專利名稱：咪唑基化合物，包含其的組合物和它們的使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及咪唑基化合物，和將它們用于多種疾病和病癥的治療、 預(yù)防和應(yīng)對(duì)的方法。
背景技術(shù)：
I-磷酸鞘氨醇(SIP)是對(duì)多種器官系統(tǒng)具有強(qiáng)力影響的生物活性分 子。Saba, J.D.和Hla， T.， Circ. Res. 94:724-734(2004)。盡管一些人相信 該化合物是胞內(nèi)第二信使，但是其作用方式仍是爭(zhēng)論的主題。出處同 前。實(shí)際上，甚至對(duì)其代謝也缺乏了解。Hla， T. ， Science 309:1682-3(2005)。目前研究人員相信SIP通過鞘氨醇的磷酸化作用形 成，通過脫磷酸作用或裂解被降解。據(jù)報(bào)道，其裂解成為磷酸乙醇胺 和長(zhǎng)鏈醛是通過SIP裂解酶催化進(jìn)行的。出處同前；Pyne & Pyne， Biochem J. 349:385-402(2000)。
1-磷酸鞘氨醇是集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)的維生素B6依賴性酶。Van Veldhoven禾B Mannaerts， J. Biol. Chem. 266:12502-12507(1991); Van Veldhoven和Mannaerts， Adv. Lipid Res. 26:69(1993)。在PCT專利申 請(qǐng)WO 99/16888中描述了人SPl裂解酶及其基因產(chǎn)物的多核苷酸和氨 基酸序列。
最近，Schwab和合作者作出結(jié)論，焦糖色I(xiàn)II組分，即2-乙?；?4-四羥基丁基咪唑(1711)，當(dāng)對(duì)小鼠施用時(shí)抑制SIP裂解酶活性。
Schwab, S.等人，Science 309:1735-1739(2005)。而另外一些人假設(shè)THI 通過不同的機(jī)制發(fā)揮其作用(例如，參見，Pyne， S.G.， ACGC Chem. Res. Comm. 11:108-112(2000))，顯然對(duì)大鼠和小鼠給予該化合物誘導(dǎo)淋巴細(xì) 胞減少并引起胸腺內(nèi)成熟T細(xì)胞積聚。例如參見，Schwab,出處同前； Pyne， S.G., ACGC Chem. Res. Comm. 11:108-112(2000): Gugsyan， R. 等人，Immunology 93(3):398陽(yáng)404(1998); Halweg， K.M.和Biichi， G.， L Org. Chem. 50:1134-1136(1985):授權(quán)給Kroeplien和Rosdorfer的美國(guó) 專利4,567,194。但是仍然沒有在除了小鼠和大鼠的其它動(dòng)物中具有免 疫學(xué)作用的THI的已知報(bào)導(dǎo)。盡管美國(guó)專利4,567,194宣稱THI和一些 相關(guān)化合物可用作免疫抑制藥，但是在人中對(duì)該化合物的研究沒有發(fā) 現(xiàn)免疫學(xué)作用。參見Thuvander， A.和Oskarsson， A.， Fd. Chem. Toxic. 32(1):7-13(1994) ; Houben， G.F.等人，F(xiàn)d. Chem. Toxic. 30(9):749-757(1992)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明部分地涉及式I的化合物
及其可藥用的鹽和溶劑合物(例如水合物)，其中X為0或NR3;
R,為OR,A、 NHOH、氫、或任選地被取代的焼基、芳基、烷基芳基、 芳基垸基、雜烷基、雜環(huán)、烷基雜環(huán)、或雜環(huán)垸基；R2為OR2A、C(0)OR2A、 氫、鹵素、腈、或任選地被取代的烷基、芳基、垸基芳基、芳基烷基、 雜垸基、雜環(huán)、烷基雜環(huán)、或雜環(huán)垸基；R3為OR3A、N(R3A)2、NHC(0)R3A、 NHS02R3A、或氫；R4為OR4A、 OC(0)R4A、氫、鹵素、或任選地被取 代的烷基、芳基、烷基芳基、芳基垸基、雜烷基、雜環(huán)、烷基雜環(huán)、 或雜環(huán)烷基；R5為N(RsA)2、氫、羥基、或任選地被取代的垸基、芳基、
烷基芳基、芳基烷基、雜垸基、雜環(huán)、烷基雜環(huán)、或雜環(huán)烷基；并且
R1A、 R2A、 R3A、 R4A和RsA中的每一個(gè)獨(dú)立地為氫或任選地被取代的烷
基、芳基、垸基芳基、芳基垸基、雜烷基、雜環(huán)、烷基雜環(huán)、或雜環(huán)
焼基o
本發(fā)明還涉及包含式I化合物的藥物組合物，和使用式I化合物治 療炎癥性疾病和病癥的方法。
可以參考以下附圖理解本發(fā)明的某些方面
圖1提供代表性的流式細(xì)胞術(shù)(FACS)點(diǎn)狀圖，表示媒介物對(duì)照 (VC)、本發(fā)明的化合物(化合物1)、和THI對(duì)胸腺T細(xì)胞組成的影響， 和所有小鼠的平均值/Sd(n二3)。
圖2提供代表性的FACS點(diǎn)狀圖，表示媒介物對(duì)照(VC)、本發(fā)明 的化合物(化合物1)、和THI對(duì)小鼠中CD4+細(xì)胞子集(新近胸腺遷出細(xì) 胞)的影響。
圖3提供代表性的FACS點(diǎn)狀圖，表示媒介物對(duì)照(VC)、本發(fā)明 的化合物(化合物1)、和THI對(duì)小鼠中CD8+細(xì)胞子集(新近胸腺遷出細(xì) 胞)的影響。
圖4展示媒介物對(duì)照、THI、化合物l、和化合物2對(duì)小鼠全血計(jì) 數(shù)的影響。
圖5表示本發(fā)明化合物的單一口服劑量給藥對(duì)小鼠中膠原蛋白誘 導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的影響。
圖6表示本發(fā)明化合物的單一口服劑量給藥對(duì)恒河猴的白細(xì)胞和 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響。
發(fā)明詳述
本發(fā)明部分地源于對(duì)S1P裂解酶剃除小鼠的研究，很大程度地涉 及據(jù)信可用于治療、預(yù)防和/或應(yīng)對(duì)自身免疫性和炎癥性疾病和病癥的 化合物。
5.1定義
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"烯基"表示含有2-20 (例如，2-10或2-6)個(gè) 碳原子，并且包含至少一個(gè)碳-碳雙鍵的直鏈、支鏈和/或環(huán)狀烴。代表 性的烯基部分包括乙烯基、烯丙基、l-丁烯基、2-丁烯基、異丁烯基、 l-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-l-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基 -2-丁烯基、l-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、l-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、l-辛烯基、2-辛烯基、3-辛烯基、l-壬烯基、2-壬烯基、3-壬 烯基、l-癸烯基、2-癸烯基和3-癸烯基。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"烷基"表示含有1-20 (例如，l-10或l-4)個(gè) 碳原子的直鏈，支鏈和/或環(huán)狀("環(huán)垸基")烴。含有1-4個(gè)碳原子的 垸基部分被稱為"低級(jí)垸基"。烷基的例子包括甲基、乙基、丙基、異丙 基、正丁基、叔丁基、異丁基、戊基、己基、異己基、庚基、4,4-二甲 基戊基、辛基、2,2，4-三甲基戊基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基。 環(huán)烷基部分可以是單環(huán)或多環(huán)，例子包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、 環(huán)己基和金剛烷基。烷基部分的其它例子具有直鏈、支鏈和/或環(huán)狀部 分(例如，l-乙基-4-甲基-環(huán)己基)。術(shù)語(yǔ)"垸基"包括飽和烴及烯基和 炔基部分。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"垸基芳基"或"垸基-芳基"表示與芳基部分結(jié) 合的垸基部分。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"垸基雜芳基"或"垸基-雜芳基"表示與雜芳基 部分結(jié)合的垸基部分。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"垸基雜環(huán)"或"烷基-雜環(huán)"表示與雜環(huán)部分結(jié) 合的烷基部分。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"炔基"表示含有2-20 (例如，2-20或2-6)個(gè)
碳原子，并且包含至少一個(gè)碳-碳三鍵的直鏈、支鏈和/或環(huán)狀烴。代表 性的炔基部分包括乙炔基、丙炔基、l-丁炔基、2-丁炔基、l-戊炔基、 2-戊炔基、3-甲基-l-丁炔基、4-戊炔基、l-己炔基、2-己炔基、5-己炔 基、l-庚炔基、2-庚炔基、6-庚炔基、l-辛炔基、2-辛炔基、7-辛炔基、 l-壬炔基、2-壬炔基、8-壬炔基、l-癸炔基、2-癸炔基和9-癸炔基。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"烷氧基"表示-O-垸基。垸氧基的例子包括但 不限于-OCH3、 -OCH2CH3、 -0(CH2)2CH3、 -0(CH2)3CH3、 -0(CH2)4CH3 和陽(yáng)0(CH2)sCH3。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"芳基"表示由碳原子和氫原子組成的芳香性 環(huán)或芳香性或部分芳香性環(huán)體系。芳基部分可以包括結(jié)合或稠合在一 起的多個(gè)環(huán)。芳基部分的例子包括蒽基、奧基(azulenyl)、聯(lián)苯基、芴 基、茚滿、茚基、萘基、菲基、苯基、1,2,3，4-四氫-萘和甲苯基。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"芳基垸基"或"芳基-垸基"表示與烷基部分結(jié) 合的芳基部分。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑"是指CLRF大于約 20%的化合物。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"循環(huán)淋巴細(xì)胞減少系數(shù)"或"CLRF"是指 通過實(shí)施例中所述的方法測(cè)定的，由以100mg/kg的單一劑量口服給藥 的化合物引起的小鼠循環(huán)淋巴細(xì)胞的數(shù)目縮小。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"囪素"和"卣"包括氟、氯、溴和碘。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"雜垸基"是指其中至少一個(gè)碳原子被雜原子 (例如，N、 O或S)替代的垸基部分(例如，直鏈、支鏈或環(huán)狀垸基)。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"雜芳基"表示其中至少一個(gè)碳原子被雜原子 (例如，N、 O或S)替代的芳基部分。例子包括吖啶基、苯并咪唑基、 苯并呋喃基、苯并異噻唑基、苯并異噁唑基、苯并喹唑啉基、苯并噻唑 基、苯并嗯唑基、呋喃基、咪唑基、B引哚基、異噻唑基、異瞎、唑基、噁 二唑基、嗯唑基、2,3-二氮雜萘基、吡嗪基、吡唑基、噠嗪基、吡啶基、
嘧啶基(pyrimidinyl)、嘧啶基(pyrimidyl)、吡咯基、喹唑啉基、喹 啉基、四唑基、噻唑基和三嗪基。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"雜芳基烷基"或"雜芳基-烷基"表示與烷基部 分結(jié)合的雜芳基部分。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"雜環(huán)"是指由碳、氫和至少一個(gè)雜原子(例 如，N、 O或S)組成的芳香性、部分芳香性或非芳香性單環(huán)或多環(huán)或 環(huán)系統(tǒng)。雜環(huán)可以包括多個(gè)(即，兩個(gè)或更多個(gè))稠合或結(jié)合在一起 的環(huán)。雜環(huán)包括雜芳基。例子包括苯并[1，3]二氧雜環(huán)戊烯基(dioxolyl)、 2，3-二氫-苯并[1，4]二氧雜芑基(dioxinyl) 、 1,2-二氮雜萘基、呋喃基、 乙內(nèi)酰脲基(hydantoinyl)、嗎啉基、氧雜環(huán)丁垸基、環(huán)氧乙烷基、哌 嗪基、哌啶基、吡咯垸酮基、吡咯烷基、四氫呋喃基、四氫吡喃基、 四氫吡啶基、四氫嘧啶基、四氫噻吩基、四氫噻喃基和戊內(nèi)酰胺基。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"雜環(huán)基垸基"或"雜環(huán)-垸基"是指與垸基部分 結(jié)合的雜環(huán)部分。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"雜環(huán)烷基"是指非芳香性雜環(huán)。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"雜環(huán)烷基垸基"或"雜環(huán)烷基-烷基"是指與垸 基部分結(jié)合的雜環(huán)垸基部分。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"應(yīng)對(duì)"包括預(yù)防特定疾病或病癥在已患所述 疾病或病癥的患者中的復(fù)發(fā)，和/或延長(zhǎng)已患所述疾病或病癥的患者保
持在緩解期的時(shí)間。該術(shù)語(yǔ)包括調(diào)節(jié)所述疾病或病癥的閾值、發(fā)展和/ 或持續(xù)時(shí)間，或者改變患者對(duì)所述疾病或病癥的應(yīng)答方式。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"可藥用鹽"是指由可藥用的無毒酸或堿，包 括無機(jī)酸和堿及有機(jī)酸和堿制備的鹽。適合的可藥用的堿加成鹽包括 但不限于由鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉和鋅制成的金屬鹽，或由賴氨酸、 N,N，-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺 (N-甲基葡萄糖胺)和普魯卡因制成的有機(jī)鹽。適合的無毒酸包括但 不限于無機(jī)酸和有機(jī)酸，如乙酸、藻酸、鄰氨基苯甲酸、苯磺酸、苯 甲酸、樟腦磺酸、檸檬酸、乙烯基磺酸、甲酸、富馬酸、糠酸、半乳 糖醛酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、羥基乙酸、氫溴酸、鹽酸、羥 乙基磺酸、乳酸、馬來酸、蘋果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、 雙羥萘酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、丙酸、水楊酸、硬脂酸、琥珀酸、 對(duì)氨基苯磺酸、硫酸、酒石酸和對(duì)甲苯磺酸。具體的無毒酸包括鹽酸、 氫溴酸、磷酸、硫酸和甲磺酸。具體的鹽的例子因此包括鹽酸鹽和甲
磺酸鹽。其它是本領(lǐng)域公知的。參見，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Publishing, Easton PA: 1990)禾口 Remington: The Science and Practice of Pharmacy(第19版，Mack Publishing, Easton PA: 1995)。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"預(yù)防"包括在患者開始患有特定疾病或病癥 之前發(fā)生的行為，該行為抑制或減輕疾病或病癥的嚴(yán)重性。換句話說， 該術(shù)語(yǔ)包括防病。
除非另有說明，化合物的"預(yù)防有效量"是足以預(yù)防疾病或病況、
或與該疾病或病況有關(guān)的一種或多種癥狀、或防止其再發(fā)生的量。預(yù)
防有效量的化合物是指一定量的治療劑(其單獨(dú)或與其它藥物組合)，
在疾病的預(yù)防中提供預(yù)防性益處。術(shù)語(yǔ)"預(yù)防有效量"可包括改善總體防 病或增強(qiáng)其它預(yù)防性藥物的預(yù)防性效力的量。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"S1P水平增強(qiáng)劑"是指具有至少約IO倍SLEF
的化合物。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"S1P水平增強(qiáng)系數(shù)"或"SLEF"是指通過 以下實(shí)施例中所述的方法測(cè)定的，由以100mg/kg的單一劑量口服給藥 的化合物引起的小鼠脾中S1P的增加。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"立體異構(gòu)混合物"包括外消旋混合物以及 立體異構(gòu)富集的混合物(例如，R/S=30/70、 35/65、 40/60、 45/55、 55/45、 60/40、 65/35和70/30)。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"立體異構(gòu)體純"是指包括化合物的一種立 體異構(gòu)體并且實(shí)質(zhì)上不含該化合物的其它立體異構(gòu)體的組合物。例如，
具有一個(gè)立構(gòu)中心的化合物的立體異構(gòu)純組合物實(shí)質(zhì)上不含該化合物 的相反立體異構(gòu)體。具有二個(gè)立構(gòu)中心的化合物的立體異構(gòu)純組合物 實(shí)質(zhì)上不含該化合物的其它非對(duì)映異構(gòu)體。典型的立體異構(gòu)純化合物 包括大于約80重量％的該化合物的一種立體異構(gòu)體和小于約20重量％ 的該化合物的其它立體異構(gòu)體，大于約90重量％的該化合物的一種立 體異構(gòu)體和小于約10重量％的該化合物的其它立體異構(gòu)體，大于約95 重量％的該化合物的一種立體異構(gòu)體和小于約5重量％的該化合物的其 它立體異構(gòu)體，大于約97重量％的該化合物的一種立體異構(gòu)體和小于 約3重量％的該化合物的其它立體異構(gòu)體，大于約99重量％的該化合 物的一種立體異構(gòu)體和小于約1重量％的該化合物的其它立體異構(gòu)體。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"取代的"，當(dāng)用于描述化學(xué)結(jié)構(gòu)或部分時(shí)， 是指該結(jié)構(gòu)或部分的衍生物，其中一個(gè)或多個(gè)其氫原子被原子、化學(xué) 部分或官能團(tuán)取代，所述化學(xué)部分或官能團(tuán)例如但不限于醇、醛、烷 氧基、鏈烷酰氧基(alkanoyloxy)、垸氧基羰基、烯基、烷基(例如， 甲基、乙基、丙基、叔丁基)、炔基、烷基羰基氧基(-OC(O)垸基)、 酰胺(-C(O)NH-烷基-或-垸基NHC(O)垸基)、脒基(amidinyl)
(-C(NH)NH-烷基或-C(NR)NH2)、胺(伯胺、仲胺和叔胺，如烷基氨 基、芳基氨基、芳基院基氨基)、芳酰基、芳基、芳氧基、偶氮、氨 基甲?；?-NHC(O)O-烷基-或-OC(O)NH-烷基)、氨甲?；?例如， CONH2，以及CONH-烷基、CONH-芳基和CONH-芳基烷基)、羰基、 羧基、羧酸、羧酸酐、酰氯、氰基、酯、環(huán)氧化物、醚(例如、甲氧 基、乙氧基)、胍基、鹵素、鹵代烷基(例如，-CC13、 -CF3、 -C(CF3)3)、 雜烷基、半縮醛、亞胺(伯和仲)、異氰酸酯、異硫氰酸酯、酮、腈、 硝基、氧代、磷酸二酯、硫化物、亞磺酰氨基(例如，S02NH2)、砜、 磺?；?包括烷基磺酰基、芳基磺酰基和芳基烷基磺?；?、亞砜、 硫醇(例如，巰基、硫醚)和脲(-NHCONH-烷基-)。
除非另有說明，化合物的"治療有效量"是在疾病或病況的治療或 應(yīng)對(duì)中足以提供治療益處，或足以延遲與該疾病或病況有關(guān)的一種或 多種癥狀或使其最小化的量。治療有效量的化合物是指一定量的治療 劑(其單獨(dú)或與其它藥物組合)，在疾病或病況的治療或應(yīng)對(duì)中提供 治療益處。術(shù)語(yǔ)"治療有效量"可包括改善全面治療、減少或避免疾病或 病況的癥狀或病因、或增強(qiáng)其它治療劑的治療效力的量。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"治療"包括發(fā)生在患者患有特定疾病或病癥 的同時(shí)，降低該疾病或病癥的嚴(yán)重程度或其一種或多種癥狀，或延遲 或延緩該疾病或病癥的進(jìn)展的行為。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)"包括"與"包括但不限于"具有相同含義，同 樣地，術(shù)語(yǔ)"諸如"與"諸如但不限于"具有相同含義。
除非另有說明，緊挨著一系列名詞之前的一個(gè)或多個(gè)形容詞被認(rèn) 為適用于每一個(gè)名詞。例如，術(shù)語(yǔ)"任選被取代的烷基、芳基或雜芳基" 與"任選被取代的垸基、任選被取代的芳基、或任選被取代的雜芳基" 具有相同含義。
應(yīng)當(dāng)注意到，構(gòu)成較大化合物的一部分的化學(xué)部分在本文中可使 用當(dāng)其作為單個(gè)分子存在時(shí)通常采用的名稱或當(dāng)其作為取代基時(shí)通常 采用的名稱進(jìn)行描述。例如，術(shù)語(yǔ)"吡啶"和"吡啶基"當(dāng)用于描述與其它 化學(xué)部分結(jié)合的部分時(shí)具有相同含義。因此，兩個(gè)詞語(yǔ)"XOH，其中X
是吡啶基"和"XOH，其中X是吡啶"具有相同含義，并且包括吡啶-2-醇、吡啶-3-醇和吡啶-4-醇。
也應(yīng)注意，如果某一結(jié)構(gòu)或某一結(jié)構(gòu)的一部分的立體化學(xué)沒有用 例如粗體線或虛線表示時(shí)，則該結(jié)構(gòu)或該結(jié)構(gòu)的一部分可被解釋為包 括該結(jié)構(gòu)的所有立體異構(gòu)體。另外，圖中顯示的具有不飽和原子價(jià)的 任何原子被假設(shè)為與足夠的氫原子結(jié)合從而滿足原子價(jià)。另外，用與 一條虛線平行的一條實(shí)線描述的化學(xué)鍵，如果原子價(jià)允許的話，包括 單鍵和雙鍵(例如芳族)。
5.2化合物
本發(fā)明包括式I的化合物
<formula>formula see original document page 27</formula>
及其可藥用的鹽和溶劑合物(例如水合物)，其中X為0或NR3; Rj為OR^、 NHOH、氫、或任選地被取代的垸基、芳基、垸基芳基、 芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)、垸基雜環(huán)、或雜環(huán)垸基；R2為OR2A、C(0)OR2A、 氫、鹵素、腈、或任選地被取代的烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、 雜垸基、雜環(huán)、垸基雜環(huán)、或雜環(huán)烷基；R3為OR3A、N(R3A)2、NHC(0)R3A、 NHS02R3A、或氫；R4為OR4A、 OC(0)R4A、氫、鹵素、或任選地被取 代的垸基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、雜垸基、雜環(huán)、烷基雜環(huán)、 或雜環(huán)烷基；Rs為N(RsA)2、氫、羥基、或任選地被取代的垸基、芳基、 烷基芳基、芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)、烷基雜環(huán)、或雜環(huán)垸基；并且
R1A、 R2A、 R3A、 R4A、和RsA中的每一個(gè)獨(dú)立地為氫或任選地被取代的 烷基、芳基、垸基芳基、芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)、烷基雜環(huán)、或雜 環(huán)烷基。
式I的具體化合物為使得如果X為O; R,為l-4個(gè)碳的垸基、苯 基、芐基或苯基乙基；R2為氫；并且R4和R5之一為羥基；則R4和R5 的另一個(gè)不是l-6個(gè)碳的垸基、l-6個(gè)碳的羥基烷基、每個(gè)碳具有最多 一個(gè)羥基的l-6個(gè)碳的多羥基烷基、每個(gè)碳具有最多一個(gè)乙?；?-6 個(gè)碳的多乙?；榛?、苯基、芐基或苯基乙基。
在具體的實(shí)施方案中，化合物不是2-乙?；?4-四羥基丁基咪唑， l-(4-(l，l,2，2,4-五羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙酮，l-(2-乙?；?lH-咪唑 -4-基)丁垸-1，1，2，2-四基四乙酸酯，或l-(2-乙酰基-lH-咪唑-4-基)丁垸 -1，1，2，2，4-五基五乙酸酯。
一個(gè)特定的實(shí)施方案包括式II的化合物 R7 R8 HO )~
及其可藥用的鹽和溶劑合物，其中X為O或NRs; A為OR!A、 NHOH、氫、或任選地被取代的垸基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、 雜垸基、雜環(huán)、烷基雜環(huán)、或雜環(huán)垸基；R2為OR2A、 C(0)OR2A、 氫、鹵素、腈、或任選地被取代的垸基、芳基、烷基芳基、芳基烷 基、雜烷基、雜環(huán)、垸基雜環(huán)、或雜環(huán)垸基；R3為OR3A、 N(R3A)2、 NHC(0)R3A、 NHS02R3A、或氫；R6為OR6A、 OC(0)R6A、 N(R6B)2、 NHC(0)R6B 、氫、或鹵素；R7為OR7A 、 OC(0)R7A 、 N(R7B)2 、 NHC(0)R7B 、氫、或鹵素；R8為OR8A 、 OC(0)R8A 、 N(R8B)2 、NHC(O)R犯、氫、或鹵素;Rg為CH2OR9A、 CH2OC(0)R9A、 N(R9B)2、 NHC(0)R9B、氫、或鹵素；R1A、 R2A、 R3A、 R6A、 R7A、 R8A禾n R9A中 的每一個(gè)獨(dú)立地為氫或任選地被取代的垸基、芳基、烷基芳基、芳基 烷基、雜垸基、雜環(huán)、烷基雜環(huán)、或雜環(huán)烷基；并且R6B、 R7B、 R8B 和R9B中的每一個(gè)獨(dú)立地為氫或任選地被一個(gè)或多個(gè)羥基或卣素基團(tuán) 取代的烷基；
具體式II的化合物為使得l)如果X為O， 為1-4個(gè)碳的烷基、
苯基、芐基或苯基乙基，并且R2為氫，則R6、 R7、 Rs和Rg中的至少
兩個(gè)不是羥基或乙酸根；2)如果X為0， Rt為甲基，R2為氫，R6和R7 都是羥基，并且R8和R9之一 為氫，則R8和R9的另 一個(gè)不是NHC(0)R9B; 3)如果X為O， &為OR1A， RiA為氫或低級(jí)垸基，并且R2為氫，則 R6、 R7、 Rs和R9中的至少一個(gè)但不是全部為羥基或乙酸根。
具體的本發(fā)明化合物由式II(a)表示: <formula>formula see original document page 29</formula>II(a)
其它的化合物由式in表示
<formula>formula see original document page 29</formula>其中Z為任選地被取代的垸基；R^為OR^、 NHOH、氫、或任 選地被取代的烷基、芳基、垸基芳基、芳基垸基、雜烷基、雜環(huán)、烷 基雜環(huán)、或雜環(huán)垸基；R2為OR2A、 C(0)OR2A、氫、鹵素、腈、或任選 地被取代的烷基、芳基、烷基芳基、芳基垸基、雜垸基、雜環(huán)、烷基
雜環(huán)、或雜環(huán)垸基；&為OR3A、 N(R3A)2、 NHC(0)R3A、 NHS02R3A、 或氫；并且R1A、 R2A、和R3A中的每一個(gè)獨(dú)立地為氫或任選地被取代 的烷基、芳基、垸基芳基、芳基垸基、雜烷基、雜環(huán)、烷基雜環(huán)、或 雜環(huán)垸基。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括式IV的化合物 R7 ,R8<formula>formula see original document page 30</formula>IV
及其可藥用的鹽和溶劑合物，其中R,為OR,A、 NHOH、氫、或 任選地被取代的烷基、芳基、烷基芳基、芳基垸基、雜烷基、雜環(huán)、 烷基雜環(huán)、或雜環(huán)烷基；R3為OR3A、 N(R3A)2、 NHC(0)R3A、 NHS02R3A、或氫；R6為OR6A、 OC(0)R6A、 N(R6B)2、 NHC(0)R6B、 氫、或鹵素；R7為OR7A、 OC(0)R7A、 N(R7B)2、 NHC(0)R7B、氫、或 鹵素；R8為OR8A、 OC(0)R8A、 N(R8B)2、 NHC(0)R8B、氫、或鹵素； R9為CH2OR9A、 CH2OC(0)R9A、 N(R9B)2、 NHC(O)R陽(yáng)、氫、或鹵素； 并且R^、 R3A、 R6a、 R7A、 RsA和R9A中的每一個(gè)獨(dú)立地為氫或任選地 被取代的烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、雜垸基、雜環(huán)、垸基雜 環(huán)、或雜環(huán)垸基。
具體的化合物由式IV(a)表示 R7 R8 HO ^~(
<formula>formula see original document page 30</formula> IV(a)
對(duì)于包含如下所述部分的以上所示的每一式，本發(fā)明的某些實(shí)施
方案為使得
在一些化合物中，X為O。在其它一些化合物中，X為NRy 在一些化合物中，！^為氫。在其它一些化合物中，！^為任選地被
取代的低級(jí)烷基。在其它一些化合物中，Ri為NHOH。在其它一些化 合物中，！^為ORu并且R,a為例如氫或任選地被取代的低級(jí)院基。
在一些化合物中，R2為氫。在其它一些化合物中，R2不是氫。在 其它一些化合物中，R2為腈。在其它一些化合物中，R2為任選地被取 代的低級(jí)垸基。在其它一些化合物中，R2為OR2A。在其它一些化合物 中，R2為C(0)OR2A。在一些化合物中，R2A為氫或任選地被取代的低
級(jí)烷基。
在一些化合物中，R3為OR3A。在其它一些化合物中，R3為 N(R3a)2或NHC(0)R3a。在其它一些化合物中，R3為NHS02R3A。在一
些化合物中，R3A為氫或任選地被取代的低級(jí)垸基。在其它一些化合物 中，R3A為任選地被取代的芳基或雜環(huán)。
在一些化合物中，R4為OR^。在其它一些化合物中，R4為鹵素。
在一些化合物中，Rs為N(RsA)2。在其它一些化合物中，Rs為氫。 在其它一些化合物中，R5為羥基。在其它一些化合物中，R5為雜垸基(例
如，烷氧基)。在其它一些化合物中，R5為任選地被取代的烷基。在其
它一些化合物中，Rs為任選地被取代的芳基。
在一些化合物中，R6、 R7、 Rs和R9中的一個(gè)或多個(gè)為羥基或鹵素。 在一些化合物中，R6、 R7、 R8、和R9都是羥基或乙酸根。
在一些化合物中，Z為任選地被一個(gè)或多個(gè)羥基/乙酸根或卣素苯 酚取代的烷基。
本發(fā)明的化合物可以含有一個(gè)或多個(gè)立體中心，并且可以作為對(duì) 映異構(gòu)體的外消旋混合物或非對(duì)映異構(gòu)體的混合物存在。本發(fā)明包括 這些化合物的立體異構(gòu)純形式、及這些形式的混合物。異構(gòu)體可以通 過不對(duì)稱合成得到，或者用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如手性柱或手性拆分劑進(jìn)行拆
分。參見，例如，Jacques, J.等人，Enantiomers, Racemates and Resolutions(Wiley Interscience, New York, 1981); Wilen， S. H.等人， Tetrahedron 33:2725(1977); Eliel， E. L.， Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw Hill, NY, 1962);禾Q Wilen， S. H.， Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions,第268頁(yè)(E丄.Eliel,編，Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame， IN, 1972)。
本發(fā)明進(jìn)一步包括本文所公開化合物的立體異構(gòu)混合物。其還包 括混合物或純或基本上純的形式的本文所公開化合物的構(gòu)型異構(gòu)體， 如順式(Z)和反式(E)烯烴異構(gòu)體。
優(yōu)選的本發(fā)明化合物為循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑。如使用實(shí)施例中所 述方法測(cè)定的，某些化合物以大于約20、 50、 75、 100、 150或200 % 抑制循環(huán)淋巴細(xì)胞的量。在這方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)盡管THI能夠減少小鼠 的循環(huán)淋巴細(xì)胞，但是THI的許多類似物和衍生物例如l-(4-甲基 -5-((lS,2R,3R)-l，2,3，4-四羥基丁基)噻唑-2-基)乙酮對(duì)循環(huán)淋巴細(xì)胞有很 少或沒有作用，盡管有相反的報(bào)道。參見WO 97/46543。
不束縛于理論，認(rèn)為本發(fā)明的化合物影響S1P代謝途徑，并且可 以在體內(nèi)直接地或間接地抑制SIP裂解酶。特定的化合物為SIP水平 增強(qiáng)劑。如使用實(shí)施例中如下所述方法測(cè)定的，某些化合物以大于約 10、 15、 20、 25、或30倍增加S1P的量。
本發(fā)明的化合物可以通過本領(lǐng)域已知的方法制備(例如，通過對(duì) Pyne， S.G., ACGC Chem. Res. Comm. 11:108-112(2000); Halweg, K.M.
和Biichi， G.， J.Org.Chem. 50:1134-1136Q985)中所述方法進(jìn)行改變和添 加)?；衔镞€可以通過以下公開的方法及其變體來生產(chǎn)，其對(duì)于本領(lǐng) 域技術(shù)人員來說是顯而易見的。
5.3使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明包括調(diào)節(jié)(例如增加)有需要的患者(例如小鼠、大鼠、狗、 貓或人)中S1P的量的方法，該方法包括對(duì)患者給用有效量的本發(fā)明 的化合物(即本文公開的化合物)。
另一個(gè)實(shí)施方案包括減少患者血液中T細(xì)胞數(shù)目的方法，該方法 包括對(duì)患者給用有效量的本發(fā)明的化合物。
另一個(gè)實(shí)施方案包括治療、應(yīng)對(duì)或預(yù)防受S1P水平影響(或具有 受S1P水平影響的癥狀)的疾病的方法，該方法包括對(duì)有需要的患者 給用治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的化合物。
另一個(gè)實(shí)施方案包括抑制患者的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括對(duì) 患者給用有效量的本發(fā)明的化合物。
另一個(gè)實(shí)施方案包括治療、應(yīng)對(duì)或預(yù)防自身免疫性或炎性疾病或 病癥的方法，該方法包括對(duì)有需要的患者給用治療或預(yù)防有效量的本 發(fā)明的化合物。疾病和病癥的例子包括強(qiáng)直性脊椎炎、哮喘(例如支氣 管哮喘)、特應(yīng)性皮炎、貝赫切特病、移植抗宿主病、川崎綜合征、紅 斑狼瘡、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、花粉癥、牛皮癬、牛皮癬性關(guān)節(jié) 炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病、移植排斥(例如器官、細(xì)胞或骨髓的移 植排斥)、l型糖尿病和葡萄膜炎。
其它的疾病和病癥包括阿狄森氏病、抗磷脂綜合征、自身免疫性 萎縮性胃炎、自身免疫性胃酸缺乏(achlorhydriaautoimmune)、乳糜瀉、 克隆病、庫(kù)欣綜合征、皮肌炎、古德帕斯丘綜合征、格雷夫斯病、橋
本甲狀腺炎、特發(fā)性腎上腺萎縮、特發(fā)性血小板減少、蘭-伊綜合征、 類天皰瘡、尋常天皰瘡、惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、原發(fā)性膽汁性 肝硬變、原發(fā)性硬化性膽管炎、雷諾病、萊特爾綜合征、復(fù)發(fā)性多軟 骨炎、施密特綜合征、舍格倫綜合征、交感性眼炎、高安動(dòng)脈炎、顳 動(dòng)脈炎、甲狀腺毒癥、潰瘍性結(jié)腸炎和韋格納肉芽腫病。
化合物的量、給藥途徑和按劑量給藥方案將根據(jù)各種因素而定， 如待治療、預(yù)防或應(yīng)對(duì)的特定適應(yīng)癥、患者的年齡、性別和狀況。這 些因素所起的作用是本領(lǐng)域公知的，并且可通過常規(guī)試驗(yàn)進(jìn)行調(diào)整。
在特定的實(shí)施方案，對(duì)人患者給用的化合物的量為約0.5、 1、 2.5或5 mpk。
5.4藥物制劑
本發(fā)明包括含本發(fā)明的一種或多種化合物的藥物組合物。某些藥 物組合物是適于對(duì)患者經(jīng)口、粘膜(例如經(jīng)鼻、舌下、陰道、面頰、或 直腸)、非腸道(例如皮下、靜脈內(nèi)、快速濃注、肌內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi))或透皮 給藥的單一單位劑型。劑型的例子包括但是不限于片劑；薄膜衣片 (caplet);膠囊，如軟彈性明膠膠囊；扁囊劑；錠劑(troche);菱形劑； 分散劑；栓劑；膏劑；泥罨劑(泥劑)；糊劑；粉劑；敷料；霜?jiǎng)?；膏藥?溶液劑；貼片；氣霧劑(例如鼻噴入劑或吸入劑)；凝膠劑；適于對(duì)患者 經(jīng)口或粘膜給藥的液體劑型，包括懸浮劑(例如水性或非水性液體懸浮 劑，水包油乳劑，或油包水液體乳劑)，溶液劑，和酏劑；適于對(duì)患者 非腸道給藥的液體劑型；和可重新構(gòu)建以提供適于對(duì)患者非腸道給藥 的液體劑型的無菌固體(例如結(jié)晶或無定形固體)。
制劑應(yīng)該適合給藥方式。例如，口服給藥要求腸溶衣以避免本發(fā) 明化合物在胃腸道內(nèi)被降解。類似地，制劑可含有促進(jìn)活性成分向起 效部位遞送的成分。例如，化合物可以脂質(zhì)體制劑形式給予，目的是 避免它們被降解酶降解，促進(jìn)在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，和實(shí)現(xiàn)穿過細(xì)胞 膜到達(dá)胞內(nèi)部位的遞送。
類似地，可在增溶劑、乳化劑、表面活性劑和無水溶劑的幫助下 將難溶性化合物并入液體劑型(和適合于重構(gòu)的劑型)，增溶劑、乳化劑 和表面活性劑例如但不限于環(huán)糊精(例如，a-環(huán)糊精、/ -環(huán)糊精、 Captisol 、禾Q EncapsinTM(參見，例如，Davis禾卩Brewster, 2004, Nat. Rev. Drug Disc. 3:1023-1034)、 Labrasol 、 Labrafil 、 Labrafac 、 cremafor， 無水溶劑例如但不限于乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲 醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜 (DMSO)、生物相容性油(例如，棉籽油、花生油、玉米油、胚油、橄 欖油、蓖麻油、和芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇、脫水山梨糖 醇的脂肪酸酯、及其混合物(例如，DMSO:玉米油)。
可以使用本領(lǐng)域公知的其它技術(shù)將難溶性化合物并入懸浮液中。 例如，可以將化合物的納米顆粒懸浮在液體中，以提供納米懸浮液(參 見，例如，Rabinow, 2004, Nature Rev. Drug Disc. 3:785-796)。本文中所 述的化合物的納米顆粒形式可以通過美國(guó)專利公開2004-0164194、 2004-0195413、 2004-0251332、 2005-0042177 Al、 2005-0031691 Al、 和美國(guó)專利5,145,684、 5,510,118、 5,518,187、 5,534,270、 5,543,133、 5,662,883、 5,665,331、 5,718,388、 5,718,919、 5,834,025、 5,862,999、 6，431，478、 6,742,734、 6,745,962中所述的方法制備，其每篇文獻(xiàn)都被 全文并入本文作為參考。在一個(gè)實(shí)施方案中，納米顆粒形式包括平均 粒徑小于約2000 nm、小于約1000 nm、或小于約500 nm的顆粒。
劑型的組成、形狀和類型將根據(jù)其用途而定。例如，在緊急治療 疾病中使用的劑型，與在該疾病的長(zhǎng)期治療中使用的劑型相比，可含 有更大量的一種或多種活性成分。同樣地，非腸道劑型，與治療該疾 病所使用的口服劑型相比，可包含更少量的一種或多種活性成分。本 發(fā)明所包括的特定劑型彼此有差異的這些和其它方式對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù) 人員是顯而易見的。例如參見，Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing, Easton PA(1990)。
5.4.1 口服劑型
適于口服給藥的本發(fā)明的藥物組合物的存在形式可以是離散劑 型，諸如但不限于片劑(例如咀嚼片)、薄膜衣片、膠囊、和液體劑(例 如調(diào)味糖漿劑)。這些劑型含有預(yù)定量的活性成分，并且可通過本領(lǐng)域
技術(shù)人員公知的藥學(xué)方法制備。例如參見，Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.， Mack Publishing, Eastern PA(1990)。
典型的口服劑型通過將活性成分與至少一種賦形劑根據(jù)常規(guī)的制 藥技術(shù)密切混合制備。賦形劑根據(jù)用于給藥所需的制劑形式的不同可 采取不同形式。
因?yàn)槠瑒┖湍z囊的易于給用，它們代表了最有利的口服劑量單位 形式。如果需要，可通過標(biāo)準(zhǔn)的水性或非水性技術(shù)對(duì)片劑包衣。這些 劑型可通過常規(guī)的制藥方法制備。通常，藥物組合物和劑型可通過使 活性成分均一地和密切地與液體載體、細(xì)粉形式的固體載體、或兩者 結(jié)合，然后如有必要使產(chǎn)品成形為所需形式而制備?？蓪⒈澜鈩┙Y(jié)合 進(jìn)固體劑型內(nèi)以促進(jìn)迅速的溶出。還可結(jié)合潤(rùn)滑劑以促進(jìn)劑型(例如片 劑)的生產(chǎn)。
5.4.2非腸道劑型
非腸道劑型可通過各種途徑對(duì)患者給藥，所述途徑包括但不限于 皮下、靜脈內(nèi)(包括快速濃注)、肌內(nèi)和動(dòng)脈內(nèi)途徑。因?yàn)榉悄c道劑 型的給藥通常繞過患者對(duì)抗外來物質(zhì)的天然屏障，因此非腸道劑型特 別是無菌的或能夠在對(duì)患者給用之前進(jìn)行滅菌處理。非腸道劑型的例 子包括但是不限于準(zhǔn)備好用于注射劑的溶液劑、準(zhǔn)備溶解在或懸浮在 注射用的可藥用媒介物中的干燥產(chǎn)品、準(zhǔn)備好用于注射的懸浮劑、和 乳劑。
可用于獲得本發(fā)明的非腸道劑型的適當(dāng)?shù)拿浇槲锸潜绢I(lǐng)域技術(shù)人
員公知的。例子包括但是不限于USP注射用水；水性媒介物，諸如
但不限于氯化鈉注射液、林格注射液(Ringer's Injection)、葡萄糖注射 液、葡萄糖和氯化鈉注射液、以及乳酸化林格注射液；可與水混溶的 媒介物，諸如但不限于乙醇、聚乙二醇、和聚丙二醇；以及非水性媒 介物，諸如但不限于玉米油、棉子油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、 肉豆蔻酸異丙酯、和苯甲酸芐酯。
5.4.3透皮、局部和經(jīng)粘膜劑型
透皮、局部和經(jīng)粘膜劑型包括但不限于眼用溶液劑、噴霧劑、氣 霧劑、霜?jiǎng)?、洗液、膏劑、凝膠劑、溶液劑、乳劑、懸浮劑，或本領(lǐng) 域技術(shù)人員公知的其它形式。例如參見，Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th禾P 18th eds.， Mack Publishing, Easton PA(1980 & 1990); 禾口 Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms,她ed., Lea & Febiger, Philadelphia(1985)。透皮劑型包括"儲(chǔ)庫(kù)型"或"基質(zhì)型"貼片，起可施用 于皮膚并佩戴特定時(shí)間，從而可滲透釋放希望量的活性成分。
可用于獲得透皮、局部和經(jīng)粘膜劑型的適當(dāng)?shù)馁x形劑(例如載體和 稀釋劑)和其它材料是制藥領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且根據(jù)所給出的藥
物組合物或劑型要施用的特定組織的不同而不同。
根據(jù)待治療的特定組織的不同，可在使用本發(fā)明的活性成分治療 之前、同時(shí)、或之后使用其它組分。例如，可使用滲透增強(qiáng)劑來幫助 遞送活性成分到組織。
還可調(diào)節(jié)藥物組合物或劑型的pH，或藥物組合物或劑型所施用組 織的pH以改善一種或多種活性成分的遞送。同樣地，可調(diào)節(jié)溶劑載體 的極性、其離子強(qiáng)度、或張力以改善遞送。還可向藥物組合物或劑型 中添加化合物如硬脂酸鹽，從而有利地改變一種或多種活性成分的親 水性或親油性以便改善遞送。在這點(diǎn)上，硬脂酸鹽可作用制劑的脂質(zhì) 媒介物，作為乳化劑或表面活性劑，并且作為遞送增強(qiáng)劑或滲透增強(qiáng)
劑?？墒褂没钚猿煞值牟煌柠}、水合物或溶劑合物形式以進(jìn)一步調(diào) 節(jié)得到的組合物的性質(zhì)。
6.實(shí)施例
可從以下實(shí)施例了解本發(fā)明的各方面，其對(duì)本發(fā)明的范圍不構(gòu)成 限制。
6.1 S1P裂解酶基因被破壞的小鼠
基因捕獲是使用編碼報(bào)告基因或選擇性標(biāo)記基因的DNA片段作
為誘變劑的隨機(jī)插入誘變方法?；虿东@載體已經(jīng)被設(shè)計(jì)成能以允許
細(xì)胞剪接工具將載體編碼的外顯子剪接到細(xì)胞mRNA的方式結(jié)合到內(nèi) 含子或外顯子中?；虿东@載體一般地在選擇性標(biāo)記序列前面包含強(qiáng) 的剪接受體序列，并且前面包含啟動(dòng)子。因此，在這種載體整合到基 因中時(shí)，細(xì)胞的剪接工具將捕獲基因的外顯子剪接到選擇性標(biāo)記序列 的5'末端。 一般地，這種選擇性標(biāo)記基因只有在編碼該基因的載體整合 到內(nèi)含子中才會(huì)得到表達(dá)。產(chǎn)生的基因捕獲事件隨后通過選擇可以在 經(jīng)歷選擇性培養(yǎng)之后幸存的細(xì)胞而得到識(shí)別。
通過包括將遺傳基因改造的載體序列的至少一部分插入到SP1裂 解酶基因中的方法使胚胎干細(xì)胞(衍生自鼠科品系A(chǔ)129)突變。然后將 突變的胚胎干細(xì)胞顯微注射到胚泡中，然后將其引入到假妊娠的雌性 宿主中并且使用確定的方法攜帶到期。在這種情況下，病毒被插入在 外顯子1和2之間，并且破壞SP1裂解酶基因。隨后使得到的嵌合動(dòng) 物繁殖，以產(chǎn)生后代，所述后代能夠種系傳遞包含SP1裂解酶基因中 的基因改造的突變的等位基因。
可用于破壞可能已經(jīng)有被破壞的基因的細(xì)胞(特別是ES細(xì)胞)中的 基因的技術(shù)公開在美國(guó)專利6,136,566; 6,139,833禾P 6,207,371和美國(guó) 專利申請(qǐng)08/728,963中，上述每篇文獻(xiàn)都作為參考以全文并入本文。
6.2 S1P裂解酶基因破壞的血液學(xué)影響
通過眶后放血收集全血并且置于包含EDTA的毛細(xì)血管血液收集 管中。使用Cell-Dyn 3500R分析儀(AbbottDiagnostics)分析血液。所述 分析儀采用雙重的技術(shù)以提供白細(xì)胞(WBC)五分類鑒定的基礎(chǔ)。多角度 偏振光散射分類法(Multi-Angle Polarized Scatter Separation, M.A.P.S.S.)
提供了主要的白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類信息，而阻抗提供在易碎的淋巴細(xì)胞 和低滲耐受性紅細(xì)胞的存在下的附加信息。
使用蠕動(dòng)泵將約135微升的全血吸出到分析儀中。用Cell-Dyn 3500R System(Abbott， IL)采用四種獨(dú)立的測(cè)量技術(shù)來得到血液學(xué)參數(shù)。 在光流通道中測(cè)量WBC關(guān)學(xué)(WOC)和WBC分類數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)WBC亞 群(嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、和嗜堿性粒 細(xì)胞)的WBC五分類鑒定。在一個(gè)電阻抗通道中測(cè)量WBC電阻計(jì)數(shù) (WIC)。在第二電阻抗通道中測(cè)量RBC和血小板數(shù)據(jù)。在分光光度計(jì) 通道中測(cè)量血紅蛋白。將樣品吸出，稀釋，混合，并且在每個(gè)裝置周 期過程中得到對(duì)每個(gè)參數(shù)的測(cè)量值。得到的最終的血液學(xué)分析參數(shù)是 白細(xì)胞計(jì)數(shù)、嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、 嗜堿性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、血細(xì)胞比容、血小板、紅細(xì)胞分 布寬度、平均紅細(xì)胞容積、和平均血小板容積。
從總共16只小鼠得到血液樣本。對(duì)從七只野生型小鼠、六只雜合 小鼠和三只純合小鼠得到的血液樣本進(jìn)行分析和比較。在平均紅細(xì)胞 (RBC)計(jì)數(shù)、血紅蛋白水平、平均紅細(xì)胞容積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白量、 平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度、血小板計(jì)數(shù)或平均血小板容積方面，不同 組的小鼠之間沒有顯著的與基因型相關(guān)的區(qū)別。在血細(xì)胞比容和紅細(xì) 胞分布寬度方面有區(qū)別。純合(-A)小鼠的平均血細(xì)胞比容為37±2.56%， 而在雜合(+/-)小鼠中為40.9±4%，和在野生型(+/+)小鼠中為44.7±2.7 %。純合(-/-)小鼠的紅細(xì)胞分布寬度為25.2±4.2%，而在雜合(+/-)小鼠 中為17.6±1.9%，和在野生型(+/+)小鼠中為17.2±2%。同樣地，SP1裂解酶缺乏小鼠在總白細(xì)胞計(jì)數(shù)方面與雜合小鼠或 野生型小鼠相比沒有顯著差異。純合(-/-)小鼠的總白細(xì)胞計(jì)數(shù)為7200 ±700細(xì)胞/pl。雜合(+/-)小鼠的總白細(xì)胞計(jì)數(shù)為6200±1800細(xì)胞/fil，和 野生型(+/+)小鼠的總白細(xì)胞計(jì)數(shù)為7200±2600細(xì)胞/|11。
在用于破壞SP1裂解酶的純合小鼠中，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，而嗜 中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、和嗜堿性粒細(xì)胞增加。用于 破壞SP1裂解酶基因的純合小鼠(-/-)的血液淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)大幅降低。純 合(-/-)小鼠的平均淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)為847±139細(xì)胞/^il，在雜合(+/-)小鼠 中，平均淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)為4582土2364細(xì)胞/pl，與野生型(+/+)小鼠的平 均淋巴細(xì)胞金屬為6126±2151細(xì)胞/pl形成對(duì)比。
相比之下，純合(-/-)小鼠中的平均中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)為5020±612 細(xì)胞 1，而在雜合(+A)小鼠中，平均中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)為1380土1140細(xì) 胞/pl，和在野生型(+/+)小鼠中的平均中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)為886士479細(xì)胞 /ji1。同樣地，純合(-A)小鼠中的平均單核細(xì)胞計(jì)數(shù)為950±218細(xì)胞~1， 而在雜合(+/-)小鼠中，平均單核細(xì)胞計(jì)數(shù)為250士108細(xì)胞/pl，和在野 生型(+/+)小鼠中，平均單核細(xì)胞計(jì)數(shù)只有146±92細(xì)胞/pl。同樣地， 純合(-/-)小鼠中的平均嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)為247±297細(xì)胞/|^1，而在雜 合(+/-)小鼠中，平均嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)為8±8細(xì)胞/(11，和在野生型(+/+) 小鼠中，平均嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)只有14±21細(xì)胞 1。
嗜堿性粒細(xì)胞的情況也是一樣的。純合(-A)小鼠中的平均嗜堿性粒 細(xì)胞計(jì)數(shù)為130±90細(xì)胞 1，而在雜合(+/-)小鼠中，平均嗜堿性粒細(xì) 胞計(jì)數(shù)為7土5細(xì)胞/pl，和在野生型(+/+)小鼠中，平均嗜堿性粒細(xì)胞計(jì) 數(shù)只有16±11細(xì)胞/pl。
同樣地，純合(-/-)小鼠中的平均單核細(xì)胞計(jì)數(shù)為950±218細(xì)胞&1， 而在雜合(+/-)小鼠中，平均單核細(xì)胞計(jì)數(shù)為250士108細(xì)胞/pl，和在野 生型(+/+)小鼠中，平均單核細(xì)胞計(jì)數(shù)只有146±92細(xì)胞 1。酸性粒細(xì)胞的情況也是一樣，純合(-/-)小鼠中的平均嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)為247± 297細(xì)胞 1，而在雜合(+A)小鼠中，平均嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)為8±8細(xì) 胞/pl，和在野生型(+/+)小鼠中，平均嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)只有14±21細(xì)
6.3 (E/Z)-l-(4-((lR,2S，3R)-l，2，3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)陽(yáng)乙
酮肟的合成
將l-[4-((lR,2S,3R)-l,2,3，4-四羥基-丁基)-lH-咪唑-2-基]-乙酮 (THI，根據(jù)Halweg, K.M.和Biichi， G.， J.Org.Chem. 50:1134-1136(1985) 制備)(350 mg, 1.52 mmol)懸浮在水(10 ml)中。加入羥胺鹽酸鹽(126.8 mg, 1.82 mmol， 1.2叫.)禾卩乙酸鈉(247.3 mg， 3.04 mmol. 2叫.)，并將懸浮 液在5(TC攪拌。反應(yīng)混合物在約4小時(shí)之后變?yōu)槌吻濉＠^續(xù)在5(TC攪 拌16小時(shí)。LCMS分析顯示形成了產(chǎn)物并且起始材料消失。使反應(yīng)混 合物回到室溫并且通過細(xì)孔過濾器。溶液直接用于通過使用制備性 HPLC純化產(chǎn)物Atlantis HILIC 二氧化硅柱30 x 100mm;在6分鐘內(nèi) 為含2%-21%水的乙腈；45ml/分鐘；在254nm檢測(cè)。將產(chǎn)物級(jí)分收集 并且將乙腈減壓蒸發(fā)。將水溶液凍干，得到產(chǎn)物，為約3:1的反式:順 式異構(gòu)體的混合物，為白色固體284mg(77%)。
LCMS: Sunfire C-18柱，4.6x50mm;在5分鐘內(nèi)為含0—17% MeOH(0.1% TFA)的水(0.1。/0 TFA);流速=3 ml/分鐘；檢觀ij 220nm; 保留時(shí)間0.56分鐘(順式異構(gòu)體，246.0(M+l))和0.69分鐘(反式異構(gòu) 體，246.0(M+1))。 NMR(D20禾卩DC1)S 2.15和2.22(單峰，3H)， 3.5-3.72(m, 4H), 4.76(br， OH質(zhì)子和H20)， 4.95和4.97(單峰，1H)， 7.17 和7.25(單峰，1H)。 13C NMR(D20和DC1)S 10.80， 16.76， 63.06， 64.59，
64.75, 70.86， 72.75, 72.85， 117.22, 117.64， 135.32， 138.39， 141.35， 144.12。
6.4 (E)-l-(4-((lR，2S，3R)-l，2,3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮
月虧的合成
如以下所示，分兩個(gè)步驟制備這個(gè)化合物
首先，向裝有THI(21.20 mmol， 4.88g)的燒瓶中加入水(25 ml)和1N 鹽酸(21.2 ml, 21.2 mmol)。在所有固體溶解之后，加入三苯甲基羥胺 (25.44 mmol, 7.00 g)的二氧雜環(huán)己烷(55 ml)溶液并將反應(yīng)在50。C保持4 小時(shí)。在完成時(shí)，使反應(yīng)冷卻到室溫并且通過加入1NNaOH水溶液調(diào) 節(jié)溶液到pH-7。然后將中和的溶液濃縮為塑性物質(zhì)，將其通過硅膠上 的快速色譜法純化[含10% MeOH/1% NH4OH(5重量％的水溶液)的 DCM]，得到三苯甲基醚，為透明的塑性物質(zhì)。用己烷處理該塑性物質(zhì) 并且濃縮，得到白色泡沫，其可以在真空下干燥為薄片狀固體(10.00g， 97%收率)。
然后，向劇烈攪拌的三苯甲基肟-醚(4.8g， 10mmol)的二氧雜環(huán)己 烷(90 ml)室溫溶液中加入HC1的二氧雜環(huán)己烷溶液(4M, 60 ml)。在幾 分鐘之后，觀察到白色沉淀，并且繼續(xù)攪拌直到總共30分鐘，然后過 濾通過燒結(jié)玻璃過濾器并且用二氧雜環(huán)己烷和乙醚漂洗濾餅。將濾餅 再溶解在水(200 ml)中，聲處理5分鐘，然后冷卻到0。C，用硅藻土(5 g)<formula>formula see original document page 42</formula>
二氧雜環(huán)己烷
HQ, ,OH 處理，并且過濾通過燒結(jié)玻璃過濾器。將水溶液濃縮到干，然后從甲
醇(30ml)/二乙基醚(60ml)分離，得到E-肟，為分析純的白色粉末(3.8 g， 80%收率)。
6.5 (E/Z)-l-(4-((lR,2S，3R)-l,2，3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙
酮O-甲基肟的合成
<formula>formula see original document page 43</formula>
標(biāo)題化合物如上實(shí)施例6.3中所述制備，使用甲氧基胺鹽酸鹽代 替羥胺鹽酸鹽，以74%收率得到。產(chǎn)物為白色蓬松固體。
LCMS: Sunfire C-18柱，4.6x50mm;在5分鐘內(nèi)含0-17% MeOH(0.1% TFA)的水(0.10/。 TFA);流速=3 ml/分鐘；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm; 保留時(shí)間1.59分鐘(順式異構(gòu)體，260.1(M+l))和1.73分鐘(反式異構(gòu) 體，260.1(M+1))。 ^NMR(D20)S 2.18和2.22(單峰，3H), 3.54—3.60(m, 1H), 3.66—3.79(m， 3H)， 3.94和3.95(單峰，3H)， 4.76(br， OH質(zhì)子和H20)， 4.93和4.97(單峰，1H)， 7.17和7.25(單峰，1H)。 13C NMR(D20)S 11.55, 17.56, 62.32, 62.38， 62.99， 63.07， 67.09, 71.54, 73.86, 119.09， 138.64， 139.79， 142.95, 144.98， 148.97。
6.6 l-(5-甲基-4-((lR,2S,3R)-l，2,3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙
酮的合成
使用方法以下所示的方法，以七個(gè)步驟制備標(biāo)題化合物。
<formula>formula see original document page 44</formula>
4-甲基咪唑-l-二甲基氨基磺酰胺(2):向4-甲基咪唑1(3.00 g, 36.54 mmol)的甲苯(200 ml)室溫溶液中連續(xù)地加入三乙胺(5.6 ml， 40.20 mmol)和N,N-二甲基氨基磺酰氯(3.9 ml， 36.54 mmol)。將反應(yīng)容器在5 "C冷凍器中儲(chǔ)存48小時(shí)，然后從反應(yīng)濾出固體并將溶液濃縮，得到區(qū) 域異構(gòu)體2和2a的2.5:1的混合物。粗產(chǎn)物通過硅膠上的快速色譜法 純化(80-100%乙酸乙酯:己垸洗脫劑)，得到區(qū)域異構(gòu)體2:2a的5.5:1 混合物(4.31 g, 62%收率)M+l=190.1。
4-甲基-2-乙?；溥?l-二甲基氨基磺酰胺(3):向-78。C的咪唑 2(1.99 g， 10.54 mmol)的四氫呋喃(70 ml)溶液中緩慢加入正丁基鋰的己 烷溶液(2.5M, 11.60 ml)。在40分鐘之后，向冷卻的溶液中滴加N-甲 氧基-N-甲基乙酰胺(1.30 g, 12.65 mmol)。使反應(yīng)回溫到室溫并且保持2
小時(shí)。在完成之后，通過加入飽和NH4C1水溶液(20 ml)將反應(yīng)猝滅， 然后用水(20ml)稀釋。將各層分開，并將有機(jī)層用乙酸乙酯洗滌(2X30 ml)。合并的有機(jī)物用鹽水洗滌(20ml)，然后用MgS04干燥并且濃縮。 粗產(chǎn)物通過二氧化硅上的快速色譜法純化(60-80%乙酸乙酯:己垸洗脫 劑)，得到3，為油狀物(1.85g, 76%收率)M+l=232.1。
4_甲基_2_(1_(三異丙基甲硅垸氧基)乙烯基)_1_二甲基氨基磺酰胺 (4):向咪唑3(1.65 g， 7.14 mmol)的二氯甲垸(45ml)溶液連續(xù)地加入三 乙胺(l.OO ml， 14.28 mmol)和三異丙基甲硅烷基三氟甲垸磺酸酯(2.12 ml， 7.86 mmol)。將反應(yīng)在室溫保持20小時(shí)，然后通過加入NaHC03 飽和水溶液(20 ml)猝滅。將混合物用水(20 ml)稀釋并將各層分開。水 層用二氯甲垸洗滌(2x20 ml)并將合并的有機(jī)物用鹽水溶液(20 ml)洗 滌，然后用MgS04干燥并且濃縮。得到的油狀物通過硅膠上的快速色 譜法純化(1-2%甲醇:二氯甲烷洗脫劑)，得到甲硅垸基烯醇醚4，為橙 色油狀物(2.26 g， 83%收率)M+l=388.2。
鄰位羥基內(nèi)醚(5):向-78。C的咪唑4(2.26 g， 5.84 mmol)的四氫呋喃 (40 ml)溶液緩慢加入正丁基鋰的己垸溶液(2.5M， 3.27 ml)。在30分鐘 之后，向所述-78。C溶液緩慢加入(-)-2,3-0-亞異丙基-D-赤酮酸內(nèi)酯 (1.66 g， 10.51 mmol)的四氫呋喃(10 ml)溶液。將反應(yīng)在-78'C保持2小 時(shí)，然后回溫到0'C，之后通過加入NH4Cl飽和水溶液(20ml)將反應(yīng)猝 滅?；旌衔镉盟?10ml)稀釋并將各層分開。有機(jī)物用乙酸乙酯洗滌(2x20 ml)并將合并的有機(jī)物用鹽水(20 ml)洗滌，然后用MgS04干燥并且濃 縮。粗產(chǎn)物在硅膠上純化(30-50%乙酸乙酯:己烷洗脫劑)，得到鄰位羥 基內(nèi)醚5(2.69 g， 85%收率)，為白色泡沫狀物M+l=546.4。
二醇(6):將NaBH4顆粒(1.4g， 38.32 mmol)分為幾個(gè)部分加入到0 。C的鄰位羥基內(nèi)醚5(2.09 g, 3.83 mmol)在乙醇(70 ml)的溶液中。在2小 時(shí)之后，使反應(yīng)回溫到室溫，維持30分鐘，然后濃縮。將殘余物再溶 解在水(40ml)和乙酸乙酯(40ml)中。將兩相混合物劇烈攪拌10分鐘，
然后將各層分開。水層用乙酸乙酯洗滌(2 x 40 ml)并將合并的有機(jī)物 用鹽水(30ml)洗滌，然后用MgS04干燥并且濃縮。粗的泡沫狀物通過 二氧化硅上的快速色譜法純化(5%甲醇:二氯甲垸洗脫劑)，得到二醇 6(1.88g, 90%收率)，為不可分離的3:1的芐位非對(duì)映體混合物。 M+l=547.4。
咪唑(7):將氟化銫(315 mg， 2.08 mmol)加入到咪唑6(567 mg, 1.04 mmol)的乙醇(10ml)溶液中并且溫?zé)岬?5°C。在1小時(shí)之后，將反應(yīng)冷 卻到室溫并且用NH4C1飽和溶液(1 ml)處理，然后濃縮。粗產(chǎn)物通過硅 膠上的快速色譜法純化(5%甲醇:二氯甲烷洗脫劑)，得到咪唑7(380 mg, 94%收率)，為白色泡沬狀物M+l=392.1。
最終產(chǎn)物(8):將被保護(hù)的咪唑7(380 mg, 0.97 mmol)溶解于丙酮(6 ml)并且連續(xù)地用水(6 ml)和濃鹽酸(3 ml)處理。將反應(yīng)容器溫?zé)岬?4(TC，保持45分鐘，然后冷卻到室溫并且濃縮。粗的物質(zhì)通過反相制 備色譜法純化，使用150mmX30 mm的Zorbax C-6柱，根據(jù)以下方法 使用未緩沖的溶劑1%乙腈:水等濃度運(yùn)行5分鐘(T^1.52分鐘)。 在凍干之后，得到化合物8，為無定形固體的二甲基氨基磺酸鹽 M+l=245.1; !H NMR(400 MHz, CDCl3)主要的S 5.04(d, 1H)， 3.62(復(fù)雜 的多重峰，2H)， 3.42(復(fù)雜的多重峰，2H)， 2.62(s， 6H), 2.43(s, 3H), 2.21(s， 3H);次要的S 5.01(d, 1H)， 3.79(復(fù)雜的多重峰，2H), 3.55(復(fù)雜的多重峰， 2H)， 2.62(s， 6H), 2.43(s, 3H), 2.21(s， 3H)。
6.7 (111，23,311)-1-(2-(1-亞聯(lián)氨基乙基)-111-咪唑-4-基)丁垸-1，2,3，4-
四醇的合成
<formula>formula see original document page 46</formula> 將l-[4-((lR，2S，3R)-l,2,3,4-四羥基-丁基)-lH-咪唑-2-基]-乙酮 (THI，根據(jù)Halweg, K.M.和Btichi, G.， J. Org. Chem. 50:1134-1136(1985) 制備)(148 mg, 0.64 mmol)懸浮在甲醇(3 ml)和水(l ml)中。加入水合肼 (35mg，0.7mmo1, 1.2叫.)和乙酸(一滴)并將懸浮液在5(TC攪拌6小時(shí)。 LCMS分析顯示形成了產(chǎn)物并且起始材料消失。將反應(yīng)混合物冷卻到室 溫并且用四氫呋喃稀釋。將得到的白色沉淀物收集并且用四氫呋喃洗 滌，得到產(chǎn)物，為約3:1 E:Z異構(gòu)體的混合物，為白色固體卯mg(58。/。)。
LCMS: Zorbax C-8柱，4.6X150mm;在6分鐘內(nèi)，在水中含 10-90%(10 mM乙酸銨)；流速=2 ml/分鐘；檢測(cè)波長(zhǎng)220nm;保留時(shí) 間0.576分鐘(順式異構(gòu)體，245.0(M+l))和1.08分鐘(反式異構(gòu)體， 245.0(M+1))。 NMR(DMSO-d6)S 2.5(單峰，3H，在DMSO下)， 3.4—3.7(m, 4H)， 4.3(m, 2H)， 4.6(m， 2H), 4.8(m， 1H), 4.9禾卩5.0(雙峰，1H)， 7.04和7.21(單峰，1H)。
6.8 N'-( 1 -(4-(( 1 R，2S,3R)-1 ，2,3,4-四羥基丁基)-1H-咪唑-2-基)亞乙
基)乙酰肼的合成
將l-[4-((lR，2S,3R)-l,2,3，4-四羥基-丁基)-lH-咪唑-2-基]-乙酮(160 mg, 0.70 mmol)懸浮在甲醇(3 ml)和水(l ml)中。加入乙酰肼(56 mg， 0.75 mmol, 1.2叫.)和鹽酸(一滴，12N)并將懸浮液在5(TC攪拌48小時(shí)。 LCMS分析顯示形成了產(chǎn)物并且起始材料消失。將反應(yīng)混合物冷卻到室 溫并且用四氫呋喃稀釋。將得到的白色沉淀物收集并且用四氫呋喃洗 滌，得到產(chǎn)物，為約3:1的E:Z異構(gòu)體的混合物，為白色固體129 mg(65%)。
OH OH
LCMS: Sunfire C-18柱，4.6x50mm;在2.5分鐘內(nèi)，在水中含2 -20%(10mM乙酸銨)；流速-3.5ml/分鐘；檢測(cè)波長(zhǎng)220nm;保留時(shí) 間0.53分鐘(287.1(M+1))。 ^NMR(DMS0-d6)S 2.2(單峰，3H)， 2.5(單 峰，3H在DMSO下)，3.4-3.7(m, 4H)， 4.3(br, 2H), 4.6-5.0(br, 4H)， 7.0(br， 1H)， 10.30禾P 10.37(單峰，1H)。
6.9 (E)-4-甲基-N'-(l-(4-((lR,2S,3R)-l，2,3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑
-2-基)亞乙基)苯磺酰肼的合成 OH OH
HN^N OH
將l-[4-((lR，2S,3R)-l,2,3，4-四羥基-丁基)-lH-咪唑-2-基]-乙酮(153 mg， 0.67 mmol)懸浮在甲醇(3 ml)和水(l ml)中。加入對(duì)甲苯磺酰肼(140 mg， 0.75 mmol， 1.2 eq.)和鹽酸(一滴，12 N)并將懸浮液在5(TC攪拌24 小時(shí)。LCMS分析顯示形成了產(chǎn)物并且起始材料消失。將反應(yīng)混合物冷 卻到室溫并且干法加載在硅膠上。經(jīng)過硅膠上的快速色譜法(10g Si02, 4:1乙酸乙酯:甲醇)，得到產(chǎn)物，為約85:15的E:Z異構(gòu)體的混合物， 為白色固體142mg(53%)。
LCMS: Sunfire C-18柱，4.6x50mm;在2.5分鐘內(nèi)，在水中含 10-90%(10mM乙酸銨)；流速-3.5ml/分鐘；檢測(cè)波長(zhǎng)220nm;保留時(shí) 間0.50分鐘(399.2(M+1))和0.66分鐘(399.3(M+1))。 !H NMR(甲醇 -d4)5 2.2(單峰，3H), 2.41禾卩2.45(單峰，3H)， 3.6—3.85(m, 4H)， 4.99禾口 5.05(單峰，1H), 7.09(br s， 1H)， 7.39(d, 2H， j=8 Hz), 7.77和7.87(d, 2H， j=8 Hz)。 6.10 N'-(l-(4-((lR，2S,3R)-l，2,3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)亞乙
基)苯甲酰肼的合成 OH
1入/OH
將l-[4-((lR，2S，3R)-l,2，3，4-四羥基-丁基)-lH-咪唑-2-基]-乙酮(150 mg， 0.65 mmol)懸浮在甲醇(3 ml)和水(l ml)中。加入苯甲酰肼(102 mg, 0.75 mmol, 1.2 eq.)和鹽酸(一滴，12N)并將懸浮液在50。C攪拌18小時(shí)。 LCMS分析顯示形成了產(chǎn)物并且起始材料消失。將均相反應(yīng)混合物冷卻 到室溫并且真空濃縮。C-18反相SPE(10g AlltechHi-loadC18，梯度為 從水到20%甲醇/水)，得到產(chǎn)物，為約1:1的E:Z異構(gòu)體的混合物，為 無色固體193mg(85%)。
LCMS: Sunfire C-18柱，4.6x50mm;在2.5分鐘內(nèi)，在水中含 10-90%(10 mM乙酸銨)；流速=3.5 ml/分鐘；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm;保留 時(shí)間0.49分鐘(349.2(M+1))。 'H NMR(甲醇-d4)S 2.2(單峰，3H)， 2.42 和2.45(單峰，3H), 3.6-3.85(m, 4H), 5.11和5.14(單峰，1H)， 7.30(br s， 1H) 7.40-7.7(m， 4H)， 7.80和7.95(m， 2H)， 8.1(br s， 1H)。
6.11(E)-2-(l-(4-((lR，2S,3R)-l，2,3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)亞
乙基)肼甲酸乙酯的合成
將l-[4-((lR，2S，3R)-l,2,3,4-四羥基-丁基)-lH-咪唑-2-基]-乙酮(150 mg， 0.65 mmol)懸浮在甲醇(3 ml)和水(l ml)中。加入肼基甲酸乙酯(78 mg, 0.75 mmol, 1.2 eq.)和鹽酸(一滴，12 N)并將懸浮液在50。C攪拌18 小時(shí)。LCMS分析顯示形成了產(chǎn)物并且起始材料消失。反應(yīng)混合物冷卻 到使室溫，真空濃縮并且用丙酮稀釋。將得到的白色沉淀物收集并且 用丙酮洗滌，得到產(chǎn)物，為一種表觀異構(gòu)體，為白色固體96mg(47%)。
LCMS: Sunfire C-18柱，4.6x50mm;在2.5分鐘內(nèi)，在水中含2 -20%(10mM乙酸銨)；流速-3.5ml/分鐘；檢測(cè)波長(zhǎng)220nm;保留時(shí) 間0.25分鐘(317.35(M+1))。
NMR(甲醇-d4)S 1.36(t, 3H, j=8 Hz)， 2.28(s， 3H)， 2.42和2.45(單峰，3H)， 3.60—3.85(m, 4H)， 4.34(dd, 2H， j=8 Hz), 5.08(s， 1H)， 7.27(s， 1H)。
6.12 (E)-N'-(l-(4-((lR，2S，3R)-l，2,3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)
亞乙基)煙酰肼的合成 OH Q)H
HN、》N OH
將l-[4-((lR,2S，3R)-l,2,3，4-四羥基-丁基)-lH-咪唑-2-基]-乙酮(215<formula>formula see original document page 50</formula>
mg, 0.93 mmol)懸浮在甲醇(3 ml)和水(l ml)中。加入煙酰肼(137 mg， 1.0 mmol， 1.1 eq.)和鹽酸(一滴，12 N)并在50。C攪拌48小時(shí)。LCMS分 析顯示形成了產(chǎn)物并且起始材料消失。將反應(yīng)混合物冷卻到室溫，并 且部分地真空濃縮。將得到的白色沉淀物收集并且用水洗滌，得到產(chǎn) 物，為一種表觀異構(gòu)體，為白色固體311mg(95%)。
LCMS: Sunfire C-18柱，4.6x50mm;在2.5分鐘內(nèi)，在水中含 10-90%(10mM乙酸銨)；流速二3.5ml/分鐘；檢測(cè)波長(zhǎng)220nm;保留時(shí) 間0.22分鐘(350.27(M+1)) 。 & NMR(DMSO-d6)S 2.37(s， 3H)， 3.60—3.85(m, 4H), 4.40(m, 2H)， 4.71(m, 1H)， 5.01(m， 2H)， 5.16(m， IH)， 7.25(br， 1H), 7.64(br， 1H)。 8.35(br， 1H)。 8.80(br， 1H)。 9.14(br, IH)。
6.13 3-氯-N'-(l-(4-((lR,2S，3R)-l,2，3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)
亞乙基)苯甲酰肼的合成
將l-[4-((lR，2S，3R)-l，2,3，4-四羥基-丁基)-lH-咪唑-2-基]-乙酮(194 mg， 0.84mmol)懸浮在乙醇(4ml)和水(1 ml)中。加入3-氯苯甲酰肼(170 mg, l.Ommol, 1.2 eq.)和鹽酸(一滴，12 N)并在5(TC攪拌48小時(shí)。LCMS 分析顯示形成了產(chǎn)物并且起始材料消失。將反應(yīng)混合物冷卻到室溫， 并且部分地真空濃縮。將得到的白色沉淀物收集并且用乙醇洗滌，得 到產(chǎn)物，為 3:1的E:Z混合物，為白色固體108mg(33%)。
LCMS: Sunfire C-18柱，4.6x50mm;在2.5分鐘內(nèi)，在水中含 10-90%(10mM乙酸銨)；流速二3.5ml/分鐘；檢測(cè)波長(zhǎng)220nm;保留時(shí)
間:0.63分鐘(383.23(M+1)) 。 NMR(甲醇-d4)S 2.44(s， 3H), 3.60—3.90(m， 4H), 5.12(s， 1H)， 7.29(s， 1H)， 7.65(m， 2H)， 8.04(m, 2H)。
6.14 (E)-4-氟-N'-(l-(4-((lR，2S，3R)-l，2,3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑
-2-基)亞乙基)苯甲酰肼的合成 OH OH
HN^N OH
將l-[4-((lR,2S，3R)-l,2，3，4-四羥基-丁基)-lH-咪唑-2-基]-乙酮(172 mg， 0.74 mmol)懸浮在乙醇(4 ml)和水(l ml)中。加入4-氟苯甲酰肼(131 mg,0.85 mmol, 1.1 eq.)和鹽酸(一滴，12 N)并在55。C攪拌48小時(shí)。LCMS 分析顯示形成了產(chǎn)物并且起始材料消失。將反應(yīng)混合物冷卻到室溫， 并且部分地真空濃縮。將得到的白色沉淀物收集并且用乙醇洗滌，得 到產(chǎn)物，為一種表觀的異構(gòu)體，為白色固體97mg(35%)。
LCMS: Sunfire C-18柱，4.6x50mm;在2.5分鐘內(nèi)，在水中含 10-90%(10mM乙酸銨)；流速=3.5 1111/分鐘；檢測(cè)波長(zhǎng)220nm;保留時(shí) 間0.55分鐘(367.24(M+1))。 NMR(甲醇-d4， 一滴DC1)S 2.55(s, 3H), 3.60—3.90(m, 4H), 5.22(s, 1H)， 7.30(m， 2H), 7.54(s， 1H), 8.08(m， 2H)。
6.15 (E)-6-氨基-N'-(l-(4-((lR，2S,3R)-l，2,3,4-四羥基丁基)-lH-咪
唑-2-基)亞乙基)煙酰肼的合成<formula>formula see original document page 53</formula>
將l-[4-((lR，2S，3R)-l,2,3,4-四羥基-丁基)-lH-咪唑-2-基]-乙酮(115 mg, 0.50mmol)懸浮在乙醇(4ml)和水(1 ml)中。加入取代的酰肼(91 mg 0.6 mmol， 1.2eq.)和鹽酸(一滴,12 N)并在55。C攪拌48小時(shí)。LCMS分 析顯示形成了產(chǎn)物并且起始材料消失。將反應(yīng)混合物冷卻到室溫，并 且部分地真空濃縮。將得到的白色沉淀物收集并且用乙醇洗滌，得到 產(chǎn)物，為一種表觀的異構(gòu)體，為白色固體136mg(75%)。
LCMS: Sunfire C-18柱，4.6 X 50mm;在2.5分鐘內(nèi)，在水中含 10-90%(10mM乙酸銨)；流速二3.5ml/分鐘；檢測(cè)波長(zhǎng)220nm;保留時(shí) 間0.15分鐘(365.32(M+l))…HNMR(甲醇-d4, —滴DC1)S 2.58(s, 3H), 3.60-3.90(m， 4H)， 5.22(s, 1H)， 7.17(m， 1H)， 7.54(m， 1H), 8.44(m， 1H), 8.68(m, IH)。
6.16 (E)-N'-(l-(4-((lR，2S，3R)-l，2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)
亞乙基)異煙酰肼的合成 OH
<formula>formula see original document page 53</formula>
將l-[4-((lR,2S,3R)-l，2，3，4-四羥基-丁基)-lH-咪唑-2-基]-乙酮(168
mg， 0.73 mmol)懸浮在乙醇(4 ml)和水(l ml)中。加入異煙酰肼(110 mg， 0.80 mmol， l.leq.)和鹽酸(一滴，12 N)并在55。C攪拌24小時(shí)。LCMS 分析顯示形成了產(chǎn)物并且起始材料消失。將反應(yīng)混合物冷卻到室溫， 并且部分地真空濃縮。將得到的白色沉淀物收集并且用乙醇洗滌，得 到產(chǎn)物，為一種表觀的異構(gòu)體，為白色固體136mg(75%)。
LCMS: Sunfire C-18柱，4.6X50mm;在2.5分鐘內(nèi)，在水中含 10-90%(10mM乙酸銨)；流速-3.5ml/分鐘；檢測(cè)波長(zhǎng)220nm;保留時(shí) 間0.15分鐘(365.32(M+l))JHNMR(甲醇-d4， 一滴DC1)5 2.63(s, 3H), 3.60-3.90(m, 4H)， 5.12(s, 1H), 7.58(s, 1H), 8.63(d， 2H, j=8 Hz), 9.14(d， 2H, j=8 Hz)。
6.17 (E)-N'-(l-(4-((lR，2S，3R)-l,2,3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)
亞乙基)聯(lián)苯基-3-甲酰肼的合成
將l-[4-((lR，2S，3R)-l，2,3，4-四羥基-丁基)-lH-咪唑-2-基]-乙酮(315 mg, 1.36 mmol)和聯(lián)苯基-3-甲酰肼(360 mg， 1.81 mmol)懸浮于DMS0(2 ml)中。加入濃鹽酸(兩滴)，并將懸浮液在40"C攪拌5小時(shí)。LCMS分 析顯示形成了產(chǎn)物并且起始材料消失。將反應(yīng)混合物冷卻到室溫，用 甲醇稀釋并且通過反相HPLC純化(10mM NH40Ac/乙腈)。分別收集所 需物質(zhì)的兩個(gè)級(jí)分(E和Z異構(gòu)體)并且凍干。級(jí)分一提供白色固體，95 mg(16%)。級(jí)分二為白色固體，82mg(14%)。
級(jí)分一分析用HPLC ZorbaxC-8柱，4.6 X 150mm;溶劑A=10 mM
乙酸銨；溶劑B二MeCN;在0分鐘為5% B，在l分鐘為5。/。B，在3 分鐘為90。/。B，在4分鐘停止；流速=3 1111/分鐘；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm; 保留時(shí)間2.9分鐘(說明包含~5%的其它異構(gòu)體)。M+H=425.28. & NMR(DMS0-d6，含2滴D20)S 2.3(單峰，3H)， 3.3-3.7(m, 4H), 4.9(m, 1H) 7.19(s， 1H)， 7.37(m， 1H)7.47(m, 2H), 7.67(m， 3H)， 7.85陽(yáng)7.92(m， 2H)和 8.15(s， 1H)。相同樣品的HSQC將2.3處的質(zhì)子信號(hào)(CH3)與20ppm的 碳信號(hào)關(guān)聯(lián)。
級(jí)分二分析用HPLC ZorbaxC-8柱，4.6X 150mm;溶劑A=10 mM 乙酸銨；溶劑B=MeCN;在0分鐘為5%B，在1分鐘為5% B，在3分 鐘為90。/。B，在4分鐘停止；流速=3!111/分鐘；檢測(cè)波長(zhǎng)220nm;保 留時(shí)間2.963分鐘(說明包含~6%的其它異構(gòu)體)。M+H=425.28. NMR(DMSO-d6，含2滴D20)S 2.4(單峰，3H), 3.4—3.6(m， 4H), 4.77和 4.86(寬的單峰，合起來4H)，6.9和7.1(寬的單峰，合起來-lH)， 7.40(m, 1H)7.50(m， 2H), 7.61(m, 1H)， 7.73(m, 2H)， 7.87(m, 2H)和8.10(s， 1H)。相 同樣品的HSQC將2.4處的質(zhì)子信號(hào)(CH3)與13 ppm的碳信號(hào)關(guān)聯(lián)。
6.18 N-羥基-4-(( 1 R，2S,3R)-1 ，2，3,4-四羥基丁基)-1H-咪唑-2-甲酰
胺的合成
將l-[4-((lR，2S,3R)-l，2，3，4-四羥基-丁基)-lH-咪唑-2-基]-乙酮(18 g 78.3 mmol)懸浮在二氯乙烷(160ml)和2,2-二甲氧基丙烷(160 ml)中。加 入4-甲苯磺酸(3 g)并將混合物在7(TC攪拌18小時(shí)。反應(yīng)用二氯甲烷稀 釋并用水、5%碳酸氫鹽、鹽水洗滌，然后干法加載到Si02上。通過快 速色譜法純化(己垸/乙酸乙酯)，得到l-(4-((4S，4'R，5R)-2,2,2'，2'-四甲基
-4，4'-雙(1,3-二氧雜環(huán)戊垸)-5-基)-111-咪唑-2-基)乙酮，為無色油狀物 (18.8 g， 60.6 mmol, 77%; M+H，計(jì)算值311.4，實(shí)測(cè)值311.3)。
將上述得到的產(chǎn)物(20 g， 64.5 mmol)溶解于DMF。加入K2C03(12.5 g，卯.3 mmol)，隨后加入芐基溴(10.7 ml, 90.3 mmol)。將反應(yīng)在50。C加 熱18小時(shí)。LC/MS分析顯示起始材料有剩余。加入另外部分的芐基溴 (5 ml, 42 mmol)并將溫度升高到60°C。在3小時(shí)之后，反應(yīng)用冷水猝 滅并且用乙酸乙酯提取。有機(jī)提取液用水洗滌，然后用鹽水洗滌，用 硫酸鈉干燥，并且加載到硅膠上。快速色譜法(含20到40%乙酸乙酯 的己烷)，得到l-(l-芐基-4-((4S，4'R，5R)-2，2，2',2'-四甲基-4，4'-雙(l,3-二氧 雜環(huán)戊烷)-5-基)-lH-咪唑-2-基)乙酮(16.1 g, 62%)。
將得到的中間體(13g, 32.5 mmol)溶解于二氧雜環(huán)己垸(120 ml)并 且用溶解于市售漂白劑(200 ml， 6Q/。NaOCl)中的NaOH(13.2 g)處理。在 劇烈攪拌2小時(shí)之后，反應(yīng)用乙酸乙酯提取。有機(jī)提取液用鹽水洗滌， 然后用硅藻土干燥。過濾并且蒸發(fā)，得到固體，將其進(jìn)一步真空干燥， 得至IJ l-芐基-4-((4S,4'R,5R)-2,2，2',2'-四甲基-4,4'-雙(l，3-二氧雜環(huán)戊 垸)-5-基)-lH-咪唑-2-甲酸(13 g，定量收率，M+H計(jì)算值403.2，實(shí) 測(cè)值403.2)。
將上述得到的產(chǎn)物(600 mg， 1.49mmo1)、 O-三苯甲基羥胺(820 mg， 2.98 mmol)、 EDAC(430 mg， 2.24 mmol)和HOBt(305 mg， 2.24 mmol)與 DMF(8 ml)和三乙胺(622 4.47 mmol)合并。將反應(yīng)在環(huán)境溫度攪拌 22小時(shí)，濃縮，然后加載在二氧化硅上，使用DCM/MeOH。快速色譜 法(MeOH/DCM)得到l-節(jié)基-4-((4S，4'R,5R)-2，2，2',2'-四甲基-4，4'-雙(l,3-二氧雜環(huán)戊垸)-5-基)-N-(三苯甲氧基)-m-咪唑-2-甲酰胺(480 mg， 0.73 mmol，49%，M+H計(jì)算值660.3，實(shí)測(cè)值660.4)。
將上述得到的產(chǎn)物(480 mg， 0.73 mmol)溶解于乙醇(50 ml)。加入 Pd(OH)2(500 mg， 20%，在炭上，濕重)并將反應(yīng)在H2(65 psi)下攪拌18
小時(shí)并且過濾。真空除去乙醇。將殘余物溶解于DCM并且通過快速
色譜法(MeOH/DCM)純化，得到N-羥基-4-((4S,4'R，5R)-2,2，2',2'-四甲基 _4，4'-雙(1，3-二氧雜環(huán)戊烷)-5-基)-111-咪唑-2-甲酰胺(150 mg, 0.46 mmol 63%，M+H計(jì)算值328.1，實(shí)測(cè)值328.3)。
將上述得到的產(chǎn)物(150 mg, 0.46 mmol)溶解于丙酮(8 ml)和水(8 ml)。使用干冰/丙酮浴將反應(yīng)冷卻到-15"C的內(nèi)部溫度。加入濃鹽酸(3 ml)，加入速率為使得內(nèi)部溫度保持低于-l(TC。除去冷卻浴并將反應(yīng)在 環(huán)境溫度攪拌3小時(shí)，在4'C攪拌18小時(shí)，并且在環(huán)境溫度攪拌7小 時(shí)。在真空除去丙酮和一些水之后，形成了沉淀物。加入二氧雜環(huán)己 垸(20ml)，隨后加入THF(10ml)。通過過濾分離固體，用THF/二氧雜 環(huán)己烷洗滌并真空干燥，得到N-羥基-4-((lR,2S,3R)-l，2,3,4-四羥基丁 基)-lH-咪唑-2-甲酰胺，為鹽酸鹽(98 mg， 0.40 mmol, 87%)。
質(zhì)譜M+H計(jì)算值248.1，實(shí)測(cè)值248.2。分析用HPLC:Luna Pheny-Hexyl， 5um， 4.6X50 mm,等濃度的10mM乙酸銨，含1%乙腈， 流速=3 ml/分鐘，220 nm檢測(cè)波長(zhǎng)，保留時(shí)間=0.245分鐘。& NMR(DMSO-d6)5 3.37-3.64(m， 4H), 4.96(broad單峰，1H)， 7.47(s, 1H)， 11.9(broad單峰，1H)。
6.19在小鼠中測(cè)量對(duì)淋巴細(xì)胞的影響
通過經(jīng)口管飼法或在飲用水中的方式給用化合物。對(duì)于口服給藥 實(shí)驗(yàn)，將結(jié)晶以10 mg/ml懸浮在媒介物(例如水)中使化合物懸浮。用 單一劑量100mg/kg的化合物(相當(dāng)于每種化合物的100mpk的游離堿) 和僅僅含媒介物的對(duì)照對(duì)小鼠(129/B6株的雜交第一代)進(jìn)行管飼，然后 送返回它們的籠子中。在劑量給藥之后18小時(shí)使用異氟烷將小鼠麻醉， 收集組織用于如下所述的分析。關(guān)于飲用水研究試驗(yàn)，以50mg/L將化 合物溶解在含10 g/L葡萄糖的酸化水(pH=2.8)中。使小鼠自由攝取 含化合物的水(或作為對(duì)照的葡萄糖溶液)達(dá)72小時(shí)。在72小時(shí)末， 收集組織用于分析。
如下獲得CBC測(cè)量數(shù)據(jù)。使用異氟垸將小鼠麻醉，從眼眶后叢收
集血液進(jìn)入EDTA血液收集管(Capiject-MQK， Terumo Medical Corp., Elkton, MD)。使用Cell-Dyn 3500(Abbott Diagnostics, Abbott Park, IL) 或HemaVet 850(Drew Scientific, Inc., Oxford, CT)儀器進(jìn)行自動(dòng)CBC分 析。
如下獲得流式細(xì)胞術(shù)(FACS)測(cè)量數(shù)據(jù)。通過低滲休克將25^1的全 血進(jìn)行溶胞，在2 ml的FACS洗滌緩沖液(FWB: PBS/0.1% BSA/0.1% NaN3/2mM EDTA)中洗滌一次，并在黑暗中使用在50^1 FWB中稀釋的 與熒光染料結(jié)合的抗體的組合在4'C染色30分鐘。染色后，用2ml的 FWB洗漆細(xì)胞一次，然后將細(xì)胞懸浮在300filFWB中用于收獲。
通過使組織強(qiáng)迫通過70pm細(xì)胞過濾器(Falcon， Becton Dickinson Labware, Bedford, MA)將器官分散為單細(xì)胞懸浮液中。對(duì)于FACS分 析，通過低滲溶胞對(duì)RBC進(jìn)行溶胞，洗滌，使用lOpl抗 -CD16/CD32(Fc Block , BD-PharMingen， San Diego, CA)(在FWB中以 1/10稀釋)在4。C培養(yǎng)1X1()6細(xì)胞達(dá)15分鐘。使用在50-100 pi FWB中 稀釋的與熒光染料結(jié)合的抗體的組合直接加入到在Fc Block中的細(xì)胞 上對(duì)細(xì)胞染色，在黑暗中在4'C染色30分鐘。染色后將細(xì)胞用lml的 FWB洗滌一次，并將細(xì)胞再懸浮在300pl的FWB中用于收獲。除非另 作說明，否則所有的抗體購(gòu)自BD-PharMingen, San Diego, CA。使用 FACSCalibur流式細(xì)胞儀和CellQuest Pro軟件軟件(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose， CA)分析樣品。
用于胸腺的抗體混合物是TCRb APC Cy7; CD4 APC; CD8 PerCP; CD69FITC;和CD62L PE1。用于脾和血液的抗體混合物是 B220PerCP; TCRb APC; CD4APCCy7; CD8PECy7; CD69 FITC; 和CD62L PE。
6.20在小鼠中測(cè)量對(duì)S1P水平的影響
使用由Murata， N.,等人在Anal. Biochem. 282:115-120(2000)中描
述的放射受體結(jié)合試驗(yàn)的改進(jìn)法測(cè)量小鼠(129/B6株的雜交第一代)脾 中的S1P水平。該方法采用了過度表達(dá)Edg-l(—種S1P受體亞型)的 HEK293F細(xì)胞，并基于在給定樣品中標(biāo)記S1P與未標(biāo)記S1P的競(jìng)爭(zhēng)。
用pEFneoSlP受體(Edg-l)-表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293F細(xì)胞，并選擇 G418抗性細(xì)胞克隆。在濕潤(rùn)的空氣:C02(19:1)氣氛中在含5%(v/v)FBS 的DMEM中在12個(gè)微孔板(multiplates)上培養(yǎng)表達(dá)Edg-l的HEK293F 細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)，將培養(yǎng)基改成含有0.1%(w/v)BSA的新鮮 DMEM(不含血清)。
給予受試化合物之后十八小時(shí)，處死小鼠，取出它們的脾并冷凍。 使用已知的方法從冷凍組織獲得S1P。例如參見，Yatomi， Y.，等人， FEBS Lett. 404:173-174(1997)。具體地，在冰上，以l分鐘為間隔，將 在1 ml的用冰冷卻的50 mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)(含有1 mM EGTA、 lmM DTT和Roche完全蛋白酶抑制劑)中的10個(gè)小鼠脾均化三次。 將所得物質(zhì)以2500 rpm在4。C離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片。然后將上 清液以45000 rpm在4'C在70Ti旋轉(zhuǎn)器中超離心1小時(shí)，以除去與膜 結(jié)合的蛋白質(zhì)。棄去上清液，將沉淀再懸浮在最小體積( lml)的用冰 冷卻的50 mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)(含有1 mM EGTA、 1 mM DTT 和33%甘油，并存在Roche完全蛋白酶抑制劑)中。使用Bradford測(cè) 定法測(cè)量總蛋白質(zhì)濃度。
將SlP提取到氯仿/KCl/NH40H(pH 12)中，保留上面的水相。然 后在氯仿/甲醇/HCl(pH < l)中提取，保留下層的有機(jī)相并蒸發(fā)得到S1P， 其在使用前冷凍保存。臨到試驗(yàn)之前，通過超聲處理將干燥樣品溶解 在結(jié)合劑緩沖液中，該緩沖液由20 mM Tris-HCl(pH 7.5)、 100 mM NaCl、 15 mM NaF和0.4 %(w/v)BSA組成。
通過放射受體-結(jié)合試驗(yàn)，在Edg-l表達(dá)細(xì)胞上，基于樣品中 ["P]S1P與S1P的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，測(cè)量樣品的S1P含量。采用用冰冷卻
的結(jié)合緩沖液將鋪滿的12個(gè)微孔板中的Edg-l表達(dá)HEK293F細(xì)胞洗 滌兩次，然后使用含有1 nM["P]SlP(每孔約18,00 dpm)和增加劑量的 可靠S1P或者試樣的最終體積為0.4 ml的相同緩沖液培養(yǎng)。將板在冰 上保留30分鐘，使用相同的用冰冷卻的結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞兩次以除 去未結(jié)合的配體。使用由0.1 % SDS、 0.4 % NaOH和2 % Na2C03組成 的溶液使細(xì)胞增溶，通過液體閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)放射性。通過從標(biāo)準(zhǔn)位 移曲線外推推定試驗(yàn)孔中的SIP含量。通過將標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的值乘以 S1P提取回收率和稀釋系數(shù)來計(jì)算初始試驗(yàn)樣品中的S1P含量。
6.21在小鼠中化合物對(duì)淋巴細(xì)胞的影響
使用上面描述的方法，確定各種化合物的體內(nèi)效果。如圖1-3所 示，當(dāng)在飲用水中對(duì)小鼠(129/B6株的雜交第一代)給予時(shí)，THI和本發(fā) 明的典型化合物(化合物l)都減少淋巴細(xì)胞從胸腺溢出。
圖4表示媒介物對(duì)照(飲用水)、THI、化合物2對(duì)全血計(jì)數(shù)的影響。 有趣的是，沒有觀察到化合物2具有由Pyne(WO 97/46543)報(bào)告的體內(nèi)效果。
6.22膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型
膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)是廣泛使用的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA) 的模型，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種由自身免疫性和炎性過程引起的關(guān)節(jié) 疾病?？偟貐⒁?，WooleyP.H.等人，J. Immunol. 135(4):2443-2451; A. Persidis, Nature Biotechnology 17:726-728; Current Protocols in Immunologv師n Wiley & Son, Inc. 1996)。早期研究確立了與某些H-2 單模標(biāo)本連接的CIA的反應(yīng)序位。新近，Campbell和同事在 C57BL/129sv(H-2b)小鼠中再次評(píng)價(jià)了 CIA并發(fā)現(xiàn)C57B6背景由來的小 鼠可以發(fā)展成CIA 。 Campbell I. K等人，Eur.丄Immunol. 30: 1568-1575(2000)。在本發(fā)明中，通過在4°C攪拌過夜，將注射用膠原蛋白，即，2mg/ml 的小雞膠原蛋白II型(CII)(Sigma)溶于10 mM醋酸中。完全弗氏佐劑 (CFA)在購(gòu)買時(shí)是制好的(Sigma)。使用玻璃注射器，臨在免疫注射前將 CII在等體積CFA中乳化。為了對(duì)小鼠進(jìn)行免疫注射，使用玻璃注射 器和26G針，在尾巴根部對(duì)小鼠皮內(nèi)注射CII/CFA乳液。每次注射使 用CFA和在總體積50^1的CFA中的100嗎的小雞CII。在初次免疫注 射之后2周通過相同途徑強(qiáng)化免疫注射在CFA中乳化的lOO(ig的CII。
注射膠原蛋白導(dǎo)致小鼠爪墊和關(guān)節(jié)腫脹，每2-3天檢查小鼠的關(guān) 節(jié)炎發(fā)病，其通過用卡鉗測(cè)量后爪爪墊的厚度與視覺評(píng)價(jià)后腿受影響 的關(guān)節(jié)相組合進(jìn)行評(píng)價(jià)。在所述疾病初次發(fā)作后的10周跟蹤C(jī)IA的進(jìn) 展，之后通過關(guān)節(jié)的組織學(xué)評(píng)價(jià)疾病。如果小鼠在II型膠原蛋白免疫 注射150天內(nèi)沒有發(fā)展成CIA則認(rèn)為它們是關(guān)節(jié)炎陰性的。
通過已確立的視覺評(píng)分系統(tǒng)測(cè)定小鼠有無關(guān)節(jié)炎。在小鼠CIA中， 可影響到任一個(gè)爪或影響到四個(gè)爪。炎癥在其最高峰時(shí)從踝延伸直至 趾并且以極度腫脹和發(fā)紅為特征。 一旦出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎， 一周檢査各爪2 到3次。為了評(píng)價(jià)炎癥的嚴(yán)重程度，使用了廣泛采用的0到4分的視 覺評(píng)分系統(tǒng)，其中0=正常，沒有發(fā)紅和腫脹；1=發(fā)紅和輕微腫脹限于 爪中部或踝關(guān)節(jié)或單個(gè)趾；2=發(fā)紅和輕微的腫脹延伸到踝和爪中部或 者在超過一個(gè)趾內(nèi)腫脹；3=發(fā)紅和中度腫脹從踝延伸至跖骨關(guān)節(jié)；和 4=發(fā)紅和嚴(yán)重腫脹，包括踝、爪和趾。
6.23在膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中的效果
在上述模型中使用30只小鼠(129/B6株的雜交第一代)測(cè)定本發(fā)明 的化合物在CIA模型中的效果。將小鼠隨機(jī)分成兩個(gè)盲組，其接受0 mpk(媒介物對(duì)照)或者100mpk的化合物。媒介物是無菌的蒸餾水。媒 介物對(duì)照的劑量為10pl/g體重。
劑量給藥為經(jīng)口管飼每天一次。在CIA實(shí)驗(yàn)開始前三天開始，并
延續(xù)整個(gè)試驗(yàn)。圖5表示化合物對(duì)CIA隨時(shí)間的效果，其中累積得分
是前肢和踝得分的總和。
6.24在猴中的效果
通過Covance Research Products Inc.(Alice， TX)研究本發(fā)明的化合 物在20只非本土(non-naive)雄性恒河猴中的作用。使用分別用數(shù)字標(biāo) 記的紋身確定每只動(dòng)物。在劑量給藥之前使動(dòng)物適應(yīng)約11天，在劑量 給藥時(shí)，認(rèn)為動(dòng)物是年輕的成年/適齡成年。
在適應(yīng)和試驗(yàn)期間，將動(dòng)物圈養(yǎng)在單獨(dú)的籠子中，在劑量給藥后 的至少48小時(shí)不將動(dòng)物攙和，從而監(jiān)控任何與媒介物和受試物質(zhì)有關(guān) 的效果。動(dòng)物可隨意獲取未認(rèn)證的靈長(zhǎng)類動(dòng)物飲食，除了關(guān)于劑量給 藥而特意指出之外。在非禁食期間還酌情提供了水果和其它治療。隨 意獲取水。
受試化合物在環(huán)境條件(近似于室溫)下避光保存在有干燥劑的 密封容器中。在媒介物對(duì)照組中口服給用由Covance提供的蒸餾水。 在給藥當(dāng)天制備試驗(yàn)所用的受試物質(zhì)劑量制劑。對(duì)于每個(gè)組，稱重適 當(dāng)量的受試物和適當(dāng)體積的蒸餾水。
在劑量給予之前使所有動(dòng)物禁食一夜并持續(xù)到劑量給予后大約4 小時(shí)。根據(jù)劑量給予當(dāng)天取得的體重計(jì)算個(gè)體劑量。
通過鼻胃插管給予口服劑量。在撤離管伺用管之前，用大約5ml 的水沖刷管，對(duì)于血液學(xué)分析，收集每只動(dòng)物劑量給用前(7天)，劑 量給用前(3天)，和劑量給用后8、 16、 24、 32和48小時(shí)的血液(大約 0.5 ml)。使用采血當(dāng)天獲得的新鮮樣品進(jìn)行全血血液學(xué)試驗(yàn)。
如圖6所示，單一口服劑量的化合物在劑量給予后的32小時(shí)測(cè)量時(shí)，對(duì)猴子的白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)具有顯著影響。
上面引用的所有公開，專利和專利申請(qǐng)作為參考以全文并入本文。
權(quán)利要求
1. 式I所示的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑或其可藥用的鹽或溶劑合物(例如，水合物)，其中X為O或NR3；R1為OR1A、NHOH、氫、或任選地被取代的烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)、烷基雜環(huán)、或雜環(huán)烷基；R2為OR2A、C(O)OR2A、氫、鹵素、腈、或任選地被取代的烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)、烷基雜環(huán)、或雜環(huán)烷基；R3為OR3A、N(R3A)2、NHC(O)R3A、NHSO2R3A、或氫；R4為OR4A、OC(O)R4A、氫、鹵素、或任選地被取代的烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)、烷基雜環(huán)、或雜環(huán)烷基；R5為N(R5A)2、氫、羥基、或任選地被取代的烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)、烷基雜環(huán)、或雜環(huán)烷基；和R1A、R2A、R3A、R4A和R5A中的每個(gè)獨(dú)立地為氫或任選地被取代的烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)、烷基雜環(huán)、或雜環(huán)烷基；條件是如果X為O；R1為1-4個(gè)碳的烷基、苯基、芐基或苯基乙基；R2為氫；并且R4和R5之一為羥基；則R4和R5中的另一個(gè)不是1-6個(gè)碳的烷基、1-6個(gè)碳的羥基烷基、每個(gè)碳具有最多一個(gè)羥基的1-6個(gè)碳的多羥基烷基、每個(gè)碳具有最多一個(gè)乙?；?-6個(gè)碳的多乙酰基烷基、苯基、芐基或苯基乙基。
2.權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其具有大于約50 %的 CLRF。
3. 權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中X為O。
4. 權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中X為NR3。
5. 權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中Ri為氫。
6. 權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中！^為任選地被取代的 低級(jí)烷基。
7. 權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中R,為NHOH。
8. 權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中R!為OR1A。
9. 權(quán)利要求7的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中RiA為氫或任選地被 取代的低級(jí)烷基。
10. 權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中R2為氫。
11. 權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中R2不是氫。
12. 權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中R2為腈。
13. 權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中R2為任選地被取代 的低級(jí)垸基。
14. 權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中112為OR2A。
15. 權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中R2為C(0)OR2A。
16. 權(quán)利要求14或15的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中R2A為氫或任選地被取代的低級(jí)垸基。
17. 權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中113為OR3A。
18. 權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中R3為N(R3A)2或 NHC(0)R3A。
19. 權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中R3為NHS02R3A。
20. 權(quán)利要求17、 18或19的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中R3A為氫 或任選地被取代的低級(jí)垸基。
21. 權(quán)利要求17、 18或19的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中R3A為任 選地被取代的芳基或雜環(huán)。
22. 權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中JU為OR4A。
23. 權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中R4為鹵素。
24. 權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中Rs為N(RsA)2。
25. 權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中Rs為氫。
26. 權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中Rs為羥基。
27. 權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中Rs為雜烷基(例如， 烷氧基)。
28. 權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中R5為任選地被取代的烷基。
29. 權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑，其中Rs為任選地被取代 的芳基。
30. 式I所示的S1P水平增強(qiáng)劑<formula>formula see original document page 5</formula>I其可藥用的鹽或溶劑合物，其中 X為O或NR3;R,為OR1A、 NHOH、氫、或任選地被取代的烷基、芳基、烷基芳 基、芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)、垸基雜環(huán)、或雜環(huán)垸基；R2為OR2A、 C(0)OR2A、氫、鹵素、腈、或任選地被取代的垸基、 芳基、垸基芳基、芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)、垸基雜環(huán)、或雜環(huán)烷基；R3為OR3A、 N(R3A)2、 NHC(0)R3A、 NHS02R3A、或氫；R4為OR4A、 OC(0)R4A、氫、鹵素、或任選地被取代的烷基、芳 基、垸基芳基、芳基烷基、雜垸基、雜環(huán)、烷基雜環(huán)、或雜環(huán)烷基；R5為N(R5A^)2、氫、羥基、或任選地被取代的垸基、芳基、垸基芳 基、芳基垸基、雜烷基、雜環(huán)、垸基雜環(huán)、或雜環(huán)垸基；和Ria、 R2A、 R3A、 R4A和R5A中的每一個(gè)獨(dú)立地為氫或任選地被取代的垸基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、雜焼基、雜環(huán)、烷基雜環(huán)、 或雜環(huán)垸基；條件是所述SIP水平增強(qiáng)劑不是2-乙?；?4-四羥基丁基咪唑、 l-(4-(l，l，2,2，4-五羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙酮、l-(2-乙酰基-lH-咪唑 -4-基)丁烷-1,1，2，2-四基四乙酸酯、或l-(2-乙酰基-lH-咪唑-4-基)丁垸 -1，1，2，2,4-五基五乙酸酯。
31. 權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑，其具有大于約20倍的SLEF。
32. 權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑，其中X為O。
33. 權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑，其中X為NRp
34. 權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑，其中R,為氫。
35. 權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑，其中！^為任選地被取代的 低級(jí)烷基。
36. 權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑，其中R^為NHOH。
37. 權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑，其中I^為0R4A。
38. 權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑，其中R,A為氫或任選地被取 代的低級(jí)烷基。
39. 權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑，其中R2為氫。
40. 權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑，其中&不是氫。
41. 權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑，其中R2為腈。
42. 權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑，其中112為任選地被取代的 低級(jí)烷基。
43. 權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑，其中R2為OR2A。
44. 權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑，其中R2為C(0)OR2A。
45. 權(quán)利要求43或44的SIP水平增強(qiáng)劑，其中R2A為氫或任選 地被取代的低級(jí)垸基。
46. 權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑，其中R3為OR3A。
47. 權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑，其中R3為N(R3A)2或 NHC(0)R3A。
48. 權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑，其中R3為NHS02R3A。
49. 權(quán)利要求46、 47或48的SIP水平增強(qiáng)劑，其中R3A為氫或 任選地被取代的低級(jí)烷基。
50. 權(quán)利要求46、 47或48的SIP水平增強(qiáng)劑，其中R3A為任選 地被取代的芳基或雜環(huán)。
51. 權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑，其中R4為0R^。
52. 權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑，其中R4為鹵素。
53. 權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑，其中Rs為N(RsA)2。
54. 權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑，其中Rs為氫。
55. 權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑，其中Rs為羥基。
56. 權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑，其中Rs為雜烷基(例如，垸 氧基)。
57. 權(quán)利要求30的SIP水平增強(qiáng)劑，其中Rs為任選地被取代的院基o
58. 權(quán)利要求30的SIP水平增強(qiáng)劑，其中Rs為任選地被取代的 芳基。
59. 式II所示的化合物<formula>formula see original document page 8</formula>其可藥用的鹽或溶劑合物，其中X為O或NR3;^為OR,a、 NHOH、氫、或任選地被取代的烷基、芳基、垸基芳 基、芳基垸基、雜烷基、雜環(huán)、烷基雜環(huán)、或雜環(huán)烷基；R2為OR^、 C(0)OR2A、氫、鹵素、腈、或任選地被取代的垸基、 芳基、垸基芳基、芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)、垸基雜環(huán)、或雜環(huán)烷基； R3為OR3A、 N(R3A)2、 NHC(0)R3A、 NHS02R3A、或氫； R6為OR6A、 OC(0)R6A、 N(R6B)2、 NHC(0)R6B、氫、或鹵素 R7為OR7A、 OC(0)R7A、 N(R7B)2、 NHC(0)R7B、氫、或鹵素 Rs為OR8A、 OC(0)R8A、 N(R8B)2、 NHC(0)R8B、氫、或鹵素； R9為CH20R9A、 CH2OCCO;>R9A、 NCR9B;>2、 NHCCO)R9B、氣、或齒素；R1A、 R2A、 R3A、 R6A、 R7A、 Rsa和R9A中的每一個(gè)獨(dú)立地為氫或 任選地被取代的垸基、芳基、烷基芳基、芳基垸基、雜垸基、雜環(huán)、 垸基雜環(huán)、或雜環(huán)垸基；和R6B、 R7B、 R8B和R9B中的每一個(gè)獨(dú)立地為氫或任選地被一個(gè)或多個(gè)羥基或鹵素基團(tuán)取代的烷基；條件是l)如果X為O， &為l-4個(gè)碳的烷基、苯基、芐基或苯基乙基，和R2為氫，則R6、 R7、 Rs和R9中的至少兩個(gè)不是羥基或乙 酸根；2)如果X為O， R!為甲基，R2為氫，R6和R7都是羥基，禾口Rs 和R9之一為氫，貝IJ Rs和R9中的另一個(gè)不是NHC(0)R9B; 3)如果X 為O， A為OR1A， RiA為氫或低級(jí)烷基，和R2為氫，貝U R6、 R7、 R8和R9中的至少一個(gè)但不是全部為羥基或乙酸根。
60. 權(quán)利要求59的化合物，其為循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑。
61. 權(quán)利要求59的化合物，其為S1P水平增強(qiáng)劑。
62. 權(quán)利要求59的化合物，其由式II(a)表示
63. 權(quán)利要求62的化合物，其中X為O。
64. 權(quán)利要求62的化合物，其中X為NR3。
65. 權(quán)利要求62的化合物，其中R,為氫。
66. 權(quán)利要求62的化合物，其中！^為任選地被取代的低級(jí)垸基。
67. 權(quán)利要求62的化合物，其中Rt為NHOH。
68. 權(quán)利要求62的化合物，其中Ri為OR!A。
69. 權(quán)利要求67的化合物，其中RiA為氫或任選地被取代的低級(jí)院基o
70. 權(quán)利要求62的化合物，其中R2為氫。
71. 權(quán)利要求62的化合物，其中R2不是氫。
72. 權(quán)利要求62的化合物，其中R2為腈。
73. 權(quán)利要求62的化合物，其中R2為任選地被取代的低級(jí)烷基。
74. 權(quán)利要求62的化合物，其中R2為OR2A。
75. 權(quán)利要求62的化合物，其中112為C(0)OR2A。
76. 權(quán)利要求74或75的化合物，其中R^為氫或任選地被取代的 低級(jí)垸基。
77. 權(quán)利要求62的化合物，其中R3為OR^。
78. 權(quán)利要求62的化合物，其中R3為N(R3a)2或NHC(0)R3a。
79. 權(quán)利要求62的化合物，其中R3為NHS02R3A。
80. 權(quán)利要求77、 78或79的化合物，其中R3A為氫或任選地被取 代的低級(jí)垸基。
81. 權(quán)利要求77、 78或79的化合物，其中R3A為任選地被取代的 芳基或雜環(huán)。
82. 權(quán)利要求62的化合物，其中X為0且R2不是氫。
83. 權(quán)利要求82的化合物，其中R2為任選地被取代的低級(jí)烷基。
84. 權(quán)利要求62的化合物，其中R6、 R7、 Rs和R9中的一個(gè)或多 個(gè)為羥基或鹵素。
85. 權(quán)利要求62的化合物，其中R6、 R7、 R8和Rg都是羥基或乙 酸根。
86. 式III所示的化合物<formula>formula see original document page 11</formula>或其可藥用的鹽或溶劑合物，其中 Z為任選地被取代的垸基；R1為OR1A、 NHOH、氫、或任選地被取代的垸基、芳基、烷基芳 基、芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)、烷基雜環(huán)、或雜環(huán)烷基；R2為OR2A、 C(0)OR2A、氫、鹵素、腈、或任選地被取代的垸基、 芳基、垸基芳基、芳基垸基、雜垸基、雜環(huán)、垸基雜環(huán)、或雜環(huán)垸基;R3為OR3A、 N(R3A)2、 NHC(0)R3A、 NHS02R3A、或氫；R1A、 R^和R3A中的每一個(gè)獨(dú)立地為氫或任選地被取代的烷基、 芳基、烷基芳基、芳基垸基、雜垸基、雜環(huán)、烷基雜環(huán)、或雜環(huán)烷基。
87. 權(quán)利要求86的化合物，其中Z為任選地被一個(gè)或多個(gè)羥基、 乙酸根或鹵素部分取代的烷基。
88. 權(quán)利要求86的化合物，其中Rt為任選地被取代的低級(jí)烷基。
89. 權(quán)利要求86的化合物，其中R,為NHOH。
90. 權(quán)利要求86的化合物，其中R2為氫或鹵素。
91. 權(quán)利要求86的化合物，其中R3為OR3A。
92. 權(quán)利要求86的化合物，其中R3為N(R3A)2或NHC(0)R3A。
93. 權(quán)利要求86的化合物，其中R3為NHS02R3A。
94. 權(quán)利要求91、 92或93的化合物，其中R3A為氫或任選地被 取代的低級(jí)烷基。
95. 權(quán)利要求91、 92或93的化合物，其中R3A為任選地被取代 的芳基或雜環(huán)。
96. 式IV所示的化合物<formula>formula see original document page 12</formula>IV或其可藥用的鹽或溶劑合物，其中!^為ORiA、 NHOH、氫、或任選地被取代的垸基、芳基、垸基芳 基、芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)、烷基雜環(huán)、或雜環(huán)烷基；R3為OR3A、 N(R3A)2、 NHC(0)R3A、 NHS02R3A、或氫； R6為OR6A、 OC(0)R6A、 N(R6B)2、 NHC(0)R6B、氫、或鹵素； R7為OR7A、 OC(0)R7A、 N(R7B)2、 NHC(0)R7B、氫、或鹵素；Rs為OR8A、 OC(0)R8A、 N(R8B)2、 NHC(0)R8B、氫、或鹵素； R^CH2OR9A、 CH2OC(0)R9A、 N(R9B)2、 NHC(O)R犯、氫、或鹵 素；和R1A、 R3A、 R6A、 R7A、 RsA和R9A中的每一個(gè)獨(dú)立地為氫或任選地 被取代的垸基、芳基、烷基芳基、芳基垸基、雜烷基、雜環(huán)、烷基雜 環(huán)、或雜環(huán)烷基。
97.權(quán)利要求96的化合物，其由式IV(a)表示<formula>formula see original document page 13</formula>
98. 權(quán)利要求96的化合物，其中R6、 R7、 Rs和R9中的一個(gè)或多 個(gè)為羥基或鹵素。
99. 權(quán)利要求96的化合物，其中R6、 R7、 Rs和119都是羥基或乙 酸根。
100. 權(quán)利要求97的化合物，其中R6、 R7、 Rs和R9都是羥基或乙 酸根。
101. 權(quán)利要求97的化合物，其中&為任選地被取代的低級(jí)垸基。
102. 權(quán)利要求97的化合物，其中&為NHOH。
103. 權(quán)利要求97的化合物，其中R3為OR3A。
104. 權(quán)利要求97的化合物，其中113為N(R3a)2或NHC(0)R3a。
105. 權(quán)利要求97的化合物，其中113為NHS02R3A。
106. 權(quán)利要求103、 104或105的化合物，其中R3A為氫或任選地 被取代的低級(jí)垸基。
107. 權(quán)利要求103、 104或105的化合物，其中R3A為任選地被取 代的芳基或雜環(huán)。
108. 化合物、或其可藥用的鹽或溶劑合物，其中所述化合物為 l-(4-((lR，2S，3R)-l，2，3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟； (E)-l-(4-((lR,2S，3R)-l,2，3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟； (Z)-l-(4-((lR,2S,3R)-l,2,3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟； l-(4-((lR,2S，3R)-l,2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙酮O-甲基肟；(E)-l-(4-((lR，2S,3R)-l,2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙酮0-甲基肟；(Z)-1 -(4陽(yáng)((1 R,2S，3R)-1 ，2,3,4-四羥基丁基)-1H-咪唑-2-基)乙酮0-甲基肟； 1-(5-甲基-4-((lR，2S,3R)-l,2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙酮；(lR,2S,3R)-l-(2-(l-亞肼基乙基)-lH-咪唑-4-基)丁垸-1,2,3,4-四醇；N'-(l-(4-((lR,2S，3R)-l，2，3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)亞乙基)乙酰肼； 4-甲基-N'-(l-(4-((lR，2S，3R)-l，2，3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)亞乙基)苯磺酰肼；(E)-4-甲基-N'-(l-(4-((lR，2S,3R)-l,2，3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)亞乙基)苯磺酰肼；(Z)-4-甲基-N'-(l-(4-((lR，2S，3R)-l，2，3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)亞乙基)苯磺酰肼；N'-(l-(4-((lR,2S，3R)-l，2,3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)亞乙基)苯甲酰肼； 2- (l-(4-((lR,2S,3R)-l,2，3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)亞乙基)肼甲酸乙酯；(E)-2-(l-(4-((lR，2S，3R)-l，2，3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)亞乙基)肼甲酸乙酯；(Z)-2-(l-(4-((lR，2S,3R)-l，2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)亞乙基)肼甲酸乙酯；N'-(l-(4-((lR,2S，3R)-l,2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)亞乙基)煙酰肼；(E)-N'-(l-(4-((lR，2S，3R)-l，2,3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)亞乙基)煙酰肼；(Z)-N'-( 1 -(4-(( 1 R，2S,3R)-1 ，2,3,4-四羥基丁基)-1H-咪唑-2-基)亞乙基)煙酰肼； 3- 氯-N'-(l-(4-((lR，2S,3R)-l，2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)亞乙基)苯甲酰肼； 4- 氟-N'-(l-(4-((lR，2S,3R)-l,2，3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)亞乙基)苯甲酰肼；(E)-4-氟-N'-(l-(4-((lR,2S，3R)-l,2,3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)亞乙基)苯甲酰肼；(Z)-4-氟-N'-(l-(4-((lR，2S,3R)-l,2,3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)亞乙基)苯甲酰肼； 6-氨基-N'-(l-(4-((lR，2S,3R)-l，2，3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)亞乙基)煙酰肼；(E)-6-氨基-N'-(l-(4-((lR,2S,3R)-l,2,3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)亞乙基)煙酰肼；(Z)-6-氨基-N'-(l-(4-((lR，2S，3R)-l,2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)亞乙基)煙酰肼； N'-(l-(4-((lR，2S，3R)-l,2,3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)亞乙基)異煙酰肼；(E)-N'-(l-(4-((lR,2S，3R)-l，2,3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)亞乙基)異煙酰肼；(Z)-N'-(l-(4-((lR，2S，3R)-l,2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)亞乙基)異煙酰肼；N'-(l-(4-((lR，2S，3R)-l，2,3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)亞乙基)聯(lián) 苯基-3-甲酰肼；(E)-N'-(l-(4-((lR,2S，3R)-l,2，3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)亞乙 基)聯(lián)苯基-3-甲酰肼；(Z)-N'-( 1 -(4-((1 R,2S，3R)-1 ，2，3,4-四羥基丁基)-1H-咪唑-2-基)亞乙 基)聯(lián)苯基-3-甲酰肼；或N-羥基-4-((lR,2S，3R)-l,2，3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-甲酰胺。
109. 藥物組合物，其包括權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑以及 可藥用的賦形劑或稀釋劑。
110. 藥物組合物，其包括權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑以及藥 用的賦形劑或稀釋劑。
111. 藥物組合物，其包括權(quán)利要求59、 84、 96或108的化合物 以及可藥用的賦形劑或稀釋劑。
112. 減少患者的循環(huán)淋巴細(xì)胞數(shù)目的方法，所述方法包括對(duì)所述 患者給予有效量的權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑。
113. 調(diào)節(jié)患者的S1P的量的方法，所述方法包括對(duì)所述患者給予 有效量的權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑。
114. 抑制患者中免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括對(duì)所述患者給予 有效量的權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑。
115. 抑制患者中免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括對(duì)所述患者給予 有效量的權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑。
116. 抑制患者中免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括對(duì)所述患者給予 有效量的權(quán)利要求59、 84、 96或108的化合物。
117. 治療、應(yīng)對(duì)或預(yù)防疾病或病癥的方法，所述方法包括對(duì)有需 要的患者給予治療或預(yù)防有效量的權(quán)利要求1的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少劑， 其中所述疾病或病癥是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、特應(yīng)性皮炎、貝切特 氏病、移植抗宿主病、紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、花粉病、銀屑病、移 植排斥或葡萄膜炎。
118. 治療、應(yīng)對(duì)或預(yù)防疾病或病癥的方法，所述方法包括對(duì)有需 要的患者給予治療或預(yù)防有效量的權(quán)利要求30的S1P水平增強(qiáng)劑，其 中所述疾病或病癥為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、特應(yīng)性皮炎、貝切特氏 病、移植抗宿主病、紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、花粉病、銀屑病、移植 排斥或葡萄膜炎。
119. 治療、應(yīng)對(duì)或預(yù)防疾病或病癥的方法，所述方法包括對(duì)有需 要的患者給予治療或預(yù)防有效量的權(quán)利要求59、 84、 96或108的化合 物，其中所述疾病或病癥為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、特應(yīng)性皮炎、貝 切特氏病、移植抗宿主病、紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、花粉病、銀屑病、 移植排斥或葡萄膜炎。
全文摘要
本發(fā)明公開了咪唑基化合物、包括所述咪唑基化合物的組合物、和它們用于治療、預(yù)防和應(yīng)對(duì)炎癥性和自身免疫性疾病和病癥的方法。具體的化合物由式I表示。
文檔編號(hào)C07D233/54GK101395141SQ200780006461
公開日2009年3月25日 申請(qǐng)日期2007年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月24日
發(fā)明者戴維·J·奧格里, 戴維德·S·金博爾, 拉克瑪爾·W·波特尤, 杰弗里·巴格達(dá)諾夫, 肯尼斯·G·卡爾森, 西奧多·C·杰索普 申請(qǐng)人:萊西肯醫(yī)藥有限公司