專利名稱：核酸保護(hù)基的脫去方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以良好的再現(xiàn)性有效地將保護(hù)低聚核酸衍生物的各核糖的2’位羥基的在中性條件下可脫去的醚型保護(hù)基，例如2-氰基乙氧基甲基(以下稱為CEM基)脫去的方法。

背景技術(shù)：
低聚核糖核酸(低聚RNA)作為基因解析的RNA探針、RNA藥物原材料(反義RNA、核酶、利用了RNAi的基因表達(dá)控制)、人工酶、適體有用。
作為用于制造低聚RNA的1種試劑，已知的有核糖的2’位羥基被中性條件下可脫去的CEM基取代保護(hù)起來的亞磷酰胺化合物(非專利文獻(xiàn)1)。
使用所述亞磷酰胺化合物制造低聚RNA時，在固相載體上制得所希望的鏈長的低聚RNA后，必須要從該低聚RNA除去固相載體和各取代基的保護(hù)基。作為除去該保護(hù)基的工序之一，有將保護(hù)低聚RNA的各核糖的2’位羥基的中性條件下可脫去的醚型保護(hù)基脫去的工序，在該工序中，一般使用氟化四丁基銨(以下稱為TBAF)作為脫保護(hù)劑，使用四氫呋喃(以下稱為THF)作為溶劑(非專利文獻(xiàn)1)。
非專利文獻(xiàn)1大木等，ORGANIC LETTERS，Vol，7，3477(2005) 發(fā)明的揭示 本發(fā)明的目的主要是提供以良好的再現(xiàn)性有效地將保護(hù)低聚核酸衍生物的各核糖的2’位羥基的在中性條件下可脫去的醚型保護(hù)基脫去的方法。
本發(fā)明者為了實現(xiàn)上述目的而進(jìn)行認(rèn)真探討的結(jié)果是，通過在使TBAF作用于以下的通式(10)表示的低聚核酸衍生物、將保護(hù)各核糖的2’位羥基的中性條件下可脫去的醚型保護(hù)基脫去的工序中，作為反應(yīng)溶劑使用可含THF的亞砜類溶劑或酰胺類溶劑或它們的混合溶劑，可有效地制得以下的通式(11)表示的低聚核酸衍生物，藉此完成了本發(fā)明。

式(10)及(11)中，各B分別獨立，表示核酸堿基或其修飾體，n表示1～200的范圍內(nèi)的整數(shù)，n優(yōu)選為10～100的范圍內(nèi)的整數(shù)，更好為15～50的范圍內(nèi)的整數(shù)，各Q分別獨立，表示O或S，各R分別獨立，表示H、羥基、鹵素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基或烷氧基烷氧基，但至少1個表示羥基，Z表示H、磷酸基或硫代磷酸基。
R1表示以下的通式(3)表示的取代基。

式(3)中，R11、R12、R13相同或不同，表示氫或烷氧基。
各R4分別獨立，表示H、鹵素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷氧基或以下的通式(4)表示的取代基。

式(4)中，WG1表示吸電子基團(tuán)。
對以B表示的核酸堿基無特別限定，可例舉例如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶等嘧啶堿基，腺嘌呤、鳥嘌呤等嘌呤堿基。
B的修飾體由核酸堿基被任意的取代基取代而得，作為該取代基，可例舉例如鹵素、?；⑼榛?、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羥基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基，它們在任意的位置取代1～3個基團(tuán)。
作為B的修飾體中的鹵素，可例舉例如氟、氯、溴、碘。
作為B的修飾體中的酰基，可例舉例如直鏈狀或支鏈狀的碳數(shù)1～6的烷?；⑻紨?shù)7～13的芳?；?。具體可例舉例如甲?；?、乙?；⒄；?、異丙酰基、正丁酰基、異丁?；?、叔丁酰基、戊?；⒓乎；⒈郊柞；?、萘甲?；⒁阴１；?。
作為B的修飾體中的烷基，可例舉例如直鏈狀或支鏈狀的碳數(shù)1～5的烷基。具體可例舉例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、叔戊基等。該烷基可被取代，作為該取代基，可例舉例如鹵素、烷基、烷氧基、氰基、硝基，它們可在任意的位置取代有1～3個。
作為B的修飾體中的芳烷基、烷氧基烷基、一烷基氨基及二烷基氨基的烷基部分，可例舉與上述烷基相同的基團(tuán)。
作為B的修飾體中的烷氧基，可例舉例如直鏈狀或支鏈狀的碳數(shù)1～4的烷氧基。具體可例舉例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基等。其中較好的是碳數(shù)1～3的烷氧基，特好的是甲氧基。
B的修飾體中的烷氧基烷基的烷氧基部分可例舉與上述烷氧基相同的基團(tuán)。
作為B的修飾體中的芳烷基的芳基部分，可例舉例如碳數(shù)6～12的芳基。具體可例舉例如苯基、1-萘基、2-萘基、聯(lián)苯基等。該芳基可被取代，作為該取代基，可例舉例如鹵素、烷基、烷氧基、氰基、硝基，它們可在任意的位置取代有1～3個。
作為B的修飾體中的烷基、芳基的取代基的鹵素、烷基及烷氧基可分別例舉與上述相同的基團(tuán)。
作為R及R4中的鹵素、烷氧基、烷基氨基或二烷基氨基，可例舉與上述B的修飾體中的對應(yīng)的基團(tuán)相同的基團(tuán)。
作為R及R4中的烷氧基烷氧基、烷硫基的烷基部分，可例舉與上述B的修飾體中的烷基相同的基團(tuán)。
作為R及R4中的烷氧基烷氧基的烷氧基，可例舉與上述B的修飾體中的烷氧基相同的基團(tuán)。
作為R及R4中的鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基的鏈烯基部分，可例舉例如直鏈狀或支鏈狀的碳數(shù)2～6的鏈烯基。具體可例舉例如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、異丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、1-戊烯基、1-己烯基等。
作為R及R4中的炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基的炔基部分可例舉例如直鏈狀或支鏈狀的碳數(shù)2～4的炔基。具體可例舉例如乙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基等。
作為R11、R12、R13中的烷氧基，可例舉與上述B中的烷氧基相同的基團(tuán)。
作為WG1的吸電子基團(tuán)，可例舉例如氰基、硝基、烷基磺?；?、芳基磺?；?、鹵素。其中優(yōu)選氰基。
作為WG1的烷基磺?；械耐榛糠?，可例舉與上述B中的烷基相同的基團(tuán)。
作為WG1中的芳基磺?；姆蓟糠郑衫e與上述B中的芳基相同的基團(tuán)。
作為亞砜類溶劑，可例舉例如下述通式(I)表示的化合物。具體可例舉二甲亞砜(以下稱為DMSO)、乙基甲基亞砜等。其中優(yōu)選DMSO。
作為酰胺類溶劑，可例舉例如下述通式(II)表示的化合物。具體可例舉N，N-二甲基甲酰胺(以下稱為DMF)、N，N-二乙基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N，N-二乙基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等。其中優(yōu)選DMF。

式(I)及(II)中，Ra、Rb相同或不同，表示烷基，Rc、Rd相同或不同，表示烷基，Re表示氫或烷基，或者Rd表示烷基，Rc、Re表示與鄰接的氮原子及碳原子一起形成的5或6元的飽和環(huán)狀酰胺基。
此外，作為本發(fā)明，可例舉以下的通式(A)表示的低聚RNA(以下稱為低聚RNA(A))的制造方法。該方法包括制造以下的通式(11)表示的低聚核酸衍生物的步驟，該步驟的特征是，在使TBAF作用于以下的通式(10)表示的低聚核酸衍生物、將保護(hù)各核糖的2’位羥基的中性條件下可脫去的醚型保護(hù)基脫去的工序中，作為反應(yīng)溶劑使用可含THF的亞砜類溶劑或酰胺類溶劑或它們的混合溶劑。

式(10)及(11)中，各B、各Q、各R、各R4分別獨立，其含義如前所述，n、R1、Z如前所述。

式(A)中，各B、各Q、各R分別獨立，其含義如前所述，n、Z如前所述。
以下，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
I.亞磷酰胺化合物 作為用于上述低聚RNA(A)的制造的核糖核酸衍生物，可例舉以下的通式(B)表示的亞磷酰胺化合物(以下稱為亞磷酰胺化合物(B))。

式(B)中，BZ表示可具有保護(hù)基的核酸堿基或其修飾體，R1、WG1如前所述，WG2表示吸電子基團(tuán)，R2a、R2b相同或不同，表示烷基或表示R2a、R2b與鄰接的氮原子一起形成的5～6元的飽和氨基環(huán)基，該飽和氨基環(huán)基除了氮原子以外可具有1個作為成環(huán)原子的氧原子或硫原子。
作為BZ中的核酸堿基，只要是被用于核酸的合成的堿基即可，無特別限定，可例舉例如胞嘧啶、尿嘧啶等嘧啶堿基，腺嘌呤、鳥嘌呤等嘌呤堿基。
BZ中的核酸堿基可被保護(hù)，其中具有氨基的核酸堿基，例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶，其氨基最好被保護(hù)。作為該氨基的保護(hù)基，只要是作為核酸的保護(hù)基使用的基團(tuán)即可，無特別限定，具體可例舉例如苯甲?；?、4-甲氧基苯甲?；?、乙?；?、丙?；⒍□；?、異丁酰基、苯基乙?；?、苯氧基乙?；?-叔丁基苯氧基乙?；?-異丙基苯氧基乙?；?、(二甲基氨基)亞甲基等。
BZ的修飾體由核酸堿基被任意的取代基取代而得，作為BZ的修飾體的取代基，可例舉例如鹵素、?；⑼榛?、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羥基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基，它們可在任意的位置取代有1～3個。
作為BZ的修飾體中的鹵素、?；?、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、一烷基氨基、二烷基氨基，可例舉與上述B的修飾體中的對應(yīng)的基團(tuán)相同的基團(tuán)。
作為R2a、R2b中的烷基，可例舉與上述B的修飾體中的烷基相同的基團(tuán)。
作為R2a、R2b中的5～6元飽和氨基環(huán)基，可例舉例如吡咯烷-1-基、哌啶-1-基、嗎啉-1-基、硫代嗎啉-1-基。
作為WG2的吸電子基團(tuán)，可例舉與上述WG1的吸電子基團(tuán)相同的基團(tuán)。
亞磷酰胺化合物(B)是在2’位羥基具有中性條件下可脫去的醚型保護(hù)基的亞磷酰胺化合物。此外，由于被導(dǎo)入2’位羥基的基團(tuán)是直鏈狀的取代基，與3’位的羥基結(jié)合的磷原子的周圍的空間不擁擠，因此與以往使用的亞磷酰胺化合物相比，在合成低聚RNA時具有縮合反應(yīng)在非常短的時間內(nèi)進(jìn)行、縮合收率良好的特征。通過使用亞磷酰胺化合物(B)，用與低聚DNA的制造相同的方法可制得高純度的低聚RNA(A)。
這里，低聚DNA是指僅由脫氧核糖核酸(DNA)形成的低聚核酸。此外，本發(fā)明中的低聚RNA是指由核糖核酸(RNA)及脫氧核糖核酸(DNA)形成的低聚核酸，是含有至少1個核糖核酸(RNA)的低聚核酸。
實施發(fā)明的最佳方式 以下所示的制法中，在原料具備對反應(yīng)有影響的取代基(例如，羥基、氨基、羧基)時，預(yù)先按照公知的方法用合適的保護(hù)基對原料進(jìn)行保護(hù)后再進(jìn)行反應(yīng)。最后通過催化還原、堿處理、酸處理等公知方法將保護(hù)基脫去。
II.亞磷酰胺化合物(B)的制造方法 亞磷酰胺化合物(B)可按照如下步驟制備。
亞磷酰胺化合物(B)可由公知化合物或易制備的中間體通過實施例如以下的步驟a～步驟h的操作而制得。
以下進(jìn)行詳細(xì)說明。
(1)步驟a 通過使烷基化試劑作用于以下的通式(12)表示的核糖核酸衍生物，制備在2’位羥基導(dǎo)入中性條件下脫去的醚型保護(hù)基的下述通式(13)、(13’)表示的核糖核酸衍生物的步驟。

式(12)、(13)及(13’)中，BZ、R1、WG1如前所述。
烷基化試劑可例舉例如以下的通式(14)表示的醚化合物。

式(14)中，L表示鹵素、芳硫基、烷基亞砜基或烷硫基，WG1如前所述。
L所表示的鹵素、芳硫基中的芳基、烷基亞砜基及烷硫基中的烷基可例舉與上述B的修飾體中的鹵素、芳基、烷基相同的基團(tuán)。
作為醚化合物(14)的具體例，可例舉以下的1～2的化合物。
1.氯甲基2-氰基乙基醚 2.2-氰基乙基甲硫基甲基醚 醚化合物(14)是可在堿性條件下對2’位羥基導(dǎo)入中性條件下可脫去的醚型取代基的新的烷基化試劑，作為制備亞磷酰胺化合物(B)的試劑有用。
醚化合物(14)可通過實施以下的步驟1～步驟4來制備。
步驟1 將以下的通式(15)表示的醇化合物烷硫基甲基化，制備以下的通式(16)表示的化合物的步驟。

式(15)及(16)中，WG1如前所述，R3表示烷基或芳基。
化合物(16)是L為烷硫基的醚化合物(14)。
R3所表示的烷基可例舉與上述B的修飾體中的烷基同樣的基團(tuán)。
R3為甲基時，作為烷硫基甲基化試劑，可例舉例如二甲亞砜、乙酸酐及乙酸的混合溶液。二甲亞砜的用量相對于化合物(15)的摩爾量以10～200倍摩爾量為宜，優(yōu)選20～100倍摩爾量。乙酸的用量相對于化合物(15)的摩爾量以10～150倍摩爾量為宜，優(yōu)選20～100倍摩爾量。乙酸酐的用量相對于化合物(15)的摩爾量以10～150倍摩爾量為宜，優(yōu)選20～100倍摩爾量。反應(yīng)溫度優(yōu)選0℃～100℃。反應(yīng)時間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以1～48小時為宜。
步驟2 將化合物(16)鹵化，制備以下的通式(17)表示的化合物的步驟。

式(16)及(17)中，WG1、R3如前所述，X2表示鹵素。
化合物(17)是醚化合物(14)中的L為鹵素的化合物。
X2所表示的鹵素可例舉與上述B的修飾體中的鹵素同樣的鹵素。
本步驟可按照公知的方法(例如，T.Benneche等，Synthesis 762(1983))實施。所用溶劑只要不會影響反應(yīng)即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷等鹵代烴類等。作為鹵化劑，可例舉例如硫酰氯、磷酰氯。鹵化劑的用量相對于化合物(16)的摩爾量以0.8～20倍摩爾量為宜，優(yōu)選1～10倍摩爾量。反應(yīng)溫度以0℃～100℃為宜。反應(yīng)時間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以30分鐘～24小時為宜。
步驟3 將化合物(17)芳硫化，制備以下通式(18)表示的化合物的步驟。

式(17)及(18)中，WG1、X2如前所述，R3a表示芳基。
化合物(18)是醚化合物(14)中的L為芳硫基的化合物。
R3a所表示的芳基可例舉與上述B的修飾體中的芳基同樣的基團(tuán)。
本步驟可采用公知方法實施。所用溶劑只要不會影響反應(yīng)即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲烷、乙腈。作為芳硫基化試劑，可例舉例如苯硫酚、4-甲基苯硫醇。芳硫基化試劑的用量相對于化合物(17)的摩爾量以0.8～20倍摩爾量為宜，優(yōu)選1～5倍摩爾量。反應(yīng)溫度以0℃～100℃為宜。反應(yīng)時間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以1～48小時為宜。
步驟4 將化合物(16)氧化，制備下述通式(19)表示的化合物的步驟。

式(16)及(19)中，WG1、R3如前所述。
化合物(19)是醚化合物(14)中的L為烷基亞砜基的化合物。
R3所表示的烷基可例舉與上述B的修飾體中的烷基相同的基團(tuán)。
本步驟可采用公知方法實施。所用溶劑只要不會影響反應(yīng)即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲烷、氯仿、甲醇。作為氧化劑，可例舉例如間氯過苯甲酸、偏高碘酸鹽、過氧化氫。氧化劑的用量相對于化合物(16)的摩爾量以0.8～10倍摩爾量為宜，優(yōu)選1～2倍摩爾量。反應(yīng)溫度以0℃～100℃為宜。反應(yīng)時間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以1～48小時為宜。
烷基化試劑采用化合物(17)時，可如下實施。
本步驟可按照公知方法，通過使烷基化試劑和堿作用于可作為市售品獲得或可按照文獻(xiàn)記載的方法合成的核糖核酸衍生物(12)而實施。所用溶劑只要不會影響反應(yīng)即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷等鹵代烴類。烷基化試劑的用量相對于核糖核酸衍生物(12)的摩爾量以0.8～20倍摩爾量為宜，優(yōu)選1～10倍摩爾量。本步驟中，也可根據(jù)需要使金屬試劑和堿作用于核糖核酸衍生物(12)，制得中間體后再使烷基化試劑與之作用。所述金屬試劑可例舉例如二氯化二丁基錫。金屬試劑的用量相對于核糖核酸衍生物(12)的摩爾量以0.8～20倍摩爾量為宜，優(yōu)選1～10倍摩爾量。作為堿，可例舉吡啶、2，6-二甲基吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、N-甲基咪唑、三乙胺、三丁胺、N，N-二異丙基乙胺、1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]-7-十一烯等有機(jī)堿。堿的用量相對于核糖核酸衍生物(12)的摩爾量以0.8～20倍摩爾量為宜，優(yōu)選1～10倍摩爾量。反應(yīng)溫度以0℃～120℃為宜。反應(yīng)時間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以30分鐘～24小時為宜。
烷基化試劑采用化合物(16)或(18)時，可如下實施。
本步驟可按照公知方法(例如，M.Matteucci，Tetrahedron Letters，Vol.31，2385(1990))，通過使烷基化試劑、酸和針對于硫原子的鹵化劑作用于可作為市售品獲得或可按照文獻(xiàn)記載的方法合成的核糖核酸衍生物(12)而實施。烷基化試劑的用量相對于核糖核酸衍生物(12)的摩爾量以0.8～5倍摩爾量為宜，優(yōu)選1～3倍摩爾量。作為酸，可例舉例如三氟甲磺酸、三氟甲磺酸銀、三氟甲磺酸三甲基硅烷基酯。酸的用量相對于核糖核酸衍生物(12)的摩爾量以0.01～20倍摩爾量為宜，優(yōu)選0.02～10倍摩爾量。所用溶劑只要不會影響反應(yīng)即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、THF、乙腈或它們的任意的混合溶劑。作為本步驟中所用的針對于硫原子的鹵化劑，可例舉例如N-溴琥珀酰亞胺(NBS)、N-碘琥珀酰亞胺(NIS)。針對于硫原子的鹵化劑的用量相對于核糖核酸衍生物(12)的摩爾量以0.8～10倍摩爾量為宜，優(yōu)選1～5倍摩爾量。反應(yīng)溫度以—78℃～30℃為宜。反應(yīng)時間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以5分鐘～5小時為宜。
烷基化試劑采用化合物(19)時，可如下實施。
本步驟可按照公知方法，通過使烷基化試劑、酸酐和堿作用于可作為市售品獲得或可按照文獻(xiàn)記載的方法合成的核糖核酸衍生物(12)而實施。烷基化試劑的用量相對于核糖核酸衍生物(12)的摩爾量以0.8～5倍摩爾量為宜，優(yōu)選1～3倍摩爾量。作為酸酐，可例舉例如三氟甲磺酸酐、乙酸酐。酸酐的用量相對于核糖核酸衍生物(12)的摩爾量以0.01～20倍摩爾量為宜，優(yōu)選0.02～10倍摩爾量。作為堿，可例舉例如四甲基脲、三甲基吡啶。堿的用量相對于核糖核酸衍生物(12)的摩爾量以0.01～20倍摩爾量為宜，優(yōu)選0.02～10倍摩爾量。所用溶劑只要不會影響反應(yīng)即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷或它們的任意的混合溶劑。反應(yīng)溫度以—78℃～30℃為宜。反應(yīng)時間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以5分鐘～24小時為宜。
(2)步驟b 分離精制步驟a制得的核糖核酸衍生物(13)的步驟。
本步驟可通過例如薄層色譜法、硅膠色譜法等常規(guī)的分離精制方法從步驟a制得的混合物進(jìn)行分離精制。
(3)步驟c 與步驟b分別進(jìn)行，通過使烷基化試劑作用于以下的通式(20)表示的核糖核酸衍生物，制得在2’位羥基導(dǎo)入了中性條件下脫去的醚型保護(hù)基的以下的通式(21)表示的核糖核酸衍生物的步驟。

式(20)及(21)中，BZ、WG1如前所述，A表示以下的通式(22a)或(22b)所示的硅取代基。

式(22a)及(22b)中，R6表示烷基。
R6所表示的烷基可例舉與上述B的修飾體中的烷基相同的基團(tuán)。
烷基化試劑可例舉與前述相同的試劑。
烷基化試劑采用化合物(17)時，可如下實施。
本步驟可按照公知方法，通過使烷基化試劑和堿作用于可作為市售品獲得或可按照文獻(xiàn)記載的方法合成的核糖核酸衍生物(20)而實施。所用溶劑只要不會影響反應(yīng)即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷等鹵代烴類。烷基化試劑的用量相對于核糖核酸衍生物(20)的摩爾量以0.8～20倍摩爾量為宜，優(yōu)選1～10倍摩爾量。本步驟中，也可根據(jù)需要使金屬試劑和堿作用于核糖核酸衍生物(20)，制得中間體后再使烷基化試劑作用。所述金屬試劑可例舉例如二氯化二丁基錫、氯化叔丁基鎂。金屬試劑的用量相對于核糖核酸衍生物(20)的摩爾量以0.8～20倍摩爾量為宜，優(yōu)選1～10倍摩爾量。作為堿，可例舉吡啶、2，6-二甲基吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、N-甲基咪唑、三乙胺、三丁胺、N，N-二異丙基乙胺、1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]-7-十一烯等有機(jī)堿等。堿的用量相對于核糖核酸衍生物(20)的摩爾量以0.8～20倍摩爾量為宜，優(yōu)選1～10倍摩爾量。反應(yīng)溫度以0℃～120℃為宜。反應(yīng)時間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以30分鐘～24小時為宜。
烷基化試劑采用化合物(16)或化合物(18)時，可如下實施。
本步驟可按照公知方法(例如，M.Matteucci，Tetrahedron Letters，Vol.31，2385(1990))，通過使烷基化試劑、酸和針對于硫原子的鹵化劑作用于可作為市售品獲得或可按照文獻(xiàn)記載的方法合成的核糖核酸衍生物(20)而實施。烷基化試劑的用量相對于核糖核酸衍生物(20)的摩爾量以0.8～5倍摩爾量為宜，優(yōu)選1～3倍摩爾量。作為酸，可例舉例如三氟甲磺酸、三氟甲磺酸銀、三氟甲磺酸三甲基硅烷基酯。酸的用量相對于核糖核酸衍生物(20)的摩爾量以0.01～20倍摩爾量為宜，優(yōu)選0.02～10倍摩爾量。所用溶劑只要不會影響反應(yīng)即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、THF、乙腈或它們的任意的混合溶劑。作為本步驟中所用的針對于硫原子的鹵化劑，可例舉例如N-溴琥珀酰亞胺(NBS)、N-碘琥珀酰亞胺(NIS)。針對于硫原子的鹵化劑的用量相對于核糖核酸衍生物(20)的摩爾量以0.8～10倍摩爾量為宜，優(yōu)選1～5倍摩爾量。反應(yīng)溫度以—78℃～30℃為宜。反應(yīng)時間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以5分鐘～5小時為宜。
烷基化試劑采用化合物(19)時，可如下實施。
本步驟可按照公知方法，通過使烷基化試劑、酸酐和堿作用于可作為市售品獲得或可按照文獻(xiàn)記載的方法合成的核糖核酸衍生物(20)而實施。烷基化試劑的用量相對于核糖核酸衍生物(20)的摩爾量以0.8～5倍摩爾量為宜，優(yōu)選1～3倍摩爾量。作為酸酐，可例舉例如三氟甲磺酸酐、乙酸酐。酸酐的用量相對于核糖核酸衍生物(20)的摩爾量以0.01～20倍摩爾量為宜，優(yōu)選0.02～10倍摩爾量。作為堿，可例舉例如四甲基脲、三甲基吡啶。堿的用量相對于核糖核酸衍生物(20)的摩爾量以0.01～20倍摩爾量為宜，優(yōu)選0.02～10倍摩爾量。所用溶劑只要不會影響反應(yīng)即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷或它們的任意的混合溶劑。反應(yīng)溫度以—78℃～30℃為宜。反應(yīng)時間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以5分鐘～24小時為宜。
(4)步驟d 與步驟a～步驟c分別進(jìn)行，通過使二甲亞砜、乙酸和乙酸酐作用于核糖核酸衍生物(20)而制得下述通式(23)表示的核糖核酸衍生物的步驟。

式(20)及(23)中，A、BZ如前所述。
本步驟可按照公知方法，通過使二甲亞砜、乙酸和乙酸酐作用于可作為市售品獲得或可按照文獻(xiàn)記載的方法合成的核糖核酸衍生物(20)而實施。
二甲亞砜的用量相對于核糖核酸衍生物(20)的摩爾量以10～200倍摩爾量為宜，優(yōu)選20～100倍摩爾量。酸酐的用量相對于核糖核酸衍生物(20)的摩爾量以10～150倍摩爾量為宜，優(yōu)選20～100倍摩爾量。乙酸酐的用量相對于核糖核酸衍生物(20)的摩爾量以10～150倍摩爾量為宜，優(yōu)選20～100倍摩爾量。反應(yīng)溫度以10℃～50℃為宜。反應(yīng)時間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以30分鐘～24小時為宜。
(5)步驟e 通過使下述通式(24)表示的醇化合物、酸和針對于硫原子的鹵化劑作用于步驟d制得的核糖核酸衍生物(23)，制備在2’位羥基導(dǎo)入了中性條件下脫去的醚型保護(hù)基的下述通式(21)表示的核糖核酸衍生物的步驟。

式(21)、(23)及(24)中，A、BZ、WG1如前所述。
本步驟可按照公知方法，通過使醇化合物(24)、酸和針對于硫原子的鹵化劑作用于核糖核酸衍生物(23)而實施。
所用溶劑只要不會影響反應(yīng)即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、THF、乙腈或它們的任意的混合溶劑。醇化合物(24)的用量相對于核糖核酸衍生物(23)的摩爾量以0.8～20倍摩爾量為宜，優(yōu)選1～10倍摩爾量。作為酸，可例舉例如三氟甲磺酸、三氟甲磺酸銀、三氟甲磺酸三甲基硅烷基酯。作為針對于硫原子的鹵化劑，可例舉例如N-溴琥珀酰亞胺(NBS)、N-碘琥珀酰亞胺(NIS)。針對于硫原子的鹵化劑的用量相對于核糖核酸衍生物(23)的摩爾量以0.1～20倍摩爾量為宜，優(yōu)選0.2～10倍摩爾量。反應(yīng)溫度以—100℃～20℃為宜。反應(yīng)時間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以5分鐘～12小時為宜。
(6)步驟f 通過實施脫去步驟c或步驟e制得的核糖核酸衍生物(21)的3’位和5’位羥基的保護(hù)基的反應(yīng)，制得下述通式(25)表示的核糖核酸衍生物的步驟。

式(21)及(25)中，A、BZ、WG1如前所述。
本步驟可通過將核糖核酸衍生物(21)溶于有機(jī)溶劑，使單獨的氟化劑或氟化劑和酸(例如，乙酸、鹽酸、硫酸)的任意混合比的混合試劑與之反應(yīng)而實施。作為可用于本步驟的氟化劑，可例舉例如氟化銨、TBAF、三乙胺三氫氟酸鹽、氟化氫吡啶。氟化劑的用量相對于核糖核酸衍生物(21)的摩爾量以0.1～20倍摩爾量為宜，優(yōu)選0.2～10倍摩爾量。反應(yīng)溫度以0℃～120℃為宜。反應(yīng)時間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以30分鐘～24小時為宜。
混合試劑中的氟化劑和酸的混合比以1∶2～1∶0.1(氟化劑酸)為宜，優(yōu)選1∶1.2～1∶1。
(7)步驟g 在步驟f制得的核糖核酸衍生物(25)的5’位羥基導(dǎo)入酸性條件下脫去的保護(hù)基(R1)的核糖核酸衍生物(13)的制造步驟。

式(13)及(25)中，BZ、R1、WG1如前所述，X3表示鹵素。
X3所表示的鹵素可例舉與上述B的修飾體中的鹵素相同的鹵素。
本步驟可按照公知的方法，通過使R1X3(30)作用于核糖核酸衍生物(25)而實施。R1X3的用量相對于核糖核酸衍生物(25)的摩爾量以0.8～20倍摩爾量為宜，優(yōu)選1～10倍摩爾量。所用溶劑只要對反應(yīng)沒有影響即可，無特別限定，可例舉例如乙腈、THF。作為堿，可例舉吡啶、2，6-二甲基吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、N-甲基咪唑、三乙胺、三丁胺、N，N-二異丙基乙胺、1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]-7-十一烯等有機(jī)堿。堿的用量相對于核糖核酸衍生物(25)的摩爾量以0.8～20倍摩爾量為宜，優(yōu)選1～10倍摩爾量。反應(yīng)溫度以0℃～120℃為宜。反應(yīng)時間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以30分鐘～24小時為宜。
(8)步驟h 通過使亞磷酰胺化試劑和根據(jù)需要使用的活化劑作用于步驟b或步驟f制得的核糖核酸衍生物(13)，制備3’位羥基被亞磷酰胺化的亞磷酰胺化合物(B)的步驟。

式(13)及(B)中，BZ、R1、R2a、R2b、WG1、WG2如前所述。
作為亞磷酰胺化試劑，可例舉例如下述通式(26a)、(26b)表示的化合物。

式(26a)及(26b)中，R2a、R2b、WG2如前所述，X1表示鹵素。
X1所表示的鹵素可例舉與上述B的修飾體中的鹵素相同的鹵素。
本步驟是使亞磷酰胺化試劑作用于核糖核酸衍生物(13)而將3’位羥基亞磷酰胺化的反應(yīng)，可按照公知的方法實施。根據(jù)需要還可采用活化劑。所用溶劑只要對反應(yīng)沒有影響即可，無特別限定，可例舉例如乙腈、THF。
亞磷酰胺化試劑的用量相對于核糖核酸衍生物(13)的摩爾量以0.8～20倍摩爾量為宜，優(yōu)選1～10倍摩爾量。作為活化劑，可例舉例如1H-四唑、5-乙硫基四唑、5-苯甲基巰基-1H-四唑、4，5-二氯咪唑、4，5-二氰基咪唑、三氟甲磺酸苯并三唑鹽、三氟甲磺酸咪唑鹽、三氟甲磺酸吡啶鎓鹽、N，N-二異丙基乙胺、2，4，6-三甲基吡啶/N-甲基咪唑。活化劑的用量相對于核糖核酸衍生物(13)的摩爾量以0.8～20倍摩爾量為宜，優(yōu)選1～10倍摩爾量。反應(yīng)溫度以0℃～120℃為宜。反應(yīng)時間因所用原料的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以30分鐘～24小時為宜。
以上所制備的亞磷酰胺化合物(B)本身可通過例如濃縮、液相轉(zhuǎn)換、轉(zhuǎn)溶、溶劑萃取、結(jié)晶化、重結(jié)晶、分餾、層析等公知的方法進(jìn)行分離精制。
III.低聚RNA(A)的制造方法 低聚RNA(A)的制造方法如下所述。

式(A)中，各B、各Q、各R分別獨立，其含義如前所述，n、Z如前所述。
低聚RNA(A)的制法可按照公知方法進(jìn)行，但也可以例如通過實施以下所示的步驟A～步驟H的操作，分步驟地由3’至5’的方向縮合核酸單體化合物，藉此制備低聚RNA(A)。
被用于下述步驟的化合物及試劑中，除亞磷酰胺化合物(B)以外，只要是常用于低聚RNA或低聚DNA的合成的化合物及試劑即可，無特別限定。此外，與使用了現(xiàn)有的核酸合成試劑的情況同樣，所有的步驟可采用人工方法或市售的DNA自動合成機(jī)來進(jìn)行。用自動合成機(jī)進(jìn)行反應(yīng)時操作方法簡便，且合成的準(zhǔn)確性高，因此優(yōu)選采用自動合成機(jī)的方法。此外，下述步驟A～步驟H中記載的化合物及試劑中，除核酸單體化合物以外，只要是常用于低聚DNA或低聚RNA的合成的化合物及試劑即可，無特別限定。
此外，在低聚RNA(A)的制造方法中，作為核酸單體化合物至少1次使用亞磷酰胺化合物(B)，藉此可制得各R中的至少1個為羥基的低聚RNA(A)。另外，例如在后述的步驟B中，作為核酸單體化合物全部使用亞磷酰胺化合物(B)，藉此可制得各R都為羥基的低聚RNA(A)。
(1)步驟A 使酸作用于以下的通式(1)表示的(低聚)核酸衍生物，藉此脫去5’位羥基的保護(hù)基，制備以下的通式(2)表示的(低聚)核酸衍生物的步驟。

式(1)及(2)中，n、R1如前所述，各Q、各R4、各WG2分別獨立，其含義如前所述，各BX分別獨立，表示可具有保護(hù)基的核酸堿基或其修飾體。
E表示?；蛞韵碌耐ㄊ?5)表示的取代基。

式(5)中，E1表示單鍵或以下的通式(6)表示的取代基。

式(6)中，Q、WG2的含義如前所述。
T表示H、酰氧基、鹵素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷氧基、上述通式(4)表示的取代基或上述通式(5)表示的取代基，但E或T的任一方為取代基(5)。
BX中的核酸堿基只要是被用于核酸的合成的堿基即可，無特別限定，例如可例舉胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶等嘧啶堿基，腺嘌呤、鳥嘌呤等嘌呤堿基。
BX中的核酸堿基可被保護(hù)，其中具有氨基的核酸堿基，例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶，其氨基最好被保護(hù)。
作為該氨基的保護(hù)基，只要是作為核酸的保護(hù)基使用的基團(tuán)即可，無特別限定，具體可例舉例如苯甲?；?、4-甲氧基苯甲?；?、乙酰基、丙酰基、丁?；?、異丁?；?、苯基乙?；?、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-異丙基苯氧基乙?；?、(二甲基氨基)亞甲基等。
BX中的修飾體由核酸堿基被任意的取代基取代而得，作為BX中的修飾體的取代基，可例舉例如鹵素、?；?、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羥基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基，它們在任意的位置取代有1～3個。
作為BX的修飾體中的鹵素、?；⑼榛?、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烷基氨基、二烷基氨基，可例舉與上述B的修飾體中對應(yīng)的基團(tuán)相同的基團(tuán)。
作為E的?；?，可例舉與上述B的修飾體中的?；嗤幕鶊F(tuán)。
作為T的酰氧基中的?；糠郑衫e與上述B的修飾體中的?；嗤幕鶊F(tuán)。
作為T中的鹵素、烷氧基、烷基氨基及二烷基氨基，可例舉與上述B的修飾體中的對應(yīng)的基團(tuán)相同的基團(tuán)。
作為T中的烷氧基烷氧基及烷硫基的烷基部分，可例舉與上述B的修飾體中的烷基相同的基團(tuán)。
作為T中的烷氧基烷氧基的烷氧基部分，可例舉與上述B的修飾體中的烷氧基相同的基團(tuán)。
作為T中的鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基的鏈烯基部分，可例舉與上述R中的鏈烯基相同的基團(tuán)。
作為T中的炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基的炔基部分，可例舉與上述R中的炔基相同的基團(tuán)。
T中的烷基氨基、鏈烯基氨基、炔基氨基可被保護(hù)，作為該保護(hù)基，只要是用作氨基的保護(hù)基的基團(tuán)即可，無特別限定，可例舉例如三氟乙酰基、苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、異丁?；?、苯基乙?；⒈窖趸阴；?、4-叔丁基苯氧基乙?；?、4-異丙基苯氧基乙酰基、(二甲基氨基)亞甲基。特好的是三氟乙酰基。
該步驟通過使酸作用于被負(fù)載于固相載體的以下的通式(27a)、(27b)表示的核酸衍生物(n＝1的核酸衍生物(1))或通過進(jìn)行步驟A～步驟D的操作而制得的被負(fù)載于固相載體的低聚RNA或低聚DNA(n＝2～100的低聚核酸衍生物(1))(以下稱為被負(fù)載于固相載體的低聚核酸衍生物)而實施。

式(27a)及(27b)中，BX、R1的含義如前所述。R2L、R4L表示取代基(5)。R2表示酰氧基。R4a表示H、酰氧基、鹵素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷氧基或取代基(4)。
作為R2、R4a的酰氧基的?；糠?，可例舉與上述B的修飾體中的酰基相同的基團(tuán)。
作為R4a的鹵素、烷氧基、烷基氨基及二烷基氨基，可例舉與上述B的修飾體中的各對應(yīng)基團(tuán)相同的基團(tuán)。
作為R4a的烷氧基烷氧基及烷硫基的烷基部分，可例舉與上述B的修飾體中的烷基相同的基團(tuán)。
作為R4a的烷氧基烷氧基的烷氧基部分，可例舉與上述B的修飾體中的烷氧基相同的基團(tuán)。
作為R4a的鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基的鏈烯基部分，可例舉與上述R的鏈烯基相同的基團(tuán)。
作為R4a的炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基的炔基部分，可例舉與上述R的炔基相同的基團(tuán)。
R4a的烷基氨基、鏈烯基氨基、炔基氨基可被保護(hù)，該保護(hù)基只要是作為氨基的保護(hù)基使用的基團(tuán)即可，無特別限定，可例舉例如三氟乙酰基、苯甲?；?-甲氧基苯甲?；?、乙?；⒈；?、丁?；?、異丁?；?、苯基乙?；?、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙?；?、4-異丙基苯氧基乙酰基、(二甲基氨基)亞甲基。特好的是三氟乙酰基。
作為固相載體，可例舉例如可控的多孔玻璃(controlled pore glass；CPG)、草酰化-可控的多孔玻璃(例如參照Alul等，Nucleic Acids Research，Vol.19，1527(1991))、TentaGel支承體-氨基聚乙二醇衍生物化支承體(例如參照Wright等，Tetrahedron Letters，Vol.34，3373(1993))、空孔-聚苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物。
作為連接基，可例舉例如3-氨基丙基、琥珀?；?、2，2’-二乙醇磺?；㈤L鏈烷基氨基(LCAA)。
核酸衍生物(27a)、核酸衍生物(27b)是按照公知方法制得的或可作為市售品獲得的被負(fù)載于固相載體的核酸衍生物，作為其優(yōu)選例子，可例舉以下的通式(28)、(29)表示的核酸衍生物。

式(28)及(29)中，BX、Q、R1、R4、WG2如前所述。
R4為取代基(4)的核酸衍生物(28)、(29)可按照公知方法由亞磷酰胺化合物(B)制得。
作為可用于本步驟的酸，可例舉例如三氟乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸。可用于本步驟的酸也可用適當(dāng)?shù)娜軇⑵錆舛认♂屩?～5％后再使用。作為溶劑，只要不會對反應(yīng)有影響即可，無特別限定，可例舉二氯甲烷、乙腈、水或它們的任意的混合溶劑。上述反應(yīng)的反應(yīng)溫度優(yōu)選20℃～50℃。反應(yīng)時間因低聚核酸衍生物(1)的種類、所用酸的種類和反應(yīng)溫度等而異，通常以1分鐘～1小時為宜。所用試劑的量相對于被負(fù)載于固相載體的(低聚)核酸衍生物以0.8～100倍摩爾量為宜，更好為1～10倍摩爾量。
(2)步驟B 采用活化劑使核酸單體化合物與步驟A制得的(低聚)核酸衍生物(2)縮合，制備以下的通式(7)表示的低聚核酸衍生物的步驟。

式(2)及(7)中，各Bx、各Q、各R4、各WG2分別獨立，其含義如前所述。E、n、R1、T的含義如前所述。
本步驟可通過使核酸單體化合物和活化劑作用于被負(fù)載于固相載體的低聚核酸衍生物而實施。
作為核酸單體化合物，可例舉亞磷酰胺化合物(B)或以下的通式(30)表示的核酸衍生物。

式(30)中，R1、R2a、R2b、R4a、WG2的含義如前所述，BY表示可具有保護(hù)基的核酸堿基或其修飾體。
作為BY中的核酸堿基，只要是被用于核酸的合成的堿基即可，無特別限定，可例舉例如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶等嘧啶堿基，腺嘌呤、鳥嘌呤等嘌呤堿基。
BY中的核酸堿基可被保護(hù)，其中具有氨基的核酸堿基，例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶，其氨基最好被保護(hù)。
作為該氨基的保護(hù)基，只要是可作為核酸的保護(hù)基使用的基團(tuán)即可，無特別限定，具體可例舉苯甲?；?-甲氧基苯甲?；?、乙?；⒈；?、丁酰基、異丁?；?、苯基乙?；⒈窖趸阴；?、4-叔丁基苯氧基乙?；?-異丙基苯氧基乙?；?二甲基氨基)亞甲基。
BY的修飾體由核酸堿基被任意的取代基取代而得，作為BY的修飾體的取代基，可例舉例如鹵素、?；⑼榛?、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羥基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基，它們可在任意的位置取代有1～3個。
作為BY的修飾體中的鹵素、?；?、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、一烷基氨基、二烷基氨基，可例舉與上述各B的修飾體中的對應(yīng)的基團(tuán)相同的基團(tuán)。
作為活化劑，可例舉與上述活化劑相同的試劑。
作為反應(yīng)溶劑，只要不會對反應(yīng)有影響即可，無特別限定，例如可例舉乙腈、THF。上述反應(yīng)的反應(yīng)溫度以20℃～50℃為宜。反應(yīng)時間因低聚核酸衍生物(2)的種類、所用活化劑的種類和反應(yīng)溫度等而異，通常以1分鐘～1小時為宜。所用試劑的量相對于被負(fù)載于固相載體的低聚核酸衍生物以0.8～100倍摩爾量為宜，更好為1～10倍摩爾量。
(3)步驟C 在步驟B中未反應(yīng)的(低聚)核酸衍生物(2)的5’位羥基的加帽(capping)步驟。

式(2)及(8)中，各BX、各Q、各R4、各WG2分別獨立，其含義如前所述，E、n、T的含義如前所述，R5表示甲基、苯氧基甲基、叔丁基苯氧基甲基。
本步驟是對步驟B中未反應(yīng)的5’位羥基進(jìn)行保護(hù)的反應(yīng)，可通過使加帽化試劑作用于被負(fù)載于固相載體的低聚核酸衍生物而實施。
加帽化試劑可例舉例如乙酸酐、苯氧基乙酸酐或叔丁基苯氧基乙酸酐。加帽化試劑也可使用經(jīng)合適的溶劑將濃度稀釋為0.05～1M的試劑。作為溶劑，只要不會對反應(yīng)有影響即可，無特別限定，可例舉例如吡啶、二氯甲烷、乙腈、THF或它們的任意的混合溶劑。此外，該步驟中可根據(jù)需要使用反應(yīng)促進(jìn)劑，例如4-二甲基氨基吡啶、N-甲基咪唑。上述反應(yīng)的反應(yīng)溫度以20℃～50℃為宜。反應(yīng)時間因低聚核酸衍生物(2)的種類、所用加帽化試劑的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以1分鐘～30分鐘為宜。所用試劑的量相對于被負(fù)載于固相載體的低聚核酸衍生物以0.8～100倍摩爾量為宜，較好為1～10倍摩爾量。
(4)步驟D 通過使氧化劑作用于步驟B中制備的低聚核酸衍生物(7)而將亞磷酸基轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿峄蛄虼姿峄牟襟E。

式(7)及(9)中，各BX、各Q、各R4、各WG2分別獨立，其含義如前所述。E、n、R1、T的含義如前所述。
本步驟是利用氧化劑將3價磷轉(zhuǎn)換為5價磷的反應(yīng)，通過使氧化劑作用于被負(fù)載于固相載體的低聚核酸衍生物而實施。
用氧來氧化磷時，作為氧化劑，例如可使用碘、過氧化氫叔丁基。該氧化劑也可用適當(dāng)?shù)娜軇⑵錆舛认♂屩?.05～2M后再使用。作為用于反應(yīng)的溶劑，只要不會對反應(yīng)有影響即可，可例舉吡啶、THF、水或它們的任意的混合溶劑。例如可采用碘/水/吡啶-THF或碘/吡啶-乙酸和過氧化劑(過氧化氫叔丁基/二氯甲烷等)。
用硫來氧化磷時，作為氧化劑，例如可使用硫、Beaucage試劑(3H-1，2-苯并二噻唑-3-酮-1，1-二氧化物)、3-氨基-1，2，4-二噻唑-5-硫酮(ADTT)。該氧化劑可用適當(dāng)?shù)娜軇⑵錆舛认♂屩?.05～2M后再使用。作為用于反應(yīng)的溶劑，只要不會對反應(yīng)有影響即可，可例舉二氯甲烷、乙腈、吡啶或它們的任意的混合溶劑。
反應(yīng)溫度以20℃～50℃為宜。反應(yīng)時間因低聚核酸衍生物(7)的種類、所用氧化劑的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常為1分鐘～30分鐘。所用試劑的量相對于被承載于固相載體的低聚核酸衍生物以0.8～100倍摩爾量為宜，更好為10～50倍摩爾量。
(5)步驟E 將步驟D制備的低聚核酸衍生物(9)從固相載體切割(cleave)，脫去各核酸堿基部及各磷酸基的保護(hù)基的步驟。

式(9)及(10)中，各B、各BX、各Q、各R4、各WG2分別獨立，其含義如前所述。E、n、R、R1、T、Z的含義如前所述。
切割步驟是利用切割劑將所需鏈長的低聚RNA從固相載體及連接基切割的反應(yīng)，可通過向負(fù)載有所需鏈長的低聚核酸衍生物的固相載體添加切割劑而實施。本步驟中可脫去核酸堿基部的保護(hù)基。
作為切割劑，可例舉例如濃氨水、甲胺。本步驟中可使用的切割劑也可用例如水、甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、THF或它們的任意的混合溶劑稀釋后再使用。其中，優(yōu)選使用乙醇。
反應(yīng)溫度以15℃～75℃為宜，優(yōu)選15℃～30℃，更好為18℃～25℃。脫保護(hù)反應(yīng)時間因低聚核酸衍生物(9)的種類、反應(yīng)溫度等而異，以10分鐘～30小時為宜，優(yōu)選30分鐘～24小時，更好為1～4小時。被用于脫保護(hù)的溶液中的氫氧化銨的濃度以20～30重量％為宜，優(yōu)選25～30重量％，更好為28～30重量％。所用試劑的量相對于被負(fù)載于固相載體的低聚核酸衍生物以1～100倍摩爾量為宜，更好為10～50倍摩爾量。
(6)步驟F 使TBAF作用于以下的通式(10)表示的低聚核酸衍生物，將各核糖的2’位羥基的保護(hù)基脫去的工序中，通過用可含THF的亞砜類溶劑或酰胺類溶劑或它們的混合溶劑作為反應(yīng)溶劑，制備以下的通式(11)表示的低聚核酸衍生物的步驟。

式(10)及(11)中，各B、各Q、各R、各R4分別獨立，其含義如前所述。n、R1、Z的含義如前所述。
本步驟可通過使TBAF作用于低聚核酸衍生物(10)而實施。所用的TBAF的量相對于被除去的保護(hù)基以1～500倍摩爾量為宜，較好為5～10倍摩爾量。作為反應(yīng)溶劑，可使用可含THF的亞砜類溶劑或酰胺類溶劑或它們的混合溶劑。此外，亞砜類溶劑或酰胺類溶劑或它們的混合溶劑作為與THF的混合溶劑使用時，THF的相對于亞砜類溶劑或酰胺類溶劑或它們的混合溶劑的用量以0～95％為宜，較好為0～50％?？珊琓HF的亞砜類溶劑或酰胺類溶劑或它們的混合溶劑(反應(yīng)溶劑)的用量因低聚核酸衍生物(10)的種類或所用的反應(yīng)溶劑等而異，相對于TBAF以0.8～100倍摩爾量為宜，較好為1～10倍摩爾量。反應(yīng)溫度因低聚核酸衍生物(10)的種類或所用的反應(yīng)溶劑等而異，以20℃～80℃為宜。反應(yīng)時間因低聚核酸衍生物(10)的種類、所用反應(yīng)溶劑或反應(yīng)溫度等而異，通常以1小時～100小時為宜。
此外，根據(jù)需要，還可添加捕集本步驟中作為副產(chǎn)物生成的丙烯腈的試劑，作為丙烯腈的捕集劑，例如可添加硝基烷、烷基胺、脒、硫醇、硫醇衍生物或它們的任意的混合物。作為硝基烷，可例舉直鏈狀的碳數(shù)1～6的硝基烷。具體可例舉硝基甲烷等。作為烷基胺，可例舉直鏈狀的碳數(shù)1～6的烷基胺。具體可例舉例如甲胺、乙胺、正丙胺、正丁胺、正戊胺、正己胺。作為脒，可例舉例如苯甲脒、甲脒。作為硫醇，可例舉例如直鏈狀的碳數(shù)1～6的硫醇。具體可例舉例如甲硫醇、乙硫醇、1-丙硫醇、1-丁硫醇、1-戊硫醇、1-己硫醇。作為硫醇衍生物，可例舉例如具有相同或不同的直鏈狀的碳數(shù)1～6的烷基硫羥基的醇或醚。具體可例舉例如2-巰基乙醇、4-巰基-1-丁醇、6-巰基-1-己醇、巰基甲醚、2-巰基乙醚、3-巰基丙醚、4-巰基丁醚、5-巰基戊醚、6-巰基己醚。
丙烯腈的捕集劑的用量因低聚核酸衍生物(10)的種類等而異，相對于保護(hù)低聚核酸衍生物(10)的各核糖的2’位羥基的2-氰基乙氧基甲基以0.1～500倍摩爾量為宜，較好為1～10倍摩爾量。
(7)步驟G 將低聚核酸衍生物(11)的5’位羥基的保護(hù)基脫去的步驟。

式(11)及(A)中，各B、各Q、各R分別獨立，其含義如前所述。n、R1、Z的含義如前所述。
本步驟是最終脫去低聚RNA的5’位羥基的保護(hù)基的反應(yīng)，可通過使酸作用于從固相載體切割得到的低聚RNA而實施。
作為可用于本步驟的酸，可例舉例如三氯乙酸、二氯乙酸、乙酸。本步驟中可使用的酸也可用適當(dāng)?shù)娜軇┫♂尯笤偈褂?。作為溶劑，只要是不會對反?yīng)有影響的溶劑即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲烷、乙腈、水、pH為2～5的緩沖液或它們的任意的混合溶劑。作為緩沖液，可例舉例如乙酸緩沖液。上述反應(yīng)的反應(yīng)溫度以20℃～50℃為宜。反應(yīng)時間因低聚核酸衍生物(11)的種類、所用酸的種類、反應(yīng)溫度等而異，通常以1分鐘～1小時為宜。所用試劑的量相對于被負(fù)載于固相載體的低聚核酸衍生物以0.8～100倍摩爾量為宜，更好為1～10倍摩爾量。
(8)步驟H 分離精制步驟G制備的低聚RNA(A)的步驟。
分離精制步驟是指通過單獨或組合使用例如萃取、濃縮、中和、過濾、離心分離、重結(jié)晶、C8-C18的反相柱色譜法、C8-C18的反相卡套柱(cartridgecolumn)色譜法、陽離子交換柱色譜法、陰離子交換柱色譜法、凝膠過濾柱色譜法、高效液相色譜法、透析、超濾等通常的分離精制方法，從上述反應(yīng)混合物分離精制所需低聚RNA的步驟。
作為洗脫溶劑，可例舉例如乙腈、甲醇、乙醇、異丙醇、水的單獨溶劑或任意比例的混合溶劑。這種情況下，也可以1mM～2M的濃度添加作為添加劑的例如磷酸鈉、磷酸鉀、氯化鈉、氯化鉀、乙酸銨、乙酸三乙基銨、乙酸鈉、乙酸鉀、Tris-HCl、乙二胺四乙酸，將溶液的pH調(diào)整至1～9的范圍。
通過重復(fù)實施步驟A～步驟D的操作，能夠制得所需鏈長的低聚RNA(A)。本制法中，作為用于制造低聚RNA(A)的起始原料，可使用R4a為取代基(4)的化合物(27a)、R4a為H或酰氧基的核酸衍生物(27a)或R2為?；暮怂嵫苌?27b)等。作為起始原料，使用了R4a為H或酰氧基的核酸衍生物(27a)或R2為酰氧基的核酸衍生物(27b)時，作為核酸單體化合物的至少1種必須使用本發(fā)明的亞磷酰胺化合物。
實施例 以下，例舉參考例、實施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不僅限定于此。
參考例1 氯甲基2-氰基乙基醚 步驟1 甲硫基甲基2-氰基乙基醚的制備 將32g(450mmol)3-羥基丙腈溶于450ml二甲亞砜，加入324mL乙酸酐和231mL乙酸，室溫下攪拌24小時。將990g碳酸氫鈉溶于4.5L水調(diào)制成溶液，用1小時的時間將反應(yīng)液滴入該溶液中，隨即攪拌1小時，用乙酸乙酯萃取反應(yīng)液，用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，用硅膠柱色譜法對所得油狀物進(jìn)行精制，獲得41g呈無色油狀物的甲硫基甲基2-氰基乙基醚(收率70％)。
1H-NMR(CDCl3)2.18(s，3H)；2.66(t，2H，J＝6.3Hz)；3.77(t，2H，J＝6.3Hz)；4.69(s，2H) 步驟2 氯甲基2-氰基乙基醚的制備 使3.3g(25mmol)步驟1獲得的甲硫基甲基2-氰基乙基醚溶于70mL二氯甲烷，冰冷下滴加2mL(25mmol)硫酰氯，再于室溫反應(yīng)1小時。反應(yīng)后蒸除溶劑，在真空中進(jìn)行蒸餾，獲得2.5g呈無色油狀物的目標(biāo)化合物(收率85％)。
沸點84～85℃(0.3托) 1H-NMR(CDCl3)2.72(t，2H，J＝6.3Hz)；3.92(t，2H，J＝6.3Hz)；5.52(s，2H) 參考例2 5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺) 步驟1 5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制備 將546mg(1mmol)5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷溶于4mL的1，2-二氯乙烷后加入452mg(3.5mmol)二異丙基乙胺，再加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基錫，然后于室溫反應(yīng)1小時。升溫至80℃后滴加155.4mg(1.3mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，隨即攪拌30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在飽和碳酸氫鈉水溶液中加入反應(yīng)液，用二氯甲烷萃取，再用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，利用30g的硅膠柱色譜對所得混合物進(jìn)行精制，獲得5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷(197mg，收率34％)。
1H-NMR(CDCl3)2.47(d，1H，J＝7.8Hz)；2.69(t，2H，J＝6.3Hz)；3.55(dd，1H，11.3，2.2Hz)；3.62(dd，1H，11.3，2.2Hz)；3.83(s，6H)；3.87(t，2H，J＝6.3Hz)；4.07-4.08(m，1H)；4.32(dd，1H，J＝5.3，1.9Hz)；4.54(q，1H，J＝5.3Hz)；4.94，5.11(2d，2H，J＝6.9Hz)；5.32(d，1H，J＝8.2Hz)；6.00(d，1H，J＝1.9Hz)；6.85-6.88(m，4H)；7.29-7.41(m，9H)；8.02(d，1H，J＝8.2Hz)；8.53(br.s，1H) ESI-質(zhì)譜652[M+Na]+ 步驟2 5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)的制備 將209mg(0.332mmol)步驟1獲得的5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷和23mg(0.332mmol)四唑溶于2mL乙腈，再滴加150mg(0.498mmol)的2-氰基乙基N，N，N’，N’-四異丙基亞磷酰胺，于45℃反應(yīng)1.5小時。反應(yīng)后加入飽和碳酸氫鈉水溶液，用乙酸乙酯萃取，再用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，利用20g的硅膠柱色譜對所得混合物進(jìn)行精制，獲得目標(biāo)化合物(200mg，收率73％)。
ESI-質(zhì)譜852[M+Na]+ 參考例3 2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷 步驟1 3’，5’-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制備 氬氣氛下，將150mg(0.3mmol)3’，5’-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)尿苷溶于7mL的THF，加入54mg(0.4mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚和100mg分子篩4A，攪拌10分鐘。將溫度調(diào)整為0℃，加入10mg(0.06mmol)三氟甲磺酸的2mlTHF溶液，攪拌后加入92mg(0.4mmol)N-碘琥珀酰亞胺，攪拌1小時。用硅藻土過濾反應(yīng)液，用二氯甲烷洗滌后，有機(jī)相用1M硫代硫酸氫鈉水溶液洗滌，再用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌，然后用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑。用薄層色譜法對所得殘渣進(jìn)行精制，獲得3’，5’-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷(150mg，收率85％)。
1H-NMR(CDCl3)0.97-1.12(m，28H)；2.68-2.73(m，2H)；3.78-3.86(m，1H)；3.96-4.05(m，2H)；4.12-4.30(m，4H)；5.0-5.04(m，2H)；5.70(d，1H，J＝8.2Hz)；5.75(s，1H)；7.90(d，1H，J＝8.2Hz)；9.62(br.s，1H) ESI-質(zhì)譜570[M+H]+ 步驟2 2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制備 將200mg(0.35mmol)步驟1獲得的3’，5’-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷溶于2mL甲醇，再加入65mg(1.76mmol)氟化銨，于50℃加熱攪拌5小時。放冷后加入乙腈攪拌，過濾濃縮。用硅膠柱色譜法對所得殘渣進(jìn)行精制，獲得目標(biāo)化合物(108mg，收率94％)。
1H-NMR(CD3OD)2.72-2.76(t，2H，J＝6.2Hz)；3.68-3.92(m，4H)；4.00-4.03(m，1H)；4.26-4.32(m，2H)；4.81-4.95(m，2H)；5.71(d，1H，J＝8.1Hz)；6.00(d，1H，J＝3.3Hz)；8.10(d，1H，J＝8.1Hz) ESI-質(zhì)譜350[M+Na]+ 參考例4 5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制備 將14g(43mmol)2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷以吡啶共沸，用真空泵干燥30分鐘。然后，溶于300mL的THF，在氬氣氛下加入68g(856mmol)吡啶和20g分子篩4A，攪拌10分鐘。將19.6g(57.8mmol)4，4’-二甲氧基三苯甲基氯以1小時的間隔分3次加入其中，再攪拌1小時。接著，加入10mL甲醇攪拌2分鐘，再用硅藻土過濾，用乙酸乙酯洗滌。濃縮濾液后將殘渣溶于乙酸乙酯，再與飽和碳酸氫鈉水溶液分液。有機(jī)相用飽和氯化鈉水溶液洗滌，用無水硫酸鎂干燥后蒸除溶劑。用硅膠柱色譜法對所得殘渣進(jìn)行精制，獲得目標(biāo)化合物(26.5g，收率98％)。
參考例5 N4-乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺) 步驟1 N4-乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制備 將588mg(1mmol)N4-乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)胞苷溶于4mL的1，2-二氯乙烷，加入452mg(3.5mmol)二異丙基乙胺后加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基錫，室溫下反應(yīng)1小時。然后，將溫度升至80℃，滴加155.4mg(1.3mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，隨即攪拌60分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，在飽和碳酸氫鈉水溶液中加入反應(yīng)液，用二氯甲烷萃取，再用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，利用30g的硅膠柱色譜對所得混合物進(jìn)行精制，獲得N4-乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷(219mg，收率35％)。
1H-NMR(CDCl3)2.19(s，3H)；2.56(d，1H，J＝8.8Hz)；2.65(t，2H，J＝6.2Hz)；3.55(dd，1H，10.5，2.5Hz)；3.63(dd，1H，10.5，2.5Hz)；3.82(s，6H)；3.86(t，2H，J＝6.2Hz)；4.09-4.14(m，1H)；4.28(d，1H，J＝5.1Hz)；4.44-4.49(m，1H)；4.97，5.24(2d，2H，J＝6.9Hz)；5.96(s，1H)；6.86-6.88(m，4H)；7.09(d，1H，J＝6.9Hz)；7.26-7.42(m，9H)；8.48(d，1H，J＝6.9Hz)；8.59(br.s，1H) ESI-質(zhì)譜693[M+Na]+ 步驟2 N4-乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)的制備 將205mg(0.306mmol)步驟1獲得的N4-乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷溶于2mL二氯甲烷，加入105mg(0.812mmol)二異丙基乙胺，再滴加116mg(0.49mmol)2-氰基乙基N，N-異丙基氯代亞磷酰胺，室溫下反應(yīng)1小時。反應(yīng)后蒸除溶劑，利用20g的硅膠柱色譜對所得混合物進(jìn)行精制，獲得目標(biāo)化合物(242mg，收率91％)。
ESI-質(zhì)譜871[M+H]+ 參考例6 N4-乙?；?2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷 步驟1 N4-乙?；?3’，5’-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制備 混合1.00g(1.89mmol)N4-乙?；?3’，5’-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)胞苷和500mg(3.79mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚，將混合物溶于10mL甲苯和10mL THF的混合溶劑。然后，加入975mg(3.79mmol)三氟甲磺酸銀，再加入分子篩4A，干燥。冰冷下加入370mg(2.08mmol)N-溴琥珀酰亞胺，將反應(yīng)容器遮光，攪拌10分鐘。再追加70mg(0.39mmol)N-溴琥珀酰亞胺，攪拌25分鐘。反應(yīng)結(jié)束后加入二氯甲烷稀釋，用飽和碳酸氫鈉水溶液進(jìn)行洗滌，用無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，用硅膠柱色譜法對所得混合物進(jìn)行精制，獲得N4-乙?；?3’，5’-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷(936mg，收率81％)。
1H-NMR(CDCl3)0.90-1.11(m，28H)；2.28(s，3H)；2.62-2.79(m，2H)；3.78-3.89(m，1H)；3.96-4.04(m，2H)；4.19-4.23(m，3H)；4.30(d，1H，J＝13.6Hz)；5.00(d，1H，J＝6.8Hz)；5.09(d，1H，J＝6.8Hz)；5.77(s，1H)；7.44(d，1H，J＝7.5Hz)；8.30(d，1H，J＝7.5Hz)；10.13(s，1H) ESI-質(zhì)譜611[M+H]+ 步驟2 N4-乙酰基-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制備 將500mg(0.819mmol)步驟1獲得的N4-乙?；?3’，5’-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷溶于2.5mL THF和2.5mL甲醇的混合溶劑，加入150mg(4.10mmol)氟化銨，于50℃反應(yīng)4小時。反應(yīng)結(jié)束后，用乙腈稀釋，過濾，蒸除溶劑，再用硅膠柱色譜法對所得混合物進(jìn)行精制，獲得目標(biāo)化合物(210mg，收率70％)。
1H-NMR(D2O)2.13(s，3H)；2.66-2.71(m，2H)；3.72-3.78(m，3H)；3.90(dd，1H，J＝13.0，2.6Hz)；4.06-4.11(m，1H)；4.20(dd，1H，J＝7.1，5.2Hz)；4.29(dd，1H，J＝5.1，2.9Hz)；4.83(d，1H，J＝7.2Hz)；4.94(d，1H，J＝7.2Hz)；5.95(d，1H，J＝2.9Hz)；7.25(d，1H，J＝7.6Hz)；8.25(d，1H，J＝7.6Hz) ESI-質(zhì)譜391[M+Na]+ 參考例7 N4-乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制備 將9.9g(26.8mmol)2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷以吡啶共沸，用真空泵干燥30分鐘。然后，溶于190mLTHF，在氬氣氛下加入43g(538mmol)吡啶和20g分子篩4A，攪拌10分鐘。將11.8g(34.9mmol)4，4’-二甲氧基三苯甲基氯以1小時的間隔分3次加入其中，再攪拌1小時。接著，加入2mL甲醇攪拌2分鐘，再用硅藻土過濾，用乙酸乙酯洗滌。用蒸發(fā)器濃縮濾液后將殘渣溶于乙酸乙酯，再與飽和碳酸氫鈉水溶液分液。有機(jī)相用飽和氯化鈉水溶液洗滌，用無水硫酸鎂干燥后蒸除溶劑。用硅膠柱色譜法對所得殘渣進(jìn)行精制，獲得目標(biāo)化合物(15g，收率83％)。
參考例8 N2-乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺) 步驟1 N2-乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷的制備 將627mg(1mmol)N2-乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)鳥苷溶于4mL的1，2-二氯乙烷，加入452mg(3.5mmol)二異丙基乙胺后加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基錫，室溫下反應(yīng)1小時。然后，將溫度升至80℃，滴加155.4mg(1.3mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，隨即攪拌60分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，在飽和碳酸氫鈉水溶液中加入反應(yīng)液，用二氯甲烷萃取，再用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，利用30g的硅膠柱色譜對所得混合物進(jìn)行精制，獲得N2-乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷(450mg，收率63％)。
1H-NMR(CDCl3)1.92(s，3H)；2.47-2.51(m，2H)；2.68(br.s，1H)；3.30(dd，1H，10.7，3.8Hz)；3.47(dd，1H，10.7，3.8Hz)；3.55-3.60(m，.1H)；3.65-3.70(m，1H)；3.74，3.75(2s，6H)；4.22-4.23(m，1H)；4.55-4.58(m，1H)；4.78，4.83(2d，2H，J＝7.0Hz)；5.01(t，1H，J＝5.1Hz)；5.99(d，1H，J＝5.1Hz)；6.76-6.79(m，4H)；7.17-7.44(m，9H)；7.88(s，1H)；8.36(br.s，1H)；12.06(br.s，1H) 步驟2 N2-乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)的制備 將400mg(0.563mmol)步驟1獲得的N2-乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷溶于2mL二氯甲烷，加入181mg(1.4mmol)二異丙基乙胺，再滴加161mg(0.68mmol)2-氰基乙基N，N-二異丙基氯代亞磷酰胺，室溫下反應(yīng)1小時。反應(yīng)后蒸除溶劑，利用20g的硅膠柱色譜對所得混合物進(jìn)行精制，獲得目標(biāo)化合物(471mg，收率92％)。
參考例9 N6-乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺) 步驟1 N6-乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制備 將22.0g(36.0mmol)N6-乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)腺苷溶于170mL的1，2-二氯乙烷，加入16.3g(126mmol)二異丙基乙胺后加入12.1g(39.7mmol)二氯化二丁基錫，室溫下反應(yīng)1小時。然后，將溫度升至80℃攪拌15分鐘，再滴加4.30g(36.0mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，隨即攪拌30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，在飽和碳酸氫鈉水溶液中加入反應(yīng)液，用二氯甲烷萃取，再用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，用硅膠柱色譜法對所得混合物進(jìn)行精制，獲得N6-乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷(7.47g，收率33％)。
1H-NMR(CDCl3)2.51(t，2H，J＝6.2Hz)；2.58(d，1H，J＝5.5Hz)；2.61(s，3H)；3.45(dd，1H，J＝10.7，4.0Hz)；3.54(dd，1H，J＝10.7，3.2Hz)；3.62-3.79(m，2H)；3.79(s，6H)；4.25(br.q，1H，J＝4.6Hz)；4.59(q，1H，J＝5.2Hz)；4.87-4.94(m，3H)；6.23(d，1H，J＝4.4Hz)；6.80-6.83(m，4H)；7.22-7.32(m，7H)；7.40-7.43(m，2H)；8.20(s，1H)；8.61(br.s，1H)；8.62(s，1H) ESI-質(zhì)譜695[M+H]+ 步驟2 N6-乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)的制備 將10.0g(14.4mmol)步驟1獲得的N6-乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于75mL二氯甲烷，加入4.7g(36mmol)二異丙基乙胺，再滴加4.82g(20.3mmol)2-氰基乙基N，N-二異丙基氯代亞磷酰胺，室溫下反應(yīng)1小時。反應(yīng)后剩余30mL左右的溶劑，進(jìn)行蒸除，再用硅膠柱色譜法對所得混合物進(jìn)行精制，獲得目標(biāo)化合物(12.0g，收率93％)。
ESI-質(zhì)譜895[M+H]+ 參考例10 N6-乙?；?2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷 步驟1 N6-乙酰基-3’，5’-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制備 使245mg(1.09mmol)N-碘琥珀酰亞胺和280mg(1.09mmol)三氟甲磺酸銀懸浮于8mL二氯甲烷，加入分子篩4A，干燥。冰冷下，在其中加入將400mg(0.73mmol)N6-乙?；?3’，5’-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)腺苷和145mg(1.11mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚溶于4mL二氯甲烷而形成的溶液，隨即攪拌3小時。反應(yīng)結(jié)束后加入二氯甲烷稀釋，再用硫代硫酸鈉水溶液和飽和碳酸氫鈉水溶液進(jìn)行洗滌，用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，所得混合物用硅膠柱色譜法精制，獲得N6-乙酰基-3’，5’-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷(201mg，收率45％)。
1H-NMR(CDCl3)0.98-1.11(m，28H)；2.62(s，3H)；2.69(td，2H，6.5，J＝1.5Hz)；3.81-3.89(m，1H)；4.02-4.09(m，2H)；4.17(d，1H，J＝9.4Hz)；4.28(d，1H，J＝13.4Hz)；4.50(d，1H，J＝4.5Hz)；4.67(dd，1H，J＝8.8，4.5Hz)；5.02(d，1H，J＝7.0Hz)；5.08(d，1H，J＝7.0Hz)；6.10(s，1H)；8.34(s，1H)；8.66(s，1H)；8.67(s，1H) ESI-質(zhì)譜636[M+H]+ 步驟2 N6-乙?；?2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制備 將300mg(0.47mmol)步驟1獲得的N6-乙酰基-3’，5’-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于0.1mL乙酸和2mL的0.5M TBAF的THF溶液的混合溶液，室溫下攪拌2小時。反應(yīng)結(jié)束后用硅膠柱色譜法對所得反應(yīng)混合物進(jìn)行精制，獲得目標(biāo)化合物(160mg，收率86％)。
1H-NMR(DMSO-d6)2.25(s，3H)；2.53-2.68(m，2H)；3.41-3.46(m，1H)；3.56-3.64(m，2H)；3.69-3.73(m，1H)；4.00-4.01(m，1H)；4.36-4.37(m，1H)；4.72-4.78(m，3H)；5.20(bt，2H)；5.41(d，1H，J＝5.2Hz)；6.17(d，1H，J＝5.7Hz)；8.66(s，1H)；8.72(s，1H)；10.72(s，1H) ESI-質(zhì)譜415[M+Na]+ 參考例11 N6-乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制備 將9.50g(24.2mmol)N6-乙?；?2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于100mL脫水吡啶，濃縮干燥后，氬氣氛下溶于100mL脫水吡啶。冰冷下，加入10.7g(31.2mmol)4，4’-二甲氧基三苯甲基氯，室溫下反應(yīng)1小時20分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，用二氯甲烷稀釋，再用水洗滌，用無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，用硅膠柱色譜法對所得混合物進(jìn)行精制，獲得目標(biāo)化合物(13.8g，收率82％)。
參考例12 N2-苯氧基乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺) 步驟1 N2-苯氧基乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷的制備 將720mg(1mmol)N2-苯氧基乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)鳥苷溶于4mL的1，2-二氯乙烷，加入452mg(3.5mmol)二異丙基乙胺后加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基錫，室溫下反應(yīng)1小時。然后，將溫度升至80℃，再滴加155.4mg(1.3mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，隨即攪拌60分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，在飽和碳酸氫鈉水溶液中加入反應(yīng)液，用二氯甲烷萃取，再用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，利用30g的硅膠柱色譜對所得混合物進(jìn)行精制，獲得N2-苯氧基乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷(384mg，收率48％)。
1H-NMR(CDCl3)2.47-2.51(m，2H)；2.58(br.s，1H)；3.42(dd，1H，10.1，3.8Hz)；3.46(dd，1H，10.1，3.8Hz)；3.53-3.57(m，1H)；3.69-3.73(m，1H)；3.77(s，6H)；4.24-4.26(m，1H)；4.48-4.50(m，1H)；4.61-4.65(m，2H)；4.83，4.87(2d，2H，J＝7.0Hz)；4.88(t，1H，J＝5.7Hz)；6.05(d，1H，J＝5.7Hz)；6.80-6.82(m，4H)；6.92-6.96(m，3H)；7.07-7.11(m，2H)；7.20-7.42(m，9H)；7.84(s，1H)；8.99(s，1H)；11.81(br.s，1H) ESI-質(zhì)譜825[M+Na]+ 步驟2 N2-苯氧基乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)的制備 將320mg(0.399mmol)步驟1獲得的N2-苯氧基乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷溶于4mL二氯甲烷，加入128.8mg(0.996mmol)二異丙基乙胺，再滴加141.5mg(0.598mmol)2-氰基乙基N，N-二異丙基氯代亞磷酰胺，室溫下反應(yīng)1小時。反應(yīng)后蒸除溶劑，再利用30g的硅膠柱色譜對所得混合物進(jìn)行精制，獲得目標(biāo)化合物(316mg，收率79％)。
ESI-質(zhì)譜1003[M+H]+ 參考例13 N2-苯氧基乙?；?2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷 步驟1 N2-苯氧基乙酰基-3’，5’-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷的制備 將2.0g(3.0mmol)N2-苯氧基乙?；?3’，5’-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)鳥苷溶于16mLTHF，加入0.99g(7.6mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚和1.0g分子篩4A，氬氣氛下于—45℃攪拌10分鐘。然后，加入0.68g(4.5mmol)三氟甲磺酸的5mLTHF溶液，攪拌后加入1.02g(4.5mmol)N-碘琥珀酰亞胺，攪拌15分鐘。在反應(yīng)液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，過濾后用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用1M硫代硫酸氫鈉水溶液洗滌，再依次用水和飽和氯化鈉水溶液洗滌，接著用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑。所得殘渣用硅膠柱色譜法精制，獲得N2-苯氧基乙酰基-3’，5’-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷(2.0g，收率89％)。
1H-NMR(CDCl3)0.99-1.11(m，28H)；2.59-2.77(m，2H)；3.82-4.05(m，3H)；4.15(d，1H，J＝9.3Hz)；4.25-4.35(m，2H)；4.52-4.56(dd，1H，J＝9.3，4.3Hz)；5.00，5.07(2d，2H，J＝7.2Hz)；5.95(s，1H)；6.99-7.12(m，3H)；7.35-7.40(m，2H)；8.09(s，1H)；9.38(br.s，1H)；11.85(br.s，1H) ESI-質(zhì)譜766[M+Na]+ 步驟2 N2-苯氧基乙酰基-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷的制備 在2.83mL(2.83mmol)的1M TBAF的THF溶液中加入0.14mL(0.14mmol)乙酸，調(diào)制出溶液。將1.0g(1.35mmol)步驟1獲得的N2-苯氧基乙?；?3’，5’-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷溶于2.83mL THF，在其中加入先前調(diào)制的溶液，氬氣氛下于室溫攪拌1小時。減壓下濃縮反應(yīng)液后將其溶于二氯甲烷，用硅膠柱色譜法精制，獲得目標(biāo)化合物(0.67g，收率99％)。
1H-NMR(DMSO-d6)2.59-2.66(m，2H)；3.41-3.63(m，4H)；3.98(m，1H)；4.32(m，1H)；4.58-4.62(t，1H，J＝5.3Hz)；4.71-4.78(dd，2H，J＝13.1，6.8Hz)；4.87(s，2H)；5.12(s，1H)；5.37(s，1H)；5.97(d，1H，J＝6.1Hz)；6.96-6.99(m，3H)；7.28-7.34(m，2H)；8.30(s，1H)；11.78(br.s，2H) ESI-質(zhì)譜500[M-H]- 參考例14 N2-苯氧基乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷的制備 將660mg(1.32mmol)N2-苯氧基乙?；?2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷以吡啶共沸，用真空泵干燥30分鐘。然后，溶于9mL THF，在氬氣氛下加入2.1g(26.4mmol)吡啶和600mg分子篩4A，攪拌10分鐘。將540mg(1.58mmol)4，4’-二甲氧基三苯甲基氯以1小時的間隔分3次加入其中，再攪拌1小時。接著，加入2mL甲醇攪拌2分鐘，再用硅藻土過濾，用乙酸乙酯洗滌。用蒸發(fā)器濃縮濾液后將殘渣溶于乙酸乙酯，再與飽和碳酸氫鈉水溶液分液。有機(jī)相用飽和氯化鈉水溶液洗滌，用無水硫酸鎂干燥后蒸除溶劑。用硅膠柱色譜法對所得殘渣進(jìn)行精制，獲得目標(biāo)化合物(800mg，收率75％)。
參考例15 N6-乙?；?3’，5’-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷 步驟1 N6-乙?；?3’，5’-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-甲硫基甲基腺苷的制備 將2.00g(3.62mmol)N6-乙酰基-3’，5’-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)腺苷溶于25mL二甲亞砜，加入17.5mL乙酸酐和12.5mL乙酸，室溫下攪拌14小時。反應(yīng)結(jié)束后在200mL水中加入反應(yīng)液，用乙酸乙酯萃取，用飽和碳酸氫鈉水溶液進(jìn)行洗滌，再用無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，用硅膠柱色譜法對所得混合物進(jìn)行精制，獲得N6-乙?；?3’，5’-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-甲硫基甲基腺苷(1.36g，收率61％)。
1H-NMR(CDCl3)0.96-1.11(m，28H)；2.20(s，3H)；2.61(s，3H)；4.03(dd，1H，J＝13.4，2.4Hz)；4.18(d，1H，J＝9.1Hz)；4.27(d，1H，J＝13.4Hz)；4.63-4.71(m，2H)；5.00(d，1H，J＝11.5Hz)；5.07(d，1H，J＝11.5Hz)；6.09(s，1H)；8.31(s，1H)；8.65(s，1H)；8.69(s，1H) ESI-質(zhì)譜635[M+Na]+ 步驟2 N6-乙?；?3’，5’-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制備 將1.00g(1.63mmol)步驟1獲得的N6-乙?；?3’，5’-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-甲硫基甲基腺苷溶于25mL THF。加入5.88g(82.7mmol)3-羥基丙腈，再加入分子篩4A，干燥，冷卻至—45℃。接著，加入440mg(1.96mmol)N-碘琥珀酰亞胺，再加入490mg(3.26mmol)三氟甲磺酸，于—45℃攪拌15分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，在冷卻的狀態(tài)下加入三乙胺進(jìn)行中和，用二氯甲烷稀釋，再用硫代硫酸鈉水溶液和飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌，用無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，所得混合物用硅膠柱色譜法精制，獲得目標(biāo)化合物(722mg，收率71％)。
參考例16 尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷 將負(fù)載有市售的2’/3’-0-苯甲?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷的CPG固相載體(37mg，1μmol)裝入帶玻璃濾器的柱子中，使用核酸自動合成機(jī)(ExpediteTM美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems))進(jìn)行作為標(biāo)題化合物的低聚RNA的合成。
作為核酸單體化合物使用5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)，作為縮合催化劑使用四唑，作為氧化劑使用碘溶液，作為加帽劑溶液使用乙酸酐和N-甲基咪唑溶液。使核酸單體化合物縮合20次后，作為切割劑使用10M甲胺的乙醇水溶液，室溫下用1～2小時實施從CPG固相載體的切割及各磷酸部位的保護(hù)基的脫去反應(yīng)。減壓下濃縮反應(yīng)混合物后，用反相柱(ODS)除去不需要的峰，再用洗脫溶劑(乙腈-50mM三乙胺-乙酸緩沖液)精制。減壓下濃縮殘渣后，用1M TBAF的THF溶液在室溫下反應(yīng)1小時，脫去2’位羥基的保護(hù)基。對溶液進(jìn)行脫鹽處理后，用80％乙酸除去5’末端的保護(hù)基(室溫下10分鐘)。減壓下濃縮后水層用乙醚洗滌，無需精制，獲得高純度的目標(biāo)化合物。
MALDI-TOF-MS計算值6367.52[M+H]+ 實測值6366.50[M+H]+ 參考例17具有硫代磷酸酯鍵(phosphorothioate bonds)的低聚RNA的制備 胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胸苷酰-[3’→5’]-胸苷 將負(fù)載有市售的5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷的CPG固相載體(22mg，1μmol)裝入帶玻璃濾器的柱子中，使用核酸自動合成機(jī)(ExpediteTM美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行作為標(biāo)題化合物的低聚RNA的合成。
作為核酸單體化合物使用5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)、N4-乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)、N6-乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)、N2-苯氧基乙?；?5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)、5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)胞苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)，作為縮合劑使用苯甲基巰基四唑，作為氧化劑使用Beaucage試劑(3H-1，2-苯并二噻唑-3-酮-1，1-二氧化物)，作為加帽劑溶液使用苯氧基乙酸酐和N-甲基咪唑溶液。使核酸單體化合物縮合20次后，作為切割劑使用濃氨水-乙醇混合液(3∶1)，于40℃用4小時實施從CPG固相載體的切割和各磷酸部位的保護(hù)基的脫去反應(yīng)及堿基的保護(hù)基的除去。減壓下濃縮反應(yīng)混合物后，用含2.5μL硝基甲烷的0.5M TBAF的DMSO溶液500μL于室溫反應(yīng)2小時，除去2’位羥基的保護(hù)基。加入250μL的1M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)后，將其滴入8mL乙醇中，使反應(yīng)生成物沉淀。在冰箱中徹夜保存后除去上清，用ODS柱(LiChroprep RP-18)精制。在80％乙酸水溶液中將4，4’-二甲氧基三苯甲基脫保護(hù)，用乙酸乙酯和水進(jìn)行分液操作，濃縮水層，獲得目標(biāo)化合物(80OD260，收率40％)。
MALDI-TOF-MS計算值6928.4[M+H]+ 實測值6930.1[M+H]+ 試驗例1 酰胺類溶劑的脫保護(hù)效果 將負(fù)載有市售的5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷的CPG固相載體(333mg，15μmol)裝入帶濾器的柱子中，使用核酸自動合成機(jī)(ExpediteTM美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，在固相上進(jìn)行腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-胸苷的合成，在固相上脫去4，4’-二甲氧基三苯甲基。對于低聚RNA 2μmol部分的樹脂，作為切割劑使用濃氨水-乙醇混合液(3∶1)6mL，于40℃用4小時實施從CPG固相載體的切割和各磷酸部位的保護(hù)基的脫去反應(yīng)及堿基的保護(hù)基的除去。將反應(yīng)混合物分為10等分，減壓下濃縮后，在下述表1記載的脫保護(hù)條件下，進(jìn)行將各核糖的2’位羥基的保護(hù)基脫去的反應(yīng)。各反應(yīng)中，每100μmol的TBAF添加1μL硝基甲烷。加入了與反應(yīng)溶液量等量的1M的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)后，用HPLC進(jìn)行各低聚RNA的分析。
HPLC的測定條件如下所示。
測定條件 HPLC裝置 送液單元LC-10AT(株式會社島津制作所制) 檢測器SPD-10A(株式會社島津制作所制) 反相HPLC柱 DNAPac PA100<4mmφ×250mm>(戴安(DIONEX)公司制) 柱溫50℃ 流動相 梯度線性梯度20分鐘(B液5—25％) A液含10％乙腈的25mM Tris-HCl緩沖液 B液含10％乙腈、700mM高氯酸鈉的25mM Tris-HCl緩沖液 流動相的流量1.5ml/分鐘 紫外可見分光光度計檢測波長260nm [表1] 酰胺類溶劑的脫保護(hù)效果 如表1所示，通過在TBAF的THF溶液中加入DMF，可縮短反應(yīng)時間或減少TBAF試劑的量。
試驗例2酰胺類溶劑及亞砜類溶劑的脫保護(hù)效果 將負(fù)載有市售的5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷的CPG固相載體(333mg，15μmol)裝入帶濾器的柱子中，使用核酸自動合成機(jī)(ExpediteTM美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，在固相上進(jìn)行腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-胸苷的合成，在固相上脫去4，4’-二甲氧基三苯甲基。對于低聚RNA 1μmol部分的樹脂，作為切割劑使用濃氨水-乙醇混合液(3∶1)3mL，于40℃用4小時實施從CPG固相載體的切割和各磷酸部位的保護(hù)基的脫去反應(yīng)及堿基的保護(hù)基的除去。減壓下濃縮上述反應(yīng)混合物后，于室溫下，在下述表2記載的脫保護(hù)條件下，進(jìn)行將各核糖的2’位羥基的保護(hù)基脫去的反應(yīng)。各反應(yīng)中，每100μmol的TBAF添加1μL硝基甲烷。此外，每100μmol的TBAF加入100μL的1M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)后，將其滴入2mL(對于Entry3為1.5ml)乙醇中，使反應(yīng)生成物沉淀。在冰箱中徹夜保存后除去上清，用HPLC分析反應(yīng)生成物，確認(rèn)本反應(yīng)的終點。HPLC的測定條件與試驗例1相同。
[表2] 酰胺類溶劑及亞砜類溶劑的脫保護(hù)效果 如表2所示，作為反應(yīng)溶劑用DMSO或DMF替代THF時，反應(yīng)性明顯提高。
此外，從上述結(jié)果可明確，作為反應(yīng)溶劑使用了DMSO時，可減少TBAF的用量、反應(yīng)溶劑的用量。TBAF的用量與作為反應(yīng)溶劑使用THF時相比，僅為其1/5左右。藉此，可在減少高價的TBAF的用量的同時減少用于使最終生成物析出的乙醇的用量。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性 經(jīng)由使TBAF作用、將各核糖的2’位羥基的保護(hù)基脫去的工序中使用亞砜類溶劑或酰胺類溶劑或它們的混合溶劑作為反應(yīng)溶劑除去了低聚核酸衍生物的各核糖的2’位羥基的保護(hù)基的低聚核酸衍生物的制造步驟，可大量制備高純度的低聚RNA(A)。
權(quán)利要求
1.以下的通式(11)表示的低聚核酸衍生物的制備方法，其特征在于，在使氟化四丁基銨(TBAF)作用于以下的通式(10)表示的低聚核酸衍生物、將各核糖的2’位羥基的保護(hù)基脫去的工序中，作為反應(yīng)溶劑使用可含四氫呋喃的亞砜類溶劑或酰胺類溶劑或它們的混合溶劑，
式(10)及(11)中，各B分別獨立，表示核酸堿基或其修飾體，n表示1～200的范圍內(nèi)的整數(shù)，各Q分別獨立，表示O或S，各R分別獨立，表示H、羥基、鹵素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基或烷氧基烷氧基，但至少1個表示羥基，Z表示H、磷酸基或硫代磷酸基，
R1表示以下的通式(3)表示的取代基，
式(3)中，R11、R12、R13相同或不同，表示氫或烷氧基，
各R4分別獨立，表示H、鹵素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷氧基或以下的通式(4)表示的取代基，
式(4)中，WG1表示吸電子基團(tuán)。
2.如權(quán)利要求1所述的低聚核酸衍生物的制備方法，其特征在于，亞砜類溶劑為以下的通式(I)表示的化合物，
式(I)中，Ra、Rb相同或不同，表示烷基。
3.如權(quán)利要求2所述的低聚核酸衍生物的制備方法，其特征在于，通式(I)表示的化合物為二甲亞砜。
4.如權(quán)利要求1所述的低聚核酸衍生物的制備方法，其特征在于，酰胺類溶劑為以下的通式(II)表示的化合物，
式(II)中，Rc、Rd相同或不同，表示烷基，Re表示氫或烷基，或者Rd表示烷基，Rc、Re表示與鄰接的氮原子及碳原子一起形成的5或6元的飽和環(huán)狀酰胺基。
5.如權(quán)利要求4所述的低聚核酸衍生物的制備方法，其特征在于，通式(II)表示的化合物為N，N-二甲基甲酰胺。
6.如權(quán)利要求1～5中任一項所述的低聚核酸衍生物的制備方法，其特征在于，WG1為氰基。
7.如權(quán)利要求1～6中任一項所述的低聚核酸衍生物的制備方法，其特征在于，使用還含有硝基烷、烷基胺、脒、硫醇或硫醇衍生物或它們的任意的混合物的反應(yīng)溶劑。
8.以下的通式(A)表示的低聚RNA的制備方法，
式(A)中，各B分別獨立，表示核酸堿基或其修飾體，n表示1～200的范圍內(nèi)的整數(shù)，各Q分別獨立，表示O或S，各R分別獨立，表示H、羥基、鹵素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基或烷氧基烷氧基，但至少1個表示羥基，Z表示H、磷酸基或硫代磷酸基，
其特征在于，包含制備以下的通式(11)表示的低聚核酸衍生物的步驟，該步驟中，在使氟化四丁基銨(TBAF)作用于以下的通式(10)表示的低聚核酸衍生物、將各核糖的2’位羥基的保護(hù)基脫去的工序中，作為反應(yīng)溶劑使用可含四氫呋喃的亞砜類溶劑或酰胺類溶劑或它們的混合溶劑，
式(10)及(11)中，各B、各Q、各R分別獨立，其含義如前所述，n、Z如前所述，
R1表示以下的通式(3)表示的取代基，
式(3)中，R11、R12、R13相同或不同，表示氫或烷氧基，
各R4分別獨立，表示H、鹵素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷氧基或以下的通式(4)表示的取代基，
式(4)中，WG1表示吸電子基團(tuán)。
9.如權(quán)利要求8所述的低聚RNA的制備方法，其特征在于，亞砜類溶劑為以下的通式(I)表示的化合物，
式(I)中，Ra、Rb相同或不同，表示烷基。
10.如權(quán)利要求9所述的低聚RNA的制備方法，其特征在于，通式(I)表示的化合物為二甲亞砜。
11.如權(quán)利要求8所述的低聚RNA的制備方法，其特征在于，酰胺類溶劑為以下的通式(II)表示的化合物，
式(II)中，Rc、Rd相同或不同，表示烷基，Re表示氫或烷基，或者Rd表示烷基，Rc、Re表示與鄰接的氮原子及碳原子一起形成的5或6元的飽和環(huán)狀酰胺基。
12.如權(quán)利要求11所述的低聚RNA的制備方法，其特征在于，通式(II)表示的化合物為N，N-二甲基甲酰胺。
13.如權(quán)利要求8～12中任一項所述的低聚RNA的制備方法，其特征在于，WG1為氰基。
14.如權(quán)利要求8～13中任一項所述的低聚RNA的制備方法，其特征在于，使用還含有硝基烷、烷基胺、脒、硫醇或硫醇衍生物或它們的任意的混合物的反應(yīng)溶劑。
15.以下的通式(A)表示的低聚RNA的制備方法，
式(A)中，各B分別獨立，表示核酸堿基或其修飾體，n表示1～200的范圍內(nèi)的整數(shù)，各Q分別獨立，表示O或S，各R分別獨立，表示H、羥基、鹵素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基或烷氧基烷氧基，但至少1個表示羥基，Z表示H、磷酸基或硫代磷酸基，
其特征在于，包括以下的步驟A～H，
步驟A
使酸作用于以下的通式(1)表示的(低聚)核酸衍生物，藉此脫去5’位羥基的保護(hù)基，制備以下的通式(2)表示的(低聚)核酸衍生物的步驟，
式(1)及(2)中，各Q分別獨立，其含義如前所述，n如前所述，各BX分別獨立，表示可具有保護(hù)基的核酸堿基或其修飾體，R1表示以下的通式(3)表示的取代基，
式(3)中，R11、R12、R13相同或不同，表示氫或烷氧基，
各WG2分別獨立，表示吸電子基團(tuán)，各R4分別獨立，表示H、鹵素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷氧基或以下的通式(4)表示的取代基，
式(4)中，WG1表示吸電子基團(tuán)，
E表示?；蛞韵碌耐ㄊ?5)表示的取代基，
式(5)中，E1表示單鍵或以下的通式(6)表示的取代基，
式(6)中，Q、WG2的含義如前所述，
T表示H、酰氧基、鹵素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷氧基、上述通式(4)表示的取代基或上述通式(5)表示的取代基，但E或T的任一方為取代基(5)，
步驟B
采用活化劑使核酸單體化合物與步驟A制得的(低聚)核酸衍生物(2)縮合，制備以下的通式(7)表示的低聚核酸衍生物的步驟，
式(2)及(7)中，各Bx、各Q、各R4、各WG2分別獨立，其含義如前所述。E、n、R1、T的含義如前所述，
步驟C
在步驟B中未反應(yīng)的(低聚)核酸衍生物(2)的5’位羥基的加帽步驟，
式(2)及(8)中，各Bx、各Q、各R4、各WG2分別獨立，其含義如前所述，E、n、T的含義如前所述，R5表示甲基、苯氧基甲基、叔丁基苯氧基甲基，
步驟D
通過使氧化劑作用于步驟B中制備的低聚核酸衍生物(7)而將亞磷酸基轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿峄蛄虼姿峄牟襟E，
式(7)及(9)中，各BX、各Q、各R4、各WG2分別獨立，其含義如前所述，E、n、R1、T的含義如前所述，
步驟E
將步驟D制備的低聚核酸衍生物(9)從固相載體切割，脫去各核酸堿基部及各磷酸基的保護(hù)基的步驟，
式(9)及(10)中，各B、各BX、各Q、各R4、各WG2分別獨立，其含義如前所述，E、n、R、R1、T、Z的含義如前所述，
步驟F
使氟化四丁基銨(TBAF)作用于以下的通式(10)表示的低聚核酸衍生物、將各核糖的2’位羥基的保護(hù)基脫去的工序中，通過用可含四氫呋喃的亞砜類溶劑或酰胺類溶劑或它們的混合溶劑作為反應(yīng)溶劑，制備以下的通式(11)表示的低聚核酸衍生物的步驟，
式(10)及(11)中，各B、各Q、各R、各R4分別獨立，其含義如前所述，n、R1、Z的含義如前所述，
步驟G
將步驟F制備的低聚核酸衍生物(11)的5’位羥基脫去的步驟。
式(11)及(A)中，各B、各Q、各R分別獨立，其含義如前所述，n、R1、Z的含義如前所述，
步驟H
分離精制步驟G制備的低聚RNA(A)的步驟。
16.如權(quán)利要求15所述的低聚RNA的制備方法，其特征在于，通過重復(fù)進(jìn)行步驟A～D制備所需鏈長的低聚RNA(A)。
17.如權(quán)利要求15所述的低聚RNA的制備方法，其特征在于，步驟B中，作為核酸單體化合物的至少1種使用以下的通式(B)表示的化合物，
式(B)中，BZ表示可具有保護(hù)基的核酸堿基或其修飾體，R1表示以下的通式(3)表示的取代基，
式(3)中，R11、R12、R13相同或不同，表示氫或烷氧基，
R2a、R2b相同或不同，表示烷基或表示R2a、R2b與鄰接的氮原子一起形成的5～6元的飽和氨基環(huán)基，該飽和氨基環(huán)基除了氮原子以外可具有1個作為成環(huán)原子的氧原子或硫原子，WG1、WG2相同或不同，表示吸電子基團(tuán)。
18.如權(quán)利要求15～17中任一項所述的低聚RNA的制備方法，其特征在于，亞砜類溶劑為以下的通式(I)表示的化合物，
式(I)中，Ra、Rb相同或不同，表示烷基。
19.如權(quán)利要求18所述的低聚RNA的制備方法，其特征在于，通式(I)表示的化合物為二甲亞砜。
20.如權(quán)利要求15～17中任一項所述的低聚RNA的制備方法，其特征在于，酰胺類溶劑為以下的通式(II)表示的化合物，
式(II)中，Rc、Rd相同或不同，表示烷基，Re表示氫或烷基，或者Rd表示烷基，Rc、Re表示與鄰接的氮原子及碳原子一起形成的5或6元的飽和環(huán)狀酰胺基。
21.如權(quán)利要求20所述的低聚RNA的制備方法，其特征在于，通式(II)表示的化合物為N，N-二甲基甲酰胺。
22.如權(quán)利要求15～21中任一項所述的低聚RNA的制備方法，其特征在于，WG1為氰基。
23.如權(quán)利要求15～22中任一項所述的低聚RNA的制備方法，其特征在于，步驟F中，使用還含有硝基烷、烷基胺、脒、硫醇或硫醇衍生物或它們的任意的混合物的反應(yīng)溶劑。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供可以良好的再現(xiàn)性有效地將在核糖的2’位羥基取代的2-氰基乙氧基甲氧基(CEM基)脫去的方法。通過在使TBAF作用于通式(10)表示的低聚核酸衍生物將各核糖的2’位羥基的保護(hù)基脫去的工序中，作為反應(yīng)溶劑使用亞砜類溶劑或酰胺類溶劑或它們的混合溶劑，制得通式(11)表示的低聚核酸衍生物。
文檔編號C07H21/02GK101426805SQ20078001386
公開日2009年5月6日 申請日期2007年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月27日
發(fā)明者柴佳伸 申請人:日本新藥株式會社