專利名稱：作為藥用產(chǎn)品的特異針對(duì)蟲(chóng)媒病毒的免疫球蛋白及F(ab)＇2和/或Fab片段的濃縮物的制作方法
作為藥用產(chǎn)品的特異針對(duì)蟲(chóng)媒病毒的免疫球蛋白及F(ab)'2 和/或Fab片段的濃縮物本發(fā)明涉及用于治療蟲(chóng)媒病毒(arboviruses)的新的藥用產(chǎn)品，即特異 針對(duì)所述蟲(chóng)媒病毒的免疫球蛋白及F(ab)'2和/或Fab片段的濃縮物，以及 其制備方法。前言在其循環(huán)中利用節(jié)肢動(dòng)物媒介的病毒被歸于通用術(shù)語(yǔ)上的蟲(chóng)媒病 毒。蟲(chóng)媒病毒被WHO定義為基本上或主要通過(guò)借助吸血節(jié)肢動(dòng)物的易 感脊推動(dòng)物宿主間的生物性傳播存在于自然界的病毒；在外潛伏期之后， 它們?cè)诩雇苿?dòng)物體內(nèi)繁殖并引發(fā)病毒血癥，在節(jié)肢動(dòng)物的組織內(nèi)增殖并 通過(guò)叮咬昆蟲(chóng)被傳播到另 一脊推動(dòng)物。所述病毒從病毒血癥宿主向成年雌蚊的傳播經(jīng)由叮咬發(fā)生時(shí)被吸出 的血液發(fā)生。所述病毒在蚊子體內(nèi)繁殖，穿過(guò)該動(dòng)物的胃屏障，在唾液 腺中^皮發(fā)現(xiàn)。通過(guò)剛好在蚊子叮入血管之前釋i文的抗凝唾液實(shí)現(xiàn)對(duì)健康 人的感染。窗口期僅有幾天，在此期間人是發(fā)病前的病毒血癥宿主。已知的蟲(chóng)々某病毒屬于五大病毒家族-4皮月莫病毒牙牛(Togaviridae),曱病毒屬(genus Alphavirus),包4舌切昆 貢亞熱(C7 汰MWgimya)、阿尼昂尼昂(O',o"g 7Vyowg)、 羅斯河(/ om i /ver)、 辛德華斯CSV"必^)和馬雅羅(A/^ara)病毒的28種病毒-黃病毒科(Flaviviridae)，黃病毒屬(genus F/aWvzV*—， 包括黃熱病病 毒、登革熱病毒、日本腦炎病毒，西尼羅病毒(環(huán)fewM/eWms)，歐亞大陸 溫帶地區(qū)的蜱傳腦炎病毒，以及能夠引起夸賽納森林病(Kyasanur forest disease)和鄂木斯克(Omsk)出血熱的病毒的68種病毒-布尼亞病毒科(Bunyaviridae)， 布尼亞病毒屬(genus Bw"y謂'ms)(包 ^"布尼亞維4立病毒(^M"少a7mvera v/n^s)的138種病毒)，白蟲(chóng)令熱病毒屬 (genus i^/e6ovzW力(包括裂谷熱病毒(Rift Valley Fever virus)的43種病毒)， 內(nèi)羅病毒屬(genus A^'ravz'ms)(包括克里米亞-剛果(Crimea-Congo)出血熱病毒的24種病毒)+ 41種未分類的病毒-呼腸孑瓜病毒一牛(Reoviridae)，環(huán)狀病毒屬(genus CW z'v/ra力(69種病毒) 和科蜱病毒屬(genus Co/"'w'ms) (2種病毒)+ 6種未分類的病毒-彈訝犬病毒牙牛(Rhabdoviridae)， 7jc皰病毒屬(genus ^w.cw/ov/n^) (18 種病毒)和狂犬病毒屬(genus Z^w"v/ms) (16種病毒)+ 36種未分類的病 毒。下面詳述在熱帶觀察到的主要蟲(chóng)媒病毒。登革熱在全球的所有熱帶、亞熱帶地區(qū)傳播，代表了由蟲(chóng)媒病毒引 起的主要的公共健康問(wèn)題。有四種登革熱病毒血清型，被稱為"登革熱1、 2、 3和4",這些血清型不產(chǎn)生交叉保護(hù)。在臨床上，有幾種形式的登革 熱比較著名無(wú)癥狀登革熱；典型登革熱(CD)及其嚴(yán)重形式，尤其是出 血形式；出血性登革熱(HD)以及能導(dǎo)致死亡特別是在兒童的登革熱休克 綜合征(DSS)。這四種類型的登革熱病毒都能引起CD以及HD。涉及HD 的發(fā)生的病理生理機(jī)制是未知的。最常使用的理論參照了"免疫加強(qiáng)"的 現(xiàn)象因?yàn)橐呀?jīng)感染了四種血清型中的一種的個(gè)體并不能被保護(hù)抵抗另 外三種病毒，繼發(fā)的異源感染可能導(dǎo)致HD。傳病媒介為伊蚊屬(genus 」ecfes)蚊子埃及伊蚊04^Z&s aegw。是主要的傳病媒介；白紋伊蚊(aetfe a/6o; z'c^s)在農(nóng)村和城市邊緣地區(qū)發(fā)揮重要的作用，并且能很好地適應(yīng)溫 帶氣候。目前認(rèn)為西尼羅病毒是繼登革熱病毒之后傳播范圍最廣的黃病毒； 它偶發(fā)地或以流行方式侵襲人類。最近描述了它第 一次出現(xiàn)在美洲大陸 的情景，在1999年以流行病形式發(fā)生在紐約(62例，包括7例死亡)。然 后在2003年它在美國(guó)大范圍傳播，在44個(gè)州侵襲了超過(guò)卯00人，包括 2866例腦炎和264例死亡。先前已經(jīng)在非洲、中東、印度和歐洲等世界 上的不同地區(qū)發(fā)現(xiàn)了這種病毒。蚊子是西尼羅病毒的主要傳病々某介，它 們大部分是庫(kù)蚊(Cwfec)屬。所述病毒的主要宿主是野生的和家養(yǎng)的(鴨子、 鵒子等)禽類。它們?cè)诓《镜膫鞑ブ邪缪葜P(guān)鍵角色。西尼羅病毒感染人 類主要是經(jīng)由傳病媒介蚊子的途徑。所述感染的特征是經(jīng)過(guò)3至6天的 潛伏期后出現(xiàn)突發(fā)性高熱。這種發(fā)熱伴隨著頭痛、背痛、肌肉痛、咳嗽、 頸淋巴結(jié)肺大，并經(jīng)常出現(xiàn)皮滲、惡心、腹痛、腹瀉和呼吸道癥狀。在低于15%的病例中出現(xiàn)了并發(fā)癥腦膜炎、腦炎、以及極少數(shù)的肝炎、 胰腺炎或心肌炎。通?；颊邥?huì)自發(fā)恢復(fù)，有時(shí)會(huì)留有后遺癥。然而所述 疾病對(duì)老人及有時(shí)對(duì)幼兒是致命的。在撒哈拉以南非洲和熱帶美洲，黃熱病(YF)仍然是難對(duì)付的地方病 和持續(xù)的威脅。它是由阿馬里爾病毒(amaW/Wm )引起的。黃熱病表現(xiàn)形 式為出血性肝腎炎、阿馬里爾斑滲傷寒、并有初期或"紅，，期、第三曰的 緩解以及淤滯期或"黃"期，伴隨黃疽、嘔吐、出血(主要是在胃腸道)及腎 綜合癥。黃熱病的流行病學(xué)是復(fù)雜的，因?yàn)樵谧匀粎^(qū)域，阿馬里爾病毒 通過(guò)作為傳病媒介的野生simiophilic蚊在猴種群中持續(xù)傳播。只是偶然 地，當(dāng)人類接觸到這種叢林中的循環(huán)時(shí)，第一個(gè)人的病例就產(chǎn)生了。切昆貢亞熱(縮寫(xiě)為CHIK)通過(guò)伊蚊屬蚊子傳播。所述名稱來(lái)自班圖 語(yǔ)，意思是彎曲的人、巻曲的人、或彎曲人的疾病，因?yàn)樗鸱浅?嚴(yán)重的關(guān)節(jié)疼痛并且合并僵硬，這使被感染的患者呈現(xiàn)出極典型的彎曲 表征。在超過(guò)950種的蚊子中，有幾種能夠傳播切昆貢亞熱，但到目前為 止只有埃及伊蚊和白紋伊蚊被確定為流行性的傳病々某介，因?yàn)樗鼈冞m應(yīng) 人類居住的區(qū)域。這些相同的物種還與其它的蟲(chóng)媒病毒的傳播有關(guān)登 革熱、登革出血熱(HDF)、黃熱病等。臨床特征主要表現(xiàn)為與登革熱(登革熱經(jīng)常被誤認(rèn)為是切昆貢亞熱， 反之亦然)發(fā)熱近似的高熱，且合并有導(dǎo)致失去活動(dòng)能力的關(guān)節(jié)疼痛，以 及有時(shí)出現(xiàn)的皮瘆。然而，還有直到現(xiàn)在仍被忽視的一些嚴(yán)重形式爆 發(fā)性肝炎、心臟病發(fā)作、腦膜腦炎等。諸如羅斯河、阿尼昂尼昂和馬雅 羅的幾種其他的曱病毒屬蟲(chóng)媒病毒(約30-KD衣殼，且3'端聚腺苷酸化的 RNA)與相似的癥狀有關(guān)。疾病的潛伏期平均持續(xù)4至7天。病毒血癥延續(xù)大約5天，該階段 病毒存在于血液中，因此可能引起傳播。隨后抗體產(chǎn)生。病毒仍存留于 血液中。因此通常是獲得終生免疫?？梢岳靡呙鐏?lái)預(yù)防黃熱病。疫苗接種在暴露群體中是系統(tǒng)的。然 而，所述群體的60%至80%必須被免疫(自然地或通過(guò)疫苗接種)以避免疾 病流行?？贵w大約在10天后出現(xiàn)。孕婦和不滿6個(gè)月的嬰兒禁忌疫苗接種。在歐洲，疫苗還被用于預(yù)防蜱傳腦炎。它以TICOVAC (Baxter SA) 的名字^皮出售。在美國(guó)，針對(duì)切昆貢亞熱疫苗的I期和II期研究已被美軍傳染病醫(yī) 學(xué)研究所實(shí)施(Edelman R等。"Phase II safety and immunogenicity study of live chikungunya virus vaccine"("活切昆貢亞熱病毒疫苗的II期安全和免 疫原性研究")TSI-GSD-218. Juin2000; Am J Trop Med Hyg， 62:681-5)目前沒(méi)有針對(duì)蟲(chóng)^ 某病毒的殺病毒治療。治療純粹是針對(duì)癥狀進(jìn)行的，以減輕發(fā)熱和減輕疼痛。 現(xiàn)有技術(shù)在曱型肝炎疫苗開(kāi)發(fā)之前，幾項(xiàng)研究已經(jīng)證明了含有抗-甲型肝炎抗體的免疫球蛋白注射劑在有暴露于該病毒風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的功效(Ohara et al., Jpn J Exp Med， 1986 Oct; 56 (5): 229-33; Conrad ME et al.， J Infect Dis, 1987 Jul; 156 (1):56誦63)。乙型肝炎特異性免疫球蛋白或抗-HB被廣泛用于保護(hù)任何被已污染 的物品刺破的未接種疫苗的個(gè)體，母親為HB抗原陽(yáng)性的新生兒(在這種 狀況下，必須在出生后馬上進(jìn)行注射，且必須伴隨疫苗接種的開(kāi)始)，避 免移植再感染的肝臟移植患者，以及HB抗原呈陽(yáng)性的個(gè)體在等待疫苗 接種產(chǎn)生作用時(shí)的性伴侶。這些免疫球蛋白在暴露于危險(xiǎn)之前或在接觸 傳染源(意外刺破)后的24小時(shí)內(nèi)建立起一種保護(hù)。發(fā)明概述面對(duì)缺乏建立的殺病毒治療，以及只有一種疫苗通過(guò)了上市核準(zhǔn)， 申請(qǐng)人:基于特異性免疫球蛋白使快速免疫暴露的人群成為可能，尋求開(kāi) 發(fā)一種藥用產(chǎn)品以治療或預(yù)防蟲(chóng)媒病毒。申請(qǐng)人以令人驚喜的方式表明為了使這樣一種治療有效，需要特異 針對(duì)蟲(chóng)媒病毒的免疫球蛋白和F(ab)'2和/或Fab片段的組合。定義術(shù)語(yǔ)"濃縮物"指通過(guò)去除特定成分獲得的產(chǎn)物。免疫球蛋白濃縮物 通過(guò)去除血漿中的特定成分獲得，以得到富含免疫球蛋白的血漿部分。術(shù)語(yǔ)"免疫球蛋白"(Ig)指天然的球蛋白，主要存在于血漿中，具有抗 體功能，其可以被用于治愈性或預(yù)防性治療。免疫球蛋白是由通過(guò)二硫鍵連接的2條重鏈和2條輕鏈組成的異源 二聚體。每條鏈都由N端的可變結(jié)構(gòu)域或區(qū)(輕鏈由重排的V-J基因編碼， 重鏈由重排的V-D-J基因編碼)和C端的恒定區(qū)組成，所述可變結(jié)構(gòu)域或 區(qū)對(duì)抗體針對(duì)的抗原是特異的，所述恒定區(qū)由輕鏈的單一 CL結(jié)構(gòu)域或重 鏈的三個(gè)結(jié)構(gòu)域(CH1、 CH2和CH3)組成。重鏈和輕《連的可變結(jié)構(gòu)域和 CH1和CL結(jié)構(gòu)域的組合形成了 Fab部分，所述Fab部分由極具彈性的 鉸鏈區(qū)連接到Fc區(qū)，所述鉸鏈區(qū)允許每個(gè)Fab結(jié)合到其靶抗原的同時(shí)， 使介導(dǎo)抗體的效應(yīng)特性的Fc區(qū)仍然能夠接近諸如FcyR受體和Clq的效 應(yīng)分子。IgG是最多的免疫球蛋白(占循環(huán)抗體的75°/。到80%)。它們保護(hù)機(jī)體 抵抗在血液和淋巴液中循環(huán)的細(xì)菌、病毒和毒素。另外，它們迅速地結(jié) 合到補(bǔ)體(免疫系統(tǒng)的一個(gè)組分)。它們還參與記憶應(yīng)答，所述記憶應(yīng)答是 免疫的基礎(chǔ)，疫苗接種的機(jī)制就是建立在其上的。最后，免疫球蛋白G 穿過(guò)胎盤(pán)屏障，從而在胎兒體內(nèi)建立被動(dòng)免疫。IgA^皮發(fā)現(xiàn)主要在諸如唾液、腸液、汗液和母乳的分泌物中。免疫球 蛋白A的主要作用是阻止致病體結(jié)合到細(xì)胞上，特別是組成粘膜和表皮 的保護(hù)細(xì)胞上。IgM是人體與抗原初次接觸時(shí)分泌的免疫球蛋白。它們是由漿細(xì)胞 釋放的第一類免疫球蛋白。IgM在血液中的存在提示現(xiàn)癥感染。免疫球蛋白經(jīng)木瓜蛋白酶酶性蛋白水解產(chǎn)生2個(gè)相同的被稱為Fab 片段(抗原結(jié)合片段)的片段和一個(gè)Fc片段(可結(jié)晶部分)。Fc片段提供了 免疫球蛋白的效應(yīng)器功能。經(jīng)胃蛋白酶蛋白水解，產(chǎn)生了 F(ab')2片段，其中所述兩個(gè)Fab片段 仍然通過(guò)兩個(gè)二辟b鍵連接，而所述Fc片段被裂解成幾個(gè)肽。所述F(ab')2 片段從兩個(gè)Fab'片段(一個(gè)Fab'片段由一個(gè)Fab和鉸鏈區(qū)組成)形成，通過(guò) 相互懸鏈的二硫鍵連接以形成F(ab') 2。術(shù)語(yǔ)"色譜層析"指分離混合物組分的方法，所述方法基于它們被合 適介質(zhì)的選4奪性保留。發(fā)明詳述首先，本發(fā)明涉及作為藥用產(chǎn)品的、特異針對(duì)蟲(chóng)媒病毒的免疫球蛋白及F(ab)'2和/或Fab片段的濃縮物。自從Cohn開(kāi)發(fā)了乙醇沉淀方法(Cohn et al. 1946， J. Am. Chem. Soc. 68， 459; Oncley et al. 1949， J. Am. Chem. Soc. 71， 541)，使用富含免疫球 蛋白的人類血漿部分治療各種感染或先天性免疫缺陷已為人所知。這種包含抗體結(jié)合部位的F(ab)'2或Fab片段可能已經(jīng)失去了衍生它 們的完整抗體的若干特性，例如結(jié)合到Fcy受體的能力。能夠用本發(fā)明提及的濃縮物治療的所述蟲(chóng)媒病毒可以是，例如，登 革熱病毒、黃熱病毒、西尼羅病毒、切昆貢亞熱病毒、羅斯河病毒、阿 尼昂尼昂病毒或馬雅羅病毒中的一種。在如本發(fā)明所述的濃縮物中，特異性針對(duì)蟲(chóng)媒病毒的免疫球蛋白A、 G和/或M的混合物與Ig A、 G和/或M的F(ab)'2和/或Fab片段之間的 所有組合都是可能的。特別地，本發(fā)明所述的濃縮物是特異性針對(duì)蟲(chóng)媒病毒的免疫球蛋白 A、 G和M與F(ab)'2和/或Fab片段的濃縮物。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的濃縮物是特異性針對(duì)蟲(chóng)媒病毒的只有免疫球 蛋白G或只有免疫球蛋白M，以及F(ab)'2和/或Fab片段的濃縮物。特別優(yōu)選地，本發(fā)明所述的濃縮物是由特異性針對(duì)蟲(chóng)媒病毒的只有 免疫球蛋白G以及Ig G和Ig M的F(ab)'2和/或Fab片段組成的。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的濃縮物包含至少50%的IgG免疫球蛋白，90% 至98%的與特異針對(duì)人體免疫球蛋白的抗體進(jìn)行反應(yīng)的蛋白，特別包含 5%至50°/。的F(ab)'2和/或Fab，特別包含至少50至60 g/L的Ig和片段用 于藥物制備。根據(jù)本發(fā)明，1至10 mmol的4美和/或鋅可以添加到濃縮物中。 本發(fā)明的另 一個(gè)主題在于使用本發(fā)明所述的濃縮物制備用于治療所 述蟲(chóng)媒病毒的藥用產(chǎn)品。這種治療是預(yù)防性和/或治愈性的。它用于向在傳染病地區(qū)未被感染 的人提供被動(dòng)免疫，或者用于治療已經(jīng)被病毒感染的患者。所述藥用產(chǎn)品可以通過(guò)局部、口服、粘膜、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)途徑給予。這種給藥在幾周內(nèi)有效，大約是21天。超過(guò)了這個(gè)時(shí)間，如果傳染 病或癥狀仍存在，必須重復(fù)給藥。本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明所述的濃縮物的方法。本方法包括將特異針對(duì)蟲(chóng)媒病毒的免疫球蛋白的濃縮物與特異針對(duì)同一蟲(chóng)媒病毒，且經(jīng)蛋白水解獲得了特異性針對(duì)該蟲(chóng)J;某病毒的F(ab)'2和 Fab片段的免疫球蛋白的濃縮物混合。本方法因此需要制備至少一種免疫 球蛋白的濃縮物。本發(fā)明從建立至少由1000份捐獻(xiàn)的血漿組成的血漿庫(kù)開(kāi)始，每份捐 獻(xiàn)的血漿都包含針對(duì)所述蟲(chóng)媒病毒的足夠滴度的Ig。當(dāng)通過(guò)諸如酶聯(lián)免 疫吸附測(cè)定方法測(cè)定滴度時(shí)，包含足夠滴度的血清相當(dāng)于，例如，被稀 釋到1/1000后抗-切昆貢亞熱的抗體檢測(cè)仍呈現(xiàn)陽(yáng)性的血清。這些捐獻(xiàn)的血漿來(lái)自于已經(jīng)接觸疾病的人或已經(jīng)產(chǎn)生疾病的患者?？梢园凑誄. van de Water et al.， Journal of Immunological Methods, 166 (1993)， 157-164進(jìn)行滴定。為了使血漿庫(kù)富含免疫球蛋白，被稱為"脂類和蛋白污染物"的血漿 的其他組分以一步法^皮沉淀。這種通過(guò)一步法沉淀的純化可以通過(guò)在如 Steinbuch (Steinbuch M.， Archiv. Biochem. Biophys., 134， 279畫(huà)284)戶斤述^J 沉淀?xiàng)l件下稀釋血漿并加入辛酸進(jìn)行。它還可以通過(guò)在存在諸如例如磷 酸三釣和皂粘土等吸附劑的條件下加入諸如，例如利凡諾、氯化鋁、西 吡氯4妄、辛酸、多聚^l酸鹽的沉淀劑來(lái)獲得。由沉淀產(chǎn)生的上清液可以構(gòu)成免疫球蛋白濃縮物。因此，它包含IgG、 IgA和IgM的混合物。這種上清液被回收，例如通過(guò)過(guò)濾，任選地通過(guò) 力口入至少 一種過(guò)濾添加劑。將由離心或過(guò)濾產(chǎn)生的上清進(jìn)行病毒滅活處理，諸如，例如利用溶 劑/去污劑(TritonX100)進(jìn)行常規(guī)的病毒滅活處理。如果實(shí)施的沉淀是如上所述的"辛酸"型沉淀，上清中的辛酸殘留物 用P04釣去除。為了得到IgG、 IgA或IgM的濃縮物，可以應(yīng)用專利EP1385886中 描述的方法，特別是涉及pH值調(diào)節(jié)、吸附到預(yù)載柱、將包含免疫球蛋白 和伴隨蛋白的上清吸附到柱、洗柱以及例如IgG、 IgA或IgM的各種免疫 球蛋白類型的連續(xù)洗脫的方法。病毒滅活步驟之后，上清經(jīng)過(guò)在堿性pH 下進(jìn)行的通過(guò)陰離子交換器色譜層析的附加純化步驟。特別地，上清的 pH值;故預(yù)先調(diào)整到8.9至9.1，且用pH為8.9至9.1的M^沖液裝載所述 柱。色譜層析步驟使免疫球蛋白吸附到柱上并使未被截留蛋白進(jìn)入流出 液。色譜層析可以在例如結(jié)合了 DEAE、 TMAE或QAE基團(tuán)的網(wǎng)狀多糖 或乙烯聚合物凝膠上進(jìn)行。用與裝載緩沖液相同的緩沖液洗柱去除未截留蛋白后，免疫球蛋白G 被用pH值為4至7，優(yōu)選pH 6.2的磷酸鹽緩沖液洗脫。用pH值為6至6.3,補(bǔ)充有100至175 mM，優(yōu)選為150 mM的氯化 鈉的相同磷酸鹽緩沖液進(jìn)行的可任選的后續(xù)洗脫可以被用于收集IgA。用pH值^皮調(diào)整到6至7且補(bǔ)充有250至350 mM，優(yōu)選為300 mM 氯化鈉的相同磷酸鹽緩沖液進(jìn)行的可任選的后續(xù)洗脫可以被用于收集 IgM。通過(guò)混合如上所述的濃縮物，可以得到IgA、 IgG和IgM間的任何類 型混合物。如此洗脫和收集的免疫球蛋白可以通過(guò)超濾方法濃縮，例如先通過(guò) 常規(guī)的滅菌過(guò)濾，然后通過(guò)孔隙從100降至15納米的納米過(guò)濾器過(guò)濾。向經(jīng)過(guò)濃縮和過(guò)濾的免疫球蛋白溶液中加入藥學(xué)上可接受的穩(wěn)定 劑，例如在專利申請(qǐng)WO2004/091656中描述的那些，然后將這一溶液包 裝為無(wú)菌溶液并且任選地將其冷凍和/或凍干。納米過(guò)濾技術(shù)的應(yīng)用使去除那些抵抗病毒滅活溶劑/去垢劑處理的病 毒成為可能。由此獲得的免疫球蛋白濃縮物的部分，或通過(guò)上述方式獲得的免疫 球蛋白另 一濃縮物，經(jīng)受蛋白水解得到F(ab)'2或Fab片段。然后將蛋白 水解產(chǎn)生的Ig濃縮物和片段的混合物混合。因此，通過(guò)如下步驟獲得IgG及IgG和IgM的F(ab)'2和/或Fab的 濃縮物(1) 制備上述的IgG濃縮物，(2) 制備上述的IgM濃縮物，(3) 將一部分IgG濃縮物和一部分IgM濃縮物混合并消化，以獲得 IgG和IgM的F(ab)'2和/或Fab片段的混合物，(4) 混合(1)和(3)。為了得到F(ab)'2片段，在pH4.0、 35。C條件下用1%的胃蛋白酶進(jìn) 行蛋白水解，所述百分比對(duì)應(yīng)于胃蛋白酶與濃縮物中蛋白重量的總重的 重量比(IGLOO操作)。為了得到Fab片段，用1%的木瓜蛋白酶進(jìn)行蛋白水解，該百分比對(duì) 應(yīng)于木瓜蛋白酶與濃縮物中蛋白重量的總重的重量比。免疫球蛋白G、 A和/或M的蛋白水解還可以通過(guò)使用纖溶酶和/或 胰蛋白酶進(jìn)行，這些蛋白酶的實(shí)際應(yīng)用為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。下面公開(kāi)的實(shí)施例描述了本發(fā)明的特定實(shí)施方案，但并不應(yīng)該被認(rèn) 為限定其范圍。實(shí)施例1:抗-切昆貢亞熱病毒的免疫球蛋白濃縮物的制備 1-1.血漿庫(kù)的建立從近期被切昆貢亞熱病毒感染且被從疾病征狀中治愈的志愿捐獻(xiàn)者 中采集1升富含抗-切昆貢亞熱病毒抗體的血漿?？贵w滴度通過(guò)酶聯(lián)免疫 吸附測(cè)定方法測(cè)定，所述方法在于將病毒抗原固定于微量滴定板上，然 后通過(guò)針對(duì)免疫球蛋白的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記試劑顯示特異抗體。為建 立所述的血漿庫(kù)，在使用"特異的"酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法的情況下，至 少1/1000稀釋的陽(yáng)性測(cè)定樣本才能被保留。1-2.免疫球蛋白的制備經(jīng)1-1步驟得到的血漿庫(kù)被冷卻到-3。C,并且在冷卻過(guò)程中加入一定 體積的乙醇，所述乙醇體積足以得到8%的終乙醇濃度。棄除由此形成的 沉淀。然后將上清的pH值調(diào)整到5.9，如通過(guò)加入乙酸緩沖液，冷卻到-5。C， 最后加入一定體積的乙醇，所述體積足以得到19°/。的終乙醇濃度。由此形成的沉淀通過(guò)例如離心法被收集，且重懸于例如乙酸緩沖液中以獲得4.7至4.9的終pH值。然后在20°C下加入辛酸，強(qiáng)烈攪拌，以獲得20 g/1的終辛酸濃度。由此形成的沉淀通過(guò)離心法或沖積過(guò)濾被分離并棄除。將磷酸三4丐 或活性炭加入到上清中，然后通過(guò)深床過(guò)濾澄清混合物。將包含從澄清步驟得到的上清的免疫球蛋白的pH值通過(guò)例如添加 氫氧化鈉/甘氨酸緩沖液調(diào)整到pH 9,并將上清應(yīng)用到陰離子交換柱(例如 Fractogel TMAE),所述陰離子交換柱在pH為9的條件下用pH為9的甘 氨酸/氯化鈉緩沖液裝載。用加載緩沖液進(jìn)行沖洗直至柱流出液在280nm處的OD接近在確立 基線時(shí)被測(cè)量的OD28Q。然后用pH值為6.2的第一磷酸鈉緩沖液進(jìn)行IgG洗脫。用補(bǔ)充有300 mM氯化鈉的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行第二次洗脫。相應(yīng)的洗脫物包含IgA、 IgM和部分IgG4。在EP 1385886中公開(kāi)了 純化的具體操作過(guò)程。1-3.抗切昆貢亞熱的活性濃縮物的制備回收包含IgG的第一洗脫物的25%,并將其加入到包含IgG4、 IgA 和IgM的洗脫物。這種免疫球蛋白的混合物通過(guò)在膜上進(jìn)行超濾，；波濃 縮到50g/1，所述膜的截留閾值等于或小于30kD。通過(guò)針對(duì)pH值為3.8至4.2的檸檬酸鹽緩沖液的透析過(guò)濾調(diào)整所述 濃縮混合物的pH值，以獲得包含在這一范圍內(nèi)的酸性PH值。所述溶液 中加入胃蛋白酶(10000 FlP/mg)，以使胃蛋白酶的量達(dá)到濃縮混合物中包 含的蛋白總量的1%。然后將所述溶液在無(wú)菌條件下于0.2 (am處過(guò)濾， 并在37。C下孵育20小時(shí)。孵育后，中和蛋白水解液，例如通過(guò)添加pH值為6.2+/-0.2的氫氧 化鈉。中和的蛋白水解液被針對(duì)pH值為6.2+/-0.2的甘氨酸緩沖液進(jìn)行 透析過(guò)濾，直到OD280達(dá)到約0.005 ，所述OD280在30kD截留閾值膜的過(guò) 濾線上被測(cè)量。經(jīng)胃蛋白酶水解產(chǎn)生的大小等于或小于30 kD的肽在經(jīng)過(guò)截留閾值膜時(shí)被棄除。由此得到的蛋白水解物包含F(xiàn)ab片段、F(ab)'2片段，但缺 少Fc片段。然后將得到的蛋白水解物與包含IgG的第 一洗脫物的剩余75%混合。 接著將所述混合物通過(guò)超濾方法濃縮，依賴于所選擇的給藥途徑，達(dá)到 范圍在50至160 g/1的終濃度。濃縮物的滴度依照在Edelman， R等 (American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 62(6)， 2000， 681-685) 中描述的方法被測(cè)量。由此得到的濃縮物中抗-切昆貢亞熱特異性抗體的 滴度至少高于初始血漿的3至10倍。1-4.制備物的用途經(jīng)1-3步得到的濃縮物通過(guò)與包含藥學(xué)上可接受的賦形劑的制劑混 合被穩(wěn)定，所述賦形劑是諸如例如終濃度為0.22M,的甘氨酸，或諸如在 專利申請(qǐng)WO 2004/091 656中描述的那些。加到濃縮物中的制劑的pH值 與獲得液體混合物是一致的，所述pH值范圍為4.2至5.6。依賴于接受者的靜脈狀態(tài)，可以通過(guò)例如靜脈內(nèi)、皮下或肌內(nèi)的途 徑給藥得到的液體混合物。給予的劑量對(duì)應(yīng)于0.2至0.8ml/kg，在流行病的情況下，作為預(yù)防措 施可以每3周一次給予特殊暴露的患者，如老人、孕婦或新生兒。
權(quán)利要求
1.作為藥用產(chǎn)品的特異針對(duì)蟲(chóng)媒病毒的免疫球蛋白及F(ab)′2和/或Fab片段的濃縮物。
2. 如權(quán)利要求1所述的濃縮物，其中所述蟲(chóng)媒病毒是登革熱病毒、 黃熱病病毒、西尼羅病毒、切昆貢亞熱病毒、羅斯河病毒、阿尼昂尼昂 病毒或馬雅羅病毒中的一種。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的濃縮物，其中所述免疫球蛋白是免疫球 蛋白A、 G和M。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的濃縮物，其中所述免疫球蛋白是免疫球 蛋白G。
5. 如權(quán)利要求1或2中所述的濃縮物，其中所述免疫球蛋白是免疫 球蛋白M。
6. 如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的濃縮物，其中包含90%至98% 的免疫球蛋白及F(ab)'2和/或Fab。
7. 如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的濃縮物，其中包含5°/。至50% 的F(ab)'2和/或Fab。
8. 如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的濃縮物，其中所述的F(ab)'2和 /或Fab片段是IgG和/或IgM的F(ab)'2和/或Fab片段。
9. 如權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的濃縮物，其中將1至10 mmol 的鎂加入其中。
10. 如4又利要求1至9中任一項(xiàng)所述的濃縮物，其中將1至lOmmol 的辭力口入其中。
11. 權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所定義的濃縮物用于制備治療所述蟲(chóng) 媒病毒的藥用產(chǎn)品的用途。
12. 如權(quán)利要求11中所述的用于制備藥用產(chǎn)品的用途，所述藥用產(chǎn) 品以通過(guò)局部、皮下、口月良、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)途徑給藥的形式存在。
13. 制備如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的濃縮物的方法，其中所述 方法包括下述步驟-建立至少由1000份捐獻(xiàn)的血漿組成的庫(kù)，每份捐獻(xiàn)血漿包含針對(duì) 所述蟲(chóng)媒病毒的足夠滴度的Ig，畫(huà)以一步法沉淀脂類和蛋白污染物， -在上清(l)中回收Ig濃縮物，-將一部分較初期濃縮物經(jīng)受蛋白水解，以獲得F(ab)'2和/或Fab片 段(2)，-混合組分(1)和(2)。
14. 制備如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的濃縮物的方法，其中所述方 法包括下述步驟-建立至少由1000份捐獻(xiàn)的血漿組成的庫(kù)，每份捐獻(xiàn)血漿包含足夠 滴度的抗-切昆貢亞熱的Ig,-以一步法沉淀脂類和蛋白污染物，-在堿性pH條件下于陰離子交換器上對(duì)上清進(jìn)行色譜層析，-用pH值為4至7的磷酸鹽緩沖液洗脫IgG,以獲得IgG濃縮物(l),-任選地，隨后用添加了 100至175mM,優(yōu)選為150mM的氯化鈉的相同磷酸鹽緩沖液在pH值為6至6.3的條件下洗脫IgA(l),-任選地，隨后用PH值為6至7且添加了 250至350 mM氯化鈉的相同磷酸鹽緩沖液洗脫IgM(l),-任擇地，混合IgG、 IgA和IgM濃縮物(l),-將一部分較初期濃縮物進(jìn)行蛋白水解，以獲得F(ab)'2和/或Fab片 段(2)，-混合組分(1)和組分(2)。
15. 如權(quán)利要求14中所述的方法，其中將上清的pH值調(diào)整到8.9至 9.1，并且在色譜層析之前將色譜層析柱用pH值為8.9至9.1的緩沖液裝 載。
16. 制備如權(quán)利要求4和8中所述的濃縮物的方法，其中所述方法包 括下述步驟(1) 制備如權(quán)利要求14或15中所述的IgG的濃縮物，(2) 制備如權(quán)利要求14或15中所述的IgM的濃縮物，(3) 將所述IgG濃縮物的一部分和所述IgM濃縮物的一部分混合并 進(jìn)行蛋白水解，以獲得IgG和IgM的F(ab)'2和/或Fab片段，(4) 混合(1)和(3)。
17. 如權(quán)利要求13至16中任一項(xiàng)所述的方法，其中獲得F(ab)'2片 段的蛋白水解在胃蛋白酶占蛋白重量的1%、 pH值為4、 35。C的條件下 發(fā)生。
18. 如權(quán)利要求13至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的獲得Fab 片段的蛋白水解發(fā)生在木瓜蛋白酶存在時(shí)。
19. 如權(quán)利要求13至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述沉淀是辛酸 的沉淀，并且其中通過(guò)P04鈣去除上清中的辛酸殘留物。
20. 如;K利要求13至19中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述沉淀物在加 入至少 一種過(guò)濾添加劑后^皮過(guò)濾分離。
21. 如權(quán)利要求13至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述上清通過(guò)溶 劑/去垢劑處理。
22. 如權(quán)利要求13至21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述洗脫的免疫 球蛋白通過(guò)超濾方法濃縮，先進(jìn)行常規(guī)的滅菌過(guò)濾法，然后再通過(guò)孔隙 從100納米縮小至15納米的納米過(guò)濾器過(guò)濾。
23. 如權(quán)利要求13至22中任一項(xiàng)所述的方法，其中將藥學(xué)上可接受 的穩(wěn)定劑添加到經(jīng)濃縮和過(guò)濾的免疫球蛋白的溶液中，然后將所述溶液 包裝成無(wú)菌溶液并且可任選地將其冷凍和凍干。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療蟲(chóng)媒病毒的新的藥用產(chǎn)品，即特異針對(duì)所述蟲(chóng)媒病毒的免疫球蛋白及F(ab)′2和/或Fab片段的濃縮物，以及其制備方法。
文檔編號(hào)C07K16/10GK101410136SQ200780011078
公開(kāi)日2009年4月15日 申請(qǐng)日期2007年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月31日
發(fā)明者羅蘭·施米特赫斯勒爾 申請(qǐng)人:分餾及生物技術(shù)法國(guó)實(shí)驗(yàn)室股份公司