專利名稱：：影響磷酸二酯酶表達的寡核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：者的氣道內(nèi)增多的腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細胞介素8(IL-8)發(fā)揮了重要作用。炎癥似乎發(fā)揮作用的呼吸系統(tǒng)疾病的其他實例包括譯喘、嗜酸性粒細胞性咳嗽、支氣管炎、肺同種異體移植物的急性和慢性排斥反應(yīng)、結(jié)節(jié)病、肺纖維化、鼻炎和鼻竇炎。哮喘被定義為氣道炎癥、可逆的阻塞和氣道高反應(yīng)性。在這種疾病中，涉及的炎性細胞主要是嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞和肥大細胞，雖然嗜中性粒細胞和巨噬細胞可能也很重要。已顯示大量各種細胞因子和趨化因子在氣道中增多并通過促進炎癥、阻塞和高反應(yīng)性而在此疾病的病理生理學(xué)中發(fā)揮作用。嗜酸性粒細胞性咳嗽的特征是慢性咳嗽和在沒有氣道阻塞或高反應(yīng)性的情況下在患者的氣道內(nèi)存在炎癥細胞，主要是嗜酸性粒細胞。在此疾病中，數(shù)種細胞因子和趨化因子增多，不過它們大多是針對嗜酸性粒細胞的。嗜酸性粒細胞在氣道內(nèi)被募集和激活并潛在地釋放在炎癥和咳嗽的維持中起作用的酶和氧自由基。急性支氣管炎是在感染或刺激事件(例如污染、粉塵、氣體或化學(xué)品)中發(fā)生的下氣道的一種急性疾病。慢性支氣管炎被定義為2年內(nèi)每年至少3個月的大部分曰子存在咳嗽和生痰。在氣道內(nèi)的急性或慢性支氣管炎期間，還可以發(fā)現(xiàn)炎性細胞，主要是嗜中性粒細胞，以及廣泛的各種趨化因子和細胞因子。這些介質(zhì)被認為在這些疾病期間發(fā)生的炎癥、癥狀和粘液產(chǎn)生中起作用。肺移植是在患有終末期肺部疾病的患者中進行。當(dāng)自身的炎性細胞、淋巴細胞未將供體器官識別為"自體"時，會發(fā)生急性的和更嚴重的慢性的同種異體移植物排斥反應(yīng)。炎性細胞由趨化因子和細胞因子募集，并釋放出大量的各種酶，這導(dǎo)致組織破壞，在慢性排斥反應(yīng)的情況中，導(dǎo)致一種稱為閉塞性細支氣管炎的疾病。結(jié)節(jié)病是一種在組織中發(fā)生慢性非干酪性肉芽腫的原因不明的疾病。肺部是最常見的受影響的器官。肺支氣管肺泡灌洗顯示大部分是淋巴細胞、巨噬細胞和有時是嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的增多。這些細胞也被細胞因子和趨化因子募集并激活，被認為與該疾病的發(fā)病機制有關(guān)。肺纖維化是一種特征為會引起慢性呼吸功能不全的進行性和慢性的纖維化(瘢痕)的肺組織疾病。存在不同類型和起因的肺纖維化，但所有的特點都是肺組織中的炎性細胞流入和持續(xù)、成纖維細胞的激活和增殖并伴隨膠原沉積。這些事件似乎與肺組織內(nèi)的細胞因子和趨化因子的釋放有關(guān)。急性鼻炎是一種鼻子或上氣道的在感染或刺激事件(例如，污染、粉塵、氣體或化學(xué)品)過程中發(fā)生的急性疾病。慢性鼻炎被定義為存在持續(xù)的慢性流鼻水、鼻充血、打噴嚏和瘙癢。在急性或慢性鼻炎期間，上氣道內(nèi)還可以發(fā)現(xiàn)炎性細胞癥狀和粘液產(chǎn)生中發(fā)揮作用。急性鼻竇炎是一種特征為鼻充血、流鼻涕、化膿性痰、頭痛或鼻竇疼痛并伴有或不伴有發(fā)燒的急性的(通常為傳染性)的鼻竇疾病。慢性鼻竇炎被定義為持續(xù)超過6個月的急性鼻竇炎癥狀。在急性或慢性鼻竇炎期間，上氣道和鼻竇內(nèi)還病中發(fā)生的炎癥、癥狀和粘液產(chǎn)生中發(fā)揮作用。有越來越多的證據(jù)表明炎癥與腫瘤疾病之間存在密切聯(lián)系。腫瘤微環(huán)境由進入其中的細胞形成，它們的功能反映了局部的狀況。在腫瘤發(fā)展中，腫瘤部位處發(fā)生的連續(xù)變化類似于慢性炎癥。這種慢性炎癥反應(yīng)似乎主要由腫瘤調(diào)控，并且似乎促進肺瘤的存活。已經(jīng)清楚的是，在發(fā)展中的腫瘤內(nèi)部或者周圍觀察到的早期和持續(xù)的炎癥反應(yīng)通過提供各種與維持組織穩(wěn)態(tài)有關(guān)的介質(zhì)(例如，可溶性生長因子和存活因子、基質(zhì)重塑酶、活性氧物種和其他生物活性分子)來調(diào)控腫瘤發(fā)展的許多方面(基質(zhì)重塑、血管生成、惡性潛能)。如上所述，這些炎性呼吸系統(tǒng)疾病或其中炎癥起關(guān)鍵作用的疾病均具有如下特征存在暮集并激活不同的炎性細胞的介質(zhì)，這些炎性細胞釋放引起正常組織的癥狀、炎癥持續(xù)和為慢性時的破壞或瓦解的酶或氧自由基。一個合理的治療方法是下調(diào)細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生和炎性細胞的反應(yīng)。這在所有上述疾病中一直利用局部或全身施用皮質(zhì)類固醇進行并獲得了不同程度的成功。皮質(zhì)類固醇具有免疫抑制性，不僅影響炎性細胞而且還影響機體的其他細胞，長期施用時會導(dǎo)致毒性。盡管可提供用于COPD、哮喘和其它炎性呼吸系統(tǒng)疾病的藥物，但是這些疾病的流行率和發(fā)病率一直保持穩(wěn)定或增加。顯然，炎性呼吸系統(tǒng)疾病的治療存在未滿足的醫(yī)療需求，因此迫切需要創(chuàng)新性的治療劑?；诜戳x寡核苦酸的治療提供了一種選擇性減少特定基因的表達而無傳統(tǒng)治療策略的毒性作用的新的替代途徑。正在研究用于治療數(shù)種疾病的反義療法。之前已顯示，如WO9966037所述，針對炎癥介質(zhì)的受體的反義寡核苷酸可以施用于肺部并下調(diào)它們的靶標。相對于目前的炎性呼吸系統(tǒng)疾病或任何其他全身性炎性疾病的療法，一種可減少由大量各種細胞釋放的促炎細胞因子和趨化因子并且同時對抗炎介質(zhì)或酶的釋放具有降低作用的治療方法可能具有優(yōu)勢。環(huán)核苦酸cAMP和cGMP是普遍存在的參與信號傳導(dǎo)途徑和機制的第二信使。哺乳動物細胞已進化出酶的復(fù)雜且高度保守的補體，該補體通過多重且復(fù)雜的前饋和反饋機制來調(diào)節(jié)環(huán)核苷酸的生成和失活。cAMP和cGMP均通過腺嘌呤基(腺苷酸根)或鳥。票呤基(鳥苷酸根)環(huán)化酶的催化活性，由它們各自的三磷酸酯(ATP和GTP)形成，分另'J如EssayanD.M.C>'c//cm"7eo,/A//a577/w6feWer"w〖尸Z)^;//7/^//cm/wm朋omot/M/a/7'o/7.Biochem.Pharmacol"1999，57，965-973中所述。cAMP/cGMP的失活通過環(huán)核苷酸依賴型磷酸二酯酶(PDE)催化的3'-磷酸二酯鍵的水解斷裂而導(dǎo)致形成相應(yīng)的無活性5'-單磷酸酯來實現(xiàn)，如Essayan(1999)與PerryM.J.,口HiggsG,A(C7zemo,/zer"peM"'c/ofe"".a/o/p/zcwp/zotZ/estenawez."/z/6zY0n'.1998,CurrOpinChemBiol.4:472-481)所述。已經(jīng)表明，炎癥反應(yīng)和其進程對環(huán)核苷酸的穩(wěn)態(tài)水平的調(diào)變極度敏感，其中受它們影響的靶細胞擴展到超過免疫細胞而包括輔助細胞，如氣道平滑肌細胞，上皮細胞和內(nèi)皮細胞以及神經(jīng)元，如Perry和Higgs(1998);Essayan(1999)所述。在這方面，胞內(nèi)環(huán)核苷酸的調(diào)變對調(diào)控炎癥環(huán)境起重要作用的新興理念最近已演變成靶向和改善炎性反應(yīng)/自身免疫反應(yīng)。環(huán)核苷酸PDE是一個龐大的不斷增多的多基因家族，包括至少11個家族的PDE酶。因此，選擇性的和非選擇性的PDE抑制劑在體外和體內(nèi)的形態(tài)(profile)提示了潛在的作為抗抑郁藥、抗增殖藥、免疫調(diào)節(jié)劑、保胎藥(tocolytics)、心肌力調(diào)節(jié)藥/心率調(diào)節(jié)藥和細胞保護劑的治療應(yīng)用。11胞內(nèi)cAMP似乎不僅在平滑肌松弛、活化和增生中，而且在由炎性細胞導(dǎo)致的介質(zhì)釋放的調(diào)變中具有根本性的作用。cAMP水平下降可導(dǎo)致氣道上皮細胞內(nèi)的如TNF-a、GM-CSF和IL-8等炎性介質(zhì)的產(chǎn)生增多。對細胞因子在細胞穩(wěn)態(tài)以及炎癥/自身免疫性/傳染性疾病中的調(diào)控作用的分子機制的研究已開始提供新的辦法來設(shè)計藥理干預(yù)的治療策略。一種此類的新穎方法是PDE酶阻斷的化療潛力，這顯示了有望治療大范圍的疾病狀態(tài)的顯著多樣而復(fù)雜的方案。對PDE抑制的一種才幾制的理解集中在環(huán)核苷酸(cAMP和cGMP)的免疫調(diào)節(jié)性能，由此鋪平了可以憑此清楚地說明抗炎、治療性應(yīng)用的渠道。炎癥反應(yīng)和其發(fā)展對環(huán)核苷酸的穩(wěn)態(tài)水平的調(diào)變極度敏感，其中受它們影響的耙細胞擴展到超過免疫細胞而包括結(jié)構(gòu)細胞，如上皮細胞、平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞以及神經(jīng)元(Perry和Higgs,1998:Essayan，1999)。月包內(nèi)環(huán)核苷酸的調(diào)變對炎性反應(yīng)的調(diào)控起主要作用。環(huán)核苷酸PDE是一個龐大的不斷增大的多基因家族，包括至少11個家族的PDE酶。PDE在它們的組織和細胞分布以及在它們的分子和理化特征(包括核苦酸和蛋白序列、底物特異性、抑制劑敏感性和輔因子需求性)方面有差異。在不同的家族內(nèi)，通過mRNA選4奪性剪接和差異性啟動子的使用由相同基因產(chǎn)生組織特異性亞型。cAMP特異性PDE4酶家族是研究最深入的PDE之一。此家族內(nèi)的酶發(fā)現(xiàn)于大多數(shù)的促炎和免疫細胞，其中它們在cAMP代謝的調(diào)控中起關(guān)鍵作用。PDE4酶在巨噬細胞、嗜中性粒細胞、細胞毒素CD8+T細胞、支氣管上皮細胞和氣道平滑肌細胞中表達。此外，PDE4抑制劑調(diào)節(jié)呼吸系統(tǒng)疾病的動物模型中的炎癥，這表明PDE4可能代表用小分子抑制劑進行干涉的治療類策略中的合適標靶?？筆DE4藥物抑制胞內(nèi)cAMP的水解，這依次又提供了支氣管擴張和對炎癥反應(yīng)的抑制。選擇性PDE4抑制劑(如西洛司特(cilomilast)和羅氟司特(roflumilast))在嗜中性粒細胞炎癥的動物模型中有效(BundschuchDS等.J.Pharmacol.Exp.Ther.2001297:280-290)。雖然將PDE4抑制劑用于治療氣道炎癥仍在進行深入的臨床研究，但是有數(shù)種抑制劑由于其毒性、劑量限制副作用(其中惡心和嘔吐是最常見的生理表現(xiàn))而已被放棄。因此，提高PDE4抑制劑的治療率已變?yōu)橹饕獑栴}，這仍然12是研究的重要領(lǐng)域?？紤]到酶在靶組織中的分布以及PDE3和PDE4在氣道平滑肌和炎性細胞中的高活性，可以在慢性氣流阻塞的治療中加入這些酶的選擇性抑制劑。一般小分子抑制劑都集中在一個或多個PDE上而未對抑制PDE的所有同工酶的潛在不利影響進行評估。例如已有人提出，大多數(shù)歸因于PDE4拮抗劑的毒性會通過抑制PDE4同種型D而發(fā)生。此外，如本文所示，抑制PDE的某些酶未能減少所有的促炎介質(zhì)，但采用反義寡核苦酸的適當(dāng)組合時，同種型特異性核普酸的組合可能導(dǎo)致范圍大得多的效果。PDE3家族包含兩種不同的基因，PDE3A和PDE3B，它們受cGMP抑制并對cAMP顯示出高親和性。每種PDE3基因編碼至少兩種剪接亞型。PDE3A已在平滑肌、血小板和心臟組織中得到鑒定。PDE3B在脂肪細胞和肝臟細胞中最為豐富。然而，來自使用選擇性PDE3抑制劑或與PDE4抑制劑的組合的臨床試驗的初步數(shù)據(jù)已經(jīng)有點令人失望，并且受到的期望明顯降低，因為這些藥品功效有限，并且由于副作用而使其在臨床上的使用受限。PDE7是首次從人類神經(jīng)膠母細胞瘤中分離出。PDE7A編碼一種對cGMP與PDE3和PDE4的抑制劑不敏感的cAMP特異性PDE,具有與其他cAMPPDE不同的氨基酸序列。在人類中，兩種基因(PDE7A和PDE7B)已得到表征。PDF/7A基因編碼通過mRNA選擇性剪接由同一基因得到的三種同工酶(PDE7A1、PDE7A2和PDE7A3)。在人類中，PDE7A2mRNA大量地表達在骨骼肌、心臟和腎臟中，而睪丸、肺和免疫系統(tǒng)(胸腺、脾、淋巴結(jié)、血液白細胞)是PDE7A1的豐富來源。此外，受激活的(而不是幼稚的)人類T淋巴細胞表達PDE7A3剪接變體。與此相反，PDE7B在人體中作為單一的同工酶存在，它與PDE7A具有約70%序列相似性，但具有明顯不同的動力學(xué)特性。PDE7B主要表達在大腦和大量的其他組織(包括肝臟、心臟、曱狀腺和骨骼肌)中。已顯示，用抗CD3和抗CD28抗體刺激人類幼稚T細胞可促進IL-2的產(chǎn)生和克隆性擴增。這些作用歸結(jié)于PDE7A,并且這種酶的下調(diào)阻礙了淋巴細胞增殖(LiL等，Science,1999，283,848-851)。PDE4家族包含4種不同的基因(PDE4A-D)。由于基因的選擇性剪接，據(jù)報13道有多種剪接變體，這些剪接變體可分為兩大類長型和短型。PDE4A、B和D基因產(chǎn)物見于大多數(shù)免疫和炎性細胞。這些產(chǎn)物以組成型存在或者在激活后存在，如BumoufC.和PmniauxM.R(CurrentPharmaceuticalDesign2002;8:1255-1296)所述。對所有的或某些的同種型PDE4的抑制與數(shù)種介質(zhì)的下調(diào)有關(guān)；不過，已描述有某些促炎細胞因子(如IL-6)增多(GiembyczM.A.ExpertOpinInvestDrugs2001,10:1361-1379)。因此，人們希望抑制所有這三種PDE酶；不過這種方法可能會被已記載的施用這些酶的每一種的抑制劑的毒性所困擾。局部施用反義寡核普酸可以避免酶抑制的全身毒性，但這些PDE有太多的同工酶，以致于此方法似乎不實用。對一種或多種的同種型的PDE酶的抑制可能不如完全PDE抑制有效，因為會存在其他同種型而具有它們的促炎作用。因此，看起來所希望的是設(shè)法在更少地影響用于炎性呼吸系統(tǒng)疾病的抗炎介質(zhì)或抑制酶的同時下調(diào)促炎介質(zhì)和它們的細胞。因而在此提出針對選定的同種型的PDE酶的反義寡核普酸的組合的治療應(yīng)用作為用于炎性呼吸系統(tǒng)疾病或環(huán)本發(fā)明提供了多種反義寡核苷酸化合物，這些反義寡核苷酸化合物可以有效下調(diào)它們所針對的PDE同種型基因，本發(fā)明還提供了選定的反義寡核苷酸化合物，這些選定的反義寡核苷酸化合物不僅可以有效下調(diào)它們所針對的PDE同種型基因，而且還可以有效下調(diào)包括其他PDE同種型基因、炎癥基因和促有絲分裂基因在內(nèi)的其他相關(guān)基因。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種組合物，該組合物包含至少2種反義寡核苷酸化合物，每種反義寡核苷酸化合物能夠下調(diào)不同的基因。在此方案的一些實施方式中，所述至少2種反義寡核苷酸化合物的組合導(dǎo)致了每種所述基因的顯著下調(diào)，這種下調(diào)比每種反義寡核苷酸單獨下調(diào)每種基因的能力的加合更大。在進一步的一些實施方式中，本發(fā)明還提供了一種組合物，該組合物包含至少2種反義寡核苷酸化合物，每種反義寡核苷酸化合物能夠下調(diào)不同的基因，每種反義
發(fā)明內(nèi)容14寡核苷酸化合物以該反義寡核普酸化合物本身對下調(diào)其所針對的基因?qū)嶋H上無效的濃度存在，所述至少2種反義寡核苷酸化合物的組合導(dǎo)致了這些反義寡核普這一方面的更進一步的實施方式中，提供了一種組合物，該組合物包含至少兩種反義寡核普酸化合物的組合，所述至少兩種反義寡核香酸化合物各自針對不同的PDE靶基因，并且各自對下調(diào)或抑制一個PDE靶基因是有效的，每種寡核苷酸化合物在該組合中存在的濃度是它顯示出少于20%的對其靶基因的抑制，這些寡核苷酸化合物的組合顯示出超過20%的抑制，并使對于至少一種所述靶基因的抑制至少加倍。本發(fā)明還提供了在本發(fā)明的組合物和方法中有效的反義寡核苷酸，所述反義寡核苦酸具有選自SEQIDNO.1~92和113~126所組成的組中的序列。本發(fā)明還提供一些藥物組合物，所述藥物組合物包含藥學(xué)可接受的載體和如上所述的本發(fā)明的寡核芬酸或者至少兩種反義寡核普酸的組合。本發(fā)明還提供了這樣的組合物在炎性呼吸系統(tǒng)疾病和其他炎癥相關(guān)疾病的治療和/或預(yù)防中的應(yīng)用。本發(fā)明的組合似乎通過被稱為多基因敲除的方法發(fā)揮抑制作用。多基因敲除包括以下情況1)反義寡核苷酸不僅下調(diào)所針對的基因，而且還下調(diào)其他相關(guān)基因；和/或2)至少2種反義寡核普酸的組合，該反義寡核苷酸各自以其本身對下調(diào)所針對的基因的下調(diào)實際上無效的濃度存在，該組合導(dǎo)致了所述反義寡核苷酸所針對的基因以及可任選的其他相關(guān)基因的顯著下調(diào)。本發(fā)明利用上述辦法來提供了用于治療和/或預(yù)防患者的與cAMP減少有關(guān)的疾病的方法、組合物和試劑盒，所述疾病包括PDE相關(guān)疾病、炎性疾病(包括呼吸系統(tǒng)疾病，特別是COPD(慢性阻塞性肺病)和哮喘)以及炎癥起重要作用的其他疾病(包括癌癥)。本發(fā)明還一是供了減少細胞cAMP磷酸二酯酶的表達并由此降低其活性，從而維持胞內(nèi)cAMP和細胞因子/趨化因子產(chǎn)生的正確平衡的方法、試劑和組合物。本發(fā)明還提供了用于體外、體內(nèi)和離體(exvivo)鑒定/篩查能夠干擾PDE表達和提高胞內(nèi)cAMP水平的新型反義寡核苷酸化合物的組合、藥物和疫苗的方法和工具。本發(fā)明還提供了基于基因的治療和轉(zhuǎn)染方法，其中一種或多種反義寡核苷酸化合物用于細胞轉(zhuǎn)染或遞送到人類和動物以干擾PDE同種型基因表達。本發(fā)明還提供了有效抗PDE3同種型(如PDE3A和PDE3B)、PDE4同種型(如PDE4A、PDE4B和PDE4D)和PDE7同種型(如PDE7A)以及其他PDE的反義寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的另一大方案，提供了用于提高反義寡核苷酸的核酸酶穩(wěn)定性和/或扭基因抑制活性的方法，該方法包括用阿拉伯糖修飾的核苷酸、優(yōu)選為2'-脫氧-2'-氟代阿糖核苷酸(FANA)置換所述寡核苷酸中的至少一個核苷酸。在參照附圖閱讀對以下若干優(yōu)選實施方式的非限制性描述之后，將明了本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點?，F(xiàn)將根據(jù)附圖對本發(fā)明進行更詳細的說明，其中圖1顯示了不同的AON抑制其特異性靶敲除的功效。(A)使用LipofectamineTM2000(Invitrogen,比率為1jig寡斗亥苦酉復(fù)ljxLLipofectamineTM2000)和200ng~400ng的AON(AS)或者相應(yīng)的錯配序歹iJ(錯配/正義)，以靶向PDE3A、PDE3B、PDE7A、PDE4A、PDE4B或PDE4D的特定AON轉(zhuǎn)染A549細胞24小時。PDE3B、PDE4A和PDE4B的mRNA表達水平使用Quantigene測定(Panomics)來量化。使用實時PCR來量化PDE3A、PDE7A和PDE4D表達。PDE表達根據(jù)對照基因((32M、Ppib或HPRT)的表達歸一化。數(shù)據(jù)以相對于未處理細胞中的表達水平的平均抑制％表示(**卩<0.01,***p<0.001，n=3)。(B)用靶向超過一種PDE4亞型的AON轉(zhuǎn)染293細胞過夜。PDE4亞型的mRNA表達水平使用實時PCR來量化并根據(jù)對照基因p2M的表達來歸一化。數(shù)據(jù)以相對于轉(zhuǎn)染有相應(yīng)正義或錯配AON的細胞的表達水平的平均抑制％表示。圖2顯示了AON對肺上皮細胞的生物效應(yīng)。將如上所述用AON轉(zhuǎn)染過夜16的A549細胞用IL-1)3(10ng/mL)刺激4小時，以謙導(dǎo)趨化因子(IL-8，MCP-1)和細胞因子(GM-SCF)的分泌。收集細胞上清液并使用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)確定趨化因子/細胞因子的水平。數(shù)據(jù)以特異性分泌的平均抑制％表示，其中對PDE-AON耙向細胞與錯配/正義的AON靶向細胞之間的分泌水平進行比較。圖3顯示了AON對免疫細胞的生物效應(yīng)。將〗吏用脂質(zhì)試劑EscortIV(1AON:0.5|LiL脂質(zhì))以AON轉(zhuǎn)染20小時的人外周血單核細胞(PBMC),然后用PHA(10昭ZmL)刺激6小時。收集細胞上清液并使用ELISA(BDBiosciences)評價PBMC響應(yīng)PHA所分泌的細月包因子TNF-a和IL-2的7^平。細月包因子的減少與無AON遞送時的PHA刺激的細胞中的水平進行比較。數(shù)據(jù)以相對于用錯配或正義對照序列AON(左軸)觀察到的特異性細胞因子抑制的水平的AON抑制％表示。收集細胞裂解液以進行l(wèi)吏用cAMPEIA(酶免疫測定)(CaymanChemical)的cAMP測定作為PDE活性量度。cAMP的增多與無AON遞送時的PHA刺激細胞中的水平進行比較。數(shù)據(jù)以相對于用錯配或正義對照序列AON(右軸)獲得的水平的cAMP的特異性增多％表示。數(shù)據(jù)表示為9-15供體之間的平均變化。/。士SE。圖4顯示了含有2，-F-ANA的AON對抑制靶基因表達的效力。(A)以所示劑量使用Lipofectamine2000(Invitrogen，1(igAON:l(iLLipofectamine2000)，以由PS-DNA構(gòu)成的或者由PS-FANA修飾物或相應(yīng)4晉配序列構(gòu)成的PDE4D特異性AON轉(zhuǎn)染A549細胞24小時。靶基因的PDE4DmRNA表達水平使用Quantigene⑧測定(Panomics)來量化，并根據(jù)(32M基因表達歸一化。數(shù)據(jù)以相對于用正義對照序列處理的細胞中的表達水平的特異性抑制％表示。(B)于不同時間點(8、24或48小時)孑吏用單劑量的Lipofectamine2000(Invitrogen,1嗎AON:lLipofectamine2000)以由PS-DNA構(gòu)成的或者由PS-FANA修飾物或相應(yīng)錯配序列構(gòu)成的PDE4D特異性AON轉(zhuǎn)染A549細胞24小時。靶基因的PDE4DmRNA表達水平使用Quantigene⑧測定(Panomics)來量化，并根據(jù)p2M基因表達歸一化。數(shù)據(jù)以相對于用正義對照序列處理的細胞中的表達水平的特異性抑制％表示。圖下方的說明描述TOP1497(PDE4特異性)AON中的FANA修飾物。圖5顯示了含有2'-F-ANA的AON對肺上皮細胞的生物效應(yīng)的影響。用由PS-DNA(TOP1545)構(gòu)成的或者修飾有FANA(PS-FANA,TOP1545-F3)的PDE4B/4D雙特異性AON轉(zhuǎn)染A549細胞過夜，然后用IL-lj3(10ng/mL)刺激4小時。通過ELISA(BDBiosciences)分析上清液的IL-8和MCP-1分泌，并才艮據(jù)alamarBlueTM測定來確定的細胞活力來對水平進行歸一化。數(shù)據(jù)以相對于用相應(yīng)的正義對照序列處理的細胞中的表達水平的平均抑制％表示(**p<0.01，n=3)。圖6顯示了含有2，-F-ANA的AON對免疫細胞的影響。(A)用FANA修飾的雙特異性PDE4B/4DAON(TOP1545)或者FANA》務(wù)飾的PDE7A特異性AON(TOP1731)或者兩者一起轉(zhuǎn)染人PBMC，然后用PHA(10fig/mL)刺激6小時。靶基因的mRNA表達使用Quantigene⑧測定(Panomics)來量化，并將所有PDE基因表達水平根據(jù)(32M基因表達歸一化。數(shù)據(jù)以相對于用正義AON轉(zhuǎn)染的細胞中的水平的PDE4B(n二8)、PDE4D(n-6)和PDE7A(11=8)的mRNA表達的特異性抑制％表示。用比較所示列的非配對t檢驗測定P值。(B)收集細胞上清液并使用ELISA(Medicorp)評價PBMC響應(yīng)PHA所分泌的細胞因子TNF-a和IL-2的水平。纟田月包因子的減少與無AON遞送時的PHA刺激細胞中的水平進行比較。數(shù)據(jù)以相對于用相同劑量的錯配或正義對照寡核苷酸觀察到的抑制水平的AON抑制％表示。數(shù)據(jù)表示為8供體之間的平均變化％±SE。圖7顯示了在使用Lipofectamine2000(Invitrogen,比率為1昭寡核苦酸:l|iLLipofectamine2000)和200ng、400ng和800ng的TOP-1545-F3或者TOP-1549AON以PDE4B/4D特異性AON(TOP-1545-F3)或TYMS(胸苷酸合成酶)特異性AON(TOP-1549)轉(zhuǎn)染的293細胞中的TYMS基因表達的抑制。使用實時PCR來量化TYMS表達，將其根據(jù)對照基因(Ppib)的表達歸一化。數(shù)據(jù)以相對于用相應(yīng)正義或錯配AON轉(zhuǎn)染的細胞中的表達水平的平均抑制％表示。圖8顯示了在CYNOM-K1猴細胞系中的(A)TOP1572-F2對減少PDE4D和PDE4BmRNA表達的功效和(B)TOP1731-F3對減少PDE7AmRNA表達的功效。用250nM的AON或相應(yīng)的在無抗生素培養(yǎng)基中以比率為1|ug寡核苷酸:2pL脂質(zhì)復(fù)合(complex)到Lipofectamine2000中的對照將細胞轉(zhuǎn)染24小時。PDE4D、PDE4B和PDE7AmRNA表達水平由RT-PCR測量，并根據(jù)PPIB對照基因的表達將其相對量化。PDEmRNA抑制的百分比相對于未轉(zhuǎn)染的細胞中的基因水平進行測定。先使用單因素Anova然后使用Dunnett比較進行統(tǒng)計分析，**p<0.01。圖9顯示了TOP1572-F2和TOP1545對減少正常人支氣管上皮細胞(NHBE)中的(A)PDE4DmRNA表達和(B)MCP-1蛋白分泌物的功效。用250nM的AON或相應(yīng)的在無抗生素培養(yǎng)基中以比率為1嗎寡核苷酸1|dL脂質(zhì)復(fù)合到Lipofectamine2000中的對照將細胞轉(zhuǎn)染24小時。在轉(zhuǎn)染期的終點用細胞因子混合物(cytomix)(500U/mLTNF-a+10ngZmLILl-p+10ng/mLIFN力刺激細胞4小時。通過ELISA測定上清液中的MCP-1蛋白分泌，并根據(jù)由AlamarBlue檢測測定的細胞活力歸一化。PDE4D、mRNA表達水平由RT-PCR測量，并根據(jù)B2M對照基因的表達進行相對量化。抑制的百分比相對于用相應(yīng)的對照處理過的細胞來確定。統(tǒng)計分析使用t檢驗進行，*p<0.05.***p<0.001。圖10顯示了反義寡核苷酸(AON)TOP1572抑制PHA刺激人PBMC的細胞因子分泌的功效。用TOP1572(6,2nM)或相應(yīng)的對照AON(TOP1572,6.3nM)轉(zhuǎn)染PBMC過夜，然后第二天用有絲分裂原PHA(10jug/ml)刺激6小時。使用ELISA將細胞上清液中的細胞因子IL-2(A)和TNF-a(B)的水平量化。數(shù)據(jù)表示1L-2(pgZml)或TNF-a(ng/ml)的三個重復(fù)孔的平均值:tSE。統(tǒng)計分析先使用單因素ANOVA進行，然后使用Bonfen'oni多重比較檢驗進行(比較AON轉(zhuǎn)染后的細胞因子水平與PHA刺激細胞或者與相應(yīng)的對照AON處理細胞)，**p<0.01且***p<0.001。細胞因子分泌的抑制％相對于響應(yīng)PHA而獲得的水平。圖11顯示了AONTOP1731抑制有絲分裂原刺激的人PBMC的細胞因子分泌的功效。用TOP1731(3.1nM)或復(fù)合有EscortIV的相應(yīng)對照AON(TOP731,3.1nM)轉(zhuǎn)染PBMC過夜，然后第二天用有絲分裂原PHA(10嗎/ml)刺激6小時。使用ELISA將細胞上清液中的細胞因子IL-2(A)和TNF-a(B)的水平量化。數(shù)據(jù)表示IL-2(pg/ml)或TNF-a(ng/ml)的三個重復(fù)孔的平均值士SE。統(tǒng)計分析使用單因素ANOVA進行，然后使用Bonferroni多重比較檢驗進行(比較AON處理后的細胞因子水平與PHA刺激細胞或者與相應(yīng)對照AON處理細胞),***p<0.001。細胞因子分泌的抑制％相對于響應(yīng)PHA而獲得的水平。圖12顯示了將F，ANA修飾的TOP1572和TOP1731組合時對PHA刺激PBMC的細胞因子分泌減少的強化功效。用TOP1572-F2(3.1和6.3nM)、TOP1731-F3(3.1和6.3nM)或者這兩種AON(各3.1nM，總計6.3nM)將人PBMC，轉(zhuǎn)染過夜。第二天用PHA(10嗎/ml)刺激PBMC6小時，然后通過ELISA將細胞上清液中的細胞因子IL-2的水平量化。IL-2分泌的抑制％相較于PHA刺激后的未轉(zhuǎn)染細胞產(chǎn)生的水平進行確定。數(shù)值表示平均值士S.E.。圖13比較了在293細胞系中對于減少(A)PDE4D和(B)PDE4BmRNA表達的TOP1572(PS-DNA)的功效與T0P1572-F1、TOP1572-F2和TOP1572-F3(PS-FANA版本)的功效。用250nM的AON或相應(yīng)的在無抗生素培養(yǎng)基中以比率為1嗎寡核苷酸:l]LiL脂質(zhì)復(fù)合到Lipofectamine2000中的對照將細胞轉(zhuǎn)染24小時、48小時或72小時。PDE4D和PDE4BmRNA表達水平由RT-PCR測量，并根據(jù)PPIB對照基因的表達進行相對量化。特異性PDEmRNA抑制的百分比相對于用相應(yīng)對照轉(zhuǎn)染的細胞中的基因水平進行確定。圖14比較了在A549細胞系中對于減少PDE7AmRNA表達的TOP1731(PS-DNA)的功效與TOP1731-F3(PS-FANA)的功效。用250nM、125nM或75nM的AON或相應(yīng)的在無抗生素培養(yǎng)基中以比率為0.8寡核苷酸:ljiL脂質(zhì)復(fù)合到Lipofectamine2000中的對照寡核芬酸將細胞轉(zhuǎn)染48小時。PDE7AmRNA表達水平由Quantigene測定來測量，并沖艮據(jù)B2M對照基因的表達將其相對量化。特異性PDEmRNA抑制的百分比相對于用相應(yīng)對照轉(zhuǎn)染的細胞中的基因水平確定。表格的簡要說明表lb鑒定了根據(jù)本發(fā)明的人PDE3A反義寡核苷酸。表lc鑒定了根據(jù)本發(fā)明的具有針對一種以上PDE4亞型(PDE4A/4D或PDE4B/4D)的雙特異性的反義寡核普酸。AON序列中的PDE4亞型間的堿基對錯配以下劃線示出。在AON中堿基對的肌普置換用字母I表示。表ld鑒定了具有針對PDE3B、PDE4D和PDE7A的特異性和針對PDE4A和4B的雙特異性的反義寡核苷酸。表2a鑒定了本發(fā)明的含有FANA石威基的人PDE7A反義寡核苷酸。FANA修飾堿基以粗體字表示。表2b鑒定了本發(fā)明的含有FANA堿基的人PDE3A反義寡核普酸。FANA修飾堿基以粗體字表示。表2c鑒定了本發(fā)明的含有FANA堿基的人PDE3B反義寡核苦酸。FANA修飾堿基以粗體字表示。表2d鑒定了本發(fā)明的舍有FANA堿基的人PDE4A反義寡核苦酸。FANA修飾石咸基以粗體字表示。表2e鑒定了本發(fā)明的含有FANA堿基的人PDE4D反義寡核苷酸。FANA修飾堿基以粗體字表示。表2f鑒定了本發(fā)明的含有FANA堿基的人PDE4B反義寡核苷酸。FANA修飾石咸基以粗體字表示。表2g鑒定了本發(fā)明的具有針對一種以上PDE4亞型的雙特異性并含有FANA堿基的人反義寡核苦酸。FANA修飾堿基以粗體字表示。表3顯示了用于實時PCR的人寡核苷酸引物。具體實施例方式此處的發(fā)明涉及用于治療與細胞內(nèi)cAMP減少有關(guān)的疾病和/或與至少一種PDE的水平升高有關(guān)的疾病的反義寡核香酸類化合物、治療組合物和方法。本發(fā)明旨在提高細胞內(nèi)cAMP的水平，同時降低炎性細胞釋放的促炎介質(zhì)以及酶的水平。為了取得這些效果，在一個方面，本發(fā)明利用了在此稱為"多基因敲除"的方法。多基因敲除指的是，通過不僅下調(diào)所針對的同工酶基因而且下調(diào)一種或多種相關(guān)基因的一種本發(fā)明的反義寡核苷酸化合物，或者通過各自下調(diào)不同同工酶基因的至少兩種反義寡核苦酸化合物的組合，來抑制或下調(diào)多個基因。與細胞cAMP水平降低有關(guān)的疾病包括其中有至少一種cAMP特異性PDE水平升高的疾病(即PDE相關(guān)疾病)。術(shù)語"下調(diào)"在此處用于指對基因表達至少部分地抑制。根據(jù)本發(fā)明，反義寡核苦酸化合物下調(diào)或抑制所針對的基因，即，該反義寡核苷酸化合物對其顯示出足以引起抑制的序列互補性的基因。21指在與細胞cAMP減少有關(guān)的疾病和/或至少一種PDE水平升高有關(guān)的疾病的病理生理學(xué)中可能也起作用的其他基因，但是對這些基因，該反義寡核苷酸化合物不具有完全的或者部分的互補性。這樣的基因包括但不局限于，編碼PDE酶或同種型、介質(zhì)(例如，細胞因子和趨化因子)的基因和編碼酶的基因。介質(zhì)的實例包括IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15和TNF-a。適當(dāng)?shù)拿傅膶嵗ǖ幌抻?，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，如MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-12。根據(jù)本發(fā)明，反義寡核苷酸(AON)化合物在此定義為對編碼特殊靶蛋白的DNA或mRNA顯示出互補性，使得能夠干擾mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯和/或誘導(dǎo)RNase(核糖核酸酶)或RNase樣活性，/人而起減少耙蛋白的表達的作用的天然產(chǎn)生的或經(jīng)修飾的(優(yōu)選為耐核酸酶的)寡核普酸。當(dāng)該寡核芬酸化合物與靶DNA或mRNA雜交時，靶蛋白的表達減少，從而干擾/防止其轉(zhuǎn)錄/翻譯。因此，本寡核苦酸化合物必須充分地與所針對的核酸互補以與該核酸雜交。所以，如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，盡管在最優(yōu)選實施方式中，這些寡核苷酸化合物與所針對的核酸有100%互補性，但是100%互補性對于在寡核苷酸化合物與所針對的核酸之間發(fā)生雜交而言不是必需的。于是，在一些實施方式中，這些寡核苷酸化合物可能與所針對的核酸具有約95%、90%、85%、80%、75%、70%、60%和50%的互補性。術(shù)語"核酸"和"核酸分子"在本文中可以互換使用，指的是由核苷酸(即核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或者兩者)組成的分子。該術(shù)語包括核糖核苷酸、脫氧核糖核苦酸的單體和聚合物，在聚合物的情況中，核糖核苷酸和/或脫氧核糖核普酸通過5'-3'連接(linkage)而連4妻在一起。不過，連4妻可以包4舌在核酸合成領(lǐng)域已知的任何連接，包括例如含5'-2'連接的核酸。核酸分子中卩吏用的核苦酸可以是天然產(chǎn)生的，也可以是合成制造的能夠與天然產(chǎn)生的4^基對形成堿基配對關(guān)系的類似物。能夠形成堿基配對關(guān)系的非天然產(chǎn)生的堿基的實例包括但不限于氮雜和脫氮嘧啶類似物、氮雜和脫氮嘌呤類似物和其中嘌呤和嘧啶環(huán)的一個或多個碳和氮原子已被雜原子(例如，氧、硫、硒和磷等)取代的其他雜環(huán)堿基類似物。此處的發(fā)明還涉及到對一種或多種的反義寡核苷酸的修飾，這樣的修飾不22會對所述反義寡核苷酸減少或抑制靶蛋白的表達的活性有顯著不利的影響，而是可以^提高此活性。本反義寡核香酸化合物也可以在對其活性無顯著不利影響的情況下通過插入或缺失1個或多個堿基來進行修飾。特別是，在對所針對的基因顯示出100%互補性的寡核普酸的末端處的堿基的增加或缺失通?？梢栽诓伙@著損失抑制活性的情況下進行。可以進行這樣的修飾以提高寡核苷酸的活性或者增強寡核苷酸的穩(wěn)定性。此外，本反義寡核苷酸化合物中的1個或多個堿基的取代也可以在對活性無不利影響的情況下進行，例如，用一種。票呤置換另一種。票呤(腺。票呤、鳥嘌呤)和用一種嘧啶置換另一種嘧啶(胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)。根據(jù)本發(fā)明的反義寡核苦酸化合物還包括siRNA(小干擾RNA)和由RNAi(RNA干擾)方法產(chǎn)生的含有siRNA的RISC(RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物)。最近4艮道的RNA干擾(RNAi)方法被視為一種抑制靶基因表達的新工具。如若干年前已知的，RNAi是基于低級真核生物中的古老的抗病毒防御機制。這是由雙鏈RNA及其剪切為21-23nt的小干擾RNA(siRNA)所誘導(dǎo)，這在RISC復(fù)合物的協(xié)助下與單鏈形式的草巴mRNA雜交之后導(dǎo)致同源的內(nèi)源性mRNA的降解。RNAi作用的方式仍有待充分闡述，但它已經(jīng)成為在各種各樣的真核細胞物種(如線蟲、蠅類、植物、真菌和哺乳動物)中產(chǎn)生功能缺失表型的首選方法。根據(jù)本發(fā)明的反義寡核苷酸化合物還包括可以引入上述化學(xué)修飾的、能夠體外和/或體內(nèi)抑制基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的核酶和短核苷酸序列、單鏈或雙鏈的RNA或DNA。在一個方面，本發(fā)明的組合物和方法，雖然不受具體作用模式的限制，似乎通過已命名為"多基因敲除"的機制發(fā)揮作用。在本發(fā)明的背景中的多基因敲除是指1)一種反義寡核香酸化合物，它不僅下調(diào)其所針對的基因而且下調(diào)其他相關(guān)基因；和2)至少2種反義寡核苷酸化合物的組合，所述至少兩種反義寡核苷酸化合物各自能夠下調(diào)基因，各自以該反義寡核苷酸化合物本身對下調(diào)所針對的基因?qū)嶋H上無效的濃度存在，該組合導(dǎo)致了對這些反義寡核苷酸化合物所針對的每種基因的顯著下調(diào)，并且還可以下調(diào)其他相關(guān)基因。此效果首次公開在本申請人的PCT申請公報WO05/030787號中。在一個方面，本發(fā)明提供了一種組合物，該組合物包含至少2種反義寡核苷酸化合物，每種反義寡核苷酸化合物能夠下調(diào)不同的基因。在該方案的一些實施方式中，至少2種反義寡核苷酸化合物的組合導(dǎo)致了每種基因的顯著下調(diào)，這種下調(diào)大于每種反義寡核苷酸化合物單獨下調(diào)每種基因的能力的加合。在一個方面，本發(fā)明提供了用于治療和/或預(yù)防與細胞cAMP減少有關(guān)的疾病和/或至少一種PDE水平升高有關(guān)的疾病的藥物組合物，所述組合物包含藥學(xué)可接受的載體和至少兩種反義寡核苷酸化合物，每種反義寡核苷酸化合物針對至少一部分的不同的靶PDE編碼基因，每種寡核苷酸化合物能夠下調(diào)其所針對的耙基因，每種寡核普酸化合物以該寡核苷酸化合物顯示少于20%的對靶PDE基因的抑制的濃度存在，該組合顯示出超過20%的抑制，并使對至少一種靶基因和可任選的其他相關(guān)基因的抑制至少加倍。本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到，本發(fā)明的寡核苷酸化合物的在非常低的濃度的組合，例如，顯示出小于1。/o的對靶PDE基因的抑制的濃度，可能無法組合成顯示出至少20%的抑制。能夠用于形成本發(fā)明的組合的每種寡核苷酸化合物的最低濃度會變化，此濃度可以為達到0.5%抑制的濃度或者達到1%~5%抑制的濃度。本發(fā)明提供了用于治療和/或預(yù)防與細胞cAMP減少有關(guān)的疾病和/或至少一種PI)E水平升高有關(guān)的疾病的藥物組合物，所述組合物包含藥學(xué)可41受的載體和至少兩種反義寡核苦酸，所述至少兩種反義寡核苦酸各自能夠下調(diào)不同的靶基因，這些寡核苷酸中的至少一種以其本身實際上無效的濃度(例如，顯示出少于20%的對靶基因的抑制的濃度)存在，這些寡核苷酸的組合顯示出超過20%的抑制，并使對至少一種靶基因和可任選的其他相關(guān)基因的抑制至少加倍。本發(fā)明還提供了至少兩種反義寡核苷酸化合物的組合在用于治療和/或預(yù)防與細胞cAMP減少有關(guān)的疾病(如呼吸道炎性疾病)的應(yīng)用，每種寡核苷酸化合物針對編碼不同的PDE同種型的基因，每種寡核苷酸化合物能夠下調(diào)其所針對的基因，這些寡核苷酸化合物以每種反義寡核苷酸化合物本身對下調(diào)其所針對的基因?qū)嶋H上無效的濃度存在，所述至少兩種寡核苦酸化合物的組合可以有效地下調(diào)24這些寡核苦酸化合物所針對的基因中的至少一種基因和可任選的其他相關(guān)基因。本發(fā)明還提供了一種治療和/或預(yù)防與細胞cAMP減少有關(guān)的疾病(如炎性呼吸系統(tǒng)疾病)的方法，該方法包括向受試者施用至少兩種反義寡核芬酸化合物，所述至少兩種反義寡核香酸化合物各自能夠下調(diào)不同的耙PDE基因，這些寡核苷酸化合物以每種反義寡核苷酸化合物本身對下調(diào)其靶基因?qū)嶋H上無效的濃度(例如，顯示出少于20%的對靶基因的抑制的濃度)進行施用，這些寡核苦酸化合物的組合可以有效地下調(diào)這些寡核苦酸化合物所針對的基因中的至少一種基因和可任選的其他相關(guān)基因。本發(fā)明還4是供了上述藥物組合物在制造用于治療和/或預(yù)防與細胞cAMP減少有關(guān)的疾病或cAMP特異性PDE水平升高有關(guān)的疾病(PDE相關(guān)疾病，如炎性疾病和癌癥)的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的方法和組合物所針對的炎性疾病總體上定義為其中存在炎性細胞和/或介質(zhì)的疾病。炎性疾病的實例包括但不限于多發(fā)性硬化癥、接觸性皮炎、變應(yīng)性和非變應(yīng)性眼病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、感染性休克、骨質(zhì)疏松癥和認知障礙。本發(fā)明的方法和組合物所針對的炎性呼吸系統(tǒng)疾病總體上定義為其中存在炎性細胞和介質(zhì)的呼吸道和肺部的疾病。炎性呼吸系統(tǒng)疾病的實例包括但不限于COPD、譯喘、嗜酸性粒細胞性咳嗽、支氣管炎、肺同種異體移植物的急性和慢性排斥反應(yīng)、結(jié)節(jié)病、肺纖維化、鼻炎和鼻竇炎。本發(fā)明還提供了上述藥物組合物在制造用于治療和/或預(yù)防病理生理學(xué)中涉及環(huán)AMP減少的疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了修飾反義寡核苷酸的方法，使得反義寡核苷酸可以到達靶核苦酸和/或更有效地針對靶基因而用于治療和Z或預(yù)防炎性呼吸系統(tǒng)疾病。本發(fā)明還提供了一種包含上迷組合物的制劑，該制劑可全身和/或局部施用。本發(fā)明還提供了將藥物組合物遞送到靶多核苷酸的體內(nèi)方法，所述方法包括向受試者施用上述組合物與使該組合物能夠到達一種或多種靶基因的表面活性劑的組合。優(yōu)選的是，可以使用本發(fā)明的反義寡核苷酸化合物進行治療的受試者或患者包括但不限于無脊推動物、脊椎動物、鳥類、哺乳動物(如豬、山羊、綿羊、牛、狗、貓，尤其是人類)。本發(fā)明的寡核苷酸化合物被設(shè)計為適用于待治療的具體動物。特別是，反義寡核普酸化合物的序列將鑒于物種間基因組差異而隨治療受試者而改變。本發(fā)明還提供了有效抗PDE家族酶(例如，能夠抑制其表達)的反義寡核苦酸，所述PDE家族酶包括但不限于PDE3、PDE4和PDE7。本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到，每種PDE亞型(subtype)可以還包括同種型。例如，PDE3亞型包括PDE3A和PDE3B同種型；PDE4亞型包括同種型PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D;PDE7亞型包括同種型PDE7A1、PDE7A2、PDE7A3和PDE7B。在此使用的術(shù)語"該反義寡核苦酸化合物實際上無效的濃度"指每種寡核苷酸化合物以單獨取用時被觀察到實際上無法下調(diào)該寡核普酸化合物所針對的基因的濃度(顯示出少于20%的對靶基因的抑制的濃度)進行使用。這與本發(fā)明的至少兩種寡核苦酸化合物的組合的效果相反，所述至少兩種寡核苦酸化合物各自以單獨對它們所針對的基因無效的濃度(顯示出少于20%的抑制的濃度)存在，該組合顯示出超過20%的抑制，并且可以有效地使對這些寡核苷酸所針對的基因中的至少一種基因的抑制至少加倍。此處所用的術(shù)語"寡核苷酸"指包含約1到大約100個核苷酸、更優(yōu)選為1到80個核苦酸、進而更優(yōu)選為約4到大約35個核苷酸的核酸分子。術(shù)語"寡核芬酸"也包括上述的經(jīng)修飾的寡核苷酸和寡核苷酸化合物。此處使用的術(shù)語"修飾的寡核苦酸"和"修飾的核酸分子"指在所有或者任何的核酸堿基、糖部分、核普酸間磷酸鍵以及增加了取代基(如二胺、膽固醇和其他脂溶性基團)的分子的天然分子結(jié)構(gòu)的分子水平上具有一種或多種化學(xué)修飾或者具有這些位點處的修飾的組合的核酸(包括寡核苷酸)。核苷酸間磷酸連接可以是磷酸二酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧曱基酯、乙酰胺酯、氨基甲酸酯、硫醚、橋聯(lián)氨基膦酸酯(phosphoranidate)、橋聯(lián)亞甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、曱基膦酸酯、二硫代磷酸酯、橋聯(lián)硫代磷酸酯和/或砜核苷酸間連接或3'-3'、2'-5'或5'-5'連接，以及這樣類似的連接的組合(產(chǎn)生混合的主鏈修飾寡核普酸)。這些修飾可以在寡核苷酸分子內(nèi)(單一或重復(fù)的)或者位于寡核苷酸分子的一個或多個末端，可以包括分子中核苷酸間磷酸連接(如膽固醇、在氨基之間具有數(shù)目變化的碳殘基的二胺化合物)的加入以及切割或交聯(lián)到相反鏈或者相關(guān)的酶或其他蛋白的末端核糖、脫氧核糖和磷酸酯修飾。如核糖-二醛等親電基團可以與所述蛋白的賴氨酰殘基的s-氨基共價連接。連接到寡聚物上的如N-乙基馬來酰亞胺等親核基團可以共價連接到mRNA的5'端或者另一親電位點。術(shù)語"修飾的寡核苷酸"還包括具有對糖部分的修飾的寡核普酸，如2'-取代的核糖核苷酸或者脫氧核糖核苦酸單體，其中任意所述單體經(jīng)5'-3'連接而連接在一起。修飾的寡核苷酸也可以由維持了序列的靶特異性的PNA或嗎啉修飾主鏈組成?？扇芜x的是，目前描述的寡核普酸可以與各種生理學(xué)載體分子一起配制。目前描述的寡核普酸也可以與強化其進入靶細胞的能力的分子相復(fù)合。這樣的分子的實例包括但不限于碳水化合物、多胺、氨基酸、肽、脂質(zhì)和對于細胞生長具有重要性的分子。例如，寡核苷酸可結(jié)合脂質(zhì)，由此產(chǎn)生的寡核苷酸/脂質(zhì)乳液或者脂質(zhì)體懸浮液可特別有效地提高寡核苷酸的體內(nèi)半衰期。作為替代，針對PDE靶的寡核苷酸也可以質(zhì)子化/酸化，從而起磷酸二酯酶抑制劑和抗菌劑的雙重作用。因此，本發(fā)明的另一個實施方式是另外質(zhì)子化/酸化的PDE調(diào)節(jié)(modulating)治療用寡核芬酸用于提高細胞攝取、改善脂質(zhì)體包封、因而還可以用作為抗生素的應(yīng)用。此外，寡核苦酸可以與例如進一步增強寡核苷酸的體內(nèi)穩(wěn)定性或以其他方式加強其藥理學(xué)性質(zhì)(例如，延長體內(nèi)半衰期、降低毒性等)的各種公知化合物或結(jié)構(gòu)相復(fù)合。此處所用的術(shù)語"核酸主鏈"指在分子中連接核苷酸的化學(xué)部分的結(jié)構(gòu)。這可以包括由任何的和所有的以化學(xué)方式連接的核苷酸所形成的結(jié)構(gòu)。此處所用的修飾的主鏈包括對核芬酸之間的化學(xué)連接的修飾，以及可以用于增強穩(wěn)定性和親和性的其他修飾，如對糖結(jié)構(gòu)的修飾。例如可以使用脫氧核糖的[a]-端基差向異構(gòu)體，其中堿基相對于天然的[P]-端基差向異構(gòu)體是倒位的。在一個優(yōu)選的實施方式中，糖基的2'-OH可以變?yōu)?'-0-烷基或2'-0-烷基-n(0-烷基)，這提供了對降解(不包括親和性)的抵抗性。此處可互換使用的術(shù)語"酸化"和"質(zhì)子化/酸化"指將質(zhì)子(或正電性的氫離子)加入到核酸上的質(zhì)子受體位點的過程。質(zhì)子受體位點包括核酸的堿基結(jié)構(gòu)上的氨基和磷酸二酯鍵的磷酸酯。當(dāng)pH降低時，被質(zhì)子化的這些受體位點的數(shù)目增加，導(dǎo)致質(zhì)子化/酸化程度更高的核酸。術(shù)語"質(zhì)子化Z酸化的核酸"指當(dāng)以約每毫升16A260的濃度溶解在水中時具有低于生理pH的pH(即低于約pH7)的核酸?！穭?wù)飾的核酸、抗核酸酶的核酸和反義核酸都可以被此定義所涵蓋。一般而言，核酸是通過使質(zhì)子加入到核酸的反應(yīng)位點上來質(zhì)子化/酸化的，盡管會降低核酸的pH的其他修飾也可以使用并且也被jt匕術(shù)i吾所涵蓋。此處所用術(shù)語"封端的，，指在分子水平具有防止選定核芬酸降解(例如通過核酸酶作用而降解)的化學(xué)修飾的核酸。這種化學(xué)修飾的定位使得它保護核酸的整體部分，例如反義寡核苷酸的編碼區(qū)。封端可以是3'封端或5'封端。例如，3'封端可以在分子的3'最末端位置，或者如果它是核酸整體序列的3'，則可以在3'端的內(nèi)部。術(shù)語"基本上抗核酸酶的"指與天然存在的或未纟，飾的核酸相比較抗核酸酶降解的核酸。本發(fā)明的^奮飾的核酸至少有超過對應(yīng)的未》務(wù)飾的核酸1.25倍的核酸酶降解抗性，與對應(yīng)的未修飾的核酸相比，更優(yōu)選超過至少2倍的抗性，進而更優(yōu)選超過至少5倍的抗性，最優(yōu)選超過至少10倍的抗性。這種基本抗核酸酶的核酸包括但不限于具有修飾主鏈的核酸，所述修飾主鏈如硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、乙基磷酸三酯、2'-0-曱基硫代磷酸酯、2'-0-曱基-對乙氣基核糖核苷酸、2'-0-烷基、2'-0-烷基-n(0-烷基)、3'-0-烷基、3'-0-烷基-n(0-烷基)、2'-氟、2'-脫氧-赤蘚戊呋喃糖基、2'-0-甲基核糖核苷、氨基曱酸甲酯、碳酸曱酯、倒位的堿基(如倒位的T)或這些主鏈的嵌合形式。此處所用術(shù)語"基本上抗酸的"指與未修飾核酸相比較抗酸降解的核酸。通常，通過比較抗性核酸的降解百分率與對應(yīng)的未修飾的核酸(即具有"正常"主鏈、堿基和磷酸二酯^fc的相應(yīng)的核酸)的降解百分率來測量核酸的相對抗酸性。與其對應(yīng)的未修飾的核酸相比，抗酸性核酸優(yōu)選至少有超過所述對應(yīng)的未修飾的核酸1.5倍的酸降解抗性，更優(yōu)選有超過至少2倍的抗性，進而更優(yōu)選有超過至少5倍的抗性，最優(yōu)選有超過至少10倍的抗性。此處所用的術(shù)語"PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7B寡核苷酸"各自指一種寡核苷酸，它對應(yīng)地靶向影響PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7B表達或活性的序28列。這些包括但不限于PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7BDNA編碼序列，PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7BDNA啟動子序列，PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7BDNA增強子序列，以及編碼PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7B的mRNA等。如以上討論，本發(fā)明的一個實施方式提供耙向影響PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4D、PDE7A表達或活性的序列的反義寡核苦酸。在一個實施方式中，反義寡核苷酸可以具有表lald或表2a2g所鑒定的序列之一。在另一個實施方式中，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，反義寡核苷酸可以包含這些序列的片段或變體，這可以改變寡核苷酸組成和/或長度，但維持或增加寡核苷酸下調(diào)基因表達的活性。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供具有表la~ld或表2a2g所鑒定的序列的至少兩種反義寡核苷酸的組合。對單一寡核苷酸的有效性的比較示于(但不限于)圖lA、圖lb和圖5。例如，在圖1A中，TOP1512(SEQIDNO.91)針對人類PDE4A和PDE4B，同時體外抑制這兩個靶。類似地，圖lb顯示了可識別PDE4B和PDE4D共有的序列的TOP1545(SEQIDNO.14)和TOP1556(SEQIDNO.24),表明兩個靶序列均有抑制作用?？勺R別PDE4A和PDE4D共有的序列的TOP1507(SEQIDNO,10)和TOP1508(SEQIDNO.11)起對兩個靶基因均有抑制的作用。對至少2種寡核苷酸化合物的組合其有效性的比較示于但不限于圖6a和12。例如，在圖6中，TOP1545-F3(SEQIDNO.85)和TOP-1731-F2(SEQIDNO.53)表現(xiàn)出比這些寡核苷酸的任何一種在單獨使用時對各自靶所具有的效果更大的同時減少PDE4B、PDE4D和PDE7A表達的效果。在圖6b中，TOP1545-F3(SEQIDNO.85)和TOP-1731-F2(SEQIDNO.53)表現(xiàn)出比這些寡核苷酸的任何一種以相同總劑量(6.3nM)單獨使用時對IL-2具有的效果更大的減少人類PBMC中IL-2釋放的效果。參照圖12，TOP1572-F2(SEQIDNO.122)和TOP17314-F3(SEQIDNO.54)表現(xiàn)出比單獨使用時更大的抑制IL-2分泌的效果。反義寡核苦酸化合物的許多組合可根據(jù)本發(fā)明進行使用，這些組合導(dǎo)致上述的多基因敲除。反義寡核苷酸的組合的實例可以包括但不限于至少一種針對29PDE3的寡核苦酸化合物與至少一種針對PDE7的寡核苦酸化合物組合的替代實例可以包括至少一種針對PDE4的寡核苷酸與至少一種針對PDE7的寡核苷酸。組合的替代實例可以包括至少一種針對PDE3的寡核普酸、至少一種針對PDE4的寡核苦酸與至少一種針對PDE7的寡核苷酸。這樣的反義寡核苷酸化合物可以選自但不限于表la-ld和表2a-2g中提供的寡核苷酸。此處所用術(shù)語"處理"、"進行處理"和"療法"等一般表示獲得期望的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效果。這種效果可以是預(yù)防性的，即完全或部分預(yù)防疾病或其癥狀，和/或可以是治療性的，即部分或完全治愈疾病和/或減輕疾病引起的不利影響。此處所用"處理"涵蓋對前文定義的受試者(尤其是人類)中的疾病的任何處理，并包括(a)預(yù)防受試者患上疾病，所述受試者容易患上該疾病但仍未診斷為患有該疾?。?b)抑制疾病，即阻止疾病的發(fā)展；或(c)緩解疾病，即引起疾病的消退。此處針對載體、表面活性劑和組合物所用的術(shù)語"藥學(xué)可接受的"指可接受用于治療受試患者的物質(zhì)，所述物質(zhì)并非有毒的或?qū)τ谕ㄟ^此處所述任何途徑給藥另外是不可接受的。本發(fā)明總體上涉及通過施用治療有效量的本發(fā)明的反義寡核苷酸化合物對受試者進行的治療，所述化合物包括siRNA、核酶、單鏈或雙《連的短核苷酸序列(包括可以與靶核酸互補或者可以任選地進行上述修飾的RNA和/或DNA)、具有所述RNA寡核苷酸的至少一部分的RNA寡核苷酸，所述RNA寡核苷酸能與RNA雜交形成寡核苷酸-RNA雙鏈體，或嵌合寡核苷酸，它們將下調(diào)或抑制內(nèi)源基因的體內(nèi)表達。"治療有效的"量指無毒性但足以提供希望治療效果的反義寡核苷酸化合物的量。在此情況下，反義寡核普酸的這種劑量有效緩解、改善或預(yù)防正在治療的狀況或疾病的癥狀，如與細胞cAMP減少有關(guān)的疾病、PDE相關(guān)疾病、如炎癥呼吸系統(tǒng)疾病等炎性疾病。此處提供的藥物組合物包含上述反義寡核苷酸化合物和一種或多種的藥學(xué)可接受的表面活性劑。用于增強本發(fā)明的反義寡核苷酸吸收的合適的表面活性劑或表面活性劑成分之前已經(jīng)在美國申請公開號2003/0087845中進行了描述，其中的關(guān)于表面活性劑的內(nèi)容并入本文。該申請?zhí)岢龊线m的表面活性劑"...包括合成和天然、以及全長和截短形式的表面活性劑蛋白A、表面活性劑蛋白B、表面活性劑蛋白C、表面活性劑蛋白D、表面活性劑蛋白E、二飽和磷脂酰膽堿(除了二棕櫚酰以外)、二棕櫚酰磷脂酰膽》威、磷脂酰膽^5威、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、泛醌、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰膽堿、棕桐酰-溶血磷脂酰膽堿、脫氫表雄酮、多辟醇、硫脂酸(sulfatidicacid)、甘油—3-磷酸酯、磷酸二羥基丙酮、甘油、甘油-3-磷酸膽堿、二羥基丙酮、棕櫚酸酯、胞嘧咬二磷酸(CDP)二?；视?、CDP膽石威、膽堿、磷酸膽石咸；以及天然和人工片狀體，它們是以下表面活性劑成分的天然載體媒介Q-3脂肪酸、多烯酸(polyenicacid)、多烯酸(polyenoicacid)、卵磷脂、棕櫚酸、環(huán)氧乙烷或環(huán)氧丙烷的非離子性嵌段共聚物、單體和聚合物形式的聚氧丙烯、單體和聚合物形式的聚氧乙烯、具有葡聚糖和/或烷酰基側(cè)鏈的聚(乙烯胺)、Brij35、TritonX-100和合成表面活性劑ALEC、Exosurf、Survan和Atovaquone等。這些表面活性劑可以在制劑中單獨使用或作為多組分表面活性劑的一部分使用，或共價鍵合到反義寡核苷酸(oligo)的5'和/或3'端。本發(fā)明組合物的反義組分包括至少兩種反義寡核普酸化合物的組合，可以在脂質(zhì)顆?；驀芭?如脂質(zhì)體或微晶)中而包含于藥物制劑中。如美國專利號6,025,339中所述，脂質(zhì)顆?？梢跃哂腥魏魏线m的結(jié)構(gòu)，如單層或多層結(jié)構(gòu)，只要該反義寡核苷酸包含于其中即可。帶正電的脂質(zhì)如乙基硫酸N-[1-(2,3-(二油酰氧)丙基)]-N,N，N-三曱基銨或"DOTAP"，對于這樣的顆粒和嚢泡是特別優(yōu)選的。這種脂質(zhì)顆粒的制備是公知的。參見例如美國專利授予Janoff等的4,880,635;授予Kurono等的4,906,477;授予Wallach的4,911,928;授予Wallach的4,917,951;授予Allen等的4,920,016;授予Wheatley等的4,921,757，等等。本發(fā)明的組合物可以用將反義寡核苷酸化合物輸送到如肺等希望部位的任31吸入時穿過鼻、口和喉并穿過支氣管和肺部肺泡的顆粒)的制劑施用于呼吸系統(tǒng)。一般來說，可吸入顆粒的尺寸為約0.5~10微米。包含在氣溶膠中的具有不可吸入尺寸的顆粒容易沉積在咽喉并被吞咽，因此氣溶膠中不可吸入顆粒的量優(yōu)選最小化。對于經(jīng)鼻施用，優(yōu)選10pm(微米)~500pm的顆粒尺寸以確保保留在鼻腔中?？梢酝ㄟ^將反義化合物與合適的載體(如無菌無致熱原水或磷酸鹽緩沖鹽水)組合來制備用于產(chǎn)生氣溶膠的活性化合物(一種或多種的反義寡核苷酸化合物)的液體藥物組合物。包含反義化合物的固體顆粒組合物可任選地含有用以促進氣溶膠形成的分散劑以及其它治療性化合物。合適的分散劑是乳糖，它可以與反義化合物以任意合適的比例(如1:1的重量比)混合。反義組合物可以按有效地抗支氣管收縮、抗變態(tài)反應(yīng)和/或抗炎的量施用，這樣的量取決于正受治療的疾病的程度、患者受試者的狀況、具體制劑、施用途徑、向受試者施用的時機等。一般來說，優(yōu)選寡核苷酸的胞內(nèi)濃度為0.05^M50iaM，或特別是更優(yōu)選為0.2)iM~5^M。對于向哺乳動物患者如人施用，通常使用約0.001mg/kg、0.01mg/kg、(Umg/kg或1mg/kg至約50mg/kg或100mg/kg或更多的劑量。不過，也可以考慮其它劑量。根據(jù)活性化合物在任何具體制劑中的溶解性，日劑量可以分成一個或數(shù)個單位劑量施用。包含反義化合物的液體顆粒的氣溶膠可以通過任意合適的手段(如用噴霧器)產(chǎn)生。噴霧器是通過壓縮氣體(通常是空氣或氧氣)加速通過狹窄的文丘里噴嘴的方式或者經(jīng)超聲攪拌的方式，將活性成分的溶液或懸浮液轉(zhuǎn)化成治療性氣溶膠霧的可商購獲得的裝置。用于噴霧器的合適制劑包含在液體載體中的活性反義寡核苷酸成分，其量最高可達制劑的40重量％，優(yōu)選為少于20重量％。載體通常是水或水性醇稀溶液，優(yōu)選通過添加例如氯化鈉而使其與體液等滲。可任選的添加劑包括防腐劑(如果制劑不是無菌制備)，例如羥基苯甲酸甲酯、抗氧化劑、抗菌劑、調(diào)味劑、揮發(fā)性油、緩沖劑和乳化劑和其它表面活性劑制劑,，包含一種或多種活性寡核普酸酸化合物和藥學(xué)可接受的表面活性劑的固體32顆粒氣溶膠還可以用任何固體顆粒藥物氣溶膠發(fā)生器產(chǎn)生。用于向受試者施用固體顆粒藥物的氣溶膠發(fā)生器產(chǎn)生可吸入的顆粒(如上所說明的)，并以適于人給藥的速率產(chǎn)生一定體積的含有預(yù)定計量劑量的藥物的氣溶力交?；钚怨押塑账岢煞滞ǔＵ贾苿┑?.1~100(重量比，w/w)。第二種類型的示例性氣溶膠發(fā)生器包括計量劑量吸入器。計量劑量吸入器是加壓式氣溶膠配送器，通常在液化推進劑中含有活性成分的懸浮液或溶液制劑。使用時，這些裝置通過適用于遞送計量體積(通常為10|il~150|il)的閥排送制劑，以產(chǎn)生含有活性成分的細顆粒噴霧。合適的推進劑包括某些氯氟烴化合物，例如二氯二氟曱烷、三氯一氟甲烷、二氯四氟乙烷或氫氟烷及其混合物。制劑還可以另外含有一種或多種助溶劑(如乙醇)、乳化劑和其它表面活性劑制劑(如油酸或脫水山梨醇三油酸酯)、抗氧化劑和合適的調(diào)味劑。無論是由固體顆粒還是由液體顆粒形成，氣溶膠均可以通過氣溶膠發(fā)生器以約1升/分鐘~150升/分鐘的速率產(chǎn)生。本發(fā)明的制劑可以是用于口服、含服、肺內(nèi)、直腸、子宮內(nèi)、腫瘤內(nèi)、顱內(nèi)、鼻、肌內(nèi)、皮下、血管內(nèi)、鞘內(nèi)、可吸入、透皮、皮內(nèi)、腔內(nèi)、可植入、離子電滲、眼、陰道、關(guān)節(jié)內(nèi)、耳、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腺體內(nèi)、器官內(nèi)、淋巴內(nèi)、可植入、緩釋或腸溶包衣制劑。用于制劑的載體可以是例如固體和/或液體載體。對于適于與本發(fā)明的寡核苷酸化合物一起組合以使組合物Z制劑適合施用以治療呼吸系統(tǒng)疾病的其它載體，可以參照"Remington'sPharmaceuticalSciences",第17版，MackPublishingCompany,Easton，Pa.，1985。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種制造的物品，該物品包含包裝材料，包裝材料內(nèi)含有可有效治療與細胞cAMP減少或PDE水平升高有關(guān)的狀況(包括炎癥疾病)的藥學(xué)可接受的反義寡核普酸組合物。在一個實施方式中，所述組合物包含有效抑制PDE基因的反義寡核苷酸化合物，所述寡核苷酸化合物與該基因有至少50%的互補性。在另一方面，所述組合物包含至少2種反義寡核苷酸化合物，每種反義寡核苷酸化合物能下調(diào)不同的PDE基因，每種反義寡核苷酸化合物以該反義寡核香酸化合物本身對下調(diào)其所針對的基因?qū)嶋H上無效的濃度存在，這些反義寡核苷酸化合物的組合可以有效下調(diào)這些反義寡核苷酸所針對的基因中的至少一種基因。33在一個實施方式中，所述物品的包裝材料包舍標簽，該標簽指示該組合物能用于治療炎癥疾病，并且還可以另外包括一個指示所述疾病是多發(fā)性硬化癥、接觸性皮炎、變應(yīng)性和非變應(yīng)性眼病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、膿毒性休克、骨質(zhì)疏松癥和認知障礙中的一種。在另一個實施方式中，所述物品的包裝材料包含標簽，該標簽指示該組合物能用于治療炎性呼吸系統(tǒng)疾病，并還可以另外包括一個指示所述疾病是COPD、譯喘、嗜酸性粒細胞性咳嗽、支氣管炎、肺同種異體移植物的急性和慢性排斥反應(yīng)、結(jié)節(jié)病、肺纖維化、鼻炎或鼻竇炎中的一種。對于本發(fā)明的目的，所述包裝材料可以是用于包裝本發(fā)明的含有核苷酸的組合物的任何合適的材料，包括瓶或其他容器(塑料或玻璃)、紙盒、管或其它保護性包裝材料。應(yīng)當(dāng)意識到的是，包裝可以隨寡核苷酸組合物的性質(zhì)而變化，例如，液體制劑可以進行不同于氣溶膠制劑的包裝。通過以下非限制性實例對本發(fā)明進行更詳細的說明。實例才才津+和試劑AIM-V培養(yǎng)基(Invitrogen,貨號31035-025);OptiMEMI(Invitrogen,貨號31985-07,批號1244206);FBS(月臺牛血清，Wisent,貨號80150);青霉素，鏈霉素(GIBCO,貨號15140-122);HEPES(Wisent,貨號2606()CI)和L-谷氨酰胺(Gibco,貨號25030-081);DMEM/F12(Wisent,貨號10090CV);丙酮酸鈉(Wisent,貨號25000-Ci);無菌PBS(GIBCO,貨號25030-081);0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA(Wisent,貨號25-052-Ci);HBSS(Hank氏平衡鹽溶液，Wisent,貨號21-022CV);PHA(植物血凝素，Sigma,貨號L-9132,批號015K88913);Ficollpaque(Amersham,貨號17-1440-03);Trizol(Invitrogen,貨號:15596-018);DnaseI(Fermentas,貨號EN0521);SuperscriptFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR試劑盒(Invitrogen,貨號11卯4-018);dNTPs(Invitrogen,貨號10297-018);oligo(dT)12.8:(Invitrogen,貨號11904-018);QiagenRNAeasyMiniKit(g—",貨號74106);QiaVac24Manifold(Qiagen,貨號19403);一次性真空連才秦器(Vacconnector)(Qiagen，貨號19407);RiboGreenQuantificationReagent(Invi加gen-Molecularprobes,貨號R-11490);Light-CyclerInstrument1.5版(Roche,貨號3531414);20ml反應(yīng)用LC毛細管(Roche.貨號l卯9339);LCFastStartDNAMasterSYBRGreen1PLUS(100ml)(Roche,貨號03752186001);K3EDTA管(GreinerBio-one,貨號455036B110306);CyclicAMPEIAKit(Cayman,貨號581001)人TNF-aELISA試劑盒(BioSource貨號CHC-1754,批號041703);人IL-8/CXCL8ELISA試劑盒(Biosource,貨號CHC1303);HumanMCP-1/CCL2ELISA試劑盒(Biosource,貨號KHC1012);cAMPEIA試劑盒(Cayman,貨號581001);人GMCSFELISA(Medicorp,貨號CHC0904);人IL-2ELISA(BDBiosciences,貨號5551卯);ELISA讀板儀(濾光片450nm，參比濾光片650nm,Biorad，680型)；EscortIV轉(zhuǎn)染劑(Sigma-Aldrich,貨號3287，批號094K0565);hlL-l"(Peprotech,貨號11195D195);Forskolin(Sigma-Aldrich貨號F3917);Rolipram(Sigma-Aldrich貨號R6520,批號022K4604);AlamarBlue(Biosource貨號DAL1100);12孔高結(jié)合力酶標板(Costar,貨號665102);ELISA用TMB色原試齊'J(MediCorp，貨號SB01);LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染劑(Invitrogen，貨號11668-019);QuantigeneScreenKit(Panomics,貨號QG-000-050);20xSSC(3MNaCl,0.3M二水合檸檬酸鈉，pH7.0);十二烷基石克酸鋰10%(重量體積比，w/v)(Sigma,貨號L9781);設(shè)定在53°C、0%C02的培養(yǎng)箱；MW96PlateWasher(BeckmanCoulter);ThermoLuminoskan(LabSystem);EMEM(HyClone,貨號SH30024.01);非必需氨基酸(HyClone,貨號30238.01);BEBM(Clonetics,貨號CC-3171);BEBM試劑盒(Clonetics,貨號3170);人TNF-a(Peprotech,貨號300-01A);人IFNy(Peprotech,貨號315-05)。細胞培養(yǎng)在含有2mML-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、1.5g/l碳酸氫鈉、1mM丙酮酸鈉、10%FBS、100U/mL青霉素和100微克/mL鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)293細胞(人轉(zhuǎn)化胚腎細胞系；ATCC貨號CRL-1573)。在含有2mML-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氬鈉、10%FBS、100U/mL青霉素、100微克/mL鏈霉素的Ham氏Fl2培養(yǎng)基中培養(yǎng)AM9(人肺癌細胞系；ATCC)。人外周血單核細月包(PBMC)(夕卜周血單核細胞)得自健康的志愿者。PBMC通過來自正常供體的EDTAK3血的Ficoll-Hypaque密度梯度離心而分離。PBMC以2x106細胞/mLZ孔鋪板到含AIM-V培養(yǎng)基的12孔板中，所述含AIM-V培養(yǎng)基還添加有100U/mL青霉素、100微克/mL鏈霉素。在含有2mML-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、10%FBS、100U/mL青霉素和100微克/mL鏈霉素的EMEM中培養(yǎng)CYNOM-Kl纟田胞。在BEBM(500mL，添加有BPE2ml;氫化可的松0.5ml;hEGF0.5ml;腎上腺素0.5ml;轉(zhuǎn)鐵蛋白0.5ml;胰島素0.5ml;視黃酸0.5ml;三械甲狀腺原氨酸0.05ml)中培養(yǎng)麗BE細胞。細月包活力用AlamarBlue試驗按生產(chǎn)商的指南系統(tǒng)性地測定細胞活力。反義物(antisense)的制備將硫代磷酸DNA反義物(SigmaGenosys)和硫代磷酸FANA反義物(Topigen、Montreal或UCDN,Calgary)重新懸浮在無菌水中，并稀釋在Opti-MEM中以進行轉(zhuǎn)染。實例中的DNA(非FANA)寡核苷酸的參比為硫代磷酸DNA寡核芬酸。細胞的反義處理A549細胞系將細胞經(jīng)胰蛋白酶消化并重新懸浮在處于無抗生素條件的添加有10%血清的HAM-F12培養(yǎng)基(0.5x105細胞/孔，48孔板)中，然后在37°C培養(yǎng)過夜。第二天，將粘附細胞以中所示濃度用反義物/Lipofectamine復(fù)合物(比率為1嗎寡核普酸1fiLLipofectamine)轉(zhuǎn)染，在37°C培養(yǎng)一定時間。293細胞系將細胞經(jīng)胰酶消化并懸浮在處于無抗生素條件的添加有10%血清的DMEM培養(yǎng)基(lx105細胞/孔，48孔板)中，然后在37。C培養(yǎng)過夜。第二天，將粘附細胞以圖說明中所示濃度用反義物/Lipofectamine復(fù)合物(比率為1pg寡核苷酸1(iLLipofectamine)轉(zhuǎn)染，并在37°C培養(yǎng)一定時間。PBMC分離當(dāng)日，將PBMC在AIM-V培養(yǎng)基中鋪板(2.0xl0Vml，12孔板)。將反義物與EscortIV試劑(Sigma)復(fù)合(比率為1嗎寡核苦酸0.5}iLEscortIV)，然后以圖中所示濃度添加。將細胞在37。C、5%C02、潮濕(humidity)下培養(yǎng)18~24小時。CYNOM-K1細月包系將細胞經(jīng)胰蛋白酶消化并重新懸浮在處于無抗生素條件的添加有10%血清的EMEM培養(yǎng)基中(0.5x105細胞/孔，200)iL，48孔板)，然后在37。C培養(yǎng)過夜。第二天，將粘附細胞以中所示濃度用反義物ZLipofectamine2000復(fù)合物(比率為1(ig寡核苷酸2|LiLLipofectamine)轉(zhuǎn)染，并在37°C培養(yǎng)一定時間。NHBE細胞將細胞經(jīng)胰蛋白酶消化并重新懸浮在處于無抗生素條件的BEBM完全培養(yǎng)基中(0.5x105細胞/孔，20(H丄，48孔板)，然后在37。C培養(yǎng)過夜。第二天，將粘附細胞以中所示濃度用反義物/Lipofectamine2000復(fù)合物(比率為1)ig寡核苷酸1Lipofectamine)轉(zhuǎn)染，并在37°C培養(yǎng)一定時間。RNA提取根據(jù)RNAeasy樣i量試劑盒(minikit)程序用Qiagen的QiaVac24歧管從細月包沉淀中提取RNA并根據(jù)Fermentas方法用DNase-I處理。根據(jù)生產(chǎn)商程序(Invitrogen-Molecular4笨針)用RiboGreen試劑定量RNA。逆轉(zhuǎn)錄(RT)使用RT-PCR用SuperscriptFirst-StrandSynthesisSystem試劑盒，在20的總反應(yīng)體積中進行第一鏈cDNA的制備。首先將l嗎的RNA與0.5mM的各種dNTP、0.5嗎oligo((1丁)12.18—起在65°C變性5分鐘，在冰上冷卻至少1分鐘。將混合物在42。C培養(yǎng)2分鐘，加入另一份預(yù)混物，該預(yù)混物含有l(wèi)x第一鏈緩沖液、10mMDTT和40單位SuperscriptIIRT。反應(yīng)在42。C培養(yǎng)10分鐘，在50°C培養(yǎng)1小時并在70。C加熱失活15分鐘。實時PCR在0.4mM各種PCR引物和4|uL的LCFastStartDNAMasterSYBRGreen1PLUS的存在下，在20|iL的總體積中使PCR反應(yīng)混合物與3的cDNA反應(yīng)。步驟l(變性)95。C，10分鐘(斜率(slope)20。C/秒);步驟2(40個循環(huán))95。C，(斜率20。C/秒)；57°C或59°C，5秒(斜率20。CZ秒)；72°C,10秒(斜率20。C/秒)；步驟3(解鏈曲線)95°C,(斜率20。C/秒)；70。C，30秒(斜率20°C/秒)；95。C,0秒(斜率0,1。C/秒)；步驟4(冷卻)40°C，30秒(斜率20。C/秒)。用于各基因的PCR引物序列描述于表3中。使用RelQuant程序(Roche)進行PCR產(chǎn)物的量化。Quantigene測定收獲細胞，并在來自Quantigene⑧試劑盒的lx裂解混合物中在53°C裂解30分鐘。在特異性探針組的存在下在Quantigene⑧捕獲板中在53°C將細胞裂解物雜交過夜，使用Luminoskan通過發(fā)光信號將mRNA表達線性量化。細胞測定(ELISA，EIA)A549細胞在轉(zhuǎn)染期結(jié)束時，用IL-1卩(10ng/ml)將A549細胞培養(yǎng)4小時。收獲上清液，并使用ELISA分析人IL-8、人MCP-1和人GM-CSF。PBMC在過夜轉(zhuǎn)染后，用6小時將PHA(10i!g/mL)添加到細胞中。在收獲細月包之前，將一些細胞用Rolipram(10嗎/mL)或Forskolin(2jiM)處理30分鐘。收集上清液，并冷凍直至按照生產(chǎn)商的指南進行IL-2和TNF-gtELISA。對裂解的細胞沉淀進行細胞內(nèi)cAMP水平測定，冷凍裂解物，直至按照生產(chǎn)商的程序進行cAMPEIA的時候。NHBE細胞在轉(zhuǎn)染期結(jié)束時，用細胞因子混合物(500U/mLTNF-a+10ng/mLILl-卩+10ng/mLIFNy)將NHBE細胞刺激4小時，通過ELISA測定上清液中的MCP-1蛋白分泌，根據(jù)AlamarBlue測定測量的細胞活力進行歸一化實例1:反義物的組成和體外效力此試驗中制備的反義寡核苷酸的序列和組成如表la、lb、lc和ld所示。所有寡核普酸均通過陰離子交換HPLC或凝膠電泳進行了純化，并經(jīng)使用Sephadex38G-25珠的尺寸排阻色譜除鹽。表la-ld中列出的一些被選序列的效力在圖1A和lb中顯示，圖1A和lb顯示了用所示AON進行轉(zhuǎn)染之后，細胞中的特異性PDE亞型的基因表達的減少。圖1A顯示了細胞系(用于PDE3A、PDE3B和PDE7A的A549或者用于PDE4A、PDE4B和PDE4D的293纟田胞)在用特異性AON過夜轉(zhuǎn)染之后具有降低的靶亞型水平。針對PDE3A/B、PDE4D和PDE7A，用Quantigene⑧測定(Panomics)對PDEmRNA表達水平進行量化，并使用實時PCR量化PDE4A/4B的表達。相對于對照基因((32M、Ppib或HPRT)的表達將PDE亞型水平歸一化，并將這些水平與未處理細胞的表達水平相比較。盡管所設(shè)計的大多數(shù)反義寡核苷酸對PDE亞型具有特異性，但是一些AON,特別是對于PDE4亞型，表現(xiàn)出對于超過一種的PDE4亞型的靶敲除的雙特異性。表lc中列出的序列描述了使用單種AON表現(xiàn)出超過一種的靶基因敲除的AON。圖lb顯示了為雙耙特異性而設(shè)計的這些AON的功效。AONTOP1545(SEQIDNO,14)和TOP1556(SEQIDNO.24)各自可識別PDE4B亞型和PDE4D亞型之間所共有的基因序列(表lc),表明有對于PDE4B和PDE4D的靶基因敲除，而AON.TOP1507(SEQIDNO.10)和1508(SEQIDNO.ll)可有效降低轉(zhuǎn)染細胞中的PDE4A和PDE4D的mRNA水平，這兩種AON可識別PDE4A和PDE4D亞型之間所共有的序列(表lc)。數(shù)據(jù)以用對照錯配或正義AON序列得到的抑制水平與用它們各自的PDE特異性AON序列得到的抑制％相比較而確定的特異性抑制％表示。實例2:AON遞送對細胞的生物學(xué)功能的影響本實例涉及AON對不同細胞類型的生物學(xué)功能、特別是細胞因子和趨化因子分泌的功效。細胞因子和趨化因子是細胞激活和募集的重要介質(zhì)。通過引起免疫細胞(如嗜中性粒細胞和單核細胞Z巨噬細胞)募集的細胞因子的分泌，肺上皮細胞可以在炎癥呼吸系統(tǒng)疾病的病理生理學(xué)中發(fā)揮重要作用。白細胞介素-8(IL-8ZCXCL8)和單核細胞化學(xué)引誘物蛋白-1(MCP-1/CCL2)水平在COPD患者中上升(SzilasiM等，PathologyOncologyResearch.200612:52-60)。IL-8和MCP-1水平可以分別參與嗜中性粒細胞和巨噬細胞募集。IL-8和MCP-1均由肺上皮細胞系A(chǔ)549響應(yīng)IL-lp的刺激而分泌。受刺激的A549細月包還分泌粒細胞-巨噬細胞刺激因子(GM-CSF)，這是已知激活嗜中性粒細胞和巨噬細胞以增強功能的細胞因子。圖2顯示了在AON過夜轉(zhuǎn)染然后用IL-1(3刺激4小時之后，A549細胞中對PDE4D亞型具有特異性的AONTOP1497(SEQIDNO.90)限制趨化因子IL-8/CXCL-8和MCP-1/CCL2和細胞因子GM-CSF分泌的功效。使用此測定使得能夠核實參與肺上皮細胞的炎癥介質(zhì)釋放的PDE亞型。在圖2中，清楚說明了在A549細胞中PDE4D經(jīng)TOP1497(SEQIDNO.90)抑制的貢獻，而PDE7A在這些細胞中對于趨化因子和細胞因子的釋放沒有貢獻，盡管用AONTOP1716(SEQIDNO.92)進行轉(zhuǎn)染成功降低了此基因的mRNA水平。圖2顯示了在用AON轉(zhuǎn)染后功能的變化，特別是通過減少可以發(fā)生在肺上皮細胞中的炎癥介質(zhì)分泌而降低炎癥潛能。圖3顯示了AON限制不同細胞類型，特別是人外周血單核細胞(PBMC)的生物學(xué)功能的功效。PBMC指分泌細胞因子，特別是已知激活巨噬細胞的TNFot和已知激活并刺激T細胞和NK細胞的IL-2的免疫細胞的混合群。用靶向PDE亞型的AON轉(zhuǎn)染過夜然后在第二天用植物血凝素(PHA)刺激的人PBMC與用錯配或正義AON序列轉(zhuǎn)染的PBMC相比分泌較少的TNFa和IL-2(圖3)。用所述AON對PBMC進行轉(zhuǎn)染導(dǎo)致了這些細胞類型的炎癥潛能的降低。在COPD中，炎性細胞和激活的上皮細胞的促炎介質(zhì)和化學(xué)引誘物的釋放有助于進一步提高炎癥水平(SzilasiM等,PathologyOncologyResearch.200612:52-60)?？梢灶A(yù)期的是，對PDE基因表達的抑制將導(dǎo)致PDE活性降低，而這又導(dǎo)致細胞內(nèi)cAMP的增多。圖3顯示了用靶向特異性PDE亞型的AON進行的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致了PBMC中的胞內(nèi)cAMP水平的升高(右軸)。數(shù)據(jù)表示了用PDE特異性AON轉(zhuǎn)染后，PBMC中的細胞因子或cAMP水平與用錯配或正義序列轉(zhuǎn)染后的水平相比的變Jt。細胞因子在包括哮喘和COPD在內(nèi)的所有疾病的慢性炎癥調(diào)控中起關(guān)鍵作用。TNF-a是在若干炎癥疾病中表達的最重要的促炎細胞因子之一。TNFa水平在患有COPD的患者的誘導(dǎo)唾液中顯著升高(Keatings等，Am.J.Respir.Crit.CareMed.1996;153;530—534.)。此外，有證據(jù)表明重量下降的COPD患者表現(xiàn)出來自40循環(huán)細胞的TNF(x釋放增多，并且TNFa可能引發(fā)骨骼肌細胞的細胞凋亡，導(dǎo)致在患有嚴重COPD的一些患者中可見到的特征性肌肉消瘦和惡病質(zhì)(DeGodoy等,Am.J.Respir.Crit.CareMed.1996，153,633—637.)。TNF-a誘導(dǎo)了包括其本身和IL-8在內(nèi)的許多促炎細胞因子的基因表達。細胞因子，特別是TNFa,是顯示出增多和/或在炎癥呼吸系統(tǒng)疾病的病理生理學(xué)中發(fā)揮作用并參與組織破壞的介質(zhì)。PDE4抑制劑經(jīng)細胞內(nèi)環(huán)AMP增多導(dǎo)致了來自炎性細胞的細胞因子和趨化因子釋放的減少(Torphy,Am.J.Respir.Crit.CareMed.1998，157，351370)。與皮質(zhì)類固醇相反，PDE4抑制劑對嗜中性粒細胞具有強的抑制效果(Au等，Br.J.Pharmacol.1998,123,1260-1266.),表明它們可用于COPD的抗炎治療。有初步證據(jù)表明，PDE4抑制劑西洛司特改善了患有COPD的患者的肺功能和癥狀，這可能是由于細胞因子抑制所致(Compton等，Lancet.2001，358,265270)。由于TNFa被視作炎性和慢性呼吸系統(tǒng)疾病的共同特征，所以本發(fā)明提供了治療多種炎性疾病的廣泛治療應(yīng)用。實例3:用2'-FANA化學(xué)修飾的AON表明對靶基因敲除有增強的功效和延長的作用表2a-2g描述了用FANA殘基修飾的AON的組成。在圖4中，將A549細胞用圖4中所提供的說明所示處于硫代磷酸組合物(PS-DNA)中的或者含有FANA堿基修飾(PS-FANA;TOP1497-F1(SEQIDNO.72)、TOP-1497-F5(SEQIDNO,76)、TOP1497-F6(SEQIDNO,77))的PDE4D特異性AONTOP1497(SEQIDNO.90)轉(zhuǎn)染24小日+。PDE4DmRNA敲除使用Quantigene⑧測定(Panomics)來確定，并相對于p2M基因表達將PDE水平歸一化。用FANA單體對TOP1497序列進行的修飾(TOP1497-F1(SEQIDNO.72))增強了AON以100ng~400ng的劑量抑制靶基因表達的功效，清楚顯示出此修飾對于AON活性的有利之處(圖4a)。2，-F-ANA修飾有望增強AON的穩(wěn)定性，使其更抗核苷酶消化，這會延長其活性。在圖4b中，對單劑量的PDE4D特異性AONTOP1497的不同制劑的隨時間的比較清楚顯示出含有2，-F-ANA的AON與PS-DNAAON相比具有長達48小時的持續(xù)抑制活性。在轉(zhuǎn)染后48小時時，AON的PS-DNA制劑未觀察到抑制，不過，即使僅用2'-F-ANA修飾AONTOP1497-F6(SEQIDNO.77)19個堿基中的5個，也足以將抑制效果維持到此時間點。通過在用TOP1497-F5(SEQIDNO.76)和TOP1497-F1(SEQIDNO.72)轉(zhuǎn)染之后將更多2，-F-ANA殘基引入到所示原序列中，持續(xù)抑制得到提高。AON中更大量的2'-F-ANA組成獲得了最長的效果，不過通過過夜轉(zhuǎn)染(24小時)，含有7個殘基的PS-FANA獲得了同含有11個殘基的PS-FANA類似的抑制水平。實例4:用2，F(xiàn)-ANA化學(xué)修飾的AON保持了在細胞中的生物學(xué)功能本實例涉及PDE特異性AON的2'-F-ANA化學(xué)修飾減少細胞的炎性響應(yīng)的容限。圖2顯示出PDE特異性AON減少肺上皮細胞分泌趨化因子的功效。在圖5中，研究了含有2，-F-ANA的AON對A549生物學(xué)功能的影響。用作為PS-DNA的PDE4B/4D雙特異性AONTOP1545(SEQIDNO.14)或者用2，-F-ANA修飾TOP1545-F3(SEQIDNO.85)轉(zhuǎn)染的A549細胞，在A549細胞中轉(zhuǎn)染含有2，-F-ANA的AON時，與未修飾AON相比，表現(xiàn)出更高的抑制趨化因子分泌的水平。在原代細胞，特別是人PBMC中，含有2'-F-ANA的AON保持有生物學(xué)功效得到了證實。PDE4B/4D特異性AONTOP1545-F3(SEQIDNO.85)與PDE7A特異性AONTOP1731-F2(SEQIDNO.53)在第二種反義物存在時提高了它們各自的靶基因的抑制，盡管該反義序列與其他靶基因不具有同源性(圖6a)。在圖6a中，實心柱表示兩種AON各自以低劑量(3.2nM)組合使用時，與AON以低和高劑量(6.3nM)單獨使用時相比，對PDE4B、PDE4D或PDE7A的耙基因mRNA的特異性抑制％,表明含有2-F-ANA的AON在原代免疫細胞中保持了靶基因敲除的功能。對于生物學(xué)功能，用PDE4B/4D雙特異性TOP1545-F3(SEQIDNO.85)與PDE7A特異性AONTOP1731-F2(SEQIDNO.53)的組合對PBMC進行的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致TNF-ot和IL-2的分泌同時受到抑制。含有2，-F-ANA的AON保持了它們降低免疫細胞的炎性潛能的功能性。42圖6a中的結(jié)果還顯示了將對兩種不同耙基因具有特異性的AON組合同時施用于細胞時發(fā)生的增強效果。盡管AON以在單獨使用時對它們的靶基因幾乎沒有效果乃至沒有效果的濃度施用，但在組合時，AON誘導(dǎo)出對它們各自靶(對于TOP1545-F3(SEQIDNO.85),為PDE4B和PDE4D;而對于TOP1731-F2(SEQIDNO.53)，為PDE7A)的基因表達的顯著抑制。實例5:PDE4B/4DAON對細胞分裂調(diào)控基因的影響表lc描述了具有對PDE4B和PDE4D的雙特異性的TOP1545AON的序列。TOP1549(SEQIDNO.17)AON的序列與胸普酸合成酶(TYMS)基因序列具有100%的同源性，并且與PDE4B和PDE4D相比具有5個堿基對錯配。TOP1549(SEQIDNO.17)AON在6小時轉(zhuǎn)染后以劑量響應(yīng)方式(200ng、400ng和800ng)抑制其靶基因表達(TYMS)。雖然與TYMS基因序列相比具有5個堿基對錯配，但是含有2'-F-ANA的TOP1545(SEQIDNO.14)AON在6小時轉(zhuǎn)染后也有效抑制293細胞中TYMS基因的表達。TYMS是DNA合成的關(guān)鍵限速酶，并且在一些癌癥中被上調(diào)。TOP1545(SEQIDNO.14)AON具有這樣的潛能不僅通過降低PDE4B和PDE4DmRNA水平而抑制PDE功能，而且還通過其對TYMS基因表達的影響而發(fā)揮抑制細胞增殖的作用。此圖表明，TOP1545(SEQIDNO.14)是具有對磷酸二酯酶4(PDE4)和胸苷酸合成酶(TS)的雙特異性的新型反義分子。在文獻中還描述了將PDE4抑制劑作為cAMP提高劑；對PDE4的抑制阻斷了cAMP分解成AMP，從而導(dǎo)致了cAMP的積累。為人熟知的是，高胞內(nèi)水平的cAMP能夠有效地殺滅體外癌細胞。胸苦酸合成酶(TYMS)對于大多數(shù)生物而言是DNA合成和細胞分裂所必需的單磷酸胸腺嘧啶的來源，所以是明顯的抗癌靶。TYMS除了其編碼區(qū)中的一小段17個連續(xù)核苷酸之外，其在結(jié)構(gòu)上與PDE無關(guān)。TOP1545(SEQIDNO.14)耙向在TYMS與PDE4B和PDE4D之間的該同源性區(qū)域，使TOP1545(SEQIDNO.14)成為獨特的抗癌化合物。實例6:AON的體外潛力本實例顯示了用PDE4D/4B特異性AONTOP1572-F2(SEQIDNO,122;圖8A)或者PDE7A特異性AONTOP1731-F3(SEQIDNO.54，圖8B)轉(zhuǎn)染的CYNOM-K1猴細胞中基因表達的減少。與未轉(zhuǎn)染的細胞相比，PDE4D和PDE4BmRNA水平分別降寸氐了53%和66%(圖8A)，PDE7A基因表達降低了70%(圖8B)。實例7:AON遞送對細胞生物學(xué)功能的影響本實例涉及PDE4D/4B特異性AONTOP1572-F2(SEQIDNO.122)和TOP1545(SEQIDNO.14)降低PDE4DmRNA表達水平(圖9A)和減少響應(yīng)細胞因子混合物(500U/mLTNF-a+10ng/mLIL1-"+10ng/mLIFN力4小時刺激的NHBE細胞中受刺激的MCP-l細胞因子分泌(圖9B)的功效。TOP1572-F2(SEQIDNO.122)減少了71%的PDE4DmRNA表達水平，同時相應(yīng)地抑制了34%的MCP-l分泌。類似地，相對于用相應(yīng)對照轉(zhuǎn)染的細胞，TOP1545(SEQIDNO.14)減少了36%的PDE4DmRNA表達水平，同時相應(yīng)地抑制了46%的MCP-l分泌。實例8:AON遞送對細胞中生物學(xué)功能的影響本實例涉及PDE特異性AON抑制經(jīng)PHA刺激的人外周血單核細胞(PBMC)的促炎細胞因子分泌的功效。PBMC是包括T淋巴細胞、B淋巴細胞和單核細胞/巨噬細胞在內(nèi)的白細胞的混合群，所有這些細胞都可以被刺激而釋放促炎細胞因子。用PDE4B/4D特異性TOP1572(圖10)轉(zhuǎn)染過夜然后第二天用有絲分裂原植物血凝素(PHA，10i!g/ml)刺激6小時的人PBMC,與用PHA刺激但不進行轉(zhuǎn)染的那些細胞相比，分泌的j足炎細胞因子IL-2減少了51%(圖10A),而TNF-a減少了42%(圖10B)。類似地，與不進行轉(zhuǎn)染但用PHA刺激的那些PBMC相比，用PDE7A特異性AONTOP1731轉(zhuǎn)染的PBMC(圖ll)分泌的IL-2減少了48%，而TNF-減少了60%。實例9:TOP1572和TOP1731組合時抑制免疫應(yīng)答的增強功效本實例涉及AON組合時減少經(jīng)PHA刺激的PBMC的IL-2分泌的效果。用44各為3.1nM的TOP1572-F2(SEQIDNO.122)和TOP1731-F3(SEQIDNO,54)轉(zhuǎn)染的PBMC導(dǎo)致了與每種AON單獨以3.1nM或6.3nM劑量轉(zhuǎn)染后觀察到的抑制水平更高的IL-2抑制水平(33%)(圖12)。在本實例中，j氐劑量TOP1572-F2獲得了少于10%的IL-2抑制,而高劑量(6.3nM)獲得了24%的IL-2抑制(圖12)。對于TOP1731-F3,低劑量(3.1nM)獲得了20。/。的IL-2抑制，當(dāng)劑量增大到6.3nM時，該水平在統(tǒng)計上并不上升(22%抑制)(圖12)。TOP1572-F2與TOP1731-F3的組合產(chǎn)生了33%的IL-2分泌抑制可能是由于同時靶向PDE4B、PDE4D和PDE7A的不同PDE亞型所致(圖12)。實例10:細月包系中的PS-DNA和PS-FANA化學(xué)性質(zhì)的比較本實例比較了在減少靶mRNA表達方面PS-DNAAON的功效與PS-FANAAON的功效。TOP1572-F2形式(SEQIDNO.122)在同時減少PDE4D(圖13A)和PDE4B(圖13B)的mRNA表達方面表現(xiàn)出比標準PS-DNA形式TOP1572(SEQIDNO.40)更長的持續(xù)作用時間。在293細胞中進行72小時轉(zhuǎn)染之后，TOP1572-F3仍減少了72%的PDE4BmRNA表達和55%的PDE4DmRNA表達，而TOP1572功效對于PDE4B降低了18%,而對于PDE4D降低了29%。在更低劑量時也觀察到FANAAON活性的上升。TOP1731-F3FANA形式(SEQIDNO.54)在阻斷以125nM和75nM劑量轉(zhuǎn)染48小時的A549細胞中的PDE7AmRNA表達方面優(yōu)于PS-DNA形式TOP1731(SEQIDNO.2)(圖14)。盡管已在本文中對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行了說明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解到，在不背離本發(fā)明的實質(zhì)和所附權(quán)利要求的范圍的情況下可以對本發(fā)明作出變動。本說明書中引用的所有文件通過引用結(jié)合于此。45表la<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>說明表lc一—f細,PDE4A+4DPDE4B+4D登錄號NM—006202NM006203TOP1507TOP1508NM002600醒006203TOP1511TOPI544TOP1545TOP1546TOP1547TOP1549TOP1550TOP1551TOP1552TOP1553TOP1554TOP1555TOP1556反義物標識TOPI557TOP1558TOP1559TOP1560TOP1561TOP1562TOP1563TOP1564TOP1565TOP1566TOP1567TOP1568TOP1569TOP1570TOP1571TOP1572TOP1573TOP1574GTGCTTGTCACACATGGGTCCTCCAAAGTGTCCGGTCTCTAGCTGGTCATGGTAATGGTCTTCTCTGCCCATGTCTCCCAAAGACCCCATTTGTTCATCTGCCCAGGTCTCCCAGAGGCCCATGTCTCCCGTCTGCCCATGTCTCCCAGATCTGCCCATGTCTCCCACATCTGCCCATGTCTCCCAGAGTCTGCCCATGTCTCCCACAAGGTTGCTCAGGTCTGCACAGTGGTTGCTCAGATCTGCACAGT反義物序列—J:-3')-一GqXT^[^^TC工C}CACAGITCAGCATGGTAATGGTCTTGCCACITCAGGATGGTAATTACATCAAIGCAAGTTCATGTCACAGTITTCTTCTGTCAATIACCATTTTCCTGTTTCIACCATIGTCTTCACTTTCTTAGTTTCIACCATTCTGCACAGTG￡ACCATG丁CTGTAIGGTCTCTAGCTTGTAIGGTCTCTAGCTGGTTTCTTQACTCCACTIATCTAATCAAGTCATCICCGTGTGTTGTGATAIGCCACITCAATTITACATCAAIGCAAGTTGTTTIGACATATCIGTTGGTTGCTCAGITCTGCACAGGTTGCTCAGATCTGCACATTGCTCAGATCTGCA書第40/44頁SF々IDNQ，1^_11———一131415_丄;6—1718192022<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表2b<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>表2c<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>表2d<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>表2e<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>表2f<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>權(quán)利要求1.一種寡核苷酸，所述寡核苷酸具有一個堿基序列，該堿基序列選自構(gòu)成如下的組(i)SEQIDNOS.1～92和113～126以及(ii)包含一個堿基插入、缺失或置換的SEQIDNOS.1～92和113～126。2.如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有選自SEQIDNOS.1~92和113~126所組成的組中的一個》咸基序列。3.如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有一個磷酸二酯主鏈。4.如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有一個硫代磷酸酯主鏈。5.如權(quán)利要求4所述的寡核苦酸，其中，所述寡核苷酸的至少一個核苷酸是2'-脫氧-2'-氟代阿糖核苷酸。6.如權(quán)利要求5所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸選自SEQIDNOS.41~88和115-126所組成的組。7.—種藥物組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1~6中任一項所述的寡核苷酸中的至少一種寡核苷酸與一種藥學(xué)可接受的載體的組合。8.—種藥物組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1-6中任一項所述的寡核苷酸中的至少兩種寡核苷酸與一種藥學(xué)可接受的載體的組合。9.如權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其中，所述至少兩種寡核苷酸中的一種第一寡核苷酸是針對PDE7A的。10.如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其中，所述至少兩種寡核苦酸的一種第二寡核香酸是針對PDE4B和PDE4D的。11.如權(quán)利要求IO所述的藥物組合物，其中，所述至少兩種寡核苷酸是選自SEQIDNOS.41~88和115~126所組成的組。12.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中，所述至少兩種寡核苦酸為SEQIDN0.2和SEQIDNO.14。13.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中，所述至少兩種寡核苷酸為SEQIDNO.2和SEQIDNO.24。14.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中，所述至少兩種寡核普酸為SEQIDNO.2和SEQIDNO.37。15.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中，所述至少兩種寡核苷酸為SEQIDNO.2和SEQIDNO.復(fù)16.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中，所述至少兩種寡核普酸為SEQIDNO.2和SEQIDNO.85。17.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中，所述至少兩種寡核苷酸為SEQIDNO.2和SEQIDNO,122。18.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中，所述至少兩種寡核苷酸為SEQIDNO.53和SEQIDNO.14。19.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中，所述至少兩種寡核苷酸為SEQIDNO.53和SEQIDNO.24。20.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中，所述至少兩種寡核苷酸為SEQIDNO.53和SEQIDNO.37。21.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中，所述至少兩種寡核苷酸為SEQIDNO.53和SEQIDNO,40。22.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中，所述至少兩種寡核苷酸為SEQIDNO.53和SEQIDNO.85。23.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中，所述至少兩種寡核苷酸為SEQIDNO.53和SEQIDNO.122。24.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中，所述至少兩種寡核苷酸為SEQIDNO.54和SEQIDNO,14。25.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中，所述至少兩種寡核苷酸為SEQIDNO.54和SEQIDNO.24。26.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中，所述至少兩種寡核苷酸為SEQIDNO.54和SEQIDNO,37。27.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中，所述至少兩種寡核苷酸為SEQIDNO.54和SEQIDNO,40。28.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中，所述至少兩種寡核苷酸為SEQIDNO.54和SEQIDNO,85。29.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中，所述至少兩種寡核苷酸為SEQIDNO.54和SEQIDNO.122。30.—種用于治療患有與cAMP減少有關(guān)的疾病的受試者的方法，所述方法包括施用權(quán)利要求7~29中任一項所述的藥物組合物。31.—種用于治療受試者的呼吸道炎癥的方法，所述方法包括施用權(quán)利要求7~29中任一項所述的藥物組合物。32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述呼吸道炎癥是由下述疾病中的任一種所引起慢性阻塞性肺病、譯喘、嗜酸性粒細胞性咳嗽、支氣管炎、肺同種異體移植物的急性和慢性排斥反應(yīng)、結(jié)節(jié)病、肺纖維化、鼻炎、鼻竇炎、病毒感染或腫瘤疾病。33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述疾病是慢性阻塞性肺病。34.權(quán)利要求7~29中任一項所述的藥物組合物在制備用于治療與cAMP減少有關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。35.權(quán)利要求7~29中任一項所述的藥物組合物在制備用于治療呼吸道炎癥的藥物中的應(yīng)用。36.如權(quán)利要求35所述的應(yīng)用，其中，所述呼吸道炎癥是由下述疾病中的任一種所引起慢性阻塞性肺病、哮喘、嗜酸性粒細胞性咳嗽、支氣管炎、肺同種異體移植物的急性和慢性排斥反應(yīng)、結(jié)節(jié)病、肺纖維化、鼻炎、鼻竇炎、病毒感染或腫瘤疾病。37.如權(quán)利要求36所述的應(yīng)用，其中，所述疾病是慢性阻塞性肺病。38.權(quán)利要求7~29中任一項所述的藥物組合物用于治療與cAMP減少有關(guān)的疾病的應(yīng)用。39.權(quán)利要求7~29中任一項所述的藥物組合物用于治療呼吸道炎癥的應(yīng)用。40.如權(quán)利要求39所述的應(yīng)用，其中，所述呼吸道炎癥是由下述疾病中的任一種所引起慢性阻塞性肺病、p孝喘、嗜酸性粒細胞性咳嗽、支氣管炎、肺同種異體移植物的急性和慢性排斥反應(yīng)、結(jié)節(jié)病、肺纖維化、鼻炎、鼻竇炎、病毒感染或肺瘤疾病。41.如權(quán)利要求40所述的應(yīng)用，其中，所述疾病是慢性阻塞性肺病。42.—種藥物組合物，所述藥物組合物包含具有SEQIDNO.54和SEQIDNO.122的兩種寡核苷酸以及一種藥學(xué)可接受的載體。43.—種寡核苷酸，所述寡核苷酸與PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A1、PDE7A2、PDE7A3和PDE7B中的至少一種的mRNA有至少80%互補性，其中，所述寡核苷酸的至少一個核苷酸是2'-脫氧-2'-氟代阿糖核苦酸。44.如權(quán)利要求43所述的寡核苦酸，所述寡核苦酸與所述mRNA有至少85%互補性。45.如權(quán)利要求43所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸與所述mRNA有至少90%互補性。46.如權(quán)利要求43所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸與所述mRNA有至少95%互補性。47.如權(quán)利要求43所述的寡核芬酸，所述寡核苦酸與所述mRNA有100%互補性。48.如權(quán)利要求43所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有一個堿基序列，該堿基序列選自構(gòu)成如下的組(i)SEQIDNOS.1~92和113~126以及(ii)包含一個;咸基插入、缺失或置4灸的SEQIDNOS.1~92和113~126。49.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求43~48中任一項所述的寡核苷酸中的至少一種寡核苷酸與一種藥學(xué)可接受的載體的組合。50.—種藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求43~48中任一項所述的寡核苷酸中的至少兩種寡核苷酸與一種藥學(xué)可接受的載體的組合。51.—種用于治療患有與cAMP減少有關(guān)的疾病的受試者的方法，所述方法包括施用權(quán)利要求49~50中任一項所述的藥物組合物。52.—種用于治療患有呼吸道炎癥的受試者的方法，所述方法包括施用權(quán)利要求49~50中任一項所述的藥物組合物。53.權(quán)利要求49~50中任一項所述的藥物組合物在制備用于治療與cAMP減少有關(guān)的疾病的一種藥物中的應(yīng)用。54.權(quán)利要求49~50中任一項所述的藥物組合物在制備用于治療呼吸道炎癥的一種藥物中的應(yīng)用。55.權(quán)利要求49~50中任一項所述的藥物組合物用于治療與cAMP減少有關(guān)的疾病的應(yīng)用。56.權(quán)利要求49~50中任一項所述的藥物組合物用于治療呼吸道炎癥的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及多種針對編碼磷酸二酯酶(PDE)的基因的治療用反義寡核苷酸和這些反義寡核苷酸的組合的應(yīng)用。這些反義寡核苷酸可以用作患者體內(nèi)與細胞cAMP減少有關(guān)的疾病的治療中的分析工具和/或治療劑，所述疾病例如為呼吸道的炎癥，包括例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫綜合征、支氣管炎、慢性支氣管炎、硅肺病、肺纖維化、肺同種異體移植物排斥反應(yīng)、變應(yīng)性鼻炎和慢性鼻竇炎以及其中環(huán)AMP升高或PDE水平降低有利的其他癥狀。文檔編號C07H21/00GK101448847SQ200780018289公開日2009年6月3日申請日期2007年5月18日優(yōu)先權(quán)日2006年5月19日發(fā)明者保羅·倫齊,呂克·帕凱,海倫妮·當(dāng)茹申請人:托皮根藥品公司