專利名稱：肽和肽衍生物以及含有它們的藥物組合物的制作方法
專利說明肽和肽衍生物以及含有它們的藥物組合物 本發(fā)明涉及肽和肽衍生物，涉及其生產(chǎn)，以及涉及它們用于制備治療和/或預(yù)防活性的藥物的用途，并涉及這樣的藥物。
EP1586586描述了來自具有抗炎癥效果的纖維蛋白序列的肽的用途。
所述效果可以基于這一事實(shí)纖維蛋白和在其分解期間產(chǎn)生的纖維蛋白片段經(jīng)由它的Bβ鏈的新-N-末端與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，經(jīng)由Aα-鏈的序列與血流中的細(xì)胞結(jié)合，從而引起這些細(xì)胞進(jìn)入組織的粘附和遷移。纖維蛋白和纖維蛋白片段對內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合配偶體是蛋白質(zhì)血管內(nèi)皮(VE)鈣粘蛋白(cadherin)，其在鄰近的內(nèi)皮細(xì)胞的粘附接點(diǎn)中專門地表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的肽阻斷這種相互作用，從而對抗血細(xì)胞的遷移。然而，血液中白細(xì)胞對感染的天然防御不受到不利的影響。因而，同樣的組合，例如粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，保持了不受影響，從而維持了天然的防御過程。
纖維蛋白原在肝臟中產(chǎn)生，在這種形式下，是無生物學(xué)活性的，通常在血液中以約3g/l的濃度提供。酶原凝血酶原的蛋白水解裂解引起凝血酶的形成，其從纖維蛋白原上裂解出纖維蛋白肽A和B。這樣，纖維蛋白原被轉(zhuǎn)化成生物學(xué)活性形式。產(chǎn)生了纖維蛋白和纖維蛋白裂解產(chǎn)物。
每當(dāng)血液凝固被激活就會形成凝血酶，即，炎癥性的、外傷性的或退化發(fā)生性的組織傷害。由凝血酶介導(dǎo)的纖維蛋白的形成基本上是保護(hù)性的過程，目的在于快速地封閉對血管系統(tǒng)產(chǎn)生的任何損傷。然而，纖維蛋白的形成也是病原性的過程。纖維蛋白血栓的出現(xiàn)作為心肌梗塞的觸發(fā)因素是在人類醫(yī)學(xué)中最突出的難題。
在一方面，纖維蛋白在炎性細(xì)胞從血流外滲到組織的過程期間起到的作用對于防御組織中的致病微生物或腫瘤細(xì)胞是期望的過程，但是，在另一方面，其本身誘導(dǎo)或延長了對組織的損害，迄今為止還根本沒有被檢查或檢查的程度不夠深入。纖維蛋白通過序列Bβ經(jīng)由它的Bβ的新-N-末端與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，通過序列Aα與血流中的細(xì)胞結(jié)合，從而引起細(xì)胞粘附和遷移到組織中。
通過以上描述的機(jī)制，根據(jù)本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)可以防止來自血流的細(xì)胞與血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，和/或它們隨后從血液向組織中的遷移。
WO9216221描述了與長鏈聚合物，例如甲氧基-聚乙二醇(PEG)共價(jià)連接的多肽。多肽與這種聚合物的結(jié)合通常會延長這些多肽的生物學(xué)半衰期并延遲它們的腎排泄。這種性質(zhì)的概述可以在Davis等，Polymeric MaterialsPharmaceuticals for Biomedical Use，441-451頁(1980)中找到。PEG基團(tuán)的添加以與PEG化肽的分子量成比例的方式發(fā)揮了這種效果，直到一定的分子大小，腎小球過濾速度與所述分子量成反比。
WO2004/101600還描述了新的聚(乙二醇)修飾的化合物和它們的用途，特別是強(qiáng)調(diào)了能活化促紅細(xì)胞生成素受體的修飾的肽。
肽和蛋白質(zhì)PEG殘基的共價(jià)修飾的進(jìn)一步的實(shí)例是白細(xì)胞介素(Knauf et al，J.Biol Chem.1988，263，15064；Tsutumi等，J.Controlled Release 1995，33，447)、干擾素(Kita等，Drug Delivery Res.1990，6157)、過氧化氫酶(Abuchowski等，J.Biol.Chem.1997，252，3582)?，F(xiàn)有技術(shù)的綜述可以在Reddy，Ann.ofPharmacotherapy，2000，34，915中找到。
延長的生物學(xué)半衰期對于肽的各種治療用途是有益的。在慢性疾病的情況下尤其有用，這種情況下需要長期施用活性試劑。根據(jù)這種需要，這可以改善患者的順應(yīng)性，因?yàn)槔缫惶煲淮蔚貞?yīng)用活性試劑將比連續(xù)的輸注更易于接受。除了通過共價(jià)修飾提高分子量之外，多肽的持續(xù)性的延長可以通過防止它們被蛋白水解酶(例如，外切或內(nèi)切蛋白酶或肽酶)降解的方式修飾它們來獲得。
使用過的各種實(shí)例都表明必需為每種肽定制合適的修飾，以防止與未修飾的肽相比對藥學(xué)效果的顯著影響。在本文中，可以涉及以下的降血鈣素(Lee等，Pharm.Res.1999，16，813)、生長激素釋放激素(Esposito等，Advanced DrugDelivery Reviews，2003，55，1279)、胰高血糖素樣肽1(Lee等，Bioconjugate Res.2005，16，377)、以及生長激素受體拮抗劑Pegvisomant(Ross等，J.Clin.Endocrin.Metab.2001，86，1716)。Caliceti和Veronese(Adv.Drug Deliv.Rev.2003，551261)以及Harris和Chess(Nature Rev.Drug Discovery2003，2，214)的綜述討論了在涉及肽-或蛋白-PEG軛合物的情況下必需考慮起始物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、肽和聚合物的分子量、軛合的聚合物鏈的數(shù)量以及接頭化學(xué)作用，以獲得有效的肽-PEG共軛物。
令人驚訝地，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，來自Bβ(15-42)纖維蛋白片段的鏈的肽，其中天然纖維蛋白序列的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被其氨基酸替換，以及在肽序列的C-末端修飾的衍生物，也具有強(qiáng)的抗炎癥效果。對于為防止蛋白酶或肽酶的破壞而被修飾的肽及肽衍生物，以及對于來自Bβ(15-42)纖維蛋白片段的基礎(chǔ)序列的肽-PEG共軛物，也是一樣。
因而，本發(fā)明涉及修飾的肽，其來源于Bβ(15-42)-纖維蛋白片段的鏈，并且其中所述序列的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被遺傳編碼的或非遺傳編碼的氨基酸或擬肽替換。它們可以作為游離肽，或作為C-末端衍生物存在和/或與聚乙二醇(PEG)-聚合物連接，并具有抗炎癥和/或內(nèi)皮穩(wěn)定效果。例如，酯或酰胺可以被考慮作為C-末端衍生物。
本發(fā)明的化合物在一個(gè)或幾個(gè)位置上與要治療的溫血動物的纖維蛋白的天然序列相比可以具有氨基酸的保守性替換。保守性替換被定義為相應(yīng)的氨基酸的側(cè)鏈被相似化學(xué)結(jié)構(gòu)和極性的側(cè)鏈替換，所述側(cè)鏈來源于遺傳編碼的或非遺傳編碼的氨基酸。這種具有相似側(cè)鏈的氨基酸的家族是本領(lǐng)域已知的。例如，它們包括具有堿性側(cè)鏈(賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側(cè)鏈(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支的側(cè)鏈(蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。這種側(cè)鏈的保守性替換可以優(yōu)選地在非關(guān)鍵位置進(jìn)行。在這個(gè)方面，序列中的關(guān)鍵位置是這樣一種位置該位置上相關(guān)氨基酸的側(cè)鏈會顯著地影響它的生物學(xué)效果。
本發(fā)明特別涉及以下通式的肽和肽衍生物 H2N-GHRPX1X2X3X4X5X6X7X8PX9X10X11PX12PPPX13X14X15X16GYR-X17(I)， 其中 X1-X16 代表20個(gè)遺傳編碼的氨基酸之一， X17 代表OR1，R1＝氫或(C1-C10)-烷基，或 NR2R3，R2和R3是相同的或不同的，并且代表氫、(C1-C10)-烷基或殘基PEG5-60K，其中PEG殘基經(jīng)由間隔區(qū)與N原子連接，或 殘基NH-Y-Z-PEG5-60K，其中Y代表化學(xué)鍵或來自S、C、K或R的組的遺傳編碼的氨基酸，Z代表間隔區(qū)，通過所述間隔區(qū)可以連接聚乙二醇(PEG)殘基，以及其生理學(xué)上可接受的鹽， 或其中 X15或X16 代表來自C或K的組的氨基酸，其經(jīng)由側(cè)鏈中的雜原子與殘基Z-PEG5-60K連接，并且其中 X17 代表OR1，R1＝氫或(C1-C10)-烷基，或NR2R3，R2和R3是相同的或不同的，并且代表氫或(C1-C10)-烷基， 以及其生理學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明的優(yōu)選的主題是通式I的肽和肽衍生物，其中 X1、X9、X10、X14 代表L、I、S、M或A， X2、X6、X7 代表E或D， X3、X4、X5、X11代表R或K X8、X12代表A、G、S或L X13代表I、L或V，并且其中 X15、X16和X17 具有與以上給出的相同的含義， 以及其生理學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明的特別優(yōu)選的主題是通式II的肽和肽衍生物， H2N-GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYR-X17(II)， 其中X17具有與以上針對式I給出的相同的含義， 以及其生理學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明的最優(yōu)選的主題是式(II)的化合物，其中 X17 代表NR2R3，R2和R3是相同的或不同的，并且是氫或(C1-C10)-烷基或殘基C(NR2R3)-(S-琥珀酰亞胺基)-(PEG5-40K)，所述琥珀酰亞胺殘基經(jīng)由C-原子3與半胱氨酸殘基的硫原子連接。
以及其生理學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明的另一最優(yōu)選的主題是式(III)的肽衍生物， H2N-GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPIS-X19-X20-X21-YR-X17(III) 其中殘基X19、X20和X21中的兩個(gè)每個(gè)是甘氨酸殘基，剩余的一個(gè)是殘基C-(S-琥珀酰亞胺基)-(PEG5-40K)，所述琥珀酰亞胺殘基經(jīng)由C-原子3與半胱氨酸殘基的硫原子連接， 并且其中X17代表NR2R3，R2和R3是相同的或不同的，并且是氫或(C1-C10)-烷基， 以及其生理學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明的另一最優(yōu)選的主題是式(III)的肽衍生物， H2N-GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPIS-X19-X20-X21-YR-X17 (III) 其中殘基X19、X20、X21中的兩個(gè)每個(gè)是甘氨酸殘基，剩余的一個(gè)是殘基K-(PEG5-40K)，PEG殘基經(jīng)由賴氨酸殘基的側(cè)鏈中的氮原子連接，并且其中 X17代表NR2R3，R2和R3是相同的或不同的，并且是氫或(C1-C10)-烷基，以及其生理學(xué)上可接受的鹽。
在以上的式I和II中，根據(jù)關(guān)于蛋白質(zhì)和肽的一般注釋，以下的字母代表氨基酸殘基p苯基丙氨酸是F，亮氨酸是L，異亮氨酸是I，甲硫氨酸是M，纈氨酸是V，絲氨酸是S，脯氨酸是P，蘇氨酸是T，丙氨酸是A，酪氨酸是Y，組氨酸是H，谷氨酰胺是Q，天冬酰胺是N，賴氨酸是K，天冬氨酸是D，谷氨酸是E，半胱氨酸是C，色氨酸是W，精氨酸是R，甘氨酸是G。
式I的化合物中的氨基酸殘基可以以它們的D或它們的L構(gòu)型存在。
術(shù)語肽是指這些氨基酸的聚合物，這些氨基酸經(jīng)由酰胺鍵連接。
“生理學(xué)上可接受的”是指與酸或堿形成的鹽，當(dāng)用于人類時(shí)它的添加沒有不希望的效果。優(yōu)選的是在美國藥典或任何其他一般公認(rèn)的藥典中列出的用于在溫血動物、特別是人類中使用的酸或堿的鹽。
PEG代表具有5,000和60,000道爾頓之間的分子量的聚乙二醇?xì)埢?，這種分子量是分子量分布的最大值，從而混合物的單獨(dú)成分可以具有更高或更低的分子量。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)通式(I)的肽和肽衍生物的方法，其特征在于 (A)相應(yīng)序列的C-末端的第一個(gè)氨基酸經(jīng)由適合的可裂解間隔區(qū)與聚合樹脂連接，隨后的氨基酸，任選地含有功能基團(tuán)的適當(dāng)保護(hù)基團(tuán)，根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法被逐步地連接，根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法將完成的肽從所述聚合樹脂上裂解下來，如果存在的話，通過適合的方法將所述保護(hù)基團(tuán)裂解下來，以及根據(jù)適合的方法純化所述肽或肽衍生物，或者 (B)具有期望的分子量的PEG基團(tuán)經(jīng)由適合的間隔區(qū)連接到聚合樹脂，使用適合的方法連接在肽的N-末端的第一個(gè)氨基酸，其余的步驟與(A)中描述的相同，或者 (C)在ε-氨基上含有適當(dāng)保護(hù)基團(tuán)的賴氨酸殘基使用適合的方法經(jīng)由適合的間隔區(qū)連接到適合的聚合樹脂，如(A)中描述的那樣合成肽鏈，在從所述聚合樹脂裂解和純化之后，如有必要，使用適合的方法將在ε氨基上的所述保護(hù)基團(tuán)裂解下來，使用適合的活化試劑將具有期望的分子量的PEG基團(tuán)連接到ε-氨基上，任選地將其余的保護(hù)基團(tuán)裂解下來，并使用適合的方法純化最終的產(chǎn)物，或者 (D)使含有半胱氨酸殘基的肽與PEG-馬來酰亞胺反應(yīng)來形成式(III)的化合物。
例如，在文件WO 2004/101600中描述了根據(jù)(A)、(B)或(C)的適合的處理步驟以及適合的試劑。
相應(yīng)的處理步驟的實(shí)施方式本身不是新的，對于有機(jī)合成領(lǐng)域的有經(jīng)驗(yàn)專家將是清楚的。
連接PEG-殘基到肽鏈的方法是熟練的技術(shù)人員已知的。例如，半胱氨酸(C)-殘基可以與PEG-馬來酰亞胺反應(yīng)，產(chǎn)生琥珀酰亞胺殘基作為殘基Z的間隔區(qū)。進(jìn)一步可能的是使任選地活化的C-末端羧基殘基與氨基烷基取代的PEG殘基反應(yīng)。進(jìn)一步的可能是通過使醛取代的PEG殘基與賴氨酸殘基的ε氨基官能團(tuán)反應(yīng)來導(dǎo)入PEG殘基。具有適合的間隔區(qū)和反應(yīng)基團(tuán)的活化的PEG試劑例如可以從NOF公司(Tokyo，Japan)獲得。
根據(jù)本發(fā)明的物質(zhì)以及根據(jù)本發(fā)明的物質(zhì)用于生產(chǎn)藥物的用途，對于藥物的生產(chǎn)是特別重要的，所述藥物用于治療由白血球的組織破壞效果引起的、或其中血管內(nèi)襯的內(nèi)皮細(xì)胞層的完整性和完全的生理學(xué)完整性被損害所引起的疾病。
屬于這個(gè)組的疾病有與自體免疫有關(guān)系的那些，例如膠原疾病、風(fēng)濕性疾病、炎癥性腸疾病，如局限性腸病或潰瘍性結(jié)腸炎，銀屑病和銀屑病性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，和感染后/伴感染疾病，以及由移植抗宿主反應(yīng)引起的疾病。隨著這種醫(yī)學(xué)藥物阻斷白血球進(jìn)入組織的遷移，發(fā)生了治愈效果。因而，白血球保持在血流中，并且不會引起對組織有害的自發(fā)反應(yīng)性效果。本發(fā)明的物質(zhì)的這種效果對于治療休克狀況、特別是由革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌性病原體的感染以及病毒感染觸發(fā)的膿毒性休克，以及由于嚴(yán)重?fù)p傷或細(xì)菌或病毒感染的重度失血引起的出血性休克，是更為重要的。
本發(fā)明的物質(zhì)一般可以用于一些情況，所述情況可以分別用術(shù)語“全身性炎癥性反應(yīng)綜合征(SIRS)”、“急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)”和器官或多器官衰竭來描述。
與用于治療和/或預(yù)防器官移植的排斥反應(yīng)的藥物一起，這種藥物會阻止白血球從血流遷移入供體器官，因而，供體器官不會被例如自體反應(yīng)性淋巴細(xì)胞破壞，從而起到治愈效果。
與用于治療和/或預(yù)防動脈硬化的藥物一起，這種藥物會阻斷淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞進(jìn)入組織的壁的遷移、因而阻斷組織壁的細(xì)胞的活化，從而起到治愈和/或預(yù)防效果。因而，動脈硬化的發(fā)展被最小化或終止，由此產(chǎn)生的動脈硬化斑塊的發(fā)展被抑制，使得動脈硬化降低。
與用于治療和/或預(yù)防外科手術(shù)或藥物誘導(dǎo)的血液重新供應(yīng)之后的，例如在經(jīng)皮冠狀動脈介入治療、中風(fēng)、血管手術(shù)、心臟旁路手術(shù)和器官移植之后的重灌注損傷的藥物一起，這種藥物能抑制淋巴細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞和單核細(xì)胞進(jìn)入血管壁的遷移，從而起到治愈和/或預(yù)防效果。重灌注損傷是由在血液的重新供應(yīng)期間血管細(xì)胞的缺氧/酸中毒、導(dǎo)致細(xì)胞的活化和/或損壞所引起。因此，淋巴細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞和單核細(xì)胞附著于血管壁上并遷移到其中。阻斷淋巴細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞和單核細(xì)胞在血管壁中的粘附和遷移使得缺氧/酸中毒誘導(dǎo)的損害降低，而沒有隨后的引起對血管的永久性損傷的炎癥性反應(yīng)。此外，本發(fā)明化合物的內(nèi)皮穩(wěn)定效果阻止了水腫的形成以及對由相應(yīng)的血管供給器官的任何進(jìn)一步損害。
與用于治療和/或預(yù)防作為代謝疾病或老化過程的結(jié)果的動脈硬化的藥物一起，這種藥物抑制淋巴細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞和單核細(xì)胞進(jìn)入血管壁的遷移、因而抑制由其引起的動脈硬化斑塊的發(fā)展，從而起到痊愈和/或預(yù)防效果。
根據(jù)本發(fā)明的藥物也可以用于另一種藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)。本發(fā)明的藥物特異性地結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞上的表面分子。因而，與之連接的藥物可以以高濃度被遞送到內(nèi)皮細(xì)胞而免除了它們在其他位點(diǎn)具有副作用的任何危險(xiǎn)。在此可以引用的實(shí)例是，使用被特異性地帶至內(nèi)皮細(xì)胞的、抑制細(xì)胞分裂的物質(zhì)，可以具有抗血管發(fā)生效果。這引起了腫瘤患者中的治愈效果，因?yàn)橥ㄟ^防止內(nèi)皮細(xì)胞增殖并因而通過防止新血管發(fā)生而阻斷了腫瘤生長。本發(fā)明的化合物本身也可以發(fā)展出抗血管發(fā)生效果，因?yàn)椋捎谒鼈兊难芊€(wěn)定效果，它們阻止了內(nèi)皮細(xì)胞變化成增殖性表型，并因而阻止了新的微血管的形成。所以，它們本身適合于治療各種類型的腫瘤疾病以及預(yù)防和/或治療腫瘤轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明的式(I)的化合物與藥物佐劑和添加劑一起，可以被配制成藥物制劑，其也是本發(fā)明的主題。為了制備這種制劑，將治療有效劑量的肽或肽衍生物與藥學(xué)上可接受的稀釋劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、乳化助劑、佐劑或載體混合，并形成適合的治療劑型。例如，這種制品含有不同pH值和離子強(qiáng)度的各種緩沖液(例如，Tris-HCl、醋酸鹽、磷酸鹽)的稀釋物、洗滌劑和增溶劑(例如，Tween80、Polysorbat 80)、抗氧化劑(例如，抗壞血酸)和填料(例如，乳糖、甘露醇)。這些制劑可以影響活性試劑的生物有效性和代謝行為。
根據(jù)本發(fā)明的藥物制品可以口服地、胃腸外地(肌內(nèi)注射地、腹膜內(nèi)地、靜脈內(nèi)地或皮下地)、透皮地施用，或在適合的生物可降解的聚合物(例如，聚乳酸或聚乙二醇)的可降解植入物中施用。
例如，所要求權(quán)利的本發(fā)明的化合物的用途的生物學(xué)效果和適用性可以在分析中被測定，在所述分析中，在用“N-末端二硫化物結(jié)蛋白II”(NDSK-II)或用凝血酶刺激之后，在顯微鏡下檢查人類臍帶內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)物。內(nèi)皮細(xì)胞的刺激引起緊密堆積的細(xì)胞層中的細(xì)胞之間形成缺口。用本發(fā)明的化合物處理可以防止形成這些缺口，并且成功地閉合已經(jīng)形成的缺口。這種效果是本發(fā)明的化合物在整個(gè)有機(jī)體中所具有的對內(nèi)皮的保護(hù)效果的表現(xiàn)。本發(fā)明的化合物在細(xì)胞的水浴溶液中在0.01nM到1mM的濃度范圍內(nèi)，優(yōu)選在1nM到0.1mM的范圍內(nèi)具有效果。
例如，體內(nèi)有效性可以使用嚙齒動物中的急性肺炎模型來確定。為此，如以下實(shí)施例7所述進(jìn)行動物的處理和物質(zhì)的施用。本發(fā)明的化合物在從0.001mg/kg體重到500mg/kg體重的劑量范圍內(nèi)，優(yōu)選從0.1mg/kg到50mg/kg的劑量范圍內(nèi)顯示有效果。
確定體內(nèi)生物學(xué)效果的另一種可能是降低或完全抑制由于溶血性病毒或細(xì)菌的感染的死亡率。為此，如實(shí)施例8所描述的，例如，將小鼠用一劑登革熱病毒感染，其中在感染后5-20天的期間內(nèi)50％的動物死亡。本發(fā)明的化合物在從0.001mg/kg體重到500mg/kg體重的劑量范圍內(nèi)，優(yōu)選從0.1到50mg/g體重的劑量范圍引起了這種死亡率的降低。
以下的實(shí)施例用來說明本發(fā)明，而不是將本發(fā)明限制到所述實(shí)施例。
根據(jù)本發(fā)明的肽的一般制備和純化 以上肽衍生物的制備和純化一般通過FMOC策略、在酸不穩(wěn)定的樹脂支持物上、使用商業(yè)上可獲得的分批肽合成儀來進(jìn)行，這也在文獻(xiàn)中描述了(例如，＂solid phase peptide synthesis-A practical approach＂by E.Atherton，R.C.Sheppard，Oxford University press 1989)。N-α-FMOC保護(hù)的衍生物被用作氨基酸組件，它的功能側(cè)鏈被酸敏感的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)。除非另有說明，純化是使用水/乙腈梯度以及0.1％TFA作為離子配對試劑通過RP層析來進(jìn)行的。
實(shí)施例1 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-NH2 以0.24mmol/g上樣量將100mg Tentagel-S-RAM(Rapp-聚合物)轉(zhuǎn)移到商業(yè)上可獲得的肽合成設(shè)備(PSMM(Shimadzu))上，其中根據(jù)碳二亞胺/HOBt方法來分步地構(gòu)建肽序列。
在轉(zhuǎn)移到反應(yīng)容器中之后，通過添加5倍等摩爾過量的二-異丙基-碳二亞胺(DIC)、二-異丙基-乙胺(DIPEA)和羥基苯并三唑(HOBt)來預(yù)先活化FMOC氨基酸衍生物，并將其與樹脂支持物混合30分鐘。5次添加900μl DMF并充分混合1分鐘，進(jìn)行洗滌步驟。添加3×900μl DMF中的30％哌啶，并徹底混合4分鐘，進(jìn)行裂解步驟。
通過迫使溶液通過反應(yīng)容器的底部過濾器來進(jìn)行單獨(dú)的反應(yīng)和洗滌溶液的除去。
采用了氨基酸衍生物FMOC-Ala、FMOC-Arg(Pbf)、FMOC-Asp、FMOC-Gly、FMOC-His(Trt)、FMOC-Ile、FMOC-Leu、FMOC-Lys(BOC)、FMOC-Pro、FMOC-Ser(tBu)和FMOC-Tyr(fBu)(Orpegen)。
當(dāng)合成完成時(shí)，干燥肽樹脂。隨后，通過用三氟醋酸/TIS/EDT/水(體積95:2:2:1)在室溫下處理2小時(shí)來裂解肽酰胺。通過過濾、溶液的濃縮以及通過添加冰冷的二乙醚的方式，獲得了固體的粗制品(75mg)。
通過RP-HPLC在Kromasil RP-18 250-20，10μm上，在具有5-60％乙腈梯度的0.1％TFA中，在40分鐘內(nèi)，以12ml/分鐘流速來純化肽，在215nm處通過UV檢測器評估洗脫物。通過分析性RP-HPLC和質(zhì)譜法來測定單獨(dú)級分的純度。在組合純化的級分以及凍干之后，獲得了48mg純的產(chǎn)物，Maldi-TOF 3036.6m/z(m.i.)。
實(shí)施例2 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys-(S-琥珀酰亞胺-PEG20K)-OH 如實(shí)施例1中那樣合成單體的肽，在此Tentagel(Rapp Polymere)用作樹脂支持物，F(xiàn)MOC-Cys(Trt)作為第一個(gè)氨基酸。
在肽的裂解和純化之后，與2到8倍摩爾過量的琥珀酰亞胺-PEG20K進(jìn)行反應(yīng)。在Kromasil RP-18上進(jìn)行回收純化之后，通過分析性RP-HPLC和MALDI-MS的方式確認(rèn)產(chǎn)物。
實(shí)施例3 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys-(S-琥珀酰亞胺基-PEG20K)-酰胺 以0.24mmol/g的上樣量將100mg Tentagel-S-RAM(Rapp-Polymere)轉(zhuǎn)移到商業(yè)上可獲得的肽合成設(shè)備(PSMM(Shimadzu))上，其中根據(jù)碳二亞胺/HOBt方法來分步地構(gòu)建肽序列。
在轉(zhuǎn)移到反應(yīng)容器中之后，通過添加5倍等摩爾過量的二-異丙基-碳二亞胺(DIC)、二-異丙基-乙胺(DIPEA)和羥基苯并三唑(HOBt)來預(yù)先活化FMOC氨基酸衍生物，并與樹脂支持物混合30分鐘。5次添加900μl DMF并充分混合1分鐘，進(jìn)行洗滌步驟。通過添加3×900μl在DMF中的30％哌啶，并徹底混合4分鐘，進(jìn)行裂解步驟。
通過使溶液通過反應(yīng)容器的底部過濾器來進(jìn)行單獨(dú)的反應(yīng)和洗滌溶液的除去。
采用了氨基酸衍生物FMOC-Ala、FMOC-Arg(Pbf)、FMOC-Asp、FMOC-Gly、FMOC-His(Trt)、FMOC-Ile、FMOC-Leu、FMOC-Lys(BOC)、FMOC-Pro、FMOC-Ser(tBu)、FMOC-Cys(Trt)和FMOC-Tyr(tBu)(Orpegen)。
在肽的裂解和純化之后，與2到8倍摩爾過量的琥珀酰亞胺基-PEG20K進(jìn)行反應(yīng)。在Kromasil RP-18上進(jìn)行回收純化之后，通過分析性RP-HPLC和MALDI-MS的方式確認(rèn)產(chǎn)物。
實(shí)施例4 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Cys-(S-琥珀酰亞胺基-PEG20K)-Gly-Tyr-Arg-酰胺 將具有0.24mmol/g載荷量的100mg Tentagel-S-RAM(Rapp-Polymere)轉(zhuǎn)移到商業(yè)上可獲得的肽合成設(shè)備(PSMM(Shimadzu))上，其中根據(jù)碳二亞胺/HOBt方法來分步地構(gòu)建肽序列。
在轉(zhuǎn)移到反應(yīng)容器中之后，通過添加5倍等摩爾過量的二-異丙基-碳二亞胺(DIC)、二-異丙基-乙胺(DIPEA)和羥基苯并三唑(HOBt)來預(yù)先活化FMOC氨基酸衍生物，并與樹脂支持物混合30分鐘。5次添加900μl DMF并充分混合1分鐘，進(jìn)行洗滌步驟。通過添加3×900μl在DMF中的30％哌啶，并徹底混合4分鐘，進(jìn)行裂解步驟。
通過使溶液通過反應(yīng)容器的底部過濾器來進(jìn)行單獨(dú)的反應(yīng)和洗滌溶液的除去。
采用了氨基酸衍生物FMOC-Ala、FMOC-Arg(Pbf)、FMOC-Asp、FMOC-Gly、FMOC-His(Trt)、FMOC-Ile、FMOC-Leu、FMOC-Lys(BOC)、FMOC-Pro、FMOC-Ser(tBu)、FMOC-Cys(Trt)和FMOC-Tyr(tBu)(Orpegen)。
當(dāng)合成完成時(shí)，干燥肽樹脂。隨后，通過用三氟醋酸/TIS/EDT/水(體積95:2:2:1)在室溫下處理2小時(shí)來裂解肽酰胺。通過過濾、濃縮溶液以及通過添加冰冷的二乙醚的方式，獲得了固體的粗制品(75mg)。
通過在Kromasil RP-18 250-20上的RP-HPLC來純化肽。使由此獲得的肽與琥珀酰基-PEG20K反應(yīng)。在回收、通過凝膠層析純化和凍干法之后，獲得純的產(chǎn)物，通過RPH-HPLC和MALDI-MS的方式確認(rèn)產(chǎn)物。
實(shí)施例5 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Cys-(S-琥珀酰亞胺基-PEG20K)-Gly-Gly-Tyr-Arg-酰胺 如實(shí)施例4中那樣獲得，適當(dāng)?shù)馗淖儽槐Ｗo(hù)氨基酸的序列。
實(shí)施例6 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Cys-(S-琥珀酰亞胺基-PEG20K)-Tyr-Arg-酰胺 如實(shí)施例4中那樣獲得，適當(dāng)?shù)馗淖儽槐Ｗo(hù)氨基酸的序列。
如實(shí)施例1中那樣制備以下 Gly-His-Arg-Pro-Ile-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-NH2 Gly-His-Arg-Pro-Ala-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-NH2 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Arg-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-NH2 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Arg-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-NH2 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Asp-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-NH2 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Asp-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-NH2 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Lys-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-NH2 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Gly-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-NH2 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Leu-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-NH2 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Lys-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-NH2 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ala-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-NH2 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ala-Ala-Gly-Gly-Tyr-Arg-NH2 Gly-His-Arg-Pro-Ile-Asp-Lys-Arg-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Ile-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ala-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-NH2 如實(shí)施例2中那樣制備以下 Gly-His-Arg-Pro-Ile-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys-(S-琥珀酰亞胺基-PEG20K)OH Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Arg-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys-(S-琥珀酰亞胺基-PEG10K)OH Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Asp-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys-(S-琥珀酰亞胺基-PEG20K)OH Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ala-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys-(S-琥珀酰亞胺基-PEG20K)OH Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ala-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ala-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys-(S-琥珀酰亞胺基-PEG20K)OH Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys-(S-琥珀酰亞胺基-PEG10K)OH Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys-(S-琥珀酰亞胺基-PEG20K)OH Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Ile-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys-(S-琥珀酰亞胺基-PEG20K)OH 如實(shí)施例3中那樣制備以下 Gly-His-Arg-Pro-Ile-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys-(S-琥珀酰亞胺基-PEG20K)酰胺 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Arg-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys-(S-琥珀酰亞胺基-PEG10K)酰胺 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Asp-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys-(S-琥珀酰亞胺基-PEG20K)酰胺 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ala-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys-(S-琥珀酰亞胺基-PEG20K)酰胺 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ala-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ala-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys-(S-琥珀酰亞胺基-PEG20K)酰胺 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys-(S-琥珀酰亞胺基-PEG10K)酰胺 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys-(S-琥珀酰亞胺基-PEG20K)酰胺 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Ile-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys-(S-琥珀酰亞胺基-PEG20K)酰胺 實(shí)施例7 在LPS誘導(dǎo)的肺炎模型中驗(yàn)證實(shí)施例1化合物的生物學(xué)效果。將C57黑小鼠隨機(jī)分配到每組6只動物的兩個(gè)組中，如下處理 讓組1鼻內(nèi)地接受100ng/kg LPS，在LPS的施用之后立即地，讓小鼠靜脈內(nèi)接受4.8mg/kg的實(shí)施例1的試劑(溶于100μl NaCl中)，在施用LPS之后60分鐘后再次靜脈內(nèi)接受第二劑。
讓組2鼻內(nèi)地接受100ng/kg LPS，在使用LPS之后立即地，讓小鼠靜脈內(nèi)接受100μl NaCl，在LPS的施用之后60分鐘，讓小鼠再次靜脈內(nèi)接受100μlNaCl，在LPS應(yīng)用之后6小時(shí)，對所有的組進(jìn)行支氣管小泡灌洗，并移出肺。從灌洗液體中，測定了許多嗜中性細(xì)胞(PMN)。這得到了以下結(jié)果
實(shí)施例8 在登革熱病毒感染的小鼠模型中驗(yàn)證實(shí)施例3化合物的生物學(xué)效果。將5周齡的雄性BALB/c小鼠被分成2組。所有的動物用小鼠適應(yīng)的登革熱病毒(DEN-2，菌株P(guān)23085以1-2LD50的劑量皮下地感染。讓15只小鼠以肌內(nèi)注射方式接受0.1ml 0.8％鹽水(對照)。讓處理的動物以肌內(nèi)注射方式接受4.8mg/kg/天的實(shí)施例3試劑(在0.1ml的0.8％鹽水中稀釋)，每天一次，共5天，從病毒感染之后3天開始。
在處理期(10天)結(jié)束時(shí)，比較存活率。
獲得了以下結(jié)果 實(shí)施例9 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys-(S-CH2-CO-NH-PEG20K)-OH 以與實(shí)施例1類似的方式進(jìn)行單體肽的合成，在此Tentagel of(RappPolymere)用作樹脂支持物，F(xiàn)MOC-Cys(Trt)作為第一個(gè)氨基酸。
在肽的裂解和純化之后，與合適的過量Br-CH2-CO-NH-PEG20K進(jìn)行反應(yīng)。在Kromasil RP-18上進(jìn)行回收純化之后，通過MALDI-MS確認(rèn)產(chǎn)物。
實(shí)施例10 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys-(S-CH2-CO-NH-PEG20K)-酰胺 以0.24mmol/g的載荷量將100mg Tentagel-S-RAM(Rapp-Polymere)轉(zhuǎn)移到商業(yè)上可獲得的肽合成設(shè)備(PSMM(Shimadzu))上，其中根據(jù)碳二亞胺/HOBt方法來分步地構(gòu)建肽序列。
在轉(zhuǎn)移到反應(yīng)容器中之后，通過添加5倍等摩爾過量的二-異丙基-碳二亞胺(DIC)、二-異丙基-乙胺(DIPEA)和羥基苯并三唑(HOBt)來預(yù)先活化FMOC氨基酸衍生物，并與樹脂支持物混合30分鐘。5次添加900μl DMF并充分混合1分鐘，進(jìn)行洗滌步驟。添加3×900μl在DMF中的30％哌啶，并徹底混合4分鐘，進(jìn)行裂解步驟。
通過使溶液通過反應(yīng)容器的底部過濾器來進(jìn)行單獨(dú)的反應(yīng)和洗滌溶液的除去。
采用了氨基酸衍生物FMOC-Ala、FMOC-Arg(Pbf)、FMOC-Asp、FMOC-Gly、FMOC-His(Trt)、FMOC-Ile、FMOC-Leu、FMOC-Lys(BOC)、FMOC-Pro、FMOC-Ser(tBu)、FMOC-Cys(Trt)和FMOC-Tyr(tBu)(Orpegen)。
在肽的裂解和純化之后，與合適的過量的Br-CH2-CO-NH-PEG20K進(jìn)行反應(yīng)。在Kromasil RP-18上進(jìn)行回收純化之后，通過MALDI-MS確認(rèn)產(chǎn)物。
實(shí)施例11 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Cys-(S-CH2-CO-NH-PEG20K)-Gly-Tyr-Arg-酰胺 以0.24mmol/g的載荷量將100mg Tentagel-S-RAM(Rapp-Polymere)轉(zhuǎn)移到商業(yè)上可獲得的肽合成設(shè)備(PSMM(Shimadzu))上，其中根據(jù)碳二亞胺/HOBt方法來分步地構(gòu)建肽序列。在轉(zhuǎn)移到反應(yīng)容器中之后，通過添加5倍等摩爾過量的二-異丙基-碳二亞胺(DIC)、二-異丙基-乙胺(DIPEA)和羥基苯并三唑(HOBt)來預(yù)先活化FMOC氨基酸衍生物，并與樹脂支持物混合30分鐘。5次添加900μl DMF并充分混合1分鐘，進(jìn)行洗滌步驟。添加3×900μl 在DMF中的30％哌啶，并徹底混合4分鐘，進(jìn)行裂解步驟。
通過使溶液通過反應(yīng)容器的底部過濾器來進(jìn)行單獨(dú)的反應(yīng)和洗滌溶液的除去。
采用了氨基酸衍生物FMOC-Ala、FMOC-Arg(Pbf)、FMOC-Asp、FMOC-Gly、FMOC-His(Trt)、FMOC-Ile、FMOC-Leu、FMOC-Lys(BOC)、FMOC-Pro、FMOC-Ser(tBu)、FMOC-Cys(Trt)和MOC-Tyr(tBu)(Orpegen)。
當(dāng)合成完成時(shí)，干燥肽樹脂。隨后，通過用三氟醋酸/TIS/EDT/水(體積95:2:2:1)在室溫下處理2小時(shí)，來裂解肽酰胺。通過過濾、濃縮溶液以及通過添加冰冷的二乙醚的方式，獲得了固體的粗制品(75mg)。
通過RP-HPLC在Kromasil RP-18 250-20上純化肽。使由此獲得的肽與O-(碘化乙?；?-N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)，隨后與氨基-乙基-氧-PEG20K反應(yīng)。
在回收、通過凝膠層析純化和凍干之后，獲得純的產(chǎn)物，通過MALDI-MS確認(rèn)該產(chǎn)物。
實(shí)施例12 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Cys-(S-CH2-CO-NH-PEG20K)-Gly-Tyr-Arg-酰胺 如實(shí)施例11中那樣獲得，適當(dāng)?shù)馗淖儽槐Ｗo(hù)氨基酸的序列。
如實(shí)施例9中那樣產(chǎn)生以下 Gly-His-Arg-Pro-Ile-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys-(S-CH2-CO-NH-PEG20K)OH Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Arg-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys-(S-CH2-CO-NH-PEG10K)OH Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Asp-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys--(S-CH2-CO-NH-PEG20K)OH Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ala-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys--(S-CH2-CO-NH-PEG20K)OH Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ala-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ala-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys--(S-CH2-CO-NH-PEG20K)OH Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys--(S-CH2-CO-NH-PEG10K)OH Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys--(S-CH2-CO-NH-PEG20K)OH Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Ile-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys--(S-CH2-CO-NH-PEG20K)OH 如實(shí)施例10中那樣產(chǎn)生以下 Gly-His-Arg-Pro-Ile-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys-(S-CH2-CO-NH-PEG20K)酰胺 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Arg-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys-(S-CH2-CO-NH-PEG10K)酰胺 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Asp-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys--(S-CH2-CO-NH-PEG20K)酰胺 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ala-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys--(S-CH2-CO-NH-PEG20K)酰胺 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ala-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ala-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys--(S-CH2-CO-NH-PEG20K)酰胺 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys--(S-CH2-CO-NH-PEG10K)酰胺 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys--(S-CH2-CO-NH-PEG20K)酰胺 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Ile-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys--(S-CH2-CO-NH-PEG20K)酰胺
權(quán)利要求
1.以下通式I的肽和肽衍生物
H2N-CHRPX1X2X3X4X5X6X7X8PX9X10X11PX12PPPX13X14X15X16GYR-X17(I)，
其中
X1-X16 代表20個(gè)遺傳編碼的氨基酸之一，
X17 代表OR1，R1＝氫或(C1-C10)-烷基，或
NR2R3，R2和R3是相同的或不同的，并且代表氫、(C1-C10)-烷基或殘基PEG5-60K，其中PEG殘基經(jīng)由間隔區(qū)與N原子連接，或
殘基NH-Y-Z-PEG5-60K，其中Y代表化學(xué)鍵或來自S、C、K或R的組的遺傳編碼的氨基酸，以及Z代表間隔區(qū)，通過所述間隔區(qū)可以連接聚乙二醇(PEG)殘基，
以及其生理學(xué)上可接受的鹽，
或其中
X15或X16代表來自C或K的組的氨基酸，其經(jīng)由側(cè)鏈中的雜原子與殘基Z-PEG5-60K連接，并且其中
X17 代表OR1，R1＝氫或(C1-C10)-烷基，或
NR2R3、R2和R3是相同的或不同的，并且代表氫或(C1-C10)-烷基，
以及其生理學(xué)上可接受的鹽。
2.通式I的肽和肽衍生物，其中
X1、X9、X10、X14 代表L、I、S、M或A，
X2、X6、X7代表E或D，
X3、X4、X5、X11代表R或K
X8、X12 代表A、G、S或L
X13 代表I、L或V，并且其中
X15、X16和X17 具有與權(quán)利要求1中相同的含義，
以及其生理學(xué)上可接受的鹽。
3.式II的肽和肽衍生物，
H2N-GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYR-X17 (II)，
其中X17具有在權(quán)利要求1中針對式I給出的含義，
以及其生理學(xué)上可接受的鹽。
4.式(II)的肽和肽衍生物，
其中
X17 代表NR2R3，R2a和R3是相同的或不同的，并且是氫或(C1-C10)-烷基，或殘基C(NR2R3)-(S-琥珀酰亞胺基)-(PEG5-40K)，所述琥珀酰亞胺殘基經(jīng)由C-原子3與半胱氨酸殘基的硫原子連接，
以及其生理學(xué)上可接受的鹽。
5.式(III)的肽衍生物，
H2N-GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPIS-X19-X20-X21-YR-X17 (III)
其中殘基X19、X20和X21中的兩個(gè)每個(gè)是甘氨酸殘基，剩余的一個(gè)是殘基C-(S-琥珀酰亞胺基)-(PEG5-40K)，所述琥珀酰亞胺基經(jīng)由C-原子3與半胱氨酸殘基的硫原子連接，
并且其中X17代表NR2R3，R2和R3是相同的或不同的，并且是氫或(C1-C10)-烷基，
以及其生理學(xué)上可接受的鹽。
6.式(III)的肽衍生物，
H2N-GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPIS-X19-X20-X21-YR-X17 (III)
其中殘基X19、X20、X21中的兩個(gè)每個(gè)是甘氨酸殘基，剩余的一個(gè)是殘基K-(PEG5-40K)，所述PEG殘基經(jīng)由賴氨酸殘基的側(cè)鏈中的氮原子連接，并且其中
X17代表NR2R3，R2和R3是相同的或不同的，并且是氫或(C1-C10)-烷基，
以及其生理學(xué)上可接受的鹽。
7.一種藥物組合物，含有根據(jù)權(quán)利要求1到6的任一項(xiàng)的肽或肽衍生物。
全文摘要
以下通式(I)的肽和肽衍生物H2N-GHRPX1X2X3X4X5X6X7X8PX9X10X11PX12PPPX13X14X15X16GYR-X17(I)，其中X1-X16代表20個(gè)遺傳編碼的氨基酸之一，X17代表OR1，R1＝氫或(C1-C10)-烷基，或NR2R3，R2和R3是相同的或不同的，并代表氫、(C1-C10)-烷基或殘基-PEG5-60K(其中PEG殘基經(jīng)由間隔區(qū)與N原子連接)，或殘基NH-Y-Z-PEG5-60K，其中Y代表化學(xué)鍵或選自S、C、K或R的組的遺傳編碼的氨基酸，以及Z代表間隔區(qū)，通過所述間隔區(qū)可以連接聚乙二醇(PEG)殘基，以及其生理學(xué)上可接受的鹽，或其中X15或X16代表選自C或K的氨基酸，其經(jīng)由側(cè)鏈中的雜原子與殘基Z-PEG5-60K連接，并且其中X17代表OR1，R1＝氫或(C1-C10)-烷基，或NR2R3，R2和R3是相同的或不同的，并且代表氫或(C1-C10)-烷基，以及其生理學(xué)上可接受的鹽。
文檔編號C07K14/435GK101389653SQ200780006303
公開日2009年3月18日 申請日期2007年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月23日
發(fā)明者P·佩特澤爾鮑爾, R·亨寧, S·賴因格魯伯 申請人:菲布雷克斯醫(yī)療研究及開發(fā)有限責(zé)任公司