專利名稱：：細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用證明細(xì)胞膜表面表達(dá)cd63的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及肺瘤性疾病的診斷和治療，特別是腫瘤細(xì)胞毒作用的介導(dǎo)，最主要是涉及腫瘤性疾病可修飾性抗體(cancerousdiseasemodifyingantibodies,CDMAB)的應(yīng)用，可選擇地，結(jié)合一種或多種化療藥物，作為誘發(fā)腫瘤細(xì)胞毒性反應(yīng)的手段。本發(fā)明還涉及了利用當(dāng)前已有的CDMAB進(jìn)4亍的結(jié)合試驗(yàn)。
背景技術(shù)：
：CD63屬于四次跨膜超家族中的三型膜蛋白，該家族目前共20個成員，特點(diǎn)是均具有四個跨膜結(jié)構(gòu)。幾個工作組通過將抗體分別加入預(yù)先活化的血小板、中性粒細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞樣品內(nèi)的方法，各自獨(dú)立地確定了細(xì)胞膜上CD63的表達(dá)。對這組同源糖蛋白抗原的cDNA進(jìn)行克隆后證明這些不同細(xì)胞上的抗原為同一種分子。1996年，第六次國際白纟田胞分型研討會(TheSixthInternationalWorkshoponLeukocyteTyping)將該抗體歸類為CD63抗體。在此之前，CD63曾被稱為黑色素瘤l抗原、眼黑色素瘤相關(guān)抗原、黑色素瘤相關(guān)抗原ME491、溶酶體相關(guān)膜糖蛋白3、guanulophysin、黑色素相關(guān)抗原MLA1,這些命名往往和導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)其部分特性以及抗原識別的抗體有關(guān)。因此，CD63也曾經(jīng)被指定為ME491抗原(MAbME491)、神經(jīng)腺(neuroglandular)抗原(MAbsLS59,LS62,LS76,LS113,LS140,LS152)、血小板gp40(MAbsH5C6，H4F8和H5D2)、人類骨髓基質(zhì)細(xì)胞抗原(MAbl2F12)、骨原細(xì)胞特異性標(biāo)志物(MAbHOP-26)和整合素相關(guān)蛋白(MAb6Hl)。目前發(fā)現(xiàn)其他能夠與人體CD63產(chǎn)生交叉反應(yīng)的抗體有8-1H,8-2A(與ME491產(chǎn)生交叉反應(yīng))、NKI/C-3和NKI/black-13(VannegoorandRumke，1986;Demetricketal.,1992;Wangetal.,1992)。研究人員用人體黑色素瘤細(xì)胞眾多抗體的一種，即MAbME491，乂t人黑色素瘤細(xì)胞的互補(bǔ)DNA文庫中最先克隆出了CD63。人體黑色素瘤活檢研究表明MAbME491的活性似與黑色素瘤的進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)。在正常黑色素細(xì)胞中，MAbME491活性低，在黑色素瘤早期進(jìn)展階賴:(包括發(fā)育不良痣和》文射生長期(radialgrowthphase,RGP)腫瘤)抗體活性升高，黑色素瘤繼續(xù)進(jìn)展，例如垂直生長期(vertialgrowthphase,VGP)和轉(zhuǎn)移性腫瘤，MAbME491活性則下降甚至喪失活性。研究人員應(yīng)用MAb2.28(抗活化血小板抗體)，發(fā)現(xiàn)了人體血小板表面特征性CD63的表達(dá)，并進(jìn)行了部分定性，檢測到了該抗體依賴于血小板膜糖蛋白(53kDa)的活性作用。此血小板膜糖蛋白也與未活化血小板內(nèi)部顆粒膜成分有關(guān)。同一研究中，MAb2.28也用于標(biāo)記巨核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)部顆粒，在顆粒上同時集聚有組織蛋白酶D抗體，后者為公認(rèn)的溶酶體抗體。接下來關(guān)于抗體簇聚集和克隆表達(dá)的研究，證明CD63與溶酶體膜相關(guān)蛋白LAMP1和LAMP2共同表達(dá)于溶酶體膜上。分子克隆鑒定該分子確為CD63，屬于四次跨膜超家族。許多不同組織和細(xì)胞上都能夠檢測到CD63表達(dá)。在細(xì)胞水平，人們發(fā)現(xiàn)其與細(xì)胞膜有關(guān)，也和細(xì)胞內(nèi)后期形成包涵體的嚢狀結(jié)構(gòu)有關(guān)。某些情況下，細(xì)胞活化導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)儲備的CD63向細(xì)胞膜表面移動。在生理上，CD63與B淋巴細(xì)胞的MHC-II類分子有關(guān)，主要是通過在內(nèi)體、外體以及排泌小泡的表達(dá)參與MHC-II復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面的過程。人們還發(fā)現(xiàn)CD63與其他四次跨膜超家族分子之間存在相互作用，例如CD9、CD81、CD11(integrinchainlaM,L,x)、CD18(integrinchain|32)、CD49c(VLA-3或integrinchaina3)、CD49d(integrinchain04)、CD49f(VLA-6或integrinchain)和CD29(integrinchain&),B、T淋巴細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，乳腺癌和黑色素瘤細(xì)胞等很多類型細(xì)胞中均可見到這種相互作用。CD63在腫瘤性疾病中的作用還不是很清楚。盡管最初由幾個相互獨(dú)立的工作組發(fā)現(xiàn)CD63參與血小板和中性粒細(xì)胞活化、MHC-II類抗原提呈、整合素依賴性細(xì)胞粘附和運(yùn)動以及某些腫瘤的惡性進(jìn)展，但其功能還有待進(jìn)一步充分闡述。雖然目前有證據(jù)支持CD63在各種細(xì)胞生理事件中的作用，可是還不清楚的是在CD63參與的各種事件過程中，它所起的作用是互相獨(dú)立的還是具有潛在的共同細(xì)胞學(xué)機(jī)制？幾個工作組已經(jīng)研究了CD63和某些類型肺瘤進(jìn)展之間的關(guān)系，特別是與黑色素瘤進(jìn)展之間的關(guān)系。除MabME491之外，還研發(fā)了多種抗CD63單克隆抗體(以下筒稱單抗)應(yīng)用于對不同進(jìn)展階段腫瘤患者的腫瘤標(biāo)本進(jìn)4亍免疫組4匕(immunohistochemical，IHC)染色。研究人員觀察到著色淺通常提示CD63低表達(dá)，并與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移性有關(guān)。更近期一項研究也描述了包括CD63在內(nèi)的幾個四次跨膜超家族成員(mRNA定量)表達(dá)水平明顯下調(diào)與幾種乳腺癌衍生的細(xì)胞體外侵襲性的顯著相關(guān)關(guān)系。另外一項研究通過差異顯示法證實(shí)培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞在雌激素減少情況下，癌細(xì)胞表達(dá)CD63。這說明CD63的表達(dá)受到激素水平的調(diào)節(jié)，并由此改變CD63量和/或功能而影響乳腺癌的進(jìn)展。與之相比，MAbFC-5.01抗CD63單抗的研究揭示了其活性表位在不同正常組織上表達(dá)不同。盡管該抗體能識別CD63，但并不能區(qū)分早期和進(jìn)展期黑色素瘤，包括轉(zhuǎn)移性黑色素瘤(這點(diǎn)與MAbME491不同)，這表明CD63抗原曾經(jīng)在這些進(jìn)展程度較高的腫瘤細(xì)胞上表達(dá)，但是在腫瘤的不同進(jìn)展階段，在細(xì)胞內(nèi)，其某些表位被掩蓋了?？赡茉蚴歉淖兞薈D63核心多肽的翻譯后修飾，或是由于CD63和其他分子的相互作用，影響了抗體識別和特異性結(jié)合所需的特殊表位。這些研究結(jié)果支持1993年Si和Hersey所報告的觀察結(jié)果，他們用MAbNKI-C3抗CD63單抗進(jìn)行染色，結(jié)果在組織切片上不能區(qū)分不同進(jìn)展階段的黑色素瘤，例如早期，放射生長期和垂直生長期，以及轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。1998年Adachi和Huang等研究分析從乳腺癌和非小細(xì)胞性肺癌細(xì)胞中提取的mRNA,通過PCR定量，發(fā)現(xiàn)四次跨膜分子超家族中的兩個成員，包括CD9和CD82，它們的表達(dá)水平與腫瘤進(jìn)展和患者預(yù)后存在明顯的相關(guān)關(guān)系，CD63在所有的樣本中表達(dá)都是相似的，因此不存在這種相關(guān)關(guān)系。由于上述試驗(yàn)結(jié)果存在明顯矛盾，因此并無有力和一致的數(shù)據(jù)資料能夠明確證明CD63和腫瘤之間的關(guān)系。到目前為止，很少數(shù)體內(nèi)研究試驗(yàn)試圖建立一種CD63與該分子可能存在的對晚期胂瘤的抑制作用之間的聯(lián)系。其中一項研究中，人CD63過度表達(dá)的H-RAS轉(zhuǎn)化的NIH-3T3細(xì)胞經(jīng)皮下和腹腔注射給無胸腺小鼠，與親代CD63非過度表達(dá)小鼠細(xì)胞比較，結(jié)果顯示前者腫瘤體積縮小，生存期延長，潛在的轉(zhuǎn)移性下降，產(chǎn)生了肺瘤趨惡性/發(fā)生性均降低的小鼠表型。這表明經(jīng)過轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞，CD63的表達(dá)能夠抑制人體腫瘤細(xì)胞的惡性行為。更近期研究工作中，利用轉(zhuǎn)基因小鼠模型表達(dá)人CD63，誘導(dǎo)小鼠對人CD63產(chǎn)生耐受，再給予注射人CD63-MHC-I類分子(H-2Kb)共轉(zhuǎn)染鼠黑色素瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞的生長能夠被抑制，小鼠生存期延長；基于此項研究，可以用痘病毒融合人CD63進(jìn)行免疫接種。該研究作者指出由于腫瘤生長的抑制作用僅僅存在于CD63-MHC-I類分子共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，而不是CD63單獨(dú)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，所以這種治療作用是T淋巴細(xì)胞依賴性的，內(nèi)源性抗CD63單抗似乎并未參與保護(hù)作用。預(yù)先經(jīng)人CD63免疫的野生型動物，產(chǎn)生抗CD63抗體支持這種解釋，因?yàn)槊庖邉游锊]有產(chǎn)生對腫瘤細(xì)胞生長的保護(hù)性抑制作用。1995年，Radford等用人CD63轉(zhuǎn)染KM3細(xì)胞(最初認(rèn)為是人源，后來定性為鼠源)，表明當(dāng)皮內(nèi)注射肺瘤細(xì)胞至無胸腺小鼠時，與未轉(zhuǎn)染的KM3親代細(xì)胞比較，該種蛋白的表達(dá)減慢了腫瘤細(xì)胞生長和惡性化進(jìn)程，盡管在體外試驗(yàn)中，各種轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長率并無顯著性差異。這些觀察說明CD63的潛在作用和其他已知的腫瘤抑制基因在體內(nèi)和體外對腫瘤細(xì)胞的作用不相同。此外，1997年Radford等發(fā)現(xiàn)，在體外試-驗(yàn)中，抗CD63單抗ME491對同種細(xì)胞的作用是通過減少細(xì)胞隨機(jī)運(yùn)動，而不是影響細(xì)胞生長速度。這項研究還描述了如下觀察在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)衍生的趨化因子作用下，CD63能刺激細(xì)胞運(yùn)動，這些趨化因子包括層粘連蛋白、纖維連接蛋白、膠原和玻璃粘連蛋白。CD63的這種功能可能由&整合素介導(dǎo)，盡管整合素抗體并不能夠阻斷這種作用。然而，玻璃粘連蛋白介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)(已知為整合素cg35的配體)，似乎與CD63轉(zhuǎn)染細(xì)胞上ECM成分包括層粘連蛋白、纖維連接蛋白合膠原所介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)作用之間存在相互拮抗作用。這提示在ECM同時存在的特殊條件下，CD63的表達(dá)能導(dǎo)致細(xì)胞遷移能力下降，這種遷移能力主要依賴于細(xì)胞粘附和運(yùn)動之間的平衡。另一項研究中，抗CD63單抗(MAb710F)提高了經(jīng)過PMA處理后HL-60細(xì)胞的粘附性和伸展性，抗CD63單抗(Mab2.28)能刺激產(chǎn)生類似作用，只是受刺激細(xì)胞所占比例小，而且需要加入的抗體量更多。這些結(jié)果說明盡管目前已經(jīng)研發(fā)了多種抗CD63抗體，但是它們的功能可能存在很大區(qū)別。四次跨膜超家族可能也參與了細(xì)胞增殖。1990年，Oren等描述了鼠MAb5A6通過識別淋巴細(xì)胞CD81(TAPA-1)而產(chǎn)生抗增殖作用。另一個研究中，通過將抗體和人類T淋巴細(xì)胞CD37連接阻斷了CD37誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。在更為近期的一項通過CD37基因敲除獲得的CD37缺失小鼠動物模型研究中，比較缺失小鼠和野生鼠分別對刀豆蛋白A激活后產(chǎn)生的增殖反應(yīng)，以及CD3受體參與的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，顯示基因敲除小鼠T淋巴細(xì)胞高度增殖。因此提出四次跨膜超家族可能具有參與細(xì)胞生長和增殖的共同特性。最近關(guān)于肝母細(xì)胞癌和肝細(xì)胞癌研究中顯示，如果在上述癌細(xì)胞中加入抗CD81單抗能活化Erk/MAP激酶途徑。已經(jīng)證實(shí)此信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與細(xì)胞生長和增殖過程。平行研究中也表明，經(jīng)過轉(zhuǎn)染過度表達(dá)人CD81的細(xì)胞和模擬轉(zhuǎn)染對照組比較顯示出增殖下降。因此相關(guān)證據(jù)已經(jīng)指出，四次跨膜超家族分子，尤其是CD63在細(xì)胞生長和增殖、粘附和運(yùn)動過程中起著重要的作用。這兩類細(xì)胞事件是目前研究的重要靶點(diǎn)，因其在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中起著中心作用。目前為止，還沒有報導(dǎo)抗CD63抗體或者其它藥物能夠特異性針對CD63表達(dá)的細(xì)胞，同時影響人體肺瘤細(xì)胞體內(nèi)和體外生長特性，或是影響腫瘤細(xì)胞生長動物模型的生存期。氨基酸序列測定和分析未能揭示四次跨膜超家族與其它蛋白質(zhì)家族或任何以前已經(jīng)定性的功能分子之間的同源性，也未能顯示其具有目前任何已知酶活性。結(jié)果，人們很難研究該蛋白質(zhì)家族分子在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的調(diào)節(jié)作用。不管怎樣，有證據(jù)說明，應(yīng)用四次跨膜超家族特異性藥物能改變細(xì)胞生理過程，這一改變和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑存在密切的依賴關(guān)系，表明了四次跨膜超家族具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)特性。CD63在生理和/或功能上均顯示出與本身是酶并且參與次級信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，或者一系列與在生理和/或功能上有相似功能的酶有關(guān)分子之間的聯(lián)系。中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用是炎癥反應(yīng)的起始步驟之一，研究其相互作用機(jī)制的試驗(yàn)表明，預(yù)先經(jīng)過抗CD63單抗(AHN-16、AHN-16.1、AHN-16.2、AHN-16.3和AHN-16.5)處理，能刺激中性粒細(xì)胞對培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞層的粘附。這種作用具有強(qiáng)鈣離子依賴性，眾所周知，鈣離子是多種細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)因子，它作用于抗體刺激細(xì)胞后的特定階段。經(jīng)過與抗體較長時間的相互作用，中性粒細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的粘附作用開始對后來加入的4丐離子敏感，提示這是動態(tài)一過性的調(diào)節(jié)。此外，在生理上CD63和CD11/CD18復(fù)合物相互作用，特異性靶向作用于此復(fù)合物的藥物也能介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。這項研究中還發(fā)現(xiàn)，在生理上，CD63和酪氨酸激酶Lck和Hck有關(guān)，或者其本身就是該酶的一部分。酪氨酸激酶是一類蛋白質(zhì)的組成成員，這些激酶在細(xì)胞表面受體活化后，參與介導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞間信號傳導(dǎo)，因其特殊的細(xì)胞生理改變。另一項研究也表明，四次跨膜超家族(包括CD63)的配體和單抗結(jié)合后，能夠增強(qiáng)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞對月交原底物的石粦酸化和FAK(focaladhesionkinase)激酶活性。這指出了CD63以及其它四次跨膜超家族成員在整合素介導(dǎo)的酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的直接調(diào)節(jié)作用。其它在功能上與CD63結(jié)合抗CD63單抗MAb710F后能產(chǎn)生交叉作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是PKC(proteinkinaseC,蛋白激酶C)調(diào)節(jié)的磷酸化途徑，這也是另外一個人們已經(jīng)很熟知的細(xì)胞內(nèi)信號通路。在本文內(nèi)，MAb710F作用于HL-60,骨髓細(xì)胞的粘附性增強(qiáng)以及形態(tài)學(xué)改變均依賴于對細(xì)胞所進(jìn)行的PMA(phorbolmyristateacetate,豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯)預(yù)處理，但PKC的一過性參與作用并沒有能夠得到最終證實(shí)。盡管如此，后來一獨(dú)立工作組的研究中證明了PMA誘導(dǎo)的HL-60分化是PKC活性依賴性的，其原因是Ro31-8220為PKC的抑制因子，阻斷了PMA的作用。進(jìn)一步的證據(jù)也支持CD63以及其它四次跨膜超家族和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系，這些證據(jù)來源于CD63(和CD53)分子本身直接或是條:為超分子復(fù)合物的一部分與酪氨酸磷酸化激酶活性之間的生理關(guān)系研究工作。研究中，利用抗CD63抗體分離的免疫沉積復(fù)合物與酪氨酸磷酸酶活性有關(guān)，研究者無法識別CD63有關(guān)的磷酸酶，CD53則與酪氨酸磷酸酶CD45有關(guān)，在這點(diǎn)上兩者存在不同。最近研究發(fā)現(xiàn)，幾個四次^夸膜超家力矣的成員與II型PI4-K(phosphatidylinositol4-kinase(磷脂酰肌醇4激酶)，Berditchevskietal.,1997)有關(guān)。這種相互作用似乎很特別，因?yàn)閮H僅在CD9、CD63、CD81、CD151和A15/TALLA中得到了證實(shí)，在CD37、CD52、CD82和NAG-2中并沒有發(fā)現(xiàn)。另外，由于PI4-K復(fù)合物僅限于個別四次跨膜超家族成員，所以四次3爭膜超家族成員和PI4-K之間的作用似乎是互相排斥的。特別的，CD63-PI4-K復(fù)合物，和其它四次跨膜超家族成員不同，該復(fù)合物幾乎完全位于細(xì)胞內(nèi)具有脂閥樣結(jié)構(gòu)域的小體上。這一觀察說明CD63與PI4-K的相互作用可能參與了細(xì)胞內(nèi)的特殊事件(Claas，C,etal.,2001)，這些事件與磷酸肌醇的生物合成途徑有關(guān)或依賴于其合成，眾所周知，磷酸肌醇除了是重要的次級信號傳導(dǎo)分子外，還參與細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)(內(nèi)吞和胞吐)以及細(xì)胞骨架的重組過程(Martin,T.,1998)。到目前為止發(fā)現(xiàn)的和CD63有直接相關(guān)關(guān)系的酶，以及酶在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的調(diào)節(jié)作用，提供了更進(jìn)一步的證據(jù)來支持CD63在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的調(diào)節(jié)作用；CD63既可以調(diào)節(jié)酶活性也可以估文為酶的下游效應(yīng)分子。由于很多觀察結(jié)果的矛盾性，努力去詳細(xì)闡述腫瘤進(jìn)展的機(jī)制非常困難和復(fù)雜，因此很少有人能夠把試驗(yàn)觀察結(jié)果成功的轉(zhuǎn)化成臨床治療方案。鑒于目前已知的關(guān)于CD63和腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制之間的關(guān)系，人們有可能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)改變CD63的功能。研發(fā)一種抗原特異性腫瘤細(xì)胞毒藥物具有極大的好處，因?yàn)樵撍幬锬軌蜃鰹槟[瘤性疾病的診斷工具和潛在治療方法。這種藥物能夠通過本身或者是結(jié)合其它分子后識別并結(jié)合細(xì)胞上表達(dá)的抗原，產(chǎn)生細(xì)胞或體內(nèi)的生理活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，同時對正常人體細(xì)胞則無明顯的損傷作用。在先專利US05296348介紹了選擇特異性識別腫瘤細(xì)胞表面內(nèi)化抗原的單抗，以及識別在細(xì)胞代謝中具有對抗轉(zhuǎn)錄和/或復(fù)制的單抗的方法。其中舉例為ME491抗體在W9、WM35和WM983黑色素瘤細(xì)胞以及SW948結(jié)直腸癌細(xì)胞能被內(nèi)化。此外該抗體還能減慢SW948細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞增殖。專利申請US20030211498A1(以及相關(guān)申請包括WO0175177A3、WO0175177A2、AU0153140A5)確定了一種方法，通過抗體結(jié)合卵巢癌標(biāo)志性多肽抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，這種多肽由一組包括CD63抗原基因的基因組編碼。應(yīng)用卵巢癌基因表達(dá)序列分析法對卵巢癌的標(biāo)志基因進(jìn)行檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD63抗原基因包含于其中。專利申請WO02055551A1(以及相關(guān)申請CN1364803A)確定了一種新型多肽，即人CD63抗原56.87。專利申請CN1326962A確定了人CD63抗原15.07。專利CN1351054A確定了人CD63抗原11.11。這些專利和專利申請均確定了CD63抗原和抗體，但是未說明目前研究中分離出的單抗的用途。
發(fā)明內(nèi)容目前已經(jīng)獲得授權(quán)的美國專利6,180,357號的發(fā)明人，把命名為"病人個體化特異性抗腫瘤抗體"直接應(yīng)用于選擇個體化常規(guī)抗腫瘤抗體，這種抗腫瘤抗體有助于治療胂瘤性疾病。就本文來說，"抗體"和"單抗，，可以互相交換使用，都是指由雜交瘤細(xì)胞(例如人或鼠)產(chǎn)生的完整的免疫球蛋白，免疫結(jié)合物，更確切的說是由上述免疫球蛋白衍生的免疫球蛋白片段和重組蛋白，例如嵌合體和人源化免疫球蛋白、F(ab')和F(ab')2片段、抗體單鏈、重組免疫球蛋白可變區(qū)(Fv)s和融合蛋白等。從文獻(xiàn)中已知，多肽中的某些氨基酸序列改變不引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能顯著變化。在抗體的分子重組過程中，免疫球蛋白骨架區(qū)核苷酸或氨基酸的修飾通常能夠被耐受，修飾包括替代(首選保守替代)、缺失和插入，但并不局限于這三種方式。此外，使用目前研發(fā)的CDMAB結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化療方法例如放射性核素法也屬于此項發(fā)明范圍，因此上述化療方法的使用也是治療關(guān)注的焦點(diǎn)。CDMAB還能結(jié)合毒素、半毒素、酶(例如生物素結(jié)合酶)和血細(xì)胞，形成抗體結(jié)合物。本專利申請應(yīng)用專利'357中介紹的分離能夠產(chǎn)生可修飾性肺瘤性疾病單抗的雜交瘤細(xì)胞的方法，用以生產(chǎn)病人特異性抗腫瘤抗體。這些抗體可以特異性應(yīng)用于一種腫瘤或者可能成為腫瘤治療的常規(guī)方法。在本專利申請中，抗腫瘤抗體的特性是具有殺死細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用或者細(xì)胞生長抑制作用，兩者都是指細(xì)胞毒作用。這些抗體可用于腫瘤分期和診斷，亦可治療轉(zhuǎn)移性腫瘤。這種個體化抗腫瘤治療前景將會改變目前腫瘤患者的治療模式。可能的臨床狀況是，在腫瘤患者初次就診時即采取腫瘤標(biāo)本并貯存于標(biāo)本庫中。利用該標(biāo)本，應(yīng)用系列預(yù)先儲存的可修飾性抗體，能對該患者腫瘤進(jìn)行分型?？梢园唇?jīng)典方法對患者進(jìn)行分期，但是應(yīng)用抗體則能對其進(jìn)一步分期。患者在就診后可立即接受預(yù)成抗體和/或?qū)δ[瘤細(xì)胞敏感的系列抗體治療。抗體獲得方法包括這里列舉的方法或者通過結(jié)合篩選法(screeningmethods)應(yīng)用于噬菌體展示庫的方法。有一種可能性，即經(jīng)過治療后的腫瘤表位可能會被具相同表位的其他腫瘤細(xì)胞所耐受，因此產(chǎn)生的全部抗體均應(yīng)加入抗腫瘤細(xì)力包抗體庫。通過這種方法產(chǎn)生的抗體對于任何能與抗體結(jié)合的任何腫瘤性疾病患者可能均有效。按照US6,180,357的方法步驟，如同在S.N.10/348,231中介紹的那樣，應(yīng)用乳腺癌患者的腫瘤組織活檢所獲得的腫瘤細(xì)胞免疫小鼠能夠獲得鼠7BD-33-llA單抗。7BD-33-llA抗原廣泛表達(dá)在人體內(nèi)不同來源組織細(xì)胞表面。體外試驗(yàn)中，在乳腺癌細(xì)胞MCF-7和前列腺癌細(xì)胞PC-3均對7BD-33-llA的細(xì)胞毒性作用存在易感性。7BD-33-11A對乳腺癌和前列腺癌培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用進(jìn)一步擴(kuò)展應(yīng)用于它在體內(nèi)可能存在的抗腫瘤活性(如美國申請.10/348,231號和10/603,006號中介紹)。前期臨床異種移植腫瘤模型明確提示治療有效。如同在美國申請10/348,284和10/603,006號中介紹的那樣，7BD-33-llA在體內(nèi)人乳腺癌腫瘤模型中具有抑制胂瘤生長、減輕腫瘤負(fù)荷的作用。治療后連續(xù)觀察300天，7BD-33-llA沒有加重腫瘤進(jìn)展，在瘤細(xì)胞植入后9月治療組存活率為87.5%。相反地，同種型對照組在試驗(yàn)第72天時(給藥后第23天)死亡率為100%。因此認(rèn)為7BD-33-11A能夠延長乳腺癌肺瘤動物模型的生存期，并且能抑制腫瘤生長(延緩腫瘤進(jìn)展)。美國申請10/348,284和10/603,006還列舉并描述如下建立人乳腺癌體內(nèi)試驗(yàn)?zāi)Ｐ停?BD-33-11A具有顯著抑制腫瘤生長和延緩腫瘤進(jìn)展的作用。在試驗(yàn)第80天(給藥后第23天)，7BD-33-llA治療組和i爰沖液對照組小鼠比4支，治療組比對照組腫瘤體積小83%(p=0.001);用存活率判斷療效，給藥第60天時，治療組的死亡危險僅為對照組的16%。同種型對照組在給藥后第50天死亡率為100%。與之相比，給藥后第130天，7BD-33-llA治療組小鼠存活率為60%。這些數(shù)據(jù)結(jié)果說明7BD-33-11A治療組和對照組比較，前者顯示對延長生存期和延緩胂瘤進(jìn)展的有益作用。7BD-33-llA治療是安全的，因?yàn)椴]有導(dǎo)致任何包括體重下降和臨床精神抑郁等毒性副作用；7BD-33-llA治療也是有效的，因?yàn)樵谌巳橄侔w內(nèi)動物試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，和對照組比較，它能夠減慢腫瘤生長和延長生存期。，過兩個不同的乳腺癌異種移植模型試驗(yàn)來判定比較單獨(dú)使用化療藥順鉑以及順鉬聯(lián)合7BD-33-l1的治療效果。MDA-MB-231(MB-231)模型中，結(jié)果顯示，試驗(yàn)第69天(給藥后第5天)，7BD-33-11A治療組腫瘤生長比緩沖液對照組慢76%(p<0.001)。順柏治療組和順柏聯(lián)合7BD-33-11A治療組與緩沖液對照組比較，前兩組小鼠腫瘤體積分別縮小了79%和86%(p<0.001)。MDA-MB-468(MB-468)模型中，于試驗(yàn)第55天(給藥后第5天)，順鉑治療組和順鈿聯(lián)合7BD-33-11A治療組分別顯示出最好的腫瘤縮小效果，兩組分別為95。/。(p-0.024)和97。/。(p-0.17)。7BD-33-llA治療組在試驗(yàn)第55天時與緩沖液對照組比較，顯示腫瘤體積縮小了37%。MB-231和MB-468模型中，測量試驗(yàn)小鼠體重并進(jìn)行比較，7BD-33-11A比順鉑治療后顯示出更好的生存狀態(tài)。試驗(yàn)結(jié)果表明MB-231模型中，7BD-33-11A和順柏比較，前者更容易被耐受，7BD-33-llA治療幾乎沒有體重下降等副反應(yīng)，顯示出更好的療效，而順鉑在兩種乳腺癌模型中均引起明顯體重下降。為了明確7BD-33-11A的最佳有效劑量，研究人員應(yīng)用乳腺癌異種移植模型進(jìn)行了藥物劑量反應(yīng)試驗(yàn)。在試驗(yàn)第55天(給藥后第5天)，0.2mg/kg治療組為同種型對照組腫瘤生長的85%。同一時間，2.0mg/kg和20mg/kg治療組沒有腫瘤生長。試驗(yàn)第125天(給藥后第75天)呈現(xiàn)類似的結(jié)果，此時20mg/kg治療組仍舊沒有腫瘤生長，但2.0mg/kg治療組可見早期腫瘤生長。7BD-33-llA治療也證明其具有延長動物生存期的作用。同種型對照組小鼠在試驗(yàn)第104天(給藥后第54天)全部死亡，然而0.2mg/kg治療組全部存活直到第197天(給藥后第147天)。2.0kg/kg和20mg/kg治療組顯示出對于生存期更好的作用，試驗(yàn)第2卯天(給藥后第240天)2.0mg/kg治療組只有50%小鼠死亡，20mg/kg治療組則無一例死亡。因此不同劑量7BD-33-llA三個治療組均表現(xiàn)出良好的減慢腫瘤生長和延長生存期的作用，20mg/kg治療組具最佳療效。7BD-33-l1A除了在乳腺癌腫瘤細(xì)胞體內(nèi)試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭酗@示出有益作用外，在前列腺癌體內(nèi)動物試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?S.N.10/603,006),也顯示了其對PC-3細(xì)胞的抗瘤活性。與同種型對照抗體組比較，7BD-33-11A在治療開始后不久即表現(xiàn)出顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用(p=0.001)。在治療期末，7BD-33-11A治療組小鼠腫瘤體積^l為同種型對照組的31%。對PC-3重癥聯(lián)合免疫缺陷異種移植動物模型而言，體重可用做疾病進(jìn)展的替代指標(biāo)。試驗(yàn)第52天，7BD-33-llA治療組與同種型對照組比較顯著預(yù)防其體重下降54%(p=0.002)。監(jiān)測小鼠的生存期，治療開始后11天，同型對照組和緩沖液對照組小鼠死亡率為100%。與之相反，7BD-33-llA治療組在治療開始后第38天死亡率才達(dá)100%,生存時間為對照組的三倍。因此7BD-33-11A治療是有效的，因?yàn)樵谌饲傲邢侔┰囼?yàn)?zāi)Ｐ椭校屯N型對照組比較7BD-33-11A能同時減慢腫瘤生長，預(yù)防體重下降和延長存活期。除了在上述前列腺癌體內(nèi)腫瘤模型中的預(yù)防作用外，人們在體內(nèi)腫瘤才莫型試驗(yàn)中也證明了7BD-33-llA對PC-3細(xì)胞的抗瘤活性(S.N.10/603,006)。在治療開始后立即測量腫瘤平均體積，7BD-33-llA治療組與同種型對照組比較，治療組胂瘤體積顯著小于同型對照組(p<0.024)。治療組與同種型對照組比4交顯示前者腫瘤抑制達(dá)36%。7BD-33-llA在幾個不同的腫瘤^f莫型中所表現(xiàn)除的抗瘤活性，4吏其成為一個頗具吸引力的抗腫瘤藥物。正常人體組織表達(dá)的7BD-33-11A已經(jīng)預(yù)先確定(S.N.10/603,006)，為了確定7BD-33-11A做為藥物其作用靶點(diǎn)表位。通過將其與商業(yè)化抗CD63抗體(RFAC4和H5C6)進(jìn)行比較使得該方面研究得以進(jìn)展。組織染色結(jié)果表明7BD-33-11A限制性結(jié)合于不同細(xì)胞類型，其中包括浸潤巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。RFAC4和H5C6抗體比較，染色圖像結(jié)果相類似。然而RFAC4和H5C6的染色圖像和7BD-33-11A比較則完全不同。特別地，RFAC4和H5C6抗體均廣泛結(jié)合于正常組織，在7BD-33-11A染色同時陽性的組織，它們的染色更強(qiáng)。RFAC4和H5C6不僅僅結(jié)合于浸潤巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，也結(jié)合于大多數(shù)組織中的內(nèi)皮細(xì)胞。對7BD-33-11A抗原進(jìn)行定位，確定其在人群中的表達(dá)率，例如在乳腺癌患者中的表達(dá)率，這對評價7BD-33-11A的療效以及設(shè)計更好的臨床試驗(yàn)很重要。為了定位乳腺癌患者腫瘤細(xì)胞上7BD-33-11A抗原表達(dá)的部位，預(yù)先篩選了50例乳腺癌患者的腫瘤組織標(biāo)本用于定位7BD-33-11A的表達(dá)部位(S.N.10/603,006)。目前的研究工作比較了7BD-33-11A與RFAC4和H5C6、抗Her2抗體(c-erbB-2)的染色特點(diǎn)。其結(jié)果與之前的研究相類似，顯示有36%的腫瘤組織標(biāo)本7BD-33-11A抗原染色陽性，H5C6和RFAC4則分別為94%和85%。由于7BD-33-11A染色局限于惡性細(xì)胞上因此考慮它是腫瘤細(xì)胞特異性的。此外，在乳腺癌患者的IO份正常組織標(biāo)本染色中7BD-33-11A均為陰性，H5C6和RFAC4則分別有7份和8份標(biāo)本染色陽性。乳腺癌細(xì)胞表達(dá)7BD-33-11A的部位位于惡性細(xì)胞的細(xì)胞膜上和胞漿內(nèi)，因此使CD63成為腫瘤治療中較具吸引力的靶點(diǎn)。人們在乳腺癌細(xì)胞雌激素和黃體酮受體表達(dá)水平的基礎(chǔ)上進(jìn)一步評估了7BD-33-11A的表達(dá)，這些激素受體的表達(dá)在乳腺癌的發(fā)展、治療以及預(yù)后方面起著重要的作用。在上述激素受體和7BD-33-11A的表達(dá)之間存在輕微相關(guān)關(guān)系，有受體表達(dá)的組織7BD-33-11A表達(dá)有輕度升高。如果在腫瘤分期和進(jìn)展程度方面進(jìn)行分析，結(jié)果是肺瘤進(jìn)展程度越高則7BD-33-llA表達(dá)越強(qiáng)。類似結(jié)果也見于RFAC4。H5C6雖然顯示出和激素受體表達(dá)之間的輕微相關(guān)關(guān)系，但是和腫瘤進(jìn)展階段無明顯相關(guān)。然而對于三種抗體來說，結(jié)果都受到樣本量小的限制。與c-erbB-2比較，7BD-33-llA顯示出完全不同的染色圖像，7BD-33-11A陽性標(biāo)本中有一半Her-2表達(dá)陰性，這提示乳腺癌患者靶向治療需要未被完全滿足。兩者染色都陽性的腫瘤組織切染色強(qiáng)度上仍舊存在不同。在一份正常乳腺組織切片c-erbB-2染色也為陽性。在前列腺癌患者中定位7BD-33-11A的表達(dá)部位以及確定人群表達(dá)率也是很重要的，主要是用于評估7BD-33-11A對于前列腺癌患者的免疫治療效果和設(shè)計有效的臨床試驗(yàn)。預(yù)先篩選51例前列腺癌患者的肺瘤組織標(biāo)本用以定位7BD-33-llA的表達(dá)部位。研究結(jié)果顯示88%組織標(biāo)本7BD-33-11A染色陽性。盡管7BD-33-llA在正常組織也有高表達(dá)，但是和正常組織比較，腫瘤組織標(biāo)本上細(xì)胞膜染色強(qiáng)度較高。一例胚胎4黃紋fl肉瘤組織7BD-33-11A抗原染色陰性。似乎在腫瘤進(jìn)展階段和7BD-33-11A抗原表達(dá)之間并不存在直接相關(guān)關(guān)系。但是該結(jié)果仍受到樣本量小的限制。為了進(jìn)一步擴(kuò)展了解7BD-33-11A的潛在治療作用，人體不同腫瘤組織中該抗原出現(xiàn)頻率和部位均經(jīng)過預(yù)先確定(S.N.10/603,006)。除了乳腺癌和前列腺癌之外，其它部位的不同類型腫瘤也表達(dá)7BD-33-UA,染色陽性的人類腫瘤組織類型包括皮膚(l/2)，肺(3/4)，肝(2/3),胃(4/5)，曱狀腺(2/2)，子宮(4/4)和腎臟(3/3)。某些腫瘤不表達(dá)抗原，其中包括卵巢(0/3),睪丸(0A)，腦(0/2)和淋巴結(jié)(0/2)。和人乳腺癌和前列腺癌腫瘤組織一樣，7BD-33-11A同時表達(dá)在腫瘤細(xì)胞膜上和胞漿內(nèi)。因此，7BD-33-l1A抗體除了在體外能夠結(jié)合在肺瘤細(xì)胞上，也有證據(jù)說明抗原能夠在人體多種類型的腫瘤細(xì)胞上表達(dá)。如下所列舉，另有生物化學(xué)數(shù)據(jù)也支持7BD-33-11A識別的抗原是CD63。研究表明，兩種抗CD63單抗(RFAC4和H5C6),通過免疫沉淀法確定了7BD-33-11A識別并結(jié)合的蛋白。另外，細(xì)菌表達(dá)研究進(jìn)一步闡明了7BD-33-11A結(jié)合CD63細(xì)胞外loop2部位。7BD-33陽11A表位為構(gòu)象依賴性。這些免疫組化染色和生物化學(xué)結(jié)果證實(shí)了7BD-33-11A結(jié)合于CD63抗原。因此有大量的證據(jù)表明7BD-33-11A介導(dǎo)的抗肺瘤作用是通過和CD63上獨(dú)特的構(gòu)想表位相連接有關(guān)。對于本文而言，表位指的是CD63抗原的一部分，其特點(diǎn)是能夠和7BD-33-UA雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單抗結(jié)合，也可與抗原結(jié)合片段或者抗體結(jié)合物相結(jié)合?？偟膩碚f，上述數(shù)據(jù)結(jié)果證明了7BD-33-11A抗原是腫瘤相關(guān)抗原，在人體中表達(dá)，病理學(xué)上相應(yīng)的是腫瘤治療耙點(diǎn)。同時也證明7BD-33-11A抗體與人體腫瘤組織相結(jié)合，合理應(yīng)用于檢驗(yàn)?zāi)軌蜉o助診斷、早期治療和判斷預(yù)后。此外，該抗原在細(xì)胞膜上的表達(dá)部位能提示瘤細(xì)胞狀態(tài)，因?yàn)槎鄶?shù)非惡性細(xì)胞均不表達(dá)此抗原。這種觀察結(jié)果有助于應(yīng)用此抗原，及其基因以及衍生物，蛋白質(zhì)或者是變異成分，用于腫瘤性疾病的診斷，早期治療和預(yù)后判斷。本文介紹了7BD-33-11A的進(jìn)展和應(yīng)用，這是美國專利6,180,357所介紹內(nèi)容的進(jìn)一步發(fā)展，內(nèi)容包括7BD-33-UA識別，作用了解以及細(xì)胞毒試驗(yàn)，已建立或未建立的腫瘤生長動物模型以及紳瘤性疾病生存期觀察。該發(fā)明代表了腫瘤治療領(lǐng)域的新進(jìn)展，首次描述了一種能夠特異性與表達(dá)在腫瘤細(xì)胞上的靶分子CD63表位相結(jié)合的藥物，同時介紹了其在體外對惡性腫瘤細(xì)胞而不是正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性特點(diǎn)，該藥物在人腫瘤體內(nèi)模型中能夠直接抑制腫瘤生長，延長生存期。說這是一項發(fā)明進(jìn)展是由于之前任何關(guān)于抗CD63抗體的描述均無類似特點(diǎn)。它第一次清楚的證明了CD63在某些類型腫瘤中參與其生長和進(jìn)展過程。它還提出了腫瘤治療的一個潛在發(fā)展，即在人類胂瘤患者中它也具有類似的抗腫瘤特性。更深一層意義，將此抗體加入抗腫瘤抗體庫，將會增加一種可能性，這種可能性是指針對腫瘤細(xì)胞表達(dá)的不同抗原標(biāo)志物，來確定不同腫瘤細(xì)胞的適合抗體，以便能發(fā)現(xiàn)最有效針對抑制腫瘤生長和進(jìn)展的抗體?？偟膩碚f，本發(fā)明介紹了應(yīng)用7BD-33-11A抗原做為藥物治療的靶抗原，使用后能夠減輕哺乳動物腫瘤因表達(dá)該肺瘤抗原所引起的腫瘤負(fù)荷，延長接受治療動物的生存期。本發(fā)明還介紹了CDMAB(7BD-33-llA)及其衍生物、抗原結(jié)合片段的使用，具有與7BD-33-11A相同的作用。此外，本發(fā)明還介紹了腫瘤細(xì)胞內(nèi)7BD-33-11A的檢測能夠用于哺乳動物中表達(dá)此抗原的腫瘤性疾病的診斷、早期治療和預(yù)后判斷。如果患者在治療后病情難以控制或者腫瘤進(jìn)展，那么在腫瘤治療過程中產(chǎn)生的腫瘤特異性抗體能夠重復(fù)用于腫瘤再次治療階段。而且，可以將患者或者是適合的供者紅細(xì)胞和抗腫瘤抗體相連接，再次注入腫瘤轉(zhuǎn)移患者體內(nèi)。轉(zhuǎn)移性腫瘤幾乎沒有有效的治療方案，一旦轉(zhuǎn)移則通常預(yù)示最終死亡的不良結(jié)局。然而，轉(zhuǎn)移性腫瘤通常具有良好的血液供應(yīng)，利用紅細(xì)胞運(yùn)送抗腫瘤抗體能夠使抗體集中作用于腫瘤部位。即使在沒有轉(zhuǎn)移情況下，多數(shù)腫瘤細(xì)胞存活也需要依賴于患者的血液供應(yīng)，因此紅細(xì)胞結(jié)合抗體對于原位腫瘤也是有效的。抗體也可以連接于其他血細(xì)胞上，例如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等?？贵w分為五類，每種抗體由于其重鏈不同而具有不同的功能。通常認(rèn)為，肺瘤細(xì)胞的殺傷是通過抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)或者是補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(CDC)。例如，鼠lgM和IgG2a抗體和補(bǔ)體Cl結(jié)合能活化補(bǔ)體系統(tǒng)經(jīng)典途徑引起腫瘤細(xì)胞溶解。人類抗體中，IgM和IgGl具有較強(qiáng)的補(bǔ)體激活作用。鼠lgG2a和IgG3同種型能夠招募攜帶Fc受體的細(xì)胞毒細(xì)胞，并由此介導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和某些淋巴細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞殺傷作用。人IgGl和IgG3同種型能夠介導(dǎo)ADCC。另外一個抗體介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞殺傷作用的可能機(jī)制為使用具有催化作用的抗體催化細(xì)胞膜上各種化學(xué)鍵以及相關(guān)糖蛋白和糖脂的水解，這種抗體稱為催化抗體。另外兩個廣泛接受的抗體介導(dǎo)胂瘤細(xì)胞殺傷作用的可能機(jī)制為第一，利用抗體作為疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對腫瘤細(xì)胞上的可能存在抗原的免疫反應(yīng)；第二，利用抗體攻擊腫瘤生長相關(guān)受體，影響或下調(diào)其功能，甚至使其功能喪失?？鼓[瘤藥物的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)是藥物對疾病有效且危險因素在患者能夠接受的范圍內(nèi)。在腫瘤治療中，不管抗腫瘤作用在延長壽命之外還具備多少公認(rèn)的益處，延長生存期是最致力追求的目標(biāo)。除了不影響生存期，其它的益處包括減輕癥狀，保護(hù)和防止不良事件的發(fā)生，延長腫瘤復(fù)發(fā)時間和無癥狀生存期，延緩腫瘤進(jìn)展。人們通常接受上述標(biāo)準(zhǔn)，也體現(xiàn)了美國食品與藥品管理局(FoodandDrugAdministration,F.D.A.)認(rèn)可的藥物所具備的有益作用(Hirschfeldetal.CriticalReviewsinOncology/Hematolgy42:137-1432002)。眾戶斤周，除了這些標(biāo)準(zhǔn)之外，還有其他方面可以提示這些益處。部分的說，美國F.D.A對該藥的迅速批準(zhǔn)，認(rèn)可了預(yù)示對患者有益的替代藥物的存在。2003年底，已經(jīng)有16種用該方法生產(chǎn)的藥物，其中4種已經(jīng)完全通過批準(zhǔn)，后續(xù)的研究已經(jīng)證實(shí)了預(yù)測的藥物對患者的有益作用。對實(shí)體瘤的藥物治療效果的評定很重要的一個方面是測定腫瘤對治療的反應(yīng)，看腫瘤對患者的影響作用(Therasseetal.JournaloftheNationalCancerInstitute92(3):205-2162000)。腫瘤國際專家小組SolidTumorsWorkingGroup發(fā)布了一個臨床腫瘤治療反應(yīng)評估標(biāo)準(zhǔn)，即RECIST標(biāo)準(zhǔn)。依據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)對腫瘤患者藥物治療反應(yīng)進(jìn)行客觀評估，證明了藥物對腫瘤患者的有益作用。在臨床前期可以直接進(jìn)行評估和記錄。進(jìn)入臨床期后，藥物在臨床前期模型中所表現(xiàn)的延長生存期作用顯示出了最大的預(yù)期臨床效果。與臨床藥物治療效果相類似，在臨床前期能夠減輕腫瘤負(fù)擔(dān)的藥物能夠?qū)膊‘a(chǎn)生顯著直接的影響。盡管抗腫瘤藥物治療臨床結(jié)果最致力尋求的是延長存活期，但還有其它臨床價值，很明確的是能夠減輕腫瘤負(fù)荷，這點(diǎn)和延遲疾病進(jìn)展，延長生存期有關(guān)，由此產(chǎn)生對臨床有益的直接影響(Eckhardtetal.DevelopmentalTherapeutics:SuccessesandFailuresofClinicalTrialDesignsofTargetedCompounds;ASCOEducationalBook,39thAnnualMeeting,2003，pages209-219)。相應(yīng)的，本發(fā)明的目的是介紹一種方法，該方法由某些特殊個體衍生的細(xì)胞合成腫瘤性疾病可修飾性抗體，此抗體對腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用，同時對非腫瘤細(xì)胞相對沒有毒性。分離雜交瘤細(xì)胞以及其編碼產(chǎn)生的相應(yīng)的單抗和抗原結(jié)合片段是這種方法的主要目的。本發(fā)明的另外一個目的是介紹CDMAB及其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明更進(jìn)一步的目的是合成通過ADCC和CDC介導(dǎo)的腫瘤細(xì)月包毒性的CDMAB。本發(fā)明的另外一個目的是合成CDMAB,其細(xì)胞毒作用在于它能夠催化水解細(xì)胞化學(xué)鍵。本發(fā)明的另外一個目的是合成CDMAB，應(yīng)用于結(jié)合試驗(yàn)，輔助腫瘤疾病的診斷、預(yù)后判斷和病情監(jiān)測。通過本文下述的說明和例證，和本發(fā)明的某些具體描述，其它相關(guān)目的和好處將更加明了。本專利或申請文件包含了至少一頁彩圖。使用帶有彩圖的本專利申請需具備正式官方申請以及支付必要費(fèi)用。圖1:采用7BD-33-11A(圖A)或同種型對照(圖B)做為探針，對MDA-MB-231細(xì)胞溶解物(泳道1)或細(xì)胞膜(泳道2和3)進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)。左側(cè)為分子量標(biāo)志。圖2:采用7BD-33-llA做為探針，對MDA-MB-231細(xì)胞膜進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)。泳道l:還原條件下。泳道2:非還原條件下。左側(cè)為分子量標(biāo)志。圖3:去糖基化在7BD-33-11A與MDA-MB-231細(xì)胞膜結(jié)合中的作用。MDA-MB-231細(xì)月包膜分別經(jīng)糖肽酶F(PNGaseF;泳道1)、O-glycanase(泳道2)、唾液酸酶(泳道3)、PNGaseF、O-glycanase和唾液酸酶(泳道4),PNGaseF、O-glycanase、唾液酸酶、半乳糖苷酶和氨基葡糖苷酶(泳道5)以及緩沖液對照(泳道6)處理。左側(cè)為分子量標(biāo)志o圖4:7BD-33-llA免疫沉淀MDA-MB-231膜蛋白SDS-PAGE(圖A)和Westernblot(圖B)。泳道A:同種型對照免疫沉淀蛋白，泳道B:7BD-33-llA免疫沉淀蛋白，泳道TM:MDA-MB-231膜蛋白。矩形框標(biāo)示泳道B的SDS-PAGE和泳道TM的Westernblot。左側(cè)為分子量標(biāo)志。圖5:Profound搜索結(jié)果。圖6:MASCOT搜索結(jié)果。圖7a:以7BD-33-11A(圖A)、抗CD63(RFAC4克隆，圖B)、IgG2a同種型對照(圖C)和IgGl同種型對照(圖D)為探針的蛋白質(zhì)Westernblots。泳道A:MDA-MB-231總膜蛋白；泳道B:7BD-33-11A免疫沉淀蛋白；泳道C:抗CD63(RFAC4)免疫沉淀蛋白；泳道D:IgG2a同種型對照免疫沉淀蛋白；泳道E:IgGl同種型對照免疫沉淀蛋白。左側(cè)為分子量標(biāo)志。圖7b:以7BD-33-11A(圖A)、抗CD63(H5C6克隆，圖B)、IgG2a同種型對照(圖C)和IgGl同種型對照(圖D)為探針的蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)。泳道A:MDA-MB-231膜蛋白；泳道B:7BD-33-11A免疫沉淀蛋白；泳道C:抗CD63(H5C6)免疫沉淀蛋白；泳道D:IgG2a同種型對照免疫沉淀蛋白；泳道E:IgGl同種型對照免疫沉淀蛋白。左側(cè)為分子量標(biāo)志。圖8:以7BD-33-11A(圖A)、抗CD63(RFAC4克隆，圖B)、抗CD63(H5C6克隆，圖C)、IgG2a同種型對照(圖D)和IgGl同種型對照(圖E)為探針的蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)。泳道1-5:7BD-33-11A免疫沉淀蛋白；泳道6-10:IgG2a同種型對照免疫沉淀蛋白。泳道1和6:不含NaCl;泳道2和7:150mMNaCl;泳道3和8:500mMNaCl;泳道4和9:2000mMNaCl;泳道5和10:RIPA緩沖液。圖9:以7BD-33-11A(圖A)、抗CD63(RFAC4克隆，圖B)、抗CD63(H5C6克隆，圖C)、IgG2a同種型對照(圖D)為探針的蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)以及考馬斯膠藍(lán)蛋白染色(圖E)。左側(cè)為分子量標(biāo)志。泳道l:非誘導(dǎo)型vector;泳道2:非誘導(dǎo)型GST-EC1;泳道3:非誘導(dǎo)型GST-EC2;泳道4:誘導(dǎo)型vector;泳道5:誘導(dǎo)型GST-EC1;泳道6:誘導(dǎo)型GST-EC2。圖10:7BD-33-llA，同種型對照和抗EGFR抗不同腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞的典型流式細(xì)胞儀圖譜。圖11:7BD-33-llA(A),同種型陰性對照(B),抗CD63(RFAC4)抗體或抗CD63(H5C6)抗體(D)與正常人結(jié)腸組織結(jié)合典型組織切片顯微照片。7BD-33-llA，RFAC4和H5C6在固有層中的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)染色，RFAC4和H5C6在粘膜上皮也為強(qiáng)染色。放大倍數(shù)為200x。閱11.，DTV"11A/A、曰R日，WrBSrD、45r/D"CT八r14、UiJl厶./JJWJJ隱1丄A、^T"V乂，l一J'II'工l>M;"、、JJ乂,、1VA'^r"vi，y抗體(C)或抗CD63(H5C6)抗體(D)與人乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織結(jié)合典型組織切片顯微照片。7BD-33-11A與RFAC4或H5C6比較，前者在肺瘤細(xì)胞染色呈弱陽性。放大倍數(shù)為200x。圖13:7BD-33-11A(A)或抗Her2(c-erbB-2)抗體(B)與人乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織結(jié)合典型組織切片顯微照片。7BD-33-llA在腫瘤細(xì)胞內(nèi)染色為強(qiáng)陽性，抗Her2抗體染色為陰性。放大倍數(shù)為200x。圖14:7BD-33-llA與前列腺癌(A)或正常前列腺組織(B)結(jié)合典型組織切片顯微照片。7BD-33-llA在前列腺癌細(xì)胞膜上染色強(qiáng)陽性，在正常前列腺組織腺上皮細(xì)胞的胞膜和胞漿內(nèi)均陽性。放大倍數(shù)為200x。圖15:MDA-MB-231乳腺癌模型中，月中瘤生長對7BD-33-11A和同種型對照抗體的劑量反應(yīng)。箭號線表示抗體給予時間，數(shù)據(jù)點(diǎn)代表+/-SEM均值。圖16:MDA-MB-231異種移植模型研究，給予不同劑量7BD-33-llA和同種型對照抗體后的劑量反應(yīng)。圖17:MDA-MB-231乳腺癌才莫型中，7BD-33-llA，順鉑，7BD-33-11A+順鉑和緩沖液對照對腫瘤生長的影響。矩形框內(nèi)表示抗體給予時間，數(shù)據(jù)點(diǎn)代表+ASEM均值。圖18:MDA-MB-231乳腺癌模型中，7BD-33-llA，順鉑，7BD-33-llA+順柏和緩沖液對照對體重的影響。圖19:MDA-MB-468乳腺癌模型中，7BD-33-11A,順鉑，7BD-33-11A+順鉑和緩沖液對照對腫瘤生長的影響。箭號線表示抗體給予時間，數(shù)據(jù)點(diǎn)代表+/-SEM均值。圖20:MDA-MB-468乳腺癌模型中，7BD-33-llA，順鉑，7BD-33-11A+順柏和緩沖液對照對體重的影響。具體實(shí)施方式實(shí)施例1免疫印跡試驗(yàn)法確認(rèn)抗體結(jié)合蛋白為了能夠確定7BD-33-11A抗體識別的抗原，細(xì)胞膜預(yù)先需經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)膜。然后利用7BD-33-11A抗體探針檢測其所識別的抗原蛋白。l.細(xì)胞溶解，細(xì)胞膜碎片預(yù)處理。1.1.細(xì)胞溶解首先分離MDA-MB-231(MB-231)細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測證實(shí)為能與7BD-33-11A抗體結(jié)合的乳腺癌細(xì)胞。應(yīng)用細(xì)胞溶解物和預(yù)處理后的細(xì)胞膜進(jìn)行抗原識別和定性。獲得MB-231細(xì)胞溶解物步驟如下MB-231細(xì)胞林(1.5g)置入2ml緩沖液中進(jìn)行細(xì)胞懸浮，該緩沖液組成包括20mMTris，pH7.4,150mMNaCl，1%(v/v)TritonX-100,0.02%(w/v)疊氮化鈉(sodiumazide)，2mM原釩酸鈉(sodiumorthovanadate)，50mM氟化鈉(sodiumfluoride)和雞尾酒蛋白酶抑制劑(proteaseinhibitorcocktail)(RocheDiagnostics;Manheim，Germany)。然后用玻璃勻漿器進(jìn)行均一化處理，4。C攪拌并孵育1小時，4"C離心(20,000g)15分鐘，洗滌除去不能溶解的物質(zhì)。采集上清，等分，-80。C保存。BCA(bicinchoninicacid)測定法檢測細(xì)胞溶解物蛋白質(zhì)濃度(Pierce;Rockford,IL.)。1.2.細(xì)胞膜碎片預(yù)處理細(xì)胞膜來源于融合培養(yǎng)的MB-231乳腺癌細(xì)胞。首先用PBS(phosphatebufferedsaline)洗滌細(xì)胞，除去細(xì)胞間介質(zhì)。然后細(xì)胞解離加入解離緩沖液(Gibco-BRL;GrandIsland,NY)37。C平;f反振蕩器上振蕩20分鐘。采集細(xì)胞，4。C離心(900g)10分鐘。PBS再次洗滌細(xì)胞，重復(fù)4。C離心(900g)10分鐘。-8(TC保存。備膜首先需溶解細(xì)胞，然后在均質(zhì)緩沖液中(內(nèi)含ltablet/50ml完整的雞尾酒蛋白酶抑制劑(Roche;LavalQC))以3ml緩沖液/lg細(xì)胞的比例進(jìn)行再懸浮，利用置于冰面上的多向振蕩器使細(xì)胞懸液均一化以助細(xì)胞溶解。細(xì)胞勻漿置4。C離心(15,000g)10分鐘去除細(xì)胞核微粒。采集上清，分裝于不同試管，4。C離心(75，600g)90分鐘。小心移除上清，膜沉淀物置入5ml均質(zhì)緩沖液中再懸浮。全部試管采集的膜沉淀物混和并重新等分，4。C下離心(75,600g)90分鐘。仔細(xì)采集并移除上清，測量沉淀物重量。含有l(wèi)%TritonX-100的增溶溶解緩沖液按照3ml/lg沉淀物的比例加入緩沖液。置于冰面上平板振蕩器300rpm振蕩1小時，使膜沉淀物增溶。得到的混懸液再次離心(75,600g)，以沉淀不溶物質(zhì)。仔細(xì)移除含有可溶膜蛋白成分的上清液，測定蛋白質(zhì)濃度，-8(TC保存。2.1-維SDS-PAGE和免疫印跡試驗(yàn)MB-231細(xì)胞經(jīng)上述步驟獲得的膜蛋白，需經(jīng)1-維SDS-PAGE(1DSDS-PAGE)進(jìn)行分離，堆積膠和分離膠濃度分別為5%和10%。然后4。C過夜電轉(zhuǎn)印至PVDF膜(Millipore;Billerica,MA)。轉(zhuǎn)印的完全性主要取決于預(yù)先加入到膜上面分子標(biāo)志物的分子量。接下來將膜放入含5%(w/v)脫脂奶的TBST液，室溫下(RT)1小時。兩個相同的樣本用〗笨針才企測如下樣斑一使用7BD-33-llA抗體(5/xg/ml，溶劑為含5%脫脂奶的TBST)探針，樣斑二使用IgG2a同種型對照抗體(5/ig/ml，溶劑為含5%脫脂奶的TBST)探針。樣斑均在TBST溶液中洗滌三次，每次10分鐘，然后在辣根過氧化物酶結(jié)合的羊抗鼠IgG(Fc)溶液中孵育(Bio-RadLaboratories;Hercules,CA)，室溫下1小時。TBST洗滌三次，每次10分鐘。然后按照生產(chǎn)廠家的"i兌明書將樣斑放入TBM過氧化酶底物試劑盒中培養(yǎng)(VectorLaboratories;Burlingame，CA)。用清水漂洗樣斑，利用凝膠記錄系統(tǒng)獲得圖像結(jié)果(圖1和圖2)(Bio-Rad;Hercules,CA)。樣斑圖像是在照相機(jī)聚焦，光圈和影像獲得時間同樣條件下留取的。在圖1中，7BD-33-llA抗體結(jié)合的蛋白條帶分子量范圍是20-80kd，其蛋白活性在細(xì)胞溶解物和膜碎片中能夠檢測到。同種型對照中未發(fā)現(xiàn)抗體結(jié)合于MB-231細(xì)胞溶解物和膜碎片成分的任何蛋白，這表明了7BD-33-11A的結(jié)合是特異性的。圖2證明了在Westernblot中，還原劑對7BD-33-llA結(jié)合的影響。該抗體的活性僅僅在無還原劑存在的條件下才能夠被檢測到(泳道2)。還原劑例如DTT和/3-巰基乙醇能使抗體和抗原不能完全結(jié)合(泳道1),提示了7BD-33-11A對天然蛋白抗原表位的識別和結(jié)合依賴于二硫鍵的存在。為確定在Westernblot中檢測到的抗原分散特性是否由于異源性糖基化的作用，給予膜片段不同糖苷酶(糖肽酶F、o-glycanase、唾液酸酶、半乳糖普酶和氨基葡糖苷酶)處理，這些酶能夠去除特殊的碳水化合物基團(tuán)。處理后的樣品進(jìn)行IDSDS-PAGE和Westernblot。預(yù)期結(jié)果是如果某些酶移除了某些碳水化合物基團(tuán)，這些基團(tuán)又和7BD-33-11A抗體識別大量的抗原有關(guān)，那么在SDS-PAGE上就會出現(xiàn)差異。圖3顯示了糖苷酶處理后的來源于MB-231細(xì)胞的膜片段，結(jié)果提示抗體識別抗原量明顯減少。這說明7BD-33-11A抗體識別抗原至少和一種糖苷酶有關(guān)。顯著抗原活性僅僅出現(xiàn)在幾種酶同時作用條件下的事實(shí)表明，至少有某些碳水化合物成分形成了N連接碳水化合物。盡管經(jīng)過糖普酶處理的細(xì)胞膜在重量上有改變，但并未減輕抗原結(jié)合強(qiáng)度。這說明抗體首先結(jié)合在抗原糖蛋白的多肽部分。實(shí)施例27BD-33-11A抗體結(jié)合抗原的識別1.MB-231細(xì)胞膜碎片抗原免疫沉淀細(xì)胞膜提取物(蛋白質(zhì)總量為5mg)，加入適量lxlysis緩沖液(50mMTrispH7.4，150mMNaCl，1%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)，0.02%NaN3，2mM原釩酸鈉(sodiumorthovanadate),50mM氟化鈉和雞尾酒蛋白酶抑制劑(RocheDiagnostics,Manheim,Germany))稀釋至蛋白質(zhì)濃度1mg/ml。再加入適量2xRIPA緩沖液(50mM.三氨基甲烷鹽酸緩沖液(Tris)pH7.4,150mMNaCl，1.0%膽酸鈉(sodiumcholate),0.2%SDS，1%TritonX-100和0.02%NaN3),最終獲得lxRIPA緩沖液濃度。向提取物中預(yù)先加入G-瓊脂糖凝膠珠(G-Sepharosebeads)(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden),4°C預(yù)潔2小時。移出膜提取物，加入庫存BSA(10mg/ml)稀釋至濃度為0.5mg/ml。在預(yù)潔階段，加入1mLBSA(0.5mg/ml),封閉抗體連接G-瓊脂糖凝膠珠。封閉后，將抗體連接G-瓊脂糖凝膠珠加入含有BSA的膜提取物中，置于端對端旋轉(zhuǎn)器(end-over-endrotator)上4。C孵育3小時。4°C離心(20,000g)10秒鐘，移出并棄去未結(jié)合碎片。lmlRIPA緩沖液洗滌去除G-瓊脂糖凝膠珠，共洗滌3次，每次5分鐘。再次用PBS洗滌一次去除G-瓊脂糖凝膠珠。分別對7BD-33-11A抗體結(jié)合G-瓊脂糖凝膠珠試驗(yàn)組和IgG2a結(jié)合G-瓊脂糖凝膠珠對照組兩組樣品進(jìn)行免疫沉淀(BDBiosciences,SanDiego,CA)。該實(shí)驗(yàn)步驟是為了評估蛋白對免疫結(jié)合物的非特異性結(jié)合。完全去除PBS，G-瓊脂糖凝膠珠在40/xL非還原性緩沖液液樣品中煮沸，部分樣品進(jìn)行1DSDS-PAGE，繼以免疫印跡試驗(yàn)，剩余樣品以考馬斯膠藍(lán)染色。40/xL樣品中，8/iL用于SDS-PAGE和免疫印跡試驗(yàn)，32jtiL用考馬斯膠藍(lán)進(jìn)行蛋白質(zhì)染色，保留過夜。用于免疫印跡試驗(yàn)的樣本于320mA，2小時轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上，然后以去離子水漂洗，含5%脫脂奶的TBST室溫下封閉l小時，然后加入7BD-33-llA,4。C孵育過夜。TBST洗滌三次去除雜質(zhì)，每次洗滌10分鐘。然后加入HRP連接Fc特異性羊抗鼠IgG(1:5000),在含5%脫脂奶的TBST內(nèi)，室溫下孵育l小時。洗滌三次去除雜質(zhì)，每次10分鐘。然后依據(jù)HRP底物TMB的標(biāo)準(zhǔn)過程進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)育。如圖4所見，用分子量標(biāo)記作為參考，免疫印跡試驗(yàn)和考馬斯膠藍(lán)染色的凝膠為線形排列?？捡R斯膠藍(lán)染色最強(qiáng)的條帶和免疫印跡中與7BD-33-llA產(chǎn)生反應(yīng)的條帶相對應(yīng)。這一部分在圖4中顯示尤為突出(矩形框內(nèi))。2.肽圖和質(zhì)譜法識別抗原通過上面的試驗(yàn)，切下考馬斯膠藍(lán)染色和免疫印跡試驗(yàn)中活性最強(qiáng)部分相平行的條帶，然后使用胰蛋白酶商業(yè)試劑盒(Pierce,Rockford,IL)進(jìn)行水解。完全水解部分在SELDI-TOF賽弗吉PBSIIc閱讀器(CiphergenPBSIIcreader)(CiphergenBiosystemsInc.,Freemont，CA)上進(jìn)行質(zhì)譜分析。簡單來說，就是將能夠完全水解消化的部分人工放在H4芯片上(CiphergenBiosystemsInc.,Freemont,CA)。干燥,力口入CHCA基質(zhì)(a-cyano4-hydroxycinnaminicacid;CiphergenBiosystemsInc.,Freemont,CA)，再次干燥。PBSIIc閱讀器進(jìn)行樣品分析。從同種型對照組以及空白組和試驗(yàn)組相平行區(qū)域取類似大小的條帶并與7BD-33-11A免疫沉淀凝膠進(jìn)行銜接處理，以便能夠檢測出7BD-33-llA免疫沉淀抗原水解后產(chǎn)生的特殊肽段。大量的特殊肽段經(jīng)PROFOUND搜索。PROFOUND是應(yīng)用質(zhì)語分析得到的信息，搜索蛋白質(zhì)序列的數(shù)據(jù)庫公共在線工具。樣品經(jīng)過7BD-33-11A免疫沉淀水解后產(chǎn)生的特殊肽段在QSTAR(AppliedBiosystems,FosterCity5CA)上進(jìn)行MS/MS分析。QSTAR安裝了一個接口，因此能對前面經(jīng)過PBSIIc閱讀器分析的相同樣斑進(jìn)行分析。MS/MS數(shù)據(jù)然后進(jìn)行MASCOT分析，MASCOT也是一個公共在線工具，它利用來源于MS/MS波譜的信息來查找蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。圖5是從Profound搜索的結(jié)果。唯一能夠顯示做為候選蛋白，而又具有顯著可信程度的是CD63。圖6是從MASCOT搜索的結(jié)果。經(jīng)過識別唯一可能性最大的蛋白是CD63，支持以前用肽圖法檢測確證的結(jié)果。3.免疫沉淀法確定7BD-33-11A抗原通過檢測已知抗人CD63單抗(RFAC4和H5C6)能否與經(jīng)過7BD-33-llA免疫沉淀識別的抗原產(chǎn)生活性反應(yīng)，以確定7BD-33-11A假定抗原的存在，反之亦然。更進(jìn)一步確認(rèn)方法是通過用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合的人CD63細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域部分轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)型或非誘導(dǎo)型細(xì)菌，對細(xì)胞溶解所得到的產(chǎn)物進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)。MB-231細(xì)胞膜事先分別給予7BD-33-11A抗體、RFAC4(CymbusBiotechnologyLTD,Hants,UK)、H5C6(BDBiosciences,SanDiego，CA)、IgG2a和IgGj(BDBiosciences,SanDiego，CA)同種型對照處理，免疫沉淀后行IDSDS-PAGE，接下來進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)。等量免疫復(fù)合物樣品置于相同凝膠上進(jìn)行分析。電轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，用7BD-33-11A單抗、RFAC4、H5C6以及IgG2a和IgGi同種型對照探針檢測。圖7a顯示交叉免疫電泳試-瞼，抗體7BD-33-11A和RFAC4分別進(jìn)行免疫沉淀，繼以免疫印跡試驗(yàn)。圖7b顯示交叉免疫電泳試驗(yàn)，抗體7BD-33-llA和H5C6分別進(jìn)行免疫沉淀，繼以免疫印跡試-驗(yàn)。這三種抗體和7BD-33-11A免疫沉淀反應(yīng)識別的相似抗原存在交叉反應(yīng)。此外，7BD-33-llA在Westernblot中也與RFAC4和H5C6經(jīng)過免疫沉淀識別的相似抗原存在交叉反應(yīng)，抗原分子量為20-80kDa,但是不能夠和同種型對照抗體形成的免疫復(fù)合物產(chǎn)生交叉反應(yīng)。同種型對照抗體探針檢測樣斑結(jié)果為完全陰性。這些數(shù)據(jù)說明7BD-33-11A抗體識別的表位包含于CD63抗原內(nèi)。為了確定交叉反應(yīng)的存在是否是由于抗體識別的是同種分子，或者是否是由于具有相似分子量的分子的相互作用的存在，研究人員提高了緩沖液的限制性(50mMTris,pH7.4，1%TritonX-100,不同濃度NaCl:0，150，500和2000mM;RIPA緩沖液內(nèi)含500mMNaCl)，用7BD-33-11A進(jìn)行免疫沉淀。結(jié)果得到的免疫復(fù)合物分別加入7BD-33-11A,H5C6和RFAC4以及IgG2a和IgG!同種型對照進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)。圖8顯示在改變了免疫沉淀條件的限制性之后沒有對免疫復(fù)合物的產(chǎn)生引起任何可以;險測到的影響，這也說明了7BD-33-11A抗體識別的分子也同樣;陂抗CD63單抗識別，反之亦然。為了進(jìn)一步確定7BD-33-11A直接結(jié)合于人CD63抗原，通過免疫印跡試驗(yàn)，利用大腸桿菌表達(dá)人CD63細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(loopsEClandEC2)的重組融合肽，對大腸桿菌溶解產(chǎn)物進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)，進(jìn)一步評估抗體活性。為完成此工作，通過亞克隆合適的cDNA片,更加入細(xì)菌表達(dá)載體PGEX-4T-2(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)上，獲得CD63細(xì)胞外環(huán)狀結(jié)構(gòu)域(loop1和loop2-EC1和EC2)分別和GST的融合片段。多聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲得cDNA片段編碼的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，利用足夠長度的人cDNA做為模板(cloneMGC-8339,AmericanTypeCultureCollectionManassas,VA)。cDNA編石馬的EClloop通過下面PCR引物獲得5'引物(ECl—5'),5'GCCGTGGGATCCGGGGCACAGCTTGTCCTGS'3'3'引物(ECl—3'),5'GATGACGAATTCTCACAGAGAGCCAGGGGTAGC3'。cDNA編碼的EC2loop通過下面PCR引物獲得5'引物(EC2—5'),55'GGCTATGGATCCAGAGATAAGGTGATG3'和3'引物(EC2—3'),5'TACCAGAATTCAATTTTTCCTCAGCCAGCC3'。PCR反應(yīng)條件如下2gL的5'引物(25pmol/jtiL),2/xL的3'引物(25pmol//xL)，0.2/iL的DNA模板(pOTB-CD63,0.76mg/mL),45.8uL的PCRSuperMixHighFidelity(Invitrogen，Burlington,ON)。PCR步驟如下94。C加熱5分鐘，然后對如下過程^故30個循環(huán)94。C解鏈30秒鐘，55°C退火30秒鐘，72。C拉伸1分鐘。在亞克隆之后，只含有PGEX-4T-2載體的陰性對照組(其中不含有cDNA片段)，其結(jié)構(gòu)成分被轉(zhuǎn)移至大腸桿菌(BL-21株)。每次轉(zhuǎn)化過程中只有抗氨千西林菌落能夠生長，對各自插入的cDNAs進(jìn)行測序。在確定cDNA序列的正確性后，每一克隆被移植到液體培養(yǎng)基中，力口入lmMIPTG(isopropyl畫/3-D曙thiogalactopyranoside)(Gibco-BRL;Rockville,MD)誘導(dǎo)GST融合體的表達(dá)。孵育2小時，細(xì)菌培養(yǎng)物在室溫下離心(2，000g)5分鐘。棄去上清，細(xì)菌沉淀物在非還原性的SDS-PAGE緩沖液樣品中煮沸。然后如前所述進(jìn)行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺堆積膠和分離膠濃度分別為5%和12%)以及免疫印跡試驗(yàn)。樣斑進(jìn)行7BD-33-llA、H5C6、RFAC4和IgG2a同種型對照4笨針枱r測。圖9顯示研究結(jié)果為7BD-33-11A特異性識別人CD63的loop2(108-202位氨基酸)(泳道6)，不識別loop1(34-52位氨基酸)。這種抗體特異性識別細(xì)菌溶解物的觀察進(jìn)一步證明了兩個已經(jīng)定性的抗人CD63抗體(RFAC4和H5C6)也能夠識別相似蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)條帶僅僅位于誘導(dǎo)的大腸桿菌溶解物所表達(dá)的EC2融合多肽區(qū)。上述全部結(jié)果均證明7BD-33-llA能識別并直接結(jié)合人CD63,抗原特異性識別區(qū)域位于細(xì)胞外108-202位氨基酸。實(shí)施例3如S.N.10/348,231中所述，根據(jù)布達(dá)佩斯條約，雜交瘤細(xì)胞7BD-33-11A被存放于美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)收集所(AmericanTypeCultureCollection,10801UniversityBlvd.,Manassas,VA20110-2209onJuanuary8,2003)，保藏編號為PTA-4890。依據(jù)37CFR1.808，存放者確保公眾使用存放物的所有限制權(quán)不被取締，使用權(quán)屬于被授予專利者?？贵w生產(chǎn)7BD-33-11A單抗由CL-1000細(xì)頸瓶(BDBiosciences,Oakville,ON)培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生，每周采集并重新接種兩次?？贵w經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)抗體純化過程進(jìn)行純化，純化采用ProteinGSepharose4FastFlow(AmershamBiosciences,Baied'Urfe,QC)。如前美國專利10/348,231中所述，(表2)將7BD-33-llA與細(xì)胞毒試驗(yàn)陽性(抗Fas(EOS9.1,IgM，kappa,20ugs/mL,eBioscience，SanDiego，CA)、抗Her2/neu(IgGl，kappa，10ug/mL,InterMedico,Markham,ON)、抗EGFR(C225，IgGl,kappa，5ug/mL，Cedarlane，Hornby,ON)、環(huán)己酰亞胺(Cycloheximide)(100umol,Sigma,Oakville,ON)、NaN3(0.1%,Sigma,Oakville,ON))以及陰性對照相比較(107J(抗TNP，IgG!,kappa,20ug/mL，BDBiosciences,Oakville,ON)、G155-178(抗TNP，IgG2a,kappa,20ug/mL，BDBiosciences,Oakville,ON)、MPC畫ll(抗原特異性未知，IgG2b，kappa,20ug/mL)、J606(抗果聚糖，IgG3，kappa，20ug/mL)和IgG緩沖液(2%))。乳腺癌(MDA-MB-231(MB-231),MDA-MB-468(MB-468)，MCF畫7)、結(jié)腸癌(HT-29，SW1116,SW620)、肺癌(NCIH460)、卵巢癌(OVCAR)、前列腺癌(PC-3)和非腫瘤細(xì)胞(CCD27sk,Hs888Lu)經(jīng)過檢測(全部來源于ATCC,Manassas,VA)。利用分子探針進(jìn)行活體或者死亡細(xì)胞毒試驗(yàn)(Eugene,OR)。進(jìn)行試驗(yàn)主要依據(jù)生產(chǎn)廠家指南，如有更改在此說明。試驗(yàn)之前按照預(yù)定密度鋪細(xì)胞板。兩天后，純化抗體和對照均進(jìn)行稀釋，取100/iL加入細(xì)胞板，C02濃度5%孵育5天，翻轉(zhuǎn)倒空細(xì)胞板，干燥樣斑。取含有MgCl2和CaCl2的DPBS稀釋后的鈣綠熒光素染色劑50gL,加入每一試-瞼孔內(nèi)，C02濃度5%,37。C孵育30分鐘，翻轉(zhuǎn)倒空細(xì)胞板，干燥樣斑。室溫下用多通道速擠瓶將含有MgC12和CaC12的DPBS加入到試驗(yàn)孔內(nèi)，輕叩三次，翻轉(zhuǎn)倒空平板，干燥樣斑。熒光多孔板高效閱讀器(Perkin-ElmerHTS7000fluorescenceplatereader)讀取試驗(yàn)結(jié)果，獲得的數(shù)據(jù)用MicrosoftExcel進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。數(shù)據(jù)代表了四組試驗(yàn)的均值，按照如下細(xì)胞毒性試驗(yàn)的界限三倍方法表示定量在細(xì)胞毒性程度方面，4/4試驗(yàn)(+++)，3/4試驗(yàn)(++)，2/4試驗(yàn)(+)。表l內(nèi)未標(biāo)志細(xì)胞代表結(jié)果矛盾或者細(xì)胞毒性小于界限值。試驗(yàn)證實(shí)了7BD-33-11A抗體對乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞的選擇性細(xì)胞毒性作用，而對于未轉(zhuǎn)化的正常細(xì)胞無影響。試驗(yàn)證實(shí)了7BD-33-11A比抗Fas抗體陽性對照組對前列腺癌更強(qiáng)的殺傷活性?；瘜W(xué)性細(xì)胞毒藥物產(chǎn)生了預(yù)期的細(xì)胞毒作用，但是用于比較的許多誘導(dǎo)產(chǎn)生的其它抗體在提供限制條件的生物細(xì)胞試驗(yàn)中顯示了預(yù)期的效果。總的來說，7BD-33-11A抗體似乎對許多腫瘤細(xì)胞類型均有細(xì)胞毒性?？贵w在其活性方面的選擇性在于不是所有的瘤細(xì)胞都有易感性。更進(jìn)一步來說，抗體的功能特異性證據(jù)還在于它對非癌細(xì)胞產(chǎn)生不毒性作用，這在治療中是很重要的因素。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>用流式細(xì)胞儀(flowcytometry,FACS)檢測將7BD-33-11A結(jié)合于上述腫瘤組織細(xì)胞以及正常細(xì)胞或者其他另外的腫瘤細(xì)i包結(jié)腸(LOVO)、胰腺(BxPC-3)、卵巢(ES-2，OCC-I)和前列腺(DU-145)以及下述其他正常細(xì)力包(CCD-112)。細(xì)胞經(jīng)過流式細(xì)胞儀前，首先要經(jīng)過DPBS(不含€&++and]\^++)洗滌細(xì)胞單層。然后加入細(xì)胞解離緩沖液(INVITROGEN,Burlington,ON),37°C使細(xì)胞從培養(yǎng)板上脫離。離心并采集細(xì)l包，然后置入Dulbecco'sphosphatebufferedsaline，內(nèi)含MgCl2,CaCl2再懸浮，2%和25%FBS(fetalbovineserum),4°C洗脫并計數(shù)，分散成細(xì)胞密度適合的細(xì)胞簇，接下來在染色劑(DPBS,內(nèi)含MgCl2和CaCl2+/-2%FBS)中再懸浮，加入20jwg/mL7BD-33-llA或者對照抗體(同種型對照或抗EGFR)水面上放置30分鐘。在加入AlexaFluor488-結(jié)合次級抗體之前，細(xì)胞用洗脫液進(jìn)行洗滌。然后加入含有AlexaFluor488結(jié)合次級抗體的染色液保留20-30分鐘。最后一次洗滌細(xì)胞，染色液中再懸浮，該染色液中含有1/xg/mL碘化丙啶(propidiumiodide)和1.5%多聚曱醛，(paraformaldehyde)。樣品通過流式細(xì)胞^U企測獲得的細(xì)J包流計凄t應(yīng)用CellQuestsoftware(BDBiosciences)分析。細(xì)胞前向運(yùn)動(FSC)和側(cè)向分散(SSC)通過調(diào)整FSC和SSC探測器上的電壓振幅決定。三個熒光通道的探測器(FL1、FL2和FL3)的調(diào)整是通過讓經(jīng)過純化的同種型對照抗體染色的細(xì)胞和AlexaFluor488結(jié)合次級抗體先后流過，這些細(xì)胞具有相同的峰值和約l-5u的中位熒光強(qiáng)度。細(xì)胞流經(jīng)FSC后即可獲得所需的活性細(xì)胞和石典化丙咬排除物(propidiumiodideexclusion)(^皮采用時)。每一份樣品，需要約10,000活性細(xì)胞進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。表2顯示了在同種型對照基礎(chǔ)上平均熒光強(qiáng)度倍增特點(diǎn)，定性表示為<5(-);5to50(+);50tol00(++);>100(+++)，括號內(nèi)為細(xì)月包染色的百分比。圖9為具有代表性的7BD-33-llA組織學(xué)圖像。7BD-33-llA在如下腫瘤細(xì)胞結(jié)合特點(diǎn)相似乳腺癌(MB-231和MCF-7)、結(jié)腸癌(HT-29,SW1116和SW520)、肺癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌(PC-3);但在另一種乳腺癌(MB-468)、結(jié)腸癌(LOVO)和前列腺癌(DU-145)中結(jié)合特點(diǎn)不同。7BD-33-llA還能結(jié)合于非肺瘤細(xì)胞，但是這種結(jié)合不產(chǎn)生細(xì)胞毒性。這進(jìn)一步證明了抗體與其抗原配體的結(jié)合并不一定是提示預(yù)后的因素，這是不明顯的發(fā)現(xiàn)。這表明抗體在不同細(xì)胞上的不同配體是決定細(xì)胞毒性的因素，而不是抗體結(jié)合本身。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>實(shí)施例4正常人體組織染色免疫組化染色法曾用于了解7BD-33-11A抗原在人體的分布(S.N.10/603,006)。目前研究比較了7BD-33-llA和另外兩個抗CD63抗體(RFAC4和H5C6)的分布特點(diǎn)，在前面通過生物化學(xué)方法進(jìn)行的研究中證實(shí)7BD-33-11A抗原是CD63。把抗體與來源于人體正常器官組織語(Clinomics,Watervliet,NY)的24例正常人組織結(jié)合。任意單位抗體(7BD-33-l1A;RFAC4(CymbusBiotechnologyLtd.,Hants,UK)和H5C6抗CD63(BDPharMingen,Oakville，ON);鼠IgGi陰性對照(Dako，Toronto,ON))置于抗體稀釋緩沖液(Dako，Toronto,ON)中稀釋至濃度5/ig/ml，此濃度為經(jīng)過前述試驗(yàn)步驟后被認(rèn)為是最佳濃度。陰性對照組抗體經(jīng)過生產(chǎn)者驗(yàn)證對哺乳動物組織結(jié)合試驗(yàn)均為陰性。免疫組化染色步驟如下25例組織切片先經(jīng)烤箱58。C去石蠟化1小時，然后將標(biāo)本浸入二曱苯染色缸內(nèi)5次脫蠟，每次4分鐘。接下來依次通過系列濃度梯度乙醇(100%-75%)沖洗切片進(jìn)行再次水化。將玻片浸入pH6的10mM檸檬酸緩沖液(Dako,Toronto,Ontario),然后以微波烘烤，高、中和低火條件下各5分鐘，最后浸入冷PBS液中。取出玻片放入3%過氧化氫溶液內(nèi)，6分鐘后用PBS洗滌三次，每次5分鐘，干燥，置常用封閉緩沖液(Dako,Toronto,Ontario)中孵育，室溫下5分鐘。7BD-33-llA、鼠抗CD63單抗(CymbusBiotechnologyLtd.,Hants,UKorDako,Toronto,Ontario)或者同種型對照抗體(針對黑曲霉素葡糖氧化酶，該酶在哺乳動物體內(nèi)既不表達(dá)也不能通過誘導(dǎo)產(chǎn)生；Dako,Toronto,Ontario)在抗體稀釋緩沖液中均稀釋至5/ig/mL，室溫下放置1小時后孵育過夜。然后用PBS液洗滌玻片三次，每次5分鐘。接下來加入HRP結(jié)合的次級抗體(DakoEnvisionSystem,Toronto,Ontario),室溫下30分鐘，以4企測或觀察原始抗體的免疫活性。繼續(xù)加入DAB(3，3'-diaminobenzidinetetrahydrachloride,Dako,Toronto,Ontario)顯色底物進(jìn)行免疫過氧化酶染色，室溫下放置10分鐘。Meyer's蘇木精(SigmaDiagnostics,Oakville,ON)對比染色，繼以梯度乙醇(75-100%)進(jìn)行脫水處理，二曱苯洗滌。加封固劑后以蓋玻片覆蓋，置Axiovert200(ZeissCanada,Toronto,ON)顯微鏡下觀察，獲得數(shù)字影像，利用NorthernEclipseImagingSoftware(Mississauga,ON)進(jìn)行存儲。其結(jié)果由病理醫(yī)生進(jìn)4亍讀取、評分和i兌明。表3是對7BD-33-llA、RFAC4和H5C6抗CD63抗體正常組織染色試驗(yàn)圖譜結(jié)果的總結(jié)。7BD-33-UA的染色結(jié)果和前面所描述的相類似(S.N.10/603,006)。需要再次指出的是7BD-33-llA除了與浸潤巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞結(jié)合外，還限制性的結(jié)合于不同類型細(xì)胞。RFAC4和H5C6抗體的染色圖像結(jié)果相似。但是兩者的染色結(jié)果和7BD-33-11A完全不同。特別的，兩者能夠與更廣泛的正常組織結(jié)合，在7BD-33-11A染色同樣為陽性的區(qū)域，RFAC4和H5C6染色通常更強(qiáng)，且不僅與浸潤巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞結(jié)合，還可與大部分組織上皮細(xì)胞結(jié)合(圖11)。7BD-33-11A染色陽性的組織RFAC4和H5C6抗CD63抗體染色也為陽性(往往前者強(qiáng)度較后兩者弱)。7BD-33-11A陰性的組織則RFAC4和H5C6抗CD63抗體染色則通常并非也為陰性。這些結(jié)果i正明7BD-33-11A識別的組織僅^f叉是RFAC4和H5C6識別組織中的一'J、部分，在這些組織中，7BD-33-llA染色的強(qiáng)度通常較弱。這些結(jié)果也表明了7BD-33-11A結(jié)合的抗原并不是廣泛表達(dá)在正常組織上的，而是特異性的存在于人體部分組織中。這些結(jié)果同樣支持關(guān)于7BD-33-11A直接結(jié)合于CD63表位的生物化學(xué)試-驗(yàn)證據(jù)，即-使其識別的表位與RFAC4和H5C6所識別的用于這些免疫組化染色的CD63表位完全不同。表3RFAC4和H5C6抗CD63抗體與7BD-33-11A在人體正常組織IHC結(jié)果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>實(shí)施例5人體乳腺癌組織染色應(yīng)用免疫組化染色以確定腫瘤和7BD-33-11A抗原的關(guān)系，以及是否7BD-33-11A抗體能夠識別肺瘤(S.N.10/603,006)。目前對RFAC4和H5C6抗CD63抗體，c-erbB-2抗Her2抗體進(jìn)行了比較。乳腺癌組織樣品來源于50例乳腺癌患者，10例樣品來源于乳腺癌患者非腫瘤乳腺組織(ImgenexCorporation,SanDiego，CA)。收集每個患者如下信息年齡、性別、AJCC(AmericanJointCommitteeonCancer)腫瘤分期、淋巴結(jié)、雌激素受體以及黃體酮受體數(shù)據(jù)資料。按照例4中介紹的步驟進(jìn)行免疫組化染色。稀釋任意單位抗體至5/xg/mL,抗Her2抗體稀釋至1.5jiig/mL。表4、表5、表6和表7列出了7BD-33-llA、RFAC4和H5C6抗CD63抗體乳腺癌組織染色的結(jié)果?？偟膩碚f，50例標(biāo)本中7BD-33-11A染色陽性占36%,RFAC4和H5C6抗CD63抗體分別為85%和94%，在7BD-33-llA和RFAC4或H5C6染色均為陽性的組織，97%的樣品對RFAC4和H5C6比7BD-33-11A染色強(qiáng)(圖12)。在乳腺癌患者的正常乳腺組織染色中，7BD-33-11A(0/10)，RFAC4和H5C6抗CD63抗體(7/8,2份樣品表現(xiàn)不典型)染色陽性。在雌激素和黃體酮受體表達(dá)與7BD-33-11A抗原表達(dá)之間存在輕孩i相關(guān)性；任何一種受體表達(dá)陽性的組織7BD-33-11A表達(dá)均輕度增高。根據(jù)腫瘤分期和進(jìn)展程度進(jìn)行分析，結(jié)果顯示隨腫瘤分期增高7BD-33-11A有染色增強(qiáng)的趨勢。RFAC4存在類似的結(jié)果。H5C6也顯示出和雌激素和黃體酮受體表達(dá)的很輕微的相關(guān)關(guān)系，但是和腫瘤分期之間沒有明確相關(guān)。但是對于三種抗體來說，檢測結(jié)果均受到樣本量的限制。表4:人體乳腺癌7BD-33-11A免疫組化染色結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表5:人體乳腺癌RFAC4免疫組化染色結(jié)果結(jié)合分?jǐn)?shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表6:人體乳腺癌H5C6免疫組化染色結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>7BD-33-llA對腫瘤細(xì)胞特異性染色陽性，正常細(xì)月包染色陰性。細(xì)胞染色圖像定位發(fā)現(xiàn)7BD-33-11A抗原位于細(xì)胞膜和胞漿內(nèi)。抗CD63抗體RFAC4和H5C6在腫瘤組織細(xì)胞的染色也呈現(xiàn)相似的結(jié)果。另外，這兩種抗體在正常乳^i且織標(biāo)本染色也為陽性，但7BD-33-11A染色為陰性。與c-erbB-2比較，7BD-33-11A顯示出完全不同的染色圖像，18例7BD-33-llA染色陽性的標(biāo)本中9例Her2表達(dá)陰性，這提示腫瘤患者靶向治療的需要并沒有得到完全滿足(表8,圖13)。即使7BD-33-11A和Her2染色均陽性的乳腺癌肺瘤組織切片，在染色強(qiáng)度方面兩者也存在不同；一些乳腺癌組織切片7BD-33-llA顯示強(qiáng)陽性，但Her2僅為弱陽性，這反過來說明7BD-33-11A能夠特異性靶向治療不同乳腺癌腫瘤患者。c-erbB-2抗體在一例正常乳腺組織切片染色也呈陽性。這些結(jié)果表明了7BD-33-llA抗原大約在2/3的乳腺癌患者表達(dá)，其中有一半患者Her2完全陰性。染色結(jié)果表明在患者樣品中，抗體能與惡性細(xì)胞特異性結(jié)合，7BD-33-llA抗原在細(xì)胞膜上表達(dá)，因此成為具有吸引力的藥物治療靶點(diǎn)。盡管7BD-33-llA與RFAC4或H5C6抗-CD63抗體比較，7BD-33-11A染色具有更多局限性，但再次證明7BD-33-llA抗原表位是CD63上更局限的表位可能性。表7:人體乳腺癌和正常乳腺組織RFAC4和H5C6抗CD63與7BD-33-11A的免疫組化染色結(jié)果數(shù)據(jù)RFAC4H5C67BD-33-11A<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>注NR:樣品不具有代表性；F:切片標(biāo)本有折疊表8:人體乳腺肺瘤和正常乳腺組織中c-erbB-2抗Her2與7BD-33-11A免疫組化染色結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>實(shí)施例6人體前列腺組織染色為了確定7BD-33-11A是否表達(dá)于除乳腺癌之外的其它人體腫瘤，使用7BD-33-llA(S.N.10/603,006;Imgenex,SanDiego,CA)探針對多種人體腫瘤組織進(jìn)行檢測。在進(jìn)一步研究中，7BD-33-llA在人體前列腺癌中的染色圖^f象已經(jīng)確定(ImgenexCorporation,SanDiego，CA)。染色步驟見例4。抗體濃度為5pg/mL。如表9所示，88%人體前列腺癌7BD-33-11A染色陽性。盡管7BD-33-llA在正常組織切片染色也呈強(qiáng)陽性，但是和正常組織相比，腫瘤組織標(biāo)本中細(xì)另包膜染色更強(qiáng)。一例胚胎^t紋月幾肉瘤7BD-33-11A染色為陰性。在腫瘤的分期與7BD-33-11A抗原表達(dá)之間未發(fā)現(xiàn)直接相關(guān)關(guān)系。但是這些結(jié)果同樣受到樣本量小的影響。7BD-33-llA在前45列腺癌組織樣品中的著色部位仍舊為細(xì)胞膜上和細(xì)胞漿內(nèi)。與乳腺癌組織樣品比較，7BD-33-llA在前列腺癌組織細(xì)胞膜染色強(qiáng)度有所增加(圖14)。對于正常前列腺組織標(biāo)本來說，并沒有觀察到這種細(xì)胞膜染色強(qiáng)度的增加。表9:人體前列腺癌7BD-33-11A免疫組化染色結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>%因此，7BD-33-llA抗原不僅表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞膜上，也同樣表達(dá)于前列腺癌細(xì)胞膜上。這些結(jié)果說明了7BD-33-11A對于除乳腺癌之外其它腫瘤類型也可做為潛在的治療藥物。有大量證據(jù)說明7BD-33-11A介導(dǎo)的抗腫瘤作用是通過其和變化的CD63構(gòu)象型表位相結(jié)合完成的。在例2中已經(jīng)i兌明7BD-33-11A抗體能夠用于從表達(dá)抗原的細(xì)胞如MDA-MB-231免疫沉淀其所連接的抗原。進(jìn)一步，利用流式細(xì)胞儀、細(xì)胞酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫組化染色技術(shù)，能夠顯示7BD-33-llA檢測到的CD63上特異性結(jié)合于抗體的抗原部分。因此，免疫沉淀7BD-33-11A抗原后能夠抑制利用流式細(xì)胞儀、細(xì)胞酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫組化染色技術(shù)所顯示的7BD-33-11A結(jié)合于該類細(xì)月包及組織的作用。所以與7BD-33-llA—樣，其它抗CD63抗體也能夠通過免疫沉淀技術(shù)分離CD63抗原的其它構(gòu)型，應(yīng)用同樣的試驗(yàn)方法，抗原也能夠用于抑制其它抗體與表達(dá)同種抗原的細(xì)胞或纟且織結(jié)合。實(shí)施例7體內(nèi)MDA-MB-231腫瘤預(yù)防性抗體劑量反應(yīng)試驗(yàn)參考圖15和圖16的結(jié)果，挑選6到8周的雌性重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠，種植500萬MDA-MB-231人體乳腺癌細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞放在100/iL鹽水中于小鼠頸部經(jīng)皮下注射入體內(nèi)。所有小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只。腫瘤細(xì)胞種植后當(dāng)天腹腔內(nèi)分別注射0.2,2.0或20mg/kg7BD-33-11A,以及20mg/kglgG同種型對照抗體，抗體固體凝集物均經(jīng)稀釋液(2.7mMKC1,1mMKH2P04，137mMNaCl和20mMNa2HP04)稀釋至300/xL。每周重復(fù)注射一次。使用測徑器每七天測量一次腫瘤直徑直到有小鼠到達(dá)CCAC終點(diǎn)。研究過程中記錄小鼠體重。在治療終點(diǎn)(第55天)，0.2mg/kg治療組小鼠腫瘤體積是同種型對照組的15%。經(jīng)過配對t檢-瞼，其體積和對照組比4交體積減小85%，具有顯著性差異(pO.OOOl)。2.0或20mg/kg治療組小鼠在治療終點(diǎn)時仍無腫瘤生長。這種趨勢持續(xù)到超過治療期后。使用7BD-33-11A抗體治療，在不同的劑量組，和對照組相比均使小鼠生存期延長。對照組小鼠于試驗(yàn)第104天(給藥后第54天)全部死亡。與之相反，0.2mg/kg治療組則一直存活至第197天(給藥后第147天)，2.0mg/kg治療組中50%小鼠直到第290天仍舊存活(給藥后第240天)，此時20mg/kg治療組全部存活。因此三種不同劑量7BD-33-11A治療后，均明顯減少了腫瘤負(fù)荷，和同種型對照抗體組比較，延長了小鼠生存期。最高劑量治療組顯示出對腫瘤生長最大抑制效果(100%)和對生存期的最大延長(無死亡小鼠)。所以，7BD-33-llA是一種潛在的抗腫瘤抗體，其藥理和藥效學(xué)方面的好處表明該抗體可用于治療包括人在內(nèi)的哺乳動物腫瘤性疾病。實(shí)施例8體內(nèi)MDA-MB-231腫瘤聯(lián)合化療試驗(yàn)參照圖17和圖18，挑選6到8周雌性重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠，種植500萬MDA-MB-231人體乳腺癌細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞放在100/iL鹽水中于小鼠頸部經(jīng)皮下注射入體內(nèi)。使用測徑器每七天測量一次腫瘤直徑。于第41天，大多數(shù)小鼠腫瘤體積達(dá)到100mm3(48-122mm3)，經(jīng)過種植的8只小鼠被隨機(jī)分成4個治療組。7BD-33-llA抗體，順鉑(化療藥)，7BD-33-11A和順鉑，以及緩沖液對照，分別經(jīng)小鼠腹腔注射入體內(nèi)，其中7BD-33-l1A和順鉑濃度分別為10mg/kg和9mg/kg?？贵w固體凝集物及順柏均經(jīng)過稀釋液(2.7mMKC1，1mMKH2P04，137mMNaCl和20mMNa2HP04)稀釋至300/iL。7BD-33-11A或緩沖液每周注射三次，在種植后第64天總量為10劑，。分別于第1、3和9天注射順鉑。每七天使用測徑器測量腫瘤直徑直到種植后第125天或者是有小鼠達(dá)到CCAC終點(diǎn)。研究過程中記錄小鼠體重。研究結(jié)束根據(jù)CCAC指南對所有小鼠實(shí)行安樂死。應(yīng)用配對t檢驗(yàn)，7BD-33-llA、順鉑以及兩者聯(lián)合治療后腫瘤負(fù)荷均減少(圖16)。試驗(yàn)第69天(給藥后第5天)，三個組和緩沖液對照組比較均顯示腫瘤體積縮小，三組分別為對照組的76%(p<0.001)、79%^<0.001)和86%(p<0.001)。體重用于評價小鼠生存狀態(tài)。盡管順柏和7BD-33-11A顯示相似的腫瘤抑制作用，但是在體重下降程度方面，兩者并不相同。7BD-33-llA和緩沖液對照組比較在各時間觀測點(diǎn)上體重并無明顯差別，事實(shí)上，兩組在治療階段體重均有輕微增加。與之相反，順鉑治療組小鼠出現(xiàn)體重下降，且在最后一次藥物注射后更為明顯。在種植后第55天，即最后一次注射順鉑后第4天，順鉑治療組顯示體重下降24-30%。由此，在一個公認(rèn)的人體乳腺癌模型中7BD-33-11A和順鉑治療組與緩沖液對照組比較前兩者均能夠減少腫瘤負(fù)荷。但7BD-33-11A治療組和順鉑治療組小鼠在體重比較后顯示前者具有更好的生存狀態(tài)。這些結(jié)果顯示了7BD-33-11A抗體對于包括人在內(nèi)的哺乳動物腫瘤治療的藥理學(xué)、藥效學(xué)以及生活質(zhì)量方面的好處。實(shí)施例9體內(nèi)MDA-MB-468肺瘤聯(lián)合化療試驗(yàn)參照圖19和圖20，挑選6到8周雌性重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠，種植200萬MDA-MB-468人體乳腺癌細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞放在lOOjtiL鹽水中于小鼠頸部經(jīng)皮下注射入體內(nèi)。使用測徑器每七天測量一次腫瘤直徑。當(dāng)大多數(shù)小鼠肺瘤體積達(dá)到100mm3(11-119mm"時，種植后第27天將8只小鼠隨沖幾分成4組，分別將7BD-33-11A抗體、順鉑、7BD-33-11A和順柏，以及緩沖液對照經(jīng)小鼠腹腔注射入小鼠體內(nèi)，7BD-33-11A與順鉑濃度分別為10mg/kg和6mg/kg?？贵w固體凝集物和順柏均經(jīng)稀釋液(2.7mMKC1,1mMKH2P04,137mMNaCl和20mMNa2HP04)稀釋為300jtiL。7BD-33-11A和緩沖液對照第一周注射四次，然后每周注射三次，在種植后第50天達(dá)到總量11劑。分別于第1、6、11和16天注射順鉑。每七天使用測徑器測量腫瘤直徑，直到種植后第66天或者是有小鼠達(dá)到CCAC終點(diǎn)。研究過程中記錄小鼠體重。研究結(jié)束根據(jù)CCAC指南對所有小鼠實(shí)行安樂死。應(yīng)用配對t檢驗(yàn)，7BD-33-llA、順鉑以及兩者聯(lián)合治療后腫瘤負(fù)荷均減少(圖18)。試驗(yàn)第55天(給藥后第5天)，三個組和緩沖液對照組比較均顯示腫瘤體積縮小，三組分別為對照組的37%(p<0.3958)、950/。(pO.024)和97%(p<0.017)。體重用于評價小鼠的生存狀態(tài)。盡管順鉑和7BD-33-11A在很大程度上顯示了相似的腫瘤抑制作用，但是在體重下降程度方面，兩者并不相同。7BD-33-llA和緩沖液對照組比較在各時間觀測點(diǎn)上體重并無明顯差別，事實(shí)上，兩組在治療階段體重均有輕微增加。與之相反，順鉑治療組出現(xiàn)體重下降，且在最后一次注射后更為明顯。在種植后第48天，即最后一次注射順鉑后第4天，順鉑治療組顯示體重下降20%。由此，在另一個公認(rèn)的人體乳腺癌模型中7BD-33-11A和順柏治療組和緩沖液對照組比較前兩者均能夠減少腫瘤負(fù)荷。但是7BD-33-11A治療組和順鉑組動物在體重比較提示前者有更好的生存狀態(tài)?？偟膩碚f，在多種人腫瘤模型的試驗(yàn)結(jié)果中7BD-33-11A具有顯著有益作用(延長生存期，和對照組比較能減輕腫瘤負(fù)荷，和化療藥比較更好的耐受性)。這些結(jié)果顯示了7BD-33-11A抗體對于包括人在內(nèi)的哺乳動物腫瘤治療的藥理學(xué)、藥效學(xué)以及生活治療方面的好處。大量的證據(jù)表明7BD-33-11A通過結(jié)合CD63的細(xì)胞外loop2介導(dǎo)抗腫瘤作用。例2中表明7BD-33-11A能用于免疫沉淀MDA-MB-231細(xì)胞表達(dá)的結(jié)合抗原。進(jìn)一步應(yīng)用流式細(xì)胞儀、細(xì)胞酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫組化染色技術(shù)，能夠顯示7BD-33-11A所;險測的CD63上表達(dá)的特異性結(jié)合于抗體的抗原部分。因此，免疫沉淀7BD-33-11A抗原后能夠抑制利用流式細(xì)胞儀、細(xì)胞酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫組化染色技術(shù)顯示的7BD-33-11A結(jié)合于該類細(xì)月包或組織作用。所以和7BD-33-11A—樣，其它抗CD63抗體也能夠應(yīng)用免疫沉淀技術(shù)分離CD63抗原的其它構(gòu)型，應(yīng)用同樣的試驗(yàn)方法，抗原也能夠用于抑制其它抗體結(jié)合于表達(dá)同種抗原的細(xì)胞或組織。本專利說明書中任何專利和專利申請都提示了該項發(fā)明所屬的專業(yè)技術(shù)水平。在此所引用的全部專利和專利申請做為整體用于參考時和單個明確的專利相同。人們可以理解，當(dāng)解釋某一發(fā)明時，不受到這里描述和顯示的特別形式和安排部分的限制。對于那些在這方面的專業(yè)人員來說，雖然有不同的變化但是均不會離開該發(fā)明的范圍；本發(fā)明也不僅僅局限于在此專利說明范圍內(nèi)。一個專業(yè)人員很容易理解目前這項發(fā)明易于施行，并且獲得上述好處和結(jié)果，這是其本身所固有的特點(diǎn)。任何在此提到的寡核苷酸、肽、多肽、生物相關(guān)復(fù)合物、方法、步驟和技術(shù)都是目前所推薦的最具代表性的，具有可重復(fù)性，不僅局限于本發(fā)明范之前他們需要理解本發(fā)明的主旨，這些改變均定義在附加聲明內(nèi)。盡管本文前面描述本發(fā)明被特別優(yōu)先收錄，但是人們應(yīng)該能夠理解，如權(quán)利要求中所講，本發(fā)明并不過分局限于該特別收錄。事實(shí)上對于專業(yè)人員來說，明顯的對于前文所介紹的用于進(jìn)行本發(fā)明研究的各種模型的多種調(diào)整都在下面權(quán)利要求范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.抗腫瘤抗體或其片段在制備治療患者腫瘤的藥物中的用途，所述抗體或其片段的特點(diǎn)是具有對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，本質(zhì)上對非腫瘤細(xì)胞是良性的；其中所述抗體或其片段能夠與其在藥理上能接受的佐劑制成混和制劑；所述抗體做為分離的單抗或者是抗原結(jié)合片段能夠結(jié)合在腫瘤組織表達(dá)的抗原部分上，該部分特點(diǎn)是能被具有明確特性的抗體識別，這種抗體是由儲存在ATCC的PTA-4890克隆所編碼的。2.如權(quán)利要求l所述的用途，其中所述抗體或其片段為人源化或嵌合型。3.如權(quán)利要求l所述的用途，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段與選自毒素、酶、放射性化合物以及血細(xì)胞中的成員相結(jié)合，從而形成抗體結(jié)合物；以及；其中所述抗體或其片段結(jié)合物能夠和藥理上能接受的佐劑制成混和制劑。4.如權(quán)利要求3所述的用途，所述的抗體或其片段為人源化或嵌合型。5.如權(quán)利要求l所述的用途，其中抗體或其片段的細(xì)胞毒性指抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。6.如權(quán)利要求l所述的用途，其中抗體或其片段的細(xì)胞毒性指的是補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用。7.如權(quán)利要求1所述的用途，其中抗體或其片段的細(xì)胞毒性是通過催化水解細(xì)胞化學(xué)鍵而介導(dǎo)。8.如權(quán)利要求l所述的用途，其中抗體或其片段的細(xì)胞毒性是通過對腫瘤細(xì)胞上公認(rèn)的抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)而介導(dǎo)。9.如權(quán)利要求l所述的用途，其中抗體或其片段的細(xì)胞毒性是通過干擾細(xì)胞膜表面的膜蛋白功能而介導(dǎo)。10.如權(quán)利要求l所述的用途，其中抗體或其片段的細(xì)胞毒性是通過產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)蛋白構(gòu)象改變啟動細(xì)胞死亡信號而介導(dǎo)。11.抗腫瘤抗體或其抗原結(jié)合片段在制備用于治療患者腫瘤的藥物中的用途，其中所述抗體或其片段的特性是具有對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，對非腫瘤細(xì)胞具有良性作用；其中所述抗體是分離的由儲存于ATCC的PTA-4890克隆所編碼的單抗或其抗原結(jié)合片段，該抗體與藥理上能夠接受的佐劑制成混和制劑。12.如權(quán)利要求11所述的用途，其中所述抗體或其片段為人源化或者嵌合型。13.如權(quán)利要求11所述的用途，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段與選自毒素、酶、放射性化合物以及血細(xì)胞的成員形成抗體結(jié)合物；以及其中所述結(jié)合的抗體與藥理上能夠接受的佐劑制成混和制劑。14.如權(quán)利要求11所述的用途，/人所述亞類中選擇的所述抗體或其片段為人源化或者嵌合型。15.如權(quán)利要求11所述的用途，其中所述抗體或其片段的細(xì)胞毒性指的是抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。16.如權(quán)利要求11所述的用途，其中所述抗體或其片段的細(xì)胞毒性指的是補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用。17.如權(quán)利要求11所述的用途，其中所述抗體或其片段的細(xì)胞毒性是通過催化水解細(xì)胞化學(xué)鍵而介導(dǎo)。18.如權(quán)利要求11所述的用途，其中所述抗體或其片段的細(xì)胞毒性是通過對腫瘤細(xì)胞上公認(rèn)的抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)而介導(dǎo)。19.如權(quán)利要求11所述的用途，其中所述抗體或其片段的細(xì)胞毒性是通過干擾細(xì)胞膜表面的膜蛋白功能而介導(dǎo)。20.如權(quán)利要求11所述的用途，其中所述抗體或其片段的細(xì)胞毒性是通過產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)蛋白構(gòu)象改變啟動細(xì)胞死亡信號而介導(dǎo)。cd63抗原部分的人體腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性的藥物中的用途，所述抗體或其抗原結(jié)合片段是分離的單抗或其抗原結(jié)合片段，能夠與所述的被表達(dá)的CD63抗原部分結(jié)合，所述抗原部分的特征是它被具有單抗識別特性并由ATCC保藏編號為PTA-4890的克隆編碼的抗體所結(jié)合，從而細(xì)胞毒的發(fā)生是該結(jié)合的結(jié)果。21.<image>imageseeoriginaldocumentpage5</image>22.如權(quán)利要求21所述的用途，所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段為人源化或者嵌合型。23.如權(quán)利要求21所述的用途，所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段與細(xì)胞毒素、酶合放射性化合物以及血細(xì)胞結(jié)合，由此可形成抗體結(jié)合物。24.如權(quán)利要求21所述的用途，所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段為人源化或嵌合型。25.如權(quán)利要求21所述的用途，所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段為鼠源型。26.如權(quán)利要求21所述的用途，所述的人體腫瘤選自結(jié)腸癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌。27.確定表達(dá)CD63抗原部分的細(xì)胞的存在的結(jié)合測定，所述CD63抗原部分與分離的單抗或其抗原結(jié)合片段結(jié)合，所述抗體由ATCC保藏編號為PTA-4890的克隆所編碼，包括提供細(xì)胞樣品；提供分離的單抗或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原結(jié)合片段是與所述表達(dá)的CD63抗原部分相結(jié)合的分離的單抗或其抗原結(jié)合片段，該抗體具有單抗的識別特性并由ATCC保藏編號為PTA-4890的克隆所編碼；將所述分離的單抗或其抗原結(jié)合片段與所述細(xì)胞樣品相接觸；以及確定所述分離的單抗或其抗原結(jié)合片斷與所述細(xì)胞樣品的結(jié)合；從而確定表達(dá)與所述分離的單抗或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合的CD63抗原部分的細(xì)胞的存在。28.如權(quán)利要求27中所述的結(jié)合測定，所述的細(xì)胞樣品是從患有結(jié)腸癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌或者乳腺癌的患者腫瘤組織中獲得。29.分離的單抗或其抗原結(jié)合片段在制備用于確定細(xì)胞存在的結(jié)合測定的試劑中的用途，所述細(xì)胞為表達(dá)CD63抗原部分的細(xì)胞，所述CD63抗原部分與所述分離的單抗或其抗原結(jié)合片段結(jié)合，所述抗體由ATCC保藏編號為PTA-4890的克隆所編碼。30.如權(quán)利要求29所述的結(jié)合測定，所述的細(xì)胞來自結(jié)腸癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌或者乳腺癌的腫瘤組織。31.從表達(dá)CD63抗原部分的樣品中分離或者篩選能夠特異性結(jié)合分離的單抗或者抗原結(jié)合片段的細(xì)胞的分離或者篩選方法，其中所述的抗原部分特性是能夠被被抗體識別，而此抗體是由儲存在ATCC的PTA-4890克隆編碼的，該方法包括提供細(xì)胞樣品；提供分離的單抗或者抗原結(jié)合片段，并且能夠和上述表達(dá)的CD63抗原部分結(jié)合，該抗原部分的特性是能夠被抗體識別，而此抗體是由儲存在ATCC的PTA-4890克隆編碼的；分離的單抗或者抗原結(jié)合片段和上述細(xì)胞樣品相互作用；確定上述分離的單抗或者抗原結(jié)合片段和上述細(xì)胞樣品相互作用；由此，CD63抗原部分能夠特異性結(jié)合于儲存在ATCC的PTA-4890克隆所編碼的分離的單抗或者抗原結(jié)合片段，這樣就能明確細(xì)胞樣品中能夠表達(dá)該CD63抗原部分的細(xì)胞。32.如權(quán)利要求31所述的方法，所述的細(xì)胞樣品是從患有包括結(jié)腸癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌或者乳腺癌的腫瘤患者腫瘤組織中獲得.33.單抗或其抗原結(jié)合片段在制備通過治療哺乳動物體內(nèi)人體肺瘤來延長生存期和/或延緩疾病進(jìn)展的藥物中的用途，其中所述腫瘤表達(dá)特異性結(jié)合于單抗或其抗原結(jié)合片段的抗原，所述抗體或其抗原結(jié)合片段具有儲存在ATCC的PTA-4890克隆所編碼的單抗的識別特性。34.如權(quán)利要求33所述的用途，所述的抗體與細(xì)胞毒性部分相結(jié)合。35.如權(quán)利要求33所述的用途，所述的細(xì)胞毒性部分是指放射性表位。36.如權(quán)利要求33所述的用途，所述的抗體能激活補(bǔ)體。37.如權(quán)利要求33所述的用途，所述的抗體能介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞毒性作用。38.如權(quán)利要求33所述的用途，所述的抗體為鼠源型抗體。39.如權(quán)利要求33所述的用途，所述的抗體為人源化抗體。40.如權(quán)利要求33所述的用途，所述的抗體為嵌合型抗體。全文摘要本發(fā)明涉及應(yīng)用腫瘤性疾病可修飾性抗體(CDMAB)7BD-33-11A治療人體腫瘤，以及分離和確定表達(dá)CD63抗原部分的腫瘤細(xì)胞。能與該抗原部分結(jié)合的7BD-33-11A單抗(ATCC登錄號PTA-4890)對表達(dá)CD63抗原部分的細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用。7BD-33-11A單抗能夠有助于延緩人體腫瘤的進(jìn)展。文檔編號C07K16/28GK101214376SQ200710308360公開日2008年7月9日申請日期2005年3月23日優(yōu)先權(quán)日2004年3月26日發(fā)明者大衛(wèi)·S·F·楊,海倫·P·芬德利,蘇姍·E·哈恩,路易斯·A·G·唐克魯茲申請人:阿里烏斯研究公司