專利名稱：顯示cd63表面表達(dá)的細(xì)胞的細(xì)胞毒性介導(dǎo)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌性疾病的診斷和治療，尤其涉及腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性 的調(diào)節(jié)；最尤其涉及癌性疾病調(diào)節(jié)抗體(CDMAB)作為引發(fā)細(xì)胞毒性反應(yīng) 的手段的用途，所述CDMAB任選地與一種或者多種化療劑聯(lián)用。本發(fā) 明還涉及利用本發(fā)明CDMAB的結(jié)合分析。
背景技術(shù)：
癌癥中的CD : CD63屬于四次跨膜蛋白(tetraspanin)家族中的三型 膜蛋白，該家族目前20個(gè)成員的特征是均具有四個(gè)跨膜片段。幾個(gè)工作 組通過(guò)使用針對(duì)活化的血小板的、中性粒細(xì)胞的和黑色素瘤細(xì)胞的全細(xì) 胞制備物的抗體，獨(dú)立地確定了 CD63的表達(dá)。對(duì)它們的同源糖蛋白抗 原的各自的cDNA進(jìn)行克隆后確認(rèn)了這些不同細(xì)胞上的抗原為同一種分 子。隨后，第六次國(guó)際白細(xì)胞分型研討會(huì)(1996)將這些抗體歸類為CD63 抗體。在1996年該研討會(huì)之前，CD63曾以多個(gè)名稱被命名(黑色素瘤1 抗原、眼黑色素瘤相關(guān)抗原、黑色素瘤相關(guān)抗原ME491、溶酶體相關(guān)膜 糖蛋白3、致密體膜蛋白(granulophysin)、黑色素相關(guān)抗原MLA1)，這些 名稱往往與導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)CD63的部分特性以及確認(rèn)的抗體有關(guān)。因此，CD63 也曾被稱為ME491抗原(MAb ME491)、神經(jīng)腺(neuroglandular)抗原(MAbs LS59， LS62， LS76， LSI 13， LSI40， LSI52)、 Pltgp40 (MAbs H5C6, H4F8 和H5D2)、人類骨髓基質(zhì)細(xì)胞抗原(MAb UF12)、骨祖細(xì)胞特異性標(biāo)志物 (MAb HOP-26)和整合素相關(guān)蛋白(MAb 6H1)。被發(fā)現(xiàn)與人類CD63發(fā)生 交叉反應(yīng)的其他抗體有8-lH、 8_2A (與ME491發(fā)生交叉反應(yīng))、NKI/C-3 禾口 NKI/black-13 (Vannegoor and Rumke， 1986; Demetrick ， 1992; Wange"/.， 1992)。
利用抗人黑素瘤細(xì)胞制備物的眾多抗體的一種，即MAbME491，從 黑素瘤cDNA文庫(kù)最先克隆出CD63 。人黑素瘤活檢研究表明MAb ME491的反應(yīng)性與黑素瘤的進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)。在正常黑色素細(xì)胞中，MAbME491 抗體的活性低，在黑色素瘤進(jìn)展早期階段(發(fā)育異常痣和放射生長(zhǎng)期 (radial growth phase ， RGP)腫瘤)抗體活性升高，在更晚期的黑色素瘤例如 垂直生長(zhǎng)期(vertialgrowth phase, VGP)和轉(zhuǎn)移性腫瘤中，MAb ME491抗 體的活性則下降甚至喪失。應(yīng)用MAb2.28(抗活化血小板)，CD63也在人 血小板中被發(fā)現(xiàn)并被部分表征，所述MAb 2.28檢測(cè)活化-依賴的血小板 膜53kDa糖蛋白。該分子還與未激活的血小板的內(nèi)部顆粒膜有關(guān)。同一 研究中，MAb2.28也用于標(biāo)記巨核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)部顆粒，其中它 與抗體共定位到組織蛋白酶D，所述組織蛋白酶D是已知的溶酶體小室 標(biāo)志物。關(guān)于抗體聚集和表達(dá)克隆的后續(xù)研究，證明該抗體識(shí)別的抗原 就是CD63，還證實(shí)其存在于溶酶體小室，在那里它與小室-特異性標(biāo)志 物L(fēng)AMP1和LAMP2共定位。該分子的克隆鑒定其確為CD63，并且屬 于四次跨膜蛋白家族。
在許多不同組織和細(xì)胞中都能夠檢測(cè)到CD63的表達(dá)。在細(xì)胞水平， 人們發(fā)現(xiàn)它與質(zhì)膜結(jié)合，也與細(xì)胞內(nèi)晚期內(nèi)體(late endosomal)的嚢狀結(jié)構(gòu) 結(jié)合。某些情況下，細(xì)胞活化通過(guò)動(dòng)員細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)備的CD63來(lái)增加表面 表達(dá)。在B淋巴細(xì)胞，尤其在內(nèi)體(endosomes)、參與將MHC II類分子 復(fù)合物輸出到表面的外體(exosomes)和分泌嚢泡中，還發(fā)現(xiàn)CD63與MHC II類分子共定位并發(fā)生物理結(jié)合。在包括B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞、中 性粒細(xì)胞、乳腺癌和黑素瘤細(xì)胞的許多細(xì)胞類型中，發(fā)現(xiàn)CD63與諸如 CD9、 CD81、 CD11 (整合素鏈"m'l,x)、 CD18 (整合素鏈/32)、 CD49c (VLA-3 或者整合素鏈a3)、 CD49d (整合素鏈a0、 CD49f (VLA-6或者整合素鏈 和CD29 (整合素鏈A)的其他四次跨膜蛋白家族的成員相互作用。
CD63在癌癥中的作用還不清楚。盡管最初幾個(gè)相互獨(dú)立的工作組發(fā) 現(xiàn)CD63參與諸如血小板和粒細(xì)胞活化、MHC II類分子依賴的抗原提呈、 整合素依賴性細(xì)胞粘附和運(yùn)動(dòng)以及某些類型癌癥的肺瘤進(jìn)展的多種事 件，但其功能還有待進(jìn)一步充分闡述。雖然目前有證據(jù)支持CD63在多 種細(xì)胞生理事件中的發(fā)揮作用，但是還不清楚這些作用是彼此獨(dú)立的還 是具有CD63參與的潛在的共同細(xì)胞機(jī)制。
幾個(gè)工作組已經(jīng)研究了 CD63和某些類型腫瘤進(jìn)展之間的關(guān)系，特別是與黑色素瘤進(jìn)展之間的關(guān)系。除MabME491之外，還研發(fā)了多種其 它的抗CD63單克隆抗體以用于對(duì)從攜帶不同進(jìn)展階段肺瘤的患者獲得 的癌癥標(biāo)本進(jìn)行免疫組化(immunohistochemical, IHC)染色。觀察到著色 變淺被作者解釋為極可能反映CD63的表達(dá)降低，并與肺瘤的晚期進(jìn)展 和轉(zhuǎn)移性特征相關(guān)。更近的一項(xiàng)研究還描述了包括CD63在內(nèi)的幾個(gè)四 次跨膜蛋白家族成員表達(dá)水平的明顯下調(diào)(mRNA定量后)與幾種乳腺癌 來(lái)源的細(xì)胞系體外侵襲性的顯著相關(guān)性。另外一項(xiàng)研究通過(guò)差異顯示法 確定了在去除雌激素的培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞中具有CD63。這說(shuō)明CD63的表 達(dá)受到類固醇-激素的調(diào)節(jié)，并且改變的CD63豐度和/或功能也可能與乳 腺肺瘤進(jìn)展有關(guān)。
與之相比，利用抗CD63單克隆抗體MAb FC-5.01的研究揭示了其 活性表位在不同正常組織中表達(dá)不同。盡管該抗體被發(fā)現(xiàn)能識(shí)別CD63， 但它并不能區(qū)分早期黑色素瘤和包括轉(zhuǎn)移性黑素瘤在內(nèi)的更晚期的黑色 素瘤(與MAbME491不同)，這表明CD63抗原存在于這些更晚期的肺瘤 細(xì)胞上，但是在來(lái)自不同階段的肺瘤的細(xì)胞中，它的某些表位被掩蓋。 這可能由于核心CD63多肽的翻譯后修飾發(fā)生改變，或是由于CD63和其 他分子的相互作用，影響了用于抗體識(shí)別和結(jié)合的特定表位的提供。這 些研究結(jié)果支持Si和Hersey(1993)所描述的觀察結(jié)果，即用抗CD63 MAb NKI-C3的染色不能區(qū)分來(lái)自諸如早期、放射生長(zhǎng)期、垂直生長(zhǎng)期以及轉(zhuǎn) 移性黑素瘤的不同進(jìn)展階段的黑素瘤的組織切片。盡管在對(duì)來(lái)自乳腺癌 和非小細(xì)胞性肺癌細(xì)胞的mRNA的其他研究分析(Adachi et al.， 1998; Huang etal., 1998)中，通過(guò)定量PCR，發(fā)現(xiàn)四次^爭(zhēng)膜蛋白分子家族中的兩 個(gè)成員(CD9和CD82)的表達(dá)水平與肺瘤進(jìn)展和患者預(yù)后存在明顯的相關(guān) 性，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CD63存在這種相關(guān)性，因?yàn)镃D63在所有的樣本中表達(dá) 都是相似的。由于這些結(jié)果存在明顯沖突，因此缺乏能明確證明CD63 和肺瘤之間的關(guān)系的有力和一致的數(shù)據(jù)。
到目前為止，很少有體內(nèi)研究試圖建立CD63與該分子的晚期胂瘤 抑制功能之間的聯(lián)系。在這些研究中的一項(xiàng)中，經(jīng)皮下和腹腔注射入無(wú) 胸腺小鼠的人CD63過(guò)度表達(dá)的H-RAS轉(zhuǎn)化的NIH-3T3細(xì)胞，與親代無(wú) CD63過(guò)度表達(dá)的小鼠細(xì)胞比較，顯示出惡性/致瘤性降低的表型，所述表型由減小的肺瘤體積和降低的轉(zhuǎn)移可能性以及增加的生存時(shí)間所表
明。這表明轉(zhuǎn)化細(xì)胞中人CD63的存在會(huì)抑制它們的惡性行為。更近期， 利用表達(dá)人CD63的轉(zhuǎn)基因d、鼠模型并誘導(dǎo)對(duì)CD63產(chǎn)生耐受的研究工作 表明用與牛痘病毒融合的人CD63免疫時(shí)，可以抑制注射的人CD63-MHC I型(H-2Kb)共轉(zhuǎn)染鼠黑素瘤細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)，并增加生存期。該研究作者 指出由于腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用僅存在于被注射CD63-MHC-I型共轉(zhuǎn)染 細(xì)胞，而不是CD63單獨(dú)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的動(dòng)物中，所以這種治療作用是T 淋巴細(xì)胞依賴性的，看起來(lái)內(nèi)源性抗CD63抗體并未參與該保護(hù)作用。 該解釋得到以下事實(shí)的支持經(jīng)純化的人CD63預(yù)免疫并且顯示已產(chǎn)生 抗人CD63抗體的野生型動(dòng)物中，沒(méi)有抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的保護(hù)作用。 Radford等人(1995)利用人CD63轉(zhuǎn)染KM3細(xì)胞系(最初認(rèn)為是人源，后 來(lái)定性為鼠源)的研究工作表明當(dāng)將所述細(xì)胞皮內(nèi)注射入無(wú)胸腺小鼠時(shí)， 與使用未轉(zhuǎn)染的KM3親代細(xì)胞觀察到的結(jié)果比較，該蛋白的表達(dá)減慢了 這些細(xì)胞的生長(zhǎng)并降低了其轉(zhuǎn)移潛能，盡管各種轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的 體外生長(zhǎng)率并無(wú)顯著性差異。這些觀察將CD63的潛在作用與其他已知 的在體內(nèi)和體外影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)率的肺瘤抑制基因區(qū)分開(kāi)來(lái)。此外， 在體外試驗(yàn)中(Radford et al., 1997),抗CD63單克隆抗體ME491的添加 不影響相同細(xì)胞的體外生長(zhǎng)率，所述ME491被發(fā)現(xiàn)通過(guò)減少細(xì)胞的隨機(jī) 運(yùn)動(dòng)影響它們的功能。
這項(xiàng)研究還描述了如下觀測(cè)結(jié)果在諸如層粘連蛋白、纖維連接蛋 白、膠原和玻璃粘連蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)衍生的趨化因子作用下， CD63能促進(jìn)遷移，并且這種作用可以由^-型整合素的功能性參與介導(dǎo)， 盡管針對(duì)整合素的抗體并不能夠阻斷這些作用。然而，看起來(lái)在CD63 轉(zhuǎn)染細(xì)胞上，玻璃粘連蛋白介導(dǎo)的信號(hào)(已知為整合素cg3s的配體)的作用 與由諸如纖維連接蛋白、層粘連蛋白和膠原的其他ECM成分介導(dǎo)的信號(hào) 的作用之間存在拮抗效應(yīng)。這提示在在特定條件下，ECM組分存在時(shí)， CD63的表達(dá)能導(dǎo)致遷移減少，這可能取決于粘附和運(yùn)動(dòng)之間的細(xì)^:平 衡。另一項(xiàng)研究中，抗CD63單克隆抗體(MAb710F)增強(qiáng)了 PMA處理的 HL-60細(xì)胞的粘附性和伸展性，而另 一種抗CD63單克隆抗體(MAb 2.28) 促進(jìn)類似作用，但只針對(duì)更小部分的細(xì)胞群，并且只在加入更大的抗體量時(shí)發(fā)揮所述作用。這些結(jié)果表明盡管目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種抗CD63抗 體，但是它們的功能性作用可能存在很大區(qū)別。
四次跨膜蛋白家族可能也參與了細(xì)胞增殖。Oren等(1990)描述了識(shí) 別CD81(TAPA-l)的小鼠MAb5A6對(duì)淋巴瘤細(xì)胞系的抗增殖作用。在另 一項(xiàng)研究中，人T淋巴細(xì)胞的CD37與抗體的結(jié)合阻斷了 CD37誘導(dǎo)的 增殖。更近期，用CD37表達(dá)缺失(CD37敲除)的小鼠動(dòng)物模型的研究顯 示，與來(lái)自野生型動(dòng)物的T淋巴細(xì)胞對(duì)刀豆蛋白A活化和CD3/T細(xì)胞受 體結(jié)合的響應(yīng)相比，來(lái)自CD37敲除小鼠的T淋巴細(xì)胞過(guò)度增殖。因此 提出在細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖中的功能性作用可能是四次跨膜蛋白家族的共 同特征。最近關(guān)于肝母細(xì)胞瘤和肝細(xì)胞癌細(xì)胞的研究顯示，這些細(xì)胞與 抗CD81單克隆抗體的結(jié)合導(dǎo)致Erk/MAP激酶通路的活化。已經(jīng)表明該 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖事件。平行研究也表明，過(guò)表達(dá)人 CD81的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系與模擬轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比顯示增殖增加。因此現(xiàn)有證據(jù) 已經(jīng)表明四次跨膜蛋白分子總體，尤其是CD63在細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和細(xì)胞 粘附/運(yùn)動(dòng)相關(guān)事件中的作用。因?yàn)檫@兩類細(xì)胞事件在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò) 程中起著重要作用，所以這兩者是目前熱點(diǎn)研究的靶點(diǎn)。
目前為止，還沒(méi)有報(bào)道抗CD63抗體或者特異性針對(duì)CD63表達(dá)細(xì)胞 的其它試劑能夠同時(shí)影響肺瘤細(xì)胞的體外和體內(nèi)生長(zhǎng)特性，以及影響腫 瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)物模型的生存期。
氨基酸序列測(cè)定和分析沒(méi)有揭示四次跨膜蛋白家族與其它蛋白質(zhì)家 族之間的同源性，或具有任何目前已表征的功能模塊，也沒(méi)有表明其具 有任何目前已知的酶活性。結(jié)果，人們很難研究該蛋白質(zhì)家族在信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)通路中的調(diào)節(jié)作用。但是，利用四次跨膜蛋白特異性試劑產(chǎn)生的證據(jù) 表明四次跨膜蛋白具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)特性，所述試劑能改變細(xì)胞的生理機(jī) 能，而這密切依賴于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)。CD63在物理和/或功能上均 顯示出與大量分子有聯(lián)系，所述分子本身是參與第二信使信號(hào)的產(chǎn)生的 酶，或者在物理和/或功能上與這類酶相關(guān)。
實(shí)驗(yàn)表明，預(yù)先用幾種抗CD63單克隆抗體(AHN-16、 AHN-16.1、 AHN-16.2、 AHN-16.3和AHN-16.5)處理中性粒細(xì)胞促進(jìn)它們與培養(yǎng)內(nèi)皮癥反應(yīng)的起始步驟之一。此外這種作
用強(qiáng)烈地依賴于鈣離子(Ca,的存在，所述4丐離子是公知的多種胞內(nèi)信號(hào)
通路的調(diào)節(jié)因子，它作用于細(xì)胞接觸刺激性抗體的特定時(shí)段。在接觸抗 體更長(zhǎng)時(shí)間后，中性粒細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附作用開(kāi)始變得對(duì)后來(lái)加入 的鈣離子不敏感，因此提示這是動(dòng)態(tài)和短暫的調(diào)節(jié)(暫時(shí)的)事件。此外，
發(fā)現(xiàn)CD63在物理上和CD11/CD18蛋白復(fù)合物相互作用，特異性靶向作 用于此復(fù)合物的試劑介導(dǎo)調(diào)節(jié)信號(hào)。在這項(xiàng)研究中還發(fā)現(xiàn)，CD63在物理 上與包括酪氨酸激酶Lck和Hck的酶的復(fù)合物有關(guān)，或者其本身就是該 復(fù)合物的一部分。這些酶是一類蛋白質(zhì)的成員，這類蛋白質(zhì)在特定表面 受體活化后，在介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)信號(hào)中發(fā)揮重要作用，是導(dǎo)致細(xì)胞特異 性生理變化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)的一部分。另一項(xiàng)研究表明，四次 跨膜蛋白(包括CD63)與單克隆抗體的共連接(co-ligation),能夠增強(qiáng)黏著 斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)的磷酸化或活性，所述FAK由 MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞對(duì)膠原底物的粘附來(lái)誘導(dǎo)。這表明CD63(和其 它四次跨膜蛋白家族成員)直接參與整合素介導(dǎo)的酪氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通
路的調(diào)節(jié)。其它可以在功能上通過(guò)抗CD63單克隆抗體MAb 710F與表面 CD63的存在和連接(ligation)交叉的信號(hào)通路是那些依賴于通過(guò)蛋白激酶 C(protdn kinase C, PKC)磷酸化調(diào)節(jié)的通路，所述PKC是另夕I、一種公知 的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)劑。在本文中，骨髓細(xì)胞系HL-60的粘附 和形態(tài)改變經(jīng)由MAb 710F的增強(qiáng)依賴于豆蔻酰佛波醇乙酯(phorbol myristate acetate, PMA)對(duì)所述細(xì)胞的預(yù)處理，盡管PKC的短暫參與并沒(méi) 有得到最終證實(shí)。然而， 一獨(dú)立工作組的后期研究證實(shí)PMA誘導(dǎo)的HL-60 分化是PKC活性依賴的，因?yàn)镽o31-8220分子(該酶的特異性抑制劑)阻 斷了 PMA的作用。
支持CD63和其他四次跨膜蛋白家族成員與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)聯(lián)的進(jìn) 一步證據(jù)來(lái)自下述研究。該研究描述了 CD63 (以及CD53)分子與酪氨酸 磷酸酶活性之間的物理關(guān)聯(lián)(直接結(jié)合的或作為超分子復(fù)合物的一部分) 在該研究中，利用抗CD63抗體分離的免疫沉淀復(fù)合物顯示與酪氨酸磷 酸酶活性有關(guān)，盡管與顯示與酪氨酸磷酸酶CD45有關(guān)的CD53不同，但 不可能鑒定CD63相關(guān)的磚酸酶。更近期還發(fā)現(xiàn)幾個(gè)四次跨膜蛋白家族的成員與II型磷脂酰肌醇4-激酶(11型PI4-K)有關(guān)(Berditchevski d a/.， 1997)。這種相互作用看起來(lái)非常特異，因?yàn)槠鋬H在CD9、 CD63、 CD81、 CD1 51和A15/TALLA中被確定，并沒(méi)有觀察到發(fā)生于CD37、 CD52、 CD82或NAG-2。此外，由于每個(gè)含有PI-4激酶的復(fù)合物限于單個(gè)四次 跨膜蛋白家族成員，所以四次^爭(zhēng)膜蛋白家族成員和PI-4K之間的關(guān)聯(lián)是 唯一的。特別發(fā)現(xiàn)CD63-PI-4激酶復(fù)合物與其它他四次跨膜蛋白成員形 成的復(fù)合物不同，幾乎完全位于脂我樣結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞內(nèi)小室中。這一發(fā) 現(xiàn)表明，與PI-4激酶相互作用的CD63部分會(huì)參與涉及或者依賴于磷酸 肌醇生物合成途徑的特定的細(xì)胞內(nèi)事件(Claas， C， "a/, 2001)，已知所述磷 酸肌醇生物合成途徑除了作為第二信使分子外，還參與了膜運(yùn)輸(胞吞和 胞吐作用)以及細(xì)胞骨架重組的調(diào)節(jié)(Martin, T., 1998)。
到目前為止發(fā)現(xiàn)的與CD63直接相關(guān)的所有酶在信號(hào)通路調(diào)節(jié)中的 直接和重要參與提供了支持CD63與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)相關(guān)聯(lián)的進(jìn)一步 的證據(jù)，所述CD63作為這些酶活性下游的調(diào)節(jié)因子或者效應(yīng)分子。
闡明導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展的機(jī)制是非常困難和復(fù)雜的工作，經(jīng)常被很多明 顯的相互矛盾的發(fā)現(xiàn)所掩蓋，因此很少能夠?qū)⒛切┌l(fā)現(xiàn)成功轉(zhuǎn)化為有效 的療法。從目前已知的關(guān)于CD63與肺瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 之間的關(guān)聯(lián)來(lái)看，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)改變CD63的功能是可能的。
開(kāi)發(fā)對(duì)腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用的抗原特異性試劑作為潛在的治療 或者診斷工具將是極其有益的，所述試劑結(jié)合表達(dá)識(shí)別抗原的細(xì)胞，并 且通過(guò)自身或者與其他分子結(jié)合而具有細(xì)胞的或者體內(nèi)的生理活性，以 使這些試劑抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，且對(duì)正常細(xì)胞群無(wú)顯著的 損傷作用。
用作癌癥治療的單克隆抗體每個(gè)患有癌癥的個(gè)體都是獨(dú)特的，正 如人的身份有所差異一樣，其患有的癌癥也不同于其他癌癥。盡管這樣， 現(xiàn)有療法用相同方式治療患有同期同類型癌癥的所有患者。這種患者中 的至少30%的一線治療是失敗的，從而導(dǎo)致更多輪次的治療并且增加了 治療失敗、轉(zhuǎn)移和最終死亡的可能性。優(yōu)良的治療方法應(yīng)該是針對(duì)特定 個(gè)體的個(gè)體化療法?，F(xiàn)有唯一的個(gè)體化療法是手術(shù)?；熀头暖煙o(wú)法針
對(duì)患者量身定做，而手術(shù)本身在大部分情況下不足以治愈癌癥。隨著單克隆抗體的出現(xiàn)，開(kāi)發(fā)個(gè)體化療法的可能性變得更加現(xiàn)實(shí)， 因?yàn)槊糠N抗體可以針對(duì)單一表位。此外，有可能制備抗體的組合，所述
組合針對(duì)表位的集群(constellation),所述集群唯一地限定了特定個(gè)體的腫瘤。
在認(rèn)識(shí)到癌性細(xì)胞和正常細(xì)胞之間的顯著差異是癌性細(xì)胞包含對(duì)轉(zhuǎn) 化細(xì)胞特異的抗原后，科學(xué)界長(zhǎng)期以來(lái)認(rèn)為可以將單克隆抗體設(shè)計(jì)為通 過(guò)特異結(jié)合這些癌癥抗原特異地靶向轉(zhuǎn)化細(xì)胞；這樣就產(chǎn)生了單克隆抗 體可以作為"魔術(shù)子彈(MagicBullets)"消除癌細(xì)胞的觀點(diǎn)。但是，現(xiàn)在已 經(jīng)廣泛意識(shí)到?jīng)]有單一的單克隆抗體可以用于癌癥的所有情形，并且單 克隆抗體可以按類來(lái)開(kāi)發(fā)，用來(lái)治療目標(biāo)癌癥。依照本發(fā)明公開(kāi)的方法 分離的單克隆抗體已經(jīng)顯示以有益于患者的方式改善癌性疾病過(guò)程，例 如通過(guò)減輕腫瘤負(fù)擔(dān)，所述分離的單克隆抗體在本文中將分別被稱為癌 性疾病調(diào)節(jié)抗體(CDMAB)或者"抗癌"抗體。
目前，癌癥患者通?？蛇x4奪的治療方法很少。癌癥治療的組合方法 已經(jīng)改善了總體存活率和發(fā)病率。但是，對(duì)于特定個(gè)體，這些改善的統(tǒng) 計(jì)數(shù)據(jù)和他們個(gè)人狀況的改善不一定必然相關(guān)。
因此，如果提出一種方法學(xué)，使醫(yī)師能夠獨(dú)立于相同群組中的其他 患者來(lái)治療每例腫瘤，這就會(huì)使根據(jù)個(gè)體進(jìn)行量身定做的獨(dú)特治療成為 可能。理論上這種治療過(guò)程將提高治愈率，產(chǎn)生更好的結(jié)果，從而滿足 長(zhǎng)期感受到的需要。
從歷史上來(lái)看，多克隆抗體已經(jīng)被用于人類癌癥的治療，但只取得 了有限的成功。已經(jīng)用人血漿來(lái)治療淋巴瘤和白血病，^旦纟艮少有延長(zhǎng)的 癥狀緩解或者反應(yīng)。此外，與化療相比，缺乏重現(xiàn)性，也沒(méi)有額外的益 處。諸如乳腺癌、黑素瘤和腎細(xì)胞癌的實(shí)體瘤也用人血液、黑猩猩血清、 人血漿和馬血清進(jìn)行治療過(guò)，但是相應(yīng)的結(jié)果是不可預(yù)見(jiàn)和無(wú)效的。
有很多用單克隆抗體治療實(shí)體腫瘤的臨床試驗(yàn)。在20世紀(jì)80年代， 就有至少四項(xiàng)針對(duì)人類乳腺癌的臨床試驗(yàn)，所述試驗(yàn)在使用了針對(duì)特定 抗原或基于組織特異性的抗體的至少47個(gè)患者中，只產(chǎn)生了一名應(yīng)答者。 直到1998年，才有了成功的臨床試驗(yàn)，該試驗(yàn)聯(lián)合使用人源化的抗 Her2/neu抗體(Herceptii/)與順粕。在這項(xiàng)試驗(yàn)中，對(duì)37個(gè)患者的反應(yīng)進(jìn)行了評(píng)估，大約有四分之一的患者有部分反應(yīng)率，另外四分之一有輕微
的或穩(wěn)定的病情發(fā)展。在反應(yīng)者中，中位進(jìn)展時(shí)間(median time to progression)是8.4個(gè)月，其中中位反應(yīng)持續(xù)時(shí)間(median response duration) 是5.3個(gè)月。
Herceptii^在1998年被批準(zhǔn)作為與Taxof聯(lián)合使用的一線用藥。臨 床試驗(yàn)結(jié)果表明，與單獨(dú)接受TaxoP治療的人群的中位疾病進(jìn)展時(shí)間(3.0 月)相比，接受抗體治療與Taxol⑧聯(lián)合應(yīng)用的患者的中位疾病進(jìn)展時(shí)間(6.9 月)增加。Herceptii^與Taxo^聯(lián)合治療組的中位存活時(shí)間也輕微增加，與 Taxo產(chǎn)單獨(dú)治療組相比是22個(gè)月18個(gè)月。除此之外，所述抗體和Taxol 聯(lián)合應(yīng)用組與單獨(dú)使用Taxof組相比，在完全應(yīng)答者(8%: 2%)和部分應(yīng) 答者(34%: 15%)的數(shù)量方面都有增加。然而Herceptir^和Taxof聯(lián)合治 療相比Taxo嚴(yán)單獨(dú)治療，導(dǎo)致了較高的心血管毒性發(fā)病率(分別是13%和 1%)。此外，Herceptii^治療也只對(duì)那些過(guò)表達(dá)人類表皮生長(zhǎng)因子受體 2(Her2/neu)(通過(guò)免疫組化(IHC)分析來(lái)確定)的患者有效。Her2/neu是目 前還不知其功能或生物學(xué)重要配體的受體；大約25%的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患 者過(guò)表達(dá)Her2/neu。因此遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足患乳腺癌的患者的治療需求。即 便那些從Herceptir^治療中受益的患者仍然需要化療，并且隨后還必須至 少在一定程度上處理這類治療的副作用。
研究結(jié)腸直腸癌的臨床試驗(yàn)涉及同時(shí)抗糖蛋白和糖脂耙的抗體。對(duì) 腺癌具有一定特異性諸如17-1A的抗體，已經(jīng)進(jìn)行了超過(guò)60例患者的2 期臨床試驗(yàn)，其中僅有1例患者有部分應(yīng)答。在其他試驗(yàn)中，在采用另 外的環(huán)磷酰胺的實(shí)驗(yàn)方案的52例患者中，使用17-lA僅產(chǎn)生1例完全應(yīng) 答和2例輕微應(yīng)答。迄今為止，17-1A作為III期結(jié)腸癌輔助治療的III 期臨床試驗(yàn)還沒(méi)有顯示出改善的療效。使用最初被批準(zhǔn)用于成像的人源 化鼠單克隆抗體也沒(méi)有使腫瘤消退。
只有到了最近，使用單克隆抗體進(jìn)行的結(jié)腸直腸癌的臨床試驗(yàn)才有 一些陽(yáng)性結(jié)果。在2004年，ERBITUX⑧被批準(zhǔn)作為表達(dá)EGFR的轉(zhuǎn)移結(jié) 腸直腸癌患者的二線治療用藥，這些患者對(duì)于基于依立替康(irinotecan) 的化療是耐受的。雙臂II期臨床研究和單臂研究的結(jié)果表明，ERBITUX 與依立替康聯(lián)合應(yīng)用分別有23%和15%的反應(yīng)率，中位疾病進(jìn)展時(shí)間分別是4.1和6.5月。來(lái)自同 一項(xiàng)雙臂II期臨床試驗(yàn)和另 一項(xiàng)單臂研究的結(jié) 果表明，ERBITUX⑧單獨(dú)治療的反應(yīng)率分別是11%和9%,中位疾病進(jìn)展 時(shí)間分別是1.5和4.2個(gè)月。
因而在瑞士和美國(guó)，￡113汀1;乂@與依立替康的聯(lián)合應(yīng)用，以及在美國(guó)， ERBITUX⑧的單獨(dú)治療都已經(jīng)被批準(zhǔn)作為依立替康一線治療失敗的結(jié)腸 癌患者的二線治療。因此，與Herceptii^—樣，ERBITUX⑧治療在瑞士只 被批準(zhǔn)作為單克隆抗體和化療聯(lián)合應(yīng)用。此外，在瑞士和美國(guó)，ERBITUX 治療只被批準(zhǔn)作為患者的二線治療。同樣，在2004年，AVASTIN⑧被批 準(zhǔn)與基于靜脈注射5-氟尿嘧啶的化療聯(lián)合應(yīng)用，作為轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌 的一線治療。ni期臨床研究結(jié)果表明，聯(lián)合應(yīng)用AVASTIN⑧和5-氟尿嘧 啶，與單獨(dú)使用5-氟尿嘧啶相比，延長(zhǎng)了患者的中位存活時(shí)間(分別是20 個(gè)月和16個(gè)月)。然而，還是與Herceptin⑧和ERBITUX⑧一樣，AVASTIN 只被批準(zhǔn)作為單克隆抗體與化療聯(lián)合應(yīng)用。
對(duì)于肺癌、腦癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌的治療，療效 仍然很差。對(duì)于非小細(xì)胞肺癌最有希望的近期結(jié)果來(lái)自II期臨床試驗(yàn)， 其中治療涉及偶聯(lián)到細(xì)胞殺傷藥物阿霉素的單克隆抗體(S GN-15; dox-BR96,抗-Sialyl-LeX)與化療劑泰素帝(Taxotere)聯(lián)用。泰素帝是唯一 經(jīng)FDA批準(zhǔn)用于肺癌二線治療的化療劑。原始數(shù)據(jù)顯示相對(duì)于單用泰素 帝，總體存活率提高。該研究招募的62例患者中，2/3接受SGN-15與泰 素帝聯(lián)合治療，而剩余的1/3接受單獨(dú)的泰素帝治療。對(duì)于接受SGN-15 與泰素帝聯(lián)合治療的患者，中位總體存活時(shí)間為7.3個(gè)月，與之相對(duì)，接 受泰素帝單獨(dú)治療的患者為5.9個(gè)月。接受SNG-15加泰素帝治療的患者 在1年和18個(gè)月時(shí)的總體存活率分別為29%和18%，與之相比，接受泰 素帝單獨(dú)治療的患者分別為24°/。和8%。進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)在計(jì)劃中。
臨床前試驗(yàn)中，使用單克隆抗體治療黑色素瘤取得了有限的成功。 這些抗體中，極少有達(dá)到臨床試驗(yàn)期的，且至今還沒(méi)有一種得到批準(zhǔn)， 或在III期臨床試驗(yàn)中顯示出良好效果。
由于對(duì)能夠明確促進(jìn)疾病發(fā)生的30， 000種已知基因產(chǎn)物中的相關(guān) 靶點(diǎn)缺乏鑒定，使治療疾病的新藥的發(fā)現(xiàn)受阻。在胂瘤學(xué)研究中，潛在 的藥物耙點(diǎn)僅因?yàn)槠湓谀[瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)這一事實(shí)而經(jīng)常被選擇。隨后，這樣鑒定的靶點(diǎn)通過(guò)與大量化合物的相互作用被篩選。就潛在抗體的治
療而言，這些候選化合物通常由依據(jù)Kohler和Milstein提出的基本原理 (1975， Nature, 256， 495-497, Kohler and Milstein)的制備單克隆抗體的傳統(tǒng) 方法所產(chǎn)生。從抗原(例如，全細(xì)胞、細(xì)胞成分、純化的抗原)免疫過(guò)的小 鼠收集脾細(xì)胞，并與永生的雜交瘤細(xì)胞伴侶融合。基于與靶抗原密切結(jié) 合的抗體的分泌來(lái)篩選所產(chǎn)生的雜交瘤。包括Herceptin⑧和RITUXIMAB 在內(nèi)的許多針對(duì)癌細(xì)胞的治療和診斷的抗體已經(jīng)被用這些方法制備并已 基于它們的親和性被選擇。這項(xiàng)策略的缺陷是雙重的。首先，由于對(duì)組 織特異性的癌癥過(guò)程認(rèn)識(shí)的貧乏及由此產(chǎn)生的鑒定這些靶標(biāo)的過(guò)分筒單 的方法(諸如通過(guò)過(guò)表達(dá)來(lái)篩選)，與用于治療或診斷的抗體結(jié)合的合適靶 標(biāo)的選擇是有限的。其次，與受體有最大結(jié)合親和性的藥物分子通常具 有啟動(dòng)或抑制信號(hào)的最大可能性這一假說(shuō)并不總是成立。
盡管乳癌和結(jié)腸癌的治療取得了 一些進(jìn)展，但是有效的抗體治療的 鑒定與開(kāi)發(fā)對(duì)所有類型癌癥而言都是不夠的，不管是作為單一試劑還是 聯(lián)合治療。
現(xiàn)有專利
US05296348講述了用于選4奪特異性針對(duì)內(nèi)化的癌細(xì)胞表面抗原的
的單克隆抗體的方法。通過(guò)實(shí)施例，顯示ME491抗體在W9、 WM35、 WM983黑素瘤細(xì)胞和SW948結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中內(nèi)化。此外，顯示了 ME491抗體降低了 SW948細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞增殖。專利申請(qǐng) US20030211498A1 (及其相關(guān)申請(qǐng):WO0175177A3， WO0175177A2, AU0153140A5)公開(kāi)了 一種使用與卵巢肺瘤標(biāo)志多肽結(jié)合的抗體來(lái)抑制 卵巢腫瘤生長(zhǎng)或者轉(zhuǎn)移的方法，所述多肽由選自包括CD63抗原的一組 的卵巢腫瘤標(biāo)志基因編碼。利用卵巢癌進(jìn)行了基因表達(dá)系列分析，將使 CD63被識(shí)別的卵巢腫瘤標(biāo)志基因作為候選基因。專利申請(qǐng) WO02055551A1 (及其相關(guān)申請(qǐng)CN1364803A)^^開(kāi)了 一種新的多肽-人 CD63抗原56.87。專利申請(qǐng)CN1326962A公開(kāi)了 一種新的多肽-人CD63 抗原14.63。專利申請(qǐng)CN1326951A公開(kāi)了一種新的多肽-人CD63抗原15.07。專利申請(qǐng)CN1351054A公開(kāi)了一種新的多肽-人CD63抗原11.11。 這些專利和專利申請(qǐng)均鑒定了 CD63抗原和抗體，但未公開(kāi)本發(fā)明分離 的單克隆抗體，或者本發(fā)明分離的單克隆抗體的應(yīng)用。
編碼ME491多肽抗原的基因被克隆，其序列于1988年2月24日被 接受公布(Can Res 48:2955, 1988年6月1日)；編碼CD63的基因被克隆 并于1991年2月公開(kāi)了其序列(JBC 266(5):3239-3245, 1991),并且所述 公開(kāi)清楚表明了 ME491與CD63的同一性。
WO2004041170.89 (序列識(shí)別號(hào)89，優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)日2004年6月29 日),WO2003068268-A2 (序列識(shí)別號(hào)1,優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)日2003年2月13日 (2003WO-EP001461); 其他優(yōu)先權(quán)日2002年2 月 14 日 (2002GB-00003480)), WO2003057160-A29 (序列識(shí)別號(hào)40,優(yōu)先權(quán)申請(qǐng) 日2002年12月30日(2002WO-US041798);其他優(yōu)先權(quán)日2002年1月 2曰(2002US-0345444P))都公開(kāi)了與CD63具有100%序列同源性的多肽。
WO2003016475-A2 (序列識(shí)別號(hào):9787&12101,優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)日2002 年8月14日(2002WO-US025765)其他優(yōu)先權(quán)日2001年8月14日(2001 US-0312147P)公開(kāi)了與包含CD63的238個(gè)氨基酸中的237個(gè)氨基酸具 有100%序列同源性的多肽。
WO2003070902-A2 (序列識(shí)別號(hào):27,優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)日2003年2月18 曰(2003WO-US004902); 其他優(yōu)先權(quán)日2002年2月 20曰 (2002US-0358279P))公開(kāi)了與包含CD63的238個(gè)氨基酸中的224個(gè)氨基 酸具有94%序列同源性的多肽。
EP1033401-A2 (序列識(shí)別號(hào)4168&4913,優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)日2000年2月 21日(2000EP-00200610); 其他優(yōu)先權(quán)日1999年2月 26日 (99US-0122487P))公開(kāi)了分別與包含CD63的238個(gè)氨基酸中的205個(gè)氨 基酸和94個(gè)氨基酸具有100%序列同源性的多肽。
WO200257303-A2 (志賀菌屬(Shigella) ospG捕獲的人獵物蛋白#26， 優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)日2002年1月11日(2002WO-EP000777);其他優(yōu)先權(quán)日 2001年1月12日(2001US-0261130P))公開(kāi)了與包含CD63的238個(gè)氨基 酸中的130個(gè)氨基酸具有100。/。序列同源性的多肽。
WO200055180-A2(序列識(shí)別號(hào)756，優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)日2000年3月8日(2000WO-US005918)其他優(yōu)先權(quán)日1999年3月12日(99US-0124270P)) 公開(kāi)了與包含CD63的238個(gè)氨基酸中的127個(gè)氨基酸具有99%序列同 源性的多肽。
WO200200677-A1 (序列識(shí)別號(hào):3203，優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)日2001年6月7 曰(2001WO-USO18569); 其他優(yōu)先權(quán)日2000年6月 7 曰 (2000US-0209467P))公開(kāi)了與包含CD63的238個(gè)氨基酸中的132個(gè)氨基 酸具有97%序列同源性的多肽。
WO9966027-A1 (來(lái)自人CD63蛋白的大胞外環(huán)(Large extracellular loop)序列，優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)?jiān)?999年6月15日(99WO-US013480);其他優(yōu) 先權(quán)日1998年6月15日(98US-0089226P))公開(kāi)了與包含CD63的238 個(gè)氨基酸中的99個(gè)氨基酸具有100%序列同源性的多肽。
WO200270539-A2 (序列識(shí)別號(hào)1207,優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)日2002年3月5 曰(2002WO-US005095); 其他優(yōu)先權(quán)日2001 年3月 5曰 (2001US-00799451))公開(kāi)了與包含CD63的238個(gè)氨基酸中的102個(gè)氨基 酸具有86%序列同源性的多肽。
EP1033401-A2(序列識(shí)別號(hào)4169，優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)日2000年2月21日 (2000EP-00200610);其他優(yōu)先權(quán)日:1999年2月26日(99US-0122487P) 公開(kāi)了與包含CD63的238個(gè)氨基酸中的74個(gè)氨基酸具有100%序列同 源性的多肽。
這些專利申請(qǐng)鑒定了與CD63抗原具有不同序列同源性的多肽。在 大多數(shù)情況下，這些申請(qǐng)還公開(kāi)了相應(yīng)多肽及其同系物的抗體和抗體衍 生物，但沒(méi)有公開(kāi)本發(fā)明分離的單克隆抗體，或本發(fā)明分離的單克隆抗 體的應(yīng)用。重要的是，所有上述申請(qǐng)都是在編碼CD63的多核苷酸序列 公開(kāi)后提交的。
發(fā)明概述
本發(fā)明人此前已被授予了 "個(gè)體化患者特異性抗癌抗體，，的美國(guó)專利 6,180,357,該專利涉及選擇個(gè)體化定制抗癌抗體的方法，所述抗體可用 于治療癌性疾病。本領(lǐng)域公知可以改變多肽中的某些氨基酸序列而不會(huì) 對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能產(chǎn)生顯著的影響。在抗體的分子重排中，對(duì)骨架區(qū)的核酸或氨基酸序列的修飾通常是可以耐受的。這些修飾包括但不限 于取代(優(yōu)選保守取代)、刪除或添加。此外，本發(fā)明還涉及將標(biāo)準(zhǔn)的化療
模式，例如放射性核素，與本發(fā)明的CDMAB偶聯(lián)，從而使所述化療劑 的作用集中。CDMAB還可以與毒素、細(xì)胞毒性部分、酶(例如生物素偶 聯(lián)酶)或者造血細(xì)胞偶聯(lián)，從而形成抗體偶聯(lián)物。
本申請(qǐng)采用6,180,357專利中講述的制備患者特異性抗癌抗體的方 法，以分離雜交瘤細(xì)胞系，所述細(xì)胞系編碼癌性疾病調(diào)節(jié)單克隆抗體。 這些抗體可以被制備為特異性地針對(duì)一種腫瘤，由此使得癌癥治療的個(gè) 體化成為可能。在本申請(qǐng)公開(kāi)的內(nèi)容中，具有細(xì)胞殺滅(細(xì)胞毒素的)或細(xì) 胞生長(zhǎng)抑制(細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的)特性的抗癌抗體將在下文中被稱為細(xì)胞毒 的。這些抗體可以用于幫助癌癥的分期和i貪斷，也可以用于治療腫瘤轉(zhuǎn) 移。這些抗體也可以通過(guò)預(yù)防性治療的方式用于癌癥預(yù)防。與傳統(tǒng)的藥 物發(fā)現(xiàn)才莫式下制備的抗體不同，用本方法制備的抗體可以耙向以前沒(méi)有 表明對(duì)惡性組織生長(zhǎng)和/或存活必需的分子和途徑。而且，這些抗體的結(jié) 合親和性滿足啟動(dòng)細(xì)胞毒性作用事件的要求，所述事件可不順從于更強(qiáng) 的親和性相互作用。
個(gè)體化抗癌治療的前景將給患者的治療方式帶來(lái)改變?？赡艹霈F(xiàn)的 臨床情景是在腫瘤出現(xiàn)時(shí)獲取腫瘤樣本并入庫(kù)。通過(guò)該樣本，從預(yù)存在 的癌性疾病調(diào)節(jié)抗體組中對(duì)肺瘤進(jìn)行分型。對(duì)該患者進(jìn)行常規(guī)分期，而 所提供的抗體可用于該患者的進(jìn)一步分期。用現(xiàn)有的抗體可以直接對(duì)該 患者進(jìn)行治療，且所述腫瘤特異性的抗體組可以通過(guò)使用本文中列出的 方法來(lái)制備或通過(guò)噬菌體顯示庫(kù)與本文公開(kāi)的篩選方法合用來(lái)制備。既 然其他腫瘤可能攜帶一些與被治療肺瘤相同的抗原決定簇，所有制備的 抗體都將被加入到抗癌抗體庫(kù)中。按照本方法制備的抗體可以用于治療 許多患有與這些抗體結(jié)合的腫瘤的患者的癌性疾病。
除抗癌抗體之外，患者可以選擇接受目前推薦的療法作為多模式治 療方案的一部分。通過(guò)本方法分離的抗體對(duì)非癌性細(xì)胞是相對(duì)無(wú)毒的事 實(shí)允許大劑量抗體組合的使用，所述組合或者單獨(dú)使用，或者與常規(guī)療 法聯(lián)用。高治療指數(shù)也允許短時(shí)程重復(fù)治療，這將降低治療抗性細(xì)胞出 現(xiàn)的可能性。如果患者的初期治療產(chǎn)生耐藥性或發(fā)生了轉(zhuǎn)移，可以重復(fù)腫瘤特異 性抗體的制備過(guò)程進(jìn)^f亍再次治療。此外，所述抗癌抗體可以與從該患者 體內(nèi)獲得的紅細(xì)胞偶聯(lián)，重新輸注到患者體內(nèi)用于治療轉(zhuǎn)移肺瘤。目前 幾乎沒(méi)有有效的治療轉(zhuǎn)移癌的方法，而轉(zhuǎn)移通常預(yù)示著導(dǎo)致死亡的不良 結(jié)果。然而，轉(zhuǎn)移癌通常血管豐富，并且通過(guò)紅細(xì)胞來(lái)遞送抗癌抗體可 以具有將抗體富集在腫瘤部位的作用。即便在轉(zhuǎn)移之前，大多數(shù)癌細(xì)胞 也要依賴于宿主的血供來(lái)存活，因而與紅細(xì)胞偶聯(lián)的抗癌抗體對(duì)原位腫 瘤同樣有效。可選#^也，所述抗體可以與例如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單 核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等其他血細(xì)胞偶聯(lián)。
抗體有五類，每類都與其重鏈所賦予的功能相關(guān)。通常認(rèn)為通過(guò)抗 體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性作用來(lái)介導(dǎo)棵抗體
的癌細(xì)胞殺傷功能。例如，鼠IgM和IgG2a抗體能夠通過(guò)結(jié)合補(bǔ)體系統(tǒng) 的Cl組分來(lái)活化人類補(bǔ)體，從而活化導(dǎo)致腫瘤裂解的補(bǔ)體活化的經(jīng)典途 徑。對(duì)于人類抗體，最有效的補(bǔ)體激活抗體通常是IgM和IgGl。鼠IgG2a 和IgG3同種型抗體可以有效地募集具有Fc受體的細(xì)胞毒細(xì)胞，所述Fc 受體會(huì)導(dǎo)致單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和某些淋巴細(xì)胞的細(xì)胞殺傷作
用。人IgGl和IgG3同種型抗體介導(dǎo)ADCC。
抗體介導(dǎo)的癌癥殺傷的另一個(gè)可能機(jī)制可能通過(guò)抗體的使用，所述
抗體能夠催化細(xì)胞膜及其結(jié)合的糖蛋白或糖脂中的多種化學(xué)鍵的水解， 即所謂的催化抗體。
抗體介導(dǎo)的癌細(xì)胞殺傷還有三種機(jī)制。第 一種是用抗體作為疫苗以
誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)存在于癌細(xì)胞的推定抗原的免疫反應(yīng)。第二種是用抗 體靶向生長(zhǎng)受體，并干擾它們的功能或下調(diào)所述受體，以使受體功能有 效喪失。第三種是這類受體對(duì)細(xì)胞表面部分的直接連接(ligation)作用，這 可導(dǎo)致直接的細(xì)胞死亡，比如諸如TRAIL Rl或TRAIL R2的死亡受體， 或是諸如aV03及其類似物的整合素分子的連接。
癌癥藥物的臨床應(yīng)用是基于該藥物在可接受的風(fēng)險(xiǎn)范圍下對(duì)患者的 益處。在癌癥治療中，存活率通常是追求的最主要的益處。但是，除了 延長(zhǎng)壽命之外，還有許多其他公認(rèn)的益處。在治療對(duì)存活率沒(méi)有負(fù)面影 響的情況下，這些其他益處包括癥狀減輕、防止副作用、延長(zhǎng)復(fù)發(fā)或無(wú)疾病存活時(shí)間以及延長(zhǎng)病情進(jìn)展時(shí)間。這些標(biāo)準(zhǔn)是一皮普遍接受的，且諸
如美國(guó)食品藥品管理局(F.D.A.)等管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)產(chǎn)生這些益處的藥物 (Hirschfeld d a/. Critical Reviews in Oncology/Hematolgy (月中瘤學(xué)/血液學(xué) 的臨床綜述)42:137-143 2002)。除了這些標(biāo)準(zhǔn)之外，人們充分認(rèn)識(shí)到還有 一些其他的指標(biāo)可以預(yù)測(cè)這些類型的益處。在某種程度上，美國(guó)FDA準(zhǔn) 許的快速審批程序肯定了可能預(yù)測(cè)患者受益的替代品的存在。到2003年 末，有16種藥物在這種程序下得到批準(zhǔn)，在這些藥物中，有四種進(jìn)入了 完全審批，即后續(xù)的研究已經(jīng)顯示了直接的患者受益，正如替代指標(biāo)預(yù) 測(cè)的那樣。確定藥物對(duì)實(shí)體肺瘤療效的一個(gè)重要的指標(biāo)是通過(guò)測(cè)定對(duì)治 療的反應(yīng)來(lái)評(píng)價(jià)月中瘤負(fù)荷(Therasse & a/. Journal of the National Cancer Institute 92(3):205-216 2000)。這類評(píng)價(jià)的臨床標(biāo)準(zhǔn)(RECIST criteria (RECIST標(biāo)準(zhǔn)))已經(jīng)由實(shí)體腫瘤反應(yīng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)工作組(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Working Group)^^布，該工作組由國(guó)際癌癥專家組 成。正如依據(jù)RECIST標(biāo)準(zhǔn)的客觀反應(yīng)顯示的，與適當(dāng)?shù)膶?duì)照組相比， 對(duì)腫瘤負(fù)荷有確切作用的藥物易于最終對(duì)患者產(chǎn)生直接的益處。在臨床 前設(shè)置中，腫瘤負(fù)荷通常能更直接地被評(píng)價(jià)和記錄。因?yàn)榕R床前研究可 以轉(zhuǎn)化成臨床設(shè)置，所以在臨床前模型中延長(zhǎng)存活率的藥物有最好的預(yù) 期臨床效用。與臨床治療產(chǎn)生的積極作用相似，在臨床前設(shè)置中減輕腫 瘤負(fù)荷的藥物也對(duì)疾病有明顯的直接影響。盡管延長(zhǎng)生存時(shí)間是癌癥藥 物治療中追求的最主要的臨床結(jié)果，但仍有其他有臨床作用的益處，并 且顯然，降低肺瘤負(fù)荷(其與疾病進(jìn)展的延遲、生存時(shí)間的延長(zhǎng)或兩者都 有關(guān)系)也能導(dǎo)致直接的益處，并具有臨床作用(Eckhardt a/. Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds (發(fā)展的治療學(xué)靶化合物的臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)的成功 與失敗)；ASCO Educational Book, 39th Annual Meeting, 2003, pages 209-219)。
基本上利用US 6,180,357的方法，以及如在美國(guó)專利6,657,048和 S.N.10/348,231和S.N.60/642,057中所公開(kāi)的(其中每個(gè)的內(nèi)容通過(guò)引用并 入本文)，用來(lái)自患者肺(H460-22-1)或者乳腺(7BDI- 58， 7BDI-60, 7BD-33-llA和1A245.6)的腫瘤活檢的細(xì)胞免疫小鼠后獲得小鼠單克隆抗體7BDI-58、 7BDI-60、 H460畫(huà)22-l、 1A245.6和7BD-33隱11A。 H460-22-l、 1A245.6和7BD-33-11A抗原在不同組織來(lái)源的廣泛人細(xì)胞系的細(xì)胞表面 表達(dá)。7BDI-58和7BDI-60抗原在乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞表面表達(dá)。乳腺癌細(xì) 胞系MDA-MB-231 (MB-231 )和黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)2058在體外對(duì)H460-22-l
的細(xì)胞毒作用敏感。乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和前列腺癌細(xì)胞系PC-3在體 外對(duì)1A245.6和7BD-33-11A的細(xì)胞毒作用敏感。乳腺癌細(xì)胞系Hs574.T 在體外對(duì)7BDI-58和7BDI-60的細(xì)胞毒作用敏感。
H460-22-l在體內(nèi)針對(duì)乳&泉癌癥的抗肺瘤活性進(jìn) 一 步擴(kuò)充了 H460-16-2針對(duì)培養(yǎng)物中乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性結(jié)果(如S.N.l 1/321,624 所公開(kāi)的)。在人乳腺癌的預(yù)防性體內(nèi)模型中，在移植腫瘤細(xì)胞前l(fā)天給 予小鼠H460-22-l ，然后每周注射一次，持續(xù)7周。在治療期間，H460-22-l 在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面比同種型對(duì)照抗體明顯更為有效(pO.OOOl)。在治療 期末，給予H460-22-l的小鼠的肺瘤生長(zhǎng)的只有對(duì)照組的17.7%。在治療 后的隨訪期間，H460-22-l的治療效果仍然持續(xù)，治療組的平均腫瘤體積 繼續(xù)明顯小于對(duì)照組，直至測(cè)量期結(jié)束。
使用存活率作為抗體功效的測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照組在移植后第74至81 天之間達(dá)到50%的死亡率。相反，H460-22-l治療組在研究結(jié)束時(shí)還沒(méi)有 達(dá)到50%的死亡率。H460-22-l與同種型對(duì)照治療組之間的這種差異是顯 著的(p0.0015)。這些數(shù)據(jù)表明，與對(duì)照治療組相比，H460-22-l治療帶 來(lái)了存活益處。H460-22-l的治療顯示是安全的，因?yàn)樗鼪](méi)有誘導(dǎo)包括體 重降低和臨床不良應(yīng)激在內(nèi)的任何毒性癥狀。與對(duì)照治療組相比， H460-22-l在已建立的人乳腺癌模型中延緩了腫瘤生長(zhǎng)并提高了存活率， 因此，H460-22-l的治療是有效的。這些結(jié)果還是可重現(xiàn)的，因?yàn)樵诹硪?項(xiàng)該類研究中觀察到類似的結(jié)果，表明了其對(duì)癌癥患者治療的關(guān)聯(lián)和益 處。
除了預(yù)防性的乳腺癌體內(nèi)肺瘤模型外，H460-22-l在建立的體內(nèi)肺瘤 模型中顯示了針對(duì)MB-231細(xì)胞的抗腫瘤活性(如在S.N.l 1/321,624中所
公開(kāi)的)。在這種異種移植腫瘤模型中，MB-231乳腺癌細(xì)胞經(jīng)皮下植入 免疫缺陷小鼠，以使所述腫瘤在抗體治療前達(dá)到臨界尺寸。比較了用 H460-22-l的治療和標(biāo)準(zhǔn)的化療藥物順鉑治療，顯示順鉑和H460-22-l治療組的平均腫瘤體積顯著(pO.001)小于同種型對(duì)照抗體治療組。
H460-22-l治療介導(dǎo)了腫瘤抑制，其約為順柏化療介導(dǎo)的腫瘤抑制的2/3, 但H460-22-l治療沒(méi)有使用順鉑時(shí)觀察到的顯著的體重降低(pO.003)和 臨床不良應(yīng)激(clinical distress)。 H460-22-l的抗肺瘤活性及其極小的毒性 使其成為有吸引力的抗癌治療劑。
在治療后的時(shí)期，與同種型對(duì)照抗體組比較，H460-22-l通過(guò)延緩肺 瘤生長(zhǎng)來(lái)維持對(duì)肺瘤的抑制。在治療后31天，與同種型對(duì)照組比專支， H460-22-l通過(guò)減少42%的紳瘤生長(zhǎng)限制了腫瘤大小，該減少可與治療結(jié) 束時(shí)觀察到48%的減少相比。在建立的乳腺癌肺瘤模型中，這些結(jié)果表 明H460-22-1在超出治療期時(shí)仍維持對(duì)肺瘤的抑制的潛力，并且證實(shí)所 述抗體在哺乳動(dòng)物中減輕腫瘤負(fù)荷和提高存活率的能力。
1 A245.6和7BD-33-l 1A針對(duì)培養(yǎng)物中乳腺和前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒 性的結(jié)果被通過(guò)其在體內(nèi)針對(duì)這些癌癥的抗腫瘤活性進(jìn)一步擴(kuò)展(如在 S.N. 10/348,231、 S.N. 10/891,866、 S.N. 10/603,006和S.N. 10/810,751所 公開(kāi)的)。
7BD-33-l 1A和1A245.6在MB-231人乳腺癌預(yù)防性體內(nèi)模型中防止 腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤負(fù)荷。治療后300天持續(xù)監(jiān)測(cè)。7BD-33-IIA從未產(chǎn)生腫 瘤，并且在移植后的9個(gè)月內(nèi)7BD-33-11A治療組的87.5%依然存活(一 只小鼠死于非腫瘤相關(guān)因素)。相反，同種型對(duì)照組在第72天(治療后23 天)的死亡率為100%。 1A245.6治療的小鼠在治療后151天達(dá)到100%的 死亡率，這比同種型對(duì)照治療組的時(shí)長(zhǎng)超過(guò)6倍。因此1A245.6在乳腺 癌模型中提高存活率并阻止腫瘤生長(zhǎng)(從而延緩疾病進(jìn)展)，同時(shí) 7BD-33-llA在更大程度上提高存活率并阻止腫瘤生長(zhǎng)。
7BD-33-l 1A和1A245.6在建立的人乳腺癌體內(nèi)模型中還顯著地抑制 腫瘤生長(zhǎng)并減輕腫瘤負(fù)荷。到第80天(治療后23天)，7BD-33-11A治療 的小鼠的平均肺瘤體積比同種型對(duì)照組低83%(p=0.001)。在該天， 1A245.6的治療減少了 35%的平均腫瘤體積，但是，所述減少在該實(shí)驗(yàn)中 沒(méi)有達(dá)到顯著性(pi.135)。
使用存活率作為抗體功效的測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)，估計(jì)在治療后大約60天， 7BD-33-11A治療組中的死亡風(fēng)險(xiǎn)為同種型對(duì)照組的約16% (p=0.0006)。同種型對(duì)照組在治療后50天100%死亡。相比之下，1A245.6治療的小鼠 存活至治療后100天，7BD-33-llA治療組的60%在治療后130天仍然存 活。這些凄t據(jù)表明，與對(duì)照治療組相比，1A245.6和7BD-33-11A治療均 帶來(lái)存活益處并減輕肺瘤負(fù)荷。
7BD-33-llA和1A245.6的治療顯示是安全的，因?yàn)槠錄](méi)有誘導(dǎo)包括 體重減輕或者臨床不良應(yīng)激在內(nèi)的任何毒性癥狀。與對(duì)照治療組相比， 7BD-33-l 1A和1A245.6治療在建立的人乳腺癌模型中延緩腫瘤生長(zhǎng)并提 高存活率，因此，7BD-33-llA和1A245.6治療是有效的。
在S.N.10/810,751公開(kāi)的研究(其內(nèi)容在此引入作為參考)中，在兩種 不同的已建立的乳腺癌異種移植模型中確定了 7BD-33-llA的作用，所述 作用被與單獨(dú)的化療藥物(順柏)治療相比或同7BD-33-11A與化療藥物 (順鉑)聯(lián)用相比。
在MB-231模型中，第83天(治療后20天)，與緩沖液對(duì)照治療動(dòng)物 相比，7BD-33-llA治療導(dǎo)致肺瘤生長(zhǎng)降低83。/。(p二0.002)。與對(duì)照比較， 單獨(dú)的順鉑治療導(dǎo)致肺瘤體積減小77%，而順鉑與7BD-33-llA聯(lián)用導(dǎo)致 腫瘤體積減小88% (p=0.006)。
在MDA-MB-468 (MB-468)模型中，第62天(治療后12天)，觀察到 與7BD-33-11A聯(lián)用的順鉑治療導(dǎo)致了最大程度的腫瘤生長(zhǎng)減少(97%, p=0.001)。與緩沖液對(duì)照比4交，單獨(dú)的順鉑治療產(chǎn)生95%的腫瘤生長(zhǎng)減少， 而單獨(dú)的7BD-33-11A治療顯示37%的減少^=0.046)。
在MB-231和MB-468模型中，以體重為量度，與順鉑治療相比， 7BD-33-llA治療導(dǎo)致更好的動(dòng)物健康狀況。這些結(jié)果表明，與單獨(dú)的順 鉑治療相比，7BD-33-llA治療在MB-231模型中具有更好的效果，并且 在兩種乳腺癌模型中比順鉑能更好的被耐受，具有較少的諸如體重減輕 的副作用。
為了確定7BD-33-11A治療在各種劑量下的作用，在預(yù)防性乳腺癌異 種移植模型中進(jìn)行了劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)(如在S.N. 10/810,751中所公開(kāi)的)。在 第55天(治療后5天)，相對(duì)于同種型對(duì)照治療組，0.2mg/kg的治療組使 肺瘤生長(zhǎng)減少了85。/。。還是在第55天，2mg/kg和20mg/kg的治療組均 沒(méi)有發(fā)生腫瘤。在第25天(治療后75天)獲得了類似的結(jié)果，其中20mg/kg治療組依然沒(méi)有發(fā)生腫瘤 > 而2 mg/kg治療組具有一些初期的胂瘤 生長(zhǎng)。7BD-33-llA的治療也顯示出存活益處。同種型對(duì)照組的所有小鼠 到第104天(治療后54天)均死亡，而0.2mg/kg7BD-33-llA治療組存活 至第197天(治療后147天)。在使用2.0和20 mg/kg 7BD-33-11A的治療 組觀察到了更大的存活益處；到第290天(治療后240天)，2.0 mg/kg治 療組只有50%死亡，而20 mg/kg治療組到第290天還沒(méi)有出現(xiàn)死亡。因 此，全部三種劑量的7BD-33-11A治療顯示出顯著的胂瘤生長(zhǎng)抑制和增加 的存活率，且最高劑量表現(xiàn)出最高程度的功效。
除了在建立的乳腺癌體內(nèi)肺瘤^t型中的有益效果，7BD-33-11A和 1A245.6治療在預(yù)防性體內(nèi)前列腺癌模型中也具有針對(duì)PC-3細(xì)胞的抗腫 瘤活性(如在S.N. 10/603,006和S.N. 10/810,751中所公開(kāi)，其各自內(nèi)容 在此引入作為參考)。在治療期后不久，7BD-33-llA和1A245.6治療比同 種型對(duì)照抗體更有效抑制肺瘤生長(zhǎng)(p值分別為0.001和0.017)。在治療期 末，給予7BD-33-llA或者1A245.6的小鼠的肺瘤生長(zhǎng)分別為同種型對(duì)照 組的僅31%和50%。
對(duì)于PC-3 SCID異種移植模型，體重可以用作疾病進(jìn)展的替代指標(biāo)。 第52天，與同種型對(duì)照相比，7BD-33-11A和1A245.6治療分別顯著(p 分別為0.002和0.004)阻止了 54%和25。/。的體重減輕。監(jiān)測(cè)治療后小鼠的 存活。治療后第11天，同種型和緩沖液對(duì)照小鼠達(dá)到100%的死亡率。 相反，7BD-33-llA和1A245.6在治療后38天達(dá)到100%的死亡率，時(shí)間 比對(duì)照組長(zhǎng)3倍多。因而，由于7BD-33-11A和1A245.6的治療與同種型 對(duì)照治療組相比，在已建立的人前列腺癌模型中延緩腫瘤生長(zhǎng)、防止體 重減輕并延長(zhǎng)存活時(shí)間，7BD-33-l 1A和1 A245.6的治療是有效的。
除了預(yù)防性的前列腺癌體內(nèi)肺瘤模型，7BD-33-l 1A在建立的體內(nèi)肺 瘤模型中顯示了針對(duì)PC-3細(xì)胞的抗腫瘤活性(如在S.N. 10/603,006和S.N. 10/810,751中所公開(kāi)的，所述專利的每一個(gè)的內(nèi)容在此引入作為參考)。 7BD-33-11A治療再次與同種型對(duì)照進(jìn)行比較。顯示就在治療后， 7BD-33-11A治療組的平均腫瘤體積顯著(p<0.024)小于同種型對(duì)照治療 組。與同種型對(duì)照組相比，7BD-33-11A的治療介導(dǎo)了 36%的腫瘤抑制。
除了在乳腺癌和前列腺癌的體內(nèi)肺瘤模型中的有益作用，7BD-33-11A治療在預(yù)防性體內(nèi)胰腺癌模型中也具有針對(duì)BxPC-3細(xì)胞的 抗肺瘤活性(如在S.N. 11/321,624中所^>開(kāi)的)。在治療期后不久， 7BD-33-llA治療比緩沖液對(duì)照更有效地抑制肺瘤生長(zhǎng)(71。/。， p=0.0009)。 此外，與緩沖液對(duì)照治療組相比，7BD-33-llA治療帶來(lái)了存活益處。在 7BD-33-llA治療組中，40%的小鼠在緩沖液對(duì)照組小鼠全部死亡后2周 依然存活。
除了在乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌體內(nèi)肺瘤;^莫型中的有益作用， 7BD-33-11A治療在兩個(gè)獨(dú)立的預(yù)防性體內(nèi)黑素瘤模型中也具有針對(duì) A2058和A375細(xì)胞的抗肺瘤活性(如在S.N. 11/321,624中所公開(kāi)的)。在 A2058和A375模型中，7BD-33-l 1A治療比緩沖液對(duì)照更有效地抑制肺 瘤生長(zhǎng)(分別為72%, p=0.011和63%, p=0.0006)。 7BD-33-l 1A在黑素瘤以 及乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌模型中的抗腫瘤活性使其成為有吸引力的 4元癌癥治療劑。
除了在人黑素瘤預(yù)防性體內(nèi)模型中顯示的有益作用，7BD-33-11A治 療在兩個(gè)獨(dú)立的建立的體內(nèi)黑素瘤模型中也具有針對(duì)A2058和A375細(xì) 胞的抗肺瘤活性(如在S.N. 11/321,624中所公開(kāi)的那樣)。在分別針對(duì) A2058和A375模型的7BD-33-11A治療和7BD-33-l 1A加氮烯唑胺治療 組中，腫瘤生長(zhǎng)均被顯著抑制。在A2058模型中，平均腫瘤體積是對(duì)照 組測(cè)量的30.87。/Q(p0.443)。在A375模型中，7BD-33-l 1A/氮烯唑胺聯(lián)合 治療組導(dǎo)致39.1天的中位TTE(time-to-endpoint,到終點(diǎn)的時(shí)間)，相當(dāng)于 腫瘤生長(zhǎng)147。/。的顯著延緩(p0.01)。在任一種模型中均未觀察到毒性死 亡。因此，看來(lái)在乳腺以及目前黑素瘤的建立的人類癌癥體內(nèi)^^莫型中 7BD-33-11A的治療是安全的并顯示出功效。
為了確定7BD-33-11A在體內(nèi)表現(xiàn)的功效是否全部或者部分歸因于 ADCC活性，在NOD SCID和SCID小鼠建立的腫瘤模型中檢測(cè)了 7BD-33-llA針對(duì)MB-231細(xì)胞的抗肺瘤活性。NOD SCID小鼠的天然殺 傷(NK)細(xì)胞具有功能缺陷，并且缺乏循環(huán)補(bǔ)體和功能上未成熟的巨噬細(xì) 胞群，而SCID小鼠同時(shí)具有補(bǔ)體和強(qiáng)有力的NK細(xì)胞活性。7BD-33-11A 是小鼠IgG2a單克隆抗體，因此在體內(nèi)具有ADCC活性。將7BD-33-llA 的抗腫瘤活性與緩沖液對(duì)照和H460-22-l(基于其同種型，不應(yīng)該通過(guò)ADCC顯示其活性的小鼠IgGl單克隆抗體)進(jìn)行比較。第54天(末次治療 后4天)，在SCID治療組中，7BD-33-llA和H460-22-l治療小鼠發(fā)生的 腫瘤的體積分別僅為緩沖液對(duì)照治療小鼠的平均腫瘤體積的1.9 %和 3.6%。相反，在NODSCID治療組中，同樣在第54天(末次治療后4天)， 7BD-33-11A治療小鼠的腫瘤生長(zhǎng)是緩沖液對(duì)照治療小鼠的平均腫瘤體 積的67%。 H460-22-l治療小鼠表現(xiàn)出與SCID小鼠類似的效果；月中瘤生 長(zhǎng)為緩沖液對(duì)照治療小鼠的平均腫瘤體積的1.4%。因此，看起來(lái) 7BD-33-l 1A的體內(nèi)活性部分歸因于ADCC活性，而H460-22-l的抗腫瘤 作用不依賴于ADCC。
為了驗(yàn)證H460-22-l 、 1A245.6和7BD-33-l 1A表位作為藥物耙點(diǎn)的 有效性，測(cè)定了它們的靶抗原在正常人組織中的表達(dá)。如在S.N. 10/603,006和S.N. 10/810,751中部分公開(kāi)的(其中每個(gè)的內(nèi)容通過(guò)引用并 入本文)，確定了 7BD-33-llA、 H460-22-l和1A245.6對(duì)正常人組織的結(jié) 合。通過(guò)IHC染色，大部分組織未能表達(dá)7BD-33-11A抗原，包括例如 腎、心臟和肺的重要的器官。7BD-33-llA使唾液腺、肝、胰腺、胃、前 列腺和十二指腸染色，并使扁桃體強(qiáng)染色。組織染色的結(jié)果表明 7BD-33-11A顯示了對(duì)多種細(xì)胞類型的受限制的結(jié)合，但具有對(duì)侵潤(rùn)性巨 噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的結(jié)合。對(duì)于H460-22-l和1A245.6，更 廣泛的組織呈現(xiàn)陽(yáng)性染色。對(duì)于大多數(shù)情況，染色局限于上皮或者侵潤(rùn) 性巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。但是，在心肌和肝細(xì)胞上均觀察 到陽(yáng)性染色。7BD-33陽(yáng)11A、 H460-22-l和1A245.6均顯示了膜和細(xì)胞質(zhì) 的染色模式。
如在S.N. 10/810,751中所公開(kāi)的(其內(nèi)容在此引入作為參考),將 7BD-33-l 1A與商品化供應(yīng)的抗CD63抗體(RFAC4和H5C6)進(jìn)行了比較。 正常人組織染色的結(jié)果表明，7BD-33-llA再次顯示出對(duì)多種細(xì)胞類型的 受限制的結(jié)合，但具有對(duì)侵潤(rùn)性巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的結(jié) 合。相互比較，RFAC4和H5C6抗體顯示了類似的染色模式。但是，RFAC4 和H5C6的染色模式非常不同于使用7BD-33-llA觀察到的模式。具體來(lái) 說(shuō)，RFAC4和H5C6抗體與更廣泛的正常組織結(jié)合，通常在7BD-33-l 1A 也是陽(yáng)性的組織中具有較高的染色強(qiáng)度，并且不僅結(jié)合于侵潤(rùn)性巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，還結(jié)合于大部分組織的上皮細(xì)胞。
H460-22-l、 1A245.6和7BD-33-11A抗原的定位以及其在諸如乳膽— 癌患者的人群中的普遍性的測(cè)定在評(píng)價(jià)這些抗體的治療用途以及設(shè)計(jì)有 效的臨床實(shí)驗(yàn)中非常重要。為了描述H460-22-l、 1A245.6和7BD-33-llA 抗原在癌癥患者乳腺腫瘤中的表達(dá)，篩檢了來(lái)自98例個(gè)體乳腺癌患者的 腫瘤組織樣本的7BD-33-llA抗原表達(dá)(來(lái)自50例患者的結(jié)果之前已經(jīng)在 S.N.10/603，006和S.N. 10/810,751中進(jìn)行了描述，所述專利每一個(gè)的內(nèi)容 在此引入作為參考)，并且篩檢了來(lái)自50例患者的肺瘤組織樣本的 1A245.6 (如在S.N.10/603,006中所公開(kāi)的，其內(nèi)容在此引入作為參考)和 H460-22-l抗原表達(dá)(如在S.N.l 1/321,624中所7>開(kāi)的，其內(nèi)容在此引入作 為參考)。
這些研究的結(jié)果顯示，37%的組織樣本對(duì)7BD-33-llA抗原的染色呈 陽(yáng)性?；颊邩颖局?BD-33-llA的表達(dá)顯示對(duì)癌細(xì)胞的特異性，因?yàn)槠淙?色局限于惡性細(xì)胞。此外，7BD-33-11A使來(lái)自乳腺癌患者的20個(gè)正常 組織樣本中的0個(gè)染色。另一方面，H460-22-l和1A245.6分別使92%和 98%的乳腺癌組織樣本染色。H460-22-l和1A245.6還使來(lái)自乳腺癌患者 的IO個(gè)正常組織樣本中的9個(gè)染色。但是，這種染色通常比使用乳腺癌 組織樣本觀察到的染色弱得多，并且一般限于侵潤(rùn)性成纖維細(xì)胞。 7BD-33-llA、 H460-22-l和1 A245.6抗原的乳腺肺瘤表達(dá)看起來(lái)定位于 惡性細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，這使CD63成為有吸引力的治療耙標(biāo)。
如在S.N. 10/810,751中所公開(kāi)的(其內(nèi)容在此引入作為參考)，將 7BD-33-l 1A與RFAC4和H5C6以及抗Her2抗體(c-erbB-2)進(jìn)行了比較。 本研究的結(jié)果與先前的結(jié)果類似，顯示36%的肺瘤組織樣品對(duì) 7BD-33-11A抗原的染色呈陽(yáng)性，而94%和85%的乳腺肺瘤組織分別對(duì) H5C6和RFAC4表位的染色呈陽(yáng)性。患者樣本中7BD-33-11A的表達(dá)顯 示出對(duì)癌細(xì)胞的特異性，因?yàn)槠淙旧窒抻趷盒约?xì)胞。此外，7BD-33-11A 使來(lái)自乳腺癌患者的10個(gè)正常組織樣品中的0個(gè)染色，而H5C6和RFAC4 使8個(gè)正常乳腺組織樣品中的7個(gè)染色。與c-erbB-2相比，7BD-33-11A 顯示了完全不同的染色模式，其中半數(shù)的7BD-33-11A抗原表達(dá)呈陽(yáng)性的 乳腺腫瘤組織樣本的Her2表達(dá)呈陰性，表明7BD-33-l 1A靶向不能用現(xiàn) 33有抗體療法治療的患者群。在對(duì)7BD-33-11A和Her2染色都呈陽(yáng)性的乳 腺肺瘤組織切片之間也存在染色強(qiáng)度的差異。c-erbB-2抗體還使一個(gè)正常 乳腺組織切片陽(yáng)性染色。
如在S.N.10/603,006、S.N.10/810,751和S.N.11/321,624中所公開(kāi)的(所 述專利的每一個(gè)的內(nèi)容在此引入作為參考)，基于乳腺肺瘤表達(dá)的雌激素 和黃體酮的受體，進(jìn)一步評(píng)價(jià)了 7BD-33-llA、 H460-22-l和1A245.6的 表達(dá)，所述雌激素和黃體酮的受體在乳腺胂瘤的發(fā)展、治療和預(yù)后中起 重要作用。1A245.6抗原的表達(dá)與雌激素或黃體酮的受體的表達(dá)之間沒(méi)有 明顯的相關(guān)性。在缺乏雌激素受體并存在黃體酮受體與7BD-33-llA抗原 表達(dá)之間以及在同時(shí)存在雌激素和孕激素受體與H460-22-l抗原表達(dá)之 間存在輕度相關(guān)性。當(dāng)基于癌癥進(jìn)展的階段或者程度來(lái)分析肺瘤時(shí)，對(duì) 于7BD-33-llA和H460-22-l而言，結(jié)果均顯示，較高的胂瘤階段具有較 高陽(yáng)性表達(dá)的趨勢(shì)。使用RFAC4獲得了類似的結(jié)果。H5C6也顯示出與 雌激素或者黃體酮受體表達(dá)有非常輕微的相關(guān)性，但與肝瘤階段沒(méi)有明 顯的相關(guān)性，然而，該結(jié)論受小樣本規(guī)模的限制。
7BD-33-11A抗原的定位及其在前列腺癌患者中的流行在評(píng)價(jià) 7BD-33-11A免疫治療對(duì)前列腺癌患者的益處和設(shè)計(jì)有效臨床試驗(yàn)中是 非常重要的。為了描述7BD-33-11A抗原在癌癥患者前列腺腫瘤中的表 達(dá)，篩才企了來(lái)自51例個(gè)體前列腺癌患者的腫瘤組織樣本的7BD-33-11A 抗原表達(dá)(如在S.N. 10/810,751中所公開(kāi)的，其內(nèi)容在此引入作為參考)。 該研究的結(jié)果顯示，88%的組織樣本的7BD-33-llA抗原的染色呈陽(yáng)性。 盡管7BD-33-llA也使正常組織切片高強(qiáng)度染色，但在胂瘤組織樣本中與 正常樣本相比存在更高程度的膜染色。有一個(gè)胚胎性橫紋肌肉瘤組織樣
本沒(méi)有7BD-33-11A抗原的染色。在測(cè)試的小樣本規(guī)模中，肺瘤階段和 7BD-33-llA抗原的存在之間看起來(lái)沒(méi)有直接的相關(guān)性。
7BD-33-11A抗原的定位及其在黑素瘤患者中的流行在評(píng)價(jià) 7BD-33-11A免疫治療對(duì)黑素瘤患者的益處中以及在設(shè)計(jì)有效臨床試驗(yàn) 中是非常重要的。為了描述7BD-33-11A抗原在癌癥患者黑素瘤中的表 達(dá)，篩沖全了來(lái)自39例個(gè)體黑素瘤患者的胂瘤組織樣本的7BD-33-UA抗 原的表達(dá)(如在S.N. 11/321,624中所公開(kāi)的)。該研究的結(jié)果顯示,90%的組織樣本的7BD-33-11A抗原染色呈陽(yáng)性。在該小樣本中，肺瘤階段和
7BD-33-llA抗原的存在之間看起來(lái)也沒(méi)有直接的相關(guān)性。
為了進(jìn)一步擴(kuò)展7BD-33-llA、 H460-22-l和1A245.6的潛在治療益
處，還測(cè)定了所述抗原在多種人類癌組織中出現(xiàn)的次數(shù)以及定位(如在
S.N.10/603，006、 S.N.10/810,751和S.N.11/321,624中所公開(kāi)的，所述專利 的每一個(gè)的內(nèi)容在此引入作為參考)。除了乳腺癌和前列腺癌，還有數(shù)種
癌癥類型表達(dá)7BD-33-11A抗原。呈現(xiàn)陽(yáng)性的人類癌癥類型包括皮膚 (1/2)、肺(3/4)、肝(2/3)、胃(4/5)、曱狀&泉(2/2)、子宮(4/4)和腎(3/3)。 一些 癌癥不表達(dá)所述抗原，這些包括卵巢(0/3)、睪丸(0/1)、腦(0/2)和淋巴結(jié) (0/2)。對(duì)于H460-22-l和1A245.6,如用正常人組織陣列一樣，來(lái)自多種 人組織類型的許多腫瘤呈現(xiàn)陽(yáng)性染色。在皮膚、肺、肝、子宮、腎、胃 和膀胱的惡性細(xì)胞中觀察到較深的染色。與在人乳腺癌、前列腺癌和黑 素瘤組織中的定位一樣，7BD-33-llA、 H460-22-l和1A245.6的定位同 時(shí)存在于這些腫瘤細(xì)胞的膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。因此，除了 H460-22-l、 1A245.6 和7BD-33-llA抗體在體外結(jié)合癌細(xì)胞系夕卜，還有證據(jù)表明所述抗原在人 類和多種類型癌癥中表達(dá)。
如在S.N. 10/810,75 l(其內(nèi)容在此引入作為參考)中對(duì)7BD-33-11A的 描述，以及如在S.N.l 1/321,624中對(duì)lA245.6和H460-22-l的描述，生化 數(shù)據(jù)也表明H460-22-l、 1 A245.6和7BD-33-l 1A識(shí)別的抗原就是CD63。 這也得到了研究支持，所述研究表明針對(duì)CD63有反應(yīng)性的單克隆抗體 RFAC4識(shí)別通過(guò)免測(cè)沉淀結(jié)合至7BD-33-llA、 H460-22-l或1A245.6的 蛋白。此外，細(xì)菌表達(dá)研究表明，H460-22-l、 1A245.6和7BD-33-11A 與CD63的胞外環(huán)2結(jié)合。還通過(guò)構(gòu)象依賴性區(qū)分了 7BD-33-llA、 H460-22-l和1A245.6的表位。這些IHC和生化結(jié)果證明，H460-22-1、 1A245.6和7BD-33-11A結(jié)合CD63抗原。因此，此優(yōu)勢(shì)證據(jù)表明， H460-22-l、 1A245.6和7BD-33-11A通過(guò)CD63上存在的獨(dú)特構(gòu)象表位的 連接來(lái)介導(dǎo)抗癌作用。為了本發(fā)明的目的，所述表位被定義為"CD63抗 原部分"，其特征在于具有與由雜交瘤細(xì)胞系7BD-33-llA、 1A245.6、 H460-22-1編碼的單克隆抗體、其抗原結(jié)合片段或者其抗體偶聯(lián)物相結(jié)合 的能力。總體上，該數(shù)據(jù)表明H460-22-l、 1A245.6和7BD-33-11A抗原是癌 癥相關(guān)抗原，并且在人類中表達(dá)，是病理相關(guān)的癌癥靶標(biāo)。此外，該數(shù) 據(jù)還i正實(shí)了 H460-22-l、 1A245.6和7BD-33-11A抗體與人類癌癥組織的 結(jié)合，并可以適用于可以是診斷、治療預(yù)測(cè)或者預(yù)后的分析。另外，因 為該抗原在多數(shù)非惡性細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)很少發(fā)生，該抗原的細(xì)胞膜定 位指示了細(xì)胞的癌性狀態(tài)，該發(fā)現(xiàn)允許該抗原、其基因或者衍生物、其 蛋白或者其變體用于可以是診斷、治療預(yù)測(cè)或者預(yù)后的分析。
本發(fā)明描述了 H460-22-l、 7BD-33-llA和1A245.6的開(kāi)發(fā)和用途，
通過(guò)美國(guó)專利6,180,357中描述的方法來(lái)開(kāi)發(fā)，并通過(guò)其在細(xì)胞毒性分析、 在動(dòng)物模型中未建立和建立的腫瘤生長(zhǎng)以及在延長(zhǎng)癌性疾病患者存活時(shí)
間中的作用來(lái)進(jìn)行鑒定。此外，本發(fā)明公開(kāi)了 7BD-33-11A兩種人源化形 式的開(kāi)發(fā)，其中一種在預(yù)防性動(dòng)物模型中顯示相似的細(xì)胞毒性。本發(fā)明 還公開(kāi)了小鼠單克隆抗體AR51A994.1、 7BDI-58和7BDI-60的開(kāi)發(fā)和用途。
本發(fā)明代表了癌癥治療領(lǐng)域的進(jìn)展，因?yàn)樗枋隽伺c靶分子CD63 上存在的一個(gè)或者多個(gè)表位特異結(jié)合的試劑，所述試劑還具有針對(duì)惡性 腫瘤細(xì)胞而不是正常細(xì)胞的體外細(xì)胞毒特性，其在人類癌癥的體內(nèi)模型 中還直接介導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)的抑制和存活的延長(zhǎng)。既然任何其他先前描述的 抗CD63抗體沒(méi)有一種顯示具有相似的性質(zhì)，這是相對(duì)于任何其他先前 描述的抗CD63抗體的進(jìn)展。它也提供了本領(lǐng)域內(nèi)的進(jìn)展，因?yàn)槠涫状?清楚證明了 CD63直接參與某些類型腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展相關(guān)的事件。它 也代表了癌癥治療的進(jìn)展，因?yàn)槠淠軌蛟谌祟惢颊咧姓故绢愃频目拱┨?性。另一個(gè)進(jìn)展是將這些抗體包含在抗癌癥抗體文庫(kù)中，通過(guò)確定不同 抗癌抗體的合適組合會(huì)提高靶向表達(dá)不同抗原標(biāo)志物的腫瘤的可能性， 以實(shí)現(xiàn)最有效的靶向和抑制所述腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展。
總而言之，本發(fā)明講述了 7BD-33-llA抗原作為治療劑靶標(biāo)的用途， 給予所述治療劑時(shí)能夠降低哺乳動(dòng)物中表達(dá)該抗原的癌癥的腫瘤負(fù)荷， 還能夠使被治療的哺乳動(dòng)物的存活延長(zhǎng)。因此，本發(fā)明的目的是利用制 備抗來(lái)源于特定個(gè)體的癌細(xì)胞、或者一種或多種特定癌細(xì)胞系的癌性疾 病調(diào)節(jié)抗體(CDMAB)的方法，以分離雜交瘤細(xì)胞系和該雜交瘤細(xì)胞系編碼的相應(yīng)的分離的單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段。所述CDMAB對(duì)癌細(xì) 胞有細(xì)胞毒性作用，而同時(shí)對(duì)非癌細(xì)胞相對(duì)無(wú)毒。
本發(fā)明的另外目的是講述癌性疾病調(diào)節(jié)抗體，其配體和其抗原結(jié)合 分段。
本發(fā)明的另外目的是產(chǎn)生癌性疾病調(diào)節(jié)抗體，其細(xì)胞毒性通過(guò)抗體 依賴的細(xì)胞毒性介導(dǎo)。
本發(fā)明的另外目的是產(chǎn)生癌性疾病調(diào)節(jié)抗體，其細(xì)胞毒性通過(guò)補(bǔ)體 依賴的細(xì)胞毒性介導(dǎo)。
本發(fā)明的另外目的是產(chǎn)生癌性疾病調(diào)節(jié)抗體，其細(xì)胞毒性是它們催 化細(xì)胞化學(xué)鍵水解的能力的功能。
本發(fā)明的另外目的是產(chǎn)生癌性疾病調(diào)節(jié)抗體和配體，其可用于癌癥 診斷、預(yù)測(cè)和監(jiān)測(cè)的結(jié)合分析。
通過(guò)本發(fā)明下述的說(shuō)明、舉例和一些實(shí)施方案的描述，本發(fā)明其他 的目的和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見(jiàn)。
附圖簡(jiǎn)述


圖1比較了雜交瘤上清針對(duì)細(xì)胞系OCC-l、 OVAR-3和CCD-27sk 的細(xì)胞毒性百分比和結(jié)合水平。
圖2是細(xì)胞毒性分析中AR51A994.1與陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的比較。
圖3表示AR51A994.1和抗EGFR對(duì)照與癌癥和正常細(xì)胞系的結(jié)合。 數(shù)據(jù)制成表格，以高于同種型對(duì)照的倍增來(lái)表示平均熒光強(qiáng)度。
圖4包括針對(duì)數(shù)種癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞系的AR51A994.1和抗EGFR 抗體的代表性FACS直方圖。
圖5是細(xì)胞毒性分析中7BDI-58和7BDI-60與陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照 的比專支。
圖6表示7BDI-58、 7BDI-60和抗Her2對(duì)照與癌細(xì)胞和正常細(xì)胞系 的結(jié)合。數(shù)據(jù)制成表格，以高于同種型對(duì)照的倍增來(lái)表示平均熒光強(qiáng)度。
圖7包括針對(duì)數(shù)種癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞系的7BDI-58、 7BDI-60和抗 Her2抗體的^表性FACS直方圖。
圖8顯示7BDI-58在預(yù)防性MDA-MB-231乳腺癌模型中對(duì)肺瘤生長(zhǎng)的影響。垂直虛線表示給予抗體的時(shí)期。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均值+ASEM(均數(shù) 的標(biāo)準(zhǔn)誤)。
圖9顯示7BDI-58在預(yù)防性MDA-MB-231乳l^癌才莫型中對(duì)體重的影 響。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均值+ASEM。
圖10.獲自MDA-MB-231細(xì)胞的全細(xì)胞膜部分的樣本(泳道l)以及 獲自PC-3(泳道2)和CCD-27sk(泳道3)細(xì)胞系的全細(xì)胞裂解產(chǎn)物的樣本的 Western印跡。用如上所述的7BDI-58 、 7BDI-60 、 AR51A994.1 、 7BD-33-l 1A、 1A245.6和H460-22-l作為探針檢測(cè)印跡。
圖11.通過(guò)MDA-MB-231細(xì)胞系的全細(xì)胞膜部分與7BD-33-llA的 免疫沉淀制備的免疫復(fù)合物。印跡的各條泳道分別用7BDI-58(泳道1)、 AR51A994.1(泳道2)、 7BD-33-l 1A(泳道3)以及同種型對(duì)照抗體(泳道4 和5)作為探針來(lái)檢測(cè)。
圖12.通過(guò)ASPC-1人胰腺癌細(xì)胞系的全細(xì)胞膜部分與1A245.6的免 疫沉淀制備的免疫復(fù)合物。印跡的重復(fù)泳道分別用7BDI-60(泳道1)、 1A245.6 (泳道2)、抗CD63克隆H5C6 (泳道3)以及用同種型對(duì)照抗體(泳 道4和5)作為探針來(lái)纟企測(cè)。
圖13.人重組融合構(gòu)建體GST-EC2(CD63)的Western印跡。印跡的 各條泳道分別用7BDI-58(泳道1)、 7BDI-60 (泳道2)、 AR51A994.1 (泳道 3)、 7BD-33-11A (泳道4)、 H460-22-l (泳道5)、 1A245.6 (泳道6)以及用 陰性對(duì)照H460-22-l (抗CD44;泳道7)和同種型對(duì)照抗體(泳道8和9)作 為探針來(lái)檢測(cè)。
圖14是7BD-33-llA在人胰腺肺瘤和正常組織微陣列中結(jié)合的匯總。 圖15.代表性顯^:圖，顯示了在人組織^:陣列中用7BD-33-llA(A) 或同種型對(duì)照抗體(B)在胰腺腫瘤組織上獲得的的結(jié)合模式以及用 7BD-33-11A (C)或同種型對(duì)照抗體(D)在非腫瘤胰腺組織上獲得的結(jié)合模 式。7BD-33-llA對(duì)肺瘤細(xì)胞顯示強(qiáng)陽(yáng)性染色，而對(duì)正常組織顯示弱-中等 染色。放大倍數(shù)是200x。
圖16.由7BD-33-11A引發(fā)的小鼠效應(yīng)細(xì)胞抗人乳腺癌細(xì)胞的體外 細(xì)胞毒活性。在不同濃度7BD-33-llA或同種型對(duì)照存在的條件下，5lCr 標(biāo)記的MDA-MB-231細(xì)胞與非粘附(a)和粘附(b)的小鼠脾效應(yīng)細(xì)胞孵育。圖17.在用7BD-33-llA或者緩沖液對(duì)照實(shí)施多種給藥方案后，來(lái)自 MDA-MB-231異種移植物的巨噬細(xì)胞數(shù)目的匯總。 圖18. 7BD-33-llA抗體N端氨基酸的序列。
圖19. 7BD-33-llA抗體輕鏈可變區(qū)的cDNA序列(SEQ ID NO:l)。核 苷酸序列下面顯示的是推導(dǎo)出的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。信號(hào)肽序列 以斜體表示。CDRs(Kabat命名法)以下劃線表示。成熟的輕鏈起始于天門(mén) 冬酰胺殘基(粗體和雙下劃線)。
圖20. 7BD-33-llA抗體重鏈可變區(qū)的cDNA序列(SEQ ID NO:3)。核 苷酸序列下面顯示的是推導(dǎo)出的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。信號(hào)肽序列 以斜體表示。CDRs(Kabat命名法)以下劃線表示。成熟的重鏈起始于谷氨 酸殘基(粗體和雙下劃線)。
圖21. VL區(qū)域氨基酸序列的比對(duì)(alignment)。7BD-33-llA(Mu33-llA) 和(hu)AR7BD-33-11A (Hu33-11A)的VL區(qū)域以及人受體1LVE和JK2的 氨基酸序列以單字母代碼表示。在7BD-33-llA VL序列中以下劃線表示 CDR序列(Kabat命名法)。圖中略去了人VL片段中的CDR序列。 (hu)AR7BD-33-llA VL序列中單下劃線的氨基酸被預(yù)測(cè)與CDR序列接 觸，因此用相應(yīng)的小鼠殘基取代。從頂部開(kāi)始讀起，公開(kāi)的序列是SEQ ID NO:2的氨基酸殘基21-50; SEQ ID NO:6的氨基酸殘基22-52; SEQ ID NO:62; SEQ ID NO:2的氨基酸殘基51-80; SEQ ID NO:6的氨基酸殘基 53-82; SEQ ID NO:6的氨基酸殘基63-77; SEQ ID NO:2的氨基酸殘基 81-110; SEQIDNO:6的氨基酸殘基83-112; SEQ ID NO:6的氨基酸殘基 85-112; SEQ ID NO:2的氨基酸殘基111-132; SEQ ID NO:6的氨基酸殘 基113-134; SEQIDNO:6的氨基酸殘基113-116和SEQ ID NO:6的氨基 酸殘基125-134。
圖22. VH區(qū)域氨基酸序列的比對(duì)。7BD-33-11A (Mu33-11A)、 (hu)AR7BD-33-l 1A (Hu33-11A)、 (hu)AR7BD-33-l 1A(V1 IL)的VH區(qū)域以 及人類受體AAR32409和JH6的氨基酸序列以單字母代碼表示。在 7BD-33-11A VH序列中以下劃線表示CDR序列(Kabat命名法)。圖中略去 了人 VH 片段中的 CDR 序歹'j 。 (hu)AR7BD-33-llA 和 (hu)AR7BD-33-11 A(Vl 1L) Vh序列中單下劃線的氨基酸被預(yù)測(cè)與CDR序列接觸，因此用相應(yīng)的小鼠殘基取代。雙下劃線的氨基酸已經(jīng)用共有的 人殘基取代以減少潛在的免疫原性。從頂部開(kāi)始讀起公開(kāi)的序列是SEQ
ID NO:4的氨基酸殘基20-49; SEQ ID NO:8的氨基酸殘基20-49; SEQ ID NO: 12的氨基酸殘基20-49; SEQ ID NO:63; SEQ ID NO:4的氨基酸殘 基50-79; SEQ ID NO:8的氨基酸殘基50-79; SEQ ID NO: 12的氨基酸殘 基50-79; SEQ ID NO:64; SEQ ID NO:4的氨基酸殘基80-109; SEQ ID NO:8的氨基酸殘基80-109; SEQ ID NO: 12的氨基酸殘基80-109; SEQ ID NO:65; SEQ ID NO:4的氨基酸殘基110-138; SEQ ID NO:8的氨基酸殘 基110-138; SEQ ID NO: 12的氨基酸殘基110-138; SEQIDNO:66以及 SEQ IDNOS:8和12的氨基酸殘基128-138。
圖23.小外顯子(mini exon)中(hu)AR7BD-33-l 1A的輕鏈可變區(qū)的核 苷酸序列(SEQ ID NO:5)和推導(dǎo)出的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)>信號(hào)肽序 列以斜體表示。CDRs(Kabat命名法)以下劃線表示。成熟的輕鏈起始于天 冬氨酸殘基(粗體和雙下劃線)。該序列側(cè)翼為獨(dú)特的Mlul (ACGCGT)和 Xbal (TCTAGA)位點(diǎn)。
圖24.小外顯子中(hu)AR7BD-33-llA(VllL)的重鏈可變區(qū)的核苦酸 序列(SEQ ID NO:7)和推導(dǎo)出的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。信號(hào)肽序列以 斜體表示。CDRs(Kabat命名法)以下劃線表示。成熟的重鏈起始于谷氨酸 殘基(粗體和雙下劃線)。顯示的序列側(cè)翼為獨(dú)特的Mlul (ACGCGT)和 Xbal (TCTAGA)位點(diǎn)。
圖25.用于7BD-33-11A Vl基因枸建的引物。從頂部讀起，公開(kāi)的 序列是SEQ ID NOS:21-39。
圖26.用于7BD-33-llA Vh基因枸建的引物。從頂部讀起，公開(kāi)的 序列是SEQ ID NOS :40-61 。
圖27. (hu)AR7BD-33-llA Vl或者VH小外顯子的合成圖解。使用一 系列的20(對(duì)于VO或22(對(duì)于VH;如圖所示)個(gè)重疊寡核苷酸。將寡核苷 酸l-20(對(duì)于Vl)或者l-22(對(duì)于Vh)退火并利用Pfu Turbo聚合酶將其延 伸。利用5'和3'側(cè)翼寡核苷酸擴(kuò)增獲得的組裝雙鏈V基因以產(chǎn)生V^和 VH基因片段，將所述片段利用凝膠純化，用Mlul和Xbal消化，并分別 亞克隆入pVk和pVgl.D.Tt或pVg2M3.D.T載體。圖28. FACS竟?fàn)帉?shí)驗(yàn)的匯總。
圖29.通過(guò)定點(diǎn)誘變產(chǎn)生單個(gè)氨基酸取代的VH突變體的圖解。進(jìn)行 兩輪獨(dú)立的PCR。在第一輪PCR中，擴(kuò)增兩個(gè)部分的Vh基因片段。這 兩個(gè)片段在第二輪PCR中進(jìn)一步共同擴(kuò)增，以產(chǎn)生具有單個(gè)氨基酸取代 的全長(zhǎng)Vh基因片^:。利用側(cè)翼的Mlul和Xbal位點(diǎn)，帶有所需突變的 Vh基因被巫克隆入pVgl.D.Tt和pVg2M3.D.T。
圖30.用于(hu)AR7BD-33-llA(VllL)抗體表達(dá)的質(zhì)粒構(gòu)建體。V^和 VH基因被構(gòu)建為側(cè)翼是Mlul和Xbal位點(diǎn)的小外顯子。V區(qū)域被整合入 相應(yīng)的表達(dá)載體。
圖31. (hu)AR7BD-33-llA /c輕鏈cDNA (SEQ ID NO:9)和翻譯的氨 基酸序列(SEQIDNO: 10)。所述氨基酸以單字母代碼表示；點(diǎn)(.)表示翻 譯終止密碼子。成熟輕鏈的第一個(gè)氨基酸以雙下劃線和粗體表示，位于 其信號(hào)肽序列之前。
圖32. (hu)AR7BD-33-l 1A (VI 1L) 7l重鏈cDNA (SEQ ID NO:l l)和翻 譯的氨基酸序列(SEQ IDNO: 12)。所述氨基酸以單字母代碼表示；點(diǎn)(*)
表示翻譯終止密碼子。成熟重鏈的第 一個(gè)氨基酸以雙下劃線和粗體表示， 位于其信號(hào)肽序列之前。
圖33. (hu)AR7BD-33-l 1A (VI 1L)下2M3重鏈cDNA (SEQ ID NO: 13) 和翻譯的氨基酸序列(SEQ ID NO: 14)。所述氨基酸以單字母代碼表示； 點(diǎn)(')表示翻譯終止密碼子。成熟重鏈的第一個(gè)氨基酸以雙下劃線和粗體 表示，位于其信號(hào)肽序列之前。
圖 34.在如本文所述的非還原和還原性條件下，進(jìn)行 7BD-33-llA(Mu33-llA) 、 (hu)AR7BD-33-l 1A-IgGl(Vl 1L)和 (hu) AR7BD-33-l 1 A-IgG2M3 (VI 1L)的SDS-PAGE分析
圖 35.利用體積排阻色鐠法(Size exclusion HPLC)對(duì)(A) (hu)AR7BD-33畫(huà)llA-IgGl(VllL)和(B) (hu)AR7BD-33-l 1A-IgG2M3 (V11L) 進(jìn)行的HPLC分析。
圖36. FACS竟?fàn)帉?shí)驗(yàn)的匯總。
圖 37. FACS 竟?fàn)帲?以比較 7BD-33-11A 、 (hu)AR7BD-33-11A-IgGl(Vl 1L)和(hu)AR7BD-33-l 1A-IgG2M3(Vl 1L)與人CD63的相對(duì)結(jié)合親和力。如本文所述，在不同量的竟?fàn)巹?7BD-33-11A 、 (hu)AR7BD-33畫(huà)llA-IgGl(VllL) 或
(hu)AR7BD-33-l 1 A-IgG2M3(Vl 1L)存在的條件下，對(duì)FITC標(biāo)記的 7BD-33-l 1A與人CD63+ PC-3細(xì)胞的結(jié)合進(jìn)行分析。
圖38顯示在人黑素瘤的小鼠模型中，7BD-33-11A 、 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl和(hu)AR7BD-33-l 1A-IgG2M3的治療對(duì)腫瘤生 長(zhǎng)的影響。腫瘤體積表示為組平均值士SEM。垂直虛線表示給藥的第一天 和最后一天。
圖39顯示研究期間單克隆抗體治療對(duì)體重的影響。體重表示為組平 均值士SEM。
圖40.抗CD63的7BD-33-llA、 H460國(guó)22-l、 1A245.6的結(jié)合親和力 以及人源化抗體(hu)AR7BD-lllA-IgGl和(hu)AR7BD-l 1A-IgG2M3的結(jié)
合親禾口力。通過(guò)表面等離子體共寺展(surface plasmon resonance)來(lái)觀'J定,斤述 抗體與純化的重組GST融合構(gòu)建蛋白GST-EC2(CD63)結(jié)合的解離常數(shù)。
發(fā)明詳述
下面用于概述、描述、實(shí)施例和權(quán)利要求書(shū)中的字詞或短語(yǔ)通常都 有其指定的含義。
術(shù)語(yǔ)"抗體"使用其最廣泛的涵義，且特別包括，例如單克隆抗體(包 括激動(dòng)劑、拮抗劑和中和抗體，脫免疫的、鼠科的、嵌合的或人源化的 抗體)、攜帶有多表位特異性的抗體組合物、單鏈抗體、抗體的免疫偶聯(lián) 物和抗體片,爻(見(jiàn)下文)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"指從一群基本上同質(zhì)的抗體中獲得的 抗體，也就是說(shuō)，包括這群抗體的單個(gè)抗體是相同的，除了可以少量存 在的可能自然發(fā)生的變異。單克隆抗體針對(duì)單一抗原部位是高度特異性 的。而且，與包含針對(duì)不同決定基(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑相 比，每一種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一的決定基。除了特異性之外， 單克隆抗體的優(yōu)勢(shì)還在于其合成可以不受其他抗體的污染。修飾語(yǔ)"單克 隆的"指從基本同質(zhì)的抗體群中獲得的抗體的特征，而不能解釋為需要通 過(guò)任何特定方法來(lái)產(chǎn)生該抗體。例如，本文使用的單克隆抗體可以通過(guò)由Kohler d a/.， Atowm, 256:495 (1975)首次描述的雜交瘤(鼠或人)方法制 備或由重組DNA方法制備(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利第4,816,567號(hào))。"單 克隆抗體"也可以從噬菌體抗體文庫(kù)中分離，使用的技術(shù)在例如Clackson d a/" A^w", 352:624- 628 (1991)和 Marks & a/.， Afo/. 5/o/， 222:581-597 (1991)中描述過(guò)。
"抗體片段"包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包括其抗原結(jié)合區(qū)域或其 可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括非全長(zhǎng)的抗體、Fab、 Fab'、 F(ab')2和Fv 片段；雙體(diabodies);線形抗體；單鏈抗體分子；單鏈抗體，單結(jié)構(gòu)域 抗體分子，融合蛋白，重組蛋白和由抗體片段形成的多特異性抗體。
"完整"抗體指不但包含輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(QJ和重鏈恒定結(jié)構(gòu)域CH1 、 CH2、 CH3,還包含結(jié)合抗原的可變區(qū)的抗體。恒定結(jié)構(gòu)域可以是天然序 列的恒定結(jié)構(gòu)域(例如，人天然序列恒定結(jié)構(gòu)域)或其氨基酸序列的變體。 優(yōu)選地，完整抗體有一個(gè)或多個(gè)效應(yīng)功能。
依據(jù)完整抗體的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，完整抗體可以分為 不同的"種類"。主要有五類完整的抗體IgA、 IgD、 IgE、 IgG和IgM, 其中幾種可進(jìn)一步分成"亞類"(同種型)，例如，IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA和IgA2。與不同種類抗體對(duì)應(yīng)的重l^恒定區(qū)分別^皮稱為o; S， e, 7和M。 不同種類的免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維空間結(jié)構(gòu)是公知的。
抗體"效應(yīng)器功能"指那些由抗體Fc區(qū)引起的(天然序列的Fc區(qū)或氨 基酸序列變體的Fc區(qū))的生物活性。抗體效應(yīng)器功能的實(shí)例包括Clq結(jié) 合；補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用；Fc受體結(jié)合；抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì) 胞毒性作用(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體的下調(diào)(例如B細(xì)胞受體； BCR)等。
"抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用"和"ADCC"指細(xì)胞介導(dǎo)的反 應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcR)的非特異性的細(xì)胞毒細(xì)胞(例如天然殺傷(NK) 細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識(shí)別結(jié)合在靶細(xì)胞上的抗體，隨后導(dǎo)致該 輩巴細(xì)胞的裂解。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，NK細(xì)胞，只表達(dá)F(ryRIII,而 單核細(xì)胞表達(dá)Fc7RI, FcryRII和FqRUL關(guān)于造血細(xì)胞FcR表達(dá)的總結(jié) 見(jiàn)Ravetch and Kinet, j薩.i ev. /畫(huà)畫(huà)/ 9:457-92 (1991)464頁(yè)的表3。為 了測(cè)定目標(biāo)分子的ADCC活性，可以進(jìn)行例如在美國(guó)專利5，500，362或5,821,337中描述的體外ADCC活性分析。用于這類分析的效應(yīng)細(xì)胞包括 外周血單核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞。可選4奪地或附加地，可以 在體內(nèi)評(píng)價(jià)目標(biāo)分子的ADCC活性，例如在諸如Clynes d a/. iW^S (USA) 95:652-656 (1998)中公開(kāi)的動(dòng)物模型中。
"效應(yīng)細(xì)胞"指表達(dá)一種或多種FcRs、執(zhí)行效應(yīng)功能的白細(xì)胞。優(yōu)選 地，這些細(xì)胞至少表達(dá)FcryRIII，并執(zhí)行ADCC效應(yīng)器功能。介導(dǎo)ADCC 的人類白細(xì)胞的實(shí)例包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、 單核細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞；優(yōu)選PBMCs和NK細(xì)胞。效 應(yīng)細(xì)胞可以從其天然來(lái)源中分離，例如從本文中描述的血液或PBMC中 分離。
術(shù)語(yǔ)"Fc受體"或"FcR"用于描述結(jié)合于抗體Fe區(qū)的受體。優(yōu)選的 FcR是天然序列的人類FcR。而且，優(yōu)選的FcR是結(jié)合于IgG抗體(7受 體)的受體，并包括FcryRI、 Fc^RII和Fcry RIII亞類的受體，其包括這些 受體的等位基因變體和可選擇的剪接形式。Fc7RJI受體包括FcyRIIA ("激 活性受體")和F(ryRIIB ("抑制性受體")，兩者的氨基酸序列相似，主要不 同在于其胞漿結(jié)構(gòu)域。激活性受體Fc7RIIA在其胞漿結(jié)構(gòu)域含有基于免 疫受體酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制性受體Fc7RIIB在其胞漿結(jié)構(gòu)域 含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(參見(jiàn)在DaSron， J"聽(tīng).Wev. /mm朋o/. 15:203-234 (1997)中的綜述M)。在Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991); Capel & a/" /mw畫(huà)匿Ac^ 4:25-34 (1994) 和de Haas " a/.， J.丄W. C/z".臉A 126:330-41 (1995)中對(duì)FcR進(jìn)行了綜 述。本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)"FcR"包括將來(lái)要被鑒定的FcR在內(nèi)的其他FcR。 該術(shù)語(yǔ)也包括負(fù)責(zé)將母體的IgGs轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒體內(nèi)的新生受體， FcRn(Guyer a/" /. /mmimo/. 1 17:587 (1976)禾口 Kim & a/"五Mr J. /畫(huà)畫(huà)/. 24:2429 (1994))。
"補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性作用"或"CDC"指分子在補(bǔ)體存在下，裂解把細(xì) 胞的能力。補(bǔ)體激活途徑通過(guò)補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)與交聯(lián)了同類抗 原的分子(比如，抗體)的結(jié)合而起始。為了評(píng)價(jià)補(bǔ)體激活，可以進(jìn)行如 Gazzano-Santoro W a/., / /mmwwo/. A^AoA 202:163 (1996)中4苗述的CDC 分析。術(shù)語(yǔ)"可變的"指可變結(jié)構(gòu)域某些部分的序列在抗體間高度不同，并 用于每一種特定抗體與其特定抗原的結(jié)合及其特異性。然而，變化并不 是均勻分布在抗體的可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)。在輕鏈和重鏈的可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)，變 化集中在所謂的高度可變區(qū)的三個(gè)片段內(nèi)?？勺兘Y(jié)構(gòu)域內(nèi)更加高度保守 的部分被稱為骨架區(qū)(FRS)。每個(gè)天然的重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，包含主 要釆用^-片層構(gòu)型的四個(gè)FRS，其由三個(gè)高度可變區(qū)連接在一起，形成
環(huán)狀連接，在一些情況下形成部分>片層結(jié)構(gòu)。每條鏈的高度可變區(qū)由FR 以密切靠近的方式結(jié)合一起，并與其他鏈的高度可變區(qū)一起，有助于抗 體的抗原結(jié)合部位的形成(參見(jiàn)Kabat a a/， 5^we"ces 尸ratoVw //wn柳o/o&ra/ /"tems^^疾夢(mèng)^M尹蛋冷的^/力，5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991 ))。恒定結(jié)構(gòu)i或并 不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，而是呈現(xiàn)各種效應(yīng)功能，例如參與抗體 在抗體依賴性的細(xì)胞毒效應(yīng)(ADCC)中的作用。
本文使用的術(shù)語(yǔ)"高度可變區(qū)"指抗體上負(fù)責(zé)與抗原結(jié)合的氨基酸殘 基。高度可變區(qū)通常包括"互補(bǔ)決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(例如輕鏈 可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基24-34 (Ll)、 50-56 (L2)和89-97 (L3)及重鏈可 變結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基31-35(H1)、 50-65(H2)和95-102(H3); Kabat d a/, Se，e"cas1 o/ /VotoVw o/ /mm調(diào)0/0g7-ca/ /"&ms,f^瘦夢(mèng)《標(biāo)蛋力的/^/力, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))和/或"高變環(huán)"區(qū)的那些殘基(例如輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的殘基2632 (Ll)、 50-52 (L2)和91 -96 (L3)及重鏈可變結(jié)構(gòu)域的26-32 (Hl)、 53-55 (H2) 和96-101 (H3); Chothia and Lesk, 7kfo/所o/. 196:901-917(1987))。"骨架 區(qū)"或"FR"殘基指除了本文定義的高變區(qū)殘基之外的那些可變區(qū)的殘基。 木瓜蛋白酶水解抗體產(chǎn)生了兩個(gè)相同的被稱為"Fab"片段的抗原結(jié)合片 段和一個(gè)殘余的"Fc"片段，每個(gè)"Fab"片段都有單一的抗原結(jié)合部位，"Fc" 片段的名稱反映了其易結(jié)晶的能力?？贵w經(jīng)胃蛋白酶處理后，產(chǎn)生F(ab')2 片段，其有兩個(gè)抗原結(jié)合部位，且仍能夠與抗原交聯(lián)。
"Fv"是包含完整的抗原識(shí)別和抗原結(jié)合部位的最小抗體片段。此區(qū) 域由以非共價(jià)鍵的方式緊密結(jié)合的一條重鏈和一條輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的二
聚體構(gòu)成。以這種每個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的三個(gè)高變區(qū)相互作用的構(gòu)型決定VH-VL 二聚體表面的抗原結(jié)合部位。六個(gè)高變區(qū)域共同賦予了抗體的抗原 結(jié)合特異性。然而，即便單一的可變結(jié)構(gòu)域(或只含有三個(gè)抗原特異性高 變區(qū)的一半的Fv)仍能夠識(shí)別和結(jié)合抗原，雖然比完整結(jié)合位點(diǎn)的親和性
低。Fab片段也含有輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)。 Fab' 片段與Fab片段的不同在于重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端多了幾個(gè)氨基酸 殘基，包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab'-SH在本文中指 代Fab'，其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基至少攜帶一個(gè)游離的硫基。最 初的F(ab')2抗體片段以Fab'片段對(duì)產(chǎn)生，之間有鉸鏈的半胱氨酸。其他 的抗體片段的化學(xué)偶聯(lián)也是公知的。
來(lái)自任意脊推動(dòng)物的抗體的"輕鏈"都可以歸于兩種截然不同的所謂 /c和入鏈中的一種，/c和入鏈的分類基于其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
"單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包含抗體的Vh和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些 結(jié)構(gòu)域存在于單一的多肽鏈上。優(yōu)選地，F(xiàn)v多肽進(jìn)一步包含Vh和Vl 結(jié)構(gòu)域之間的多肽連接子，使scFv形成適于抗原結(jié)合的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv 的纟宗述參見(jiàn)Pliickthun in 尸力awz"co/ow o/Mo"oc/o"a/ J""Z76>d/&s"(^^^ 發(fā)我i/^秀理釣，vol. 113， Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag， New York, pp. 269-315 (1994)。
術(shù)語(yǔ)"雙體(Diabodies)"指帶有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小型抗體片段，其
在相同多肽鏈上(VH-VO含有與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VO結(jié)合的重鏈可變結(jié)構(gòu) 域(Vh)。通過(guò)使用因過(guò)短而不能使同一條鏈上的兩個(gè)區(qū)域配對(duì)的連接子， 使這些結(jié)構(gòu)域被迫與另一條鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，由此產(chǎn)生了兩個(gè)抗 原結(jié)合位點(diǎn)。例如在EP 404,097; WO 93/11161 ;和Hollinger & a/.， Jcad. 90:6444-6448 (1993)中對(duì)雙體作了更詳細(xì)的描述。
"分離"抗體是指從其天然環(huán)境的組分中鑒別、分離和/或回收的抗體。 其天然環(huán)境下的污染成分是指干擾抗體診斷或治療性用途的物質(zhì)，可能 包括酶、激素和其它的蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)溶質(zhì)。因?yàn)榭贵w的天然環(huán)境中 的至少 一種組分將不存在，所以分離抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)部的原位抗體。 但是，通常分離的抗體會(huì)經(jīng)過(guò)至少一步的純化步驟來(lái)制備。
"結(jié)合"目的抗原(例如，CD63抗原)的抗體是指能夠?qū)υ摽乖谐浞?親和力的抗體，以致該抗體在耙向表達(dá)該抗原的細(xì)胞時(shí)，可以用作治療或診斷試劑。如果抗體是結(jié)合CD63部分的抗體，那么它通常會(huì)優(yōu)先結(jié)
合CD63抗原部分，而不是其它受體，這不包括諸如非特異性的Fc接觸 的偶然的結(jié)合或與其他抗原共有的翻譯后修飾成分結(jié)合，該抗體不會(huì)與 其他蛋白有明顯的相互作用。檢測(cè)與目的抗原結(jié)合的抗體的方法在本領(lǐng) 域中是公知的，可以包括但并不局限于諸如FACS、細(xì)胞ELISA和Western 印跡等分析。
如本文使用的，"細(xì)胞"、"細(xì)胞系"、"細(xì)胞培養(yǎng)物"的表述可以交替使 用，所有這些用法都包括其子代。也可以理解為由于人為的或非人為的 突變，所有的子代在DNA組成上不可能完全相同。在原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)篩 選的有相同功能或生物學(xué)活性的突變子代包括在內(nèi)。從有意使用不同指 代的上下文中，指代是清楚的
"治療"既指治療性處理，也指預(yù)防性或防止的措施，其目的就是預(yù) 防或減緩(減輕)靶向的病理狀態(tài)或病癥。需要治療的個(gè)體包括那些已經(jīng)存 在所述病癥的個(gè)體，還包括那些將發(fā)展為該病癥的或名夂對(duì)其病癥進(jìn)行預(yù) 防的個(gè)體。因此，本文中欲被治療的哺乳動(dòng)物可已經(jīng)^皮診斷為患有該病 癥或可傾向于或易感于該病癥。
術(shù)語(yǔ)"癌癥"和"癌性"是指或描述哺乳動(dòng)物的生理狀態(tài)，其典型特征是 細(xì)胞生長(zhǎng)或死亡不受調(diào)控。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、胚細(xì) 胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴惡性腫瘤。這些腫瘤更多具體的實(shí)例包括鱗 狀細(xì)胞癌(例如鱗狀上皮細(xì)胞癌)，包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺的 ^i癌和肺的鱗狀癌的肺癌，腹膜癌，肝細(xì)胞癌，包括胃腸道癌的胃癌， 胰腺癌，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，宮頸癌，卯巢癌，肝臟癌癥，膀胱癌，肝細(xì)胞 瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜或子宮癌，唾液
腺腫瘤，腎癌，前列腺癌，外陰腫瘤，甲狀腺癌，肝癌，肛癌，陰莖癌， 還有頭頸部癌。
"化療劑"是用于癌癥治療的化合物。化療劑的實(shí)例包括諸如噻替 派和環(huán)磷酰胺(CYTOXANTM)的烷化劑；例如白消安(busulfan)、英丙舒凡 (improsulfan)、哌泊舒凡(piposulfan)的烷基磺酸酯類；如笨佐替派 (benzodopa)、 卡波醌、美妥一齊口底(meturedopa)和烏瑞"^派(uredopa)的氮丙 啶類；包括六甲蜜胺、曲他胺(triethylenemelamine)、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代磷酰胺和三曱基奧羅蜜胺(trimethylolomelamine)在內(nèi)的乙 烯亞胺類(ethylenimines)和曱基蜜胺類(methylamelamine);如瘤可寧 (chlorambucil)、萘氮芥、環(huán)磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺、 氮芥(mechlorethamine)、 鹽酉史曱氧氮芥、美法侖、新氮芥(novembichin)、 苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼莫司汀、曲磷胺、烏拉莫司汀(uracil mustard) 等氮芥類藥物；如卡氯芥、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、 雷莫司汀等硝脲類(nitrosureas);如阿克拉霉素類、放線菌素、安曲霉素、 重氮絲氨酸、博來(lái)霉素、放線菌素C、加里剎霉素、洋紅霉素、碳霉素 (camomycin)、嗜癌霉素、色霉素、放線菌素D、柔紅霉素、地托咪定、 6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星、依達(dá)比星、 麻西羅霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、灰霉素、 potfiromycin、噤呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑霉素、鏈佐星、 殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星類的抗生素；曱氨碟呤和 5-氟尿嘧啶(5-FU)類抗代謝類藥；如二甲葉酸、氨曱喋呤、蝶羅呤、三曱 曲沙等葉酸擬似物；如氟達(dá)拉濱、6-巰嘌呤、硫米噤呤、石克鳥(niǎo)。票呤類噪呤 類似物；如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮雜尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫 氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU等嘧啶類似物；如卡魯 睪酮、屈他雄酮丙酸酯、表硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯酮等男性激素類藥 物；如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦等抗腎上腺類藥物；如亞葉酸等葉 酸補(bǔ)充物；醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶； bestrabucil;比生群；依達(dá)曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鳥(niǎo) 氨酸；依利醋銨；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達(dá)明； 米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；尼曲吖啶；噴司他??；蛋氨氮芥；吡 柔比星；足葉草酸；2-乙肼；丙卡巴肼；PSK ;雷佐生；西佐喃；鍺螺 胺；細(xì)交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2',2"-三氯三乙胺；烏拉坦；長(zhǎng)春地 辛；達(dá)卡巴。秦；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷； gacytosine;阿拉伯糖苷("Ara-C");環(huán)磷酰胺；塞替派；如紫杉醇(泰素， Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N丄)禾口多西他賽(泰素帝， Aventis, Rhone-Poulenc Rorer， Antony, France)等紫杉》克類；苯丁酉吏氮界； 吉西他濱；6-碌u鳥(niǎo)噪呤；巰。票呤；曱氨蝶呤；如順鉑和卡鉑等鉑類似物；長(zhǎng)春^f成；鉑；依托泊苷(VP-16);異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C;米托蒽醌； 長(zhǎng)春新石咸；長(zhǎng)春瑞濱；去曱長(zhǎng)春i咸；諾消靈(novantrone);替尼泊苷；柔 紅霉素；氨蝶呤鈉；希羅達(dá)；伊班膦酸鈉；CPT-11;拓樸異構(gòu)酶抑制劑RFS 2000; 二氟甲基鳥(niǎo)氨酸(DMFO);視黃酸；埃斯波霉素；卡培他濱；以及 上述任一種藥物在藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì) 腫瘤作用的抗激素類藥物也包括在本定義內(nèi)，像抗雌激素藥物，例如， 包括它莫西芬、雷洛昔芬、芳香化酶抑制劑4(5)-咪唑、4-輕基他莫昔芬、 曲沃昔芬、雷諾昔芬、LY117018、奧那司酮和托瑞米芬(法樂(lè)通)；抗雄激 素物質(zhì)，例如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以 及上述任一種藥物在藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。
用于治療目的的"哺乳動(dòng)物"指任何一種可歸于哺乳類的動(dòng)物，包括 人類、小鼠、免疫缺陷鼠或棵鼠或品系小鼠、家畜和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物及動(dòng)物園 內(nèi)的動(dòng)物、體育動(dòng)物或?qū)櫸?，比如綿羊、狗、馬、貓、母牛等。優(yōu)選地， 本文的哺乳動(dòng)物指人類。
"寡核苷酸"指短長(zhǎng)度、單鏈或雙鏈多聚脫氧核苦酸，其可利用已知 的方法化學(xué)合成(例如磷酸三酯、亞磷酸鹽、亞磷酰胺化學(xué)，利用例如發(fā) 表于1988年5月4日的EP 266,032描述的固相技術(shù)；或利用Froehler d a/， M/c/. Jc/A Wm.， 14:5399-5407, 1986描述的脫氧核苷H-磷酸鹽中間物)， 然后用聚丙烯酰胺凝膠純化。
除非另外指出，術(shù)語(yǔ)"CD63抗原部分"用于本文時(shí)是指四次跨膜蛋 白家族的III型膜蛋白，其還稱為黑色素瘤1抗原、眼黑色素瘤相關(guān)抗原、 黑色素瘤相關(guān)抗原ME491、溶酶體相關(guān)膜糖蛋白3、 granulophysin、黑色 素相關(guān)抗原MLA1。
"嵌合"抗體指免疫球蛋白，其部分重鏈和/或輕鏈與來(lái)源于特定種屬 或?qū)儆谔囟贵w種類或亞類的抗體的對(duì)應(yīng)序列相同或同源，同時(shí)鏈上余 下序列與來(lái)源于另一種屬或?qū)儆诹硪环N類或亞類的抗體的對(duì)應(yīng)序列相同 或同源，此外還指這些抗體的片段，只要這些片段能夠表現(xiàn)出所需的生 物活性(美國(guó)專利4,816,567和Morrison W a/，尸rac.淑/. 《"■園,
81 :6851 -6855 (1984))。
非人類(例如鼠科)抗體的"人源化"形式指特殊的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片^爻(例如Fv， Fab, Fab', F(ab)2或抗體的其他抗原結(jié)合序 列)，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。在絕大多數(shù)情況下，人源 化抗體是人的免疫球蛋白(受者抗體)，其中，所述受者抗體的互補(bǔ)決定區(qū) (CDR)的殘基被諸如具有所需的特異性、親和力、能力的小鼠、大鼠或兔 等的非人類抗體(供者抗體)的CDRs的殘基所替代。在一些情況下，人類 免疫球蛋白的Fv骨架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人類FR殘基所替代。此 外，人源化抗體可以包括既不在受者抗體也不在引入的CDR或FR序列 的殘基。這些修飾進(jìn)一步改善和優(yōu)化了抗體的性能。通常，人源化抗體 包括至少一個(gè)，通常是兩個(gè)可變區(qū)的基本上全部，其中全部或基本上全 部的CDR區(qū)對(duì)應(yīng)非人類免疫球蛋白的CDR區(qū)，且全部或基本上全部的 FR殘基是人類免疫球蛋白共有序列的FR殘基。人源化抗體也最適宜包 含至少一部分的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc),通常是人類免疫球蛋白的恒定 區(qū)。
疫球蛋白。通過(guò)改造抗體的結(jié)構(gòu)可以實(shí)現(xiàn)去免疫化。任何本領(lǐng)域技術(shù)人 員公知的去免疫化技術(shù)都可以使用。例如，在發(fā)表于2000年6月15曰 的WO 00/34317中，描述了一項(xiàng)-使抗體去免疫原性的適當(dāng)?shù)腲支術(shù)。
"同源性"被定義為比對(duì)序列和必要時(shí)引入空位(gaps),以實(shí)現(xiàn)最大同 源性百分比后，氨基酸序列變體中相同殘基的百分比。用于比對(duì)的方法 和計(jì)算機(jī)程序是本領(lǐng)域公知的。
在本說(shuō)明書(shū)自始至終中，雜交瘤細(xì)胞系以及從其產(chǎn)生的分離的單克 隆抗體可^皮選^奪用其內(nèi)部名稱7BDI-58、 7BDI-60、 7BD-33-11A、 1A245.6、 H460-22-l或AR51A994.1，或者用保藏號(hào)IDAC 141205-01、 ATCC PTA-4623 、 ATCC PTA-4890 、 ATCC PTA-4889 、 ATCC PTA-4622或ID AC 141205-06來(lái)表示。
本文使用的"配體"包含對(duì)靶抗原顯示結(jié)合特異性的部分，其可以是 完整的抗體分子和至少具有抗原結(jié)合區(qū)或者其部分(即，抗體分子的可變 部分)的任意分子，例如，F(xiàn)v分子、Fab分子、Fab'分子、F(ab')2分子、 雙特異抗體、融合蛋白或者任意基因工程分子，所述分子特異識(shí)別并結(jié) 合與分離的單克隆抗體結(jié)合的抗原，所述單克隆抗體由命名為IDAC141205-01， ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA陽(yáng)4889， ATCC PTA-4622或者IDAC 141205-06 ( IDAC 141205-01, ATCC PTA畫(huà)4623， ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622或者IDAC 141205-06抗原)的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。
本文使用的"抗原結(jié)合區(qū)"表示識(shí)別靶抗原的分子的部分。 本文使用的"竟?fàn)幮砸种?指使用常規(guī)的抗體相互(reciprocal)竟?fàn)幏?析(Belanger L.， Sylvestre C. and Dufour D. (1973), Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures(竟?fàn)幒蛫A心法的曱胎蛋白的酶聯(lián)免疫測(cè)定).Clinica Chimica Acta48, 15)能夠識(shí)別并結(jié)合決定簇位點(diǎn)，其中由命名為IDAC 141205-01, ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA陽(yáng)4889， ATCC PTA-4622或 IDAC 141205-06的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體(IDAC 141205- 01, ATCC PTA-4623， ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622或 IDAC 141205-06抗體)耙向所述決定簇位點(diǎn)。
本文使用的"耙抗原"是IDAC 141205-01， ATCC PTA- 4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622或IDAC 141205-06抗原或 其部分。
如本文所用，"免疫偶聯(lián)物"指以化學(xué)或生物學(xué)方式與細(xì)胞毒素、放 射性試劑、酶、毒素、抗腫瘤藥或治療劑結(jié)合的諸如抗體的任何分子或 配體。該抗體可以在所述分子的任何位置與細(xì)胞毒素、放射性試劑、抗 腫瘤藥或治療劑連接，只要它能夠與其靶標(biāo)結(jié)合。免疫偶聯(lián)物的實(shí)例包 括抗體毒素化學(xué)偶聯(lián)物和抗體-毒素融合蛋白。
如本文所用，"融合蛋白"指任何嵌合蛋白，其中，抗原結(jié)合區(qū)與例 如毒素、酶或蛋白藥物的生物活性分子連接。
為了更充分理解本文中描述的發(fā)明，進(jìn)行下述說(shuō)明。
本發(fā)明提供配體(即，IDAC 141205-01， ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622或IDAC 141205-06配體)， 其特異識(shí)別并結(jié)合IDAC 141205-01 ， ATCC PTA-4623， ATCC PTA-4890， ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622或IDAC 141205-06抗原。
本發(fā)明的配體可以采用任何形式，只要它具有抗原結(jié)合區(qū)，所述抗原結(jié)合區(qū)竟?fàn)幮砸种朴呻s交瘤IDAC 141205-01, ATCC PTA- 4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622或IDAC 141205-06產(chǎn)生的 單克隆抗體與其靶抗原的免疫特異結(jié)合。因此，與IDAC 141205-01 , ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622或 IDAC 141205-06抗體具有相同結(jié)合特異性的任何重組蛋白(例如，融合蛋 白，其中所述抗體與諸如淋巴因子或者腫瘤抑制生長(zhǎng)因子的另 一蛋白結(jié) 合)也屬于本發(fā)明的范圍。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，所述配體是IDAC 141205-01， ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622或IDAC 141205-06抗體。
在其他實(shí)施方案中，所述配體是抗原結(jié)合片段，其可以是具有IDAC 141205- 01, ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622或者IDAC 141205-06抗體的抗原-結(jié)合區(qū)的Fv分子(例如單鏈 Fv分子)，F(xiàn)ab分子，F(xiàn)ab'分子，F(xiàn)(ab')2分子，融合蛋白，雙特異抗體，異種抗 體或者任何重組分子。本發(fā)明的配體針對(duì)IDAC 141205-01, ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890， ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622或IDAC 141205-06單克隆抗體針對(duì)的表位。
本發(fā)明的配體可以被修飾，即，通過(guò)分子內(nèi)的氨基酸+務(wù)飾，從而產(chǎn) 生衍生物分子。也可以是化學(xué)修飾。
衍生物分子將保留所述多肽的功能特性，即，具有這類取代的分子 ^!夸仍然允許所述多肽與IDAC 141205-01, ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622或IDAC 141205-06抗原或者其 部分結(jié)合。
這些氨基酸取代包括在本領(lǐng)域中公知的"保守"氨基酸取代，但并不 局限于此。
例如，某些被稱為"保守氨基酸取代"的氨基酸取代能夠在蛋白中經(jīng) 常出現(xiàn)，但并不改變?cè)摰鞍椎臉?gòu)象或功能，這是蛋白質(zhì)化學(xué)中已建立的法則。
這些改變包括異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)和亮氨酸(L)的任何一種取代任 何其他的疏水氨基酸；天門(mén)冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，反之亦然；谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，反之亦然；以及絲氨酸(S)取代蘇氨酸(T),反之 亦然。其他的取代也可被認(rèn)為是保守的，這取決于特定氨基酸的環(huán)境和 其在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)可經(jīng)?；Q， 丙氨酸和纈氨酸(V)也是。相對(duì)疏水的曱硫氨酸(M)可經(jīng)常與亮氨酸和異 亮氨酸互換，有時(shí)與纈氨酸互換。賴氨酸(K)和精氨酸(R)經(jīng)?；Q，其發(fā) 生部位氨基酸殘基的明顯特征是其電荷，這兩種氨基酸殘基的不同pK的 差別并不明顯。在特定情境下，仍有其他的一些變化可以被認(rèn)為是"保守 的"。
給定一種抗體，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以制備識(shí)別相同表位的竟?fàn)?性抑制配體，例如竟?fàn)幮钥贵w(Belanger d a/., 1973)。 一種方法是用表達(dá) 該抗體識(shí)別抗原的免疫原產(chǎn)生免疫。該樣品可以包括組織、分離的蛋白 或細(xì)胞系，但并不局限于這些?？梢杂弥T如ELISA、 FACS或免疫沉淀的 竟?fàn)幮苑治龊Y選產(chǎn)生的雜交瘤，該分析能鑒定抑制所檢測(cè)抗體結(jié)合的抗 體。另一種方法可以利用噬菌體展示文庫(kù)，淘選識(shí)別所述抗原的抗體 (Rubinstein da/.， 2003)。在任何一種情況下，雜交瘤的選擇都是基于它們 竟?fàn)庍^(guò)原抗體與其靶抗原的結(jié)合的能力。因此，這些雜交瘤的特征是識(shí) 別與所述原抗體相同的抗原，并且這些雜交瘤將更為特異地識(shí)別同樣的 表位。
實(shí)施例1
雜交瘤制備-雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)R51A994.1和7BDI-58
依據(jù)布達(dá)佩斯條約，雜交瘤細(xì)胞系7BDI-58和AR51A994.1于2005 年12月14日保藏于加拿大國(guó)際微生物保藏單位(IDAC)，位于加拿大馬 尼托巴省溫尼伯市阿林頓街道1015的加拿大衛(wèi)生部微生物局，R3E3R2, 保藏號(hào)分別為141205-01和141205-06。依據(jù)37 CFR 1.808的規(guī)定，保藏 者保證在專利授權(quán)時(shí)將不可撤銷地取消對(duì)公眾獲取該保藏材料的所有限 制。
如在S.N. 10/713,642中所公開(kāi)的那樣，制備產(chǎn)生抗癌抗體7BDI-58 的雜交瘤。為了制備產(chǎn)生AR51A994.1抗癌抗體的雜交瘤，在PBS中制 備冷凍的人卵巢子Cambridge, MA)的單細(xì)胞懸浮液。將IMMUNEASY (Qiagen, Venlo, Netherlands)佐劑輕輕混合后備用。通過(guò)皮下注射含2百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的50微 升抗原-佐劑來(lái)免疫4到6周齡的BALB/c小鼠。初次免疫后2和5周， 用新鮮制備的含2百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的50至60微升抗原-佐劑腹腔注射加強(qiáng)免 疫小鼠。末次免疫后第3天，取出脾臟用于融合。將分離的脾細(xì)胞與NSO-l 骨髓瘤細(xì)胞伴侶融合，制備雜交瘤。檢測(cè)雜交瘤亞克隆融合的上清。
為了檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體是IgG,還是IgM同種型，進(jìn)行 ELISA分析。將4。C包被緩沖液(O.l M碳酸鹽/石友酸氫鹽緩沖液，pH 9.2-9.6) 中的濃度為2.4微克/mL的山羊抗小鼠的IgG + IgM (H+L)，按100微升 /孔加入ELISA板過(guò)夜。該ELISA板用洗滌緩沖液(PBS + 0.05%吐溫)洗 三次。按100微升/孔加入封閉緩沖液(5%奶洗滌緩沖液)，室溫l小時(shí)， 隨后用洗滌緩沖液洗三次。按100微升/孔加入雜交瘤上清，將該板室溫 孵育1小時(shí)。該板用洗滌緩沖液洗三次，按100微升/孔加入山羊抗小鼠 的IgG或IgM辣才艮過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物的1/100,000稀釋液(用含5%奶的 PBS稀釋)。室溫孵育1小時(shí)后，該板用洗滌緩沖液洗三次。按100微升 /孔加入TMB溶液，室溫孵育1-3分鐘。按50微升/孔加入2MH2SO4， 終止顏色反應(yīng)，用Perkin-Elmer HTS7000酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處讀板。 如圖1所示，AR51A994.1雜交瘤主要分泌IgG同種型抗體。
為了確定雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的亞類，使用小鼠單克隆抗體同種型 分型試劑盒(HyCuIt Biotechnology, Frontstraat, Netherlands)進(jìn)4亍同種型分 型(isotyping)實(shí)驗(yàn)。將500微升緩沖溶液加入到包含大鼠抗小鼠亞類特異 抗體的檢測(cè)條(test strip)上。向試管中添加500微升雜交瘤上清，并通過(guò) 溫和攪拌浸沒(méi)。利用偶聯(lián)到膠體微粒的大鼠單克隆二抗來(lái)直接檢測(cè)捕獲 的小鼠免疫球蛋白。這兩種蛋白的組合產(chǎn)生了用于分析同種型的可視信 號(hào)?？拱┛贵wAR51A994.1為IgGl, k同種型。
經(jīng)過(guò)一輪有限稀釋，在細(xì)胞ELISA分析中，檢測(cè)雜交瘤上清中與靶 細(xì)胞結(jié)合的抗體。檢測(cè)了 2種人卵巢癌細(xì)胞系，和1種人正常皮膚細(xì)胞 系分別是OCC-l、 OVCAR-3和CCD-27sk。鋪板的細(xì)胞在使用前先固 定。室溫下，該板用包含MgCl2和CaCl2的PBS洗滌三次。每孔加入100 微升稀釋于PBS中的2%多聚曱醛，室溫10分鐘，然后倒掉。室溫下，該板用包含MgCh和CaCl2的PBS再洗滌三次。每孔加100微升溶于洗 滌緩沖液(PBS + 0.05%吐溫)的5%奶進(jìn)行封閉，室溫1小時(shí)。該板用洗 滌緩沖液洗三次，纟姿75^:升/孔加入雜交瘤上清，室溫孵育1小時(shí)。用洗 滌緩沖液將該板洗三次，按100微升/孔加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊 抗小鼠的IgG抗體的1/25,000稀釋液(用含5%奶的PBS稀釋)。室溫孵育 1小時(shí)后，該板用洗滌緩沖液洗三次，每孔加入100微升TMB底物， 室溫孵育1-3分鐘。每孔加入50微升2 M H2S04終止反應(yīng)，并用 Perkin-Elmer HTS7000酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處讀板。如圖1列表所示， 結(jié)果表示為與內(nèi)部(in-house)的IgG同種型對(duì)照相比，高出背景的倍數(shù)， 事先已經(jīng)證明該對(duì)照不與所檢測(cè)的細(xì)胞系結(jié)合。來(lái)源于雜交瘤 AR51A994.1的抗體顯示出與卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3和正常皮膚細(xì)胞系 CCD-27sk的結(jié)合。
進(jìn)行抗體結(jié)合試馬全的同時(shí)，在OCC-l、 OVCAR-3和CCD-27sk這 些細(xì)胞系上4全測(cè)了雜交瘤上清的細(xì)胞毒性作用。Calcein AM購(gòu)自 Molecular Probes (Eugene, OR)。根據(jù)廠商的說(shuō)明及下述的改動(dòng)進(jìn)行分析。 所述分析前將細(xì)胞以預(yù)定的合適密度進(jìn)行鋪板。2天后，將來(lái)自雜交瘤微 量滴定板的75微升上清轉(zhuǎn)移到細(xì)胞板，在5% C02培養(yǎng)箱中孵育5天。 將陽(yáng)性對(duì)照孔吸凈，加入100微升疊氮鈉(NaN3)或者放線菌酮。經(jīng)過(guò)5 天處理后，倒空反應(yīng)^反的液體并吸干。通過(guò)多通道^4f瓦將室溫下包含 MgCl2和CaCl2的DPBS分入每個(gè)孔中，叩打3次，倒空液體并吸干。將 用包含MgCl2和CaCl2的DPBS稀釋的50微升熒光鈣黃綠素染料添加到 每個(gè)孔中，在5% C02培養(yǎng)箱中37。C孵育30分鐘。在Perkin-Elmer HTS7000熒光讀板儀中讀板，數(shù)據(jù)用Microsoft Excel進(jìn)行分析。結(jié)果列 表于圖1。來(lái)自AR51A994.1雜交瘤的上清分別對(duì)OCC-l和OVCAR-3 細(xì)胞產(chǎn)生了 14%和10%的特異細(xì)胞毒性。對(duì)于OCC-l的細(xì)胞毒性分別是 從陽(yáng)性對(duì)照疊氮鈉和放線菌酮得到的細(xì)胞毒性的16%和15%。對(duì)于 OVCAR-3的細(xì)胞毒性是從陽(yáng)性對(duì)照放線菌酮得到的細(xì)胞毒性的22%。圖 1的結(jié)果表明AR51A994.1的細(xì)胞毒性作用不與其對(duì)癌細(xì)胞類型的結(jié)合水 平成正比。盡管OVCAR-3細(xì)胞中的結(jié)合水平更高，但是與OVCAR-3細(xì) 胞相比，OCC-l細(xì)胞中產(chǎn)生的細(xì)胞毒性水平更高。如圖1所示，AR51A994.1在CCD-27sk正常細(xì)胞系中不產(chǎn)生細(xì)胞毒性。已知的非特異 性的細(xì)胞毒性試劑放線菌酮和NaN3普遍產(chǎn)生了預(yù)期的細(xì)胞毒性作用。
實(shí)施例2
抗體制備
通過(guò)在CL-1000瓶(BD Biosciences, Oakville， ON)中培養(yǎng)雜交瘤來(lái)制 備AR51A994丄7BDI-58和7BDI-60單克隆抗體，每周進(jìn)行兩次收集和 再接種。根據(jù)利用蛋白G瓊脂糖凝膠4快流(Protein G Sepharose 4 Fast Flow) (Amersham Biosciences, Baie d'Urft, QC)的標(biāo)準(zhǔn)抗體純化步驟來(lái)純 化抗體。利用去免疫的、人源化的、嵌合的或者鼠科的單克隆抗體也在 本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在細(xì)胞毒性分析中，將AR51A994.1抗體與許多陽(yáng)性對(duì)照(抗-EGFR 抗體(C225, IgGl, k, 5微克/mL, Cedarlane, Hornby, ON),放線菌酮(100微 摩爾，Sigma, Oakville, ON> NaN3 (0.1%, Sigma， Oakville, ON))和陰性對(duì)照 (107.3 (抗TNP, IgGl, k, 20微克/mL， BD Biosciences, Oakville, ON),以及 IB7.1 (抗TNP), IgGl, /c, 20微克/mL,內(nèi)部純化))，以及緩沖稀釋液對(duì)照進(jìn) 行了比較(圖2)。檢測(cè)了胰腺癌(BxPC-3)、卵巢癌(OCC-l和OVCAR-3) 和非癌(CCD-27sk, Hs888丄u)細(xì)胞系(均來(lái)自ATCC, Manassas, VA)。 4丐黃 綠素AM購(gòu)自Molecular Probes (Eugene, OR)。根據(jù)廠商的說(shuō)明及下面列 出的改動(dòng)進(jìn)行分析。所述分析前將細(xì)胞以預(yù)定的合適密度進(jìn)行鋪板。2天 后，將100微升純化的抗體或者對(duì)照稀釋于培養(yǎng)基中，然后轉(zhuǎn)移到所述 細(xì)胞板，在5。/。C02培養(yǎng)箱中孵育5天。然后將板倒空并吸干。通過(guò)多通 道擠瓶將室溫下包含MgCl2和CaCl2的DPBS分入每個(gè)孔中，叩打3次， 倒空液體，然后吸干。將用包含MgCl2和CaCl2的DPBS稀釋的50微升 熒光鈣黃綠素染料添加到每個(gè)孔中，在5% C02培養(yǎng)箱中37。C孵育30分 鐘。在Perkin-ElmerHTS7000熒光讀板儀內(nèi)讀板，數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 進(jìn)行分析，結(jié)果列表于圖2。每種抗體得到5至50的分?jǐn)?shù)，其基于以一 式三份檢測(cè)的4次實(shí)驗(yàn)觀察到的平均細(xì)胞毒性，以及得到25至100的分 數(shù)，其基于分析間所觀察到的變異。這兩種分?jǐn)?shù)(細(xì)胞毒性分?jǐn)?shù))的總和顯 示于圖2。大于或者等于55的細(xì)胞毒性分?jǐn)?shù)被認(rèn)為對(duì)所測(cè)細(xì)胞系是陽(yáng)性的。相對(duì)于同種型和緩沖液陰性對(duì)照，AR51A994.1抗體在OVCAR-3卵 巢癌細(xì)胞系和BxPC-3胰腺癌細(xì)胞系中產(chǎn)生了特異的細(xì)胞毒性。這與來(lái)自 AR51A994.1克隆的雜交瘤上清的數(shù)據(jù)一致，所述上清也顯示出針對(duì) OVCAR-3細(xì)胞系的特異細(xì)胞毒性(參見(jiàn)實(shí)施例1)。在OCC-l卵巢癌細(xì)胞 系中AR51A994.1沒(méi)有產(chǎn)生陽(yáng)性的細(xì)胞毒性分?jǐn)?shù)。重要的是，與陰性對(duì)照 相比，AR51A994.1對(duì)諸如CCD-27sk或者Hs888丄u的非癌細(xì)胞系沒(méi)有產(chǎn) 生顯著的細(xì)胞毒性，表明該抗體對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性是特異的?；瘜W(xué)細(xì) 胞毒性試劑誘導(dǎo)了針對(duì)多種細(xì)胞系的預(yù)期的細(xì)胞毒性。
通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測(cè)AR51A994.1與胰腺癌(BxPC-3)、卯巢 癌(OCC-l和OVCAR-3)和非癌(CCD-27sk，Hs888丄u)細(xì)胞系的結(jié)合。首先 用DPBS(不含Ca"和^^++)洗滌細(xì)胞單層來(lái)制備用于FACS的細(xì)胞。然后 在3TC使用細(xì)胞離解緩沖液(INVITROGEN, Burlington, ON)將細(xì)胞從它 們的細(xì)胞培養(yǎng)板上分離出來(lái)。經(jīng)離心和收集后，將細(xì)胞重懸于4°C的包含 MgCl2、 CaCl2和2%胎牛血清的DPBS(染色培養(yǎng)基)并計(jì)數(shù)，等分到合適 的細(xì)胞密度，離心以沉淀所述細(xì)胞，并在20 Aig/mL測(cè)試抗體(AR51A994.1) 或者對(duì)照抗體(同種型對(duì)照，抗EGFR)存在的條件下將其重懸于4。C的染 色培養(yǎng)基中，冰上置30分鐘。在添加AlexaFluor546偶聯(lián)的二抗前，用 染色培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次。然后在4。C添加溶于染色培養(yǎng)基的Alexa Fluor 546偶聯(lián)的抗體，孵育30分鐘。然后最后一次洗滌細(xì)胞，將其重懸于固 定培養(yǎng)基(包含1.5%多聚曱醛的染色培養(yǎng)基)。使用FACSarray System Software (BD Biosciences, Oakville, ON)在FACSarray 上運(yùn)行樣本來(lái)評(píng) 價(jià)細(xì)胞的流式細(xì)胞采集。通過(guò)調(diào)整前向角散射(FSC)和側(cè)向角散射(SSC) 探測(cè)器上的電壓和振幅，設(shè)置細(xì)胞的FSC和SSC。通過(guò)運(yùn)行未染色的細(xì) 胞來(lái)調(diào)節(jié)熒光(Alexa-546)通道的檢測(cè)器，以便細(xì)胞具有中位熒光強(qiáng)度約 為1至5單位的一致的峰。對(duì)于每種樣本，獲得大約10,000個(gè)門(mén)事件(染 色的固定細(xì)胞)用于分析，結(jié)果顯示于圖3。
圖3以高于同種型對(duì)照的倍增來(lái)表示平均熒光強(qiáng)度。圖4匯集了 AR51A994.1抗體的代表性直方圖。AR51A994.1顯示了與卵巢癌細(xì)胞系 OCC-l和OVCAR-3(分另U為16和14.8倍)以及非癌月申細(xì)胞系 Hs888丄u(24.6倍)的強(qiáng)結(jié)合，與胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3(8.6倍)和非癌皮膚細(xì)胞系CCD-27sk(5.1倍)的較弱結(jié)合。這些數(shù)據(jù)表明AR51A994.1顯示出 功能特異性，因?yàn)楸M管AR51A994.1與多種被測(cè)細(xì)胞系存在明顯的結(jié)合， 但其在體外只存在與OVCAR-3卵巢癌和BxPC-3胰腺癌相關(guān)的細(xì)胞毒性。
為了進(jìn)一步證實(shí)上述的體外結(jié)合和細(xì)胞毒性結(jié)果，在細(xì)胞毒性分析 中，利用肺癌(A549)、其他的胰腺癌(AsPC-l和PL45)和卯巢癌(C-13, ES-2, Hey， OV2008, OVCA-429和OVCAR-3)細(xì)胞系(A549， AsPC-l, PL45和 OVCAR-3來(lái)自ATCC, Manassas， VA; C-13, ES-2， Hey, OV2008和 OVCA-429購(gòu)自 Ottawa Regional Cancer Center (Ottawa, Ontario))只十 AR51A994.1抗體以及上述陽(yáng)性和陰性對(duì)照進(jìn)行了檢測(cè)。如上所述進(jìn)行 Live/Dead細(xì)胞毒性分析。相對(duì)于同種型和緩沖液陰性對(duì)照，AR51A994.1 抗體在ES-2、 OV2008和OVCA-429卵巢癌細(xì)胞系和A549肺癌細(xì)胞系中 產(chǎn)生了特異的細(xì)月包毒性(圖2)。AR51A994.1抗體也在OVCAR-3卯巢癌細(xì) 胞系中產(chǎn)生特異的細(xì)胞毒性。這與上述OVCAR-3細(xì)胞毒性的數(shù)據(jù)一致。 AR51A994.1在C-B和Hey卵巢癌細(xì)胞系或AsPC-1和PL45胰腺細(xì)胞系 中沒(méi)有產(chǎn)生陽(yáng)性的細(xì)胞毒性分?jǐn)?shù)?；瘜W(xué)細(xì)胞毒性試劑誘導(dǎo)針對(duì)多種細(xì)胞 系的預(yù)期的細(xì)胞毒性。
通過(guò)上述流式細(xì)胞術(shù)(FACS)評(píng)估了 AR51A994.1與肺癌(A549)、其 他的胰腺癌(AsPC-l和PL45)和卵巢癌(C-13、 ES-2、 Hey、 OV2008、 OVCA-429和OVCAR-3)細(xì)胞系的結(jié)合。圖3以高于同種型對(duì)照的倍增來(lái) 表示平均焚光強(qiáng)度。圖4匯集了 AR51A994.1抗體的代表性直方圖。 AR51A994.1顯示了與卵巢癌細(xì)胞系ES-2和OV2008 (分別為22.2和19.8 倍)更強(qiáng)的結(jié)合，而與卵巢癌細(xì)胞系C-13、Hey、OVCA-429和OVCAR-3(分 別為9.8、 4.4、 3.9和4.3倍)、胰腺細(xì)胞系A(chǔ)sPC-1和PL45(分別為4.1和 2.4倍)和肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549(4.6倍)的結(jié)合較弱。這些數(shù)據(jù)表明AR51A994.1 顯示出功能特異性，因?yàn)楸M管AR51A994.1與所有的被測(cè)細(xì)胞系存在明顯 的結(jié)合，但其只存在與 一些癌細(xì)胞系相關(guān)的細(xì)胞毒性。
在細(xì)胞毒性分析中，將7BDI-58和7BDI-60抗體與許多陽(yáng)性對(duì)照(抗 Her2(IgGl,k, 10微克/mL, Inter Medico, Mai'kham, ON)，放線菌酮(100微 摩爾，Sigma, Oakv"e, ON))和陰性對(duì)照(107.3 (抗TNP, IgGl, k, 20微克/mL, BD Biosciences, Oakville， ON))以及緩沖稀釋液對(duì)照進(jìn)行比較(圖 5》檢測(cè)了卵巢癌(OVCAR-3)和乳腺癌(MDA-MB-468 (MB-468))以及非癌 (Bst549, CCD陽(yáng)27sk, Hs888丄u)細(xì)胞系(均來(lái)自ATCC, Manassas, VA)。 Live/Dead細(xì)胞毒性分析購(gòu)自Molecular Probes (Eugene, OR)。根據(jù)廠商的 說(shuō)明及下面列出的改動(dòng)進(jìn)行分析。所述分析前將細(xì)胞以預(yù)定的合適密度 鋪板。2天后，將100微升純化的抗體或者對(duì)照稀釋于培養(yǎng)基中，然后轉(zhuǎn) 移到所述細(xì)胞板，在5。/。C02培養(yǎng)箱中孵育5天。然后將板倒空并吸干。 通過(guò)多通道擠瓶將室溫下包含MgCl2和CaCl2的DPBS分入每個(gè)孔中，叩 打3次，倒空液體，然后吸干。將用包含MgCl2和CaCl2的DPBS稀釋的 50微升熒光鈣黃綠素染料添加到每孔中，在5% C02培養(yǎng)箱中37。C孵育 30分鐘。在Perkin-ElmerHTS7000熒光讀板儀內(nèi)讀板，數(shù)據(jù)用Microsoft Excel進(jìn)行分析，結(jié)果列表于圖5。每種抗體得到5至50的分?jǐn)?shù)，其基于 以一式三份檢測(cè)的4次實(shí)驗(yàn)觀察到的平均細(xì)胞毒性，以及得到25至100 的分?jǐn)?shù)，其基于分析間所觀察到的變異。這兩種分?jǐn)?shù)(細(xì)胞毒性分?jǐn)?shù))的總 和顯示于圖5。大于或者等于55的細(xì)胞毒性分?jǐn)?shù)被認(rèn)為對(duì)所測(cè)細(xì)胞系是 陽(yáng)性的。相對(duì)于同種型和緩沖液陰性對(duì)照，7BDI-58抗體在OVCAR-3卵 巢癌細(xì)胞系中產(chǎn)生特異的細(xì)胞毒性。7BDI-58在MB-468乳腺癌細(xì)胞系中 沒(méi)有產(chǎn)生陽(yáng)性的細(xì)胞毒性分?jǐn)?shù)。重要的是，與陰性對(duì)照相比，7BDI-58 對(duì)例如Bst549、 CCD-27sk或Hs888丄u的非癌細(xì)胞系沒(méi)有產(chǎn)生顯著的細(xì) 胞毒性，表明該抗體對(duì)癌細(xì)胞具有特異的細(xì)胞毒性。相對(duì)于同種型和緩 沖液陰性對(duì)照，7BDI-60抗體在MB-468乳腺癌細(xì)胞系中產(chǎn)生了特異的細(xì) 胞毒性。7BDI-60在OVCAR-3卵巢癌細(xì)胞系中沒(méi)有產(chǎn)生陽(yáng)性的細(xì)胞毒性 分?jǐn)?shù)。重要的是，與陰性對(duì)照相比，7BDI-60對(duì)例如Bst549、 CCD-27sk 或者Hs888丄u的非癌細(xì)胞系沒(méi)有產(chǎn)生顯著的細(xì)胞毒性，表明該抗體對(duì)癌 細(xì)胞具有特異的細(xì)胞毒性?；瘜W(xué)細(xì)胞毒性試劑誘導(dǎo)針對(duì)多種細(xì)胞系的預(yù) 期的細(xì)胞毒性。
通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測(cè)了 7BDI-58和7BDI-60與乳腺癌 (MB-468)、卵巢癌(OVCAR-3)和非癌(Bst549、 CCD-27sk、 Hs888丄u)細(xì) 胞系的結(jié)合。首先用DPBS(不含Ca+'和Mg++)洗滌細(xì)胞單層來(lái)制備用于 FACS的細(xì)胞。然后在37°C使用細(xì)胞離解緩沖液(INVITROGEN,Burlington, ON)將細(xì)胞從它們的細(xì)胞培養(yǎng)板上分離出來(lái)。經(jīng)離心和收集 后，將細(xì)胞重懸于4。C的包含MgCl2、 CaCl2和25%胎牛血清的Dulbecco's 磷酸鹽緩沖液中(洗滌培養(yǎng)基)并計(jì)數(shù)，等分到合適的細(xì)胞密度，離心以沉 淀所述細(xì)胞，將所述細(xì)胞重懸于包含20 /xg/mL測(cè)試抗體(7BDI-58或 7BDI-60)或?qū)φ湛贵w(同種型對(duì)照或者抗EGFR)的染色培養(yǎng)基(包含MgCl2 和CaCl2的DPBS )中，冰上置30分鐘。在添加Alexa Fluor 488偶聯(lián)的二 抗前，用洗滌培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次。然后添加溶于染色培養(yǎng)基的Alexa Fluor488偶聯(lián)抗體20分鐘。然后最后一次洗滌細(xì)胞，重懸于包含l微克 /mL碘化吡啶的染色培養(yǎng)基。使用CellQuest軟件(BD Biosciences)在 FACScan上運(yùn)行樣本來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的流式細(xì)胞采集。通過(guò)調(diào)整前向角散射 (FSC)和側(cè)向角散射(SSC)探測(cè)器上的電壓和振幅，設(shè)置細(xì)胞的FSC和 SSC。通過(guò)運(yùn)行使用純化的同種型對(duì)照抗體染色，繼之用AlexaFluor488 偶聯(lián)的二抗染色的細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)3種焚光通道的^企測(cè)器(FL1、 FL2和FL3), 以便細(xì)胞具有一致的峰，且中位熒光強(qiáng)度約為1-5單位。通過(guò)FSC設(shè)門(mén) 和碘化吡啶拒染法獲得活細(xì)胞。對(duì)于每種樣本，獲得大約10,000個(gè)活細(xì) 胞用于分析，結(jié)果顯示于圖6。
圖6顯示高于每種抗體的同種型對(duì)照的平均焚光強(qiáng)度倍增。7BDI-58 和7BDI-60抗體的代表性直方圖匯集于圖7。 7BDI-58對(duì)卵巢癌細(xì)胞系 OVCAR-3(13.8倍)、非癌肺細(xì)胞系Hs888丄u(18.3倍)、非癌乳腺細(xì)胞系 Bst549(10.8倍)和非癌皮膚細(xì)胞系CCD-27sk(22.5)顯示出較強(qiáng)的結(jié)合，而 與乳腺癌細(xì)胞系MB-468(3.8倍)的結(jié)合較弱。這些凄t據(jù)表明7BDI-58顯示 出功能特異性，因?yàn)楸M管7BDI-58與多種^^f僉測(cè)的細(xì)胞系存在明顯的結(jié) 合，但其只存在與OVCAR-3卵巢癌相關(guān)的細(xì)胞毒性。7BDI-60顯示了與 卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3 (5.7倍)、乳腺癌細(xì)胞系MB-468 (5.1倍)、非癌 肺細(xì)胞系Hs888丄u (9.1倍)、非癌乳腺細(xì)胞系Bst549 (3.7倍)和非癌皮膚 細(xì)胞系CCD-27sk (8.1倍)的結(jié)合。這些數(shù)據(jù)表明7BDI-60顯示出功能特 異性，因?yàn)楸M管7BDI-60與多種被^^測(cè)的細(xì)胞系存在明顯的結(jié)合，但其 只存在與MB-468乳腺癌相關(guān)的細(xì)胞毒性。
實(shí)施例3MDA-MB-231細(xì)胞的體內(nèi)肺瘤實(shí)驗(yàn)
參考圖8和9，將頸背部皮下注射的100微升生理鹽水中的5百萬(wàn) 個(gè)人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)植入到4至6周的雌性SCID小鼠。將所 述小鼠隨機(jī)分成2個(gè)治療組，每組5只。在植入后一天，每組小鼠經(jīng)腹 腔給予稀釋后體積為30(M鼓升的20 mg/kg 7BDI-58測(cè)試抗體或者緩沖液 對(duì)照，所述稀釋使用含有2.7mMKCl、 lmMKH2P04、 137mMNaCl和 20 mM Na2HP04的稀釋劑/人原液濃度稀釋。然后在整個(gè)研究期間以同樣 方式每周注射一次所述抗體和對(duì)照樣本，共8次劑量。利用測(cè)徑器大約 每7天測(cè)量一次腫瘤生長(zhǎng)。在整個(gè)研究期間每周記錄一次動(dòng)物的體重。 研究結(jié)束時(shí)，依據(jù)CCAC的指導(dǎo)方針，所有的動(dòng)物都采取安樂(lè)死。在人 乳腺癌的MDA-MB-231體內(nèi)預(yù)防模型中，7BDI-58顯著降低肺瘤生長(zhǎng)。 移植后第55天，也是最后一次治療給藥后5天，7BDI-58治療組的平均 腫瘤體積比緩沖液對(duì)照治療組的腫瘤體積小91.2%(圖8)。研究結(jié)束時(shí) 7BDI-58治療組的腫瘤體積與對(duì)照的腫瘤體積有顯著差異(p咱.0105， t-檢驗(yàn))。
在整個(gè)研究期間沒(méi)有臨床毒性癥狀。每周測(cè)量一次的體重是動(dòng)物健 康和發(fā)育停止的指標(biāo)。如圖9所示，在整個(gè)研究期間對(duì)照或7BDI-58治 療組的體重沒(méi)有顯著差異。治療周期結(jié)束時(shí)兩組間的體重也沒(méi)有顯著差異。
總之，7BDI-58在該人乳腺癌異種移植模型中被良好地并且降低了腫
瘤的負(fù)荷。
實(shí)施例4
單克隆抗體7BDI-58、 7BDI-60、 AR55A994.1和抗CD63抗體之間交叉反 應(yīng)的測(cè)定
當(dāng)利用7BDI-58、 7BDI-60和AR51A994.1作為探針時(shí)，全細(xì)胞膜部 分和全細(xì)胞裂解產(chǎn)物的Western印跡結(jié)果顯示與利用ARIUS'抗CD63單 克隆抗體7BD-33-llA、 1A245.6和H460-22-l獲得結(jié)果的高相似性(圖 10)。為了確定前面的抗體是否與CD63交叉反應(yīng)，在免疫沉淀復(fù)合物的 Western印跡中使用它們作為探針，所述免疫沉淀復(fù)合物利用7BD-33-l 1A或者1A245.6從培養(yǎng)生長(zhǎng)的細(xì)胞的全細(xì)胞膜部分獲得。
簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，300微克的MDA-MB-231全細(xì)胞膜部分(l mg/mL終蛋白 濃度)與偶聯(lián)7BD-33-llA的蛋白G瓊脂糖珠在4。C孵育2小時(shí)。洗滌后 將所述珠在1 x非還原性十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE )樣本緩沖液中煮沸，通過(guò)10%聚丙歸酰胺凝膠電泳分析樣 本。在電轉(zhuǎn)到PVDF膜上后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Western印跡步驟，所述印跡用 抗體7BDI-58、 AR51A994.1 、 7BD-33-11A以及IgGl和IgG2a同種型對(duì) 照作為探針檢測(cè)。所有一抗在5微克/mL的工作濃度下使用。所獲印跡 的圖像(圖ll)顯示，,7BDI-58和AR51A994.1與7BD-33-llA抗體識(shí)別 的相同抗原交叉反應(yīng)，因此它們特異與CD63結(jié)合。
為了確定抗體7BDI-60是否與CD63交叉反應(yīng)，從ASPC-1細(xì)胞系分 離的全細(xì)胞膜部分制備人CD63和抗體1A245.5的免疫復(fù)合物。通過(guò)在非 還原性條件下的10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析免疫復(fù)合物以及將蛋 白電轉(zhuǎn)到PVDF膜后，利用抗體7BDI-60、 1A245.6、抗CD63克隆H5C6 和IgGl同種型對(duì)照檢測(cè)所述印跡。所有一抗在5微克/mL的工作濃度下 使用。圖12顯示除了同種型對(duì)照外，所有抗體與相同的抗原CD63交叉 反應(yīng)。
為了進(jìn)一步證實(shí)7BDI-58、7BDI-60和AR51A994.1之間針對(duì)人CD63 的交叉反應(yīng)，在大腸桿菌表達(dá)的人CD63最大胞外環(huán)重組GST融合構(gòu)建 體的Western印跡中使用所述抗體作為探針。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，通過(guò)10%制備 性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析5微克純化的重組GST融合蛋白。轉(zhuǎn)移 后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Western印跡步驟，用7BDI-58、 7BDI-60和AR51A994.1 以及用抗CD63抗體7BD-33-l 1A、 1 A245.6和H460-22-l 、抗CD44抗體 (克隆H460-16-2)和用IgGl和IgG2a同種型對(duì)照抗體作為探針進(jìn)行檢測(cè)。 所有一抗在5微克/mL的工作濃度下使用。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(圖13)顯示，除 了同種型對(duì)照外，所有抗體與人CD63最大胞外環(huán)的重組GST融合構(gòu)建 體特異性交叉反應(yīng)，因此表明7BDI-58、 7BDI-60和AR51A994.1與人 CD63特異結(jié)合。
實(shí)施例5人胰腺肺瘤組織染色
進(jìn)行IHC研究以進(jìn)一步(在S.N.10/603,006中初次^^開(kāi)了胰腺癌的染 色)評(píng)價(jià)7BD-33-11A與人胰腺腫瘤組織的結(jié)合。此前進(jìn)行IHC優(yōu)化研究 以便確定進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的條件。
組織切片在58。C烘箱中干燥1小時(shí)脫蠟，通過(guò)將組織切片5次浸泡 于染色缸中的二甲苯進(jìn)行脫蠟，每次4分鐘。經(jīng)過(guò)一系列梯度乙醇洗滌 (100%-75%)處理后，切片在水中重新水合。將載玻片浸泡于pH值為6 的10 mM檸檬酸鹽緩沖液(Dako, Toronto, Ontario)中，隨后分別用高、中、 低能量設(shè)置的微波爐加熱載玻片5分鐘，最后將其浸沒(méi)在冷的PBS中。 隨后將載玻片浸沒(méi)在3%的過(guò)氧化氫溶液中6分鐘，用PBS清洗3次，每 次5分鐘，干燥，并在室溫用通用封閉液(Dako, Toronto, Ontario)孵育5 分鐘。用抗體稀釋緩沖液(Dako, Toronto, Ontario)將7BD-33-l 1A、單克 隆小鼠抗肌動(dòng)蛋白(Dako, Toronto, ON)或同種型對(duì)照抗體(靶向黑曲霉 (As/ e^/〃M A7ge。葡萄糖氧化酶，該酶在哺乳動(dòng)物組織中不存在或也不可 誘導(dǎo)；Dako， Toronto, Ontario)稀釋至工作濃度(除了抗肌動(dòng)蛋白抗體被 稀釋到2微克/mL外，每種抗體都是5微克/mL)，并在室溫孵育1小時(shí)。 用PBS清洗所述載玻片3次，每次5分鐘。用提供的HRP偶聯(lián)的二抗(Dako Envision System, Toronto, Ontario)來(lái)4全測(cè)/顯現(xiàn)一抗的免疫活性，室溫孵育 30分鐘。在該步驟之后，用PBS清洗所述載玻片3次，每次5分鐘，隨 后加入DAB(3, 3'-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽，Dako, Toronto, Ontario)生 色團(tuán)底物溶液，在室溫下進(jìn)行免疫過(guò)氧化物酶染色10分鐘，發(fā)生顏色反 應(yīng)。在自來(lái)水中洗滌所述載玻片以終止顯色反應(yīng)。用Meyer蘇木精(Sigma Diagnostics, Oakville， ON)復(fù)染后，將所述載玻片用梯度乙醇(75%-100%) 脫水并用二曱苯透明。用封固齊'J(Dako Faramount， Toronto, Ontario)在所 述載玻片上蓋上蓋玻片。使用Axiovert 200(Ziess Canada, Toronto, ON) 對(duì)載玻片進(jìn)行顯微檢查，使用Northern Eclipse成像軟件(Mississauga ON) 獲取并存儲(chǔ)數(shù)字圖像。由組織病理學(xué)家對(duì)結(jié)果進(jìn)行讀取、評(píng)分和解釋。
利用人胰腺的正常和腫瘤組織微陣列(Pentagen, Seoul, Korea)對(duì)32種 人胰腺腫瘤和4種正常胰腺組織進(jìn)行抗體結(jié)合的檢測(cè)。圖14是人正常和 腫瘤胰腺組織陣列的7BD-33-11染色結(jié)果的匯總。每種腫瘤樣本用兩個(gè)點(diǎn)代表以克服組織異質(zhì)性。2個(gè)點(diǎn)的平均分?jǐn)?shù)作為最終腫瘤切片的分?jǐn)?shù)。 對(duì)于4種非腫瘤組織中的每一種只提供1個(gè)點(diǎn)。
如圖14所示，微陣列上7BD-33-11A與被測(cè)胰腺癌的總結(jié)合是 27/32(84%)。抗體在3/32中顯示強(qiáng)(+++)染色，在7/32中顯示中等(++)染 色，在9/32中顯示弱(+)染色和以及在8/32中顯示疑似(+/-)染色。所述結(jié) 合限于腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞定位是細(xì)胞質(zhì)和膜的，且具有顆粒狀染色模式。 染色細(xì)胞的百分比表明了 7BD-33-llA與胂瘤細(xì)胞的不同結(jié)合，范圍在小 于10%至大于50%之間。根據(jù)組織微陣列提供的胰腺肺瘤組織學(xué)類型， 7BD-33-l 1A對(duì)26/30(87%)的導(dǎo)管腺癌和1/2(50%)的內(nèi)分泌癌存在結(jié)合。 對(duì)4/4(100%)的非腫瘤胰腺組織存在結(jié)合；所述結(jié)合是針對(duì)腺泡上皮細(xì)胞 和胰島(圖l5)。
根據(jù)胰腺腫瘤的組織學(xué)分級(jí)，所述抗體分別對(duì)切片分級(jí)為Gl、 G1-G2、G2、G2-G3、G3、G4的1/1(100%)、 2/3(67%)、 9/12(75%)、 2/2(100%)、 6/6( 100%)和1/1(100%)存在結(jié)合。對(duì)5/5(100%)未知等級(jí)的切片存在結(jié)合。 就胰腺癌的肺瘤TNM期而言，所述抗體分別對(duì)I、 II、 III和IV期的 1/1(100%)、 14/17(82%)、 1/1(100%)和10/11(91%)的切片存在結(jié)合。因此， 沒(méi)有在抗體結(jié)合和不同的癌參數(shù)(組織學(xué)腫瘤類型，等級(jí)和TNM期)之間 發(fā)現(xiàn)聯(lián)系。相關(guān)性的這種缺乏可能歸因于代表一些癌癥分期的小樣本規(guī) 模。
7BD-33-11A抗原看起來(lái)在胰腺腫瘤組織表達(dá)。因此7BD-33-11A具
有作為治療胰腺癌的治療藥物的潛力。
實(shí)施例6
抗體7BD-33-11A體外抗體依賴的細(xì)胞的細(xì)胞毒(ADCC)活性的證明
先前來(lái)自7BD-33-11A在預(yù)防性人乳腺癌模型上的體內(nèi)治療用途的 證據(jù)表明，ADCC是該抗體在所述動(dòng)物模型中的體內(nèi)活性的可能機(jī)制， 所述證據(jù)通過(guò)比較7BD-33-l 1A在SCID與NOD/SCID小鼠中的功效獲得 (如在S.N. 60/642,057中所公開(kāi)的)。通過(guò)體外細(xì)胞毒性分析進(jìn)一步驗(yàn)證了 7BD-33-11A介導(dǎo)針對(duì)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系的抗體依賴的細(xì)胞的 細(xì)胞毒性的能力。從BALB/cAJcrniT小鼠的脾臟獲得小鼠效應(yīng)細(xì)胞，并用小鼠IL-2(20 nM)刺激4天。粘附和非粘附的效應(yīng)細(xì)胞被分離并用于體 外細(xì)胞毒性分析。從細(xì)胞培養(yǎng)板解離MDA-MB-231耙細(xì)胞，1000萬(wàn)個(gè)細(xì) 月包用40jitCi的Na251Cr04 (GE Healthcare Amersham Biosciences)標(biāo)i己60分 鄰并按每孔104個(gè)細(xì)胞加到96孔板中。就在以25:1的效應(yīng)物靶標(biāo)(E:T) 比例添加小鼠效應(yīng)細(xì)胞前，將不同終濃度的7BD-33-llA或者IgG2a同種 型-配對(duì)對(duì)照添加到"Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞。37。C孵育4小時(shí)后，測(cè)量溶解細(xì) 胞釋放的51Cr。每次分析重復(fù)3次，結(jié)果表示為特異性溶解的百分比， 其定義為(實(shí)驗(yàn)cpm-自發(fā)cpm)x 100/(最大cpm-自發(fā)cpm)。
該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(圖16)清楚地表明7BD-33-llA利用粘附和非粘附的效 應(yīng)細(xì)胞誘導(dǎo)特異性和劑量依賴的MDA-MB-231靶細(xì)胞溶解，而當(dāng)耙細(xì)胞 在相同濃度的同種型-配對(duì)對(duì)照存在的條件下孵育時(shí)，沒(méi)有觀察到這種現(xiàn) 象。因此，該數(shù)據(jù)證明7BD-33-11A能夠通過(guò)募集效應(yīng)細(xì)胞活性介導(dǎo) ADCC。
實(shí)施例7
MDA-MB-231異種移才直物中的巨喧細(xì)胞積聚
關(guān)于7BD-33-11A介導(dǎo)針對(duì)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系的抗體依賴 的細(xì)胞的細(xì)胞毒性的能力的其它證據(jù)來(lái)自利用免疫組織化學(xué)的體內(nèi)研 九。
6至8周大的雌性SCID小鼠經(jīng)頸背皮下注射植入溶于100微升生理 鹽水的5百萬(wàn)個(gè)人乳腺癌纟田胞(MDA-MB-231)。每周用測(cè)徑器測(cè)量肝瘤生 長(zhǎng)。當(dāng)同組中的大多數(shù)達(dá)到100 mm、范圍80-120 mm"的平均腫瘤體積 時(shí)，處死3只小鼠，收集它們的腫瘤，其中一部分保存在福爾馬林和OCT 中。剩余的小鼠被分到治療或者對(duì)照組，每組3只小鼠。分配后1天， 每組經(jīng)腹腔給予稀釋后體積為300微升的7BD-33-11A測(cè)試抗體(劑量為 15 mg/kg)或者緩沖液對(duì)照，所述稀釋使用含有2.7 mM KC1、 1 mM KH2P04、 137 mM NaCl和20 mM Na2HP04的稀釋劑從原液濃度稀釋。 在3、 6或者IO次給予測(cè)試抗體或者對(duì)照后，每周給予3次，處死小鼠， 收集腫瘤并保存在福爾馬林和OCT中。將腫瘤樣本轉(zhuǎn)移到多倫多綜合醫(yī) 院(Toronto General Hospital) (Toronto, ON)的病理學(xué)研究實(shí)'瞼室(Pathology Research Lab)進(jìn)行處理。
組織切片在58。C烘箱中干燥1小時(shí)脫蠟，通過(guò)將組織切片5次浸泡 于染色缸中的二曱苯進(jìn)行脫蠟，每次4分鐘。經(jīng)過(guò)一系列梯度乙醇洗滌 (100%-75%)處理后，切片在水中重新水合。將載玻片浸沒(méi)于pH值為6 的10 mM檸檬酸鹽緩沖液(Dako, Toronto, Ontario)中，隨后用高、中、低 能量設(shè)置的微波爐分別加熱載玻片5分鐘，最后將其浸沒(méi)在冷的PBS中。 隨后將載玻片浸沒(méi)在3%的過(guò)氧化氬溶液中6分鐘，用PBS洗滌3次，每 次5分鐘，干燥，并在室溫用通用封閉液(Dako, Toronto, Ontario)卵孚育5 分鐘，抗生物素蛋白D封閉液(Vector Laboratories, Burlingame, CA)室溫 孵育15分鐘以及生物素封閉液(Vector Laboratories, Burlingame, CA)室溫 孵育15分鐘。將抗Mac-3 (BD Bioscience, Oakville, ON)在抗體稀釋緩沖 液(Dako, Toronto, Ontario)中稀釋到其工作濃度(0.75孩吏克/mL),并在室溫 孵育1小時(shí)。只與抗體稀釋緩沖液孵育的載玻片被用作陰性對(duì)照。用PBS 洗滌所述載玻片3次，每次5分鐘。利用生物素化的抗大鼠(BD Bioscience, Oakville, ON)來(lái)檢測(cè)/顯現(xiàn)一抗的免疫反應(yīng)性。利用Vectastain EliteABC 試劑(Vector Laboratories, Burlingame, CA)斗企測(cè)顏色反應(yīng)。在自來(lái)水中洗滌 所述載玻片以終止顯色反應(yīng)。用Meyer蘇木精(Sigma Diagnostics, Oakville， ON)復(fù)染后，將所述載玻片用梯度乙醇(75%-100%)脫水并用二 甲苯透明。用封固劑(DakoFaramount， Toronto, Ontario)在所述載玻片上 蓋上蓋玻片。使用Axiovert 200 (Ziess Canada, Toronto, ON)對(duì)載玻片進(jìn) 行顯樣b險(xiǎn)查，使用Northern Eclipse成像軟件(Mississauga， ON)獲取并存 儲(chǔ)數(shù)字圖像。由組織病理學(xué)家對(duì)結(jié)果進(jìn)行讀取、評(píng)分和解釋。在100x放 大率(Ziess Axiovert 200M)下進(jìn)行載玻片的掃描。隨機(jī)選擇5個(gè)不同熱點(diǎn) 部位計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞(Mac-3陽(yáng)性)。選擇肺瘤內(nèi)區(qū)域計(jì)數(shù)，同時(shí)避開(kāi)外圍密 集地帶。在選擇了欲計(jì)數(shù)的區(qū)域后，將放大率調(diào)整為400x，并利用 QImaging Retiga相才幾和Northern Eclipse軟件(Version 7.0)捕獲圖# 利用 Northern Eclipse的手動(dòng)計(jì)數(shù)功能進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞的手動(dòng)計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)期間避 開(kāi)壞死區(qū)和血管間隙。
胂瘤切片的檢查顯示了胂瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的3種分布模式。在肺瘤 外圍和周圍結(jié)締組織之間存在條帶樣模式的外周侵潤(rùn)。所有7BD-33-11A治療的腫瘤中這種模式都很明顯，而緩沖液治療的腫瘤中只有 一些較明 顯。腫瘤細(xì)胞間還存在成群的聚集，最后，在腫瘤細(xì)胞之間或者環(huán)繞著 腫瘤細(xì)胞有分散的單個(gè)細(xì)胞的存在。
如圖17所示，與緩沖液治療相比，所有3個(gè)劑量的7BD-33-llA的 治療導(dǎo)致更高的巨噬細(xì)胞積聚。最高的積聚發(fā)生在6次給藥的樣本，并 且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的(p二0.047)。這與說(shuō)明在6次給予7BD-33-llA后觀 察到腫瘤生長(zhǎng)抑制的最大百分比的數(shù)據(jù)是一致的。此外，當(dāng)考慮到來(lái)自 全部3個(gè)劑量的數(shù)據(jù)時(shí)，巨噬細(xì)胞在7BD-33-l 1A治療的肺瘤中的積聚也 是顯著升高(p=0.037)。只與抗體稀釋緩沖液孵育的全部樣本均是陰性的。
因此，在MDA-MB-231異種移植物中，相對(duì)于緩沖液治療的異種移 植物，7BD-33-11A治療的異種移植物存在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的顯著積 聚。該數(shù)據(jù)支持先前關(guān)于ADCC作為7BD-33-11A的作用機(jī)制的證據(jù)。
實(shí)施例8
7BD-33-11A的人源4匕
由蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室(Protein Design Labs) (PDL, Fremont, CA)基本 上根據(jù)Queen等的步驟(1989)進(jìn)行7BD-33-UA的人源化操作。首先，鑒 定與7BD-33-l 1A的重鏈和輕鏈(分別為VH和VO可變區(qū)的氨基酸序列具 有高同源性的人可變(V)區(qū)。然后，CDR序列以及對(duì)于保持CDRs結(jié)構(gòu)重 要的骨架氨基酸被移植到選擇的人骨架序列。此外，被發(fā)現(xiàn)在相應(yīng)人V 區(qū)亞群中非典型的人骨架氨基酸被共有氨基酸取代以減少潛在的免疫原 性。所獲人源化的可變區(qū)在小鼠骨髓瘤細(xì)胞系Sp2/0中表達(dá)于IgGl和 IgG2M3 形式(分別為 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl(VllL)和 (hu)AR7BD-33-l 1A陽(yáng)IgG2M3(Vl 1L))中。
產(chǎn)生小鼠抗人CD63單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系7BD-33-11A在 DMEM (HyClone, Logan， UT)中培養(yǎng)，所述DMEM包含10% FBS (HyClone， Logan, UT) 、 1% MEM-非必需氨基酸 (BioWhittaker, Walkersville, MD)、 0.1% 2-巰基乙醇(Sigma, St. Loms, MO)、 1%丙酮酸 #] (Invitrogen, Carlsbad, CA)、 1% L-谷氨酰胺(Invitrogen, Carlsbad, CA)。將小鼠骨髓瘤細(xì)胞系Sp2/0-Agl4 (ATCC, Manassus, VA;以下稱為Sp2/0)在包含10%FBS的DMEM中培養(yǎng)利用蛋白G瓊脂糖柱通過(guò)親和 層析從培養(yǎng)上清純化小鼠單克隆抗體7BD-33-11A>利用FluoReporter熒 光素-EX蛋白標(biāo)記試劑盒(Molecular Probes, Eugene, OR)制備FITC偶聯(lián) 的7BD-33-llA。最初從國(guó)立癌癥研究所獲得的人前列腺癌細(xì)胞系PC-3 在包含10% FBS的RPMI-1640 (BioWhittaker， Walkersville, MD)中培養(yǎng)。 所有細(xì)胞系均在37。C下于7.5%032培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
在Argo BioAnalytica, Inc. (Kenilworth, NJ)進(jìn)行7BD-33-l 1A N端氨基 酸的測(cè)序。圖18顯示的所測(cè)氨基酸的序列與根據(jù)小鼠輕鏈和重輕鏈可變 區(qū)基因預(yù)測(cè)測(cè)的序列一致。
利用TRIzol試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA, Burlington, ON)/人大約107 個(gè)7BD-33-11A雜交瘤細(xì)胞提取總RNA，并根據(jù)供應(yīng)商的操作步驟利用 PolyATtract mRNA分離系統(tǒng)(Promega Corporation, Madison, WI)分離 poly(A)+RNA 按照供應(yīng)商的操作步驟，利用SMART RACE cDNA擴(kuò)增 試劑盒(BD Biosciences Clontech， Palo Alto, CA)合成雙鏈cDNA。利用分 別與小鼠7和k鏈C區(qū)退火的3'引物以及SMART RACE cDNA擴(kuò)增試 劑盒提供的5'通用引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增重鏈和輕鏈的可 變區(qū) cDNAs 。 對(duì)于 VH PCR ， 3'引物具有序歹ll 5'-GCCAGTGGATAGACCGATGG-3'(SEQIDNO: 15)。對(duì)于V^PCR， 3'引 物具有序列5'-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3' (SEQ ID NO: 16)。 VH 和VL cDNAs被亞克隆入pCR4Blunt-TOPO載體(Invitrogen, Carlsbad, CA) 以便序列測(cè)定。才艮據(jù)廠商的說(shuō)明書(shū)，通過(guò)利用熒光雙脫氧鏈終止劑 (Applied Biosystems， Foster City， CA)的PCR循環(huán)測(cè)序反應(yīng)進(jìn)行DNA測(cè) 序。在Model 3100基因分析儀(Applied Biosystems, Foster City, CA)上分 析測(cè)序反應(yīng)。鑒定出與典型的小鼠輕鏈和重鏈可變區(qū)同源的獨(dú)特序列。 發(fā)現(xiàn)VL和VH序列分別屬于亞群I和IIA。編碼輕鏈和重鏈可變區(qū)的cDNA 序列分別顯示于圖19和20。從cDNA序列分析推導(dǎo)的N端20個(gè)氨基酸 的序列與由對(duì)輕鏈和重鏈氨基酸測(cè)序確定的相應(yīng)序列一致。
按照Queen等人(1989)公開(kāi)的方法進(jìn)行人源化抗體V區(qū)的設(shè)計(jì)。根 據(jù)序列同源性選擇用作7BD-33-llACDRs受體的人V區(qū)骨架。計(jì)算機(jī)程 序ABMOD和ENCAD (Levht， 1983)被用于構(gòu)建可變區(qū)的分子模型。被預(yù)測(cè)與CDRs接觸的人源化V區(qū)的氨基酸用7BD-33-llA的相應(yīng)殘基取代。 將被發(fā)現(xiàn)在相同V區(qū)亞群中非典型的人源化V區(qū)中的氨基酸改變?yōu)楣灿?氨基酸以消除潛在的免疫原性。根據(jù)對(duì)人V和J區(qū)序列的同源性檢索， 選擇人V區(qū)AAR32409(Huang et al., 1997)和J片段JH6(Ravetch " a/., 1981)作為(hu)AR7BD-33-llA 重鏈可變區(qū)的骨架。對(duì)于 (hu)AR7BD-33-l 1A輕鏈可變區(qū)，使用人V區(qū)1LVE (Miura 2003)和 J片段JK2 (Hieter " a/.， 1982)。 7BD-33-l 1A的Vh和人受體AAR32409/JH6 之間的骨架氨基酸的同一性是77%，而7BD-33-11A的V^和人受體1L VE/JK2之間的同 一性是88%。
在計(jì)算機(jī)模型提示與CDRs有顯著接觸的骨架位置，來(lái)源于V區(qū)的 氨基酸被原始人骨架氨基S復(fù)取代。這發(fā)生在重鏈的殘基30， 48， 67， 68, 70, 72,74,97和98。對(duì)于輕鏈，取代發(fā)生在殘基22。相應(yīng)的人V區(qū)亞群中 在其各自位置很少存在的骨架殘基被在那些位置的人類共有氨基酸取 代。這發(fā)生在重鏈的殘基38、 40和84。 7BD-33-llA、設(shè)計(jì)的 (hu)AR7BD-33-l 1A以及受體人的VL和VH的V區(qū)氨基酸序列的比對(duì)分 別顯示于圖21和22。
利用20 (對(duì)于輕鏈)或者22 (對(duì)于重鏈)個(gè)重疊的合成寡核苷酸構(gòu)建和 擴(kuò)增重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，所述寡核苷酸大約40個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)(Stemmer ^ a/., 1995)。將所述寡核苷酸退火，并利用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene, LaJolla，CA)延伸以產(chǎn)生組裝的雙鏈全長(zhǎng)V基因。利用Pfu Turbo聚合酶 通過(guò)PCR擴(kuò)增組裝的重鏈和輕鏈的V基因片段。用凝膠純化PCR擴(kuò)增 的片段，并用Mlul和Xbal消化，用凝膠純化，再分別亞克隆入pVgl.D.Tt 或pVg2M3.D.Tt (Cole & "/.，997)和pVk (Co W a/, 1992)。質(zhì)粒pVgl .D.Tt 類似于pVg2M3.D.Tt (Cole d a/.， 1997)，<旦它包含編碼^1恒定區(qū)而不是？2 恒定區(qū)的基因組片段。利用Pfu Turbo聚合酶，通過(guò)用22個(gè)重疊寡核苷 酸的基于PCR的一步基因組裝法導(dǎo)入單個(gè)氨基酸取代(Stemmer ^ a/.， 1995)，以產(chǎn)生一組(hu)AR7BD-33-llA VH變體(V24A, R38K和V24A, R38K)。使用高保真擴(kuò)增聚合酶)(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)通過(guò) 重疊-延伸PCR進(jìn)行定點(diǎn)誘變以產(chǎn)生另一組(hu)AR7BD-33-llA VH變體 (V11L、 120M和Q111A)。編碼人源化Vl或者VH的基因被設(shè)計(jì)為小外顯子(圖23和24),所述小外顯子包括信號(hào)肽、剪接供體信號(hào)以及用于后續(xù) 克隆入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)。Vl和VH小外顯子 中的剪接供體信號(hào)分別來(lái)源于相應(yīng)的人種系JK和JH序列。人源化的 和VH小外顯子中的信號(hào)肽序列來(lái)源于小鼠抗E/P選擇素單克隆抗體 EP5C7的Vl和Vh區(qū)(He e/a/., 1998)。分別通過(guò)20和22個(gè)重疊的合成寡 核苷酸的延伸(圖25和26)構(gòu)建(hu)AR7BD-33-l 1A Vl和Vh基因，并進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，如圖27所示。將用于Vl的寡核苦酸1-20和用于Vh的寡核 苷酸1-22混合、退火并通過(guò)使用PfU Turbo DNA聚合酶的PCR延伸。通 過(guò)使用引物1和20(對(duì)于VJ或者1和22(對(duì)于VH)的PCR擴(kuò)增獲得的V 基因雙鏈DNA組裝物以并入側(cè)翼的Mlul和Xbal位點(diǎn)。獲得的V^基因 片賴j皮克隆入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pVk (Co a/., 1992)以產(chǎn)生 pVk-(hu)AR7BD-33-11A 。 VH片分別#皮克隆入pVgl.D.Tt和 pVg2M3.D.Tt (Co d a/, 1997)以產(chǎn)生pVgl-(hu)AR7BD-33-l 1A和 pVg2M3-(hu)AR7BD-33-l 1A。
按照供應(yīng)商的推薦利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(Lipofectamine)方法將 pVgl-(hu)AR7BD-33-llA 或 pVg2M3-(hu)AR7BD-33-l 1A 以及 pVk-(hu)AR7BD-33-llA共轉(zhuǎn)染入293-H細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，所述 293-H細(xì)胞在包含2%低Ig FBS (HyClone, Logan, UT)的RPMI-1640中培 養(yǎng)。大約7"06個(gè)細(xì)胞與各15微克的輕鏈和重鏈質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，所述質(zhì)粒已 經(jīng)與70微升的脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑形成復(fù)合物。細(xì)胞在C02培養(yǎng)箱中 孵育5-7天。
通過(guò)蛋白A瓊脂糖柱層析純化瞬時(shí)表達(dá)的(hu)AR7BD-33-llA.IgGl 和(hu)AR7BD-33-llA.IgG2M3抗體。在FACS竟?fàn)幏治鲋?企測(cè)這兩種抗 體對(duì)人CD63的親和力。7BD-33-UA、 (hu)AR7BD-33-11A.IgGl和 (hu)AR7BD-33-11 A.IgG2M3抗體以濃度依賴的方式與FITC-偶聯(lián)的 AR7BD-33-11A竟?fàn)?。利用?jì)算機(jī)軟件GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) 獲得的 7BD-33-11A 、 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl和(hu)AR7BD-33-l 1 A-IgG2M3抗體的ICso值分 別是7.02微克/mL、 25.3微克/mL和62.3孩i克/mL(圖28)。 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl的親和力比7BD-33-l 1A的親和力低3.6倍。為了恢復(fù)人源化期間7BD-33-11A喪失的抗原結(jié)合親和力，通過(guò)22 個(gè)重疊的合成寡核苷酸的延伸和PCR擴(kuò)增(V24A和R38K)以及如圖29 顯示的定點(diǎn)誘變(V11L、 I20M和Q111A)，在VH中實(shí)現(xiàn)從人類殘基到小 鼠殘基的數(shù)個(gè)單氨基酸取代。對(duì)于每種突變體，中間的數(shù)字指示氨基酸 取代的位置，左邊和右邊的字母分別以單字母代碼指示突變前后的氨基 酸。V24A和R38K突變體被組合以產(chǎn)生雙氨基酸取代突變體(V24A, R38K)。六種VH突變體被克隆入如上所述的pVgl。
六種變異的(hu)AR7BD-33-llA IgGl抗體在293-H細(xì)胞中瞬時(shí)表 達(dá)，并通過(guò)蛋白A瓊脂糖柱層析純化，利用FACS竟?fàn)幏椒ǚ治鏊鼈儗?duì) 人CD63的親和力。所述六種抗體以濃度依賴的方式與FITC-偶聯(lián)的 7BD-33-l 1A竟?fàn)?。它們的ICM)值顯示于圖28中。在它們中間，只有VI1L 變異體與CD63的結(jié)合高于野生型和其他變異抗體。在 VH((hu)AR7BD-33-llA-IgGl(VllL)) 中攜帶 VI1L 取代的 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl抗體的親和力在7BD-33-l 1A的親和力的3倍以 內(nèi)。
如上所述產(chǎn)生攜帶 V11L 突變的重鏈表達(dá)載體 pVgl-(hu)AR7BD-33-l 1A (pVgl-(hu)AR7BD-33-l 1A (VI 1L))。為了表達(dá) (hu)AR7BD-33-llA畫(huà)IgG2M3(VllL), 將攜帶 VI1L 突變的 (hu)AR7BD-33-llA Vh基因克隆入如上所述的pVg2M3.D.Tt (Cole d 1997)，產(chǎn)生pVg2M3-(hu)AR7BD-33-llA. V11L。輕《連恒定區(qū)來(lái)源于人種 系k片段(Hieter " a/., 1980)重鏈分別來(lái)源于人種系(Ellison & a/., 1982) 和人 72M3 (Cole " a/, 1997)片段。應(yīng)注意到 pVg2M3(hu)AR7BD-33-llA.VllL中編碼的下2M3重鏈的倒數(shù)第二個(gè)殘基 是甘氨酸，甘氨酸是比Cole等人(1997)使用的絲氨酸更典型的殘基。人 巨細(xì)胞病毒主要的立即早期啟動(dòng)子和增強(qiáng)子啟動(dòng)輕鏈和重鏈基因的表 達(dá)。選擇標(biāo)志(g;^基因)的表達(dá)由SV40早期啟動(dòng)子啟動(dòng)。如圖30所示的 最終質(zhì)粒的總體結(jié)構(gòu)通過(guò)限制性酶切圖語(yǔ)進(jìn)行驗(yàn)證。輕鏈和重鏈基因的 可變區(qū)和恒定區(qū)外顯子的序列通過(guò)核苦酸測(cè)序來(lái)驗(yàn)證。
為 了得到穩(wěn)定產(chǎn)生(hu)AR7BD-33-11A-IgGl(VllL)和 (hu)AR7BD-33-llA-IgG2M3(VllL)的細(xì)胞系，通過(guò)電穿孔將相應(yīng)的重鏈和輕鏈表達(dá)載體引入小鼠骨髓瘤細(xì)胞系Sp2/0的染色體?；旧习凑誄o 等人(1992)的描述通過(guò)電穿孔進(jìn)行到Sp2/0的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，利用Fspl 使表達(dá)載體線性化。將大約107個(gè)細(xì)胞分別與25微克和50微克的線性化 的輕鏈和重鏈質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。在包含10% FBS (HyClone, Logan, UT)的 DMEM (BioWhittaker， Walkersville， MD)中懸浮轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，然后按照100 微升/孔接種入幾個(gè)96孔板。48小時(shí)后，每孔加入100微升選擇培養(yǎng)基(包 含10% FBS、 HT培養(yǎng)基添加劑(Sigma， St. Louis, MO)、 0.5 mg/mL黃噤呤 (Sigma， St. Louis, MO)和2.4微克/mL霉酚酸(Sigma, St. Louis, MO的 DMEM)。選4奪開(kāi)始后大約10天，通過(guò)ELISA分析培養(yǎng)上清中的抗體生 成。Immulon 4 HBX免疫分析4反(ThermoLabsystems, Franklin, MA)用100 微克/孔的1微克/mL的AffiniPure山羊抗人IgG Fc7-鏈特異性多克隆抗 體(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA)在4°C包被 過(guò)夜，所述抗體溶于pH為9.4的0.2M碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液中。所述 板用洗滌緩沖液(包含0.1%吐溫-20的PBS)洗滌，再用300微升/孔的溶 于TBS的SuperBlock封閉緩沖液(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)室溫 下封閉30分鐘。用洗滌緩沖液洗滌后，將包含(hu)AR7BD-33-UA的樣 本適當(dāng)稀釋于ELISA緩沖液(包含1% BSA和0.1%吐溫20的PBS)中， 并按照100微升/孔加入ELISA板。使用人源化的IgGl， k抗體 HuAIP12(Protein Design Labs, Inc.; WO 2004/101511A2)和嵌合的 IgG2M3， k抗體OKT3 (Colee,a/, 1997)作為標(biāo)準(zhǔn)品。室溫下孵育所述板 1.5小時(shí)并用洗滌緩沖液洗滌后，使用100微升/孔的HRP-偶聯(lián)的 AffiniPure 山羊抗人IgG Fc下-鏈特異性多克隆抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA)的1:1000牙希jf奪液沖企測(cè) 結(jié)合的抗體。室溫下孵育1小時(shí)并用洗滌緩沖液洗滌后，按照100微升/ 孔添加ABTS過(guò)氧化物酶底物/過(guò)氧化物酶溶液B (KPL, Inc., Gaithersburg, MD)進(jìn)行顯色。室溫下孵育4分鐘后，通過(guò)添加100微升/ 孔的2%草酸終止顯色。利用VersaMax微板讀數(shù)儀(Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA)在415 nm處讀耳又吸光度。
高產(chǎn)的Sp2/0轉(zhuǎn)染子，Sp2/0-(hu)AR7BD-33-llA-IgGl(VllL)(克隆 弁18)和Sp2/0-(hu)AR7BD-33-UA-IgG2M3(VllL)(克隆#5)，在包舍10%FBS的DMEM中擴(kuò)增，然后在包含1%低Ig FBS (HyClone， Logan, UT) 的無(wú)蛋白基礎(chǔ)培養(yǎng)基-2 (Protein-Free Basal Medium-2, PFBM-2) (Protein Design Labs, Inc.; Sauer et al. (2000))中適應(yīng)并擴(kuò)增生長(zhǎng)， 一直生長(zhǎng)到衰 竭所述PFBM-2添加有無(wú)蛋白添加培養(yǎng)基-3 (Protein-Free Feed Medium-3: PFFM-3) (Protein Design Labs, Inc.; Sauer et al. (2000))。
為 了 i正實(shí)輕鏈和重《連 mRNA 序列， 從 Sp2/0(hu)AR7BD-33-llA-IgGl(VllL) ( 克 隆 #18) 和 Sp2/0(hu)AR7BD-33-llA-IgG2M3(VllL)(克隆#5)分離總RNA。利用總 RNA作為模板并且用隨機(jī)的六脫氧核苷酸作為引物，通過(guò)Superscript Preamplification System (Invitrogen， Carlsbad, CA)合成第一鏈cDNA按月g 供應(yīng)商的操作步驟使用Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反應(yīng)。使用分別結(jié)合 5'和3'非編碼區(qū)的5'和3'引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增包含(hu)AR7BD-33-llA輕 鏈或重鏈的完整編碼區(qū)的DNA片段。引物序列顯示如下
輕鏈和重鏈的5'引物
mbr3 5'-CCATAGAAGACACCGGGACC-3' (SEQ ID NO: 17) 輕鏈的3'引物
mcl21 5'-AGGTGCAAAGATTCACTT-3' (SEQ ID NO: 18) 重鏈的3'引物
mcl24 5'-TCCCGTCGCGACCCACG-3' (SEQ ID NO: 19)
將擴(kuò)增的片段用凝膠純化，并利用合適的引物將其進(jìn)行測(cè)序。輕鏈 和重鏈的測(cè)定序列在每個(gè)核普酸位置都與
(hu)AR7BD-33-l 1 A-IgGl(Vl lL)和(hu)AR7BD-33-l 1 A-IgG2M3(Vl 1L)的 已知編碼序列一致(圖31、 32和33)。
通過(guò)在90% FBS (HyClone， Logan, UT> 10% DMSO (Sigma, St, Louis, MO)中冷凍 Sp2/0-(hu)AR7BD-33-llA.VllL.Gl (克隆#18)和 Sp2/0-(hu)AR7BD-33-llA.VllL.G2M3 (克隆#5)轉(zhuǎn)染子制備了 10個(gè)小^f瓦 的種子庫(kù)。每個(gè)小瓶包含大約5xl(^個(gè)細(xì)胞。每個(gè)種子庫(kù)中的1個(gè)小瓶被 解凍并在PFBM-2中生長(zhǎng)，將細(xì)胞培養(yǎng)物送出進(jìn)行支原體檢測(cè)(Bionique Testing Laboratories, Saranac Lake, NY)。 DNA熒光染料分析和直接培養(yǎng) 法均顯示是支原體污染陰性的。(Hu)AR7BD-33匿l lA畫(huà)IgGl(Vl 1L)和 (hu)AR7BD-33-llA-IgG2M3(VllL)抗體在293-H細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，或者 在如下所述的 S p 2 / 0 細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。 Sp2/0-(hu)AR7BD-33-llA-IgGl(VllL)(克隆弁18)和 Sp2/0-(hu)AR7BD-33-llAIgG2M3(VllL)(克隆#5)在滾瓶(每個(gè)滾瓶400 mL)中中擴(kuò)增至在包含1。/。低IgFBS的PFBM-2中的0.8升。在Protein A Sepharose(蛋白A瓊脂糖)上通過(guò)親和層析從用過(guò)的培養(yǎng)上清中純化 (hu)AR7BD-33-l lA-IgGl(Vl lL)和(hu)AR7BD-33-l 1A-IgG2M3(Vl 1L)單 克隆抗體。離心及過(guò)濾后，來(lái)自瞬時(shí)或者穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子的培養(yǎng)上清加載于 HiTrap Protein A HP柱(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)上。在用20 mM檸檬酸鈉緩沖液(pH 3.5)洗脫該抗體前，用含有150 mM NaCl的20 mM檸檬酸鈉緩沖液(pH 7.0)洗柱。洗脫的混合部分用1.5M檸檬酸鈉緩 沖液(pH 6.5)中和。用PBS透析蛋白，然后在4。C保存前將其經(jīng)過(guò)0.2微 米濾器過(guò)濾。通過(guò)測(cè)量280 nm處的吸光度確定抗體濃度(l mg/mL=1.4 A280)。 (hu)AR7BD-33-l 1A-IgGl(Vl 1L)的產(chǎn)量是50 mg, (hu)AR7BD-33-llA-IgG2M3(VllL)的產(chǎn)量是22 mg。然后通過(guò)按照標(biāo)準(zhǔn) 程序進(jìn)行的SDS-PAGE分析抗體。按照供應(yīng)商推薦的還原和非還原性條 件，在NuPAGE樣本還原劑(Invitrogen, Carlsbad， CA)存在或不存在的情 況下分別將7BD-33-llA、 (hu)AR7BD扁33-l 1 A-IgGl(Vl 1L)和 (hu)AR7BD-33-llA-IgG2M3(VllL)抗體在70。C加熱10分鐘。然后，在 NuPAGE MES SDS電泳緩沖液(Invitrogen, Carlsbad, CA)中，抗體在 4隱12%的Bis-Tris NuPAGE凝膠(Invitrogen, Carlsbad, CA)中于200伏特下 跑20分鐘。作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，廣范圍的SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)品(BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA)在還原條件下泳動(dòng)。室溫下凝膠用SimplyBlue SafeStain (Invitrogen, Carlsbad, CA)染色過(guò)夜，然后在室溫下用1120脫色 過(guò)夜。非還原條件下的SDS-PAGE分析(圖 3 4 )表明 (hu)AR7BD-33-llA(VllL)抗體的分子量大約為150至160 kDa。還原條 件下的分析表明(hu)AR7BD-33-UA(VUL)抗體由一條分子量大約為50 kDa的重4連和一條分子量大約為25 kDa的輕鏈組成。然后通過(guò)體積排阻 色譜法(Size exclusion HPLC)分析純度。利用Vanon HPLC系統(tǒng)進(jìn)行體積排阻HPLC,所述系統(tǒng)由Rainin柱加熱器CH-1型、Dynamax溶劑遞送系 統(tǒng)SD200型和Knaver可變波長(zhǎng)監(jiān)浮見(jiàn)器組成使用Varian Prostar/Dynamax 0.24系統(tǒng)控制5.51版軟件控制自動(dòng)進(jìn)樣器、泵和檢測(cè)器，以及獲得、保 存和處理數(shù)據(jù)。利用串聯(lián)連接的兩個(gè)TosoHaas TSK-GEL G3000SWXL體 積排阻HPLC柱(7.8 mmx300 mm, 5微米粒徑，250A孔徑；TosoHaas， Montgomery ville, MD)實(shí)現(xiàn)分離。流動(dòng)相是pH 7.4的PBS，流速為1.5 mL/ 分鐘。用分光光度計(jì)測(cè)量法在280 nm處監(jiān)測(cè)柱洗脫液。利用體積排阻 H P L C測(cè)定的抗體純度看起來(lái)大于9 5 % (圖 3 5)。
通過(guò)FACS竟?fàn)幏椒ǚ治?hu)AR7BD-33-llA(VllL)抗體對(duì)人CD63 的親和力，所述抗體已經(jīng)從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子的培養(yǎng)上清中純化。用無(wú)菌PBS (BioWhittaker, Walkersville, MD)洗滌PC-3細(xì)胞三次。在37。C的〔02培養(yǎng) 箱中，將所述細(xì)胞在包含2.5 mM EDTA的HBSS(BioWhittaker, Walkersville,MD)培養(yǎng)基中孵育5-7分鐘以使細(xì)胞脫離。再用FACS染色 緩沖液(FSB)(包含0.5% BSA的PBS(Sigma, St, Louis, MO》洗滌細(xì)胞三 次。細(xì)胞的最后一次洗滌在V形底的96孔分析板(Nalgene Nunc International, Rochester, NY)中進(jìn)行，隨后棄掉上清。每次試-驗(yàn)中每孔含 有105個(gè)細(xì)胞。按照100微升/孔將FITC偶聯(lián)的7BD-33-llA(15微克/mL 終濃度)和竟?fàn)幙贵w(7BD-33-l 1A或者(hu)AR7BD-33-l 1A，從終濃度400 微克/mL開(kāi)始，并連續(xù)稀釋3倍)的混合物加入到分析板中的細(xì)胞沉淀， 并在4。C孵育1小時(shí)。將細(xì)胞在FSB中洗滌三次，然后在200微升1%的 多聚曱醛溶液中重懸該沉淀，并在雙激光FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD Biosciences Immunocytometry Systems, San Jose, CA)上通過(guò)ifL式纟田月包術(shù)^j" 所述細(xì)胞進(jìn)行分析。7BD-33-llA、 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl(VllL)和 (hu)AR7BD-33-llA-IgG2M3(VllL)抗體以濃度依賴的方式與FITC偶聯(lián) 的7BD-33-l 1A竟?fàn)?。如圖36所示，利用計(jì)算機(jī)軟件GraphPad Prism獲 得 的 7BD-33-11A 、 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl(VllL) 和 (hu)AR7BD-33-l 1A-IgG2M3(Vl 1L)的平均IC50值分別是6.83微克/mL、 12.7微克/mL和38.8微克/mL。 FACS竟?fàn)幏治龅拇硇越Y(jié)果顯示于圖 37 中 。 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl(Vl 1L) 和
(hu)AR7BD-33-llA-IgG2M3(Vl 1L)對(duì)人CD63的相對(duì)結(jié)合比7BD-33-l 1A對(duì)人CD63的相對(duì)結(jié)合大約低1.9倍和5.7倍。先前已經(jīng)顯示IgG2亞類 抗體的親和力比IgGl亞類抗體的親和力低2至3倍(Cole a/., 1997; Morelock d 1994)，在本文觀察到(hu)AR7BD-33-l 1A-IgGl(Vl 1L)和 (hu)AR7BD-33-l 1A-IgG2M3(Vl 1L)抗體之間相同的親和力差異。人源化 的(hu)AR7BD畫(huà)33-l lA-IgGl(Vl 1L)和(hu)AR7BD-33-l 1A-IgG2M3(Vl 1L) 抗體在后面分別被稱為 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl 和 (hu)AR7BD-33-l 1A陽(yáng)IgG2M3。
實(shí)施例9
A2058細(xì)胞的體內(nèi)腫瘤實(shí)驗(yàn)
參考圖38和39， 4至6周大的雌性SCID小鼠經(jīng)頸背皮下注射植入 溶于100微升生理鹽水的500,000個(gè)人黑素瘤細(xì)胞(A2058)。這些小鼠被 隨機(jī)分成4個(gè)治療組，每組8只小鼠。移植后1天，每組小鼠經(jīng)腹腔給 予稀釋后體積為 300微升的 2 mg/kg的 7BD-33-11A 、 (hu)AR7BD-22-llA-IgGl、 (hu)AR7BD-22-l 1A-IgG2M3測(cè)試抗體或緩沖 液對(duì)照，所述稀詳奪使用含有2.7 mM KC1、 1 mM KH2P04、 137 mM NaCl 和20 mM Na2HP04的稀釋劑從原液濃度稀釋。然后在整個(gè)研究期間以同 樣方式每周給予一次所述抗體和對(duì)照樣品。大約每7天用測(cè)徑器測(cè)量一 次肺瘤生長(zhǎng)。因?yàn)榭贵w的供給問(wèn)題，用(hu)AR7BD-33-llA-IgG2M3治療 的組總共接受3次給藥。該研究在34天后終止，因?yàn)閯?dòng)物由于大潰瘍性 損傷達(dá)到CCAC的終點(diǎn)。在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)照組、7BD-33-11A和 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl治療組已經(jīng)接受6次給藥。在整個(gè)研究期間每 周一次記錄動(dòng)物的體重。研究結(jié)束時(shí)，依據(jù)CCAC的指導(dǎo)方針，所有的 動(dòng)物都采取安樂(lè)死。
在建立的人黑素瘤A2058體內(nèi)模型中，小鼠7BD-33-11A和 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl抑制腫瘤生長(zhǎng)。圖38顯示與緩沖液對(duì)照相比， 2 mg/kg的3種抗體對(duì)肺瘤生長(zhǎng)的影響。第27天，當(dāng)治療組的所有小鼠 都存活時(shí)，7BD-33-11A 降低56%的月中瘤生長(zhǎng)(p=0.0086)， (hu)AR7BD-33-UA-IgGl 降低 63%的月中瘤生長(zhǎng)(p=0.0016) 而 (hu)AR7BD-33 -11 A-IgG2M3對(duì)肺瘤生長(zhǎng)沒(méi)有顯著的影響(10%的胂瘤抑制)。這些結(jié)果證明人源化的IgGl保留了鼠科的抗體的功效，但lgG2M3 形式的功效顯著下降。這種觀察到的降低至少可以部分歸因于IgG2M3 治療組接受的較少次數(shù)的給藥，或者該同種型的較低親和力(參見(jiàn)上面)。
在整個(gè)研究期間沒(méi)有臨床毒性癥狀。每周測(cè)得的體重用做動(dòng)物健康 和發(fā)育停止的指標(biāo)。圖39顯示整個(gè)研究期間各治療組的體重結(jié)果。，在 第27天或者研究結(jié)束時(shí)(第34天)，來(lái)自任何抗體治療組的小鼠的體重與 緩沖液對(duì)照組的體重相比都沒(méi)有顯著變化。
總之，在A2058黑素瘤模型中，(hu)AR7BD-33-llA-IgGl顯示了與 鼠科的抗體相同或者比其更高的功效。相反，在該人A2058黑素瘤模型 中(hu)AR7BD-33-llA-IgG2M3嵌合抗體不抑制肺瘤生長(zhǎng)。此外，鼠科抗 體和人源化抗體看起來(lái)被小鼠良好地耐受。
實(shí)施例10
7BD-33-llA、 1A245.6 、 H460-22扁l 、 Chu)AR7BD-33 - 11A-IgGl和 (hu)AR7BD-33 - 11A-IgG2M3對(duì)CD63的結(jié)合親和力的測(cè)定
通過(guò)測(cè)定 7BD-33-11A 、 1A245.6 、 H460-22-l 以及 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl和(hu)AR7BD-33-l 1A-IgG2M3在結(jié)合到細(xì)菌表 達(dá)和純化的人CD63細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域2 (GST-EC2)的重組蛋白GST融合構(gòu) 建體后的各自的解離常數(shù)的來(lái)比較它們的結(jié)合親和力。
使用標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)步驟固定抗GST抗體。通過(guò)注射35 mL包含0.05 M NHS和0.2 M EDC的混合物(溶于H20中)活化CM5傳感器芯片(Biacore， Uppsala， Sweden)的表面。注射濃度為30 mg/mL溶于10 mM醋酸鈉(pH 5.0)的抗GST抗體，直到捕獲50,000 RU至100,000RU。最后，注射35 mL 1.0 M的鹽酸乙醇胺以封閉傳感器芯片表面的任何活化位點(diǎn)。注射5 mg/mL的GST-EC2 (25 mL),隨后注射25至50 mL的所述抗體。通過(guò) 20 mM甘氨酸(pH 2.2)的兩次10 mL脈沖的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)傳感器芯片表面的再 生以用于隨后的注射。連續(xù)地注射濃度從12.5至200 nM變動(dòng)的抗體。 作為對(duì)照，在捕獲GST而不是GST-EC2的表面上注射每種抗體濃度。 根據(jù)測(cè)定的穩(wěn)態(tài)結(jié)合水平來(lái)計(jì)算不同抗體對(duì)EC2的親和力。對(duì)于每條傳 感器曲線(sensorgram),在抗體注射結(jié)束前20秒提取報(bào)告點(diǎn)(Req)。對(duì)于每種抗體濃度，從在GST-EC2上注射抗體獲得的Req中減去在GST上 注射抗體獲得的Req。確定Req/Conc對(duì)Req的曲線的斜率，其代表結(jié)合 常數(shù)(KA)。解離常數(shù)(KD)計(jì)算為KA的倒數(shù)。利用Biacore 2000系統(tǒng) (Biacore, Uppsala， Sweden)進(jìn)行所述實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)得到的7BD-33-llA、 H460-22-l和1A245.6的KD值分別為135 nM、 42 nM和10 nM(圖40), 從而表明在該研究使用的抗體中7BD-33-IIA的親和力最低。它也表明人 源化抗體(hu)AR7BD-33-llA-IgGl和(hu)AR7BD-33-l 1A-IgG2M3的親和 力高于親代的鼠科的7BD-33-11A的親和力。這些結(jié)果不同于實(shí)施例8 中報(bào)道的那些結(jié)果。所述結(jié)果中的差異可以部分歸因于下述因素。首先， 使用了 FACS對(duì)表面等離子體共振的不同的方法學(xué)。其次，在實(shí)施例8 中使用PC-3細(xì)胞，而在實(shí)施例10中，使用細(xì)菌表達(dá)的重組CD63。這兩 個(gè)來(lái)源會(huì)體現(xiàn)CD63的構(gòu)象或者糖基化形式的輕度差異。
此優(yōu)勢(shì)證據(jù)表明，AR51A994.1、 7BDI誦58、 7BDI-60、 H460-22-l、 7BD-33-llA、 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl和1A245.6通過(guò)CD63上存在的 表位的連接來(lái)介導(dǎo)抗癌作用。在實(shí)施例4中已經(jīng)顯示，AR51A994.1、 7BDI-58、 7BDI-60和7BD-33-11A抗體可以用于免疫沉淀來(lái)自諸如 MDA-MB-231細(xì)胞的表達(dá)細(xì)胞的同源抗原。此外還表明，利用例如但并 不限于FACS、細(xì)胞ELISA或IHC等技術(shù)，AR51A994.1、 7BDI-58、 7BDI-60 、 7BD-33-11A 、 (hu)AR7BD-33-l lA扁IgGl 和 (hu)AR7BD-33-llA-IgG2M3抗體可以用于4企測(cè)表達(dá)與之特異性結(jié)合的 CD63抗原部分的細(xì)胞和/或組織。
因此，利用FACS、細(xì)胞ELISA或者IHC分析，可以顯示免疫沉淀 的AR51A994.1、 7BDI-58、 7BDI-60和7BD-33-l 1A抗原能夠抑制任一種 抗體對(duì)這類細(xì)胞或者組織的結(jié)合。此外，就象AR51A994.1、 7BDI-58、 7BDI-60和7BD-33-l 1A抗體一樣，其他抗CD63抗體可以用于免疫沉淀 和分離其他形式的CD63抗原，并且利用相同類型的分析，所述抗原也
本說(shuō)明書(shū)中提及的所有專利和公開(kāi)出版物代表了本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 技術(shù)人員的水平。所有專利和公開(kāi)出版物通過(guò)引用的方式并入本文，其 弓1用程度如同每個(gè)出版物被特別單獨(dú)地指明以引用的方式并入本文。應(yīng)該明白，盡管本發(fā)明以某種形式被說(shuō)明，但這不是要將本發(fā)明限 定在本文所描述和顯示的特定形式或布局。對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易 見(jiàn)的是，在不偏離本發(fā)明的范圍的前提下還可做出各種變化，且不應(yīng)當(dāng) 認(rèn)為本發(fā)明限于本說(shuō)明書(shū)中顯示和描述的內(nèi)容。本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容 易看出使本發(fā)明較好地適合實(shí)現(xiàn)所描述的目的并獲得提及的結(jié)果和益 處，以及其中固有的部分。本文中描述的任一寡核香酸、肽、多肽、生 物相關(guān)化合物、方法、流程和技術(shù)都是優(yōu)選實(shí)施方案中有代表性的，其 目的在于示例，并不是限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠想到 包括在本發(fā)明精神的范疇內(nèi)的變化和其它用途，并由所附權(quán)利要求書(shū)的 范圍所限定。盡管借助特定的優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)理解
描述的實(shí)施本發(fā)明的方式的各種變化，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而 易見(jiàn)的，均在所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。為專利^呈序的微生物《呆藏耳5^得國(guó)卩示7"P:i人的布達(dá)《風(fēng)其開(kāi)條纟勺
國(guó)際表
豐艮J居第7.3條發(fā)布的纟散生物^f呆藏i正明以及 才、艮J居第10.2條發(fā)布的微生物存^舌聲明
(譯文)
致(保藏人成代理人名稱及地址)
Arius Research Inc.(阿里烏斯研究公司)
代理人Jean de Sousa-Hitzler
55 York Street 16th Floor
Toronto, Ontario
Canada M5J 1R7
(加拿大多倫多)
代表Anus Research Inc.(阿里烏斯研究公司)而保藏 保藏人標(biāo)識(shí)號(hào)
小鼠雜交瘤細(xì)胞系H460-16-2 小鼠雜交瘤細(xì)胞系H460-22-1 小鼠雜交瘤細(xì)胞系7BDI-60
專利保藏指定 PTA-4621 PTA-4622 PTA-4623
所述保藏附有以下說(shuō)明的_科學(xué)性描述_建議的分類描述。
本國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)丁- 2002年9月4日收到所述保藏，并且所述保藏己被接受。 應(yīng)您的耍求1 我們旌向您通知30年內(nèi)對(duì)所述齒種的諾求。
如果布達(dá)佩斯條約成員國(guó)專利W證明某人有權(quán)收到該齒—種，成者如果匕出版引用該齒種的關(guān)國(guó)專 利，且美國(guó)專利與商標(biāo)局成本保減人指示ATCC釋放該齒種，那么將可獲得該齒種。
如X該培養(yǎng)物在所述保藏的有效期內(nèi)死亡成被破壞，那么您將負(fù)有川相冋的活培養(yǎng)物代替它的責(zé) 任。
在G保藏日起至少30年內(nèi)，成者在最近的樣品諾求之后5年內(nèi)，該齒種將被維持，所述時(shí)間以 較L;者為準(zhǔn)。美國(guó)和其他很多國(guó)家都是布達(dá)佩斯條約成員國(guó)。
于2002年9月6日檢測(cè)以上所引用培養(yǎng)物的存活。在當(dāng)天，所述培養(yǎng)物是存活的。
國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)American Type Culture Collection(美國(guó)典荊微生物保藏中心)，Manassas, VA 20110-2209 USA(美國(guó)弗吉尼亞)
ATCC授權(quán)代忐簽字
____曰助2002年10月9 U
Ferris Lander先生
巻-;):2056.009 &關(guān)W序列"09/72736]為專禾lJ禾呈序的微生物《呆藏耳JU尋國(guó)際7"^i人的布達(dá)f風(fēng)其斤條纟勺
國(guó)際表
才、艮J居第7.3條發(fā)布的f散生物^f呆藏i正明以及 才、艮J居第10.2條發(fā)布的^效生物存;、舌聲明
(譯文)
致(保藏人或代理人名稱及地址)
Arius Research Inc.(阿里烏斯研究公司)
f^理人LisaCechetto
55 York Street, 16th Floor
Toronto, ONM5J 1R7
Canada
(加拿大多倫多) 代表Arius Research Inc.(阿里烏斯研究公司)而保藏
保藏人標(biāo)識(shí)號(hào) 小鼠雜交瘤細(xì)胞系1A245.6
所述保藏附有以下說(shuō)明的_科學(xué)性描述_建議的分類描述。
本國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)于2003年1月8閂收到所述保藏，并且所述保藏已被接受。
應(yīng)您的要求L 我們旌向您通知30年內(nèi)對(duì)所述菌種的請(qǐng)求。
如果布達(dá)佩斯條約成員國(guó)專利局證明某人有權(quán)收到該菌種，或者如果已出版引用該菌 種的美國(guó)專利，且美國(guó)專利與商標(biāo)局或本保藏人指示ATCC釋放該菌種，那么將可獲 得該菌種。
如果該培養(yǎng)物在所述保藏的有效期內(nèi)死亡或被破壞，那么您將負(fù)有用相同的活培養(yǎng)物 代替它的責(zé)任。
在自保藏閂起至少30年內(nèi)，或者在最近的樣品請(qǐng)求之后5年內(nèi)，該菌種將被維持， 所述時(shí)間以較長(zhǎng)者為準(zhǔn)。關(guān)國(guó)和其他很多國(guó)家都是布達(dá)佩斯條約成員國(guó)。
于2003年1月27 R檢測(cè)以上所引用培養(yǎng)物的存活。在當(dāng)天，所述培養(yǎng)物是存活的。
國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)American Type Culture Collection(關(guān)國(guó)典型微生物保藏中心)， Manassas, VA 20110-2209 USA(美國(guó)弗吉尼亞)
ATCC授權(quán)代表簽字
_ 眺2003年2 W Ij己
Ferris Lander先生 巻"2056.018
專利保藏指定 PTA-4889為專禾，J禾呈序的微生物l呆藏耳又《尋國(guó)P示7T"人的布達(dá)f風(fēng)其斤條纟勺
國(guó)際表
才、艮J居第7.3條發(fā)布的微生物〗呆藏i正明以及 豐艮J居第10.2條發(fā)布的f散生物存;、舌聲明
(譯文)
致(保藏人或代理人名稱及地址)
Arius Research Inc.(阿里烏斯研究公司)
代理人LisaCechetto
55 York Street, 16th Floor
Toronto, ONM5J 1R7
Canada
(加拿大多倫多) 代表Arius Research Inc.(阿里烏斯研究公司)而保藏 保藏人標(biāo)識(shí)號(hào)
小鼠雜交瘤細(xì)胞系7BD-33-11A
所述保藏附有以下說(shuō)明的_科學(xué)性描述_建議的分類描述。
本國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)于2003年1月8 R收到所述保藏，并且所述保藏己被接受。
應(yīng)您的要求L 我們旌向您通知30年內(nèi)對(duì)所述菌種的請(qǐng)求。
如果布達(dá)佩斯條約成員國(guó)專利局證明某人有權(quán)收到該菌種，或者如果已出版引用該菌 種的美國(guó)專利，且美國(guó)專利與商標(biāo)局或本保藏人指示ATCC釋放該菌種，那么將可獲 得該菌種。
如果該培養(yǎng)物在所述保藏的有效期內(nèi)死亡或被破壞，那么您將負(fù)有用相同的活培養(yǎng)物 代替它的責(zé)任。
在自保藏H起至少30年內(nèi)，或者在最近的樣品請(qǐng)求之后5年內(nèi)，該菌種將被維持， 所述時(shí)間以較長(zhǎng)者為準(zhǔn)。美國(guó)和其他很多國(guó)家都是布達(dá)佩斯條約成員國(guó)。
于2003年1月19閂檢測(cè)以上所引用培養(yǎng)物的存活。在當(dāng)天，所述培養(yǎng)物是存活的。
國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)American Type Culture Collection(美國(guó)典型微生物保藏中心)， Manassas, VA20110-2209 USA(美國(guó)弗吉尼亞)
ATCC授權(quán)代表簽字
__N期2003年2爿11 II
Ferris Lander先生 巻'4: 2056.018
專利保藏指定 PTA-4890加拿大公共衛(wèi)生部國(guó)立微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室
加拿大馬尼托巴省溫尼伯市阿林頓街1015 電話(204)789-2070
R3E 3R2_傳真(204)789-2097
國(guó)際IDAC/BP/4表
微生物保藏證明(譯文)
(根據(jù)布達(dá)佩其開(kāi)條約第7.1條發(fā)布)
所附文件為原始保藏合同與活存聲明的副本 1 、 國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)接受了以下具體描述的微生物 保藏人姓名Valerie Harris (哈里斯'瓦萊麗)
地址 ARIUS Research Inc., 55 York Street, Suite 1600, Toronto, ON M5J 1R7
(加拿大多倫多阿里烏斯研究公司) 提交日期2005年12月14閂
2、 保藏的標(biāo)識(shí)
保藏人對(duì)培養(yǎng)物指定的名稱和符號(hào)
7BDI-58
由該國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào):
141205-01
以上標(biāo)識(shí)的保藏附有
□科學(xué)性描述
□建議的分類指定
3、國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)IDAC授權(quán)代表^^
圓:2005年12月14 1:1加拿大公共衛(wèi)生部國(guó)立微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室
加拿大馬尼托巴省溫尼伯市阿林頓街1015 電話(204)789-2070
R3E 3R2_傳真(204)789-2097
國(guó)際ID AC/BP/9表
微生物保藏存活證明譯文
(根據(jù)布達(dá)佩其斤條約第10.2條發(fā)布)
致
姓名Ferris Lander先生
地址2855 PGA Boulevard, Palm Beach Gardens, Florida, USA 33410
(美國(guó)佛羅里達(dá))
1.保藏人
姓名Valerie Harris (哈里斯'瓦萊麗、
地址ARIUS Research Inc., 55 York Street, Suite 1600, Toronto, ON M5J 1R7
(加拿大多倫多阿里烏斯研究公司)
2.保藏標(biāo)識(shí):
由國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào)141205-01
保藏閂期(或最近相關(guān)閂期)2005年12月14閂
3.存活檢測(cè)
于(最近檢測(cè)円期)對(duì)以上標(biāo)識(shí)的微生物進(jìn)行存活檢測(cè) 在以上指出的閂期，所述微生物
0存活
□不再存活
進(jìn)行存活檢測(cè)的條件(在已請(qǐng)求該信息且檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)填寫(xiě)):
4.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)授權(quán)代表簽字:
隱2006年1月9 R加拿大公共衛(wèi)生部國(guó)立微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室
加拿大馬尼托巴省溫尼伯市阿林頓街1015 電話(204)789-2070
R3E 3R2_傳真(204)789-2097
國(guó)際IDAC/BP/4表
微生物保藏證明(譯文)
(根據(jù)布達(dá)佩其斤條約第7.1條發(fā)布)
所附文件為原始保藏合同與活存聲明的副本
1. 國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)接受了以下具體描述的微生物 保藏人姓名Valerie Harris (哈里斯'瓦萊麗)
;t也i止 ARIUS Research Inc., 55 York Street, Suite 1600, Toronto, ON, M5J 1R7
(加拿大多倫多阿里烏斯研究公司) 提交閂期2005年12月14閂
2. 保藏的標(biāo)識(shí)
保藏人對(duì)培養(yǎng)物指定的名稱和符號(hào)
AR51A994.1
由該國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào):
141205-06
以上標(biāo)識(shí)的保藏附有
□科學(xué)性描述
□建議的分類指定
3.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)IDAC授權(quán)代表簽！
閂期2005年12月14閂加拿大公共衛(wèi)生部國(guó)立微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室
加拿大馬尼托巴省溫尼伯市阿林頓街1015 電話(204)789-2070
R3E3R2_傳真(204)789-2097
國(guó)際IDAC/BP/9表
微生物保藏存活證明譯文
(根據(jù)布達(dá)佩其斤條約第10.2條發(fā)布)
致
姓名Ferris Lander先生
地址2855 PGA Boulevard, Palm Beach Gardens, Florida, USA 33410
(美國(guó)佛羅里達(dá))
1.保藏人
姓名Valerie Harris (哈里斯'瓦萊麗)
地址ARIUS Research Inc., 55 York Street, Suite 1600, Toronto, ON, M5J 1R7
(加拿大多倫多阿里烏斯研究公司)
2.保藏標(biāo)識(shí)
由國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào)141205-06
保藏閂期(或最近相關(guān)n期)2005年12月14 R
3.存活檢測(cè):
于(最近檢測(cè)日期)對(duì)以上標(biāo)識(shí)的微生物進(jìn)行存活檢測(cè) 在以上指出的閂期，所述微牛:物
0存活
□不再存活
進(jìn)行存活檢測(cè)的條件(在已請(qǐng)求該信息且檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)填寫(xiě)): 4.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)授權(quán)代表簽字_
閂期2006年1月09閂
權(quán)利要求
1. 分離的單克隆抗體，所述抗體由以保藏號(hào)141205-01保藏在IDAC的克隆編碼。
2. 如權(quán)利要求1所述的抗體，所述抗體是人源化的。
3. 如權(quán)利要求l所述的抗體，所述抗體是嵌合的。
4. 由以保藏號(hào)141205-01保藏在IDAC的分離的克隆。
5. 引發(fā)抗體誘導(dǎo)的選自人類肺瘤的組織樣本中癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性作 用的方法，其包括提供來(lái)自所述人類腫瘤的組織樣本；提供由以保藏號(hào)141205-01保藏在IDAC的克隆編碼的分離的單克隆 抗體或者其細(xì)胞的細(xì)胞毒性誘導(dǎo)配體，所述配體的特征在于具有竟?fàn)幮?抑制所述分離的單克隆抗體與其靶抗原結(jié)合的能力；以及將所述分離的單克隆抗體或者其細(xì)胞的細(xì)胞毒性誘導(dǎo)配體與所述組 織樣本接觸；其中所述分離的單克隆抗體或者其細(xì)胞的細(xì)胞毒性誘導(dǎo)配體與所述 組織樣本的結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。
6. 如權(quán)利要求1所述的分離的單克隆抗體的配體。
7. 如權(quán)利要求2所述的人源化抗體的配體。
8. 如權(quán)利要求3所述的嵌合抗體的配體。
9. 如權(quán)利要求1、 2、 3、 6、 7或者8中的任一項(xiàng)所述的分離的抗體 或配體，所述抗體或配體與選自細(xì)胞毒部分、酶、放射性化合物和造血細(xì)胞的成員偶聯(lián)。
10. 治療哺乳動(dòng)物中對(duì)抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用敏感的人類 腫瘤的方法，其中所述人類肺瘤表達(dá)與分離的單克隆抗體或者其細(xì)胞的 細(xì)胞毒性誘導(dǎo)配體特異結(jié)合的抗原，所述分離的單克隆抗體由以保藏號(hào)141205-01保藏在IDAC的克隆編碼，所述配體的特征在于具有竟?fàn)幮砸种扑龇蛛x的單克隆抗體與其靶抗原結(jié)合的能力，所述方法包括給予所 述哺乳動(dòng)物有效誘導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用從而減輕所述哺乳動(dòng)物的腫瘤負(fù)荷的量的所述單克隆抗體或者所述其細(xì)胞的細(xì)胞毒性誘導(dǎo)配體。
11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述單克隆抗體或配體與細(xì)胞 毒部分偶聯(lián)。
12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述細(xì)胞毒部分是放射性同位素。
13. 如權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述單克隆抗體或配體活化補(bǔ)體。
14. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述單克隆抗體或配體介導(dǎo)抗 體依賴的細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。
15. 如權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述單克隆抗體是人源化的。
16. 如權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述單克隆抗體是嵌合的。
17. 分離的單克隆抗體，所述抗體由以保藏號(hào)141205-06保藏在 ID AC的克隆編碼。
18. 如權(quán)利要求17所述的抗體，所述抗體是人源化的。
19. 如權(quán)利要求17所述的抗體，所述抗體是嵌合的。
20. 由以保藏號(hào)141205-06保藏在IDAC的分離的克隆。
21. 引發(fā)抗體誘導(dǎo)的選自人類腫瘤的組織樣品中癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性 作用的方法，其包括提供來(lái)自所述人類腫瘤的組織樣本；提供由以保藏號(hào)141205-06保藏在IDAC的克隆編碼的分離的單克隆抗體或者其細(xì)胞的細(xì)胞毒性誘導(dǎo)配體，所述配體的特征在于具有竟?fàn)幮?抑制所述分離的單克隆抗體與其靶抗原結(jié)合的能力；以及將所述分離的單克隆抗體或者其細(xì)胞的細(xì)胞毒性誘導(dǎo)配體與所述組 織樣本4妄觸；其中所述分離的單克隆抗體或其細(xì)胞的細(xì)胞毒性誘導(dǎo)配體與所述組 織樣本的結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。
22. 如權(quán)利要求17所述的分離的單克隆抗體的配體。
23. 如權(quán)利要求18所述的人源化抗體的配體。
24. 如權(quán)利要求19所述的嵌合抗體的配體。
25. 如4又利要求17、 18、 19、 22、 23或24中的任一項(xiàng)所述的分離的 抗體或抗原配體，所述抗體或抗原配體與選自細(xì)胞毒部分、酶、放射性 化合物和造血細(xì)胞的成員偶聯(lián)。
26. 治療哺乳動(dòng)物中對(duì)抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用敏感的人類 腫瘤的方法，其中所述人類腫瘤表達(dá)與分離的單克隆抗體或其細(xì)胞的細(xì) 胞毒性誘導(dǎo)配體特異結(jié)合的抗原，所述分離的單克隆抗體由以保藏號(hào) 141205-06保藏在1DAC的克隆編碼，所述配體的特征在于具有竟?fàn)幮砸种扑龇蛛x的單克隆抗體與其靶抗原結(jié)合的能力，所述方法包括給予所 述哺乳動(dòng)物有效-誇導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用^v而減輕所述哺乳動(dòng)物的腫瘤 負(fù)荷的量的所述單克隆抗體或所述其細(xì)胞的細(xì)胞毒性誘導(dǎo)配體。
27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述單克隆抗體或者配體與細(xì) 胞毒部分偶聯(lián)。
28. 如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述細(xì)胞毒部分是放射性同位素。
29. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述單克隆抗體或者配體活化 補(bǔ)體。
30. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述單克隆抗體或者配體介導(dǎo) 抗體依賴的細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。
31. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述單克隆抗體是人源化的。
32. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述單克隆抗體是嵌合的。
33. 分離的單克隆抗體，所述抗體由以保藏號(hào)PTA-4623保藏在 ATCC的克隆編碼。
34. 如權(quán)利要求33所述的抗體，所述抗體是人源化的。
35. 如權(quán)利要求33所述的抗體，所述抗體是嵌合的。
36. 由以保藏號(hào)PTA-4623保藏在ATCC的分離的克隆。
37. 引發(fā)抗體誘導(dǎo)的選自人類紳瘤的組織樣品中癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用的方法，其包括提供來(lái)自所述人類腫瘤的組織樣本；提供由以保藏號(hào)PTA-4623保藏在ATCC的克隆編碼的分離的單克 隆抗體或者其細(xì)胞的毒性誘導(dǎo)配體，所述配體的特征在于具有竟?fàn)幮砸?制所述分離的單克隆抗體與其靶抗原結(jié)合的能力；以及將所述分離的單克隆抗體或其細(xì)胞的細(xì)胞毒性誘導(dǎo)配體與所述組織 樣本接觸；其中所述分離的單克隆抗體或其細(xì)胞的細(xì)胞毒性誘導(dǎo)配體與所述組 織樣本的結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。
38. 如權(quán)利要求33所述的分離的單克隆抗體的配體。
39. 如權(quán)利要求34所述的人源化抗體的配體。
40. 如權(quán)利要求35所述的嵌合抗體的配體。
41. 如權(quán)利要求33、 34、 35、 38、 39或40中的任一項(xiàng)所述的分離的 抗體或者配體，所述抗體或者配體與選自細(xì)胞毒部分、酶、放射性化合 物和造血細(xì)胞的成員偶聯(lián)。
42. 治療哺乳動(dòng)物中對(duì)抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用敏感的人類 腫瘤的方法，其中所述人類腫瘤表達(dá)與分離的單克隆抗體或者其細(xì)胞的 細(xì)胞毒性誘導(dǎo)配體特異結(jié)合的抗原，所述分離的單克隆抗體由以保藏號(hào) PTA-4623保藏在ATCC的克隆編碼，所述配體的特征在于具有竟?fàn)幮砸?制所述分離的單克隆抗體與其靶抗原結(jié)合的能力，所述方法包括給予所 述哺乳動(dòng)物有效誘導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用從而減輕所述哺乳動(dòng)物的腫瘤負(fù)荷的量的所述單克隆抗體或所述其細(xì)胞的細(xì)胞毒性誘導(dǎo)配體。
43. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述單克隆抗體或配體與細(xì)胞 毒部分偶聯(lián)。
44. 如^l利要求43所述的方法，素。
45. 如權(quán)利要求42所述的方法，體。
46. 如權(quán)利要求42所述的方法， 體依賴的細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。
47. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述細(xì)胞毒部分是放射性同位其中所述單克隆抗體或配體活化補(bǔ)其中所述單克隆抗體或配體介導(dǎo)抗其中所述單克隆抗體是人源化的。
48. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述單克隆抗體是嵌合的。
49. 能夠特異性結(jié)合于人CD63的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體 與人CD63的一個(gè)或多個(gè)表位反應(yīng)，所述表位與獲自雜交瘤細(xì)胞系 H460-22-l的單克隆抗體與之反應(yīng)的表位相同，所述雜交瘤細(xì)胞系的 ATCC保藏號(hào)為PTA-4622。
50. 能夠特異性結(jié)合于人CD63的單克隆抗體或配體，其中所述單克 隆抗體或其配體與人CD63的一個(gè)或者多個(gè)表位反應(yīng)，所述表位與獲自 具有ATCC保藏號(hào)PTA-4889的雜交瘤細(xì)胞系1A245.6的分離的單克隆抗 體與之反應(yīng)的表位相同；所述單克隆抗體或配體的特征在于具有竟?fàn)幮?抑制所述分離的單克隆抗體與其人CD63靶抗原結(jié)合的能力。
51. 能夠特異性結(jié)合于人CD63的單克隆抗體或配體，其中所述單克 隆抗體或其配體與人CD63的一個(gè)或者多個(gè)表位反應(yīng)，所述表位與獲自 具有ATCC保藏號(hào)PTA-4890的雜交瘤細(xì)胞系7BD-33-11A的分離的單克 隆抗體與之反應(yīng)的表位相同；所述單克隆抗體或者配體的特征在于具有竟?fàn)幮砸种扑龇蛛x的單克隆抗體與其人CD63靶抗原結(jié)合的能力。
52. 能夠特異性結(jié)合于人CD63的單克隆抗體或配體，其中所述單克 隆抗體或其配體與人CD63的一個(gè)或者多個(gè)表位反應(yīng)，所述表位與獲自 具有ATCC保藏號(hào)PTA-4623的雜交瘤細(xì)胞系7BDI-60的分離的單克隆 抗體與之反應(yīng)的表位相同；所述單克隆抗體或者配體的特征在于具有竟?fàn)幮砸种扑龇蛛x的單克隆抗體與其人CD63靶抗原結(jié)合的能力。
53. 能夠特異性結(jié)合于人CD63的單克隆抗體或配體，其中所述單克 隆抗體或其配體與人CD63的一個(gè)或者多個(gè)表位反應(yīng)，所述表位與獲自 具有IDAC保藏號(hào)141205-01的雜交瘤細(xì)胞系7BDI-58的分離的單克隆抗 體與之反應(yīng)的表位相同；所述單克隆抗體或配體的特征在于具有竟?fàn)幮?抑制所述分離的單克隆抗體與其人CD63靶抗原結(jié)合的能力。
54. 能夠特異性結(jié)合于人CD63的單克隆抗體或配體，其中所述單克 隆抗體或其配體與人CD63的一個(gè)或者多個(gè)表位反應(yīng)，所述表位與獲自 具有IDAC保藏號(hào)141205-06的雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)R51A994.1的分離的單克隆抗體與之反應(yīng)的表位相同；所述單克隆抗體或配體的特征在于具有竟?fàn)幮砸种扑龇蛛x的單克隆抗體與其人CD63靶抗原結(jié)合的能力。
55. 與選自下列組的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體識(shí)別相同的 一個(gè)或者 多個(gè)表位的單克隆抗體或者配體，所述組由具有ATCC保藏號(hào)PTA-4622 的雜交瘤細(xì)胞系H460-22-1 、具有ATCC保藏號(hào)PTA-4889的雜交瘤細(xì)胞 系1A245.6、具有ATCC保藏號(hào)PTA-4890的雜交瘤細(xì)胞系7BD-33-llA、 具有ATCC保藏號(hào)PTA-4623的雜交瘤細(xì)胞系7BDI-60、具有IDAC保藏 號(hào)141205-01的雜交瘤細(xì)胞系7BDI-58和具有IDAC保藏號(hào)141205-06的 雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)R51A994.1組成。
56. 治療表達(dá)人CD63抗原的人癌性肺瘤的方法，所述方法包括 給予患有所述人類癌癥的個(gè)體至少一種單克隆抗體或配體，所述單克隆抗體或配體與由雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體識(shí)別相同的 一個(gè)或多個(gè)表位，所述雜交瘤選自具有ATCC保藏號(hào)PTA-4622的雜交瘤細(xì)胞 系H460陽(yáng)22-l，具有ATCC保藏號(hào)PTA-4889的雜交瘤細(xì)胞系1A245.6, 具有ATCC保藏號(hào)PTA-4890的雜交瘤細(xì)胞系7BD-33-11A,具有ATCC 保藏號(hào)PTA-4623的雜交瘤細(xì)胞系7BDI-60，具有IDAC保藏號(hào)141205-01 的雜交瘤細(xì)胞系7BDI-58和具有IDAC保藏號(hào)141205-06的雜交瘤細(xì)胞系 AR51A994.1;其中所述一個(gè)或多個(gè)表位的結(jié)合有效降低腫瘤負(fù)荷。
57. 治療表達(dá)人CD63抗原的人癌性腫瘤的方法，所述方法包括 給予患有所述人類癌癥的個(gè)體至少 一種單克隆抗體或配體，所述單克隆抗體或配體與由雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體識(shí)別相同的一個(gè)或 多個(gè)表位，所述雜交瘤選自具有ATCC保藏號(hào)PTA-4622的雜交瘤細(xì)胞 系H460陽(yáng)22-l，具有ATCC保藏號(hào)PTA-4889的雜交瘤細(xì)胞系1A245.6, 具有ATCC保藏號(hào)PTA-4890的雜交瘤細(xì)胞系7BD-33-llA，具有ATCC 保藏號(hào)PTA-4623的雜交瘤細(xì)胞系7BDI-60,具有IDAC保藏號(hào)141205-01 的雜交瘤細(xì)胞系7BDI-58和具有IDAC保藏號(hào)141205-06的雜交瘤細(xì)胞系 AR51A994.1;所述單克隆抗體或配體與至少 一種化療劑聯(lián)用； 其中所述給藥有效降低腫瘤負(fù)荷。
58. 確定在靈長(zhǎng)類動(dòng)物組織樣本中表達(dá)CD63的一個(gè)或多個(gè)表位的細(xì)胞存在的結(jié)合分析，所述分析包括提供來(lái)自所述靈長(zhǎng)類動(dòng)物的組織樣本；提供至少一種單克隆抗體或配體，所述單克隆抗體或配體與由雜交 瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體識(shí)別相同的一個(gè)或多個(gè)表位，所述雜交瘤選 自具有ATCC保藏號(hào)PTA-4622的雜交瘤細(xì)胞系H460-22-l ，具有ATCC 保藏號(hào)PTA-4889的雜交瘤細(xì)胞系1A245.6,具有ATCC保藏號(hào)PTA-4890 的雜交瘤細(xì)胞系7BD-33-llA，具有ATCC保藏號(hào)PTA-4623的雜交瘤細(xì) 胞系7BDI-60,具有IDAC保藏號(hào)141205-01的雜交瘤細(xì)胞系7BDI-58和 具有IDAC保藏號(hào)141205-06的雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)R51A994.1;將所述至少一種單克隆抗體或其配體與所述靈長(zhǎng)類動(dòng)物組織樣本接觸；以及確定所述至少一種單克隆抗體或其配體與所述靈長(zhǎng)類動(dòng)物組織樣本的結(jié)合；由此指示所述細(xì)胞在所述靈長(zhǎng)類動(dòng)物組織樣本中的存在。
59.確定在選自人類腫瘤的組織樣品中表達(dá)CD63的一個(gè)或多個(gè)表 位的癌性細(xì)胞存在的結(jié)合分析，所述分析包括提供來(lái)自所述人類腫瘤的組織樣本；提供至少一種單克隆抗體或者配體，所述單克隆抗體或配體與由雜 交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體識(shí)別相同的一個(gè)或者多個(gè)表位，所述雜交 瘤選自具有ATCC保藏號(hào)PTA-4622的雜交瘤細(xì)胞系H460-22-1,具有 ATCC保藏號(hào)PTA-4889的雜交瘤細(xì)胞系1A245.6,具有ATCC保藏號(hào) PTA-4890的雜交瘤細(xì)胞系7BD-33-llA，具有ATCC保藏號(hào)PTA-4623 的雜交瘤細(xì)胞系7BDI-60，具有IDAC保藏號(hào)141205-01的雜交瘤細(xì)胞系 7BDI-58和具有IDAC保藏號(hào)141205-06的雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)R51A994.1;將所述至少一種單克隆抗體或其配體與所述組織樣本接觸；以及確定所述至少一種單克隆抗體或其配體與所述組織樣本的結(jié)合；由此指示所述癌細(xì)胞在所述組織樣本中的存在。
全文摘要
本發(fā)明涉及癌性疾病的診斷和治療，尤其涉及腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用的介導(dǎo)；最尤其涉及癌性疾病調(diào)節(jié)抗體(CDMAB)作為引發(fā)細(xì)胞毒性反應(yīng)的手段的用途，所述CDMAB任選地與一種或者多種化療劑聯(lián)用。本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明CDMAB的結(jié)合分析。
文檔編號(hào)C07K16/30GK101421395SQ200780012743
公開(kāi)日2009年4月29日 申請(qǐng)日期2007年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月24日
發(fā)明者保羅·亨頓, 克瑞斯蒂恩·羅格斯, 山喀爾·庫(kù)馬爾, 戴德·薩耶和, 戴維·S·F·揚(yáng), 海倫·P·芬德利, 蘇姍·E·哈恩, 路易斯·A·G·唐克魯茲 申請(qǐng)人:阿里烏斯研究公司