專利名稱：新的表面外露流感嗜血菌蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)E；pE)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉M面外露蛋白質(zhì)E，其為毒力因子，存在于所有有莢膜的 和非典型的流感嗜血菌(/^ie/m /^i7附iV(/Z"ewz恥)中。
背景技術(shù)：
b型流感嗜血菌(Hib)和非典型流感嗜血菌(NTHi)都可以在兒童和成 人中引起多種疾病。Hib在4歲以下兒童中引起細(xì)菌性腦膜炎和其他侵入 性感染，而NTHi從中耳炎、鼻竇炎、會厭炎、支氣管炎和肺炎病例中分 離出來，其可引起新生兒膿毒癥。目前還沒有商業(yè)上可獲得的抗NTHi疫 苗，但是已使用多種抗Hib的疫苗。這些疫苗包括Hib莢膜多糖、磷酸聚 核糖基核糖醇(polyribosyl ribitol phosphate )，所述磷酸聚核糖基核糖醇 與多種蛋白質(zhì)載體(腦膜炎球菌外膜復(fù)合物、破傷風(fēng)類毒素、白喉毒素?zé)o毒 突變體或白喉類毒素)綴合，從而克服小于18個月的兒童對莢膜多糖產(chǎn)生 的弱的免疫應(yīng)答。流感嗜血菌外膜蛋白(OMPs)也可以作為多核糖基磷酸核 糖醇的載體，因為它們是Hib和NTHi感染以后宿主抗體的目標(biāo)。在對抗 流感嗜血菌感染的體內(nèi)防御和體外殺菌試驗中檢測OMPPl、 P2、 P4、 P5 和P6和98-kDa蛋白質(zhì)的抗體，Pl、 P4和P6的抗體顯示對抗同源和異 源流感嗜血菌菌林的生物學(xué)活性。其他OMP的抗體缺乏異源防御的部分 原因是這些蛋白質(zhì)在不同流感嗜血菌菌林中的抗原多樣性。因此，理想的 抗原必須是外露于細(xì)菌表面且具有良好的抗原保守性。在本實驗室中，分 離、克隆、測序了一種"-kDa的膜蛋白(蛋白質(zhì)D),其在Hib和NT扭 菌林中廣泛分布且具有抗原保守性，同時其為致病因子和可能的疫苗候選 者(l-5)。
二十年以前發(fā)現(xiàn)流感嗜血菌和粘膜炎莫拉菌(7kf. cato/rAtf/is)對于可 溶的和表面結(jié)合的人IgD具有強(qiáng)親和力(6)。 IgD結(jié)合似乎與細(xì)胞水平上與 表面結(jié)合的IgD的類似相互作用是平行的，該現(xiàn)象解釋了流感嗜血菌和粘 膜炎莫拉菌對人淋巴細(xì)胞的強(qiáng)促有絲分裂作用(7-9)。分離和克隆了來自流 感嗜血菌的IgD結(jié)合外膜蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)D)，其為重要的致病性因子(l-5)。 然而，蛋白質(zhì)D不都結(jié)合于所有的IgD骨髓瘤(lO)。
發(fā)明概述
由于發(fā)現(xiàn)流感嗜血菌是上和下呼吸道感染的重要原因，目前需要U 用于對抗流感嗜血菌的疫苗。
因此，本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)流感嗜血菌與機(jī)體細(xì)胞和免疫系統(tǒng)相互作 用的方式，并且能夠提供新型疫苗。
本發(fā)明的一方面提供可以在流感嗜血菌中檢測到的表面外露蛋白質(zhì)， 其具有標(biāo)識號為Sequence ID No. 1的M酸序列，或其片段、同源物、功 能性等同物、衍生物，降解或羥基化、磺化或糖基化產(chǎn)物，或其他次級加 工產(chǎn)物。
本發(fā)明的另一方面提供所a面外露蛋白質(zhì)的免疫原性片段，該片段 可以在流感嗜血菌中檢測到，或者是其天然存在的或人工修飾的變體。
本發(fā)明的另一方面提供基于上述表面外露蛋白質(zhì)的重組免疫原性蛋 白質(zhì)，其中Sequence ID No. 1的第1-21位^J^酸缺失或被一個或多個氨 基酸取代。在一個實施方案中，Sequence ID No. l序列的第1-21位氨基酸 被0-21個任選氨基酸的序列所取代。在另一個實施方案中，重組免疫原性 蛋白質(zhì)具有標(biāo)識號為Sequence ID No. 2的氨基酸序列，或其片段、同源物、 功能性等同物、衍生物，降解或羥基化、磺化或糖基化產(chǎn)物，或其他次級 力口工產(chǎn)物。
本發(fā)明的另一方面提供具有標(biāo)識號為Sequence ID No.3的^J^酸序列 的肽，或其片段、同源物、功能性等同物、衍生物，降解或羥基化、磺化 或糖基化產(chǎn)物，或其他次級加工產(chǎn)物。
本發(fā)明的仍然另一方面提供具有標(biāo)識號為S叫uence ID No.4的氨基酸
序列的肽，或其片段、同源物、功能性等同物、衍生物，降解或羥基化、 磺化或糖基化產(chǎn)物，或其他次級加工產(chǎn)物。
本發(fā)明的另 一方面還提供具有標(biāo)識號為Sequence ID No.5的M^ 列的肽，或其片段、同源物、功能性等同物、衍生物，降解或羥基化、磺 化或糖基化產(chǎn)物，或其他次級加工產(chǎn)物。
本發(fā)明的另 一方面提供具有標(biāo)識號為Sequence ID No.6的M酸序列 的肽，或其片段、同源物、功能性等同物、衍生物，降解或羥基化、磺化 或糖基化產(chǎn)物，或其他次級加工產(chǎn)物。
本發(fā)明的仍然另 一方面提供具有標(biāo)識號為Sequence ID No.7的氨基酸 序列的肽，或其片段、同源物、功能性等同物、衍生物，降解或羥基化、 磺化或糖基化產(chǎn)物，或其他次級加工產(chǎn)物。
本發(fā)明的另 一方面還提供具有標(biāo)識號為Sequence ID No.8的氨基^ 列的肽，或其片段、同源物、功能性等同物、衍生物，降解或羥基化、磺 化或糖基化產(chǎn)物，或其他次級加工產(chǎn)物。
本發(fā)明的另 一部分提供具有標(biāo)識號為Sequence ID No.9的^酸序列 的肽，或其片段、同源物、功能性等同物、衍生物，降解或羥基化、磺化 或糖基化產(chǎn)物，或其他次級加工產(chǎn)物。
本發(fā)明的另一方面提供具有標(biāo)識號為Sequence ID No.10的#^* 列的肽，或其片段、同源物、功能性等同物、衍生物，降解或羥基化、磺 化或糖基化產(chǎn)物，或其他次級加工產(chǎn)物。
本發(fā)明的另 一方面提供至少一種上述蛋白質(zhì)、片段或肽在制備用于預(yù) 防或治療感染的藥物中的用途。在一個實施方案中，感染由流感嗜血菌引 起，且在另一個實施方案中，流感嗜血菌是有莢膜的或非典型的。在另一 個實施方案中，所述用途是用于預(yù)防或治療兒童的中耳炎、鼻竇炎或下呼 吸道感染，和成人的例如慢性梗阻性肺疾病(COPD)。
本發(fā)明的一個方面提供包含至少一種上述蛋白質(zhì)、片段或肽的藥物， 其也包含一種或多種可藥用佐劑、介質(zhì)、賦形劑、結(jié)合劑、栽體、防腐劑、 緩沖劑、乳化劑、濕潤劑或利于轉(zhuǎn)染的化合物。
本發(fā)明的另一方面提供包含至少一種上述蛋白質(zhì)、片段或肽的疫苗組 合物。在一個實施方案中，所述疫苗組合物包含至少一種所述蛋白質(zhì)、片 段或肽的二-、三-或多聚體。在另一個實施方案中，疫苗組合物還包含一 種或多種可藥用佐劑、介質(zhì)、賦形劑、結(jié)合劑、栽體、防腐劑、緩沖劑、 乳化劑、濕潤劑或利于轉(zhuǎn)染的化合物。在另一個實施方案中，所述疫苗組 合物包含至少一種其他疫苗，而且在另一個實施方案中，其包含另一分子 的免疫原性部分，其中另一分子的免疫原性部分可以選自流感嗜血菌的蛋
白質(zhì)D(EP 594 610)、粘膜炎莫拉菌(^/^0^//" c"似/r/rtf/is)的MID (WO 03/004651、 WO 97/41731和WO96/34960)、粘膜炎莫拉菌的UspAl或 UspA2(W093/03761),和任意呼吸道病原體的外膜蛋白質(zhì)或糖類莢膜、或 DNA寡核苷酸、例如CpG基序。
本發(fā)明的一個方面涉及編碼上述蛋白質(zhì)、片段或肽的核*列，及其 同源物、多態(tài)變體、降解和剪接變體。在一個實施方案中，所述核酸序列 與至少另一種基因融合。
本發(fā)明的另 一方面涉及包含上述核酸序列的質(zhì)?；蚴删w。 本發(fā)明的另一個實施方案還涉及包含至少一種上述質(zhì)粒的非人宿主， 所述非人宿主能夠產(chǎn)生上述蛋白質(zhì)、片段或肽，及其同源物、多態(tài)變體、 降解和剪接變體，并且該宿主選自細(xì)菌、酵母和植物。在一個實施方案中，
所述宿主是大腸桿菌。
本發(fā)明的另一方面提供融合蛋白質(zhì)或多肽，其中通過使用上述重組核 ^列使上述蛋白質(zhì)、片段或肽與至少另一種蛋白質(zhì)結(jié)合。在一個實施方 案中，所述融合蛋白質(zhì)是上述蛋白質(zhì)、片段或肽的二-、三-或多聚體。
本發(fā)明的一個方面涉及融合產(chǎn)物，其中上述蛋白質(zhì)、片段或肽共價或 通過其他方式與蛋白質(zhì)、糖類或基質(zhì)結(jié)合。
本發(fā)明的另一方面涉及分離上述蛋白質(zhì)、片段或肽的方法，所述方法 包含下列步驟
a)培養(yǎng)含有所述蛋白質(zhì)、片段或肽的編碼DNA的流感嗜血菌或大腸桿 菌，收集細(xì)菌并分離外膜或包涵體；
b) 用強(qiáng)溶解劑(solvatising agent)'溶解包涵體；
c) 加入復(fù)性劑；和
d) 得到的混懸液以pH8-10的緩沖液透析。
在所述方法的一個實施方案中，溶解劑是鹽酸胍(guanidium hydrochloride),而在另一個實施方案中復(fù)性劑是精氨酸(arginin)。
本發(fā)明的另 一方面涉及上述藥物或疫苗組合物，其包含所述融合蛋白 質(zhì)或多肽、或所述融合產(chǎn)物。
本發(fā)明的一個方面涉及預(yù)防或治療個體感染的方法，其包含施用藥學(xué) 有效量的上述藥物或疫苗組合物。在一個實施方案中，所述感染由有莢膜 的或非典型的流感嗜血菌引起，而在另一個實施方案中，感染選自中耳炎、 鼻竇炎或下呼吸道感染。
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)E，具體是蛋白質(zhì)E多肽和蛋白質(zhì)E多核苷酸，以 及產(chǎn)生它們所用的重組材料和方法。在另一方面，本發(fā)明涉及使用此類多 肽和多核苷酸的方法，包括預(yù)防和治療孩i生物疾病(microbial disease)等 等。在另一方面，本發(fā)明涉及檢測微生物感染相關(guān)疾病和此類感染的相關(guān) 病癥的診斷測定，例如檢測蛋白質(zhì)E多核苷酸或多肽的表達(dá)或活性的測定。
通過閱讀以下描述和本公開文本的其他部分，公開的本發(fā)明的精神和 范圍的多種改變和修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
附圖描述


圖1.通過IgD(k)骨髓瘤蛋白質(zhì)檢測16.3kDa的流感嗜血菌蛋白質(zhì)E。 A中顯示在流感嗜血菌772中pE表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析。圖示Empigen -處理的流感嗜血菌MinnA外膜蛋白質(zhì)的SDS-PAGE和Western印跡(B) 以及二維SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(C)。圖示Q-瓊脂糖分離前(B)和后 (C)的外膜蛋白質(zhì)提取物。C中的箭頭表示相應(yīng)凝膠Western印跡(用IgD(X) 作為探針)上pE的預(yù)測位置。A中細(xì)菌和IgD(k)骨髓瘤蛋白質(zhì)一起上樣， 然后與兔FITC綴合的抗IgD pAb —起孵育并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。B中 顯示考馬斯亮藍(lán)染色的SDS凝膠(染色)和以人骨髓瘤IgD(X)為探針、1^
與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗人IgD多克隆抗體一起孵育的Western印 跡。上樣前樣品在2-巰基乙醇存在下煮沸10分鐘。
圖2.表達(dá)pE的大腸桿菌與流感嗜血菌3655野生型和pE缺失突變體 相比較的流式細(xì)胞術(shù)i普。攜帶空載體pUC18的大腸桿菌(A)與含流感嗜血 菌772基因組DNA(基因HI0175到HI0178)的pUC18轉(zhuǎn)染的細(xì)菌(B)相比 較。顯示了在非典型流感嗜血菌3M5野生型(C)和相應(yīng)突變體(D)中的pE 表達(dá)。大腸桿菌菌株JM83和流感嗜血菌在液體培養(yǎng)基中生長過夜。大腸 桿菌與人骨髓瘤IgD(k)—同在冰上孵育。 一小時以后洗滌，加入FITC綴 合的兔抗人IgD pAb再孵育30分鐘，然后進(jìn)行洗滌步驟，隨后進(jìn)行流式 細(xì)胞術(shù)分析。對流感嗜血菌3655或衍生的pE突變體，使用特異性兔抗 pE多克隆抗體和FITC綴合的山羊抗兔pAb進(jìn)行同樣的操作。
圖3.通過流式細(xì)胞術(shù)和IgD(X)骨髓瘤血清顯示流感嗜血菌和相關(guān)種 中的pE表達(dá)。分析了 22個NTHi和27個嗜血菌屬物種或相關(guān)細(xì)菌菌林。 細(xì)菌生長到靜止期，并與人骨髓瘤IgD(k)在冰上共同孵育。 一小時以后洗 滌，加入FITC綴合的兔抗人IgD多克隆抗體(pAb)再孵育30分鐘，然后 進(jìn)行洗滌步驟，隨后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。
圖4. Western印跡顯示pE在NTHi和有莢膜的流感嗜血菌中表達(dá)。 來自所示菌林的細(xì)菌蛋白質(zhì)用Empigen⑧制備，進(jìn)行SDS凝膠電泳，然后 以人骨髓瘤IgD(X)為探針進(jìn)行Western印跡，并用辣根過氧化物酶綴合的 山羊抗人IgD多克隆pAb作為檢測抗體。
圖5.相對于流感嗜血菌MinnA的天然pE，基于NTHi772序列的重 組pE22-160。 A中為pE衍生片段A的氨基端序列與天然蛋白質(zhì)pE預(yù)測 的氨基端序列相比較。B中為具有組氨酸標(biāo)記的pE(A)的示意圖。C中為 在考馬斯亮藍(lán)染色的PAGE上證明的大小和純度。D和E為考馬斯亮藍(lán)染 色的凝膠和Western印跡中流感嗜血菌MinnA中提取的外膜蛋白(OMP) 與重組產(chǎn)物pE(A)分別相比較。A中除第21位谷氨酸氨基酸殘基以外，除 去了信號肽序列。如所示4達(dá)載體pET26(+)衍生了 9個氨基酸。數(shù)字 代表從pE翻譯起始的氨基酸位點。重組pE(A)在大腸桿菌中產(chǎn)生、純化，
并進(jìn)行Edman降解從而分析信號肽酶切割位點。在D和E中，同時進(jìn)行 兩塊凝膠的電泳， 一個用考馬斯亮藍(lán)染色， 一個印跡到Immobilon-P膜上， 以人IgD(k)骨髓瘤蛋白為探針，然后與合適的辣根過氧化物酶綴合的二抗 一起孵育。OMP部分用Empigen⑧按材料和方法中所述進(jìn)行純化。
圖6.蛋白質(zhì)E非常保守。圖中顯示了涵蓋有莢膜和非典型分離物的 13到31流感嗜血菌菌林(表2)中點突變的頻率。結(jié)果通過使用側(cè)翼引物測 序得到。所有的序列與用作參考序列的流感嗜血菌Rd的pE序列進(jìn)行比較， 并在此顯示。
圖7.pE的親水性圖鐠。圖中顯示了各氨基酸殘基的疏水和親水部分。 也標(biāo)出預(yù)測的信號肽。數(shù)據(jù)通過使用所述標(biāo)準(zhǔn)方法獲得(21)。
圖8. SDS-PAGE證明的重組pE22-160(片段A)和稱為B到H的一系 列截短片段。A中顯示不同片段的略圖，而B中顯示SDS-PAGE圖。編碼 多種蛋白質(zhì)的DNA被連接到表達(dá)載體pET26(+)中，并且在大腸桿菌中重 組表達(dá)。得到的過表達(dá)蛋白質(zhì)在鎳樹脂上純化，并在SDS-PAGE上分離， 隨后用考馬斯亮藍(lán)染色。
圖9. pE缺失的突變菌林(NTHi3655)誘導(dǎo)大鼠急性中耳炎的能力降低 100-1000倍。在雄性Sprague-Dawley大鼠中通過在頸腹側(cè)正中切口，然 后向中耳腔注射0.05ml所示數(shù)字的細(xì)菌，從而誘導(dǎo)感染。所示的數(shù)據(jù)是從 攻擊3天，每組5個代表性動物得到的數(shù)據(jù)。
圖10.不同年齡組的血清中直接抗pE的IgG和IgA抗體的平均濃度。 用重組pE(A)作為bate,抗pE抗體通過夾心ELISA進(jìn)4亍分析。pE(A)的 純度在圖5中顯示。
圖11. pE在不同嗜血菌屬菌林中特別保守。使用側(cè)翼引物在a型 (n=2)、 b型(n=2)、 c型(n=2)、 d型(n=l)、 e型(『2)和f型(i^3)有莢膜 的流感嗜血菌、NTHi(n=8)、流感嗜血菌生物變型aegypticus (11=6)和埃及 嗜血菌(漢Mgv/7ft'c"s， n-5)中對/ e基因進(jìn)行測序。Rd意指流感嗜血菌 菌林Rd(Hi0178)，而772為NTHi菌林772。數(shù)字65-577相應(yīng)為表1所 列出的菌林。
發(fā)明詳述
在詳細(xì)解釋本發(fā)明之前，很重要的是理解在本申請中，本發(fā)明不限于 本文描述的實施方案和步驟的細(xì)節(jié)。提及的實施例是為了說明本發(fā)明，而 不是以任何方式限制本發(fā)明。本發(fā)明也可以用其他實施方案和以多種方式 實踐或進(jìn)行。也應(yīng)理解本文使用的詞語和術(shù)語的目的是為說明而不是限制。
本申請描述稱為蛋白質(zhì)E(pE)的新的流感嗜血菌外膜蛋白質(zhì)的克隆和 表達(dá)。該蛋白質(zhì)是使用與pE有特異性親和力的人IgD (k)骨髓瘤血清而發(fā) 現(xiàn)的。
為了使重組pE的產(chǎn)量最大化，制備了包含第22位賴氨酸至第160位 賴氨酸M酸殘基的截短的pE片段。因而除去了包含第21位谷氨酸M 酸的N末端信號肽，除源自栽體pET26(+)的9個殘基以外用前導(dǎo)肽取代。 截短的pE(即pE22-160)稱為pE(A)。
本發(fā)明包含嗜血菌外膜蛋白質(zhì)pE和pE衍生的肽pE22-60、 pE22-95、 pE22醫(yī)125、 pE41-68、 pE56國125、 pE56-160、 pE86畫160、 pE115-160，和其 二-、三-或寡聚體。尤其更為優(yōu)選表面外露的pE或衍生肽的序列。
因此，本發(fā)明的疫苗組合物包含可以在所有流感嗜血菌中檢測到的作 為免疫原性成分的表面外露蛋白質(zhì)、所述表面外露蛋白質(zhì)的免疫原性片 段、基于所述表面外露蛋白質(zhì)的重組免疫原性蛋白質(zhì)、具有標(biāo)識號為 Sequence ID No 2的^J^酸序列的重組免疫原性蛋白質(zhì)；和/或具有標(biāo)識號 為S叫uencelDNo: -10的^J^酸序列的肽，或其片段、同源物、功能性等 同物、衍生物，降解或羥基化、磺化或糖基化產(chǎn)物，或其他次級加工產(chǎn)物。 疫苗組合物也可以包含融合蛋白質(zhì)或多肽、或作為免疫原性成分的本發(fā)明 的融合產(chǎn)物。免疫原性成分能夠產(chǎn)生對流感嗜血菌的抗體或其他免疫應(yīng) 答，其中產(chǎn)生的抗體抑制流感嗜血菌細(xì)菌對受試者細(xì)胞的致病作用。本發(fā) 明疫苗組合物的"免疫原性劑量"是與施用前的標(biāo)準(zhǔn)免疫應(yīng)答相比在施用 以后產(chǎn)生可檢測的體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的劑量。
插入多種表達(dá)載體中的任一個。此類方法是本領(lǐng)域^支術(shù)人員所公知的。
使用熟知的方法和技術(shù)可以容易地獲得疫苗組合物，并且該疫苗組合 物可以以多種方式施用，優(yōu)選胃腸外或鼻內(nèi)施用。適合于胃腸外或鼻內(nèi)施 用的制劑包括水和非水性無菌注射溶液、其可能包含抗氧化劑、緩沖液、
制菌劑和使制劑與所述受試者的體液等滲的溶質(zhì)；而且水和非水性無菌混 懸液可以包括懸浮劑或增稠劑?；钚悦庖咴猿煞滞ǔＥc賦形劑相混合， 賦形劑為可藥用的，例如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等等。另外，疫 苗組合物也可以包含少量的輔助性物質(zhì)，例如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖 劑、結(jié)合劑、載體或防腐劑。
疫苗組合物也可以包括用于增強(qiáng)組合物免疫原性的佐劑，例如弗氏佐 劑和本領(lǐng)域/>知的其他系統(tǒng)。疫苗組合物的免疫原性成分(即本發(fā)明的蛋白 質(zhì)、片段、肽、融合蛋白質(zhì)或多肽、或融合產(chǎn)物)可以制備成中性或鹽形式 的疫苗。
疫苗組合物的劑量依賴于疫苗的特異活性，并且可以通過常規(guī)實驗容 易地確定。疫苗組合物以基于受試者治療上有效的和有免疫原性的量施用。
本發(fā)明涉及下面更詳細(xì)描述的蛋白質(zhì)E多肽和多核苦酸。具體地，本 發(fā)明涉及非典型流感嗜血菌的蛋白質(zhì)E的多肽和多核苷酸。蛋白質(zhì)E多肽 具有信號序列，并且外露于細(xì)菌表面。信號肽位于蛋白質(zhì)E多肽的第1-20 個殘基。
本文所述"蛋白質(zhì)E"指本文描述的本發(fā)明任意肽、免疫原性片段、 融合物(fusion)、多肽或蛋白質(zhì)(例如有或沒有信號序列的SEQ ID NO: 1)。 "編碼蛋白質(zhì)D的多核苷酸"指編碼本文描述的本發(fā)明任意肽、免疫原性 片段、融合物、多肽或蛋白質(zhì)的任意多核苷酸序列。
術(shù)語"包含"在本文可以任選地被術(shù)語"包括"取代。 本發(fā)明尤其涉及本文列出的蛋白質(zhì)E多核苷酸和編碼的多肽。 應(yīng)該理解下面序列表中列出的作為"DNA"的序列代表本發(fā)明的一個 實施方案的范例，因為普通技術(shù)人員將認(rèn)識到此類序列 一般以多核苦酸(包
括核糖多核苷酸)應(yīng)用。
蛋白質(zhì)E多核苷酸的序列示于SEQ ID NO: 11 (來自ntHi菌林772)。 蛋白質(zhì)E編碼多肽的序列示于SEQIDNO:l(來自ntHi菌林772)、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10。
顛
本發(fā)明的一個方面提供流感嗜血菌的多肽(尤其是非典型流感嗜血 菌)，在本文中稱為"蛋白質(zhì)E"和"蛋白質(zhì)E多肽"，以及其生物學(xué)上、 診斷上、預(yù)防上、臨床上或治療上有用的變體，和包含這些的組合物。
本發(fā)明還提供
(a) 分離的多肽，其包含與SEQ ID NO: 1-10中的任一序列具有至少 85%同一性、優(yōu)選至少90%同一性、更優(yōu)選至少95%同一性、最優(yōu)選至少 97-99%同 一性或完全同 一性的M酸序列；
(b) 分離的多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸包含在所選SEQ ID NO: 0序列的全長上與SEQ ID NO: 11任意序列具有至少85%同一性、優(yōu)選至 少90%同一性、更優(yōu)選至少95%同一性、甚至更優(yōu)選至少97-99%同一性 或完全同一性的多核苷,列；或
(c) 由分離的多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸包含編碼與SEQ ID NO: 1-10的任意M酸序列具有至少85%同一性、優(yōu)選至少卯％同一性、 更優(yōu)選至少95%同一性、甚至更優(yōu)選至少97-99%同一性或完全同一性的 多肽的多核苷酸序列。
SEQ ID NO: l-10提供的蛋白質(zhì)E多肽是來自非典型流感嗜血菌菌林 的蛋白質(zhì)E多肽。已經(jīng)確定了來自表l列出的流感嗜血菌菌抹的其他蛋白 質(zhì)E序列。
本發(fā)明也提供蛋白質(zhì)E多肽的免疫原性片段，即蛋白質(zhì)E多肽的連續(xù) 部分，其與包含選自SEQIDNO: 1-10的相應(yīng)氨基酸序列的多肽具有相同 的或基本相同的免疫原性。也就是說該片段(如需要與載體配對)能夠產(chǎn)生 識別蛋白質(zhì)E多肽的免疫應(yīng)答?？蛇x擇地或另外地，免疫原性片段可以保 留全長蛋白質(zhì)的IgD結(jié)合功肯&(如在實施例部分的描述，例如從結(jié)合位點
(Birmingham,英國)結(jié)合IgD (X)的能力)。此類免疫原性片段可包括例如缺 失N末端前導(dǎo)序列、和/或跨膜結(jié)構(gòu)域、和/或C末端錨定結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì) E多肽。在優(yōu)選的方面，本發(fā)明的蛋白質(zhì)E的免疫原性片段基本上包含在 所述序列全長上與選自SEQIDNO: 1-10的序列具有至少85%同一性、優(yōu) 選至少90%同一性、更優(yōu)選至少95%同一性、最優(yōu)選至少97-99%同一性 的多肽的所有胞外結(jié)構(gòu)域。
片段是具有與本發(fā)明任意多肽的氨基酸序列部分但不是全部完全相 同的氨基^列的多肽。對于蛋白質(zhì)E多肽，片段可以是"獨立的"，或 包含在較大的多肽中，在其中片段形成一部分或區(qū)域，最優(yōu)選在單個較大 多肽中作為單個連續(xù)區(qū)域。因此片段可以比全長的天然序列短，或者如果 包含在較大的多肽之內(nèi)，其可以是全長的天然序列或更長的融合蛋白質(zhì)。
優(yōu)選的片段包括例如具有選自SEQIDNO: 1-10的M酸序列的一部 分的截短多肽或其變體，例如包括氨基和/或氛基端M酸序列的殘基的連 續(xù)系列。也優(yōu)選由或在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的本發(fā)明多肽的降解形式。還優(yōu)選 由結(jié)構(gòu)或功能屬性表征的片段，例如包含a-螺旋和a-螺旋形成區(qū)、p-片層 和P-片層形成區(qū)、轉(zhuǎn)角和轉(zhuǎn)角形成區(qū)、巻曲和巻曲形成區(qū)、親水區(qū)、疏水 區(qū)、a兩親區(qū)、p兩親區(qū)、柔性區(qū)、表面形成區(qū)、底物結(jié)合區(qū)和高抗原指 數(shù)區(qū)的片段。
更優(yōu)選的片段分離的多肽，其包括含有選自SEQ ID NO: 1-10的^ 酸序列的至少15、 20、 30、 40、 50或100個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，或 含有選自SEQIDNO: 1-10的^J^酸序列截短或缺失的至少15、 20、 30、 40、 50或100個連續(xù)氨基酸^J^酸序列。
還更優(yōu)選包含B細(xì)胞表位的片段，例如實施例10中描述的那些片ISL/肽。
本發(fā)明多肽的片段可以用于通過肽合成產(chǎn)生相應(yīng)的全長多肽；因此， 這些片段可以用作產(chǎn)生本發(fā)明的全長多肽的中間體。
尤其優(yōu)選幾個、5-10、 1-5、 1-3、 1-2或1個氨基酸以任意組合被取代、 缺失或添加的變體。 本發(fā)明的多肽或免疫原性片段可以是"成熟"形式的蛋白質(zhì)，或可以 是較大蛋白質(zhì)(例如前體或融合蛋白質(zhì))的一部分。通常有利地包括附加氨 基酸序列，其含有分泌或前導(dǎo)序列、前序列、輔助純化的序列(例如多組氨 酸殘基)，或有利地包括在重組制備中保持穩(wěn)定的附加序列。此外，也考慮 增加外源多肽或脂類尾或多核苷^f列，從而增加最終分子的免疫原性潛 力。
本發(fā)明的一個方面涉及包含本發(fā)明多肽的基因工程可溶融合蛋白質(zhì)，
或其片段，以及多種亞類免疫球蛋白(IgG、 IgM、 IgA、 IgE)的重或輕鏈恒 定區(qū)的多個部分。優(yōu)選的免疫球蛋白是人IgG(尤其是IgGl)的重鏈的恒定 部分，其中融合發(fā)生在鉸鏈區(qū)。在具體實施方案中，可以通過摻入可,皮血 液凝固因子Xa切割的切割序列而簡單地除去Fc部分。
此外，本發(fā)明涉及通過基因工程制備這些融合蛋白質(zhì)的方法，和這些 融合蛋白質(zhì)用于藥物篩選、診斷和治療的用途。本發(fā)明的另一方面也涉及 編碼此類融合蛋白質(zhì)的多核苷酸。融合蛋白質(zhì)技術(shù)的實例可以在國際專利 申請W094/29458號和W094/22914號中找到。
蛋白質(zhì)可以通過化學(xué)方法綴合，或作為重組融合蛋白質(zhì)表達(dá)，與非融 合蛋白質(zhì)相比較，該融合蛋白質(zhì)可以增加在表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的水平。融合 配偶體可以協(xié)助提供t輔助細(xì)胞表位(免疫融合配偶體)，優(yōu)選由人識別的 t輔助細(xì)胞表位，或可以協(xié)助表達(dá)比天然重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量更高的蛋白質(zhì)(表 達(dá)增強(qiáng)子)。優(yōu)選的融合配偶體既是免疫融合配偶體，也是增強(qiáng)表達(dá)的配偶 體。
融合配偶體包括來自流感嗜血菌(EP 594610)的蛋白質(zhì)D和來自流感 病毒NS1的非結(jié)構(gòu)型蛋白質(zhì)(血凝素)。另一個融合配偶體是已知為Omp26 (WO97/01638)的蛋白質(zhì)。另一個融合配偶體是已知為LytA的蛋白質(zhì)。優(yōu) 選使用該分子的C末端部分。LytA是衍生自合成N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶 (酰胺酶LytA)的肺炎鏈球菌0ft"/7too cc附/mewwo附Vie)，該酶(由lytA基因 {Gene, 43 (1986)， 265- 272頁}編碼)是自溶素，其特異性降解肽聚糖主鏈 的某些鍵。LytA蛋白質(zhì)的C末端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與膽堿或某些膽堿類似物(例
如DEAE)的親和性。該特性可以用于開發(fā)用于融合蛋白質(zhì)表達(dá)的大腸桿菌 C-LytA表達(dá)質(zhì)粒。氨基末端含有C-lytA片段的雜化物蛋白質(zhì)的純化在 {Biotechnology: 10， (1992), 795-798頁}中描述?？梢允褂肔ytA分子C末 端從178殘基開始的重復(fù)部分，例如殘基188-305。
本發(fā)明也包括上述多肽的變體，即通過保守^^酸取代而與參照物不 同的多肽，其中殘基被另一個具有類似特性的殘基所取代。通常此類取代 在丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸中；在絲氨酸和蘇氨酸中；在酸性 殘基天冬氨酸和谷氨酸中；在天冬酰胺和谷氨酰胺中；和在堿性殘基賴氨 酸和精氨酸中；或在芳香族殘基苯丙氨酸和酪氨酸中。
本發(fā)明的多肽可以用任意合適的方法制備。此類多肽包括分離的天然 存在的多肽、重組產(chǎn)生的多肽、合成產(chǎn)生的多肽、或這些方法組合產(chǎn)生的 多肽。制備此類多肽的方法是本領(lǐng)域熟知的。
最優(yōu)選本發(fā)明的多肽衍生自非典型流感嗜血菌，然而，也可以優(yōu)選從 其他相同分類學(xué)屬的生物中獲得。本發(fā)明的多肽也可以例如從相同分類學(xué) 科或目的生物中獲得。
本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供編碼蛋白質(zhì)E多肽的多核苷酸，尤其是編碼 本文稱為蛋白質(zhì)E的多肽的多核苷酸。
在本發(fā)明尤其優(yōu)選的實施方案中，多核苷酸包含編碼含SEQ ID NO: 11所示序列(包括全長基因)的蛋白質(zhì)E多肽的區(qū)域或其變體。
SEQ ID NO: 11提供的蛋白質(zhì)E多核苷酸是來自非典型流感嗜血菌菌 林772的蛋白質(zhì)E多核苷酸。確定為來自流感嗜血菌菌林的蛋白質(zhì)E的編 碼基因的其他序列在表l中列出。
本發(fā)明的另一方面提供編碼和/或表達(dá)蛋白質(zhì)E多肽和多核苷酸的分 離的核酸分子，尤其是編碼非典型流感嗜血菌蛋白質(zhì)E多肽和多核苷酸的 分離的核酸分子，其包括例如未加工的RNA、核酶RNA、 mRNA、 cDNA、 基因組DNA、 B-和Z-DNA。本發(fā)明的其他實施方案包括在生物學(xué)上、診 斷上、預(yù)防上、臨床上或治療上有用的多核普酸和多肽、和其變體、和包
含這些的纟且合物。
本發(fā)明的另一方面涉及編碼具有SEQ ID NO: l-10推導(dǎo)的氨基酸序列 的蛋白質(zhì)E多肽的分離的多核苷酸(包括至少一種全長基因)，和緊密相關(guān) 的多核苷酸和其變體。
本發(fā)明的另一個尤其優(yōu)選的實施方案涉及來自非典型流感嗜血菌的 蛋白質(zhì)E多肽，其包含或包括選自SEQ ID NO: 1-10的M酸序列或其變 體。
使用本文提供的信息，例如SEQIDNO: 11所示的多核普酸序列，本 發(fā)明編碼蛋白質(zhì)E多肽的多核苷酸可以用標(biāo)準(zhǔn)克隆和篩選方法獲得，例如 那些用于以非典型流感嗜血菌菌林3224A(或772)細(xì)胞作為起始材料從細(xì) 菌中克隆和測序染色體DNA片段的方法，隨后獲得全長克隆。例如，為 獲得本發(fā)明的多核苷*列，例如SEQIDNO:0中給出的多核苷#列， 通常用》文射標(biāo)記的寡核苷酸(優(yōu)選衍生自局部序列的17-mer或更長的寡 核苷酸)探針對于大腸桿菌或某些其他合適宿主中的非典型流感嗜血菌菌 林3224A(或772)的染色體DNA克隆文庫進(jìn)行探測。然后可以用嚴(yán)格雜交 條件區(qū)分出攜帶與探針一致的DNA的克隆。用由原始多肽或多核苷^ 列設(shè)計的測序f j物對雜交鑒定的單個克隆進(jìn)行測序，可以在兩個方向延伸 多核苷酸序列從而確定全長基因序列。方便地，例如使用從質(zhì)粒克隆制備 的變性雙鏈DNA來進(jìn)行此類測序。合適的技術(shù)在Maniatis， T.， Fritsch， E. F. 和Sambrook等人，MOLECULAR CLONING^ A LABORATORY MANUAL,第二版；Cold Spring Harbor Laboratory出版,Cold Spring Harbor,紐約(1989)中描述。(具體見雜交篩選l.卯和變性雙鏈DNA模板 測序13.70)。也可以進(jìn)行直接基因組DNA測序從而獲得全長基因序列。如 本發(fā)明舉例的，SEQ ID NO: 11所示多核苷酸是在源自非典型流感嗜血菌 的DNA文庫中發(fā)現(xiàn)的。
而且，SEQ ID NO: 11所示的各DNA序列包含編碼蛋白質(zhì)的可讀框， 該蛋白質(zhì)具有近似于SEQ ID NO: 1所示的氨基酸殘基數(shù)，并具有可以用 本領(lǐng)域4支術(shù)人員熟知的氨基酸殘基分子量值計算的推導(dǎo)分子量。
SEQ ID NO: 0的多核苷酸的起始密碼子和終止密碼子之間分別編碼 SEQ ID NO: 1的多肽。
在另一方面，本發(fā)明提供分離的多核苷酸，其包含或包括
(a) 多核苷酸序列，其在SEQ ID NO: 0的多核苷酸序列的全長上與 SEQ ID NO: 11的任意多核苷酸序列具有至少85%同一性、優(yōu)選至少90% 同一性、更優(yōu)選至少95%同一性、甚至更優(yōu)選至少97-99%同一性或完全
同一性；或
(b) 多核苷酸序列，其編碼多肽，所述多肽在SEQ ID NO: 1-10的氨 基酸序列(或片段)的全長上與選自SEQ ID NO: 1-10的任意M酸序列(或 其片段)具有至少85%同一性、優(yōu)選至少90%同一性、更優(yōu)選至少95%同 一性、甚至更優(yōu)選至少97-99%同一性或100%完全同一性。
獲得編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸(包括來自非典型流感嗜血菌以外的
種的同源物和直向同源物)的方法包括在嚴(yán)格性雜交^Ht下(例如使用范圍 為45-65"C的溫度和SDS濃度為0.1-1%),用包括或包含選自SEQ ID NO: 11的任意序列或其片段標(biāo)記的或可檢測的探針篩選適當(dāng)文庫的步驟；和分 離含有所述多核苦^列的全長基因和/或基因組克隆的步驟。
本發(fā)明提供在其全長上與SEQ ID NO: 11所示的編碼序列(可讀框)相 同的多核普^f列。本發(fā)明也提供成熟多肽或其片段本身的編碼序列，以 及與其他編碼序列在同 一讀碼框內(nèi)的成熟多肽或片段的編碼序列，例如編 碼前導(dǎo)或分泌序列、前-或原-蛋白質(zhì)序列或前蛋白原序列。本發(fā)明的多核 普酸也可以包含至少一個非編碼序列，其包括但不限于例如至少一個非編 碼的5，和3，序列，例如被轉(zhuǎn)錄但不被翻譯的序列、終止信號(例如rho依賴 的和非rho依賴的終止信號)、核糖體結(jié)合位點、Kozak序列、穩(wěn)定mRNA 的序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化信號。多核苷酸序列也可以包含編碼附加氨 基酸的附加編碼序列。例如，編碼利于融合多肽純化的標(biāo)記序列。在本發(fā) 明的某些實施方案中，標(biāo)記序列是6-組氨酸肽，如pQE載體(Qiagen, Inc.) 所提供的，其在Gentz等人，Proc. Natl. Acad. Sci.， USA 86: 821-824 (1989) 中描述，或者是HA肽標(biāo)記(Wilson等人，Cell 37: 767 (1984))，兩者都可
以用于純化與它們?nèi)诤系亩嚯男蛄?。本發(fā)明的多核苷酸也包括但不限于含 有結(jié)構(gòu)基因和與其天然結(jié)合的控制基因表達(dá)的序列的多核苷酸。
SEQ ID NO: 1-10的蛋白質(zhì)E多肽的編碼核苷酸序列可以與SEQ ID NO: 11的相應(yīng)多核苷酸編碼序列(或包含于SEQ ID NO: 11中的相應(yīng)多核 苷酸編碼序列)一致?？蛇x擇地，其可以是由遺傳密碼冗余(簡并)而得到的 任意序列，也編碼SEQ ID NO: 1-10的多肽。
本文所用術(shù)語"編碼多肽的多核苷酸"包括具有本發(fā)明多肽的編碼序 列的多核苷酸，該多肽尤其是細(xì)菌多肽和更尤其是具有SEQ ID NO: 1-10 中任一序列所示M,列的非典型流感嗜血菌蛋白質(zhì)E多肽或其片段。
該術(shù)語也包括具有編碼多肽的單個連續(xù)區(qū)或不連續(xù)區(qū)(例如被整合的噬菌 體、整合的插入序列、整合的載體序列、整合的轉(zhuǎn)座子序列間斷的多核苷 酸，或由于RNA編輯或基因組DNA重組引起間斷的多核苷酸)，以及附 加區(qū)(也可以包括編碼和/或非編碼序列)的多核普酸。
本發(fā)明還涉及本文所述的多核苷酸的變體，其編碼具有SEQ ID NO: 1-10的任意序列推導(dǎo)的氨基酸序列的多肽的變體。本發(fā)明多核苷酸的片段 可以用于例如合成本發(fā)明的全長多核苷酸。
優(yōu)選的片段是編碼B細(xì)胞表位的那些多核苷酸，例如在實施例10中 描述的片^/肽，和包含所述多核苷酸片段的重組、嵌合基因。
更優(yōu)選的實施方案是蛋白質(zhì)E變體的編碼多核苷酸，該變體具有SEQ IDNO: l-10的任意序列的蛋白質(zhì)E多肽的JL&酸序列，其中幾個、少數(shù)、 5-10、 1-5、 1-3、 2、 1個或沒有氨基酸殘基以任意組合被取代、修飾、缺 失和/或添加。其中尤其優(yōu)選沉默取代、添加和缺失，即不改變蛋白質(zhì)E多 肽的性質(zhì)和活性(例如實施例部分所述的性質(zhì))。
本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案是在其全長上與具有SEQ ID NO: 1-10的氨 基酸序列所示任一蛋白質(zhì)E多肽的編碼多核苷酸有至少85%同一性的多 核苷酸，和與該多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。可擇地，最優(yōu)選包含在其全長 上與蛋白質(zhì)E多肽的編碼多核苷酸有至少卯％同一性的區(qū)域的多核苷酸 和與其互補(bǔ)的多核苷酸。在此方面，尤其優(yōu)選在其全長上與上述多核苷酸
有至少95%同一性的多核苷酸。此外，在至少95。/。同一性的多核苷酸中更 優(yōu)選具有至少97%同一性的多核普酸，和尤其更優(yōu)選至少98%和至少99% 同一性的多核苷酸，更優(yōu)選至少99%同一性的多核苷酸。
優(yōu)選的實施方案;i^本保留與選自SEQ ID NO: 11的DNA序列編碼 的成熟多肽有相同生物學(xué)功能或活性(例如本文實施例部分所述的活性)的 多肽的編碼多核苦酸。
本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案提供尤其在嚴(yán)格性條件下與蛋白質(zhì)E多核 苷酸序列(例如SEQ ID NO: 11的多核苷酸)雜交的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及與本文提供的多核普酸序列雜交的多核苷酸。在此方 面，本發(fā)明尤其涉及在嚴(yán)格性條件下與本文所述多核苷酸雜交的多核普 酸。本文所用術(shù)語"嚴(yán)格性條件"和"嚴(yán)格性雜交條件"指僅在有至少95% 和優(yōu)選至少97%同一性的序列之間發(fā)生雜交。嚴(yán)格雜交條件的特異性實例 是在42'C孵育過夜，溶液包含50%甲酰胺、5x SSC (150 mM NaCl、 15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.p)、 5x Denhardt's溶液、10%硫 酸葡聚糖和20 jig/ml剪切的變性鮭精DNA，然后在O.lxSSC中于約65"C 洗脫雜交支持物。雜交和洗脫條件是熟知的，并在Sambrook，等人， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y.， (1989)中、尤其在第ll章中舉例說明。雜交溶液也可以用于 本發(fā)明提供的多核苷酸序列。
本發(fā)明也提供包括或包含由篩選適當(dāng)文庫而獲得的多核苷酸序列的 多核苷酸或其片段，該文庫含有任意SEQ ID NO: 11序列所示多核苷* 列的完全基因，篩選在嚴(yán)格性雜交條件下以具有SEQ ID NO: 11相應(yīng)序列 的所述多核苷酸序列的探針進(jìn)行；并且分離所述多核苦酸序列。用于獲得 此類多核苷酸的片段包括例如本文所述的探針和引物。
對于本文別處討論的本發(fā)明的多核苷酸測定，例如本發(fā)明的多核苷酸 可以用作RNA、 cDNA和基因組DNA的雜交探針從而分離編碼蛋白質(zhì)E 的全長cDNA和基因組克隆，和分離與蛋白質(zhì)E基因具有高度同一性、尤 其是具有高度序列同一性的其他基因的cDNA和基因組克隆。此類探針通
常包含至少15個核苷酸殘基或堿基對。優(yōu)選地，此類探針具有至少30個 核苷酸殘基或>5^}"，和可以具有至少50個核苷酸殘基或堿^。尤其優(yōu) 選探針具有至少20個核苷酸殘基或堿基對，和具有少于30個核苷酸殘基 或堿基對。
可以通過用SEQ ID NO: 11提供的DNA序列來合成寡核苷酸探針進(jìn) 行篩選，從而分離蛋白質(zhì)E基因的編碼區(qū)。然后使用具有與本發(fā)明基因互 補(bǔ)的序列的標(biāo)記寡核苷酸來篩選cDNA、基因組DNA或mRNA文庫，從 而確定探針與文庫中哪些成員雜交。
有幾種可行的并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法來獲得全長DNA 或延伸短DNA，例如基于cDNA末端快速擴(kuò)增的方法(RACE)(見例如 Frohman，等人，PNAS USA 85: 8998-9002, 1988)。該才支術(shù)的最新改進(jìn)由 MarathonTM technology (Clontech Laboratories Inc.)舉例說明，例如其具 有顯著簡化的較長cDNA查詢。在MarathonTM technology中，cDNA從 所選組織中提取的mRNA制備，并且各末端連接一個"接頭"序列。然后 用基因特異的和接頭特異的寡核苷酸引物的組合進(jìn)行核酸擴(kuò)增(PCR)從而 擴(kuò)增DNA "缺失"的5，末端。
然后用"嵌套"引物重復(fù)PCR反應(yīng)，該引物設(shè)計為與擴(kuò)增產(chǎn)物退火(通 常為還與接頭序列3'退火的接頭特異性引物，和還與所選基因序列5，退火 的基因特異性引物)。隨后可以通過DNA測序來分析該反應(yīng)的產(chǎn)物，并且 通過將產(chǎn)物直接連接于已有DNA而獲得完全序列、或用新的序列信息設(shè) 計5，引物進(jìn)行分離的全長PCR，來構(gòu)建全長DNA。
本發(fā)明的多核苷酸和多肽可以用作例如發(fā)現(xiàn)治療和診斷疾病(尤其是 人類疾病)的研究試劑和材料，正如本文討論的關(guān)于多核苷酸測定。
本發(fā)明的多核苷酸是衍生自SEQIDNO: ll序列的寡核苷酸，其可以 用于本文所述的方法，但是優(yōu)選用于PCR，從而確定本文鑒定的多核苷酸 是否在感染組織的細(xì)菌中被全部或部分轉(zhuǎn)錄。認(rèn)為此類序列也可以用于診 斷病原體達(dá)到的感染期和感染類型。
本發(fā)明也提供編碼多肽的多核苷酸，其中多肽是成熟蛋白質(zhì)加上附加.、或成熟多肽內(nèi)部氨基酸(例如當(dāng)成熟形式具有多于一 條肽鏈時)。此類序列可以在蛋白質(zhì)從前體到成熟形式的加工過程中起作 用，可以允許蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運，可以延長或縮短蛋白質(zhì)半衰期或有利于用于控 制測定或生產(chǎn)的蛋白質(zhì)等等。通常在體內(nèi)的情況下，附加氨基酸可以通過 細(xì)胞酶從成熟蛋白質(zhì)經(jīng)加工除去。
對于本發(fā)明的各個多核苷酸，提供其互補(bǔ)多核苷酸。優(yōu)選這些互補(bǔ)多 核苷酸是和與其互補(bǔ)的各個多核苷酸完全互補(bǔ)的。
具有融合于一個或多個前序列的成熟形式多肽的前體蛋白質(zhì)可以是 多肽的非活性形式。當(dāng)前序列被除去時，此類非活性前體通常被激活。某 些或所有前序列可以在激活之前被除去。通常，此類前體稱為前蛋白質(zhì)。
除標(biāo)準(zhǔn)的A、 G、 C、 T/U代表性核苦酸以外，詞語"N"也可以用于 描述本發(fā)明的特定多核苷酸。"N"指在DNA或RNA序列的該指定位點 可以出現(xiàn)4個DNA或RNA核苷酸中的任一個，除此之外優(yōu)選N不是當(dāng) 與臨近核苷酸位點組合和當(dāng)在正確讀碼框中讀碼時會在該讀碼框中產(chǎn)生 提前終止密碼子的核酸。
總之，本發(fā)明的多核苷酸可以編碼成熟蛋白質(zhì)、附加前導(dǎo)序列的成熟 蛋白質(zhì)(指前蛋白質(zhì))、具有一個或多個非前蛋白質(zhì)前導(dǎo)序列的原序列的成 熟蛋白質(zhì)前體；或具有前導(dǎo)序列，以及一個或多個原序列的前蛋白原(原蛋 白質(zhì)的前體)，原序列通常在加工步驟中被除去從而產(chǎn)生激活的和成熟形式 的多肽。
本發(fā)明的一個方面提供本發(fā)明多核苷酸用于治療或預(yù)防目的的用途， 尤其是用于基因免疫。
本發(fā)明的多核苷酸用于基因免疫的用途優(yōu)選使用合適的遞送方法，例 如直接向肌肉中注射質(zhì)粒DNA(Wolff等人，Hum Mol Genet (1992) 1: 363， Manthorpe等人，Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419)、用特異蛋白質(zhì)載體遞送 DNA復(fù)合物(Wu等人，J Biol Chem. (1989) 264: 16985)、 DNA與磷酸4丐共 沉淀(Benvenisty & Reshef, PNAS USA, (1986) 83: 9551)、 DNA包裹在多種 形式的脂質(zhì)體中(Kaneda等人，Science (1989) 243: 375)、粒子轟擊(Tang
等人，Nature (1992) 356:152， Eisenbraun等人，DNA Cell Biol (1993) 12: 791)和用克隆的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行體內(nèi)感染(Seeger等人，PNAS USA (1984) 81: 5849)。
4'#、涼i勿應(yīng)、4^t系鍵
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的一種或多種多核苷酸的載體、用本發(fā)明載 體產(chǎn)生的基因工程宿主細(xì)胞和通過重組技術(shù)產(chǎn)生的本發(fā)明的多肽產(chǎn)物。也
使用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)用衍生自本發(fā)明DNA構(gòu)建體的RNA產(chǎn)生此類蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的重組多肽可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法從包含表達(dá) 系統(tǒng)的基因工程宿主細(xì)胞制備。相應(yīng)地，本發(fā)明的另一方面涉及包含本發(fā) 明的一種或多種多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)、以該表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的基因工程宿主 細(xì)胞和通過重組才支術(shù)產(chǎn)生的本發(fā)明的多肽產(chǎn)物。
對于本發(fā)明的重組多肽產(chǎn)物，可以通過基因工程將表達(dá)系統(tǒng)或其部 分，或本發(fā)明的多核苷酸摻入到宿主細(xì)胞中?？梢酝ㄟ^許多標(biāo)準(zhǔn)實驗室手 冊中描述的方法有效地將多核苷酸引入宿主細(xì)胞中，例如Davis，等人， BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986)和Sambrook，等 人，MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL,第二版， Cold Spring Harbor Laboratory出版，Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)， 這些方法例如磷酸鉀轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)介、顯微注射、 陽離子脂類介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、劃痕標(biāo)記(scrape loading )、 沖擊引入和感染。
合適宿主的4戈表性實例包括細(xì)菌細(xì)胞，例如鏈球菌屬(streptococci)、 葡萄球菌屬(staphylococci)、腸球菌屬(enterococci)、大腸桿菌(E. coll)、鏈 霉菌屬(streptomyces)、 藍(lán)細(xì)菌(cyanobacteria)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、 腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、 流感嗜血菌 (Haemophilus influenzae)和粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)細(xì)胞；真 菌細(xì)胞，例如酵母、克魯維酵母屬(Kluveromyces )、酵母屬 (Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、 4旦子菌綱(basidiomycete)、白假絲
酵母(Candida albicans)和曲霉屬(Aspergillus)細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞，例如果蠅 S2和Spodoptera Sf9細(xì)胞；動物細(xì)胞，例如CHO、 COS、 HeLa、 C127、 3T3、 BHK、 293、 CV-1和Bowes黑色素瘤細(xì)胞；和植物細(xì)胞，例如棵子 植物或被子植物細(xì)胞。
可以使用極為多樣的表達(dá)系統(tǒng)來產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。此類載體包括染 色體-、游離型-和病毒-衍生的載體等等，例如衍生自細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、 轉(zhuǎn)座子、酵母附加體、插入元件、酵母染色體元件、病毒(例如桿狀病毒、 乳多空病毒(例如SV40)、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病病毒、 微小RNA病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和a病毒)的載體，和衍生自其組合的載體， 例如衍生自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件(例如粘粒和噬菌粒)的那些載體。表達(dá) 系統(tǒng)構(gòu)建體可以包含調(diào)控和引^達(dá)的控制區(qū)。通常，此種表達(dá)可以使用 適合于在宿主中維持、繁殖或表達(dá)多核苷酸和/或表達(dá)多肽的任意系統(tǒng)或載 體?？梢酝ㄟ^多種熟知和常規(guī)技術(shù)將適當(dāng)?shù)腄NA序列插入到表達(dá)系統(tǒng)中， 例如Sambrook等人，MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL,(如上)中的技術(shù)。
在真核重組表達(dá)系統(tǒng)中，為了將翻譯的蛋白質(zhì)分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、周質(zhì) 空間或細(xì)胞外環(huán)境去，可以在表達(dá)的多肽中摻入適當(dāng)?shù)姆置谛盘?。這些信 號可以是多肽內(nèi)源的或異源的信號。
本發(fā)明的多肽可以通過熟知方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)性和純化，這 些方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸 纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層 析。最優(yōu)選使用金屬離子親和層析(IMAC)進(jìn)行純化。當(dāng)多肽在細(xì)胞內(nèi)合成、 分離和純化過程中變性時，可以使用蛋白質(zhì)重折疊的熟知技術(shù)恢復(fù)活性構(gòu) 象。
表達(dá)系統(tǒng)也可以是重組的活微生物，例如病毒或細(xì)菌。目的基因可以 插入到活的重組病毒或細(xì)菌的基因組中。用此類活載體接種和體內(nèi)感染會 導(dǎo)致抗原的體內(nèi)表達(dá)和誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。為此目的使用的病毒和細(xì)菌是例 如痘病毒(例如牛痘、禽痘、金絲雀痘(canarypox))、 a病毒(辛德比斯病
毒(Sindbis virus)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus) 、 Venezuelian 馬腦炎病毒(Venezuelian Equine Encephalitis Virus))、腺病毒、腺伴隨病毒、 微小RNA病毒(脊MA質(zhì)炎病毒、鼻病毒)、皰瘆病毒(水痘帶狀病毒等等)、 利斯特氏菌屬(Listeria)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、 BCG、鏈球菌屬。這些病毒和細(xì)菌可以是有毒的或以多種方式減毒的，從 而獲得活疫苗。此類活疫苗也形成本發(fā)明的部分。 轉(zhuǎn)、資抓J&,為、費和奴縱
本發(fā)明也涉及本發(fā)明的蛋白質(zhì)E多核苷酸和多肽用作診斷試劑的用 途。在真核生物(尤其是哺乳動物、而且尤其是人類)中檢測蛋白質(zhì)E多核 苷酸和/或多肽可以提供診斷疾病、疾病分期或感染生物體對藥物的響應(yīng)的 診斷方法?？梢酝ㄟ^多種熟知技術(shù)和本文提供的方法在核酸或氨基酸水平 上檢測真核生物、尤其哺乳動物、和尤其人類、尤其那些,皮含蛋白質(zhì)E基 因或蛋白質(zhì)的生物體感染或疑似感染的人類。
用于預(yù)測、診斷或其他分析的多肽和多核苷酸可以獲自推測被感染和 /或感染的個體的機(jī)體材料。來自任意這些來源的多核苷酸(尤其是DNA或 RNA)可以直接用于檢測，或在分析之前用PCR或任意其他擴(kuò)增技術(shù)酶性 擴(kuò)增。RNA(尤其mRNA)、 cDNA和基因組DNA也可以以相同方式使用。 使用擴(kuò)增，可以通過分析生物體的所選多核苷酸的基因型來表征個體中存 在的感染或定居生物體的種和菌林?？梢酝ㄟ^與選自相關(guān)生物體的參考序 列的基因型比較擴(kuò)增產(chǎn)物的大小變化來檢測缺失和插入，相關(guān)生物體優(yōu)選 同屬不同種或同種不同菌林。可以通過將擴(kuò)增的DNA和標(biāo)記的蛋白質(zhì)E 多核苷酸序列雜交來鑒定點突變。對DNA或RNA分別通過DNA酶或 RNA酶消化、或通過檢測解鏈溫度或復(fù)性動力學(xué)的差異，來區(qū)分完全或顯 著匹配的序列和不完全或更顯著不匹配的雙鏈體。也可以通過與參考序列 相比多核苦酸片段在凝膠上電泳遷移率的改變來檢測多核苦酸序列的差 異?？梢允褂没虿皇褂米冃栽噭﹣磉M(jìn)行。也可以通過直接DNA或RNA測 序來檢測多核苷酸差異。例如見Myers等人，Science, 230: 1242 (1985)。也 可以通過核酸酶^f呆護(hù)測定(例如RNA酶)、VI和SI保護(hù)測定或化學(xué)裂解方
法來顯示特異位點的序列改變。例如見Cotton等人，Proc. Natl. Acad. Sci.， USA, 85: 4397-4401 (1985)。
在另一個實施方案中，構(gòu)建包含蛋白質(zhì)E核苷^f列或其片段的寡核 苷酸探針陣列從而引導(dǎo)例如遺傳突變、血清分型、分類學(xué)分類或鑒定的有 效篩選。陣列技術(shù)方法是熟知的并具有廣泛應(yīng)用性，并且可以用于解決多 種分子遺傳方面的問題，包括基因表達(dá)、遺傳連鎖和遺傳變異性(例如見 Chee等人，Science, 274: 610 (1996))。
因此，本發(fā)明的另一方面涉及診斷藥盒，其包含
(a) 本發(fā)明的多核苷酸，優(yōu)選SEQIDNO: 11的任意核香酸序列，或其
片段；
(b) 與(a)互補(bǔ)的核苷酸序列；
(c) 本發(fā)明的多肽，優(yōu)選SEQIDNO: 1-10的任一多肽或其片段；或
(d) 本發(fā)明多肽的抗體，優(yōu)選SEQ ID NO: 1-10的任一多肽。 應(yīng)該理解在4壬意此類藥盒中，(a)、 (b)、 (c)或(d)可以包含基本成分。
這樣的藥盒可以用于診斷疾病或?qū)膊〉囊赘行?，等等?br> 本發(fā)明也涉及本發(fā)明多核苷酸用作診斷試劑的用途。檢測與疾病或致 病性相關(guān)的本發(fā)明多核普酸(優(yōu)選SEQ ID NO: 11的任意序列)的突變形 式，可以提供診斷工具來增加或定義對由多核苷酸表達(dá)不足、過表達(dá)或表 達(dá)改變引起的疾病的診斷、病程預(yù)測、疾病期確定或疾病易感性確定。可 以通過例如本文描述的多種技術(shù)在多核苷酸水平上檢測攜帶此類多核苷 酸突變的生物體(尤其是感染的生物體)。
來自攜帶本發(fā)明多核苷酸和/或多肽的突變體或多態(tài)形式(等位基因變 體)生物體的細(xì)胞也可以通過多種技術(shù)在多核苦酸或多肽水平上被檢測，從 而例如允許用于血清分型。例如可以用RT-PCR檢測RNA中的突變。尤 其優(yōu)選使用結(jié)合自動化檢測系統(tǒng)的RT-PCR,例如GeneScan。為同樣目的 PCR中也可以4吏用RNA、 cDNA或基因組DNA。作為一個實例，d吏用與 編碼蛋白質(zhì)E多肽的多核苷酸互補(bǔ)的PCR引物來鑒定和分析突變。
本發(fā)明還提供5，和/或3，端除去l、 2、 3或4個核苷酸的引物。這些引
物可以用于擴(kuò)增來自個體樣品(例如機(jī)體材料)的蛋白質(zhì)E DNA和/或 RNA。該引物可以用于擴(kuò)增從感染個體分離的多核苷酸，然后通過多種技 術(shù)來闡明這些多核苷酸的序列。以這種方式，可以檢測到多核苷酸序列中 的突變，并可將其用于診斷和/或預(yù)測感染或感染期或病程，或者用于血清 分型和/或感染物分類。
本發(fā)明還提供診斷疾病、優(yōu)選細(xì)菌感染、更優(yōu)選由非典型流感嗜血菌 引起的感染的方法，其包含從來自個體的樣品(例如機(jī)體材料)中檢測具有 SEQ ID NO: 11任意序列的多核普酸的表達(dá)水平的提高?？梢杂萌我獗绢I(lǐng) 域熟知的多核苷酸定量方法測量蛋白質(zhì)E多核苷酸表達(dá)的增加或減少，例 如擴(kuò)增、PCR、 RT畫PCR、 RNAS^護(hù)、Northern印跡、光i普測定和其他 雜交方法。
另夕卜，本發(fā)明用于檢測與正常對照組織樣品相比較蛋白質(zhì)E多肽過表 達(dá)的診斷測定可以用于檢測例如感染的存在。在來自宿主的樣品(例如機(jī)體 材料)中確定蛋白質(zhì)E多肽水平所使用的測定技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟 知的。此類測定方法包括方t射免疫測定法、竟?fàn)幮越Y(jié)合測定法、Western 印跡分析、抗體夾心測定法、抗體檢測和ELISA測定。
本發(fā)明的多核苷酸可以用作多核苷酸陣列的成分，優(yōu)選用于高密度陣 列或載網(wǎng)。這些高密度陣列尤其用于診斷和預(yù)測目的。例如包含不同基因 和還包含本發(fā)明一種或多種多核苷酸的一系列點，可以用作例如在雜交或 核酸擴(kuò)增中所用的獲自或衍生自機(jī)體樣品的探針，來確定個體中特定多核 香酸序列或相關(guān)序列的存在。此類存在可以表示病原體(尤其是非典型流感 嗜血菌)的存在，并且可以用于診斷和/或預(yù)測疾病或病程。優(yōu)選包含SEQ ID NO: ll任意多核苷酸序列的多種變體的網(wǎng)格。也優(yōu)選包含SEQ ID NO: l-10任意多肽序列的編碼多核苷酸序列的許多變體。
絲
本發(fā)明的多肽和多核苷酸或其變體、或表達(dá)其的細(xì)胞可以用作免疫原 從而產(chǎn)生分別對此類多肽或多核苷酸特異免疫專一的抗體?？蛇x地，多肽 序列中的表位的模擬表位(尤其是肽模擬表位)也可以用作免疫原從而產(chǎn)生
對本發(fā)明多肽特異免疫專一的抗體。術(shù)語"特異免疫專一"指總體上抗體 對本發(fā)明的多肽比對現(xiàn)有技術(shù)中其他相關(guān)多肽具有更高的親和力。
本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案提供抗蛋白質(zhì)E多肽或多核苷酸的抗體。 本發(fā)明的多肽或多核苷酸的抗體可以通過以下方式獲得以常規(guī)方法 向動物(優(yōu)選非人類)施用本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸、或它們之一或兩者 的表位攜帶片段、它們之一或兩者的同源物、或表達(dá)它們之一或兩者的細(xì) 胞。為制備單克隆抗體，可以使用本領(lǐng)域已知的通過培養(yǎng)傳代細(xì)胞系產(chǎn)生 抗體的任意技術(shù)。實例包括多種技術(shù)，例如在Kohler， G和Milstein， C， Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor等人，Immunology Today 4: 72 (1983); Cole等人，MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, 77-96頁,Alan R. Liss， Inc. (1985)中所述。
產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國專利No. 4,946，778)適合于產(chǎn)生本發(fā)明多肽 或多核苷酸的單鏈抗體。同時，可以用轉(zhuǎn)基因小鼠、轉(zhuǎn)基因其他生物體或 動物(例如其他哺乳動物)來表達(dá)對本發(fā)明多肽或多核苷酸特異免疫專一的 人源化抗體。
可選擇地，可以利用噬菌體展示技術(shù)從篩選具有抗蛋白質(zhì)E的人淋巴 細(xì)胞PCR擴(kuò)增的v-基因的所有組成成分中或從天然文庫中篩選與本發(fā)明 多肽有結(jié)合活性的抗體基因(McCafferty，等人，(1990)， Nature 348， 552-554; Marks,等人，(1992) Biotechnology 10， 779-783)。也可以通過例如鏈改組來 改良這些抗體的親和力(Clackson等人，(l"l) Nature 352: 628)。
上述抗體可以用于分離或鑒定表達(dá)本發(fā)明多肽或多核苷酸的克隆，從 而通過例如親和層析來純化該多肽或多核苷酸。
因此，除此之外蛋白質(zhì)E多肽或蛋白質(zhì)E多核苦酸的抗體可以用于治 療感染，尤其是細(xì)菌感染。
包括抗原的、表位的或免疫的等同變體的多肽變體構(gòu)成本發(fā)明的特定 方面。
優(yōu)選地，修飾抗體或其變體，使其在個體中具有較小的免疫原性。例 如，如果個體是人類，那么抗體最優(yōu)選是"人源化的"，其中互補(bǔ)決定區(qū)
或雜交瘤衍生的抗體區(qū)被移植到人單克隆抗體中，例如在Jones等人 (1986), Nature 321， 522-525或Tempest等人，(1991) Biotechnology 9， 266-273中描述的。
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本發(fā)明的多肽和多核苷酸也可以用于評測小分子底物和配體的結(jié)合， 例如在細(xì)胞、無細(xì)胞制劑、化學(xué)文庫和天然產(chǎn)物混合物中。這些底物和配 體可以是天然底物和配體、或是結(jié)構(gòu)或功能模擬物。例如見Coligan等人， Current Protocols in Immunology 1(2)， 第5章(1991)。
篩選方法可以通過標(biāo)記直接或間接與候選化合物結(jié)合的方式從而筒 單地測量候選化合物與多肽或多核苷酸的結(jié)合、或與細(xì)胞或細(xì)胞膜攜帶的 多肽或多核苷酸的結(jié)合、或多肽的融合蛋白質(zhì)的結(jié)合?？蛇x擇地，篩選方 法包括與標(biāo)記的竟?fàn)幬锞範(fàn)帯４送?，這些篩選方法使用適合于包含多肽或 多核苷酸的細(xì)胞的檢測系統(tǒng)，可以測試候選化合物是否通過激活或抑制多 肽或多核苷酸從而產(chǎn)生信號。通常在存在已知激動劑時測定激活的抑制 劑，并且在存在〗矣選化合物時觀察激動劑對激活的作用。組成型激活的多
選方法，該方法在缺乏激動劑或抑制劑的情況下，通過測試候選化合物是 否抑制多肽或多核苷酸(視情況而定)的激活。此外，篩選方法可以簡單 地包括將候選化合物與含本發(fā)明多肽或多核苷酸的溶液混合的步驟，從而 形成混合物，測量混合物中蛋白質(zhì)E多肽和/或多核苷酸的活性，并且將其 與標(biāo)準(zhǔn)相比較。上述融合蛋白質(zhì)(例如Fc部分和蛋白質(zhì)E多肽形成的融合 蛋白質(zhì))也可以用于高通量篩選測定從而鑒定本發(fā)明多肽和系統(tǒng)發(fā)育和/或 功能上相關(guān)的多肽的拮抗劑(見D. Bennett等人，J Mol Recognition, 8:52-58 (1995);和K. Johanson等人，J Biol Chem， 270 (16) :9459-9471 (1995))。
與本發(fā)明的多肽結(jié)合和/或相互作用的多核苷酸、多肽和抗體也可以用 于檢測細(xì)胞中所加入的化合物對mRNA和/或多肽產(chǎn)生的作用的構(gòu)型篩選 方法。例如，可以用單克隆和多克隆抗體通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法構(gòu)建
ELISA測定方法來測量多肽的分泌或結(jié)合細(xì)胞的水平?？梢杂迷摲椒◤倪m
本發(fā)明也提供篩選化合物的方法，以鑒定那些增強(qiáng)(激動劑)或阻斷(拮 抗劑)蛋白質(zhì)E多肽或多核苷酸作用的化合物，尤其是那些制菌和/或殺菌 的化合物。篩選方法可以包括高通量技術(shù)。例如，為篩選激動劑或拮抗劑， 含有蛋白質(zhì)E多肽和該多肽的標(biāo)記底物或配體的合成反應(yīng)混合物、細(xì)胞區(qū) 室(例如細(xì)胞膜、胞外被膜或細(xì)胞壁)、或任意其制品在缺乏或存在可能是 蛋白質(zhì)E激動劑或拮抗劑的候選分子的情況下孵育。候選分子激動或拮抗 蛋白質(zhì)E多肽的能力反映在減少標(biāo)記配體的結(jié)合或降低來自該底物的產(chǎn)物 的產(chǎn)生。自然結(jié)合的分子(即不需誘導(dǎo)蛋白質(zhì)E多肽的作用)最可能是好的 拮抗劑。結(jié)合良好并且根據(jù)具體情況，增加從底物產(chǎn)生產(chǎn)物的速率、增加 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或增加化學(xué)通道活性的分子是激動劑。根據(jù)具體情況，可以通過 使用報告系統(tǒng)來增進(jìn)從底物產(chǎn)生產(chǎn)物的速率或水平、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、或化學(xué)通 道活性的檢測。在此方面可以使用的報告系統(tǒng)包括但不限于顯色法、轉(zhuǎn)換 為產(chǎn)物的標(biāo)記底物、負(fù)責(zé)改變蛋白質(zhì)E多核苷酸或多肽活性的報告基因和 本領(lǐng)域公知的結(jié)合測定。
蛋白質(zhì)E激動劑測定方法的另一個實例是竟?fàn)幮詼y定，即在對竟?fàn)幮?抑制測定合適的條件下，將蛋白質(zhì)E和可能的激動劑與蛋白質(zhì)E結(jié)合分子、 重組蛋白質(zhì)E結(jié)合分子、天然底物或配體、或模擬底物或配體相結(jié)合。例 如通it^射性或顯色化合物可以將蛋白質(zhì)E標(biāo)記，從而精確地確定結(jié)合于 結(jié)合分子或轉(zhuǎn)換為產(chǎn)物的蛋白質(zhì)E分子的量，來評價可能的拮抗劑的效應(yīng)。
可能的拮抗劑包括結(jié)合于本發(fā)明多核苷酸和/或多肽并由此抑制或消 減其活性或表達(dá)的有機(jī)小分子、肽、多肽和抗體?？赡艿霓卓箘┮部梢允?與結(jié)合分子結(jié)合于相同位點的有機(jī)小分子、肽、多肽(例如緊密相關(guān)的蛋白 質(zhì))或抗體，例如不誘導(dǎo)蛋白質(zhì)E誘導(dǎo)的活性的結(jié)合分子，從而通過排除蛋 白質(zhì)E多肽和/或多核苷酸的結(jié)合來阻止其作用或表達(dá)。
可能的拮抗劑包括結(jié)合并占據(jù)多肽結(jié)合位點的小分子，由此阻止細(xì)胞
結(jié)合分子的結(jié)合，從而阻止正常的生物活性。小分子的實例包括但不限于 有機(jī)小分子、肽或肽類分子。其他可能的拮抗劑包括反義分子(這些分子的
描述見Okano，丄Neurochem. 56: 560 (1991); OLIGODEOXY-NUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC出版，Boca Raton, FL (1988))。優(yōu)選的可能拮抗劑包 括蛋白質(zhì)E的相關(guān)化合物和變體。
本發(fā)明的另 一方面涉及包含本發(fā)明多肽的基因工程可溶融合蛋白質(zhì)， 或其片段，和多種亞類免疫球蛋白(IgG、 IgM、 IgA、 IgE)的重鏈或輕鏈恒 定區(qū)的多個部分。優(yōu)選免疫球蛋白是人IgG(優(yōu)選IgGl)的重鏈的恒定部分， 其中融合發(fā)生在鉸鏈區(qū)。在特定實施方案中，通過摻入可被血液凝固因子 Xa切割的切割序列可容易地將Fc部分除去。此外，本發(fā)明涉及通過基因 工程制備這些融合蛋白質(zhì)的方法，和其用于藥物篩選、診斷和治療的用途。 本發(fā)明的另一方面也涉及編碼此類融合蛋白質(zhì)的多核普酸。融合蛋白質(zhì)技 術(shù)的實例可以在國際專利申請W094/29458號和W094/22914號中找到。
本文提供的各多核苷酸序列可以用于抗菌化合物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)。表達(dá) 的編碼蛋白質(zhì)可以用作篩選抗菌藥物的靶。另外，編碼該編碼蛋白質(zhì)M 末端區(qū)域、或SD序列或其他有利于各自mRNA翻譯的序列的多核苦^f 列可以用于構(gòu)建反義序列從而控制目的編碼序列的表達(dá)。
本發(fā)明也提供本發(fā)明的多肽、多核苷酸、激動劑或拮抗劑用于干涉病 原體與真核(優(yōu)選哺乳動物)宿主之間造成感染后遺癥的原始物理相互作用
的用途。具體地，本發(fā)明的分子可以用于預(yù)防細(xì)菌(尤其是革蘭氏陽性和 /或革蘭氏陰性細(xì)菌)粘附于真核生物(優(yōu)選哺乳動物)內(nèi)在裝置或創(chuàng)傷部位 的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)；阻斷與真核生物(優(yōu)選哺乳動物)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì) 的細(xì)菌粘附和介導(dǎo)組織損傷的細(xì)菌蛋白質(zhì)E蛋白質(zhì)之間的細(xì)菌粘附，和/ 或阻斷原始感染的正常發(fā)病進(jìn)程，而不是通過植入內(nèi)在裝置或通過其他外 科技術(shù)。
本發(fā)明的另 一方面還提供蛋白質(zhì)E激動劑和拮抗劑，優(yōu)選制菌或殺菌 的激動劑和拮抗劑。
本發(fā)明的拮抗劑和激動劑可以用于例如預(yù)防、抑制和/或治療疾病。 本發(fā)明的另 一方面涉4發(fā)明多肽的模擬表位。模擬表位是極為類似
于(序列上或結(jié)構(gòu)上)天然肽的肽序列，其能夠被識別天然肽的抗體識別； 或當(dāng)其與合適載體配對時能夠產(chǎn)生識別天然肽的抗體。
可以通過所選氨基酸的添加、缺失或取代來設(shè)計用于特定目的的肽模 擬表位。因此，為易于與蛋白質(zhì)載體結(jié)合的目的可以對肽進(jìn)行修飾。例如， 為了某些化學(xué)結(jié)合方法期望包括末端半胱氨酸。另外，為了結(jié)合于蛋白質(zhì) 載體的肽期望包括肽結(jié)合端遠(yuǎn)端的疏7jc末端，從而使肽游離的非結(jié)合末端 保持與載體蛋白質(zhì)表面的結(jié)合。由此肽呈現(xiàn)最接近整體天然分子中發(fā)現(xiàn)的 肽的構(gòu)象。例如可以將肽改變?yōu)榫哂蠳-端半胱氨酸和C-端疏水酰胺尾。 可選擇地，添加或取代一個或多個M酸(反向序列)的D-立體異構(gòu)體，從 而可以產(chǎn)生有益的衍生物，例如增強(qiáng)肽穩(wěn)定性的衍生物。模擬表位也可以 是天然肽序列的逆向序列，即序列的方向;^良向的。模擬表位也可以是特 征上逆向相反的。逆向相反和逆向相反的肽在WO 95/24916和WO 94/05311中描述。
可選擇地，肽模擬表位可以用能夠結(jié)合于本發(fā)明多肽的抗體通過例如 噬菌體展示技術(shù)(EP 0 552 267 Bl)來鑒定。該技術(shù)產(chǎn)生大量模擬天然肽結(jié)構(gòu) 的肽序列，因此能夠結(jié)合天然肽的抗體，而不必需其本身具有與天然肽顯 著同源的序列。
瘦麥
本發(fā)明的另一方面涉及在個體(尤其哺乳動物，優(yōu)選人類)中誘導(dǎo)免 疫應(yīng)答的方法，其包含以足夠產(chǎn)生抗體和/或T細(xì)胞免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)E 多核苷酸和/或多肽、或其片段或變體接種個體，從而使所述個體防御感染、 尤其是細(xì)菌感染和最尤其是非典型流感嗜血菌感染。本發(fā)明也提供此類免 疫應(yīng)答減緩細(xì)菌復(fù)制的方法。本發(fā)明另 一方面涉及在個體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答 的方法，其包含向該個體遞送核酸載體、序列或核酶從而指導(dǎo)蛋白質(zhì)E多 核香酸和/或多肽、或其片段或變體的表達(dá)，在體內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)E多核苷酸 和/或多肽、或其片段或變體來誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，例如產(chǎn)生抗體和/或T細(xì)胞(包括例如產(chǎn)生細(xì)胞因子的T細(xì)胞或細(xì)胞毒T細(xì)胞)免疫應(yīng)答，從而不論 個體是否罹患疾病，都可以在所述個體(優(yōu)選人類)中防御疾病。施用基因 的一個實例是通過包被顆?；蚱渌緩郊铀倨溥M(jìn)入目的細(xì)胞中。此類核酸 載體可以包含DNA、 RNA、核酶、修飾的核酸、DNA/RNA雜化物、DNA畫 蛋白質(zhì)復(fù)合物或RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。
本發(fā)明的另 一方面涉及引入個體(優(yōu)選人類)后能夠在其中誘導(dǎo)免疫應(yīng) 答的免疫組合物，其在該個體中誘導(dǎo)對蛋白質(zhì)E多核苷酸和/或編碼多肽的 免疫應(yīng)答，其中組合物包含重組蛋白質(zhì)E多核苷酸和/或編碼多肽，和/或 包含編碼和表達(dá)所述蛋白質(zhì)E多核苷酸和/或編碼多肽、或本發(fā)明其他多肽 的抗原的DNA和/或RNA。免疫應(yīng)答可以在治療上或預(yù)防上應(yīng)用，并且形 成抗體免疫和/或細(xì)胞免疫，例如由CTL或CD4+T細(xì)胞引起的細(xì)胞免疫。
蛋白質(zhì)E多肽或其片段可以與輔助蛋白質(zhì)(co-protein)或化學(xué)部分融 合，這些部分本身可以產(chǎn)生或不產(chǎn)生抗體，但是能夠穩(wěn)定第一蛋白質(zhì)和產(chǎn) 生具有抗原和/或免疫性質(zhì)、優(yōu)選防護(hù)性質(zhì)的融合或修飾蛋白質(zhì)。因此，融 合的重組蛋白質(zhì)優(yōu)選還包含抗原性輔助蛋白質(zhì)，例如脂蛋白或來自流感嗜 血菌的蛋白質(zhì)D(EP 594610)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)或P-半乳糖苷酶、或 任意其他使蛋白質(zhì)溶解和利于其產(chǎn)生和純化的相對大的輔助蛋白質(zhì)。而 且，輔助蛋白質(zhì)可以充當(dāng)佐劑從而引起接受蛋白質(zhì)的生物體的免疫系統(tǒng)產(chǎn) 生全身性刺激。輔助蛋白質(zhì)可以附加到第一蛋白質(zhì)的^J^-或g-末端。
本發(fā)明的疫苗組合物、蛋白質(zhì)E多肽和/或多核苷酸，或其片段、模擬 表位或變體，可以存在于載體中，例如上述活的重組載體中，例如活的細(xì) 菌栽體。
對于蛋白質(zhì)E多肽，非活載體也是合適的，例如細(xì)菌外膜小泡或"皰 (blebs)"。 OM皰衍生自革蘭氏陰性細(xì)菌的雙層膜的外膜，并且在許多革蘭 氏陰性細(xì)菌中被證明(Zhou， L等人1998. FEMS Microbiol . Lett. 163:223-228)，包括C. trachomatis和C. psittaci。 l艮道過的產(chǎn)生皰的細(xì)菌 病原體的非詳盡名單也包括百日咳博德特式菌(Bordetella pertussis )、 博氏疏螺體(Borrelia burgdorferi)、 馬爾他布魯氏菌(Brucellamelitensis)、羊布魯氏菌(Bmcella ovis)、大腸桿菌、流感嗜血菌、嗜肺性 軍團(tuán)病桿菌(Legionella pneumophila),凈占膜炎莫拉菌、淋病奈瑟氏球菌 (Neisseria gonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟氏球菌、綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)。
皰的優(yōu)點在于提供天然構(gòu)象的外膜蛋白質(zhì)，并因此尤其可用于疫苗。 針對疫苗用途，皰也可以通過改造細(xì)菌以修飾一個或多個外膜上分子的表 達(dá)而得到改良。因此例如可以引入或上調(diào)目的免疫原性蛋白質(zhì)(例如蛋白質(zhì) E多肽)在外膜上的表達(dá)(例如通過改變啟動子)。替代的或另外的，可下調(diào) 不相關(guān)的(例如非保護(hù)性抗原或免疫顯性但是可變的蛋白質(zhì))或有害的(例如 毒性分子例如LPS、或自身免疫應(yīng)答的可能誘導(dǎo)物)外膜分子的表達(dá)。這些 途^圣在下面更詳細(xì)的論述。
蛋白質(zhì)E基因的非編碼側(cè)翼區(qū)包含對于基因表達(dá)重要的調(diào)控元件。此 類調(diào)控在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上發(fā)生。在基因可讀框上游或下游的這些區(qū)域的 序列可以通過DNA測序而獲得。該序列信息可以確定可能的調(diào)控基序， 例如不同的啟動子元件、終止子序列、可誘導(dǎo)序列元件、阻抑物、負(fù)責(zé)相 轉(zhuǎn)變的元件、SD序列、具有可能涉及調(diào)控的二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域、以及其他 類型的調(diào)控基序或序列。該序列是本發(fā)明的另一方面。
這些序列信息調(diào)控蛋白質(zhì)E基因的天然表達(dá)?？梢酝ㄟ^改變啟動子、 SD序列、可能的阻抑或操縱元件或其他相關(guān)元件來實現(xiàn)基因表達(dá)的上調(diào)。 同樣，可以通過相似類型的修飾來實現(xiàn)表達(dá)的下調(diào)?？蛇x擇地，通過改變 相轉(zhuǎn)變序列，可以將基因的表達(dá)置于相轉(zhuǎn)變控制下，或與該調(diào)控解耦合。 對于另一途徑，可以將基因的表達(dá)置于一個或多個可誘導(dǎo)元件的控制下， 從而調(diào)控表達(dá)。此類調(diào)控的實例包括但不限于變溫誘導(dǎo)、添加誘導(dǎo)底物(如 所選的糖類或其f汴生物、孩^量元素、維生素、輔助因子、金屬離子等等)。
上述此類修飾可以通過幾種不同方法引入?；虮磉_(dá)中涉及的序列修 飾可以在體內(nèi)通過隨機(jī)誘變進(jìn)行，隨后篩選所希望的表型。另一途徑包括 分離目的區(qū)域和通過隨機(jī)誘變、或位點定向取代、插入或缺失誘變對其進(jìn) 行修飾。然后將修飾的區(qū)域通過同源重組再插入到細(xì)菌基因組中，并評測
對基因表達(dá)的作用。在另一途徑中，可以使用目的區(qū)域的序列信息來取代 或刪除所有或部分天然調(diào)控序列。在此情況下，分離和修飾靶向的調(diào)控區(qū)， 使其包含另一基因的調(diào)控元件、不同基因的調(diào)控元件的組合、合成的調(diào)控 區(qū)或任意其他調(diào)控區(qū)，或者刪除野生型調(diào)控序列的所選部分。這些1務(wù)飾的 序列隨后可以通過同源重組再插入到細(xì)菌基因組中?？梢杂糜谏险{(diào)基因表 達(dá)的優(yōu)選的啟動子的非詳盡名單包括來自腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟
氏球菌的啟動子porA、 porB、 lbpB、 tbpB、 pllO、 1st、 hpuAB; ompCD、 copB、 lbpB、 ompE、 UspAl; UspA2;來自粘膜炎莫拉菌的TbpB;來自 流感嗜血菌的pl、 p2、 p4、 p5、 p6、 1pD、 tbpB、 D15、 Hia、 Hmwl、 Hmw2。
在一個實施例中，可以通過用強(qiáng)啟動子交換其啟動子(通過分離基因的 上游序列，體外修飾該序列并通過同源重組再引入基因組)來調(diào)節(jié)基因的表 達(dá)?？梢栽诩?xì)菌和從細(xì)菌脫落(制造)的外膜嚢泡中獲得上調(diào)的表達(dá)。
在其他實施例中，所述途徑可以用于為疫苗應(yīng)用產(chǎn)生具有改良性質(zhì)的 重組細(xì)菌菌林。這些可以是(但不限于)減毒菌林、所選抗原表達(dá)增加的菌 林、敲除(或降低表達(dá))干涉免疫應(yīng)答的基因的菌林、免疫顯性蛋白質(zhì)調(diào)節(jié) 性表達(dá)的菌林、外膜嚢泡調(diào)節(jié)性脫落的菌林。
因此，本發(fā)明也提供蛋白質(zhì)E基因的修飾的上游區(qū)域，該修飾的上游 區(qū)域包含改變位于外膜的蛋白質(zhì)E蛋白質(zhì)表達(dá)水平的異源調(diào)控元件。本發(fā) 明此方面的上游區(qū)域包括蛋白質(zhì)E基因的上游序列。該上游區(qū)域剛好起始 于蛋白質(zhì)E基因的上游，并且通常延續(xù)到基因ATG起始密碼子上游不超 過約1000 bp的位點。對于基因位于多順反子序列(操縱子)中的情況，上 游區(qū)域可以剛好起始于目的基因前面、或操縱子中第一基因的前面。優(yōu)選 地，本發(fā)明此方面的修飾的上游區(qū)域在ATG上游500到700 bp之間的位 點包含異源啟動子。
所公開的上游區(qū)域上調(diào)蛋白質(zhì)E基因表達(dá)的用途、通過同源重組實現(xiàn) 該目的的方法(例如本文引入?yún)⒖嫉腤O 01/09350中所述)、包含適合于此 目的的上游序列的載體和如此改變的宿主細(xì)胞都是本發(fā)明的另外方面。
因此，本發(fā)明提供在修飾的細(xì)菌皰中的蛋白質(zhì)E多肽。本發(fā)明還提供 能夠產(chǎn)生基于非活膜皰載體的修飾的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供包含蛋白質(zhì) E基因的核酸載體，該蛋白質(zhì)E基因具有含異源調(diào)控元件的修飾的上游區(qū)域。
本發(fā)明還提供制備本發(fā)明的宿主細(xì)胞和細(xì)菌皰的方法。 本發(fā)明也提供包含本發(fā)明多肽和/或多核苷酸和免疫刺激性DNA序列
的組合物(尤其是疫苗組合物)和方法，例如Sato, Y.等人Science 273: 352
(1996)中描述的。
本發(fā)明也提供在感染非典型流感嗜血菌的動物模型的此類基因免疫 實驗中使用的多核苷酸構(gòu)建體中，使用所述編碼細(xì)菌細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的不 可變區(qū)的多核苷酸或其特定片段的方法。此類實驗尤其用于鑒定能夠產(chǎn)生 預(yù)防或治療性免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)表位。相信此途徑允許衍生自成功抵抗或 清除感染的動物的必需器官的有特定價值的單克隆抗體的此后制備，也允 許開發(fā)哺乳動物(尤其是人類)中細(xì)菌感染的預(yù)防藥物或治療方法，尤其是 對于非典型流感嗜血菌感染。
本發(fā)明也包括包含本發(fā)明的免疫原性重組多肽和/或多核苷酸以及合 適載體(例如可藥用載體)的疫苗制劑。由于多肽和多核苷酸可能在胃中,皮 破壞，因此優(yōu)選腸胃外施用，包括例如皮下施用、肌肉內(nèi)施用、靜脈施用 或真皮內(nèi)施用。適合于腸胃外施用的制劑包括水的和非水的無菌注射溶 液，其可以包含抗氧化劑、緩沖液、制菌化合物，以及使制劑與體液(優(yōu)選 血液)等滲的溶質(zhì)；和水的和非水的無菌混懸液，其可以包括懸浮劑或增稠 劑。該制劑可以存在于單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿和小瓶 中，并且可以于凍干條件儲存，在使用前僅需要添加無菌液體載體。
本發(fā)明的疫苗制劑也可以包括用于增強(qiáng)制劑免疫原性的佐劑系統(tǒng)。優(yōu)
選的佐劑系統(tǒng)優(yōu)先引起TH1型應(yīng)答。
免疫應(yīng)答可以大致分為兩種極端種類，即體液或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答 (通常分別以抗體和細(xì)胞效應(yīng)子保護(hù)機(jī)制來表征)。這些應(yīng)答的分類稱為
TH1型應(yīng)答(細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答)和TH2型免疫應(yīng)答(體液應(yīng)答)。
極端TH1型免疫應(yīng)答的特征在于產(chǎn)生抗原特異的單元型限制性細(xì)胞 毒T淋巴細(xì)胞，和天然殺傷細(xì)胞應(yīng)答。在小鼠中，TH1型應(yīng)答通常的特征 在于產(chǎn)生IgG2a亞型的抗體，在人類中這些相應(yīng)于IgGl型抗體。TH2型 免疫應(yīng)答的特征在于產(chǎn)生廣泛的免疫球蛋白同種型，包括小鼠中的IgGl、 IgA和IgM。
認(rèn)為這兩種類型的免疫應(yīng)答t艮的推動力是細(xì)胞因子。高水平的TH1 型細(xì)胞因子傾向于誘導(dǎo)對給定抗原的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而高水平的 TH2型細(xì)胞因子傾向于誘導(dǎo)對抗原的體液免疫應(yīng)答。
TH1和TH2型免疫應(yīng)答的差別不是絕對的。事實上，應(yīng)描述為個體 主要支持TH1免疫應(yīng)答或主要支持TH2免疫應(yīng)答。然而，通常方便地認(rèn) 為細(xì)胞因子家族為Mosmann和Coffman描述的小鼠CD4+ve T細(xì)胞克隆 (Mosmann， T. R.和Coffman, R. L. (1989) THl and TH2 cells: different patterns of lymphoklne secretion lead to different functional properties . Annual Review of Immunology, 7, 145-173頁)。通常，THl型應(yīng)答伴隨T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的INF-y和IL-2細(xì)胞因子。通常直接伴隨THl型免疫應(yīng)答 的誘導(dǎo)的其他細(xì)胞因子不是由T細(xì)胞產(chǎn)生，例如IL-12。相反，TH2型應(yīng) 答伴隨IL-4、 IL-5、 IL-6和IL-13的分泌。
已知某些疫苗佐劑尤其適合于刺激TH1或TH2型細(xì)胞因子應(yīng)答。通 常接種或感染以后最好的免疫應(yīng)答TH1:TH2平衡指示劑包括直接測量抗 原再刺激以后體外T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的TH1或TH2細(xì)胞因子，和/或測量 抗原特異性抗體應(yīng)答的IgGl:IgG2a比率。
因此，當(dāng)抗原在體外再刺激時，TH1型佐劑優(yōu)先刺激分離的T細(xì)胞群 體以產(chǎn)生高水平的TH1型細(xì)胞因子，并促進(jìn)CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和伴 隨TH1型同種型的抗原特異性免疫球蛋白應(yīng)答的發(fā)展。
能夠優(yōu)選刺激TH1細(xì)胞應(yīng)答的佐劑在國際專利申請WO 94/00153號 和WO 95/17209號中描述。
3去氧酰化單磷酸類脂A(De-O畫acylated monophosphoryl lipid A, 3D-MPL)就是此類佐劑之一。這從GB 2220211 (Ribi)獲知?；瘜W(xué)上其是3 去氧?；瘑瘟姿犷愔珹與4、 5或6個酰化鏈的混合物，并且由Ribi Immunochem， Montana制造。3去氧?；瘑瘟姿犷愔珹的優(yōu)選形式在歐 洲專利0 689 454 Bl (SmithKline Beecham Biologicals SA)中公開。
優(yōu)選地，3D-MPL顆粒足夠小以致于可以通過0.22微米膜過濾除菌(歐 洲專利0 689 454號)。
3D-MPL以10 jig-100 ng每劑量、優(yōu)選25-50ng每劑量的范圍存在， 其中抗原通常以每劑量2-50pg范圍存在。
另 一個優(yōu)選的佐劑包含QS21，其為獲自Quillaja Saponaria Molina樹 皮的HPLC純化的非毒性級分。任選可以將其與3去氧?；瘑瘟柞Ｖ?A(3D-MPL)混合，任選地與載體一起。
產(chǎn)生QS21的方法在美國專利5，057，540號中7>開。
先前已經(jīng)描述了包含QS21的非反應(yīng)原性的佐劑制劑(WO 96/33739)。 已表明此類包含QS21和膽固醇的制劑當(dāng)與抗原配制到一起時是成功刺激 TH1的佐劑。
優(yōu)先刺激TH1細(xì)胞應(yīng)答的其他佐劑包括免疫調(diào)節(jié)寡核苷酸，例如WO 96/02555中7〉開的未甲基化的CpG序列。
如上所述的不同的刺激TH1的佐劑的組合也估計是優(yōu)先刺激TH1細(xì) 胞應(yīng)答的佐劑。例如QS21可以與3D-MPL配制在一起。QS21:3D-MPL 的比例通常是1:10到10:1的級別；優(yōu)選1:5到5:1和通?；緸?:1。優(yōu) 選的最佳協(xié)同作用的范圍是3D-MPL: QS21為2.5:1到1:1。
在本發(fā)明的疫苗組合物中也優(yōu)選存在載體。載體可以是水包油乳劑， 或鋁鹽，例如磷酸鋁或氫氧化鋁。
優(yōu)選的水包油乳劑包含代謝油，例如角鯊烯、a生育酚和吐溫80。在 尤其優(yōu)選的方面，在該乳劑中本發(fā)明的疫苗組合物中的抗原與QS21和 3D-MPL組合。另外的水包油乳劑可以包含span 85和/或磷脂酰膽堿和/ 或辛酸甘油酯。
人類通常施用的QS21和3D-MPL在疫苗中以每劑量1-200照、例如 10-100 jig、優(yōu)選10-50 jig的范圍存在。通常水包油乳劑包含2-10%的角鯊
烯、2-10%的0[生育酚和0.3-3%的吐溫80。角篁烯a生育酚的優(yōu)選比例 等于或小于l，因為這樣會提供更穩(wěn)定的乳劑。Span85也可以以1%的水 平存在。某些情況下有利的是本發(fā)明的疫苗還包^l定劑。
無毒水包油乳劑優(yōu)選在水載體中包含無毒油(例如篁烷或角篁烯)、乳 化劑(例如吐溫80)。水載體可以是例如磷酸鹽緩沖鹽水。
在水包油乳劑中包含QS21、 3D-MPL和生育酚的尤其有效的佐劑制 劑在WO 95/17210中描述。
雖然本發(fā)明參考特定蛋白質(zhì)E多肽和多核苷酸進(jìn)行描述，但是應(yīng)該理 解其覆蓋天然存在的多肽和多核苷酸的片段，和具有添加、缺失或取代而 基本上不影響重組多肽或多核苷酸的免疫原性的類似多肽和多核苷酸。優(yōu) 選的片^肽在實施例10中描述。
本發(fā)明也提供包含本發(fā)明疫苗制劑與其他抗原組合的多價疫苗組合 物，其中其他抗原尤其是用于治療中耳炎的抗原。此類多價疫苗組合物可 以包括上述誘導(dǎo)TH1的佐劑。
在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的多肽、片段和免疫原與一個或多個如下 抗原組配制(a)—個或多個肺炎球菌莢膜多糖(純的或結(jié)合于載體蛋白質(zhì))； (b)—個或多個可以使宿主防御粘膜炎莫拉菌感染的抗原；(c)一個或多個能 夠使宿主防御肺炎鏈球菌感染的蛋白質(zhì)抗原；(d)—個或多個其他非典型流 感嗜血菌蛋白質(zhì)抗原；(e)—個或多個能夠使宿主防御RSV的抗原；和(f) 一個或多個能使宿主防御流感病毒的抗原。優(yōu)選組a)和b); b)和c); b)、 d)和a)和/或c); b)、 d)、 e)、 f)、和a)和/或c)的組合。此類疫苗可以有利 地用作綜合中耳炎疫苗(global otitis media vaccine)。
肺炎球菌莢膜多糖抗原優(yōu)選選自血清型1、 2、 3、 4、 5、 6B、 7F、 8、 9N、 9V、 IOA、 IIA、 12F、 14、 15B、 17F、 18C、 19A、 19F、 20、 22F、 23F和33F(最優(yōu)選選自血清型1、 3、 4、 5、 6B、 7F、 9V、 14、 18C、 19F 和23F)。
優(yōu)選的肺炎球菌蛋白質(zhì)抗原是外露于肺炎球菌外表面的那些肺炎球 菌蛋白質(zhì)(在肺炎球菌生活周期過程的至少部分中能夠被宿主的免疫系統(tǒng)
識別)，或者是由肺炎球菌分泌或釋放的蛋白質(zhì)。最優(yōu)選的蛋白質(zhì)是毒素、
黏附素、2-組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物、或肺炎鏈球菌的脂蛋白，或其片段。尤其優(yōu) 選的蛋白質(zhì)包括但不限于肺炎球菌溶血素(優(yōu)選通過化學(xué)處理或突變而去 毒)[Mitchell等人Nucleic Acids Res. 1990年7月11日；18(13): 4010 "Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2."， Mitchell等人Biochim Biophys Acta 1989年1 月 23 日；1007(1): 67-72 "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coll: rapid purification and biological properties.", WO 96/05859 (A. Cyanamid) , WO 90/06951 (Paton等人)，WO 99/03884 (NAVA)]; PspA和其跨膜缺失變體(WO 92/14488; WO 99/53940; US 5804193 - Briles等人)；PspC和其跨膜缺失變體(WO 99/53940; WO 97/09994 - Briles等人)；PsaA和其跨膜缺失變體(Berry & Paton， Infect Immun 1996年12月；64 (12) : 5255-62 "Sequence heterogeneity of PsaA， a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae");肺炎球菌膽堿結(jié)合蛋白質(zhì)和其跨膜缺失變體；CbpA和其 跨膜缺失變體(WO 97/41151; WO 99/51266);甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Infect. Immun. 1996 64:3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez- Beato等 人FEMS Microbiol Lett 1998， 164:207-14); M類蛋白質(zhì)，SB專利申請EP 0837130號；和黏附素18627 (SB專利申請EP 0834568號)。更優(yōu)選的肺炎 球菌蛋白質(zhì)抗原在WO 98/18931中公開，尤其是WO 98/18930和 PCT/US99/30390中選擇的蛋白質(zhì)抗原。
包括在組合疫苗(尤其是預(yù)防中耳炎)之內(nèi)的優(yōu)選的粘膜炎莫拉菌蛋白 質(zhì)抗原是OMP106 [WO 97/41731 (Antex)和WO 96/34960 (PMC)； OMP21; LbpA和/或LbpB [WO 98/55606 (PMC)]; TbpA和/或TbpB [WO 97/13785和WO 97/32980 (PMC)；CopB [Helminen ME,等人(1993) Infect. Immun. 61:2003-2010；UspAl和/或UspA2 [WO 93/03761 (University of Texas)；OmpCD ; HasR (PCT/EP99/03824) ; PilQ (PCT/EP99/03823); OMP85 (PCT/EPOO/01468); lipo06 (GB 9917977.2);lipo10 (GB 9918208.1); lipoll (GB 9918302.2); lipo18 (GB 9918038.2); P6 (PCT/EP99/03038); D15 (PCT/EP99/03822 ); OmplAl(PCT/EP99/06781); Hly3 (PCT/EP99/03257 );和OmpE。
包括在組合疫苗(尤其是預(yù)防中耳炎)之內(nèi)的更優(yōu)選的非典型流感嗜血 菌蛋白質(zhì)抗原包括絲束蛋白[(US 5766608 - Ohio State Research Foundation) j和含其肽的融合物[例如LBl (f)肽融合物；US 5843464 (OSU) 或WO 99/64067；OMP2WO 97/01638 (Cortecs)；PEP 281673 (紐約 州立大學(xué))；蛋白質(zhì)D(EP594610); TbpA和/或TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmwl; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641); P2; P5 (WO 94/26304); NlpC2 (BASB205) [WO 02/30971；Sip (BASB203) [WO 02/30960；和iOMP1681 (BASB210) [WO 02/34772。
優(yōu)選的流感病毒抗原包括在蛋或MDCK細(xì)胞、或Vero細(xì)胞或完整流 感病毒體中生長的完整、活的或滅活的病毒、裂解的流感病毒(如在R.
Gluck ， Vaccine, 1992， 10， 915-920中描述)、或其純化的或重組的蛋白質(zhì)， 例如HA、 NP、 NA或M蛋白質(zhì)、或其組合。
優(yōu)選的RSV(呼吸道合胞病毒)抗原包括F糖蛋白、G糖蛋白、HN蛋 白質(zhì)、或其f汴生物。
邀合參、秀盆和淑才法
本發(fā)明的另一方面提供包含蛋白質(zhì)E多核苷酸和/或蛋白質(zhì)E多肽的 組合物，用于向細(xì)胞或多細(xì)胞生物體施用。
本發(fā)明也涉及包含本文所述多核苷酸和/或多肽，或其激動劑或拮抗劑 的組合物。本發(fā)明的多肽和多核苷酸可以與用于細(xì)胞、組織或生物體的有 菌或無菌載體組合應(yīng)用，例如適合于個體施用的藥用載體。此類組合物包 含例如介質(zhì)添加劑或治療有效量的本發(fā)明多肽和/或多核苷酸和可藥用載 體或賦形劑。此類載體可以包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、 甘油、乙醇和其組合。制劑應(yīng)當(dāng)適合于施用方式。本發(fā)明還涉及包含充滿
一種或多種上迷本發(fā)明組合物成分的一種或多種容器的診斷和藥物包裝 和藥盒。
本發(fā)明的多肽、多核苷酸和其他化合物可以單獨4吏用或與其他化合物 (例如治療化合物)組合使用。
藥物組合物可以以任意有效方便的方式施用，包括例如通過局部、口 腔、肛門、陰道、靜脈、,內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或皮內(nèi)等途徑施用。
作為治療或預(yù)防，可以向個體施用作為可注射組合物的活性試劑，例 如無菌水分歉系，優(yōu)選等滲的。
本發(fā)明的另一方面提供包含藥學(xué)有效量的多肽和/或多核苷酸的藥物 組合物，例如本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸、激動或拮抗肽或小分子化合物 的可溶形式，其與可藥用載體或賦形劑組合。此類栽體包括但不限于鹽水、 緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、和其組合。本發(fā)明還涉及包含充滿 一種或多種上述本發(fā)明組合物成分的一種或多種容器的藥物包裝和藥盒。 本發(fā)明的多肽、多核苷酸和其他化合物可以單獨^使用或與其他化合物(例如 治 療化合物)組合使用。
組合物應(yīng)適合于施用途徑，例如通過全身或經(jīng)口途徑。優(yōu)選的全身施 用形式包括注射，通常通過靜脈注射。也可使用其他注射途徑，例如皮下 的、肌內(nèi)的或 內(nèi)的注射。全身施用的可選方式包括使用滲透劑(例如膽 鹽或夫西地孢酸或其他去污劑)經(jīng)粘膜和經(jīng)皮施用。另外，如果本發(fā)明的 多肽或其他化合物以腸溶劑或微嚢制劑形式制備，那么也可以經(jīng)口施用。 這些化合物也可以局部和/或定位施用，形式為軟膏劑、糊劑、凝膠劑、溶 液劑、粉末劑等等。
對于向哺乳動物(尤其人類)施用，預(yù)期活性試劑的每日劑量水平為
0.01mg/kg到10mg/kg,通常約為lmg/kg。無論如何，醫(yī)師將會確定最適 合個體并隨具體個體的年齡、體重和反應(yīng)而改變的實際劑量。上述劑量為 一般情況的實例。當(dāng)然，有應(yīng)用更高或更低劑量范圍的個體實例，這些也 在本發(fā)明的范疇之內(nèi)。
所需的劑量范圍依賴于肽的選擇、施用途徑、制劑的本性、受試者的 自然條件、和主治醫(yī)師的判斷。然而，合適的劑量是在0.1-100ng/kg受試
者的范圍內(nèi)。疫苗組合物方便地為可注射的形式?？梢允褂贸Ｒ?guī)佐劑從而增強(qiáng)免疫
應(yīng)答。免疫接種的合適單位劑量是0.5-5照抗原/kg，并且該劑量優(yōu)選施用 1-3次，中間間隔1-3周。用所示劑量范圍，沒有觀察到本發(fā)明化合物防礙 其施用于合適個體的有害毒理學(xué)作用。
然而，考慮到多種有效化合物和多種施用途徑的不同功效，所需的劑 量預(yù)期有廣泛改變。例如經(jīng)口施用預(yù)期比靜脈注射需要更高的劑量。正如 本領(lǐng)域所熟知的，這些劑量水平的改變可以用標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)化實驗程序來校 正。
序/y炎紫岸、才多介j井時,W、 >#法
多核苷酸和多肽序列形成有價值的信息資源，用其可以確定它們的2-和3-維結(jié)構(gòu)，也可以鑒定其他相似同源性的序列。最有利于這些途徑的是 通過將序列儲存到計算機(jī)可讀介質(zhì)中，然后將儲存的數(shù)據(jù)用于已知的大分 子結(jié)構(gòu)程序或用熟知的查詢工具(例如GCG程序包)在序列數(shù)據(jù)庫中查詢本發(fā)明也提供分析特征序列或字符串的方法，尤其是基因序列或編碼 蛋白質(zhì)的序列。優(yōu)選的序列分析方法包括例如序列同源性分析方法(例如同 一性和相似性分析)、DNA、 RNA和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析、序列集合、支序分 析、序列基序分析、可讀框確定、核酸堿基判定、密碼子使用分析、核酸 堿基修整、和測序色i普峰分析。
提供基于計算機(jī)的方法進(jìn)行同源性鑒定。該方法包含如下步驟在計 算機(jī)可讀介質(zhì)中提供包含本發(fā)明多核苷酸序列的第 一多核苷酸序列；和將 所述第一多核苷酸序列與至少一個第二多核苷酸或多肽序列進(jìn)行比較從 而鑒定同源性。
也提供基于計算機(jī)的方法進(jìn)行同源性鑒定，所述方法包含如下步驟 在計算機(jī)可讀介質(zhì)中提供包含本發(fā)明多肽序列的第一多肽序列；和將所述
第一多肽序列與至少一個第二多核苷酸或多肽序列進(jìn)行比較從而鑒定同源性。
本說明書中引用的所有的出版物和參考文獻(xiàn)、包括但不限于專利和專 利申請在本文完整引入作為參考，就如同每一出版物或參考文獻(xiàn)在本文明
確和單獨地完整引入作為參考一樣。本申請書優(yōu)先要求的任意專利申請也 以上述出版物和參考文獻(xiàn)的方式在本文完整引入作為參考。
定義
"同一性"如本領(lǐng)域所知的，是兩個或多個多肽序列或兩個或多個多 核苷酸序列之間的關(guān)系，根據(jù)具體情況通過比較序列來確定。本領(lǐng)域中，
"同一性，，也指多肽或多核苷^f列之間序列相關(guān)性的程度，根據(jù)具體情 況通過此類序列的字符串之間的匹配來確定。"同一性"可以通過已知方
法容易地計算，包括但不限于(Computational Molecular Biology, Lesk， A.M.編著，Oxford University出版，紐約，1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.編著，Academic出版，紐約，1993; Computer Analysis of Sequence Data,第 一部分，Griffin, A.M.和Griffin, H.G.編著，Humana出版，新澤西州，1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G" Academic 出版，1987;和Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.和Devereux， J.編著，M Stockton出版， 紐約，1991;和Carillo， H.和Lipman, D.， SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)中描述的方法。確定同一性的方法是給出測試序列之間最大的 匹配。而且，確定同一性的方法被編成可公開獲得的計算^14呈序。確定兩 序列之間同 一性的計算機(jī)程序方法包括但不限于CGC程序包中的GAP程 序(Devereux, J.，等人，Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984))、 BLASTP、 BLASTN (Altschul, S. F.等人，J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)和FASTA ( Pearson和Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988))。 BLAST家族程序是可以從NCBI和其他來源可公開獲 得的(BLAST Manual, Altschul， S.等人，NCBI NLM NIH Bethesda， MD 20894; Altschul, S.等人，J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990))。也可以4吏用熟 知的Smith Waterman算法來確定同一性。 多肽序列比較的參數(shù)包括如下
算法Needleman和Wunsch， J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)
比較矩陣BLOSSUM62來自Henikoff和Henikoff， Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992) 空位罰分8 空位長度罰分2
使用這些參數(shù)的程序是可以作為"空位"程序從Genetics Computer Group, Madison WI公開獲得的。上述參數(shù)是肽比較的缺省參數(shù)(對于末端 空位沒有罰分)。
多核苷酸比較的參數(shù)包括如下
算法Needleman和Wunsch， J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970) 比較矩陣匹配=+10，不匹配=0 空位罰分50 空位長度罰分3
可獲得來自Genetics Computer Group, Madison WI的"空位"程
序。這些是核酸比對的缺省參數(shù)。
根據(jù)具體情況多核苷酸和多肽"同一性"的優(yōu)選含意在下面(1)和(2)
中提供。
(l)多核苷酸實施方案還包括分離的多核苷酸，其包含與SEQ ID NO: 11參考序列具有至少50、 60、 70、 80、 85、 90、 95、 97或100%同一性的 多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列可以與SEQ ID NO: 11參考序列是 相同的，或可以包括與參考序列相比有高達(dá)特定整數(shù)的核苷酸改變，其中 所述改變是選自至少一個核苷酸缺失、取代(包括轉(zhuǎn)換和顛倒)、或插入， 并且其中所述改變可以出現(xiàn)在參考核苷酸序列的5，或3，末端位點或這些末 端位點之間的任意位置，單獨*于參考序列的核苷酸之中或分軟在參考 序列中一個或多個連續(xù)基團(tuán)中，并且其中所述的核苷酸改變數(shù)的確定是通 過將定義同一性百分比的整數(shù)除以100再乘以SEQ ID NO: 11的核苷酸總 數(shù)，然后用所述SEQIDNO: ll核苷酸總數(shù)減去該乘積，或
nn S xn - (xn y)
其中nn是核苷酸改變數(shù)，Xn是SEQ ID NO: 11的核苷酸總數(shù)，y對
于50%是0.50、對于60%是0.60、對于70%是0.70、對于80%是0.80、 對于85%是0.85、對于90%是0.90、對于95%是0.95、對于97%是0.97
或?qū)τ?00%是1.00，并且.是乘法操作的符號，并且其中任意非整數(shù)的Xn
和y的乘積在從xn減去之前要四舍五入為最接近的整數(shù)。編碼SEQ ID NO: 1-10的多肽的多核苷酸序列的改變會在編碼序列中產(chǎn)生無義的、錯義的或 移碼突變，由此在此類改變后多核苷酸編碼的多肽發(fā)生改變。
例如，本發(fā)明的多核苷酸序列可以與SEQIDNO: 11參考序列是相同 的，即同一性100%,或者其可以包括與參考序列相比較高達(dá)特定整數(shù)的 核酸改變，從而使同一性百分比小于100%。此類改變選自至少一個核酸 缺失、取代(包括轉(zhuǎn)換和顛倒)、或插入，并且其中所述改變可以出現(xiàn)在參 考多核苷酸序列的5，或3，末端位點或這些末端位點之間的任意位置，單獨 M于參考序列的核酸之中或介狀在參考序列中一個或多個連續(xù)基團(tuán)中。 給定同一性百分比的核苷酸改變數(shù)的確定是通過將定義同一性百分比的 整數(shù)除以100再乘以SEQ ID NO: 11的核酸總數(shù)，然后用所述SEQ ID NO: ll核酸總數(shù)減去該乘積，或
nn ^ xn畫(xn y)
其中nn是核酸改變數(shù)，xn是SEQ ID NO: 11的核酸總數(shù)，y例如對 于70%是0.70、對于80%是0.80、對于85%是0.85等等，，是乘法操作的
符號，并且其中任意非整數(shù)的Xn和y的乘積在從Xn減去之前要四舍五入 為最接近的整數(shù)。
(2)多肽實施方案還包括分離的多肽，其包含與SEQ ID NO: 1-10多肽 參考序列具有至少50、 60、 70、 80、 85、 90、 95、 97或100%同一性的多 肽，其中所述多肽序列可以與SEQIDNO: l-10參考序列是相同的，或可 以包括與參考序列相比較高達(dá)特定整數(shù)的氨基酸改變，其中所述改變選自 至少一個氨基酸缺失、取代(包括保守和非保守取代)、或插入，并且其中 所述改變可以出現(xiàn)在參考多肽序列的氨基或羧基末端位點或這些末端位 點之間的任意位置，單獨M于參考序列的M酸之中或^:在參考序列 中一個或多個連續(xù)基團(tuán)中，并且其中所述的氨基酸改變數(shù)的確定是通過將
定義同一性百分比的整數(shù)除以100再乘以SEQ ID NO: l-10的氨基酸總數(shù)， 然后用所述SEQ ID NO: 1-10氨基酸總數(shù)減去該乘積，或 na^xa-(xa' y)
其中na是氨基酸改變數(shù)，Xa是SEQIDNO: l-10的氨基酸總數(shù)，y對 于50%是0.50、對于60%是0.60、對于70%是0.70、對于80%是0.80、 對于85%是0.85、對于90%是0.90、對于95%是0.95、對于97%是0.97 或?qū)τ?00%是1.00，并且.是乘法操作的符號，并且其中任意非整數(shù)的Xa 和y的乘積在從xa減去之前要四舍五入為最接近的整數(shù)。
例如，本發(fā)明的多肽序列可以與SEQ ID NO: 1-10參考序列是相同的， 即同一性100%，或者其可以包括與參考序列相比較高達(dá)特定整數(shù)的Jl^ 酸改變，從而使同一性百分比小于100%。此類改變選自至少一個氨基酸 缺失、取代(包括保守和非保守取代)、或插入，并且其中所述改變可以出 現(xiàn)在參考多肽序列的氨基或羧基末端位點或這些末端位點之間的任意位 置，單獨#于參考序列的^&酸之中或*在參考序列中一個或多個連 續(xù)基團(tuán)中。給定同一性百分比的氨基酸改變數(shù)的確定是通過將定義同一性 百分比的整數(shù)除以100再乘以SEQ ID NO: 1-10的M酸總數(shù)，然后用所 述SEQ ID NO: 1-10氬基酸總數(shù)減去該乘積，或
na￡xa-(xa* y)
其中na是氨基酸改變數(shù)，Xa是SEQIDNO: l-10的狄酸總數(shù)，y例 如對于70%是0.70、對于80%是0.80、對于85%是0.85等等，并且*是乘
法操作的符號，并且其中任意非整數(shù)的Xa和y的乘積在從Xa減去之前要四 舍五入為最接近的整數(shù)。
本文所用"個體"當(dāng)指生物體時，指多細(xì)胞真核生物，包括但不限于 后生動物、哺乳動物、ovid、?？?bovid)、猿、靈長類和人類。
"分離的"指從天然狀態(tài)"通itA工"改變，即如果其天然存在，那 么從其原始環(huán)境改變或移出、或同時進(jìn)行。例如在活的生物體中天然存在 的多核苷酸或多肽就不是"分離的"，但是從其天然狀態(tài)的共存材料中分 離的相同的多核苷酸或多肽是"分離的"，正如該術(shù)語在本文中的應(yīng)用。
而且，通過轉(zhuǎn)化、基因操作或任意其他組合方法引入到生物體中的多核苷 酸或多肽，即使其仍然存在于所述生物體中，其也是"分離的"，該生物 體可以是活的或無生命的。
"多核普酸"通常指任意多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，其可以
是包括單鏈和雙鏈區(qū)域的未修飾RNA或DNA，或修飾的RNA或DNA。
"變體"指與參考多核苷酸或多肽不同但是保留基本特性的多核苷酸 或多肽。通常多核苷酸變體與其他參考多核苷酸在核苷酸序列上有所不 同。變體的核苷酸序列的改變可以改變或不改變參考多核苷酸編碼的多肽 的M酸序列。如下所述，核苷酸改變可以在參考序列編碼的多肽中導(dǎo)致 氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。通常多肽變體與其他參考多肽在 M酸序列上有所不同。通常差異是有限的，從而使參考多肽序列和變體 在許多區(qū)域中整體上接近相似和相同。變體和參考多肽在M酸序列上的 不同可以是任意組合的一個或多個取代、添加、缺失。取代或插入的^J^ 酸殘基可以是或不是由遺傳密碼所編碼的。多核苷酸或多肽變體可以天然 存在(例如等位變體)，或其可以不是天然存在的。非天然存在的多核苷酸 和多肽變體可以通過誘變技術(shù)形成或直接合成。
"疾病"指由細(xì)菌感染引起或與細(xì)菌感染相關(guān)的任意疾病，包括例如 嬰兒和兒童的中耳炎、老年肺炎、鼻竇炎、醫(yī)源性感染和4曼入性疾病、聽 覺喪失的慢性中耳炎、中耳積水、聽覺神經(jīng)損傷、語音學(xué)習(xí)遲緩、上呼吸 道感染和中耳發(fā)炎。
實驗部分
除非另外詳細(xì)說明，下面的實施例用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行，這些技術(shù)是本領(lǐng) 域技術(shù)人員熟知和常規(guī)使用的。實施例是為了說明而不是限制本發(fā)明。
^研究描述命名為流感嗜血菌的蛋白質(zhì)E(pE)的新的外膜蛋白質(zhì)和新 的截短的重組pE(A)的分離、純化、表征、克隆和表達(dá)，該蛋白質(zhì)通過4吏 用人IgD (X)骨髓瘤血清而發(fā)現(xiàn)。
材料和方法 試浙
b型流感嗜血菌菌林MinnA和NTHi3655獲自Robert S. Munson Jr. (Washington University School of Medicine (St. Louis， Mo)。非典型流感嗜 血菌菌林NTHi772是從本系臨床上的鼻咽擦洗培養(yǎng)物中分離的(2)。也分 析了 一系列不同嗜血菌屬物種并在表1中描述。人IgD骨髓瘤血清(whole serum )IgD(X)購自The Binding Site (Birmingham,英國)。為產(chǎn)生特異性 抗pE抗血清，用200照在完全弗氏佐劑(Difco， Becton Dickinson, Heidelberg,德國)中乳化的重組pE22-160 [pE(A)]或結(jié)合于匙孔血藍(lán)蛋白 (KLH)的pE41-68肽對兔進(jìn)行肌肉內(nèi)免疫，并且在18天和36天用等劑量 的在不完全弗氏佐劑中的蛋白質(zhì)強(qiáng)化。2到3周后取血。通過用pE(A)或 綴合于CnBr-瓊脂糖的特異性pE肽(pE41-68)進(jìn)行親和層析來分離得到的 多克隆抗體(ll)。辣根過氧化物酶(HRP)綴合的山羊抗人IgD來自 Biosource (Camarillo， CA)。兔抗人IgD pAb來自Dakopatts (Gentofte，丹 麥)。
異硫氰酸熒光素(FITC)綴合的小鼠抗人IgD、 HRP綴合的兔抗人輕鏈 (K和X)、和FITC綴合的豬抗兔多克隆免疫球蛋白購自Dakopatts。
b型流感嗜血菌(MinnA)在補(bǔ)充NAD和氯高鐵血紅素(Sigma， St. Louis， MO)各10 ng/ml的腦心浸液(BHI)培養(yǎng)基(Difco Laboratories, Detroit, Mich.)中生長過夜。洗滌細(xì)菌兩次后在含0.5 % Empigen (Calbiochem Novabiochena， Bedford, MA)的0.05 M Tris畫HCl-緩沖液(pH 8.8)中提取細(xì) 菌。細(xì)菌懸液經(jīng)磁力攪拌在37X:混合2小時。在4。C、 8000xg離心20分 鐘以后，上清用無菌濾器(0.45 nm; Sterivex-HV， Millipore)過濾。在0.5 % Empigei^中提取的流感嗜血菌應(yīng)用于以含6M尿素的0.05 M Tris-HCl (pH 8.8)平衡的Q-瓊脂糖柱(Amersham Pharmacia Biotech)。該柱在相同緩沖 液中用0至1M NaCl線性梯度洗脫。將用IgD (X)骨髓瘤血清檢測的級分 混合，在Spectraphor薄膜管(分子量截留6-8，000; Spectrum, Laguna hills,CA)中向0.05 M Tris-HCl， pH 8.8透析，并且在Yml00圓盤膜(分子量截留 10,000; Amicon， Beverly, MA)上濃縮。
^"J:f ^^^S/XS-ZMC^^M^^iTPf^ter"伊逸)
用10% Bis-Tris凝膠以電泳緩沖液(MES)、樣品緩沖液(LDS)和轉(zhuǎn)膜 緩沖液，以及來自Novex (San Diego， CA)的印跡儀器在150恒壓下 SDS-PAGE。樣品按常規(guī)在100"C加熱10分鐘。凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250 (13; Bio-Rad， Sundbyberg,瑞典)染色。蛋白質(zhì)條帶從凝膠向immobilon-P膜 (Millipore， Bedford, MA)的電泳轉(zhuǎn)移在30V進(jìn)行2-3小時。轉(zhuǎn)移以后， immobilon-P膜用含5%奶粉和0.05 %吐溫20的PBS (PBS-Tween)封閉。 在PBS-Tween中洗滌幾次之后，膜與純化的IgD骨髓瘤蛋白質(zhì)(0.5 jig/ml， 人IgD (k)骨髓瘤)在含2。/。奶粉的PBS-Tween中在室溫孵育1小時。用 PBS-Tween洗滌幾次之后，加入1/1000稀釋的HRP綴合的山羊抗人IgD。 室溫孵育40分鐘，然后再進(jìn)4亍幾次另外的PBS-Tween洗滌，最后用ECL Western印跡檢測試劑(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 進(jìn)4亍顯影。
二維SZ)S炎丙;^應(yīng)/^凝應(yīng)冶泳(2-" /MG巧和W^ter"伊遊 離子交換層析之后，Empigei^提取的流感嗜血菌(MinnA)用IPGphor IEF系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech)進(jìn)行等電聚焦(IEF)(5，12)。使用 標(biāo)準(zhǔn)物凝膠定標(biāo)(gel calibration,目錄號161-0320; Bio-Rad)。 2-D聚丙烯 酰胺凝膠經(jīng)120mA過夜電轉(zhuǎn)移到Immobilon-PVDF濾膜(filter)上(0.45 mm; Millipore， Bedford, US)。飽和以后，進(jìn)行上述孵育、封閉和洗滌步驟。 扇差辦船、浙
用應(yīng)用生物系統(tǒng)(Foster City, CA) 470A氣液固相序列分析儀進(jìn)行自動 氨基斜列分析。
流^ ，j&豚差的游建
通過使用改進(jìn)的Berns和Thomas方法(2，13)從772菌林制備染色體 DNA。簡言之，從40jig以Sau3A部分消化1小時的DNA構(gòu)建流感嗜血 菌772基因組文庫。切割的DNA用蔗糖梯度分級(14)。將包含合適大小
(2國7kbp)DNA片段的級分混合，將DNA連接到BamHI消化的pUC18中， 然后用基因脈沖器(Bio-Rad ， Richmond CA)經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 JM83中。將細(xì)菌涂布到補(bǔ)充氨千青霉素和乂-031(5-溴-4-氯-3-丐|咮-|5-0-吡喃半乳糖苷)的LB瓊脂上。
^發(fā)名瘦浙定、Z>A^4為、岸和浙y^
通過干濾膜覆蓋在瓊脂表面將在LB瓊脂上過夜培養(yǎng)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化 體轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾膜(Sartorius，GOttingen，德國)上。平^L置15分 鐘，通過暴露于飽和氯仿蒸汽20分鐘來裂解細(xì)胞。在含卵清蛋白的Tris 平衡鹽(50 mM Tris-鹽酸化物、154 mM NaCl、 1.5 %卵清蛋白[pH 7.4)中 孵育濾膜30分鐘從而將濾膜上剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點封閉。封閉以后，濾 膜與人IgD (X)一起孵育30分鐘。洗滌后，加入HRP綴合的抗人IgD多克 隆抗體，并與濾膜一起孵育30分鐘。所有的孵育在室溫下進(jìn)行。最后，濾 膜用4-氯-1-萘酚和11202進(jìn)行顯影。糸沐陽性克隆，并純化含NTHi772基 因組DNA的pUC18質(zhì)粒DNA。得到的NTHi772DNA插入片段用側(cè)翼序 列M13+和M13-和BigDye末端循環(huán)測序儀第2.0版即時反應(yīng)測序試劑盒 (Perkin- Elmer, Foster City, Ca)進(jìn)行測序。獲得的插入序列(3.55kbp)相應(yīng) 于含編碼蛋白質(zhì)HI0175、 HI0176、 HI0177、和最終HI0178的DNA的一 段序列(15)。
層j義發(fā)和蛋^^4這
所有的構(gòu)建體使用PCR擴(kuò)增的片段制備。用含NTHi772基因組 DNA(HI0175到HI0178)的pUC18作為模板。Taq DNA聚合酶來自Roche (Mannheim,德國)，PCR條件按制造商所推薦?？寺×?4個預(yù)測蛋白質(zhì) HI0175到HI0178的可讀框，但是本文僅包括克隆HID(HI0178)過程的描 述。pE^"n[稱為pE(A)缺少包括谷氨酰胺21氨基酸殘基的內(nèi)源信號肽， 用 引物 5'-ctcaggatccaaaggctgaacaaaatgatgtg-3， 和
5'-ggtgcagattaagcttttttttatcaactg-3，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并引入限制酶位點 BamHI和HindIII。為了融合由載體編碼的6組氨酸殘基，將pE2"幼終止 密碼子突變。將獲得的戶e基因的417 bp可讀框連接到pET26(+)(Novagen，
Darmstadt,德國)中。為了避免假定的毒性，首先將獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿 主大腸桿菌DH5a中。此后，將編碼pE和pE(A)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主 BL21(DE3)中。除全長pE和pE(A)以夕卜，也制備了一系列截短的pE變體。 概要在圖8中顯示。所有構(gòu)建體使用包含BamHI和HindIII的引物。截短 變體的過程如上所述。所有構(gòu)建體用BigDye末端循環(huán)測序儀第2.0版即時 反應(yīng)測序試劑盒(Perkin- Elmer, Foster City, Ca)進(jìn)行測序。
為產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)，細(xì)菌生長到對數(shù)中期(OD6。。為0.6-0.8)，隨后用1 mM異丙基-l-硫代-P-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)得到pE(A)的過表達(dá)。當(dāng) OD細(xì)達(dá)到1.5到1.7時，收集細(xì)菌并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法分離包涵體。重組蛋白 質(zhì)還可以用鎳柱通過親和層析純化。純化的重組蛋白質(zhì)隨后用SDS-PAGE 進(jìn)行分析。
流感嗜j&,Z)A^趟必，戶C7
臨床分離的流感嗜血菌的基因組DNA用Dneasy組織試劑盒(Qiagen， Hilden，德國)分離。Taq DNA聚合酶來自Roche (Mannheim,德國)，且 PCR條件按制造商所推薦。為分離/7e基因，使用分別與HI0177和HI0179 側(cè)翼基因退火的引物對 5，畫 gcatttattaggtcagtttattg畫3，和 5，隱gaaggattatttctgatgcag-3，。獲得的PCR產(chǎn)物(948bp)通過基因步行法用上 述除5'-cttgggttacttaccgcttg-3，和5'-gtgttaaacttaacgtatg畫3，以夕卜的引物進(jìn)4亍 測序。用染料末端循環(huán)測序試劑盒(CEQ DTCS試劑盒，Beckman Coulter, Stockholm,瑞士)在Beckman CEQ 2000上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。獲得的DNA 序列的編輯和比對用 PHRED (CodonCode， Deadham， USA)和 SEQUENCHER (MedProbe， Oslo,挪威)進(jìn)行。
^關(guān)^流^嗜i蘿(A^^' J/ " ^辦務(wù)
用分離自NTHi772的基因組DNA作為模板。包^P分HI0177和 HI0179基因的/^的5'和3，末端作為兩個盒(分別為815 bp和836 bp)用 DyNAzymeTM II DNA聚合酶(Finnzymes， Espoo， Finland)來擴(kuò)增，除在兩 個盒中特異引入的序列以外，分別引入限制酶位點XhoI和EcoRI、 EcoRI 和SpEI(18)。消化得到的PCR片段，并將其克隆到pBluescript SK (+/-)
中。從pUC4K中通過EcoRI限制酶位點獲得卡那霉素抗性基因盒(1282 bp)。 PCR產(chǎn)物經(jīng)消化后，連接到含部分HI0177和HI0179基因的截短的 ，基因片段中。根據(jù)heriott等人的M-IV方法轉(zhuǎn)化流感嗜血菌菌林Eagan 和RM804(19)。通過PCR!Hi得到的突變體，并用Western印跡和流式 細(xì)胞術(shù)分析pE表達(dá)。 #于^參#我斧
得到的序列與可獲得的流感嗜血菌KW20基因組(http:〃www.tigr.org) 進(jìn)行比較(15)。用環(huán)球網(wǎng)預(yù)測服務(wù)器中心的生物序列分析SignalP 1.1版 (http:〃www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/)推測信號肽(16)。用Kyte和 Doolittle的方法分沖斤pE疏水性i瞽。
動#,手術(shù)橫#々義處？M^模費
使用體重200-250g的健康雄性Sprague-Dawley大鼠。在手術(shù)之前通 過耳顯微鏡確定所有動物沒有中耳感染。在介入時，靜脈內(nèi)施用美索比妥 (Brietal , Elli Lilly and Company, Indianapolis, IN)或^Jt內(nèi)施用7K合氯 醛(apoteksbolaget， Lund,瑞典)麻醉大鼠。用于動物實驗的細(xì)菌的培養(yǎng)如 上所述。通過離心收集以后，在新鮮的培養(yǎng)基中重懸細(xì)菌，對于NTHi3655 和相應(yīng)pE突變體細(xì)菌濃度為2xl(T克隆形成單位(cfu)。制備物在水上保 存直到使用。為誘導(dǎo)急性中耳炎(AOM)，從頸腹側(cè)正中切口延伸到達(dá)中耳， 向中耳腔緩慢滴入約0.05ml細(xì)菌懸液。在手術(shù)3天和5天后進(jìn)行耳顯微鏡 觀察。具有化膿性滲出物的中耳炎(即不透明滲出物并且在第3天通常可見 血管顯著膨脹)稱為AOM。
結(jié)果
由/^d a) f"體yfj&,檢浙時^^嗜^^"蛋^灰^T/^)時爽承和為、庠
先前認(rèn)為非典型流感嗜血菌(NTHi)不結(jié)合IgD(19)，而有莢膜的流感 嗜血菌與IgD強(qiáng)烈結(jié)合。我們發(fā)現(xiàn)IgD (k)骨髓瘤血清也特異性地結(jié)合于 NTHi。 NtHi772的典型流式細(xì)胞術(shù)語在圖1中顯示。當(dāng)存在IgD (k)骨髓 瘤蛋白質(zhì)時，與沒有IgD的對照相比較有強(qiáng)烈的位移和增強(qiáng)的熒光。
為詳細(xì)分析由IgD(X)骨髓瘤檢測的流感嗜血菌外膜蛋白質(zhì)，將外膜部
分在去污劑Empige,中溶解。圖IB表明在Western印跡上表觀分子量為 約16kDa的蛋白質(zhì)具有非常強(qiáng)的IgD結(jié)合活性。然而，在考馬斯亮藍(lán)染色 的SDS-PAGE上檢測不到相應(yīng)IgD結(jié)合活性的明顯蛋白質(zhì)條帶。用Q-瓊 脂糖柱分離以后，相同的外膜提取物應(yīng)用于2維凝膠電泳和銀染色(圖1C)。 作為平行，用人IgD (l)作為探針進(jìn)行相應(yīng)的Western印跡。由此圏定pE 定位的區(qū)域。然而，沒有檢測到可見的蛋白質(zhì)(圖1C)。
蛋^^五^鏖一凝乏/^的率^藝流感繚血蘿炎《琳^新務(wù) 由于分離以后在2-D分析中沒有檢測到任何蛋白質(zhì)，因此我們使用非 典型流感嗜血菌(NTHi)菌林772構(gòu)建流感嗜血菌DNA文庫。包含2-7kbp 范圍的片段的基因組DNA連接到pUC18中，隨后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM83 中。用包括人IgD (X)和HRP綴合的抗人IgD多克隆抗體的克隆免疫測定 法來分析轉(zhuǎn)化物的IgD結(jié)合。在測試的20000個克隆中發(fā)現(xiàn)3個陽性克隆， 將它們用IgD (l)進(jìn)行第二輪篩選。我們將一個陽性克隆測序，發(fā)現(xiàn)了 3.55kb的插入序列，其包含編碼根據(jù)流感嗜血菌KW20物理圖譜的4個蛋 白質(zhì)HI0175到HI0178的DNA(15)。為了進(jìn)一步^與IgD (k)的特異性 相互作用，所選的轉(zhuǎn)化細(xì)胞也用流式細(xì)胞術(shù)分析。如圖2B所示，與僅轉(zhuǎn) 化空載體的陰性對照大腸桿菌相比較，通過IgD (k)檢測到含有相應(yīng)于 HI0175到HI0178編碼序列的流感嗜血菌772基因組DNA的大腸桿菌 JM83 (圖2A)。
除分析大腸桿菌JM83克隆以外，將4個流感嗜血菌蛋白質(zhì)(HI0175 到HI0178)克隆到表達(dá)載體pET26(+)中，并在大腸桿菌BL21DE3中產(chǎn)生 這些蛋白質(zhì)。獲得的重組蛋白質(zhì)用IgD (X)在Western印跡上分析，發(fā)現(xiàn) HI0178是唯一能用IgD (X)檢測的蛋白質(zhì)(數(shù)據(jù)未顯示)。
在pE編碼基因中引入卡那霉素抗性基因盒從而將非典型流感嗜血菌 (NTHi3655)突變。獲得的突變體用PCR確認(rèn)，并通過Western印跡用特 異性抗pE抗血清分析外膜蛋白質(zhì)來證實pE表達(dá)的缺失(數(shù)據(jù)未顯示)。 NTHi 3655Ape突變體也用流式細(xì)胞術(shù)測定，并發(fā)現(xiàn)當(dāng)用兔抗pE單克隆抗 血清和FITC綴合的山羊抗兔二抗pAb分析時，突變體與相應(yīng)NTHi3655
野生型相比較，熒光明確減少(圖2C和D)。
在摩才^感攀血漭^檢浙^蛋^^五，而^趟亞;^力厲遂
為了分析臨床分離物的pE表達(dá)和NTHi典型菌林，我們開發(fā)了包括 IgD (X)血清和直接抗人IgD的FITC綴合二抗的直接結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)測定。 在最初的實驗中，分析在不同時間點收集的細(xì)菌的pE表達(dá)。沒有檢測到 對數(shù)生長期和靜止期細(xì)菌之間pE表達(dá)的差異，提示NTHi表面pE不依賴 于生長期。因此在所有進(jìn)一步分析中使用靜止期的細(xì)菌。分析每個細(xì)菌細(xì) 胞的平均熒光強(qiáng)度(mfi),我們的研究中總共包括22個NTHi菌林。不同 的NTHi菌林之間熒光強(qiáng)度不同，盡管在使用IgD (k)骨髓瘤血清作為檢測 抗體的該具體測定中多數(shù)NTHi中檢測到pE(圖3)。
在其他實驗中，使用特異性兔抗pE抗體檢測表面外露的pE。特異抗 pE抗血清也在有莢膜的流感嗜血菌、埃及嗜血菌(好.fl紹y/7ric船)和溶血 嗜血菌(i/.^i^w(^c"s)菌抹中特異性識別pE(數(shù)據(jù)未顯示)。
為了進(jìn)一步分析pE表達(dá)水平，Empigen⑧處理的多種嗜血菌屬物種的 外膜提取物用IgD (k)作為檢測抗體在Western印跡中測試(表l)。在這些 實驗中，高表達(dá)和低表達(dá)的嗜血菌菌林之間沒有發(fā)現(xiàn)差異，即在Western 印跡中，所有菌林展現(xiàn)相同強(qiáng)度的pE，并在相應(yīng)于16kDa的相同位置。 Western印跡表明有莢膜的流感嗜血菌(a到f型)也表達(dá)pE(表1)。例如， 在圖4中，4個b型莢膜流感嗜血菌(Hib)中的pE表達(dá)與NTHi相比較。 埃及嗜血菌和溶血嗜血菌表達(dá)pE(表1),而其他相關(guān)嗜血菌屬物種在流式 細(xì)胞術(shù)中呈陰性(圖3)， Western印跡分析沒有檢測到pE。特異抗pE抗血 清也在有莢膜的菌株中特異性識別pE(數(shù)據(jù)未顯示)。
表l
有莢膜的或非典型的 (NT)
556流感嗜血菌CCUG EF 6881 1芙膜a型 557流感嗜血菌CCUG EF 7315 I莢膜a型
Western印跡 (陽性/陰性;0) 陽性 陽性
94流感嗜血菌a型陽性
479流感嗜血菌MinnAb型陽性
547流感嗜血菌Eagan b型陽性
485流感嗜血菌85 05 30 b陽性
539流感嗜血菌D-22莢膜b型陽性
541流感嗜血菌HK695莢膜b型陽性
542流感嗜血菌HK 691莢膜b型陽性
577流感嗜血菌HK 713莢膜b型陽性
578流感嗜血菌HK714莢膜b型陽性
582流感嗜血菌HK 83458莢膜b型陽性
581流感嗜血菌HK 163莢膜b型陽性
580流感嗜血菌HK729莢膜b型陽性
569流感嗜血菌17 B Dallas莢膜b型陽性
568流感嗜血菌DL 42/2F4莢膜b型陽性
579流感嗜血菌HK 720莢膜b型陽性
477流感嗜血菌6-460莢膜b型陽性
570流感嗜血菌DL42莢膜b型陽性
流感嗜血菌RM 804無莢膜b型陽性
583流感嗜血菌HK705無莢膜b型陽性
551流感嗜血菌CCUG EF 4851 II莢膜c型陽性
552流感嗜血菌CCUG EF 4852 II莢膜c型陽性
95 流感嗜血菌c型陽性
555流感嗜血菌CCUG EF 6878 IV莢膜d型陽性
560流感嗜血菌CCUG EF NCTC 8470莢膜d型陽性
96 流感嗜血菌d型陽性
554流感嗜血菌CCUG EF 6877 Iv莢膜e型陽性
88 流感嗜血菌e型All/01陽性
89 流感嗜血菌e型A76/01陽性
卯流感嗜血菌e型A77/99陽性
559流感嗜血菌CCUG EF 15519 II莢膜f型陽性
78流感嗜血菌CCUG 15435莢膜f型陽性
91流感嗜血菌f型Al/01陽性
92流感嗜血菌f型A58/01陽性
93流感嗜血菌f型A91/01陽性
67流感嗜血菌NT 6-9547 b. I型陽性
478流感嗜血菌6-601 NT陽性
484流感嗜血菌6-6200 NT NT陽性
507流感嗜血菌6-102 NT NT陽性
65流感嗜血菌NT 7-68/99 Claren. lavage陽性
68流感嗜血菌NT 7-758陽性
546流感嗜血菌6-9547 NT陽性
480流感嗜血菌772 NT陽性
476流感嗜血菌6-115 NT陽性
481流感嗜血菌6-504 NT陽性
482流感嗜血菌6-7702 NT陽性
483流感嗜血菌82 10 23 NT陽性
486流感嗜血菌6-121 NT陽性
506流感嗜血菌6-6267 NT陽性
540流感嗜血菌D-26 NT陽性
543流感嗜血菌Buffalo 1479 NT陽性
544流感嗜血菌Buffalo C 7961 NT陽性
64流感嗜血菌56-2934 000428 NT陽性
69流感嗜血菌7-120/99 bronch NT陽性
70流感嗜血菌7-161/99 bronch NT陽性
66流感嗜血菌S6-2952 000428 NT陽性
105流感嗜血菌RM 3655 NT陽性
531埃及嗜血菌EF628NT，nob陽性
73埃及嗜血菌CCUG 25716陽性
74埃及嗜血菌CCUG 26840陽性
76埃及嗜血菌CCUG 39154陽性
79埃及嗜血菌HK 1247陽性
80埃及嗜血菌HK 1229陽性
81埃及嗜血菌HK1242陽性
82流感嗜血菌生物變型aegypticus HK 865陽性
83流感嗜血菌生物變型aegypticus HK 871陽性
84流感嗜血菌生物變型aegypticus HK 1222陽性
85流感嗜血菌生物變型aegypticus HK 1239陽性
86BPF-類疾病HK1212陽性
87 BPF-類疾病HK1213陽性
72溶血嗜血菌CCUG 15642陽性
101溶血嗜血菌34669/83陽性
102溶血嗜血菌47802/88陽性
103溶血嗜血菌937016陽性
104 '溶血嗜血菌74108/81陽性
520副流感嗜血菌生物型IHK4090
521副流感嗜血菌生物型IIHK230
58 5卯04副流感嗜血菌生物型III0
59 75834副流感嗜血菌生物型III0
60 78909副流感嗜血菌生物型III0
97副流感嗜血菌9471720
98副流感嗜血菌59257/910
99副流感嗜血菌59004/910
100副流感嗜血菌9771010
545副流感嗜血菌Buffalo 3198 NT075 H.som扁CCUG 37617 0
512副豬嗜血菌(H.parasuis) 9918 0
516副豬嗜血菌99 19 0
527副豬嗜血菌EF 3712 0
524副嗜沫嗜血菌(H. paraphrophilus ) HK 319 0
525副嗜沫嗜血菌HK 415 0
517副嗜沫嗜血菌12894 0
71 H.segnis CCUG 14834 0
526嗜沫嗜血菌(H,aphrophiliis)HK327 0
529嗜沫嗜血菌11832 A 0
532 H. pleurapneumoniae EF 99_^
61 39612 Eikenella corrodens 0
62 49064 Eikenella corrodens 0
63 959074 Eikenella corrodens 0 537伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomyc.) HK666 0 P.mult.78^8^0 0
在最初的實驗中，我們試圖制備重組pE，但是僅獲得微小的濃度。為 了使蛋白質(zhì)產(chǎn)量最大化，構(gòu)建了包括第22位賴氨酸到第160位賴氨酸M 酸殘基的截短的pE片段。包括第21位谷氨酰胺M酸的N末端信號肽被 除去，并且除來自載體pET26(+)的9個殘基以外用前導(dǎo)肽取代(圖5A)。截 短的pE22-160稱為pE(A)(圖5B)。為了確定相對于"野生型"pE的重組 蛋白質(zhì)產(chǎn)物，用IgD (X)作為探針通過SDS-PAGE和Western印跡分析重 組表達(dá)的pE(A)和從NTHi772分離的pE。如圖5D中所示，值得注意的是 在SDS-PAGE中重組pE(A)相當(dāng)于野生型pE。此外，用IgD (k)抗血清可 以檢測到低至0.01ng的大腸桿菌中產(chǎn)生的pE(A)(圖5E)。
用pE(A)免疫兔，如材料和方法中詳述的免疫接種程序完成以后，在
包含預(yù)測的免疫顯性肽(pE41-68 ^J^酸)的柱上純化抗pE抗血清。獲得的 抗體可以在細(xì)菌表面(圖2C)和Western印跡中(數(shù)據(jù)未顯示)清楚地檢測到 pE。
fe J:西^ /)A^ 一/y和^r諒蕃
來自NTHi772菌林的pEl-160的DNA和^J^絲列在圖6中概述。 可讀框(ORF)長度為160個氛基酸，并且預(yù)測的信號肽長度為20個氮基酸。 計算機(jī)分析表明信號肽酶識別第18位丙氨酸到第22位賴氨酸的氨基酸殘 基，并在第20位異亮氨酸和第21位谷氨酰胺殘基之間切割(38)。同時， HID親水性圖(39)顯示pE具有疏水的信號肽，而剩余的分子主要是親水 的(圖7)。
為了詳細(xì)確定信號肽切割位點，將重組全長pE進(jìn)行埃德曼降解。然 而，pE多肽鏈的氨基末端可能被封閉。該失敗的一個可能的解釋是第一 個M酸是焦谷氨酰殘基，正如先前所描述的粘膜炎莫拉菌UspA家族蛋 白質(zhì)(ll)。然而，用焦谷氨酸氨肽酶除去該假定殘基的嘗試失敗了。與全 長pEl-160相反，缺失內(nèi)源流感嗜血菌信號肽的pE (A) (pE22- 160)的N 末端序列(圖5)可以成功地由埃德曼降解來表征，并含有預(yù)測的載體序列， 即在大腸桿菌中信號肽酶在正確位置切割(圖5A)。
將在一系列不同嗜血菌屬物種(包括NTHi和有莢膜的流感嗜血菌) 中的蛋白質(zhì)E測序(表l)。有趣的是，pE是非常保守的。僅有幾個M酸 點突變，并且這些突變在多數(shù)菌林中以特定方式進(jìn)行(圖6和表2)。
表2.當(dāng)與參考菌林"流感嗜血菌Rd相比較時，不同嗜血菌屬物種中
/7C基因的點突變
點突變 具有突變的菌株數(shù)(％) 分析數(shù)
Ue20 > Thr20 18 (58 %) 31
Ala23 > Val23 5 (16 %) 31
Glu24 > Lys24 lb) (3.2%) 31
Val28 > Met28 2 (6.5 %) 31
Ala31>Thr3119 (61 %)31
Pro32 > Val323 (9.7 %)31
Pro32>Ala325 (16 %)31
Ile41 > VaI418 (26 %)31
Val47>Ala473 (10 %)30
Arg76 > Lys762 (7.7 %)26
Ilel07> Vall0716 (62 %)26
Lysl53>Glul53lb) (3.2%)13
Alal54> Vall542 (15 %)13
延長的C-末端
(3 extra aa)
SVDKK終止(-Rd)O11 (85 %)13
SVDKKSAP終止2 (15 %)13
a) 用側(cè)翼引物測序有莢膜流感嗜血菌a型(11=2)、 b型(11=2)、 c型(n-2)、 d型(Ti=I) 、 e型(11=2)和f型(n=3) 、 NTHi(n=8)、流感嗜血菌biovar aegypticus (n-6)和埃及嗜血菌(11=5)中的基因。
b) NTHi 772 (Sequence ID No:l)
c) Rd指定為流感嗜血菌菌林Rd
^T以容《她^義靡并,f斧/務(wù)的/;五的不^7々拔
衍生自全長pE的8個cDNA序列克隆到pET26b(+)中并在大腸桿菌 中表達(dá)。得到的蛋白質(zhì)在鎳樹脂上與組氨酸標(biāo)記親和來純化(圖8)。重組蛋 白質(zhì)覆蓋全部成熟pE蛋白質(zhì)產(chǎn)物，并且它們每個的長度和位點在圖8A中 表明，純化產(chǎn)物在圖8B中概述。
/7五^€義篇,惑# ^孚^0OM)的重要毒力廚:f
為研究pE作為NTHi毒力因子的作用，用105-109 NTHi 3655 Ape或 相應(yīng)野生型NTHi3655刺激大鼠中耳(圖9)。有趣的是，與野生型細(xì)菌相比 較，誘導(dǎo)相似AOM所需要的NTHi 3655 Ape要多100-1000倍。因此，pE 是NTHi誘導(dǎo)的AOM的重要毒力因子。pE在定義種群中具有高免疫原性。
為了在兒童和獻(xiàn)血者中測量抗體水平，從大腸桿菌中純化重組
pE(A)(圖5B)并用于ELISA?？筽E(A)抗體的ELISA分析結(jié)果在圖9中顯 示。小于6個月的兒童中可檢測到抗pE(A)的IgG和IgA。在5-10歲兒童 中，IgG抗體顯示峰水平。相反，IgA抗體隨年齡增加而逐漸增加，并且 在70-80年齡組中檢測到最高值。 才廁拍
蛋白質(zhì)的B細(xì)^位主要定位于其表面。為預(yù)測蛋白質(zhì)E多肽的B 細(xì)胞表位，將兩種方法組合使用2D結(jié)構(gòu)預(yù)測和抗原性指數(shù)預(yù)測。用 PSIPREQ程序(來自David Jones, Brunei Bioinformatics Group, Dept . Biological Sciences, Brunei University, Uxbridge UB8 3PH， UK)進(jìn)4亍2D結(jié) 構(gòu)預(yù)測。基于Jameson和Wolf (CABIOS 4:181-186 [1988)所述方法計算 抗原性指數(shù)。在該程序中使用的參數(shù)是抗原性指數(shù)和抗原性肽的最小長 度。最小為5個連續(xù)氨基酸的抗原性指數(shù)0.9用作該程序的閾值。包* 的、可能的B細(xì)胞表位的肽在表3中列出。這些(優(yōu)選綴合或重組結(jié)合于更 大的蛋白質(zhì))可以用于防御NTHi感染的疫苗組合物，其可以是天然蛋白質(zhì) E(SEQIDNO: 1或上^ 2中所示的其天然同源物)多肽的^^呆守性突變 (優(yōu)選與表3的序列具有70、 80、 85、 95、 99或100%同一性)的類似肽、 或包含5個或更多(例如6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 15、 20或25)個^J^酸 的截短形式、或在N-和/或C-末端包含例如l、 2、 3、 5、 10個其他氨基酸 的延長形式，其保持了能夠在宿主中引起對抗蛋白質(zhì)E多肽的免疫應(yīng)答的 有效表位。
表3: SEQIDNO:l(或其天然同源物)的可能的B細(xì)胞表位
位點 序列
21 QKAKQND
21 QKVKQND
21 QKAQQND
21 QKVQQND 59 DNQEPQ
82 PEPKRYARSVRQ
106 QIRTDFYDEFWGQG
106 QVRTDFYDEFWGQG
123 APKKQKKH
136 PDTTL
結(jié)論
外露于表面的嗜血菌外膜蛋白質(zhì)pE是NT扭誘導(dǎo)的AOM的重要毒 力因子，其在定義種群中具有高免疫原性，并且因此成為對于多種人類疾 病非常合適的疫苗候選者。
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權(quán)利要求
1.表面外露蛋白質(zhì)，其可以在流感嗜血菌中檢測到，具有Sequence IDNo.1中所述的氨基酸序列，或為其片段、同源物、功能性等同物、衍生物，降解或羥基化、磺化或糖基化產(chǎn)物，或其他次級加工產(chǎn)物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的表面外露蛋白質(zhì)的免疫原片段、或其天然存在的 或人工修飾的變體，該片段能夠在流感嗜血菌中檢測到。
3. 基于權(quán)利要求l的蛋白質(zhì)的重組免疫原性蛋白質(zhì)，其中Sequence ID No. 1的第1-21位M酸缺失或被一個或多個氨基酸取代。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的重組免疫原性蛋白質(zhì)，其中S叫uence ID No. 1 的第1-21位^酸被0-21個任選氮基酸的序列所取代。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4的重組免疫原性蛋白質(zhì)，其具有Sequence ID No.2的^J^酸序列，或為其片段、同源物、功能性等同物、衍生物，降解 或羥基化、磺化或糖基化產(chǎn)物，或其他次級加工產(chǎn)物。
6. 具有Sequence ID No. 3的氨基酸序列的肽，或其片段、同源物、 功能性等同物、衍生物，降解或羥基化、磺化或糖基化產(chǎn)物，或其他次級 加工產(chǎn)物。
7. 具有Sequence ID No. 4的氨基紗列的肽，或其片段、同源物、 功能性等同物、衍生物，降解或羥基化、磺化或糖基化產(chǎn)物，或其他次級 力口工產(chǎn)物。
8. 具有Sequence ID No. 5的^J^絲列的肽，或其片段、同源物、 功能性等同物、衍生物，降解或羥基化、磺化或糖基化產(chǎn)物，或其他次級 力口工產(chǎn)物。
9. 具有Sequence ID No. 6的氨基酸序列的肽，或其片段、同源物、 功能性等同物、衍生物，降解或羥基化、磺化或糖基化產(chǎn)物，或其他次級 力口工產(chǎn)物。
10. 具有S叫uencelDNo.7的氨基酸序列的肽，或其片段、同源物、 功能性等同物、衍生物，降解或羥基化、磺化或糖基化產(chǎn)物，或其他次級 加工產(chǎn)物。
11. 具有Sequence ID No. 8的氨基醋列的肽，或其片段、同源物、 功能性等同物、衍生物，降解或羥基化、磺化或糖基化產(chǎn)物，或其他次級 加工產(chǎn)物。
12. 具有Sequence ID No. 9的氨基^f列的肽，或其片段、同源物、功能性等同物、衍生物，降解或羥基化、磺化或糖基化產(chǎn)物，或其他次級 力口工產(chǎn)物。
13. 具有Sequence ID No. 10的#^^列的肽，或其片段、同源物、 功能性等同物、衍生物，降解或羥基化、磺化或糖基化產(chǎn)物，或其他次級 力口工產(chǎn)物。
14. 至少一種權(quán)利要求1-13任一項的蛋白質(zhì)、片段或肽在制備預(yù)防或 治療感染的藥物中的用途。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14的用途，其中感染由流感嗜血菌引起。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其中流感嗜血菌是有莢膜的或非典型的。
17. 根據(jù)權(quán)利要求14-16任一項的用途，其用于預(yù)防或治療兒童中耳 炎、鼻竇炎或下呼吸道感染，以及成人的例如慢性梗阻性肺疾病(COPD)。
18. 藥物，其包含至少一種權(quán)利要求1-13任一項的蛋白質(zhì)、片段或肽， 以及一種或多種可藥用佐劑、介質(zhì)、賦形劑、結(jié)合劑、載體、防腐劑、緩 沖劑、乳化劑、濕潤劑或利于轉(zhuǎn)染的化合物。
19. 疫苗組合物，其包含至少一種權(quán)利要求1-13任一項的蛋白質(zhì)、片 段或肽。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19的疫苗組合物，其包含至少一個權(quán)利要求1-13 任一項的蛋白質(zhì)、片段或肽的二-、三-或多聚體。
21. 根據(jù)權(quán)利要求19或20的疫苗組合物，其還包含一種或多種可藥 用佐劑、介質(zhì)、賦形劑、結(jié)合劑、載體、防腐劑、緩沖劑、乳化劑、濕潤 劑或利于轉(zhuǎn)染的化合物。
22. 根據(jù)權(quán)利要求19-21任一項的疫苗組合物，其包含至少一種其他 疫苗。
23. 根據(jù)權(quán)利要求19-22任一項的疫苗組合物，其包含另一分子的免 疫原性部分。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23的疫苗組合物，其中另一分子的免疫原性部分選 自流感嗜血菌的蛋白質(zhì)D、粘膜炎莫拉菌的MID、粘膜炎莫拉菌的UspAl 或UspA2，以及4壬意呼吸道病原體的外膜蛋白質(zhì)。
25. 核*列，其編碼權(quán)利要求1-13任一項的蛋白質(zhì)、片段或肽，及 其同源物、多態(tài)變體、降解和剪接變體。
26. 重組核酸序列，其包含權(quán)利要求25的核酸序列，并與至少另一基 因融合。
27. 質(zhì)粒或噬菌體，其包含權(quán)利要求25或26的核酸序列。
28. 非人宿主，其包含至少一個權(quán)利要求27的質(zhì)粒，并能夠產(chǎn)生權(quán)利 要求1-13任一項的蛋白質(zhì)、片段或肽，該宿主選自細(xì)菌、酵母和植物。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28的宿主，其是大腸桿菌。
30. 融合蛋白質(zhì)或多肽，其中權(quán)利要求1-13任一項的蛋白質(zhì)、片段或 肽通過使用權(quán)利要求26的重組核酸序列而與至少另一種蛋白質(zhì)連接。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30的融合蛋白質(zhì)，其為權(quán)利要求l-13任一項的蛋 白質(zhì)、片段或肽的二-、三-或多聚體。
32. 融合產(chǎn)物，其中權(quán)利要求1-13任一項的蛋白質(zhì)、片段或肽與蛋白 質(zhì)、糖類或基質(zhì)共價結(jié)合或以任意其他方式結(jié)合。
33. 根據(jù)權(quán)利要求18的藥物或根據(jù)權(quán)利要求19-24任一項的疫苗組合 物，其包含權(quán)利要求30的融合蛋白質(zhì)或多肽、或權(quán)利要求31的融合產(chǎn)物。
34. 分離權(quán)利要求1-13任一項的蛋白質(zhì)、片段或肽的方法，所述方法 包含如下步驟a) 培養(yǎng)包含編碼所述蛋白質(zhì)、片段或肽的DNA的流感嗜血菌或大腸 桿菌，收集細(xì)菌并分離外膜或包涵體；b) 用強(qiáng)溶解劑溶解包涵體；c) 添加復(fù)性劑；和d) 將獲得的混懸液對pH8-10的緩沖液透析。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中溶解劑是鹽酸胍。
36. 根據(jù)權(quán)利要求34或35的方法，其中復(fù)性劑是精氨酸。
37. 預(yù)防或治療個體感染的方法，其包含施用藥學(xué)有效量的權(quán)利要求 18的藥物或;f又利19-23 4壬一項的疫苗組合物。
38. 分離的多肽，其包含在SEQIDNO:l全長上與SEQIDNO:l的 氨基^列具有至少85。/。同一性的^J^^列。
39. 權(quán)利要求38的分離的多肽，其中^J^絲列與SEQIDNO:l的 氨基酸序列具有至少95%的同一性。
40. 權(quán)利要求38中的多肽，其包含SEQIDNO:l的絲^f列。
41. SEQ ID NO:l的分離的多肽。
42. 權(quán)利要求40或41的多肽，其中SEQ ID NO:l缺少信號肽(第1-20 位絲酸)。
43. 權(quán)利要求40或41的多肽，其中在SEQIDNO:l的第20位由蘇氨酸取代異亮氨酸。
44. 權(quán)利要求40-43的多肽，其中在SEQ ID NO:l的第23位由纈氨酸取代丙氨酸。
45. 權(quán)利要求40-44的多肽，其中在SEQ ID NO:l的第24位由谷氨 酰胺取代賴氨酸。
46. 權(quán)利要求40-45的多肽，其中在SEQ ID NO:l的第28位由曱硫 氨酸取代纈氨酸。
47. 權(quán)利要求40-46的多肽，其中在SEQ ID NO:l的第31位由蘇氨 酸取代丙氨酸。
48. 權(quán)利要求40-47的多肽，其中在SEQ ID NO:l的第41位由纈氨 酸取代異亮氨酸。
49. 權(quán)利要求40-48的多肽，其中在SEQ ID NO:l的第47位由丙氨 酸取代纈氨酸。
50. 權(quán)利要求40-49的多肽，其中在SEQ ID NO:l的第76位由賴氨 酸取代精氨酸。
51. 權(quán)利要求40-50的多肽，其中在SEQIDNO:l的第107位由纈氨 酸取代異亮氨酸。
52. 權(quán)利要求40-51的多肽，其中在SEQIDNO:l的第152位由賴氨酸取代甘氨酸。
53. 權(quán)利要求40-52的多肽，其中在SEQIDNO:l的第154位由翔氨 酸取代丙氨酸。
54. 權(quán)利要求40-53的多肽，其中SEQ ID NO:l在其C端具有附加的
55. 權(quán)利要求40-54的多肽，其中在SEQ ID NO:l的第32位由纈氨 酸取代脯氨酸。
56. 權(quán)利要求40-55的多肽，其中在SEQ ID NO:l的第32位由丙氨 酸取代脯氨酸。
57. 免疫原性片段，其包含具有來自SEQIDNO:lJL&酸序列或來自 權(quán)利要求40-55多肽的至少15個連續(xù)氨基酸的M酸序列，該片段(如需 要，當(dāng)與載體連接時)能夠產(chǎn)生識別SEQ ID NO:l多肽(或分別識別權(quán)利要 求40-55多肽)的免疫應(yīng)答、或能夠結(jié)合人IgD。
58. 權(quán)利要求38-58任一項的多肽或免疫原性片段，其中所述多肽或 所述免疫原性片段是較大融合蛋白質(zhì)的 一部分。
59. 分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求38-58任一項中的多肽或免疫 原性片段。
60. 分離的多核苷酸，其包含編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽在SEQ ID NO:l全長上與SEQ ID NO:l的M酸序列具有至少85%的同一性； 或包含與所述分離的多核普酸互補(bǔ)的核苷酸序列。
61. 分離的多核苷酸，其包含在全部編碼區(qū)上與編碼SEQ ID NO:l 多肽的核苷酸序列具有至少85%同一性的核苷酸序列；或包含與所述分離 的多核苷酸互補(bǔ)的核苦酸序列。
62. 分離的多核苷酸，其包含在SEQ ID NO:ll全長上與SEQ ID NO:ll的核苷酸序列具有至少85%同一性的核苷酸序列；或包含與所述分 離的多核苷酸互補(bǔ)的核苷^列。
63. 權(quán)利要求59-62任一項的分離的多核普酸，其與SEQ ID NO:ll 的同一性至少為95%。
64. 分離的多核苷酸，其包含編碼SEQ ID NO:l多肽或權(quán)利要求57 或58的免疫原性片段的核苷^f列。
65. 包含SEQIDNO:ll多核苷酸的分離的多核苷酸。
66. 分離的多核苷酸，其包含編碼SEQIDNO:l多肽的核苷酸序列， 其通過在嚴(yán)格雜交條件下以具有SEQ ID NO:ll的序列或其片段的標(biāo)記探 針篩選合適文庫而獲得。
67. 表達(dá)栽體或重組活微生物，其包含權(quán)利要求59-66任一項的分離 的多核苦酸。
68. 包含權(quán)利要求67的表達(dá)載體的重組活微生物。
69. 包含權(quán)利要求67的表達(dá)栽體的宿主細(xì)胞。
70. 權(quán)利要求66表達(dá)分離的多肽的宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜，其包含與SEQ ID NO:l的M酸序列具有至少85。/。同一性的^J^酸序列。
71. 產(chǎn)生權(quán)利要求38-58的多肽或免疫原性片段的方法，其包含在足 以產(chǎn)生所述多肽或所述免疫原性片段的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求69的宿主細(xì) 胞，以及從培養(yǎng)基中回收多肽。
72. 表達(dá)權(quán)利要求59-66任一項的多核苷酸的方法，其包含用含有至 少一個所述多核苦酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，以及在足以表達(dá)任一所述 多核苷酸的^下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
73. 疫苗組合物，其包含有效量的權(quán)利要求38-58任一項的多肽或免 疫原性片段，以及可藥用賦形劑。
74. 疫苗組合物，其包含有效量的權(quán)利要求59-66任一項的多核苷酸 和可藥用賦形劑。
75. 根椐權(quán)利要求73或74任一項的疫苗組合物，其中所述組合物包 含至少一種其他流感嗜血菌抗原。
76. 權(quán)利要求38-58任一項的多肽或免疫原性片段產(chǎn)生的抗體。
77. 診斷流感嗜血菌感染的方法，其包含鑒定權(quán)利要求38-58任一項 的多肽或免疫原性片段、或?qū)λ龆嚯木哂忻庖咛禺愋缘目贵w，所述抗體 存在于來自疑似有此類感染的動物的生物樣品中。
78. 包含免疫有效量的權(quán)利要求38-58任一項的多肽或免疫原性片段 的組合物在制備在動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的用途。
79. 包含免疫有效量的權(quán)利要求59-66任一項的多核苷酸的組合物在 制備在動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的用途。
80. 用于治療人流感嗜血菌疾病的治療性組合物，其包含至少一種直 接針對權(quán)利要求38-58任一項的多肽或免疫原性片段的抗體，以及合適的 藥用賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及表面外露蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)E；pE)，其為毒力因子，可以在流感嗜血菌中檢測到，其具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列；本發(fā)明涉及所述表面外露蛋白質(zhì)的免疫原性片段、和基于所述表面外露蛋白質(zhì)的重組免疫原性蛋白質(zhì)(pE(A))或其截短的變體。本發(fā)明也描述了核酸序列、疫苗、質(zhì)粒和噬菌體、非人宿主、重組核酸序列、融合蛋白質(zhì)和融合產(chǎn)物。本發(fā)明也論述了重組產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)或其截短片段的方法。
文檔編號C07K16/12GK101374859SQ200780003278
公開日2009年2月25日 申請日期2007年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月17日
發(fā)明者K·里斯貝克, 阿恩·福斯格倫 申請人:阿恩·福斯格倫