專(zhuān)利名稱(chēng)：：C-反應(yīng)蛋白的結(jié)合劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及特異性結(jié)合某種蛋白質(zhì)(在本發(fā)明中為c-反應(yīng)蛋白)的分子及其用途的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：對(duì)折疊多肽進(jìn)行重新設(shè)計(jì)的目的在于增加我們對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的了解，并且還提供了具有剪切功能的新蛋白質(zhì)的工程技術(shù)所需的平臺(tái)。經(jīng)設(shè)計(jì)的折疊多肽(其在配體的作用下發(fā)生了受到pH控制的、具有位點(diǎn)選擇性的自功能化過(guò)程)構(gòu)成了用于構(gòu)建各種復(fù)雜的分子體系的極好的工具箱，其中所述各種復(fù)雜的分子體系例如有模型糖蛋白或復(fù)雜受體。國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)WO03/080653的目的是提供經(jīng)折疊的、配體修飾的螺旋-環(huán)-螺旋的多肽支架結(jié)構(gòu)，該多肽支架結(jié)構(gòu)與識(shí)別和報(bào)告之類(lèi)的重要的生物傳感事件有關(guān)。選擇人碳酸酐酶II(HCAII)與其抑制劑(4-羧基苯磺酰胺)之間良好表征的相互作用來(lái)作為原理實(shí)證的證明。C-反應(yīng)蛋白是一種血漿蛋白，其在發(fā)炎期間以及在組織受損之后以增加的量在血流中循環(huán)。測(cè)定CRP的水平以用于評(píng)價(jià)(例如)發(fā)炎和心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)增加的程度。此外，重要的是在心臟手術(shù)期間也要測(cè)量CRP的水平。發(fā)明概述本發(fā)明涉及經(jīng)進(jìn)一步修飾從而特異性地與C-反應(yīng)蛋白(CRP)結(jié)合的多肽支架結(jié)構(gòu)。在下文中，這種經(jīng)修飾的多肽支架結(jié)構(gòu)被稱(chēng)為"CRP-特異性結(jié)合劑"、"CRP-結(jié)合劑，，或簡(jiǎn)稱(chēng)為"結(jié)合劑"，除非另外指明，否則這些術(shù)語(yǔ)可交換使用。在第一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及CRP-特異性結(jié)合劑，其包含具有根據(jù)SEQIDN0:l序列的多肽，其中至少1個(gè)磷酸膽堿衍生物與所述多肽和多肽支架結(jié)構(gòu)連接，所述多肽支架結(jié)構(gòu)由四螺旋束構(gòu)成，該四螺旋束由具有根據(jù)SEQIDNO:1序列的多肽的二聚體形成，其中所述CRP-特異性結(jié)合劑通過(guò)引入包含磷酸膽堿衍生物和可任選的報(bào)告基團(tuán)的結(jié)合部分而被修飾，其中所述報(bào)告基團(tuán)可以產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。所述二聚體的2個(gè)原聚體可以通過(guò)(例如)二硫鍵而彼此共價(jià)連接，但是也可以以非共價(jià)的形式彼此結(jié)合。此外，每個(gè)原聚體都可以被用作結(jié)合劑。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生根據(jù)所述第一實(shí)施方案的多肽的方法，該方法包括以下步驟-合成具有根據(jù)SEQIDNO:l序列的多肽；衍生物與所述多肽的未封閉的賴(lài)氨酸接觸；、、'-可任選地，在適于報(bào)告基團(tuán)與賴(lài)氨酸發(fā)生連接的條件下使報(bào)告基團(tuán)與所述多肽的未封閉的賴(lài)氨酸接觸。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及根據(jù)所述第一方面的結(jié)合劑在治療和診斷應(yīng)用中以及在生物技術(shù)應(yīng)用中的用途，其中所述治療和診斷應(yīng)用例如為將所述結(jié)合劑摻入到藥物或診斷用的組合物中以及用于檢測(cè)樣品(例如得自心臟手術(shù)中的或懷疑患有炎癥的患者)中CRP的濃度的測(cè)定，其中所述的生物技術(shù)應(yīng)用例如為蛋白質(zhì)純化或結(jié)合鑒定。圖1為本發(fā)明所用的肽支架結(jié)構(gòu)的文庫(kù)的概況。圖2示出了本發(fā)明的CRP-結(jié)合劑與CRP的親和性。圖3是使用本發(fā)明的CRP-結(jié)合劑進(jìn)行CRP檢測(cè)的示意圖。圖4分別示出了天然丙酮酸激酶、與連接體結(jié)合的丙酮酸激酶以及與CRP-結(jié)合劑結(jié)合的丙酮酸激酶的活性。圖5為分別由本發(fā)明的激酶結(jié)合的CRP-結(jié)合劑和激酶結(jié)合的CRP-特異性抗體所產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度的對(duì)比圖。圖6為由檢測(cè)得自人、馬和狗的CRP所使用的、本發(fā)明的激酶結(jié)合的CRP-結(jié)合劑所產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度的對(duì)比圖。發(fā)明詳述另人驚奇的是，本發(fā)明人示出了通過(guò)將磷酸膽堿連接在某一位置處可以急劇地增加CRP與多肽支架結(jié)構(gòu)之間的結(jié)合親和力。單獨(dú)的磷酸膽堿與CRP的結(jié)合親和力為~1juM，支架多肽與CRP的結(jié)合親和力為~100-1000jjM，然而用磷酸膽堿衍生物修飾的所述多肽與crp的結(jié)合親和力可為納摩爾級(jí)。未經(jīng)修飾的支架結(jié)構(gòu)與CRP的表面結(jié)合，而磷酸膽堿衍生物被引入到所述多肽支架結(jié)構(gòu)上的結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)部的位置處或者與所述多肽支架結(jié)構(gòu)上的結(jié)合位點(diǎn)非常接近的位置處。為了到達(dá)CRP上的結(jié)合位點(diǎn)，磷酸膽堿衍生物可以具1-12個(gè)碳原子(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)碳原子)的間隔物。本發(fā)明的結(jié)合劑的另一個(gè)令人驚奇的優(yōu)點(diǎn)在于它們與得自不同哺乳動(dòng)物的CRP都具有高的親和力，這一點(diǎn)與CRP-特異性抗體截然不同，CRP-特異性抗體通常與得自一種哺乳動(dòng)物物種的CRP以高親和力結(jié)合，而與得自其他物種的CRP則以較低的親和力結(jié)合。所述多肽支架結(jié)構(gòu)還可以根據(jù)電荷的變化而改變，以便使該多肽支架結(jié)構(gòu)與CRP的結(jié)合親和力達(dá)到最佳。這可以?xún)?yōu)選地通過(guò)在所述多肽中將帶電的氨基酸殘基更換為不帶電的氨基酸殘基，或者通過(guò)使所述多肽中的氨基酸殘基帶有不同的電荷來(lái)實(shí)現(xiàn)，反之亦然。例如，Val或Ala(不帶電荷)可以更換為Glu(帶1個(gè)負(fù)電荷)或Arg(帶1個(gè)正電荷)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述多肽支架結(jié)構(gòu)具有至少2個(gè)可以分別連接CRP-結(jié)合部分和報(bào)告基團(tuán)的賴(lài)氨酸殘基?；镜亩嚯闹Ъ芙Y(jié)構(gòu)原聚體具有根據(jù)SEQIDN0:l的序列。所述原聚體可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法制備，所述方法例如有重組技術(shù)或傳統(tǒng)的自動(dòng)化固相多肽合成技術(shù)。一個(gè)或多個(gè)位置處可以為賴(lài)氨酸。這些位置優(yōu)選選自位置8、10、15、17、22、25、34和37。然后，根據(jù)以下所述的方法使CRP-結(jié)合部分和可任選的報(bào)告基團(tuán)與賴(lài)氨酸連接。所述報(bào)告基團(tuán)可以為能夠與賴(lài)氨酸殘基連接并且能夠產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的任何基團(tuán)。報(bào)告基團(tuán)的優(yōu)選實(shí)例為熒光探針，例如丹磺?；?、香豆素、熒光素、羅丹明和OregonGreen衍生物。所述報(bào)告基團(tuán)還可以是酶(例如磷酸烯醇丙酮酸激酶)或可檢測(cè)的顆粒(例如金質(zhì)納米顆粒)?？梢愿鶕?jù)供貨商的說(shuō)明書(shū)或釆用其他傳統(tǒng)方法使所述報(bào)告基團(tuán)與賴(lài)氨酸殘基連接。優(yōu)選的是，在新合成的原聚體還在樹(shù)脂上時(shí)，使所述報(bào)告基團(tuán)與所述原聚體連接。所述CRP-結(jié)合部分為包含磷酸膽堿部分和間隔物的磷酸膽堿衍生物。所述間隔物的長(zhǎng)度取決于配體與所述支架結(jié)構(gòu)連接的位置以及配體與CRP結(jié)合的位置。所述間隔物通常為l-12個(gè)碳原子的脂肪族鏈，該脂肪族鏈可任選地被親水性基團(tuán)所取代，從而增強(qiáng)其溶解性。通過(guò)使原聚體與磷酸膽堿衍生物的活性酯接觸，使得磷酸膽堿衍生物與原聚體連接。所述活性酯具有以下所示的通式OP(OH)20(CH2)2N+(CH3)2(CH2)nC00R1(I)其中1<n<12,并且W為pKa為約6-8的離去基團(tuán)。其中n為4、6或11并且W為對(duì)硝基苯基的活性酯的合成在以下的試驗(yàn)部分中有所描述。如試驗(yàn)部分所公開(kāi)的那樣將磷酸膽堿衍生物引入到多肽支架結(jié)構(gòu)中。本發(fā)明的CRP-結(jié)合劑還可以可任選地通過(guò)連接體與固體支持物結(jié)合。許多固體支持物(例如片、板、珠子和膜)和連接體是市售可得的，并且技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明的CRP-結(jié)合劑的使用環(huán)境而將它們結(jié)合起來(lái)。結(jié)合測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的一個(gè)方面涉及使用本發(fā)明的結(jié)合劑進(jìn)行的結(jié)合測(cè)定方法，更具體地說(shuō)，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于消除由生物樣品中類(lèi)風(fēng)濕因子或人抗小鼠抗體(HAMA)造成的干擾的方法。不同類(lèi)型的夾心測(cè)定法(sandwichassays):故廣泛4吏用。最普通的方法之一是夾心ELISA法，在該方法中，使用抗體來(lái)捕獲抗原并使用另一種標(biāo)記抗體來(lái)檢測(cè)結(jié)合的抗原。這些抗體通常都是哺乳動(dòng)物來(lái)源的。在所述的測(cè)定方法中，存在于樣品(通常得自諸如血液或血清之類(lèi)的體液中)中的抗哺乳動(dòng)物IgG的抗體可以通過(guò)檢測(cè)抗體與捕獲抗體相結(jié)合而模擬抗原的行為，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性反應(yīng)。這種假陽(yáng)性反應(yīng)可以在基于多克隆抗體和單克隆抗體的夾心測(cè)定中觀察到。越來(lái)越多的患者被給予小鼠單克隆抗體以進(jìn)行診斷或治療。施用單克隆抗體通常會(huì)誘導(dǎo)患者體內(nèi)發(fā)生抗體反應(yīng)12;從而產(chǎn)生人抗鼠類(lèi)動(dòng)物抗體(HAMA)。已知，當(dāng)HAMA存在于患者的血清中時(shí)，基于小鼠單克隆抗體的夾心型測(cè)定會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。隨著使用單克隆抗體進(jìn)行治療的患者的數(shù)量的增多，在臨床化學(xué)試驗(yàn)中將產(chǎn)生越來(lái)越多的問(wèn)題。此外，在許多免疫測(cè)定中，類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)是產(chǎn)生干擾的主要原因。RF是與哺乳動(dòng)物IgG的Fc部分發(fā)生反應(yīng)的自身抗體。RF可以是IgA種類(lèi)、IgG種類(lèi)或IgM種類(lèi)。在60%至80%的患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的患者的血清中具有RF活性。在患有其他相關(guān)組織疾病和許多其他疾病的患者的血清中也發(fā)現(xiàn)了RF。雖然RF與IgG的Fc-部分發(fā)生反應(yīng)，但是RF在與不同種類(lèi)的IgG的反應(yīng)性中顯示出異質(zhì)性。在涉及抗體的測(cè)定方法中，這種與其他種類(lèi)的IgG的反應(yīng)性可以產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。經(jīng)典的用于RF的試驗(yàn)為凝集試驗(yàn)，該試驗(yàn)中，RF與兩種(如果是IgM-RF試驗(yàn)，則為更多種)不同的哺乳動(dòng)物IgG分子發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致凝集。在夾心ELISA中，同樣的反應(yīng)也將產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)，這是由于在抗原(該抗原為對(duì)所述測(cè)定方法進(jìn)行設(shè)計(jì)以便將其檢測(cè)出來(lái)的抗原)不存在的情況下檢測(cè)抗體與捕獲抗體發(fā)生了結(jié)合的原因。由于抗-IgG的抗體通常直接針對(duì)IgG分子的Fc部分，所以解決上述問(wèn)題的一個(gè)方法是在所述的測(cè)定中使用Fab片段。然而，對(duì)IgG進(jìn)行酶切以產(chǎn)生Fab片段是耗時(shí)的，并且通常導(dǎo)致抗體滴度減少，并且不會(huì)降低由抗-Fab的抗體所產(chǎn)生的干擾。此外，為了避免上文中提及的問(wèn)題，已經(jīng)采用引入小鼠IgG或小鼠血清或者引入層析法來(lái)除去起干擾作用的抗體。引入正常小鼠IgG或正常小鼠血清有時(shí)不會(huì)消除假陽(yáng)性反應(yīng)。通過(guò)層析法除去起干擾作用的抗體是耗時(shí)的，并且很少適用于常規(guī)分析。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是將所述測(cè)定方法中的至少一種抗體變成根據(jù)本發(fā)明的、不會(huì)被HAMA或RF結(jié)合的結(jié)合劑。在這方面的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于測(cè)定樣品中C-反應(yīng)蛋白的濃度的方法，該方法包括-使所述樣品與根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的第一多肽二聚體接觸，其中所述第一多肽與固體支持物結(jié)合；-使所述樣品與根據(jù)權(quán)利要求3-6中任意一項(xiàng)所述的、其上連接有報(bào)告基團(tuán)的第二多肽二聚體接觸，以及-檢測(cè)所述第二多肽二聚體上所述報(bào)告基團(tuán)的存在及缺乏情況。實(shí)驗(yàn)部分磷酸膽堿衍生物PC6、PC11和PC4的合成如上文中說(shuō)明的那樣，與所述多肽支架結(jié)構(gòu)連接的磷酸膽堿衍生物可以具有1-12碳原子的間隔物。在上述磷酸膽堿衍生物中，PC表示磷酸膽堿，PC后的數(shù)字表示間隔物的長(zhǎng)度，即PC6表示具有6個(gè)碳原子的間隔物。關(guān)于PC6的合成，我們首先選擇一種如方案1所概述的簡(jiǎn)短的途徑。在第一步驟中，通過(guò)在催化氫化條件下使用甲醛將相應(yīng)氨基酸烷基化，從而以較高的產(chǎn)率制備出6-二甲基氨基己酸。使用強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換劑對(duì)所得叔胺進(jìn)行簡(jiǎn)單純化。3然后，將羧酸官能團(tuán)酯化，從而以基本定量的產(chǎn)率生成甲基酯，并且無(wú)需純化步驟。通常，隨后僅以適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)率進(jìn)行使用了溴化物的烷基化過(guò)程，其中所述溴化物是由二乙基磷酰氯和2-溴乙醇容易地制得的。4在經(jīng)過(guò)RPHPLC純化后，用氫氧化鋰使甲基酯裂解，并且以幾乎定量的產(chǎn)率得到羧酸，并且無(wú)需純化?；钚怎サ纳墒前凑誎im等人的方法使用氯曱酸對(duì)硝基苯酯、一種堿和DMAP來(lái)進(jìn)行的。5在經(jīng)過(guò)RPHPLC純化后，獲得了所述的活性酯，產(chǎn)率僅為28%。磷酸基團(tuán)的最終脫保護(hù)過(guò)程是使用TMSBr在溫和的條件下進(jìn)行的，從而沒(méi)有影響?hù)人狨ァ?另一方面，對(duì)于某些底物而言，該反應(yīng)過(guò)程中生成副產(chǎn)物是該過(guò)程的已知的缺點(diǎn)。7但是，除了單脫保護(hù)的磷酸酯和不具有磷酸基團(tuán)的季胺之外，我們得到了所需的磷酸酯，產(chǎn)率為25%。關(guān)于PC11的制備，為了避免繁瑣的純化過(guò)程和溶解性問(wèn)題，我們選擇在固相上合成的途徑(方案2)，該途徑包括若干步驟。因此，利用DIC方法使Fmoc保護(hù)的十一酸與Wang樹(shù)脂相連，產(chǎn)率為66%。8在使用哌啶脫保護(hù)后，用曱酸和硼氫化鈉完成二甲基化過(guò)程。9對(duì)季胺的烷基化步驟是緩慢的反應(yīng)過(guò)程，并需要IO當(dāng)量的溴化物并需要加熱4天。1Q在使粗產(chǎn)物從樹(shù)脂上裂解下來(lái)之后，釆用我們?cè)谥苽銹C6過(guò)程中使用的相同的方法將該粗產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚怎?。磷酸基團(tuán)的最終脫保護(hù)步驟與PC6中的過(guò)程相似，并且有副產(chǎn)物形成，但是得到了27%的所需產(chǎn)物。方案1PC6-對(duì)硝基苯基酯的合成磷酸2-溴-乙基酯二乙基酯。將由2-溴乙醇(1.42mL，20mmol)和無(wú)水吡啶(3.23mL，40mmol)在無(wú)水二氯甲烷(25mL)中形成的溶液冷卻至0C。向其中滴加二乙基磷酰氯(3.36mL，23mmol)，并在室溫下將所得的反應(yīng)混合物攪拌24小時(shí)。加入二乙酯(40mL)和1NHCl(40mL)，將形成的有機(jī)層分離出來(lái)，并用1NHC1和飽和的NaHC03進(jìn)行連續(xù)的洗滌，然后在MgSO,上干燥。在溶劑蒸發(fā)后，采用柱層析(硅膠，乙酸乙酯戊烷=1:l)純化殘余物，從而得到為淺黃色油狀物的產(chǎn)物(4.85g，18.6mmol，93%)。！11NMR(CDC13,400MHz)&=1.34(dt，6H，2xCH3，3J[H，H]=7.2Hz，4J(H，P)-1.2Hz);3.52(t，2H，CH2Br，3J=6Hz);4.13(dq，4H，2xCH2CH3，3J(H，H)=7.2Hz，3J(H，P)=7.2Hz);4.28(dt，4H，2xOCH2CH2Br，3J(H，H)=6.4Hz,3J(H，P)=8.4Hz)。13CNMR(CDC13，100.5MHz)5=16.0(d，2xCH3，3J=6.8Hz);29.4(d，CH2Br，2J-7.6Hz);64.0(d，OCH2，2J=5.3Hz);66.5(d，OCH2，2J-5.3Hz)。6-二曱基氨基己酸。在過(guò)量的甲醛(4mL)和10。/。Pd/C(0.5g)存在的條件下，在室溫、&壓力為90psi的條件下將由氨基酸(l.32g，10mmol)在水中形成的溶液在Parr裝置中氫化36小時(shí)。將催化劑通過(guò)過(guò)濾除去，并用熱水洗滌2次。將混合的水層通過(guò)DOWEX50WX2-100離子交換柱。在將該交換柱用水洗滌之后，用2y。的含水Nm)H對(duì)該柱進(jìn)行洗脫，從而得到為無(wú)色晶體的純凈產(chǎn)物(l.39g，8，7mmol,87%)。6-二甲基氨基己酸甲酯。在30分鐘內(nèi)，向由6-二甲基氨基己酸(1.37g,8.6mmol)在無(wú)水甲醇(50mL)中形成的冰冷卻的溶液中滴加亞硫酰氯(9mL)。將所得反應(yīng)混合物溫暖至室溫，并攪拌過(guò)夜。在減壓下使溶劑蒸發(fā)。反復(fù)加入甲醇，隨后再進(jìn)行蒸發(fā)，從而以幾乎定量的產(chǎn)率得到為無(wú)色固體的、純的曱基酯。'HNMR(DMSOd6，400MHz)5=1.27(m，2H，CH2);1.53(m，2H，CH2);1.63(m，2H，CH2);2.31(t，2H，I=7.6Hz，CH2);2.67(s，6H，N(CH3)2);2.96(t，2H，3J=8Hz，CH2);3.57(s，3H，COOCH》。13CNMR(DMSOd6，100,5MHz)5=23.1;23.8;25.3;32.9;41.7;51.2;56.0;173.1。三氟乙酸[2-二乙氧基-磷酰氧基]-乙基]-(5-甲氧基羰基-戊基)-二甲基銨。將曱基酯(1.73g，10mmol)溶解于無(wú)水乙腈(15mL)中，并加入K2C03(1.38g，10mmol)。將所得懸浮液在氮?dú)庀禄亓?6小時(shí)。在所得混合物冷卻至室溫后，加入水，并通過(guò)加入TFA將pH調(diào)至2。所得溶液采用rpHPLC(SupelcoDiscoveryC18，21.2mmx15cm,5fim，A:5%IPA，95%H20，0.1%TFA;B:90%IPA，10%H20,0.1%TFA;在14分鐘內(nèi)B由0%升至15%，tR=11.8min)進(jìn)行純化，并將所得物凍干，從而得到為淺黃色油狀物的TFA的季胺鹽(l.06g，3.Ommol，30%)。LC-MS(Phe誦enexGemini,C18，5jum，150x3.0mm，A:0.1%的甲酸水溶液，B:0.1%的甲酸乙腈溶液，在10分鐘內(nèi)B由10%升至50%),tR=6.4min(LSD信號(hào))，對(duì)于[M+H]+,m/z=354.2。力NMR(CD30D，400MHz)5=1.41-1.50(m，8H,2xOCH2CH3和CH》;1,77(m，2H，CH2);1.90(m，2H，CH2);2.44(t，2H，CH2，3J=7.2Hz);3.25(s，6H，N(CH3)2);3.48(m，2H，CH2);3.72(s，3H，C00CH3)3.82(m，2H，CH2);4.26(dq，4H，2xCH2CH3，3J(H，H)=6.8Hz，3j(HiP)=8.0Hz);4.58(brs，2H，CH2)。13C證(CD30D，100.5MHz)5=16.4(d，2xOCH2CH3，3J=6.1Hz);23.3(CH2);25.3(CH2);26.7(CH2);34.4(CH2);52.0(CH3);52.2(CH3);62.1(d，CH2，2J=5.3Hz);64.8(CH2);66.1(d，CH2，2J=6.1Hz);66.7(CH2);175.5(CO)。三氟乙酸(5-羧基-苯基)-[2-(二乙氧基-磷酰氧基)-乙基]-二甲基銨。將TFA的季胺鹽(200mg,0.56mmol)溶解于叔丁醇/水(2:1,9mL)的混合物中，并加入LiOHH20(47mg，1.12mmol)。將所得反應(yīng)混合物在室溫下攪拌3小時(shí)，并在減壓下除去有機(jī)溶劑。用O.1NHC1將所得含水溶液的pH調(diào)至7，隨后將該混合物凍干，并在未進(jìn)行純化的條件下進(jìn)一步使用。LC-MS(Phe誦enexGemini,C18，5|am,150x3.0mm，A:0.1%的甲酸水'溶液，B:0.1%的甲酸乙腈溶液，在10分鐘內(nèi)B由10°/。升至40%),tR=6.8min(LSDsignal),對(duì)于[M+H]+,m/z=340.2。力腿(CD3OD，400MHz)5=1.34-1.42(m，8H，2xOCH2CH3和CHJ;1.67(m,2H，CH2);1.80(m，2H，CH2);2.20(t，2H，CH2，3J=7.6Hz);3.16(s，6H，N(CH3)2);3.40(m，2H，CH2);3.72(brs，2H，CH2);4.18(dq，4H，2xCH2CH3，3J(H，H)=7.0Hz，3J(H，P)=8.0Hz);4.50(brs，2H，CH2)。13CNMR(CD3OD，100.5MHz)5=16.4(d，2xOCH2CH3，3J=6.8Hz);23.2(CH2);26,5(CH2);27.1(CH2);37.9(CH2);52.0(CH3);62.1(d，CH2，2J=4.6Hz);64.5(CH2);66.1(d，CH2，2J=6.1Hz)，66.8(CH2);181.3(CO)。三氟乙酸[2-(二乙氧基-磷酰氧基)-乙基]-二甲基-[5-(4-硝基-苯氧羰基)-戊基]-銨。向由羧酸(26mg，0.076mmol)在無(wú)水乙腈(3mL)中形成的溶液中連續(xù)加入三乙胺(O.01mL，0.084mmol)、氟甲酸對(duì)硝基苯酯(31mg，0.15mmol)和DMAP(lmg)。4小時(shí)后，通過(guò)加入0.1%的TFA水溶液4吏反應(yīng)停止，隨后采用rpHPLC(SupelcoDiscoveryC18，21.2mmx15cm，5|um，A:5%IPA，95%H20，0.1%TFA，B:90%IPA，10%H20，0.1%TFA，在12分鐘內(nèi)B由20%升至40%,tR-10.3min)進(jìn)行純化，從而得到為無(wú)色油狀物的對(duì)硝基苯酯(IOmg，0.022mmol,28%)。LC-MS(PhenomenexGemini,C18,5pm，150x3.0mm，A:0.1%的甲酸水溶液，B:0.1%的曱酸乙腈溶液，在8分鐘內(nèi)B由10%升至90%)tK-4.3min(UV信號(hào))，對(duì)于[M+H]+，m/z-461.5。^腿(CDC13，300MHz)5=1.34(t，6H，2xOCH2CH3，3J=7.2Hz);1.48(m，2H，CH2);1.81(m，4H，2xCH2);2.63(t，2H，CH2，3J=7.2Hz);3.27(s，6H，N(CH3)2);3.51(m，2H，CH2);3.92(m，2H，CH2);4.14(dq，4H，2xCH2CH3，3J(H，H)=7.5Hz，3J(H，P)=7.5Hz);4.47(m，2H，CH2);7.27(d，2H，3J=9Hz，Phe-H);8,25(d，2H，3J-9Hz，Phe-H)。13CNMR(CDC13，75.4MHz)5=16.0(d，2xOCH2CH3，3J=6.6Hz);22.4(CH2);23.8(CH2);25.4(CH2);33.6(CH2);51.6;60.8(d，CH2，2J=4.8Hz);63.3();64.7(d，CH2，2J=5.9Hz);65.7;122.5(2xPhe-CH);125.2(2xPhe-CH);145.3(Phe-C;155.3(Phe-C);170.8(CO)。三氟乙酸二曱基-[5-(4-硝基-苯氧羰基)-戊基]-(2-膦酰氧基-乙基)-銨。將被保護(hù)的對(duì)硝基苯酯(20mg，0.043mmol)溶于無(wú)水乙腈(3mL)中，并加入三甲基溴硅烷(O.11mL，0.87mmol)。將所得反應(yīng)混合物在室溫下攪拌24小時(shí)。在向其中加入0.1%的TFA水溶液(lmL)后，所得溶液采用rpHPLC(SupelcoDiscoveryC18，21.2mmx15cm,5|am，A:0.1%的TFA水溶液，B:0.1%的TFA乙腈溶液，在14分鐘內(nèi)B由17%升至30%，tR=12.7min)進(jìn)行純化，從而得到作為T(mén)FA鹽的磷酸膽堿衍生物PC廣對(duì)硝基苯酯(4.6mg，0.011mmol，25%)。LC-MS(PhenomenexGemini,C18，5|um，150x3.0mm,A:0.1°/。的甲酸水溶液，B:0.1%的甲酸乙腈溶液，在10分鐘內(nèi)B由10%升至90%)tR=3.8min(UV信號(hào))，對(duì)于[M+H]+，m/z=405.5。方案2三氟乙酸(10-羧基-癸基)-[2-(二乙氧基-磷酰氧基)-乙基]-二曱基-銨將Fmoc-十一酸(635mg，1.5mmol)溶于無(wú)水DMF(2ml)中，并加入由二異丙基碳二亞胺(O.12ml，0.75mmol)在無(wú)水二氯甲烷(10ml)中形成的溶液。將所得的黃色混合物在0X:下攪拌20分鐘。在除去揮發(fā)性的二氯甲烷之后，將對(duì)稱(chēng)酐溶液加入Wang樹(shù)脂(250mg，1.2mmol/g，0.3mmol)中。加入DMAP(18mg，0.15mmol)，并將所得反應(yīng)混合物攪拌過(guò)夜(W.C.Chan,P.D.WhiteinFmocSolidPhasePeptideSynthesis,APracticalApproach(Eds.:W.C.Chan,P.D.White)OxfordUniversityPress,Oxford2000，pp.55-56.)。將樹(shù)脂用DMF(5x2min)和二氯甲烷(5x2min)洗滌，并用乙醚進(jìn)行收縮。將該過(guò)程重復(fù)l次，并根據(jù)對(duì)Fmoc-哌咬加合物進(jìn)行的UV分光光度測(cè)定法，測(cè)定最終的取代水平為0.8醒ol/g(66°/。)。(ibid.，pp62-63)在用20。/fl的派咬/DMF進(jìn)行Fmoc脫保護(hù)后，使樹(shù)脂在THF中溶脹。向其中加入由THF(2ml)、甲醛(40%，0.7ml,1mmol)和乙酸(0.7ml)形成的混合物，并將樹(shù)脂溫育5分鐘。然后，加入氰基硼氫化鈉(62mg，1mmol)，并將樹(shù)脂在室溫下攪拌過(guò)夜。此后，將樹(shù)脂用THF、H20和MeOH依次洗涂。E.G.Brown,J.M.NussTetrahedronLett1997，38，8457-8460。使樹(shù)脂在DMF中溶脹，并加入磷酸二乙酯-(2-溴-乙酯)/磷酸2-溴乙酯二乙酯(520mg，2mmol)和DIEA(O.03ml,0.2mmol)，然后將所得反應(yīng)混合物加熱至60X:，并持續(xù)4天。將所得樹(shù)脂用DMF和DCM洗滌，并用MeOH進(jìn)行收縮。J.Cai，B.WatheyTetrahedronLett.2001，42,1383-1385。最后，通過(guò)將產(chǎn)物與TFA/H20/TIS(95:2.5:2.5)的混合物一起攪拌2h，從而將所述產(chǎn)物從樹(shù)脂上裂解下來(lái)。在有機(jī)溶劑蒸發(fā)之后，使用了羧酸，并加入水，然后將產(chǎn)物凍干并且沒(méi)有進(jìn)行進(jìn)一步的純化。三氟乙酸[2-(二乙氧基-磷酰氧基)-乙基]-二甲基-[10-(4-硝基-苯氧羰基)-癸基]-銨向由羧酸X在無(wú)水乙腈(5ml)中形成的溶液中連續(xù)加入三乙胺(0.03ml，0.2mmol)、氯曱酸對(duì)硝基苯酯(80mg,0.39mmol)和DMAP(7mg)。4小時(shí)后，通過(guò)加入0.1%的TFA水溶液使反應(yīng)停止，隨后釆用RPHPLC(SupelcoDiscoveryC18，21.2mmx15cm,5jum，A:濃度為0，1%的由TFA在IPA/H20(5:95)中形成的溶液，B:濃度為0.1%的由TFA在IPA/H2O(90:10)中形成的溶液，在20分鐘內(nèi)B由15%升至45%,tR=16.5min)對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行純化，從而得到為無(wú)色油狀物的對(duì)硝基苯酉旨X(4mg，0.007mmol，。/。)。LC-MS(Phe醒enexGemini,C18，5jam,150x3.0mm,A:0.1°/。的甲酸水溶液，B:0.1°/。的甲酸乙腈溶液，在IO分鐘內(nèi)B由10%升至90°/。)tR=5.2min(UV信號(hào))；M=三氟乙酸二甲基-[10-(4-硝基-苯氧羰基)-癸基]-(2-膦酰氧基-乙基)-銨將被保護(hù)的對(duì)硝基苯酯(4mg，0.007mmol)溶于無(wú)水乙腈(3ml)中，并且分別在O小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)后加入三甲基溴硅烷(O.11ml,0.07mmol)。將所得反應(yīng)混合物在室溫下共攪拌36小時(shí)。在向其中加入O.r/。的TFA水溶液(lml)之后，通過(guò)rpHPLC(HichromC8，21.2mmx25cm,10jam,A:濃度為0.1%的由TFA在ACN/H20(10:90)中形成的溶液，B:濃度為0.1%的由TFA在ACN/H20(90:10)中形成的溶液，在15分鐘內(nèi)B由40°/。升至60%,tR=14.2min)對(duì)所得溶液進(jìn)行純化，從而得到作為T(mén)FA鹽的磷酸膽堿衍生物(l.1mg，0.002mmol，27%)。LC-MS(Phe誰(shuí)enexGemini,C18，5jlim，150x3.0mm,A:0.1%的甲酸水溶液，B:0.1%的甲酸乙腈溶液，在IO分鐘內(nèi)B由10°/。升至90%)tR=5.9min(UV信號(hào))，M=475.4(M+)。PC44-二甲基氨基丁酸甲酯與制備PC6的過(guò)程相同!H證(D20，400MHz)5=2.06(m，2H，CH2);2.56(t，2H，3J=7.2Hz，CH2);2.93(s，6H，N(CH3)2);3.22(m，2H，CH2);3.75(s，3H，C00CH3)。13CNMR(CD3OD，100.5MHz)5=20.9;31.2;43.5;52.3;58.1;174.3。IX-MS(Phe議enexGemini,C18,5|am，150x3.0mm,A:0.1%的曱酸水溶液，B:0.1%的甲酸乙腈溶液，在IO分鐘內(nèi)B由10°/。升至50%)tR=1.3min(ELSD信號(hào));M=146.4((M+H)+)。h3oh3三氟乙酸[2-二乙氧基-磷酰氧基]-乙基]-(3-甲氧基羰基-丙基)-二甲基銨將曱酯X(516mg，3.5mmol)溶于無(wú)水乙腈(8ml)中，并加入K2C03(484mg，3.5mmol)。將所得懸浮液在氮?dú)庀禄亓?4h。在將其冷卻至室溫后，加入水，并通過(guò)加入TFA將pH調(diào)至2。所得溶液采用rpHPLC(SupelcoDiscoveryC18，21.2mmx15cm,5pm，A:0.1%的TFA，5W的IPA水溶液，B:0.1%的TFA，10%的IPA水溶液，在10分鐘內(nèi)B由0%升至10%,tR=8.8min)進(jìn)行純化，并將所得物凍干，從而得到為淺黃色油狀物的TFA的季胺鹽。力腿(CD30D，400MHz)5=1.36(t，6H，2x0CH2CH3，3J-6.8Hz);2.08(m，2H，CH2);2,47(t，2H，CH2，3J-7.2Hz);3.20(s，6H，N(CH3)2);3.45(m，2H，CH2);3.70(s，3H,C00CH3);3.76(t，2H，CH2，3J=4.4Hz);4,18(dq，4H，OCH2CH33J(H，H)=7.2Hz，3J(H，H)=7.2Hz);4.52(bs，2H，CH2)。13C腿(CD30D，100.5MHz)5-16.4(d，2xOCH2CH3，3J=6.1Hz);19.0(CH2);30.7(CH2);52.3(CH3);52.4(CH3);62.1(d，CH2，2J=4.5Hz);64.4(CH2);65.4(CH2);66.1(d，CH2，2J=6.0Hz);174.0(CO)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>三氟乙酸(3-羧基-丙基)-[2-(二乙氧基-磷酰氧基)-乙基]-二甲基銨與制備PC6的過(guò)程相同LC-MS(Phe議enexGemini,C18，5|am，150x3.0mm,A:0.1%的甲酸水溶液，B:0，1%的甲酸乙腈溶液，在IO分鐘內(nèi)B由10%升至50%)tR=1.8min(ELSD信號(hào))；M-312.3<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>三氟乙酸[2-(二乙氧基-礴酰氧基)-乙基]-二甲基-[3-(4-硝基-苯氧羰基)-丙基]-銨向由羧酸在無(wú)水乙腈(5ml)中形成的溶液中連續(xù)加入三乙胺、氯甲酸對(duì)硝基苯酯和DMAP。4小時(shí)后，通過(guò)0.1%的TFA水溶液使反應(yīng)停止，隨后采用RPHPLC(SupelcoDiscoveryC18，21.2mmx15cm,5pm,A:0.1%的TFA，5°/。的IPA水溶液，B:0.1%的TFA，10%的IPA水溶液，在13分鐘內(nèi)B由10%升至30%,tR=11.8min)進(jìn)行純化，從而得到為無(wú)色油狀物的對(duì)硝基苯酯。LC-MS(PhenomenexGemini,C18，5叫150x3.0mm，A:0.1%的甲酸水溶液，B:0.1%的甲酸乙腈溶液，在10分鐘內(nèi)B由10°/。升至90%)U=3.1min(UV信號(hào));M=433.2(M+)。用于制備PC6的備選方案前幾年，開(kāi)發(fā)出了用于制備磷酸膽堿配體PC6的備選策略。下文中將對(duì)此進(jìn)行概述。將這種用于制備PC6(化合物9)的策略概括于方案3中。由于即使使磷酸官能團(tuán)以被保護(hù)的形式來(lái)進(jìn)行其他必需的轉(zhuǎn)化步驟，其也被認(rèn)為是麻煩的，所以將磷酸化過(guò)程選擇作為最后的步驟。通過(guò)Eschweiler-Clarke形式的反應(yīng)過(guò)程(用甲醛和氫/鈀/碳進(jìn)行處理)，對(duì)市售可得的氨基己酸2進(jìn)行N，N-二甲基化n'12,并通過(guò)用曱醇的鹽酸溶液進(jìn)行處理來(lái)將所得產(chǎn)物(3，86%)酯化，從而得到甲基酯4(96%)。通過(guò)使曱基酯4與被單甲氧基三苯甲基保護(hù)的溴乙醇1反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)季銨化過(guò)程，從而形成衍生物5(73%)。未被保護(hù)的溴乙醇也能與曱基酯4反應(yīng)，但是反應(yīng)產(chǎn)率較低，并且產(chǎn)物更難以檢測(cè)和純化。單曱氧基三苯甲基保護(hù)基團(tuán)賦予了重要的中間產(chǎn)物5以親油性和TLC可檢測(cè)性(UV光可見(jiàn)并且可進(jìn)行酸染色)。用氫氧化鋰/水/叔丁醇對(duì)衍生物5進(jìn)行皂化，得到了相應(yīng)的酸6，在未對(duì)酸6(95W進(jìn)行分離的情況下，用溶解于吡啶中的對(duì)硝基苯酚和二異丙基碳二亞胺對(duì)其進(jìn)行處理，得到了對(duì)硝基苯酯7(86%)。由于對(duì)硝基苯酯7易于發(fā)生自縮合，所以用曱酸對(duì)對(duì)硝基苯酯7進(jìn)行簡(jiǎn)單的處理便得到了相應(yīng)的醇8，該醇8在下一步驟中被直接使用。將醇8粗品在ox:下溶解于乙腈中，并使其首先與過(guò)量的氯氧化磷和三乙胺反應(yīng)，然后再與水反應(yīng)，從而在HPLC純化后由對(duì)硝基苯酯7得到了所需的單磷酸酯9，產(chǎn)率為22%。化合物9顯示出了所期望的醒R和LC-MS光語(yǔ)，并且在pH為酸性的水溶液(O.1y。TFA)中穩(wěn)定存在。但是，為了方便儲(chǔ)存，將化合物9作為DMS0儲(chǔ)備溶液存放于冰箱中。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>方案3，試劑，條件和產(chǎn)率a:CH20，H2，Pd/C(86%);b:CH30H，HC1(96%);c:Na2C03,CH3CN(73%);d:LiOH，t-BuOH/H20(95%);e:DIPCDI，吡咬(86W;f:HC00H/H20;g:P0C13，TEA;h:H20(22%,由對(duì)硝基苯酯7得到).常規(guī)方法-在減壓下進(jìn)行濃縮[浴溫〈401C]。使用VarianUnity500MHz分光計(jì)在298。K下記錄醒R光鐠。只報(bào)告所選的NMR數(shù)據(jù)。通過(guò)合適的2-D試驗(yàn)來(lái)確證分配。采用Perkin-ElmerSCIEXAPI150-EX質(zhì)譜儀以直接進(jìn)樣模式來(lái)進(jìn)行針對(duì)稀釋的曱醇或乙腈溶液的電噴霧質(zhì)譜(ES-MS)測(cè)定。使用供應(yīng)商提供的軟件在AppleMacintoshQuadra計(jì)算機(jī)上記錄陽(yáng)離子模式的光鐠，并對(duì)其進(jìn)行處理。在SilicaGelF254(Merck,Darmstadt,Germany)板上進(jìn)行TLC，并采用UV光和/或用5%的茚三酮丁醇溶液或5%的硫酸乙醇溶液進(jìn)行染色來(lái)實(shí)施檢測(cè)。除非另作說(shuō)明，否則在Matrexsilicagel60A(35-70jam,Amicon)上進(jìn)行柱層析。使用VarianHPLC系統(tǒng)來(lái)實(shí)施制備性HPLC的過(guò)程，其中所述VarianHPLC系統(tǒng)由9012梯度泵、9065二極陣列檢測(cè)器、以及運(yùn)行VarianStarHPLC軟件的PC計(jì)算機(jī)系統(tǒng)構(gòu)成。用得自InternationalSorbentTechnology有限公司(MidGlamorgan,UK)的IsoluteC-18EC反相硅膠(40-70微米顆粒尺寸)填滿(mǎn)開(kāi)放式玻璃柱，并用特定的溶劑洗脫該IsoluteC-18EC反相硅膠。除非另作說(shuō)明，否則其他試劑和溶劑均購(gòu)買(mǎi)具有高商業(yè)品質(zhì)的種類(lèi)，并且在無(wú)需進(jìn)一步純化的條件下使用。2-單曱氧基三苯甲氧基-l-溴乙醇(l)-該化合物的制備方法與相應(yīng)的三苯甲基衍生物的制備方法類(lèi)似13。簡(jiǎn)言之，在室溫下將單甲氧基三苯曱基氯(3.09g，10mmol)加入到由溴乙醇(l.0g，8.0mmol)在無(wú)水吡啶(5mL)中形成的溶液中。12小時(shí)后，TLC(己烷乙酸乙酯=9:1)顯示存在2個(gè)1^吸收點(diǎn)，一個(gè)吸收點(diǎn)(主要的)的rf值為0.9，一個(gè)吸收點(diǎn)(次要的)的rf值為0.7。向所述溶液中加入水(O.1mL)，并且在室溫下將所得混合物攪拌15分鐘后，該混合物被隔在乙酸乙酯和2M硫酸水溶液之間，然后用碳酸氫鈉水溶液洗滌有機(jī)層，并濃縮該有機(jī)層。通過(guò)柱層析在硅膠(160g)上純化殘余物(其中所述硅膠裝于濃度比為95:5的戊烷-乙酸乙酯中)，并用逐步梯度為95:5至90:10的戊烷-乙酸乙酯進(jìn)行洗脫。收集主要的部分，從而得到作為漿狀物的1(2.75g，87%),其在靜置過(guò)程中發(fā)生結(jié)晶?？晒┻x用的其他方式是，省略層析過(guò)程，并使?jié){狀物粗品直接從曱醇中結(jié)晶析出，從而得到純的晶體，產(chǎn)率為40-50°/。。直接進(jìn)樣模式的ES-MS顯示，在m/z273處形成1個(gè)巨大的峰(其為單甲氧基三苯甲基陽(yáng)離子)，但是在419/421處形成了2個(gè)非常小的峰(M+Na)。H-NMR數(shù)據(jù)(CDC13):3.44/3.48(2個(gè)多重峰，2+2H，OCH2CH2Br)，3.83(s，3H，Ar0CH3)，6.88(d，2HiArH)，7.24-7.52(m，12H,Ar-H)。6-[N，N-二甲基氨基]-N-[2-(單甲氧基三苯甲氧基)-乙基]-己酸甲酯(5)-將由6-氨基己酸(2，13.2g)在含水曱醛(37。/n，40mL)中形成的溶液與Pd/C(1.0g)混合，并將所得混合物在室溫和50巴下、在Parr不銹鋼裝置中進(jìn)行氫化，同時(shí)進(jìn)行磁力攪拌。通過(guò)TLC(乙酸乙酯甲醇乙酸水=6:3:3:2，茚三酮檢測(cè))方法進(jìn)行的檢驗(yàn)表明，起始物(rf0.7)幾乎完全轉(zhuǎn)化為遷移較慢的產(chǎn)物(rf0.5，褐色)。使反應(yīng)混合物通過(guò)硅藻土床過(guò)濾，并將該過(guò)濾器床用水洗滌(20mL)，然后用水(60mL:進(jìn)行稀釋?zhuān)⑹顾萌芤壕徛ㄟ^(guò)Dowex-50Wx2(100目)的柱(其中Dowex-50Wx2為H+形式，0.7meq/mL，150mL，并用milli-Q水仔細(xì)地進(jìn)行了預(yù)洗滌)。然后，用milli-Q水(200+100mL)洗滌所述的柱子，接著用2%的氨水(400mL)洗脫所得產(chǎn)物。通過(guò)TLC(乙酸乙酯甲醇乙酸水=6:3:3:2，茚三酮檢測(cè))方法對(duì)洗脫物進(jìn)行監(jiān)測(cè)。使合適的流分部分蒸發(fā)，然后凍干，從而得到半固體殘余物(13.7g，86%)。直接進(jìn)樣模式的ES-MS顯示出，在m/z160.2處形成了一強(qiáng)峰(M+H)，其與N，N-二甲基化的產(chǎn)物(3)相應(yīng)。將一部分產(chǎn)物(3)粗品物質(zhì)(3.97g，25mmol)溶解于甲醇(75mL)中，并且在冰中冷卻并進(jìn)行攪拌，同時(shí)在30分鐘內(nèi)滴加亞硫酰氯(10mL，134mmo1)，然后停止冷卻，并將所得混合物置于室溫下過(guò)夜。通過(guò)TLC(乙酸乙酉旨曱醇乙酸水=10:3:3:2，茚三酮檢測(cè))方法進(jìn)行的檢驗(yàn)表明，上述混合物轉(zhuǎn)化成移動(dòng)稍快的化合物，并且該化合物的著色淺且顏色不同。其中還帶有少量之前步驟中的移動(dòng)較快的雜質(zhì)。16小時(shí)后，濃縮所得反應(yīng)混合物，并將所得物與甲醇進(jìn)行若干次共濃縮，從而得到一種在靜置時(shí)發(fā)生部分結(jié)晶的殘余物(5.05g)。該殘余物的直接進(jìn)樣模式的ES-MS顯示出，在m/z174.0處形成了一強(qiáng)峰(M+H)，其與6-(N,N-二甲基氨基)-己酸甲酯(4)相應(yīng)。將一部分產(chǎn)物(4)粗品物質(zhì)(1.12g，純度約為75%，4.0mmol)、無(wú)水乙腈(25mL)、2-(單甲氧基三苯氧基)-2-溴乙醇(1，1.60g，4.0mmol)和固態(tài)無(wú)水碳酸鈉(800mg)回流(浴溫為70匸)過(guò)夜，而后，TLC表明僅發(fā)生了部分轉(zhuǎn)化，因此加入更多的化合物1(800mg，2.Ommol)和碳酸鈉(500mg),并將回流再持續(xù)24小時(shí)。然后，TLC表明大部分起始物質(zhì)消失，并生成一種新的、遷移較快且發(fā)生茚三酮顯色的UV吸收點(diǎn)。該混合物被隔在二氯甲烷和水之間(其中所需的物質(zhì)存在于有機(jī)相中)，然后將水相用少量的二氯甲烷洗滌，接著將所得的混合的有機(jī)層用少量的水洗滌，然后將所得物濃縮至小體積(10mL)，該濃縮物被隔在甲基叔丁基醚和水之間(現(xiàn)在，所需的物質(zhì)存在與水相中)。將有機(jī)相用少量水洗滌，并將混合的水層用少量的甲基叔丁基醚洗滌。然后馬上對(duì)混合的水性溶液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，從而除去非水性溶劑(大約除去了1/3體積的溶劑)，使殘余溶液通過(guò)Bond-ElutC-18-EC柱(35g，填充甲醇，然后用水平衡)，然后用水洗滌，然后先用20%、再用50°/。、最后用60%的甲醇水溶液進(jìn)行洗脫。用60%的甲醇洗脫液洗脫作為純的條帶的所需物質(zhì)。收集合適的流分，然后加入幾滴吡啶，并將所得溶液凍干，從而得到了為白色固體的化合物5(1.53g，73%)。ES-MS在m/z490處顯示出強(qiáng)的峰(M+)。H-NMR數(shù)據(jù)(CDC13):1.31(m，2H，H-4)，1.65(m，2H，H-3)，1.75(m，2H，H-5)，2.31(t，2H，H-2),3.30(s，6H，(CH3)2N)，3.47(m，2H，H-6)，3.62(m，2H,0CH2CH2N)，3.68(s，3H，C00CH3)，3.82(s，3H，Ar0CH3)，3.93(m,2H，0CH2C謹(jǐn))，6.89(d，2H，ArH)，7.24-7.41(m，12H,ArH)。6-(N，N-二甲基氨基)-N-[2-(單甲氧基三苯氧基)-乙基]-己酸對(duì)硝基苯酯(7)-將化合物5(420mg，0.86mmo1)在2:1的丁醇-水(6.0mL)中形成的溶液與氫氧化鋰(72mg)混合，并將所得溶液在室溫下攪拌3小時(shí)，然后TLC(乙酸乙酯甲醇乙酸水-12:3:3:2)表明，所述混合物完全轉(zhuǎn)化成rf稍低的化合物。在此階段的ES-MS光鐠顯示出在m/z476.0和482.3處形成峰(分別為M+H和M+Li)。將所述混合物用水稀釋(10mL)，然后用0.1M的鹽酸水溶液將pH調(diào)至7.5，接著將所得溶液凍干，從而得到粗品6(510mg，混有氯化鋰)。將該粗品6物質(zhì)(約0.86mmol)溶于無(wú)水吡啶(6.0mL)中，然后加入對(duì)硝基苯酚(400mg，2.86mmol)和二異丙基碳二亞胺(270microL，0.176mmol)。在RT下攪拌3小時(shí)后，加入另一部分二異丙基碳二亞胺(200微升)，并將所得混合物在r.t.下再攪拌24小時(shí)，而后TLC(乙酸乙酯甲醇乙酸水=15:3:3:2)表明反應(yīng)完全。使所述混合物蒸發(fā)，然后將所得物與二氯曱烷-曱苯共蒸發(fā)3次，從而除去吡啶。所得殘余物被隔在0.2M的含水乙酸三乙基銨(pH5.O)和甲基叔丁基醚之間(其中每種溶劑均為約100mL,并且需要?jiǎng)×业負(fù)u動(dòng)以使各種物質(zhì)均被溶解)，TLC(乙酸乙酯甲醇乙酸水=10:3:3:2，UV和茚三酮檢測(cè))表明，所得產(chǎn)物只存在于水相中，而大部分的對(duì)硝基苯酚和其他UV吸收雜質(zhì)存在于有機(jī)相中。將該有機(jī)相用少量的含水緩沖溶液洗滌，并將混合的水相用甲基叔丁基醚洗滌，然后用二氯甲烷萃取(現(xiàn)在，TLC表明所述產(chǎn)物完全進(jìn)入到有機(jī)相中)。將所述水層用少量的二氯甲烷洗滌，并將混合的有機(jī)層用少量的緩沖液洗滌，然后小心分離。在此階段，TLC表明形成了純度極高的物質(zhì)，并且H-NMR也證實(shí)了這一點(diǎn)。將所述物質(zhì)以溶液形式保存在冰箱中，如果需要的話，可以對(duì)其進(jìn)行濃縮，從而得到漿狀的粗品7(440mg，86%)。按照所述的方式，在冷凍溫度下所述物質(zhì)還可以保持?jǐn)?shù)星期不變。所述物質(zhì)的ES-MS顯示出在m/z596.8處形成了強(qiáng)的信號(hào)(M+)。H-NMR數(shù)據(jù)(CDC13):1.41(m，2H，H-4)，1.75-1.85(m，4H，H-3，H-5),2.63(t，2H，H-2)，3.24(s，6H，(CH3)2N)，3.49(m，2H，H-6)，3.62(m，2H，0CH2CH2N)，3.81(s，3H，Ar0CH3)，3.84(m，2H，0CH2CH2N)，6.89(d，2H，ArH)，7.24—7.41(m，12H,ArH)，8.28(d，2H，ArH)。6-(N，N-二甲基氨基)-N-[(2-磷酰氧基)-乙基]-己酸對(duì)硝基苯酯(9)-將由化合物7(55mg，0.10mmol)溶于甲酸(2mL)中形成的溶液在RT下保持60分鐘，然后將其濃縮，接著再與無(wú)水乙腈共濃縮3次。將所得殘余物8(通過(guò)TLC(乙酸乙酯甲醇乙酸水=6:3:3:2,茚三酮和UV檢測(cè))和ES-MS(m/z325.2，M+)方法表明其純度較高)溶于無(wú)水乙腈(0.5mL)中，并將所得物加入到冷的(OK)、由氯氧化磷(0.019mL，0.2mmo1，剛剛蒸餾得到)和三乙胺(0.069mL，0.5mmol)在無(wú)水乙腈(O.5mL)中形成的溶液中。在將所得物在OiC下保持1小時(shí)后，加入更多的氯氧化磷(O.05mL)和三乙胺(O.05mL)，再過(guò)1小時(shí)后，加入水(O.05mL),并將所得混合物在Or下再攪拌1小時(shí)，而后TLC表明大部分的起始物質(zhì)消失，并出現(xiàn)了遷移率極低(rf0.05)的UV吸收點(diǎn)。將所得的反應(yīng)混合物用0.2%的TFA水溶液(3.8mL)稀釋?zhuān)儆眉谆宥』?3.5mL)洗滌，然后小心分離水相，并立刻在35X:下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(減少至約2/3的體積)，然后將所得溶液注入SupelcoDiscoveryC-18柱(15x21.2cm,5microM)上的400微升的部分中，其中流速為8.0mL/min并且在40分鐘內(nèi)水在乙腈中的濃度梯度從82%減少至58%(其中0.1%TFA的濃度被一直保持)。分別在18-20分鐘和24-26分鐘時(shí)觀察到一個(gè)主要的和一個(gè)次要的UV吸收(300nm)峰，這兩個(gè)峰分別與所需的產(chǎn)物9和起始物質(zhì)8相應(yīng)。將含有產(chǎn)物9的流分集中起來(lái)并濃縮至小體積，然后凍干，從而得到為無(wú)定形物質(zhì)的純的產(chǎn)物9(9mg，由化合物7得到，產(chǎn)率為22W。LC-MS光鐠在m/z405.2處顯示出一個(gè)主要的信號(hào)(M+)。H-NMR數(shù)據(jù)(DMSO-d6):1.38(m，2H，H-4)，1.67-1.78(m，4H，H-3，H-5)，2.69(t，2H，H-2)，3.01(s，6H，(CH3)2N)，3.35(m，2H，H-6)，3.60(m，2H，0CH2CH2N)，4.24(m，2H，0CH2CH2N)，7.44(d，2H，ArH)，8.31(d，2H，ArH)。H-醒R數(shù)據(jù)(D20，HOD=4.68):1.35(m，2H，H-4)，1.66(m,2H，H-3或H-5)，1.72(m，2H，H-3或H-5)，2.59(t，2H，H-2)，3.02(s，6H，(CH3)2N)，3.28(m，2H，H-6)，3.52(m，2H，0CH2C咖，4.19(m，2H，0CH2C固)，7.22(d，2H，ArH)，8.19(d，2H，ArH)。肽的合成通過(guò)固相肽合成技術(shù)制備出16個(gè)含有42個(gè)殘基的肽的文庫(kù)(參見(jiàn)圖1)。所述文庫(kù)中的組分隨著帶電殘基的個(gè)數(shù)以及配體摻入的位置的變化而變化。在各種情況下，合成過(guò)程相同，在此以3-C15L8Cys24(TA4Cys(Acm)}的合成過(guò)程作為實(shí)例進(jìn)行說(shuō)明。利用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc化學(xué)法，在Pioneer自動(dòng)化肽合成儀(AppliedBiosystems)上合成多肽。以0.2mmol/g的取代7jc平在Fmoc-PAL-PEG-PS樹(shù)脂上以0.lmmol的規(guī)模進(jìn)行合成。使用以下氨基酸衍生物(得自NovabiochemAG):Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-0H、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH和Fmoc-Val-OH。Lysl5的側(cè)鏈?zhǔn)艿紸loc保護(hù)，而B(niǎo)oc保護(hù)用于Lys8。將4倍過(guò)量的氨基酸衍生物用于各偶聯(lián)步驟中。在與DIEA(二異丙基乙胺，1M，溶于DMF中)連接的過(guò)程中，將TBTU(0-(7-苯并三唑-l-基)-l，1，3，3-四曱基脲四氟硼酸酯，0.5M，溶于DMF中)用作偶聯(lián)劑。除了Gln、Cys、Pro和His(90min)以及第一殘基Arg和Asn(2小時(shí))外，均采用60min的標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)時(shí)間。在傳統(tǒng)的自動(dòng)化固相肽合成結(jié)束后，用乙酸酐使游離的N-末端乙酰化，然后將樹(shù)脂用乙酸酐/二氯甲烷(3:1)的混合物處理2小時(shí)，接著用二氯甲烷(6X)洗滌該樹(shù)脂，再用乙醚使樹(shù)脂收縮。用溶于氯仿/乙酸/N固(N-甲基嗎啉)(18:2:1)中的3當(dāng)量的四(三苯基)鈀(O)處理2.5小時(shí)來(lái)除去Aloc保護(hù)基團(tuán)。將樹(shù)脂連續(xù)用DIEA(濃度為0.5%，溶于DMF中)、二乙基二硫代氨基甲酸鈉(濃度為0.5%,溶于DMF中)、DMF和二氯甲烷洗滌，并用乙醚收縮。用溶于DMF中的HBTU(3當(dāng)量)、HOBt(3當(dāng)量)和DIEA(6當(dāng)量)處理4個(gè)小時(shí)來(lái)使得7-甲氧基香豆素-3-羧酸(3當(dāng)量)與Lysl5的側(cè)鏈偶聯(lián)。將樹(shù)脂用DMF和二氯甲烷洗滌，并用乙醚收縮。在室溫下，用TFA、TIS(三異丙基硅烷)和水(這三種物質(zhì)的比例為95:2.5:2.5，每100mg的樹(shù)脂加入lml上述混合物)處理超過(guò)2個(gè)小時(shí)來(lái)將肽從樹(shù)脂上切下。在減壓下使TFA蒸發(fā)，并通過(guò)加入冷的二乙基醚使肽沉淀，然后進(jìn)行離心、洗滌和凍干處理。通過(guò)RPHP1X(HichromC8，21,2mmx25cm，10jam,A:0.1°/。的TFA，10%的ACN水溶液，B:0.1°/。的TFA，10%的ACN水溶液，在18分鐘內(nèi)B由38°/。升至46%，tR-16.0min)處理使粗產(chǎn)物得以純化。肽支架結(jié)構(gòu)二聚體的制備二疏鍵的形成(H.Tamamura，A.Otaka，J.Nakamura，K，Okubo，T.Koide，K.Ikeda，T.Ibuka，N.FujiIntJ.PeptideProteinRes.1995，45,312-319.):將所述的3-C15L8Cys(Acm)24肽(2.4mg(0.51jnmol)溶于TFA(200pl)中，并加入三氟甲基磺酸銀(silvertriflate)(5mg，20jLimol)和苯曱醚(l滴)。將所得的反應(yīng)混合物在4X:的水箱中溫育24小時(shí)。在加入乙醚之后，所述的肽發(fā)生沉淀，然后用冷的乙醚洗滌3次。向沉淀中加入DMSO(O.25ml)和lNHC1(1ml)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌22小時(shí)。將所得的懸浮液離心，并丟棄沉淀。用稀釋的NaOH中和所得的液體，并通過(guò)RP-HPLC(分析條件VarianC18,150x4.6mm，5ym，A:0.1%的TFA，10。/。的ACN水溶液，B:0.1°/。的TFA，10°/。的ACN水溶液，在30分鐘內(nèi)B由30%升至60%，tR-23.4min)方法進(jìn)行分析。PC6-對(duì)硝基苯酯與TA4+Cys(Acm)的反應(yīng)本部分為用于將磷酸膽堿衍生物引入肽上的方法的具體實(shí)施例，在這種情況下，所述肽為在Cys殘基上具有保護(hù)基團(tuán)Acm的TA4+。向由TA4+Cys(Acm)肽(500pg，0.1pmole)在100|uL0.1M的磷酸緩沖液(pH8)中形成的溶液中加入2.8jiL溶有O.1MPC6-對(duì)硝基苯酯的DMSO(0.3pmole，3當(dāng)量)。將所得的反應(yīng)混合物在40*€下溫育。LC-MS(Phe麵enexGemini,C18，5jum，150x3.0mm,A:0.1°/。的甲酸水溶液，B:0.1%的甲酸乙腈溶液，在10分鐘內(nèi)B由100/0升至90°/。)tR=4.1min(UV信號(hào))，對(duì)于[M+8H廣，m/z-670.5，對(duì)于[M+7H廣，m/z=766.1，對(duì)于[M+6H]"，m/z-893.3，對(duì)于[M+5H廣，m/z=1071.9。TA4+PC6Cys(Acm)肽在涂敷有F108-2-吡啶基二硫化物的多孔聚苯乙烯上的固定向由ta4+PC6Cys(Acm)肽(90pg，18nmol)在18jiL0.1M的磷酸緩沖液(pH8)中形成的溶液中加入1.8jaL的5(^的MeOH水溶液(其中溶有5mg/mL碘)(8.6jjg，34nmol，相對(duì)于巰基是2倍過(guò)量的)。將所得的反應(yīng)混合物在25X:下溫育20分鐘，然后用PepCleanC18柱(得自Pierce)凈化，接著將其直接加入到50pL的懸浮液中，該懸浮液為含有IOmgF108-PDS涂敷的多孔顆粒的磷酸緩沖液。激酶與肽的接合向由TA/PC6Cys(Acm)肽(90jng，18nmol)在18juL0.1M的磷酸緩沖液(pH8)中形成的溶液中加入l.8uL的50。/。的MeOH水溶液(其中溶有5mg/mL殃)(8.6ng，34nmol，相對(duì)于巰基是2倍過(guò)量的)。將所得的反應(yīng)混合物在25t:下溫育20分鐘，然后用PepCleanC18柱(得自Pierce)凈化，接著將其直接加入1.5mL含有1.3mg/ml的激酶-PDS的磷酸緩沖液中。TA4PC6CysH的形成PC6-對(duì)硝基苯酯與TA4Cys(Acm)的反應(yīng)。向由TA4Cys(Acm)肽(1mg，0.2iumol)在lmL0.1M的磷酸緩沖液(pH8)中形成的溶液中加入10ML0.1M的PC6-對(duì)硝基苯酯DMS0溶液(0.8pmol，5當(dāng)量)。將所得的反應(yīng)混合物在4X:下溫育2天，然后用NAP-10柱(得自GEHealthcare)通過(guò)凝膠過(guò)濾進(jìn)行純化，從而得到1.5mL的TA4PC6Cys(Acm)水溶液，并最終將其凍干。LC-MS(PhenomenexGemini,C18，5jim，150x3.0mm，A:0.1%的甲酸水溶液，B:0.1%的甲酸乙腈溶液，在10分鐘內(nèi)B由10%升至90%)"=4.lmin(UV信號(hào))，對(duì)于[M+6H廣，m/z-856.0，對(duì)于[M+5H廣，m/z-1026.8，對(duì)于[M+4H廣，m/z=1282.6。半胱氨酸的脫保護(hù)。將TA4PC6Cys(Acm)溶于lmL的TFA/苯甲醚(99:1)中，并加入6mg的AgOTf(20jimol，100當(dāng)量)。將所得混合物在4X:下保持2小時(shí)后，用冷的醚使肽的銀鹽沉淀，然后通過(guò)離心進(jìn)行分離，而后再用醚洗滌2次。向所得物中加入116juLDTT(10mg/ml)的乙酸(1M)溶液，并用1M的乙酸將所得溶液的體積增大至1mL。在25X:下經(jīng)過(guò)l夜之后，用NAP-15柱通過(guò)凝膠過(guò)濾純化肽，從而得到1.5mL的TA4PC6CysH水溶液，并將其凍干。LC-MS(PhenomenexGemini,C18，5pm，150x3.0mm,A:0.1%的甲酸水溶液，B:0.1%的曱酸乙腈溶液，在10分鐘內(nèi)B由10%升至90%)tR=4.6min(UV信號(hào))，對(duì)于[M+6H廣，m/z=843.5，對(duì)于[M+5H廣，m/z=1012.3，對(duì)于[M+4H]"，m/z=1264.6。TA一PC6CysH的形成PC6-對(duì)硝基苯酯與TA4+Cys(Acm)的反應(yīng)。向由TA4+Cys(Acm)肽(1mg，0.2iumol)在lmL0.1M的磷酸緩沖液(pH8)中形成的溶液中加入10yL0.1M的PC6-對(duì)硝基苯酯的DMSO溶液(O.8jnmol，5當(dāng)量)。將所得的反應(yīng)混合物在41C下溫育過(guò)夜，然后用NAP-10柱(得自GEHealthcare)通過(guò)凝膠過(guò)濾進(jìn)行純化，從而得到1.5mL的TA4+PC6Cys(Acm)水溶液，并最終將其凍干。LC-MS(PhenomenexGeminiC18，5ym，150x3.0mm，A:0.1°/。的甲酸水溶液，B:0.1%的甲酸乙腈溶液，在10分鐘內(nèi)B由10%升至90%)^=4.0min(UV信號(hào))，對(duì)于[M+8H廣，m/z-670.3，對(duì)于[M+7H]7+，m/z-766.1，對(duì)于[M+6H]"，m/z=893.4。半胱氨酸的脫保護(hù)。將TA4+PC6Cys(Acm)溶于lmL的TFA/苯甲醚(99:1)中，并加入6mg的AgOTf(20pmol，100當(dāng)量)。將所得混合物在4'C下保持2小時(shí)后，用冷的醚使肽的銀鹽沉淀，然后通過(guò)離心進(jìn)行分離，而后再用醚洗滌2次。向所得物中加入116pLDTT(10mg/ml)的乙酸(1M)溶液，并用1M的乙酸將所得溶液的體積增大至lmL。在25"C下經(jīng)過(guò)1夜之后，用NAP-15柱通過(guò)凝膠過(guò)濾純化肽，從而得到1.5mL的TA4+PC6CysH水溶液，并將其凍干。LC-MS(PhenomenexGemini,C18，5nm，150x3.0mm，A:0.1%的甲酸水溶液，B:0.1%的甲酸乙腈溶液，在10分鐘內(nèi)B由10°/。升至90%)tR=4.6min(UV信號(hào))，對(duì)于[M+8H]"，m/z=661.5，對(duì)于[M+7H;T+，m/z=755.9，對(duì)于[M+6H廣，m/z-881.6。配體向所述肽文庫(kù)的各種多肽支架結(jié)構(gòu)中的引入以下給出用于引入磷酸膽堿衍生物的一個(gè)更加概括的方法。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠?qū)λ龇椒ㄟM(jìn)行修改，從而使其針對(duì)可能應(yīng)用的具體條件達(dá)到最優(yōu)化。將所述文庫(kù)中的各種肽溶于lmL的50mM磷酸緩沖液(pH8)中，直至肽的濃度為lmM，由此形成儲(chǔ)備溶液。假設(shè)水的含量為25%，由肽的分子量來(lái)計(jì)算用于形成所述儲(chǔ)備溶液所需的肽的量。利用在355nm下值為20300M^cm—i的消光系數(shù)來(lái)確定各種儲(chǔ)備溶液的濃度。將100pL的各種儲(chǔ)備溶液轉(zhuǎn)移至微量滴定板的孔中，并加入2當(dāng)量的溶于DMSO中的待檢測(cè)的配體活性酯(初始濃度為100mM)，然后使混合物反應(yīng)1小時(shí)。親和性測(cè)定在微量滴定板的一組分開(kāi)的孔中，將C-反應(yīng)蛋白(CRP)溶于包含10mM的HEPES、150mM的NaCl和5mM的CaCl2的混合物(pH7.4)中，直至濃度為500nM。將用配體官能化的各種多肽和熒光團(tuán)稀釋?zhuān)⒓尤氲胶心康牡鞍椎母鱾€(gè)孔中，從而得到最終濃度為500nM的肽。作為陰性對(duì)照，在平行試驗(yàn)中，使用具有熒光團(tuán)但不具有配體的多肽來(lái)實(shí)施相同的過(guò)程。將微量滴定板引入到基于熒光的滴定板讀取器中，其中所述讀取器被設(shè)定為激發(fā)波長(zhǎng)為355nm，發(fā)射波長(zhǎng)為420nm。將這樣的肽作為"釆樣數(shù)"，所述肽在用配體官能化的形式下與不具有配體的形式下的熒光發(fā)射強(qiáng)度是不同的，并且選擇該肽用于更詳細(xì)的分析。使用熒光計(jì)來(lái)對(duì)親和性進(jìn)行詳細(xì)分析的方法在表l和圖2中給出。所用多肽具有名為3-C15L8的序列。雖然C-反應(yīng)蛋白具有5個(gè)磷酸膽堿的結(jié)合位點(diǎn)的事實(shí)使得對(duì)熒光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)分析復(fù)雜化，但清楚的是，在5mM的CaCl2存在的條件下，C-反應(yīng)蛋白與官能化的多肽的親和性與低nM解離常數(shù)一致，或者親和性更高。具有熒光團(tuán)但不具有配體的多肽的相應(yīng)試驗(yàn)表明，熒光強(qiáng)度作為CRP濃度的函數(shù)沒(méi)有發(fā)生改變，表明多肽支架結(jié)構(gòu)本身對(duì)CRP具有極低的親和性。因此，多肽與磷酸膽堿衍生物的結(jié)合形成了CRP的結(jié)合劑，其中官能化的多肽組分與CRP之間的協(xié)同作用導(dǎo)致總體上極高的親和性。表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>固相CRP的檢測(cè)涉及本發(fā)明的結(jié)合劑(其與固相結(jié)合)的CRP檢測(cè)的一個(gè)實(shí)施方案示意性地顯示于圖3中。在該檢測(cè)中，CRP的捕獲是由與乳膠顆粒連接的CRP-結(jié)合劑完成的，并且識(shí)別信號(hào)是由與丙酮酸激酶綴合的結(jié)合劑產(chǎn)生的。所述激酶在所加入的PEP(磷酸烯醇丙酮酸)的幫助下將ADP磷酸化，從而形成ATP。而ATP又與螢光素酶形成了復(fù)合體，該復(fù)合體能夠使螢光素酶催化螢光素的氧化過(guò)程，從而形成氧化螢光素。該反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生了光。光的強(qiáng)度成為樣品中激酶的量的直接量度，而激酶的量又成為所結(jié)合的CRP的量的量度。與乳酸顆粒結(jié)合的CRP-結(jié)合劑的制備將直徑為239nm的單分散性聚苯乙烯乳膠顆粒懸浮于含有聚合物表面活性劑PluronicF108的超純(Mi11iQ)水中，其中所述的聚合物表面活性劑PluronicF108具有與吡咬基二硫化物(PDS)接合的端基，從而允許其與含有巰基的配體連接。所述的表面活性劑分子通過(guò)它們的疏水性中心嵌段而吸附于所述顆粒上"。通過(guò)沉降流場(chǎng)分離(SdFFF)方法測(cè)定出，在經(jīng)過(guò)過(guò)夜吸附后，被各個(gè)顆粒吸附的Pluronic分子的數(shù)目為1650015。然后，將PDS基團(tuán)用含有Cys的CRP-結(jié)合劑代替。上文給出了用于固定結(jié)合劑(Ta4+)的方法。通過(guò)SdFFF方法進(jìn)行的分析表明，各顆粒吸附了2560個(gè)結(jié)合劑分子。對(duì)原樣形式的、或在經(jīng)過(guò)雙官能的連接體分子(SPDP，PierceBiotechnology,產(chǎn)品號(hào)21857)處理后的、或在通過(guò)二硫鍵橋與結(jié)合劑連接(上文給出的示例性方法)之后的丙酮酸激酶(得自兔肌的111型丙酮酸激酶；Sigma-Aldrich，產(chǎn)品號(hào)P9136-5KU)進(jìn)行檢測(cè)。按照以下方式來(lái)分別對(duì)三種形式的丙酮酸激酶將ADP磷酸化的能力進(jìn)行檢測(cè)將在50mM的甘氨酸-TRIS緩沖液(pH7.6)中含有0.36mg丙酮酸激酶的等分試樣均加入到"發(fā)光試劑"中，即，含有40iiL的0.5mg/mL的螢光素酶("熱穩(wěn)定的"，得自BioThemaAB，Stockholm)、10"L的8.9mg/mL的PEP(得自Sigma-Aldrich)、以及10jnL的15mM的螢光素(得自Sigma-Aldrich)的混合物。在時(shí)間t-0時(shí)，將10pL的ADP等分試樣(得自Sigma-Aldrich，2.6mg/mL)加入到各樣品混合物中，然后用CCD照相機(jī)在300秒內(nèi)跟蹤發(fā)光情況。結(jié)果如圖4所示。三種形式的丙酮酸激酶在很大程度上具有相當(dāng)?shù)幕钚浴Ｅc經(jīng)修飾的丙酮酸激酶相比，出乎意料的是，購(gòu)買(mǎi)的丙酮酸激酶產(chǎn)品的活性稍差一些，這可能是由于在處理過(guò)程中(無(wú)意地)除去了少量抑制劑的原因。使用CCD照相機(jī)測(cè)定圖3所示類(lèi)型的反應(yīng)混合物的光子通量，并且還測(cè)定了以CRP的特異性抗體IgY作為CRP的結(jié)合劑(而沒(méi)有使用本發(fā)明的CRP-結(jié)合劑)的反應(yīng)混合物的光子通量。所述試劑的濃度和總量與圖4中用于"發(fā)光試劑"的所述的情況相同。樣品為不含CRP的血清，或是含有12mgCRP/L的血清。最大的光子通量是由其中位于顆粒表面上的CRP-結(jié)合劑已經(jīng)從濃縮血清樣品中捕獲了CRP的混合物提供的。在經(jīng)過(guò)3個(gè)循環(huán)的洗滌和離心之后，允許混合樣品吸附結(jié)合劑-激酶的綴合物；然后，將其與上述發(fā)光試劑混合，從而允許其產(chǎn)生光子通量。同樣，允許含有抗體(抗-CRPIgY，由Prof.A.Larsson，UppsalaAcademicHospital惠贈(zèng))的顆粒與得自濃度(12mg/L)已知的血清中的CRP結(jié)合。如上所述，加入抗體-激酶綴合物，從而產(chǎn)生光子通量。將不含CRP的血清作為空白對(duì)照。除了剛剛描述的4種樣品之外，還存在一種樣品，該樣品只由涂敷有表面活性劑的納米顆粒構(gòu)成，其中所述的納米顆粒的尺寸與4種實(shí)際樣品中帶有結(jié)合劑或抗體的顆粒的尺寸相同。所得結(jié)果如圖5所示。圖5清楚地示出，基于結(jié)合劑的CRP的檢測(cè)產(chǎn)生了強(qiáng)的信號(hào)，而由不含有CRP的血清產(chǎn)生的基于結(jié)合劑的信號(hào)形成了光強(qiáng)度為0的直的基線?；诳贵w的檢測(cè)在含有CRP的血清中產(chǎn)生了稍弱的信號(hào)，但是由不含CRP的血清所產(chǎn)生的信號(hào)來(lái)判斷，證實(shí)與結(jié)合劑類(lèi)似物相比，抗體具有更高的非特異性吸附。在本研究中，涂敷有表面活性劑的顆粒是完全的空白對(duì)照。與圖5所示類(lèi)似的試驗(yàn)是在綴合有結(jié)合劑的乳膠顆粒(10jLiL，10%w/v聚苯乙烯顆粒，直徑為239nm)上進(jìn)行的。將所述顆粒加入到100juL得自狗、馬或人的血清中，其中狗和馬的血清中CRP的含量是未知的，而人的血清中CRP的含為12mg/L。在將混合物溫育10分鐘后，將所述顆粒洗滌，然后離心，重復(fù)3次，然后與結(jié)合劑-激酶綴合物溫育15分鐘。在經(jīng)過(guò)3次洗滌之后，加入圖4所述的"發(fā)光試劑"，然后用得自BioThema的光度計(jì)掃描所述樣品，其中所述光度計(jì)用于測(cè)量累積產(chǎn)生的光子，并計(jì)算作為激酶濃度的量度的ATP生成的速率，而所述的激酶的濃度又與樣品中CRP的量成比例。所得結(jié)果示于圖6和表1中。由上述分析，清楚表明本發(fā)明的結(jié)合劑不僅具有捕獲得自人的CRP的能力，還具有捕獲得自狗和馬的CRP的能力。反應(yīng)速率(pmol/min)0.045±0.007人CRP狗CRP馬CRP0.084±0.0090.026±0.007參考文獻(xiàn)Hansen^HJ.,LaFontame,G.,Newman,E.S.,Scliwartz,M.K.,Malkin,A.,Mojzisik,K.,Martin3.W.,Goldenberg,D.M.,(1989)Solvingtheproblemofantibodyinterferenceincommercial"s幼dwich"-typeimmunoassaysofcarcinoembryonicantigen.Clin.Chera,35,146-151,2Moseley,K.R_fKnapp,R.C.,Haisma,H.J,,〖1988)Anassayforthedetectionofhumananti-murineimmunoglobulinsintiiepresenceofCA125antigeaJ.Immunol-Methods,106,1-6.3R.P.Jain,R.M.Willi咖refraAafron2001,57,6505-6509.4A.Kamitani,N.Chatani,S.M咖i/4"gew.CAew.2003,〃<5,1435-1437;CAem.2003，42.1397-1399.5S.Kim,J.ILee,Y.C.Kim/'Og.C/i抓.1985,JO,560-565.6C.E.McKenaa,M.T.Higa'N.H.Cheung,M,CMcKcnnarefraAerfron丄e".1977,/S,155-158.b)C.E.McKenna,Jf.Schmidhauserj;Oiew.Soc.,Diew.Cbwm.1979,739.7P.A,Bartlet^L.A.McQuaid/j仿.CAem.5Vc,1984，706,7854-7860.8W.C.Chan,P,D.Whitein尸wocSo/M戶(hù)AosePepWde^"Aew's,J/Vocrica/^/iwocA(Eds.:W.C.Chan^P.D.White)OxfordUniversityPress,Oxford2000,pp.55-56.9E.G.Brown,J.M.Nuss7V/raAedrcwieff.1997,3&8457-8460.10J.Cai,B.WatheyrefroAe&oniert.2001,C1383-1385.11R.P.Jaii^R.M.Williams:Asymmetricsynthesisof(S)~(+)-caraitineandanalogs,71raAedw57(2001)(5505-09.'2S.Rahal,L.Badache:TheEschweiler-Clarkemethylationofaminoacids,J。Krna/rfe/aSoct'eie/4,ge"'en"eCA,'加'e4(1994),75-8513PAFowler,A.H.Haines,R.J.K,Taylor,E丄T.Chrystal,M.B.Giavestock:SynthesisandbiologicalactivityofacyclicanaloguesofNojirimycii^乂CS/VWw/(1994)2229-35."Bohner,M.'Ring,T.A,'Rapoport^N.andCaldwell,K.D."FibrinogenuptakebyPSlatexparticlescoatedwithvariousartiountsofaPEO/^PO/PEOtriblockcopolymer",J.BiomaterialsSci.，Polymered.,13(2002),733-746,15Andersson^M.,Fromell,K.,G函erg,E.,Artursson,P.，andCaldwell,K.D."CharacterizationofSurfaceModifiedNanoparticlesfor!-"vivoBiointeraction-ASedimentationField-FlowFractionationStudy",n'"/CV卿—(2005)77,5488-5493.權(quán)利要求1.具有根據(jù)SEQIDNO1的序列的多肽，其中至少一個(gè)磷酸膽堿衍生物與所述的多肽連接。2.由2個(gè)二聚化的根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽構(gòu)成的多肽，其中所述的2個(gè)原聚體具有相同或不同的氨基酸序列。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多肽，其中所述磷酸膽堿衍生物與原聚體之一的、位于位置8、17、22或34上的賴(lài)氨酸連接。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任意一項(xiàng)中所述的多肽，其還具有與所述多肽連接的報(bào)告基團(tuán)，該報(bào)告基團(tuán)優(yōu)選地與原聚體之一的、位于位置10、15、25或37上的賴(lài)氨酸連接。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的任意一項(xiàng)中所述的多肽，其中所述的磷酸膽堿衍生物通過(guò)間隔物與所述多肽連接，所述間隔物包含長(zhǎng)度為1-12個(gè)碳原子的碳鏈。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的任意一項(xiàng)中所述的多肽，其與C-反應(yīng)蛋白的結(jié)合親和力小于IOO納摩爾。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任意一項(xiàng)中所述的多肽，其中所述原聚體具有相同的序列或不同的序列，并且所述的序列選自SEQIDN0:3-18。8.用于生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求2-7的任意一項(xiàng)中所述的多肽二聚體的方法，所述方法包括以下步驟-合成至少2個(gè)具有根據(jù)SEQIDNO:l的序列的多肽；-在適于所述磷酸膽堿衍生物與所述賴(lài)氨酸發(fā)生連接的條件下使者說(shuō)磷酸膽堿衍生物與所述多肽之一的未封閉的賴(lài)氨酸接觸；-任選地，在適于所述報(bào)告基團(tuán)與所述賴(lài)氨酸發(fā)生連接的條件下使報(bào)告基團(tuán)與所述多肽之一的未封閉的賴(lài)氨酸接觸；以及-使所述多肽形成多肽二聚體。9.用于測(cè)定樣品中C-反應(yīng)蛋白的濃度的方法，所述方法包括使所述樣品與根據(jù)權(quán)利要求l-7的任意一項(xiàng)中所述的多肽相接觸的步驟。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述樣品得自患病的哺乳動(dòng)物。11.根據(jù)權(quán)利要求9-10的任意一項(xiàng)中所述的方法，其中所述的多肽二聚體與固體支持物結(jié)合。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其包括以下步驟-使所述樣品與根據(jù)權(quán)利要求1-7的任意一項(xiàng)中的第一多肽接觸，所述第一多肽與固體支持物結(jié)合；-使所述樣品與根據(jù)權(quán)利要求4-7的任意一項(xiàng)中的第二多肽接觸，所述第二多肽具有與其連接的報(bào)告基團(tuán)；以及-檢測(cè)在所述第二多肽上的所述報(bào)告基團(tuán)的存在或缺失情況。13.用于純化C-反應(yīng)蛋白的方法，其包括使包含C-反應(yīng)蛋白的組合物與根據(jù)權(quán)利要求1-7的任意一項(xiàng)中所述的多肽接觸。14.含有根據(jù)權(quán)利要求1-7的任意一項(xiàng)中所述的多肽的藥物組合物。15.含有根據(jù)權(quán)利要求1-7的任意一項(xiàng)中所述的多肽的診斷用組合物。全文摘要本發(fā)明涉及多肽二聚體，其中2個(gè)原聚體都具有根據(jù)SEQIDNO1的序列，并且其中至少1個(gè)磷酸膽堿衍生物與所述多肽連接。所述多肽對(duì)C-反應(yīng)蛋白(CRP)顯示出特異的結(jié)合作用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述多肽在用于檢測(cè)CRP的濃度的測(cè)定中、以及在純化CRP和含有CRP的組合物中的用途。文檔編號(hào)C07K1/10GK101415727SQ200780012601公開(kāi)日2009年4月22日申請(qǐng)日期2007年4月10日優(yōu)先權(quán)日2006年4月7日發(fā)明者L·巴爾策申請(qǐng)人:莫德普羅股份公司