) 或其它的黃病毒，例如日本腦炎病毒(JCV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、 EB病毒(EBV)、流行性感冒病毒、人類乳突狀病毒(HPV)、輪狀病 毒、金黃色葡萄球菌、肺炎衣原體、沙眼衣原體、結(jié)核桿菌、肺炎鏈 球菌、炭疽桿菌、霍亂弧菌、瘧疾原蟲(chóng)(惡性瘧原蟲(chóng)、間日瘧原蟲(chóng)， 等等)、曲霉屬(Aspergillus sp.)或白色念珠菌。在肽抗原的情況下，肽模型表位(mimotope) /激動(dòng)劑/高級(jí)激動(dòng) 劑/拮抗劑，或者在某些位置改變但不影響免疫特性的肽或者非肽模型 表位/激動(dòng)劑/高級(jí)激動(dòng)劑/拮抗劑的用途包括在本發(fā)明中，肽抗原也可 以在肽抗原羧基或氨基末端含有延長(zhǎng)，以促進(jìn)與聚陽(yáng)離子化合物或免 疫刺激性化合物的相互作用。也可對(duì)抗原進(jìn)行^"生化，以包括增強(qiáng)抗原遞呈和將抗原靼向抗原 呈遞細(xì)胞的分子。根據(jù)本發(fā)明，所使用的流行性感冒或肝炎抗原通常不受限于特定 形式，似乎所述作用根據(jù)本發(fā)明對(duì)于流行性感冒、乙型肝炎或丙型肝 炎病原體特異性地進(jìn)一步增強(qiáng)，但是不特異于來(lái)自流行性感冒或HBV 病原體的某個(gè)類型的抗原。然而，在本疫苗中使用標(biāo)準(zhǔn)流行性感冒或 HBV抗原也是優(yōu)選的，即血凝素抗原，神經(jīng)氨酸酶抗原，聯(lián)合抗原或 者一個(gè)或多個(gè)這些抗原的組合。優(yōu)選地，分離自流行性感冒病毒、HBV或HCV來(lái)源(例如細(xì)胞培 養(yǎng)物)或它們重組對(duì)應(yīng)物的蛋白質(zhì)或肽被用作這樣的抗原，包括衍生 化抗原。根據(jù)本發(fā)明的疫苗優(yōu)選地進(jìn)一步(或者，在流行性感冒、HCV或 HBV的情況下特異性地，而不是肽A)含有聚陽(yáng)離子肽，根據(jù)本發(fā)明待使用的聚陽(yáng)離子肽或化合物可以是根據(jù)wo 97/30721任何顯示特征性作用的聚陽(yáng)離子化合物。優(yōu)選的聚陽(yáng)離子化合物選自堿性多肽、有機(jī)聚陽(yáng)離子、堿性聚氨基酸或它們的混合物。這些聚氨基酸應(yīng)當(dāng)具有至少4個(gè)氨基酸殘基的鏈長(zhǎng)度。尤其優(yōu)選地是 含有肽鍵的物質(zhì)，象聚賴氨酸、聚精氨酸以及在多于8個(gè)，尤其是多 于20個(gè)氨基酸殘基的范圍之內(nèi)含有多于20%，尤其是多于50%堿性氨 基酸的多肽或者它們的混合物。其它優(yōu)選的聚陽(yáng)離子和它們的藥物組 合物在WO 97/30721 (例如，聚乙烯亞胺)和WO 99/38528中有描述。 優(yōu)選地這些多肽含有20至500個(gè)之間的氨基酸殘基，尤其是30至200 個(gè)之間的殘基。這些聚陽(yáng)離子化合物可化學(xué)或重組產(chǎn)生或者可從天然來(lái)源衍生。陽(yáng)離子(多聚)肽也可是聚陽(yáng)離子抗細(xì)菌微生物肽。這些(多聚) 肽可以是原核或真核來(lái)源的或者化學(xué)或重組產(chǎn)生的。肽還可以屬于天 然發(fā)生的抗微生物肽類。這樣的宿主防御肽或防御物也是優(yōu)選形式的 根據(jù)本發(fā)明的聚陽(yáng)離子聚合體。通常，允許適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的終末產(chǎn) 物激活(或下調(diào))，優(yōu)選地由APC介導(dǎo)的(包括樹(shù)突細(xì)胞)的化合物 被用作聚陽(yáng)離子聚合體。此外，神經(jīng)活性化合物，例如(人)生長(zhǎng)激素(如例如W0Q1/24822 中描述的)也可用作免疫刺激劑(免疫物)。天然來(lái)源衍生的聚陽(yáng)離子化合物包括HIV-REV或HIV-TAT (衍生 陽(yáng)離子肽、觸角足(antennapedia)肽、殼聚糖(chitosan)或者甲 殼素(chitin)的其它衍生物)或者通過(guò)生化或重組生產(chǎn)從這些肽或 蛋白質(zhì)衍生的其它肽。其它優(yōu)選的聚陽(yáng)離子化合物是cathelin或來(lái)自 cathelicidin的相關(guān)或衍生物質(zhì)，尤其是小鼠、牛或尤其是人 cathelicidin和/或cathelicidin。相關(guān)或衍生的cathelicidin物 質(zhì)含有全部或部分帶有至少15-20個(gè)氨基酸殘基的cathelicidin序 列。衍生化包括天然氨基酸被不屬于20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸中的氨基酸替代 或修飾。另外，可將更多的陽(yáng)離子殘基引入這樣的cathelicidin分子。 這些cathelicidin分子優(yōu)選與根據(jù)本發(fā)明的抗原/疫苗組合物聯(lián)合。 然而，令人驚訝地這些cathelin分子作為抗原的佐劑也是有效的，而 無(wú)需加入更多的佐劑。所以，這樣的cathelicidin分子可用作有或沒(méi)有更多免疫刺激物質(zhì)的疫苗制劑中的有效佐劑。根據(jù)本發(fā)明的疫苗優(yōu)選地含有象肽A KLKL5KLK以及象I-/U-0DN 寡聚d (IC)13 (肽A和寡聚d (IC)u的聯(lián)合也稱為IC31)。這兩個(gè)物 質(zhì)在根據(jù)本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中顯示了特別有利的結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明疫苗可進(jìn)一步地(或者，特別在流行性感冒、HCV或 HBV的情況下，而不是U-/I-0DN)含有作為免疫調(diào)節(jié)核酸的含有CpG-基序的寡聚脫氧核苷酸。根據(jù)本發(fā)明使用的免疫調(diào)節(jié)核酸是可以合成、 原核和真核來(lái)源的。在真核來(lái)源的情況下，DNA基于種系樹(shù) (phylogenetic tree)應(yīng)當(dāng)從較低等發(fā)育種類衍生而來(lái)(例如昆蟲(chóng)， 但是也可是其它)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫原性寡聚脫氧 核香酸(ODN)是合成生產(chǎn)的DNA分子或這類分子的混合物。也包括如 例如美國(guó)專利US 5, 723， 335和US 5,663， 153描述的ODN衍生物或 修飾物例如硫代磷酸酯取代的類似物(替代磷酸酯的硫代磷酸酯殘 基)，以及其它的衍生物和修飾物，優(yōu)選地它們穩(wěn)定免疫刺激組合物 但是不改變它們的免疫特性。優(yōu)選的序列基序是含有側(cè)翼為兩個(gè)5， 噤呤和兩個(gè)3，嘧咬的(非甲基化的)CpG二核苷酸的六堿基DNA基序 (5'-Pur-Pur-C-G-Pyr-Pyr- 30。根據(jù)本發(fā)明ODN中含有的CpG基序 在微生物DNA中比在更高等的脊推動(dòng)物DM中更普遍，并且顯示出甲 基化模式的不同。令人驚訝地，刺激小鼠APC的序列對(duì)人類細(xì)胞不是 非常有效。根據(jù)本發(fā)明使用的優(yōu)選回文或非回文ODN在例如奧地利專 利申請(qǐng)A 1973/2000、 A 805/2001， EP 0 468 520 A2， WO 96/02555， W0 98/16247, W0 98/18810， WO 98/37919， WO 98/40100, WO 98/52581, WO 98/52962， WO 99/51259和WO 99/56755中有公開(kāi)，此處引用作為 參考，ODN/DNA可化學(xué)或重組產(chǎn)生或者從天然來(lái)源衍生。優(yōu)選的天然 來(lái)源是昆蟲(chóng)。根據(jù)本發(fā)明的疫苗可優(yōu)選地包含聚陽(yáng)離子肽與含有CpG基序的寡 聚脫氧核苷酸的組合。在本發(fā)明的過(guò)程中甚至發(fā)現(xiàn)在流行性感冒疫苗 組合物中CpG-ODN和聚陽(yáng)離子肽的組合顯示了改進(jìn)的作用，這與肽A 和I-ZU-ODN組合的作用相當(dāng)，并不是僅僅與肽A和I"VU-ODN聯(lián)合而甚至是替代它們而被使用。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明也可使用不同免疫刺激核
酸(I-/U-ODNs，CpG-ODNs， ..)和肽A變異物(以及其它刺激物)的混 合物。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明也涉及兩個(gè)都根據(jù)本發(fā)明定義的肽A和 I-/U-0DN組合的用途，以改進(jìn)疫苗抗病毒病原體，尤其是流行性感冒 病毒、HCV或HBV、 HIV、 HPV或JEV的保護(hù)效能。特別地，能改進(jìn)疫 苗的抗病毒病原體，尤其是流行性感冒病毒、HCV或HBV、 HIV、 HPV 或JEV的抗原特異性1型應(yīng)答，尤其是IgG2抗體應(yīng)答或IFN-y應(yīng)答， 并且在同一時(shí)間能保存(或優(yōu)選地也增加)所述疫苗的2型應(yīng)答，尤 其是IgGl抗體應(yīng)答或白細(xì)胞介素4 (IL-4)應(yīng)答。
先前顯示(W0 02/13857 )天然發(fā)生的cathelicidin衍生的抗微 生物肽或其衍生物具有免疫應(yīng)答刺激活性，所以構(gòu)成了高效1型誘導(dǎo) 佐劑(免疫物)?？刮⑸镫牡闹饕獊?lái)源是嗜中性粒細(xì)胞和呼吸、胃 腸道和生殖道上皮細(xì)胞的顆粒，通常它們發(fā)現(xiàn)于最常暴露于微生物入 侵的解剖學(xué)位點(diǎn)，分泌到內(nèi)部體液或貯存在專門(mén)噬菌細(xì)胞(嗜中性粒 細(xì)胞)的細(xì)胞質(zhì)顆粒內(nèi)。
在WO 02/32451中，公開(kāi)了能夠很強(qiáng)地增加對(duì)特異性共給予抗原 的免疫應(yīng)答并所以構(gòu)成了高效佐劑的l型誘導(dǎo)佐劑(免疫物)，即包 含序列R廣XZXZJZX-R2的肽A。尤其優(yōu)選的肽是KLKLLLLLKLK。除了天 然發(fā)生的抗微生物肽外，已經(jīng)生產(chǎn)和研究了合成抗微生物肽。在金黃 葡萄糖菌感染的小鼠中顯示合成抗微生物肽KLKLLLLLKLK-NH2具有顯 著的化學(xué)治療活性；人嗜中性粒細(xì)胞被激活經(jīng)由細(xì)胞表面鋦網(wǎng)蛋白 (calreticulin)產(chǎn)生超氧陰離子(02—)。發(fā)現(xiàn)K和L的確切數(shù)目和位 置對(duì)于合成肽的抗微生物活性是關(guān)鍵的(Nakajima， Y. (1997); Cho， J-H. (1999))。
如果例如皮下地、肌內(nèi)注射地、皮內(nèi)地或透皮地給予聯(lián)合藥劑， 本發(fā)明尤其有益。然而，其它的應(yīng)用形式，例如非腸道、靜脈、鼻內(nèi)、 口腔或局部應(yīng)用，也適合本發(fā)明。
根據(jù)本發(fā)明流行性感冒抗原可與佐劑(免疫物)(組合物)混合,或者另外特殊地制成制劑，例如脂質(zhì)體、延遲制劑等等。
根據(jù)本發(fā)明疫苗以流行性感冒疫苗接種領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的有
效量給予個(gè)體?？乖亢兔庖呶锪康淖顑?yōu)化能從已經(jīng)確立的量開(kāi)始并
使用可利用的方法。
本發(fā)明將通過(guò)下面的實(shí)施例和圖例更加詳細(xì)地描述，但是本發(fā)明
當(dāng)然并不局限于這些。
圖l顯示陽(yáng)離子肽與不同ODN共注射協(xié)同誘導(dǎo)抗市售流行性感冒 疫苗的強(qiáng)1型體液應(yīng)答(IgG2b );
圖2顯示KLK/o-d (IC)n強(qiáng)烈地改善市售流行性感冒疫苗的效能；
圖3顯示單次注射KLK/o-d (1013協(xié)同誘導(dǎo)很強(qiáng)的抗市售流行性 感冒疫苗的細(xì)胞1型和體液1型及2型應(yīng)答。
圖4顯示單次注射KLK/o-d (1013很強(qiáng)地改進(jìn)市售流行性感冒病 毒的效能。
圖5顯示用來(lái)自流行性感冒A病毒的ncORF衍生肽聯(lián)合KLK/o-d (IC)"的疫苗接種誘導(dǎo)強(qiáng)產(chǎn)生IFN-y的T細(xì)胞和抗病毒攻擊的保護(hù) 圖6顯示KLK/0-d (IC) 13誘導(dǎo)HCV-肽特異性1型細(xì)胞免疫應(yīng)答 圖7顯示陽(yáng)離子肽與不同0DN共注射誘導(dǎo)HBsAg特異性細(xì)胞1型 應(yīng)答(IFN-y的產(chǎn)生)，而HBsAg誘導(dǎo)的2型應(yīng)答(IL-4的產(chǎn)生)不 受影響或降低。
圖8a顯示一次注射陽(yáng)離子抗微生物肽KLK與合成寡聚脫氧核苷酸 o-d (IC)n(ODNla)和低量市售流行性感冒疫苗"grippal Sl)的聯(lián)
合協(xié)同誘導(dǎo)很強(qiáng)的疫苗特異性細(xì)胞1型免疫應(yīng)答的結(jié)果.
圖8b顯示了一次注射陽(yáng)離子抗微生物肽KLK與合成寡聚脫氧核苷 酸o-d (ICh3(0DNla)和低量市售流行性感冒疫苗(Agrippal Sl)的 聯(lián)合協(xié)同誘導(dǎo)很強(qiáng)的混合1型/2型體液免疫應(yīng)答的結(jié)果。
圖9a:顯示一次注射低劑量的陽(yáng)離子抗微生物肽KLK與合成寡聚 脫氧核苷酸o-d (IC) "(ODNla)的聯(lián)合協(xié)同誘導(dǎo)很強(qiáng)的抗市售流行性 感冒疫苗(Agrippal Sl)的細(xì)胞免疫應(yīng)答的結(jié)果。
圖9b:顯示一次注射低劑量的陽(yáng)離子抗微生物肽KLK與合成寡聚脫氧核苷酸o-d (IC) 13(0DNla)和低量市售流行性感冒疫苗(Agri卯a(chǎn)l Sl)的聯(lián)合協(xié)同誘導(dǎo)很強(qiáng)的混合1型/2型體液免疫應(yīng)答的結(jié)果，
圖IO顯示一次注射市售流行性感冒疫苗(Agrippal Sl)聯(lián)合于 陽(yáng)離子抗微生物肽KLK和合成寡聚脫氧核苷o-d (IC) 13 (ODNla)與聯(lián)合 于其它佐劑比較的結(jié)果。
實(shí)施例:
實(shí)施例1:
陽(yáng)離子肽(pR或KLK)與不同的寡聚脫氧核苷(ODN) (Cp I ， n t C p I ， o-d(IC) 13)共注射協(xié)同誘導(dǎo)很強(qiáng)的抗市售流行性感冒疫苗(Fluvirin) 的1型體液應(yīng)答(IgG2b)。
小鼠 C57BL/6(Harlan/01ac)
流行性感冒疫苗 Fluvirin (Evans vaccine);下列純化的
失活流行性感冒病毒表面抗原(血凝素和
神經(jīng)氨酸酶)
A/NewCaledonia/20/99 (HlNl)樣林 (15ng血凝素)
A/Moscow/10/99 (H3N2)樣林(A/Panama/ 007/99 RESVIR-17)
(15ng血凝素) B/Sichuan/379/99樣林
U5)jg血凝素)
劑量l叫總蛋白/小鼠 A1(0H)3 Alhydrogel; Biosys，丹麥
劑量與抗原1: 1的混合物 pR 有平均43個(gè)精氨酸殘基的多聚化程度的
聚-L-精氨酸(由MALLS測(cè)定的)；Sigma
Aldrich IncKLK
oligo-d (IC)13 (=0DNla)
I-0DN 2
I-ODN 2b
制劑
劑量lOO^ig/小鼠
KLKLLLLLKLK-COOH 由 MPS(Multiple Peptide System, USA)合成 劑量168pg/小鼠
ODN 5'ICI CIC ICI CIC ICI CIC ICI CIC IC3'由 PurimexNucleic Acids Technology, G6ttingen合成 劑量5nmol/鼠
含有脫氧肌苷的^5充代磷酸取代的ODN: tec atg aci ttc ctg atg ct ， 由 Purimex Nucleic Acids Technology, G6ttingen 合成
劑量5訓(xùn)l/鼠
含有脫氧肌苷的ODN: tec atg aci ttc ctg
atg ct ， 由 Purimex Nucleic Acids
Technology, G6ttingen合成
劑量5nmol/鼠
5mM Tris/270mM山梨醇，pH 7
實(shí)驗(yàn)組(12只小鼠/組)
1. 幼稚的
2. 流感(Flu)疫苗
3. 流感疫苗+ pR
4. 流感疫苗+ KLK
5. 流感疫苗+ Al (0H) 3
6. 流感疫苗+ o-d (IC) 13
7. 流感疫苗+ I-ODN 2
8. 流感疫苗+ I-ODN 2b
9. 流感疫苗+ pR +I-0DN 210. 流感疫苗+ KLK + o-d (IC)
11. 流感疫苗+ KLK + I-0DN 2
12. 流感疫苗+ KLK +I—0DN 2b
說(shuō)明書(shū)第14/35頁(yè)
在第0、 28和56天，C57BL/6小鼠雙后足墊皮下注射含有上面列 出的化合物總體積100^1/小鼠(50pl/足墊)。在第26、 54和82天 收集血清，通過(guò)ELISA分析流行性感冒疫苗特異性IgGl和IgG2b抗體。 滴度相應(yīng)于得到半數(shù)最大ODw血清的那個(gè)稀釋度。
圖l指出陽(yáng)離子肽(pR或KLK)和不同的0DN(I-0DN2， I-ODN 2b 或o-d (IC)J的聯(lián)合注射以協(xié)同方式誘導(dǎo)了非常強(qiáng)的抗原(流行性感 冒疫苗)特異性體液1型應(yīng)答(IgG2b)。流行性感冒疫苗單獨(dú)或與Al (0H)3聯(lián)合、陽(yáng)離子肽(pR， KLK)單獨(dú)或不同的ODN(除I-ODN 2夕卜) 單獨(dú)注射后，沒(méi)有特異性IgG2b應(yīng)答可以檢測(cè)的到。加強(qiáng)疫苗接種很 強(qiáng)地增加觀察到的應(yīng)答。
流行性感冒疫苗與A1 (OH)3、 KLK的共注射或聯(lián)合pR/I-ODN 2、 KLK/I-0DN 2、 KLK/I-0DN 2b或KLK/o- d (IC) 13誘導(dǎo)流4亍性感冒疫苗 特異性IgGl的產(chǎn)生(2型應(yīng)答)。
實(shí)施例2:
聯(lián)合KLK/o-d (IC)u很強(qiáng)地改進(jìn)了市售流行性感冒疫苗(Fluvirin) 的效能。
小鼠 BALB/c (Harlan/01ac)
流行性感冒疫苗 Fluvirin (Evans vaccine);下歹'J林純
化的失活流行性感冒疫苗表面抗原(血
凝素和神經(jīng)氨酸酶)<formula>formula see original document page 17</formula>A1(0H)
KLK
oligo-d (IC)13 (-ODNla)
制劑
(A/Panama/2Q07/99 RESVIR-17)
(15jug血凝素) B/Sichuan/379/99樣林
(15 jag血凝素)
劑量lpg總蛋白/小鼠(-低劑量/文獻(xiàn): 10ng/小鼠)
Alhydrogel; Biosys， Denmark 劑量與抗原1: 1的混合物 KLKLLLLLKLK-C00H 由 MPS(Multiple Peptide System, USA)合成 劑量168pg/鼠
ODN 5' ICI CIC ICI CIC ICI CIC ICI CIC
IC3' 由PurimexNucleic Acids
Technology, G6ttingen合成
劑量5nmol/鼠
5mM Tris/270mM山梨醇，pH 7
實(shí)驗(yàn)組(12只小鼠/組)
1. 幼稚的
2. 流感疫苗
3. 流感疫苗+ Al (0H)3
4. 流感疫苗+ KLK + o-d (IC)13
在第0、 28和56天BALB/c小鼠雙后足墊皮下注射含有上面列出 的化合物總體積100jal/小鼠(50pl/足墊)。在第26、 54和82天收 集血清并使用標(biāo)準(zhǔn)血凝應(yīng)答抑制試驗(yàn)分析中和抗血凝素抗體。簡(jiǎn)要地， 病毒表面上血凝素的存在誘導(dǎo)紅細(xì)胞的血凝應(yīng)答，這能被中和抗血凝 素抗體抑制。測(cè)定抗不同病毒抹(A1 = A/NewCaledonia/20/99 (H1N1) 樣林；A2= A/Panama/2007/99RESVIR-17; B = B/Sichuan/379/99樣 林)血凝素的抗體的滴度。血清的滴度相應(yīng)于顯示抑制的終點(diǎn)稀釋度。與流行性感冒疫苗單獨(dú)或和Al (0H)3聯(lián)合的注射相反，流行性感 冒疫苗加上KLK和o-d (10 的共注射誘導(dǎo)高水平的抗所有三種受試 血凝素的中和抗體(圖2)。因?yàn)橐呀?jīng)顯示流行性感冒疫苗的有效性 與抗血凝素抗體的血清滴度相關(guān)，得到的結(jié)果指出KLK/o-d (1013誘 導(dǎo)抗流行性感冒的保護(hù)的很高的潛能。
實(shí)施例3:
單次注射陽(yáng)離子抗微生物肽KLK和合成寡聚脫氧核苷酸o-d (ICL的聯(lián)合協(xié)同誘導(dǎo)很強(qiáng)的抗市售流行性感冒疫苗(Agrippal Sl)的 細(xì)胞1型和體液1型/2型免疫應(yīng)答
材料 小鼠
流行性感冒疫苗
BALB/c (Harlan-Winkelmaiin，德國(guó)) Agrippal SI(Chiron SpA， Italyj season2002/2003);來(lái)自下列林失活的純 化流行性感冒病毒抗原(血凝素和神經(jīng)氨
A/NewCaledonU/20/99 (H1N1)樣林 (A/New Caledonia/20/99 IVR-116) A/Moscow/10/99 (H3N2)樣林 (A/Panama/2007/99 RESVIR-17) B/ HongKong/33 0/2001樣林
(B/Shangdong/7/97) 總抗原含量45ng (對(duì)于每個(gè)抗原15叫)； 批號(hào)4307;失效日期05/2003
劑量lng總蛋白/小鼠 F/i/ad (Chiron SpA， 意大利；season 2002/2003);來(lái)自下列林失活的純化流行 性感冒病毒抗原(血凝素和神經(jīng)氨酸酶)A/NewCaledonia/20/99 (HlNl)樣株 (A/New Caledonia/20/99 IVR-116) , A/Moscow/10/99 (H3N2)樣林 (A/Panama/2007/99 RESVIR17) (B/Shangdong/7/97)
總抗原量45^g (對(duì)于每個(gè)抗原15ng);
MF59C. l作為佐劑加入
批號(hào)3403;失效日期05/2003
劑量lng總蛋白/小鼠 oligo-d (IC)13 (=0DNla) ODNICI CIC ICI CIC ICI CIC ICI CIC
IC3'由 PurimexNucleic Acids
Technology, G6tt ingen合成
劑量0. 4nmol/鼠 KLK KLKLLLLLKLK-COOH 由 MPS (Multiple
Peptide System, USA)合成
劑量10nmol/小鼠 制劑 lOmMs Tris/135mM NaCl; pH— 7
實(shí)驗(yàn)設(shè)置(10只小鼠/組)
1. 幼稚的
2. Agrippal SI
3. Fluad
4. Agrippal SI + KLK +o-d (IC)13
在笫0天，BALB/c小鼠雙后股骨肌內(nèi)注射含有上面列出的化合物 總量IO(HU疫苗/小鼠(50pl/肌肉)。在第21天收集血清并且用ELISA 分析流行性感冒疫苗特異性IgGl和IgG2a抗體。滴度相應(yīng)于得到半數(shù) 最大OD405nm血清的稀釋度。另外，合并每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的脾并且制備單 個(gè)細(xì)胞懸浮液。脾細(xì)胞的分裝物用磁性分揀試劑盒(CD4 MACS sort,Miltenyi)分開(kāi)為CD4+T細(xì)胞。為了計(jì)數(shù)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組Agrippal Sl抗 原特異性產(chǎn)細(xì)胞因子的細(xì)胞的數(shù)目，在96孔ELIspot平板中對(duì)未分開(kāi) 的脾細(xì)胞或分開(kāi)的CD4+T細(xì)胞聯(lián)合經(jīng)照射的抗原遞呈細(xì)胞(APC;來(lái)源 于幼稚小鼠的)進(jìn)行刺激。分析下面細(xì)胞因子的產(chǎn)生IFN-y (作為細(xì)胞1型應(yīng)答的指示物)，IL-4和IL-5 (作為細(xì)胞2型應(yīng)答的指示物)結(jié)果(圖3a)低量流行性感冒疫苗Agrippal Sl (未加佐劑的)和Fluad (加了 MF59佐劑的)單獨(dú)注射不能誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生疫苗(AgrippalSl)特 異性的IFN-y,而Agrippal Sl與KLK/o-d (1013聯(lián)合注射后，觀察 到CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生很強(qiáng)的疫苗(Agrippal Sl)特異性IFN-y。與幼稚小 鼠相比，單獨(dú)Agrippal Sl僅略微誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-4， KLK/o-d (IC)u加入到疫苗未顯示進(jìn)一步地增加。然而，F(xiàn)luad是CD4+T細(xì)胞產(chǎn) 生IL-4以及未分開(kāi)的脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-5有力的誘導(dǎo)劑。在Agrippal Sl 單獨(dú)注射后僅可檢測(cè)到很低水平的IL-5，但是在與KLK/o-d (1013的 聯(lián)合就檢測(cè)不到。未分開(kāi)脾細(xì)胞的再刺激之后，得到相似的結(jié)果。結(jié)果(圖3b)圖3b顯示加佐劑的流行性感冒疫苗Fluad單獨(dú)注射誘導(dǎo)很強(qiáng)的疫 苗(Agrippal Sl)特異性體液2型應(yīng)答(IgGl),但僅僅微弱的1型應(yīng) 答(IgG2a)。然而，未加佐劑的流行性感冒疫苗與KLK/o-d (IC)u 的聯(lián)合注射誘導(dǎo)了非常強(qiáng)的疫苗(AgrippalSl)特異性IgG2a (體液 l型免疫應(yīng)答)以及比單獨(dú)Agrippal Sl更高水平的IgGl。因?yàn)榭沽?行性感冒的保護(hù)與疫苗抗原特異性IgG2a抗體的存在相關(guān)，得到的結(jié) 果指出KLK/o-d (1013作為流行性感冒疫苗有效佐劑的很高的潛能。實(shí)施例4:聯(lián)合KLK/o-d (1013—次注射后很強(qiáng)地改善了市售流行性感冒疫苗(Agrippal Sl)的效能 材料小鼠 BALB/c (Harlan-Winkelmann，德國(guó))流行性感冒疫苗 ^^r/; /7a/ 57 (Chiron SpA， Italy;season2002/2003);下列林純化的失活流行性 感冒病毒抗原(血凝素和神經(jīng)氨酸酶) A/NewCaledonia/20/99 (HlNl)樣林(A/New Caledonia/20/99 IVR-116) A/Mos歸/10/99 (H3N2)樣抹(A/Panama/2007/99 RESVIR-17) B/ HongKong/33 0/2001樣林(B/Shangdong/7/97) 總抗原量45^g (對(duì)于每個(gè)抗原15jiig); 批號(hào)4307;失效日期05/2003 劑量lpg總蛋白/小鼠Fluad (Chiron SpA，意大利； season 2002/2003);下列林純化的失活流行性感冒病 毒抗原(血凝素和神經(jīng)氨酸酶) A/NewCaledonia/20/99 (HlNl)樣林 (A/New Caledonia/20/99 IVR-116) A/Moscow/10/99 (H3N2)樣林 (A/Panama/2007/99 RESVIR 17)(B/Shangdong/7/97) 總抗原量45pg (對(duì)于每個(gè)抗原15ng);MF59C. 1 作為佐劑的加入 批號(hào)3403;失效日期05/2003劑量lpg總蛋白/小鼠o-d (IC)13 (-ODNla) ODNICI CIC ICI CIC ICI CIC ICI CIC IC3'由 Purimex Nucleic Acids Technology,G6ttingen合成劑量0. 5nmol/小鼠 KLK KLKLLLLLKLK-C00H由MPS (Multiple PeptideSystem, USA)合成劑量10nmol/小鼠 制劑 10mM Tris/270mM山梨醇，pH 一 7實(shí)驗(yàn)設(shè)置(10只小鼠/組)1. 幼稚的2. Agrippal SI3. Fluad4. Agrippal SI + KLK + o-d (IC)在第0天，BALB/c小鼠雙后股骨肌內(nèi)注射含有上面列出的化合物 總量100^1疫苗/小鼠(50nl/肌肉)。在第21天，收集血清并且使 用人類血清標(biāo)準(zhǔn)血凝素抑制(HI)試驗(yàn)分析中和抗血凝素抗體。測(cè)定 抗來(lái)源于流行性感冒疫苗Aggripal SI和Fluad不同病毒林(見(jiàn)材料) 的抗體的滴度。結(jié)果(圖4)與單獨(dú)Agrippal SI的注射相反，流行性感冒疫苗與低量KLK/o-d (IC)13的共注射很強(qiáng)地誘導(dǎo)了抗兩個(gè)受試流行性感冒A抹(A/New Caledonia/20/99; A/Panama/2007/99)的中和抗體水平的增加。然而， 用Fluad的疫苗接種誘導(dǎo)了與Agrippal SI和低量KLK/o-d (IC)"的 共注射水平相同的中和抗體。因?yàn)橐呀?jīng)顯示流行性感冒疫苗的有效性 與抗血凝素抗體的血清滴度相關(guān)，本結(jié)果指出KLK/o-d (IC)n作為佐 劑誘導(dǎo)抗流行性感冒的保護(hù)很高的潛能。實(shí)施例5:用來(lái)自流行性感冒A病毒的ncORF衍生肽聯(lián)合KLK/o-d (1013對(duì) 小鼠的疫苗接種。在疫苗接種后7天測(cè)量特異性T細(xì)胞應(yīng)答，動(dòng)物隨 后用致死劑量小鼠適應(yīng)的流行性感冒A病毒(x31)刺激(chal lenge )。 監(jiān)測(cè)存活15天。材料小鼠 C57B1/6 (Harlan-Winkelmann， Germany)肽 p82 (GLCTLVAML)來(lái)源于EBV的對(duì)照肽；HLA-A*0201; AA開(kāi)始點(diǎn)280p1574 (IASNE腿TM)來(lái)源于流行性感冒核蛋白質(zhì)的對(duì)照肽，AA開(kāi)始 點(diǎn)365pi569 (TMLY腿EF)來(lái)自片斷1 、框架1 、 0RF1的流感ncORF衍生肽， AA開(kāi)始點(diǎn)569 p1600 (SSIAAQDAL)來(lái)自片斷3、框架6、ORF2的流感ncORF衍生肽，AA開(kāi)始點(diǎn)83P1664 (VTILNLALL)來(lái)自片斷4、框架5、ORF6的流感ncORF衍生肽，AA開(kāi)始點(diǎn)9劑量100ng/肽/小鼠 o-d (IC)13 0DN5"CI CIC ICI CIC ICI CIC ICI CIC IC3'(=ODNla) 由 Purimex Nucleic Acids Technology,G6ttingen合成劑量0. 5nmol/鼠KLK KLKLLLLLKLK-C00H由MPS (Multiple Peptide System, USA)合成劑量127nmol/小鼠 制劑 270mM山梨醇/ lOmM Hepes流行性感冒A 病毒x31，小鼠適應(yīng)的流行性感冒A病毒，rec.病毒，來(lái)源于A/Pr/8/34(seg 1， 2， 3， 5， 7, 8)和A/Aichi/2/68 (seg 4， 6)實(shí)驗(yàn)設(shè)置(15只小鼠/組)1. p1574 + KLK + o-d (IC)132. pl569 + KLK + o-d (IC)133. pl600 + KLK + o-d (IC)134. pl664 + KLK + o-d (IC)135. pl600 + pl569 + KLK + o-d (IC)在第0天小鼠雙后足墊皮下注射含有上面列出的化合物總量 100pl疫苗/小鼠(50jiil/足墊)。在第7天，為了計(jì)數(shù)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組產(chǎn) 肽特異性IFN-y細(xì)胞的數(shù)目，在96孔ELIspot平板中刺激來(lái)自5只小 鼠的未分開(kāi)脾細(xì)胞。剩下的IO只小鼠用小鼠適應(yīng)的x31流行性感冒A病毒(5*10E5 pfu) 進(jìn)行攻擊。監(jiān)測(cè)存活15天。結(jié)果ELIspot (圖5a)組1和3(肽p1574和p1600 )的脾細(xì)胞在用各自的肽再刺激后未 顯示任何特異性的斑點(diǎn)。組2和4 (pl569和pl664 )在再刺激后特異 性地釋放IFN，。組5用兩個(gè)單獨(dú)的肽(不是混合物，pl600和p1569 ) 進(jìn)行疫苗接種。用兩個(gè)肽的混合或pl569再刺激后，檢測(cè)到特異性的 細(xì)胞因子釋放。相反，用pl600單獨(dú)再刺激后，沒(méi)有檢測(cè)到IFN，。這與組3 (pl600單獨(dú)) 一致。 結(jié)果攻擊(圖5b)圖5b顯示用致死劑量小鼠適應(yīng)的流行性感冒A病毒x31刺激小鼠 的存活率，組l (pl574，報(bào)告的H2-Db保護(hù)抗原決定簇)保護(hù)了 30% 的所有受刺激小鼠。肽pl569根本不提供保護(hù)(0%)。相反，肽pl600 和p1664分別保護(hù)了 50%和62%的受刺激動(dòng)物。當(dāng)動(dòng)物用兩個(gè)不同的肽 (組5，肽p1600和p1569 )進(jìn)行疫苗接種時(shí)一共70%的動(dòng)物受到保護(hù)，實(shí)施例6:用五個(gè)不同HCV衍生肽的聯(lián)合注射、抗微生物肽KLK和合成寡聚 核苷酸o-d (1013誘導(dǎo)很強(qiáng)的HCV特異性1型細(xì)胞應(yīng)答 小鼠 HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠(HHD. 1)肽 肽p83、 p84、 p87、 p89、 pl426用于疫苗接種。p83: HCV衍生肽， (KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL) p84: HCV衍生肽， (GYKVLVLNPSVAAT) p87: HCV衍生肽， (DLMGYIPAV) p89: HCV衍生肽， (CINGVCWTV) p1426 : HCV衍生肽， (匿N(xiāo)F ISGIQ YL AGLSTLPGNP A) (pl274作為不相關(guān)肽用于再刺激 (YMDGTMSQV ; HLA-A*0201限制的) 所有肽用標(biāo)準(zhǔn)固相F-moc合成進(jìn)行合KLKoligo-d (IC)13 (=0DNla)制劑成、HPLC純化并用質(zhì)譜法分析純度。 劑量20pg/肽/小鼠 KLKLLLLLKLK-COOH由MPS (Multiple Peptide System, USA)合成 劑量10nmol/小鼠ODNICI CIC ICI CIC ICI CIC ICI CICIC3' 由Purimex Nucleic AcidsTechnology, Got t ingen合成劑量0. 4nmol/鼠lOmM Tris/135mM NaCl， pH —7實(shí)驗(yàn)設(shè)置(5只小鼠/組)1. HCV肽2. 戲肽+ KLK + o-d (IC)13在第0、 14和28天，HHD. 1小鼠雙后足墊皮下注射含有上面列出 的化合物總量鼠(50nl/足塾)。在第35天(最后一次疫苗 接種后7天)用磁性分開(kāi)試劑盒(MACS, Miltenyi)從脾細(xì)胞的單個(gè) 細(xì)胞舉浮液分離CDf以及CDrr細(xì)胞，T細(xì)胞用培養(yǎng)液孵育(背景對(duì)照) 或在有用于疫苗接種不同的肽或不相關(guān)肽p1274的存在下用來(lái)自幼稚 HHD. 1小鼠經(jīng)照射的脾細(xì)胞作為APC進(jìn)行再刺激。過(guò)夜孵育后，用 ELIspot試驗(yàn)分析IFN-"y的產(chǎn)生。圖6顯示KLK/o-d (IC)u和五個(gè)HCV衍生肽共注射后，誘導(dǎo)抗p84、 p87、 p89、 p1426 CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生高量的IFN- <y。此外，可檢測(cè)到抗 p87、 p89 CD8+t細(xì)胞產(chǎn)生很強(qiáng)的IFN-y。實(shí)施例7:陽(yáng)離子肽與不同寡聚脫氧核苷酸(ODN) (CpI， ntCpI， o-d (IC)")共注射協(xié)同誘導(dǎo)很強(qiáng)的抗肝炎B表面抗原的l型細(xì)胞應(yīng)答(IFN-y)小鼠 抗原 Al (OH)PRKLKI-ODN 2I一ODN 2bo-d (IC)13 HDNla)制劑C57BL/6 (Harlan-Winkelmann, 德國(guó))；對(duì)HBsAg特異性免疫應(yīng)答低應(yīng)答的小鼠乙型肝炎表面抗原(HBsAg)劑量5pg/小鼠Alhydrogel; Biosys， 丹麥劑量與抗原1: 1的混合物有平均43個(gè)精氨酸殘基多聚程度的聚-L-精氨酸(由MALLS測(cè)定)；Sigma Aldrich Inc劑量100ng/小鼠KLKLLLLLKLK一C00H由MPS (Multiple Peptide System, USA)合成 劑量168pg/小鼠(- Cpl 2)含有脫氧肌苷的硫代磷酸替代的 ODN: 5'tec atg aci Uc ctg atg ct3'由 Purimex Nucleic Acids Technology, G6ttingen合成 劑量5nmol/小鼠(-CpI 2b)含有脫氧肌苷的ODN: 5'tec atg aci ttc ctg atg ct3'由Purimex Nucleic Acids Technology, G6ttingen合成 劑量5nmol/小鼠ODN 5'ICI CIC ICI CIC ICI CIC ICI CIC IC3'由 Purimex Nucleic Acids Technology,G6ttingen合成劑量5nmol/小鼠5mM Tris/270mM山梨醇，pH 7實(shí)驗(yàn)設(shè)置(5只小鼠/組/時(shí)間點(diǎn))1. HBsAg2. HBsAg + Alum3. HBsAg + I-0DN 24. HBsAg + I-ODN 2b5. HBsAg + o-d (IC)136. HBsAg + pR7. HBsAg + KLK8. HBsAg + pR + I-ODN 29. HBsAg + pR + I-ODN 2b10. HBsAg + pR + o-d (IC)1311. HBsAg + KLK + I-ODN 212. HBsAg + KLK + I-ODN 2b13. HBsAg + KLK + o-d (IC)在第0天和第56天，小鼠右側(cè)皮下注射含有上面列出的化合物總 體積100nl/小鼠。分別在第一和二次注射后第7天、第21天和第50 天，進(jìn)行免疫應(yīng)答的分析。每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)五只小鼠的脾細(xì)胞用 10pg/ml HBsAg離體(ex vivo )再刺激，為了分析HBsAg特異性IFN~y (1型免疫應(yīng)答)以及IL-4 (2型免疫應(yīng)答)的產(chǎn)生進(jìn)行ELIspot試 驗(yàn)。結(jié)果(圖7)HBsAg單獨(dú)或和Alum聯(lián)合注射并不誘導(dǎo)或僅誘導(dǎo)非常低水平的 IFN-y，而HBsAg聯(lián)合pR/ODN或KLK/ODN注射后，誘導(dǎo)了 HBsAg特異 性IFN，的產(chǎn)生，強(qiáng)化疫苗接種能進(jìn)一步地增加IFN，的產(chǎn)生。與HBsAg 單獨(dú)注射相比強(qiáng)化之后Alum、 pR和KLK共注射以及KLK/ODN聯(lián)合共注射后觀察到略微增加的IL-4的產(chǎn)生。實(shí)施例8:陽(yáng)離子抗微生物肽KLK與合成寡聚脫氧核苷酸o-d (IC)n (0DNla) 和低量市售流行性感冒疫苗(AgrippalSl)聯(lián)合的一次注射協(xié)同誘導(dǎo) 很強(qiáng)的疫苗特異性細(xì)胞1型應(yīng)答。材料小流行性感冒疫苗o-d (IC)13 (=0DNla)BALB/c (Harlan-Winkelmann，德國(guó)) Agri卯a(chǎn)l SI (Chiron SpA，意大利；疫苗接 種季節(jié)2003/2004);批號(hào)035105,失效曰期 06/2004下列林純化的失活流行性感冒病毒抗原(血凝 素和神經(jīng)氨酸酶) A/NewCaledonia/20/99 (HlNl)樣林(A/New Caledonia/20/99 IVR-116) A/Moscow/10/99 (H3N2)樣林(A/Panama/20(n/99 RESVIR 1" B/Hong Kong/330/2001-樣林(B/Shangdong/7/97) 總抗原含量45叫血凝素(每個(gè)病毒林15叫) 劑量9叫總蛋白質(zhì)/小鼠(直接從預(yù)填注射器 使用的)0.1ng總蛋白質(zhì)/小鼠 含有13個(gè)脫氧(-肌苷、-胞嘧啶)基序(ICICIC ICI CIC ICI CIC ICI CIC IC)的磷酸二酯替 代的ODN; 由Transgenomics合成；部分號(hào) 102A03001N。 劑量4nmol/小鼠1. 4nmol/小鼠 0. 4畫(huà)l/小鼠KLK 含有賴氨酸和亮氨酸的合成陽(yáng)離子聚氨基酸(KLKLLLILKLK-C00H);由Bachem AG合成 批號(hào)0562101 劑量100nmol/小鼠 35nmol/小鼠 10nmol/小鼠制劑 由Intercell的藥物開(kāi)發(fā)部制成；10mMTris/135mM NaCl pH 7.5實(shí)驗(yàn)設(shè)置(10小鼠/組)1. 幼稚的2. 9pg Agrippal Sl3. 0. ljig Agrippal Sl4. 0. lpg Agrippal Sl + IOO畫(huà)I KLK + 4麵1 ODNla5. 0. l^ig Agrippal Sl + 35nmol KLK +1.4nmol ODNla6. 0. lpg Agrippal Sl +10nmol KLK + 0. 4麵1 ODNla在第0天，BALB/c小鼠雙股骨肌內(nèi)注射含有上面列出的化合物總 量lOOul疫苗/小鼠(50^1 /肌肉)。在第21天，收集血清并用ELISA 分析流行性感冒疫苗特異性IgGl和IgG2a抗體。滴度相應(yīng)于得到半數(shù) 最大OD405nm的血清稀釋度。此外，合并每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的脾并制備單個(gè) 細(xì)胞懸浮液。脾細(xì)胞的分裝物用磁性分揀試劑盒(CD4和CD8 MACS sort, Miltenyi)分開(kāi)為CD4+和CD8+T細(xì)胞。為了計(jì)數(shù)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組 Agrippal Sl抗原特異性產(chǎn)細(xì)胞因子的細(xì)胞的數(shù)目，在96孔ELIspot 平板中刺激未分開(kāi)的脾細(xì)胞或分開(kāi)的CD4+和CD8+T細(xì)胞聯(lián)合經(jīng)照射的 抗原遞呈細(xì)胞(APC;來(lái)源于幼稚小鼠的)。分析下面細(xì)胞因子的產(chǎn)生IFN-y (作為細(xì)胞1型應(yīng)答的指示物)，IL-4和IL-5 (作為細(xì)胞2型應(yīng)答的指示物)結(jié)果(圖8a)單獨(dú)用9pg和0. lpg Agrippal Sl的疫苗接種不能夠誘導(dǎo)CD4+ 脾細(xì)胞產(chǎn)生疫苗特異性IFN-y，而Agrippal Sl聯(lián)合不同濃度KLK/o-d (IC)n注射后，觀察到CD4+T脾細(xì)胞產(chǎn)生很強(qiáng)的IFN-y。然而，CD8+脾 細(xì)胞不能誘導(dǎo)ifn-y。與幼稚小鼠相比，單獨(dú)Agrippal Sl僅略微誘 導(dǎo)了未分開(kāi)的和CD4+脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-4， KLK/o-d (1013加入到疫苗中 未顯示進(jìn)一步地增加。然而，KLK/o-d (IC)n共注射后Agrippal Sl 誘導(dǎo)IL-5被完全消除。結(jié)果(圖8b)如圖8b闡明地，低量無(wú)佐劑的流行性感冒疫苗與不同濃度 KLK/o-d (IC)13的聯(lián)合注射誘導(dǎo)非常強(qiáng)的疫苗(AgrippalSl)特異性 IgG2a (體液1型免疫應(yīng)答)和比低量AgrippalSl單獨(dú)更高水平的 IgGl。然而，高劑量的AgrippalSl顯示了最高滴度的疫苗特異性IgGl 抗體。因?yàn)榭沽餍行愿忻氨Ｗo(hù)與疫苗抗原特異性IgG2a抗體的存在相 關(guān)，得到的結(jié)果指出KLK/o-d (IC)n作為流行性感冒疫苗有效佐劑的 很高的潛能。實(shí)施例9:陽(yáng)離子抗微生物肽KLK和合成寡聚脫氧核苷酸0-d (IC) 13 (0DNla) 聯(lián)合的低劑量一次注射協(xié)同誘導(dǎo)很強(qiáng)的抗市售流行性疫苗(Agrippal Sl)的疫苗特異性細(xì)胞I型免疫應(yīng)答材料小鼠 BALB/c (HarUn-Winkel陽(yáng)n,德國(guó))流行性感冒疫苗 AgrippalSl (Chiron SpA，意大利；疫苗接種季節(jié)2003/2004); 批號(hào)035105，失效日期06/2004 下列林純化的失活流行性感冒病毒抗原(血凝素和神經(jīng)氨酸酶) A/NewCaledonia/20/99 (隨l)樣林(A/New Caledonia/20/99 IVR-116) A/Moscow/10/99 (H3N2)樣林(A/Panama/2007/99 RBSVIR 17) B/Hong Kong/330/2001-樣林(B/Shangdong/7/97) 總抗原含量45pg血凝素(每個(gè)病毒林 15|ng)劑量9pg總蛋白質(zhì)/小鼠(直接從預(yù)填注 射器使用的) l網(wǎng)總蛋白質(zhì)/小鼠 o-d (IC)13 (-0DNla)含有13個(gè)脫氧(-肌苷、-胞嘧啶)基序(ICICIC ICI CIC ICI CIC ICI CIC IC)的碌酸 二酉旨替代的ODN; 由Transgenomics合成； 部分號(hào)102A03001N。 劑量0. 4nmol/小鼠0. 2畫(huà)l/小鼠0. 04畫(huà)1/小鼠KLK 含有賴氨酸和亮氨酸的合成陽(yáng)離子聚氨基酸(KLKLLLILKLK-C00H);由Bachem AG合 成批號(hào)0562101 劑量10nmol/小鼠5nmol/小鼠lnmol/小鼠制劑 由Intercell的藥物開(kāi)發(fā)部制成；10mMTris/135mM NaCl pH 7.5實(shí)驗(yàn)設(shè)置(5只小鼠/組)1. 幼稚的2. 9pg Agrippal Sl3. ljxg Agrippal Sl4. lpg Agrippal Sl + IO畫(huà)I KLK + 0. 4訓(xùn)1 ODNla5. lpg Agrippal Sl + 5畫(huà)1 KLK + 0. 2畫(huà)1 ODNla6. l^ig Agrippal Sl +lnmol KLK + 0. 04畫(huà)1 ODNla在第0天，BALB/c小鼠雙股骨肌內(nèi)注射含有上面列出的化合物總 量lOOpl疫苗/小鼠(50jli1 /肌肉)。在第21天，收集血清并用ELISA 分析流行性感冒疫苗特異性IgGl和IgG2a抗體。梯度相應(yīng)于得到半數(shù) 最大OD40Snm的血清稀釋度。此外，合并每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的脾并制備單個(gè) 細(xì)胞懸浮液。為了計(jì)數(shù)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組Agrippal Sl抗原特異性產(chǎn)細(xì)胞因 子的細(xì)胞的數(shù)目，在96孔ELIspot平板中刺激脾細(xì)胞。分析下面細(xì)胞 因子的產(chǎn)生IFN-y (作為細(xì)胞1型應(yīng)答的指示物)， IL-4和IL-5 (作為細(xì)胞2型應(yīng)答的指示物)結(jié)果(圖9a)單獨(dú)用9ng和liig Agrippal Sl對(duì)小鼠的疫苗接種仍然不能(也 見(jiàn)圖8a)誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生疫苗特異性IFN，，而Agrippal Sl聯(lián) 合不同低濃度的KLK/o-d (IC)"注射后，觀察到很強(qiáng)的IFN，的產(chǎn)生. 與幼稚小鼠相比，Agrippal Sl單獨(dú)僅略微誘導(dǎo)了小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生 IL-4， KLK/o-d (1013加入到疫苗沒(méi)有作用。KLK/o-d (IC)n共注射后 Agrippal Sl誘導(dǎo)的IL-5劑量依賴性地被消除。甚至在很低的劑量， KLK/o-d (1013的聯(lián)合誘導(dǎo)很強(qiáng)的細(xì)胞I型免疫應(yīng)答。結(jié)果(圖9b)低量無(wú)佐劑的流行性感冒疫苗與不同濃度KLK/o-d (IC)u的聯(lián)合注射誘導(dǎo)非常強(qiáng)的疫苗(Agrippal Sl)特異性IgG2a (體液1型免疫應(yīng) 答)和與低量單獨(dú)Agrippal Sl大致同等(comparable )水平的IgGl. 然而，單獨(dú)高劑量的AgrippalSl顯示了略微增加的疫苗特異性IgGl 抗體滴度以及與Agrippal SI和最低濃度KLK/o-d (1013共注射相比 相當(dāng)水平的IgG2a抗體.因?yàn)榭沽餍行愿忻暗谋Ｗo(hù)與疫苗抗原特異性 IgG2a抗體的存在相關(guān)，得到的結(jié)果指出KLK/o-d (IC)"，甚至在非 常低的劑量，作為流行性感冒疫苗有效佐劑的很高的潛能。實(shí)施例10市售流行性感冒疫苗(Agrippal Sl)聯(lián)合于陽(yáng)離子抗微生物肽KLK 和合成寡聚脫氧核苷酸o-d (IC)n (ODNla)的一次注射與聯(lián)合于其它 佐劑的比較種季節(jié)2003/2004);批號(hào)035105，失效日期 06/2004Fluad (Chiron SpA，意大利；疫苗接種季節(jié) 2003/2004); 批號(hào)4003， 失效日期 05/2004 ; MF59C作為佐劑的加入 兩個(gè)疫苗含有下列林純化的失活流行性感冒 病毒抗原(血凝素和神經(jīng)氨酸酶) A/NewCaledonia/20/99 (HlNl)樣林(A/New Caledonia/20/99 IVR-116) A/Moscow/10/99 (H3N2)樣林(A/Panama/2007/" RESVIR 17) B/Hong Kong/330/2001-樣林(B/Shangdong/7/97)材料小鼠流行性感冒疫苗BALB/c (Harlan-Winkelmaim，德國(guó)) Agrippal SI (Chiron SpA，意大利；疫苗接總抗原含量45^ig血凝素(每個(gè)病毒株15^g )
劑量9pg總蛋白質(zhì)/小鼠(直接從預(yù)填注射
器使用的)
lpg總蛋白質(zhì)/小鼠 o-d (IC)" (-0DNla) 含有13個(gè)脫氧(-肌苷、-胞嘧啶)基序(ICI
CIC ICI CIC ICI CIC ICI CIC IC)的辨酸二
酯替代的0DN;由Transgenomics合成；部分
號(hào):I02A03001N.
劑量0. 4nmol/小鼠 KLK 含有賴氨酸和亮氨酸的合成陽(yáng)離子聚氨基酸
(KLKLLLILKLK-C00H);由Bachem AG合成
批號(hào)0562101
劑量100nmol/小鼠 10nmol/小鼠
CpG1668 含有CpG基序(5'-tcc atg acg Uc ctg
atgct-3')的硫代磷酸替代的ODN;由Purimex Nucleic Acids Technology, Gttingen合成j 批號(hào)020614 劑量5nmol/小鼠
Alum Al (OH)3[15g/l];由Chiron Behring,德國(guó)
提供
劑量與抗原1: 1混合物 pR 有平均43個(gè)精氨酸殘基多聚程度的聚 -L-精氨酸(由MALLS測(cè)定);由Sigma提供； 批號(hào)50K7280; 劑量100ng/小鼠 IFA 不完全Freud氏佐劑；由Dif co實(shí)驗(yàn)室提供；
批號(hào)2158430 劑量與抗原1: 1混合物CFA 完全Freud氏佐劑；由Difco實(shí)驗(yàn)室提供；
批號(hào)3126639
劑量與抗原1:1混合物 制劑 Intercell 的藥物開(kāi)發(fā)部制成；10mM
Tris/135mM NaCl pH 7. 5
實(shí)驗(yàn)設(shè)置(5只小鼠/組)
1. 幼稚的
2. 9pg Fluad
3. 9pg Agrippal Sl
4. l]iig Agrippal Sl
5. ljig Agrippal Sl +10畫(huà)1 KLK + 0. 4畫(huà)1 0DNla
6. lpg Agrippal Sl + 5nmo1 CpG1668
7. lpg Agrippal Sl + lOOpg pR43
8. l|ng AgrippalSl十100訓(xùn)1 KLK
9. lpg AgrippalSl + Alum
10. l^ig Agrippal Sl + CFA
11. l^ig Agrippal Sl + IFA
在第0天，BALB/c小鼠雙股骨肌內(nèi)注射含有上面列出的化合物總 量100)il疫苗/小鼠(50nl /肌肉)。在第21天，合并每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的 脾并制備單個(gè)細(xì)胞懸浮液。為了計(jì)數(shù)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組Agrippal Sl抗原特 異性產(chǎn)細(xì)胞因子的細(xì)胞的數(shù)目，在96孔ELIspot平板中刺激脾細(xì)胞。 分析下面細(xì)胞因子的產(chǎn)生
IFN，(作為細(xì)胞1型應(yīng)答的指示物)，
IL-4和IL-5 (作為細(xì)胞2型應(yīng)答的指示物)
結(jié)果(圖IO)
與單獨(dú)用Agrippal Sl和Fluad疫苗接種相比低量無(wú)佐劑的流行 性感冒疫苗和低劑量KLK/o-d (IC)u的聯(lián)合注射誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生更高水平的疫苗(Agrippal Sl)特異性IFN-y。只在用CFA疫苗接種后 獲得等同量的IFN~7，與單獨(dú)Agrippal Sl相比所有其它實(shí)驗(yàn)組大致 顯示小鼠脾細(xì)胞沒(méi)有(pR43、 Alum、 IFA)或有略微增加的(CpG1668、 KLK) IFN-Y的產(chǎn)生。與幼稚小鼠相比，只有Fluad顯著誘導(dǎo)小鼠脾細(xì) 胞產(chǎn)生IL-4而所有其它實(shí)驗(yàn)組幾乎顯示同樣低水平的IL-4。疫苗抗 原特異性IL-5在用Fluad對(duì)小鼠疫苗接種后可檢測(cè)到非常高的水平， 在單獨(dú)Agrippal Sl或與KLK聯(lián)合的注射后可檢測(cè)到中等水平《> Agrippal Sl與pR、 Alum或IFA共注射僅顯示略微增加水平的IL-5， 而所有其它組顯示IL-5產(chǎn)生的降低。
權(quán)利要求
1.用于預(yù)防病毒感染的疫苗，包含-HBV抗原、-KLKL5KLK和-寡聚d(IC)13。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的疫苗，特征在于它進(jìn)一步舍有A1(0H)3佐劑，
3. 根據(jù)權(quán)利要求l的疫苗，特征在于它進(jìn)一步含有聚陽(yáng)離子肽。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l的疫苗，特征在于它進(jìn)一步含有含CpG基序的 寡聚脫氧核苷酸.
5. 根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗，特征在于它進(jìn)一步含有聚陽(yáng)離子肽和 含CpG基序的寡聚脫氧核苷酸。
6. KLKL5KLK和寡聚d(ICL組合的用途，用于制備針對(duì)HBV感染的 疫苗。
7. KLKLsKLK和寡聚d(ICh3組合的用途，用于制備針對(duì)HBV感染之 疫苗，所迷疫苗針對(duì)HBV感染具有改善的抗原特異性1型應(yīng)答，并且同 時(shí)保存或增加所述疫苗的2型應(yīng)答。
8. 權(quán)利要求7的用途，其中所述抗原特異性1型應(yīng)答為IgG2抗體應(yīng) 答或IFN- Y應(yīng)答，所述疫苗的2型應(yīng)答是IgGl抗體應(yīng)答或白細(xì)胞介素 4應(yīng)答.
9. 用于預(yù)防病毒感染的疫苗，包含 —HCV抗原、—KLKLsKLK和 —寡聚d (IC) 。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的疫苗，特征在于它進(jìn)一步含有A1(0H)3佐劑。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9的疫苗，特征在于它進(jìn)一步含有聚陽(yáng)離子肽。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9的疫苗，特征在于它進(jìn)一步含有含CpG基序的 寡聚脫氧核苷酸。
13. 根據(jù)權(quán)利要求9的疫苗，特征在于它進(jìn)一步含有聚陽(yáng)離子肽和含CpG基序的寡聚脫氧核苷酸。
14. KLKL5KLK和寡聚(1(1013組合的用途，用于制備針對(duì)HCV感染 的疫苗。
15. KLKLsKLK和寡聚d(IC)n組合的用途，用于制備針對(duì)HCV感染 之疫苗，所述疫苗針對(duì)HCV感染具有改善的抗原特異性1型應(yīng)答，并且 同時(shí)保存或增加所述疫苗的2型應(yīng)答。
16. 權(quán)利要求15的用途，其中所述抗原特異性1型應(yīng)答為IgG2抗體 應(yīng)答或IFN- Y應(yīng)答，所述疫苗的2型應(yīng)答是IgGl抗體應(yīng)答或白細(xì)胞介 素4應(yīng)答。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對(duì)病原體，尤其是病毒病原體感染的改進(jìn)的疫苗，包含抗原、式R₁-XZXZ_N-XZX-R₂的肽和含有脫氧肌苷和/或脫氧尿苷殘基的免疫刺激性脫氧核酸。
文檔編號(hào)C07K14/18GK101214375SQ20071018504
公開(kāi)日2008年7月9日 申請(qǐng)日期2004年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月24日
發(fā)明者A·哈貝爾, J·弗里茨, K·普林茨, K·林瑙, M·比施爾 申請(qǐng)人:英特塞爾股份公司