專利名稱：：用于疫苗的高滴度重組流感病毒的制作方法用于疫苗的高滴度重組流感病毒相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2006年3月31日提交的美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)NO.60/787,766的提交日期的權(quán)利，其公開內(nèi)容通過(guò)引用合并在此。政府支持本發(fā)明是在來(lái)自國(guó)家衛(wèi)生研究所的撥款編號(hào)AI044386的政府支持下做出的。在本發(fā)明中美國(guó)政府擁有某些權(quán)利。背景陰性-正義RNA病毒纟皮分類為七個(gè)科(彈狀病毒科(A/^Z)<io"w>z'<iae)，副粘病毒科(尸ar"，;coW〃'(i"e),絲狀病毒科(F,7ov/r/d"e)，十專爾纟內(nèi)病毒一牛(Sor"av/〃'Jae),正粘病毒牙+((9w/zom>aovz>/<i(3e),布尼亞病毒科(5w"j^rW".c/—和沙粒病毒科(/1re加wnGfae)),其包括常見的人類病原體，例如呼吸道合胞體病毒、流感病毒、麻滲病毒和埃博拉(Ebola)病毒，以及對(duì)家禽和家畜產(chǎn)業(yè)具有重要經(jīng)濟(jì)影響的動(dòng)物病毒(例如，新城疫病毒和牛瘟病毒)。前四個(gè)科的特征在于非片段化的基因組，而后三個(gè)科具有分別包括六到八個(gè)、三個(gè)或兩個(gè)陰性-正義RNA片段的基因組。陰性-正義RNA病毒的一般特征是它們的RNA基因組的陰性極性；即，病毒RNA(vRNA)是與mRNA互補(bǔ)的，因而本身不是傳染性的。為了啟動(dòng)病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，vRNA必需通過(guò)病毒聚合酶復(fù)合物和核蛋白分別轉(zhuǎn)錄成正鏈(plus-sense)mRNA或cRNA;對(duì)于A型流感病毒，病毒聚合酶復(fù)合物包括三種聚合酶蛋白質(zhì)PB2、PB1和PA。在病毒復(fù)制期間，cRNA充當(dāng)了新的vRNA分子的合成的模板。對(duì)于所有的陰性鏈RNA病毒，在vRNA和cRNA的5'和3'末端的非編碼區(qū):l或?qū)τ诓《净蚪M的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制都是關(guān)鍵的。不同于細(xì)胞或病毒mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，cRNA和vRNA都既不在5'末端帽化也不在極3'末端多聚腺苷化。9許多病毒蛋白質(zhì)的基本功能已經(jīng)生物化學(xué)地和/或在病毒感染的環(huán)境中闡明了。然而，反向遺傳學(xué)系統(tǒng)已經(jīng)顯著地增進(jìn)了我們對(duì)陰性鏈片段化和非片段化RNA病毒關(guān)于它們的病毒復(fù)制和致病性、以及關(guān)于活體減毒病毒疫苗開發(fā)的認(rèn)識(shí)。作為在分子病毒學(xué)中使用的術(shù)語(yǔ)，反向遺傳學(xué)被定義為產(chǎn)生具有來(lái)自克隆的cDNA的基因組的病毒(綜述參見Neumann等，2002))。為了啟動(dòng)陰性鏈RNA病毒的病毒復(fù)制，vRNA或cRNA必須與聚合酶復(fù)合物和核蛋白共同表達(dá)。狂犬病病毒是第一種完全從克隆的cDNA產(chǎn)生的非片段化的陰性-正義RNA病毒Schnell等(1994)通過(guò)編碼全長(zhǎng)cRNA的cDNA構(gòu)建體和L、P和N代表的蛋白質(zhì)表達(dá)構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)染，都處在T7RNA聚合酶啟動(dòng)子的控制下，產(chǎn)生了重組狂犬病病毒。用提供了T7RNA聚合酶的重組牛痘病毒感染，引起了傳染性的狂犬病病毒的產(chǎn)生。在這個(gè)T7聚合酶系統(tǒng)中，處在T7RNA聚合酶的控制下的全長(zhǎng)cRNA的最初的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生了非帽化的cRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。然而，形成T7RNA聚合酶的最佳的起始序列的三個(gè)胍核苷酸附著在5'末端。為了產(chǎn)生對(duì)于生產(chǎn)性傳染性周期必須的cRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的可信的3'末端，肝炎A核酶(HDVRz)序列被用于在cRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3'末端精確地自動(dòng)催化裂解。自Schnell等(1994)的初步報(bào)告開始，利用類似技術(shù)的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)引起了許多非片段化陰性鏈RNA病毒的產(chǎn)生(Conzelmann,1996;Conzelmann，1998;Conzelmann等，1996;Marriott等，1999;Munoz等，2000;Nagai,1999;Neumann等，2002;Roberts等，1998;Rose，1996)。最初的拯救操作的改進(jìn)包括從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系(Radecke等，1996)或從蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒(Lawson等，1995)的T7RNA聚合酶表達(dá)，或熱激操作來(lái)提高拯救效力(Parks等，1999)。根據(jù)T7聚合酶系統(tǒng)，Bridgen和Elliott(1996)從克隆的cDNA產(chǎn)生了布尼奧羅病毒(Bunyaviridae科)，并展現(xiàn)了通過(guò)T7聚合酶系統(tǒng)人工地產(chǎn)生片段化的陰性-正義RNA病毒的可能性。在1999年，基于細(xì)胞RNA聚合酶產(chǎn)生了基于質(zhì)粒的反向遺傳學(xué)技術(shù)，用于完全從克隆的cDNA產(chǎn)生片段化的A型流感病毒(Fodor等，1999;Neumann和Kawaoka,1999)。核仁酶RNA聚合酶I合成核糖體RNA,其象流感病毒RNA—樣，不含有5'帽或3'polyA結(jié)構(gòu)。側(cè)翼是RNA聚合酶I啟動(dòng)子和終止子序列的、含有流感病毒cDNA的構(gòu)建體的RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄引起了流感vRNA合成(Fodor等，1999;Neumann和Kawaoka,1999;Neumann禾口Kawaoka,2001;Pekosz等，1999)。該系統(tǒng)是高效的，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)產(chǎn)生了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的每毫升上清液超過(guò)108個(gè)傳染性病毒顆粒。需要的是完全地從克隆的cDNA制備高滴度的正粘病毒例如A型流感病毒的方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的多種流感病毒載體的組合物，例如，對(duì)于制備重配體(reassortant)病毒有用的那些，包括7:1重配體，6:1:1重配體、5:1:2重配體和5:1:1:1重配體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物包括用于vRNA產(chǎn)生的載體，所述載體選自包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PAcDNA可4喿作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PB1cDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PB2cDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒HAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NPcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒McDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，以及包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NScDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體。所述組合物還包括用于病毒蛋白質(zhì)產(chǎn)生的載體，所述載體選自編碼流感病毒PA的載體、編碼流感病毒PBl的載體、編碼流感病毒PB2的載體和編碼流感病毒NP的載體，以及任選地編碼NP、NS、M例如M1和M2、HA或NA的一種或多種載體。優(yōu)選的，編碼病毒蛋白質(zhì)的載體進(jìn)一步包括轉(zhuǎn)錄終止序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，PB1、PB2、PA、NP、M和NS、以及任選的NA的cDNA具有來(lái)自在有胚蛋中復(fù)制到高滴度的流感病毒的PB1、PB2、PA、NP、M和NS、以及4壬選的NA的序列，HA的cDNA具有來(lái)自不同的流感病毒毒林的序列(來(lái)自具有相同或不同HA亞型，即，異源HA的異源流感病毒分離物)。對(duì)于來(lái)自在有胚蛋中不生長(zhǎng)到高滴度的病原性H5N1病毒的HA,至少NA的cDNA具有在有胚蛋中復(fù)制到高滴度的Nl流感病毒的序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，PB1、PB2、PA、NP、M和NS的cDNA包括與一序列(多核苦酸)相應(yīng)的核酸分子，所述序列編碼高滴度的，例如大于108EID50/mL,例如109EID50/mL、1010EID50/mL或更高的滴度流感病毒的至少一種蛋白質(zhì)。在有胚蛋中具有高滴度的本發(fā)明范圍內(nèi)的重配體，對(duì)于5:1:1:1重配體(具有NSK55)、5:1:2重配體(具有NSK55)和6:1:1重配體(具有NSK55)具有至少約109EID5o/mL的滴度，對(duì)于5:1:1:1重配體(具有NSK55E)或5:1:2重配體(具有NSK55E)具有至少4xl08PFU/mL的滴度。在MDCK細(xì)胞中具有高滴度的本發(fā)明范圍內(nèi)的重配體，對(duì)于5:1:1:1或6:1:1具有至少0.75x108PFU/mL,例如至少2.0xl08PFU/mL的滴度。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括包含5:1:2或6:1:1重配體的多種流感病毒載體的組合物。所述組合物包括包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PB1cDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PB2cDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒HAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NPcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒McDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，以及包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NScDNA可才喿作地連接的啟動(dòng)子的載體。PB1、PB2、PA、NP和M的cDNA具有來(lái)自在有胚蛋中復(fù)制到高滴度的一種或多種流感病毒的序列，其中NS的cDNA是來(lái)自在有胚蛋中復(fù)制到高滴度的一種或多種流感病毒，NS的cDNA是來(lái)自在有胚蛋中復(fù)制到高滴度的一種或多種流感病毒或具有異源NA的序列。HA的cDNA具有異源HA的序列，其對(duì)于至少PB1、PB2、PA、NP和M的病毒基因片段是異源的。在一個(gè)實(shí)施方式中，NS的cDNA具有位置55處的Glu。所述組合物還包括包含與編碼流感病毒PA的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒PB1的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒PB2的DNA片辜史可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒NP的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、任選的包含與編碼流感病毒HA的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒NA的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒M1的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒M2的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、或包含與編碼流感病毒NS2的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體。在一個(gè)實(shí)施方式中，PB1、PB2、PA、NP、M和NS的cDNA包括與一序列(多核苷酸)相應(yīng)的核酸分子，所述序列編碼高滴度的，例如大于108EID5o/mL，例如109EID5o/mL、101QEID5()/mL或更高的滴度流感病毒的至少一種蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括包含5:1:1:1或6:1:1重配體的多種流感病毒載體的組合物。所述組合物包括包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PB1cDNA可4喿作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PB2cDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒HAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NPcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒McDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，以及包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NScDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體。PB1、PB2、PA、NP和M的cDNA具有來(lái)自在MDCK細(xì)胞中復(fù)制到高滴度的一種或多種流感病毒的序列，其中NS的cDNA是來(lái)自在MDCK細(xì)胞中復(fù)制到高滴度的一種或多種流感病毒，其中NA的cDNA可以具有異源NA的序列，以及其中HA的cDNA具有異源HA的序列。所述組合物還包括包含與編碼流感病毒PA的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒13PB1的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒PB2的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒NP的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、任選的包含與編碼流感病毒HA的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒NA的DNA片l殳可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒M1的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒M2的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、或包含與編碼流感病毒NS2的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體。在一個(gè)實(shí)施方式中，PB1、PB2、PA、NP、M和NS的cDNA包括與一序列(多核苷酸)相應(yīng)的核酸分子，所述序列編碼高滴度的，例如大于108EID5Q/mL，例如109EID5o/mL、101GEID5Q/mL或更高的滴度流感病毒的至少一種蛋白質(zhì)。如在此描述的，與野生型PR8毒一朱相比，重組(6:2重配體)病毒在蛋中生長(zhǎng)得不太好，雖然它們具有相同的PR8"內(nèi)部"基因(即，除了HA和NA的那些)。由于在蛋中的旺盛生長(zhǎng)是滅活疫苗的生產(chǎn)中使用的疫苗種子病毒的重要性質(zhì)，產(chǎn)生了在蛋中與PR8供體毒抹生長(zhǎng)得一樣好的H5N1疫苗候選物。發(fā)現(xiàn)的是，HA-NA平衡和PB1功能是重要的生長(zhǎng)決定因素。根據(jù)這種認(rèn)識(shí)，產(chǎn)生了具有PR8背景的、具有改變的HA-NA組合的一系列H5N1病毒，相對(duì)于更常規(guī)的6:2重配體，包括WHO建議的NIBRG-14病毒來(lái)評(píng)估它們?cè)诘爸械纳L(zhǎng)。7:1重配體病毒和6:2重配體之一顯示了在蛋中增強(qiáng)的生長(zhǎng)。因而，對(duì)于一般在蛋中產(chǎn)生低滴度的疫苗病毒，用在蛋中生長(zhǎng)良好的流感病毒的NA替換疫苗病毒的至少NA,或用來(lái)自在蛋中生長(zhǎng)到高滴度的流感病毒的其他病毒基因片段替換疫苗病毒的除HA和NA之外所有的、或除HA之外所有的，可以產(chǎn)生顯著更高的病毒滴度。本發(fā)明的重配體病毒的滴度可以是相應(yīng)的非重配體疫苗病毒的2倍、3倍、或更高，例如7倍或更高。如還在此描述的，確定了對(duì)于重配體在蛋中的高生長(zhǎng)速度負(fù)責(zé)的內(nèi)部基因，所述重配體具有來(lái)自兩種不同PR8病毒分離物的基因。最高的病毒滴度是大部分內(nèi)部基因來(lái)自PR8HG(PR8(UW))的那些。特別是，5:1:2重配體(PR8(UW)PB1、PB2、PA、NP和M;PR8(Cam)NS;以及H5N1HA和NA)和6:1:1重酉己體(PR8(UW)NA、PB1、PB2、PA、NP禾口M;PR8(Cam)NS;以及H5HA)具有蛋中的高滴度。如還在此描述的，評(píng)估了對(duì)在MDCK細(xì)胞中的高生長(zhǎng)速度負(fù)責(zé)的病毒基因，MDCK細(xì)胞是可能被批準(zhǔn)作為疫苗病毒來(lái)源的細(xì)胞。使用來(lái)自PR8(UW)的PB2、來(lái)自PR8(Cam)的NS或來(lái)自PR8(UW)的NSK55E,以及具有長(zhǎng)莖部(stalk),例如大于20個(gè)氨基酸但低于約100個(gè)氨基酸的莖部，例如，長(zhǎng)度大于約40個(gè)直到約80個(gè)氨基酸，發(fā)現(xiàn)了在MDCK細(xì)胞中的最高生長(zhǎng)速度。因而具有PR8(UW)PA、PB1、PB2、NP和M,以及來(lái)自PR8(UW)或PR8(Cam)的NS、來(lái)自PR8(UW)或異源NA來(lái)源的NA,以及異源HA的5:1:1:1和6:1:1重配體，在MDCK細(xì)胞中生長(zhǎng)到最高滴度。在一個(gè)實(shí)施方式中，核酸分子相應(yīng)于編碼PB1、PB2、PA、NP、M和NS，以及^f壬選的NA的序列，所述PB1、PB2、PA、NP、M和NS,以及任選的NA具有與SEQIDNO:1-6或8之一編碼的相應(yīng)多肽基本上相同的活性。如在此使用的，"基本上相同的活性"包括一活性，其是相應(yīng)的全長(zhǎng)多肽的活性或蛋白質(zhì)水平的約0.1%、1%、10%、30%、50%、90%、例如直到100%或更多，或約80%、90%或更多的可檢測(cè)的蛋白水平。在一個(gè)實(shí)施方式中，核酸分子相應(yīng)于編碼多肽的序列，所述多肽基本上相同于SEQIDNO:l-6或8編碼的多肽，例如，具有與SEQIDNO:1-6或8編碼的多肽的至少80%,例如，90%、92%、95%、97%或99%的連續(xù)的氨基酸序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方式中，分離的和/或純化的核酸分子包含核苷酸序列，其基本上相同于SEQIDNO:1-6、8或33至'j38之一，例如，具有與SEQIDNO:1-6、8或33到38之一至少50%，例如，60%、70%、80%或90%或更高的連續(xù)核酸序列同一性，在一個(gè)實(shí)施方式中，還編碼多肽，所述多肽與SEQIDNO:1-6、8或33到38之一編碼的多肽具有至少80%,例如，90%、92%、95%、97%或99%的連續(xù)的氨基酸序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方式中，分離的和/或純化的核酸分子編碼多肽，相對(duì)于由SEQIDNO:l-6或8之一編碼的多肽，具有一個(gè)或多個(gè)，例如，2、5、10、15、20個(gè)或更多個(gè)保守性氨基酸替換，例如高達(dá)10%或20%的殘基的保守性替換。保守性氨基酸替換是指具有相似側(cè)鏈的殘基的可互換性。例如，具有脂肪族側(cè)鏈的一組氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族-羥基側(cè)鏈的一組氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺的策略的一組氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族側(cè)鏈的一組氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的一組氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；以及具有含硫的側(cè)鏈的一組氨基酸是半胱氨酸和曱硫氨酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，保守性氨基酸替換組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸；苯丙氨酸-酪氨酸；賴氨酸-精氨酸；丙氨酸-纈氨酸；谷氨酸-天冬氨酸；以及天冬酰胺-谷氨酰胺。在一個(gè)實(shí)施方式中，分離的和/或純化的核酸分子編碼多肽，相對(duì)于由SEQIDNO:1-6或33-38之一編碼的多肽，具有一個(gè)或多個(gè)，例如，2、3或4個(gè)非保守性氨基酸替換。例如，K55ENS和S360YPB2替換是非保守的替換。在另一個(gè)實(shí)施方式中，具有PB1、PB2、PA、NP、M和NS、以及任選的NA序列或其互補(bǔ)物的核酸分子，在低度嚴(yán)格、中度嚴(yán)格或嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:1-6、8或33到38之一，或其互補(bǔ)物雜交。例如，可以采用以下條件50。C的7%十二烷基石危酸鈉(SDS)、0.5MNaP04、lmMEDTA,在50。C在2xSSC、0.1%SDS中洗滌(低度嚴(yán)格)，更理想地在50。C的7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaP04、lmMEDTA,在50。C在lxSSC、0.1%SDS中洗滌(中度嚴(yán)格)，更理想地仍在50。C的7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaP041mMEDTA中，在50。C用0.5xSSC、0.1°/。SDS洗滌(嚴(yán)格)，優(yōu)選的在50。C的7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaP041mMEDTA中，在50。C在O.lxSSC、0.1%SDS中洗滌(更嚴(yán)才各)，更優(yōu)選的在50。C的7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaP04、1mMEDTA中在65°C在O.lxSSC、0.1%SDS中洗滌(非常嚴(yán)格)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述核酸分子編碼多肽，其基本上相同于SEQIDNO:1-6或33到38之一，例如與SEQIDNO:1-6或33到38之一具有至少50%,例如，60%、70%、80%或90%或更高的連續(xù)核酸序列同一性，優(yōu)選地具有與SEQIDNO:1-6、8或33到28之一所編碼的相應(yīng)全長(zhǎng)多肽基本上相同的活性。那些核酸分子，或來(lái)自在蛋中生長(zhǎng)良好的其他Nl毒抹的核酸分子，可以與任何HA,例如H5的核酸一起采用。16達(dá)流感蛋白質(zhì)，來(lái)制備嵌合基因，例如，與其他病毒基因、包括其他流感病毒基因的嵌合基因，和/或來(lái)制備重組病毒。因而，本發(fā)明還提供了分離的多肽、重組病毒以及與本發(fā)明的核酸分子或重組病毒接觸的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了多種以下的分離的和/或純化的載體包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PB1cDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PB2cDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒HAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NPcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒McDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NScDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，其中至少一種載體包含序列，所述序列相應(yīng)于編碼PB1、PB2、PA、NP、M、NS和任選的NA、或其部分的那些，所述PB1、PB2、PA、NP、M、NS和4壬選的NA、或其部分與SEQIDNO:1-6或8之一編碼的相應(yīng)多肽具有基本上相同活性，所述序列例如編碼一多肽的序列，所述多肽與SEQIDNO:1-6、8或33到38之一所編碼的多肽具有至少80%的氨基酸同一性。任選的，在包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒McDNA可操作連接的啟動(dòng)子的載體的地方可以采用兩種載體，例如，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒MlcDNA可操作連接的啟動(dòng)子的載體，和包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒M2cDNA可操作連一妾的啟動(dòng)子的載體.本發(fā)明包括分離的或純化的載體或質(zhì)粒的用途，其表達(dá)或編碼流感病毒蛋白質(zhì)，或表達(dá)或編碼流感vRNA，包括天然的和重組的vRNA。優(yōu)選的，所述載體包含流感cDNA,例如，A型(例如，任何A型流感基因，包括15種HA或9種NA亞型的任一種)、B型或C型流感DNA(參見FieldsVirology(Fields等編，Lippincott國(guó)RavenPubl.,Philadelphia,PA(1996)的45和46章)，其通過(guò)引用特別地合并在此)，然而預(yù)想的是，任何生物體的基因可以在本發(fā)明的載體或方法中采用。cDNA相對(duì)于啟動(dòng)子可以是正義或反義取向的。因而，本發(fā)明的載體可以編碼流感病毒蛋白質(zhì)(正義)或vRNA(反義)。可以采用任何適合的啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止序列來(lái)表達(dá)蛋白質(zhì)或肽，例如，病毒蛋白質(zhì)或肽，非病毒病原體的蛋白質(zhì)或肽，或治療性蛋白質(zhì)或肽。本發(fā)明的組合物還可以包含感興趣的基因或開放閱讀框，例如，編碼作為疫苗有用的免疫原性肽或蛋白質(zhì)的外源基因。因而，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式包括如上所述的本發(fā)明的組合物，其中所述載體之一被替換為，或者所述組合物進(jìn)一步包含，包含啟動(dòng)子的載體，所述啟動(dòng)子連4妻到5'流感病毒序列，任選地包4舌5'流感病毒編碼序列或其部分，連接到期望的核酸序列，例如，期望的cDNA,連接到3'流感病毒序列，任選地包括3'流感病毒編碼序列或其部分，連接到轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選的，所述期望的核酸序列例如cDNA是反義取向的。這種組合物向可感染流感病毒用于流感病毒復(fù)制的宿主細(xì)胞中的導(dǎo)入產(chǎn)生了包含與載體的序列相應(yīng)的vRNA的重組病毒。這種用于vRNA生產(chǎn)的載體中的啟動(dòng)子可以是RNA聚合酶I啟動(dòng)子、RNA聚合酶II啟動(dòng)子、RNA聚合酶III啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子以及T3啟動(dòng)子，任選地所述載體包含轉(zhuǎn)錄終止序列，例如RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄終止序列、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄終止序列、RNA聚合酶in轉(zhuǎn)錄終止序列，或核酶。在一個(gè)實(shí)施方式中，包含期望的核酸序列的所述載體包含感興趣的cDNA。無(wú)論是在用于vRNA還是用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的載體中，感興趣的cDNA可以編碼免疫原性表位，例如在癌癥治療或疫苗中有用的表位，或在基因治療中有用的肽或多肽。當(dāng)制備病毒時(shí)，包含感興趣的基因或cDNA的所述載體或質(zhì)粒可以替換流感病毒基因的載體或質(zhì)粒，或可以附加于所有流感病毒基因的載體或質(zhì)粒。多個(gè)本發(fā)明的載體可以是物理上連接的，或者每種載體可以存在于單獨(dú)的質(zhì)?；蛘咂渌模?，線性的核酸遞送工具上。vRNA或病毒蛋白質(zhì)表達(dá)載體中的啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止序列相當(dāng)于vRNA的載體或質(zhì)粒包含適合于在至少一種特定的宿主細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子，所述宿主細(xì)力包例如禽類或哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，例如犬、貓、18馬、牛、羊或靈長(zhǎng)類細(xì)胞，包括人類細(xì)胞，或者優(yōu)選的，包含適合于在超過(guò)一種宿主中表達(dá)的啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于vRNA產(chǎn)生的一種或多種載體包含啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子包括但不限于RNA聚合酶I啟動(dòng)子例如人類RNA聚合酶I啟動(dòng)子，RNA聚合酶II啟動(dòng)子、RNA聚合酶III啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子或T3啟動(dòng)子。用于vRNA載體的優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄終止序列包括，但不限于，RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄終止序列、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄終止序列、RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄終止序列、或核酶。本發(fā)明的范圍內(nèi)的核酶包括，但不限于，四膜蟲核酶、RNaseP、錘頭核酶、發(fā)夾核酶、肝炎核酶、以及合成的核酶。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于vRNA的至少一種載體包括RNA聚合酶II啟動(dòng)子，連接到核酶序列，連接到病毒編碼序列，連接到另一個(gè)核酶序列，任選地連接到RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄終止序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于vRNA產(chǎn)生的至少2種，優(yōu)選的更多的，例如3、4、5、6、7或8種載體包含RNA聚合酶II啟動(dòng)子、第一核酶序列，其5'于(5'to)相應(yīng)于病毒序列的序列，包括病毒編碼序列，其5'于第二核酶序列，其5'于轉(zhuǎn)錄終止序列。每個(gè)vRNA載體中的每個(gè)RNA聚合酶II啟動(dòng)子可以是與任何其他的vRNA載體中的RNA聚合酶II啟動(dòng)子相同或不同的。類似地，每個(gè)vRNA載體中的每個(gè)核酶序列可以是與任何其他vRNA載體中的核酶序列相同或不同的。在一個(gè)實(shí)施方式中，單個(gè)載體中的核酶序列不是相同的。本發(fā)明還提供了制備流感病毒的方法。所述方法包括用多種本發(fā)明的載體接觸細(xì)胞，例如，次序地或同時(shí)地，例如，采用本發(fā)明的組合物，以有效產(chǎn)生傳染性流感病毒的數(shù)量。本發(fā)明還包括來(lái)自與所述組合物接觸的細(xì)胞的分離的病毒。因而，本發(fā)明進(jìn)一步提供了分離的病毒，以及與本發(fā)明的組合物或病毒接觸的宿主細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括在其他載體，vRNA或蛋白質(zhì)生產(chǎn)載體，之前，用一種或多種載體，vRNA或蛋白質(zhì)生產(chǎn)載體，接觸細(xì)胞。不需要輔助病毒感染的在此描述的產(chǎn)生病毒的方法，在病毒誘變研究中、在疫苗的生產(chǎn)(例如，用于AIDS、流感、B型肝炎、C型肝炎、鼻病毒、線狀病毒、癡疾、皰滲和口蹄疫)和基因治療載體(例19如，用于癌癥、AIDS、腺苷脫氨酶、肌營(yíng)養(yǎng)不良、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨曱酰酶缺失和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤)中是有用的。因而，提供了用于藥物治療(例如，用于疫苗或基因治療)的病毒。本發(fā)明還提供了相對(duì)于病原體，例如細(xì)菌、病毒、寄生蟲或惡性腫瘤來(lái)免疫個(gè)體的方法。所述方法包括向所述個(gè)體施用有效免疫所述個(gè)體的量的至少一種本發(fā)明的分離的病毒，任選地與佐劑組合。所述病毒包含vRNA,所述vRNA包含由病原體所編碼的多肽或腫瘤特異性多肽。還提供的是在哺乳動(dòng)物中增加或提高內(nèi)源蛋白質(zhì)的表達(dá)的方法，所述哺乳動(dòng)物具有特征是內(nèi)源蛋白質(zhì)的降低數(shù)量或缺乏的癥候或疾病。所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物施用在哺乳動(dòng)物中增加或提高內(nèi)源蛋白數(shù)量的有效數(shù)量的本發(fā)明的分離的病毒。優(yōu)選的，所述哺乳動(dòng)物是人。附圖的簡(jiǎn)要描述附圖1.各種流感病毒的滴度。附圖2.用于通過(guò)反向遺傳學(xué)產(chǎn)生H5N1/PR8重配體病毒的NlNA。VN1203fi11含有來(lái)自H5N1前體毒株GsGd96的Nl的20氨基酸(aa)插入物。VN1203fill.N2除了來(lái)自GsGd96NA的20aa之外，含有來(lái)自N2NA的14-aa,產(chǎn)生VN1203NA的莖部?jī)?nèi)的34-aa插入物。VN1202fill.N2N9除了來(lái)自GsGd96NA的20aa和來(lái)自N2NA的14aa之外，含有來(lái)自N9NA的14-aa,產(chǎn)生VN1203的莖部?jī)?nèi)的48-aa插入物。每個(gè)NA的莖部區(qū)域的預(yù)測(cè)的總長(zhǎng)度在每個(gè)分子之下給出。附圖3.H5N1/PR8重配體病毒在雞的有胚蛋中的生長(zhǎng)。通過(guò)用MDCK細(xì)胞的斑塊滴定比較了含有無(wú)毒力形式的VN1203HA以及同源的NA(VN1203)或異源的NA(VN1203fi11、VN1203fill.N2、HK213或PR8)與PR8背景的滴度。還包括了野生型(采用的蛋)PR8的滴度用于對(duì)比。數(shù)據(jù)報(bào)告為每個(gè)病毒接種的3個(gè)蛋的平均滴度和標(biāo)準(zhǔn)偏差。附圖4.H5N1重配體病毒在有胚雞蛋中的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。我們用含有PR8NA(PR8)、VN1203NA(VN1203)或VN1203fi11NA(VN1203fi11)的相同數(shù)量(104EID50)的病毒接種了蛋。在標(biāo)明的時(shí)點(diǎn)測(cè)定每種病毒接種的3個(gè)蛋的平均HA滴度和標(biāo)準(zhǔn)偏差。附圖5.雞紅血球的病毒洗脫。含有具有不同的莖部長(zhǎng)度的VN1203NA或PR8NA的每種病毒(1:1024的HA滴度)的20倍稀釋物在微量滴定板中在4。C與雞紅血球孵育1小時(shí)。平板然后在37°C保存，記錄HA滴度的降低8小時(shí)。附圖6.H5N1/PR8重配體病毒在雞的有胚蛋中的生長(zhǎng)比較。通過(guò)用MDCK細(xì)胞的斑塊滴定比4支了6:2和7:1重配體病毒，包括WHO建議的NIBRG-14毒林(VN1194/PR86:2重配體病毒)的病毒滴度。顯示了用每種病毒接種的3個(gè)蛋的平均滴度和標(biāo)準(zhǔn)偏差。因而，僅用PR8的NA替換H5N1病毒的NA可以改善蛋中的滴度。附圖7.具有PR8(UW)或PR8(Cambridge)內(nèi)部基因的重配體H5N1病毒在有胚雞蛋中的生長(zhǎng)。星號(hào)表明與PR8(UW)/1194相比傳染性的顯著的(p<0.05,Studentt-test)降低。附圖8.M和NS基因?qū)Σ《驹谟信唠u蛋中的生長(zhǎng)的影響。星號(hào)表明與PR8(UW)/1194相比傳染性的顯著的(p<0.05，Studentt-test)提高。附圖9.PR8(UW)/1194和NIBRG-14病毒在MDCK細(xì)胞中的生長(zhǎng)。附圖10.對(duì)于相對(duì)NIBRG-14在MDCK細(xì)胞中PR8(UW)/1194的增強(qiáng)的生長(zhǎng)負(fù)責(zé)的基因段的鑒定。附圖11.對(duì)于在MDCK細(xì)胞中疫苗種子病毒的高生長(zhǎng)速度負(fù)責(zé)的PB2中的氨基酸的筌定。附圖12.具有不同的HA、NA和NS基因的重配體在MDCK細(xì)胞中的生長(zhǎng)速度。星號(hào)表明與PR8(UW)/1194的相比顯著地更好的病毒生長(zhǎng)。雙星號(hào)表明與表達(dá)PR8(UW)NS的病毒相比顯著地更好的生長(zhǎng)速度。附圖13.含有異源NS段的H5N1疫苗種子病毒在MDCK細(xì)胞中的生長(zhǎng)。附圖14.在有胚雞蛋或MDCK細(xì)胞中具有高生長(zhǎng)能力的H5N1疫苗種子病毒的基因型的示意圖。21附圖15.PR8(Cambridge)基因的核普酸序列(SEQIDNO.28-33)。發(fā)明的詳細(xì)^兌明定義如在此使用的，術(shù)語(yǔ)"分離的或純化的"是指本發(fā)明的載體、質(zhì)?；虿《镜捏w外制備、分離和/或純化，從而它不與體內(nèi)物質(zhì)相關(guān)，或基本上從體外物質(zhì)中純化。分離的病毒制品一般通過(guò)體外培養(yǎng)和增殖、和/或經(jīng)由在蛋中傳代來(lái)獲得，并且基本上沒(méi)有其他的傳染原。如在此使用的，"基本上沒(méi)有"是指低于使用該病原的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的特定傳染原的檢測(cè)水平。"重組"病毒是已經(jīng)例如利用重組DNA技術(shù)體外操作來(lái)向病毒基因組中引入改變的病毒。重配體病毒可以通過(guò)重組或非重組技術(shù)來(lái)制備。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)"重組核酸"或"重組DNA序列或片段"是指核酸，例如，是指DNA,其以及衍生自或分離自一來(lái)源，其可以隨后被體外化學(xué)改變，從而它的序列不是天然發(fā)生的，或相應(yīng)于天然發(fā)生的序列，所述序列不位于它們?cè)谔烊换蚪M中所處的位置。"衍生自"一來(lái)源的DNA的實(shí)例可以是被筌定為有用的片段、然后以基本上純的形式被化學(xué)合成的DNA序列。從來(lái)源"分離的"這種DNA的實(shí)例將是有用的DNA序列，其通過(guò)化學(xué)方法，例如通過(guò)使用限制性內(nèi)切酶從所述來(lái)源上切除或除下，/人而它可以通過(guò)遺傳工程的方法進(jìn)一步操作，例如，擴(kuò)增，以在本發(fā)明中使用。如在此使用的，"異源，，流感病毒基因或基因片段是來(lái)自流感病毒來(lái)源的，其不同于重配體流感病毒中的大多數(shù)的其他流感病毒基因或基因片段。流感病毒復(fù)制A型流感病毒具有編碼總共十個(gè)蛋白質(zhì)的八個(gè)單鏈的陰性-正義病毒RNA(vRNA)的基因組。流感病毒生命周期開始于血球凝集素(HA)與宿主細(xì)胞表面上含唾液酸的受體的結(jié)合，隨后是受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。晚期內(nèi)涵體中的低pH值觸發(fā)了HA中的構(gòu)象移動(dòng)，從而暴露HA2亞單位的N-末端(所謂的融合肽)。融合肽啟動(dòng)病毒和內(nèi)涵體膜的融合，基質(zhì)蛋白質(zhì)(Ml)和RNP復(fù)合物被釋放到細(xì)胞質(zhì)中。RNP由殼體包裹vRNA核蛋白(NP)、病毒聚合酶復(fù)合物組成，病毒聚合酶復(fù)合物由PA、PB1和PB2蛋白質(zhì)形成。RNP被轉(zhuǎn)運(yùn)到核中，在其中發(fā)生轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。RNA聚合酶復(fù)合物催化三種不同的反應(yīng)具有5'帽和3'ployA結(jié)構(gòu)的mRNA的合成，全長(zhǎng)互補(bǔ)RNA(cRNA)的合成，以及利用cDNA作為模板的基因組vRNA的合成。新近合成的vRNA、NP和聚合酶蛋白質(zhì)然后組裝成RNP,乂人核中輸出，并轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜，在此發(fā)生子代病毒顆粒的出芽。神經(jīng)氨酸酶(NA)蛋白質(zhì)在感染晚期起到重要作用，通過(guò)從唾液酸寡糖移除唾液酸，從而從細(xì)胞表面釋放新組裝的病毒顆粒，并阻止病毒顆粒的自我聚集。雖然病毒組裝涉及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-vRNA相互作用，這些相互作用的性質(zhì)很多是未知的。雖然B型和C型流感病毒在結(jié)構(gòu)上和功能上類似于A型流感病毒，但存在著某些差異。例如，B型流感病毒不具有M2蛋白質(zhì)。類似地，C型流感病毒不具有M2蛋白質(zhì)?？梢栽诒景l(fā)明中使用的細(xì)胞系和流感病毒根據(jù)本發(fā)明，支持流感病毒的有效復(fù)制的任何細(xì)胞可以在本發(fā)明中采用，包括表達(dá)減低的或降低的一種或多種唾液酸的突變的細(xì)胞，唾液酸是流感病毒的受體。通過(guò)所述方法獲得的病毒可以制成重配體病毒。優(yōu)選的，細(xì)胞是WHO驗(yàn)證的、或是可驗(yàn)證的連續(xù)傳代細(xì)胞系。驗(yàn)證這些細(xì)胞系的要求包括針對(duì)至少一個(gè)家系、生長(zhǎng)特征、免疫學(xué)標(biāo)記物、病毒易感性腫瘤發(fā)生學(xué)和保存條件，以及通過(guò)在動(dòng)物、蛋和細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)試來(lái)表征。這些特征被用于確認(rèn)所述細(xì)胞沒(méi)有可檢測(cè)的不確定病原。在某些國(guó)家，細(xì)胞核學(xué)也是需要的。此外，腫瘤發(fā)生學(xué)在細(xì)胞中優(yōu)先#:測(cè)試，所述細(xì)胞處于與用于疫苗產(chǎn)生的那些細(xì)胞相同的傳代水平。在滅活或減毒用于疫苗生產(chǎn)之前，病毒優(yōu)選地通過(guò)已經(jīng)顯示了得出一致結(jié)果的過(guò)程來(lái)純化(參見，例如WorldHealthOrganization,1982)。優(yōu)選的是建立要使用的細(xì)胞系的完整的特征，從而可以包括對(duì)最終產(chǎn)物的純度的合適的測(cè)試?？梢杂糜谝诒景l(fā)明中使用的細(xì)胞的表征的數(shù)據(jù)包括(a)關(guān)于它的來(lái)源、衍生和傳代歷史的信息；(b)關(guān)于它的生長(zhǎng)和形態(tài)學(xué)特征的信息；(c)不確定病原的測(cè)試的結(jié)果；(d)容許細(xì)胞在其他細(xì)胞系中被明確地識(shí)別的區(qū)別特征，例如，生物化學(xué)、免疫學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)模式；和(e)腫瘤發(fā)生學(xué)的測(cè)試結(jié)果。優(yōu)選的，使用的宿主細(xì)胞的傳代水平或群體加倍是盡可能低的。優(yōu)選的是，在疫苗或基因治療制劑之前，在細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒是高度純化的。一般地，純化操作將產(chǎn)生細(xì)胞DNA、其他細(xì)胞組分和不確定病原的廣泛的去除。也可以使用廣泛地降解或變性DNA的操作。參見，例如，Mizrahi,1990.疫苗本發(fā)明的疫苗可以包括免疫原性蛋白質(zhì)，包括任何病原體的糖蛋白，例如，來(lái)自一種或多種細(xì)菌、病毒、酵母或真菌的免疫原性蛋白質(zhì)。因而，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的流感病毒可以是流感病毒或其他病毒病原體的疫苗載體，包括但不限于慢病毒，例如HIV,B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、皰滲病毒，例如CMV或HSV或口蹄疫病毒。通過(guò)超濾來(lái)濃縮完整的病毒顆粒疫苗，然后通過(guò)區(qū)帶離心或通過(guò)層析來(lái)純化。在純化之前或之后使用例如福爾馬林或P-丙內(nèi)酯來(lái)滅活。亞單位疫苗包括純化的糖蛋白。這些疫苗可以如下制備使用通過(guò)洗滌劑處理來(lái)片斷化的病毒懸浮液，通過(guò)例如超速離心來(lái)純化表面抗原。亞單位疫苗因而主要含有HA蛋白質(zhì)，還含有NA。使用的洗滌劑可以是陽(yáng)離子洗滌劑，例如，溴化十六碳烷基三甲銨(Bachmeyer，1975),陰離子洗滌劑，例如脫氧膽酸銨(Laver&Webster,1976);或非離子型洗滌劑，例如以名稱TRITONX100商品化的那些。還可以在用蛋白酶例如菠蘿蛋白酶處理病毒顆粒之后分離血球凝集素，然后通過(guò)例如Grand和Skehel(1972)所描述的方法來(lái)純化。裂解疫苗(splitvaccine)包含病毒顆粒，所述病毒顆粒已經(jīng)經(jīng)歷了溶解脂質(zhì)的試劑的處理。裂解疫苗可以如下制備如上獲得的、滅活或不滅活的純化的病毒的水懸浮液，通過(guò)與洗滌劑一起添加脂質(zhì)溶24劑例如乙醚或氯仿在攪動(dòng)下處理。病毒包膜脂質(zhì)的溶解引起病毒顆粒的段裂。復(fù)原含有裂解疫苗的水相，主要由除去了它們最初的脂質(zhì)環(huán)境的血球凝集素和神經(jīng)氨酸酶、以及核心和其降解產(chǎn)物組成。然后，如果還沒(méi)有進(jìn)行的話，滅活殘余的傳染性的顆粒。滅活疫苗.本發(fā)明的滅活的流感病毒疫苗通過(guò)使用已知的方法，例如但不限于福爾馬林或|3-丙內(nèi)酯處理來(lái)滅活本發(fā)明的復(fù)制的病毒來(lái)提供?？梢杂糜诒景l(fā)明的滅活疫苗類型可以包括完整病毒(wv)疫苗或亞病毒顆粒(SV)(裂解)疫苗。WV疫苗含有完整的、滅活的病毒，而SV疫苗含有純化的病毒，其是用溶解含脂質(zhì)的病毒包膜的洗滌劑破壞了的，隨后是殘余病毒的化學(xué)滅活。此外，可以使用的疫苗包括含有分離的HA和NA表面蛋白質(zhì)的那些，其稱為表面抗原或亞單位疫苗。一般地，對(duì)SV和表面抗原(即，純化的HA或NA)疫苗的反應(yīng)是類似的。含有與流4亍病毒免疫地相關(guān)的NA抗原和不相關(guān)的HA的實(shí)^險(xiǎn)滅活的WV疫苗，與常規(guī)的疫苗相比似乎是較不有效的(Ogra等，1977)。含有兩種相關(guān)的表面抗原的滅活疫苗是優(yōu)選的?；畹臏p毒病毒疫苗.根據(jù)已知的方法步驟，活的減毒的流感病毒疫苗也可以用于預(yù)防或治療流感病毒感染。優(yōu)選的，通過(guò)根據(jù)已知的方法(參見，例如Murphy,1993)從減毒的供體病毒轉(zhuǎn)移減毒的基因到復(fù)制的分離物或重配的病毒，在單個(gè)步驟中實(shí)現(xiàn)減毒。由于對(duì)A型流感病毒的抗性是由對(duì)HA和NA糖蛋白的免疫反應(yīng)的發(fā)展所介導(dǎo)的，編碼這些表面抗原的基因必須來(lái)自重配的病毒或高生長(zhǎng)的臨床分離物。減毒的基因來(lái)源于減毒的親本。在這種方法中，賦予減毒的基因優(yōu)選地不編碼HA和NA糖蛋白。另外的，這些基因不能^C轉(zhuǎn)移到攜帶臨床病毒分離物的表面抗原的重配體。已經(jīng)評(píng)估了許多供體病毒來(lái)生產(chǎn)性地減毒流感病毒的能力。作為非限制性實(shí)例，A/AnnArbor(AA)/6/60(H2N2)冷適應(yīng)的(ca)供體病毒可以用于減毒疫苗生產(chǎn)(參見，例如，Edwards,1994;Murphy,1993)。另外，活的減毒的重配體病毒疫苗可以通過(guò)交配ca供體病毒和本發(fā)明的強(qiáng)毒復(fù)制病毒來(lái)產(chǎn)生。然后在存在H2N2抗血清的情況下在25。C選擇重配體子代(對(duì)于強(qiáng)毒病毒的復(fù)制是限制性的)，H2N225抗血清抑制帶有減毒的A/AA/6/60(H2N2)ca供體病毒的表面抗原的病毒的復(fù)制。已經(jīng)在人類中評(píng)估了一大系列的H1N1和H3N2重配體并發(fā)現(xiàn)是令人滿意的(a)傳染性，(b)對(duì)于血清反應(yīng)陰性的兒童和免疫性致敏的成年人減毒的，(c)免疫原性和(d)遺傳溫度。ca重配體的免疫原性平行于它們的復(fù)制水平。因而，新的野生型病毒獲得ca供體病毒的六個(gè)可轉(zhuǎn)移基因，可再生性地減毒了這些病毒，用于免疫易感的成年人和兒童。其他的減毒突變可以通過(guò)定點(diǎn)誘變導(dǎo)入流感病毒中來(lái)拯救帶有這些突變基因的傳染性病毒。減毒的突變可以被導(dǎo)入基因組的非編碼區(qū)域，以及導(dǎo)入編碼區(qū)域。這樣的減毒突變也可以;故導(dǎo)入除了HA或NA以外的基因，例如，PB2聚合酶基因(Subbamo等，1993)。因而，還可以產(chǎn)生帶有通過(guò)定點(diǎn)誘變導(dǎo)入的減毒突變的新的供體病毒，這種新的供體病毒可以以類似于以上對(duì)A/AA/6/60ca供體病毒所描述的方式用于活的減毒重配體H1N1和H3N2疫苗的產(chǎn)生。類似地，其他已知的和適合的減毒供體毒抹可以與本發(fā)明的流感病毒重配，來(lái)獲得適用于哺乳動(dòng)物的疫苗接種的減毒疫苗(Enami等，1990;Muster等，1991;Subbarao等，1993)。優(yōu)選的是，這種減毒病毒維持了來(lái)自病毒的基因，其編碼基本上類似于最初的臨床分離物的那些的抗原決定簇。這是因?yàn)闇p毒疫苗的目的是提供與病毒的原始臨床分離物基本上相同的抗原性，而同時(shí)缺乏傳染性，達(dá)到疫苗在接種的哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生誘導(dǎo)嚴(yán)重病原狀況的最小的改變。因而，根據(jù)已知的方法，病毒可以被減毒或滅活，被配制和施用，作為疫苗來(lái)在動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。用于確定這種減毒的或滅活的疫苗是否維持了與臨床分離物或由此衍生的高生長(zhǎng)毒抹相似的抗原性的方法是本領(lǐng)域公知的。這些已知的方法包括使用抗血清或抗體來(lái)消除表達(dá)供體病毒的抗原決定簇的病毒；化學(xué)選擇(例如，金剛烷胺或金剛乙胺(rimantidine));HA和NA活^化和抑制；和DNA篩選(例如，探針雜交或PCR),來(lái)確認(rèn)編碼抗原決定簇的供體基因(例如，HA或NA基因)不存在于減毒病毒中。參見，例如，Robertson26等，1988;Kilboume，1969;Aymard-Henry等，1985;Robertson等,1992。藥物組合物適合于接種或胃腸外或口服施用的本發(fā)明的藥物組合物包含減毒的或滅活的流感病毒，任選地進(jìn)一步包含無(wú)菌的水性或非水性溶液、懸浮液和乳劑。如本領(lǐng)域已知的，所述組合物可以進(jìn)一步包含助劑或貝武形劑。參見，例^口，Berkow等，1987;Avery'sDrugTreatment,1987;Osol,1980;Katzung,1992。本發(fā)明的組合物一般以單次劑量(單位劑量)的形式存在。常規(guī)的疫苗一般含有約0.1到200貼、優(yōu)選的10到15嗎的來(lái)自每種毒抹的血球凝集素進(jìn)入它們的組合物。形成本發(fā)明的疫苗組合物的主要成分的疫苗可以包含A、B或C型的病毒或任何它們的組合，例如，三種類型的至少兩種、不同亞型的至少兩種、相同類型的至少兩種、相同亞型的至少兩種、或不同的分離物或重配體。人類A型流感病毒包括H1N1、H2N2和H3N2亞型。用于胃腸外施用的制品包括無(wú)菌的水性或非水性溶液、懸浮液和/或乳劑，其可以含有本領(lǐng)域已知的助劑或賦形劑。非水性溶劑的實(shí)例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖油，以及可注射的有才幾酯，例如油酸乙酯。載體或閉塞敷料可以用于提高皮膚透過(guò)性并增強(qiáng)抗原吸收。用于口服施用的液體劑型一般可以包含含有液體劑型的脂質(zhì)體溶液。懸浮脂質(zhì)體的適合的形式包括乳劑、懸浮液、溶液、糖漿和酏劑，其含有本領(lǐng)域通常使用的惰性稀釋劑，例如純水。除了惰性稀釋劑之外，這種組合物還可以包括佐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑和懸浮劑，或糖化劑、調(diào)味劑或芳香劑。參見，例如，Berkow等，1992;Avery's,1987;Osol,1980;和Katzung,1992。當(dāng)本發(fā)明的組合物被用于向個(gè)體施用時(shí)，它可以進(jìn)一步包括鹽、緩沖液、佐劑或改善組合物的效力所希望的其他物質(zhì)。對(duì)于疫苗，可以使用佐劑，其是可以增加特異性免疫反應(yīng)的物質(zhì)。通常，在呈遞給免疫系統(tǒng)之前混合佐劑和混合物，或者單獨(dú)地呈遞，但是進(jìn)入被免疫的生物體的相同的部位。適用于疫苗組合物的材料的實(shí)例在Osol(1980)中提供了。27疫苗中的異質(zhì)性可以通過(guò)混合復(fù)制的流感病毒與至少兩種流感病毒毒株，例如2-50種毒株或其中的任何范圍或值來(lái)提供。具有當(dāng)前的抗原性成分的A或B型流感病毒毒抹是優(yōu)選的。根據(jù)本發(fā)明，利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，可以為流感病毒的單個(gè)毒株中的變異提供疫苗。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以進(jìn)一步或另外包括至少一種化學(xué)治療化合物，例如，對(duì)于基因治療，免疫抑制劑、抗炎癥試劑或免疫增強(qiáng)劑，對(duì)于疫苗，化學(xué)治療劑包括但不限于，丙種球蛋白、金剛烷胺、胍、羥基苯并咪唑、干擾素-a、干擾素-卩、干擾素i、腫瘤壞死因子-a、硫代半卡巴腙(thiosemicarbarzones)、曱吲漆腙、利福平、病毒唑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、膦甲酸、膦乙酸、無(wú)環(huán)鳥苷、雙脫氧核苷、蛋白酶抑制物或更昔洛韋。分別參見，例如，Katzung(1992)和在第798-800和680-681頁(yè)中引用的參考文獻(xiàn)。組合物還可以含有可變量但是少量的無(wú)內(nèi)毒素的甲醛和防腐劑，果。-、"、、、'、"、藥物目的組合物(或它引發(fā)的抗血清)的施用可以是用于"預(yù)防性的"或"治療性的"目的。當(dāng)預(yù)防性地提供時(shí)，作為疫苗的本發(fā)明的組合物在病原體感染的任何癥狀變得顯明之前來(lái)提供。組合物的預(yù)防性施用用來(lái)阻止或減弱任何隨后的感染。當(dāng)預(yù)防性地提供時(shí)，本發(fā)明的基因治療組合物在疾病的任何癥狀變得顯明之前來(lái)提供。組合物的預(yù)防性施用用來(lái)阻止或減弱與疾病相關(guān)的一種或多種癥狀。當(dāng)治療性地提供時(shí)，在檢測(cè)到實(shí)際感染的癥狀時(shí)提供減毒的或滅活的病毒疫苗?；衔锏闹委熜允┯糜脕?lái)減弱任何實(shí)際的感染。參見，例如，Berkow等，1992;Avery,1987;和Katzung,1992。當(dāng)治療性地提供時(shí)，在檢測(cè)到疾病的癥狀或癥候時(shí)提供基因治療組合物?；衔锏闹委熜允┯糜脕?lái)減弱疾病的癥狀或癥候。因而，本發(fā)明的減毒的或滅活疫苗的疫苗組合物可以在感染的發(fā)作之前(以便阻止或減弱預(yù)期的感染)或在實(shí)際感染的開始之后來(lái)提供。類似地，對(duì)于基因治療，組合物可以在失調(diào)或疾病的任何癥狀明細(xì)之前或在檢測(cè)到一種或多種癥狀之后來(lái)提供。如其施用可以被接受者患者耐受，組合物被稱為是"藥學(xué)上可接受的"。如果施用的數(shù)量是生理學(xué)上顯著的，這樣的試劑被稱為以"治療有效量"施用。如果其存在引起了接受者患者的生理方面的可檢測(cè)的改變，例如，增強(qiáng)針對(duì)至少一種傳染性流感病毒的毒抹的至少一種初級(jí)或刺激體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)，本發(fā)明的組合物是生理學(xué)上顯著的。如果存在著相比對(duì)照群體或患者組存在著統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的改善，提供的"保護(hù)，，不必是完全的，即，流感感染不必被完全防止或消滅。保護(hù)可以限于緩解流感病毒感染的癥狀的嚴(yán)重度或發(fā)作的快速性。藥物施用病原體，例如一種或多種流感病毒的抗性。在主動(dòng)免疫中，滅活的減毒的活疫苗組合物預(yù)防性地向宿主(例如，哺乳動(dòng)物)施用，宿主針對(duì)該施用的免疫反應(yīng)保護(hù)了免于感染和/或疾病。對(duì)于^皮動(dòng)免疫，可以回收引發(fā)的抗血清，并施用給懷疑具有至少一種流感病毒毒抹引起的感染的接受者。本發(fā)明的基因治療組合物可以通過(guò)主動(dòng)免疫產(chǎn)生預(yù)防或治療水平的期望的基因產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，在足以引起免疫反應(yīng)的產(chǎn)生的時(shí)間和數(shù)量條件下向雌性哺乳動(dòng)物(或在妊娠或分娩之前)提供疫苗，所述免疫反應(yīng)用來(lái)保護(hù)雌性和胎兒或新生兒(通過(guò)穿越胎盤的或在母親的母乳中的抗體的被動(dòng)摻合)。因而本發(fā)明包括防止或減弱失調(diào)或疾病，例如至少一種病原體的抹系的感染的方法。如在此使用的，如果其施用引起了疾病的癥狀或狀況的總體或部分減弱(即，抑制)，或引起個(gè)體對(duì)疾病的總體或部分免疫性，疫苗被稱為阻止或減弱疾病。如在此使用的，如果其施用引起了疾病的癥狀或狀況的總體或部分減弱(即，抑制)，或引起個(gè)體對(duì)疾病的總體或部分免疫性，基因治療組合物;故稱為阻止或減弱疾病。本發(fā)明的至少一種滅活的或減毒的流感病毒、或其組合物可以使用如早先描述的藥物組合物通過(guò)實(shí)現(xiàn)預(yù)期目的的任何方式來(lái)施用。例如，這種組合物的施用可以通過(guò)各種胃腸外的途徑，例如，皮下的、靜脈內(nèi)的、皮內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、鼻內(nèi)的、口腔的或穿表皮的途徑。胃腸外施用可以通過(guò)彈丸注射，或通過(guò)一定時(shí)間內(nèi)的逐步灌注。使用本發(fā)明的藥物組合物的優(yōu)選的方式是通過(guò)肌肉內(nèi)的或皮下的應(yīng)用。參見，例如，Berkow等，1992;Avery,1987;和Katzung,1992。防止、抑制或治療流感病毒相關(guān)病理的典型方式包括在一定時(shí)期內(nèi)，包括一周和約24個(gè)月之間、或其中的任何范圍或值的時(shí)間，施用有效量的在此描述的疫苗組合物，作為單次治療、或作為增強(qiáng)或強(qiáng)化給藥來(lái)重復(fù)。根據(jù)本發(fā)明，"有效量，，的組合物是足以實(shí)現(xiàn)期望的生物學(xué)效果的組合物。要理解的是，有效劑量將取決于接受者的年齡、性別、健康狀態(tài)和體重，當(dāng)前治療的類型，如果有的話，治療的頻率以及希望的效果的性質(zhì)。以下提供的有效劑量的范圍不意圖限制本發(fā)明，是代表優(yōu)選的劑量范圍。然而，最優(yōu)選的劑量將適合于個(gè)體的受試者，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解和可確定的。參見，例如，Berkow等，1992;Avery's，1987;和Katsimg，1992。用于哺乳動(dòng)物(例如，人類)或禽類成年生物體的減毒病毒的劑量可以是約10M0"噬斑形成單位(PFU)/kg,或其中的任何范圍或值。滅活疫苗的劑量可以是約0.1到200jug的范圍，例如50pg的血球凝集素蛋白質(zhì)。然而，劑量應(yīng)當(dāng)是利用現(xiàn)有的疫苗作為出發(fā)點(diǎn)通過(guò)常規(guī)方法測(cè)定的安全和有效量。每劑復(fù)制的病毒疫苗中免疫反應(yīng)性HA的劑量可以被標(biāo)準(zhǔn)化為含有合適的數(shù)量，例如，1-50pg或其中的任何范圍或值，或者美國(guó)公眾健康服務(wù)(PHS)所推薦的數(shù)量，其通常是對(duì)于超過(guò)3歲的較大的兒童15jig每份，對(duì)于小于3歲的兒童7.5pg每份。NA的數(shù)量也可以被標(biāo)準(zhǔn)化，然而，這種糖蛋白可能在加工過(guò)程和保存期間是不穩(wěn)定的(Kendal等，1980)。每個(gè)0.5ml劑量的疫苗優(yōu)選地含有大約10-500億病毒顆粒，優(yōu)選的100億顆粒。本發(fā)明將通過(guò)以下非限制性實(shí)例進(jìn)一步描述。30實(shí)施例1為了開發(fā)用于A型流感/PuertoRico/8/34的反向遺傳系統(tǒng)，根據(jù)廠家的方案利用RNeasyMini試劑盒(Qiagen)從A/PuertoRico/8/34(H1N1)Madison高生長(zhǎng)變體(PR8HG)的尿嚢液提取病毒RNA。使用MMLV-RTase(Promega)和Unil2引物合成cDNA。使用以下的通過(guò)PCR將cDNA擴(kuò)增過(guò)4支引物集PB1:BaPB1國(guó)1和PB1-1735R(前方片|殳)以及PB1-903和Ba-PB1-2341R(后方片段)Ba-PB1-1CACACACGGTCTCCGGGAGCGAAAGCAGGCA(SEQIDNO:9)173PB1-1735RGGGTTTGTATTTGTGTGTCACC(SEQIDNO:28)233PBl-卯3CCAGGACACTGAAATTTCTTTCAC(SEQIDNO:IO)Ba國(guó)PBl國(guó)2341RCACACAGGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGCATTT(SEQIDNO:ll)PB2:BaPB2-1和B21260R(前方片l殳)以及WSNPB2seq-2和Ba-PB2-2341R(后方片段)Ba-PB2陽(yáng)1CACACAGGTCTCCGGGAGCGAAAGCAGGTC(SEQIDNO:12)B21260RCACACACGTCTCCATCATACAATCCTCTTG(SEQIDNO:13)31WSNPB2seq國(guó)2CTCCTCTGATGGTGGCATAC(SEQIDNO:14)Ba-PB2誦2341RNO:15)Bm-PA國(guó)1CACACACGTCTCCGGGAGCGAAAGCAGGTAC(SEQIDNO:16)Bm-PA-2233RCACACACGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGTACTT(SEQIDNO:17)HA:Bm畫HA-l:CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGGG(SEQIDNO:18)Bm-NS-890R:IDNO:19)NP:Bm-NP-1CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGGTA(SEQIDNO:20)Bm-NP-1565RIDNO:21)NA:Ba國(guó)NA誦lIDNO:22)Ba畫NA-1413R:IDNO:23)M:Bm-M-1CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGTAG(SEQIDNO:24)Bm國(guó)M-1027RIDNO:25)Bm-NS-1CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGGTG(SEQIDNO:26)Bm-NS誦890RCACACACGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT(SEQIDNO:27)DNA聚合酶；/wNativeDNA聚合酶(Stratagene)通過(guò)凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，使用凝膠提取試劑盒(Qiagen)從瓊脂糖凝月交提取。提取的基因使用Takara連接試劑盒ver.II(Takara)連接到pT7Blue鈍的載體(Novagen)中。在5小時(shí)之后，連接的基因轉(zhuǎn)化到JM109(PB2、M和NS基因)或DH5alpha(PA、PB1和NP)中。每個(gè)基因的六個(gè)菌落在TB中培養(yǎng)8小時(shí)。從細(xì)菌培養(yǎng)物提取質(zhì)粒，測(cè)序每個(gè)基因的四個(gè)克隆。pT7Blue中的PA、NP、M和NS基因通過(guò)^smBI酶(NewEnglandBiolabs)切下。PB1基因通過(guò)BmI(NewEnglandBiolabs)切下。切下的基因與用&mBI消化的pPolIR載體連接過(guò)夜，pPolIR載體含有人類RNA聚合酶I啟動(dòng)子和小鼠RNA聚合酶I終止子。pT7Blue中PB2基因的前部片段通過(guò)GI(NewEnglandBiolabs)和HI(Roche)切下，后部片段通過(guò)SwGI(NewEnglandBiolabs)和I(Roche)切下?；旌锨邢碌钠危ㄟ^(guò)AyaI消化。6小時(shí)之后，消化的基因利用PCR純化試劑盒(Qiagen)來(lái)純化，在pPolIR載體的wBI位點(diǎn)之間連接過(guò)夜。連接的PB1、PA、NP、M和NS-pPolIR基因用于轉(zhuǎn)化JM109(M和NS基因)或DH5alpha(PB1、PA和NP基因)過(guò)夜。轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的克隆在LB上培養(yǎng)過(guò)夜。連接的PB2-pPolIR被用于轉(zhuǎn)化JM109過(guò)夜。從細(xì)菌培養(yǎng)物提取質(zhì)粒，通過(guò)酶消化確認(rèn)插入物。PB2-PolIR轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的菌落在LB中培養(yǎng)8小時(shí)。然后提取質(zhì)粒，通過(guò)酶消化確認(rèn)基因插入物。測(cè)序所有的pPolI構(gòu)建體來(lái)確保它們不含有不希望的突變。PR8HG的pPolIR構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到具有A/WSN/33(WSN)-HA和NA、A/HongKong/483/97(HK)畫HAavir和NA、或A/Kawasaki/01(Kawasaki)-HA和NAPoll構(gòu)建體，以及聚合酶蛋白質(zhì)和A/WSN/33的NP的四種蛋白質(zhì)表達(dá)構(gòu)建體的293T人類胚腎細(xì)胞中。連續(xù)稀釋來(lái)自轉(zhuǎn)化的293T細(xì)胞的上清液(未稀釋到ICT7),感染到9天齡的有胚雞蛋的尿嚢腔中。收獲感染的雞蛋的尿嚢液，通過(guò)HA分析測(cè)試它們的病毒滴度(表1)。表1具有PR8基因和以下的HA和NA基因的病毒用以下稀釋度的293T上清液接種的雞蛋的尿嚢液的HA滴度(HAU/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>HA陽(yáng)性實(shí)例(在l(T2具有WSN-HANA的病毒和在未稀釋時(shí)具有HK-HAavirNA的病毒)被連續(xù)稀釋10-2到1(T8,lOOpl的每種稀釋物感染到有胚雞蛋中。收獲感染的雞蛋的尿嚢液，通過(guò)HA分析測(cè)試它們的病毒滴度(表2)。從質(zhì)粒制備的A/PuertoRico/8/34(H1N1)的50%蛋傳染性劑量(EID50)是101033/ml,HA滴度是1:3200。制備了具有來(lái)自A/HongKong/213/2003(H5N1)的HA和NA基因以及來(lái)自PR8HG的其余A性流感病毒基因的重組病毒。該重組病毒的滴度是10ia67EID5o/ml,HA滴度是1:1600。表2具有PR8基因和以下的HA和NA基因的病毒每個(gè)稀釋度中的HA滴度(HAU/ml)l(T2l(T3io-4lev510-6l(T7l(T8WSN-HANA160404032040640<1HK-HAavirNA400800400400400800<1PR8基因的序列:PAAGCGAAAGCAGGTACTGATCCAAAATGGAAGATTTTGTGCGACAATGCTTCAATCCGATGATTGTCGAGCTTGCGGAAAAAACAATGAAAGAGTATGGGGAGGACCTGAAAATCGAAACAAACAAATTTGCAGCAATATGCACTCACTTGGAAGTATGCTTCATGTATTCAGATTTTCACTTCATCAATGAGCAAGGCGA35GTCAATAATCGTAGAACTTGAAGCACAGATTTGAAATAATCGAGGGAAGAAGTAGTAAACAGTATTTGCAACACTACAGGTACCAGATTTGTATGATTACAAGGAGAATAACAAGGAGAGAAGTTCACATATACTATCTGATCTGAGAAAACACACATCCACATTTTCTCCCACAAAGGCAGACTACACTCTCGATGAAGACCAGACTATTCACCATAAGACAAGAAATGTTCCTTTCGTCAGTCCGAGAGAGGAGAAGAAAATCACAGGAACAATGCGCAAGCTTGCCGTTCTCCAGCCTTGAAAATTTTAGAGCCTATCGGCTACATTGAGGGCAAGCTGTCTCAAATGAATTGAACCTTTTTTGAAAACAACACCACGGGCCTCCCTGTTCTCAGCGGTCCAAATTCATTAAGCATTGAGGACCCAAGTCATGAAGGATGCAATCAAGTGATCCAAATGCACTTTTGGATCGCACAATGGCCTGGACGGCTGAGAAACCAAAGTTTCGATTCATCGAAATTGGAGTAGAAAAGGCCAATAAAATTAAGTTCACTGGGGAAGAAATGGAAAGCAGGGCTAGGATCAAAGCCAGCAGAGGCCTCTGGGAGACAATTGAAGAAAGGTTTGACCAAAGTCTCCCGCCGAACGTGGATGGATTCGAACCGAAGTCCAAAGAAGTAAATGCTAGACCACTTAGACTTCCGAATCTGCTGATGGATGCCTTAAAAGAGGGAATACCGCTATATG36<formula>formulaseeoriginaldocumentpage37</formula>GCCCATGTTCTTGTATGTGAGAACAAATGGAACCTCAAAAATTAAAATGAAATGGGGAATGGAGATGAGGCGTTGCCTCCTCCAGTCACTTCAACAAATTGAGAGTATGATTGAAGCTGAGTCCTCTGTCAAAGAGAAAGACATGACCAAAGAGTTCTTTGAGAACAAATCAGAAACATGGCCCATTGGAGAGTCCCCCAAAGGAGTGGAGGAAAGTTCCATTGGGAAGGTCTGCAGGACTTTATTAGCAAAGTCGGTATTCAACAGCTTGTATGCATCTCCACAACTAGAAGGATTTTCAGCTGAATCAAGAAAACTGCTTCTTATCGTTCAGGCTCTTAGGGACAACCTGGAACCTGGGACCTTTGATCTTGGGGGGCTATATGAAGCAATTGAGGAGTGCCTGATTAATGATCCCTGGGTTTTGCTTAATGCTTCTTGGTTCAACTCCTTCCTTACACATGCATTGAGTTAGTTGTGGCAGTGCTACTATTTGCTATCCATACTGTCCAAAAAAGTACCTTGTTTCTACT(SEQIDN0:1)PB1AGCGAAAGCAGGCAAACCATTTGAATGGATGTCAATCCGACCTTACTTTTCTTAAAAGTGCCAGCACAAAATGCTATAAGCACAACTTTCCCTTATACTGGAGACCCTCCTTACAGCCATGGGACAGGAACAGGATACAC38CATGGATACTGTCAACAGGAGGAAGATGGACAACAAACACCGAAACTGGATGATGGGCCACTGCCAGAAGACAATGAACCATTGTGTATTGGAGGCGATGGCTTTCCTTGTTTGAAAACTCGTGTATTGAAACGATGGAGAGACAAGCTGACACAAGGCCGACAGACCTAACCAACCTGCTGCAACAGCATTGGCCAACAAATGGCCTCACGGCCAATGAGTCTGGAAGGTGTAATGGAGTCAATGAACAAAGAAGAAATAGAGAAAGAGACGGGTGAGAGACAATATGAAGAACAATGGGTAAAAAGAAGCAGAGATTGTAGAGCATTGACCCTGAACACAATGACCAATAAAACGGAGAGCAATTGCAACCCCAGGGATACTTTGTTGAGACACTGGCAAGGAGTATAAGGGTTGCCAGTTGGAGGCAATGAGAAGAATAAGGAAGATCACATCAGTACTCAGAAAAGGCACCGCAACTCAACCCGATAAGTGGTTATGCCCAAACAGAGGAATCCCATCCTGGTATTGTTGTTCAGCAAACACGAGTTGACTGGACTCTAAATAGAACAATAGAAGTGTTCAGATCACTCATAGACTTCCTTAAGGAGGGGATCACAACTCATTTTCCTAAGAAAATGATAACACAGAACAAAAGGAGTTATCTAATAGATGCTGAGAGAGGGAAGCTGCAAATAAGGGGGTTTGTATGTGAGAAACTTGAACAATCAGCAAAGTTGGCAAATGTTG39GATGACCAATACTGGAGATAACACCAAATGGGCCATGATCACATATATGATTCTAAGTATTGCTCCAATAAAAGGGTATATGTTTGAGAGTGCAGAAATGCTAGCAAGCAGAAAGAAGATTGAAAAAATCTTGAGCCCTGGAATGATGATAGGCGTCTCCATCCTGAATCACTGGTGGGATmT/^TTr>A八1VJVJ丄H丄GCACCCAATCATGAAGGGATCTGTAAGCTACTTGGAATCAGAACAGGTACATTTGAATTCGCCAATTTCAGCATGGAGCTGTCAGCGGACATGAGTATTGACAATGATCTTCTCAGGACAGAACGAAAATCCAGAAATCAATGTTCTCAACAAGAGTATGTCGATTTGAACGACCGCTCTGGGCATGTTCTTGGACAAAATCCTCTGACGTCAAGCCGGAATATGAGCAAACAAGTTTTTTCCCAGTTTTGAGTTACTGTCCGAACTTTCCAGAATCCTCGCCCGAATGGACAAAATGGCAAACTTAGAAATATTTCAATTAATAGAGGGAATATGTTAAGAGATACACCATTTTGCTCTGTCGACAGGTGAAAAAGTCTTCTATCGTTAGGGGTGTCTGCATCAAAAACTTTCACCATCGGATGTTTTTTTCAGAAATGGAGACTGGGACTCAAATACCGATTCAACAAGACTGCATCAGCACTGTATTAAGACTACTTGATTGTGAATTTTATCGAACTACATAAACATGGGTTTGTTGGATCAACGAAATATGATAA40<formula>formulaseeoriginaldocumentpage41</formula>PB2AGCGAAAGCAGGTCAATTATAAGAACTACGAAATCTAATGTCGCAGTCTCAAAACCACCGTGGACCATATGGCCATAATCACAGGAGAAGAACCCAGCACTTAGGATGAAATCCAATTACAGCAGACAAGAGGATAACGGGAGCAAGGACAAACTTTATGGAGTAAAATGAGTGATGGTATCACCTCTGGCTGTGACATGTAACAAATACAGTTCATTATCCAAAAATCTGTCGAAAGGCTAAAGCATGGAACCTTTGGCAGTCAAAATACGTCGGAGAGTTGACATAAAGTGCCAAGGAGGCACAGGATGTAATCATGGGTGGGAGCCAGGATACTAACATCGGAATCGGAAGAAAGAAGAACTCCAGGATTGCAAAATACATGTTGGAGAGAGAACTGGTCCGCAAAAGGTGGAACAAATTCAATATGGAAAGAATAAGCACCCGCGAGATACTCACAAAGAAGTACACATCAGGAAGATGGATGATGGCAATGAAATAAATGATTCCTGAGAGAAATAATGATGCCGGATCAGACCGGTGGAATAGGAATGGACCAAACAAAACTTATTTTGAAAGACCTGTCCATTTTAGAAACCATCCTGGTCATGCAGATCTCAAAGTTGTTTTCCCTAACGAACAACTAACGATAACCAAAGATTCTCCTTTGATGGTTGCATCGAGATTCCTCCCAGTGGCT42GCAGTGTGTACATTGAAGTGATGCTGGGAACAGATGTATACTCCAGGAGGTTGATCAAAGCTTGATTATTGCTGCTAGGAGTATCAGCAGATCCACTAGCATCTTTATTGGATTGGTGGAATTAGGATGGTAGACATCCTAGCAAGCCGTGGATATATGCAAGGCTGCAATCCTTCAGTTTTGGTGGATTCACATTTAAGCAAGAGAGAGGAAGAGGTGCTTACGGGCAAGAGTGCATGAGGGATATGAAGAGTTCACAAGCCATACTCAGAAAAGCAACCAGGAGATTGGAGAGACGAACAGTCGATTGCCGAAGCAATCACAAGAGGATTGTATGATAAAAGCAGTCAAATAGGGCGAATCAACGATTGAATCCTATGTCAGAAGGATGCGAAAGTGCTTTTTCAAAAACAATGTGATGGGAATGATTGGGATATTGCGAGATGTCAATTGCATTTGACTCAAGGAACGGAAGTGAGGAATGATGATGACATAGTGAGAAGAGCTGCAGAGATGTGCCACAGCACACATAGGCAGAACCCAACAGAAGTGGGACTGAGAATTAGCTCAAGAACAAGCGGATCATCAGTTCTTCAAACATTGAAGATAATGGTTGGGAGAAGAGCAACAATTCAGCTGATAGTGAGTGGAATTGTGGCCATGGTATTTTGAGGTGATCTGAATTTCGTCCATCAACTTTTAAGACATTTTTGGGGAGTTGAACCTATCGCCGACATGACTCCAAGCATC43TGAGAGGAGTGAGAATCAGCCTCCAGCACGGAGAGGGTAGTGGTGAGCATGGGACCAACGAGGAAATGTACTACTGTCTCCAGGGAACAGAGAAACTGACAATAACTTACGATTAATGGTCCTGAATCAGTGTTGGTCAAGAAACTGGGAAACTGTTAAAATTCAGTGGTTACAATAAAATGGAATTTGAACCATTTCAGTAGAGGCCAATACAGTGGGTTTGTAAGAACATGTGCTTGGGACATTTGATACCGCACAGAGCAGCCGCTCCACCAAAGCAAAGTAGAATGGAATGTGAGGGGATCAGGAATGAGAATACTTATTCAACTATAACAAGGCCACGAAGAGACGCTGGCACTTTAACTGAAGACCCAGATGAACGCTGTTCTGAGGGGATTCCTCATTCTGGGGGCCAGCACTAAGCATCAATGAACTGAGCAGCTAATGTGCAAAATGGGTGTAGATGAGTATGACCGTTTTTTGAGAATCCCCGAGGAGGTCAGTGAAACATCATCGTCAATGATGTGGGATACCTATCAATGGATCATCACCCAGAACCCTACAATGCTATCTTTAGTACCTAAGGCCATTCTGTTCCAACAAATGAGGGTAATAAAACTTCTTCCCTTCCAGTTCTCCTCATTTACTGTTGTAAGGGGCAATTCTCCTGTCACAGTTCTCGGAAAGGATGGCACAGCTGGAGTGGAGTCCAAAGAAGACAAGAGATATGACCTTGCGAAAGGAGAGAAG<formula>formulaseeoriginaldocumentpage45</formula>CTGATGCAAGCAGGTGCTGCAGTCAAAGGAATGATCAAACGTGGGATCAAACGAAAAACAAGAATTGCTTAATTTCAAACTGCTGCACAACGGAACCCAGGGAATGCTGATGCACTCATATTGAGAGGGTGTGTGTATGGACCTGCCGTATACTCTCTAGTCGGAATAGAGTACAGCCTAATCAGACCAATGTGGATGGCATGCCATTCTTTCATCAAAGGGACGAAGGTAGTTCAAATTGCTTCCAATGTTGAACTGAGAAGCAGGTACACCAATCAACAGAGGGCATCCTCAGTACAGGTTCAACTCTGTTGGAACAATGATCGGAACATGAAAGAATAAAGCAATGAGTTCGAAGATCGGTTGCTCAGCCAGTGGGTCCCTTTCAGAATGAGAATCCGCCGCATTTGGCTCCCAAGAAAAATATGGATGGGCCATAATGCGGGCCAACCCTAGGAGGTGGTGATGGATTCTGGAGGGGTGCAACATTTGGATCAAGTCTCACTTTTCCAAGTCCTGCACGACTTTGACTGCTTCAAAAGCACACAAGAAGATCTAAGGGGAAGCTTTGACTATGGAAGGACCAGAAGATCAGCATACTCTGGAGCCGATTGGTCAGAGTGAGAATGGCTCAAAGGGAGAGAGAGAGCTAGCACGGTCCTGCCTGCCTAAGGGAGGGAACAGCCAAGTAGTCAACTGGAGTATTAAGCCCACTAGAGGTCAAGTACACTGGAGGAAACAACCTACGTT46AGAAATCTCCCTTTTGACAGAACAACCATTATGGCAGCATTCAATGGGAATACAGAGGGGAGAACATCTGACATGAGGACCGAAATCATAAGGATGATGGAAAGTGCAAGACCAGAAGATGTGTCTTTCCAGGGGCGGGGAGTCTTCGAGCTCTCGGACGAAAAGGCAGCGAGCCCGATCGTGCCTTCCTTTGACATGAGTAATGAAGGATCTTATTTCTTCGGAGACAATGCAGAGGAGTACGACAATTAAAGAAAAATACCCTTGTTTCTACT(SEQIDNO:4)MAGCAAAAGCAGAGGTCGAAACGTACGTACTCGAGATCGCACAGAGACTTGTTGAGGTTCTCATGGAATGGACTAAGGGGATTTTAGGATTAGGACTGCAGCGTAGACGCTATCCAAATAACATGGACAAAGAGATAACATTCCATGGGGCTGCACTTGCCGGTAGATATTGAAAGATGAGTCTTCTAACCCTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCAAGATGTCTTTGCAGGGAAGAACACCGATCCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGTTGTCCAAAATGCCCTTAATGGGAACGGGGGCAGTTAAACTGTATAGGAAGCTCAAGAGGCAAAGAAATCTCACTCAGTTATTCTGCTGGAGTTGTATGGGCCTCATATACAACAGGATGGGGGCTGTGACCACTGAAGTGGCATTTGGCCTGGTATGTGCAACCTGTGAACAGATTGCTGACTCCCAGCATCGGTCTCATAGGCAAATGGTGACAACAACCAATCCACTAATCAGACATGAGAACAGAATGGTTTTAGCCAGCACTACAGCTAAGGCTATGGAGCAAATGGCTGGATCGAGTGAGCAAGCAGCAGAGGCCATGGAGGTTGCTAGTCAGGCTAGACAAATGGTGCAAGCGATGAGAACCATTGGGACTCATCCTAGCTCCAGTGCTGGTCTGAAAAATGATCTTCTTGAAAATTTGCAGGCCTATCAGAAACGAATGGGGGTGCAGATGCAACGGTTCAAGTGATCCTCTCACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTGTGGATTCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCATTTACCGTCGCTTTAAATACGGACTGAAAGGAGGGCCTTCTACGGAAGGAGTGCCAAAGTCTATGAGGGAAGAATATCGAAAGGAACAGCAGAGTGCTGTGGATGCTGACGATGGTCATTTTGTCAGCATAGAGCTGGAGTAAAAAACTACCTTGTTTCTACT(SEQIDN0:5)NSAGCAAAAGCAGGGTGACAAAAACATAATGGATCCAAACACTGTGTCAAGC48TTTCAGGTAGTTGCAGACCAAGAACTAGGCGATCAGAAATCCCTAAGAGGGACAGCCACACGTGCTGGAAAATCCGATGAGGCACTTAAATACCTAACTGACATGACTCTCATACCCAAGCAGAAAGTGGCGATCATGGATAAGAACATCGACCGGCTGGAGACTCTAATAATTGTTGGCGAAATTTCACAGGATGTCAAAAATGCAGTTGATAACACAGTTCGAGTCTCCAGTAATGAGAATGGGAGACTGGCGGGAACAATTAGGTCAAGAAGTGAGACACAAACTGACATTTATGCAATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGAGGATGCCCCATTCCTTGATCGGCTTCGCCGAAAGGGGCAGTACTCTCGGTCTGGACATCAAAGCAGATAGTGGAGCGGATTCTGAAAGAAGATGACCATGGCCTCTGTACCTGCGTCGCGTTGAGGAAATGTCAAGGGACTGGTCCATGCTCAGGCCCTCTTTGTATCAGAATGGACCAGGATACTGAAAGCGAACTTCAGTGTGATTTTTATTGCTAAGGGCTTTCACCGAAGAGGGAGCCATTGCCTTCTCTTCCAGGACATACTGCTGGGAGTCCTCATCGGAGGACTTGAATGGAATTGAAACTCTACAGAGATTCGCTTGGAGAAGCTCCACTCACTCCAAAACAGAAACGAGAAAGAAGTTTGAAGAAATAAGATGGTTGATTGAAGATAACAGAGAATAGTTTTGAGCAAATAA49AGCCTTACATCTATTGCTTGAAGTGGAGCAAGAGATAAGAACTTTCTCGT(SEQIDNO:6)HAACCTACTGGTCCTGTTATGTGCACTTGCAGCTGCAGATCACTGTTGACACAGTACTCGAGAAGAATGTGACAGTTATGTAGATTAAAAGGAATAGCCCCACTACAATTGGGACCCACTGCTTCCAGTGAGATCATGGTCCTACATTATTTCATCGACTATGAGGAGCTGAGGGAGCAATTGAGGCTCATGGCCCAACCACAACACAAACGGAGTAACGGCTATGGCTGACGGAGAAGGAGGGCTCATACCCAAAGACTGTGGGGTATTCATCACCCGCCTAACAGTAAGGATGACTTCAAATTATAACAGGAGATTTACCCCGGAAACTATTACTGGACCTTGCTAAAACCCGGAGACACAATACGCACTGAGTAGAGGCTTTGGGTCCGGCATCATCACCCCTGGGAGCTATAAACAGCAGTCTCCCTTACCAGAGAGTGCCAAATTGAGGATGGTTACAGGACTAAGGAACTTTATTGAAGGGGGATGGACTGGAATGATAGATGGCAGCGGATCAAAAAAGCACACAAAATGCCATTAACGCAATTCACAGCTGTGGGTAAAGAATTCAACAAATTATTCTGGACATTTGGACATATAATGCAGAATTGTTAGTTGAAGAATCTGTATGAGAAAGTAAAAAGCCAATTAACACAAGTGTGACAATGAATGCATGGAAAGTGTAAGAGTTCACTGGTGCTTTTGGTCTCCCTGGGGGCAATCATCTGAGATTAGAATTTCAGAGATATGAGGAAAAACACCCTTGTTTCTACT(SEQIDNO:7)NAAACCATTGGATCAATCTGTCTGGTAGTCGGACTAATTCCATTCAATTCAAACTGGAAGTCAAAACCATACTGGTAAAGGACACAACTTCAGTGATATTAACCGGCAATT51<formula>formulaseeoriginaldocumentpage52</formula>實(shí)施例2流感病毒A/HongKong/213/2003(H5N1，HK213)在雞中全身地復(fù)制，引起致死性感染。此外，這個(gè)病毒對(duì)于雞胚胎是致死的。因而，雖然它的表面蛋白質(zhì)與當(dāng)前傳播的病原性的禽流感病毒是高度相關(guān)的，HK213不能用作疫苗毒林，因?yàn)樵谟信唠u蛋中生長(zhǎng)它的嘗試引起了不良性質(zhì)的尿嚢液的產(chǎn)生。另外，這種高毒力病毒在疫苗的生產(chǎn)中使用對(duì)于疫苗工作者是不安全的。為了測(cè)試使用A/PR/8/34作為主要疫苗毒林的可能性，HK213(含有多個(gè)堿性氨基酸)的血球凝集素(HA)基因的裂解位點(diǎn)從強(qiáng)毒表型突變成無(wú)毒表型(從RERRRKKR(SEQIDNO:29)到——TETR(SEQIDNO:30))。含有突變的HA基因的病毒在雞中產(chǎn)生非致死的、局部的感染。另外，突變的病毒對(duì)于雞胚胎是非致死性的。因而，有胚雞蛋中突變病毒的生長(zhǎng)產(chǎn)生高質(zhì)量的尿嚢液，并且在這種減毒的形式中，病毒對(duì)于疫苗生產(chǎn)者是安全的。含有來(lái)自HK213的神經(jīng)氨酸酶(NA)和突變的HA基因、以及來(lái)自在雞蛋中比其他A/PR/8/34PR8毒株生長(zhǎng)更好10倍(1010EID50/ml;HA滴度:1:8,000)的高滴度A/PR/8/34(H1N1,HG-PR8)病毒(實(shí)施例1)的所有其余基因的重組病毒，在有胚雞蛋中產(chǎn)生。這種重組病毒表達(dá)與當(dāng)前傳播的病原性禽流感病毒相關(guān)的表面蛋白質(zhì)，在有胚雞蛋中生長(zhǎng)到高滴度(附圖1)。因而，用當(dāng)前傳播的流感病毒毒抹的基因替換HG-PR8的HA和NA基因產(chǎn)生了可以安全地生產(chǎn)的疫苗毒株，并展現(xiàn)了PR8-HG作為主疫苗毒抹的用途。實(shí)施例3在1997年香港，高度病原性的H5N1禽流感病毒從鳥類直接傳播給人類，引起18起確認(rèn)的感染和6起死亡(Subbarao等，1998;Claas等，1998)。在2004年6月，H5N1病毒的地理分布擴(kuò)展到亞洲，波及幾個(gè)鄰近的歐洲國(guó)家和非洲。總共地，在越南、泰國(guó)、柬埔寨、印度尼西亞、中國(guó)、土耳其和伊拉克，感染病毒的96人死亡(Li等，2004;WHO)。這些致死的發(fā)作和大流行的持續(xù)威脅導(dǎo)致了用于人類的H5N1病毒疫苗的開發(fā)。然而，由于病原性的H5N1病毒在有胚雞蛋中難以生長(zhǎng)并構(gòu)成對(duì)疫苗生產(chǎn)者的嚴(yán)重生物安全問(wèn)題，反向遺傳學(xué)53-故用于產(chǎn)生疫苗候選物(Subbarao等，2003;Webby等，2004;Stepha謂n等，2004;Wood&Robertson,2004)。具有來(lái)自病原性H5N1毒抹的修飾的無(wú)毒力類型血球凝集素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因、以及來(lái)自在雞蛋中生長(zhǎng)良好的供體病毒的所有其余基因的重組(6:2重配體)病毒，處于通過(guò)這種方法產(chǎn)生的候選物之中。世界衛(wèi)生組織(WHO)建議A/PuertoRico/8/34(H1N1;PR8)作為供體病毒，由于它在人類中的安全性和在蛋中的旺盛生長(zhǎng)(Wood&Robertson,2004;Webby&Webster,2003)。近來(lái)，顯示的是這種重組病毒與野生型PR8毒株相比在雞蛋中生長(zhǎng)的不那么好，雖然它們具有相同的PR8"內(nèi)部"基因(即，除了HA和NA之外的基因)(Horimoto等，2006)。由于在蛋中的旺盛生長(zhǎng)是滅活疫苗的生產(chǎn)中使用的疫苗種子病毒的重要性質(zhì)，如下所述的，產(chǎn)生了在蛋中與PR8供體毒抹生長(zhǎng)得一樣好的H5N1疫苗候選物。首先，通過(guò)使用在雞蛋中不良生長(zhǎng)的PR8和WSN毒抹之間的重配體分析確定對(duì)這種性質(zhì)負(fù)責(zé)的基因，確定了PR8在蛋中的高度生長(zhǎng)的分子基礎(chǔ)。發(fā)現(xiàn)的是，HA-NA平衡和PB1功能是重要的生長(zhǎng)決定因素。根據(jù)這種認(rèn)識(shí)，產(chǎn)生了具有PR8背景的、具有改變的HA-NA組合的一系列H5N1病毒，相對(duì)于更常規(guī)的6:2重配體，包括WHO建議的NIBRG-14病毒來(lái)評(píng)估它們?cè)陔u蛋中的生長(zhǎng)。方法細(xì)月包,口病毒293T人類胚腎細(xì)胞維持在具有10%胎牛血清和抗生素的Dulbecco修飾的Eagle's最低必需培養(yǎng)基(DMEM)中。Madin-Darby犬腎臟(MDCK)細(xì)胞在具有5%新生小牛血清和抗生素的MEM中生長(zhǎng)。為在人類疫苗生產(chǎn)中使用的生物安全測(cè)試之后建立的非洲綠猴VeroWCB細(xì)胞(Sugawara等，2002)維持在具有抗生素的無(wú)血清的VP-SFM培養(yǎng)基(GIBCO-BRL)中。細(xì)胞維持在5%C〇2、37。C中。分離自人類的A/Vietnam/1194/2004和A/Vietnam/1203/2004(H5N1;VN1194和VN1203)毒株，在37。C在10天齡有胚雞蛋中增殖2天，在這之后，收獲含有病毒的尿嚢液，用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。使用這些病毒的所有實(shí)驗(yàn)在3級(jí)生物安全防范實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。WHO建議的疫苗種子病毒NIBRG-14(VN1194/PR86:2重配體病毒)由英國(guó)國(guó)家生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和控制學(xué)會(huì)的Drs.JohnWood和JimRobertson好意地贈(zèng)送。質(zhì)粒的構(gòu)建和反向遺傳學(xué)為了產(chǎn)生A型流感病毒的重配體，使用了基于質(zhì)粒的反向遺傳學(xué)(Neumann等，1999)。來(lái)自VN1194或VN1203的病毒RNA同使用商業(yè)的試劑盒(ISOGENLS,NipponGene)從尿嚢液提取，通過(guò)使用逆轉(zhuǎn)錄酶(SuperscriptIII;GIBCO-BRL)和含有H5病毒的RNA片段的3'末端的共有序列的引物來(lái)轉(zhuǎn)變成cDNA。全長(zhǎng)cDNA然后用ProofStart聚合酶(QIAGEN)和H5亞型特異性引物對(duì)PCR擴(kuò)增，克隆到質(zhì)粒中處在人類聚合酶I啟動(dòng)子和小鼠RNA聚合酶I終止子的控制下(Poll質(zhì)粒)，產(chǎn)生分別含有VN1194或VN1203HA基因的PolI-VN1194/HA或PolI-VN1203/HA構(gòu)建體。通過(guò)利用背對(duì)背引物對(duì)的逆反PCR，之后連接，野生型VN1194或VN1203病毒的HA裂解位點(diǎn)序列(RERRRKKR;SEQIDNO:29)^皮改變，來(lái)產(chǎn)生無(wú)毒力類型的序列(RETR;SEQIDNO:31),如在Horimoto等(2006)中描述的，其^^開內(nèi)容通過(guò)引用合并在此。含有VN1203NA基因的PolI-VN1203NA通過(guò)使用Nl特異性引物的RT-PCR操作(如上所述)來(lái)構(gòu)建。通過(guò)逆反PCR制備一系列的pPollNA突變體。使用PolI-VN1203NA作為模板，構(gòu)建pPolI-NAfill,其編碼來(lái)自A/goose/Guangdong/1/96(H5N1;GsGd96)NA、插入48-Pro和49-Ile之間的的20個(gè)氨基酸(aa)(CNQSIITYENNTWVNQTYVN;SEQIDNO:32)的插入物的突變NA。如Castrucci等(1993)所描述的構(gòu)建pPolI-NAfill.N2和-NAfill.N2N9，其中來(lái)自每種NA亞型的莖部區(qū)域的N2(12aa)或N2+N9(12+12aa)序列被插入42-Asn和43-Gin之間的莖部中。所有這些構(gòu)建體進(jìn)行測(cè)序來(lái)確保不存在不需要的突變。使用了來(lái)自A/WSN/33(H5N1;WSN)和PR8毒4朱的早先生產(chǎn)的Poll構(gòu)建體系列用于反向遺傳學(xué)。(Horimoto等，2006;Neumann等，1999)。另夕卜，在這項(xiàng)研究中使用了含有來(lái)自A/HongKong/213/03(H5N1;HK213)和A/Kanagawa/173/2001(H1N1;Kanagawa)的NA基因的Poll構(gòu)建體(Horimoto等，2006;Kobasa等，2004;Peiris等，2004)。55處在雞p-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子控制下表達(dá)WSN或PR8NP、PA、PB1或PB2的質(zhì)粒一皮用于所有反向遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)(Horimoto等，2006;Neumann等，1999)。簡(jiǎn)要地，Poll質(zhì)粒和蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑Trans-IT293T(Panvera)混合，在室溫下孵育15分鐘，然后添加到293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在Opti-MEMI(GIBCO-BRL)中孵育48小時(shí)。對(duì)于在VeroWCB細(xì)胞中的反向遺傳學(xué)，電極(Amaxa)被用來(lái)根據(jù)廠家的說(shuō)明書轉(zhuǎn)染質(zhì)?；旌衔?。轉(zhuǎn)染后十六小時(shí)，新制備的VeroWCB細(xì)胞添加到轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上，6小時(shí)后向培養(yǎng)物添加TPCK-胰蛋白酶(1|ug/ml)。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在無(wú)血清VP-SFM中孵育總共4天。收獲含有傳染性病毒的上清液，通過(guò)限制稀釋在有胚雞蛋中生物學(xué)克隆，并用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。在蛋中病毒復(fù)制的性質(zhì)病毒接種到IO天齡的有胚雞蛋的尿嚢腔中，在37。C孵育48小時(shí)。尿嚢液中的病毒然后通過(guò)利用0.5%雞紅血球或0.8%豚鼠紅血球或在蛋中的HA分析來(lái)滴定，以確定病毒的中值蛋傳染性劑量(EID5o)/ml。對(duì)于某些病毒，用MDCK細(xì)胞和TPCK胰蛋白酶(1|ig/ml)進(jìn)行噬菌斑滴定。在接種1(^EID5o的的之后在蛋中評(píng)估某些病毒的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。雞紅血3求的病毒洗脫分析含有1:1024的HA滴度的病毒的50pl兩倍稀釋物在微量滴定板中與50)il的0.5%雞紅血球在4。C孵育1小時(shí)。平板然后在37。C保存，周期性地記錄HA滴度的降低。具有6.8mMCaC12的磷酸鹽緩沖鹽水用作稀釋劑。結(jié)果PR8在雞中的高生長(zhǎng)性質(zhì)的分子基礎(chǔ)雖然PR8是WHO推薦的用作供體病毒來(lái)產(chǎn)生基于反向遺傳學(xué)的H5流感疫苗，它的高生長(zhǎng)性質(zhì)的分子基礎(chǔ)是不完全了解的。據(jù)說(shuō)M基因?qū)τ赑R8在蛋中的旺盛生長(zhǎng)負(fù)責(zé)(Subbarao等，2003),但是這個(gè)聲明在公開的原始數(shù)據(jù)中沒(méi)有找到(Kilbourne等，1969)。因而，利用在蛋中不良生長(zhǎng)的WSN毒抹進(jìn)行了重配體分析。表3顯示了就在有胚雞蛋中的病毒生長(zhǎng)而言PR8對(duì)比WSN毒林的HA和NA之間的相容性。所有的重配體測(cè)試病毒比野生型WSN生長(zhǎng)得更好，但是低于蛋適應(yīng)的PR8,表明表面糖蛋白和內(nèi)部蛋白質(zhì)都對(duì)PR8的高生長(zhǎng)性質(zhì)負(fù)責(zé)。表3.通過(guò)在有胚雞蛋中的病毒生長(zhǎng)評(píng)估的PR8對(duì)比WSN毒4朱的HA和NA之間的相容性_重配體的基因構(gòu)成HA滴度b)HANA6種其他的》雞RBC豚鼠RBCWSNWSNWSN16/832/8PR8WSNWSN64/3264/32WSNPR8WSN16/1632/16PR8PR8WSN128/128128/128WSNWSNPR864/6464/64PR8WSNPR864/12864/128WSNPR8PR8512/512512/512PR8PR8PR82048/20482048/2048a)編碼內(nèi)部蛋白質(zhì)PB1、PB2、PA、NP、M和NSd和基因。b)用0.5%雞RBC和0.8%豚鼠RBC在HA分析中評(píng)估的每種重配體病毒在雞蛋中的生長(zhǎng)顯示了來(lái)自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的HA滴度。由于與PR8的相比，含有PR8糖蛋白和來(lái)自WSN的所有六種內(nèi)部蛋白質(zhì)的重配體病毒的生長(zhǎng)在蛋中劇烈地降低(表3和4),產(chǎn)生了一系列的重配體病毒來(lái)確定對(duì)這種性質(zhì)負(fù)責(zé)的內(nèi)部蛋白質(zhì)。含有WSNPB1和來(lái)自PR8的所有其余基因的單基因重配體病毒不良地生長(zhǎng)，處于與含有所有編碼內(nèi)部蛋白質(zhì)的WSN基因的重配體類似的水平，而含有PR8PB1和編碼所有其余內(nèi)部蛋白質(zhì)的WSN基因的重配體復(fù)制到高滴度(表4)。因而，與早先暗示M片段的作用的報(bào)告(Subbarao等，2003)相比，PR8PB1可能具有病毒基因組在蛋中復(fù)制的最佳的聚合酶活性。表4通過(guò)在有胚雞蛋中的病毒生長(zhǎng)評(píng)估的、在PR8和WSN病毒的編碼內(nèi)部蛋白質(zhì)的基因之中的相容性重配體的基因構(gòu)成a)<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>"在所有重配體病毒中HA和NA基因都來(lái)源于PR8,而編碼內(nèi)部蛋白質(zhì)的一些基因來(lái)自WSN毒株。W使用在0.5。/。雞RBC中的HA分析評(píng)估每種重配體病毒在雞蛋中的生長(zhǎng)速度。顯示了三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中獲得的HA滴度。具有在雞蛋中增強(qiáng)的生長(zhǎng)能力的H5N1疫苗種子候選物的產(chǎn)生在較早的研究中，顯示了WSN在蛋中的生長(zhǎng)通過(guò)延長(zhǎng)NA莖部以提高NA功能來(lái)增強(qiáng)莖部越長(zhǎng)，病毒的復(fù)制越好(Castmcci等，1993)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)促使產(chǎn)生一系列的H5N1病毒，其包含具有PR8背景的突變的或異源的Nl,并比較它們?cè)诘爸械纳L(zhǎng)。A/Vietnam/1203/2004(H5N1;VN1203)NA含有在它的莖部區(qū)域中的20-氨基酸(20-aa)刪除(因而，莖部中的24aa)。因此，構(gòu)建了突變的NA,VN1203fi11,其含有象H5N1前體病毒A/goose/Guangdong/1/96(H5N1)的44-aa的莖部(Xu等，1999)，以及其他的NA突變體，VN1202fill.N2和VN1203fill.N2N9，其含有較長(zhǎng)的莖部，分別是58-和72-aa(附圖2)。還檢查了在莖部中含有44-aa的來(lái)自A/HongKong/213/03(H5N1;HK213)的異源N1。還測(cè)試了來(lái)自H1N1毒4朱例如PR8、A/Kanagawa/173/2001(H1N1;Kanagawa)和WSN的NA,所有這些都在莖部中具有24aa。利用這些NA構(gòu)建體，產(chǎn)生了總共八種重配體病毒，七種6:2和一種7:1，具有修飾的無(wú)毒力型VN1203HA和PR8背景(表5)。用修飾的無(wú)毒力型的A/Vietnam/1194/2004(H5N1;VN1194)HA構(gòu)建了其他系列的重配體病毒。通過(guò)與含有親本VN1203NA的構(gòu)建體比較，僅含有修飾的VN1194HA和VN1203fi11NA的組合的7:1重配體病毒和6:2重配體顯示了在蛋中的增強(qiáng)的生長(zhǎng)。表5H5N1/PR8重配體病毒在有胚雞蛋中的病毒滴度a)HA滴^傳染性滴度(1og2/logwEID5o/ml)實(shí)來(lái)自以下的NA《野生型HAb)驗(yàn)VN12(BVN1203fi11VN咖MN2VN120SffllN2N9HK213PR8WSN環(huán)203192ifl.4/8.9df)3s9.6ifl.5/8.8i0.69:2ifi.5/8.9:!fl.49.0ifl.0/8.8iD.59劍.5/8細(xì).19滅4A4ifl2<1.0膨10.7±0.6/103±0.429.肚歸.4ifl29細(xì).0".7i0283iD.6/8.6:!￡)28.01fl.0/ND8.7iD.6/8.51D.39.7ifl.6/10.1±O2ND/NDND/ND11艦0/lO3也4VN119418.7ifi.6/8.7:!fl29.3ifl.6"3±0.293i0.6"2遊9.0iD.0/8.6ifl2ND扁9.0ifl廳:tf).9<1.0/5，210.7iflM0.im2&)用病毒(104EID50)接種蛋(10天齡)，在37。C孵育48小時(shí)；測(cè)定尿嚢液中的病毒滴度。W兩種H5HA基因(VN1203和VN1194)被用于產(chǎn)生具有PR8背景的重配體病毒。VN1203和VN1194的HA裂解位點(diǎn)被修飾成無(wú)毒力型H5HA的。￡)對(duì)于VN1203構(gòu)建體，使用3到5個(gè)蛋進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，而對(duì)VN1194進(jìn)行單次實(shí)驗(yàn)。。總共八個(gè)NA基因被用于產(chǎn)生重配體病毒；制備三個(gè)插入突變的NA(VN1203fi11、VN1203fill.N2和VN1203fill.N2N9)通過(guò)與親本VN1203NA比較來(lái)評(píng)估NA莖部長(zhǎng)度對(duì)蛋中的病毒生長(zhǎng)的影響；其他NA來(lái)自H5N1人類分離物(HK213)或H1N1病毒(PR8，Kanagawa和WSN)。因而，除了含有PR8NA(7:1重配體)的之外所有的重配體病毒是具有PR8背景的6:2重配體病毒。6)還評(píng)估了野生型PR8的生長(zhǎng)作為每個(gè)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。O通過(guò)HA或傳染性分析評(píng)估了每個(gè)重配體病毒的生長(zhǎng)，報(bào)告為HA滴度的平均值士s.d.(1og2)/傳染性滴度的平均值士s.d.(logl。EID5Q/ml)。通過(guò)與含有VN1203HA和VN1203NA或VN1194HA和VN1203NA的標(biāo)準(zhǔn)病毒的相比，顯著增強(qiáng)的HA和傳染性滴度(p<0.05，t-測(cè)驗(yàn))以黑體字顯示。ND,沒(méi)有測(cè)定。通過(guò)儲(chǔ)備病毒的噬菌斑分析的選定重配體病毒的進(jìn)一步測(cè)試展現(xiàn)了與含有親本VN1203NA的病毒相比，含有PR8NA的重配體病毒的高于3倍的滴度(p=0.003，Studentt-test)，而它不象蛋適應(yīng)的PR8生長(zhǎng)得那么好(附圖3)。具有PR8、VN1203fi11或VN1203NA的重配體病毒在蛋中的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的評(píng)估顯示了具有PR8NA的病毒(7:1重配體)的優(yōu)越的生長(zhǎng)速度(附圖4)。為了測(cè)定在7:1重配體病毒中觀察到的高生長(zhǎng)性質(zhì)的分子基礎(chǔ)，通過(guò)評(píng)估雞紅血球的病毒洗脫物的分析來(lái)測(cè)試了重配體病毒的NA功能(附圖5)。含有PR8或VN1203fi11NA的重配體病毒與親本VN1203NA的相比更快速地從紅血球洗脫，表明PR8或VN1203fill.NA的更高的NA活性。這些結(jié)果支持了高NA功能增強(qiáng)蛋中的病毒生長(zhǎng)的思想(Cast脇i等，1993)。使用WHO建議的疫苗種子病毒NIBRG-14在這項(xiàng)研究中產(chǎn)生的H5N1疫苗種子候選物在蛋中的生長(zhǎng)比較為了驗(yàn)證候選種子病毒在H5N1疫苗的生產(chǎn)中的潛力，在相同的實(shí)-險(xiǎn)條件下與WHO提供的NIBRG-14病毒的傳染性滴度比較它們的傳染性滴度。含有VN1194或VN1203衍生的HA和來(lái)自我們的PR8毒抹的所有其他基因的7:1重配體病毒在蛋中顯示了比NIBRG-14病毒顯著更高的滴度(p<0.05,Studentt-test),如通過(guò)EID50(表6)和噬菌斑滴定(附圖6)所評(píng)估的。有趣地，通過(guò)噬菌斑滴定，即使是含有來(lái)自VN1194病毒的HA和NA的6:2重配體病毒也比NIBRG-14(以及VN1194/PR86:2重配體病毒)生長(zhǎng)得顯著更好(約7倍，口=0.047)(附圖5)。在具有相同的VN1194HA和NA的兩種6:2重配體病毒的生長(zhǎng)中的這種差異表明，這項(xiàng)研究中使用的PR8毒株對(duì)于在蛋中的疫苗生產(chǎn)期間支持高的病毒生長(zhǎng)要優(yōu)于用來(lái)產(chǎn)生NIBRG-14的毒林。表6在這項(xiàng)研究中使用WHO建議的疫苗種子病毒(NIBRG-14)產(chǎn)生的H5N1/PR8重配體病毒的比較a)<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>^通過(guò)用每種病毒接種蛋(r^3)、在指定的時(shí)間收獲尿嚢液、并測(cè)定EID5G,來(lái)評(píng)估重配體病毒的生長(zhǎng)。數(shù)據(jù)顯示為傳染性滴度的平均值土s.d.(log1QEID5。/ml)。通過(guò)與NIBRG-14的比較顯著地增強(qiáng)的傳染性滴度(p<0.05，t-test)以黑體字顯示。W通過(guò)HA/NA的衍化來(lái)分類。VN1203和VN1194的HA裂解位點(diǎn)都^1修飾為無(wú)毒力型H5HA的。200780020095.1轉(zhuǎn)滔也被54/593討論產(chǎn)生了具有都來(lái)自H5N1人類分離物的修飾的無(wú)毒力型HA和NA基因、以及來(lái)自PR8毒抹的所有其余基因的重組病毒(6:2重配體)，并用作種子疫苗用于現(xiàn)在在人類臨床實(shí)驗(yàn)中測(cè)試的滅活流感疫苗(Wood&Robertson,2004)。這樣使用的種子毒4朱必須在有胚雞蛋中生長(zhǎng)良好。雖然蛋適應(yīng)的PR8滿足這些要求，某些6:2重配體病毒盡管含有來(lái)自PR8的六種內(nèi)部基因，不在蛋中生長(zhǎng)良好(表3和5)。在此展現(xiàn)的是，蛋適應(yīng)的PR8在雞蛋中的生長(zhǎng)收到HA和NA表面糖蛋白的功能平衡的影響。可能的是，具有PR8背景和來(lái)自高病原性禽類病毒的表面糖蛋白的某些6:2重配體病毒的低產(chǎn)量不僅是產(chǎn)自關(guān)于在蛋中生長(zhǎng)的HA-NA功能不平衡，還來(lái)自PR8的禽類表面糖蛋白基因和內(nèi)部基因之間的遺傳(和/或功能)不相容性。在此顯示的是，在PR8的內(nèi)部基因之中，PB1對(duì)于它在蛋中的高生長(zhǎng)是非常重要的。這個(gè)信息暗示了基于反向遺傳學(xué)的H5N1疫苗生產(chǎn)的另一種策略；也就是說(shuō)，單獨(dú)的PB8PB1基因可能足以產(chǎn)生用于疫苗種子病毒的強(qiáng)力生長(zhǎng)的重配體。因而，通過(guò)使用來(lái)自PR8以外的毒株的、編碼非PB1內(nèi)部蛋白質(zhì)的基因，人們可以避免禽類和PR8病毒之間的遺傳學(xué)不相容性。剖析PR8PB1在蛋中的高生長(zhǎng)性質(zhì)的分子基礎(chǔ)的研究將是相當(dāng)令人感興趣的。例如，人們將分析PR8和WSN的PB1或PB1-F2之間的結(jié)構(gòu)和功能差異(其分別相差18和10個(gè)氨基酸；Chen等，2004)。這項(xiàng)研究中產(chǎn)生的7:1重配體病毒比WHO建議的6:2重配體病毒NIBRG-14復(fù)制得顯著更好(噬菌斑滴定超過(guò)20倍)。即使除了來(lái)源的PR8毒林之外與NIBRG-14相同的6:2重配體也比建議的病毒復(fù)制更好7倍。這些發(fā)現(xiàn)表明，這項(xiàng)研究中使用的PR8毒株可能是用于基于反向遺傳學(xué)的流行疫苗生產(chǎn)的優(yōu)越的供體病毒。人們可以爭(zhēng)辯說(shuō)，由于NA蛋白質(zhì)中的抗原性差異，7:1重配體病毒將誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)的損失(雖然PR8和高度病原性的病毒都含有N1NA)(Murphy等，1972;Kilboume等，1968;Chen等，2000)。然而，由于HA是滅活疫苗中主要的保護(hù)性抗原，PR8NA所賦予的更高的生長(zhǎng)性質(zhì)將可能補(bǔ)償這種較小的保護(hù)性抗原中有限的抗原性錯(cuò)配。在高病原性禽流感病毒引起的大流行的情況下，雞蛋將供應(yīng)短缺。提出的是在這種情況下，具有在蛋中增強(qiáng)的生長(zhǎng)性質(zhì)的基于7:1重配體的疫苗種子病毒將提供了用于基于反向遺傳學(xué)的H5疫苗病毒產(chǎn)生的吸引人方案。實(shí)施例4為了鑒定對(duì)于H5N1疫苗種子病毒在有胚雞蛋中的高生長(zhǎng)速度負(fù)責(zé)的基因，評(píng)估了具有PR8(UW)或PR8(Cambridge)內(nèi)部基因的重配體H5N1病毒在有胚雞蛋中的生長(zhǎng)(附圖7)。所有重配體病毒的HA和NA基因都來(lái)自A/Vietnam/1194/2002。所有其他基因來(lái)自PR8(UW)或PR8(Cambridge),其還提供了NIBRG-14疫苗毒抹的非HA和非NA基因。當(dāng)大部分內(nèi)部基因來(lái)自PR8(UW)時(shí)獲得了更高的滴度。M和NS基因?qū)Σ《驹谟信唠u蛋中的生長(zhǎng)的影響在附圖8中顯示。對(duì)于PR8(UW)/1194誦CamM和PR8(UW)/1194-CamNS,M和NS基因片段分別來(lái)源于PR8(Cambridge),而另一個(gè)內(nèi)部片段來(lái)自PR8(UW)。HA和NA片段來(lái)源于A/Vietnam/1194/2004。最高的滴度是PR8(UW)的M基因片段和PR8(Cambridge)的NS基因。附圖7-8中的結(jié)果顯示了PR8(UW)的聚合酶亞單位(PA、PB1和PB2)和NP基因增強(qiáng)了H5N1疫苗種子病毒在有胚雞蛋中的生長(zhǎng)。并且，PR8(Cambridge)的NS基因增強(qiáng)了H5N1疫苗種子病毒在有胚雞蛋中的生長(zhǎng)。為了鑒別對(duì)于H5N1疫苗種子病毒在MDCK細(xì)胞中的高生長(zhǎng)速度負(fù)責(zé)的基因和氨基酸，評(píng)估了PR8(UW)/1194和NIBRG-14病毒在MDCK細(xì)胞中的生長(zhǎng)。附圖9中的數(shù)據(jù)顯示了，在MDCK細(xì)胞中，PR8(UW)/1194的生長(zhǎng)顯著好于NIBRG-14的。此外，PR8(UW)的PB2片段增強(qiáng)了疫苗種子病毒在MDCK細(xì)胞中的生長(zhǎng)(附圖10)。在PR8(UW)的PB2中位置360的酪氨酸殘基可能對(duì)疫苗種子病毒在MDCK細(xì)胞中的高生長(zhǎng)速度負(fù)責(zé)(附圖11)。為了鑒定對(duì)于H5N1疫苗種子病毒在MDCK細(xì)^9包中的高生長(zhǎng)負(fù)責(zé)的基因的組合，測(cè)定了具有不同的HA、NA和NS基因的重配體的MDCK細(xì)胞中的生長(zhǎng)速度。來(lái)自PR8(Cambridge)的NS和具有長(zhǎng)莖64部的NA(例如，來(lái)自A/HongKong/213/2003或VN1203Fi11)增強(qiáng)了病毒在MDCK細(xì)胞中的生長(zhǎng)(附圖12)。為了確定NS中的哪些氨基酸對(duì)H5N1疫苗種子病毒在MDCK細(xì)胞中的高生長(zhǎng)速度負(fù)責(zé)，測(cè)量了含有異源NS片段的H5N1疫苗種子病毒在MDCK細(xì)胞中的生長(zhǎng)。在NS1的位置55處從K[PR8(UW)NS]到E[PR8(Cambridge)]的氨基酸替換增強(qiáng)了H5N1疫苗種子病毒在MDCK細(xì)胞中的生長(zhǎng)(附圖13)。附圖14概括了在有胚雞蛋或MDCK細(xì)胞中具有高生長(zhǎng)能力的H5N1疫苗種子病毒的基因型。參考文獻(xiàn)Avery'sDrugTreatment:PrinciplesandPracticeofClinicalPharmacologyandTherapeutics,3rdedition,ADISPress,Ltd.,WilliamsandWilkins，Baltimore,MD(1987).Aymard-Henry等,Virology:APracticalA叩roach,OxfordIRLPress,Oxford,119-150(1985).Bachmeyer，Intervirologv,5:260(1975).Berkow等,eds.,TheMerckManual，16thedition,Merck&Co.,Rahway,NJ(1992).Bridgen等，Proc.Natl.Acad.Sci,U.S.A,21:15400(1996).Castrucci&Kawaoka,J.Virol.,^Z:759(1993).Castrucci等，J.Virol.,^￡:2725(1995).Chen等，Emerg.Infect.Dis.,M:630(2004).Chen等，Vaccine,腦214(2000).Claas等，Lancet,351:472(1998).Conzelmann等，J.Gen.Virol.,22:381(1996).Conzelmann等，TrendsMicrobiol.,4:386(1996).Conzelmann,A腿.Rev.Genet，12:123(1998).Cozelmann等，J.Virol.，^:713(1994).Edwards,J.InfectDis.,169:68(1994).Enami等，Proc.Natl.Acad.Sd.U.S.A.,^2:3802(1990).Enami等，Virology,185:291(1991).65Fodor等，J.Virol.,21:9679(1999).GrandandSkehel，Nature,NewBiology,238:145(1972)Hatta等，Science,221:1840(2001).Horimoto等，J.Virol.,組3120(1994).Horimoto等，Vaccine,M:3669(2006).Keitel等，inTextbookofInfluenza,eds.Nickolson,K.G.,Webster,R.G.，andHay,A.(Blackwell，Oxford),pp.373-390(1998).Kendal等，InfectImmunity,2^:966(1980).Kilbourne等，J.Virol.,2:281(1968).Kilbo畫e,Bull.M2WorldHealthOrg.,虹653(1969).Kilbo腦e,Bull.WorldHealthOrg.,化643(1969).Kobasa等，Nature,431:703(2004).Kovesdi等，丄Curr.Opin.Biotechnol.,旦:583(1997).Laver&Webster,Virology,^:511(1976).Lawson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，21:4477(1995).Li等，Nature,430:209(2004).Marriott等，Adv.VirusRes.,2:321(1999).Mizrahi,(ed.),VimlVaccines,Wiley隱Liss,NewYork,39-67(1990).Munoz等，AntiviralRes.,4^:91(2000).Murphy等，NewEngl.J.Med.，,:1329(1972).Murphy,Infect.Dis.Clin.Pract，&174(1993).Muster等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，M:5177(1991).Nagai等，Microbiol.Immunol.，41:613(1999).Nagai,Rev.Med.Virol.,2:83(1999).Neumann等，Adv.VimsRes.,，65(1999).Neumann等Ncumami等N6unmmi等Neumann等[.Gen.Virol.,83:2635(2002)J.Virol.，21:9690(1997).Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:9345(1999)■Virology,287:243(2001).Ogra等，J.Infect.Dis.,這499(1977).Co.Osol(ed.),Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingEastern,PA1324-1341(1980).Parks等，J.Virol.，21:3560(1999).Peiris等，Lancet,363:617(2004).Pekosz等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,￡^:8804(1999)Radecke等，EMBOJ.,14:5773(1995).Roberts等，Virology,247.1(1998).Robertson等，Biologicals,巡:213(1992).Robertson等,GiornalediIgieneeMedicinaPreventiva,29:4(1988).Rose,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,93:14998(1996),Schnell等，EMBOJ.,U:4195(1994).Stephenson等，LancetInf.Dis.,4:499(2004).Subbarao等，J.Virol.,@:7223(1993).Subbarao等，Science,279:393(1998).Subbamo等，Virology,305:192(2003).Sugawara等，Biologicals,祉303(2002).Webby&Webster等，Science,巡:1519(2003).Webby等，Lancet,巡:1099(2004).Wood&Robertson,Nat.Rev.Microbiol.,2:842(2004).WorldHealthOrganizationTSRNo.673(1982).WorldHealthOrganization.ConfirmedhumancasesofavianinfluenzaA(H5N1).Xu等，Virology,261:15(1999).所有公開物、專利和專利申請(qǐng)通過(guò)引用合并在此。雖然在以上的說(shuō)明書中已經(jīng)相對(duì)于某些優(yōu)選的實(shí)施方式描述了本發(fā)明，為了例示的目的闡述了許多細(xì)節(jié)，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，本發(fā)明對(duì)于其他實(shí)施方式是敏感的，在此描述的某些細(xì)節(jié)可以;故顯著地改變而不背離本發(fā)明的基本原理。權(quán)利要求1.一種組合物，其包含7:1重配體的多種流感病毒載體，包含a)包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PB1cDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PB2cDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒HAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NPcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒McDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，以及包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NScDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，其中PB1、PB2、PA、NP、NA、M和NS的cDNA具有來(lái)自在有胚蛋或MDCK細(xì)胞中復(fù)制到高滴度的一種或多種流感病毒的PB1、PB2、PA、NP、NA、M和NS的序列，并且其中所述HA的cDNA具有異源HA的序列；以及b)包含與編碼流感病毒PA的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒PB1的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒PB2的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、以及包含與編碼流感病毒NP的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、任選的包含與編碼流感病毒HA的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒NA的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒M1的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒M2的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、或包含與編碼流感病毒NS2的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體。2.—種組合物，其包含5:1:2或6:1:1重配體的多種流感病毒載體，包括a)包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PB1cDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PB2cDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒HAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NPcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒McDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，以及包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NScDNA可才喿作地連接的啟動(dòng)子的載體，其中PB1、PB2、PA、NP和M的cDNA具有來(lái)自在有胚蛋中復(fù)制到高滴度的一種或多種流感病毒的序列，其中NS的cDNA來(lái)自在有胚蛋中復(fù)制到高滴度的一種或多種流感病毒，其中NA的cDNA來(lái)自在有胚蛋中復(fù)制到高滴度的一種或多種流感病毒或具有異源NA的序列，以及其中HA的cDNA具有異源HA的序列；以及b)包含與編碼流感病毒PA的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒PB1的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒PB2的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒NP的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒HA的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、任選的包含與編碼流感病毒NA的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒M1的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒M2的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、或包含與編碼流感病毒NS2的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體。3.—種組合物，其包含5:1:1:1或6:1:1重配體的多種流感病毒載體，包括a)包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PB1cDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PB2cDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒HAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NPcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒McDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，以及包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NScDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，其中PB1、PB2、PA、NP和M的cDNA具有來(lái)自在MDCK細(xì)胞中復(fù)制到高滴度的一種或多種流感病毒的序列，其中NS的cDNA來(lái)自在MDCK細(xì)胞中復(fù)制到高滴度的一種或多種流感病毒，其中NA的cDNA具有異源NA的序列，以及其中HA的cDNA具有異源HA的序列；以及，b)包含與編碼流感病毒PA的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒PB1的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒PB2的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒NP的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、任選的包含與編碼流感病毒HA的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒NA的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒M1的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒M2的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、或包含與編碼流感病毒NS2的DNA片^R可操作連接的啟動(dòng)子的載體。4.權(quán)利要求1到3的任一項(xiàng)的組合物，其中PB1、PB2、PA、NP和M的cDNA編碼多肽，所述多肽具有與SEQIDNO:1-5編碼的相應(yīng)多肽基本上相同的氨基酸序列。5.權(quán)利要求1到3的任一項(xiàng)的組合物，其中NA、PB1、PB2、PA、NP、M和NS的cDNA編碼多肽，所述多肽具有與SEQIDNO:1-6和8編碼的相應(yīng)多肽基本上相同的氨基酸序列。6.權(quán)利要求3的組合物，其中NS的cDNA編碼多肽，所述多肽具有與SEQIDNO:38編碼的相應(yīng)多肽基本上相同的氨基酸序列。7.權(quán)利要求1到6的任一項(xiàng)的組合物，其中所述啟動(dòng)子是RNA聚合酶I啟動(dòng)子、RNA聚合酶II啟動(dòng)子、RNA聚合酶III啟動(dòng)子、T3啟動(dòng)子或T7啟動(dòng)子。''8.權(quán)利要求1到7的任一項(xiàng)的組合物，其中所述HA是A型HA。9.權(quán)利要求1到7的任一項(xiàng)的組合物，其中所述HA是B型HA。10.權(quán)利要求1到8的任一項(xiàng)的組合物，其中所述NA是Nl。11.權(quán)利要求1到8的任一項(xiàng)的組合物，其中所述HA是H5。12.權(quán)利要求1到11的任一項(xiàng)的組合物，其中a)的多種載體包含RNA聚合酶I啟動(dòng)子或RNA聚合酶II啟動(dòng)子。13.權(quán)利要求12的組合物，其中RNA聚合酶I啟動(dòng)子是人類RNA聚合酶I啟動(dòng)子。14.權(quán)利要求1到12的任一項(xiàng)的組合物，其中b)的所有載體g含RNA聚合酶II啟動(dòng)子。15.權(quán)利要求1到14的任一項(xiàng)的組合物，其中a)的每種載體處在獨(dú)立的質(zhì)粒上。16.權(quán)利要求1到14的任一項(xiàng)的組合物，其中b)的每種載體處在獨(dú)立的質(zhì)粒上。17.權(quán)利要求1到16的任一項(xiàng)的組合物，其中b)的每種載體進(jìn)一步包含RNA轉(zhuǎn)錄終止序列。18.權(quán)利要求1到17的任一項(xiàng)的組合物，其中所述NA或HA是嵌合的NA或HA。.19.權(quán)利要求1到18的任一項(xiàng)的組合物，其中HA的cDNA不編碼多肽，所述多肽相應(yīng)于SEQIDNO:7編碼的多肽。20.權(quán)利要求1或2的組合物，其中NA中莖部的長(zhǎng)度大于20個(gè)氨基酸。21.權(quán)利要求1、2或3的組合物，其中所述HA是無(wú)毒力的H5HA。22.—種制備流感病毒的方法，其包括以有效產(chǎn)生傳染性流感病毒的數(shù)量用以下之一接觸細(xì)胞包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PB1cDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PB2cDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒HAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NPcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒McDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，以及包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NScDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，其中PB1、PB2、PA、NP、NA、M和NS的cDNA具有來(lái)自在有胚蛋或MDCK細(xì)胞中復(fù)制到高滴度的一種或多種流感病毒的PB1、PB2、PA、NP、NA、M和NS的序列，和其中所述HA的cDNA具有異源HA的序列；以及包含與編碼流感病毒PA的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒PB1的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒PB2的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒NP的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、任選的包含與編碼流感病毒HA的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒NA的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒Ml的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒M2的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、或包含與編碼流感病毒NS2的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體；包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PB1cDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PB2cDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒HAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NPcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒McDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，以及包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NScDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，其中PB1、PB2、PA、NP和M的cDNA具有來(lái)自在有胚蛋中復(fù)制到高滴度的一種或多種流感病毒的序列，其中NS的cDNA來(lái)自在有胚蛋中復(fù)制到高滴度的一種或多種流感病毒，其中NA的cDNA來(lái)自在有胚蛋中復(fù)制到高滴度的一種或多種流感病毒或具有異源NA的序列，以及其中HA的cDNA具有異源HA的序列；以及包含與編碼流感病毒PA的DNA片l殳可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒PB1的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒PB2的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒NP的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、任選的包含與編碼流感病毒HA的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒NA的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒M1的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒M2的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、或包含與編碼流感病毒NS2的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體；或包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PB1cDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒PB2cDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒HAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NPcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NAcDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒McDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，以及包含與連接到轉(zhuǎn)錄終止序列的流感病毒NScDNA可操作地連接的啟動(dòng)子的載體，其中PB1、PB2、PA、NP和M的cDNA具有來(lái)自在MDCK細(xì)胞中復(fù)制到高滴度的一種或多種流感病毒的序列，其中NS的cDNA來(lái)自在MDCK細(xì)胞中復(fù)制到高滴度的一種或多種流感病毒，其中NA的cDNA具有異源NA的序列，以及其中HA的cDNA具有異源HA的序列；以及包含與編碼流感病毒P乂的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒PB1的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒PB2的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒NP的DNA片l殳可操作連接的啟動(dòng)子的載體、任選的包含與編碼流感病毒HA的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒NA的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒Ml的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、包含與編碼流感病毒M2的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體、或包含與編碼流感病毒NS2的DNA片段可操作連接的啟動(dòng)子的載體。23.權(quán)利要求22的方法，進(jìn)一步包括分離所述病毒。24.通過(guò)權(quán)利要求23的方法獲得的病毒。25.用權(quán)利要求24的病毒感染的細(xì)胞。26.權(quán)利要求25的細(xì)胞，其是有胚蛋中的細(xì)胞。27.權(quán)利要求23的細(xì)胞，其是MDCK細(xì)胞。28.—種免疫個(gè)體對(duì)抗病原體的方法，包括向所述個(gè)體施用有效免疫所述個(gè)體的數(shù)量的權(quán)利要求24的病毒。29.—種分離的重組流感病毒，包含來(lái)自在有胚蛋中復(fù)制到高滴度的流感病毒的PB1、PB2、PA、NP、M和NA的病毒片段，在位置55具有Glu殘基的NS的病毒片段，以及異源HA的病毒片段。>30.權(quán)利要求29的分離的重組病毒，其中復(fù)制到高滴度的流感病毒是PR8HG。31.—種分離的重組流感病毒，包含來(lái)自在有胚蛋中復(fù)制到高滴度的流感病毒的PB1、PB2、PA、NP和M的病毒片段，在位置55具有Glu殘基的NS的病毒片段，來(lái)自在有胚蛋中或在MDCK細(xì)胞中復(fù)制到高滴度的病毒的NA的病毒片段，以及異源HA的病毒片段。32.權(quán)利要求31的分離的重組流感病毒，其中所述PB1、PB2、PA、NP和M的病毒片段來(lái)自PR8HG。33.權(quán)利要求31或32的分離的重組流感病毒，其中所述NA的病毒片段來(lái)自PR8。34.權(quán)利要求31或32的分離的重組流感病毒，其中所述NA的病毒片段對(duì)于PB1、PB2、PA、NP和M的病毒片段是異源的。35.權(quán)利要求31到34的任一項(xiàng)的分離的重組流感病毒，其中所述HA的病毒片段是H5的。36.包含權(quán)利要求24或29到35的任一項(xiàng)的分離的重組病毒的滅活的流感病毒疫苗。37.—種分離的重組流感病毒，其包含PB2的病毒片段，所述病毒片段編碼在位置360處具有絲氨酸、并具有與SEQIDNO:3編碼的相應(yīng)多肽基本上相同的氨基酸序列和基本上相同的活性的PB2，但是所述病毒片段不編碼具有SEQIDNO:3的PB2。38.權(quán)利要求37的分離的重組病毒，其具有相對(duì)于SEQIDNO:3的一個(gè)或多個(gè)但是低于20個(gè)替換。39.權(quán)利要求37的分離的重組病毒，其具有相對(duì)于SEQIDNO:3的一個(gè)或多個(gè)但是低于25個(gè)替換。40.權(quán)利要求38或39的分離的重組病毒，其中所述一個(gè)或多個(gè)替換包括保守性替換。全文摘要本發(fā)明提供了對(duì)于制備高滴度流感病毒有用的組合物，例如在沒(méi)有輔助病毒的情況下，其包括來(lái)自在有胚雞蛋或MDCK細(xì)胞中復(fù)制到高滴度的流感病毒分離物的至少五個(gè)內(nèi)部基因。文檔編號(hào)C07K14/11GK101472941SQ200780020095公開日2009年7月1日申請(qǐng)日期2007年3月29日優(yōu)先權(quán)日2006年3月31日發(fā)明者堀本泰介,村上晉,河岡義裕申請(qǐng)人:沃弗-威斯康星校友研究基金會(huì)