專利名稱：：用于蛋白質(zhì)純化的吸附劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及化合物及其作為親和配體用于蛋白質(zhì)純化的用途。
背景技術(shù)：
：抗體是具有基本單體結(jié)構(gòu)單元的免疫球蛋白糖蛋白。所述單體是由四條多肽鏈(其中兩條是相同的重鏈，兩條是相同的輕鏈，通過二硫橋相連)組成的Y形蛋白質(zhì)。存在五種不同類型的重鏈(Y、ft、《、s和5)，它們可用于區(qū)分免疫球蛋白的種類(分別是IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)。還存在由不同基因產(chǎn)物所產(chǎn)生的兩種不同類型的輕鏈U和K)。IgG(大小約150kD的單體免疫球蛋白)提供了對抗入侵病原體的基于抗體的免疫性，由于IgG在體內(nèi)對特異性抗原具有高度特異性，因此它是免疫學(xué)研究和臨床診斷中最常用的試劑。單克隆抗體(本文中稱為Mab)是對單一抗原具有相同特異性的抗體，其由單一克隆細胞所形成的細胞系所產(chǎn)生。Mab構(gòu)成了生物藥品產(chǎn)業(yè)中增長最迅速的部分，估計到2010年其銷售額將達到300億美元(美國)。在近20年來，來自哺乳動物細胞培養(yǎng)物的抗體效價持續(xù)增加，需要可替代的下游技術(shù)和色譜吸附劑來解決Mab處理中的方法瓶頸?？贵w片段(整個抗體分子的部分)提供了優(yōu)于整個抗體的幾個優(yōu)點。它們更易于生產(chǎn)且更具成本效益，由于缺乏Fc(重鏈)區(qū)，它們通過降低細胞因子釋放的風(fēng)險以及與之相關(guān)的毒性而在患者中具有較少的副作用，可將其進行修飾以包含治療性有效負載。存在幾種類型的抗體片段，其或者是通過特異性內(nèi)肽酶的酶消化而制備的IgG結(jié)構(gòu)域或者其是在細胞系中通過基因工程而得到的。這些抗體片段包括單價片段如Fab，、Fab和scFv;二價片段如F(ab，)2二聚體抗體(diabody)和微型抗體(minibody);以及多價片段如三聚體抗體(triabody)和四聚體抗體(tetrabody)。有多種抗體片段產(chǎn)品正處在用作治療劑或用于診斷的開發(fā)當(dāng)中。預(yù)塊成象應(yīng)用)中60億美元(美國)的重要份額(Holliger,P.,&HudsonP.J"iV化丑/Wedi23(9;2005)1126-1136)。大多數(shù)抗體片段產(chǎn)品缺乏蛋白A結(jié)合位點，因此與完整鏈的抗體不同，其不能通過蛋白A親和色鐠進行純化。在大多數(shù)情況下，常規(guī)色鐠技術(shù)用于純化抗體片段。蛋白L是一種源自大消化鏈球菌(i^/7toW/^/^ococcws附"gwMS)屬細菌的分子量為35000道爾頓的蛋白質(zhì)，已知其與抗體輕鏈結(jié)合，并且已對其用于純化一些抗體片段進行了研究，但并不認為蛋白L是有成本效益的，且其不能以商業(yè)量而得到。WO97/10887公開了可用作親和吸附劑的式I的基于三溱的化合物其中R是H、烷基、羥烷基、環(huán)己基、NH2、苯基、萘基、l-苯基吡唑、吲唑、苯并噻唑、苯并嗯唑或苯并咪唑，其中任一所述芳族基團均可被烷基、烷氧基、酰氧基、酰氨基、氨基、NH2、OH、C02H、磺?；?、氨基甲酰基、氨磺?；?sulphamoyl)、烷基磺?；拓账刂械囊粋€或多個所取代；一個X是N，另一個X是N、C隱C1或C-CN;Y是O、S或NRsZ是O、S或,；R2和R3各自是H、烷基、羥烷基、爺基或p-苯基乙基；Q是苯、萘、苯并噻唑、苯并嗯唑、l-苯基吡唑、吲唑或苯并咪唑；R4、Rs和R6各自是H、OH、烷基、烷氧基、氨基、NH2、酰氧基、酰基氨基、C02H、磺酸、氨基曱?；被酋；?、烷基磺?；蜇账?；n是06jp是020;和A是任選地通過間隔基(spacer)連接到含有X的環(huán)上的載體基質(zhì)。公開了式I化合物對蛋白質(zhì)(比如免疫球蛋白、胰島素、VII因子或人生長激素)具有親和力。在WO00/67卯0和WO03/097112中公開了具有相關(guān)結(jié)構(gòu)的化合物。它們對內(nèi)毒素具有親和力。WO97/10887中所公開的某些基于三溱的化合物對免疫球蛋白具有親和力。顯示這種親和力的化合物的一個實例是式II的化合物例如II的化合物能夠從復(fù)雜混合物或原料(比如人血漿)中特異性地除去免疫球蛋白。另一種類型的常見的原料是工業(yè)上生產(chǎn)的細胞培養(yǎng)上清，其中單克隆抗體以高達5g/l上清的濃度而存在。例如II的化合物還可用于從這些混合物中特異性地除去單克隆抗體，盡管已知其性能因細胞培養(yǎng)添加劑(比如普流尼克F-68(PluronicF-68))的存在而受到影響。普流尼克F-68是哺乳動物細胞培養(yǎng)中常用的消泡劑。其為聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物，分子量為約8000道爾頓。普流尼克F-68用于保護細胞免受剪切和氣泡的損傷，通常以量為1g/L用于細胞培養(yǎng)上清中。其存在可降低或消除例如II的化合物除去這些原料中的免疫球蛋白的能力，這代表了利用這些配體從哺乳動物細胞培養(yǎng)基中直接捕獲單克隆抗體的相當(dāng)大的障礙。
發(fā)明內(nèi)容出乎意料地，發(fā)現(xiàn)某些化合物(其中許多均是新的)甚至在存在化合物比如普流尼克F-68的情況下可用于免疫球蛋白(包括但不限于單克隆抗體和抗體片段)的基于親和力的純化。用于本發(fā)明的化合物是式III的化合物其中A是H、烷基、芳基、羥烷基、環(huán)己基、氨基或雜環(huán)基，例如萘基、l-苯基吡唑、吲唑、苯并噻唑、苯并嗯唑或苯并咪唑，其中任一所述芳族基團均可包含另一個稠合的環(huán)并且可被烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、酰氨基、氨基、OH、C02H、磺?；?、氨基曱?；?、氨磺?；⑼榛酋；拓账刂械囊粋€或多個所取代；一個X是N，另一個X是N、C-C1或C-CN;Y是O、S或NR2;Z是O、S或NRs;R2和R3各自是H、烷基、羥烷基、芐基或p-苯基乙基；Q是苯、萘、苯并噻唑、苯并嗯唑、l-苯基吡唑、吲唑或苯并咪唑；R4、Rs和R6各自是H、OH、烷基、芳基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、氨基、酰氧基、酰氨基、C02H、磺酸、氨基甲?；被酋；?、烷基磺?；蜇账?，或者R4、Rs和R6中的兩個或多個相連接形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)；U和V是相同或不同的d-K)直鏈亞烷基，其任選地被羥基、烷基、芳基、羥烷基、p-苯基乙基和卣素中的一個或多個所取代，比如CHOH;以及A是任選地通過間隔基連接到含有X的環(huán)上的載體基質(zhì)。此外，本發(fā)明的化合物包括對應(yīng)的配體，其中A被直接或間接與三喚環(huán)相連的官能團所替代，所述官能團可被固定到載體基質(zhì)上。在下文中，術(shù)語"配體"和"吸附劑"可互換使用。實施方式WO97/10887、WO00/67卯0和WO003/097112公開了如何在固體栽體上構(gòu)建配體組合文庫。它們的公開內(nèi)容(包括與本發(fā)明共同的實施方案和方法的實施例)通過參考并入本文。在利用含有白蛋白、免疫球蛋白和普流尼克F-68的原料篩選一套這些組合文庫的過程中，多種配體被鑒定為能夠選擇性結(jié)合和洗脫免疫球蛋白?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備用于本發(fā)明的式III化合物。這些方法描述于上述的3篇PCT公開文獻中；可容易地采用它們來制備新化合物。在用于本發(fā)明的化合物中，優(yōu)選&和/或QR4R5R6是環(huán)狀結(jié)構(gòu)或者包含環(huán)狀結(jié)構(gòu)；任一個或每個環(huán)狀結(jié)構(gòu)優(yōu)選具有OH或S03H取代基。優(yōu)選地，每個X均是N。另夕卜，優(yōu)選U和/或V被取代，例如是CHOH。這些被取代的化合物均是新的。本發(fā)明優(yōu)選的結(jié)合免疫球蛋白的配體或吸附劑是式IV-XIII的那些<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>本文中所述的結(jié)合免疫球蛋白的配體可用于從復(fù)雜混合物中純化免疫球蛋白，所述復(fù)雜混合物包括但不限于人血漿和重組發(fā)酵上清。下述實施例2中利用多種原料通過色鐠實驗證實了該實用性。本文中使用術(shù)語"免疫球蛋白"來描述完整的免疫球蛋白本身(包括IgG、IgA、IgM和IgE)以及具有免疫球蛋白的功能或結(jié)構(gòu)特性(例如根據(jù)與本文中所述給定化合物的親和力)的類似物。因此，分析物可以是作為免疫球蛋白的功能片段的蛋白質(zhì)，或具有一個、多個或全部相同結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)類似物，或融合蛋白。任選的連接子可包括將本發(fā)明的配體與載體基質(zhì)相連接并使所述配體與所述載體基質(zhì)表面間隔開的任何方式。所述載體基質(zhì)可包含任何材料，可溶性或不溶性的、顆粒或非顆粒(包括纖維和膜)、多孔或非多孔的。其提供了一種將本發(fā)明的配體從接觸溶液的溶質(zhì)中分離出來的便利方法。載體基質(zhì)和任選的連接子A的實例包括碳水化合物基質(zhì)(比如瓊脂糖、纖維素、葡聚糖、淀粉、藻酸鹽或角叉菜膠)、合成聚合物基質(zhì)(比如聚苯乙烯、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、聚曱基丙烯酸酯(例如聚(羥乙基甲基丙烯酸酯))、聚乙烯醇、聚酰胺或全氟化碳)、無機基質(zhì)(比如玻璃、二氧化硅或金屬氧化物)以及復(fù)合材料。以下實施例舉例說明本發(fā)明。實施例1-吸附劑的合成所述類型吸附劑的合成在WO97/10887、WO00/67卯0和WO003/097112中做了i兌明。描述了吸附劑XI的合成，該合成具有代表性。將6%交聯(lián)PuraBead瓊脂糖凝膠(650g，置于RO水中)與RO水(650mL)、10M氫氧化鈉(NaOH)(88mL)和表氯醇(124mL)一起調(diào)漿。攪拌所述漿19小時以上。然后再加入10M氫氧化鈉(NaOH)(22mL)、表氯醇(37mL)，并攪拌所述漿1.5小時以上。在取出樣品供分析后，過濾漿，然后以RO水(12xlL)洗滌。環(huán)氧基的分析表明每g已沉降凝膠被21.6nmol環(huán)氧基衍生化。在加入RO水(780mL)和0.88比重的氨水溶液(200mL)之前將所述凝膠的溶劑排空。將混合物攪拌并加熱至40'C，然后在此溫度下攪拌16小時以上。在取出樣品供分析后，過濾漿，然后以12xlLRO水洗滌(12xlL)。胺基的TNBS分析表明每g已沉降凝膠被20.8nmol胺基衍生化。將已沉降的胺化凝膠(475g)在1M磷酸鉀(475mL)中調(diào)漿并使之沉降。然后加入1M磷酸鉀(140mL),劇烈攪拌混合物，加入丙酮(70mL)。在一次性地全部加入在冷丙酮(120mL)中的氰尿醜氯(11.9g)之前，將混合物在冰鹽浴中冷卻至0'C。將漿在0-4。C攪拌1小時以上，之后排水，然后用50%v/v丙酮水溶液(5x500mL)、RO水(5x500mL)、50%v/v丙酮7JC溶液(5x500mL)和RO7JC(10x500mL)洗滌。分析表明每g已沉降凝膠上連接了25nmol二氯三嗪基。將二氯三溱基瓊脂糖(50g)在RO水(55mL)中調(diào)漿。將鹽酸去甲苯福林(1.99g)溶于RO水(15mL)中，加入10MNaOH(0.95mL)，在將所述混合物加入到二氯三溱基瓊脂糖中之前，在冰上冷卻混合物。使混合物在60'C反應(yīng)19小時以上。在將凝膠貯存于冷室中20%乙醇水溶液中之前，用50%DMF(5x100mL)、ROK(5x100mL)、0.1MHC1(5x100mL)、30%IPA/0.2MNaOH(5x100mL)、RO水(10x100mL)、和20%乙醇水溶液(3x100mL)洗滌凝膠。實施例2-色鐠法利用表l中列出的每種吸附劑進行色譜實驗。對所有實驗來說，使用床高5.5cm、柱體積(CV)4.3mL、直徑1cm的柱，其中線性流速為300cm/小時。最初用10CV的pH7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)平衡吸附劑，然后負載下述樣品純IgG、IgG原料1(1g/LIgG、1g/L普流尼克F-68、以及其它蛋白質(zhì)以模擬細胞培養(yǎng)上清)或IgG原料2(1g/LIgG、1g/L普流尼克F-68并含有5%胎牛血清)、或濃度高達30g/L吸附劑的鼠IgGi原料。然后在用5CVpH3.5的50mM檸檬酸洗脫IgG之前，用10CVpH7.4的PBS洗滌吸附劑。然后將吸附劑用5CV0.5M氫氧化鈉進行原位清洗(CIP)，然后用7CVpH7.4的PBS進行重新平衡。在色鐠實驗后，通過濁度法、A280、HPLC或GPC評價負載物(load)、負載后洗滌液、洗脫液和CIP級分中的IgG含量以評價結(jié)合能力和洗脫能力，通過SDSPAGE分析以評價純度。結(jié)合能力和洗脫能力歸納于表l中。純IgG原料在pH7.4的PBS中含有1g/L多克隆IgG，并且存在或不存在1g/L普流尼克F-68。模擬品原料1含有在CHO細胞培養(yǎng)基中的1g/L多克隆IgG、1g/L馬肌紅蛋白、5g/L人血清白蛋白和1g/L普流尼克F-68。模擬品供料原料2含有在CHO細胞培養(yǎng)基中的1g/L多克隆IgG、5%胎牛血清和1g/L普流尼克F-68。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>洗脫緩沖液50niMpH3.5的檸檬酸,含有30%乙二醇和Na('l為評價所述材料的純化能力，還研究了吸附劑XI的色鐠性能。使用床高2.5cm、柱體積(CV)2.0mL、直徑1cm的柱完成實驗，其中線性流速為50cm/小時(保留時間3分鐘)。最初用10CVpH7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)平衡吸附劑。向柱上加載60mL在CHO(中國倉鼠卵巢)細胞培養(yǎng)上清中的IgGi至濃度為54g/L吸附劑。然后在用5CVpH3.0的50mM杼檬酸鈉洗脫IgG之前，用10CVpH7.4的PBS洗滌吸附劑。然后將吸附劑用5CV0.5M氫氧化鈉進行原位清洗(CIP),然后用7CVpH7.4的PBS進行重新平衡。在整個色語過程中收集級刺2mL)并分析IgG含量(蛋白AHPLC)、DNA含量(Picogreen分析)和總蛋白質(zhì)(Bradford總蛋白質(zhì)測定)。IgG!對吸附劑XI的突破曲線(breakthroughprofile)表明結(jié)合能力為21.6g/L，洗脫能力為20.9g/L。利用凝膠滲透色譜，被洗脫的IgG的純度測定為92.8%，吸附劑XI的DNA清除率為2個對數(shù)級。利用吸附劑XI，使用通過酶(胃蛋白酶)消化而制備的抗體片段完成色譜實驗。胃蛋白酶是僅在酸性PH下有活性而在中性或堿性pH下則不可逆地變性的非特異性內(nèi)肽酶。胃蛋白酶消化導(dǎo)致形成一個F(ab，)2片段和Fc片段的幾個小肽。通過使IgG與胃蛋白酶在pH4.0下于37。C接觸1小時而制備人、綿羊和牛多克隆抗體的片段(混合的抗體群)。通過調(diào)節(jié)pH到7.0以上而停止消化，通過凝膠過濾分離F(ab，)2片段。研究吸附劑XI的色鐠性能以評價用于抗體片段的材料的純化能力。使用床高2.511、柱體積(CV)2.0mL、直徑1cm的柱完成實驗，其中線性流速為50cm/小時(保留時間3分鐘)。最初用10CVpH7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)平衡吸附劑。每mL吸附劑負栽約20mgF(ab，)2片段。然后在用5CVpH3.0的50mM檸檬酸鈉洗脫所述片段之前，用10CVpH7.4的PBS洗滌吸附劑。然后將吸附劑用5CV0.5M氫氧化鈉進行原位清洗(CIP)，然后用7CVpH7.4的PBS進行重新平衡。所有實驗的對照均是蛋白質(zhì)L吸附劑(使用與吸附劑XI相同的實驗條件)。收集來自色鐠柱的每個級分并利用Western印跡技術(shù)進行分析。該技術(shù)表明吸附劑XI與人的k和X輕鏈以及綿羊和牛的F(ab，)2片段結(jié)合；蛋白質(zhì)L僅與人的k輕鏈結(jié)合而不與綿羊和牛的片段結(jié)合。權(quán)利要求1.親和吸附劑用于蛋白質(zhì)物質(zhì)的分離、去除、離析、純化、表征、鑒定或定量的用途，其中所述親和吸附劑是式III的化合物其中R1是H、烷基、芳基、羥烷基、環(huán)己基、氨基或雜環(huán)基，其任選地被烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、酰氨基、氨基、OH、CO2H、磺?；被柞；被酋；⑼榛酋；望u素中的一個或多個所取代；一個X是N，另一個X是N、C-Cl或C-CN；Y是O、S或NR2；Z是O、S或NR3；R2和R3各自是H、烷基、羥烷基、芐基或β-苯基乙基；Q是苯、萘、苯并噻唑、苯并噁唑、1-苯基吡唑、吲唑或苯并咪唑；R4、R5和R6各自是H、OH、烷基、芳基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、氨基、酰氧基、酰氨基、CO2H、磺酸、氨基甲酰基、氨磺?；?、烷基磺酰基或鹵素，或者R4、R5和R6中的兩個或多個相連接形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)；U和V是相同的或不同的C1-10直鏈亞烷基，其任選地被羥基、烷基、芳基、羥基烷基、β-苯基乙基和鹵素中的一個或多個所取代；并且A是任選地通過間隔基連接到含有X的環(huán)上的載體基質(zhì)。2.權(quán)利要求l的用途，其中&和/或QR4RsR6是環(huán)狀結(jié)構(gòu)或者包含環(huán)狀結(jié)構(gòu)。3.權(quán)利要求2的用途，其中任一個或每個環(huán)狀結(jié)構(gòu)具有OH或S03H取代基。4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的用途，其中U和V中任一個或每一個是CHOH。5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的用途，其中每個X均是N。6.權(quán)利要求l的用途，其中所述吸附劑是式III化合物。7.權(quán)利要求l的用途，其中所述吸附劑是式IV化合物。8.權(quán)利要求l的用途，其中所述吸附劑是式V化合物。9.權(quán)利要求l的用途，其中所述吸附劑是式VI化合物。10.權(quán)利要求l的用途，其中所述吸附劑是式VII化合物。11.權(quán)利要求l的用途，其中所述吸附劑是式VIII化合物。12.權(quán)利要求l的用途，其中所述吸附劑是式IX化合物。13.權(quán)利要求l的用途，其中所述吸附劑是式X化合物。14.權(quán)利要求l的用途，其中所述吸附劑是式XI化合物。15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述蛋白質(zhì)物質(zhì)是免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或蛋白質(zhì)。16.權(quán)利要求15的用途，其中所述物質(zhì)是單克隆抗體。17.權(quán)利要求15的用途，其中所述物質(zhì)是選自Fab、Fab，、F(ab，)2、scFV、二聚體抗體、微型抗體、三聚體抗體和四聚體抗體片段的免疫球蛋白片段。18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述蛋白質(zhì)物質(zhì)處于細胞培養(yǎng)物中。19.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述蛋白質(zhì)物質(zhì)與消泡劑相聯(lián)合。20.權(quán)利要求19的用途，其中所述消泡劑是聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物。21.如權(quán)利要求1至14中任一項所定義的式III化合物，其中U和/或v被取代。22.權(quán)利要求21的化合物，其中所述取代基是OH、芳基或鹵素。23.權(quán)利要求21的化合物，其中U和/或V是CHOH。全文摘要本發(fā)明描述了親和吸附劑用于蛋白質(zhì)物質(zhì)的分離、去除、離析、純化、表征、鑒定或定量的用途，其中所述親和吸附劑是式(III)的化合物，其中R₁是H、烷基、芳基、羥烷基、環(huán)己基、氨基或雜環(huán)基，其任選地被烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、酰氨基、氨基、OH、CO₂H、磺酰基、氨基甲?；被酋；?、烷基磺酰基和鹵素中的一個或多個所取代；一個X是N，另一個X是N、C-Cl或C-CN；Y是O、S或NR₂；Z是O、S或NR₃；R₂和R₃各自是H、烷基、羥烷基、芐基或β-苯基乙基；Q是苯、萘、苯并噻唑、苯并噁唑、1-苯基吡唑、吲唑或苯并咪唑；R₄、R₅和R₆各自是H、OH、烷基、芳基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、氨基、酰氧基、酰氨基、CO₂H、磺酸、氨基甲?；?、氨磺?；?、烷基磺?；螓u素，或者R₄、R₅和R₆中的兩個或更多個相連接形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)；U和V是相同的或不同的C_1-10直鏈亞烷基，其任選地被羥基、烷基、芳基、羥基、烷基、β-苯基乙基和鹵素中的一個或多個所取代；以及A是任選地通過間隔基連接到含有X的環(huán)上的載體基質(zhì)。文檔編號C07D251/48GK101415692SQ200780011865公開日2009年4月22日申請日期2007年3月2日優(yōu)先權(quán)日2006年3月2日發(fā)明者凱利·萊里克,海倫·塔頓,詹森·理查德·貝特利,馬修·韋布申請人:普羅米蒂克生物科學(xué)有限公司