專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種仙人掌類(lèi)植物dna的提取和純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種DNA的提取和純化方法，特別是涉及提取DNA時(shí)會(huì)產(chǎn)生粘液的仙人掌類(lèi)植物DNA的提取和純化方法。
背景技術(shù)：
：仙人掌主要分布于美洲熱帶地區(qū)，目前世界上已知的有2000種以上，其中以墨西哥最多，我國(guó)的西南和華南沿海地區(qū)也有少數(shù)野生的仙人掌植物。近十幾年來(lái)通過(guò)引種栽培，仙人掌植物在我國(guó)已逐年增多。主要分布在我國(guó)南部。由于食用和果用仙人掌類(lèi)植物的市場(chǎng)需求不斷增加，為了更好的利用和保護(hù)這些資源，大量的研究工作正在展開(kāi)，這些研究工作包括揭示其種間親緣關(guān)系、遺傳多樣性以及分子標(biāo)記育種等，進(jìn)行這些研究的前提是得到純度較高的DNA。但是，仙人掌類(lèi)植物中含有粘液物質(zhì)，采用標(biāo)準(zhǔn)的CTAB方法提取DNA會(huì)受到粘液物質(zhì)的干擾，得不到很純的DNA，不能滿(mǎn)足研究的需要。如何從含有粘液物質(zhì)的仙人掌類(lèi)植物中提取純度較高的DNA是分子生物學(xué)研究人員急待解決的問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種能有效的從含有粘液的仙人掌類(lèi)植物中提取和純化DNA的方法，該方法可以有效的克服粘液物質(zhì)的干擾，提取的DNA的純度可以達(dá)到進(jìn)一步研究的需要。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的提取和純化方法為將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的試樣于液氮中磨成粉末，加入65。C的細(xì)胞裂解液后置65。C水浴中保持，然后離心，吸取上清液，加入4。C飽和酚溶液和常溫氯仿，離心，吸取上清液，加入4。C乙酸鉀溶液和-2(TC異丙醇，置于-20°C的冰柜中進(jìn)行沉淀，吸取團(tuán)狀DNA沉淀用70X乙醇洗滌并風(fēng)干，然后沉淀用4'CTE緩沖液充分溶解，溶解后加入4'C飽和酚和常溫氯仿，重復(fù)從第二次離心至風(fēng)干沉淀的操作一次，所得沉淀用4°CTE緩沖液溶解即得DNA的TE溶液。具體的操作步驟如下(1)取58g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的試樣于液氮中迅速研磨成粉末，然后快速轉(zhuǎn)移至l.5ml離心管中；(2)立即加入65。C預(yù)熱的細(xì)胞裂解液600y1，置于65。C水浴中保溫5070分鐘，其間每隔510min輕搖l次，將裂解樣離心1822分鐘，吸取上清液于離心管中；(3)在步驟(2)的離心管中加入上清液同體積的4。C飽和酚溶液和常溫氯仿，輕搖812分鐘，以12000r/min離心1822分鐘；(4)吸取上清液于1.5ml離心管中，加入上清液體積O.1倍的4。C乙酸鉀溶液和上清液同體積的-2(TC異丙醇，放置于-2(TC的冰柜中1S22分鐘；(5)吸取離心管中的團(tuán)狀DNA沉淀于1.5ml離心管中，用70%乙醇洗滌沉淀2次，風(fēng)干沉淀；(6)沉淀用4'CTE緩沖液溶解，在4'C保存2小時(shí)使DNA充分溶解；(7)重復(fù)(3)(5)的操作一次，沉淀加4。CTE緩沖液300yl溶解，保存于4。C的冰箱備用。優(yōu)選地，仙人掌類(lèi)植物DNA的提取和純化方法如下(1)取58g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的試樣于液氮中迅速研磨成粉末，然后快速轉(zhuǎn)移至l.5ml離心管中；(2)立即加入65。C預(yù)熱的細(xì)胞裂解液600y1，置于65。C水浴中保溫1小時(shí)，其間每隔510min輕搖l次，將裂解樣離心20分鐘，吸取上清液于離心管中；(3)在步驟(2)的離心管中加入上清液同體積的4。C飽和酚溶液和常溫氯仿，輕搖IO分鐘，以12000r/min離心20分鐘；(4)吸取上清液于1.5ml離心管中，加入上清液體積O.1倍的4。C乙酸鉀溶液和上清液同體積的-2crc異丙醇，放置于-2crc的冰柜中2o分鐘；(5)吸取離心管中的團(tuán)狀DNA沉淀于1.5ml離心管中，用70%乙醇洗滌沉淀2次，風(fēng)干沉淀；(6)沉淀用4'CTE緩沖液溶解，在4'C保存2小時(shí)使DNA充分溶解；(7)重復(fù)(3)(5)的操作一次，沉淀加4。CTE緩沖液300yl溶解，保存于4。C的冰箱備用。其中，前述細(xì)胞裂解液為2XCTAB細(xì)胞裂解液，其配制方法為在去離子水中加入CTAB4g、NaCl16.364g和lmol/l的Tris—HC120ml，充分溶解，定容至200ml。所述飽和酚的pH值為8.5。所述乙酸鉀溶液是濃度為3mo1/1、pH值為5.2的乙酸鉀水溶液。與提取DNA的標(biāo)準(zhǔn)CTAB法相比，本發(fā)明在步驟(2)中增加了一次離心和抽提上清液的操作。發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，將仙人掌類(lèi)植物火龍果嫩莖和磷片采用標(biāo)準(zhǔn)CTAB方法提取時(shí)，由于火龍果材料呈粘稠狀，離心分層效果差，得不到所需純度的DNA，為了降低粘液物質(zhì)的干擾，增加了步驟(2)的一次離心和抽提上清液的操作。本發(fā)明在步驟(3)中延長(zhǎng)了離心時(shí)間，常規(guī)的離心操作是15分鐘，但發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)明，由于火龍果材料呈粘稠狀，粘液物質(zhì)的干擾大離心分層效果差，為了達(dá)到更好的分層效果，本發(fā)明中將離心時(shí)間延長(zhǎng)至20分鐘。在步驟(4)中，采用乙酸鉀和異丙醇分別代替了常規(guī)方法中的乙酸鈉和異戊醇可以進(jìn)一步提高所得DNA的純度。本發(fā)明還增加了抽提次數(shù)對(duì)提取得到的DNA進(jìn)行進(jìn)一步的純化，使DNA的純度能滿(mǎn)足進(jìn)一步研究的需要。為了驗(yàn)證本發(fā)明方法的有效性，發(fā)明人對(duì)經(jīng)過(guò)本發(fā)明方法提取得到的DNA的質(zhì)量和純度進(jìn)行了檢査，具體如下1、試劑和儀器試劑火龍果嫩莖(置于-2(TC冰柜中保存?zhèn)溆?、2XCATB細(xì)胞裂解液(CTAB4g、NaCl16.364g、1MTris-HC120ml)、飽禾口酚(pH8.5)、氯仿、乙酸鉀(3mo1/1pH5.2)、異丙醇、乙醇(70%)、1XTAE緩沖液，TE緩沖液、瓊脂糖(0.8%)。儀器高速冷凍離心機(jī)(AvantiJ—25，Beckman)、紫外分光光度計(jì)(DU—800，Beckman)、水平電泳儀(安發(fā)瑪西亞)、紫外凝膠成像系統(tǒng)(基因公司)、恒溫水浴鍋。2、實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果2.1DNA純度和濃度檢測(cè)取少量采用本發(fā)明方法提取純化得到的火龍果的DNA溶液，在紫外分光光度計(jì)下測(cè)定波長(zhǎng)260nm、280nm的光吸收值。計(jì)算00260/28()值，根據(jù)OD，/28o值判斷DNA純度，當(dāng)1.8《0D260/280〈2.0時(shí)，表明DNA純度很好；并根據(jù)0026()的值，計(jì)算DNA的濃度，結(jié)果見(jiàn)表l。DNA濃度(yg/ml)二OD26oX50X稀釋倍數(shù)/1000表l火龍果材料提取的基因組DNA檢測(cè)數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注稀釋倍數(shù)為l。采用CTAB法對(duì)6個(gè)火龍果材料的基因組DNA的提取結(jié)果表明(見(jiàn)表2)，所提各種材料的DNA的OD，/28o值在1.92.l之間，16號(hào)材料的DNA濃度均超過(guò)0.030mg/g，說(shuō)明DNA的得率高，提取物中糖、酚、酶等干擾物質(zhì)含量去除較為理想，能達(dá)到進(jìn)一步研究的要求。2.2DNA質(zhì)量檢測(cè)取100200ng經(jīng)本發(fā)明方法提取得到的火龍果DNA，點(diǎn)樣于0.8%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，EB(溴化乙啶)染色，進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測(cè)，電泳緩沖液為1XTAE，按每厘米凝膠的長(zhǎng)度5V恒定電壓進(jìn)行電泳，電泳1小時(shí)左右，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察記錄所提取的DNA的質(zhì)量、純度及RNA的消化去除情況。從得到的瓊脂糖凝膠電泳圖譜可以看出，所得的DNA除6號(hào)材料跑出的電泳帶較弱外，各個(gè)提取物均呈現(xiàn)一條清晰整齊的主帶，清晰明亮，可用于進(jìn)一步分析。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明在標(biāo)準(zhǔn)CTAB法提取DNA的基礎(chǔ)上，采用調(diào)整試驗(yàn)順序、適當(dāng)延長(zhǎng)有機(jī)溶劑的抽提時(shí)間和增加抽提次數(shù)等方法，有效地克服了DNA提取過(guò)程中粘液物質(zhì)的干擾，有效地去除了提取物中糖、酚、酶等干擾物質(zhì)，提高了DNA提取的得率和純度，所得的DNA提取物能達(dá)到進(jìn)一步研究的要求。整個(gè)提取和純化方法不需要其它特殊儀器，成本較低，并且操作簡(jiǎn)便，一般試驗(yàn)人員都可順利完成。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:采用如下方法提取火龍果DNA:(1)采集火龍果嫩莖，用清水沖洗干凈、涼干，取58g于液氮中迅速研磨成粉末，然后快速轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中；(2)立即加入65。C預(yù)熱的細(xì)胞裂解液600y1，置于65。C水浴中保溫1小時(shí)，其間每隔510min輕搖l次，將裂解樣離心20分鐘，吸取上清液于離心管中；(3)在步驟(2)的離心管中加入上清液同體積的4。C飽和酚溶液和常溫氯仿(飽和酚溶液氯仿=1:1)，輕搖10分鐘，以12000r/min離心20分鐘；(4)吸取上清液于1.5ml離心管中，加入上清液體積O.1倍的4。C乙酸鉀溶液和上清液同體積的-2crc異丙醇，放置于-2crc的冰柜中2o分鐘；(5)吸取離心管中的團(tuán)狀DNA沉淀于1.5ml離心管中，用70%乙醇洗滌沉淀2次，風(fēng)干沉淀；(6)沉淀用4。CTE緩沖液500yl溶解，在4。C保存2小時(shí)使DNA充分溶解；(7)重復(fù)(3)(5)的操作一次，沉淀加4'CTE緩沖液溶解，保存于4'C的冰箱備用實(shí)施例2:采用如下方法提取仙人掌DNA:(1)采集仙人掌的葉，用清水沖洗干凈，晾干，取58g于液氮中迅速研磨成粉末，然后快速轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中；(2)立即加入65。C預(yù)熱的細(xì)胞裂解液600y1，置于65。C水浴中保溫70分鐘，其間每隔510min輕搖l次，將裂解樣離心22分鐘，吸取上清液于離心管中；(3)在步驟(2)的離心管中加入上清液同體積的4。C飽和酚溶液和常溫氯仿，輕搖8分鐘，以12000r/min離心22分鐘；(4)吸取上清液于1.5ml離心管中，加入上清液體積O.1倍的4。C乙酸鉀溶液和上清液同體積的-2(TC異丙醇，放置于-2(TC的冰柜中18分鐘；(5)吸取離心管中的團(tuán)狀DNA沉淀于1.5ml離心管中，用70%乙醇洗滌沉淀2次，風(fēng)干沉淀；(6)沉淀用4。CTE緩沖液500yl溶解，在4。C保存2小時(shí)使DNA充分溶解；(7)重復(fù)(3)(5)的操作一次，沉淀加4'CTE緩沖液溶解，保存于4'C的冰箱備用實(shí)施例3:采用如下方法提取火龍果DNA(1)采集火龍果嫩莖，用清水沖洗干凈、涼干，取58g于液氮中迅速研磨成粉末，然后快速轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中；(2)立即加入65。C預(yù)熱的細(xì)胞裂解液600y1，置于65。C水浴中保溫50分鐘，其間每隔510min輕搖l次，將裂解樣離心18分鐘，吸取上清液于離心管中；(3)在步驟(2)的離心管中加入上清液同體積的4。C飽和酚溶液和常溫氯仿，輕搖12分鐘，以12000r/min離心18分鐘；(4)吸取上清液于1.5ml離心管中，加入上清液體積O.1倍的4。C乙酸鉀溶液和上清液同體積的-2(TC異丙醇，放置于-2(TC的冰柜中22分鐘；(5)吸取離心管中的團(tuán)狀DNA沉淀于1.5ml離心管中，用70%乙醇洗滌沉淀2次，風(fēng)干沉淀；(6)沉淀用4。CTE緩沖液500yl溶解，在4。C保存2小時(shí)使DNA充分溶解；(7)重復(fù)(3)(5)的操作一次，沉淀加4'CTE緩沖液溶解，保存于4'C的冰箱備用權(quán)利要求1.一種仙人掌類(lèi)植物DNA的提取和純化方法，其特征在于將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的試樣于液氮中磨成粉末，加入65℃的細(xì)胞裂解液后置65℃水浴中保持，然后離心，吸取上清液，加入4℃飽和酚溶液和常溫氯仿，離心，吸取上清液，加入4℃乙酸鉀溶液和-20℃異丙醇，置于-20℃的冰柜中進(jìn)行沉淀，吸取團(tuán)狀DNA沉淀用70％乙醇洗滌并風(fēng)干，然后沉淀用4℃TE緩沖液充分溶解，溶解后加入4℃飽和酚和常溫氯仿，重復(fù)從第二次離心至風(fēng)干沉淀的操作一次，所得沉淀用4℃TE緩沖液溶解即得DNA的TE溶液。2.按照權(quán)利要求1所述的仙人掌類(lèi)植物DNA的提取和純化方法，其特征在于(1)取58g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的試樣于液氮中迅速研磨成粉末，然后快速轉(zhuǎn)移至l.5ml離心管中；(2)立即加入65。C預(yù)熱的細(xì)胞裂解液600y1，置于65。C水浴中保溫5070分鐘，其間每隔510min輕搖l次，將裂解樣離心1822分鐘，吸取上清液于離心管中；(3)在步驟(2)的離心管中加入上清液同體積的4。C飽和酚溶液和常溫氯仿，輕搖812分鐘，以12000r/min離心1822分鐘；(4)吸取上清液于1.5ml離心管中，加入上清液體積O.1倍的4。C乙酸鉀溶液和上清液同體積的-2(TC異丙醇，放置于-2(TC的冰柜中1822分鐘；(5)吸取離心管中的團(tuán)狀DNA沉淀于1.5ml離心管中，用70%乙醇洗滌沉淀2次，風(fēng)干沉淀；(6)沉淀用4'CTE緩沖液溶解，在4'C保存2小時(shí)使DNA充分溶解；(7)重復(fù)(3)(5)的操作一次，沉淀加4。CTE緩沖液300yl溶解，保存于4。C的冰箱備用。3.按照權(quán)利要求2所述的仙人掌類(lèi)植物DNA的提取和純化方法，其特征在于(1)取58g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的試樣于液氮中迅速研磨成粉末，然后快速轉(zhuǎn)移至l.5ml離心管中；(2)立即加入65。C預(yù)熱的細(xì)胞裂解液600y1，置于65。C水浴中保溫1小時(shí)，其間每隔510min輕搖l次，將裂解樣離心20分鐘，吸取上清液于離心管中；(3)在步驟(2)的離心管中加入上清液同體積的4。C飽和酚溶液和常溫氯仿，輕搖IO分鐘，以12000r/min離心20分鐘；(4)吸取上清液于1.5ml離心管中，加入上清液體積O.1倍的4。C乙酸鉀溶液和上清液同體積的-2crc異丙醇，放置于-2crc的冰柜中2o分鐘；(5)吸取離心管中的團(tuán)狀DNA沉淀于1.5ml離心管中，用70%乙醇洗滌沉淀2次，風(fēng)干沉淀；(6)沉淀用4'CTE緩沖液溶解，在4'C保存2小時(shí)使DNA充分溶解；(7)重復(fù)(3)(5)的操作一次，沉淀加4。CTE緩沖液300yl溶解，保存于4。C的冰箱備用。4.按照權(quán)利要求l、2或3所述仙人掌類(lèi)植物DNA的提取和純化方法，其特征在于所述細(xì)胞裂解液為2XCTAB細(xì)胞裂解液。5.按照權(quán)利要求4所述仙人掌類(lèi)植物DNA的提取和純化方法，其特征在于所述細(xì)胞裂解液的配制方法為在去離子水中加入CTAB4g、NaCl16.364g和lmo1/1的Tris—HC120ml，充分溶解，定容至200ml。6.按照權(quán)利要求l、2或3所述仙人掌類(lèi)植物DNA的提取和純化方法，其特征在于所述飽和酚溶液的pH值為8.5。7.按照權(quán)利要求l、2或3所述仙人掌類(lèi)植物DNA的提取和純化方法，其特征在于所述乙酸鉀溶液是濃度為3mo1/1、pH值為5.2的乙酸鉀水溶液。全文摘要本發(fā)明提供了一種仙人掌類(lèi)植物DNA的提取和純化方法，特別適合于從含有粘液的仙人掌類(lèi)植物中提取和純化DNA。本發(fā)明方法是在標(biāo)準(zhǔn)CTAB方法上的改進(jìn)，采用調(diào)整試驗(yàn)順序、適當(dāng)延長(zhǎng)有機(jī)溶劑的抽提時(shí)間和增加抽提次數(shù)等方法，有效地克服了DNA提取過(guò)程中粘液物質(zhì)的干擾，有效地去除了提取物中糖、酚、酶等干擾物質(zhì)，提高了DNA提取的得率和純度，所得的DNA提取物能達(dá)到進(jìn)一步研究的要求。整個(gè)提取和純化方法不需要其它特殊儀器，成本較低，并且操作簡(jiǎn)便，一般試驗(yàn)人員都可順利完成。文檔編號(hào)C07H21/00GK101182344SQ20071020296公開(kāi)日2008年5月21日申請(qǐng)日期2007年12月10日優(yōu)先權(quán)日2007年12月10日發(fā)明者濤劉,向青云,蔡永強(qiáng),金吉芬,剛陶,茜韋申請(qǐng)人:貴州省果樹(shù)科學(xué)研究所