專利名稱：：核酸保護(hù)基的脫離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及對于核糖的2'位羥基被下述取代基(I)保護(hù)、3'位羥基和5'位羥基被硅保護(hù)基保護(hù)的核糖核酸衍生物，除去核糖的3'位羥基和5'位羥基的硅保護(hù)基的方法。(I)式(I)中，WGi表示吸電子基團(tuán)。作為WGi的吸電子基團(tuán)，可例舉例如氰基、硝基、烷基磺酰基、芳基磺?；Ⅺu素。其中優(yōu)選氰基。作為WGi的垸基磺?；耐榛糠?，可例舉例如直鏈狀或支鏈狀的碳數(shù)15的烷基。具體可例舉例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、叔戊基。作為W&的芳基磺?；姆蓟糠?，可例舉例如碳數(shù)612的芳基。具體可例舉例如苯基、l-萘基、2-萘基、聯(lián)苯基。該芳基可被取代，作為該取代基，可例舉例如鹵素、烷基、烷氧基、氰基、硝基，它們可在任意位置取代有13個(gè)。
背景技術(shù)：
：眾所周知，低聚核糖核酸(低聚RNA)作為基因分析的RNA探針、RNA藥物原材料(反義RNA、核酶、利用了RNAi的基因表達(dá)控制)、人工酶、適體有用。作為用于制造低聚RNA的試劑，已知的有核糖的2'位羥基被中性條件下可脫離的2-氰基乙氧基甲基(CEM基)取代的亞磷酰胺化合物(非專利文獻(xiàn)1)。此外，作為用于制造低聚RNA的試劑，和田等人還提供了例如在2'位羥基導(dǎo)入了l-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE基)的亞磷酰胺化合物(非專利文獻(xiàn)2、非專利文獻(xiàn)3)。據(jù)和田等人報(bào)道，在制造該亞磷酰胺化合物的過程中，為了脫離保護(hù)核糖的3'位羥基和5，位羥基的二硅氧垸基(-乂口年^/k基)，可使用氟化劑(氟化四丁基銨(以下稱為TBAF))、三乙胺三氫氟酸鹽、氫氟酸吡啶等)和酸(乙酸、鹽酸、硫酸)的任意的混合比的混合試劑(專利文獻(xiàn)1)。但是，實(shí)施例中僅有使用TBAF和乙酸的混合試劑進(jìn)行二硅氧烷基的脫保護(hù)的例子。此外，據(jù)實(shí)吉等人報(bào)道，在制造2'位羥基被2-氰基乙基取代的亞磷酰胺化合物的過程中，為了脫離保護(hù)核糖的3'位羥基和5，位羥基的二硅氧垸基，可使用三乙胺三氫氟酸鹽和三乙胺的1:0.5的混合比的混合試劑(非專利文獻(xiàn)4)。專利文獻(xiàn)l:國際公報(bào)W02005/023828Al文本非專利文獻(xiàn)l:大木等，ORGANICLETTERS,Vol,7,3477(2005)非專利文獻(xiàn)2:和田猛，BIOINDUSTRY,Vol.21，No.1，17(2004)非專禾U文獻(xiàn)3:T.Umemoto等，TetrahedronLetters,Vol.45，9529(2004)非專利文獻(xiàn)4:實(shí)吉尚郎等，JornalofOrganicChemistry,70,10453(2005)發(fā)明的揭示本發(fā)明的目的主要是提供對于核糖的2'位羥基被下述取代基(I)保護(hù)、3'位羥基和5'位羥基被硅保護(hù)基保護(hù)的核糖核酸衍生物，高效地將保護(hù)核糖的3'位羥基和5'位羥基的硅取代基脫離的方法。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>(I)式(i)中，WG^n前所述。本發(fā)明者為了實(shí)現(xiàn)上述目的而進(jìn)行了認(rèn)真探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過使以下的通式(2)表示的叔胺和氫氟酸的鹽或叔胺和氫氟酸的混合物作用于以下的通式(l)表示的核糖核酸衍生物，可高效地制造以下的通式(3)表示的核糖核酸衍生物，藉此完成了本發(fā)明。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>式(l)、(2)及(3)中，Bz表示可具有保護(hù)基的核酸堿基或其修飾體，WG1如前所述，R7a、R7b、R"分別相同或不同，表示烷基，或者R73、R7b、R"表示與鄰接的氮原子一起形成的2環(huán)性飽和氨基環(huán)基，x表示130的范圍內(nèi)的數(shù)，A表示以下的通式(4a)或(4b)表示的硅取代基，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>式(4a)及(4b)中，R6表示垸基。Bz的核酸堿基只要是被用于核酸的合成的堿基即可，無特別限定，例如可例舉胞嘧啶、尿嘧唆等嘧啶堿基，腺嘌呤、鳥嘌呤等嘌呤堿基。Bz的核酸堿基可被保護(hù)，其中具有氨基的核酸堿基，例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶，其氨基最好被保護(hù)。作為該氨基的保護(hù)基，只要是作為核酸的保護(hù)基使用的基團(tuán)即可，無特別限定，具體可例舉例如苯甲?；?-甲氧基苯甲?；?、乙酰基、丙?；⒍□；?、異丁?；⒈交阴；?、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙?；?-異丙基苯氧基乙?；?二甲基氨基)亞甲基。Bz的修飾體是指核酸堿基被任意的取代基取代而得的基團(tuán)，作為該取代基，可例舉例如鹵素、?；?、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基垸基、羥基、氨基、一垸基氨基、二垸基氨基、羧基、氰基、硝基，它們在任意的位置取代有13個(gè)。作為Bz的修飾體中的鹵素，可例舉例如氟、氯、溴、碘。作為Bz的修飾體中的?；?，可例舉例如直鏈狀或支鏈狀的碳數(shù)16的垸?；?、碳數(shù)713的芳酰基。具體可例舉例如甲?；⒁阴；?、正丙?；惐；?、正丁?；?、異丁?；?、叔丁?；?、戊?；?、己酰基、苯甲酰基、萘甲?；?、乙酰丙?；?。作為Bz的修飾體中的烷基，可例舉例如直鏈狀或支鏈狀的碳數(shù)15的垸基。具體可例舉例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、叔戊基。該烷基可被取代，作為該取代基，可例舉例如鹵素、垸基、垸氧基、氰基、硝基，它們可在任意的位置取代有3個(gè)。Bz的修飾體中的芳烷基、烷氧基烷基、一烷基氨基、二烷基氨基及垸基磺?；耐榛糠挚衫e與上述垸基相同的基團(tuán)。作為Bz的修飾體中的烷氧基，可例舉例如直鏈狀或支鏈狀的碳數(shù)14的垸氧基。具體可例舉例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基。其中較好的是碳數(shù)13的烷氧基，特好的是甲氧基。Bz的修飾體中的垸氧基烷基的垸氧基部分可例舉與上述垸氧基相同的基團(tuán)。Bz的修飾體中的芳烷基的芳基部分可例舉例如碳數(shù)612的芳基。具體可例舉例如苯基、1-萘基、2-萘基、聯(lián)苯基等。該芳基可被取代，作為該取代基，可例舉例如鹵素、垸基、烷氧基、氰基、硝基，它們可在任意的位置取代有13個(gè)。作為Bz的修飾體中的垸基、芳基的取代基的鹵素、垸基及垸氧基，可分別例舉與上述相同的基團(tuán)。作為R6的烷基，可例舉例如直鏈狀或支鏈狀的碳數(shù)15的烷基。具體可例舉例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、叔戊基。作為可在本發(fā)明中使用的叔胺和氫氟酸的鹽或叔胺和氫氟酸的混合物，可例舉例如上述通式(2)表示的叔胺和氫氟酸的鹽或在合適的溶劑中叔胺和氫氟酸以任意比混合而得的混合物。作為R73、R7b、Rje的烷基，可例舉與Bz的修飾體中的烷基相同的基團(tuán)。作為R^、R7b、R"的2環(huán)性飽和氨基環(huán)基，可例舉例如奎寧環(huán)、三亞乙基二胺。x表示130的范圍內(nèi)的數(shù)，可以不是整數(shù)，優(yōu)選215的范圍內(nèi)的數(shù)，更好為310的范圍內(nèi)的數(shù)。作為本發(fā)明所用的叔胺，可例舉例如三甲胺、三乙胺、三丙胺、三丁胺、N,N-二異丙基乙胺、奎寧環(huán)、三亞乙基二胺。作為本發(fā)明的叔胺和氫氟酸的鹽，可例舉例如三甲胺三氫氟酸鹽、三甲胺四氫氟酸鹽、三甲胺五氫氟酸鹽、三甲胺六氫氟酸鹽、三甲胺五氫氟酸鹽、三乙胺二氫氟酸鹽、三乙胺三氫氟酸鹽、三乙胺四氫氟酸鹽、三乙胺26氫氟酸鹽、奎寧環(huán)三氫氟酸鹽、三亞乙基二胺四氫氟酸鹽(參照例如，分子結(jié)構(gòu)期刊(JournalMolecularStructure)，193，247(1989)，Pol.J.Chem,67(2)，281(1993)，歐洲化學(xué)期刊(Chemistry-AEuropeanJournal),4(6),1043(1998),氟化學(xué)期刊(JournalofFluorineChemistry),118(1-2)，123,(2002))。尤其好的是三乙胺三氫氟酸鹽。此外，作為可用于本發(fā)明的叔胺和氫氟酸的混合物，可例舉例如上述叔胺和氫氟酸在適當(dāng)?shù)娜軇?例如，THF、乙腈、甲醇、異丙醇、甲苯)中例如以1:11:30(叔胺氫氟酸)的混合比(摩爾比)混合而得的混合物。優(yōu)選以1:21:15(叔胺氫氟酸)的混合比(摩爾比)混合而得的混合物，更好是以1:31:10(叔胺氫氟酸)的混合比(摩爾比)混合而得的混合物。作為本發(fā)明，可例舉以下的通式(A)表示的亞磷酰胺化合物(以下稱為亞磷酰胺化合物(A))的制造方法，該方法包括通過使以下的通式(2)表示的叔胺和氫氟酸的鹽或叔胺和氫氟酸的混合物作用于以下的通式(l)表示的核糖核酸衍生物，將保護(hù)核糖的3，位羥基和5'位羥基的硅取代基脫離，從而制造以下的通式(3)表示的核糖核酸衍生物的工序。式(l)、(2)及(3)中，A、Bz、Il7a、R7b、R7c、WG1、x如前所述。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>(A)式(A)中，Bz、WGi如前所述，R2a、R^相同或不同，表示垸基或R2a、R2b表示與鄰接的氮原子一起形成的56元的飽和氨基環(huán)基，該飽和氨基環(huán)基除了氮原子以外可具有1個(gè)作為成環(huán)原子的氧原子或硫原子，WG2相同或不同，表示吸電子基團(tuán)，R'表示以下的通式(5)表示的取代基。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>(5)式(5)中，R11、R12、R"相同或不同，表示氫或烷氧基。作為R11、R12、R"的烷基，可例舉與上述Bz的修飾體中的垸基相同的基團(tuán)。作為Rh、R^的垸基，可例舉與上述Bz的修飾體中的烷基相同的基團(tuán)。作為R23、R^的56元飽和氨基環(huán)基，可例舉例如吡咯烷-1-基、哌啶-l-基、嗎啉-l-基、硫代嗎啉-l-基。作為WG2的吸電子基團(tuán)，可例舉與上述WG'的吸電子基團(tuán)相同的基團(tuán)。亞磷酰胺化合物(A)是核糖的2，位羥基被下述取代基(I)保護(hù)、3'位羥基和5'位羥基被硅保護(hù)基保護(hù)的亞磷酰胺化合物。此外，由于被導(dǎo)入2'位羥基的基團(tuán)是直鏈狀的取代基，與3'位的羥基結(jié)合的磷原子的周圍的空間不擁擠，因此與以往使用的亞磷酰胺化合物相比，在合成低聚RNA時(shí)具有縮合反應(yīng)在非常短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行、縮合收率良好的特點(diǎn)。通過使用亞磷酰胺化合物(A)，用與低聚DNA的制造大致相同的方法可制得高純度的低聚■。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>(I)式(I)中，WG'如前所述。這里，低聚DNA是指僅由脫氧核糖核酸(DNA)形成的低聚核酸。此外，本發(fā)明中的低聚RNA是指由核糖核酸(RNA)及脫氧核糖核酸(DNA)形成的低聚核酸，是含有至少1個(gè)核糖核酸(RNA)的低聚核酸。以下對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施發(fā)明的最佳方式以下所示的制法中，在原料具備對反應(yīng)有影響的取代基(例如，羥基、氨基、羧基)時(shí)，預(yù)先按照公知的方法用合適的保護(hù)基對原料進(jìn)行保護(hù)后再進(jìn)行反應(yīng)。最后可通過催化還原、堿處理、酸處理等公知方法將保護(hù)基脫離。I.本發(fā)明的亞磷酰胺化合物(A)的制法以下，詳述本發(fā)明的以下通式(A)表示的亞磷酰胺化合物(A)的制造方法(以下稱為本發(fā)明的亞磷酰胺的制造方法)。亞磷酰胺化合物(A)可由公知化合物或易制備的中間體通過實(shí)施例如以下的步驟a步驟f的操作而制得。以下進(jìn)行詳細(xì)說明。(l)步驟a:通過使垸基化試劑作用于以下的通式(6)表示的核糖核酸衍生物，制備在2，位羥基導(dǎo)入了中性條件下脫離的醚型保護(hù)基的下述通式(1)表示的核糖核酸衍生物的步驟。rw院^l^、o6ho。v。-^、鵬,(6)(1>式(1)及(6)中，Bz、A、WG'如前所述。垸基化試劑可例舉例如以下的通式(ll)表示的醚化合物。、0,U1)式(11)中，L表示鹵素、芳硫基、院基亞砜基或烷硫基，WG'如前所述。L所表示的鹵素、芳硫基中的芳基、垸基亞砜基及垸硫基中的垸基可例舉與上述BZ的修飾體中的鹵素、芳基、烷基相同的基團(tuán)。作為醚化合物(ll)的具體例，可例舉以下的1.2.的化合物。1.氯甲基2-氰基乙基醚2.2-氰基乙基甲硫基甲基醚醚化合物(11)是可在堿性條件下對2'位羥基導(dǎo)入中性條件下可脫離的醚型取代基的新的垸基化試劑，作為用于制備亞磷酰胺化合物(A)的試劑有用。醚化合物(ll)可通過實(shí)施以下的步驟1步驟4來制備。步驟1:將以下的通式(13)表示的醇化合物烷硫基甲基化，制備以下的通式(14)表示的化合物的步驟。(13)(14)式(13)及(14)中，WG'如前所述，R3表示垸基或芳基?；衔?14)是L為烷硫基的醚化合物(11)。R3所表示的烷基可例舉與上述Bz的修飾體中的垸基同樣的基團(tuán)。R3為甲基時(shí)，作為烷硫基甲基化試劑，可例舉例如二甲亞砜、乙酸酐及乙酸的混合溶液。二甲亞砜的用量相對于化合物(13)的摩爾量以10200倍摩爾量為宜，優(yōu)選20100倍摩爾量。乙酸的用量相對于化合物(13)的摩爾量以10150倍摩爾為宜，優(yōu)選20100倍摩爾量。乙酸酐的用量相對于化合物(13)的摩爾量以10150倍摩爾量為宜，優(yōu)選20100倍摩爾量。反應(yīng)溫度優(yōu)選0"C10(TC。反應(yīng)時(shí)間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以148小時(shí)為宜。步驟2:將化合物(14)鹵化，制備以下的通式(15)表示的化合物的步驟。R3八WG1-^X2、WG1(14)U5)式(14)及(15)中，WG1、R3如前所述，X2表示鹵素?；衔?14)是醚化合物(11)中的L為鹵素的化合物。X2所表示的鹵素可例舉與上述Bz的修飾體中的鹵素同樣的鹵素。本步驟可按照公知的方法(例如，T.Benneche等，Synthesis762(1983))實(shí)施。所用溶劑只要不會影響反應(yīng)即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲垸、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷等鹵代烴類。作為鹵化劑，可例舉例如硫酰氯、磷酰氯。鹵化劑的用量相對于化合物(14)的摩爾量以0.820倍摩爾量為宜，優(yōu)選110倍摩爾量。反應(yīng)溫度以0。C10(TC為宜。反應(yīng)時(shí)間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以30分鐘24小時(shí)為宜。步驟3:將化合物(15)芳硫基化，制備以下通式(16)表示的化合物的步驟。X2、WG1_^R3aSA0WGl(16)(15)式(15)及(16)中，WG1、X2如前所述，R3a表示芳基。化合物(16)是醚化合物(11)中的L為芳硫基的化合物。R"所表示的芳基可例舉與上述Bz的修飾體中的芳基同樣的基團(tuán)。本步驟可采用公知方法實(shí)施。所用溶劑只要不會影響反應(yīng)即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲烷、乙腈。作為芳硫基化試劑，可例舉例如苯硫酚、4-甲基苯硫醇。芳硫基化試劑的用量相對于化合物(15)的摩爾量以0.820倍摩爾量為宜，優(yōu)選15倍摩爾量。反應(yīng)溫度以0'C10(TC為宜。反應(yīng)時(shí)間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以148小時(shí)為宜。步驟4:將化合物(14)氧化，制備下述通式(17)表示的化合物的步驟。R3SA0WG1-^R3S、WG1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>式(14)及(17)中，WG1、R3如前所述?；衔?17)是醚化合物(11)中的L為烷基亞砜基的化合物。R3所表示的烷基可例舉與上述Bz的修飾體中的垸基相同的基團(tuán)。本步驟可采用公知方法實(shí)施。所用溶劑只要不會影響反應(yīng)即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲垸、氯仿、甲醇。作為氧化劑，可例舉例如間氯過苯甲酸、偏高碘酸鹽、過氧化氫。氧化劑的用量相對于化合物(14)的摩爾量以0.810倍摩爾量為宜，優(yōu)選12倍摩爾量。反應(yīng)溫度以0'CIO(TC為宜。反應(yīng)時(shí)間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以148小時(shí)為宜。烷基化試劑采用化合物(15)時(shí)，可如下實(shí)施。本步驟可按照公知方法，通過使烷基化試劑和堿作用于可作為市售品獲得或可按照文獻(xiàn)記載的方法合成的核糖核酸衍生物(6)而實(shí)施。所用溶劑只要不會影響反應(yīng)即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲垸、氯仿、四氯化碳、1,2-二氯乙垸等鹵代烴類。垸基化試劑的用量相對于核糖核酸衍生物(6)的摩爾量以0.820倍摩爾量為宜，優(yōu)選110倍摩爾量。本步驟中，也可根據(jù)需要使金屬試劑和堿作用于核糖核酸衍生物(6)，制得中間體后再使垸基化試劑與之作用。所述金屬試劑可例舉例如二氯化二丁基錫、氯化叔丁基鎂。金屬試劑的用量相對于核糖核酸衍生物(6)的摩爾量以0.820倍摩爾量為宜，優(yōu)選110倍摩爾量。作為堿，可例舉吡啶、2，6-二甲基吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、N-甲基咪唑、三乙胺、三丁胺、N，N-二異丙基乙胺、1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]-7-十一烯等有機(jī)堿。堿的用量相對于核糖核酸衍生物(6)的摩爾量以0.820倍摩爾量為宜，優(yōu)選110倍摩爾量。反應(yīng)溫度以0r12(TC為宜。反應(yīng)時(shí)間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以30分鐘24小時(shí)為宜。垸基化試劑采用化合物(14)或(16)時(shí)，可如下實(shí)施。本步驟可按照公知方法(例如，M.Matteucci，TetrahedronLetters,31巻，2385(1990))，通過使烷基化試劑、酸和針對于硫原子的鹵化劑作用于可作為市售品獲得或可按照文獻(xiàn)記載的方法合成的核糖核酸衍生物(6)而實(shí)施。烷基化試劑的用量相對于核糖核酸衍生物(6)的摩爾量以0.85倍摩爾量為宜，優(yōu)選13倍摩爾量。作為酸，可例舉例如三氟甲磺酸、三氟甲磺酸銀、三氟甲磺酸三甲基硅烷基酯。酸的用量相對于核糖核酸衍生物(6)的摩爾量以0.0120倍摩爾量為宜，優(yōu)選0.0210倍摩爾量。所用溶劑只要不會影響反應(yīng)即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙垸、苯、甲苯、二甲苯、四氫呋喃(以下稱為THF)、乙腈或它們的任意的混合溶劑。作為本步驟中所用的針對于硫原子的鹵化劑，可例舉例如N-溴琥珀酰亞胺(NBS)、N-碘琥珀酰亞胺(NIS)。針對于硫原子的鹵化劑的用量相對于核糖核酸衍生物(6)的摩爾量以0.810倍摩爾量為宜，優(yōu)選15倍摩爾量。反應(yīng)溫度以一78"C3(TC為宜。反應(yīng)時(shí)間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以5分鐘5小時(shí)為宜。烷基化試劑采用化合物(17)時(shí)，可如下實(shí)施。本步驟可按照公知方法，通過使烷基化試劑、酸酐和堿作用于可作為市售品獲得或可按照文獻(xiàn)記載的方法合成的核糖核酸衍生物(6)而實(shí)施。烷基化試劑的用量相對于核糖核酸衍生物(6)的摩爾量以0.85倍摩爾量為宜，優(yōu)選13倍摩爾量。作為酸酐，可例舉例如三氟甲磺酸酐、乙酸酐。酸酐的用量相對于核糖核酸衍生物(6)的摩爾量以0.0120倍摩爾量為宜，優(yōu)選O.0210倍摩爾量。作為堿，可例舉例如四甲基脲、三甲基吡啶。堿的用量相對于核糖核酸衍生物(6)的摩爾量以0.0120倍摩爾量為宜，優(yōu)選0.0210倍摩爾量。所用溶劑只要不會影響反應(yīng)即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲垸、氯仿、四氯化碳、1,2-二氯乙烷或它們的任意的混合溶劑。反應(yīng)溫度以一78。C30。C為宜。反應(yīng)時(shí)間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以5分鐘24小時(shí)為宜。(2)步驟b:與步驟a分別進(jìn)行，通過使二甲亞砜、乙酸和乙酸酐作用于核糖核酸衍生物(6)而制造下述通式(7)表示的核糖核酸衍生物的步驟。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>式(6)及(7)中，A、Bz如前所述。作為R6中的烷基，可例舉與上述Bz的修飾體中的垸基相同的基團(tuán)。本步驟可按照公知方法，通過使二甲亞砜、乙酸和乙酸酐作用于可作為市售品獲得或可按照文獻(xiàn)記載的方法合成的核糖核酸衍生物(6)而實(shí)施。二甲亞砜的用量相對于核糖核酸衍生物(6)的摩爾量以10200倍摩爾量為宜，優(yōu)選20100倍摩爾量。乙酸的用量相對于核糖核酸衍生物(6)的摩爾量以10150倍摩爾量為宜，優(yōu)選20100倍摩爾量。乙酸酐的用量相對于核糖核酸衍生物(6)的摩爾量以10150倍摩爾量為宜，優(yōu)選20IOO倍摩爾量。反應(yīng)溫度以1CTC5(TC為宜。反應(yīng)時(shí)間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以30分鐘24小時(shí)為宜。(3)步驟c:通過使下述通式(8)表示的醇化合物、酸和針對于硫原子的鹵化劑作用于步驟b制得的核糖核酸衍生物(7)，制備在2'位羥基導(dǎo)入了中性條件下脫離的醚型保護(hù)基的下述通式(l)表示的核糖核酸衍生物的步驟。9、r7hoWG1o<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>式(7)、(8)及(1)中，A、Bz、WG'如前所述。本步驟可按照公知方法，通過使醇化合物(8)、酸和針對于硫原子的鹵化劑作用于核糖核酸衍生物(7)而實(shí)施。所用溶劑只要不會影響反應(yīng)即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1,2-二氯乙垸、苯、甲苯、二甲苯、THF、乙腈或它們的任意的混合溶劑。醇化合物(8)的用量相對于核糖核酸衍生物(7)的摩爾量以0.820倍摩爾量為宜，優(yōu)選110倍摩爾量。作為酸，可例舉例如三氟甲磺酸、三氟甲磺酸銀、三氟甲磺酸三甲基硅烷基酯。作為針對于硫原子的鹵化劑，可例舉例如N-溴琥珀酰亞胺(NBS)、N-碘琥珀酰亞胺(NIS)。針對于硫原子的囟化劑的用量相對于核糖核酸衍生物(7)的摩爾量以0.l20倍摩爾量為宜，優(yōu)選0.210倍摩爾量。反應(yīng)溫度以一10(TC2(TC為宜。反應(yīng)時(shí)間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以5分鐘12小時(shí)為(4)步驟d:通過使以下的通式(2)表示的叔胺和氫氟酸的鹽或叔胺和氫氟酸的混合物作用于步驟a或步驟c制得的核糖核酸衍生物(1)，將保護(hù)核糖的3'位羥基和5'位羥基的硅取代基脫離，藉此制造下述通式(3)表示的核糖核酸衍生物的步驟。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>式(l)、(2)及(3)中，A、Bz、R7a、R7b、R7c、WG1、x如前所述。本步驟可通過將核糖核酸衍生物(1)溶于合適的溶劑，使如上述通式(2)的叔胺和氫氟酸的鹽或叔胺和氫氟酸的混合物與之反應(yīng)而實(shí)施。此外，也可根據(jù)情況使用在叔胺和氫氟酸的鹽或叔胺和氫氟酸的混合物中加入合適的酸而獲得的混合試劑來實(shí)施本步驟。作為可使用的酸，可例舉例如乙酸、鹽酸、硫酸。該酸的用量相對于核糖核酸衍生物(l)的摩爾量例如以0.810為宜，優(yōu)選11.5。作為可使用的溶劑，可例舉例如THF、乙腈、甲醇、異丙醇、甲苯。特好為THF、乙腈?？捎糜诒静襟E的叔胺和氫氟酸的鹽、叔胺和氫氟酸的混合物的用量根據(jù)核糖核酸衍生物(1)的種類或叔胺和氫氟酸的鹽、叔胺和氫氟酸的混合物、所用溶劑等有所不同，但相對于核糖核酸衍生物(l)的摩爾量，以110倍摩爾量為宜，較好為1.21.5倍摩爾量。反應(yīng)溫度以0'C8(TC為宜。反應(yīng)時(shí)間因核糖核酸衍生物的種類或所用的叔胺和氫氟酸的鹽、叔胺和氫氟酸的混合物、所用溶劑、反應(yīng)溫度等而異，通常以30分鐘10小時(shí)為宜。反應(yīng)結(jié)束后直接冷卻或在反應(yīng)混合物中加入適量的水后冷卻，藉此可作為析出物獲得核糖核酸衍生物(3)。加入的水的量相對于所用溶劑的量以0.055倍量為宜，較好為O.06l倍量，更好為0.070.1倍量。(5)步驟e:(1)Bz在步驟d制得的核糖核酸衍生物(3)的5'位羥基導(dǎo)入酸性條件下脫離的保護(hù)基(R1)的制造核糖核酸衍生物(10)的步驟。式(3)、(9)及(10)中，Bz、R1、WG'如前所述，X3表示鹵素。X3所表示的鹵素可例舉與上述Bz的修飾體中的鹵素相同的鹵素。本步驟可按照公知的方法，通過使R^3(9)作用于核糖核酸衍生物(3)而實(shí)施。R'X3(9)的用量相對于核糖核酸衍生物(3)的摩爾量以0.820倍摩爾量為宜，優(yōu)選110倍摩爾量。所用溶劑只要對反應(yīng)沒有影響即可，無特別限定，可例舉例如乙腈、THF等。作為堿，可例舉吡啶、2，6-二甲基吡啶、2，4,6-三甲基吡啶、N-甲基咪唑、三乙胺、三丁胺、N，N-二異丙基乙胺、1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]-7-十一烯等有機(jī)堿。堿的用量相對于核糖核酸衍生物(3)的摩爾量以0.820倍摩爾量為宜，優(yōu)選110倍摩爾量。反應(yīng)溫度以0'C12(TC為宜。反應(yīng)時(shí)間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以30分鐘24小時(shí)為宜。(6)步驟f:通過使亞磷酰胺化試劑和根據(jù)需要使用的活化劑作用于步驟e制得的核糖核酸衍生物(IO)，制備3'位羥基被亞磷酰胺化的亞磷酰胺化合物(A)的步驟。式(10)及(A)中，Bz、R1、R2a、R2b、WG1、WG2如前所述。作為亞磷酰胺化試劑，可例舉例如下述通式(12a)、(12b)表示的化合物。(A)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>式(12a)及(12b)中，R2a、R2b、WG2如前所述，X'表示鹵素。X'所表示的鹵素可例舉與上述Bz的修飾體中的鹵素相同的鹵素。本步驟是使亞磷酰胺化試劑作用于核糖核酸衍生物(IO)而將3'位羥基亞磷酰胺化的反應(yīng)，可按照公知的方法實(shí)施。根據(jù)需要還可采用活化劑。所用溶劑只要對反應(yīng)沒有影響即可，無特別限定，可例舉例如乙腈、THF。亞磷酰胺化試劑的用量相對于核糖核酸衍生物(10)的摩爾量以0.820倍摩爾量為宜，優(yōu)選110倍摩爾量。作為活化劑，可例舉例如1H-四唑、5-乙硫基四唑、5-苯甲基巰基-1H-四唑、4，5-二氯咪唑、4,5-二氰基咪唑、三氟甲磺酸苯并三唑鹽、三氟甲磺酸咪唑鹽、三氟甲磺酸吡啶鏃鹽、N，N-二異丙基乙胺、2,4，6-三甲基吡啶/N-甲基咪唑。活化劑的用量相對于核糖核酸衍生物(10)的摩爾量以0.820倍摩爾量為宜，優(yōu)選110倍摩爾量。反應(yīng)溫度以0'C12(TC為宜。反應(yīng)時(shí)間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以30分鐘24小時(shí)為宜。如上所制備的亞磷酰胺化合物(A)本身可通過例如濃縮、液相轉(zhuǎn)換、轉(zhuǎn)溶、溶劑萃取、結(jié)晶化、重結(jié)晶、分餾、層析等公知的方法進(jìn)行分離精制。II.低聚RNA的制法通過使用亞磷酰胺化合物(A)，可制造以下的通式(B)表示的低聚RNA(以下稱為低聚RNA(B))。以下進(jìn)行詳述。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>式(B)中，各B分別獨(dú)立，表示核酸堿基或其修飾體，各Q分別獨(dú)立，表示O或S，各R分別獨(dú)立，表示H、羥基、鹵素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基或烷氧基垸基氧基，但至少l個(gè)表示羥基，z表示H、磷酸基或硫代磷酸基，n表示l200的范圍內(nèi)的整數(shù)。n較好為10100的范圍內(nèi)的整數(shù)，更好為1550的范圍內(nèi)的整數(shù)。對B表示的核酸堿基無特別限定，例如可例舉胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶等嘧啶堿基，腺嘌呤、鳥嘌呤等嘌呤堿基。B的修飾體是指核酸堿基被任意的取代基取代而得的基團(tuán)，作為B的修飾體的取代基，可例舉例如鹵素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羥基、氨基、一垸基氨基、二垸基氨基、羧基、氰基、硝基，它們在任意的位置取代有13個(gè)。作為B的修飾體中的鹵素、酰基、垸基、芳烷基、垸氧基、垸氧基烷基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基，可例舉與上述Bz的修飾體中的對應(yīng)的基團(tuán)相同的基團(tuán)。作為R的卣素、烷氧基、烷基氨基或二烷基氨基，可例舉與上述Bz的修飾體中的對應(yīng)的基團(tuán)相同的基團(tuán)。作為R的垸氧基垸基氧基、烷硫基的烷基，可例舉與上述Bz的修飾體中的烷基相同的基團(tuán)。作為R的烷氧基烷基氧基的烷氧基，可例舉與上述Bz的修飾體中的烷氧基相同的基團(tuán)。作為R的鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基的鏈烯基，可例舉例如直鏈狀或支鏈狀的碳數(shù)26的鏈烯基。具體可例舉例如乙烯基、烯丙基、l-丙烯基、異丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、1-戊烯基、1-己烯基等。作為R的炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基的炔基，可例舉例如直鏈狀或支鏈狀的碳數(shù)24的炔基。具體可例舉例如乙炔基、2-丙炔基、l-丁炔基等。使用亞磷酰胺化合物(A)的低聚RNA(B)的制法可按照公知方法進(jìn)行，但也可以例如通過實(shí)施以下所示的步驟A步驟G的操作，分步驟地由3'至5'的方向縮合核酸單體化合物，藉此制備低聚RNA(B)。由低聚RNA的制法可制得各R中的至少1個(gè)為羥基的低聚RNA(B)。例如在后述的步驟B中，作為核酸單體化合物全部使用亞磷酰胺化合物(A)，藉此可制得各R都為羥基的低聚RNA(B)。被用于下述步驟的化合物及試劑中，除亞磷酰胺化合物(A)以外，只要是常用于低聚RNA或低聚DNA的合成的化合物及試劑即可，無特別限定。此外，與使用了現(xiàn)有的核酸合成試劑的情況同樣，所有的步驟可采用人工方法或市售的DNA自動合成機(jī)來進(jìn)行。用自動合成機(jī)進(jìn)行反應(yīng)時(shí)操作方法簡便，且合成的準(zhǔn)確性高，因此優(yōu)選采用自動合成機(jī)的方法。此外，下述步驟A步驟G記載的化合物及試劑中，除核酸單體化合物以外，只要是常用于低聚DNA或低聚RNA的合成的化合物及試劑即可，無特別限定。(l)步驟A:使酸作用于以下的通式(18)表示的(低聚)核酸衍生物，藉此脫離5，位羥基的保護(hù)基，制備以下的通式(19)表示的低聚核酸衍生物的步驟。、Bx、？y'〕酸、9xrv1ws3、Bxn-1:§(18)(，9)式(18)及(19)中，各Q分別獨(dú)立，其含義如前所述，n、R1、WGa如前所述，各Bx分別獨(dú)立，表示可具有保護(hù)基的核酸堿基或其修飾體，各W分別獨(dú)立，表示H、鹵素、烷氧基、垸硫基、烷基氨基、二烷基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、垸氧基烷基氧基或以下的通式(20)表示的取代基，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>式(20)中，WGi如前所述。E表示?；蛞韵碌耐ㄊ?21)表示的取代基。€5-連接基固相載體(21)連接基固相載體式(21)中，￡1表示單鍵或以下的通式(22)表示的取代基(<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>(22)式(22)中，Q、WG2如前所述。T表示H、酰氧基、鹵素、垸氧基、垸硫基、烷基氨基、二烷基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、垸氧基烷基氧基、上述通式(20)表示的取代基或上述通式(21)表示的取代基，但E或T的任一方為取代基(21)。Bx的核酸堿基只要是被用于核酸的合成的堿基即可，無特別限定，例如可例舉胞嘧啶、尿噴啶、胸腺嘧啶等嘧啶堿基，腺嘌呤、鳥嘌呤等嘌呤堿基。Bx的核酸堿基可被保護(hù)，其中具有氨基的核酸堿基，例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶，其氨基最好被保護(hù)。作為該氨基的保護(hù)基，只要是作為核酸的保護(hù)基使用的基團(tuán)即可，無特別限定，具體可例舉例如苯甲酰基、4-甲氧基苯甲?；?、乙?；?、丙酰基、丁?；?、異丁?；⒈交阴；?、苯氧基乙?；?-叔丁基苯氧基乙?；?-異丙基苯氧基乙?；?、(二甲基氨基)亞甲基。Bx的修飾體是指核酸堿基被任意的取代基取代而得的基團(tuán)，作為Bx的修飾體的取代基，可例舉例如鹵素、?；?、垸基、芳烷基、垸氧基、烷氧基烷基、羥基、氨基、一垸基氨基、二垸基氨基、羧基、氰基、硝基，它們在任意的位置取代有13個(gè)。作為Bx的修飾體中的卣素、?；?、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、一烷基氨基、二垸基氨基，可例舉與上述Bz的修飾體中的對應(yīng)的基團(tuán)相同的作為W的鹵素、垸氧基、垸基氨基及二烷基氨基，可例舉與上述Bz的修飾體中的對應(yīng)的基團(tuán)相同的基團(tuán)。作為R4的烷氧基烷基氧基及烷硫基的垸基部分，可例舉與上述BZ的修飾體中的垸基相同的基團(tuán)。作為R4的烷氧基烷基氧基的烷氧基部分，可例舉與上述Bz的修飾體中的烷氧基相同的基團(tuán)。作為w的鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基的鏈烯基部分，可例舉與上述R的鏈烯基相同的基團(tuán)。作為w的炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基的炔基部分，可例舉與上述R的炔基相同的基團(tuán)。w的烷基氨基、鏈烯基氨基、炔基氨基可被保護(hù)，作為該保護(hù)基，只要是作為氨基的保護(hù)基使用的基團(tuán)即可，無特別限定，可例舉例如三氟乙酰基、苯甲?；?、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁?；惗□；?、苯基乙?；?、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙?；?、4-異丙基苯氧基乙酰基、(二甲基氨基)亞甲基。特好的是三氟乙?；?。作為E的?；?，可例舉與上述Bz的修飾體中的?；嗤幕鶊F(tuán)。作為T的酰氧基中的?；糠?，可例舉與上述Bz的修飾體中的酰基相同的基團(tuán)。作為T中的鹵素、烷氧基、烷基氨基及二烷基氨基，可例舉與上述Bz的修飾體中的對應(yīng)的基團(tuán)相同的基團(tuán)。作為T中的烷氧基烷基氧基及烷硫基的垸基部分，可例舉與上述Bz的修飾體中的垸基相同的基團(tuán)。作為T中的烷氧基烷基氧基的烷氧基部分，可例舉與上述Bz的修飾體中的烷氧基相同的基團(tuán)。作為T中的鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基的鏈烯基部分，可例舉與上述R中的鏈烯基相同的基團(tuán)。作為T中的炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基的炔基部分，可例舉與上述R中的炔基相同的基團(tuán)。T中的烷基氨基、鏈烯基氨基、炔基氨基可被保護(hù)，作為該保護(hù)基，只要是作為氨基的保護(hù)基使用的基團(tuán)即可，無特別限定，可例舉例如三氟乙?；?、苯甲?；?、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙?；⒍□；?、異丁酰基、苯基乙?；?、苯氧基乙?；?-叔丁基苯氧基乙?；?-異丙基苯氧基乙?；?二甲基氨基)亞甲基。特好的是三氟乙?；?。該步驟可通過使酸作用于被負(fù)載于固相載體的以下的通式(23a)、(23b)表示的核酸衍生物(11=1的核酸衍生物(18))或通過進(jìn)行步驟A步驟D的操作而制得的被負(fù)載于固相載體的低聚RNA或低聚DNA(n二2100的低聚核酸衍生物(18))(以下稱為被負(fù)載于固相載體的低聚核酸衍生物)而實(shí)施。式(23a)及(23b)中，Bx、Ri如前所述，R2L、1141^表示上述取代基(21)，R2表示酰氧基，R"表示H、酰氧基、鹵素、垸氧基、垸硫基、烷基氨基、二烷基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷基氧基或上述取代基(20)。作為R2、R"的酰氧基的?；糠?，可例舉與上述Bz的修飾體中的?；嗤幕鶊F(tuán)。作為R"的鹵素、烷氧基、烷基氨基及二烷基氨基，可例舉與上述Bz的修飾體中的各對應(yīng)的基團(tuán)相同的基團(tuán)。作為R4a的烷氧基烷基氧基及烷硫基的烷基部分，可例舉與上述Bz的修飾體中的垸基相同的基團(tuán)。作為R4a的烷氧基烷基氧基的烷氧基部分，可例舉與上述Bz的修飾體中的烷氧基相同的基團(tuán)。作為R"的鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基的鏈烯基部分，可例舉與上述R中的鏈烯基相同的基團(tuán)。作為R"的炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基的炔基部分，可例舉與上述R中的炔基相同的基團(tuán)。R"的氨基、烷基氨基、鏈烯基氨基、炔基氨基可被保護(hù)，作為該保護(hù)基，只要是作為氨基的保護(hù)基使用的基團(tuán)即可，無特別限定，可例舉例如三氟乙?；⒈郊柞；?、4-甲氧基苯甲?；?、乙?；⒈；⒍□；?、異丁?；⒈交阴；?、苯氧基乙?；?-叔丁基苯氧基乙?；?、4-異丙基苯氧基乙?；?二甲基氨基)亞甲基。特好的是三氟乙酰基。作為固相載體，可例舉例如可控孔度玻璃(controlledporeglass;CPG)、草酰化-可控孔度玻璃(例如參照Alul等，NucleicAcidsResearch,Vol.19，1527(1991))、TentaGel支承體-氨基聚乙二醇衍生物化支承體(例女口參照Wright等，TetrahedronLetters,Vol.34，3373(1993))、Poros-聚苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物。作為連接基，可例舉例如3-氨基丙基、琥珀?；?、2，2，-二乙醇磺酰基、長鏈烷基氨基(LCAA)。核酸衍生物(23a)、核酸衍生物(23b)是按照公知方法制得的或可作為市售品獲得的被負(fù)載于固相載體的化合物，作為其優(yōu)選例子，可例舉以下的通式(24)、(25)表示的核酸衍生物。式(24)及(25)中，Bx、Q、R1、R4、WG2如前所述。R4為取代基(20)的核酸衍生物(24)、(25)可按照公知方法由亞磷酰胺化合物(A)制得。作為可用于本步驟的酸，可例舉例如三氟乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸。該可用于本步驟的酸也可用適當(dāng)?shù)娜軇⑵錆舛认♂屩?5%后再使用。作為溶劑，只要不會對反應(yīng)有影響即可，無特別限定，可例舉二氯甲垸、乙腈、水或它們的任意的混合溶劑。上述反應(yīng)的反應(yīng)溫度優(yōu)選2(TC5(TC。反應(yīng)時(shí)間因(低聚)核酸衍生物(18)的種類、所用酸的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以1分鐘1小時(shí)為宜。所用試劑的量相對于被負(fù)載于固相載體的低聚核酸衍生物以0.8100倍摩爾量為宜，更好為110倍摩爾量。(2)步驟B:采用活化劑使核酸單體化合物與步驟A制得的低聚核酸衍生物(19)縮合，制備以下的通式(26)表示的低聚核酸衍生物的步驟。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>核酸單體化合物——————-^-^&活化劑<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>式(19)及(26)中，各Bx、各Q、各R4、各WG2分別獨(dú)立，其含義如前所述。E、n、R1、T如前所述。本步驟可通過使核酸單體化合物和活化劑作用于被負(fù)載于固相載體的低聚核酸衍生物而實(shí)施。作為核酸單體化合物，可例舉亞磷酰胺化合物(A)或以下的通式(27)表示的核酸衍生物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>式(27)中，R1、R2a、R2b、R4a、WG2如前所述，By表示可具有保護(hù)基的核酸堿基或其修飾體。作為By中的核酸堿基，只要是被用于核酸的合成的堿基即可，無特別限定，可例舉例如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶等嘧啶堿基，腺嘌呤、鳥嘌呤等嘌呤堿基。BY中的核酸堿基可被保護(hù)，其中具有氨基的核酸堿基，例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶，其氨基最好被保護(hù)。作為該氨基的保護(hù)基，只要是作為核酸的保護(hù)基使用的基團(tuán)即可，無特別限定，具體可例舉例如苯甲酰基、4-甲氧基苯甲?；⒁阴；?、丙?；⒍□；?、異丁?；?、苯基乙酰基、苯氧基乙?；?、4-叔丁基苯氧基乙?；?-異丙基苯氧基乙?；?、(二甲基氨基)亞甲基。BY的修飾體是指核酸堿基被任意的取代基取代而得的基團(tuán)，作為By的修飾體的取代基，可例舉例如鹵素、?；⑼榛?、芳烷基、烷氧基、烷氧基垸基、羥基、氨基、一烷基氨基、二垸基氨基、羧基、氰基、硝基，它們可在任意的位置取代有13個(gè)。作為BY的修飾體中的鹵素、酰基、垸基、芳烷基、烷氧基、垸氧基烷基、一烷基氨基、二垸基氨基，可例舉與上述各Bz的修飾體中的對應(yīng)的基團(tuán)相同的基團(tuán)。作為活化劑，可例舉與上述相同的試劑。作為反應(yīng)溶劑，只要不會對反應(yīng)有影響即可，無特別限定，例如可例舉乙腈、THF。上述反應(yīng)的反應(yīng)溫度以2(TC50。C為宜。反應(yīng)時(shí)間因低聚核酸衍生物(19)的種類、所用活化劑的種類和反應(yīng)溫度等而異，通常以l分鐘1小時(shí)為宜。所用試劑的量相對于被負(fù)載于固相載體的低聚核酸衍生物以0.8100倍摩爾量為宜，更好為110倍摩爾量。(3)步驟C:對在步驟B中未反應(yīng)的低聚核酸衍生物(19)的5'位羥基進(jìn)行加帽(capping)步驟。H--0<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>(19)(28)式(19)及(28)中，各Bx、各Q、各R4、各WG'分別獨(dú)立，其含義如前所述，rS表示甲基、苯氧基甲基，e、n、t如前所述，rs表示甲基、苯氧基甲基、<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>叔丁基苯氧基甲基。本步驟是對步驟B中未反應(yīng)的5'位羥基進(jìn)行保護(hù)的反應(yīng)，可通過使帽化劑作用于被負(fù)載于固相載體的低聚核酸衍生物而實(shí)施。作為帽化劑，可例舉例如乙酸酐、苯氧基乙酸酐或叔丁基苯氧基乙酸酐。帽化劑也可用合適的溶劑將其濃度稀釋至0.051M后再使用。作為溶劑，只要不會對反應(yīng)有影響即可，無特別限定，可例舉例如吡啶、二氯甲垸、乙腈、THF或它們的任意的混合溶劑。此外，該步驟中可根據(jù)需要使用反應(yīng)促進(jìn)劑，例如4-二甲基氨基吡啶、N-甲基咪唑。上述反應(yīng)的反應(yīng)溫度以20°C5(TC為宜。反應(yīng)時(shí)間因低聚核酸衍生物(19)的種類、所用帽化劑的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以l分鐘30分鐘為宜。所用試劑的量相對于被負(fù)載于固相載體的低聚核酸衍生物以0.8100倍摩爾量為宜，較好為110倍摩(4)步驟D:通過使氧化劑作用于步驟B中制備的低聚核酸衍生物(26)而將亞磷酸基轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿峄蛄虼姿峄牟襟E。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>式(26)及(29)中，各Bx、各Q、各R4、各\\^32分別獨(dú)立，其含義如前所述。E、n、R1、T如前所述。本步驟是利用氧化劑將3價(jià)磷轉(zhuǎn)換為5價(jià)磷的反應(yīng)，通過使氧化劑作用于被分子于固相載體的低聚核酸衍生物而實(shí)施。用氧來氧化磷時(shí)，作為氧化劑，例如可使用碘、過氧化氫叔丁基。該氧化劑也可用適當(dāng)?shù)娜軇⑵錆舛认♂屩?.052M后再使用。作為用于反應(yīng)的溶劑，只要不會對反應(yīng)有影響即可，可例舉吡啶、THF、水或它們的任意的混合溶劑。例如可米用碘/水/吡啶-THF或碘/吡啶-乙酸和過氧化劑(過氧化氫叔丁基/二氯甲垸等)。用硫來氧化磷時(shí)，作為氧化劑，例如可使用硫、Beaucage試劑(3H-苯并-1，2-二噻茂-3-酮-l，1-二氧化物)、3-氨基-l，2，4-二噻唑-5-硫酮(ADTT)。該氧化劑可用適當(dāng)?shù)娜軇⑵錆舛认♂屩?.052M后再使用。作為用于反應(yīng)的溶劑，只要不會對反應(yīng)有影響即可，可例舉二氯甲烷、乙腈、吡啶或它們的任意的混合溶劑。反應(yīng)溫度以2(TC5(TC為宜。反應(yīng)時(shí)間因低聚核酸衍生物(26)的種類、所用氧化劑的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常為l分鐘30分鐘。所用試劑的量相對于被負(fù)載于固相載體的低聚核酸衍生物以0.8100倍摩爾量為宜，更好為1050倍摩爾量。(5)步驟E:將步驟D制備的低聚核酸衍生物(29)從固相載體切割(cleave)，脫離各核酸堿基部及各磷酸基的保護(hù)基的步驟。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>式(29)及(30)中，各B、各Bx、各Q、各R4、各WG2分別獨(dú)立，其含義如前所述。E、R、R1、n、T、Z如前所述。切割步驟是利用切割試劑將所需鏈長的低聚RNA從固相載體及連接基切割的反應(yīng)，可通過向負(fù)載有所需鏈長的低聚RNA的固相載體添加切割試劑而實(shí)施。本步驟中可脫離核酸堿基部的保護(hù)基。作為切割試劑，可例舉例如濃氨水、甲胺等。本步驟中可使用的切割試劑也可用例如水、甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、THF或它們的任意的混合溶劑稀釋后再使用。其中，優(yōu)選使用乙醇。o-z反應(yīng)溫度以15"75i:為宜，優(yōu)選15。C30。C，更好為18°C25°C。脫保護(hù)反應(yīng)時(shí)間以10分鐘30小時(shí)為宜，優(yōu)選30分鐘24小時(shí)，更好為14小時(shí)。被用于脫保護(hù)的溶液中的氫氧化銨的濃度以2030重量％為宜，優(yōu)選2530重量％，更好為2830重量％。所用試劑的量相對于被負(fù)載于固相載體的低聚核酸衍生物以0.8100倍摩爾量為宜，更好為1050倍摩爾量。(6)步驟F:使用于脫離各核糖的2，位羥基的保護(hù)基的試劑作用于步驟E制造的低聚核酸衍生物(30)，藉此制備以下的通式(31)表示的低聚核酸衍生物的步驟。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>(30)(31)式(30)及(31)中，各B、各Q、各R、各W分別獨(dú)立，其含義如前所述，n、R1、Z如前所述。本步驟可通過使脫離2'位羥基的保護(hù)基的試劑作用于低聚核酸衍生物(30)而實(shí)施。脫離2'位羥基的保護(hù)基的步驟可通過使作為脫離2'位羥基的保護(hù)基的試劑的例如TBAF、三乙胺三氫氟酸鹽等作用而實(shí)施。所用的脫離2'位羥基的保護(hù)基的試劑的量相對于被脫離的保護(hù)基以1500倍摩爾量為宜，較好為510倍摩爾量。作為所用溶劑，只要是不會影響反應(yīng)的溶劑即可，無特別限定，例如可例舉THF、N-甲基吡咯垸酮、吡啶、二甲亞砜或它們的任意的混合溶劑。反應(yīng)溶劑的用量相對于脫離2'位羥基的保護(hù)基的試劑以0.8100倍摩爾量為宜，較好為110倍摩爾量。反應(yīng)溫度以20'C8(TC為宜。反應(yīng)時(shí)間因低聚核酸衍生物(30)的種類、所用脫離2，位羥基的保護(hù)基的試劑的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以1小時(shí)100小時(shí)為宜。此外，根據(jù)需要還可添加用于捕集本步驟中作為副產(chǎn)物生成的丙烯腈的試劑，作為丙烯腈的捕集劑，例如有硝基烷、烷基胺、脒、硫醇、硫醇衍生物或它們的任意的混合物。作為硝基烷，可例舉直鏈狀的碳數(shù)16的硝基垸。具體可例舉硝基甲垸。作為烷基胺，可例舉直鏈狀的碳數(shù)16的烷基胺。具體可例舉例如甲胺、乙胺、正丙胺、正丁胺、正戊胺、正己胺。作為脒，可例舉例如苯甲脒、甲脒。作為硫醇，可例舉例如直鏈狀的碳數(shù)l6的硫醇。具體可例舉例如甲硫醇、乙硫醇、l-丙硫醇、1-丁硫醇、1-戊硫醇、l-己硫醇。作為硫醇衍生物，可例舉例如具有相同或不同的直鏈狀的碳數(shù)16的垸基巰基的醇或醚。具體可例舉例如2-巰基乙醇、4-巰基-1-丁醇、6-巰基-1-己醇、巰基甲醚、2-巰基乙醚、3-巰基丙醚、4-巰基丁醚、5-巰基戊醚、6-巰基己醚。丙烯腈的捕集劑的用量因低聚核酸衍生物(30)的種類等而異，相對于保護(hù)低聚核酸衍生物(30)的各核糖的2'位羥基的2-氰基乙氧基甲基以0.8500倍摩爾量為宜，較好為110倍摩爾量?？赏ㄟ^使用例如萃取、濃縮、中和、過濾、離心分離、重結(jié)晶、硅膠柱色譜法、薄層色譜法、反相ODS柱色譜法、離子交換柱色譜法、凝膠過濾柱色譜法、透析、超濾等通常的分離精制方法，從上述反應(yīng)混合物分離精制5'位得到了保護(hù)的低聚RNA。(7)步驟G:將低聚核酸衍生物(31)的5'位羥基的保護(hù)基脫離的步驟。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage35</formula>式(31)及(B)中，各B、各Q、各R分別獨(dú)立，其含義如前所述。n、R1.Z如前所述。本步驟是最終脫離低聚核酸衍生物(31)的5'位羥基的保護(hù)基的反應(yīng)，可通過使酸作用于從固相載體切割得到的低聚RNA而實(shí)施。作為可用于本步驟的酸，可例舉例如三氯乙酸、二氯乙酸、乙酸等。本步驟中可使用的酸也可用適當(dāng)?shù)娜軇┫♂尯笤偈褂?。作為溶劑，只要是不會對反?yīng)有影響的溶劑即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲烷、乙腈、水、pH為25的緩沖液或它們的任意的混合溶劑。作為緩沖液，可例舉例如乙酸緩沖液。上述反應(yīng)的反應(yīng)溫度以2(TC5(TC為宜。反應(yīng)時(shí)間因低聚核酸衍生物(31)的種類、所用酸的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以l分鐘1小時(shí)為宜。所用試劑的量相對于被負(fù)載于固相載體的低聚核酸衍生物以0.8100倍摩爾量為宜，更好為110倍摩爾量。(8)步驟H:分離精制步驟G制備的低聚RNA(B)的步驟。分離精制步驟是指通過單獨(dú)或組合使用例如萃取、濃縮、中和、過濾、離心分離、重結(jié)晶、C8-U的反相柱色譜法、Cs-d8的反相卡套柱(cartridgecolumn)色譜法、陽離子交換柱色譜法、陰離子交換柱色譜法、凝膠過濾柱色譜法、高效液相色譜法、透析、超濾等通常的分離精制方法，從上述反應(yīng)混合物分離精制所需低聚RNA(B)的步驟。作為洗脫溶劑，可例舉例如乙腈、甲醇、乙醇、異丙醇、水的單獨(dú)溶劑或任意比例的混合溶劑。這種情況下，也可以lmM2M的濃度添加作為添加物的例如磷酸鈉、磷酸鉀、氯化鈉、氯化鉀、乙酸銨、乙酸三乙基銨、乙酸鈉、乙酸鉀、Tris-HC1、乙二胺四乙酸，在l9的范圍調(diào)整溶液的pH。通過重復(fù)實(shí)施步驟A步驟D的操作，能夠制得所需鏈長的低聚RNA(B)。作為本制法中用于制造低聚RNA(B)的起始原料，可使用R"為取代基(20)的核酸衍生物(23a)、R4a為H或酰氧基的核酸衍生物(23a)或R2為?；暮怂嵫苌?23b)等。作為起始原料，使用R"為H或酰氧基的核酸衍生物(23a)或R2為?；暮怂嵫苌?23b)時(shí)，作為核酸單體化合物的至少1種必須使用本發(fā)明的亞磷酰胺化合物。此外，本制法中在實(shí)施步驟E的操作前進(jìn)行步驟F的操作，然后進(jìn)行步驟E的操作，接著再進(jìn)行步驟G的操作，也可分離精制低聚RNA(B)。實(shí)施例以下，例舉參考例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不僅限定于此。參考例1氯甲基2-氰基乙基醚步驟1甲硫基甲基2-氰基乙基醚的制備將32g(450mmo1)3-羥基丙腈溶于450ml二甲亞砜，加入324mL乙酸酐和231mL乙酸，室溫下攪拌24小時(shí)。將990g碳酸氫鈉溶于4.5L水調(diào)制成溶液，用1小時(shí)的時(shí)間將反應(yīng)液滴入該溶液中，隨即攪拌l小時(shí)，用乙酸乙酯萃取反應(yīng)液，用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，用硅膠柱色譜法對所得油狀物進(jìn)行精制，獲得41g呈無色油狀物的甲硫基甲基2-氰基乙基醚(收率70%)。!H—NMR(CDC13):2.18(s，3H);2.66(t，2H，J=6.3Hz);3.77(t,2H,J=6.3Hz);4.69(s，2H)步驟2氯甲基2-氰基乙基醚的制備使3.3g(25mmol)步驟1獲得的甲硫基甲基2-氰基乙基醚溶于70mL二氯甲垸，冰冷下滴加2mL(25mraol)硫酰氯，再于室溫反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)后蒸除溶劑，在真空中進(jìn)行蒸餾，獲得2.5g呈無色油狀物的目標(biāo)化合物(收率85%)。沸點(diǎn)8485°C(0.3托)'H—NMR(CDC13):2.72(t，2H，J=6.3Hz);3.92(t，2H，J=6.3Hz);5.52(s，2H)參考例25，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3，-0-(2-氰基乙基N,N-二異丙基亞磷酰胺)步驟15，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制備將546mg(lmmo1)5,-0-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)尿苷溶于4mL的1,2-二氯乙垸后加入452fflg(3.5ramol)二異丙基乙胺，再加入365mg(1.2腸1)二氯化二丁基錫，然后于室溫反應(yīng)l小時(shí)。升溫至8(TC后滴加155.4mg(1.3mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，隨即攪拌30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在飽和碳酸氫鈉水溶液中加入反應(yīng)液，用二氯甲烷萃取，再用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，利用30g的硅膠柱色譜對所得混合物進(jìn)行精制，獲得5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷(197mg,收率34%)。'H-醒R(CDC13):2.47(d，1H，J=7.8Hz);2.69(t，2H，J=6.3Hz);3.55(dd,1H，11.3,2.2Hz);3.62(dd，1H,11.3，2.2Hz);3.83(s，6H);3.87(t，2H，J=6.3Hz);4.07—4.08(m，1H);4.32(dd，1H，J=5.3，1.9Hz);4.54(q，1H，J=5.3Hz);4.94，5.11(2d，2H，J=6.9Hz);5.32(d,1H，J=8.2Hz);6.00(d，1H,J=1.9Hz);6.85-6.88(m,4H);7.29-7.41(m,9H);8.02(d，1H，J=8.2Hz);8.53(br.s，1H)ESI-質(zhì)譜652[M+Na]+步驟25，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3'-0-(2-氰基乙基N,N-二異丙基亞磷酰胺)的制備將209mg(0.332mmol)步驟1獲得的5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷和23mg(0.332mmo1)四唑溶于2mL乙腈，再滴加150mg(0.498mmol)的2-氰基乙基N,N,N，，N，-四異丙基亞磷酰胺，于45。C反應(yīng)1.5小時(shí)。反應(yīng)后加入飽和碳酸氫鈉水溶液，用乙酸乙酯萃取，再用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，利用20g的硅膠柱色譜對所得混合物進(jìn)行精制，獲得目標(biāo)化合物(200mg，收率73%)。ESI-質(zhì)譜852[M+Na]+參考例32，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷步驟13，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制備氬氣氛下，將150mg(0.3mmol)3'，5'-0-(四異丙基二硅氧烷-l，3-二基)尿苷溶于7mL的THF，加入54mg(0.4誦o1)甲硫基甲基2-氰基乙基醚和100mg分子篩4A，攪拌10分鐘。將溫度調(diào)整為(TC，加入10mg(0.06mrao1)三氟甲磺酸的THF溶液2mL，攪拌后加入92mg(0.4mmol)N-碘琥珀酰亞胺，攪拌1小時(shí)。用硅藻土過濾反應(yīng)液，用二氯甲垸洗滌后，有機(jī)相用1M硫代硫酸氫鈉水溶液洗滌，再用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌，然后用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑。用薄層色譜法對所得殘?jiān)M(jìn)行精制，獲得3'，5'-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷(150mg，收率85%)。'H-醒R(CDC13):0.97-1.12(m'28H);2.68-2,73(m，2H);3.78-3.86(m，1H);3.96—4.05(m，2H);4.12—4.30(ra，4H);5.0—5.04(m，2H);5.70(d，1H，J=8.2Hz);5.75(s，1H);7.90(d,1H，J=8.2Hz);9.62(br.s，1H)ESI-質(zhì)譜570[M+H]+步驟22，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制備將200mg(0,35mmol)步驟1獲得的3'，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷溶于2mL甲醇，再加入65mg(1.76mmo1)氟化銨，于5(TC加熱攪拌5小時(shí)。放冷后加入乙腈攪拌，過濾濃縮。用硅膠柱色譜法對所得殘?jiān)M(jìn)行精制，獲得目標(biāo)化合物(108mg，收率94%)。'H-NMR(CD30D):2.72-2.76(t，2H，J=6.2Hz);3.68-3.92(m，4H);4.00-4.03(m，1H);4.26—4.32(m，2H);4.81-4.95(m，2H);5.71(d，1H，J二8.1Hz);6.00(d，1H，J=3.3Hz);8.10(d，1H，J=8.1Hz)ESI-質(zhì)譜350[M+Na]+參考例45，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制備將14g(43mraol)2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷以吡啶共沸，用真空泵干燥30分鐘。然后，溶于300mL的THF，在氬氣氛下加入68g(856mmo1)吡啶和20g分子篩4A，攪拌10分鐘。將19.6g(57.8mmo1)4,4，-二甲氧基三苯甲基氯以l小時(shí)的間隔分3次加入其中，再攪拌1小時(shí)。接著，加入10mL甲醇攪拌2分鐘，再用硅藻土過濾，用乙酸乙酯洗滌。濃縮濾液后將殘?jiān)苡谝宜嵋阴?，再與飽和碳酸氫鈉水溶液分液。有機(jī)相用飽和氯化鈉水溶液洗滌，用無水硫酸鎂干燥后蒸除溶劑。用硅膠柱色譜法對所得殘?jiān)M(jìn)行精制，獲得目標(biāo)化合物(26.5g，收率98%)。參考例5W-乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷3，-0-(2-氰基乙基N,N-二異丙基亞磷酰胺)步驟1Nt乙?；?5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制備將588mg(lmmol)N4-乙酰基-5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)胞苷溶于4mL的1，2-二氯乙垸，加入452mg(3.5mmo1)二異丙基乙胺后加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基錫，室溫下反應(yīng)l小時(shí)。然后，將溫度升至8(TC，滴加155.4mg(1.3mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，隨即攪拌60分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，在飽和碳酸氫鈉水溶液中加入反應(yīng)液，用二氯甲垸萃取，再用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，利用30g的硅膠柱色譜對所得混合物進(jìn)行精制，獲得N^乙?；?5'-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷(219mg,收率35%)。'H—麗R(CDC13):2.19(s，3H);2.56(d，1H，J=8.8Hz);2.65(t，2H，J二6.2Hz);3.55(dd，1H,10,5，2.5Hz);3.63(dd,1H，10.5，2.5Hz);3,82(s,6H);3.86(t，2H，J=6.2Hz);4.09—4.14(m，1H);4.28(d，1H，J=5.1Hz);4.44—4.49(m，1H);4.97，5.24(2d，2H，J=6.9Hz);5.96(s，1H);6.86—6.88(m，4H);7.09(d，1H，J=6.9Hz);7.26—7.42(m，9H);8.48(d，1H，J=6.9Hz);8.59(br.s，1H)ESI-質(zhì)譜693[M+Na]+步驟2W-乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷3，-0-(2-氰基乙基N,N-二異丙基亞磷酰胺)的制備將205mg(0.306畫o1)步驟1獲得的N4-乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0_(2-氰基乙氧基甲基)胞苷溶于2mL二氯甲烷，加入105mg(0.812ramol)二異丙基乙胺，再滴加116mg(0.49mmo1)2-氰基乙基N，N-二異丙基氯代亞磷酰胺，室溫下反應(yīng)l小時(shí)。反應(yīng)后蒸除溶劑，利用20g的硅膠柱色譜對所得混合物進(jìn)行精制，獲得目標(biāo)化合物(242mg，收率91%)。ESI-質(zhì)譜871[M+H]+參考例6N^乙?；?2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷步驟1^-乙酰基-3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制備混合1.OOg(l.89mmol)N4-乙?；?3，,5，-0-(四異丙基二硅氧垸-1，3-二基)胞苷和500mg(3.79rarao1)甲硫基甲基2-氰基乙基醚，將混合物溶于10mL甲苯和10mLTHF的混合溶劑。然后，加入975mg(3.79mmol)三氟甲磺酸銀，再加入分子篩4A，干燥。冰冷下加入370mg(2.08mmol)N-溴琥珀酰亞胺，將反應(yīng)容器遮光，攪拌10分鐘。再追加70mg(0.39mmol)N-溴琥珀酰亞胺，攪拌25分鐘。反應(yīng)結(jié)束后加入二氯甲烷稀釋，用飽和碳酸氫鈉水溶液進(jìn)行洗滌，用無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，用硅膠柱色譜法對所得混合物進(jìn)行精制，獲得N4-乙?；?3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷(936mg，收率81%)。'H—NMR(CDC13):0.90—1.11(m，28H);2.28(s,3H);2.62—2.79(m，2H);3.78—3.89(m，1H);3.96—4.04(m，2H);4.19—4.23(m，3H);4.30(d，1H，J二13.6Hz);5.00(d,1H，J=6.8Hz);5.09(d，1H'J=6.8Hz);5.77(s,1H);7.44(d,1H，J=7.5Hz);8.30(d,1H，J=7.5Hz);10.13(s，1H)ESI-質(zhì)譜611[M+H]+步驟2N4-乙?；?2'-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制備將500mg(0.819mmol)步驟l獲得的N4-乙酰基-3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷溶于2.5mLTHF和2.5mL甲醇的混合溶劑，加入150mg(4.10mmol)氟化銨，于5(TC反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用乙腈稀釋，過濾，蒸除溶劑，再用硅膠柱色譜法對所得混合物進(jìn)行精制，獲得目標(biāo)化合物(210mg，收率70%)。'H—NMR(D20):2.13(s，3H);2.66-2.71(m，2H);3.72—3.78(m，3H);3.90(dd，1H，J=13.0,2.6Hz);4.06—4.11(m，1H);4.20(dd，1H，J=7.1，5.2Hz);4.29(dd，1H，J=5.1,2.9Hz);4.83(d，1H，J=7.2Hz);4.94(d，1H，J=7.2Hz);5.95(d，1H，J=2.9Hz);7.25(d，1H'J=7.6Hz);8.25(d，1H，J二7.6Hz)ESI-質(zhì)譜:391[M+Na]+參考例7N4-乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制備將9.9g(26.8mmo1)2，-0_(2-氰基乙氧基甲基)胞苷以吡啶共沸，用真空泵干燥30分鐘。然后，溶于190mLTHF，在氬氣氛下加入43g(538mmo1)吡啶和20g分子篩4A，攪拌10分鐘。將11.8g(34.9mmol)4,4'-二甲氧基三苯甲基氯以1小時(shí)的間隔分3次加入其中，再攪拌1小時(shí)。接著，加入2mL甲醇攪拌2分鐘，再用硅藻土過濾，用乙酸乙酯洗滌。用蒸發(fā)器濃縮濾液后將殘?jiān)苡谝宜嵋阴ィ倥c飽和碳酸氫鈉水溶液分液。有機(jī)相用飽和氯化鈉水溶液洗滌，用無水硫酸鎂干燥后蒸除溶劑。用硅膠柱色譜法對所得殘?jiān)M(jìn)行精制，獲得目標(biāo)化合物(15g，收率83%)。參考例8W-乙?；?5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2'-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)步驟1N2-乙酰基-5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷的制備將627mg(lmraol)NL乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)鳥苷溶于4mL的1,2-二氯乙烷，加入452mg(3.5mmol)二異丙基乙胺后加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基錫，室溫下反應(yīng)l小時(shí)。然后，將溫度升至80。C，滴加155.4mg(1.3mraol)氯甲基2-氰基乙基醚，隨即攪拌60分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，在飽和碳酸氫鈉水溶液中加入反應(yīng)液，用二氯甲垸萃取，再用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，利用30g的硅膠柱色譜對所得混合物進(jìn)行精制，獲得W-乙酰基-5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷(450mg，收率63X)。'H-麗R(CDC13):1.92(s，3H);2.47-2.51(ra，2H);2.68(br.s,1H);3.30(dd，1H,10.7，3.8Hz);3.47(dd,1H，10.7，3.8Hz);3.55—3.60(m，1H);3.65-3.70(m，1H);3.74,3.75(2s，6H);4.22-4.23(m，1H);4.55-4.58(m，1H);4.78，4.83(2d，2H，J=7.0Hz);5.01(t，1H，J=5.1Hz);5.99(d，1H，J=5.1Hz);6.76—6.79(ra，4H);7.17—7.44(m，9H);7.88(s，1H);8.36(br.s，1H);12.06(br.s，1H)步驟2tf-乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)的制備將400mg(0.563匪ol)步驟1獲得的N2-乙酰基-5，-0-(4，4,-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷溶于2mL二氯甲烷，加入181mg(1.4mmol)二異丙基乙胺，再滴加161mg(0.68mmo1)2-氰基乙基N，N-二異丙基氯代亞磷酰胺，室溫下反應(yīng)l小時(shí)。反應(yīng)后蒸除溶劑，利用20g的硅膠柱色譜對所得混合物進(jìn)行精制，獲得目標(biāo)化合物(471mg，收率92%)。參考例9NL乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)步驟1If-乙?；?5，_0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制備將22.0g(36.0讓ol)N6-乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)腺苷溶于170mL的1，2-二氯乙垸，加入16.3g(126mmol)二異丙基乙胺后加入12.lg(39.7mmol)二氯化二丁基錫，室溫下反應(yīng)1小時(shí)。然后，將溫度升至8(TC攪拌15分鐘，再滴加4.30g(36.0mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，隨即攪拌30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，在飽和碳酸氫鈉水溶液中加入反應(yīng)液，用二氯甲垸萃取，再用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，用硅膠柱色譜法對所得混合物進(jìn)行精制，獲得N6-乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2,-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷(7.47g，收率33%)。'H-廳R(CDC13):2.51(t，2H，J=6.2Hz);2.58(d，1H，J=5.5Hz);2.61(s，3H);3.45(dd,1H,J=10.7，4.0Hz);3.54(dd，1H，J=10.7，3.2Hz);3.62-3.79(m，2H);3.79(s，6H);4.25(br.q，1H，J=4.6Hz);4.59(q，1H，J=5.2Hz);4.87—4,94(m，3H);6.23(d，1H，J=4.4Hz);6.80-6.83(m，4H);7.22-7.32(m，7H);7.40-7.43(m，2H);8.20(s，1H);8.61(br.s，1H);8.62(s，1H)ESI-質(zhì)譜695[M+H]+步驟2N6-乙?；?5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷3，-0-(2-氰基乙基N,N-二異丙基亞磷酰胺)的制備將10.0g(14.4mmol)步驟1獲得的N6-乙酰基-5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于75mL二氯甲垸，加入4.7g(36mmol)二異丙基乙胺，再滴加4.82g(20.3mmo1)2-氰基乙基N,N-二異丙基氯代亞磷酰胺，室溫下反應(yīng)l小時(shí)。反應(yīng)后剩余30mL左右的溶劑，進(jìn)行蒸除，再用硅膠柱色譜法對所得反應(yīng)混合物進(jìn)行精制，獲得目標(biāo)化合物(12.0g,收率93%)。ESI-質(zhì)譜:895[M+H]+參考例10W-乙?；?2'-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷步驟1N6-乙酰基-3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2'-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制備使245mg(1.09mmol)N-碘琥珀酰亞胺和280mg(1.09mmol)三氟甲磺酸銀懸浮于8mL二氯甲烷，加入分子篩4A，干燥。冰冷下在其中加入將400mg(O.73mmol)N6-乙?；?3，，5，-0-(四異丙基二硅氧垸-1，3-二基)腺苷和145mg(1.llmmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚溶于4mL二氯甲烷而形成的溶液，隨即攪拌3小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后加入二氯甲垸稀釋，再用硫代硫酸鈉水溶液和飽和碳酸氫鈉水溶液進(jìn)行洗滌，用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，所得混合物用硅膠柱色譜法精制，獲得N6-乙?；?3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷(201mg，收率45%)。薩R(CDC13):0.98—1.11(m，28H);2.62(s，3H);2.69(td，2H，6.5,J=1.5Hz);3.81—3.89(m，1H);4.02—4.09(m，2H);4.17(d,1H，J=9.4Hz);4.28(d，1H，J=13.4Hz);4.50(d，1H，J=4.5Hz);4.67(dd，1H，J=8.8,4.5Hz);5.02(d，1H，J=7.0Hz);5.08(d,1H，J=7.0Hz);6.10(s，1H);8.34(s，1H);8.66(s，1H);8.67(s,1H)ESI-質(zhì)譜:636[M+H]+步驟2N6-乙酰基-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制備將300mg(0.47mmol)步驟1獲得的N6-乙?；?3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于0.lmL乙酸和2mL的0.5MTBAF的THF溶液的混合溶液，室溫下攪拌2小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后用硅膠柱色譜法對所得反應(yīng)混合物進(jìn)行精制，獲得目標(biāo)化合物(160mg,收率86%)。'H-騰(DMSO-d6):2.25(s,3H);2.53-2.68(m，2H);3.41-3.46(m，1H);3.56-3.64(m,2H);3.69-3.73(m，1H);4.00-4.01(m，1H);4.36—4.37(m,1H);4.72—4.78(m，3H);5.20(bt，2H);5.41(d'1H，J=5.2Hz);6.17(d,1H，J=5.7Hz);8.66(s，1H);8.72(s'1H);10.72(s，1H)ESI-質(zhì)譜415[M+Na]+參考例11N6-乙?；?5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)_2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制備將9.50g(24.2腿ol)I^-乙酰基-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于100mL脫水吡啶，濃縮干燥后，氬氣氛下溶于100mL脫水吡啶。冰冷下，加入10，7g(31.2mmo1)4，4，-二甲氧基三苯甲基氯，室溫下反應(yīng)1小時(shí)20分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，用二氯甲垸稀釋，再用水洗滌，用無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，用硅膠柱色譜法對所得混合物進(jìn)行精制，獲得目標(biāo)化合物(13.8g，收率82%)。參考例12Ni苯氧基乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)步驟1!f-苯氧基乙酰基-5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷的制備將720mg(lmmol)N2-苯氧基乙酰基-5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)鳥苷溶于4mL的1，2-二氯乙烷，加入452mg(3.5mmol)二異丙基乙胺后加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基錫，室溫下反應(yīng)1小時(shí)。然后，將溫度升至8CTC，再滴加155.4rag(1.3mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，隨即攪拌60分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，在飽和碳酸氫鈉水溶液中加入反應(yīng)液，用二氯甲烷萃取，再用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，利用30g的硅膠柱色譜對所得混合物進(jìn)行精制，獲得NL苯氧基乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷(384mg,收率48%)。'H—NMR(CDC13):2.47—2.51(m，2H);2.58(br.s，1H);3.42(dd，1H，10.1，3.8Hz);3.46(dd，1H，10.1，3.8Hz);3.53—3.57(m，1H);3.69一3.73(m，1H);3.77(s，6H);4,24—4.26(m，1H);4.48—4.50(m，1H);4.61-4.65(m，2H);4.83，4.87(2d,2H，J二7.0Hz);4.88(t，1H,J=5.7Hz);6.05(d，1H,J=5.7Hz);6.80—6.82(m，4H);6,92-6.96(m，3H);7.07-7,11(m，2H);7.20-7.42(m,9H);7.84(s，1H);8.99(s，1H);11.81(br.s，1H)ESI-質(zhì)譜825[M+Na]+步驟2Ni苯氧基乙酰基-5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷3'-0-(2-氰基乙基N,N-二異丙基亞磷酰胺)的制備將320mg(0.399誦o1)步驟1獲得的N^苯氧基乙?；?5，-0-(4，4,-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷溶于4raL二氯甲烷，加入128.8mg(0.996mmol)二異丙基乙胺，再滴加141.5mg(0.598mmo1)2-氰基乙基N，N-二異丙基氯代亞磷酰胺，室溫下反應(yīng)l小時(shí)。反應(yīng)后蒸除溶劑，再利用30g的硅膠柱色譜對所得混合物進(jìn)行精制，獲得目標(biāo)化合物(316mg，收率79%)。ESI-質(zhì)譜1003[M+H]+參考例13N^苯氧基乙?；?2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷步驟1W-苯氧基乙?；?3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷的制備將2.0g(3.0mraol)N2-苯氧基乙酰基-3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1,3-二基)鳥苷溶于16mL的THF，加入0.99g(7.6mmo1)甲硫基甲基2-氰基乙基醚和1.0g分子篩4A，氬氣氛下于一45。C攪拌IO分鐘。然后，加入O.68g(4.5mmol)三氟甲磺酸的5mLTHF溶液，攪拌后加入1.02g(4.5mmo1)N-碘琥珀酰亞胺，攪拌15分鐘。在反應(yīng)液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，過濾后用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用1M硫代硫酸氫鈉水溶液洗滌，再依次用水和飽和氯化鈉水溶液洗滌，接著用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑。所得殘?jiān)霉枘z柱色譜法精制，獲得N2-苯氧基乙?；?3',5，-0-(四異丙基二硅氧疾-l,3-二基)-2'-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷(2.0g，收率89X)。'H-NMR(CDC1》0.99—1.11(m,28H);2.59—2.77(m，2H);3.82—4.05(m，3H);4.15(d，1H,J=9.3Hz);4.25—4.35(m，2H);4.52-4.56(dd，1H，J=9,3，4.3Hz);5.00，5.07(2d，2H，J=7.2Hz);5.95(s，1H);6.99-7.12(m,3H);7.35-7.40(ra，2H);8.09(s，1H);9.38(br.s，1H);11.85(br.s，1H)ESI-質(zhì)譜766[M+Na]+步驟2N2-苯氧基乙?；?2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷的制備在2.83mL(2.83mmo1)的1MTBAF/THF溶液中加入0.14mL(0.14mmo1)乙酸，調(diào)制出溶液。將1.0g(1.35腿ol)步驟1獲得的NL苯氧基乙?；?3，，5，-0-(四異丙基二硅氧垸-1,3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷溶于2.83mLTHF，在其中加入先前調(diào)制的溶液，氬氣氛下于室溫?cái)嚢?小時(shí)。減壓下濃縮反應(yīng)液后將其溶于二氯甲烷，用硅膠柱色譜法精制，獲得目標(biāo)化合物(0.67g，收率99%)。!H—NMR(DMS0—d6):2.59-2.66(m，2H);3.41—3.63(m，4H);3.98(m，1H);4,32(m,1H);4.58—4.62(t，1H，J=5.3Hz);4,71—4.78(dd，2H，J=13.1,6.8Hz);4.87(s,2H);5.12(s，1H);5.37(s，1H);5.97(d，1H，J=6.1Hz);6.96—6.99(m，3H);7.28—7.34(m,2H);8,30(s,1H);11.78(br.s，2H)ESI-質(zhì)譜:500[M-H]-參考例14N2-苯氧基乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷的制備將660mg(1.32mmol)N2-苯氧基乙?；?2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷以吡啶共沸，用真空泵干燥30分鐘。然后，溶于9mLTHF，在氬氣氛下加入2.lg(26.4mmol)吡咬和600mg分子篩4A，攪拌10分鐘。將540mg(1.58腿o1)4，4，-二甲氧基三苯甲基氯以1小時(shí)的間隔分3次加入其中，再攪拌1小時(shí)。接著，加入2mL甲醇攪拌2分鐘，再用硅藻土過濾，用乙酸乙酯洗漆。用蒸發(fā)器濃縮濾液后將殘?jiān)苡谝宜嵋阴?，再與飽和碳酸氫鈉水溶液分液。有機(jī)相用飽和氯化鈉水溶液洗滌，用無水硫酸鎂干燥后蒸除溶劑。用硅膠柱色譜法對所得殘?jiān)M(jìn)行精制，獲得目標(biāo)化合物(800mg，收率75%)。參考例15N6-乙?；?3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-l,3-二*基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷步驟1N6-乙?；?3，，5，-0-(四異丙基二硅氧垸-1，3-二基)-2'-0-甲硫基甲基腺苷的制備將2.00g(3.62mmol)N6-乙?；?3，,5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1,3_二基)腺苷溶于25mL二甲亞砜，加入17.5mL乙酸酐和12.5mL乙酸，室溫下攪拌14小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后在200mL水中加入反應(yīng)液，用乙酸乙酯萃取，用飽和碳酸氫鈉水溶液進(jìn)行洗滌，再用無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，用硅膠柱色譜法對所得混合物進(jìn)行精制，獲得N6-乙酰基-3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2'-0-甲硫基甲基腺苷(l.36g，收率61%)。'H—NMR(CDC1》0.96—1.11(m,28H);2.20(s，3H);2.61(s，3H);4.03(dd,1H,J=13.4，2.4Hz);4.18(d，1H，J二9.1Hz);4.27(d,1H，J=13.4Hz);4.63-4.71(m，2H);5.00(d,1H，J=11.5Hz);5.07(d，1H，J=11.5Hz);6.09(s，1H);8.31(s，1H);8.65(s，1H);8.69(s，1H)ESI-質(zhì)譜635[M+Na]+步驟2N6-乙酰基-3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制備將1.00g(1.63mmol)步驟1獲得的N6-乙酰基-3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2，-0-甲硫基甲基腺苷溶于25mLTHF。加入5.88g(82.7mmo1)3-羥基丙腈，再加入分子篩4A，干燥，冷卻至一45。C。接著，加入440mg(1.96mmol)N-碘琥珀酰亞胺，再加入490mg(3.26mmo1)三氟甲磺酸，于一45t:攪拌15分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，在冷卻的狀態(tài)下加入三乙胺進(jìn)行中和，用二氯甲烷稀釋，再用硫代硫酸鈉水溶液和飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌，用無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，所得混合物用硅膠柱色譜法精制，獲得目標(biāo)化合物(722mg，收率71%)。參考例16胞苷酰-[3'—5']-尿苷酰-[3'—5']-尿苷酰-[3'—5']-腺苷酰-[3'—5']-胞苷酰-[3'—5']-鳥苷酰-[3'—5']-胞苷酰-[3'—5']-尿苷酰-[3,—5，].-鳥苷酰-[3，—5，]-腺苷酰-[3,—5，]--鳥苷酰-[3，—5,]-尿苷酰-[3，一5，].-腺苷酰-[3,—5，].-胞苷酰-[3，—5，]-尿苷酰-[3，—5，]-尿苷酰_[3,—5，]'-胞苷酰-[3，—5,]'-鳥苷酰-[3，—5，]-腺苷酰-[3，—5，]-尿苷的制造將負(fù)載有市售的2，/3，-0-苯甲?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)尿苷的CPG固相載體(37mg，lumol)裝入帶玻璃濾器的柱子中，使用核酸自動合成機(jī)(Expedite:美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystems))進(jìn)行作為標(biāo)題化合物的低聚RNA的合成。作為核酸單體化合物使用5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)、N4-乙?；?5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)、N6-乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)、N2-苯氧基乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)，作為縮合催化劑使用5-乙硫基四唑，作為氧化劑使用碘溶液，作為加帽劑溶液使用苯氧基乙酸酐和N-甲基咪唑溶液。使核酸單體化合物縮合19次后，在固相上進(jìn)行5'末端的羥基的保護(hù)基的除去，然后，作為切割試劑使用濃氨水-乙醇混合液(3:l)，于4(TC用4小時(shí)實(shí)施從CPG固相載體的切割和各磷酸部位的保護(hù)基的脫離反應(yīng)及堿基的保護(hù)基的除去。減壓下濃縮反應(yīng)混合物后，用含10%正丙胺、0.6%雙(2-巰基乙基)醚的1M氟化四丁基銨的THF溶液于室溫反應(yīng)1小時(shí)，除去2'位羥基的保護(hù)基。進(jìn)行溶液的脫鹽處理后，用DEAE-離子交換樹脂(TOYOPEARLDEAE-650)精制，獲得高純度的目標(biāo)化合物(1120D26。，收率58%)。這里，作為目標(biāo)化合物的收量，采用了波長260nm的紫外線吸光度(0D26。)。以下，同樣地將吸光度(OD，)作為目標(biāo)化合物的收量。MALDI-T0F-MS:計(jì)算值6305.9[M+H]+實(shí)測值6304.8[M+H]+試驗(yàn)例1W-乙?；?2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷將50g(95mmo1)的N4-乙?；?3，，5，-0-(四異丙基二硅氧垸-1，3-二基)胞苷溶于500mL(142mmol)THF，加入18.64g甲硫基甲基2-氰基乙基醚和40g分子篩4A，氮?dú)夥障掠谝?5。C攪拌30分鐘。滴加21.41g(142mmol)三氟甲磺酸后，加入31.97g(142mmol)N-碘琥珀酰亞胺，攪拌30分鐘。在反應(yīng)液中加入三乙胺80ml，過濾后用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層依次用1M硫代硫酸氫鈉水溶液、飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和氯化鈉水溶液洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑。將所得殘?jiān)苡?00mL的THF，加入18.3g(110mmo1)三乙胺三氫氟酸鹽，于45。C攪拌2小時(shí)。通過吸濾回收生成的析出物，用冷卻的THF洗滌，干燥，獲得目標(biāo)化合物(27g，收率78%)。ESI-質(zhì)譜:391.3[M+Na]+<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>對于核糖的2，位羥基被l-(2-氰基乙氧基)乙基保護(hù)、3'位羥基和5，羥基被二硅氧垸基保護(hù)的胞苷衍生物，如果使用三乙胺三氫氟酸鹽，將保護(hù)3，位羥基和5'位羥基的二硅氧烷基脫保護(hù)，則無需進(jìn)行硅膠柱精制就能夠作為析出物獲得目標(biāo)化合物。試驗(yàn)例2N2-苯氧基乙?；?2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷將47g(63mmo1)的N2-苯氧基乙?；?3，，5，-0-(四異丙基二硅氧垸-1，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷溶于280itiL乙腈，加入15.3g(95mmol)三乙胺三氫氟酸鹽，于35'C攪拌2小時(shí)。用100ml對反應(yīng)液萃取2次，在剩余的乙腈層中加入30ml水，室溫下攪拌5分鐘。通過吸濾回收生成的析出物，用冷卻的混合溶劑(水乙腈=1:1)洗滌，干燥，獲得目標(biāo)化合物(22g，收率69%)。ESI-質(zhì)譜:500[M—H]一<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>對于核糖的2'位羥基被1-(2-氰基乙氧基)乙基保護(hù)、3'位羥基和5，羥基被二硅氧垸基保護(hù)的鳥苷衍生物，如果使用三乙胺三氫氟酸鹽，將保護(hù)3，位羥基和5，位羥基的二硅氧烷基脫保護(hù)，則無需進(jìn)行硅膠柱精制就能夠作為析出物獲得目標(biāo)化合物。試驗(yàn)例3N6-乙?；?2'-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷將44g(69誦o1)的N6-乙?；?3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-l，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于150mL的THF，將13.4g(83mmo1)的三乙胺三氫氟酸鹽溶于50mL的THF形成的溶液，加入該溶液，于45。C攪拌1小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，加入50mL己垸，冰冷下攪拌。通過吸濾回收生成的析出物，獲得目標(biāo)化合物(29g,定量)。ESI-質(zhì)譜415.4[M+Na]+<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>對于核糖的2'位羥基被1-(2-氰基乙氧基)乙基保護(hù)、3'位羥基和5，羥基被二硅氧垸基保護(hù)的腺苷衍生物，如果使用三乙胺三氫氟酸鹽，將保護(hù)3，位羥基和5'位羥基的二硅氧垸基脫保護(hù)，則無需進(jìn)行硅膠柱精制就能夠作為析出物獲得目標(biāo)化合物。產(chǎn)業(yè)上利用的可能性利用本發(fā)明，在將保護(hù)核糖核酸衍生物(l)的核糖的3'位羥基和5'位羥基的硅取代基脫離的工序中，使叔胺和氫氟酸的鹽或叔胺和氫氟酸的混合物作用，藉此無需硅膠柱精制操作，就能夠以低成本高純度地作為析出物獲得核糖核酸衍生物(3)。因此，如果采用本發(fā)明，則能夠以低成本制造可用于低聚RNA(B)的制造的亞磷酰胺化合物(A)。權(quán)利要求1.以下的通式(3)表示的核糖核酸衍生物的制造方法，其特征在于，使以下的通式(2)表示的叔胺和氫氟酸的鹽或叔胺和氫氟酸的混合物作用于以下的通式(1)表示的核糖核酸衍生物，將保護(hù)核糖的3’位羥基和5’位羥基的硅取代基脫離，式(1)、(2)及(3)中，Bz表示可具有保護(hù)基的核酸堿基或其修飾體，R7a、R7b、R7c分別相同或不同，表示烷基，或者R7a、R7b、R7c表示與鄰接的氮原子一起形成的2環(huán)性飽和氨基環(huán)基，x表示1～30的范圍內(nèi)的數(shù)，WG1表示吸電子基團(tuán)，A表示以下的通式(4a)或(4b)表示的硅取代基，式(4a)及(4b)中，R6表示烷基。2.如權(quán)利要求1所述的核糖核酸衍生物的制造方法，其特征在于，x表示215的范圍內(nèi)的數(shù)。3.如權(quán)利要求1或2所述的核糖核酸衍生物的制造方法，其特征在于，叔胺和氫氟酸的鹽是三乙胺三氫氟酸鹽。4.如權(quán)利要求13中任一項(xiàng)所述的核糖核酸衍生物的制造方法，其特征在于，WG'為氰基。5.以下的通式(A)表示的亞磷酰胺化合物的制造方法，R1iOBzWG2R"N、R2b(A)式(A)中，Bz表示可具有保護(hù)基的核酸堿基或其修飾體，R'表示以下的通式(5)表示的取代基，(5)式(5)中，R11、R12、R"相同或不同，表示氫或烷氧基，R2a、R^相同或不同，表示垸基或R23、R2b表示與鄰接的氮原子一起形成的56元的飽和氨基環(huán)基，該飽和氨基環(huán)基除了氮原子以外可具有1個(gè)作為成環(huán)原子的氧原子或硫原子，WG1、WG2相同或不同，表示吸電子基團(tuán)，其特征在于，包括下述工序通過使以下的通式(2)表示的叔胺和氫氟酸的鹽或叔胺和氫氟酸的混合物作用于以下的通式(l)表示的核糖核酸衍生物，將保護(hù)核糖的3'位羥基和5'位羥基的硅取代基脫離而制造以下的通式(3)表示的核糖核酸衍生物，xHF(2)WG1、WG1(3)式(l)、(2)及(3)中，Bz、WGi如前所述，R7a、R7b、R"分別相同或不同，表示烷基，或者R7a、R7b、R^表示與鄰接的氮原子一起形成的2環(huán)性飽和氨基環(huán)基，x表示l30的范圍內(nèi)的數(shù)，A表示以下的通式(4a)或(4b)表示的硅取代基，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式(4a)及(4b)中，R6表示烷基。6.如權(quán)利要求5所述的亞磷酰胺化合物的制造方法，其特征在于，x表示215的范圍內(nèi)的數(shù)。7.如權(quán)利要求5或6所述的亞磷酰胺化合物的制造方法，其特征在于，叔胺和氫氟酸的鹽是三乙胺三氫氟酸鹽。8.如權(quán)利要求57中任一項(xiàng)所述的亞磷酰胺化合物的制造方法，其特征在于，WG'為氰基。9.以下的通式(A)表示的亞磷酰胺化合物的制造方法，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式(A)中，Bz表示可具有保護(hù)基的核酸堿基或其修飾體，W表示以下的通式(5)表示的取代基，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式(5)中，R11、R12、R"相同或不同，表示氫或烷氧基，R2a、R^相同或不同，表示烷基或R23、R2b表示與鄰接的氮原子一起形成的56元的飽和氨基環(huán)基，該飽和氨基環(huán)基除了氮原子以外可具有1個(gè)作為成環(huán)原子的氧原子或硫原子，WG1、WG2相同或不同，表示吸電子基團(tuán)，其特征在于，包括以下的步驟af，步驟a:通過使烷基化試劑作用于以下的通式(6)表示的核糖核酸衍生物，制備在2，位羥基導(dǎo)入了中性條件下脫離的醚型保護(hù)基的下述通式(1)表示的核糖核酸衍生物的步驟，、，取烷基化試劑<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式(1)及(6)中，Bz、W&如前所述，A表示以下的通式(4a)或(4b)表示的硅取代基，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式(4a)及(4b)中，R6表示垸基，步驟b:與步驟a分別進(jìn)行，通過使二甲亞砜、乙酸和乙酸酐作用于核糖核酸衍生物(6)而制造下述通式(7)表示的核糖核酸衍生物的步驟，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式(6)及(7)中，A、Bz如前所述，步驟c:通過使下述通式(8)表示的醇化合物、酸和針對于硫原子的鹵化劑作用于步驟b制得的核糖核酸衍生物(7)，制備在2'位羥基導(dǎo)入了中性條件下脫離的醚型保護(hù)基的下述通式(l)表示的核糖核酸衍生物的步驟，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式(l)、(7)及(8)中，A、Bz、WG工如前所述，步驟d:使以下的通式(2)表示的叔胺和氫氟酸的鹽或叔胺和氫氟酸的混合物作用于步驟a或c制得的以下的通式(l)表示的核糖核酸衍生物，將保護(hù)核糖的3'位羥基和5，位羥基的硅取代基脫離而制造下述通式(3)表示的核糖核酸衍生物的步驟，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式(l)、(2)及(3)中，A、Bz、WG'如前所述，R7a、R7b、R7e分別相同或不同，表示垸基，或者R73、R7b、R"表示與鄰接的氮原子一起形成的2環(huán)性飽和氨基環(huán)基，x表示l30的范圍內(nèi)的數(shù)，步驟e:在步驟d制得的核糖核酸衍生物(3)的5'位羥基導(dǎo)入酸性條件下脫離的保護(hù)基(R1)的制造核糖核酸衍生物(10)的步驟，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式(3)、(9)及(10)中，Bz、R1、WG^口前所述，X3表示鹵素，步驟f:通過使亞磷酰胺化試劑和根據(jù)需要使用的活化劑作用于步驟e制得的核糖核酸衍生物(IO)，制備3，位羥基被亞磷酰胺化的以下的通式(A)表示的亞磷酰胺化合物的步驟，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式(10)及(A)中，Bz、R1、WG'如前所述，R2a、！^b相同或不同，表示烷基或R23、R2b表示與鄰接的氮原子一起形成的56元的飽和氨基環(huán)基，該飽和氨基環(huán)基除了氮原子以外可具有l(wèi)個(gè)作為成環(huán)原子的氧原子或硫原子，WG2表示吸電子基團(tuán)。10.如權(quán)利要求9所述的亞磷酰胺化合物的制造方法，其特征在于，垸基化試劑為以下的通式(ll)表示的醚化合物，(11)式(11)中，L表示鹵素、芳硫基、垸基亞砜基或垸硫基，^W^^表示吸電子基團(tuán)。11.如權(quán)利要求9或10所述的亞磷酰胺化合物的制造方法，其特征在于，x表示215的范圍內(nèi)的數(shù)。12.如權(quán)利要求911中任一項(xiàng)所述的亞磷酰胺化合物的制造方法，其特征在于，叔胺和氫氟酸的鹽是三乙胺三氫氟酸鹽。13.如權(quán)利要求912中任一項(xiàng)所述的亞磷酰胺化合物的制造方法，其特征在于，^\^}1為氰基。14.如權(quán)利要求913中任一項(xiàng)所述的亞磷酰胺化合物的制造方法，其特征在于，亞磷酰胺化試劑為以下的通式(12a)或(12b)表示的化合物，t2aR2b，1(12a)(12b)式(12a)及(12b)中，R2a、R^相同或不同，表示烷基或R23、R"表示與鄰接的氮原子一起形成的56元的飽和氨基環(huán)基，該飽和氨基環(huán)基除了氮原子以外可具有l(wèi)個(gè)作為成環(huán)原子的氧原子或硫原子，WG2表示吸電子基團(tuán)，X'表示鹵素。15.如權(quán)利要求914中任一項(xiàng)所述的亞磷酰胺化合物的制造方法，其特征在于，步驟f中使用的活化劑為1H-四唑、5-乙硫基四唑、5-苯甲基巰基-lH-四唑、4，5-二氯咪唑、4，5-二氰基咪唑、三氟甲磺酸苯并三唑鹽、三氟甲磺酸咪唑鹽、三氟甲磺酸吡啶鏡鹽、N,N-二異丙基乙胺或2,4，6-三32:-Rb2RN-R甲基吡啶/N-甲基咪唑。16.以下的通式(B)表示的低聚RNA的制造方法:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>式(B)中，各B分別獨(dú)立，表示核酸堿基或其修飾體，各Q分別獨(dú)立，表示O或S，各R分別獨(dú)立，表示H、羥基、鹵素、烷氧基、垸硫基、垸基氨基、二垸基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基或烷氧基烷基氧基，但至少l個(gè)表示羥基，Z表示H、磷酸基或硫代磷酸基，n表示l200的范圍內(nèi)的整數(shù)，其特征在于，使用由權(quán)利要求515中任一項(xiàng)所述的制造方法制備的亞磷酰胺化合物。全文摘要本發(fā)明的目的是提供對于核糖的2’位羥基被所述取代基(I)保護(hù)、3’位羥基和5’位羥基被硅取代基保護(hù)的核糖核酸衍生物，以低成本大量且高效地將保護(hù)核糖的3’位羥基和5’位羥基的硅取代基脫離的方法，式(I)中，WG1表示吸電子基團(tuán)。通過使通式(2)表示的叔胺和氫氟酸的鹽或叔胺和氫氟酸的混合物作用于通式(1)表示的核糖核酸衍生物，將保護(hù)核糖的3’位羥基和5’位羥基的硅取代基脫離，藉此制造通式(3)表示的核糖核酸衍生物。文檔編號C07H19/00GK101421289SQ20078001378公開日2009年4月29日申請日期2007年2月26日優(yōu)先權(quán)日2006年2月27日發(fā)明者北川英俊,增田博文申請人:日本新藥株式會社