專利名稱：：拮抗性抗-cd4o抗體藥物組合物的制作方法拮抗性抗-CD40抗體藥物組合物發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及藥物制劑領(lǐng)域，更具體涉及含有拮抗性抗-CD40抗體的穩(wěn)定的液體藥物組合物，其可用于治療增生性疾病以及具有自身免疫性和/或炎性成分的疾病。
背景技術(shù)：
：遺傳工程技術(shù)研究的最新進(jìn)展已經(jīng)提供了許多生物活性多肽，其存在量之大足以用作藥物。然而，由于物理不穩(wěn)定性(包括變性和形成可溶及不溶的聚集體)以及各種化學(xué)不穩(wěn)定性(如水解、氧化和脫酰胺)，多肽可能喪失其生物活性。多肽在液體藥物制劑中的穩(wěn)定性可受到諸如pH、離子強(qiáng)度、溫度、反復(fù)的凍融循環(huán)以及例如在加工期間發(fā)生的接觸機(jī)械剪切力等因素的影響。聚集體的形成以及生物活性的喪失也可能是物理攪動以及儲存藥瓶的溶液中和液-氣界面上的多肽分子相互作用所致。由于運(yùn)輸或其他過程中的攪動，吸附到氣-液和固-液界面上的多肽在界面的壓縮-延伸期間可發(fā)生進(jìn)一步的構(gòu)象變化。這種攪動可造成蛋白質(zhì)纏繞、聚集、形成顆粒、并最終與吸附的其他蛋白質(zhì)一起沉淀。有關(guān)蛋白質(zhì)藥物穩(wěn)定性的綜述可參見，例如，Manning等(1989)6:903-918，以及Wang和Hanson(1988)乂尸腳她ra/^Tfec/z.42:S14。含多肽的液體藥物制劑的不穩(wěn)定性促使將這些制劑以凍干形式與合適的重建用液體介質(zhì)一起包裝。盡管凍干提高了組合物的儲存穩(wěn)定性，但許多多肽表現(xiàn)出活性降低，這發(fā)生在以干燥狀態(tài)儲存期間(Pikal(1990)B/op/zwm.27:26-30)或者在重建成液體制劑時(shí)由于聚集體形成或喪失純化活性(參見，例如，Carpenter等(1991)Z)eve一歷o/,加油W74:225-239;Broadhead等(1992)i>wg"eve/,/"d泡肌1169-1206;Mumenthaler等(1994)W仏":12-20;Carpenter禾卩Crowe(1988)Z5:459-470;和Roser(1991)4:47-53)。盡管使用添加劑能提高干燥蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，但許多再水合的制劑仍舊有無法接受或不良含量的無活性聚集蛋白質(zhì)(參見，例如，Townsend和DeLuca(1983)J尸/zarm.朋:63-66;Hora等(1992)P/zflrm.化33-36;Yoshiaka等(1993)PAarm.i^，70:687-691)。再者，需要重建也不方便并有可能造成錯(cuò)誤劑量。藥學(xué)上有用的多肽包括重組制造的單克隆抗體。在這種類型的治療劑中，靶向TNF家族受體成員CD40的拮抗性抗-CD40抗體最有可能用于治療B細(xì)胞相關(guān)性惡性腫瘤和非血液惡性腫瘤，以及具有自身免疫性和/或炎性成分的疾病。CD40受體是一種50-55kDa的細(xì)胞表面抗原，其存在于正常和腫瘤性人B細(xì)胞、樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、單核和上皮細(xì)胞、一些上皮癌、以及許多實(shí)體瘤(包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌和結(jié)腸癌)表面。CD40抗原還表達(dá)在活化的T細(xì)胞、活化的血小板、炎性血管平滑肌細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的滑膜、皮膚成纖維細(xì)胞和其他非淋巴細(xì)胞類型上。根據(jù)表達(dá)CD40的細(xì)胞類型，結(jié)合可導(dǎo)致胞間粘連、分化、活化和增殖。例如，CD40與其同源配體CD40L(也稱為CD154)結(jié)合能刺激B細(xì)胞增殖和分化成漿細(xì)胞、抗體產(chǎn)生、同種型轉(zhuǎn)換、以及產(chǎn)生B細(xì)胞記憶。在B細(xì)胞分化期間，CD40在前B細(xì)胞上表達(dá)但在分化成漿細(xì)胞之后喪失。APC上的CD40表達(dá)在這些細(xì)胞的活化中扮演重要的共刺激(co-sdmulatory)作用。例如，激動性(agonistic)抗-CD40單克隆抗體(mAb)已顯示能模擬T輔助細(xì)胞在B細(xì)胞活化中的作用。當(dāng)出現(xiàn)在表達(dá)FcyRII的粘附細(xì)胞上時(shí)，這些抗體誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖(Banchereau等(1989)Sc/e"ce251:70)。此外，當(dāng)存在IL-4時(shí)，激動性抗-CD40mAb可代替負(fù)責(zé)分泌IgM、IgG和IgE的T輔助細(xì)胞信號(Gascan等(1991)/mmw"o/.147:8)。此外，激動性抗-CD40mAb可防止從淋巴結(jié)分離的B細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡(凋亡)。這些以及其他觀察結(jié)果支持了目前的理論，即CD40和CD40L的相互作用在調(diào)節(jié)體液和細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中扮演關(guān)鍵作用。更近的研究已經(jīng)揭示了CD40/CD40L相互作用在各種生理和病理過程中更加廣泛的作用。因此，CD40與CD40L的結(jié)合以及隨后CD40信號傳導(dǎo)的激活是正常免疫反應(yīng)的必需步驟；然而，CD40信號傳導(dǎo)的失調(diào)可導(dǎo)致疾病。CD40信號傳導(dǎo)途徑已顯示參與自身免疫性疾病(Ichikawa等(2002)J/mwwwo/.169:2781-2787和Moore等(2002)/^to/mmw".19:139-145》此外，CD40/CD40L相互作用在炎性過程中扮演重要角色。例如，在人的和實(shí)驗(yàn)性的動脈粥樣硬化病損中CD40和CD40L都過表達(dá)。CD40刺激誘導(dǎo)粥樣斑相關(guān)細(xì)胞類型如內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中基質(zhì)降解酶類的表達(dá)和組織因子的表達(dá)。再者，CD40刺激誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子如IL-1、IL-6和IL-8以及粘附分子如ICAM-1、E-選擇蛋白和VCAM的產(chǎn)生。抑制CD40/CD40L相互作用在動物模型中能防止動脈粥樣化形成。在移植模型中，阻斷CD40/CD40L相互作用能防止炎癥。已顯示CD40/CD40L結(jié)合與與阿爾茨海默病淀粉樣蛋白-P肽協(xié)同作用以促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，從而導(dǎo)致神經(jīng)毒性。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者中，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的CD40表達(dá)提高，因此，CD40信號傳導(dǎo)可能促使損傷性細(xì)胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生。參見，Gotoh等(2004)JA/7e"wWo/.31:1506-1512。類似地，腫瘤類型B細(xì)胞譜系的惡性B細(xì)胞表達(dá)CD40,而其存活和增殖似乎依賴于CD40信號傳導(dǎo)。低級和高級B細(xì)胞淋巴瘤、B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥以及霍奇金病患者的轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)CD40。還在2/3的急性成髓細(xì)胞性白血病病例和50%的AIDS相關(guān)性淋巴瘤中檢測到CD40的表達(dá)。許多癌和肉瘤還顯示出高水平的CD40表達(dá)，盡管與CD40表達(dá)有關(guān)的CD40信號傳導(dǎo)對這些癌細(xì)胞的作用還不十分清楚。表達(dá)CD40的癌包括膀胱癌(Paulie等(1989)//mmw"o/.142:590-595;Braesch國Andersen等(1989)//mmw"o/.142:562-567)，乳腺癌(Hirano等(1999)飾od93:2999-3007;Wingett等(1998)5wflWOmceri仏7>eaA50:27-36);前列腺癌(Rokhlin等(1997)Ca"cer7仏57:1758-1768)，腎細(xì)胞癌(Kluth等(1997)C羅erU:891-899)，未分化鼻咽癌(UNPC)(Agathanggelou等(1995)^m,//^/zo/.147:1152-1160)，鱗狀細(xì)胞癌(SCC)(Amo等(2000)/D簡ato/.10:438-442;Posner等(1999)C//".Ca膨r5:2261-2270)，甲狀腺乳頭狀癌(Sm他等(1999)T7^raW9:749-755)，皮膚惡性黑色素瘤(vandenOord等(1996)爿m./PaAo/.149:1953-1961)，胃癌(Yamaguchi等(2003)/"AJO"coZ.23(6):1697-702)，以及肝癌(參見，例如，Sugimoto等(1999)Z/e/^to/ogy30(4):920-26，其中討論了人肝細(xì)胞癌)。關(guān)于表達(dá)CD40的肉瘤，參見，例如，Lollini等(1998)C7/".Cfl"cw/"4(8):1843-849，其中討論了人骨肉瘤和尤因肉瘤。鑒于拮抗性抗-CD40抗體在各種癌癥和自身免疫性疾病/炎性疾病中調(diào)節(jié)CD40L-介導(dǎo)的CD40信號傳導(dǎo)中的潛在治療作用，以及配制這些多肽的問題，需要包含這些抗體的穩(wěn)定的藥物組合物。發(fā)明簡述提供了包含拮抗性抗-CD40抗體作為治療或預(yù)防活性組分的穩(wěn)定的穩(wěn)定的液體藥物組合物以及它們的制備方法。這些組合物包含拮抗性抗-CD40抗體、維持組合物的pH在約pH5.0和約pH7.0之間的緩沖劑、以及含量足以使該液體組合物接近等滲的精氨酸-HCl。在一些實(shí)施方式中，所述緩沖劑是檸檬酸鹽/檸檬酸緩沖齊U，所述拮抗性抗-CD40抗體是CHIR-12.12或CHIR-5.9拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段，所述組合物包含精氨酸-HCl作為等滲劑，且該組合物還包含非離子表面活性劑和/或L-甲硫氨酸作為其它穩(wěn)定劑。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的含拮抗性抗-CD40抗體的穩(wěn)定的液體藥物組合物可用于治療增生性疾病以及具有自身免疫性和/或炎性成分的疾病的方法。附圖簡述圖1顯示了通過SEC-HPLC分析測得的緩沖劑類型對于在25r儲存3個(gè)月或5個(gè)月的mAbCHIR-12.12制劑純度的影響。圖2顯示了通過SEC-HPLC分析測得的緩沖劑類型對在25t:儲存3個(gè)月或5個(gè)月的各種抗體制劑內(nèi)mAbCHIR-12.12的聚集體形成的影響。圖3顯示了通過SEC-HPLC分析測得的緩沖劑類型對在25t:儲存3個(gè)月或5個(gè)月的各種抗體制劑內(nèi)mAbCHIR-12.12的片段化的影響。圖4顯示了通過SEC-HPLC分析測得的緩沖劑類型對于在4(TC儲存3個(gè)月或5個(gè)月的mAbCHIR-12.12制劑純度的影響。圖5顯示了通過SEC-HPLC分析測得的緩沖劑類型對在4(TC儲存3個(gè)月或5個(gè)月的各種抗體制劑內(nèi)mAbCHIR-12.12的聚集體形成的影響。圖6顯示了通過SEC-HPLC分析測得的緩沖劑類型對在4(TC儲存3個(gè)月或5個(gè)月的各種抗體制劑內(nèi)mAbCHIR-12.12的片段化的影響。圖7顯示了含NaCl或L-精氨酸-HCl作為等滲劑的制劑中mAbCHIR-12.12的差示掃描量熱法的熱分析圖。圖8顯示了通過SEC-HPLC測得的當(dāng)在25"儲存2、4或6個(gè)月時(shí)含NaCl或L-精氨酸-HCl作為等滲劑的制劑中保留的mAbCHIR-12.12單體形式％。圖9顯示了通過SEC-HPLC測得的當(dāng)在25。C儲存2、4或6個(gè)月時(shí)含NaCl或L-精氨酸-HCl作為等滲劑的制劑中的mAbCHIR-12.12聚集體％。圖10顯示了通過SEC-HPLC測得的當(dāng)在25"C儲存2、4或6個(gè)月時(shí)含NaCl或L-精氨酸-HCl作為等滲劑的制劑中的mAbCHIR-12.12片段％。圖11顯示了通過SEC-HPLC測得的當(dāng)在4(TC儲存2或4個(gè)月時(shí)含NaCl或L-精氨酸-HCl作為等滲劑的制劑中保留的mAbCHIR-12.12單體形式％。圖12顯示了通過SEC-HPLC測得的當(dāng)在4(TC儲存2或4個(gè)月時(shí)含NaCl或L-精氨酸-HCl作為等滲劑的制劑中的mAbCHIR-12.12聚集體％。圖13顯示了通過SEC-HPLC測得的當(dāng)在4(TC儲存2或4個(gè)月時(shí)含NaCl或L-精氨酸-HCl作為等滲劑的制劑中的mAbCHIR-12.12片段％。圖14顯示了通過C正X-HPLC測得的當(dāng)在25。C儲存2、4或6個(gè)月時(shí)含NaCl或L-精氨酸-HCl作為等滲劑的制劑中mAbCHIR-12.12的純度％。圖15顯示了通過CIEX-HPLC測得的當(dāng)在25°。儲存2、4或6個(gè)月時(shí)含NaCl或L-精氨酸-HCl作為等滲劑的制劑中mAbCHIR-12.12的酸性變體％。圖16顯示了通過CIEX-HPLC測得的當(dāng)在25°。儲存2、4或6個(gè)月時(shí)含NaCl或L-精氨酸-HCl作為等滲劑的制劑中mAbCHIR-12.12的堿性變體％。發(fā)明詳述下文參考附圖中更詳細(xì)地描述本發(fā)明，附圖中顯示了部分但非全部的本發(fā)明實(shí)施方式。實(shí)際上，這些發(fā)明可以許多不同形式體現(xiàn)而不限于文中列出的實(shí)施方式；再者，因?yàn)樘峁┝诉@些實(shí)施方式從而本發(fā)明將滿足所適用的法律要求。從以上描述和相關(guān)附圖的教導(dǎo)中獲益的本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員會想到文中列出的本發(fā)明的許多改進(jìn)和其他實(shí)施方式。因此，應(yīng)理解，本發(fā)明不限于披露的特定實(shí)施方式，這種改進(jìn)和其他實(shí)施方式也包含在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。盡管文中采用了特定術(shù)語，但只以一般性和描述性含義使用而非出于限制目的。本發(fā)明涉及包含至少一種拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段作為治療或預(yù)防活性組分的穩(wěn)定的液體藥物組合物，并涉及它們的制備方法。出于本發(fā)明的目的，藥物組合物或制劑的相關(guān)術(shù)語"液體"包括術(shù)語"水性"。"治療或預(yù)防活性組分"是指具體將拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段摻入組合物，從而當(dāng)將藥物組合物給予對象時(shí)，能帶來治療、預(yù)防或診斷對象的疾病或癥狀相關(guān)的所需治療或預(yù)防反應(yīng)。"穩(wěn)定的"是指本發(fā)明的藥物組合物提供了拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的物理和/或化學(xué)穩(wěn)定性。這就是說，該拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段基本保留其物理和/或化學(xué)穩(wěn)定性并具有所需生物活性，即本文其他地方定義的一種或多種拮抗活性，包括但不限于抑制T細(xì)胞刺激的正常人外周B細(xì)胞的免疫球蛋白分泌；抑制JurkatT細(xì)胞刺激的正常人外周B細(xì)胞的存活和/或增殖；抑制表達(dá)CD40L的細(xì)胞或可溶性CD40配體(sCD40L)刺激的正常人外周B細(xì)胞的存活禾n/或增殖；抑制sCD40L或固相CD40L刺激的任何細(xì)胞內(nèi)的"存活的"抗-凋亡胞內(nèi)信號；抑制sCD40L或固相CD40L結(jié)合之后任何細(xì)胞內(nèi)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；抑制人惡性B細(xì)胞增殖；帶有CD40的耙細(xì)胞或帶有CD40同源配體的細(xì)胞(包括但不限于T細(xì)胞和B細(xì)胞)的刪除、無反應(yīng)性和/或耐受誘導(dǎo)；誘導(dǎo)CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞的擴(kuò)增或活化(參見，例如，經(jīng)CD40-CD40L干擾發(fā)生的供體同種抗原-特異性組織排斥，vanMaurik等(2002)J/mmw"o/.169:5401-5404);經(jīng)任何機(jī)制發(fā)生的細(xì)胞毒性(包括但不限于耙細(xì)胞中依賴于抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)、增殖的下調(diào)和/或凋亡)；調(diào)節(jié)耙細(xì)胞細(xì)胞因子分泌和/或細(xì)胞表面分子表達(dá)；以及它們的組合。監(jiān)測蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法是本領(lǐng)域熟知的。參見，例如，Jones(1993)A/v.Z>wgZ)Wve^iev.10:29-90;Lee編(1991)朋af尸rafe/"Z>wgZ)e//veo<itf〃^^^^^秀激游遞送)(MD公司(MarcelDekker，Inc.),紐約，紐約)；以及下文中描述的穩(wěn)定性試驗(yàn)。通常，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性是在所選溫度下在特定時(shí)間期內(nèi)測定的。在優(yōu)選實(shí)施方式中，穩(wěn)定的抗體藥物組合物在室溫(約25。C)儲存至少1個(gè)月、至少3個(gè)月或至少6個(gè)月，和/或在約2-8。C儲存至少6個(gè)月、至少9個(gè)月、至少12個(gè)月、至少18個(gè)月、至少24個(gè)月能提供拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)如抗體被配制成藥物組合物時(shí)，如果該藥物組合物中未顯示出沉淀、聚集和/或變性的可見標(biāo)志(即，變色或喪失透明度)或可測標(biāo)志(例如，采用尺寸排阻層析(SEC)或UV光散射)則認(rèn)為其在給定時(shí)間點(diǎn)上保留其物理穩(wěn)定性。就化學(xué)穩(wěn)定性而言，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)如抗體被配制成藥物組合物時(shí)，如果化學(xué)穩(wěn)定性的測量值提示在藥物組合物中該蛋白質(zhì)(即，抗體)保留感興趣的生物活性，則認(rèn)為其在給定時(shí)間點(diǎn)上保留其化學(xué)穩(wěn)定性。監(jiān)測化學(xué)穩(wěn)定性改變的方法是本領(lǐng)域熟知，包括但不限于檢測蛋白質(zhì)化學(xué)改變形式(如切割(clipping)所致)的方法，其采用，例如，SDS-PAGE，SEC，和/或基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜；和與分子電荷變化相關(guān)的(例如，與脫酰胺相關(guān))降解，其采用，例如，離子交換層析。參見，例如，下文所述的方法。拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段被配制成藥物組合物時(shí)，如果通過測量所需生物活性的合適試驗(yàn)測得給定時(shí)間點(diǎn)的所需生物活性在該藥物組合物制備時(shí)顯示出的所需生物活性的約30%之內(nèi)，優(yōu)選約20%之內(nèi)則認(rèn)為其在該時(shí)刻保留了所需生物活性。測定本文所述拮抗性抗-CD40抗體及其抗原結(jié)合片段所需生物活性的試驗(yàn)可按以下申請中的描述進(jìn)行2003/11/4、2003/11/26和2004/4/27提交的并分別給予美國專利申請?zhí)?0/517,337(代理人案巻號PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人案巻號PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人案巻號PP20107.003(035784/277214))的題為"^"fago"/W^油'-CD40Mowoc/owa/Jw"6oWesMeAoA>T7ze/rL^e滯貧絲恭CD40卓克廣貧沐J^"帝法/，的臨時(shí)申請；以及2004/11/4提交并公布為WO2005/044854的同樣題為"^4齒《朋^"油--(^_/>^Mo"oc/owa/^w幼o(hù)d/eya"c/M"/zo<iyybr77ze/rL^e卩獵貧性貧-OM卓克燈拔體及其I萄"的國際專利申請?zhí)朠CT/US2004/037152(代理人案巻號PP20107.004(035784/282916));它們各自的內(nèi)容通過引用全文納入本文。也可參見以下申請中描述的試驗(yàn)題為"Me,/zofife/orZ)/ag"a^朋d7^ea加eWo/尸ra啡ra"veZ)&ora^tyCZW5Vg"a〃"g「珍銜,洽^"CDW/,號傳導(dǎo)分導(dǎo)游潛主絲疾瘋游方法/'的臨時(shí)申請，該申請于2005/12/9提交并給予美國專利申請?zhí)?0/749,285(代理人案巻號PP028035.0002(035784/304312))，以及2006/5/18提交并公布為WO2006/125143的相應(yīng)的國際專利申請?zhí)朠CT/US2006/019414(代理人案巻號PP028035.0003(035784/311611));和題為"MeAoAZ)/ag"a^Trea加e"fo/D/secises//aW打gawviwfo/mmimeawd/or/"/Zammafor;vCompowewf(診斷禾口治療具有^身,度絲和/或炎性成分的疾病的方法)"的臨時(shí)申請，該申請于2005/12/9提交并給予美國專利申請?zhí)?0/749,336(代理人案巻號PP028062.0002(035784/304311))，以及2006/5/18提交并公布為WO2006/125117的相應(yīng)的國際專利申請?zhí)朠CT/US2006/019325(代理人案巻號PP028062.0003(035784/311608));它們各自的內(nèi)容通過引用全文納入本文。也可參見以下文獻(xiàn)中描述的試驗(yàn)Schultze等(1998)尸rac.Ato/.Ja^.92:8200-8204;Denton等(1998)尸ecfe^:rramp/aW,2:6-15;Evans等(2000)J！/mmw"o/.164:688-697;Noelle(1998)^4c^owfSw;;/.49:17-22;Lederman等(1996)Cw/rQp/w.ifemato/.3:77-86;Coligan等(1991)Cm"eW尸ratocofef"http://wmw"o/ogy13:12,Kwekkeboom等(1993)/mmM"o/ogy79:439-444;以及美國專利號5,674,492和5,847,082;通過引用納入本文。要按照本發(fā)明方法配制的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段可采用任何本領(lǐng)域已知方法制備，包括本文其他地方描述的那些方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體，或其抗原結(jié)合片段是在下文所述的CHO細(xì)胞系內(nèi)重組產(chǎn)生。制備和純化之后，可采用本文所述方式將拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段制備成液體藥物組合物。如果要先儲藏拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段再配制，可將其冷凍在例如^-2(TC，然后室溫下解凍以進(jìn)一步配制。本發(fā)明的液體藥物組合物包含治療或預(yù)防有效量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段。制劑中抗體或其抗原結(jié)合片段的存在量考慮了給藥途徑和所需劑量體積。該方式中，本發(fā)明的液體藥物組合物包含拮抗性抗-CD40抗體，例如，CHIR-12.12或CHIR-5.9抗體，或其抗原結(jié)合片段，其濃度為約0.1mg/ml至約50.0mg/ml，約0.5mg/ml至約40.0mg/ml，約1.0mg/ml至約35.0mg/ml，約1.0mg/ml至約30.0mg/ml，約5.0mg/ml至約25.0mg/ml，約5.0mg/ml至約20.0mg/ml，約10.0mg/ml至約35.0mg/ml，或約15.0mg/ml至約25.0mg/ml。在一些實(shí)施方式中，該液體藥物組合物包含拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段，其濃度為約0.1mg/ml至約5.0mg/ml，約5.0mg/ml至約10.0mg/ml，約10.0mg/ml至約15.0mg/ml，約15.0mg/ml至約20.0mg/ml，約20.0mg/ml至約25.0mg/ml，約25.0mg/ml至約30.0mg/ml，約30.0mg/ml至約35.0mg/ml，約35.0mg/ml至約40.0mg/ml，約40.0mg/ml至約45.0mg/ml，或約45.0mg/ml至約50.0mg/ml。在其他實(shí)施方式中，該液體藥物組合物包含拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段，其濃度為約15.0mg/ml，約16.0mg/ml，約17.0mg/ml，約18.0mg/ml，約19.0mg/ml，約20.0mg/ml，約21.0mg/ml，約22.0mg/ml，約23.0mg/ml，約24.0mg/ml，約25.0mg/ml，約26.0mg/ml，約27.0mg/ml，約28.0mg/ml，約29.0mg/ml，約30.0mg/ml，約31.0mg/ml，約32.0mg/ml，約33.0mg/ml,約34.0mg/ml，或約35.0mg/ml。根據(jù)本發(fā)明，拮抗性抗-CD40抗體，例如，下述單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段，與維持藥物組合物的pH在約pH5.0至約pH7.0范圍內(nèi)的緩沖劑以及含量足以使該組合物接近等滲的酸形式的精氨酸(本文稱為精氨酸-HCl)—起配制。"接近等滲"是指水性制劑的摩爾滲透壓濃度為約240mmol/kg至約360mmol/kg，優(yōu)選約240至約340mmol/kg，更優(yōu)選約250至約330mmol/kg，再優(yōu)選約260至約320mmol/kg，更優(yōu)選約270至約310mmol/kg。在一些實(shí)施方式中，該液體藥物組合物的摩爾滲透壓濃度為約295mmol/kg。測定溶液等滲性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見，例如，Setnikar等(1959)乂」m.Awc.48:628。精氨酸-HCl不僅作為等滲劑，而且可用來穩(wěn)定抗體以抵抗本發(fā)明液體藥物組合物儲存期間的構(gòu)象改變、聚集體形成、片段化和/或脫酰胺。"儲存期間"是指在液體藥物組合物或制劑制備之后不立即給于對象。而是在制備之后將其包裝以供儲18存，可以是液體形式、冷凍狀態(tài)或以后重建成液體形式的干燥形式或適合給予對象的其他形式。"干燥形式"是指液體藥物組合物或制劑通過以下方法干燥冷凍干燥(即，凍干；參見，例如，Williams和Polli(1984)</iW她ra/Sc/.7fec/"o/.3S:48陽59)，噴霧干燥(參見，Masters(1991)Spra;;-Do^"gi/a"^oo"噴霧于潔手J^(第五版；英國埃西澤朗曼科技出版社(LongmanScientificandTechnical,Essez，U.K.))，491-676頁；Broadhead等(1992)Z>wgDeve/./m/.7S:1169-1206;禾口Mumenthaler等(1994)尸/wr附./仏":12-20)，或空氣干燥(Carpenter和Crowe(1988)Co;o6/o/ogv25:459-470;以及Roser(1991)4:47-53)。液體藥物組合物儲存期間抗體的構(gòu)象改變、聚集體形成、片段化和/或脫酰胺可對抗體的生物活性造成不利影響，導(dǎo)致藥物組合物喪失療效。此外，聚集體形成可造成其他問題，如當(dāng)采用輸注系統(tǒng)給予含有抗體的藥物組合物時(shí)會阻塞管道、膜或泵。精氨酸的任何立體異構(gòu)體(S卩，L、D或DL異構(gòu)體)或這些立體異構(gòu)體的組合也存在于本發(fā)明的藥物組合物中，只要精氨酸以其酸形式，即精氨酸-HCl存在。優(yōu)選采用L-立體異構(gòu)體。本發(fā)明的組合物也可用這種氨基酸的類似物配制。"氨基酸類似物"是指天然產(chǎn)生氨基酸的衍生物，其帶來使得組合物接近等滲以及降低在本發(fā)明液體藥物組合物儲存期間多肽的聚集體形成、片段化和/或脫酰胺等所需效果。合適的精氨酸類似物包括，例如，氨基胍和N-單乙基L-精氨酸。與精氨酸一樣，氨基酸類似物也以它們的酸形式摻入組合物。精氨酸-HCl在藥物組合物中的濃度將取決于其他組分對張力的作用。在一些實(shí)施方式中，精氨酸-HCl的濃度為約50mM至約300mM，約50mM至約250mM，約50mM至約200mM，約50mM至約175mM，約50mM至約150mM，約75mM至約175mM，約75mM至約150mM，約100mM至約175mM，約100mM至約200mM，約100mM至約150mM，約125mM至約175mM，約125mM至約150mM，約130mM至約170mM，約130mM至約160mM，約135mM至約155mM，約140mM至約155mM，或約145mM至約155mM。在一個(gè)這樣的實(shí)施方式中，精氨酸-HCl的濃度為約125mM，約150mM，或約175mM。含有抗體的液體藥物組合物的pH會影響其中所含抗體的穩(wěn)定性，這種影響主'要通過其對多肽聚集體形成的影響。因此，本發(fā)明藥物組合物中緩沖劑的存在量將根據(jù)使感興趣的特定拮抗性抗-CD40抗體穩(wěn)定性的最佳pH而變化。確定該最佳pH可通過本領(lǐng)域通常可采用的方法，包括，例如評估構(gòu)象穩(wěn)定性的差示掃描量熱法(DSC);評估聚集和片段化的SDS-PAGE和大小排阻層析(SEC-HPLC);和評估電荷改變相關(guān)降解的陽離子交換HPLC(CIEX-HPLC)分析。本發(fā)明的液體藥物組合物的優(yōu)選pH為約pH5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，以及約pH5.0至約pH7.0范圍內(nèi)的其他此類值。在一些實(shí)施方式中，所述緩沖劑將該藥物組合物的pH維持在約pH5.0至約pH6.5，約pH5.0至約pH6.0，約pH5.0至約pH5.5，約pH5.5至約7.0，約pH5.5至約pH6.5，或約pH5.5至約pH6.0的范圍內(nèi)。維持拮抗性抗-CD40抗體液體藥物組合物的pH在約pH5.0至約pH7.0范圍內(nèi)的任何合適緩沖劑可用于該制劑，只要所述抗體能保留物理化學(xué)穩(wěn)定性和所需生物活性，如上所述。合適的緩沖劑包括，但不限于，常規(guī)的酸及其鹽，其中的抗衡離子可以是，例如，鈉，鉀，銨，鈣，或鎂。可用來緩沖該液體藥物組合物的常規(guī)酸及其鹽的離子包括，但不限于，檸檬酸或檸檬酸鹽，琥珀酸或琥珀酸鹽，醋酸或醋酸鹽，酒石酸或酒石酸鹽，磷酸或磷酸鹽，葡糖酸或葡糖酸鹽，谷氨酸或谷氨酸鹽，天冬氨酸或天冬氨酸鹽，馬來酸或馬來酸鹽，以及蘋果酸或蘋果酸鹽緩沖劑。已知緩沖劑可以是酸和該酸的鹽形式的混合物，例如，檸檬酸和檸檬酸鹽的混合物(文中稱為檸檬酸鹽/檸檬酸緩沖劑)，琥珀酸和琥珀酸鹽的混合物(文中稱為琥珀酸鹽/琥珀酸緩沖劑)，醋酸和醋酸鹽的混合物(文中稱為醋酸鹽/醋酸緩沖劑)，以及上述每種酸/酸鹽對。緩沖劑的濃度可以從約1mM至約50mM，包括約lmM，2mM，5mM，8mM，10mM，15mM，20mM，25mM，30mM，35mM，40mM，45mM，50mM，或約1mM至約50mM范圍內(nèi)的其他此類值。在一些實(shí)施方式中，緩沖劑的濃度是從約5mM至約15mM，包括約5mM，6mM，7mM，8mM，9mM，10mM,llmM，12mM，13mM，14mM，15mM，或約5mM至約15mM范圍內(nèi)的其他此類值。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述液體藥物組合物包含所需濃度(即，約0.1mg/ml至約50.0mg/ml，如上所述)的本文其他地方所述的拮抗性抗-CD40抗體，例如，單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原結(jié)合片段，使組合物接近等滲的一定量的精氨酸-HCl，以及緩沖劑，該緩沖劑是檸檬酸鹽/檸檬酸緩沖劑，其中緩沖劑的濃度能維持藥物組合物的pH在約pH5.0至約pH7.0的范圍內(nèi)，優(yōu)選約pH5.0至約pH6.5，包括約pH5.0，5.5，6.0禾B6.5。"檸檬酸鹽"是指含有檸檬酸的鹽的緩沖劑。在優(yōu)選實(shí)施方式中，檸檬酸鹽抗衡離子是鈉陽離子，因此該檸檬酸鹽緩沖劑組分是檸檬酸鈉。然而，預(yù)計(jì)任何陽離子都是有效的。其他可能的檸檬酸鹽陽離子包括，但不限于，鉀，銨，鈣，和鎂。如上所述，檸檬酸鹽/檸檬酸緩沖20劑包含酸(即，檸檬酸)和該酸的鹽形式(即，檸檬酸鹽)的混合物，其中，酸的鹽形式中的抗衡離子可以是任何合適的陽離子。在一個(gè)這樣的實(shí)施方式中，酸的鹽形式中的抗衡離子是鈉陽離子，因此該緩沖劑包含檸檬酸和檸檬酸鈉的混合物。如上所述，檸檬酸鹽/檸檬酸緩沖劑的濃度可從約1mM至約50mM，包括約1mM，2mM，5mM，8mM，10mM，15mM，20mM，25mM，30mM，35mM，40mM，45mM，50mM，或lmM至約50mM范圍內(nèi)的其他此類值。在一些實(shí)施方式中，檸檬酸鹽/檸檬酸緩沖劑的濃度從約5mM至約15mM，包括約5mM，6mM，7mM，8mM，9mM，10mM，11mM，12mM，13mM，14mM，或約15mM。在其他實(shí)施方式中，該液體藥物組合物包含拮抗性抗-CD40抗體如單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原結(jié)合片段，其濃度為約0.1mg/ml至約50.0mg/ml，約5.0mg/ml至約35.0mg/ml，約10.0mg/ml至約35.0mg/ml，或約10.0mg/ml至約20.0mg/ml;使組合物接近等滲的一定量的精氨酸-HCl;以及緩沖劑，所述緩沖劑是檸檬酸鹽/檸檬酸緩沖劑，其濃度為約1mM至約20mM，約5mM至約15mM，優(yōu)選約10mM。再在其他實(shí)施方式中，該液體藥物組合物包含拮抗性抗-CD40抗體如單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原結(jié)合片段，其濃度為約0.1mg/ml至約50.0mg/ml，約5.0mg/ml至約35.0mg/ml，約10.0mg/ml至約35.0mg/ml，或約10.0mg/ml至約20.0mg/ml;使組合物接近等滲的一定量的精氨酸-HC1;以及緩沖劑，所述緩沖劑是檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖劑，其濃度為約1mM至約20mM，約5mM至約15mM，優(yōu)選約10mM。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，該液體藥物組合物包含拮抗性抗-CD40抗體，例如，單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原結(jié)合片段；維持藥物組合物的pH在約pH5.0至約pH7.0范圍內(nèi)的緩沖劑；和精氨酸-HCl的濃度為約100mM至約200mM。在這些實(shí)施方式的一些中，所述緩沖劑是檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖劑，其濃度為約5mM至約15mM，所述液體藥物組合物包含拮抗性抗-CD40抗體，例如，單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原結(jié)合片段，且該藥物組合物的pH為約pH5.0至約pH7.0，約pH5.0至約pH6.5，或約pH5.5至約pH6.0。在其他實(shí)施方式中，該液體藥物組合物包含拮抗性抗-CD40抗體，例如，單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原結(jié)合片段，其濃度為約0.1mg/ml至約50.0mg/ml，約5.0mg/ml至約35.0mg/ml，或約10.0mg/ml至約35.0mg/ml，包括約10.0mg/ml，約15.0mg/ml，約20.0mg/ml，約25.0mg/ml，約30.0mg/ml，或約35.0mg/ml;約150mM精氨酸-HCl;以及緩沖劑，其為約10mM的檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖劑；該制劑的pH為約pH5.5。由于本發(fā)明液體藥物制劑的加工期間因凍融或機(jī)械剪切造成的蛋白質(zhì)降解可通過在制劑中加入表面活性劑降低液-氣界面的表面張力來抑制。因此，在一些實(shí)施方式中，該液體藥物組合物包含拮抗性抗-CD40抗體，例如，單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原結(jié)合片段；維持藥物組合物的pH在約pH5.0至約pH7.0范圍內(nèi)的緩沖劑；一定量的使液體藥物組合物接近等滲的精氨酸-HCl;以及還包含表面活性劑。在其他實(shí)施方式中，該液體藥物組合物包含拮抗性抗-CD40抗體，例如，單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原結(jié)合片段；維持藥物組合物的pH在約pH5.0至約pH7.0范圍內(nèi)的緩沖劑；精氨酸-HCl，其濃度為約50mM至約300mM，或約100mM至約200mM;以及還包含表面活性劑。所采用的典型表面活性劑是非離子型表面活性劑，包括聚氧乙烯山梨醇酯，例如聚山梨酸酯80(吐溫80)和聚山梨酸酯20(吐溫20);聚氧丙烯-聚氧乙烯酯，例如PluronicF68;聚氧乙烯醇，例如Brij35;二甲硅油；聚乙二醇，例如PEG400;溶血磷脂酰膽堿；和聚氧乙烯-對-叔辛基苯酚，例如TritonX-IOO。表面活性劑或乳化劑的經(jīng)典藥物穩(wěn)定作用描述于，例如納入本文作為參考的Levine等(1991)，l/jPm^^ra/&/.7fec/z"o/.45(3):160-165。用于實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選表面活性劑是聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80。當(dāng)包含表面活性劑時(shí)，一般按以下量加入0.001%至約1.0%，約0.001%至約0.5%，約0.001%至約0.4%，約0.001%至約0.3%，約0.001%至約0.2%，約0.005%至約0.5%，約0.005%至約0.2%，約0.01%至約0.5%，約0.01%至約0.2%，約0.03%至約0.5%，約0.03%至約0.3%，約0.05%至約0.5%，或約0.05%至約0.2%,其中的百分比為重量/體積(w/v)百分比。因此，在一些實(shí)施方式中，該液體藥物組合物包含拮抗性抗-CD40抗體，例如，單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原結(jié)合片段；所述緩沖劑是檸檬酸鹽/檸檬酸緩沖劑，例如，檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖劑，其濃度為約lmM至約50mM，約5mM至約25mM，或約5mM至約15mM;組合物的pH為約pH5.0至約pH7.0，約pH5.0至約pH6.5，或約pH5.5至約pH6.0;存在精氨酸-HCl，其濃度為約50mM至約300mM，約100mM至約200mM,或約50mM至約150mM;該藥物組合物還包含表面活性劑，例如，聚山梨酸酯20，其含量從約0.001%至約1.0%(w/v)或從約0.001%至約0.5%(w/v)。在其他實(shí)施方式中，該液體藥物組合物包含拮抗性抗-CD40抗體，例如，單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原結(jié)合片段，其濃度為約0.1mg/ml至約50.0mg/ml，約5.0mg/ml至約35.0mg/ml，或約2210.0mg/ml至約35.0mg/ml，包括約10.0mg/ml，約15.0mg/ml，約20.0mg/ml，約25.0mg/ml，約30.0mg/ml，或約35.0mg/ml;約50mM至約200mM精氨酸-HCl，包括約150mM精氨酸-HCl;所述緩沖劑是檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖劑，其濃度為約5mM至約20mM，包括約10mM;且該藥物組合物任選包含表面活性劑，例如，聚山梨酸酯20，含量從約0.001%至約1.0%(w/v)，包括約0.001%至約0.5%(w/v)，約0.01%至約0.25%(w/v)，約0.025%至約0.2%(w/v)，約0.025%至約0.1%(w/v)，或約0.05%至約0.2%(w/v);其中的液體藥物組合物的pH為約pH5.0至約pH7.0，約pH5.0至約pH6.0，約pH5.0至約pH5.5，約pH5.5至約pH6.5，約pH5.5至約pH6.0，或約pH5.5。該液體藥物組合物可基本上不含任何防腐劑和其它載體、賦形劑或穩(wěn)定劑?；蛘撸撍幬锝M合物可任選包含一種或多種防腐劑，例如抗細(xì)菌劑，藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或本文它處描述的穩(wěn)定劑，前提是它們對抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的理化穩(wěn)定性無不利影響?？山邮艿妮d體、賦形劑和穩(wěn)定劑的例子包括，但不限于額外的緩沖試劑，助溶劑，表面活性劑，抗氧化劑，包括維生素C和甲硫氨酸，螯合劑，例如EDTA、金屬復(fù)合物(例如，Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)和生物可降解的聚合物，例如聚酯。關(guān)于制劑和選擇藥學(xué)上可接受的載體、穩(wěn)定劑和等滲劑(isomolytes)的詳盡討論見纟內(nèi)入本文作為參考的Remington'sPharmaceuticalSciences(雷明頓藥物科學(xué))(第18版；賓西法尼亞州伊頓市麥克出版公司(MackPublishingCompany,Eaton，Pennsylvania),1990)。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的含拮抗性抗-CD40抗體的液體藥物組合物還包含氨基酸甲硫氨酸以抑制抗體多肽鏈內(nèi)可氧化的氨基酸殘基的氧化。"抑制"是指盡可能降低隨時(shí)間產(chǎn)生的氧化種類的累積。抑制氧化使得更多的拮抗性抗-CD40抗體維持其合適的分子形式。可采用甲硫氨酸的任何立體異構(gòu)體(L、D或DL異構(gòu)體)或其組合。加入量應(yīng)為足以抑制可氧化氨基酸殘基氧化的量，從而使得氧化種類的量為管理機(jī)構(gòu)所接受。通常，這意味著該組合物含有不超過約10%至約30%的氧化產(chǎn)物。一般來說，這可通過加入甲硫氨酸來實(shí)現(xiàn)，從而加入的甲硫氨酸與甲硫氨酸殘基的比值范圍為約1:1至約1000:1，更優(yōu)選10:1至約100:1。要加入的甲硫氨酸的優(yōu)選量通過制備包含感興趣的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段以及不同濃度甲硫氨酸的組合物并測定對于多肽氧化種類形成的相對效果從而根據(jù)經(jīng)驗(yàn)方便地確定，測定相對效果可采用，例如，層析分離分子種類并利用多肽分子量標(biāo)準(zhǔn)品鑒定，如采用RP-HPLC或?qū)嵤├?所述的疏水相互作用層析(HIC)。最大可能抑制可氧化氨基酸殘基的氧化而對抗體聚集的氨基酸相關(guān)抑制沒有不良影響的甲硫氨酸濃度代表著要加入組合物以進(jìn)一步提高抗體穩(wěn)定性的甲硫氨酸的優(yōu)選量。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述液體藥物組合物包含拮抗性抗-CD40抗體，例如，單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原結(jié)合片段；所述緩沖劑是檸檬酸鹽/檸檬酸緩沖劑，例如，檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖劑，其濃度為約1mM至約50mM，約5mM至約25mM，或約5mM至約15mM;藥物組合物的pH為約pH5.0至約pH7.0，約pH5.0至約pH6.5，或約pH5.5至約pH6.0;存在精氨酸-HCl，其濃度為約50mM至約300mM，約100mM至約200mM，或約50mM至約150mM;存在表面活性劑，例如，聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80，其含量從約0.001%至約1.0%(w/v)或從約0.001%至約0.5%(w/v);且該藥物組合物還包含甲硫氨酸，其濃度為約0.5mM至約20.0mM，約0.5mM至約10.0mM，約1.0mM至約20.0mM，約1.0mM至約10.0mM，約1.0mM至約7.0mM，約2.0mM至約6.0mM，或約2.5mM至約5.0mM。在其他實(shí)施方式中，該液體藥物組合物包含拮抗性抗-CD40抗體，例如，單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原結(jié)合片段，其濃度為約0.1mg/ml至約50.0mg/ml，約5.0mg/ml至約35.0mg/ml，或約10.0mg/ml至約35.0mg/ml，包括約10.0mg/ml，約15.0mg/ml，約20.0mg/ml，約25.0mg/ml，約30.0mg/ml，或約35.0mg/ml;約50mM至約200mM精氨酸-HCl，包括約150mM精氨酸-HCl;檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖劑，其濃度為約5mM至約20mM，包括約10mM;任選的表面活性劑，例如，聚山梨酸酯20，其含量從約0.001%至約1.0%(w/v)，包括約0.001%至約0.5%(w/v)，約0.01%至約0.25%(w/v)，約0.025%至約0.2%(w/v)，約0.025%至約0.1%(w/v)，或約0.05%至約0.2%(w/v);以及任選的甲硫氨酸，例如，其濃度為約0.5mM至約10.0mM，約1.0mM至約7.0mM，約2.0mM至約6.0mM，或約2.5mM至約5.0mM，包括約2.0mM，約2.5mM，約3.0mM，約3.5mM，約4.0mM，約4.5mM，約5.0mM，或約5.5mM;其中，該液體藥物組合物的pH為約pH5.0至約pH7.0，約pH5.0至約pH6.0，約pH5.0至約pH5.5，約pH5.5至約pH6.5，約pH5.5至約pH6.0,或約pH5.5。再在其他實(shí)施方式中，所述液體藥物組合物包含單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原結(jié)合片段，其濃度為約0.1mg/ml至約50.0mg/ml，約5.0mg/ml至約35.0mg/ml，或約10.0mg/ml至約35.0mg/ml，包括約10.0mg/ml，約15.0mg/ml，約20.0mg/ml，約25.0mg/ml,約30.0mg/ml，或約35.0mg/ml;約100mM至約200mM精氨酸-HCl，包括約150mM精氨酸-HCl;檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖劑，其濃度為約5mM至約20mM，包括約10mM;任選的表面活性劑，例如，聚山梨酸酯20，其含量從約0.025%至約0.1%(w/v);以及任選的甲硫氨酸，例如，其濃度為約2.0mM至約5.5mM，包括約5.0mM;其中，該液體藥物組合物的pH為約pH5.0至約pH6.0,包括約pH5.5。除了上述那些試劑，可任選加入其他穩(wěn)定劑如白蛋白、乙二胺四乙酸(EDTA)或它的一種鹽如EDTA二鈉以進(jìn)一步提高液體藥物組合物的穩(wěn)定性。需要時(shí)，可加入的白蛋白的濃度為約1.0%w/v或更低。EDTA作為已知能催化許多氧化反應(yīng)的金屬離子的清除劑，從而提供了一種額外的穩(wěn)定劑。需要時(shí)，可加入的EDTA的濃度為約0.1至約5.0mM。需要時(shí)，本發(fā)明的含拮抗性抗-CD40抗體的穩(wěn)定的液體藥物組合物中也可包含糖或糖醇?？墒褂萌魏翁穷?，如單糖、二糖或多糖或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、葡聚糖、支鏈淀粉、糊精、環(huán)糊精、可溶性淀粉、羥乙基淀粉和羧甲基纖維素鈉。蔗糖是最優(yōu)選的糖添加劑。"糖醇"定義為具有羥基的C4-C8烴，包括例如，甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇(galacititol)、衛(wèi)矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇，甘露醇是最優(yōu)選的糖醇添加劑。上述糖或糖醇可單獨(dú)或組合使用。對于用量沒有固定限制，只要糖或糖醇在液體制品中可溶且對采用本發(fā)明方法獲得的穩(wěn)定效果沒有不良影響。優(yōu)選地，糖或糖醇的濃度在約1.0%和約15.0%(\￥~)之間，更優(yōu)選在約2.0%和約10.0%(\￥)之間。制備了上述液體藥物組合物之后可將其凍干以防降解。凍干液體組合物的方法是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的。使用前，組合物可用含有其它成分的無菌稀釋劑(例如林格溶液、蒸餾水或無菌鹽水)重建。重建后，組合物優(yōu)選用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法給藥。本發(fā)明的含拮抗性抗-CD40抗體的液體藥物組合物是穩(wěn)定的，因此與用含有氯化鈉作為等滲劑的緩沖溶液制備的拮抗性抗-CD40抗體組合物相比，儲存穩(wěn)定性提高。不受理論局限，認(rèn)為在液體制劑中觀察到了這種提高的儲存穩(wěn)定性，而無論以后來使用的形式直接儲存，以冷凍狀態(tài)儲藏并在使用之前解凍，或制備成干燥形式，如凍干的、空氣干燥的或噴霧干燥的形式，以便日后在使用前重建成液體形式或其他形式。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物以其液體形式直接儲存以充分利用液體形式儲存穩(wěn)定性提高的益處，無需重建從而便于給藥，以及能夠提供預(yù)裝填、隨時(shí)可用的注射劑或者作為多劑量制品，如果該制劑可與抑菌劑配伍。本發(fā)明的組合物涉及以下發(fā)現(xiàn)，即與用氯化鈉和相應(yīng)緩沖劑制備的含拮抗性抗-CD40抗體的液體藥物組合物相比，使用精氨酸-HCl作為等滲劑以及使用酸和它的鹽形式的混合物，如檸檬酸鈉/檸檬酸，作為緩沖劑能使含拮抗性抗-CD40抗體的液體藥物組合物的儲存穩(wěn)定性提高。組合物儲存穩(wěn)定性的這種提高是由于精氨酸的酸形式對治療活性拮抗性抗-C40抗體穩(wěn)定性的影響，更具體說是它對液體制劑儲存期間的多肽聚集、片段化和脫酰胺的影響所致。此外，將精氨酸-HCl作為等滲劑摻入用本文所述方式緩沖的拮抗性抗-CD40抗體液體組合物中能使該液體藥物組合物接近等滲而無需加入其他等滲劑，如氯化鈉。摻入本發(fā)明穩(wěn)定的液體藥物組合物中的精氨酸的酸形式能保護(hù)治療活性拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段免遭物理和化學(xué)改變，從而提高組合物儲存期間的抗體穩(wěn)定性。"提高穩(wěn)定性"是指與包含拮抗性抗-CD40抗體和相同制劑組分但不含這種特定等滲劑和穩(wěn)定劑的液體藥物組合物在儲存期間觀察到的相比，液體藥物組合物儲存期間抗體的聚集體形成、片段化和脫酰胺中的一種或多種情況有所降低。通過測量溶液中可溶性抗-CD40抗體隨時(shí)間的變化不難測定液體組合物儲存期間精氨酸-HCl對拮抗性抗-CD40抗體聚集的影響。溶液中可溶性抗-CD40抗體的量可通過適合檢測感興趣抗體的許多分析試驗(yàn)來量化。這種試驗(yàn)包括，例如，反相(RP)-HPLC、尺寸排阻(SEC)-HPLC和UV吸光度。聚集也可采用SDS-PAGE來監(jiān)測。也可參見下面的實(shí)施例。就聚集而言，要摻入含拮抗性抗-CD40抗體的液體藥物組合物以獲得本發(fā)明的穩(wěn)定藥物組合物的精氨酸-HCl的有效量是能降低隨時(shí)間形成的聚集體，從而在溶液中保留更多未聚集的、生物活性分子形式可溶性拮抗性抗-CD40抗體的用量。因此，例如，當(dāng)所述拮抗性抗-CD40抗體是下面實(shí)施例中所述的CHIR-12.12單克隆抗-CD40抗體時(shí)，用于制備本發(fā)明的穩(wěn)定組合物的精氨酸-HCl的有效量是使CHIR-12.12抗體更多地保持其單體分子形式的量。不受理論局限，本發(fā)明的含有拮抗性抗-CD40抗體的穩(wěn)定液體組合物的儲存穩(wěn)定性提高也可能與儲存期間精氨酸-HCl對抗體片段化和/或治療活性抗體內(nèi)谷氨酰胺和/或天冬酰胺殘基脫酰胺的抑制作用有關(guān)。精氨酸-HCl對抗體片段化的作用通過監(jiān)測制劑內(nèi)分子種類隨時(shí)間的改變不難確定，例如，使用SDS-PAGE和/或SEC-HPLC分析；見下文中的實(shí)施例。儲存期間，精氨酸-HCl對液體組合物中抗-CD40抗體多肽脫酰胺的作用通過監(jiān)測以其脫去酰氨基的形式存在的拮抗性抗-CD40抗體的量隨時(shí)間的改變不難確定。測量溶液相中存在的多肽的分子類型(即26天然的或脫去酰氨基的)的方法是本領(lǐng)域公知的。這種方法包括層析分離分子種類并采用多肽分子量標(biāo)準(zhǔn)品鑒定，如下文實(shí)施例所述的RP-HPLC或陽離子交換層析(CIEX-HPLC)。本發(fā)明的含拮抗性抗-CD40抗體的穩(wěn)定液體藥物組合物可含有其他化合物，這種化合物能提高作為治療活性組分的感興趣拮抗性抗-CD40抗體的功效或提高其所需特性，只要對精氨酸-HCl實(shí)現(xiàn)的基礎(chǔ)穩(wěn)定作用沒有不良影響。該組合物對于所選途徑給藥必需安全，必需無菌，且必需保留其所需治療活性。例如，可通過預(yù)混合穩(wěn)定劑和緩沖劑，以及任何其他賦形劑，之后摻入感興趣的拮抗性抗-CD40抗體來制備本發(fā)明的藥物組合物。可加入以進(jìn)一步穩(wěn)定本發(fā)明的組合物的任何其他賦形劑必需對基礎(chǔ)等滲劑和穩(wěn)定劑，即精氨酸-HCl的穩(wěn)定作用沒有不良影響，再將其與緩沖劑混合，以獲得本文所述的新組合物。加入精氨酸-HCl以使感興趣的拮抗性抗-CD40抗體接近等滲并提高穩(wěn)定性之后，可用緩沖劑調(diào)節(jié)該液體組合物的pH，優(yōu)選調(diào)至本文所述范圍內(nèi)，更優(yōu)選調(diào)至感興趣的拮抗性抗-CD40抗體的最佳pH，例如，對單克隆抗體CHIR-12.12而言，pH在約pH5.0禾卩pH7.0之間，優(yōu)選約pH5.5。盡管可在將拮抗性抗-CD40抗體加入組合物之后調(diào)節(jié)pH，但優(yōu)選在加入這種多肽之前調(diào)節(jié)，因?yàn)檫@樣可降低多肽變性的風(fēng)險(xiǎn)。然后采用合適的機(jī)械裝置來實(shí)現(xiàn)各組分的適當(dāng)混合。因此，本發(fā)明提供了一種提高液體藥物組合物中拮抗性抗-CD40抗體，或其抗原結(jié)合片段的穩(wěn)定性的方法。該方法包括將拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段與維持藥物組合物的pH在約pH5.0和pH7.0之間的緩沖劑以及用量足以使組合物接近等滲的精氨酸-HCl混合。在一些實(shí)施方式中，所述緩沖劑是檸檬酸鹽/檸檬酸緩沖劑，所述緩沖劑的濃度為約5mM至約50mM，精氨酸-HCl的用量能提供組合物中該等滲劑的濃度在約50mM至約300mM精氨酸-HCl之間。在其他實(shí)施方式中，所述拮抗性抗-CD40抗體是CHIR-12.12或CHIR-5.9抗體，或其抗原結(jié)合片段；所述緩沖劑為約5mM至約25mM的檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖劑；組合物中的精氨酸-HCl濃度為約150mM，且該組合物的pH為約5.0，約5.5，約6.0，或約6.5。包含感興趣的拮抗性抗-CD40抗體，例如，拮抗性抗-CD40抗體如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體，或其抗原結(jié)合片段的穩(wěn)定液體藥物組合物應(yīng)配制成單位劑量并且可以是可注射或可輸注形式，如溶液、懸浮液或乳劑。如上所述，可將其冷凍儲存或制成干燥形式，如凍干粉末，在通過各種方法給藥如口服或胃腸外給藥途徑之前將其重建成液體溶液、懸浮液或乳劑。優(yōu)選以液體制劑儲存，從而能利用按照上述本發(fā)明方法獲得的提高的儲存穩(wěn)定性。這種穩(wěn)定的藥物組合物優(yōu)選通過膜過濾滅菌并儲存在單位劑量或多劑量容器中，如密封的藥瓶或安瓿?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的配制藥物組合物的其他方法進(jìn)一步提高本文所述液體藥物組合物的儲存穩(wěn)定性，只要這些方法對上文所述的優(yōu)選穩(wěn)定劑和緩沖劑的有益效果沒有不良影響。制劑和選擇藥學(xué)上可接受的載體、穩(wěn)定劑等的詳盡討論見納入本文作為參考的Remington'sPharmaceuticalSciences(雷明頓藥物科學(xué))(第18版；賓西法尼亞州伊頓麥克出版公司，1990)。在這種方式中，本發(fā)明提供了一種制品，其中包含裝有本發(fā)明的含拮抗性抗-CD40抗體的穩(wěn)定液體藥物組合物的容器，并任選包含使用說明書。合適的容器包括，例如，小藥瓶、瓶子和注射器。該容器可用各種材料制成，如塑料或玻璃。在一個(gè)實(shí)施方式中，該容器是3-50cc的一次性玻璃藥瓶?；蛘撸瑢τ诹⒓纯捎玫闹苿?，該容器可以是，例如，3-100cc的玻璃藥瓶。該容器中裝有制劑并貼有標(biāo)簽，或附有使用說明。所述制品還可包含從商業(yè)或使用者角度看來所需的其他物質(zhì)，其中包括其他緩沖劑、稀釋劑、濾器、針頭、注射器以及使用說明書。本發(fā)明藥物組合物中的抗-CD40抗體本發(fā)明的藥物組合物包含抗-CD40抗體，尤其是拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段，其靶向CD40受體并調(diào)節(jié)ADCC，干擾CD40信號傳導(dǎo)，特別是由CD40和CD40配體(CD40L)相互作用介導(dǎo)的CD40信號傳導(dǎo)途徑，或這兩者。"CD40抗原"、"CD40細(xì)胞表面抗原"、"CD40受體"或"CD40"指屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體家族的跨膜糖蛋白(參見，例如美國專利號5,674,492和4,708,871;Stamenkovic等(1989)五MBO8:1403;Clark(1990)^""ge"s36:33;Barclay等(1997)7Te丄ewcoqyte爿W/ge"FacAs5ooy^^^艱貧^"手浙J(第二版；學(xué)術(shù)出版社，圣地亞哥))。已鑒定到該基因交替剪接轉(zhuǎn)錄變體編碼的人CD40的兩種同種型。第一種同種型(也稱為"長同種型"或"同種型1")表達(dá)為277個(gè)氨基酸的前體多肽(SEQIDNO:12(首次報(bào)道為GenBank登錄號CAA43045，在GenBank登錄號NP—001241中鑒定為同種型1)，由SEQIDNO:11(參見GenBank登錄號X60592和NMJ)01250)編碼)，其具有由前19個(gè)殘基代表的信號序列。第二種同種型(也稱為"短同種型"或"同種型2")表達(dá)為203個(gè)氨基酸的前體多肽(SEQIDNO:10(首次報(bào)道為GenBank登錄號NP_690593)，由SEQIDNO:9(GenBank登錄號NMJ52854)編碼)，其也具有由前19個(gè)殘基表示的信號序列。人CD40的這兩種同種型的前體多肽的前16528個(gè)殘基相同(即，SEQIDNO:10和SEQIDNO:12的殘基1-165)。短同種型的前體多肽(SEQIDNO:10所示)由缺乏編碼區(qū)段，導(dǎo)致翻譯讀框移位的轉(zhuǎn)錄物變體(SEQIDNO:9)編碼；與CD40長同種型所含有的(SEQIDNO:12的殘基166-277所示C-末端)相比，得到的CD40同種型含有較短且不同的C-末端(SEQIDNO:10的殘基166-203)。對于本發(fā)明的目的，術(shù)語"CD40抗原"、"CD40細(xì)胞表面抗原"、"CD40受體"或"CD40"包括CD40的短和長同種型。如本文別處所述，CD40抗原展示在各種類型細(xì)胞的表面。"展示于表面"和"表達(dá)于表面"指CD40抗原的全部或一部分暴露在細(xì)胞的外部。展示的或表達(dá)的CD40抗原可完全或部分糖基化。"激動活性"指作為激動劑的物質(zhì)功能。激動劑可結(jié)合細(xì)胞的受體，引起與該受體的天然配體所引起的類似或相同的反應(yīng)或活性。CD40激動劑可誘導(dǎo)但不限于以下所有應(yīng)答B(yǎng)細(xì)胞增殖和分化；抗體產(chǎn)生；胞間粘連；B細(xì)胞記憶產(chǎn)生；同種型轉(zhuǎn)換；上調(diào)II類MHC和CD80/60的細(xì)胞表面表達(dá)；分泌促炎性細(xì)胞因子如IL-8、IL-12和TNF等。"拮抗活性"指作為拮抗劑的物質(zhì)功能。CD40的拮抗劑可防止或降低通過CD40受體與激動劑配體，特別是CD40L結(jié)合所誘導(dǎo)的應(yīng)答。拮抗劑可使激動劑結(jié)合所誘導(dǎo)的一種或多種應(yīng)答降低5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、優(yōu)選40%、45%、50%、55%、60%、更優(yōu)選70%、80%、85%和最優(yōu)選90%、95%、99%或100%。檢測抗-CD40治療劑，例如抗-CD40抗體和CD40-配體結(jié)合特異性與拮抗活性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括但不限于標(biāo)準(zhǔn)的競爭性結(jié)合試驗(yàn)、監(jiān)測B細(xì)胞分泌免疫球蛋白的試驗(yàn)、B細(xì)胞增殖試驗(yàn)、Banchereau樣B細(xì)胞增殖試驗(yàn)、抗體產(chǎn)生的T細(xì)胞輔助試驗(yàn)、B細(xì)胞增殖的共同刺激試驗(yàn)和上調(diào)B細(xì)胞激活標(biāo)記的試驗(yàn)。參見，例如納入納入本文作為參考的WO00/75348和美國專利號6,087,329中公開的試驗(yàn)。也可參見，2003/11/4、2003/11/26和2004/4/27分別提交并給予美國專利申請?zhí)?0/517,337(代理人案巻號PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人案巻號PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人案巻號PP20107.003(035784/277214))的題為"J虛g畫'Wy4w"-CD￥0Mwoc/o"a/v4w幼WesMeAoA/or77zez>L^e(^貧性拔-CDW単克廣貧沐i某賴茲尸的臨時(shí)申請；以及2004/11/4提交并公布為WO2005/044854的同樣題為"J"togom、"油'-CZ)40M9"oc/owa/J""Z)od/esMef/zocfe7%e/rt/ser舒拔絲貧-CZ)W卓^一y^拔沐i^"^^法/'的國際專利申請?zhí)朠CT/US2004/037152(代理人案巻號PP20107.004(035784/282916));它們各自的內(nèi)容通過引用全文納入本文。"明顯的"激動活性指在B細(xì)胞應(yīng)答試驗(yàn)中所檢測的激動活性比天然物質(zhì)或陰性對照誘導(dǎo)的高至少30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。"明顯的"激動活性優(yōu)選在B細(xì)胞應(yīng)答試驗(yàn)中檢測到的激動活性比天然物質(zhì)或陰性對照誘導(dǎo)的高至少2倍或3倍。因此，例如當(dāng)感興趣的B細(xì)胞應(yīng)答是B細(xì)胞增殖時(shí)，"明顯的"激動活性指誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖水平比天然物質(zhì)或陰性對照誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖水平大至少2倍或3倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，不結(jié)合CD40的非特異性免疫球蛋白，例如IgGl作為陰性對照。"無明顯激動活性"的物質(zhì)顯示在B細(xì)胞應(yīng)答試驗(yàn)中檢測到的激動活性高出天然物質(zhì)或陰性對照誘導(dǎo)的激動活性不超過約25%，優(yōu)選不超過約20%、15%、10%、5%、1%、0.5%，或者甚至不超過約0.1%。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的穩(wěn)定液體藥物組合物包含拮抗性抗-CD40抗體。如上所述，當(dāng)這種抗體與人細(xì)胞上的CD40抗原結(jié)合時(shí)無明顯激動活性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述拮抗性抗-CD40抗體在一種細(xì)胞應(yīng)答中無明顯激動活性。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，所述拮抗性抗-CD40抗體在一種以上細(xì)胞應(yīng)答(例如，增殖和分化，或增殖、分化，以及對B細(xì)胞而言的抗體產(chǎn)生)試驗(yàn)中無明顯激動活性。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述拮抗性抗-CD40抗體是，例如，完整的人單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原結(jié)合片段，如下文所述。任何本領(lǐng)域已知試驗(yàn)可用來測定抗-CD40抗體是否能作為一種或多種B細(xì)胞應(yīng)答的拮抗劑。在一些實(shí)施方式中，所述抗-CD40抗體作為至少一種B細(xì)胞應(yīng)答的拮抗劑，所述應(yīng)答選自下組B細(xì)胞增殖，B細(xì)胞分化，抗體產(chǎn)生，胞間粘連，B細(xì)胞記憶產(chǎn)生，同種型轉(zhuǎn)換，上調(diào)II類MHC和CD80/60的細(xì)胞表面表達(dá)，以及分泌促炎性細(xì)胞因子如IL-8、IL-12和TNF。特別感興趣的是當(dāng)結(jié)合人B細(xì)胞表面的人CD40抗原時(shí)對B細(xì)胞增殖無明顯激動活性的拮抗性抗-CD40抗體。在一個(gè)這樣的實(shí)施方式中，如在例如下文實(shí)施例4中所述的B細(xì)胞增殖試驗(yàn)中所測得的，所述抗-CD40抗體是B細(xì)胞增殖的拮抗劑，且該拮抗性抗-CD40抗體刺激B細(xì)胞增殖的水平高出天然物質(zhì)或陰性對照誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖不超過約25%，優(yōu)選高出不超過約20%、15%、10%、5%、1%、0.5%，或者甚至高出不超過約0.1%。在其他實(shí)施方式中，如在下文實(shí)施例4中所述的B細(xì)胞增殖試驗(yàn)中所測得的，所述抗-CD40抗體是其他抗-CD40抗體，如S2C6抗-CD40抗體誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖的拮抗劑，且存在該拮抗性抗-CD40抗體時(shí)由其他抗-CD40抗體刺激的B細(xì)胞增殖的水平不超過不存在該拮抗性抗-CD40抗體時(shí)由其他抗-CD40抗體誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖的約25%(艮卩，至少75%抑制)，優(yōu)選不超過約20%，15%，10%，5%，1%，0.5%，或者甚至不超過約0.1%。再在其他實(shí)施方式中，如在下文實(shí)施例4中所述的B細(xì)胞活化試驗(yàn)中所測得的，所述抗-CD40抗體是細(xì)胞系EL4B5誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖的拮抗劑，且存在該拮抗性抗-CD40抗體時(shí)由EL4B5細(xì)胞系刺激的B細(xì)胞增殖的水平不超過不存在該拮抗性抗-CD40抗體時(shí)由該細(xì)胞系誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖的約25%(6卩，至少75%抑制)，優(yōu)選不超過約20%，15%，10%，5%，1%，0.5%,或者甚至不超過約0.1%。再在其他實(shí)施方式，如在下文實(shí)施例4中所述的B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的人輔助T細(xì)胞試驗(yàn)中所測得的，所述抗-CD40抗體是人T細(xì)胞誘導(dǎo)的人B細(xì)胞抗體產(chǎn)生的拮抗劑。在這種方式中，存在所述拮抗性抗-CD40抗體時(shí)由T細(xì)胞刺激的B細(xì)胞產(chǎn)生IgG抗體、產(chǎn)生IgM抗體、或者產(chǎn)生IgG和IgM兩者抗體的水平不超過不存在該拮抗性抗-CD40抗體時(shí)由T細(xì)胞刺激的B細(xì)胞產(chǎn)生各種抗體水平的約50%(即，至少75°/。抑制)，優(yōu)選不超過約25%，20%，15%，10%，5%，1%，0.5%，或者甚至不超過約0.1%。"CD40配體"表示可結(jié)合并活化一種或多種CD40信號傳導(dǎo)途徑的任何肽、多肽或蛋白質(zhì)。因此，"CD40配體"包括，但不限于，全長CD40配體蛋白以及保留了充足活性以在表達(dá)CD40的細(xì)胞上行使結(jié)合并刺激CD40信號傳導(dǎo)功能的它的變體和片段。對天然CD40配體，例如，人CD40配體(CD40L;也稱為CD154)的修飾包括，但不限于，取代、缺失、平截、延伸、融合蛋白、片段、肽模擬物，等等。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，評價(jià)拮抗性抗-CD40抗體生物活性的試驗(yàn)包括使用可溶性CD40L，例如，可溶性重組人CD40L(英國諾丁漢郡賓漢亞歷克西斯公司(AlexisCorporation,Bingham，Nottinghamshire,UK))來刺激表達(dá)CD40的細(xì)胞中的CD40信號傳導(dǎo)。"CD40L-介導(dǎo)的CD40信號傳導(dǎo)"是指細(xì)胞表面受體CD40和CD40配體相互作用導(dǎo)致的任何生物活性。CD40信號傳導(dǎo)的例子是導(dǎo)致表達(dá)CD40的細(xì)胞增殖和存活，以及刺激表達(dá)CD40的細(xì)胞內(nèi)的一種或多種CD40-信號傳導(dǎo)途徑的信號。CD40"信號傳導(dǎo)途徑"或"信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑"用來表示CD40受體和CD40配體，例如CD40L，相互作用所導(dǎo)致并生成信號的至少一種生化反應(yīng)，或一組生化反應(yīng)，當(dāng)該信號通過信號途徑傳遞時(shí)導(dǎo)致信號傳導(dǎo)級聯(lián)中一個(gè)或多個(gè)下游分子的活化。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑涉及多個(gè)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，該分子導(dǎo)致信號從細(xì)胞表面CD40受體傳遞通過細(xì)胞脂膜，并通過一系列信號傳導(dǎo)分子中的一個(gè)或多個(gè)，通過細(xì)胞胞質(zhì)，且在某些情況下還進(jìn)入細(xì)胞核。CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括，例如，AKT信號傳導(dǎo)途徑，其導(dǎo)致AKT活化，并最終經(jīng)NF-KB信號傳導(dǎo)途徑激活NF-KB;和促分裂原-活化的蛋白激酶(MAPK)信號傳導(dǎo)途徑，包括MEK/ERK信號傳導(dǎo)途徑和MEK/p38信號傳導(dǎo)途徑，其分別導(dǎo)致ERK和p38活化。這些信號傳導(dǎo)途徑的激活和阻斷之間的平衡有利于細(xì)胞存活或凋亡。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的穩(wěn)定藥物組合物包含阻斷CD40L-介導(dǎo)的CD40信號傳導(dǎo)的拮抗性抗-CD40抗體。拮抗性抗-CD40抗體在阻斷CD40L-介導(dǎo)的CD40信號傳導(dǎo)中的作用的更加詳細(xì)描述可參見，例如，2003/11/4、2003/11/26和2004/4/27分別提交并給予美國專利申請?zhí)柕?0/517,337(代理人案巻號PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人案巻號PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人案巻號PP20107.003(035784/277214))的題為J油'-CD40Mcwoc/cwa/^油力ocfeyam/M"/zo(is1ybr7Tze/rt7^襟貧絲界CD40卓克廣貧體及真^法/，的臨時(shí)申請，以及2004/11/4提交并公布為WO2005/044854的同樣題為"v4幽gom's"w"-CZ)卯Mo"oc/o"a/y4油'6oofey朋d77zez>t/s"哲貧絲貧-CZ)W卓J^廣貧體i^"^法/，的國際專利申請?zhí)朠CT/US2004/037152(代理人案巻號PP20107.004(035784/282916));它們各自的內(nèi)容通過引用全文納入本文。也ty0)^^^^'"^珍銜//7洽#0)40,號傳導(dǎo)分導(dǎo)游潛全性疾諒游方法尸的臨時(shí)申請，該申請于2005/12/9提交并給予美國專利申請?zhí)?0/749,285(代理人案巻號PP028035.0002(035784/304312))，以及2006/5/18提交并公布為WO2006/125143的相應(yīng)的國際專利申請?zhí)朠CT/US2006/019414(代理人案巻號PP028035.0003(035784/311611));禾口題為"A/e決ody/brZ)/ag"cw'517>ea^7e"fo/ZXsecwesi/aW"ga"^Mto/附mw"eo"d/or/"y7awwator_yCom/o"e"f(i參斷禾口治療具有^身_^度/^口/或炎性成分的疾病的方法)"的臨時(shí)申請，該申請于2005/12/9提交并給予美國專利申請?zhí)?0/749,336(代理人案巻號PP028062.0002(035784/304311))，以及2006/5/18提交并公布為WO2006/125117的相應(yīng)的國際專利申請?zhí)朠CT/US2006/019325(代理人案巻號PP028062.0003(035784/311608));它們各自的內(nèi)容通過引用全文納入本文。本發(fā)明的穩(wěn)定液體藥物組合物包含抗-CD40抗體，尤其是拮抗性抗-CD40抗體和/或其抗原結(jié)合片段。以下術(shù)語和定義適用于這種抗體。"抗體"和"免疫球蛋白"(Ig)是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。使用這兩個(gè)術(shù)32語時(shí)意義相同。一些情況下，免疫球蛋白的抗原特異性是已知的。術(shù)語"抗體"以最廣泛含義使用，包括完整裝配的抗體、能夠結(jié)合抗原的抗體片段(例如，F(xiàn)ab，F(xiàn)(ab')2，F(xiàn)v，單鏈抗體，雙特異抗體，抗體嵌合體，雜交抗體，雙特異性抗體，人源化抗體，等等)、以及包含以上物質(zhì)的重組肽。本文使用的術(shù)語"單克隆抗體"和"mAb"指得自基本上均質(zhì)的抗體群的抗體，即除了可能存在極少量天然發(fā)生的突變以外，構(gòu)成該群的每個(gè)抗體是相同的。"天然抗體"和"天然免疫球蛋白"通常是由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)組成的約150,000道爾頓的異四聚糖蛋白。每條輕鏈經(jīng)共價(jià)二硫鍵與重鏈相連，而二硫鍵的數(shù)目視不同免疫球蛋白同種型的重鏈而不同。每條重鏈和輕鏈也具有律則隔開的鏈內(nèi)二硫橋。每條重鏈的一端為可變區(qū)(VH)，其后是多個(gè)恒定區(qū)。每條輕鏈的一端為可變區(qū)(VL)，在另一端為恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一恒定區(qū)配對，輕鏈可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)配對。據(jù)信，特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變區(qū)之間形成相互作用界面。術(shù)語"可變"表示以下內(nèi)容在抗體之間，可變區(qū)的某些部分在序列上差別很大?？勺儏^(qū)賦予抗原結(jié)合特異性。然而，可變性不是均勻分布于整個(gè)抗體可變區(qū)中。它集中于位于輕鏈或重鏈可變區(qū)中稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或超變區(qū)的3個(gè)區(qū)段。可變區(qū)的較保守部分稱為框架(FR)區(qū)。天然輕鏈和重鏈的可變區(qū)各包含主要采取卩-片層構(gòu)型并通過3個(gè)CDR相連的4個(gè)FR區(qū)，CDR形成(有時(shí)形成部分)連接P-片層結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的CDR通過FR區(qū)緊密相聚，并且與另一條鏈的CDR緊靠在一起形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見，Kabat等(1991)7Vffl^wW.91-3242，第I巻，647-669頁)。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但顯示各種效應(yīng)器功能，例如Fc受體(FcR)結(jié)合、抗體參與依賴于抗體的細(xì)胞毒性、啟動依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性和肥大細(xì)胞脫顆粒。本文使用的術(shù)語"超變區(qū)"指負(fù)責(zé)結(jié)合抗原的抗體氨基酸殘基。超變區(qū)包括"互補(bǔ)決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(即，輕鏈可變區(qū)的殘基24-34(Ll)、50-56(L2)禾口89-97(L3)和重鏈可變區(qū)的殘基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3);Kabat等(1991)S^wewc"o/prafe/m0/7附附""0/0《/<^//"化^5《免;^^#"^￥邀游歪^^:^^^/必(第5版，馬里蘭州貝薩達(dá)國立衛(wèi)生研究院公眾健康服務(wù)部(PublicHealthService,NationalInstituteofHealth,Bethesda，MD))和/或"超變環(huán)"的氨基酸殘基(即，輕鏈可變區(qū)的殘基26-32(Ll)、50-52(L2)和91-96(L3)和重鏈可變區(qū)的殘基26-32(Hl)、53-55(H2)和96-101(H3);Clothia和Lesk，(1987)/編.編.196:901-917)。"框架"或"FR"殘基是除超變區(qū)殘基以外的可變區(qū)殘基。"抗體片段"包括完整抗體的一部分，優(yōu)選完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的例子包括Fab、Fab、F(ab')2和Fv片段；雙特異抗體；線性抗體(Zapata等(1995)8(10):1057-1062);單鏈抗體分子和由抗體片段形成的多特異性(multispecific)抗體。木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)稱為"Fab"片段的相同抗原結(jié)合片段(各具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn))與一殘留的"Fc"片段(其名字反映它易于結(jié)晶)。胃蛋白酶處理得到具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的F(ab')2片段，該片段仍能交聯(lián)抗原。"Fv"是含有完整的抗原識別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。該區(qū)由緊密地非共價(jià)締合的一條重鏈可變區(qū)和一條輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。每個(gè)可變區(qū)的3個(gè)CDR正是以這種構(gòu)型相互作用而確定了Vh-Vl二聚體表面上的抗原結(jié)合位點(diǎn)。6個(gè)CDR共同賦予了該抗體的抗原結(jié)合特異性。然而，即使一個(gè)可變區(qū)(或僅含有3個(gè)抗原特異性CDR的半個(gè)Fv)也能識別并結(jié)合抗原，雖然親和力低于完整的結(jié)合位點(diǎn)。Fab片段也含有輕鏈恒定區(qū)和重鏈第一恒定區(qū)(CHl)。Fab片段因在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端多幾個(gè)殘基(包括抗體絞鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基)而不同于Fab，片段。本文稱為Fab'-SH的是其恒定區(qū)半胱氨酸殘基帶有一個(gè)游離巰基的Fab'。通過還原F(ab')2片段的重鏈二硫鍵產(chǎn)生Fab'片段?？贵w片段的其它化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)也是已知的。任何脊椎動物種類的抗體(免疫球蛋白)的"輕鏈"可分為兩種明顯不同的類型，該兩種類型根據(jù)它們恒定區(qū)的氨基酸序列稱為k和X。免疫球蛋白可依它們重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列分為不同類型。人免疫球蛋白主要有5類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中幾類可進(jìn)一步分成亞類(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。對應(yīng)于不同類免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域分別稱為a、S、e、Y和p。不同類免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是熟知的。不同的同種型具有不同的效應(yīng)器功能。例如，人IgGl和IgG3同種型具有ADCC(依賴于抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)活性。本文所用的"標(biāo)記"指直接或間接與抗體偶聯(lián)而產(chǎn)生"標(biāo)記"抗體的可檢測化合物或組合物。標(biāo)記本身可檢測(例如，放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記)，或者就酶標(biāo)記而言，可催化可檢測的底物化合物或組合物的化學(xué)轉(zhuǎn)變。本文所用的術(shù)語"宿主細(xì)胞"指以單核實(shí)體培養(yǎng)的微生物或真核細(xì)胞或細(xì)胞系，它們可以或已用作重組載體或其它轉(zhuǎn)移多核苷酸的受者，并且包括受轉(zhuǎn)染原始細(xì)胞的后代。應(yīng)理解，由于天然的、偶發(fā)的或設(shè)計(jì)的突變，一個(gè)細(xì)胞的后代在形態(tài)或基因組或總DNA互補(bǔ)性上無需和原始親代完全相同。"人效應(yīng)細(xì)胞"是表達(dá)一種或多種FcR并行使效應(yīng)器功能的白細(xì)胞。這些細(xì)胞優(yōu)選至少表達(dá)FcYRII并行使依賴抗原的細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性(ADCC)效應(yīng)器功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單核的細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。具有ADCC活性的抗體通常是IgGl或lgG3同種型。應(yīng)注意，除了分離IgGl和IgG3抗體以外，這種ADCC介導(dǎo)性抗體可通過將非ADCC抗體的可變區(qū)或可變區(qū)片段工程改造為IgGl或IgG3同種型的恒定區(qū)來制備。術(shù)語"Fc受體"或"FcR"用于描述能結(jié)合抗體Fc區(qū)域的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列的人FcR。此外，優(yōu)選的FcR可結(jié)合IgG抗體(y受體)，包括FcyRI、FcYRII和FcYRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體或者交替剪接形式。FcYRII受體包括具有相似氨基酸序列(主要在于胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域不同)的FcYlIA("活化性受體")和FqIIB("抑制性受體")?；罨允荏wFcYRIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制性受體FcyRIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見Daeron(1997)」"肌./mmw"o/.15:203隱234)。FcR綜述見Ravetch和Kinet(1991)爿""w.iev./www"o/.9:457-492(1991);Capel等(1994)/mmw"om"/zocfr4:25-34和deHaas等(1995),丄a6.C//".126:330-341。本文的術(shù)語"FcR"包括其它FcR，包括將來鑒定到的FcR。該術(shù)語也包括將母體IgG轉(zhuǎn)移至胎兒的新生受體，F(xiàn)cRn(Guyer等(1976)//mmw"o/.117:587和Kim等(1994)//mm騰/.24:249(1994))。制備人抗體的方法有很多。例如，可用Epstein-Barr病毒(EBV)感染使分泌細(xì)胞無限增殖。然而，EBV-感染的細(xì)胞難于克隆并且得到的免疫球蛋白產(chǎn)量通常較低(James和Bell(1987)J/m附w"o/.Me溈o^100:5-40)。將來，可能通過引入轉(zhuǎn)化基因的有限組合來實(shí)現(xiàn)人B細(xì)胞的無限增殖。近來的發(fā)現(xiàn)增加了這種可能性，即端粒酶催化性亞基連同H-ras的SV40大癌蛋白和H-ras癌等位基因一起表達(dá)可導(dǎo)致正常人上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的致癌性轉(zhuǎn)變(Hahn等(1999)A^m400:464-468)。現(xiàn)在已可能制備經(jīng)過免疫后能產(chǎn)生全套人抗體而不產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動物(例如，小鼠)(Jakobovits等(1993)Nature362:255-258;Lonberg和Huszar(1995)/"A/evJ附ww"o/.13:65-93;Fishwild等(19%)A^,.5/oecA"o/.14:845-851;Mendez等(1997)A^f.Ge"".15:146-156;Green(1999)J/mmw"o/.M"/wA231:11-23;Tomizuka等(2000)PracJVw/Jcflc/.S"'.USA97:722-727;綜述見Little等(2000)/mmw朋/.7b^y21:364-370)。例如，嵌合型和種系突變小鼠的抗體重鏈連接區(qū)(jh)基因的純合消除可完全抑制內(nèi)源性抗體的產(chǎn)生己見描述(Jakobovits等(1993)尸rac.Ato/Jcac^c/.USA90:2551-2555)。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移入這種種系突變小鼠可制備轉(zhuǎn)基因小鼠品系(Jakobovits等(1993)A^we362:255-258)。Mendez等(1997)(Atowre15:146-156)，當(dāng)用抗原攻擊后可產(chǎn)生高親和力完全人抗體。這可通過將兆堿基的人重鏈和輕鏈基因座通過種系整合入刪除了上述內(nèi)源性jh區(qū)段的小鼠來實(shí)現(xiàn)。這些小鼠(XenoMouse②II技術(shù)(抗體基因公司(Abgenix);弗里蒙特(Fremont)，加州(California)))具有1,020kb的人重鏈基因座和800kb的人k基因座，其中人重鏈基因座含有約66個(gè)Vh基因、完全的Dh和Jh區(qū)域，以及3個(gè)不同的恒定區(qū)，人k基因座含有32個(gè)Vk基因、Jk片段和Ck基因。這些小鼠中產(chǎn)生的抗體在各方面，包括基因重排、裝配和所有成分極其類似于在人中觀察到的抗體。由于刪除了內(nèi)源性片段從而防止了鼠基因座中基因重排，優(yōu)先表達(dá)此種人抗體而不是內(nèi)源性抗體。這種小鼠可用特別感興趣的抗原免疫。可篩選這種免疫動物血清對原先(接種)抗原的抗體反應(yīng)性?？蓮牧馨徒Y(jié)或脾細(xì)胞分離淋巴細(xì)胞，可進(jìn)一步選擇淋巴細(xì)胞中的CD138-陰性和CD19-陽性細(xì)胞來選擇B細(xì)胞。一方面，可將這種B細(xì)胞培養(yǎng)物(BCC)與骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生上述雜交瘤。在另一方面，宜進(jìn)一步篩選這種B細(xì)胞培養(yǎng)物對原先(接種)抗原的反應(yīng)性。這種篩選包括采用靶/抗原蛋白質(zhì)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，用能與感興趣抗原結(jié)合和與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)該耙抗原的CHO或其它細(xì)胞體外結(jié)合的已知抗體的競爭性試驗(yàn)。CD40的單克隆抗體是本領(lǐng)域已知的。參見，例如以下文獻(xiàn)中有關(guān)B-細(xì)胞抗原的章節(jié)，McMichael編，(1987;1989)LeukocyteTypingIIIandIV(白細(xì)胞分型III和IV)(牛津大學(xué)出版社，紐約)；美國專利號5,674,492;5,874,082;5,677,165;6,056,959;WO00/63395;國際公布號WO02/28905和WO02/28904;Gordon等(1988)J7mww"o/.140:1425;Valle等(1989)五w^7/mmw"o/.19:1463;Clark等(1986)iWJS83:4494;Paulie等(1989)//mmw"o/.142:590;Gordon等(1987)/mm""o/17:1535;Jabara等(1990)J^c/.^fed.172:1861;Zhang等(1991)■//mmw"o/.146:1836;Gascon等(1991)J/mm""o/.147:8;Banchereau等(1991)a/w,/mmwwo/,S;ec^wW3:8;禾口Banchereau等(1991)Scz'ewce251:70;所有文獻(xiàn)纟內(nèi)入本文作為參考。其他抗-CD40單克隆抗體包括，但不限于，人源化抗-CD40抗體，如SGN-40(Tai等(2004)64:2846-52;美國專利號6,838,261)，它是鼠抗-CD40抗體SGN-14的人源化形式(Francisco等(2000)C""cer60:3225-31)，以及美國專利申請公布號2004/0120948中所述的激動性和拮抗性抗體；通過引用全文納入本文。本發(fā)明特別感興趣的是用來阻斷CD40L-介導(dǎo)的CD40信號傳導(dǎo)的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段，它也可調(diào)節(jié)ADCC，如例如下文所述的CHIR-12.12抗體所做的那樣。用于本發(fā)明的穩(wěn)定液體藥物組合物中的拮抗性抗-CD40抗體包括能特異性結(jié)合人細(xì)胞表面表達(dá)的人CD40抗原的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。在一些實(shí)施方式中，所述穩(wěn)定的液體藥物組合物內(nèi)的拮抗性抗-CD40抗體對CD40細(xì)胞表面抗原顯示出強(qiáng)烈的單一位點(diǎn)結(jié)合親和力。采用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)，例如BiacoreTM測定這種單克隆抗體對CD40的解離平衡常數(shù)(KD)顯示為至少1(T5M、至少3X1(T5M、優(yōu)選至少10^M至10^M、更優(yōu)選至少10—SM至約10^M。Biacore分析是本領(lǐng)域已知的，其細(xì)節(jié)見"BIAapplicationshandbook"(BIA應(yīng)用手冊)。WO01/27160所述的方法用于調(diào)節(jié)結(jié)合親和力。特別感興趣的是當(dāng)結(jié)合人細(xì)胞上的CD40抗原時(shí)，尤其是當(dāng)結(jié)合腫瘤性人B細(xì)胞上的CD40抗原時(shí)，如上文所定義無明顯激動活性但顯示出拮抗活性的拮抗性抗-CD40抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述拮抗性抗-CD40抗體在一種B細(xì)胞應(yīng)答中無明顯激動活性。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，所述拮抗性抗-CD40抗體在一種以上B細(xì)胞應(yīng)答(例如，增殖和分化，或者增殖，分化，和抗體產(chǎn)生)試驗(yàn)中無明顯激動活性。合適的單克隆抗-CD40抗體具有人恒定區(qū)；優(yōu)選它們還具有完整的或部分人源化框架區(qū)；和最優(yōu)選是完整的人抗體或其抗原結(jié)合片段。這種單克隆抗體的例子是本文稱為CHIR-5,9和CHIR-12.12的抗體。因此，在一些實(shí)施方式中，存在于本發(fā)明的穩(wěn)定液體藥物組合物中的拮抗性抗-CD40抗體是單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12。所述CHIR-5.9和CHIR-12.12抗體是雜交瘤細(xì)胞系131.2F8.5.9(本文稱為細(xì)胞系5.9)和153.8E2.D10.D6.12.12(本文稱為細(xì)胞系12.12)產(chǎn)生的IgG,同種型完全人抗-CD40單克隆抗體。采用含有人IgG,重鏈基因座和人K鏈基因座的免疫的異種小鼠(XenoMouse⑧II技術(shù)；抗體基因公司；弗里蒙特，力Q州)的脾細(xì)胞產(chǎn)生這些細(xì)胞系。使脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞(謝拉生物源公司(SierraBioSource))融合。將得到的雜交瘤亞克隆數(shù)次得到穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞系5.9和12.12。本發(fā)明的其它抗體可用含有人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠或通過本領(lǐng)域已知和/或本文所述的其它方法類似地制備。本文公開了CHIR-12.12抗體可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列，以及CHIR-5.9抗體可變區(qū)的氨基酸序列。更具體地說，mAbCHIR-12.12輕鏈和重鏈前導(dǎo)區(qū)、可變fx:和恒定區(qū)的氨基酸序列示于SEQIDNO:2(mAbCHIR-12.12輕鏈的完整序列)，SEQIDNO:4(mAbCHIR-12.12重鏈的完整序列)，和SEQIDNO:5(SEQIDNO:4所示mAbCHIR-12.12重鏈的變體的完整序列，其中所述變體用絲氨酸取代了SEQIDNO:4第153位殘基上的丙氨酸)。mAbCHIR-12.12輕鏈和重鏈的編碼核訐酸序列示于SEQIDNO:l(mAbCHIR-12.12輕鏈的編碼序列)和SEQIDNO:3(mAbCHIR-12.12重鏈的編碼序列)。CHIR-5.9mAb輕鏈和重鏈的前導(dǎo)區(qū)、可變區(qū)和恒定區(qū)的氨基酸序列示于SEQIDNO:6(mAbCHIR-5.9輕鏈的完整序列)，SEQIDNO:7(mAbCHIR-5.9重鏈的完整序列)，和SEQIDNO:8(SEQIDNO:7所示mAbCHIR-5.9重鏈的變體的完整序列，其中所述變體用絲氨酸取代了SEQIDNO:7第158位殘基上的丙氨酸)。再者，表達(dá)CHIR-5.9抗體的雜交瘤(小鼠雜交瘤系131.2FS.5.9(CMCC弁12047)和表達(dá)CHIR-12.12抗體的雜交瘤(小鼠雜交瘤系153.8E2.D10.D6.12.12(CMCC弁12056)于2003/9/17由ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心；10801大學(xué)大道，馬納斯，弗吉尼亞20110-2209(美國))保藏，專利保藏編號分別為PTA-5542和PTA-5543。除了拮抗活性，用于本發(fā)明的穩(wěn)定液體藥物組合物的抗-CD40抗體可具有抵抗腫瘤細(xì)胞的其他作用機(jī)制。例如，天然CHIR-5.9和CHIR-12.12抗體具有ADCC活性?；蛘?，CHIR-5.9和CHIR-12.12抗體的可變區(qū)可表達(dá)具有ADCC活性的其他抗體同種型。還可以將CHIR-5.9或CHIR-12.12的天然形式、重組形式或抗原結(jié)合片段與細(xì)胞毒素、治療劑或者放射性金屬離子或放射性同位素偶聯(lián)，如下文所述。在ELISA類型的試驗(yàn)中，通過流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)測定，CHIR-5.9和CHIR-12.12單克隆抗體結(jié)合可溶性CD40，防止CD40-配體與細(xì)胞表面CD40結(jié)合，并替代了之前結(jié)合的CD40-配體。抗體CHIR-5.9和CHIR-12.12相互競爭結(jié)合CD40，但不與2000/10/2提交的題為"Z/wmfl"J油'-CZ)Wv4w必otfe^乂^"-0)W拔鉤"的美國臨時(shí)申請序列號60/237,556以及2001/10/2提交的同樣題為"Fwwa"^""-CDW^"^oafe^乂拔-CZ)卯貧鄰"的PCT國際申請?zhí)朠CT/US01/30857(代理人案巻號PP16092.003)中所述的抗-CD40單克隆抗體15B8競爭，這兩個(gè)申請通過引用全文納入本文。當(dāng)在體外檢測對來自正常人對象的B細(xì)胞增殖的作用時(shí)，CHIR-5.9和CHIR-12.12作為拮抗性抗-CD40抗體。此外，CHIR-5.9和CHIR-12.12不誘導(dǎo)來自正常人對象的人淋巴細(xì)胞強(qiáng)烈增殖。這些抗體能夠通過依賴于抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)殺死表達(dá)CD40的靶細(xì)胞。通過BiacoreTM試驗(yàn)測得，CHIR-5.9對人CD40的結(jié)合親和力為1.2xl(T8M，對CHIR-12.12的結(jié)合親和力為5xlCr1QM。具有與上述單克隆抗體CHIR-5.9和CHIR-12.12相同結(jié)合特性的其他拮抗性抗《040抗體包括，但不限于以下抗體(1)由稱為131.2F8.5.9(文中稱為細(xì)胞系5.9)和153.8E2.D10.D6.12.12(文中稱為細(xì)胞系12.12)的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體，所述兩種細(xì)胞系由ATCC分別以專利保藏編號PTA-5542和專利保藏編號PTA-5543保藏；(2)包含選自下組的氨基酸序列的單克隆抗體SEQIDNO:2所示序歹U,SEQIDNO:4所示序列，SEQIDNO:5所示序列，SEQIDNO:2和SEQIDNO:4二者所示的序列，以及SEQIDNO:2和SEQIDNO:5二者所示的序列；(3)包含選自下組的氨基酸序列的單克隆抗體SEQIDNO:6所示序列，SEQIDNO:7所示序列，SEQIDNO:8所示序列，SEQIDNO:6和SEQIDNO:7二者所示的序列，以及SEQIDNO:6和SEQIDNO:8二者所示的序列；(4)具有由包含選自下組的核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體SEQIDNO:l所示核苷酸序列，SEQIDNO:3所示核苷酸序列，以及SEQIDNO:l和SEQIDNO:3二者所示的核苷酸序列；(5)與能夠結(jié)合雜交瘤細(xì)胞系5.9或雜交瘤細(xì)胞系12.12產(chǎn)生的單克隆抗體的表位結(jié)合的單克隆抗體；(6)與包含SEQIDNO:10或SEQIDNO:12所示氨基酸序列的殘基82-87的表位結(jié)合的單克隆抗體；(7)在競爭性結(jié)合試驗(yàn)中與單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；和(8)作為CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或者上述項(xiàng)目(l)-(7)中所述單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結(jié)合人CD40抗原的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，本文所述的抗體以及這些抗體的抗原結(jié)合片段包括采用本領(lǐng)域熟知和下文描述的方法重組產(chǎn)生的抗體及其抗原結(jié)合片段，包括，例如，重組產(chǎn)生的單克隆抗體CHIR-5.9和CHIR-12.12。其他拮抗性抗-CD40抗體包括稱為5D12、3A8和3C6的單克隆抗體，它們分別由ATCC登錄號為HB11339、HB12024和HB11340的雜交瘤分泌。參見，例如，美國專利號6,315,998，通過引用全文納入本文。其他拮抗性抗-CD40抗體是本領(lǐng)域已知。參見，例如，由通過引用全文納入本文的美國專利申請公布號20020142358和20030059427中披露的稱為F4-465的雜交瘤制造的人抗-CD40抗體。F4-465獲自HAC小鼠(Kuroiwa等(2000)Atowe10:1086(2000))并因此而表達(dá)人X輕鏈。本發(fā)明藥物組合物中抗體的產(chǎn)生可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何抗體產(chǎn)生方法制備用于本發(fā)明藥物組合物中的抗體，例如，本文披露的拮抗性抗-CD40抗體。因此，可通過常規(guī)方法制備多克隆血清。通常先用含感興趣的抗原，即CD40抗原的溶液免疫合適的動物，優(yōu)選小鼠、大鼠、家兔或山羊。由于可獲得大量血清同時(shí)有標(biāo)記的抗-家兔和抗-山羊抗體可用，優(yōu)選用家兔和山羊制備多克隆血清。可在轉(zhuǎn)基因動物，優(yōu)選攜帶人免疫球蛋白基因座的小鼠中制備多克隆血清。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)，例如CD40，的SF9細(xì)胞用作免疫原。也可用鹽水，優(yōu)選佐劑，例如完全弗氏佐劑混合或乳化含有抗原的溶液，經(jīng)胃腸外(通常是皮下或肌肉內(nèi))注射該混合物或乳劑來免疫。每次注射50-200)ig的劑量一般足夠。通常在2-6周后注射用鹽水，優(yōu)選用不完全弗氏佐劑配制的蛋白質(zhì)加強(qiáng)免疫一次或多次?；蛘呖捎帽绢I(lǐng)域已知的方法通過體外免疫產(chǎn)生抗體，就本發(fā)明目的而言體外與體內(nèi)免疫等效。將免疫動物的血液放入玻璃或塑料容器，25。C孵育該血液1小時(shí)，然后4。C孵育2-18小時(shí)獲得多克隆抗血清。離心(例如，l，OOOXg10分鐘)回收血清。每次放血可自家兔獲得約20-50ml血清。Sf9(草地夜蛾0S^otfc^era/rag^e^/a))細(xì)胞的制備方法見納入本文作為參考的美國專利號6,004,552中所述。對于CD40，簡言之，將編碼人CD40的序列用轉(zhuǎn)移載體重組入桿狀病毒。將質(zhì)粒與野生型桿狀病毒DNA共同轉(zhuǎn)染入Sf9細(xì)胞。鑒定重組桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞并克隆純化。優(yōu)選的抗體在性質(zhì)上是單克隆抗體。"單克隆抗體"指得自基本上均質(zhì)抗體群的抗體，即除了存在極少量天然發(fā)生的突變以外，組成該群的每個(gè)抗體相同。該術(shù)語不受限于抗體的種類或來源。該術(shù)語包括完整的免疫球蛋白及其片段，例如Fab、F(ab')2、Fv和保留了抗體的抗原結(jié)合功能的其它片段。單克隆抗體是高度特異性的，針對一個(gè)的抗原性位點(diǎn)；例如，對于抗-CD40抗體是CD40細(xì)胞表面抗原。此外，與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制劑相反，每種單克隆抗體針對抗原上一個(gè)決定簇。修飾詞"單克隆的"表示得自基本上均質(zhì)的抗體群的抗體特性，不可理解為需要通過任何具體方法產(chǎn)生該抗體。例如，本發(fā)明所用的單克隆抗體可通過Kohler等(1975)A^加"256:495首次描述的雜交瘤方法或重組DNA方法制備(參見，例如美國專利號4,816,567)。"單克隆抗體"也可用，例如Clackson等(1991)A^we352:624-628;Marks等(1991)JMo/.B/o/.222:581-597;和美國專利號5,514,548中所述技術(shù)從噬菌體抗體文庫分離得到。"表位"指抗原性分子中能產(chǎn)生抗體并結(jié)合該抗體的那一部分。表位可含有線性氨基酸殘基(即，表位內(nèi)的殘基以線性方式一個(gè)接一個(gè)順序排列)，非線性氨基酸殘基(本文稱為"非線性表位"；這些表位非順序排列)或線性與非線性氨基酸殘基?？墒褂肒ohler等(1975)Atoww256:495-496所述方法或其改進(jìn)形式制備單克隆抗體。通常用含抗原的溶液免疫小鼠?？捎名}水，優(yōu)選佐劑，例如完全弗氏佐劑混合或乳化含有抗原的溶液，經(jīng)胃腸外注射混合物或乳劑來免疫?？捎帽绢I(lǐng)域已知的任何免疫方法來獲得本發(fā)明的單克隆抗體。免疫動物后，取出脾臟(任選取出幾個(gè)大的淋巴結(jié))解離成為單個(gè)細(xì)胞。使細(xì)胞混懸液涂布于包被有感興趣抗原的板或孔來篩選脾細(xì)胞。表達(dá)抗原特異性膜結(jié)合免疫球蛋白的B細(xì)胞與板結(jié)合而不被洗掉。然后誘導(dǎo)得到的B細(xì)胞或所有分離的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤，用選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。通過連續(xù)稀釋接種得到的細(xì)胞并測定能特異性結(jié)合感興趣抗原(但不結(jié)合無關(guān)抗原)的抗體產(chǎn)生。然后將分泌單克隆抗體(mAb)的選出的雜交瘤在體外(例如，在組織培養(yǎng)瓶或中空纖維反應(yīng)器中)或體內(nèi)(作為小鼠的腹水)培養(yǎng)。當(dāng)用重組DNA方法制備拮抗性抗-CD40抗體時(shí)，使用常規(guī)方法(例如，用能特異性結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)不難分離并測序編碼單克隆抗體的DNA。本文所述的雜交瘤細(xì)胞是這種DNA的優(yōu)選來源。一旦分離后，可將此DNA置于表達(dá)載體中，然后將載體轉(zhuǎn)染入本身不產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌、猿COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞中從而獲得在該重組宿主細(xì)胞中合成的單克隆抗體。在細(xì)菌中重組表達(dá)編碼抗體的DNA的綜述包括Skerra等(1993)CwrO//"/ow7mmw"o/.5:256禾口Phickthun(1992)/mm""o/.iew.130:151?；蛘撸缂{入本文作為參考的美國專利號5,545,403;5,545,405和5,998,144中所公開的，可在細(xì)胞系，例如CHO細(xì)胞系中制備抗體。簡言之，用能表達(dá)輕鏈和重鏈的載體分別轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系。嵌合抗體可通過轉(zhuǎn)染不同載體上的兩種蛋白質(zhì)來制備。另一優(yōu)點(diǎn)是該抗體正確糖基化。在一些實(shí)施方案中，用GS基因表達(dá)系統(tǒng)(新罕布什爾州樸茨茅斯隆薩生物技術(shù)公司(LonzaBiologies,Portsmouth,NewHampshire))在CHO細(xì)胞中制備拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9抗體或其抗原結(jié)合片段，所述表達(dá)系統(tǒng)使用谷氨酰胺合成酶作為標(biāo)記。也參見其內(nèi)容全文納入本文作為參考的美國專利號5,122,464;5,591,639;5,658,759;5,770,359;5,827,739;5,879,936;5,891,693;和5,981,216。此外，用于本發(fā)明藥物組合物的抗體可以是具有所需結(jié)合特性的嵌合抗體。因此，例如，用于本發(fā)明方法的嵌合抗-CD40抗體可具有本文所述CHIR-5.9和CHIR-12.12單克隆抗體的結(jié)合特性。"嵌合"抗體指最好是用重組脫氧核糖核酸技術(shù)衍生的含有人(包括免疫相關(guān)物種，例如黑猩猩)和非人組分的抗體。因此，嵌合抗體恒定區(qū)最好基本上與天然人抗體的恒定區(qū)相同；嵌合抗體可變區(qū)最好衍生自非人來源并對感興趣的抗原，即CD40抗原具有所需的抗原特異性。非人來源是可用來產(chǎn)生針對人抗原或含有人CD40抗原物質(zhì)的抗體的任何脊椎動物來源。這種非人來源包括，但不限于嚙齒類(例如，家兔、大鼠、小鼠等；參見，例如，納入本文作為參考的美國專利號4,816，567)和非人靈長類(例如，古猴(OldWorldMonkey)，類人猿等；例如納入本文作為參考的美國專利號5,750,105和5,756,096)。當(dāng)本文所用的短語"免疫活性"指嵌合性抗-CD40抗體時(shí)，指能結(jié)合人CD40的嵌合抗體。"人源化"指含有衍生自非人免疫球蛋白序列的最少序列的抗體形式。人源化抗體的大部分是具有所需特異性、親和力或能力的人免疫球蛋白(受者抗體)，其中受者超變區(qū)(也稱為互補(bǔ)決定區(qū)或CDR)的殘基被非人物種(供體抗體)，例如小鼠、大鼠、家兔或非人靈長類的超變區(qū)的殘基取代。短語"互補(bǔ)決定區(qū)"指共同確定天然免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn)的天然Fv區(qū)域的結(jié)合親和力和特異性的氨基酸序列。參見，例如Chothia等(1987)/MoLB/o/.196:901-917;Kabat等(1991)美國健康與人類服務(wù)部(U.S.Dept.ofHealthandHumanServices),NIH公布號91-3242)。短語"恒定區(qū)"指抗體分子中賦予效應(yīng)器功能的那部分。在以前涉及產(chǎn)生用于治療人疾病的無免疫原性抗體的研究中，小鼠恒定區(qū)被人恒定區(qū)取代。所述人源化抗體的恒定區(qū)衍生自人免疫球蛋白。然而，這些人源化抗體仍能在人中引發(fā)有害且可能危險(xiǎn)的免疫應(yīng)答并且喪失了親和力。用于本發(fā)明藥物組合物的人源化抗體，例如，人源化抗-CD40抗體，具有類似于感興趣的親代抗體，例如本文所述CHIR-5.9和CHIR-12.12單克隆抗體所顯示的結(jié)合特性。人源化基本上可根據(jù)Winter及其同事(Jones等(1986)A^w"321:522-525;Riechmann等(1988)A^we332:323-327;Verhoeyen等(1988)Sc/e"ce239:1534-1536)的方法通過用嚙齒類或突變型嚙齒類CDR或CDR序列取代人抗體的相應(yīng)序列來進(jìn)行。也參見納入本文作為參考的美國專利號5，225，539;5,585,089;5,693,761;5,693,762和5,859,205。在一些例子中，人免疫球蛋白的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)的框架區(qū)內(nèi)的殘基為對應(yīng)的非人殘基所取代(參見，例如美國專利號5,585,089;5,693,761;5,693,762和6,180,370)。此外，人源化抗體可含有在受者抗體或供體抗體中沒發(fā)現(xiàn)的殘基。制備這些修飾物可進(jìn)一步精制抗體的性能(例如，獲得所需的親和力)?？傮w上，人源化抗體基本上含有所有可變區(qū)、至少一個(gè)，通常兩個(gè)可變區(qū)，其中所有或基本上所有的超變區(qū)對應(yīng)于非人免疫球蛋白序列，所有或基本上所有的框架區(qū)是人免疫球蛋白序列。人源化抗體也任選包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)的至少一部分。更多的細(xì)節(jié)見引作參考的Jones等(1986)7Va^w331:522-525;Riechmann等(1988)A^wre332:323-329;和Presta(1992)CwT.Qp.&n^.Ao/.2:593-596。因此，這種"人源化"抗體可包括其中基本上小于完整的人可變區(qū)被非人種類的相應(yīng)序列取代的抗體。實(shí)際上，人源化抗體通常是其中一些CDR殘基和可能的一些框架殘基被嚙齒類抗體中類似位點(diǎn)的殘基取代的人抗體。參見，例如美國專利號5,225,539;5,585,089;5,693,761;5,693,762;5,859,205。也參見美國專利號6,180,370，和國際公布號WO01/27160，其中公開了人源化抗體和產(chǎn)生對預(yù)定抗原的親和力改進(jìn)的人源化抗體的技術(shù)。實(shí)踐本發(fā)明時(shí)還可采用在以滅活的內(nèi)源性免疫球蛋白(Ig)基因座為特征的非人哺乳動物宿主，更具體說是轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)產(chǎn)生異種抗體或修飾抗體。在這種轉(zhuǎn)基因動物中，使得表達(dá)宿主免疫球蛋白輕鏈和重鏈的活性內(nèi)源性基因無功能，并用同類人免疫球蛋白基因座取代。這些轉(zhuǎn)基因動物可產(chǎn)生基本上無宿主免疫球蛋白輕或重鏈亞基的人抗體。參見，例如納入本文作為參考的美國專利號5,877,397和5，939，598。在一些實(shí)施方式中，針對CD40的完整人抗體例如是通過免疫轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的。這種小鼠可采用XenoMouse⑧II技術(shù)(抗體基因公司；弗里蒙特，加州)獲得并公開于納入本文作為參考的美國專利號6,075,181;6,091,001和6,114,598中。為制備本文公開的抗體，用表達(dá)人CD40的Sf9細(xì)胞免疫具有人IgGi重鏈基因座和人K輕鏈基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠。小鼠也可以是具有其它同種型的轉(zhuǎn)基因動物。本發(fā)明的穩(wěn)定液體藥物組合物所用的完整人抗體的特征在于其結(jié)合特性與本文公開的CHIR-5.9和CHIR-12.12單克隆抗體所顯示的特征相似。感興趣的特定抗體，例如抗-CD40抗體(包括拮抗性抗-CD40抗體)的片段也適用于本發(fā)明的穩(wěn)定液體藥物組合物，只要它們保留了全長抗體的所需親和力。因此，例如，抗-CD40抗體的片段將保留結(jié)合CD40B細(xì)胞表面抗原的能力。這種片段的特征在于其性能與相應(yīng)的全長抗體相似。因此，例如，全長拮抗性抗-CD40抗體的片段可特異性結(jié)合人細(xì)胞表面表達(dá)的人CD40抗原，并且當(dāng)與人CD40表達(dá)細(xì)胞上的CD40抗原結(jié)合時(shí)無明顯激動活性卻顯示拮抗活性。本文將這種片段稱為"抗原結(jié)合"片段。抗體的合適抗原結(jié)合片段含有全長抗體的一部分，通常是其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括，但不限于Fab、F(ab')2、Fv片段和單鏈抗體分子。"Fab"指由輕鏈或重鏈的一部分組成的免疫球蛋白的單價(jià)抗原結(jié)合片段。F(ab')2指含有兩條輕鏈和兩條重鏈的一部分的免疫球蛋白的二價(jià)抗原結(jié)合片段。"單鏈Fv"或"sFv"抗體片段指含有抗體的Vh和VL結(jié)構(gòu)域的片段，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈中。參見，例如納入本文作為參考的美國專利號4,946,778;5,260,203;5,455,030和5,856,456。Fv多肽通常在Vh和Vl結(jié)構(gòu)域之間還含有一多肽接頭使sFv能形成抗原結(jié)合的所需結(jié)構(gòu)。sFv的綜述見Pluckthun(1994)77^尸/za，aco/ogyo/Mo"oc/owa"油力c^/eV卓ig"虔貧沐游^"潘學(xué)入第113巻，Rosenburg和Moore編，(Springer-Verlag，紐約)，269-315頁。如下文所述，本文公開的拮抗性抗-CD40抗體的抗原結(jié)合片段也可與細(xì)胞毒素偶連以起殺死靶癌細(xì)胞的作用。可利用例如McCafferty等(1990)A^"w348:552-554(1990)和美國專利號5,514,548中描述的技術(shù)從抗體噬菌體文庫分離抗體或抗體片段。Clackson等(1991)A^"re352:624-628和Marks等(1991)/Mo/.說>《222:581-597分別描述了利用噬菌體文庫分離鼠和人抗體。隨后的出版物描述了通過鏈改組(Marks等(1992)Ao/rec/z"o/ogy10:779-783)以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建極大噬菌體文庫的方案來產(chǎn)生高親和力(nM范圍)人抗體(Waterhouse等(1993)A^c/e/c.^c/<*21:2265-2266)。因此，這些技術(shù)是分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替代方法。已開發(fā)了各種技術(shù)來制備抗體片段。這些片段通過使完整抗體蛋白水解消化而獲得(參見，例如Morimoto等(1992)Jowz-"a/5,oc/zem/ca/fl"<iMeAocfe24:107-117(1992)和Brennan等(1985)Sc/e"ce229:81)。然而，現(xiàn)在這些片段可通過重組宿主細(xì)胞直接制備。例如，可從上述噬菌體文庫分離抗體片段?；蛘?，可從大腸桿菌中直接回收Fab'-SH片段并化學(xué)偶聯(lián)形成F(ab')2片段(Carter等(1992)5/o/rec/mo/ogy10:163-167)。根據(jù)另一方法，可從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物直接分離F(ab')2片段。其它制備抗體片段的技術(shù)是技術(shù)人員熟知的。本發(fā)明的穩(wěn)定液體藥物組合物所用的拮抗性抗-CD40抗體包括本文公開的CHIR-5.9和CHIR-12.12單克隆抗體以及與該抗體不同但保留了CDR的抗體；具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、刪除或取代的抗體，其中所述拮抗活性可通過抑制B細(xì)胞增殖和/或分化來測定。本發(fā)明也包括脫免疫的(de-immunized)抗體，特別是脫免疫的拮抗性抗-CD40抗體，該抗體可按納入本文作為參考的國際公布號WO98/52976和WO0034317所述制備。本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體內(nèi)的殘基以該方式修飾而使得該抗體對人無免疫原性或較低，但卻保留了它們對人CD40表達(dá)細(xì)胞的拮抗活性，所述活性可用本文其它部分所述試驗(yàn)測定。本發(fā)明的范圍也包括本領(lǐng)域已知的含有感興趣的抗體，例如拮抗性抗-CD40抗體或其片段的融合蛋白，所述融合蛋白可合成或從相應(yīng)的多核苷酸載體表達(dá)。參考本文它處所述的抗體偶聯(lián)來描述這種融合蛋白。具有感興趣的結(jié)合特異性的任何已知抗體可具有用例如納入本文作為參考的專利公布號EP0983303A1、WO00/34317和W098/52976中所述方法產(chǎn)生的序列變異。例如，CDR中的序列顯示可導(dǎo)致抗體與II類MHC結(jié)合并引發(fā)有害的輔助45性T細(xì)胞應(yīng)答。保守取代可使得該抗體保留結(jié)合活性而喪失其引發(fā)有害T細(xì)胞應(yīng)答的能力?？捎帽绢I(lǐng)域已知，例如本文其它部分所述的方法進(jìn)行任何這種保守或非保守取代，得到的抗體也可用于本發(fā)明的穩(wěn)定液體藥物組合物。用本文所述方法常規(guī)測試變體抗體的具體活性，例如拮抗活性、親和力和特異性。通過上述任一種方法或本文所述任何其他方法制造的拮抗性抗-CD40抗體可按類似于CHIR-12.12或CHIR-5.9抗體的方法使用，其中，它具有以下生物活性中的至少一種抑制T細(xì)胞刺激的正常人外周B細(xì)胞分泌免疫球蛋白；抑制JurkatT細(xì)胞刺激的正常人外周B細(xì)胞存活和/或增殖；抑制表達(dá)CD40L的細(xì)胞或可溶性CD40配體(sCD40L)刺激的正常人外周B細(xì)胞存活和/或增殖；抑制sCD40L或固相CD40L刺激的任何細(xì)胞中"存活的"抗-凋亡胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；抑制細(xì)胞與sCD40L或固相CD40L結(jié)合時(shí)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；抑制人惡性B細(xì)胞增殖；帶有CD40的靶細(xì)胞或帶有CD40同源配體的細(xì)胞(包括但不限于T細(xì)胞和B細(xì)胞)的刪除、無反應(yīng)性和/或耐受誘導(dǎo)；誘導(dǎo)CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞的擴(kuò)增或活化(參見，例如，經(jīng)CD40-CD40L干擾發(fā)生的供體同種抗原-特異性組織排斥，vanMaurik等(2002)7/mmw"o/.169:5401-5404);經(jīng)任何機(jī)制發(fā)生的細(xì)胞毒性(包括但不限于靶細(xì)胞中依賴于抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)、增殖的下調(diào)和/或凋亡)；調(diào)節(jié)靶細(xì)胞細(xì)胞因子分泌和/或細(xì)胞表面分子表達(dá)；以及它們的組合。測定本文所述拮抗性抗-CD40抗體及其抗原結(jié)合片段的所需生物活性的試驗(yàn)可按以下申請中的描述進(jìn)行2003/11/4、2003/11/26和2004/4/27分別提交并給予美國專利申請?zhí)?0/517,337(代理人案巻號PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人案巻號PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人案巻號PP20107.003(035784/277214))的題為"^mago"WJ""-CZ>/0Mo"oc/o"a/爿""kwf/es"WM"/k^/w77^>C^"獵貧絲貧-CZ)^卓克潑貧體i真賴法/，的臨時(shí)申請；以及2004/11/4提交并公布為WO2005/044854的同樣題為"^"togo"/WJw/-CZ>^Mo朋c/owa/^油'6o血sM"/wcfe/or77zez>L^ef"舒貧性界CD40卓克廣貧體及真^法/'的國際專利申請?zhí)朠CT/US2004/037152(代理人案巻號PP20107.004(035784/282916));它們各自的內(nèi)容通過引用全文納入本文。也可參見以下申請中描述的試驗(yàn)題為"M"/zO(i5/brDz'ag"c^a"c/7)"ea加加尸ra啡ra"veD/jwr/ensMec/WWCZ)W信號傳導(dǎo)分導(dǎo)游谫生絲疾諒游方法/'的臨時(shí)申請，該申請于2005/12/9提交并指定為美國專利申請?zhí)?0/749,285(代理人案巻號PP028035.0002(035784/304312))，以及2006/5/18提交并公布為WO2006/125143的相應(yīng)的國際專利申請?zhí)朠CT7US2006/019414(代理人案巻號PP028035.0003(035784/311611));和題為"M"/zotfe/orD/agmw/s3eame"Zo//^'seoses//av/wga"y4t^oz.mmw"ea"t//or7ny7￡W7w"tor_yGompo"e"《i會斷和治療具有^身扇疫辦n/或炎性成分的疾病的方法)"的臨時(shí)申請，該申請于2005/12/9提交并指定為美國專利申請?zhí)?0/749,336(代理人案巻號PP028062.0002(035784/304311))，以及2006/5/18提交并公布為WO2006/125117的相應(yīng)的國際專利申請?zhí)朠CT/US2006/019325(代理人案巻號PP028062.0003(035784/311608));它們各自的內(nèi)容通過引用全文納入本文。也可參見以下文獻(xiàn)中描述的試驗(yàn)Schultze等(1998)尸rac.A^/.92:8200-8204;Denton等(1998)PeWa化Tra"5p/a"A2:6-15;Evans等(2000)J/mmw"o/.164:688-697;Noelle(1998)^"/wwSwpp/.49:17-22;Lede腿n等(1996)C匿爭".//國to/.3:77-86;Coligan等(1991)Ci/廳eW尸ratoco/sTmmtmoZogy13:12,'Kwekkeboom等(1993)Zwmwno/ogy79:439-444;以及美國專利號5,674,492和5,847,082;通過引用納入本文。檢測本文所鑒定的CD40-抗原表位的特異性拮抗性抗-CD40抗體的代表性試驗(yàn)是"競爭性結(jié)合試驗(yàn)"。競爭性結(jié)合試驗(yàn)是通過抑制標(biāo)記的已知配體和其特異抗體結(jié)合的能力來檢測和定量未知物的血清學(xué)試驗(yàn)。也稱為競爭性抑制試驗(yàn)。在代表性的競爭性結(jié)合試驗(yàn)中，標(biāo)記的CD40多肽與樣品中的候選抗體，例如與用本發(fā)明單克隆抗體的一種或多種表位產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合而沉淀?？赏ㄟ^篩選用CD40蛋白或含有感興趣CD40蛋白的特定表位的蛋白片段而制備的一系列抗體來鑒定能與感興趣某表位特異性反應(yīng)的抗-CD40抗體。例如，就人CD40而言，感興趣的表位包括含有人CD40短同種型(參見，GenBank登錄號NP_690593，示于SEQIDNO:IO，由SEQIDNO:9所示序列編碼；也可參見GenBank登錄號NM_152854)或人CD40長同種型(參見，GenBank登錄號CAA43045和NP—001241，示于SEQIDNO:12，由SEQIDNO:ll所示序列編碼；參見GenBank登錄號X60592禾口NM—001250)的線性和/或非線性氨基酸殘基的表位?；蛘?，可用以前鑒定的合適的拮抗性抗-CD40抗體進(jìn)行競爭性結(jié)合試驗(yàn)來選擇與以前鑒定的抗體相當(dāng)?shù)膯慰寺】贵w。這種免疫試驗(yàn)采用的抗體可以是標(biāo)記的或未標(biāo)記的。未標(biāo)記的抗體可用于凝結(jié)試驗(yàn)；采用各種各樣標(biāo)記物的標(biāo)記抗體可用于各種試驗(yàn)。通過使抗體與可檢測物質(zhì)連接有助于檢測抗-CD40抗體與感興趣表位之間形成的抗體-抗原復(fù)合物。合適的檢測方式包括使用例如放射性核素、酶、輔酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、色原、酶底物或輔助因子、酶抑制劑、輔基復(fù)合物、自由基、顆粒、染料等標(biāo)記。合適的酶的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、(3-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物例子包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和親和素/生物素；合適的熒光物質(zhì)例子包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的例子是魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)的例子包括螢光素酶、螢光素和水母蛋白；合適的放射性物質(zhì)的例子包括1251、1311、"S或SH。這種標(biāo)記的試劑可用于各種熟知的試驗(yàn)，例如放射性免疫試驗(yàn)，酶免疫試驗(yàn)如ELISA、熒光免疫試驗(yàn)等。參見，例如美國專利號3,766,162;3,791,932;3,817,837和4,233,402?？上扰悸?lián)任何前述的拮抗性抗-CD40抗體或它們的抗原結(jié)合片段，再用于本發(fā)明的藥物組合物。制備偶聯(lián)抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。因此，可用間接標(biāo)記或間接標(biāo)記方法來標(biāo)記抗-CD40抗體。"間接標(biāo)記"或"間接標(biāo)記方法"指將螯合劑共價(jià)偶聯(lián)于抗體并且將至少一種放射性核素插入該螯合劑中。例如，參見納入本文作為參考的Srivagtava和Mease,(1991)A^c/.Med所o.18:589-603中所述的螯合劑和放射性核素。合適的標(biāo)記包括熒光基團(tuán)、生色團(tuán)、放射性原子(特別是32P和1251)、高電子密度試劑、酶和具有特異性結(jié)合伴侶的配體。一般通過其活性來檢測酶。例如，常通過將3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)轉(zhuǎn)變?yōu)榭捎梅止夤舛扔?jì)定量的藍(lán)色色素的能力來檢測辣根過氧化物酶。"特異性結(jié)合伴侶"指能以高特異性結(jié)合配體分子的蛋白質(zhì)，例如抗原和其特異性單克隆抗體。其它特異性結(jié)合伴侶包括生物素和親和素或鏈霉抗生物素蛋白、IgG和蛋白A、本領(lǐng)域已知的許多受體-配體對。因?yàn)橄嗤臉?biāo)記可以幾種不同模式使用，以上描述應(yīng)該理解為不是要將各種標(biāo)記歸為截然不同的種類。例如，1251可用作放射性標(biāo)記或作為高電子密度試劑。HRP可用作酶或mAb的抗原。此外，可為所需作用組合各種標(biāo)記。例如，mAb與親和素在實(shí)施本發(fā)明中也需要標(biāo)記因此，可用生物素標(biāo)記mAb，然后用標(biāo)記1251的親和素或用標(biāo)記HRP的抗-生物素mAb檢測其存在。其它排列組合與可能性對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難理解，應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明范圍內(nèi)的等價(jià)物?；蛘?，感興趣的拮抗性抗-CD40抗體可使用放射性核素與抗體直接共價(jià)相連(一般通過氨基酸殘基)的"直接標(biāo)記"或"直接標(biāo)記方法"標(biāo)記。優(yōu)選的核素見Srivagtava和Mease(1991)，同上。特別優(yōu)選間接標(biāo)記方法。也參見，例如國際公布號WO00/52031和WO00/52473，其中接頭用于連接放射性標(biāo)記與抗體；抗-CD40抗體的受標(biāo)記形式描述于納入本文作為參考的美國專利號6,015,542?？贵w變體本發(fā)明的藥物組合物可用本領(lǐng)域已知的拮抗性抗-CD40抗體的變體來配制。這種變體將保留親代抗體的所需結(jié)合特性。因此，例如，當(dāng)要配制的拮抗性抗-CD40抗體是親代CHIR-12.12或CHIR-5.9抗體的變體時(shí)，該變體抗體將保留親代CHIR-12.12或CHIR-5.9抗體的結(jié)合特性。制備抗體變體的方法一般是本領(lǐng)域可用的。例如，拮抗性抗-CD40抗體，如本文所述的CHIR-5.9或CHIR-12.12單克隆抗體的氨基酸序列變體可通過突變克隆的編碼感興趣抗體的DNA序列來制備。誘變與核苷酸序列改變的方法是本領(lǐng)域熟知的。參見，例如，納入本文作為參考的Walker和Gaastra編，(1983)，rec/zm々wesMo/ecw/w5/o/og>Yi^f生激學(xué)^"^K紐約麥克米蘭出版公司(MacMillanPublishingCompany,NewYork));Kunkel，(1985)，iVoc.Ato/.Jc^/.ScZ.t/&482:488-492;Kunkel等(1987)MethodsEnzymol.154:367-382;Sambrook等(1989)，Mo/ecw/arC7om'"g.'^4Mam/a《分^:克虔.'^■^^手i^(冷泉港，紐約)；美國專利號4,873,192;和其中引用的參考文獻(xiàn)。不影響感興趣多肽的生物活性的適當(dāng)氨基酸取代的指南見納入本文作為參考的Dayhoff等(1978)o//Vofez/zSe《we"ce朋d5^M"wr"蚤A^^^/^7翁/々綴(Natl.Biomed.Res.Found.，華盛頓特區(qū))中的模型。優(yōu)選保守取代，例如用具有相似特性的另一氨基酸取代一個(gè)氨基酸。保守取代的例子包括，但不限于GlyoAla、ValoIleGLeu、Asp。Glu、LysoArg、Asn<=>Gln禾卩PheoTrp。Tyr。在構(gòu)建感興趣的拮抗性抗-CD40抗體多肽，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9抗體的變體過程中，進(jìn)行修飾使變體繼續(xù)具有所需活性，即相似的結(jié)合親和力并且，以拮抗性抗-CD40抗體為例，能特異性地結(jié)合表達(dá)于人細(xì)胞表面的人CD40抗原，并且當(dāng)與人CD40表達(dá)細(xì)胞上的CD40抗原結(jié)合時(shí)無明顯的激動活性而顯示拮抗活性。編碼這種變體多肽的DNA中的任何突變顯然無須將其序列置于讀框外并且優(yōu)選不要生成可能產(chǎn)生二級mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)。參見歐洲專利申請公布號75,444。49此外，可以許多方式使拮抗性抗-CD40抗體的恒定區(qū)突變而改變其效應(yīng)器功能。例如，參見美國專利號6，737,056Bl和美國專利申請公布號2004/0132101A1所述的優(yōu)化抗體與Fc受體結(jié)合的Fc突變。優(yōu)選地，參比拮抗性抗-CD40抗體的變體的氨基酸序列與該參比抗體，例如本文所述的CHIR-5.9或CHIR-12.12單克隆抗體的氨基酸序列，或與該參比抗體分子的較短部分具有至少70%或75%序列相同性，優(yōu)選至少80%或85%序列相同性，更優(yōu)選至少90%、91%、92%、93%、94%或95%序列相同性。更優(yōu)選地，這些分子具有至少96%、97%、98%或99%序列相同性。出于本發(fā)明的目的，可使用Sm他-Waterman同源性檢索算法以仿射空位(affinegap)檢索確定序列相同性百分比，所用參數(shù)為空位開放罰分12、空位延伸罰分2、BLOSUM矩陣62。Smith-Waterman同源性檢索算法的說明見Smith和Waterman,(1981)"i/vJ/p/.Mfl仇2:482-489。例如，變體與參比的抗-CD40抗體有少至1-15個(gè)氨基酸殘基、少至1-10個(gè)氨基酸殘基，如6-10，少至5個(gè)、少至4個(gè)、3個(gè)、2個(gè)、甚至l個(gè)氨基酸殘基的不同。就兩條氨基酸序列的最佳比對而言，與參比氨基酸序列相比，變體氨基酸序列的毗連區(qū)段可具有額外的氨基酸殘基或刪除的氨基酸殘基。用于和參比氨基酸序列比較的毗連區(qū)段包括至少20個(gè)毗連氨基酸殘基，可以是30、40、50或更多個(gè)氨基酸殘基?？蓪εc保守殘基取代或空位相關(guān)的序列相同性進(jìn)行校正(參見Smith-Waterman同源性檢索算法)。采用本發(fā)明藥物組合物的治療方法發(fā)現(xiàn)本發(fā)明藥物組合物可用于治療患有與表達(dá)CD40的細(xì)胞相關(guān)的癌癥或惡變前病癥(pre-malignantcondition)的對象，或用于治療與表達(dá)CD40的細(xì)胞相關(guān)的炎性疾病和/或自身免疫性疾病。本文將"治療"定義為將含有拮抗性抗-CD40抗體的藥物組合物應(yīng)用于或給予對象，或?qū)⒑修卓剐钥?CD40抗體的藥物組合物應(yīng)用于或給予對象的分離的組織或細(xì)胞系，所述對象具有疾病，疾病癥狀，或?qū)膊【哂幸赘行?，其中所述給藥的目的是為治愈、治療、緩解、減輕、改變、補(bǔ)救、改善、提高或影響該疾病、疾病的癥狀、或?qū)膊〉囊赘行浴?對象"指任何動物。優(yōu)選地，所述對象是哺乳動物，更優(yōu)選地，所述對象是人。除人之外，特別重要的哺乳動物包括，但不限于，狗、貓、牛、馬、綿羊和豬。當(dāng)給藥是出于治療目的時(shí)，給藥可以出于預(yù)防性或治療性目的。當(dāng)預(yù)防性提供時(shí)，藥物組合物在任何癥狀出現(xiàn)之前提供。藥物組合物的預(yù)防性給藥用來預(yù)防或緩解任何之后的癥狀。當(dāng)治療性提供時(shí)，藥物組合物在癥狀發(fā)作時(shí)(或之后不久)提供。藥物組合物的治療性給藥用來緩解任何實(shí)際癥狀。典型的給藥途徑包括，但不限于，口服給藥和腸胃外給藥，包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鞘內(nèi)、鼻內(nèi)、舌下、動脈內(nèi)和腹膜內(nèi)注射或輸注，以及皮下注射。實(shí)現(xiàn)這種給藥的方法是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合物是靜脈內(nèi)給予的。進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥時(shí)優(yōu)選通過輸注進(jìn)行，輸注時(shí)間約1至約10小時(shí)，更優(yōu)選約1至約8小時(shí)，再優(yōu)選約2至約7小時(shí)，再優(yōu)選約4至約6小時(shí)，輸注時(shí)間取決于所給予的拮抗性抗-CD40抗體。第一次輸注藥物組合物的時(shí)間可以是約4至約6小時(shí)，之后可以更加快地輸注。后面的輸注可為期約1至約6小時(shí)，包括，例如，約1至約4小時(shí)，約1至約3小時(shí)，或約1至約2小時(shí)。將藥學(xué)上有效量的本發(fā)明藥物組合物給予對象。"藥學(xué)上有效量的"指用來治療疾病或癥狀的用量，其中所述治療可出于如上文所述的預(yù)防或治療目的。在這種方式中，藥學(xué)上有效量的組合物將治療有效劑量或用量的拮抗性抗-CD40抗體給予需要治療的對象。"治療有效劑量或用量"或"有效量"指拮抗性抗-CD40抗體的用量，當(dāng)給予該用量時(shí)對于治療患有包含表達(dá)CD40的細(xì)胞的疾病的患者能帶來正面的治療反應(yīng)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，拮抗性抗-CD40抗體，例如，單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原結(jié)合片段的治療有效劑量范圍從約0.01mg/kg至約40mg/kg，從約0.01mg/kg至約30mg/kg，從約0.1mg/kg至約30mg/kg，從約1mg/kg至約30mg/kg，從約3mg/kg至約30mg/kg，從約3mg/kg至約25mg/kg，從約3mg/kg至約20mg/kg，從約5mg/kg至約15mg/kg，或從約7mg/kg至約12mg/kg。應(yīng)該知道，該治療方法可包括一次給予或多次給予治療有效劑量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的藥物組合物可用于治療患有對用抗-CD40治療劑，更具體說是拮抗性抗-CD40抗體治療有反應(yīng)的癌癥或惡變前病癥的任何對象。測定癌癥或惡變前病癥對用抗-CD40抗體治療的反應(yīng)性的方法包括診斷和預(yù)后試驗(yàn)，例如以下申請中描述白勺i式驗(yàn)題為"^Mef/zocfeD/ag"cw/51aw<i7eaZme"fo//Vo/i/^n3"veZ)&orcfe^yMe^atec/O)卯&^^//"^珍銜浙治#0^0/,號傳導(dǎo)介導(dǎo)游譜f絲^"剪游方茲/'的待批和共有臨時(shí)專利申請，該申請于2005/12/9提交，并指定為美國專利申請?zhí)?0/749,285(代理人案巻號PP028035.0002(035784/304312)，以及2006/5/18提交并公布為WO2006/125143的相應(yīng)的國際專利申請?zhí)朠CT/US2006/019414(代理人案巻號PP028035.0003(035784/311611));它們各自的內(nèi)容通過引用全文納入本文。類似地，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的藥物組合物可用于治療患有對用抗-CD40治療劑，更具體說是拮抗性抗-CD40抗體治療有反應(yīng)的炎性和/或自身免疫性疾病的任何對象。測定炎性和/或自身免疫性疾病對用抗-CD40抗體治療的反應(yīng)性的方法包括診斷和預(yù)后試驗(yàn)，例如以下申請中描述的試驗(yàn)題為"MeAocfe/wD/ag"os^aw/7>ea^eWo/iVo/z/era&eZ^orafe"&'g"a//"g(^^4^f〃^#CDW,號/,導(dǎo)々導(dǎo)游潛f絲疾瘋游方法尸的待批和共有臨時(shí)專利申請，該申請于2005/12/9提交，并指定為美國專利申請?zhí)?0/749,336(代理人案巻號PP028062.0002(035784/304311)，以及2006/5/18提交并公布為WO2006/125117的相應(yīng)的國際專利申請?zhí)朠CT/US2006/019325(代理人案巻號PP028062.0003(035784/311608));它們各自的內(nèi)容通過引用全文納入本文。"腫瘤"在文中指所有惡性或良性的腫瘤性細(xì)胞生長和增殖，以及所有癌前和癌性細(xì)胞和組織。"腫瘤性"在文中指任何形式的無論惡性或良性的失調(diào)的或不受調(diào)控的細(xì)胞生長，這種生長導(dǎo)致異常的組織生長。因此，"腫瘤性細(xì)胞"包括細(xì)胞生長失調(diào)或不受調(diào)控的惡性和良性細(xì)胞。"抗腫瘤活性"指降低表達(dá)CD40的惡性細(xì)胞增殖或積累的速率從而降低已存在的腫瘤或在治療期間產(chǎn)生的腫瘤的生長速率，和/或破壞已存在的腫瘤性(腫瘤)細(xì)胞或新形成的腫瘤性細(xì)胞從而減小治療期間腫瘤的總體積。用本發(fā)明的含拮抗性抗-CD40抗體的藥物組合物治療可導(dǎo)致就治療與人體中表達(dá)CD40的細(xì)胞上CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活相關(guān)的癌癥和惡變前病癥而言有益的生理應(yīng)答。術(shù)語"癌癥"和"癌性"是指或描述了通常以不受調(diào)控的細(xì)胞生長為特征的哺乳動物的生理狀況。癌癥的例子包括，但不限于，淋巴瘤和白血病，以及實(shí)體瘤。"B細(xì)胞相關(guān)癌癥"或"B細(xì)胞譜系癌癥"是指其中失調(diào)的或不受調(diào)控的細(xì)胞生長與B細(xì)胞相關(guān)的任何類型的癌癥。"難治"就癌癥而言是指特定癌癥對用特定治療劑，例如感興趣的拮抗性抗-CD40抗體治療有抗藥性或無反應(yīng)。某癌癥可以從用特定治療劑治療開始時(shí)就對用該特定治療劑治療難治(S卩，一開始接觸該治療劑就無反應(yīng))，或者由于對該治療劑產(chǎn)生了抗藥性而難治，抗藥性可以在用該治療劑治療的第一個(gè)治療期內(nèi)產(chǎn)生或者在隨后的治療期內(nèi)產(chǎn)生。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的藥物組合物可用于治療需要對由表達(dá)CD40的細(xì)胞上的CD40信號傳導(dǎo)的激活介導(dǎo)的癌癥或惡變前病癥，或者對由表達(dá)CD40的細(xì)胞上的CD40信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的炎性或自身免疫性疾病進(jìn)行治療干預(yù)的對象。"表達(dá)CD40的細(xì)胞"是指表達(dá)CD40抗原的正常細(xì)胞、惡變前細(xì)胞以及惡性細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，表達(dá)CD40的細(xì)胞是惡性B細(xì)胞。"惡性"B細(xì)胞指任何腫瘤性B細(xì)胞，包括但不限于衍生自淋巴瘤的B細(xì)胞，包括低級、中級和高級B細(xì)胞淋巴瘤，免疫母細(xì)胞性淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金病，Epstein-Barr病毒(EBV)誘導(dǎo)的淋巴瘤，和AIDS相關(guān)淋巴瘤以及B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病，骨髓瘤，慢性淋巴細(xì)胞性白血病，等等。在其他實(shí)施方式中，表達(dá)CD40的細(xì)胞是癌細(xì)胞或肉瘤細(xì)胞。"表達(dá)CD40的癌細(xì)胞"或"表達(dá)CD40的肉瘤細(xì)胞"指表達(dá)CD40細(xì)胞表面抗原的實(shí)體瘤的任何惡性(S卩，腫瘤性)或惡變前的癌細(xì)胞或肉瘤細(xì)胞。出于本發(fā)明的目的，表達(dá)CD40抗原的癌細(xì)胞以及癌前細(xì)胞或惡變前細(xì)胞被稱為"表達(dá)CD40的腫瘤性細(xì)胞"。檢測細(xì)胞內(nèi)CD40表達(dá)的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且包括，但不限于，PCR技術(shù)、免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、Western印跡、ELISA，等等。當(dāng)允許用拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段進(jìn)行治療時(shí)，包含拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物可通過任何合適的給藥途徑給予。需要用本發(fā)明的藥物組合物進(jìn)行治療干預(yù)的對象可能患有以下疾病或者有產(chǎn)生或復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)由表達(dá)CD40的腫瘤性細(xì)胞上的CD40信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的任何癌癥或惡變前病癥。這種癌癥和惡變前病癥的例子包括，但不限于，B細(xì)胞譜系的任何癌癥，非-B細(xì)胞血液惡性腫瘤，以及巳知由表達(dá)CD40的腫瘤性細(xì)胞上的CD40信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的實(shí)體瘤。包含表達(dá)CD40的腫瘤性細(xì)胞的B細(xì)胞譜系癌癥的例子是急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)，慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)，幼淋巴細(xì)胞白血病(PLL)，多毛細(xì)胞白血病，霍奇金病，多發(fā)性骨髓瘤，瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥，重鏈病，以及淋巴瘤，包括但不限于，彌散性小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤，濾泡性，DLBCL，粘膜相關(guān)性淋巴組織淋巴瘤，單核細(xì)胞樣B細(xì)胞淋巴瘤，脾淋巴瘤，淋巴瘤樣肉芽腫病，血管內(nèi)淋巴瘤病，免疫母細(xì)胞性淋巴瘤，AIDS相關(guān)性淋巴瘤，等等。因此，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的藥物組合物可用于治療患有與異常、不受控的B細(xì)胞增殖或累積相關(guān)的非霍奇金淋巴瘤的對象。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)『oA/"gFw7m^"oM(Cr^試^5分類表，這種淋巴瘤的分類為低級、中級或高級的B細(xì)胞淋巴瘤(參見"TheNon-Hodgkin'sLymphomaPathologicClassificationProject"(非霍奇金淋巴瘤病理分類項(xiàng)目)，Ca"ceM9(1982):2112-2135)。因此，低級B細(xì)胞淋巴瘤包括小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤，濾泡性小卵裂細(xì)胞(small-cleavedcell)淋巴瘤，和濾泡性混合性小卵裂細(xì)胞及巨細(xì)胞淋巴瘤；中級淋巴瘤包括濾泡性巨細(xì)胞淋巴瘤，彌散性小卵裂細(xì)胞淋巴瘤，彌散性混合性小細(xì)胞和巨細(xì)胞淋巴瘤，和彌散性巨細(xì)胞淋巴瘤；而高級淋巴瘤包括巨細(xì)胞免疫母細(xì)胞性淋巴瘤，成淋巴細(xì)胞淋巴瘤，和伯基特和非伯基特類型的小非卵裂細(xì)胞淋巴瘤。應(yīng)該知道本發(fā)明的藥物組合物可用于治療按修正的歐美淋巴瘤分類(REAL)系統(tǒng)分類為B細(xì)胞型的淋巴瘤。這種B細(xì)胞淋巴瘤包括，但不限于按以下分類的淋巴瘤前B細(xì)胞瘤，例如B淋巴細(xì)胞性白血病/淋巴瘤；外周B細(xì)胞瘤，包括B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病/小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、漿細(xì)胞樣淋巴細(xì)胞(lymphoplasmacytoid)淋巴瘤/免疫細(xì)胞瘤、外套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)、濾泡中心淋巴瘤(濾泡性)(包括彌散性小細(xì)胞、彌散性小和巨細(xì)胞，與彌散性巨細(xì)胞淋巴瘤)、邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤(包括結(jié)節(jié)外、結(jié)節(jié)的和脾臟類型)、漿細(xì)胞瘤/骨髓瘤、原發(fā)性縱隔(胸腺)亞型彌散性巨細(xì)胞型B細(xì)胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和伯基特樣高級B細(xì)胞淋巴瘤；和不可分類的低級或高級B細(xì)胞淋巴瘤。本發(fā)明的藥物組合物也可用于治療患有稱為MGUS(意義未定的單克隆丙種球蛋白病)的惡變前病癥的對象。經(jīng)評價(jià)，大約25。/。的MGUS患者最終發(fā)展成多發(fā)性骨髓瘤(MM)或相關(guān)的漿細(xì)胞疾病(Kyle(1993)MqyoC//m'c./Voc.68:26-36)。骨髓中惡性漿細(xì)胞增殖、在血清或尿液中檢測出單克隆蛋白(M蛋白)、貧血、高鈣血癥、腎機(jī)能不全、以及溶骨性骨損傷都是MM的臨床表現(xiàn)，而臨床上通過血清或尿液中出現(xiàn)M蛋白以及其他MM臨床特征來判別MGUS(參見，例如，Kyle和Lust(1989)i/ema/o/.26:176-200;Greipp和LustStemCe〃s(1995)13:10-21)。MGUS患者是無癥狀的并具有穩(wěn)定的M蛋白測量值(Kyle(1993)MqyoC//m'c.iVoc.68:26-36)。一旦鑒定對象有MGUS，采用合適的本發(fā)明藥物組合物，例如，含有本文所述拮抗性抗-CD40抗體的組合物的維持療法能夠阻斷這些對象中多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)展。具體地說，本發(fā)明的藥物組合物可用于治療對于第一線腫瘤療法難治(S卩，有抗藥性或已經(jīng)變得有抗藥性)的B細(xì)胞淋巴瘤，包括上述那些。術(shù)語"腫瘤療法(oncotherapeutic)"用來指癌癥治療方法，例如化療、手術(shù)、放療、單一抗癌抗體治療以及它們的組合。需要用一種或多種能調(diào)節(jié)CD40L-介導(dǎo)的CD40信號傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)ADCC或這兩者的抗-CD40抗體對這類患者亞群進(jìn)行治療干預(yù)。本發(fā)明的藥物組合物還可用于治療非B細(xì)胞相關(guān)血液惡性腫瘤。這種惡性腫瘤包括，但不限于，急性白血??；成髓細(xì)胞性白血??；急性髓細(xì)胞性白血?。磺八杓?xì)胞性白血??；髓性單核細(xì)胞性白血?。粏魏思?xì)胞性白血??；紅白血??；粒細(xì)胞性白血病(慢性粒細(xì)胞性白血病)；真性紅細(xì)胞增多癥；等等。包含表達(dá)CD40的腫瘤性細(xì)胞、因此受益于用本發(fā)明藥物組合物治療的實(shí)體瘤包括，但不限于卵巢癌，肺癌(例如，鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和巨細(xì)胞癌類型的非小細(xì)胞肺癌，以及小細(xì)胞肺癌)，乳腺癌，結(jié)腸癌，腎癌(包括，例如，腎細(xì)胞癌)，膀胱癌，肝癌(包括，例如，肝細(xì)胞癌)，胃癌，宮頸癌，前列腺癌，鼻咽癌，甲狀腺癌(例如，甲狀腺乳頭狀癌)，皮膚癌如黑色素瘤，以及肉瘤(包括，例如，骨肉瘤和尤因肉瘤。通過給患有癌癥或惡變前病癥的對象施用本發(fā)明的藥物組合物能實(shí)現(xiàn)的有益結(jié)果包括就癌癥或癥狀而言的任何正面治療反應(yīng)。就癌癥治療而言，"正面治療反應(yīng)"指與抗-CD40治療劑的抗腫瘤活性相關(guān)疾病的改善，和/或與感興趣的疾病相關(guān)癥狀的改善。即，可觀察到抗增殖作用、防止腫瘤進(jìn)一步增殖，腫瘤體積減小、腫瘤細(xì)胞數(shù)量降低、和/或CD40表達(dá)細(xì)胞激活所介導(dǎo)的一種或多種癥狀的減輕。因此，例如，正面治療反應(yīng)將涉及疾病中以下一種或多種改善(1)腫瘤體積減小；(2)癌癥(即，腫瘤性)細(xì)胞數(shù)目降低；(3)腫瘤性細(xì)胞死亡增加；(4)抑制腫瘤性細(xì)胞存活；(4)抑制(S卩，減緩到一定程度，優(yōu)選停止)腫瘤生長；(5)抑制(即，減緩到一定程度，優(yōu)選停止)癌細(xì)胞滲透入外周器官；(6)抑制(S卩，減緩到一定程度，優(yōu)選停止)腫瘤轉(zhuǎn)移；(7)防止進(jìn)一步腫瘤生長；(8)提高患者存活率；禾卩(9)在一定程度上緩解一種或多種癌癥相關(guān)癥狀。可通過專門用于惡性腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)指標(biāo)來測定對于任何給定的惡性腫瘤的正面治療反應(yīng)?？捎靡韵潞Y選技術(shù)評價(jià)腫瘤應(yīng)答所導(dǎo)致的腫瘤形態(tài)(即，總的腫瘤負(fù)荷、腫瘤體積等)變化例如磁共振成像(MRI)掃描、x-放射顯影成像、計(jì)算機(jī)化斷層顯像(CT)掃描、骨掃描成像以及包括抽取骨髓(BMA)的腫瘤活體組織取樣和循環(huán)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)。除了這些正面治療反應(yīng)以外，用本發(fā)明的含拮抗性抗-CD40抗體的藥物組合物治療的對象可經(jīng)歷疾病相關(guān)癥狀改善的有益作用。因此，就B細(xì)胞腫瘤而言，對象可經(jīng)歷所謂的B癥狀，即盜汗、發(fā)熱、體重降低和/或蕁麻疹的減輕。就惡變前病癥而言，用抗-CD40治療劑治療55可阻斷和/或延長發(fā)展成相關(guān)惡性癥狀之前的時(shí)間，如患有意義未定的單克隆丙種球蛋白病(MGUS)的對象中多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)展。"抗炎活性"是指減輕或預(yù)防炎癥。用本發(fā)明的含拮抗性抗-CD40抗體的液體藥物組合物治療能產(chǎn)生就治療自身免疫性疾病和/或炎性疾病而言有益的生理反應(yīng)，其中所述疾病涉及表達(dá)CD40抗原的細(xì)胞。應(yīng)了解，本發(fā)明的組合物可用于預(yù)防細(xì)胞的表型改變，如增殖、活化等等。正在接受本發(fā)明的含拮抗性抗-CD40抗體的液體藥物組合物治療干預(yù)的對象可能患有以下疾病或者有產(chǎn)生或復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)由表達(dá)CD40的腫瘤性細(xì)胞上的CD40信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的任何炎性或自身免疫性疾病。炎性疾病的特征為炎癥和組織破壞，或者它們的組合。"炎性疾病"包括任何炎性免疫介導(dǎo)的過程，其免疫反應(yīng)的起始事件或目標(biāo)涉及非自身抗原，包括，例如，同種抗原，異種抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、未知抗原或變應(yīng)原。再者，出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"炎性疾病"包括"自身免疫性疾病"。文中，術(shù)語"自身免疫性"通常被理解為包括涉及"自身"抗原的炎性免疫介導(dǎo)的過程。在自身免疫性疾病中，自身抗原觸發(fā)宿主的免疫反應(yīng)。同時(shí)，本發(fā)明的藥物組合物可用于治療與組織移植排斥相關(guān)的炎癥。"移植排斥"或"移植物排斥"指任何在宿主產(chǎn)生的針對移植物，包括但不限于HLA抗原、血型抗原等的免疫反應(yīng)。本發(fā)明的藥物組合物也可用于治療移植物抗宿主病，如與骨髓移植相關(guān)的移植物抗宿主病。在這種移植物抗宿主病中，供體骨髓包含淋巴細(xì)胞和成熟后變?yōu)榱馨图?xì)胞的細(xì)胞。供體的淋巴細(xì)胞將受者的抗原識別成非自身抗原并啟動炎性免疫反應(yīng)。因此，"移植物抗宿主病"或"移植物抗宿主反應(yīng)"在文中指其中供者淋巴細(xì)胞與宿主的抗原發(fā)生反應(yīng)的任何T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。自身免疫性和/或炎性疾病的例子包括，但不限于，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，盤狀狼瘡，狼瘡腎炎，結(jié)節(jié)病，炎性關(guān)節(jié)炎，包括幼年型關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病關(guān)節(jié)炎，萊特爾綜合征，強(qiáng)直性脊柱炎，以及痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，器官或組織移植排斥，超急性、急性或慢性排斥反應(yīng)和/或移植物抗宿主病，多發(fā)性硬化，超IgE綜合征，結(jié)節(jié)性多動脈炎，原發(fā)性膽汁性肝硬變，炎性腸病，克羅恩病，乳糜瀉(麩膠敏感性腸病)，自身免疫性肝炎，惡性貧血，自身免疫性溶血性貧血，銀屑病，硬皮病，重癥肌無力，自身免疫性血小板減少性紫癜，自身免疫性甲狀腺炎，格雷夫斯病，橋本甲狀腺炎，免疫復(fù)合物病，慢性疲勞性免疫功能障礙綜合征(CFIDS)，多肌炎和皮肌炎，冷球蛋白血癥，溶栓，心肌病，尋常型天皰瘡，肺間質(zhì)纖維化，I型和II型糖尿病，1、2、3和4型遲發(fā)型超敏反應(yīng)，變態(tài)反應(yīng)或變態(tài)反應(yīng)性疾病，對治療蛋白質(zhì)的不希望/非故意免疫反應(yīng)(參見，例如，美國專利申請?zhí)杣s2002/0119151和Koren等，(2002)Cwr.3:349-60)，哮喘，丘陽施二氏綜合征(變應(yīng)性肉芽腫病)，特應(yīng)性皮炎，過敏性和刺激性接觸性皮炎，蕁麻疹，IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)，動脈粥樣硬化，血管炎，特發(fā)性炎性肌病，溶血性疾病，阿爾茨海默病，慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病，等等。在一些其他實(shí)施方式，本發(fā)明的藥物組合物被用于治療個(gè)體的肺部炎癥，其中包括但不限于，肺移植排斥，哮喘，結(jié)節(jié)病，肺氣腫，囊性纖維化病，特發(fā)性肺纖維化，慢性支氣管炎，變應(yīng)性鼻炎和變應(yīng)性肺病如超敏感性肺炎，嗜酸細(xì)胞性肺炎，由于骨髓和/或肺移植或其他原因造成的梗阻性細(xì)支氣管炎，移植物動脈粥樣硬化/移植物靜脈硬化，以及膠原、血管和自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和紅斑狼瘡導(dǎo)致的肺纖維化。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合物用于治療對于其它已知治療方法一開始就有抗藥性或者產(chǎn)生了抗藥性的自身免疫性疾病和炎性疾病，所述已知療法的作用模式不同于通過調(diào)節(jié)CD40L-介導(dǎo)的CD40信號傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)ADCC、或這二者。本發(fā)明的藥物組合物也可用于治療需要用一種或多種能調(diào)節(jié)CD40L-介導(dǎo)的CD40信號傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)ADCC或這二者的拮抗性抗-CD40抗體進(jìn)行治療干預(yù)的患者亞群。通過給患有炎性疾病或自身免疫性疾病的對象施用本發(fā)明的藥物組合物能實(shí)現(xiàn)的有益結(jié)果包括就該病而言的任何正面治療反應(yīng)。就自身免疫性疾病和/或炎性疾病而言，"正面治療反應(yīng)"是指與這些抗體或其抗原結(jié)合片段的抗炎活性相關(guān)的疾病改善，和/或與疾病相關(guān)的癥狀改善。即，可觀察到抗增殖作用，防止表達(dá)CD40的細(xì)胞進(jìn)一步增殖，炎性反應(yīng)減輕，包括但不限于炎性細(xì)胞因子、粘附分子、蛋白酶、免疫球蛋白(此時(shí)，帶有CD40的細(xì)胞為B細(xì)胞)的分泌減少，或其組合，等等，抗炎癥蛋白的產(chǎn)量提高，自身反應(yīng)性細(xì)胞數(shù)目減少，免疫耐受性提高，抑制自身反應(yīng)性細(xì)胞的存活，和/或表達(dá)CD40的細(xì)胞介導(dǎo)的一種或多種癥狀減輕。這種正面治療反應(yīng)不限于給藥途徑，同時(shí)可包括對供者給藥、對供者組織給藥(例如器官灌注)、對宿主給藥、其任意組合，等等?？刹捎靡韵潞Y選技術(shù)評價(jià)臨床反應(yīng)例如磁共振成像(MRI)掃描、x-放射顯影成像、計(jì)算機(jī)化斷層顯像(CT)掃描、流式細(xì)胞術(shù)或熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分析、組織學(xué)、普通病理學(xué)、以及血液化學(xué)，包括但不限于通過ELISA、RIA、層析法等可檢測的變化。除了這些正面治療反應(yīng)，用本發(fā)明的含拮抗性抗-CD40抗體的液體藥物組合物治療的對象可經(jīng)歷疾病相關(guān)癥狀改善的有益效果。提供以下實(shí)施例是為了說明，絕非限制。實(shí)驗(yàn)CHIR-12.12是通過CHO細(xì)胞培養(yǎng)方法制造的完全人源化的抗-CD40IgG,單克隆抗體。該分子的分子量為150kDa，其分子結(jié)構(gòu)由通過二硫鍵連接在一起的兩條重鏈和兩條輕鏈構(gòu)成。CHIR-12.12靶向人CD40細(xì)胞表面受體蛋白。它是強(qiáng)烈拮抗劑并在體外抑制正常B細(xì)胞的CD40配體-介導(dǎo)的增殖，同時(shí)在體外抑制CD40配體-介導(dǎo)的NHL和CLL患者癌細(xì)胞增殖。表達(dá)CHIR-12.12抗體的雜交瘤細(xì)胞系153.8E2.D10.D6.12.12(CMCC弁12056)于2003/9/17由美國典型培養(yǎng)物保藏中心[ATCC;10801大學(xué)大道，馬納斯，弗吉尼亞20110-2209(美國)]以專利保存號PTA-5543保藏。不受理論局限，CHIR-12.12抗體是具有獨(dú)特特性組合的雙作用拮抗性抗-CD40中-克隆抗休。這種完全的人單克隆抗體阻斷B細(xì)胞存活和增殖所需的CD40L-介導(dǎo)的CD40信號傳導(dǎo)途徑；這種拮抗作用最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。CHIR-12.12還介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞的識別和結(jié)合，啟動依賴f抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。--ACHIR-12.12W效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合便釋放溶細(xì)胞酶類并導(dǎo)致B細(xì)胞凋亡和溶解。有關(guān)CHIR-12.12生物活性更加洋細(xì)的描述以及用來測定它們的試驗(yàn)可參見2003/ll/4、2003/ll/26和2004/4/27提交的并分別指定為美國專利申請?zhí)?0/517,337(代理人案巻號PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人案巻號PP20107.002(035784/271525))禾n60/565,710(代理人案巻號PP20107.003(035784/277214))的題為"血啤頻'W顛-CWO飾彥/owa/顛'W/e5"淑Ws./or7%>^W總貧俘貧-CDW卓克潑貧沐及幼"的臨時(shí)申請；以及2004/11/4提交并公布為WO2005/044854的同樣題為"J"togom'WJ""-O>/0Mo"oc/o""/湘"力(W^朋t/A/"力c7A/w7Tze,'r仏ef/才貧性拔-0^0卓^"摩拔伴及茲/'的國際爭利申請?zhí)朠CT/US2004/037152(代理人案巻號PP20107.004(035784/282916));它們各自的內(nèi)容通過引用全文納入本文。也可參見國際公布號WO2005/044304，WO2005/044305，WO2005/044306，WO2005/044855，WO2005/044307，和WO2005/044294;它們各自的內(nèi)容通過引用全文納入本文。也可參見以下申請中描述的試驗(yàn)題為/orW(3g"c^朋(i7ea加eWo//Vo啡ra"veZ^orc/ens"Mecfc&c/&CDW15^^//"^珍銜浙洽#0￡>^信號傳導(dǎo)介導(dǎo)游潛主絲疾瘋游方法/，的臨時(shí)申請，該申請于2005/12/9提交并指定為美國專利申請?zhí)?0〃49,285(代理人案巻號PP028035.0002(035784/304312))，以及2006/5/18提交并公布為WO2006/125143的相應(yīng)的國際專利申請?zhí)朠CT/US2006/019414(代理人案巻號PP028035.0003(035784/311611));和題為"W"/o^/or^tog"cw/;7>eame"fo/Z)/seasesZ/aWwga/^wto/mmwwea"oi/or/"/7a7n附fltoryCow/owew《i參斷禾口治療具有^身^疫^SV或炎性成分的疾病的方法)"的臨時(shí)申請，該申請于2005/12/9提交并指定為美國專利申請?zhí)?0/749,336(代理人案巻號PP028062.0002(035784/304311))，以及2006/5/18提交并公布為WO2006/125117的相應(yīng)的國際專利申請?zhí)朠CT/US2006/019325(代理人案巻號PP028062.0003(035784/311608));它們各自的內(nèi)容通過引用全文納入本文。CHIR-12.12的主要臨床應(yīng)用是治療B細(xì)胞相關(guān)的惡性腫瘤，包括慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)，多發(fā)性骨髓瘤(MM)，和非霍奇金淋巴瘤(NHL)，以及與表達(dá)CD40的細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性和/或炎性疾病。將用于臨床實(shí)驗(yàn)的CHIR-12.12藥物產(chǎn)品配制成20mg/mlCHIR-12.12抗體的液體制劑。進(jìn)行以下研究以確定在液體制劑中穩(wěn)定抗體的最佳緩沖劑、等滲劑和各種賦形劑。實(shí)施例1:各種緩沖劑種類和甲硫氨酸對于穩(wěn)定CHIR-12.12的作用溶液狀況(例如，pH、緩沖劑種類和離子強(qiáng)度)和賦形劑(例如，表面活性劑和穩(wěn)定劑)是液體制劑中蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。CHIR-12.12的理化穩(wěn)定性在pH5.5時(shí)最佳。然而，CHIR-12.12蛋白在不利的溶液條件下會通過聚集和片段化而降解；它也會被氧化，尤其是當(dāng)存在與原始賦形劑材料如吐溫一起引入的過氧化物雜質(zhì)和/或痕量金屬時(shí)。進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)以鑒定當(dāng)在最佳pH5.5配制時(shí)對于穩(wěn)定CHIR-12.12單克隆抗體以避免聚集、片段化和氧化的最佳緩沖劑種類和適合的賦形劑。材料用于該研究的CHIR-12.12藥品(DS)批次為CHO-衍生的純化原料，其批號為CD021105A和PD010705A。DS批次由Xoma有限公司(伯克利，力口州)制造。用各種緩沖劑溶液透析DS，然后摻加所需量的吐溫，以此制備用于該研究的制劑樣品。所有樣品中CHIR-12.12蛋白的濃度約為20mg/ml。59分析方法尉微鎌。通過SEC-HPLC以分子量降低的順序分離分子。因此，首先從HPLC柱上洗脫下CHIR-12.12聚集體，然后是單體，最后洗脫片段。通過WaterAllianceHPLC分析CHIR-12.12的純度、聚集和片段化，分析時(shí)采用TosohaasTSK-GEL3000SWx!柱，50mM磷酸鈉，200mMNaCl，pH7.0作為流動相，流速為0.7mL/分。郝板歸,微/QCHIR-12.12的氧化采用WatersAllianceHPLC系統(tǒng)測量，采用TosohTSK凝膠丁基-NPR柱，2M硫酸銨/20mMTris，pH7.0作為流動相A，20mMTris，pH7.0作為流動相B，流速為1.0ml/分。CHIR-12.12抗體用木瓜蛋白酶消化以產(chǎn)生Fab和Fc片段。CHIR-12.12的氧化產(chǎn)物是氧化的Fc片段(metSO)，該片段是在主要Fab種類和主要Fc種類之間從HPLC柱被洗脫的前-Fc種類。實(shí)驗(yàn)和結(jié)果微麟餅艦菜穀/7#虔眾游穩(wěn)定諸用含150mMNaCl，0.1%(w/v)吐溫80，pH5.5的10mM檸檬酸鹽、醋酸鹽、琥珀酸鹽或磷酸鹽緩沖液將DS批號為PD010705A的CHIR-12.12配制成20mg/ml。將1.2ml制劑樣品溶液裝入3cc玻璃瓶并在5"C、25'C和4(TC儲存。在指定的時(shí)間點(diǎn)通過SEC試驗(yàn)分析CHIR-12.12樣品的穩(wěn)定性。圖1-3分別顯示了對25'C儲存的樣品的純度、聚集體和片段進(jìn)行的SEC分析。圖4-6分別總結(jié)了4(TC儲存的樣品的純度、聚集體和片段的SEC分析。所有結(jié)果顯示，在所測試的4種制劑中基于檸檬酸鹽的制劑樣品保留了最高的純度、最低的聚集和片段化水平。盡管對于在5'C儲存5個(gè)月的樣品幾乎未檢測到變化(數(shù)據(jù)未顯示)，但升高的SEC數(shù)據(jù)預(yù)測，檸檬酸鹽緩沖劑在改善CHIR-12.12抵抗聚集和片段化的長期實(shí)時(shí)穩(wěn)定性方面有可能優(yōu)于其他三種常用緩沖劑類型。^微i餅艦C層-"."麟歸劍歸用檸檬酸鹽、醋酸鹽和琥珀酸鹽緩沖劑以及0.1%和0.2%(w/v)吐溫80制備CHIR-12.12穩(wěn)定性樣品。將樣品儲藏于5'C、25。C和4(TC并通過疏水相互作用層析(HIC)分析預(yù)定時(shí)間點(diǎn)的氧化。測定CHIR-12.12氧化產(chǎn)物中前-Fc峰種類總和的百分比，即前-Fc。/。。表1的結(jié)果顯示，基于檸檬酸鹽的制劑產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物少于琥珀酸鹽-和醋酸鹽-緩沖的制劑，說明檸檬酸鹽緩沖劑能使CHIR-12.12的氧化最小化。這些結(jié)果提示，檸檬酸可能作為螯合劑從而抑制痕量金屬誘導(dǎo)的CHIR-12.12蛋白氧化。SEC和HIC分析表明，檸檬酸鹽緩沖劑在保護(hù)CHIR-12.12免于聚集和片段化方面優(yōu)于琥珀酸鹽、醋酸鹽和磷酸鹽緩沖劑種類。檸檬酸鹽緩沖劑也優(yōu)于琥珀酸鹽和醋酸鹽緩沖劑，這是由于它能使CHIR-12.12蛋白的氧化最小化。表l.通過HIC試驗(yàn)測得的緩沖劑種類對CHIR-12.12(20mg/ml)氧化的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>*N/D，未檢測。丄-術(shù)賓艇C歷-"."纖眾鄉(xiāng)/鎖用10mM檸檬酸鈉/檸檬酸，150mMNaCl，0.1%吐溫80或吐溫20以及各種量(0-5mM)的L-甲硫氨酸將批號為CD021105A的DS配制成20mg/ml。將2.5ml制劑樣品裝入3cc樣品并在4(TC儲存。表2顯示了開始時(shí)和在4(TC儲存3個(gè)月時(shí)的樣品的HIC結(jié)果。開始時(shí)，所有制劑中CHIR-12.12的氧化程度與批號為CD021105A的最初原料藥品(DS)相當(dāng)。在4(TC儲存3個(gè)月后不含L-甲硫氨酸的制劑中氧化水平高出一倍以上。然而，含有L-甲硫氨酸的制劑在4(TC儲存3個(gè)月后的氧化水平幾乎沒變。結(jié)果表明，5mML-甲硫氨酸能有效而充分地防止高應(yīng)力儲存條件下CHIR-12.12的氧化。Lyc-肽圖證實(shí)了L-甲硫氨酸對CHIR-12.12的氧化抑制作用。表2.L-甲硫氨酸對CHIR-12.12氧化的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>*N/D，未檢測。總之，檸檬酸鹽緩沖劑能使CHIR-12.12的聚集、片段化和氧化最小化，因此是CHIR-12.12液體制劑的最佳緩沖劑。L-甲硫氨酸有效抑制CHIR-12.12的氧化，其中優(yōu)選5mML-甲硫氨酸。實(shí)施例2:精氨酸-HCl對CHIR-12.12的穩(wěn)定作用以下研究的目的是選擇配制成通過靜脈內(nèi)輸注給藥的液體藥物組合物的CHIR-12.12長期儲存穩(wěn)定性的等滲劑和穩(wěn)定劑。盡管NaCl是最經(jīng)常使用的腸胃外蛋白質(zhì)制品的等滲劑，但它對于抗體療法沒有最佳穩(wěn)定作用。該研究比較了氯化鈉和精氨酸的酸形式(精氨酸-HCl)對水性制劑中CHIR-12.12的穩(wěn)定作用。CHIR-12.12原料抗體藥品用pH5.5的檸檬酸鹽緩沖劑配制，采用150mMNaCl或150mML-精氨酸-HCl以使CHIR-12.12液體制劑達(dá)到295mOsm/kg的目標(biāo)摩爾滲透壓濃度。采用差示掃描量熱法(DSC)，尺寸排阻層析(SEC-HPLC)，SDS-PAGE，和陽離子交換HPLC(CIEX-HPLC)評價(jià)CHIR-12.12抗體的生物物理和/或生化穩(wěn)定性。研究證實(shí)，150mML-精氨酸-HCl不僅賦予CHIR-12.12水性制劑等滲性，而且能提高CHIR-12.12的構(gòu)象穩(wěn)定性以抵抗聚集、片段化和脫酰胺。經(jīng)證實(shí)，在加速穩(wěn)定條件下L-精氨酸-HCl優(yōu)于NaCl。此外，這種加速穩(wěn)定數(shù)據(jù)預(yù)測，CHIR-12.12L-精氨酸-HCl制劑有較長儲存期。材料用于該研究的CHIR-12.12藥品(DS)是CHO-衍生的純化原料，其批號為CD021105A。DS批次由Xoma有限公司(伯克利，加州)制造。該DS批次的CHIR-12.12被用于下述制劑制劑l:20mg/mlCHIR-12.12，10mM檸檬酸鈉/擰檬酸，150mMNaCl，0.1%吐溫80，pH5.5制劑2:20mg/mlCHIR-12.12，10mM檸檬酸鈉/檸檬酸，150mML-精氨酸-HCl，0.1%吐溫80，pH5.5分析方法差示械量微度)以rC/分鐘從15t:加熱至90'C后，采用MicroCalVP-DSC評價(jià)CHIR-12.12配方樣品的構(gòu)象穩(wěn)定性。ye卞纖鎌,-肌c)。通過WatersAllianceRPLC分析CHIR-12.12的純度、聚集和片段化，采用TSK-GEL3000SWxl柱，50mM鈉的磷酸鹽，200mMNaCl，pH7.0作為流動相，流速為0.7ml/分。皿觸￡卩凝微艦微)用12%Tris-甘氨酸凝膠在非還原和還原條件下評價(jià)CHIR-12.12的純度。蛋白質(zhì)通過考馬斯藍(lán)染色檢測。A齢孜換激(O^Y"-肌Q用WatersAllianceHPLC系統(tǒng)測量CHIR-12.12的電荷改變相關(guān)脫酰胺，使用DionexPropacWCX-10柱，50mMHEPES，pH7.3作為流動相A，含500mMNaCl的50mMHEPES，pH7.3作為流動相B,流速為0.8ml/分。以下是本文結(jié)果部分所提及的圖中縮寫的含義琥珀酸鹽，NaCl，0.1%TW80=10mM琥珀酸鈉/琥珀酸緩沖劑，150mMNaCl，0.1%吐溫80，pH5.5檸檬酸鹽，NaCl,0.1%Tw80=10mM檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖劑，150mMNaCl，0.1%吐溫80，pH5.5醋酸鹽，NaCl，0.1%Tw80=10mM醋酸鈉/醋酸緩沖劑，150mMNaCl，0.1%吐溫80,pH5.5Phos，NaCl，0.1%Tw80=10mM磷酸氫二鈉/磷酸鈉磷酸二氫鈉緩沖液，150mMNaCl，0.1%吐溫80，pH5.5擰檬酸鹽，Arg，0.1%Tw80=10mM檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖劑，150mML-精氨酸-HCl，0.1%吐溫80，pH5,5結(jié)果差示娜量艦,)圖7顯示了上文"材料"章節(jié)中所述兩種制劑中的CHIR12.12的DSC熱分析圖(theogram)。CHIR-12.12的熱解折疊顯示出至少兩個(gè)熱躍遷，可能分別代表了Fab和Fc結(jié)構(gòu)域的解折疊/解鏈。在較高溫度時(shí)，推測蛋白質(zhì)是聚集的，導(dǎo)致DSC信號喪失。該研究中，最低熱躍遷溫度被定義為解鏈溫度Tm。含L-精氨酸-HCl的制63劑顯示出的Tm高于含NaCl的制劑，說明L-精氨酸-HCl提供的CHIR-12.12構(gòu)象穩(wěn)定性高于NaCI提供的。犯C-朋丄C分析。在5'C存放6個(gè)月之后，SEC-HPLC檢測出含L-精氨酸-HCl的制劑和含NaCl的制劑中蛋白質(zhì)聚集體和片段的量可忽略(<0.5%),且這兩種制劑之間的穩(wěn)定性差異不明顯(數(shù)據(jù)未顯示)。在加速儲存條件下，即25t:儲存6個(gè)月，含L-精氨酸-HCl的制劑含有較高比例的單體，如圖8所示。隨著單體的消耗，聚集體和片段的含量隨儲存時(shí)間緩慢增加。然而，含L-精氨酸-HCl的制劑產(chǎn)生的聚集體和片段少于含NaCl的制劑，分別如圖9和10所示。類似地，當(dāng)在4(TC儲存時(shí)，相比含NaCl的制劑，含L-精氨酸-HCl的制劑顯示出較高比例的單體和較低比例的聚集體和片段，分別如圖ll、12和13所示。在4(TC儲存4個(gè)月后，含L-精氨酸-HCl的制劑仍舊含有91.8%單體，1.7%聚集體和6.5%片段，而含NaCl的制劑含有87.9%單體，2.2%聚集體和9.9%片段。SEC-HPLC結(jié)果證實(shí)，相比NaCl，L-精氨酸-HCl提高了CHIR-12.12蛋白的穩(wěn)定性。*還微艦微)表3為非還原(NR)和還原(R)條件下含L-精氨酸-HCl的制劑和含NaCl的制劑的SDS-PAGE分析結(jié)果。CHIR-12.12的純度通過非還原條件下主帶的百分比或還原條件下重鏈和輕鏈條帶之和的百分比來測量。除了0時(shí)刻，在非還原和還原條件下，含L-精氨酸-HCl的制劑的純度都高于含NaCl的制劑。SDS-PAGE的觀察結(jié)果與SEC-HPLC結(jié)果一致，說明L-精氨酸-HCl在提高CHIR-12.12穩(wěn)定性方面優(yōu)于NaCl。表3.通過SDS-PAGE分析比較L-精氨酸-HCl和NaCl<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>CIEX-HPLC基于電荷區(qū)分分子，因此酸性變體在主峰之前洗脫出來，而堿性變體在主峰之后洗脫出來。CHIR-12.12的純度及其脫酰胺產(chǎn)物的含量分別通過主峰的百分比和酸性變體的百分比來測量。圖14、15和16分別顯示了兩種制劑的純度、脫酰胺產(chǎn)物的含量和堿性變體的含量。在0時(shí)刻，兩種制劑的純度為68.6%，含15.5%脫酰胺產(chǎn)物以及15.9%堿性變體。當(dāng)在25'C儲存時(shí)，相比含NaCl的制劑，含L-精氨酸-HCl的制劑仍舊具有較高的純度和較高的堿性變體含量，并顯示較低的脫酰胺產(chǎn)物百分比。在25'C儲存6個(gè)月后，含L-精氨酸-HCl的制劑的純度為47.3%，含12.5%堿性變體，并產(chǎn)生了40.0%脫酰胺產(chǎn)物，而含NaCl的制劑的純度為45.6%，含11.7%堿性變體，和42.7%脫酰胺產(chǎn)物。盡管含L-精氨酸-HCl的制劑和含NaCl的制劑在5'C儲存6個(gè)月后顯示幾乎沒有變化，但在加速儲存條件(25")下獲得的CIEX-HPLC結(jié)果預(yù)測，在提高CHIR-12.12的長期實(shí)時(shí)穩(wěn)定性以抵抗脫酰胺方面，L-精氨酸-HCl可能優(yōu)于NaCl?？傊?，該研究證實(shí)，150mML-精氨酸-HCl不僅賦予CHIR-12.12液體制劑等滲性，而且能提高CHIR-12.12的構(gòu)象穩(wěn)定性以抵抗聚集、片段化和脫酰胺。在加速穩(wěn)定條件下L-精氨酸-HCl優(yōu)于NaCl，且加速穩(wěn)定數(shù)據(jù)進(jìn)一步預(yù)測，CHIR-12.12L-精氨酸-HCl制劑具有較長的儲存期。實(shí)施例3:吐溫80和吐溫20在使冷凍保存的CHIR-12.12原料藥品聚集最小化方面的作用要儲存幾個(gè)季度時(shí)，將CHIR-12.12原料藥品冷凍儲存要優(yōu)于液體儲存，其優(yōu)勢在于能提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性和儲存期、降低微生物生長、以及消除運(yùn)輸過程中產(chǎn)生泡沫。然而，冷凍和隨后的解凍會由于引入冰-液界面和溶質(zhì)濃度梯度而在蛋白質(zhì)溶液中誘導(dǎo)產(chǎn)生應(yīng)力。這種應(yīng)力會使蛋白質(zhì)變性并導(dǎo)致聚集，在更壞的情況下，形成可見的顆?；虺恋怼５鞍踪|(zhì)聚集通常與藥物功效降低和免疫原性提高相關(guān)，因此通過優(yōu)化蛋白質(zhì)制劑主峰和凍融條件以使聚集最小化是非常關(guān)鍵的。制劑賦形劑，如糖類、多元醇、氨基酸和表面活性劑可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)和抗體防止聚集。在一項(xiàng)單克隆抗體研究中，發(fā)現(xiàn)一些通常使用的糖類、多元醇和氨基酸比表面活性劑能更有效地減輕凍融引發(fā)的聚集。然而，對CHIR-12.12的早期研究顯示，單獨(dú)使用糖(例如，海藻糖)、多元醇(例如，山梨醇)或氨基酸(如甘氨酸)不能顯著降低冷凍和解凍期間CHIR-12.12的聚集。該研究關(guān)注的是能使冷凍和解凍期間CHIR-12.12的聚集最小化的配制方法。在這種方式中，評價(jià)了各種表面活性劑以最小化凍融誘導(dǎo)的CHIR-12.12的聚集。盡管實(shí)際上冷凍的CHIR-12.12藥品不可能經(jīng)歷如該研究所評價(jià)的多次凍融循環(huán)，但密集凍融應(yīng)力研究是用來預(yù)測如果在長期儲存和運(yùn)輸期間不經(jīng)意發(fā)生多次冷凍和解凍配制的原料藥聚集的可能性的最壞情況假想研究。材料該研究采用批號為UA787(KTC23-2、UB1291、PD010705A和CD083005A的CHIR-12.12原料DS。吐溫80、吐溫20、Brij35和PluronicF68分別購自西格瑪公司(Sigma)、貝克公司(J.T.Baker)、AA公司(AlfaAesar)和MTC公司(MediaTechCellgro)。用于冷凍儲存CHIR-12.12藥品的聚碳酸酯(PC)藥瓶購自奈爾基因公司(Nalgene)。方法除了對照樣品，所有其他樣品在-2(TC或-6(TC完全冷凍，然后在室溫完全解凍，如此進(jìn)行多個(gè)循環(huán)。采用三種分析方法來檢測從單體到可見聚集體的CHIR-12.12蛋白。Tyndal光(MW科技有限公司(M.W.Technologies,Inc,))下目測來檢測可見顆粒。利用液體顆粒計(jì)數(shù)系統(tǒng)(HIAC/Royco)計(jì)算210pm和^25pm的亞可見聚集體的數(shù)目。利用動態(tài)光散射分析儀(MalvernNanoSeries)測定單體和聚集體的流體力學(xué)半徑以及粒度分布。^"孺控伊份用于凍融研究的樣品從批號為UA7870和TC23-2的CHIR-12.12藥品制備。所有樣品用10mM檸檬酸鈉/檸檬酸，150mMNaCl，和pH5.5緩沖液通過透析配制，然后加入各種百分比(0-0.5%w/v)的以下非離子型表面活性劑中的一種吐溫80，吐溫20，Brij35，和PluronicF68。將2.5ml各樣品裝入玻璃瓶，在-60。C冷凍過夜，然后在室溫充分解凍，最多8個(gè)循環(huán)。目測最初時(shí)刻(O時(shí)刻)和每次凍融循環(huán)之后的樣品的澄清度和可見沉淀/聚集體。f確麟維將批號為UB1291和PD010705A的CHIR-12.12藥品配制成溶液(20mg/mlCHIR-12.12，10mM擰檬酸鈉/擰檬酸，150mMNaCl，pH5.5)，然后加入0-0.5%(w/v)吐溫80或吐溫20。將20-ml等分制劑樣品裝入125cc聚碳酸酯藥瓶，然后在-60X:冷凍并在室溫解凍。5個(gè)凍融循環(huán)之后，用HIAC-Royco液體顆粒計(jì)數(shù)系統(tǒng)測量樣品中210nm和225pm的亞可視聚集體。動絲教射藩在進(jìn)行5輪凍融之前和之后用動態(tài)光散射分析儀評價(jià)制劑(20mg/mlCHIR-12.12，10mM檸檬酸鈉/擰檬酸，150mML-精氨酸-HCl，5mML-甲硫氨酸，0-0.2%吐溫20，pH5.5)中的聚集體。動態(tài)光散射(DLS)分光術(shù)采用Stokes-Einstein方程并假設(shè)顆粒呈球形從測得的顆粒擴(kuò)散系數(shù)計(jì)算包括單體和聚集體在內(nèi)的顆粒的流體力學(xué)直徑。通過DLS研究還獲得了聚集體種類的數(shù)目和多分散性。結(jié)果表4總結(jié)了目測觀察的結(jié)果。在開始凍融循環(huán)之前的O時(shí)刻，所有樣品輕微發(fā)白，沒有可視聚集體/沉淀。1次凍融循環(huán)之后，未添加任何表面活性劑的所有制劑，含有0-0.05%(w/v)吐溫80的制劑和含有0-0.1%(w/v)Brij35的制劑以及含有0-0.5%(w/v)PluronicF68的樣品中都形成少數(shù)可視聚集體/沉淀。含有0.05%-0.5%(w/v)吐溫20的樣品在8輪凍融之后未顯示任何聚集體或沉淀。這說明吐溫20在防止多輪凍融循環(huán)后形成不可溶的大聚集體方面比吐溫80更加有效。Brij35和PluronicF68遠(yuǎn)不如吐溫80和吐溫20有效。表4.含有各種濃度表面活性劑的檸檬酸鹽緩沖制劑中CHIR-12.12的外觀<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>表6顯示了每毫升含或不含吐溫20的檸檬酸鹽/檸檬酸緩沖制劑中亞可視顆粒的數(shù)目。在制劑中加入吐溫20大大降低了聚集體的數(shù)目。當(dāng)吐溫20為0.05%(w/v)或更高時(shí)，亞可視聚集體數(shù)目的降低幾乎達(dá)到平臺，說明使用吐溫20的合適濃度為0.05-0.2%(w/v)。表6.含20mg/mlCHIR-12.12，10mM擰檬酸鈉/檸檬酸，150mMNaCl以及各種濃度(0-0.2%w/v)吐溫80，pH5.5的制劑中亞可視顆粒的數(shù)目<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>此外，表5和表6顯示，含吐溫80和吐溫20的制劑都產(chǎn)生非常少量的225pm的聚集體，而在5輪凍融之后，含吐溫20的制劑產(chǎn)生的^10pm的聚集體比含吐溫80的制劑更少。該結(jié)果說明，吐溫20在使CHIR-12.12檸檬酸鹽/檸檬酸緩沖制劑中亞可視聚集體形成最小化方面比吐溫80更加有效?；诒?、5和6的結(jié)果，在最小化CHIR-12.12制劑中形成聚集體方面，吐溫-20是比吐溫80優(yōu)選的賦形劑。因此，進(jìn)行了額外的研究以進(jìn)一步優(yōu)化消除CHIR-12.12制劑中形成聚集體所需的吐溫-20的濃度。從批號為CD083005A的CHIR-12.12藥品制備制劑(20mg/mlCHIR-12.12，10mM檸檬酸鈉/檸檬酸，150mML-精氨酸-HCl，5mML-甲硫氨酸，0-0.2%吐溫20，pH5.5)。將20ml制劑樣品裝入125cc聚碳酸酯藥瓶，在-20'C冷凍并室溫解凍。5輪凍融循環(huán)之前和之后，用HIAC-Royco液體顆粒記數(shù)儀測量制劑樣品中亞可視顆粒的數(shù)目。結(jié)果總結(jié)于表7。表7.含20mg/mlCHIR-12.12，10mM檸檬酸鈉/擰檬酸，150mML-精氨酸-HCl，5mML-甲硫氨酸，0-0.2%吐溫20，pH5.5的制劑中亞可視顆粒的數(shù)目吐溫20的濃度(w/v)顆粒數(shù)/ml^10pm顆粒數(shù)/ml225pmFT之前5XFT之后舉FT之前5XFT之后0%吐溫202316970.005%吐溫20424020.025%吐溫206110.05%吐溫2029010.1%吐溫2067110.2%吐溫20106415*縮寫含義XFT=凍融循環(huán)數(shù)5輪凍融之后，含L-精氨酸-HCl和L-甲硫氨酸的樣品產(chǎn)生的聚集體遠(yuǎn)小于不含L-精氨酸-HCl和L-甲硫氨酸的制劑，S卩，不含吐溫20時(shí)為169顆粒/ml^l0nm對比1439或1671顆粒/ml^10pm(參見，表6和7)。然而，直到加入吐溫20，L-精氨酸-HCl和L-甲硫氨酸未顯著降低凍融誘導(dǎo)的聚集體至最低水平。這說明L-精氨酸-HCl和L-甲硫氨酸在使凍融誘導(dǎo)的CHIR-12.12聚集最小化方面不十分有效。由表5-7中總結(jié)的數(shù)據(jù)可見，經(jīng)凍融處理的含0.025-0.P/。(w/v)吐溫20的樣品中亞可視聚集體數(shù)目與凍融循環(huán)之前的各樣品仍舊相當(dāng)。這說明含吐溫20與L-精氨酸-HCl和L-甲硫氨酸組合的制劑產(chǎn)生了最少的亞可視聚集體。因此，吐溫20是能有效使凍融期間CHIR-12.12產(chǎn)生亞可視聚集體最小化的制劑賦形劑。測定吐溫20的有效濃度為0.025-0.1%(w/v)。69樣絲教浙分析表8顯示了顆粒的平均流體力學(xué)直徑、多分散性、以及CHIR-12.12單體種類的百分強(qiáng)度。動態(tài)光散射分析僅檢測5輪凍融前后所有樣品中的單體種類，如表所示為100%強(qiáng)度單體種類。這說明所有樣品主要由單體構(gòu)成。5輪凍融研究之后，不含吐溫20和含0.005%(w/v)吐溫20的樣品中可能有少數(shù)聚集體(可能是二聚體或三聚體)與單體共存，如流體力學(xué)直徑和多分散性提高所示。含0.025-0.1%(w/v)吐溫20的樣品顯示流體力學(xué)直徑和多分散性值有輕微改變，表面它們保留了之前的單體水平而沒有明顯的聚集體形成。表8.5輪凍融前后含20mg/mlCHIR-12.12，10mM檸檬酸鈉/檸檬酸，150mML-精氨酸-HCl，5mML-甲硫氨酸，和各種濃度(0-0.2%)吐溫20，pH5.5的制劑中CHIR-12.12的動態(tài)光散射分析吐溫20的濃度(w/v)平均流體力學(xué)直徑(mm)多分散性單體種類的強(qiáng)度％FT之前*5XFT之后*FT之前5XFT之后FT之前5XFT之后0%吐溫2012.212.40.0470.055畫.O100.00.005%吐溫2012.212.40,0450.045100.0100.00.025%吐溫2012.312.40.0350.034畫.o100.00.05%吐溫2012.312,20.0350.031畫.o100,00.1%吐溫2012.412.40.0350.039100.0100.00.2%吐溫2012,312.20.0360.043100,0100.0*縮寫含義FT=凍融；XFT=凍融循環(huán)數(shù)基于目測、亞可視顆粒計(jì)數(shù)和動態(tài)光散射分析，就使凍融誘導(dǎo)的CHIR-12.12聚集最小化而言，確定吐溫20的最佳濃度為0.025-0.1%(w/v)?？傊l(fā)現(xiàn)吐溫20和吐溫80能使凍融期間的CHIR-12.12聚集最小化。吐溫20和吐溫80的最佳濃度分別為0.025-0.1%(w/v)和0.1-0.2(w/v)%。吐溫20比吐溫80更加有效，因?yàn)檩^低濃度的吐溫20能將聚集體形成的數(shù)目和程度降至降低水平。該研究證實(shí)，加入最佳濃度的吐溫，優(yōu)選與L-精氨酸-HCl和L-甲硫氨酸組合加入，能在-20。C或以下儲存擰檬酸鹽/檸檬酸緩沖的CHIR-12.12原料藥品而沒有顯著聚集。實(shí)施例4:測定抗-CD40抗體的拮抗活性用以下試驗(yàn)來評價(jià)抗-CD40抗體的拮抗活性?？赏ㄟ^，例如，從獲自接受扁桃體切除術(shù)個(gè)體的扁桃體分離獲得用于這些試驗(yàn)的人B細(xì)胞，該過程基本描述于De70Groot等(1990)Z^w;/zoyb'"e/ewfln^(1990)9:321。簡言之，用解剖刀分散組織，用5mML-亮氨酸甲酯處理以除去吞噬細(xì)胞和NK細(xì)胞，并用2-氨乙基異硫代溴化脲(2-aminoethylisothiouroniumbromide)處理的綿羊紅細(xì)胞(SRBC)進(jìn)行一輪花結(jié)形成(rosetting)以除去T細(xì)胞。可通過佛羅里達(dá)州海爾勒阿市考特克隆公司的抗-(CD20)mAbBl(CoulterClone，Hialeah，F(xiàn)A)或新澤西州拉里坦市澳索公司的抗-(CD3)mAbOKT3(Ortho，Raritan，NJ)以及FITC-偶聯(lián)的兔抗-(小鼠Ig)的F(ab，)2片段(扎邁得公司(Zymed)，舊金山，力B州)直接免疫熒光標(biāo)記和FACS分析檢測所得B淋巴細(xì)胞制品的純度。B細(xì)胞增殖試驗(yàn)。在96孔平底微滴定板中用添加有10%胎牛血清的200plIMDM培養(yǎng)B細(xì)胞(每孑L4xl04)。加入固定的抗-(IgM)抗體(免疫珠(Immunobead);5叫/ml;拜爾萊得公司(BioRad)，里士滿(Richmond)，力t]州)以刺激B細(xì)胞。需要時(shí)加入100u/ml重組IL-2。在微量培養(yǎng)開始時(shí)加入各種濃度的待測單克隆抗體(mAb)，并在第3天通過測量18小時(shí)脈沖后^H)-胸腺嘧啶的摻入來評價(jià)增殖。當(dāng)存在固定的抗-IgM或存在固定的抗-IgM和IL-2時(shí)，拮抗性抗-CD40抗體不會顯著共刺激人B細(xì)胞增殖。5朋c/^eaw-摔5浙應(yīng)潛遭試驗(yàn)為檢測抗-CD40單克隆抗體剌激B細(xì)胞增殖的能力，在類似于Banchereau等(1991)Sc/ewce(1991)251:70所述的培養(yǎng)系統(tǒng)中使用表達(dá)人FcyRIIHR等位基因形成的小鼠3T6轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在存在lxl(^轉(zhuǎn)染細(xì)胞(用5000拉德照射)時(shí)，在平底微孔中用添加了10%胎牛血清和100u/ml重組IL-4的200plIMDM中培養(yǎng)B細(xì)胞(每孔2x104)。加入B細(xì)胞之前，使3T6細(xì)胞附于培養(yǎng)塑料(cultureplastic)至少5小時(shí)。加入從15ng/ml到2000ng/ml各種濃度的抗-CD40mAb，并在第7天用[3司胸腺嘧啶脈沖18小時(shí)后通過測量胸腺嘧啶摻入來估算B細(xì)胞的增殖。鵬拔性拔-C舗鄉(xiāng)S2C6-微游5潘層遭還采用上述B細(xì)胞增殖試驗(yàn)通過拮抗性抗-CD40單克隆抗體(mAb)抑制抗-CD40抗體如S2C6(也稱為SGN-14，據(jù)報(bào)道它是CD40刺激B細(xì)胞增殖的激動劑；Francisco等(2000)Ca"ceri"60:3225-3231)刺激B細(xì)胞增殖的能力對它們進(jìn)行了表征。在存在與瓊脂糖珠偶聯(lián)的抗-IgM(5嗎/ml)和抗-CD40mAbS2C6(1.25嗎/ml)時(shí)，在微孔中用200^培養(yǎng)基中培養(yǎng)人扁桃體B細(xì)胞(每孔4x104)。加入各種濃度的感興趣的抗-CD40mAb，3天后評價(jià)[3司-胸腺嘧啶摻入。以類似濃度加入抗-(葡糖腦苷脂酶)mAb8E4作為對照。Barneveld等(1983)￡欲/說'oc/ze附.134:585。拮抗性抗-CD40抗體可抑制mAbS2C6對抗-IgM誘導(dǎo)的人B細(xì)胞增殖的共刺激，例如，抑制至少75%或者更多(艮卩，存在拮抗性抗-CD40抗體時(shí)，S2C6-刺激的增殖不超過不存在拮抗性抗-CD40抗體時(shí)觀察到的增殖的25n/。)。相反，用等量的針對p-葡糖腦苷脂酶的非相關(guān)mAb8E4未見顯著抑制。Barneveld等，同上。這種結(jié)果說明，抗-CD40mAb不遞送人B細(xì)胞增殖的刺激信號，相反，能夠抑制其他mAb觸發(fā)CD40而產(chǎn)生的刺激信號。^五Z^55潘應(yīng)遂/f游S潘應(yīng)活眾試凝Zubler等(1985)//mmw"o/.(1985)134:3662觀察到，小鼠胸腺瘤EL-4系的突變型亞克隆，稱為EL4B5，在體外能夠強(qiáng)烈刺激鼠源和人源B細(xì)胞增殖和分化成分泌免疫球蛋白的血漿細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)這種活化作用不依賴于抗原，并不受MHC限制。為優(yōu)化人B細(xì)胞刺激，需要存在來自活化的人T細(xì)胞的上清液，但當(dāng)用佛波醇-12-肉豆蔻酸13-醋酸酯(PMA)或IL-1預(yù)活化EL4B5細(xì)胞時(shí)還會發(fā)生B細(xì)胞應(yīng)答。Zubler等(1987)/mmw"o/og/ca/WeWews99:281;和Zhang等(19卯)J/mmM"o/.144:2955。該培養(yǎng)系統(tǒng)中的B細(xì)胞活化是充足的一有限稀釋試驗(yàn)顯示，大多數(shù)人B細(xì)胞被活化以增殖或分化成分泌抗體的細(xì)胞。Wen等(1987)￡w/mmwo/.17:887。將B細(xì)胞(每孔1000)與經(jīng)照射的(5000拉德)EL4B5細(xì)胞(每孔5x104)—起在平底微滴定板中用添加有10%熱滅活胎牛血清、5ng/ml佛波醇-12-肉豆蔻酸13-醋酸酯(Sigma)和5。/。人T細(xì)胞上清液的20()HlIMDM培養(yǎng)。培養(yǎng)開始時(shí)加入不同濃度的mAb，用[3印-胸腺嘧啶脈沖18小時(shí)后評價(jià)胸腺嘧啶摻入。為制備T細(xì)胞上清液，在存在1pg/mlPHA和10ng/mlPMA時(shí)以106/ml密度將純化的T細(xì)胞培養(yǎng)36小時(shí)。Wen等(1987)&//畫畫/.(1987)17:887。通過細(xì)胞離心獲得T細(xì)胞上清液并儲存于-20'C。檢測了T細(xì)胞上清液增強(qiáng)EL4B5-B細(xì)胞培養(yǎng)物中人B細(xì)胞增殖的功效并收集最有效的上清液用于實(shí)驗(yàn)。當(dāng)評價(jià)抗-CD40抗體對EL4B5誘導(dǎo)的人B細(xì)胞增殖的作用時(shí)，可加入單克隆抗體如M0PC-141(IgG2b)作為對照。拮抗性抗-CD40抗體能夠抑制EL4B5細(xì)胞系刺激的B細(xì)胞增殖，例如，抑制至少75%或更高(即，存在拮抗性抗-CD40抗體時(shí)EL4B5誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖不超過不存在拮抗性抗-CD40抗體時(shí)觀察到的值的25%)。相反，對照抗體如M0PC-141對于EL4B5誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖沒有顯著影響。72丑潘應(yīng)產(chǎn)鋪鄉(xiāng)乂r薪勵(lì)鍾微拮抗性抗-CD40抗體可作為B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白的拮抗劑。在T輔助細(xì)胞試驗(yàn)中，可通過評價(jià)抗體抑制B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白的能力來檢測抗-CD40抗體的這種拮抗活性，其中所述B細(xì)胞已經(jīng)用活化的T細(xì)胞以依賴于接觸的方式刺激過。在這種方式中，用1:500稀釋的抗-CD3mAbCLB-T3/3腹水液(CLB，阿姆斯特丹，荷蘭)涂布96孔組織培養(yǎng)板。按照指示加入共刺激mAb:抗CD2mAbCLB-T11.1/1和CLB-T11.2/1(CLB，阿姆斯特丹，荷蘭)，1:1000腹水和抗-CD28mAbCLB-28/1(CLB，阿姆斯特丹，荷蘭)二者。隨后加入扁桃體T細(xì)胞(經(jīng)照射，3000拉德；105每孔)，扁桃體B細(xì)胞(104每孔)，和rlL-2(20LVml)。各細(xì)胞培養(yǎng)物的終體積為200^1。8天后離心細(xì)胞，收獲不含細(xì)胞的上清液。如下所述通過ELISA10異、々布不芊M干加卞乂、ig丄vi々UlgJtf、JMX/爻。在一個(gè)實(shí)施方式中，將人扁桃體B細(xì)胞(10"L)與經(jīng)照射的純化T細(xì)胞(3000拉德，109孔)一起在用抗-CD3mAb涂布的96孔板中培養(yǎng)，各孔中含或不含不同mAb以共刺激T細(xì)胞。培養(yǎng)8天后收獲上清液以測定B細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白。通過下述ELISA試驗(yàn)測定B細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白。培養(yǎng)開始時(shí)加入各種濃度的感興趣抗-CD40抗體?？杉尤雖AbM0PC-141作為對照。拮抗性抗-CD40抗體可以抑制人T細(xì)胞刺激的B細(xì)胞產(chǎn)生IgG和IgM抗體達(dá)至少50%或更高(即，存在拮抗性抗-CD40抗體時(shí)的T細(xì)胞誘導(dǎo)的B細(xì)胞產(chǎn)生抗體不超過不存在拮抗性抗-CD40抗體時(shí)的觀察值的50%)。相反，對照抗體如M0PC-141對于T細(xì)胞誘導(dǎo)的B細(xì)胞產(chǎn)生抗體沒有顯著影響。錢激定免棘節(jié)游五麗試驗(yàn)通過ELISA估算人IgM和IgG的濃度。96孔ELISA平板用0.05M碳酸鹽緩沖液(pH=9.6)配制的4嗎/ml小鼠抗-人IgGmAbMH16-01(CLB，阿姆斯特丹，荷蘭)或1.2嗎/ml小鼠抗-人IgMmAb4102(Tago，伯林蓋姆(Burlingame)，力口州)涂布，4。C培育16小時(shí)。平板用PBS-0.05。/。吐溫-20(PBS-吐溫)洗滌3次并用BSA飽和1小時(shí)。2次洗滌后將平板與測試樣品的不同稀釋液一起在37"C培育1小時(shí)。3次洗滌后與1pg/ml過氧化物酶標(biāo)記的小鼠抗-h人IgGmAbMH16-01(CLB)或小鼠抗-人IgMmAbMH15-01(CLB)—起在37'C培育1小時(shí)以檢測結(jié)合的Ig。將平板洗滌4次并加入O-苯二胺作為底物以顯示結(jié)合的過氧化物酶的活性。利用人標(biāo)準(zhǔn)血清(HOO,CLB)建立各試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。冠詞"一個(gè)"在文中表示一個(gè)或多個(gè)(即，至少一個(gè))該冠詞的邏輯主語。例如，"一個(gè)元件"是指一個(gè)或多個(gè)元件。說明書中述及的所有出版物和專利申請表明本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。如同每篇單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾執(zhí)囟ㄇ要?dú)立地用作參考一樣，所有出版物和專利申請納入本文作為參考。盡管出于透徹理解的目的己經(jīng)通過舉例和實(shí)施例在一定程度上詳細(xì)描述了上述發(fā)明，但顯然，在附加權(quán)利要求的范圍之內(nèi)可采取一定的變化和修飾。申諾人或代理人國際中請?zhí)枡n案號PP028228.0002(325Q23)PCT7US2007/關(guān)于微生物或其他生物材料保藏的說明(PCT細(xì)則13.2)A對說明書第40貞第5行所述的已保藏的微生物或其.他生物材料的說叫B.保藏事項(xiàng)Mi多的保藏丫l附加"說叨保藏申.位名稱^國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏申位地址f3/^//^^薪/^//7/^》;)10801人學(xué)人道馬納斯，弗吉尼亞州2011O2209美國保藏M期2003/9/17登錄".PTA-5542C.補(bǔ)充說明(必,〃力史多仏'息/i附加似中□第40化第5行;第41貞，第2":D.本說明是為下列指定國作出的(勿榮說鄉(xiāng)/、^為,#恭.定//必/力','/〃補(bǔ)充說明f必,》刃下列說明將隨后向閨際局提供(^￥///說效/^^^"伊《勿，"^^/^薪(/-"由受理局填S□本似'己經(jīng)和閨際申沾一起收到授權(quán)官'力'由閨際局培'4'[□閨I;小局收到本;UIl期:授權(quán)官員PCT/RO/134表(1998/7)75申諾人或代理人國際申請?zhí)枡n案號PP028228.0002(325023)PCT/US2007/關(guān)于微生物或其他生物材料保藏的說明(PCT細(xì)則13.2)A對說叨書第40貞第5行所述的己保藏的微生物或其他生物材料的說叨B.保藏事項(xiàng)史多的保藏在附加頁說叨保藏申.位名稱熒國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏中.位地址(^舒/銀歡編《與////>7》)10801人學(xué)人道馬納斯，弗吉尼亞州2011O2209美國保藏U期2003/9/17登錄UPTA-5543C.補(bǔ)充說明f必姿'/^史多仿息在附加頁中□第40頁，第5行；第41頁，第2行；第67頁，第17行D.本說明是為下列指定國作出的(*菜說//^、屋力屏《恭定保幼,,'//)E.補(bǔ)充說明〖^麥助F列說叫將隨G向閨際局提供rw/,'說w游類:W,你.勿，"汰廯游編(/"由受理局填寫□本頁己經(jīng)和國際申請一起收到授權(quán)官員由國際局填s□國際局收到本貞H期:授權(quán)官員PCTZRO/134衣(1998Z7)76ATCC_10801大學(xué)大道馬納斯，弗吉尼亞20110-2209;電話700-065-2700;傳真703-365-2745;國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約國際表依照第7.3條頒布的原始保存物的保存證明和依照第10條頒布的存活性證明至(交存人成代理人姓名成地址)希龍公司代理人KVNoto4560Horton人街艾.突利維爾，加州94608代表希龍公司保藏交存人給的分類^:專利保藏弓小鼠雜交瘤131.2F8.5.9:CMCC#12047PTA-5542小鼠雜交瘤153.8E2.D10.D6.12.12:CMCC#12056PTA-5543保藏物伴冇科學(xué)描述；給山的以上分類描述。保藏物由本國際保藏單位丁-2003年9月17曰收到并接受。根據(jù)你方要求X我們通知你方要求保藏菌株30年如果簽署布達(dá)佩斯條約的專利局證實(shí)某人接收的權(quán)利，成者如果弓I用該菌株的美國專利授權(quán)，并且ATCC收到美國專利和商標(biāo)局成教存人的指令來發(fā)放所述菌株，則該齒株對公眾可用。如果在保藏的有效時(shí)期內(nèi)培養(yǎng)物死亡或破壞，你方應(yīng)用相同的活培養(yǎng)物替換它們。該齒株將O保藏之日起維持至少30年，成需耍最新的樣品，無論哪個(gè)更K。關(guān)國和許多其它國家簽署了布達(dá)佩斯條約。上述培養(yǎng)物的活性T2003年9月23日測試。在該日，培養(yǎng)物是存活的。國家保藏單位美國典型培養(yǎng)物保藏中心，馬納斯，弗吉尼亞20110-2209美國。冇權(quán)代表ATCC者的簽名V^力",!/^y"_口期2003什:10月2[〕馮利>1哈単斯(MarieHarris),專利專員，ATCC專利保藏CC:利莎亞歷山大(LisaAlexander)Ref:審理或案件號P20107.00權(quán)利要求1.一種穩(wěn)定的液體藥物組合物，其包含a)拮抗性抗-CD40單克隆抗體作為治療或預(yù)防活性組分，其中，所述單克隆抗體能夠特異性結(jié)合人B細(xì)胞表面表達(dá)的人CD40抗原，所述單克隆抗體當(dāng)與所述B細(xì)胞表面表達(dá)的CD40抗原結(jié)合時(shí)無明顯激動活性；b)含量足以使所述組合物接近等滲的酸形式精氨酸(精氨酸-HCl)；和c)維持所述組合物的pH在約pH5.0和約pH7.0之間的緩沖劑，其中，所述緩沖劑是檸檬酸鹽/檸檬酸緩沖劑。2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物的摩爾滲透壓濃度為約240mmol/kg至約360mmol/kg。3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述緩沖劑的濃度為約5mM至約100mM。4.如權(quán)利要求3所述的組合物,其特征在于，所述緩沖劑的濃度為約5mM至約20mM。5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，所述緩沖劑的濃度為約10m!VL6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述緩沖劑是檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖劑。7.如權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于，所述組合物的pH為約pH8.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含的精氨酸-HC1的濃度為約50mM至約200mM。9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含的精氨酸-HC1的濃度為約100mM至約175mM。10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含的精氨酸-HC1的濃度為約150mM。11.如權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，所述緩沖劑的濃度為約5mM至約20mM。12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，所述緩沖劑是檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖劑，且其中所述緩沖劑的濃度為約10mM，所述組合物的pH為約pH5.5。13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含的精氨酸-HC1的濃度為約150mM。14.如權(quán)利要求1所述的組合物，還包含表面活性劑。15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述表面活性劑是聚山梨酸酯20。16.如權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，所述表面活性劑是聚山梨酸酯20，其濃度為約0.001%至約1.0%(w/v)。17.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含聚山梨酸酯20，其濃度為約0.025%至約0.1%(w/v)。18.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求14所述的組合物，還包含甲硫氨酸，其含量足以抑制所述組合物儲存期間所述抗-CD40單克隆抗體中至少一種可氧化的氨基酸殘基的氧化。19.如權(quán)利要求18所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含甲硫氨酸，其濃度為約0.5mM至約20.0mM。20.如權(quán)利要求19所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含甲硫氨酸，其濃度為約1.0mM至約20.0mM。21.如權(quán)利要求20所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含甲硫氨酸，其濃度為約5.0mM。22.如權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述拮抗性抗-CD40單克隆抗體選自下組a)單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12;b)由雜交瘤細(xì)胞系5.9或12.12產(chǎn)生的單克隆抗體；c)包含選自下組的氨基酸序列的單克隆抗體SEQIDNO:6所示序列，SEQIDNO:7所示序列，SEQIDNO:8所示序列，SEQIDNO:6和SEQIDNO:7所示的序列，以及SEQIDNO:6和SEQIDNO:8所示的序列；d)包含選自下組的氨基酸序列的單克隆抗體SEQIDNO:2所示序列，SEQIDNO:4所示序列，SEQIDNO:5所示序列，SEQIDNO:2和SEQIDNO:4所示的序列，以及SEQIDNO:2和SEQIDNO:5所示的序列；e)具有由包含選自下組的核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體SEQIDNO:1所示序列，SEQIDNO:3所示序列，以及SEQIDNO:1和SEQIDNO:3所示的序列；f)與能夠結(jié)合雜交瘤細(xì)胞系5.9或12.12產(chǎn)生的單克隆抗體的表位結(jié)合的單克隆抗體；g)與包含SEQIDNO:10或SEQIDNO:12所示人CD40序列的殘基82-87的表位結(jié)合的單克隆抗體；h)與包含SEQIDNO:10或SEQIDNO:12所示人CD40序列的殘基82-89的表位結(jié)合的單克隆抗體；i)在競爭性結(jié)合試驗(yàn)中與單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；j)上述項(xiàng)目a)所述的單克隆抗體或上述項(xiàng)目c)-i)中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體，其中，所述抗體是重組產(chǎn)生；和k)作為上述項(xiàng)目a)-j)中任一項(xiàng)所述單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中，所述片段保留了特異性結(jié)合所述人CD40抗原的能力。23.如權(quán)利要求22所述的組合物，其特征在于，所述片段選自下組Fab片段，F(xiàn)(ab')2片段，F(xiàn)v片段，以及單鏈Fv片段。24.如權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述拮抗性抗-CD40單克隆抗體在所述組合物中的濃度為約0.1mg/ml至約50.0mg/ml。25.如權(quán)利要求24所述的組合物，其特征在于，所述拮抗性抗-CD40單克隆抗體在所述組合物中的濃度為約1.0mg/ml至約35.0mg/ml。26.如權(quán)利要求25所述的組合物，其特征在于，所述拮抗性抗-CD40單克隆抗體在所述組合物中的濃度為約10.0mg/ml至約35.0mg/ml。27.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物在約2。C至約8°C的溫度下能穩(wěn)定至少18個(gè)月。28.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物在約25°C能穩(wěn)定至少3個(gè)月。29.—種穩(wěn)定的液體藥物組合物，該組合物包含拮抗性抗-CD40單克隆抗體作為治療或預(yù)防活性組分，濃度為約50mM至約200mM酸形式的精氨酸(精氨酸-HCl)，以及維持所述組合物的pH在約pH5.0和約pH7.0之間的緩沖劑，其中所述緩沖劑是檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖劑，其濃度為約5mM至約20mM，其中所述拮抗性抗-CD40單克隆抗體選自下組a)單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12;b)由雜交瘤細(xì)胞系5.9或12.12產(chǎn)生的單克隆抗體；c)包含選自下組的氨基酸序列的單克隆抗體SEQIDN0:6所示序列，SEQIDNO:7所示序列，SEQIDNO:8所示序列，SEQIDNO:6和SEQIDNO:7所示的序列，以及SEQIDNO:6和SEQIDNO:8所示的序列；d)包含選自下組的氨基酸序列的單克隆抗體SEQIDNO:2所示序列，SEQIDNO:4所示序列，SEQIDNO:5所示序列，SEQIDNO:2和SEQIDNO:4所示的序列，以及SEQIDNO:2和SEQIDNO:5所示的序列；e)具有由包含選自下組的核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體SEQIDNO:l所示序列，SEQIDNO:3所示序列，以及SEQIDNO:l和SEQIDNO:3所示的序列；f)與能夠結(jié)合雜交瘤細(xì)胞系5.9或12.12產(chǎn)生的單克隆抗體的表位結(jié)合的單克隆抗體；g)與包含SEQIDNO:10或SEQIDNO:12所示人CD40序列的殘基82-87的表位結(jié)合的單克隆抗體；h)與包含SEQIDNO:10或SEQIDNO:12所示人CD40序列的殘基82-89的表位結(jié)合的單克隆抗體；i)在競爭性結(jié)合試驗(yàn)中與單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；j)上述項(xiàng)目a)所述的單克隆抗體或上述項(xiàng)目c)-i)中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體，其中，所述抗體是重組產(chǎn)生；和k)作為上述項(xiàng)目a)-j)中任一項(xiàng)所述單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中，所述片段保留了特異性結(jié)合所述人CD40抗原的能力。30.如權(quán)利要求29所述的組合物，其特征在于，所述片段選自下組Fab片段，F(xiàn)(ab')2片段，F(xiàn)v片段，以及單鏈Fv片段。31.如權(quán)利要求29所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含的精氨酸-HC1的濃度為約150mM，且所述緩沖劑是檸檬酸鈉/檸檬酸，其濃度為約5mM至約20mM，其中所述組合物的pH為約5.0至約6.0，摩爾滲透壓濃度為約250mmol/kg至約330mmol/kg。32.如權(quán)利要求29所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含甲硫氨酸，聚山梨酸酯20，或者甲硫氨酸和聚山梨酸酯20，其中當(dāng)存在所述甲硫氨酸時(shí)，其在所述組合物中的濃度為約0.5mM至約20.0mM，其中當(dāng)存在所述聚山梨酸酯20時(shí)，其在所述組合物中的濃度為約0.025%至約0.1%(w/v)。33.如權(quán)利要求29-32中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述拮抗性抗-CD40單克隆抗體在所述組合物中的濃度為約10.0mg/ml至約35.0mg/ml。34.如權(quán)利要求33所述的組合物，其特征在于，所述拮抗性抗-CD40單克隆抗體是單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12。35.—種治療患有與表達(dá)CD40的細(xì)胞相關(guān)的癌癥或惡變前病癥的對象的方法，所述方法包括給予藥學(xué)上有效量的如權(quán)利要求1-34中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述癌癥以腫瘤性B細(xì)胞生長為特征。37.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述癌癥選自下組非霍奇金淋巴瘤，慢性淋巴細(xì)胞性白血病，多發(fā)性骨髓瘤，B細(xì)胞淋巴瘤，高級B細(xì)胞淋巴瘤，中級B細(xì)胞淋巴瘤，低級B細(xì)胞淋巴瘤，B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病，霍奇金病，漿細(xì)胞瘤，濾泡性淋巴瘤，濾泡性小卵裂細(xì)胞淋巴瘤，濾泡性巨細(xì)胞淋巴瘤，濾泡性混合性小卵裂細(xì)胞淋巴瘤，彌散性小卵裂細(xì)胞淋巴瘤，彌散性小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤，幼淋巴細(xì)胞白血病，淋巴漿細(xì)胞性淋巴瘤，邊緣區(qū)淋巴瘤，粘膜相關(guān)性淋巴組織淋巴瘤，單核細(xì)胞樣B細(xì)胞淋巴瘤，脾淋巴瘤，多毛細(xì)胞白血病，彌散性巨細(xì)胞淋巴瘤，縱隔大B細(xì)胞淋巴瘤，淋巴瘤樣肉芽腫病，血管內(nèi)淋巴瘤病，彌散性混合細(xì)胞淋巴瘤，彌散性巨細(xì)胞淋巴瘤，免疫母細(xì)胞性淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，AIDS相關(guān)性淋巴瘤，瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥，外套細(xì)胞淋巴瘤，和重鏈病。38.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述癌癥是非-B細(xì)胞血液惡性腫瘤。39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述惡性腫瘤選自下組急性白血病，成髓細(xì)胞性白血病，急性髓細(xì)胞性白血病，前髓細(xì)胞性白血病，髓性單核細(xì)胞性白血病，單核細(xì)胞性白血病，紅白血病，慢性粒細(xì)胞性白血病，和真性紅細(xì)胞增多癥。40.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述癌癥是包含表達(dá)CD40抗原的腫瘤性細(xì)胞的實(shí)體瘤。41.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述實(shí)體瘤選自下組肺癌，乳腺癌，卵巢癌，皮膚癌，結(jié)腸癌，膀胱癌，肝癌，胃癌，前列腺癌，腎細(xì)胞癌，鼻咽癌，鱗狀細(xì)胞癌，甲狀腺乳頭狀癌，宮頸癌，和肉瘤。42.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述惡變前病癥是意義未定的單克隆丙種球蛋白病(MGUS)。43.—種治療患有與表達(dá)CD40的細(xì)胞相關(guān)的炎性疾病或自身免疫性疾病的對象的方法，所述方法包括給予治療有效量的如權(quán)利要求1-34中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。44.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述炎性疾病或自身免疫性疾病選自下組系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，盤狀狼瘡，狼瘡腎炎，結(jié)節(jié)病，幼年型關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病關(guān)節(jié)炎，萊特爾綜合征，強(qiáng)直性脊柱炎，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，器官或組織移植排斥，移植物抗宿主病，多發(fā)性硬化，超IgE綜合征，結(jié)節(jié)性多動脈炎，原發(fā)性膽汁性肝硬變，炎性腸病，克羅恩病，乳糜瀉(麩膠敏感性腸病)，自身免疫性肝炎，惡性貧血，自身免疫性溶血性貧血，銀屑病，硬皮病，重癥肌無力，自身免疫性血小板減少性紫癜，自身免疫性甲狀腺炎，格雷夫斯病，橋本甲狀腺炎，免疫復(fù)合物病，慢性疲勞性免疫功能障礙綜合征(CFIDS)，多肌炎和皮肌炎，冷球蛋白血癥，溶栓，心肌病，尋常型天皰瘡，肺間質(zhì)纖維化，結(jié)節(jié)病，I型和II型糖尿病，1、2、3和4型遲發(fā)型超敏反應(yīng)，變態(tài)反應(yīng)或變態(tài)反應(yīng)性疾病，哮喘，丘-施二氏綜合征(變應(yīng)性肉芽腫病)，特應(yīng)性皮炎，過敏性和刺激性接觸性皮炎，蕁麻疹，IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)，動脈粥樣硬化，血管炎，特發(fā)性炎性肌病，溶血性疾病，阿爾茨海默病，和慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病。45.—種提高抗-CD40單克隆抗體在液體藥物組合物中的穩(wěn)定性的方法，所述方法包括將所述抗-CD40單克隆抗體、含量足以使所述組合物接近等滲的精氨酸-HCl以及維持所述組合物的pH在約pH5.0和約pH7.0之間的緩沖劑混合以配制所述組合物，其中所述緩沖劑是檸檬酸鹽/檸檬酸緩沖劑。46.—種制備含抗-CD40單克隆抗體的液體藥物組合物的方法，所述方法包括將所述抗-CD40單克隆抗體、含量足以使所述組合物接近等滲的酸形式精氨酸(精氨酸-HCl)以及維持所述組合物的pH在約pH5.0和約pH7.0之間的緩沖劑混合以配制所述組合物，其中所述緩沖劑是檸檬酸鹽/檸檬酸緩沖劑。47.如權(quán)利要求45或46所述的方法，其特征在于，所述組合物的摩爾滲透壓濃度為約240mmol/kg至約360mmol/kg。48.如權(quán)利要求45或46所述的方法，其特征在于，所述緩沖劑的濃度為約5mM至約100mM，并將約50mM至約200mM精氨酸-HCl與所述抗-CD40單克隆抗體和所述緩沖劑混合。49.如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述緩沖劑的濃度為約5mM至約20mM，并將約100mM至約175mM精氨酸-HCl與所述抗-CD40單克隆抗體和所述緩沖劑混合。50.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述緩沖劑的濃度為約10mM,并將約150mM精氨酸-HCl與所述抗-CD40單克隆抗體和所述緩沖劑混合。51.如權(quán)利要求45-50中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述緩沖劑是檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖劑。52.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述組合物的pH為約pH53.如權(quán)利要求45或46所述的方法，其特征在于，所述組合物配制成還包含甲硫氨酸、聚山梨酸酯20、或甲硫氨酸和聚山梨酸酯20兩者，其中當(dāng)存在所述甲硫氨酸時(shí)，其在所述組合物中的濃度為約0.5mM至約20.0mM，且其中當(dāng)存在所述聚山梨酸酯20時(shí)，其在所述組合物中的濃度為約0.025%至約0.1%(w/v)。54.如權(quán)利要求45-53中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述拮抗性抗-CD40單克隆抗體選自下組a)單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12;b)由雜交瘤細(xì)胞系5.9或12.12產(chǎn)生的單克隆抗體；c)包含選自下組的氨基酸序列的單克隆抗體SEQIDNO:6所示序列，SEQIDNO:7所示序列，SEQIDNO:8所示序列，SEQIDNO:6和SEQIDNO:7所示的序列，以及SEQIDNO:6和SEQIDNO:8所示的序列；d)包含選自下組的氨基酸序列的單克隆抗體SEQIDNO:2所示序列，SEQIDNO:4所示序列，SEQIDNO:5所示序列，SEQIDNO:2和SEQIDNO:4所示的序列，以及SEQIDNO:2和SEQIDNO:5所示的序列；e)具有由包含選自下組的核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體SEQIDNO:1所示序列，SEQIDNO:3所示序列，以及SEQIDNO:1和SEQIDNO:3所示的序列；f)與能夠結(jié)合雜交瘤細(xì)胞系5.9或12.12產(chǎn)生的單克隆抗體的表位結(jié)合的單克隆抗體；g)與包含SEQIDNO:10或SEQIDNO:12所示人CD40序列的殘基82-87的表位結(jié)合的單克隆抗體；h)與包含SEQIDNO:10或SEQIDNO:12所示人CD40序列的殘基82-89的表位結(jié)合的單克隆抗體；i)在競爭性結(jié)合試驗(yàn)中與單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；j)上述項(xiàng)目a)所述的單克隆抗體或上述項(xiàng)目c)-i)中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體，其中，所述抗體是重組產(chǎn)生；和k)作為上述項(xiàng)目a)-j)中任一項(xiàng)所述單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中，所述片段保留了特異性結(jié)合所述人CD40抗原的能力。55.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述片段選自下組Fab片段，F(xiàn)(ab')2片段，F(xiàn)v片段，以及單鏈Fv片段。56.如權(quán)利要求45-55中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述拮抗性抗-CD40單克隆抗體在所述組合物中的濃度為約0.1mg/ml至約50.0mg/ml。57.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述拮抗性抗-CD40單克隆抗體在所述組合物中的濃度為約10.0mg/ml至約35.0mg/ml。58.—種穩(wěn)定的液體藥物組合物，其包含單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或者其抗原結(jié)合片段作為治療或預(yù)防活性組分，濃度為約50mM至約200mM酸形式的精氨酸(精氨酸-HCl)，以及維持所述組合物的pH在約pH5.0和約pH7.0之間的緩沖劑，其中所述緩沖劑是檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖劑，其濃度為約5mM至約20mM。59.—種治療患有與表達(dá)CD40的細(xì)胞相關(guān)的癌癥或惡變前病癥的對象的方法，所述方法包括給予藥學(xué)上有效量的如權(quán)利要求58所述的藥物組合物。60.—種治療患有與表達(dá)CD40的細(xì)胞相關(guān)的炎性疾病或自身免疫性疾病的對象的方法，所述方法包括給予治療有效量的如權(quán)利要求58所述的藥物組合物。61.—種提高單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段在液體藥物組合物中的穩(wěn)定性的方法，所述方法包括將所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與約50mM至約200mM酸形式的精氨酸(精氨酸-HCl)以及維持所述組合物的pH在約pH5.0和約pH7.0之間的緩沖劑混合來配制所述組合物，其中所述緩沖劑是檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖劑，其濃度為約5mM至約20mM。62.—種制備包含單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段的液體藥物組合物的方法，所述方法包括將所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與約50mM至約200mM酸形式的精氨酸(精氨酸-HCl)以及維持所述組合物的pH在約pH5.0和約pH7.0之間的緩沖劑混合以配制所述組合物，其中所述緩沖劑是檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖劑，其濃度為約5mM至約20mM。全文摘要提供了包含拮抗性抗-CD40抗體作為治療或預(yù)防活性組分的穩(wěn)定液體藥物組合物以及它們的制備方法。這些組合物包含拮抗性抗-CD40抗體、維持組合物的pH在約pH5.0和約pH7.0之間的緩沖劑、以及含量足以使該液體組合物接近等滲的精氨酸-HCl。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的含拮抗性抗-CD40抗體的穩(wěn)定液體藥物組合物可用于治療增生性疾病以及具有自身免疫性和/或炎性成分的疾病的方法。文檔編號C07K16/28GK101426817SQ200780013973公開日2009年5月6日申請日期2007年4月17日優(yōu)先權(quán)日2006年4月21日發(fā)明者A·奧克哈馬菲,B·-L·陳,K·阿拉亞,陸曉峰申請人:諾華有限公司;愛克索馬技術(shù)有限公司