專利名稱：：Mcp-1的表達(dá)抑制劑、使用其的炎癥性疾病的改善劑、藥品、補(bǔ)充劑、食品、飲料和食品添加劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及MCP-l的表達(dá)抑制劑、使用其的炎癥性疾病的改善劑、藥品、補(bǔ)充劑、食品、飲料和食品添加劑。
背景技術(shù)：
：MCP-1(monocytechemoattractantprotein-1,單斗亥纟田月包趨化蛋白-1)是趨化因子(Chemokine)的一種。其主要由單細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等分泌，具有單細(xì)胞或T細(xì)胞的遷移活性、誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生、黏附因子的表達(dá)等功能。另外，MCP-1的受體為CCR2。最近的研究表明，脂肪組織為分泌MCP-1的器官，已知肥胖者的脂肪組織的MCP-l的分泌量增加。另外還已知，MCP-1與感染癥、自身免疫性疾病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、器官移植的排斥反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化和腫瘤轉(zhuǎn)移等炎癥性疾病、胰島素抵抗等有關(guān)(非專利文獻(xiàn)l)。因此，以MCP-l為靶的藥品的開發(fā)正在發(fā)展(專利文獻(xiàn)l)。但是，化學(xué)合成的藥品其效果顯著，但例如也可能伴有副作用，在安全性方面有問(wèn)題。另外，包括肥胖在內(nèi)的炎癥性疾病或胰島素抵抗等與生活習(xí)慣密切相關(guān)，因此有必要運(yùn)動(dòng)或改善飲食習(xí)慣。因而，認(rèn)為在飲食等日常生活中抑制MCP-l的表達(dá)將與炎癥性疾病等的預(yù)防或治療有關(guān)。但是，化學(xué)合成的藥品由于如上所述具有副作用的問(wèn)題，因此難以長(zhǎng)期地?cái)z取。另外，化學(xué)合成的藥品由于具有特殊的味道，因此在隨食品一起攝取時(shí)，例如還具有有損食品原本風(fēng)味的問(wèn)題。因而，化學(xué)合成的藥品例如在醫(yī)師指導(dǎo)下的治療中也許有用，但安全性具有問(wèn)題，另外，具有無(wú)法用于食品、飲料或補(bǔ)充劑等、應(yīng)用范圍狹窄的問(wèn)題。非專利文獻(xiàn)l:《月巴胖研究》Vol.11No.3200527(267)-32(272)專利文獻(xiàn)l:日本特開2005—187451號(hào)/>才艮
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的問(wèn)題因此，本發(fā)明的目的在于提供安全性優(yōu)異、且能夠廣泛用于食品等的MCP-l的表達(dá)抑制劑。用于解決問(wèn)題的方法為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的MCP-l的表達(dá)抑制劑含有橙皮油素。本發(fā)明的炎癥性疾病的改善劑含有本發(fā)明的MCP-1的表達(dá)抑制劑。另外，本發(fā)明為用于預(yù)防或治療炎癥性疾病的藥品，含有本發(fā)明的炎癥性疾病的改善劑。料或食品添加劑，含有本發(fā)明的炎癥性疾病的改善劑。本發(fā)明為抑制MCP-l的表達(dá)的方法，其包括給予一登皮油素的工序。另外，本發(fā)明為預(yù)防或治療炎癥性疾病的方法，其包括給予橙皮油素的工序。本發(fā)明為橙皮油素在用于抑制MCP-l的表達(dá)或者用于預(yù)防或治療炎癥性疾病中的應(yīng)用。發(fā)明效果本發(fā)明人為了達(dá)成上述目的，以天然產(chǎn)物為中心，對(duì)抑制MCP-l表達(dá)的物質(zhì)進(jìn)行了一系列研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)柑橘類所含5的橙皮油素會(huì)抑制MCP-l的表達(dá)，進(jìn)而完成了本發(fā)明。含有橙皮油素的柑橘類長(zhǎng)年作為食品使用，其安全性沒(méi)有問(wèn)題。另外，由于橙皮油素沒(méi)有獨(dú)特的風(fēng)味或者有也很少，因此即便用于食品或飲料等，也不會(huì)損害它們的風(fēng)味。另外，橙皮油素由于卡路里少，由于這一點(diǎn)，即便如肥胖者或糖尿病患者等需要限制卡路里的人長(zhǎng)期間攝取也沒(méi)有問(wèn)題。因而，本發(fā)明的MCP-l的表達(dá)抑制劑安全性優(yōu)異、且可以廣泛用于食品等，而且可以長(zhǎng)期地4聶取。圖l為表示本發(fā)明一實(shí)施例中基因水平的MCP-1的表達(dá)抑制效果的圖。圖2為表示上述實(shí)施例中蛋白質(zhì)水平的MCP_1的表達(dá)抑制效果的圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明中，上述MCP-l的表達(dá)抑制為基因水平的表達(dá)抑制和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)抑制中的至少l種。上述基因水平的表達(dá)抑制包括抑制向mRNA的轉(zhuǎn)錄。另外，上述蛋白質(zhì)水平的表達(dá)抑制包括例如翻譯中的抑制、在翻譯后進(jìn)行修飾時(shí)，包括上述修飾的抑制。本發(fā)明中，上述橙皮油素優(yōu)選來(lái)源于柑橘類。柑橘類來(lái)源的橙皮油素可以來(lái)源于上述柑橘類的任何部分，例如有果汁來(lái)源、果肉來(lái)源、果皮來(lái)源。上述柑橘類并無(wú)特別限定，例如有曰本夏沖登(學(xué)名C//rw/L4Z4T^)、八朔蜜柑(學(xué)名C7/rws/2fl5^aA:w/fortex7M7V^iO！)、夏枯(學(xué)名C7/^wswa&wda/(ia//L4Z47^突變種)、葡萄柚(學(xué)名Owpa^^"/)等。另外，上述橙皮油素例如可以使用由柑橘類分離精制而成的物質(zhì)，還可以以全部或部分含有柑橘類的粗提物狀態(tài)使用。另外，橙皮油素還可以^吏用合成物或市售品。本發(fā)明的MCP-l的表達(dá)抑制劑如上所述只要含有橙皮油素即可，其構(gòu)成或形態(tài)并無(wú)限定。即，本發(fā)明中，MCP-l的表達(dá)抑制劑可以為單一的橙皮油素，還可以含有其它成分。其它成分并無(wú)限定，可以根據(jù)本發(fā)明的用途等適當(dāng)決定，例如可以舉出下述例示的各種成分。通過(guò)給予或攝取本發(fā)明的MCP-l的表達(dá)抑制劑，例如可以在基因水平或蛋白質(zhì)水平抑制MCP-l的表達(dá)。本發(fā)明的表達(dá)抑制劑并無(wú)限定，例如優(yōu)選對(duì)人和除人以外的哺乳類動(dòng)物給予或使其攝取。接著，本發(fā)明的MCP-l的表達(dá)抑制劑例如可以用于炎癥性疾病的改善劑、藥品、補(bǔ)充劑、食品、飲料、食品添加劑等。予以-說(shuō)明，它們與本發(fā)明的MCP-l的表達(dá)承卩制劑同才羊，例如其構(gòu)成或形態(tài)并無(wú)限定。本發(fā)明的炎癥性疾病的改善劑含有上述本發(fā)明的MCP-1的表達(dá)抑制劑。上述炎癥性疾病例如為代謝綜合癥、變態(tài)反應(yīng)、腎疾病、感染、自身免疫性疾病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、器官移植的排斥反應(yīng)和腫瘤轉(zhuǎn)移。上述代謝綜合癥例如為胰島素抵抗、高胰島素血癥、2型糖尿病、高脂血癥、動(dòng)脈硬化、高血壓癥、肥胖和內(nèi)臟脂肪型肥胖等。通過(guò)給予本發(fā)明的炎癥性疾病的改善劑，可以改善這樣的炎癥性疾病。給予對(duì)象并無(wú)限定，例如可以舉出人、除人以外的哺乳類動(dòng)物。本發(fā)明中，橙皮油素的給予量或攝取量并無(wú)特別限定。另外，橙皮油素的給予或者攝取例如可每日進(jìn)行l(wèi)次，還可每曰分?jǐn)?shù)次進(jìn)行。本發(fā)明的藥品為用于預(yù)防或治療炎癥性疾病的藥品，含有7上述本發(fā)明的炎癥性疾病的改善劑。通過(guò)給予本發(fā)明的藥品，能夠預(yù)防或者治療例如胰島素抵抗、高胰島素血癥、2型糖尿病、高脂血癥、動(dòng)脈石更化、高血壓癥、肥胖和內(nèi)臟脂肪型肥胖等代謝綜合癥，變態(tài)反應(yīng)，腎疾病，感染，自身免疫性疾病，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化癥，器官移植的排斥和肺瘤轉(zhuǎn)移等疾病。給予本發(fā)明藥品的對(duì)象并無(wú)特別限定，例如可以舉出人、除人以外的哺乳類動(dòng)物。本發(fā)明的藥品除了上述本發(fā)明的改善劑之外，例如可以含有其它的MCP_l表達(dá)抑制成分、藥學(xué)上允許的添加物等。本發(fā)明的藥品，其具體的劑型例如可以舉出片劑、顆粒劑(包括散劑)、膠嚢劑、液體劑(包括糖漿劑)等。還可以根據(jù)這些各自的劑型，適當(dāng)使用各自合適的添加劑或基材等，根據(jù)日本藥局方等記載的通常方法來(lái)制造。另外，給予途徑并無(wú)特別限定，例如可以舉出經(jīng)口給藥或非經(jīng)口給藥。上述非經(jīng)口l會(huì)藥例如可以舉出口腔內(nèi)給藥、氣管內(nèi)給藥、直腸內(nèi)給藥、皮下給藥、肌肉內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥等。本發(fā)明的補(bǔ)充劑為用于預(yù)防或改善炎癥性疾病的補(bǔ)充劑，含有本發(fā)明的炎癥性疾病的改善劑。通過(guò)攝取本發(fā)明的補(bǔ)充劑，例如能夠預(yù)防或改善胰島素抵抗、高胰島素血癥、2型糖尿病、高脂血癥、動(dòng)脈硬化、高血壓癥、肥胖和內(nèi)臟脂肪型肥胖等代謝綜合癥，變態(tài)反應(yīng)，腎疾病，感染，自身免疫疾病，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化癥，器官移植排斥和腫瘤轉(zhuǎn)移等疾病。本發(fā)明的補(bǔ)充劑并無(wú)限定，與上述同樣，優(yōu)選被人、除人以外的哺乳類動(dòng)物攝取。本發(fā)明的補(bǔ)充劑除了上述本發(fā)明的改善劑之外，例如還可以含有各種添加劑、其它補(bǔ)充劑等。其它成分例如可以舉出其它的MCP-l表達(dá)抑制成分、維生素C等各種維生素類、氨基酸、寡糖等。本發(fā)明的補(bǔ)充劑的形態(tài)并無(wú)特別限定，例如可以舉出片劑、顆粒劑(包括散劑)、膠嚢劑、液體劑(包括糖漿劑)等。本發(fā)明的食品為用于預(yù)防或改善炎癥性疾病的食品，含有上述本發(fā)明的炎癥性疾病的改善劑。通過(guò)攝取本發(fā)明的食品，可預(yù)防或改善胰島素抵抗、高胰島素血癥、2型糖尿病、高脂血癥、動(dòng)脈硬化、高血壓癥、肥胖和內(nèi)臟脂肪型肥胖等代謝綜合癥，變態(tài)反應(yīng)，腎疾病，感染，自身免疫疾病，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化癥，器官移植排斥和腫瘤轉(zhuǎn)移等疾病。本發(fā)明的食品并無(wú)限定，例如優(yōu)選一皮人、除人以外的哺乳類動(dòng)物攝取。本發(fā)明的食品除了上述改善劑之外，還可以含有各種成分。其它成分例如可以舉出其它的MCP-l表達(dá)抑制成分、各種添加劑、補(bǔ)充劑等。本發(fā)明中，上述食品包括例如一般食品和功能性食品兩者。本發(fā)明中，食品的形態(tài)并無(wú)限定，例如可以舉出谷類、面類、點(diǎn)心類、湯、肉、海產(chǎn)類、海藻、蔬菜、水果、豆類、各種加工品、干燥食品、冷凍食品、熏制品、罐裝食品、瓶裝食品、方便食品等。本發(fā)明的飲料為用于預(yù)防或改善炎癥性疾病的飲料，含有上述本發(fā)明的炎癥性疾病的改善劑。通過(guò)攝取本發(fā)明的飲料，例如可以預(yù)防或改善胰島素抵抗、高胰島素血癥、2型糖尿病、高脂血癥、動(dòng)脈硬化、高血壓癥、肥胖和內(nèi)臟脂肪型肥胖等代謝綜合癥，變態(tài)反應(yīng)，腎疾病，感染，自身免疫疾病，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化癥，器官移植排斥和腫瘤轉(zhuǎn)移等疾病。本發(fā)明的飲料并無(wú)限定，例如優(yōu)選被人、除人以外的哺乳類攝取。本發(fā)明的飲料除了上述改善劑之外，還可以含有各種成分。其它成分例如可以舉出其它的MCP-l表達(dá)抑制成分、各種添加劑、補(bǔ)充劑等。本發(fā)明中，上述飲料包括例如一般飲料和功能性飲料兩者。本發(fā)明中，飲料的形態(tài)并無(wú)限定，例如可以舉出9果汁等清涼飲料、碳酸飲料、咖啡、紅茶、綠茶、礦泉水等。本發(fā)明的食品添加劑為用于預(yù)防或改善炎癥性疾病的食品添加劑，含有上述本發(fā)明的炎癥性疾病的改善劑。通過(guò)l聶取本發(fā)明的食品添加劑，例如可以預(yù)防或改善胰島素抵抗、高胰島素血癥、2型糖尿病、高脂血癥、動(dòng)脈石更化、高血壓癥、月巴胖和內(nèi)臟脂肪型肥胖等代謝綜合癥，變態(tài)反應(yīng)，腎疾病，感染，自身免疫疾病，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化癥，器官移植排斥和腫瘤轉(zhuǎn)移等疾病。本發(fā)明的食品添加劑并無(wú)限定，例如優(yōu)選被人、除人以外的哺乳類動(dòng)物攝取。本發(fā)明的食品添加劑除了上述改善劑之外，還可以含有各種成分。其它成分例如可以舉出其它的MCP-l表達(dá)抑制成分、各種添加劑、補(bǔ)充劑等。本發(fā)明的食品添加劑的形態(tài)并無(wú)限定，例如可以舉出液體狀、粉末狀、薄片狀、顆粒狀等。另外，本發(fā)明的食品添加劑除了食品用之外，還包括飲料用的食品添加劑等。本發(fā)明為抑制MCP-l表達(dá)的方法，包括給予上述橙皮油素的工序。通過(guò)鄉(xiāng)合予才登皮油素，可以抑制細(xì)月包中的MCP-l的表達(dá)。給予橙皮油素的對(duì)象并無(wú)限定，例如可以為生物體，還可以為從生物體分離的細(xì)胞。上述生物體并無(wú)限定，例如可以舉出人或包括人在內(nèi)的哺乳類動(dòng)物等。所給予的上述橙皮油素的形態(tài)并無(wú)限定，例如可以舉出與上述本發(fā)明MCP-l的表達(dá)抑制劑或炎癥性改善劑、藥品、補(bǔ)充劑、食品、飲料、食品添加劑等同樣的形態(tài)。上述給予方法并無(wú)限定，例如生物體時(shí)，可以舉出經(jīng)口給藥或非經(jīng)口給藥。上述非經(jīng)口給藥例如可以舉出口腔內(nèi)給藥、氣管內(nèi)給藥、直腸內(nèi)給藥、皮下給藥、肌肉內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥等。另外，為從生物體分離的細(xì)胞時(shí)，例如可以舉出在培養(yǎng)基中添加橙皮油素進(jìn)行培養(yǎng)的方法。接著，本發(fā)明為預(yù)防或治療炎癥性疾病的方法，包括給予本發(fā)明的MCP-l的表達(dá)抑制劑的工序。上述本發(fā)明的MCP-1的表達(dá)抑制劑的形態(tài)并無(wú)限定，與前述同樣。另外，上述MCP-l的表達(dá)抑制劑例如可以以上述的炎癥性改善劑、藥品、補(bǔ)充劑、食品、飲料、食品添加劑形式給予。上述給予方法并無(wú)限定，例如可以舉出經(jīng)口給藥或非經(jīng)口給藥。上述非經(jīng)口給藥例如可以舉出口腔內(nèi)給藥、氣管內(nèi)給藥、直腸內(nèi)給藥、皮下給藥、肌肉內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥等。給予上述本發(fā)明MCP-l的表達(dá)抑制劑的對(duì)象并無(wú)限定，例如可以舉出人或包括人在內(nèi)的哺乳類動(dòng)物。本發(fā)明的橙皮油素如上所述優(yōu)選以柑橘類為原料制造。以下舉出該制造方法的一例(日本特開平ll-29565號(hào)7>才艮)。首先，在常溫下將柑橘類的果皮浸漬于水中后，進(jìn)行離心分離獲得果皮油。還可以使用果實(shí)、果肉、果汁代替上述果皮，但由于果皮中橙皮油素的含量多，因此優(yōu)選使用。接著，使上述果皮油吸附在吸附劑上。上述吸附劑例如優(yōu)選使用為電中性、比表面積大的多孔性吸附劑。這種吸附劑例如可以舉出含有苯乙烯與二乙烯基苯的共聚物的樹脂等。另夕卜，從增加吸附量、高效地精制橙皮油素的觀點(diǎn)出發(fā)，作為上述吸附劑使用的樹脂優(yōu)選以干燥狀態(tài)使用。使用醇水溶液洗滌吸附有上述果皮油的吸附劑。由此，將吸附在上述吸附劑上的雜質(zhì)除去。上述醇水溶液的醇濃度例如小于50%(體積比)、優(yōu)選為10%以上、45%以下、更優(yōu)選為35%以上、45%以下。上述醇例如可以舉出乙醇、異丙醇等。其中，將精制的橙皮油素用于補(bǔ)充劑、食品、飲料或食品添加劑等的情況下，優(yōu)選乙醇，用于藥品中時(shí)，優(yōu)選異丙醇。另外，上述醇水溶液的量并無(wú)限定，例如優(yōu)選為吸附在吸附劑上的橙皮油素含有液(例如果皮油)的約14倍(體積比)。然后，使用醇水溶液將橙皮油素從上述吸附劑洗脫出來(lái)。該洗脫液由于含有一登皮油素，因此可以直接使用，還可以濃縮或干燥后使用。如此獲得的橙皮油素基本為白色，無(wú)臭無(wú)味。洗脫用的上述醇7K溶液的醇濃度例如為50%以上、95%以下、優(yōu)選為60%以上、90%以下、更優(yōu)選為75%以上、85%以下。上述醇水溶液及其添加量例如與上相同。接著，說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施例。本發(fā)明并非限定于下述實(shí)施例。實(shí)施例1本實(shí)施例為確認(rèn)橙皮油素在基因水平和蛋白質(zhì)水平的MCP-l表達(dá)抑制的例子。(前體脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo))首先準(zhǔn)備以下所示的2種培養(yǎng)基，即分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化促進(jìn)培養(yǎng)基。分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(組成0.25pMDEX、0.5mMMIX、1Opg/mL胰島素/含10%FBS的DMEM)在DMEM(SIGMA制)500mL中加入FBS(胎牛血清(GIBCO制))55mL,調(diào)制含10%FBS的DMEM。向其中加入138.75nL的含lmMDEX(;也塞米+>)的DMSO(Nacalaitesque制)和555iiL的含10mg/mL胰島素的PBS(SIGMA制)。予以說(shuō)明，含胰島素的PBS為預(yù)先在PBS中加入INHC1,達(dá)到胰島素能夠溶解的程度的酸性后，使胰島素溶解。在使用之前，將MIX(3-異丁基-1_曱基黃嘌呤)(Nacalaitesque制)力口入到必要量的上述培養(yǎng)基中，使MIX達(dá)到0.5mM，調(diào)制分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基。MIX由于非常難溶，因此首先溶解于少量的99.5%乙醇中后，加入到含10%FBS的DMEM中。此時(shí)，在分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，使得99.5%乙醇的最終濃度不超過(guò)1%。分化促進(jìn)培養(yǎng)基(組成5pg/mL胰島素/含10%FBS的DMEM/橙皮油素)在555mL含10%FBS的DMEM中加入277.5|iL的上述含10mg/mL胰島素的PBS。向該混合液中加入各種濃度的一登皮油素(AUR),調(diào)制分化促進(jìn)培養(yǎng)基。予以說(shuō)明，將使用添加DMSO來(lái)取代橙皮油素、即未添加橙皮油素的分化促進(jìn)培養(yǎng)基的培養(yǎng)細(xì)胞作為無(wú)處理對(duì)照(對(duì)照)。接著，復(fù)蘇冷凍的培養(yǎng)前體脂肪細(xì)胞3T3_Ll，接種于放有培養(yǎng)基的100mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3T3-Ll達(dá)到約80%匯合。將達(dá)到約80%匯合的1個(gè)皿量的3T3-Ll傳代于l個(gè)6孔板中。然后，在上述6孔板中培養(yǎng)傳代的3T3-Ll直至達(dá)到100%匯合后，將培養(yǎng)基更換為分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基使其分化誘導(dǎo)。換成分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基48小時(shí)后，接著將培養(yǎng)基換成分化促進(jìn)培養(yǎng)基。然后每隔2天進(jìn)行分化促進(jìn)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基交換。在開始分化誘導(dǎo)8天后，<吏用Sepasol畫RNAISuper(商品名，Nacalaitesque制)/人i條養(yǎng)細(xì)胞中提取mRNA。然后使用Light/Cycler(注冊(cè)商標(biāo))測(cè)定作為脂肪細(xì)胞分化初期指標(biāo)的36B4和MCP-l的mRNA表達(dá)量。以下詳細(xì)說(shuō)明mRNA表達(dá)量的測(cè)定。另外，從每孔中各采集lmL分化誘導(dǎo)開始后8天的培養(yǎng)基，使用ELISA試劑盒(BDBioscience公司制、商品名BDOptEIASetMouseMCP-1),根據(jù)上述試劑盒的說(shuō)明書，測(cè)定培養(yǎng)上清中的MCP-l量(蛋白質(zhì)的量)。(利用LightCycler(注冊(cè)商標(biāo))的mRNA的定量)總RNA的提耳又和定量如上所述，從上述6孔板中除去培養(yǎng)基，向各孔中分別加13入lmLSepasol-RNAISuper(Nacalaitesque制)，反復(fù)吹打數(shù)次將細(xì)胞分散。將該細(xì)胞分散液移至容量1.5mL的管中，在室溫下放置5分鐘。放置后向上述管中加入200|iL氯仿，利用渦流充分地?cái)嚢瑁谑覝叵路胖?分鐘。然后將上述管冷卻至4°C,以12000xg離心15分鐘，分離為酚層(下層，黃色)和水層(上層，無(wú)色)。注意不要打亂上述層間的界面，同時(shí)僅將上述水層移至容量1.5ml的其它管中。此時(shí)，注意不要讓懸浮在層與層之間的蛋白質(zhì)混入。向從上述管內(nèi)取出的水層中加入異丙醇500nL進(jìn)行混合，在室溫下放置10分鐘。將上述管冷卻至4°C,以12000xg離心10分鐘，除去上清約lmL。向回收的沉淀中加入lmL的75%乙醇攪拌，充分地懸浮沉淀。然后將上述管冷卻至4。C，以12000xg離心IO分鐘，除去上清。將所得沉淀(總RNA)干燥后，溶解于20(iL的水(無(wú)核酸酶的水)中，利用NanoDrop(義夕，厶制)測(cè)定mRNA的濃度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)如上所述，將測(cè)定濃度后的mRNA〗容液調(diào)整為mRNA濃度達(dá)到lngL。然后，向8聯(lián)管(容量0.2mL)中添加OligodT引物l(iL和上述RNA溶液10|iL。使用熱循環(huán)4義在70。C下孵育該RNA樣品/引物混合液10分鐘，/人而石皮壞RNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)，移至冰上放置l分鐘以上。然后，按順序加入上述RNA樣品/引物混合液llpL、5x逆轉(zhuǎn)錄緩沖液5pL、RNase抑制劑l|iL、2.5mMdNTPMix5fiL和無(wú)核酸酶的水2pL(共計(jì)24jiL)。使用上述熱循環(huán)儀(注冊(cè)商標(biāo)ThermalCycler)在42。C下醉育上述混合液5分鐘后，加入逆轉(zhuǎn)錄酶1^L,通過(guò)吹打充分混合70。C下孵育15分鐘。孵育后，在水上冷卻上述管，輕輕地離心以將上述管內(nèi)的反應(yīng)液集中到上述管底，在-20。C下冷凍保存。予以說(shuō)明，測(cè)定中使用LightCycler(注冊(cè)商標(biāo))時(shí)，使用時(shí)稀釋10倍來(lái)使用。將所得產(chǎn)物稱作測(cè)定用cDNA樣品。LightCycler(注冊(cè)商標(biāo))測(cè)定以下的操作全部在潔凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。作為外標(biāo)，準(zhǔn)備通過(guò)以往公知的方法插入有測(cè)定表達(dá)量的目標(biāo)基因(MCP-l基因或36B4基因)片斷的質(zhì)粒。將該質(zhì)粒溶液5pL放入容量0.65mL的管中，進(jìn)而添加LightCycler(注冊(cè)商標(biāo))DNAMasterSYBRGreen(商品名)所帶的水45pL,而將上述質(zhì)粒稀釋10倍。重復(fù)該操作，制作質(zhì)粒的102、103、104、105、106、107和108倍稀釋的各稀釋溶液。用鑷子將專用的毛細(xì)管安裝到LightCycler(注冊(cè)商標(biāo))CentrifugeAdapter(商品名)上，向上述毛細(xì)管中注入在上述"逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)"中調(diào)制的混合液(共計(jì)24(iL)中的18pL。然后，將上述7種質(zhì)粒稀釋溶液2pL和上述10倍稀釋的測(cè)定用cDNA樣品2)iL添加至上述毛細(xì)管中，使用鑷子蓋上蓋子。然后，將上述毛細(xì)管在5000rpm、4。C下離心10秒鐘后，裝在托盤中，安裝于溝槽，進(jìn)行測(cè)定。予以說(shuō)明，作為陰性對(duì)照，使用水代替上述測(cè)定用cDNA樣品，同樣地進(jìn)4亍測(cè)定。根據(jù)LightCycler(注冊(cè)商標(biāo))的定量結(jié)果，首先對(duì)各測(cè)定用cDNA樣品，計(jì)算36B4的mRNA表達(dá)量(A)與MCP-l的mRNA表達(dá)量(B)之比(B/A)。然后，將未添加橙皮油素的無(wú)處理對(duì)照(對(duì)照)的上述比(B/A)作為100%,計(jì)算各樣品的相對(duì)值。將其結(jié)果示于下述表l和圖l的圖中。下述表l和圖l的橙皮油素濃度為分化促進(jìn)培養(yǎng)基中的最終濃度(以下相同)。圖l中，AUR表示橙皮油素，Ctrl表示無(wú)處置對(duì)照(對(duì)照)。另外，該圖中橫軸記載橙皮油素(AUR)的各添加量(pM)、縱軸表示相對(duì)于無(wú)處置對(duì)照(對(duì)照)的mRNA相對(duì)表達(dá)量(％)。另夕卜，將利用ELISA測(cè)得的MCP-l分泌量的測(cè)定值、以無(wú)處置對(duì)照(對(duì)照)的測(cè)定值作為100計(jì)算出的相對(duì)比示于下述表2和圖2的圖中。下述表2和圖2的橙皮油素濃度為分化促進(jìn)培養(yǎng)基中的最終濃度。圖2中，AUR表示橙皮油素，Ctrl表示無(wú)處置對(duì)照(對(duì)照)。另外，該圖中橫軸記載橙皮油素(AUR)的各添加量(|iM)、^/v軸表示相對(duì)于無(wú)處置對(duì)照(對(duì)照)的MCP-1的蛋白質(zhì)的相對(duì)量(分泌量)(％)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>由上述表l和圖l的圖可知，通過(guò)添加橙皮油素，可以在基因水平上抑制MCP-l的表達(dá)，且該抑制依賴于橙皮油素的用量。另外，如上述表2和圖2的圖可知，通過(guò)添加橙皮油素，可以在蛋白質(zhì)水平上抑制MCP-l的表達(dá)，且該抑制依賴于橙皮油素的用量。產(chǎn)業(yè)實(shí)用性如上所述，本發(fā)明的MCP-l的表達(dá)抑制劑通過(guò)含有橙皮油素，安全性優(yōu)異、即便長(zhǎng)期攝取也沒(méi)有問(wèn)題，可以抑制MCP-l的表達(dá)。另外，由于沒(méi)有風(fēng)味的問(wèn)題，例如即便用于食品等中也不會(huì)損害風(fēng)味。因而，本發(fā)明的MCP-l的表達(dá)抑制劑例如可以用于藥品、補(bǔ)充劑、食品、々欠料、食品添加劑等各種物質(zhì)，其用途并無(wú)限定。權(quán)利要求1.一種MCP-1的表達(dá)抑制劑，其為MCP-1的表達(dá)抑制劑，并含有橙皮油素。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的MCP-l的表達(dá)抑制劑，其中，所述MCP-1的表達(dá)抑制為基因水平的表達(dá)抑制和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)抑制中的至少一者。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MCP-l的表達(dá)抑制劑，其中，所述橙皮油素為柑橘類來(lái)源橙皮油素。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的MCP-l的表達(dá)抑制劑，其中，所述柑橘類為選自日本夏橙、八朔蜜柑、夏桔和葡萄柚中的至少一種。5.—種炎癥性疾病的改善劑，其含有權(quán)利要求l所述的MCP-l的表達(dá)抑制劑。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的炎癥性疾病的改善劑，其中，所述炎癥性疾病為選自代謝綜合癥、變態(tài)反應(yīng)、腎疾病、感染、自身免疫疾病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、器官移植的排斥反應(yīng)和腫瘤轉(zhuǎn)移所組成的組中的至少一個(gè)。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的改善劑，其中，所述代謝綜合癥為選自胰島素抵抗、高胰島素血癥、2型糖尿病、高脂血癥、動(dòng)脈硬化、高血壓癥、肥胖和內(nèi)臟脂肪性肥胖所組成的組中的至少一個(gè)。8.—種藥品，其為用于預(yù)防或治療炎癥性疾病的藥品，含有權(quán)利要求5所述的炎癥性疾病的改善劑。9.一種補(bǔ)充劑，其為用于預(yù)防或改善炎癥性疾病的補(bǔ)充劑，含有權(quán)利要求5所述的炎癥性疾病的改善劑。10.—種食品，其為用于預(yù)防或改善炎癥性疾病的食品，含有權(quán)利要求5所述的炎癥性疾病的改善劑。11.一種飲料，其為用于預(yù)防或改善炎癥性疾病的飲料，12.—種食品添加劑，其為用于預(yù)防或改善炎癥性疾病的13.—種MCP-l的抑制方法，其為抑制MCP-l表達(dá)的方法，其包括給予橙皮油素的工序。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的MCP-l的抑制方法，其中，所述給予為選自經(jīng)口給藥、口腔內(nèi)給藥、氣管內(nèi)給藥、直腸內(nèi)給藥、皮下給藥、肌肉內(nèi)給藥和靜脈內(nèi)給藥所組成的組中的至少l個(gè)給予方法。15.—種預(yù)防或治療方法，其為預(yù)防或治療炎癥性疾病的方法，其包括給予橙皮油素的工序。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的預(yù)防或治療方法，其中，所述給予為選自經(jīng)口給藥、口腔內(nèi)給藥、氣管內(nèi)給藥、直腸內(nèi)給藥、皮下給藥、肌肉內(nèi)給藥和靜脈內(nèi)給藥所組成的組中的至少1個(gè)給予方法。17.—種橙皮油素的應(yīng)用，其用于抑制MCP-l的表達(dá)。18.—種橙皮油素的應(yīng)用，其用于預(yù)防或治療炎癥性疾病。全文摘要本發(fā)明提供安全性優(yōu)異、且可以廣泛應(yīng)用于食品等的MCP-1的表達(dá)抑制劑。本發(fā)明的MCP-1的表達(dá)抑制劑的特征在于含有橙皮油素。橙皮油素包含在日本夏橙、八朔蜜柑、夏桔和葡萄柚等柑橘類中，由于這些一直都在食用，因此本發(fā)明沒(méi)有安全性問(wèn)題。另外，由于橙皮油素基本無(wú)臭無(wú)味，因此即便添加于食品等中，也不會(huì)損害其風(fēng)味。由于橙皮油素的卡路里低，因此即便是肥胖者或糖尿病患者等也可以長(zhǎng)期攝取。橙皮油素在基因水平(參照?qǐng)D1)和蛋白質(zhì)水平上抑制MCP-1的表達(dá)。文檔編號(hào)C07D311/16GK101448813SQ200780018000公開日2009年6月3日申請(qǐng)日期2007年5月16日優(yōu)先權(quán)日2006年5月17日發(fā)明者佐佐木貴生申請(qǐng)人:愛(ài)科來(lái)株式會(huì)社