專利名稱：：肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hgf)的結(jié)合蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
涉及分子生物學(xué)、免疫學(xué)和腫瘤學(xué)。更具體地說，本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
為與人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)結(jié)合的基于抗體的結(jié)合蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
：肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，也被稱為擴(kuò)散因子(ScatterFactor,SF)，是一種主要由間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的多功能異源二聚體蛋白質(zhì)，并且是表達(dá)Met酪氨酸激酶受體的細(xì)胞的效應(yīng)器(參見Bottaro等人(1991)SCIENCE251:802-804，Rubin等人(1993)BI0CHIM.BI0PHYS.ACTA1155:357-371)。人Met受體還被稱為"c-Met"。成熟的HGF包含兩個(gè)多肽鏈，即，cx鏈和P鏈。已經(jīng)公開的研究指出，oc鏈包含HGF的c-Met受體結(jié)合域。當(dāng)HGF與其同源受體結(jié)合時(shí)，HGF調(diào)節(jié)了多種細(xì)胞活性。HGF-Met信號(hào)傳導(dǎo)通路在肝再生、傷口愈合、神經(jīng)再生、血管發(fā)生和惡性腫瘤中起作用。例如參見Cao等人(2001)PROC.NATL.ACAD.SCI,USA98:7443-7448,Burgess等人(2006)CANCERRES.66:1721-1729，以及美國(guó)專利序號(hào)5，997，868和5，707，624。研究者已經(jīng)開發(fā)出了許多HGF調(diào)節(jié)劑(包括抗體)來治療涉及HGF活性的多種紊亂，例如某些HGF響應(yīng)的癌癥(HGFresponsivecancer)。例:i口參見國(guó)際專利中請(qǐng)乂>開序號(hào)W02005/017107。圖1示意性地顯示了所有抗體所共有的基本結(jié)構(gòu)。抗體是含有4條多肽鏈的多聚體蛋白質(zhì)。其中的2條多肽鏈被稱為重鏈或H鏈，另外2條多肽鏈被稱為輕鏈或L鏈。通過鏈間的二硫鍵連接免疫球蛋白的重鏈和輕鏈。通過多個(gè)鏈間二硫鍵連接免疫球蛋白的重鏈。輕鏈由1個(gè)可變區(qū)(圖1中的VJ和1個(gè)恒定區(qū)(圖1中的CJ構(gòu)成，而重鏈由l個(gè)可變區(qū)(圖1中的VJ和至少3個(gè)恒定區(qū)(圖1中的CHi、CH2和CH3)構(gòu)成。可變區(qū)決定了抗體的特異性，而恒定區(qū)則包含其他功能。氨基酸和結(jié)構(gòu)信息表明，每個(gè)可變區(qū)都包含3個(gè)超變區(qū)(也稱為互補(bǔ)性決定區(qū)或CDR),其側(cè)翼是4個(gè)相對(duì)保守的框架區(qū)或FR。所述的3個(gè)CDR(分別稱為CDId、CDR2和CDR3)決定了單個(gè)抗體的結(jié)合特異性。當(dāng)將抗體用作診斷劑和治療劑時(shí)，通常理想的是產(chǎn)生包含對(duì)于目標(biāo)分子最高度的結(jié)合特異性和親和力的抗體。據(jù)信，可變區(qū)的差異對(duì)抗體的特異性和親和力包含深遠(yuǎn)的影響。美國(guó)專利序號(hào)5，707，624描述了抗HGF的抗體在治療卡波西肉瘤中的用途。類似的，美國(guó)專利序號(hào)5，997，868描述了通過向待治療患者施用抗HGF的抗體，從而阻斷內(nèi)源HGF促進(jìn)腫瘤中血管發(fā)生的能力的腫瘤治療。最近，研究者提出，與HGF的P鏈結(jié)合的抗體包含成為患有HGF依賴的腫瘤患者的治療劑的潛力(Burgess(2006)同上)。然而，仍需要可以被用作治療劑和診斷劑的其他HGF調(diào)節(jié)劑。發(fā)明概述本發(fā)明部分地基于特異性地結(jié)合HGF(特別是人HGF)的結(jié)合蛋白質(zhì)家族的發(fā)現(xiàn)。所述結(jié)合蛋白質(zhì)是基于抗體的，以至于其包含基于特異性地結(jié)合HGF的抗體家族的CDR的抗原(即，HGF)結(jié)合位點(diǎn)。所述CDR賦予了所述結(jié)合蛋白質(zhì)對(duì)HGF的結(jié)合特異性。所述結(jié)合蛋白質(zhì)可以用作診斷劑和治療劑。當(dāng)將所述結(jié)合蛋白質(zhì)用作治療劑時(shí)，將該結(jié)合蛋白質(zhì)改造(例如人源化)，從而減小或消除在施用至接受者(例如人)時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)所述結(jié)合蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)。所述結(jié)合蛋白質(zhì)中和了HGF的活性，因此可以被用作治療劑。在某些實(shí)施方案中，所述的結(jié)合蛋白質(zhì)抑制HGF與其同源受體(c-Met)結(jié)合，由此中和了HGF的活性。在其他實(shí)施方案中，所述的結(jié)合蛋白質(zhì)與HGF結(jié)合，并中和其生物活性，但不抑制HGF與c-Met受體的結(jié)合。由于HGF涉及癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，因此所述結(jié)合蛋白質(zhì)可用于抑制癌細(xì)胞的增殖。此外，當(dāng)用施用至哺乳動(dòng)物時(shí)，所述的結(jié)合蛋白質(zhì)能夠抑制或減少哺乳動(dòng)物中肺瘤的生長(zhǎng)。通過下文所述的附圖、發(fā)明詳述和權(quán)利要求的描述，清楚明白地顯示本發(fā)明的這些和其他方面以及優(yōu)點(diǎn)。參見以下附圖可以更徹底地理解本發(fā)明。圖1是典型抗體的示意性代表的圖。圖2為顯示如下氨基酸序列的示意圖，所述的氨基酸序列定義了抗體的完整的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，其中所述的抗體用1A3、1D3、1F3、2B8、2F8、3A12、3B6和3D11表示。每個(gè)抗體的氨基酸序列都與另一抗體的氨基酸序列比對(duì)，并且在方框中限定了定義信號(hào)肽、CDRi、CDR2和CDR3的區(qū)域。不帶方框的序列表示FR序列。圖3為顯示圖2中顯示的每個(gè)免疫球蛋白重鏈可變區(qū)序列的CDlCDR2和CDR3序列的示意圖。圖4為顯示如下氨基酸序列的示意圖，所述的氨基酸序列定義了抗體1A3、1D3、1F3、2B8、2F8、3A12、3B6和3D11的完整的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。每個(gè)抗體的氨基酸序列都與另一抗體的氨基酸序列比對(duì)，并且在方框中限定了定義信號(hào)肽、CDRi、CDR2和CDR3的區(qū)域。不帶方框的序列表示FR序列。圖5為顯示圖4中顯示出的每個(gè)免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)序列的CDR丄、CDR2和CDR3序列的示意圖。圖6為由測(cè)定U87MG異種移植模型中抗HGF的抗體1D3、1F3、1A3和2B8的腫瘤抑制活性的試驗(yàn)中所得的結(jié)果的匯總圖。菱形對(duì)應(yīng)于PBS;三角形對(duì)應(yīng)于抗HGF的抗體1A3;X對(duì)應(yīng)于抗HGF的抗體1D3;方形對(duì)應(yīng)于抗HGF的抗體1F3;而圓形對(duì)應(yīng)于抗HGF的抗體2B8。圖7為由測(cè)定U118異種移植;f莫型中抗HGF的抗體1D3、1F3、1A3和2B8的腫瘤抑制活性的試驗(yàn)中所得的結(jié)果的匯總圖。菱形對(duì)應(yīng)于IgG;方形對(duì)應(yīng)于抗HGF的抗體1F3;三角形對(duì)應(yīng)于抗HGF的抗體1D3;X對(duì)應(yīng)于抗HGF的抗體1A3;而圓形對(duì)應(yīng)于抗HGF的抗體2B8。圖8為一個(gè)表，該表總結(jié)了抗原結(jié)合親和力以及人HGF與嵌合的2B8抗體、嵌合的/人源化的2B8抗體或人源化的2B8抗體之間相互作用的動(dòng)力學(xué)的表面等離子共振數(shù)據(jù)。該表列出了所測(cè)試的多對(duì)Kappa輕鏈和IgGl重鏈。在3個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)中，對(duì)這些列出的包含標(biāo)準(zhǔn)偏差(STDEV)的抗體進(jìn)行分析。圖9為總結(jié)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的柱狀圖，表明Hu2B8結(jié)合與小鼠單克隆抗體2B8相互排斥的表位。將人源化的或嵌合的2B8捕獲在抗人的Fc的芯片上。然后，將HGF與人源化的或嵌合的2B8結(jié)合。測(cè)定小鼠2B8或?qū)φ湛贵w(多克隆的山羊抗HGF的抗體)與被捕獲的HGF結(jié)合的能力。人源化的2B8抗體和嵌合的2B8都抑制鼠2B8與HGF的結(jié)合。白色的柱對(duì)應(yīng)于嵌合的2B8抗體；灰色的柱對(duì)應(yīng)于人源化Hu2B8抗體(Kappa可變區(qū)Kvl-39.1和重鏈可變區(qū)Hv5-51.1);黑色的柱對(duì)應(yīng)于人源化Hu2B8抗體(Kappa可變區(qū)Kv3-15.1和重鏈可變區(qū)Hv5-51.1)。發(fā)明詳述本發(fā)明部分地基于特異性地結(jié)合HGF并中和HGF(特別是人HGF)的活性的結(jié)合蛋白質(zhì)家族的發(fā)現(xiàn)。所述結(jié)合蛋白質(zhì)可用于許多診斷和治療應(yīng)用。所述的結(jié)合蛋白質(zhì)基于就其結(jié)合HGF并中和HGF的活性的能力而被選擇的某些單克隆抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。具體而言，所述的結(jié)合蛋白質(zhì)包含多個(gè)免疫球蛋白可變區(qū)CDR序列，其一起定義了用于HGF的結(jié)合位點(diǎn)?？紤]到這些抗體的中和活性，它們特別適用于介導(dǎo)HGF應(yīng)答細(xì)胞(例如癌細(xì)胞)的生長(zhǎng)和/或增殖。當(dāng)將所述的結(jié)合蛋白質(zhì)用作治療劑時(shí)，可以對(duì)其改造，從而最小化或消除在施用至接受者時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)所述結(jié)合蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)。此外，根據(jù)具體的應(yīng)用，包括將所述結(jié)合蛋白質(zhì)與其他部分(例如可檢測(cè)的標(biāo)簽(如放射性標(biāo)簽)和效應(yīng)器分子(如其他蛋白質(zhì)和基于小分子的治療劑))綴合。下文將對(duì)本發(fā)明的這些特征和方面中的每一個(gè)進(jìn)行詳細(xì)的說明。I—結(jié)合HGF的結(jié)合蛋白質(zhì)在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種結(jié)合人HGF的分離的結(jié)合蛋白質(zhì)，該結(jié)合蛋白質(zhì)包含(i)包含結(jié)構(gòu)CDRu-CDRL廣CDRu的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)；和(ii)包含3個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，其中所述的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和所述的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)一起定義了用于結(jié)合人HGF的單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。CDRU包含氨基酸序列XASerXJsXeXJ^oXnXuXjMX,"其中氨基酸X!為Arg、Lys或Ser，義2為Ala或Thr，X4isGlu、Gin或Ser，X5為Asn、Asp或Ser，X6為Ile或Val，X為Asp、Lys、Ser、Val或Tyr，Xs為肽鍵或Tyr,X,為肽鍵或Asp，Xi。為肽鍵或Gly，Xu為肽鍵或Asn，X^為肽鍵、lie或Ser，Xn為Asn或Tyr，X"為Ile、Leu、Met或Val,X15為Ala、Asn、His或Ser。CDR^包含氨基酸序列X16X17X18X19X2。X21X22，其中氨基酸X"為Ala、Asp、Arg、Gly或Val，X"為Ala、Thr或Val，X^為Asn、Ser或Thr，X"為Arg、Asn、Lys、或His，乂2。為L(zhǎng)eu或Arg，Xn為Ala、Asn、Glu、Val或Pro,Xu為Asp、Ser或Thr。CDRL3包含氨基酸序列X23X24X25X26X27X28ProX3。Thr,其中氨基酸X"為L(zhǎng)eu、Gly或Gln，X24為His或Gin,叉25為Phe、Ser、Trp或Tyr，X26》Asp、Ile、Ser、Trp或Tyr，Xn為Gly、Glu、Asn或Ser,乂28為Asp、Asn、Phe、Thr或Tyr，X，。為L(zhǎng)eu、Phe、Pro或Tyr。在其他方面中，本發(fā)明提供一種結(jié)合人HGF的分離的結(jié)合蛋白質(zhì)，該結(jié)合蛋白質(zhì)包含(i)包含結(jié)構(gòu)CDIU-CDRH2-CDRH3的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)；和(ii)包含3個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其中所述的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和所述的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)一起定義了用于結(jié)合人HGF的單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。CDRH1包含氨基酸序列XJyrX^Xs,其中氨基酸X,為Asp、Asn、Ser或Thr，X〗為Phe、Ser、Trp或Tyr，l為Ile、Leu或Met，Xs為Asn、His或Ser。CDRH2包含氨基酸序列X6lleXj9Xi。X"GlyX"X!4X!5TyrXnXi8XwX2。X"X22，其中氨基酸Xs為L(zhǎng)ys、Gln、Glu、Val或Tyr，Xs為Asn、Gly、Ser、Trp或Tyr，Xs為Ala、Pro或Ser，Xu為Gly或Thr，Xu為肽鍵、Asp、Asn、Gly或Ser，X!3為Asp、Asn、His、或Ser，X"為Ser或Thr，乂15為Asn或Tyr,Xn為Asn或Pro，乂18為Ala、Asp、Gly、Gln、Glu、Pro或Ser，Xw為Asn、Lys、Met或Ser，乂2。為L(zhǎng)eu、Phe或Val,X2!為L(zhǎng)ys、Met或Gln，X22為Asp、Gly或Ser。CDRH3包含氨基酸序列X23X24X25X26X27X28X29X30X3iX32X33X34Tyr，其中氛基酸X23為Arg、Asn、Gin或Glu，Xw為Gly、Leu、Arg、或Tyr，X"為肽鍵、Asp或Gly,X26為肽鍵或Gly，Xn為肽鍵或Tyr，乂28為肽鍵、Leu或Tyr,乂29為肽鍵、Gly、Leu、Arg或Val，乂3。為肽鍵、Asp、Gly或Glu，Xn為肽鍵、Asn、Arg、Ser或Tyr，又32為肽鍵、Ala、Gly、lie或Tyr，X"為Met或Phe，X34為Ala或Asp。應(yīng)該理解，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含如上所述的免疫球蛋白輕鏈和免疫球蛋白重鏈或其片段。此外，應(yīng)該理解，所述結(jié)合蛋白質(zhì)可以為完整的抗體或其抗原結(jié)合片段、或生物合成的抗體位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，在免疫球蛋白輕鏈和免疫球蛋白重鏈的CDR序列中插入框架區(qū)(FR)。在某些其他的實(shí)施方案中，將免疫球蛋白輕鏈和免疫球蛋白重鏈的CDR序列插入人或人源化的框架區(qū)之間。在另一方面，本發(fā)明提供一種特異性地結(jié)合人HGF的分離的結(jié)合蛋白質(zhì)。該結(jié)合蛋白質(zhì)包含(a)包含結(jié)構(gòu)CDRu-CDRu-CDRu的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)；和(b)免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，其中所述的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和所述的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)一起定義了用于結(jié)合人HGF的單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。CDRu包含選自SEQIDNO.8(1A3)、SEQIDNO.18(2B8)、SEQIDNO.28(2F8)、SEQIDNO.38(3B6)、SEQIDNO.48(3D11)、SEQIDNO.58(1D3)、SEQIDNO.68(1F3)和SEQIDNO.78(3A12)中的序列。CDRu包含選自SEQIDNO.9(1A3)、SEQIDNO.19(2B8)、SEQIDNO.29(2F8)、SEQIDNO.39(3B6)、SEQIDNO.49(3D11)、SEQIDNO.59(1D3)、SEQIDNO.69(1F3)、SEQIDNO.79(3A12)和SEQIDNO.206(LRMR2B8LC)中的序列。CDRL3包含選自SEQIDNO.10(1A3)、SEQIDNO.20(2B8)、SEQIDNO.30(2F8)、SEQIDNO.40(3B6)、SEQIDNO.50(3D11)、SEQIDNO.60(1D3)、SEQIDNO.70(1F3)和SEQIDNO.80(3A12)中的序列。在整個(gè)說明書和權(quán)利要求書中，由具體的SEQIDNO.所表示的序列后為被括在括號(hào)中的抗體，該抗體為具體序列的來源。例如，SEQIDNO.8(1A3)表示，SEQIDNO.8的序列基于抗體1A3中的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含CDRU、CDRu和CDRu,其中CDRU包含SEQIDNO.8(1A3)所示的序列,CDRu包含SEQIDNO.9(1A3)所示的序列，而CDRu包含SEQIDNO.10(1A3)所示的序列。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含CDRU、CDRl2和CDRl3，其中CDRU包含SEQIDNO.18(2B8)所示的序列，CDRu包含SEQIDNO.19(2B8)或SEQIDNO.206(LRMR2B8LC)所示的序列，而CDRl3包含SEQIDNO.20(2B8)所示的序列。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含CDRu、CDRu和CDRU，其中CDRU包含SEQIDNO.28(2F8)所示的序列，CDRL2包含SEQIDNO.29(2F8)所示的序列，而CDRu包含SEQIDNO.30(2F8)所示的序列。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含CDRu、CDRu和CDRU，其中CDRU包含SEQIDNO.38(3B6)所示的序列，CDRL2包含SEQIDNO.39(3B6)所示的序列，而CDRl3包含SEQIDNO.40(3B6)所示的序列。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含CDRu、CDRU和CDRu,其中CDRU包含SEQIDNO.48(3D11)所示的序列，CDRu包含SEQIDNO.49(3D11)所示的序列，而CDRl3包含SEQIDNO.50(3D11)所示的序列。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含CDRu、CDRu和CDRu,其中CDRU包含SEQIDNO.58(1D3)所示的序列,CDRu包含SEQIDNO.59(1D3)所示的序列，而CDRu包含SEQIDNO.60(1D3)所示的序列。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含CDRU、CDRl2和CDRl3，其中CDRU包含SEQIDNO.68(1F3)所示的序列,CDRl2包含SEQIDNO.69(1F3)所示的序列，而CDRu包含SEQIDNO.70(1F3)所示的序列。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含CDRU、CDRU和CDRU，其中CDRU包含SEQIDNO.78(3A12)所示的序列，CDRL2包含SEQIDNO.79(3A12)所示的序列，而CDRu包含SEQIDNO.80(3A12)所示的序列。在以上所述的實(shí)施方案中的每個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選地將所述CDRU、CDRl2和CDRu序列插入人或人源化的免疫球蛋白FR之間。應(yīng)該理解，所述結(jié)合蛋白質(zhì)可以為完整的抗體、其抗原結(jié)合片段或生物合成的抗體位點(diǎn)。在另一方面，本發(fā)明提供一種結(jié)合人HGF的分離的結(jié)合蛋白質(zhì)。該結(jié)合蛋白質(zhì)包含(a)包含結(jié)構(gòu)CDI^-CDRH2-CDRH3的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)；和(b)免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其中所述的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和所述的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)一起定義了用于結(jié)合人HGF的單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。CDRh,包含逸自SEQIDNO.5(1A3)、SEQIDNO.15(2B8)、SEQIDNO.25(2F8)、SEQIDNO.35(3B6)、SEQIDNO.45(3D11)、SEQIDNO.55(1D3)、SEQIDNO.65(1F3)和SEQIDNO.75(3A12)中的序列；CDRh2包含逸自SEQIDNO.6(1A3)、SEQIDNO.16(2B8)、SEQIDNO.26(2F8)、SEQIDNO.36(3B6)、SEQIDNO.46(3D11)、SEQIDNO.56(1D3)、SEQIDNO.66(1F3)、SEQIDNO.76(3A12)、SEQIDNO.202(Hu2B8Hvlf.l)，SEQIDNO.203(Hu2B8Hv5a.1或Hu2B8Hv5-51.1)、SEQIDNO.204(LR2B8HC)和SEQIDNO.205(LRMR2B8HC)中的序列;以及CDRh3包含逸自SEQIDNO.7(1A3)、SEQIDNO.17(2B8)、SEQIDNO.27(2F8)、SEQIDNO.37(3B6)、SEQIDNO.47(3D11)、SEQIDNO.57(1D3)、SEQIDNO.67(1F3)和SEQIDNO.77(3A12)中的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含CDR^、CDRh2和CDRH3，其中CDRH1包含SEQIDNO.5(1A3)所示的序列;CDRH2包含SEQIDNO.6(1A3)所示的序列;以及CDRh3包含SEQIDNO.7(1A3)所示的序列。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含CDRH1、CDRm和CDRK3，其中CDRH1包含SEQIDNO15(2B8)所示的序列;CDRH2包含SEQIDNO.16(2B8)、SEQIDNO.202(Hu2B8Hvlf.1)、SEQIDNO.203(Hu2B8Hv5a.1或Hu2B8Hv5-51.1)、SEQIDNO.204(LR2B8HC)或SEQIDNO.205(L腿2B8HC)所示的序列；以及CDRh3包含SEQIDN0.17(2B8)所示的序列。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中CDRH1包含SEQIDNO.25(2F8)所示的序列;CDRH2包含SEQIDNO.26(2F8)所示的序列；以及CDRh3包含SEQIDNO.27(2F8)所示的序列。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含CDRm、CDRH2和CDRH3，其中CDRH1包含SEQIDNO,35(3B6)所示的序列;CDRH2包含SEQIDNO.36(3B6)所示的序列；以及CDRh3包含SEQIDNO.37(3B6)所示的序列。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含CDR^、CDRH2和CDRH3，其中CDRH1包含SEQIDNO.45(3D11)所示的序列;CDRH2包含SEQIDNO.46(3D11)所示的序列；以及CDRh3包含SEQIDNO.47(3D11)所示的序列。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含CDIU、CDRh2和CDRh3，其中CDRH1包含SEQIDNO.55(1D3)所示的序列；CDRH2包含SEQIDNO.56(1D3)所示的序列；以及CDRh3包含SEQIDNO.57(1D3)所示的序列。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中CDRH1包含SEQIDNO.65(1F3)所示的序列;CDRH2包含SEQIDNO.66(1F3)所示的序列；以及CDRh3包含SEQIDNO.67(1F3)所示的序列。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中CDRH1包含SEQIDNO.75(3A12)所示的序列;CDRH2包含SEQIDNO.76(3A12)所示的序列；以及CDRm包含SEQIDNO.77(3A12)所示的序列。在以上所述的實(shí)施方案中的每個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選地將所述CDRH1、CDRh2和CDRh3序列插入人或人源化的免疫球蛋白FR之間。應(yīng)該理解，所述結(jié)合蛋白質(zhì)可以為完整的抗體、其抗原結(jié)合片段或生物合成的抗體位點(diǎn)。在另一方面，本發(fā)明提供一種結(jié)合人HGF的結(jié)合蛋白質(zhì)。該結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，所述的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)選自SEQIDNO.2(1A3)的殘基20-141、SEQIDNO.12(2B8)的殘基20—137、SEQIDNO.22(2F8)的殘基20-137、SEQIDNO.32(3B6)的殘基20-139、SEQIDNO.42(3D11)的殘基20-132、SEQIDNO.52(1D3)的殘基20-141、SEQIDNO.62(1F3)的殘基20-141以及SEQIDNO.72(3A12)的殘基20-141,所述的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)選自SEQIDNO.4(1A3)的殘基21-127、SEQIDNO.14(2B8)的殘基21-127、SEQIDNO.24(2F8)的殘基20-131、SEQIDNO.34(3B6)的殘基23-129、SEQIDNO.44(3D11)的殘基23-128、SEQIDNO.54(1D3)的殘基21-127、SEQIDNO.64(1F3)的殘基21-127、以及SEQIDNO.74(3A12)的殘基21-127。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，所述的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO.2(1A3)的殘基20-141的氨基酸序列，所述的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO.4(1A3)的殘基21-127的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，所述的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO.12(2B8)的殘基20-137的氨基酸序列，所述的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO.14(2B8)的殘基21-127的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，所述的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO.22(2F8)的殘基20-137的氨基酸序列，所述的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO.24(2F8)的殘基20-131的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，所述的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO.32(3B6)的殘基20-139的氨基酸序列，所述的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO.34(3B6)的殘基23-129的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，所述的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO.42(3D11)的殘基20-132的氨基酸序列，所述的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO.44(3D11)的殘基23-128的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，所述的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO.52(1D3)的殘基20-141的氨基酸序列，所述的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO.54(1D3)的殘基21-127的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，所述的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO.62(1F3)的殘基20-141的氨基酸序列，所述的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO.64(1F3)的殘基21-127的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，所述的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO.72(3A12)的殘基20-141的氨基酸序列，所迷的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO.74(3A12)的殘基21-127的氨基酸序列。在以上所述的實(shí)施方案中的每個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)為完整的抗體、其抗原結(jié)合片段或生物合成的抗體位點(diǎn)。在另一方面，本發(fā)明提供一種結(jié)合人HGF的分離的結(jié)合蛋白質(zhì)。該結(jié)合蛋白質(zhì)包含(i)免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其選自SEQIDNO.173(Hu2B8Kvl-39.1輕鏈可變區(qū))、SEQIDNO.179(Hu2B8Kv3-15.1輕鏈可變區(qū))、SEQIDNO.193(LR2B8LC輕鏈可變區(qū))以及SEQIDNO.199(LRMR2B8LC輕鏈可變區(qū))；以及(ii)免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，其選自SEQIDNO.159(Hu2B8Hvlf.1重鏈可變區(qū))，SEQIDNO.165(Hu2B8Hv5a.1重鏈可變區(qū))，SEQIDNO.169(Hu2B8Hv5-51.1重鏈可變區(qū))，SEQIDNO.183(LR2B8HC重鏈可變區(qū))以及SEQIDNO.189(LRMR2B8LC輕鏈可變區(qū))。所述結(jié)合蛋白質(zhì)可以是完整的抗體、其抗原結(jié)合片段或生物合成的抗體位點(diǎn)。在另一方面，本發(fā)明提供一種結(jié)合人HGF的分離的結(jié)合蛋白質(zhì)。該結(jié)合蛋白質(zhì)包含(i)免疫球蛋白輕鏈，其選自SEQIDNO.177(Hu2B8Kvl-39.1+Kappa恒定區(qū)(Km(3)同種異型(等位基因2))、SEQIDNO.181(Hu2B8Kv3-15.1+Kappa恒定區(qū)(Km(3)同種異型(等位基因2))、SEQIDNO.197(LR2B8LC+Kappa恒定區(qū)(Km(3)同種異型(等位基因l))以及SEQIDNO.201(LRMR2B8LC+Kappa恒定區(qū)(Km(3)同種異型(等位基因l));以及(ii)免疫球蛋白重鏈，其選自SEQIDNO.163(Hu2B8Hvlf1+IgGl恒定區(qū)(Glm(17，1)同種異型))、SEQIDNO.167(Hu2B8Hv5a.1+IgGl恒定區(qū)(Glm(17，1)同種異型))、SEQIDNO.171(Hu2B8Hv5-51.1+IgGl恒定區(qū)(Glm(17，1)同種異型))、SEQIDNO.187(LR2B8HC+IgGl恒定區(qū)(Glm(3)同種異型)(等位基因1))以及SEQIDNO.191(LRMR2B8HC+IgGl恒定區(qū)(Glm(3)同種異型)(等位基因1))。所述結(jié)合蛋白質(zhì)可以是完整的抗體、其抗原結(jié)合片段或生物合成的抗體位點(diǎn)。在另一方面，本發(fā)明提供一種結(jié)合還原的人HGF的分離的結(jié)合蛋白質(zhì)。該結(jié)合蛋白質(zhì)包含(i)包含3個(gè)CDR的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，以及(ii)包含3個(gè)CDR的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)。CDR通常被插在FR之間。免疫球蛋白輕鏈和免疫球蛋白重鏈的CDR—起定義了結(jié)合還原的人HGF的結(jié)合位點(diǎn)(例如還原的HGF的oc鏈)。還原的HGF是指使用足以還原oc鏈和P鏈之間二石危鍵的量的還原劑(例如二石充蘇糖醇(DTT)、2-巰基乙醇或谷胱甘肽)處理的HGF。示例性的濃度包括，例如100mM的DTT和5%的2-巰基乙醇。在某些實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含選自CDRU、CDRu和CDRu中的至少1個(gè)CDR。備選地，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含2個(gè)CDR,例如CDRu和CDRu、或CDRl,和CDRl3、或CDRu和CDRu。備選地，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含所有的3個(gè)CDR,即，CDRL1、CDRL2和CDRL3。CDRL1包含氨基酸序列X^SerX^XJWWWUXnXuXnXnX^其中氨基酸X！為Arg或Lys，X:為Ala或Thr,乂4為Glu或Gln，Xs為Asn、Ser或Asp，乂6為lie或Val，乂7為Tyr、Asp或Lys，Xs為肽鍵或Tyr,X,為肽鍵或Asp，X^為肽鍵或Gly，Xu為肽鍵或Asn，Xu為肽鍵或Ser，X"為Asn或Tyr，X"為lie或Leu，Xu為Ala、Asn或Ser。CDRU包含氨基酸序列X16X17X18X19LeuX21X22，其中氨基酸X16為Ala、Asp、Val或Arg，X丄？為Ala或Val，Xu為Asn、Ser或Thr，Xn為Arg、Asn或His,X21為Ala、Glu、Val或Pro，X22為Asp或Ser。CDRL3包含氨基酸序列X23X2J25X26X27X28ProX3。Thr，其中氨基酸X"為L(zhǎng)eu或Gln，X"為His或Gln，Xu為Phe、Ser或Tyr，Asp、lie或Trp,乂27為Gly或Gin,Xu為Asp、Phe或Thr，乂30為Phe、Pro或Tyr。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含選自CDRH1、CDRh2和CDRh3中的至少l個(gè)CDR。備選地，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含2個(gè)CDR，例如CDRh,和CDRH2、或CDRm和CDRh3、或CDFU和CDRh3。備選地，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含所有的3個(gè)CDR，即，CDRH1、CDlOCDRH3。CDRH1包含氨基酸序列XJyrXJJs，其中氨基酸Xi為Asp、Asn、Ser或Thr，乂3為Phe、Trp或Tyr，X^為lie或Met,X5為Asn、His或Ser。CDRH2包含氨基酸序列XJleXAGlyXuGlyXuUsTyrX^HoLysXn,其中氨基酸X6為L(zhǎng)ys、Gln或Tyr，Xs為Gly、Ser或Tyr，X9為Pro或Ser，Xu為Asp、Gly或Ser，Xn為Asp或Ser,乂14為Ser或Thr，X^為Asn或Tyr,Xn為Asn或Pro,義18為Ala、Asp、Gly或Glu，叉19為Asn、Met或Ser，X2。為Phe或Val,X22為Asp或Gly。CDRH3包含氨基酸序列X23X24X25X26X27X28X29X3。X31X32X33AspTyr,其中氨基酸Xn為Arg或Gin,X24為Gly或Leu，X25為Asp、Gly或肽鍵，X26為Gly或肽鍵，&7為肽鍵或Tyr，Xa為L(zhǎng)eu、肽鍵或Tyr，X"為Gly、Arg或Leu，Xw為Asp、Gly或Glu，Xn為Tyr、Arg或Asn,乂32為Ala、Gly或Tyr，X"為Met或Phe。應(yīng)該理解，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含如上所述的免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈或其片段。此外，應(yīng)該理解，所述結(jié)合蛋白質(zhì)為完整的抗體或其抗原結(jié)合片段、或生物合成的抗體位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含(i)CDRu，其具有選自SEQIDNO.8(1A3)、SEQIDNO.28(2F8)、SEQIDNO.38(3B6)、SEQIDNO.58(1D3)和SEQIDNO.68(1F3)的序列，(ii)CDRL2，其具有選自SEQIDNO.9(1A3)、SEQIDNO.29(2F8)、SEQIDNO.39(3B6)、SEQIDNO.59(1D3)和SEQIDNO.69(1F3)的序列，以及(iii)CDRL3，其具有選自SEQIDNO.10(1A3)、SEQIDNO.30(2F8)、SEQIDNO.40(3B6)、SEQIDNO.60(1D3)和SEQIDNO.70(1F3)的序列。可以將CDR序列插入人或人源化的FR之間。在其他實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含選自SEQIDNO.4(1A3)的殘基21-127、SEQIDNO.24(2F8)的殘基20-131、SEQIDNO.34(3B6)的殘基23-129、SEQIDNO.54(1D3)的殘基21-127以及SEQIDNO.64(1F3)的殘基21-127中的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含(i)CDRH1,其具有選自SEQIDNO.5(1A3)、SEQIDNO.25(2F8)、SEQIDNO.35(3B6)、SEQIDNO.55(1D3)和SEQIDNO.65(1F3)的序列，(ii)CDRH2，其具有選自SEQIDNO.6(1A3)、SEQIDNO.26(2F8)、SEQIDNO.36(3B6)、SEQIDNO.56(1D3)和SEQIDNO.66(1F3)的序列，以及(iii)CDRH3，其具有選自SEQIDNO.7(1A3)、SEQIDNO.27(2F8)、SEQIDNO.37(3B6)、SEQIDNO.57(1D3)和SEQIDNO.67(1F3)的序列?？梢詫DR序列插入人或人源化的FR之間。在另一實(shí)施方案中，所述的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含選自SEQIDNO.2(U3)的殘基20-141、SEQIDNO.22.(2F8)的殘基20-137、SEQIDNO.32(3B6)的殘基20-139、SEQIDNO.52(1D3)的殘基20-141以及SEQIDNO.62(1F3)的殘基20-141中的氨基酸序列。在另一方面，本發(fā)明提供一種分離的結(jié)合蛋白質(zhì)，其結(jié)合人HGF，并且包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和免疫球蛋白重鏈可變區(qū)。所述分離的結(jié)合蛋白質(zhì)與至少1種參照抗體竟?fàn)幮缘亟Y(jié)合HGF，其中所述參照抗體選自(i)具有SEQIDNO.24(2F8)的殘基20-131的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和SEQIDNO.22(2F8)的殘基20-137的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的抗體，(ii)具有SEQIDNO.34(3B6)的殘基23-129的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和SEQIDNO.32(3B6)的殘基20-139的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的抗體，以及(iii)具有SEQIDNO.44(3D11)的殘基23-128的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和SEQIDNO.42(3D11)的殘基20-132的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的抗體。在某些條件下，所述結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合與參照抗體之一相同的HGF相表位。應(yīng)該理解，上文所討論的每種結(jié)合蛋白質(zhì)都可以是完整的抗體，例如單克隆抗體。備選地，所述結(jié)合蛋白質(zhì)可以為抗體的抗原結(jié)合片段，或者可以為生物合成的抗體結(jié)合位點(diǎn)?？贵w片段包括Fab、Fab'、(Fab')2或Fv片段。用于制備這種抗體片段的技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。多種生物合成的抗體結(jié)合位點(diǎn)是本領(lǐng)域已知的，其包括，例如單一的Fv或sFv分子，例如美國(guó)專利序號(hào)5，476，786所述。其他生物合成的抗體結(jié)合位點(diǎn)包括雙特異性或雙功能性的結(jié)合蛋白質(zhì)，例如雙特異性或雙功能性的抗體，其為結(jié)合至少兩種不同的抗原的抗體或抗體片段。例如，雙特異性結(jié)合蛋白質(zhì)可以結(jié)合HGF(例如人HGF)和其他目的抗原。用于制備雙特異性抗體的方法在本領(lǐng)域中是已知的，其包括，例如通過融合雜交瘤或通過連接FaV片段。例如參見Songsivilai等人(1990)CLIN.EXP.IMMUNOL.79:315-325;Kostelny等人(1992)LIMMUNOL.148:1547-1553。本發(fā)明的結(jié)合蛋白質(zhì)可以與包含在561位置處的半胱氨酸被精氨酸取代或者在555位置處的甘氨酸被谷氨酸取代的hHGF結(jié)合。在另一方面中，本法提供一種分離的結(jié)合蛋白質(zhì)，其與人HGF結(jié)合的kd是4.0x105s^或更低、3.0x10—5s^或更低、或者2.0x10—5s—1或更低。所述分離的蛋白質(zhì)與人HGF結(jié)合的kd是5.Oxl(Ts—工至0.5xl(T5s-1、4.Oxl(Ts-i至1.Oxl(Ts-1、或3.0xl(T5s—!至1.5x10—5s-1。在另一方面中，本發(fā)明提供一種分離的結(jié)合蛋白質(zhì)，其與人HGF結(jié)合的K。是100pM或更低、20pM或更低、10pM或更低、或者5pM或更低。所述分離的蛋白質(zhì)與人HGF結(jié)合的K。是100pM至5pM、20pM至5pM、15pM至10pM、20pM至10pM、或者15pM至5pM。除非另作說明外，通過實(shí)施例6中所述的方法和條件來測(cè)定K。值。在另一方面，本法提供一種分離的結(jié)合人HGF的結(jié)合蛋白質(zhì)，其中所述的抗體在37t:下與人HGF結(jié)合的K。比在25"C下與人HGF結(jié)合的K。低。所述結(jié)合蛋白質(zhì)任選地在37X:下，以低于5pM的K。與人HGF結(jié)合。在其他方面和實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)抑制hHGF與c-Met的結(jié)合。例如，當(dāng)采用實(shí)施例7(a)中所述的方案進(jìn)行測(cè)定時(shí)，所述結(jié)合蛋白質(zhì)的ICs。(最大抑制的50%時(shí)的濃度)至少為約4.0、4，5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0nM。在某些其他的實(shí)施方案中，通過使用實(shí)施例7(b)所述的方法，所述結(jié)合蛋白質(zhì)中和引入到4MBr-5細(xì)胞(ATCC，CatalogNo.CCL208)中的HGFBrdU。當(dāng)使用實(shí)施例7(b)中所述的方案進(jìn)行分析時(shí)，所述結(jié)合蛋白質(zhì)的I"為50nM或更低、優(yōu)選為45、40、35、30、25、20、15、10、5、1、0.5nM或更低。在某些其他的實(shí)施方案中，通過使用實(shí)施例9中所述的分析，所述結(jié)合蛋白質(zhì)可用于抑制PC-3細(xì)胞(ATCC，Manassus,VACatalogNo.CRL-1435)中HGF刺激的c-Met磷酸化。使用實(shí)施例9中所述的分析，所述結(jié)合蛋白質(zhì)以2nM或更低的ICs。(參見表8)來抑制PC-3細(xì)胞中HGF刺激(1.25nM)的c-Met磷酸化。II一結(jié)合蛋白質(zhì)的制備質(zhì)。例如，通過使用市售的合成儀器以及本文所提供的序列信息化學(xué)合成編碼輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的DNA分子?？梢詫⑦@種合成的DNA分子連接至其他合適的核苷酸序列，例如包括編碼序列的恒定區(qū)和表達(dá)控制序列，從而制備出編碼所需結(jié)合蛋白質(zhì)的常規(guī)基因表達(dá)構(gòu)建體。制備所定義的基因構(gòu)建體的方法為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。備選地，可以出本文所提供的序列，其中所述核酸探針的序列基于本文所提供的序列信息或者關(guān)于雜交瘤細(xì)胞中編碼小鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因的現(xiàn)有技術(shù)的序列信息。這種探針的制備和使用是本領(lǐng)域的普通技術(shù)。可以將編碼所需的結(jié)合蛋白質(zhì)的核酸引入(連接)到表達(dá)栽體中，入到宿主細(xì)胞中。示例性的宿主細(xì)胞包括，例如大腸桿菌細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CH0)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人肝癌細(xì)胞(例如HepG2)和骨髓瘤細(xì)胞，這些細(xì)胞都不會(huì)另外產(chǎn)生免疫球蛋白?？梢栽谠试S宿主細(xì)胞表達(dá)目的基因(例如表達(dá)免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)或重鏈可變區(qū)的基因)的條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)收獲所得的表達(dá)產(chǎn)物。具體的表達(dá)和純化條件根據(jù)所使用的表達(dá)系統(tǒng)而改變。例如，如果在大腸桿菌中表達(dá)基因，首先要將該基因克隆到表達(dá)載體中。通過將工程改造的基因置于合適的細(xì)菌啟動(dòng)子(例如Trp或Tac)和信號(hào)序列(例如編碼蛋白質(zhì)A的片段B(FB)的序列)的下游來實(shí)現(xiàn)該過程。體內(nèi)累積，并且可以通過弗氏壓碎器(Frenchpress)或超聲波法在破碎細(xì)胞后收獲。然后，溶解折射體，并使用已經(jīng)針對(duì)其他重組蛋白質(zhì)建立的方法重折疊和剪切表達(dá)的蛋白質(zhì)。如果在真核宿主細(xì)胞(例如骨髓瘤細(xì)胞或CH0細(xì)胞)中表達(dá)工程基因，首先將該工程基因插入到包含合適的真核啟動(dòng)子、分泌信號(hào)、免疫球蛋白增強(qiáng)子和多個(gè)內(nèi)含子的表達(dá)載體中。該表達(dá)載體任選地包含編碼所有恒定區(qū)或部分恒定區(qū)的序列，從而使整個(gè)或部分的重鏈或輕鏈被表達(dá)?？梢允褂靡呀?jīng)建立的轉(zhuǎn)染方法將所述的基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到骨髓瘤細(xì)胞或CH0細(xì)胞中。這種轉(zhuǎn)染細(xì)胞能夠表達(dá)Vl或VH片段、V「Vh的異源二聚體、Vh-Vl或V廣VH單鏈多肽、完整的免疫球蛋白重鏈或輕鏈、或其部分，其中每一個(gè)都可以與包含另一功能(例如細(xì)胞毒性)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域相連。III一結(jié)合蛋白質(zhì)的修飾應(yīng)該理解，根據(jù)所述結(jié)合蛋白質(zhì)的目的用途，可以對(duì)該結(jié)合蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，從而優(yōu)化其性能。例如，當(dāng)所述結(jié)合蛋白質(zhì)用作治療劑時(shí)，可以對(duì)該結(jié)合蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，以減少其在目的接受者中的免疫原性。備選地或另外地，可以將所述結(jié)合蛋白質(zhì)與另一蛋白質(zhì)或肽(例如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子或細(xì)胞毒素)融合或偶聯(lián)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的常規(guī)的基因操作技術(shù)來實(shí)現(xiàn)這種修飾。用于減小抗體和抗體片段的抗原性的多種技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的。這些技術(shù)可用于減小或消除本發(fā)明的結(jié)合蛋白質(zhì)的抗原性。例如，當(dāng)將所述結(jié)合蛋白質(zhì)施用至人時(shí)，優(yōu)選地對(duì)該結(jié)合蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，以減少其在人體中的抗原性。該過程通常被稱為人源化過程。優(yōu)選地，人源化的結(jié)合蛋白質(zhì)對(duì)抗原的親和力與其衍生而來的、原始的非人源化的結(jié)合蛋白質(zhì)對(duì)抗原的親和力相同或基本相同。在一個(gè)公知的人源化方法中，產(chǎn)生嵌合蛋白質(zhì)，其中來自一種物種(例如小鼠)的抗體的免疫球蛋白恒定區(qū)被得自第二種不同的物種(例如人)的免疫球蛋白恒定區(qū)所取代。在該實(shí)施例中，所得的抗體為小鼠-人的嵌合體，其中人恒定區(qū)序列的免疫原性在原則上比對(duì)應(yīng)的小鼠的序列的免疫原性要小。這種抗體工程學(xué)在(例如)Morrison等人(1984)PROC.NAT.ACAD.SCI.81:6851-6855;Neuberger等人(1984)NATURE312:604-608;以及美國(guó)專利序號(hào)6,893,625(Robinson)、5,500,362(Robinson)和4，816，567(Cabilly)中有所描述。在另一方法(稱為CDR移植)中，將目的抗體的輕鏈可變區(qū)CDR和重鏈可變區(qū)的CDR移植到另一種抗體的框架(FR)中。例如，將小鼠CDR移植到人FR序列中。在一些實(shí)施方案中，將抗HGF的抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)的CDR移植到人FR或共有人FR中。為了形成共有人FR,比對(duì)來自多個(gè)人重鏈或輕鏈的氨基酸序列的FR，以確定共有的氨基酸序列。CDR移植在例如美國(guó)專利序號(hào)7，022，500(Queen)、6，982，321(Winter)、6,180,370(Queen)、6,054,297(Carter)、5，693，762(Queen)、5,859,205(Adair)、5,693,761(Queen)、5,565,332(Hoogenboom)、5，585，089(Queen)、5，530，101(Queen)中；以及Jones等人(1986)NATURE321:522-525;Riechmann等人(1988)NATURE332:323-327;Verhoeyen等人(1988)SCIENCE239:1534-1536;和Winter(1998)FEBSLETT430:92-94中有所描述。在被稱為"超級(jí)人源化，，的方法中，通過移植的另一種形式來產(chǎn)生其中人免疫原性被減小或消除的抗體。在超級(jí)人源化中，基于人CDR與待人源化的小鼠抗體的CDR的結(jié)構(gòu)相似度，從一組人種系的基因中選擇人FR序列。該方法在，例如美國(guó)專利序號(hào)6,881,557(Foote)和Tan等人(2002)J.IMMUNOL169:1119-1125中有所描述。其他減小免疫原性的方法包括用于產(chǎn)生人源化抗體的稱為為"改形，，、"高度嵌合(hyperchimerization)，，或"鑲飾(veneering)/重塑(resurfacing)"的技術(shù)。例如參見Vaswami等人(1998)ANNALSOFALLERGY,ASTHMA,&IMMUNOL.81:105;Roguska等人(1996)PR0T.ENGINEER9:895-904;以及美國(guó)專利序號(hào)6，072，035(Hardman)。在鑲飾/重塑方法中，小鼠抗體中接近表面的氨基酸殘基被在人抗體中相同位置處更頻繁出現(xiàn)的氨基酸殘基所取代。這種抗體重塑技術(shù)在，例如美國(guó)專利序號(hào)5,639,641(Pedersen)中有所描述。一種用于將小鼠抗體轉(zhuǎn)化成適于人類醫(yī)藥用途形式的示例性方法被稱為ACTIVMABTM技術(shù)(Vaccinex公司，Rochester,NY)，該技術(shù)涉及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)抗體的以痘苗病毒為基礎(chǔ)的載體。據(jù)稱，將產(chǎn)生免疫球蛋白重鏈和輕鏈的高水平的組合多樣性。例如參見美國(guó)專利序號(hào)6，706，477(Zauderer)、6，800，442(Zauderer)和6，872，518(Zauderer)。另一種用于將小鼠抗體轉(zhuǎn)化成適于人類使用的形式的示例性方法為由KaloBiosPharmaceuticals乂>司(PaloAlto，CA)商業(yè)化實(shí)施的技術(shù)。該技術(shù)涉及使用專有的人"受體"庫(kù)來產(chǎn)生用于進(jìn)行抗體篩選的"表位匯集"庫(kù)用于將小鼠抗體修飾成適于人類醫(yī)藥用途形式的另一種示例性方法為HUMANENGINEERING(服，)技術(shù)，該技術(shù)是由XOMA(US)LLC公司商業(yè)化實(shí)施。例如參見國(guó)際申請(qǐng)公開序號(hào)WO93/11794以及美國(guó)專利序號(hào)5，766，886、5,770,196、5，821，123和5，869，619。包括任何上述方法在內(nèi)的任何合適的方法都可以用于減小或消除目的結(jié)合蛋白質(zhì)的人免疫原性。此外，在小鼠中產(chǎn)生完整的人抗體是可能的。在該方法中，使用轉(zhuǎn)基因小鼠制備人抗體，所述轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生小鼠抗體的基因被產(chǎn)生人抗體的基因的實(shí)質(zhì)性部分所取代。這種小鼠產(chǎn)生了人免疫球蛋白分子而不產(chǎn)生小鼠免疫球蛋白分子。例如參見WO98/24893(Jacobovitz等人)和Mendez等人(1997)NATUREGENETICS15:146-156?？梢允褂靡韵路椒▉懋a(chǎn)生完整的人抗HGF的單克隆抗體。使用目的抗原(例如HGF)免疫含有人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。然后，從所述小鼠中獲得該小鼠的淋巴細(xì)胞，之后將其與骨髓類細(xì)胞系融合，從而制備永生化雜交瘤細(xì)胞系。篩選并選擇該雜交瘤細(xì)胞系，從而鑒定出產(chǎn)生HGF特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞系。根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合蛋白質(zhì)的目的用途，將該結(jié)合蛋白質(zhì)與其他分子綴合。例如，如果所述結(jié)合蛋白質(zhì)用作治療劑，則隨后將該結(jié)合蛋白質(zhì)與另一試劑(例如介導(dǎo)或另外促進(jìn)治療的效應(yīng)器分子)綴合。就所述的效應(yīng)器為非基于蛋白質(zhì)的試劑(例如小分子藥物、放射性標(biāo)簽或放射性毒素)的情況，那么可以使用標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)偶聯(lián)化學(xué)法將該試劑與所述結(jié)合蛋白質(zhì)化學(xué)偶聯(lián)。另一方面，如果所述的效應(yīng)器分子為蛋白質(zhì)或肽(例如酶、受體、毒素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子或其他免疫調(diào)節(jié)劑)，那么可以使用體內(nèi)偶聯(lián)化學(xué)法使所述結(jié)合蛋白質(zhì)與效應(yīng)器化學(xué)偶聯(lián)，或者可以使所述結(jié)合蛋白質(zhì)與效應(yīng)器偶聯(lián)形成融合蛋白質(zhì)?？梢允褂门c部分II中討論的方法相似的技術(shù)來構(gòu)建和表達(dá)融合蛋白質(zhì)。IV—結(jié)合蛋白質(zhì)的用途本文所述結(jié)合蛋白質(zhì)可以用作診斷劑或治療劑。(1)治療應(yīng)用由于本發(fā)明的結(jié)合蛋白質(zhì)中和HGF的活性，所以其可以用于多種治療應(yīng)用中。例如，本發(fā)明的某些結(jié)合蛋白質(zhì)可用于預(yù)防或治療高增殖疾病或紊亂(例如多種形式的癌癥)?？梢允褂盟鼋Y(jié)合蛋白質(zhì)來抑制或減少腫瘤細(xì)胞的增殖。在該方法中，將所述的腫瘤細(xì)胞暴露于治療有效量的結(jié)合蛋白質(zhì)中，從而抑制或減少腫瘤細(xì)胞的增殖。在某些實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)抑制腫瘤細(xì)胞增殖至少為50%、60%、70%、80%、90%、95°/?；?00%。在某些實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白質(zhì)用于抑制或減少腫瘤細(xì)胞的增殖，其中所述結(jié)合蛋白質(zhì)降低了hHGF與c-Met的結(jié)合能力。在其他實(shí)施方案中，即使在所述結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合hHGF但沒有實(shí)質(zhì)性地抑制hHGF與c-Met的結(jié)合時(shí)，所述結(jié)合蛋白質(zhì)用于抑制或減少腫瘤細(xì)胞的增殖，如表5和6中的抗體3B6所示。此外，所述結(jié)合蛋白質(zhì)可用于抑制或減慢哺乳動(dòng)物中腫瘤的生長(zhǎng)或發(fā)展。在該方法中，向哺乳動(dòng)物施用有效量的所述結(jié)合蛋白質(zhì)，從而抑制或減慢哺乳動(dòng)物中腫瘤的生長(zhǎng)。因此，所迷結(jié)合蛋白質(zhì)可用于治療，例如哺乳動(dòng)物中的腫瘤。所述方法包括向哺乳動(dòng)物施用治療有效量的所述結(jié)合蛋白質(zhì)。所述結(jié)合蛋白質(zhì)可以單獨(dú)施用或者與另一種藥物活性分子組合施用，以便治療肺瘤。包括本發(fā)明的結(jié)合蛋白質(zhì)可用于治療多種HGF應(yīng)答紊亂，包括例如肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、卵巢癌、頭頸癌、卵巢癌、多發(fā)性骨髓瘤、肝癌、胃癌、食道癌、腎癌、鼻咽癌、胰腺癌、間皮瘤、黑素瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的HGF應(yīng)答腫瘤細(xì)胞。如本文所用，"治療，，、"療法，，和"治療處理"是指對(duì)治療哺乳動(dòng)物(特別是人)中疾病狀態(tài)的的治療處理，包括(a)預(yù)防疾病狀態(tài)在哺乳動(dòng)物中發(fā)生，特別是在該哺乳動(dòng)物傾向于發(fā)生疾病狀態(tài)但是還沒有被診斷出具有該疾病狀態(tài)時(shí)；(b)抑制疾病狀態(tài)，即，停止疾病狀態(tài)的發(fā)展；和/或(c)減輕疾病狀態(tài)，即，使疾病狀態(tài)消退。總體而言，活性成分的治療有效量的范圍是約0.lmg/kg至約100mg/kg，任選地是約1mg/kg至約100mg/kg，任選地是約1mg/kg至10mg/kg。施用量取決于多種因素，例如待治療的疾病或適應(yīng)癥的類型和程度、具體患者的總體健康狀態(tài)、所遞送的結(jié)合蛋白質(zhì)的相對(duì)生物學(xué)效力、結(jié)合蛋白質(zhì)的劑型、劑型中賦形劑的存在和種類、以及施用途徑。為了快速達(dá)到所需的血液水平或組織水平，將初始施用劑量提高到最高水平的范圍以外，或者使初始施用劑量低于最佳劑量并在治療過程中根據(jù)具體的狀況使每日施用劑量逐漸增加。例如在經(jīng)設(shè)計(jì)由0.5mg/kg至20mg/kg范圍的常規(guī)的I期劑量遞增研究中，優(yōu)化人的劑量。用藥頻率根據(jù)諸如施用途徑、劑量和在治療的疾病狀態(tài)的因素而變化。示例性的用藥頻率為每天1次、每周1次和每2周1次。優(yōu)選的施用途徑為腸胃外施用，例如靜脈內(nèi)輸注?；趩慰寺】贵w的藥物的配制是本領(lǐng)域的普通技術(shù)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，將所述結(jié)合蛋白質(zhì)(例如單克隆抗體)凍干，并在施用時(shí)，將其在緩沖鹽水中重構(gòu)。所述結(jié)合蛋白質(zhì)可以單獨(dú)施用，或者與其他的藥物活性組分組合施用。所述的其他活性組分(例如免疫調(diào)節(jié)劑)可以與所述結(jié)合蛋白質(zhì)一起施用，或者可以在所述結(jié)合蛋白質(zhì)之前或之后施用。包含治療用途的結(jié)合蛋白質(zhì)的制劑通常含有與可藥用的載體組合的結(jié)合蛋白質(zhì)。如本文使用的，"可藥用的載體"是指緩沖劑、載體和賦形劑，在可靠的醫(yī)學(xué)判斷(soundmedicaljudgment)范圍內(nèi)，所述的緩沖劑、載體和賦形劑適用于與人和動(dòng)物組織相接觸而沒有過多的毒性、刺激、變態(tài)反應(yīng)或者其他問題或并發(fā)癥，與合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比相稱。從與制劑中其他組分相容的意義上說，所述的載體應(yīng)該是"可接受的"，并且對(duì)接受者是無害的。就這一點(diǎn)而言，可藥用的載體旨在包括任何及所有的與藥物施用方式相兼容的緩沖劑、溶劑、分散介質(zhì)、包衣、等滲和吸收延遲劑等。用于藥物活性物質(zhì)的這些介質(zhì)和試劑的使用是本領(lǐng)域已知的。所述的制劑可以方便地以劑量單位的形式存在，并且可以通過任何合適的方法(包括藥劑學(xué)領(lǐng)域中已知的任何方法)制備。應(yīng)該將本發(fā)明的藥物組合物制成與其計(jì)劃的施用途徑相兼容。施用途徑的實(shí)例包括腸胃外施用或非腸胃外施用，例如靜脈內(nèi)施用、皮內(nèi)施用、吸入施用、透皮施用(局部)、透粘膜施用和直腸施用。可以通過藥學(xué)領(lǐng)域中已知的任何方法(例如在Remington'sPharmaceuticalSciences:18thed.(MackPublishingCompany,1990)中所述的方法)制備用于口腔施用或腸胃外施用的溶液。適用于口腔施用的制劑為以下形式分離的單位，例如注射劑、膠嚢、明膠膠嚢、袋裝(sachet)、片劑、藥片或錠劑，每一種分離的單位中都含有預(yù)定量的結(jié)合蛋白質(zhì)；粉末或顆粒組合物；在水性液體或非水性液體中的溶液或懸浮液；水包油的乳液或油包水的乳液。適用于腸胃外施用的制劑包括，例如以下成分無菌稀釋液，例如用于注射的水、鹽水溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成的溶劑；抗菌劑，例如苯甲醇或羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞石危酸氫鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸；緩沖劑，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用于調(diào)節(jié)張力的試劑，例如氯化鈉或葡萄糖?？梢允褂盟峄驂A(例如鹽酸或氫氧化鈉)來調(diào)節(jié)pH。腸胃外施用的制備物可以被封裝在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多劑量的小瓶中。大體上，適用于注射用途的組合物包括水性溶液(在可溶于水的情況下)或分散液、以及用于即時(shí)制備無菌注射溶液或分散液的粉末。對(duì)于靜脈內(nèi)施用而言，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、CremophorELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩沖液(PBS)。其在生產(chǎn)和儲(chǔ)存的條件下應(yīng)該是穩(wěn)定的，并且應(yīng)該被保存起來以防止諸如細(xì)菌和真菌之類的微生物的污染。所述的載體可以是含有，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇)、以及它們的合適的混合物的溶劑或分散介質(zhì)。藥物制劑優(yōu)選為無菌的。例如通過無菌過濾膜的過濾進(jìn)行滅菌。在凍干所述組合物的情況下，可以在凍干和重構(gòu)之前或之后進(jìn)行使用了上述方法的滅菌。一旦配制成藥物組合物，其就可以以溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體或者脫水或凍干的粉末的形式儲(chǔ)存在，例如小瓶中。(2)診斷性應(yīng)用無論何時(shí)將所述結(jié)合蛋白用于體外或體內(nèi)的診斷，通常用可檢測(cè)的部分直接標(biāo)記或間接標(biāo)記該結(jié)合蛋白質(zhì)?？蓹z測(cè)的部分是能夠直接或間接產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)的任何部分。例如，可檢測(cè)的部分可以為放射性同位素，如3氫(3H)、14碳(14C)、32磷(32P)、35硫(35S)或125碘(1251);熒光化合物或化學(xué)發(fā)光化合物，如異疏氰酸熒光素、羅丹明或熒光素；酶，如堿性磷酸酶、P半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶；自旋探針，如自旋標(biāo)記；或有色顆粒，如乳膠或金顆粒。應(yīng)該理解，使用本領(lǐng)域中已知的多種方法(例如，在Hunter等人(1962)NATURE144:945;David等人(1974)BIOCHEMISTRY13:1014;Pain等人(1981)J.IMMUNOL.METH.40:219;以及Nygren(1982)J.HISTOCHEM.ANDCYTOCHEM.30:407中所述的方法)將結(jié)合蛋白質(zhì)與可檢測(cè)的部分綴合。通過例如目測(cè)或者通過分光光度計(jì)或其他檢測(cè)儀來檢測(cè)所述的標(biāo)記?？梢栽诒绢I(lǐng)域中可用的多種免疫分析法中使用所述結(jié)合蛋白質(zhì)。示例性的免疫分析法包括，例如夾心免疫分析法、竟?fàn)幮悦庖叻治龇ā⒚庖呓M化方法。在夾心免疫分析法中，使用了兩種與分析物或目的抗原結(jié)合的抗體，例如，其中一種抗體被固定到固體支持物上，而另一種抗體游離在溶液中并用可檢測(cè)的部分標(biāo)記。當(dāng)將含有抗原的樣品引入到該體系中時(shí)，該抗原既與固定化的抗體結(jié)合又與標(biāo)記的抗體結(jié)合，從而在支持物的表面上形成了"夾心"免疫復(fù)合物。通過洗去未結(jié)合的樣品成分和多余的標(biāo)記抗體來檢測(cè)復(fù)合的蛋白質(zhì)，并測(cè)定支持物表面上的蛋白質(zhì)復(fù)合的標(biāo)記抗體的量。備選地，通過用與游離抗體結(jié)合的可檢測(cè)部分標(biāo)記的第三抗體來檢測(cè)游離于溶液中的抗體。免疫學(xué)分析的設(shè)計(jì)、理論和方案的詳細(xì)綜述可以在許多文章中找到，包括Butt等人(1984)PRACTICALIMMUNOLOGY,MarcelDekker，NewYork;Harlow等人，編輯(1988)ANTIBODIES,ALABORATORYAPPROACH,ColdSpringHarborLaboratory;以及Diamandis等人，編輯(1996)IMMUNOASSAY,AcademicPress,Boston。本發(fā)明包括標(biāo)記的結(jié)合蛋白質(zhì)可以用作體內(nèi)的顯像劑，因此，結(jié)合蛋白質(zhì)將顯像劑靶向接受者體內(nèi)的目的特定組織。用于體內(nèi)顯像的優(yōu)選的遠(yuǎn)距離可檢測(cè)部分包括反射性原子锝—99mfmTc)，其為一種半衰期為約6小時(shí)的Y發(fā)射體。還可以在體內(nèi)顯像中使用的非放射性部分包括硝基氧自旋標(biāo)記、以及鑭系元素和過渡金屬離子，所有這些物質(zhì)都能夠誘導(dǎo)原位質(zhì)子弛豫。除了免疫顯像外，可以在標(biāo)準(zhǔn)的放射免疫治療方法中使用復(fù)合的放射性部分，從而破壞靶細(xì)胞。用于高劑量放射免疫治療的優(yōu)選的核苷酸包括放射性原子9。釔(，t)、131碘(1311)或m銦(mIn)?？梢允褂蔑@像領(lǐng)域中已知的偶聯(lián)技術(shù)，用131I、mIn和99mTc來標(biāo)記結(jié)合蛋白質(zhì)。類似的，用于制備和施用顯像劑以及捕獲和處理圖像的方法在顯像領(lǐng)域中是已知的，因此在本文中不再詳述。類似的，用于進(jìn)行基于抗體的免疫治療的方法在本領(lǐng)域中是已知的。例如參見美國(guó)專利序號(hào)5,534,254。在整個(gè)說明書中，當(dāng)將組合物描述成具有、包含或含有具體成分時(shí)，包括組合物也基本由所述的成分組成或由所述的成分組成。類似的，當(dāng)將方法描述成具有、包括或包含具體的處理步驟時(shí)，該方法也基本由所述的處理步驟組成或由所述的處理步驟組成。除非另作說明，否則步驟的次序或用于進(jìn)行某些操作的次序是不重要的，只要本發(fā)明可操作的即可。此外，除非另作說明，否則可以同時(shí)實(shí)施兩個(gè)或多個(gè)步驟或操作。實(shí)施例以下實(shí)施例討論了多種抗hHGF單克隆抗體的制備和特性。實(shí)施例l一抗hHGF的單克隆抗體的制備本實(shí)施例描述了一定量抗hHGF的單克隆抗體的制備。根據(jù)多位點(diǎn)重復(fù)免疫(RIMMS)方法，由MBS公司(Portland,ME)進(jìn)行免疫、融合和初篩。使用重組人HGF(R&DSystems,Minneapolis,MN;CatalogNo.294-HGN-025)免疫5只AJ小鼠和5只Balb/c小鼠。選擇在酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)中其血清顯示出最高抗HGF活性的2只小鼠用于隨后的融合。收集來自適合小鼠的脾和淋巴結(jié)。然后收集B細(xì)胞，并使其與骨髓瘤細(xì)胞系融合。在一個(gè)或多個(gè)平板上對(duì)融合產(chǎn)物進(jìn)行系列稀釋，直至接近成克隆性。通過ELISA，就結(jié)合hHGF對(duì)來自所得的融合物的上清液進(jìn)行篩選。被鑒定為包含針對(duì)HGF的抗體的上清液，通過如以下實(shí)施例所述的體內(nèi)功能測(cè)試進(jìn)一步表征。選擇一組雜交瘤，并對(duì)該雜交瘤亞克隆并擴(kuò)增。然后，通過在標(biāo)準(zhǔn)條件下，在ProteinA/G樹脂上的親和層析純化單克隆抗體。實(shí)施例2—抗hHGF的單克隆抗體的序列分析本實(shí)施例描述了實(shí)施例1中制備的抗hHGF的單克隆抗體的同種型和序列分析。a.HGF的鼠單克隆抗體同種型的測(cè)定使用IsoStripMouseMonoclonalAntibodyIsotyping試劑盒(RocheAppliedScience)，根據(jù)制造商提供的說明書測(cè)定每種單克隆抗體的輕鏈種類和重鏈的同種型。所有的抗體都被檢測(cè)出包含Kappa免疫球蛋白輕鏈和IgGl免疫球蛋白重鏈。b.編碼免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列的測(cè)使用RNeasyMiniprep試劑盒(QiagenVenlo，TheNetherlands)，根據(jù)制造商提供的說明書從每種單克隆雜交瘤細(xì)胞系中提取總RNA。使用BDSMARTRACEcDNAAmplification試劑盒(Clontech)，根據(jù)制造商提供的說明書，使用寡核苷酸引物BDSMARTIIA(5'aagcagtggtatcaacgcagagtacgcggg3')(SEQIDNO.85)和5'-RACECDS引物(5'tttttttttttttttttttttttttvn3、其中v=a、g或c而n=a、g、c或t)(SEQIDNO.86)生成全長(zhǎng)的第一鏈cDNA，以進(jìn)行5'RACE(cDNA末端快速擴(kuò)增)。使用ExpandHigh-FidelityPCRSystem(RocheAppliedScience),根據(jù)制造商提供的說明書通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來擴(kuò)增免疫球蛋白Kappa鏈的可變區(qū)和重鏈(IgGl)的可變區(qū)。使用5'寡核香酸引物混合物UniversalPrimerMixA(5'ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt3'(SEQIDNO.87)與5'ctaatacgactcactatagggc3'(SEQIDNO.88)的混合物)以及3'IgGl恒定區(qū)的特定引物(5'tatgcaaggcttacaaccaca3'(SEQIDNO.89)或5'gccagtggatagacagatgggggtgtcg3'(SEQIDNO.90))擴(kuò)增重鏈可變區(qū)。使用5'寡核苷酸引物混合物UniversalPrimerMixA和3'Kappa恒定區(qū)特定引物(5'cteattectgttgaagctcttgacaat3'(SEQIDNO.91)或5'cgactgaggcacctccagatgtt3'(SEQIDNO.92))擴(kuò)增Kappa鏈的可變區(qū)。通過瓊脂糖凝膠電泳分離單獨(dú)PCR產(chǎn)物，并使用QiaquickGelPurification試劑盒(Qiagen)，根據(jù)制造商提供的說明書進(jìn)行純化。隨后使用基于拓樸異構(gòu)酶的克隆試劑盒TOPOTACloning試劑盒(具有pCR2.l-T0P0⑧載體)(Invitrogen,Carlsbad,CA)，根據(jù)制造商提供的說明書將PCR產(chǎn)物克隆到pCR2.1T0P0質(zhì)粒中，并使用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化技術(shù)，將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5細(xì)菌中。由AgencourtBioscience公司使用標(biāo)準(zhǔn)的雙脫氧DNA測(cè)序方法，使用T7(5'TAATACGACTCACTATAGGG30(SEQIDNO.93)、M13正向引物(5'GTAAAACGACGGCCAGT30(SEQIDNO.94)和Ml3反向引物(5'CAGGAAACAGCTATGACC30(SEQIDNO.95)對(duì)由轉(zhuǎn)化的細(xì)菌克隆中分離的質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序，從而鑒定可變區(qū)序列的順序。利用VectorNTI軟件(Invitrogen，Carlsbad,CA)和IMGT/V-Quest網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器(http://imgt.cines.fr/textes/vquest)對(duì)所得序歹寸進(jìn)行分才斤，從而鑒定和驗(yàn)證可變區(qū)的序列。c.編碼1A3、1D3、1F3和2B8的Kappa以及IgGl鏈的免疫球蛋白重鏈和輕鏈恒定區(qū)序列的核苷酸序列的測(cè)定使用正向引物5'ttcc(劃線部分為起始密碼子)(SEQIDNO.96)和反向引物5'ggggaccactttgtacaagaaagctgggt^^tttaccaggagagtgggagagg3'(劃線部分為終止密碼子)(SEQIDNO.97)，從上述制備的cDNA中PCR擴(kuò)增1A3、1D3和1F3的IgGl鏈的全長(zhǎng)的cDNA。使用正向引物5'ttt(劃線部分為起始密碼子)(SEQIDNO.98)和反向引物5'線部分為終止密碼子)(SEQIDNO.99)，從上述制備的cDNA中擴(kuò)增2B8的IgGl鏈的全長(zhǎng)cDNA。使用正向引物5'ata3'(劃線部分為起始密碼子)(SEQIDNO.IOO)和反向引物5'(劃線部分為終止密碼子)(SEQIDNO.101)擴(kuò)增2B8的Kappa鏈的全長(zhǎng)的cDNA。通過GatewayBP重組反應(yīng)(Invitrogen，Carlsbad,CA)，將PCR片段亞克隆到pD0NR221(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，并的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，從而鑒定恒定區(qū)的序列，并進(jìn)一步驗(yàn)證可變區(qū)的序列。d.序列分析利用IMGT/V-QUEST網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器軟件(http:〃imgt.cines.fr/textes/vquest/)鑒定可變區(qū)(正常文本)。根據(jù)確認(rèn)位于測(cè)定的可變區(qū)的上游的閱讀框中的起始密碼子(ATG)來預(yù)測(cè)信號(hào)肽序列。鑒定信號(hào)肽序列并在其下標(biāo)記下劃線。每個(gè)可變區(qū)的最后一個(gè)核苷酸為由可變區(qū)/恒定區(qū)連接體所產(chǎn)生的下一個(gè)密碼子的第一個(gè)堿基。該核苷酸包含在可變區(qū)內(nèi)，這是因?yàn)槠錇橥怙@子的一部分。以下所列的恒定區(qū)的氨基酸序列包含該連接體密碼子的翻譯產(chǎn)物。為了產(chǎn)生完整的重鏈或kappa鏈抗體序列，以下標(biāo)注的可變區(qū)序列與其各自的恒定區(qū)序列結(jié)合(信號(hào)序列帶有下劃線)。(1)1A3重鏈可變區(qū)(SEQIDNO.1)1atgaactttgggctcagattgattttccttgtccttgttttaaaaggtgtgaagtp;tgaa61gtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgcagcctggagggtccctgaaactctcc121tgtgcagcctctgaattcactttcagtaactattacatgtcttgggttcgccagactcca181gagaagaggctgcagtgggtcgcatacattagtcctggtggtggtagctcctactatcca241gccagtgtgaagggtcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctg301caaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtattactgtgcaagacaaggggat361ggttactacggggactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcc421tcag(2)1A3Kappa輕鏈可變區(qū)(SEQIDNO.3)1atgagtgtgcccactcaggtcctggggttgctgctgctet浮cttacagatgccagatgt61gacatccagatgactcagtctccagcctccctatctgtttctgtgggagaaactgtcacc121atcacatgtcgagcaagtgagaatatttatagtaatttagcatggtatcagcagaaacag181ggaaaatctcctcagctcctggtctatgctgcaacaaacttagcagatggtgtgccatca241鄉(xiāng)ttcagtggcagtggatcaggcacacagttttccctcaagatcaacagcctgcagtct301gaagattttgggacttattactgtcaacatttttggggtactccgtacacgttcggaggg361gggaccaagctggaaataaaac(3)2B8重鏈可變區(qū)卿IDNO.11)1atgggatggag;ctatatcatcctctttttggtagcaacagctacagatgtccactcccag61gtccaactgcagcagcctggggctgaactggtgaagcctgggacttcaglgaagctgtcc121tgcaaggcttctggctacaccttcaccacctactggatgcactgggtgaatcagaggect181ggacaaggccttgagtggattggagagattaatcctaecaacggtcatactaactacaat24〗gagaagttcaagagcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatg301caactcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgtgcaagaaactatgtt361ggtagcatctttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctcag(4)2B8Kappa輕鏈可變區(qū)卿IDNO,13)3atggaatcacagactctggtcttcatatccatactgctctggttatatggtgctgatggg61aacattgtaatgacecaatctcccaaatccatgtccatgtcagtaggagagagggtcacc121ttgagctgcaaggccagtgagaatgtggtttcttatgtatcctggtatcaacagaaacca181gcgcagtctectaaactgctgatatacggggcatccaaccggaacactggggtccccgat241cgcttcacaggcagtggatctgcaacagatttcactctgaccatcagcagtgtgcgggct301gaagaccttgcagattatcactgtgggcagagttacaactatccgtacacgttcggaggg361gggaccaggctggaaataaaac(5)2F8重鏈可變區(qū)卿IDNO.21)1atggaatggagctgggtctttctcttcctcctgtcagtaactgcagg:tgtccactgccag61gtccagctgaagCagtctggagctgagctg魄aggcctgggacttoagtgaagatgtcc21tgcaaggcttctggctacaccttcactacctactatatacactgggtgaatcagaggect181ggacagggeettgagtggattggaaagattggtcctggaagtggtagtacttactacaat241gagatgttcaaagacaaggccacattgactgtagacacatcctccagcacagcctacatg301cagctcagcagcctgacatctg'acgactctgcggtotatttctgtgcaagaaggggactg361ggacgtggctttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctcag(6)2F8Kappa輕鏈可變區(qū)(SEQIDNO.23)1、atggagacagacacaatcctgctatgggtgctgctgctctgggttccapgctccactggt61gacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccacc121atctcctgcaaggccagccaaagtgttgattatgatggtaatagttatatcaactggtac181caacagaaaccaggacagccacccaaagtcctcatctatgttgcatccaatctagaatct241gggatcccagccaggtttagtggcagtgggtotgggacagacttcaccctcaacatccat301cctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcaaagtattgaggatcctccc361acgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaac(7)3B6重鏈可變區(qū)(SEQIDNO.31)1atggaatggccttptatctttctcttcctcctatcaetaaetgaaggtgtccactpq.cag61gttcagctgcagcagtctggggctgaactggtgaggcctgggtcctcagtgaagatttcc121tgcaaggcttctggctatgtattcagtagctactggatgaactgggtgaagcagaggcct181ggacagggtcttgagtggattggacagatttatcctggagatggtgatagtaactacaat241ggaaacttcaagggtaaagccacactgactgcagaeaaatcctccagtacagcctacatg301cagctcagcagcctaacatctgaggactctgcggtctatttctgtgcatcccagctcggg361ctacgtgagaactactttgactactggggceaaggcaccactctcacagtctcctcag(8)3B6Kappa輕鏈可變區(qū)(2個(gè)可能的ATG起始密碼子(大寫字母表示))(SEQIDNO.33)613aatgtga^catcaagatgacccagtctccatcttccatgtatgcatctctaggagagaga121gtcacaatcacttgcaaggcgagtcaggacattaaaagctatttaagctggttccagcag181aaaccagggaaatctcctaagaccctgatctatcgtgtaaacagattggtagatggggtc241ccatoaaggttcagtggcagtggatctgggcaagattcttctctcaccatcaccagcctg301gagaatgaagatatgggaatttattattgtctacagtatgatgagtttccgttcacgttc361ggaggggggaccaagctggaaataaagc(9)3D11重鏈可變區(qū)(SEQIDNO.41)1atggctgtcccggtgctgttcctctgcctggttgeatttccaagctgtgtcctgtcccag61gtacagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcact121tgcactgtctctgggttttcattaaccagctatagtttacactgggttcgccagcctcca181ggaaagggtctggaatggctgggagtaatatgggctggtggaaacacaaattataattcg241tctctcatgtccagactgaccatcaggaaagacaactccaagagccaagttttcttaaaa301atgaacagtctgcaaactgatgacacagccatgtactactgtgccagagagaggtttgct3'61tactggggccaagggactctggtcactgtctctgcag(10)3D11Kappa輕鏈可變區(qū)(SEQIDNO.43)1.atggattttcaagtacagattttoagcttcctgctaatcagtgcctcagtcaaaatatcc61卿,caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatatccaggggagaag121gtcaccatgacctgca魄ccagctcaagtgtaagttacatgcactggtaccagcagaag181tcaggcacctcccccaaaagatggatttatgacacatccaaactggcttctggagtccct241gctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactccctcacaatcagtagtatggag301gctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagtaacccactcacgttcggt361gctgggaccaagctggagctgaaac(11)1D3重鏈可變區(qū)(SEQIDNO.51)1atgaactttgggctcagattgattttccttgtccttettttaaaaggtgtgaagtgtgaa61gtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgcagcctggagggtccctgaaactctcc121tgtgcagcctctggattcactttcagtgactattacatgtcttgggttcgccagactcca181gagaagaggctggagtgggtcgcatacattagtagtggtggtggtagcacctactatcca241gacagtgtgaagggtcgattcaccatctcccgagacaatgccaagaacaccctgtacctg301c総tgagcagtetgaagtctgaggacacagccatatattactgtgtgagacaaggggat361ggttattacggggactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcatcgtctoc421tcag(12)1D3Kappa輕鏈可變區(qū)(SEQIDNO.53)1atgagt艦cccactcaggtcctggggttgctgctgctgtggctt織gatgtcagatgt61gacatccagatgactcagtctccagcctccctatctgtatctgtgggagaaactgtcacc121atcacatgtcgaacaa魄agaatatttacagtaatttagcgtggtatcagcagaaacag18ggaaaatctcctcagctcctaatctatgctgcaacaaacttagcagatggtgtgccatca241aggttcagtggcagtggatcaggcacacagttttccctcaggatcaacagcctgcagtct301gaagattttgggaggtattactgtcaacatttttgggggactccgtacacgttcggaggg361gggaccaaactggaaataaaac(13)1F3重鏈可變區(qū)卿IDNO.61)1atgaactttgggctcagattgattttccttgtccttgttttaaaaggtgtgaagtgtgag61gtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgcagtctggagggtccctgaaactctcc121tgtgcggcctctggattcactttcagtaactattt.catgtcltgggttcgccagactcca181gagaagaggctggagtgggtcgcatatattagtagtggtggtggtagcacctactatcca24〗gacagtgtgaagggtcgattcaccatctctagagacaatgccaagaacaccctgtacctg301caaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtattactgtgtaagaeaaggggat36]ggttactacggggactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcc421tcag(14)1F3Kappa輕鏈可變區(qū)(SEQIDNO.63)1atgagtgtgcccactcaggtcctggggttgctgctgctgtggcttacagatgccagatgt61gacatccagatgactcagtctccagcctccctatctgtatctgtgggagaaactgtcacc121atcacatgtcgagcaagtgagaatatttacagtaatttagcatggtatcagcagaaacag181ggaaaatctcctcagctcctggtctatgatgcaacacacttaccagatggtgtgccatca241aggttcagtggcagtggatcaggcacacagttttccctcaagatcaacagcctgcagtct301gaagattttgggagttatta)ctgtcaacatttttggggtactccgtacacgtttggaggg361gggaccagactggaaattaaac(15)3A12重鏈可變區(qū)卿IDNO.71)1atgaacfflgggctcagattgattttccttgtccttgttttaaaaggtgtgaagtgtgaa61gtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgcagcctggagggtccctgaaaatctcc121tgtgcagcctctggatttactttcagtaactatttcatgtcttgggttcgccagactcca181gagaagaggctggagtgggtcgcatacattagtagtggtggtggtagcacctactatcca241gacagtgtgaagggtcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctg301caaatgaacagtctgaagtctgaggacacagccatgtattactgtgtaagacaaggagat361ggttactatggggactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcc、S421tcag(16)3A12Kappa輕鏈可變區(qū)(SEQIDNO.73)〗atgagtgtgcccactcaggtcctggggttgctgctgctgtggcttacagatgccagatgt61gacatccagatgactcagtcgccagcctccctatctgtatctgtgggagaaactgtcaec121atcacatgtcgagcaagtgagaatatttacattaatttagcatggtatcagcagaaacag181ggaaaatetcctcagctcctggtocatgctgcaacaaagttagcagatggtgtgccatca241aggttcagtggcagtggatcaggcacacagtattccctcaagatcaacagcctgcagtct301gaagattttgggagttattactgtcaacattntggggtactccgtacacgttcggaggg361gggaccaaactagaaataaaac(17)參照小鼠IgGl重鏈恒定區(qū)(J00453)(SEQIDNO.81)1ccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgccc幼actaact61ccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacct121ggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctggagtctgacc181tctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagccctcggcccagcgagaccgtca241cctgcaacgttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaattgtgcccaggg301attgtggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatcttcc361ccccaaagcccaaggatgtgetcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtgg421tagacatcagcaaggatgatcccgaggtceagttcagctggtttgtagatgatgtggagg481tgcacacagctcagacgcaaccccgggaggagcagttcaacagcactttccgcteagtca541gtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggtca601aca魄cagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggcagaccga661aggctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtca721gtctgacctgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcagtgga781atgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatgaacacgaatggctctt841acttc沐tacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttca901cctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccact961ctcctggtaaatga(18)1A3、1D3、1F3和2B8的測(cè)定的小鼠IgGl重鏈恒定區(qū)(衍生自AJ系小鼠)卿IDNO.82)1ccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaact61ccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacct121ggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtctgacc18〗tctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcxcagcgagaccgtca241cctgcaacgttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaattgtgcccaggg301attgtggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatcttcc361ccccaaagcccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtgg421tagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggagg481tgcacacagctoagacgcaaccccggg鄉(xiāng)agcagttcaacagcactttccgctcagtca541gtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggtca601acagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggcagaccga661aggctccacaggtgtacaccattccacctccca鄉(xiāng)agcagatggccaaggataaagtca721gtctgacctgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcagtgga781atgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggetctt841acttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttca901cctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccact961ctcctggtaaatga(19)參照小鼠Kappa輕鏈恒定區(qū)(V00807)以及1D3、1F3和2B8的測(cè)定的小鼠Kappa輕鏈恒定區(qū)(衍生自AJ系小鼠)(SEQIDNO.83)1gggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctg61gaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagt121ggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggaca181gcaaagacagcacctacagcatgagcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaac241gacataacagctatacctgtgaggccaetcacaagacatcaacttcacccattgtcaaga301gcttcaacaggaatgagtgttag(20)與1D3、1F3和2B8的情況相比含有1個(gè)改變的核苷酸(用下劃線表示)的，1A3的測(cè)定的小鼠Kappa輕鏈恒定區(qū)(SEQIDNO.84)1gggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctg61gaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagt121ggaagattgatggca魄aacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggaca181gcaaagacagcacctacagcatgagcagcaccctca^gttgaccaaggacgagtatgaac241gacataacagctatacctgtgaggccactc,acaagacatcaacttcacccattgtcaaga301gcttcaacaggaatgagtgttag限定實(shí)施例1所制備的抗體的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的每個(gè)氨基酸序列都列于圖2中。每個(gè)序列都與其他序列比對(duì)，并且在方框中確定了限定信號(hào)肽、CDR,、CDR2和CDR3的序列。圖3顯示了每個(gè)抗體的、單獨(dú)的CDR,、CDR2和CDR3的比對(duì)。限定了實(shí)施例1所制備的每個(gè)抗體的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的每個(gè)氨基酸序列都列于圖4中。每個(gè)序列都與其他序列比對(duì)，并且在方框中確定了限定信號(hào)肽、CDRi、CDR2和CDR3的序列。圖5現(xiàn)實(shí)了用于每個(gè)抗體的、單獨(dú)的CDRi、CDR2和CDR3的排列。為了方便，表1提供了本實(shí)施例中所討論的抗體序列與序列表中列出的那些序列之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系的索引表。表1_<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>此外，為了方便，以下序列代表了本實(shí)施例所述的每個(gè)抗體的實(shí)際的或者預(yù)計(jì)的全長(zhǎng)重鏈序列和輕鏈序列(即，包含可變區(qū)序列和恒定區(qū)序列二者)。注意，小鼠抗體2F8、3A12、3B6和3D11的恒定區(qū)沒有測(cè)序，但是假定它們包含與1D3、1F3和2B8抗體(其經(jīng)過測(cè)序)相同的恒定區(qū)序列，這是因?yàn)樗鼈兌佳苌訟J系小鼠。但是，應(yīng)該理定區(qū)序列中的每一個(gè)序列連接，從而產(chǎn)生有活性的全長(zhǎng)免疫球蛋白重鏈和輕鏈。(1)編碼全長(zhǎng)1A3會(huì)鏈序列(1A3重鏈可變區(qū)和IgGl恒宕區(qū))的枋酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SFi)IDNO.122)61121181241301361421481541601"1721781841901961102110811141120113211381atgaactttgggrctca卵ttgattttccttgtccttgttttaaaaggtgtgaagtgtgaatgtgca_gcctgccagtgtgaggttactacgscctgga^ctgacc仁ctacaagggattgtgttccccccaagtcagtgaacgtcaacagtgccgaaggctcgtcagtctgattcscctgctcacrtctcctgtggagtctggctga^ttcsctgcsgtgggtagggtcgattgtctg貼gtcgggactatgccgaca^ccccctgaccctgggctggatccctgttgtaagccagcccaaggratc&gc貼ggaLcagctcagacttcccstcatca^gctttccccctgc3tgatctgtgttacsgtaaatgacgcatacattC3ccatctcctgaggacacatatggactacatctgtctatgtccagcggtctcagrtgactcccggccagcttgcatatgttgtgc:tcaccgcaaccccgggcaccagg汰ctgcccccatcaacagacttcgctcaatgtgtgagggcctgrgtgcagcctgtattacatgtagtcctggtggccatgtatttggggtcaeigccactggrcccgtcccctcca^acagtcccagattactctgagsggagcag仁tggctcaatgcc仁cccaaggttccctgaagaacactcetgccttgggttcggtggtagctcrax:tgtgc:aagctggEttctgctccctgagcctcccagctgtgcacctggccctcctaaggtgctggtttgtgc貼ggagttacattactgtccatceitggasctgggaggcccagactccactactatccacctgtacctgcaccgtctcccctgcagtctcagcgagacctgtcttcatccacgtgtgttc貼atgcaggcacagatggcgagcctctcc(2)限定了全長(zhǎng)1A3重鏈序列(1A3重鏈可變區(qū)和IgGl恒定區(qū))的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEOIDNO.123)1evcjlvesggg121ssakttppsv181sdlytlsssv241ifppkpkdvl301svselpimhg361kvsltcmitci421tftcBvlhegsrdnaknt工ytvpsstwpsetitltpkvtcffpeditvewlhnhhteksllqmsslksedtnsmrvtlgclrvnsaafpapqwngqpaenyshspgkvkgyfpepvtsstkvdkkivevgfswfvddiektisktkgkntqpimdtdpekrlqwvaydgyygdyatndvtwnsgslssrpkapqvytigsyfvysklnywgggtsvtvgvhtfpavlqctvpevssvfreegfnstfr(3)編碼全長(zhǎng)1A3輕鏈序列(1A3Kappa可變區(qū)和恒定區(qū))的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEOIDNO.124)1atgagtgtgcccactcaggtcctggggttgctgctgctgtgrgcttacagatgccagatgt61gaca^tccsgai121atcacsitgtc:181ggaaaatctc241aggttcagtg30工g沃aga仁tttg"361gggaccaagc421tccagtgagc481cccaaagaca541aacagttgga501ttgaccaagg661tcaacttcactgactcagtcctc&gctcctccetttgtc的tccagcctccggtctatgctctgtcaacattggaggtgccgtggaagattgagcttc貼cctatctgtttttttccctcattttggggtagctgcaLCcaagatggcasrtgagcsicctacaagctatacctctgtgggagacatggtatcactccgtacacctgt這tccatgcatgagcaggttagasctgtcaccgcagraa^cagtgtgccatcscctgcagtctgttcggagggcttcccaccatggcgtcctgcaccctcstgtcacaagaca(4)限定了全長(zhǎng)1A3輕鏈序列(1A3Kappa可變區(qū)和恒定區(qū))的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SE0IDNO.125)1diqmtqspaslsv"svgetvtitc:raseriiysnlawyggkcjg)cspqlivyaatnladgvps61rfsgsgsgtgfslkin曰lqsedfgtyycqhfwgtpytfgrggtkleikradaaptvsifpp121ssegltsggaswcflnnfypkdinvkwkidgsergngvlnswtdqdskdstysmsstlm181ltkdeyerhnsy仁ceathktstspivicsfiirnec(5)編碼全長(zhǎng)2B8重鏈序列(2B8重鏈可變區(qū)和IgGl恒定區(qū))的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEOIDNO.126)atgggatggagctata匕catcctctttttggtagcaacagctacagatgtccactcccagSI1211812413013S142148154160165172178:18419019611021108111411201工2S113211381gtccaactgctgcaaggcttggtagcatctggatccctgtctgsgceigctgttgcccscctgtaagcc仁tcccaaggatgagcaaggatggctcagacgccccatcatgcgctttccctgcaggtgtacatgcatgata_accagcggsgagtgtt3catgagcagcctggctggctacacttgagtggatagagcaaggcgcctgacatcttgactactgctgtctatccgcctgg仁caacagtgactgtgcatatgtactgctcaccatatcccgaggtaaccccgggaccccdatcgaccattccaccca_gacttcttcttcaccacctggagagratttgaggactctgggccaaggcactggcccctgggcta仁ttcgcax;acct:仁ccccctccsgccaccaaggtgtactctgactccagttcagcggagcagttcgctcaatggcgaaaaccatctcccaaiggagccctgaagaccactcagcccga^gagcaacgtgaagcctgtactggatgcgcgg仁ctattggatctgctgcctgagccagccagctgtccacctggcccagtatcatctgcctaaggtcatggtttgta^gaaggagttcacagatggccaattactgtggacggtcataccctccagcacactgtgcaagcagtctcctctgaca_gtgsctgc3gtctg3gcgagsccgtttgtgcccagtcttcaXcttcgtgtgttgttccgctcagtaaggcag^ccagtggcag匕ggcctctcccagasgctgtcctcagaggcctt汪actaGaatagcctacsitgagccaaa^cgctgg貼ctctcctctacactcacctgc貼cggattgtggtcccccca^agggtagacatcggtgcacacagaatgggcagttacttcgtccacctgctctctctcctggt(6)限定了全長(zhǎng)2B8重鏈序列(2B8重鏈可變區(qū)和IgGl恒定區(qū))的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEOIDNO.127)1qvglqqpgaelvkpgtsvkl61nekfkskatltvdkssstay121ttppsvyplapgsaaqtnsm181tlsssvtvpsstwpsetvtc241kpkdvltitltpkvtcvwdrnqlssltsedvtlgclvkgyiskddpevgftywmhwvngrsavyycamyfpepvtvtwnvdkkivprdcswfvddvevhpgqglewigesgslssgvhtgckpcictvpirxptnghtnygttltvssakfpavlqsdlyevssvfifppfnstfrsvse301lpi油gdw工iigkefkcrvnsaafpapiektisktkgrpkapqvytipppkeqmak:dkvsl361tcmitdlffped土tvewqwxigqpaenykntgpimdtdgrsyfvysklnvgksnweagntftc421svlhegllinhhtekslshspgk(7)編碼全長(zhǎng)2B8輕鏈序列(2B8Kappa輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū))的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SE0IDNO.128)atggaatcacagactc:匕ggtcttcatatccatactgctctggttatatggtgctgatggg61^c&ttg"taa121ttgagctgca181gcgcagtctc241cgcttcacag301g犯g3ccttg361gggr3CC￡ig*gc481cccaaagaca541aacagttgga601ttg3c:ca_agg661tcaacttcacctaaactgctgcagtggatccagattatcactgatcaggatcccaaatccgaatgtggttgataitacgggacgggctgattggaggtgcc3cgacataacatgtccatgttcttatgtatgca_tccaaccttcactctgagctgcax:caatcagtcgtgtgstggcagtgagctatacctagg貼仁gagt的aax:ax:tggccatcagcagctgtatccatgcttcttgaagcatgagcaggtgagrgccacgttagggtccccgattgtgcgggctgttcggsgggcaacttctaccaccctcscg(8)限定了全長(zhǎng)2B8輕鏈序列(2B8Kappa可變區(qū)和恒定區(qū))的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEOIDNO.129)1nivmtqspksmsmsvgervtlsckasenwsyvswyq;qkpagspklliygasnrntgvpd61rftgsgsatdftltissvraedladyhcgqsynypytfgggtrleikradaaptvsifpp121ssegltsggaswcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnsw仁dqdskdstysmsstlt181ltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec(9)編碼全長(zhǎng)2F8f鏈序列(2F8重鏈可變區(qū)和IgGl恒定區(qū))的核121tgcsaggctt181241gagatgttca301cagctcagcagg^Lcgtggct4213cacccccat481accct:ggrgrat:541601ctgagcagct"1gttgcccacc721tgt33gcctt781cccaagrgatg841501gctcagacgc■S611021gctttccctg10811141120112611321grtgttacatg138igctggg匕ctt仁ctcttcctcctgtc:agtaactgcaggtgtccactgccagctggctacacttgagtggatgcctgracatcttgactactgctgtctatccgcctggtcaaccagcggtgtcagtgactgtcggccagcagatcccgaiggtaccagrgactgccsttccaccagctgagctgtggaaagattcacattgacttgracgactctgggcca^ggcactggcccctgggctatttccccctccagctactctgactggagcagttcgctcaatggcactacaagaacactcagccctcaatgtgcagaagagcaacagggcctgcacaacca_ccatgtgaggcctgggtcctggaagtagacacatgcggtct&ttggatctgctgcctgag"ccagccsgctgtccacctgg"cccagtatcatctgc:ctaag"g仁caaaggagt:tcacagatggccaatcatggacatgggaggrcagactg沃g貼gacctccagcactctgtgcaagcagtctcctctgacag"tgactgc3gtctg3gcgagaccgtttgtgcccagtcttca_tcttcgtgrtgttgttccgctcagtsatgcagggtagtggcagtgcaga仁ggctcgcctctcccasgcct3C3tgctggaactctcacctgcaacggattgtggtcagtgaeict:tcsgtctg5Lcccacctgctctctctcctggt(10)限定了全長(zhǎng)2F8重鏈序列(2F8重鏈可變區(qū)和IgGl恒定區(qū))的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SE0IDNO.131)1qyqlkqsgae121ttppsvypla181tlsssvtvps241]cpkcivltitl301lpimhgdwln361tcmitdffpe421svlheglhrihlvrpgtsvkmtvdtssstaystwpsetvtcgkefkc:rvnsditvewqvmgsckasgytftmglssltsddvtlgclvkgynvahpasstkaafpapiektqpaenykntqtyyihwvnqrsavyfcarrgfpepvtvtvmvdkkivprdcisktkgrpkapimdtdgsyfpgqglewigklgrgfdywgcjsgslssgvhtgckpcictvptagtqpreeqpgvytipppkvyskl:nvqksgttltvssaJcfpavlqsd工yevssvfifppfnstfrsvseeqmakdkvslnweagntftc(11)編碼全長(zhǎng)2F8輕鏈序列(2F8Kappa可變區(qū)和恒定區(qū))的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEOIDNO.132)atggagacagacacraa匕cctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggctccactggt611211812413013S1421481541G6工gacattgtgcatctcctgcagggatcccagcctg匕gg3ggatcttcccacaatggcgtcctgacccaatcaggccagcc5Lctgggaccaacatccagtgatgaacagttg:cgttgaccaa匕ccagcttcttggcagtggggctggagc仁gcatcaatgtcgactgatcagggacgagtatscccattgtctatgatggtatctgggacag站ax;gggctgtctggaggtgttgcstccaaSCttC3CCCtaaagtattgaatgctgcacccctcagtcgtttga^tggcagracagctatacacagrgaatgagagggccsccggstcctcccgtgcttcttggtgttag(12)限定了全長(zhǎng)2F8輕鏈序列(2F8Kappa可變區(qū)和恒定區(qū))的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEOIDNO.133)1divltqspaslavslggratisckasgsvdydgnsyinwyqqkpgqppkvliyvaanles61giparfsgsgrsgtdftlnihpveeedaatyycqqsiedpptfgagtklelkxadaaptvs121ifppssegltsggaswcflnnfypkdinvkwkidgserqngvliiswtdqdskdstysms181stltltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec'(13)編碼全長(zhǎng)3B6重鏈序列(3B6重鏈可變區(qū)和IgGl恒定區(qū))的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEOIDNO.134)1atggaatggccttgtatctttctcttcctcctgtc叫taactg站ggtgtccactcccag61Ftcagctgcagcagtctggggctgaactggtgaggcctgggtcctcagtgaagatttcc121tgcaaggcttctggctatgtattcagtagctactggatgaactgggtgaagcagaggcct181ggacagggtcttgagtggattggacagatttatcctggagatgrgtgatagtaactacaat241301361421481541SOI661721781841901361102110811141126113211381tacactctgatgcaacgttgtg仁ggttgtagacatcagcaagtgcagcttgctccacaggttcgtctacatgc仁ctgtgtcctggt3貼tcccceitctgtcccacccggcagrgatgtgctaggatgatcctcatgcaccatccctgcccctgataacagacacactgacttgaggactctctatcc3Ctgggtcasgggcgactgrtccccatgtacagtccgaggtccagggactggctctccacctccccttcttccctcctgcacaacgcggtct汰ttgcccctggattatttccctgttcagctggtaccatctccaagcaactgggcctccagtactctgtgcatcctctcacagtctgctgcccaagccagtgacctgtcctgcaggcccagcgacatctgtcttaggtcscgrtgttgtagatgaagttcaaatgctgtgrsragtgagaagagcctccsgctcgggctcctcagccaactaactccagtgacctggg仁ctg"acctcgaccgtcsccgcccsigggatca^tcttcccctg仁tgtggtatgtgrgaggtgcagaccgaagctcccactct(14)限定了全長(zhǎng)3B6重鏈序列(3B6重鏈可變區(qū)和IgGl恒定區(qū))的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEQIDNO.135)1qvqlqqsg^elvrpgssvkisckasgyvfssyvminwvkqrpggglewigqiypgdgdsny61ngnfkgkatltadkssstayTnqlss工tsedsavyfcasglglrenyfdywgq;g仁tltvss121akttppsvyplapgsaaqtrisnrvt工gclvk:gyfpepvtvtwnsgslssgvht,fpavlgsd181lytlsssvtvpssfwpsetvtcnvahpasst3cvdkkivprdcgckpcictvpevssvfif241ppkpkcivltitltpkvtcvvvdiskcidpev*qfswfvddvevhtaqtqpreegfiistfrsv301selpimhgdwlngkefkcrvnsaafpapiektisktkgarpJc&pgvytipppkeqraakdkv361sltcmitciffpedi仁vewqwngqpaenyJcntqpimdtdgsyfvysJc工nvgksnweagntf421tcsvlheglhnhlitekslsh叩gk(15)編碼全長(zhǎng)3B6輕鏈序列(3B6Kappa可變區(qū)和恒定區(qū))的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEQIDNO.136)JVTGgacATGaggacccc仁gc仁cagtt仁cttggaatc仁仁ffttgctctggtttccaggtatc161121181241301361421481541601gagaatgaagcc￡iccatcc3ttctaccccsctcacgttgacttgcaaggctcagtggcaggtgagcagttcttcacccatccagtctccagaccc仁gatctggatctgggttattattgttgtc站gtgggtatgaacgaatt站貼gcttatcgtgtaacaagattcttggtgccteagcata^cagctttcaacaggaatgcatctctatgagtttcctcgtgtgcttgcsgtgaacggttccagcaggttcacgttcacaaaatggc的ccactC3Cg(16)限定了全長(zhǎng)3B6輕鏈序列(3B6Kappa可變區(qū)和恒定區(qū))的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEQIDNO,137)工dikmtq印ssmyaslgervtitckasqdiksylswfqqkpgk，ktliy^vm:"d^psS1rfdssltitsienedmgiyyclqydefpftfgggftklwla:"aaptvs:^^121SseqlLggaswcflnnfypkdinvkv/kidgsergngvlnswtdqdskdstysmsstlt181ltkdeyerhnsytceat歐stspivksfnmec(17)編碼全長(zhǎng)3D11重鏈序列(3D11重鏈可變區(qū)和IgGl恒定區(qū))的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEQIDN0.138)atggctgtcccggtgctgttcctctgcctggttgcatttccaagctgtgtcctgtcccag61121181241301361《21481541SOI"1721781841901961102110811141120112611321ggr站agggtctctctca仁gttnctggggcctatccactggggtgtgcacatgtacagtccaccattactcgactggctcattcttccctgctgggttttccccctggatcatttccctgaccttcccagcccagcacc仁gtcagctggttag"cccatcat:acctggcctgggtcsc仁gtc仁g"c仁gcccaa匕gtcctgcagatctgtcttcggtcacgtgtcactttccgcgttcaaatgcggccaagga仁tgtggagtgggtggcgcccttatagtttacatgtactacttctgcagccaaccgrtcacctatcttcccccgtt;gtggtsgtcag仁cag仁gagggtcsiacaggctcttactactgggttcggtgccagagatggtgsccctactctggatcacactctgaggcaacgttgcca^agccc幼ac3csgctcaaac匕tcccatgtgrcagctttctccacaggtgg*cagecagetcgrtctacaggc仁ctgt:gttccagcctccacccatctgtc:gggatgcctgcctgtccsgcceigctcagtgccacccggccggatgtg"ctcggatgatcccgacgcaacccC3tgcacc3gccctgcccccgtacaccattggregaactacca^gctcsatacatgagggc3(18)限定了全長(zhǎng)3D11重鏈序列(3Dll重鏈可變區(qū)和IgGl恒定區(qū))的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEOIDNO.139)1qvqlkesgpglvapsgslsitctvsgfs,ltsyslhwv:rqp61sslmsrlti:rkdnsksqvflkmnslqtddtamyyca:rerf121vyplapgsaaq;tnsnivtlgclvkgyfpepv仁vtwnsgsls181vtvpsstwpsetvtcnvahpasstkvdkkivprdcgckpc2"ltitltpkvtcvwdiskddpevqfswfvddvevhtagtq301gdwlngkefkc:rvnsaafpapiektisktlcgrpkapqyyt361dffpeditvewqwngqpaenykntqpimdtdgr曰yfvy曰kl421glhnhhtekslshspgkpgkglewlgvaywgqgtlvt:ictvpevssvipppkeqmsiknvqksnw的giwaggntnynvsaakttppsgsdlytlsssfifppkp)cdvz:svselpimhdkvsltcmitn仁ftcsvlhe(19)編碼全長(zhǎng)3D11輕鏈序列(3D11Kappa可變區(qū)和恒定區(qū))的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEOIDNO.140)1g^SgJL^ttt:caagrtgeagattttca^cttcctgetaateagtgcctcacft61a^aggacaaa121gtc汪ccstg^181tcaggcacct241gctcgcttca301gctgaagatgr361gctgggacca481taccccaaagS41ctgaacagtt661acatc貼cttcaaaatatccttgttctcaccctgcagtgcccccc￡i￡ia_aggtggcagtggctgccacttsgguctgratcaaggacgagrtacacccattgtgrtctgggaccttactgccagatctggaggttg貼cgacatca沃g3gcttctcttetctcccgatgetgeaegcctcsgtcgCtgcatatcctgcactggtaaactggcttcgtaacccax:ttgtgcttcttagtgttagccagcagaagtggagtccctcacgttcggtg站caacttc(20)限定了全長(zhǎng)3D11輕鏈序列(3D11Kappa可變區(qū)和恒定區(qū))的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEOIDNO.141)1givltqspaimsaypgekvtmtcsasssvsymhwygqksgtspkrwiydtsklasgvpar61fsgsgsgtsysltissmeaedaatyycgqw.ssxipltfgagtklelkradaaptvsifpps121seqltsggraswcflnnfypJcdinvJcwkidgsergngvlnswtdgds3cdstysmsstltl18工tkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec(21)編碼全長(zhǎng)1D3重鏈序列(1D3重鏈可變區(qū)和IgGl恒定區(qū))的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEQIDNO.142)atgaactttgggctcagatt:gattttccttgtccttgttttaaaaggtgtgaagrtgtgaa61gtgcagctgg121tgtgcagcct181ga_ga_a_ga_ggc241gacagtgtga301caaa仁gagca361ggttattacg481a_actccatgg541acctggs3ct601gacctctaca661gtcacctgca721aggga11gtg781ttcccccca^841gtgrg仁agaca301gaggtgcaca961gtcagtga^c1021gtcaacagtg1081ccgaaggctc1141gtcagtctga1201Cggaatgggc1261tcttacttcg1321仁tcscctgct1381cax:tctcctgtggagtctggtggagtgggtgggactstgctgaccctgggctggatccctacgttgcccagttgtaagcc仁tccca仁catcagctttccccacaggtgtacctgcatgattctacagcaactgtgt匕acatttcagtgaccacc3仁ctcctStggactac3tctgtc仁ateitgcctggtcgtccagcggtccc的cca^gcttgcatatgt仁gtgctc:accgcaaccccggtgcccccatcagta_gtggtgtggggtcaagccactggcccgtcccctccaacsgtcccag"eittactctgagraggagcagttggctca^tgcctccca^gggagggtccctcttgggttcggtggtagcacctgg3tctgctccatgeigcctcccagctgtaagtatcatcctcctaaggtgctggtttgtacattactgtgaaactctccccagactccactactatccacctgtacctgcatcgrtctcccctgcagtctcagcgagaccaattgtgccctgtcttcatccscgtgtgtttttccgctcaggagtggcaggagcctctcc(22)限定了全長(zhǎng)1D3重鏈序列(1D3重鏈可變區(qū)和Ig,Gl恒定區(qū))的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEQIDNO.143)1evq[lves的g"lvqpggslJclscaasgrftfsdyymswirgtpekrlewvayissgggstyy61pdsvkgrftisrdnakntlylgmsslksedtaiyycvz*ggdgyygciyarodywgggtsviv121ssakttppsvyplapgsaagtnsmvtlgclvkgyfpepvtvtvmsgslssgvhtfpavlg181sdlytlsssvtvpsstwpsetvtcnvahpasstkvdkkivprdcgckpcictvpevssvf241ifppkpkdvltitltpkvtcvwdiskcidpevgfswfvddvevhtagtqpreecjfiastfr301svselpimhg;dwlngkef)ccrvns站fpap丄eJctisktkgrpkapqvytipppkeqmakd361)cvsltcmitdffpeditvewqwngqpaenykntqpimdtdgsyfvysklnvgksnweagn(23)編碼全長(zhǎng)1D3輕鏈序列(1D3Kappa可變區(qū)和恒定區(qū))的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEQIDNO.144)1atgagtgtgcccactcaggtcctggggttgctgctgctgtggcttacagatgtcagatgt61gacatccaga仁gactcagtc仁ccagcctcc121atcacatgtcgaacaagtgagaatatttac181ggaaaatctcctcagctcctastctatgct241aggttcagtggcagtggatcaggcacacag301gaagat仁ttgggaggtattactgtcaacat361gggaccaaactggaeataaaacgggctgat421tccagtgagca_gtta^ca_tct的aggtgcc481ccca貼gacatcaatgtcaagtggaagattS41aacagttggactgatcaggacagcaaagac601ttgaccssggacgeigtatgaacgacstaac661tcaacttcacccattgtcaagagcttcaacctatctgtatagtaatttaggcaacsaactttttccctc&ttttgggggagctgcaccaatcagtcgtgt&gctata>cctcgtggt3tcatagcagatggctccgtscacctgtatccatgcttcttgaagtgaggccacaactgtcacccctgcsgtctgttcggagggtggcgtcctg(24)限定了全長(zhǎng)1D3輕鏈序列(1D3Kappa可變區(qū)和恒定區(qū))的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEQIDNO.145)1diqmtgspaslsvsvgretvtitcrtseniysnlawyqgkqgkspqlliyaatnladgvps61rfsgsgsgtqfslrinslqsedfgryycqhfwgtpytfgggtkleikradaaptvsifpp121sseqltsggaswcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnswtdqdskdstysmsstlt181ltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec(25)編碼全長(zhǎng)1F3重鏈序列(1F3重鏈可變區(qū)和IgGl恒定區(qū))的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEQIDNO，146)a^g"aact:ttgg^ctcagattgattttccttgtccttgttttaaaaggtgtgaagtgtgag611211812413013614214815416016617217818419019611021108111411201126113211381gtgcagctgggscagtgt:ga貼ctccatggacctggraactgtcacctgrcaagggattgtgttccccccsagtggrtagacagaggtgcacagtc站cagtgccgaagrgctcgtcagtctgstggaatgggctcttacttcgttcacctgctcsctctcctgtggsgtctgggggaggcttsctggattcactttcagtaacagrggtcg3tt:caccatctctgtctgaag仁ctgaggacacacgsca^ccccctgaccctggggttgtaagcctcagcaaggacsgctcagaccagctttccccc仁gcatgatagccagcggactgtgttacaatctgtctatgtccagcggtctcagtg^ctcccggccagcttgcattatgt仁gtgctcacctgeitcccga^ggcaaccccggtgccccca/tccaccattccaa^LCagacttcgctcaa_tgtgg"tgcagtctgtatttcatgt:ccactggcccgtgcacacctgtcccc仁ccaacagtcccaggtc"gttcagaggagcsgtcctcccasggttccctg站gaacactcagecagaagagcacttgggttcgrgrtggtagcacactgtgtaaggaacctcag仁ctggatctgctccca^ctgtctcctaaggtgctggtttgttcsacagcacagcagatggc:3cstta^ctgtccatcatggaactgggaggcccagactccactsctatccscctgtacctgacaaggggatcaccgtc仁cccctgcagtct站ttgtgccctgtcrttcatccacgtgtgttcaiaggataaacaca_gatgrgcgragcctctcc(26)限定了全長(zhǎng)1F3重鏈序列(1F3重鏈可變區(qū)和IgGl恒定區(qū))的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEQIDNO.147)evqlvesggg工vqsggslklscaasgftfsnyfmsvrvrgtpekrlewvaysrdnakntlylqmsslksedtamyyevrqgdgyygdyamdyplapgsaaqtusuivtlgclvkgyfpepvtvtwnsgslsstvpsstwpsetvtcnvahpassticv^kkivprdegekpeititltpkvtcvwdiskddpevgfswfvddvevhfcagtqpsvselpimhxjdwlngricefkcrvnsaafpapiektisktkgrpkapqvytikvsltcmitdffpeditvewqwnggpaenykntqpimdtdgsyfvysklntftcsvlheglhnhhtekslshspgk1121181241301361421pdsvkgrftissskttppsvsdlytlsssv丄fppkpkdvlissgggstyyywgggtsvtvgvhtfpavlgctvpevssvfreegfnstfr*pp沐e(cuò)gmalcd(27)編碼全長(zhǎng)1F3輕鏈序列(lF3Kappa可變區(qū)和恒定區(qū))的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEQIDNO.148)stgagtgtqcccsctcaggtcctggggttgctqctqctgtggcttacagatgcca^gstgt61gacatccaga121atcacatgtc181ggaaaatc6c241aggfctcagtg301ga^gattttg361gggaccagac421tcc3gtg*agc481cccaaagaca541aacagrttgga601ttgacwagg661tcaacttcactgactcagtcggagttattactgatcaggsccattgtcwtccagcctccgaatatttacggtct汪tgatacgggcrtgratcta匕ctgtatttttccctcattttggggtagctgc這ccaatceigtcgtg仁gatggcagtgagcacctacasgcta_t3cctagg貼tgsgtctgtgggagataccagatggagatcaacagctccgtacacctgtatccatgcatgagcagaactgtcaccgcagaaac&gcctgcagtctgtttggagggca^cttctsctggcgtcctgcaccctcacg(28)限定了全長(zhǎng)1F3輕鏈序列(1F3Kappa可變區(qū)和恒定區(qū))的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEQIDNO.149)1diqmtgspaslsvsvgetvtitcraseniysnlawyqqkqgkspqllvydathlpdgvps61rfsgsgsgtqfsl)cinslgsedfgsyycghfwgtpytfgggtriei)cradaaptvsifpp121sseqltsggaswcflrmfypkdinvkwkidg曰ei:qrigvlnswtdqdskdstysmsstlt181itkdeye:rhnsytceathktstspiv)csfn:rnec(29)編碼全長(zhǎng)3A12重鏈序列(3A12重鏈可變區(qū)和IgGl恒定區(qū))的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEQIDNO.150)161121181241301361421481541601721781841SOI9"10211081120112S113211381atgaactttgggctcagattgattttccttgtccttgttttaaaaggtgtgaagtgtgascaaatgaacaggttectatgaactccatggacctggaactagggsttgtgttccccccsagtcagtgaacgtcaacagtgccgaaggctctgg貼tggrgctctt^cttcgttcacctgctcactctcctgtggagtctggtggagtgggtggg"actatgctgaccctgggctggatccctgttgtaagcccagctcagracttcccatcstcagctttccccacaggtgtactg"tgttacagggrsiggcttacgcateicattcaccatctc;ctatggactacatgcctggtcgtccagcggtctcagtgactcccggccagctgfcgctcacctgatcccgaggcsccaggactgcccecstccaccattccaagtstgtggtgtggggtc貼gcc&ctggcccgtgcacacctagcaccaaggatta^ctctgatggctc站tgttccctgasgtccctgagcctcccagctgtctcctssggtgctggtttgttcaacagcacactgggaggcccagactccactactatccacctgtacctgC3ccg:tctcctgcccaa^ctcctgcag匕ctaattgtgccctgtcttc3tccacgtgtgttagatgatgtgtttccgctCEicsiaaggcagacacagatggcgsgcctctcc(30)限定了全長(zhǎng)3A12重鏈序列(3A12重鏈可變區(qū)和IgGl恒定區(qū))的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEQIDNO.151)1evqlvesggg61pdsvJcgrfti121ssakttppsv181sdlytlsssv241ifppkpkdvl301svselpimhg361kvsltcmitd421tftcsvlheglvqpggsllciyplapgsa^qtvpsstwpsetitltpkvtcdwlngkefkcffpeditvewlhnhhteksllqmnslksedtnsmvtlgcltvtcnvahpsLrvnsaafpapqwngqpaenynyfmswvrgttamyycvrggvkgyfpepvtsstkvdkkivevgfswfvdciiektisJctkg"kntgpimdtddgyygdyamdvtwnsgslssprdcgckpcirpkapgvytiis曰gggstyyywgqgtsvtv9"\rhtfpavlqctvpevssvfreeqfnstfrpppfceqmskd(31)編碼全長(zhǎng)3A12輕鏈序列(3A12Kappa可變區(qū)和恒定區(qū))的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEQIDNO.152)1atgagtgtgcccactcaggtcctggggttgc仁qctgctgtggcttacagatgcc的atgt61gacatccaga181ggaasatctc241aggttcsgtg301gaagattttg3SIgggaccaaac421tccagtgagc481cccaaagaca541aa_ca_gttggaS61tcsacttcax:tgactcagtcctcagctcctgcagtggatctcaatgtc貼gccagcctccggtccatgctaggcacacagctgtcaacatacgggctgattggaggtgccgtgga^gattgagcttcaacattaatttaggcaacaa^gtfcattccctcattttggggtagctgcaccaatcagtcgtgtagctatacctctgtgggagatagcagatggctgtstccatgcttcttgaagcatgagcaggtgaggrccacgttagaactgtcacctgtgcca仁cacctgcagtctt的cgtcctgC3CCCtCELCg(32)限定了全長(zhǎng)3A12輕鏈序列(3A12Kappa可變區(qū)和恒定區(qū))的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEQIDNO.153)1d丄gmtqspaslsvsvgetvtitcraseniyinlawygq)cq61rfsgsgsgtqyslkinslqsedfgsyycqhfwgtpytfgg121sseqltsggaswcflrmfy沐dinvkwkidgserqngvl181ltkdeyerhnsytcea仁hktstspivksfnrnec為了方便，表2提供了本實(shí)施例中所討論的抗體的全長(zhǎng)序列與序列表中列出的那些序列之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系的索引表。表2gkspgllvhaatkladgvpsgtkleikradaaptvsifppnswtdigdskcistysmsstlt<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>實(shí)施例3—多種重組hHGF蛋白質(zhì)的制備本實(shí)施例描述了用于表征實(shí)施例1和實(shí)施例14中制備的抗體的多種重組蛋白質(zhì)的克隆和表達(dá)。具體而言，本實(shí)施例描述了以下蛋白質(zhì)的克隆和表達(dá)，所述的蛋白質(zhì)為重組hHGF蛋白質(zhì)、含有在555位置處甘氨酸被谷氨酸取代的重組hHGF蛋白質(zhì)(G555E)、含有在561位置處半胱氨酸被精氨酸取代的重組hHGF蛋白質(zhì)(C561R)、含有置于小鼠HGF序列中的人V495-L585HGF序列的重組小鼠-人-小鼠(mhm)嵌合體HGF蛋白質(zhì)、含有置于小鼠HGF序列中的人I499-R566HGF序列的重組mhm嵌合體HGF蛋白質(zhì)、以及含有置于小鼠HGF序列中的人W507-L585HGF序列的重組mhm嵌合體HGF蛋白質(zhì)。利用標(biāo)準(zhǔn)的分子技術(shù)產(chǎn)生以下的表達(dá)構(gòu)建體，并通過DNA測(cè)序驗(yàn)證所得的cDNA序列。a.hHGF-Fc在PCR的第一輪中，產(chǎn)生2個(gè)重疊的PCR片段，其中在hHGF和hlgFc之間引入了NotI位點(diǎn)并編碼了6xHis標(biāo)簽。在第二輪中，重疊的PCR片段作為模板以擴(kuò)增hHGF-his-IgFc。用Nhel和BamHI消化所得的片段，再克隆到pcDNA5/FRT(Invitrogen，#35-3014)中。然后，從Invitrogen克隆序號(hào)IOH29794(人HGFcDNA)中擴(kuò)增hHGF。發(fā)現(xiàn)，所得的序列對(duì)應(yīng)于NCBI中儲(chǔ)存的收錄號(hào)為NM-000601.4的序列。(1)5'hHGFNhel引物ACTGGCTAGCATGTGGGTGACCAAACTCCT(SEQIDNO.102)(2)hHGFNotlHis標(biāo)簽引物GTGATGGTGATGGTGATGGCGGCCGCATGACTGTGGTACCTTATATG(SEQIDNO.103)(3)5'HisIgFc引物ACTGGCGGCCGCCATCACCATCACCATCAC(SEQIDNO.104)(4)^IgFcBamHI引物ACTGGGATCCTCACTATTTACCCGGGGACAG(SEQIDNO.105)b.hHGF-FcG555E和hHGF-FcC561R使用QuikChangeIIXL定點(diǎn)突變?cè)噭┖?Stratagene),根據(jù)制造商提供的說明書，通過定點(diǎn)突變產(chǎn)生hHGF-Fc突變體G555E和hHGF-Fc突變體C561R。(1)hHGF-Fc(G555E)正義引物CATGATGTCCACGAAAGAGGAGATGAG(SEQIDNO.106)(2)hHGF-Fc(G555E)反義引物CTCATCTCCTCTTTCGTGGACATCATG(SEQIDNO.107)(3)hHGF-Fc(C561R)正義引物GGAAGAGGAGATGAGAAACGCAAACAGGTTCTCAATG(SEQIDNO.108)(4)hHGF-Fc(C561R)反義引物CATTGAGAACCTGTTTGCGTTTCTCATCTCCTCTTCC(SEQIDNO.109)c.小鼠-人-小鼠嵌合體Fc小鼠-人-小鼠嵌合體IgFc構(gòu)建體包含mHGFot鏈-hHGF、人HGF的P鏈氨基酸Val495-Leu585、以及其后為6xHis標(biāo)簽和IgG-Fc的mHGFC末端p鏈。從Invitrogen克隆序號(hào)IOH29794(人HGFcDNA)擴(kuò)增編碼氨基酸V495-L585的人HGFcDNA。該序列對(duì)應(yīng)于NCBI中儲(chǔ)存的收錄號(hào)為NM—000601.4的序列。使用來自Invitrogen的SuperScriptOneStepRT-PCR試劑盒(#10928-034)，根據(jù)制造商提供的說明書，從小鼠肝的總RNA(Clontech，#636603)中，通過RT-PCR擴(kuò)增小鼠HGF序列。所得的mHGFcDNA序列對(duì)應(yīng)于NCBI中儲(chǔ)存的收錄號(hào)為D10213.1的序列。使用重疊的PCR引物產(chǎn)生3個(gè)片段(分別被稱為片段1、2和3)，并在PCR擴(kuò)增的連續(xù)的輪次中退火。將終產(chǎn)物用Nhel和Notl酶切，并克隆到pcDNA5/FRTIgGFc中。(1)用于mHGFoc鏈5，Nhel的片段l的引物5'ATCGGCTAGCATGATGTGGGGGACCAAAC(SEQIDNO.110)GAATCCCATTTACAACCCGCAGTTGTTTTGTTTTGG(SEQIDNO.Ill)(2)用于hHGFp鏈aaV495-L585的片段2的引物5'CCAAAACAAAACAACTGCGGGTTGTAAATGGGATTC(SEQIDNO.112)CAGGATTGCAGGTCGAGCAAGCTTCATTAAAACCAGATCT(SEQIDNO.113)(3)用于mHGF0鏈C末端3，Notl的片段3的引物AGATCTGGTTTTAATGAAGCTTGCTCGACCTGCAATCCTG(SEQIDNO.114)3'GTAATTTTGACATACAAGTTGTGCGGCCGCCATCACCATCACCATCAC(SEQIDNO.115)d.hHGF和mhm嵌合體的構(gòu)建通過定點(diǎn)突變產(chǎn)生不含有Fc-標(biāo)簽的、編碼hHGF和mhm嵌合體(V495-L585)的載體，即pcDNA5/FRThHGF和pcDNA5/FRT-mhm嵌合體(V495-L585)。使用QuikChangeIIXL定點(diǎn)突變?cè)噭┖?Stratagene)，根據(jù)制造商提供的說明書將終止密碼子引入6xHis-標(biāo)簽的3，端。突變引物包括引物1和引物2，其中引物l為CATCACCATCACCATCACTAAGCGGGTCTGGTGCCACG(SEQIDNO.116)，引物2為CGTGGCACCAGACCCGCTTAGTGATGGTGATGGTGATG(SEQIDNO.117)。此外，使用QuikChangeIIXL定點(diǎn)突變?cè)噭┖?Stratagene)，根椐制造商提供的說明書，通過定點(diǎn)突變由pcDM5/FRT-mhm(V495-L585)構(gòu)建體產(chǎn)生2個(gè)另外的mhm嵌合體。其中1個(gè)mhm構(gòu)建體含有位于小鼠序列之間的hHGF的I499-R556區(qū)域。另一個(gè)mhm構(gòu)建體含有位于小鼠序列之間的hHGF的W507-L585區(qū)域。對(duì)于mhm嵌合體(1499-R556)，利用合適的寡核苷酸序列，在模板pcDM5/FRT-mhm嵌合體(V495-L585)構(gòu)建體中依次制造以下點(diǎn)突變D558E、C561R、V564I、V567I和M583L。對(duì)于mhm嵌合體(W507-L585),利用合適的寡核苷酸序列，在模板pcDM5/FRT-mhm嵌合體(V495-L585)構(gòu)建體中在一個(gè)步驟中引入以下點(diǎn)突變:Q502R、N504T和I505Vo所得的hHGF-Fc蛋白質(zhì)的核苷酸序列如SEQIDNO.118所示，包含信號(hào)序列(核苷酸1-93)和原結(jié)構(gòu)域(prodomain)(核苷酸94-162)。hHGF-Fc蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQIDNO.119所示。所得的編碼mhm(V495-L585)-Fc嵌合體蛋白質(zhì)的核苷酸序列如SEQIDNO.120所示，包含信號(hào)序列(核苷酸l-96)和原結(jié)構(gòu)域(核苷酸97-165)。mhm(V495-L585)-Fc嵌合體蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQIDNO.121所示。所得的編碼mhm(V495-L585)構(gòu)建體的核苷酸序列和限定mhm(V495-L585)構(gòu)建體的蛋白質(zhì)序列分別如SEQIDNO.211和212所示。如SEQIDNO.211所示的核酸序列包含信號(hào)序列(核苷酸1-96)和原結(jié)構(gòu)域(核苷酸97-165)，而如SEQIDNO.212所示的蛋白質(zhì)序列包含活性蛋白質(zhì)序列(不含有信號(hào)序列或原結(jié)構(gòu)域)。所得的編碼mhm(1499-R556)構(gòu)建體的核苷酸序列和限定mhm(1499-R556)構(gòu)建體的蛋白質(zhì)序列分別如SEQIDNO.213和214所示。如SEQIDNO.213所示的核酸序列包含信號(hào)序列(核苷酸1-96)和原結(jié)構(gòu)域(核苷酸97-165),而如SEQIDNO.214所示的蛋白質(zhì)序列包含活性蛋白質(zhì)序列(不含有信號(hào)序列或原結(jié)構(gòu)域)。所得的編碼mhm(W507-L585)的核苷酸序列和限定mhm(W507-L585)的蛋白質(zhì)序列分別如SEQIDNO.215和216所示。如SEQIDNO.215所示的核酸序列包含信號(hào)序列(核苷酸l-96)和原結(jié)構(gòu)域(核苷酸97-165),而如SEQIDNO.216所示的蛋白質(zhì)序列包含活性蛋白質(zhì)序列(不含有信號(hào)序列或原結(jié)構(gòu)域)。e.蛋白質(zhì)的表達(dá)(1)細(xì)胞培養(yǎng)在37。C、5%0)2以及100pg/mLZeocin(Invitrogen，CatalogNo.R250-Ol)條件下，在F12K培養(yǎng)基(ATCC，CatalogNo.30-2004)、10%FCS(Invitrogen，CatalogNo.10438026)、1%青霉素(10000units/mL)/鏈霉素(10，000jig/mL)(Invitrogen，CatalogNo.15140—122)中培養(yǎng)CHOFlpln細(xì)胞(Invitrogen，CatalogNo.R758-07)。(2)穩(wěn)定的CH0Flpln細(xì)胞系的產(chǎn)生使用Lipofectamine2000(Invitrogen，CatalogNo.11668-027)，才艮據(jù)制造商提供的說明書，用比例為9:1的pOG44:pcDNA5/FRT表達(dá)質(zhì)粒DM轉(zhuǎn)染CHOFlpln宿主細(xì)胞。使用空的pcDNA5/FRT載體/pOG44和單獨(dú)的pOG44質(zhì)粒(Invitrogen，CatalogNo.35-3018)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，分開細(xì)胞，并在48小時(shí)后，向該細(xì)胞中加入0.5mg/mL潮霉素B(Sigma,CatalogNo.H0654-SPEC)。在F12K、10%FCS、1%青霉素/鏈霉素、0.5mg/mL潮霉素B中，選擇多克隆的穩(wěn)定的細(xì)胞。(3)在穩(wěn)定的CHOFlpln細(xì)胞系中蛋白質(zhì)的表達(dá)將大約2乂106個(gè)細(xì)胞接種于15cm的平板中，并在37X:、5%C02下，在比例為1:1的F12K(ATCC，CatalogNo.30-2004)/DMEM高糖(Invitrogen，CatalogNo.11995065)、以及5°/。極低IgGFCS(InvUrogen,#16250-78)中培養(yǎng)5-6天。收集上清液，并通過ELISA和表面等離子體共振分析所得的蛋白質(zhì)。實(shí)施例4一抗hHGF單克隆抗體的結(jié)合特性實(shí)施例1制備的單克隆抗體以及實(shí)施例3中制備的一些重組HGF蛋白質(zhì)可通過它們結(jié)合hHGF的能力來表征，使用BIAcoreT100裝置，通過表面等離子體共振來分析所述的抗體以及一些在實(shí)施例3中所討論的融合蛋白質(zhì)，從而評(píng)估它們結(jié)合HGF的能力。使用胺偶聯(lián)(BIAcore，CatalogNo.BR-1000-50)，根據(jù)制造商提供的說明書，通過標(biāo)準(zhǔn)的偶聯(lián)方法將每種抗體固定于羧甲基化的葡聚糖CM5的傳感器芯片(BIAcore，CatalogNo.BR-1006-68)上。在25。C下，使用PBS(GIBC0，CatalogNo.14040-133)作為運(yùn)行緩沖劑來進(jìn)行分析，所述的PBS含有0.05%表面活性劑P20(BIAcore，CatalogNo.R-1000—54)、2mg/mLBSA(EMD，CatalogNo.2930)和10mg/mLCM-葡聚糖的鈉鹽(Fluka，CatalogNo.86524)。將含有不同HGF融合蛋白質(zhì)的上清液或者來自用空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清液以30ML/min的流速注射在每種抗體上，時(shí)間持續(xù)3分鐘。在注射完畢后30秒時(shí)，在基線上，以共振單位(RU)測(cè)定所得的結(jié)合。將結(jié)合與稀釋于運(yùn)行緩沖劑中的人HGF(R&DSystems,CatalogNo.294-HGN-025)比較。通過比較與對(duì)照表面的結(jié)合，監(jiān)測(cè)到不存在特異性的結(jié)合，其中所述的對(duì)照表面上包含使用相同的胺偶聯(lián)方法固定的小鼠IgG(Rockland,CatalogNo.010-0102)。所得的結(jié)果總結(jié)于表3中。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>表3中的結(jié)果表明，每種抗體都與rHGF和純化的人HGF結(jié)合。此外，所有的抗體都與含有點(diǎn)突變G555E和C561R的hHGF結(jié)合?？傮w而言，除了1F3和2F8之外的所有抗體都不與小鼠HGF結(jié)合，表明抗體1A3、1D3、2B8、3A12、3B6和3D11特異性地結(jié)合人HGF?？贵w1D3、1F3和2B8結(jié)合小鼠-人-小鼠嵌合體，而其他抗體則不結(jié)合該嵌合體。這些結(jié)果表明抗體1D3和2B8至少部分地結(jié)合人HGF的殘基495-585。抗體1A3、3A12、3B6和3D11似乎結(jié)合人hHGF的除了殘基495-585之外的部分。目前尚不確定為什么2F8不結(jié)合mhm嵌合體，而其似乎結(jié)合hHGF和mHGF。實(shí)施例5—抗hHGF的單克隆抗體結(jié)合還原的和非還原的HGF的能力在本實(shí)施例中，對(duì)實(shí)施例1制備的抗hHGF的單克隆抗體結(jié)合還原的和非還原的HGF的能力進(jìn)行分析。通過免疫印跡法評(píng)估抗HGF的血清與重組hHGF的反應(yīng)性。在4-12%Bis-Tris1.0mmX2D孑L凝膠(wel1gel)(Invitrogen，Carlsbad,CA)上，對(duì)在含有或不含有NuPAGE樣品還原緩沖劑(Invitrogen的NuPAGEMOPSSDS運(yùn)行緩沖劑(Invitrogen)中的8ng重組hHGF進(jìn)行分級(jí)。然后，使用標(biāo)準(zhǔn)的方法將分級(jí)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝化纖維膜上。將該硝化纖維膜用溶于含有0.1%Tween-20(TBST)的Tris緩沖鹽溶液中的5%脫脂奶粉溶液封閉，然后封片到MiniProteanIIMulti-Screen儀器(BioRad)中以便進(jìn)一步封閉。用純化的抗體在Multi-Screen儀器上探針檢查所得的膜。將純化的抗體在封閉緩沖劑中稀釋成5jag/mL。然后，將硝化纖維膜從所述儀器中取出，并與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠的IgG抗體溫育。所得的結(jié)果總結(jié)于表4中，其中數(shù)字反應(yīng)了結(jié)合的程度，-代表最少結(jié)合(幾乎不結(jié)合或不結(jié)合)而3+代表最多結(jié)合。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>表4中的數(shù)據(jù)表明，所有的抗體都與非還原的rhHGF結(jié)合。與此形成對(duì)比的是，單克隆抗體1A3、1D3、1F3、2F8和3B6結(jié)合還原的rhHGF，但抗體2B8、3A12和3D11不結(jié)合還原的rhHGF。實(shí)施例6—結(jié)合親和力通過表面等離子體共振測(cè)定實(shí)施例l制備的每種抗體與hHGF的結(jié)合親和力及相互作用的動(dòng)力學(xué)。使用胺偶聯(lián)(BIAcore，CatalogNo.BR-1000-50)，根據(jù)制造商提供的說明書，通過標(biāo)準(zhǔn)的偶聯(lián)方法將兔抗小鼠免疫球蛋白(BIAcore，CatalogNo.BR-1005-14)固定于羧曱基化的葡聚糖CM5的傳感器芯片(BIAcore，CatalogNo.BR-1006-68)上。在25C下，使用PBS(GIBCO，CatalogNo.14040-133)作為運(yùn)行緩沖劑來進(jìn)行分析，所述的PBS含有0.05%表面活性劑P20(BIAcore,CatalogNo.BR-1000-54)、2mg/mLBSA(EMD，CatalogNo.2930)和10mg/mLCM-葡聚糖的鈉鹽(Fluka，CatalogNo.86524)。將抗體捕獲在流速為10jiL/min的單個(gè)流動(dòng)的細(xì)胞上。用于每種抗體的注射時(shí)間是可變的，從而使每個(gè)循環(huán)中捕獲大約20RU的抗體。以60yL/min的速度，在2分鐘內(nèi)向參照表面(沒有被捕獲的抗體)和活性表面(有待測(cè)試的抗體)上依次注射緩沖劑或稀釋于運(yùn)行緩沖劑中的HGF(R&DSystems,CatalogNo.294-HGN-025)。才艮據(jù)濃度，對(duì)解離相監(jiān)測(cè)15或90分鐘。然后，再開始另一個(gè)循環(huán)之前，使用10mM的甘氨酸-HCl,pH1.7(BIAcore，CatalogNo.BR-1003-54)使所述的表面再生，其中所述的甘氨酸-HCl是在3分鐘內(nèi)以60jiL/min的流速注入的。所測(cè)試的HGF的濃度為0.46nM至7.5nM。利用BIAevalutation軟件的動(dòng)力學(xué)函數(shù)及推薦的差級(jí)，確定動(dòng)力學(xué)參數(shù)。每種抗體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)(ka(結(jié)合速率常數(shù))，kd(解離速率常數(shù))和L(平衡解離常數(shù)))總結(jié)于表5中。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>表5中的數(shù)據(jù)表明，所述抗體結(jié)合hHGF的K。為約100pM或更低、約50pM或更低、或者20pM或更低。實(shí)施例7—抗hHGF的抗體的中和活性在本實(shí)施例中，用抗體(a)抑制hHGF與c-Met結(jié)合的能力和(b)抑制4MBr-5細(xì)胞中HGF刺激的BrdU引入的能力來表征實(shí)施例1制備的抗體。a.HGF-Met結(jié)合抑制分析(中和作用分析)使用ELISA測(cè)試抗體抑制hHGF與c-Met結(jié)合的能力。具體而言，在4X:下，用碳酸鹽包被緩沖劑(15mMNa2C03和34mMNaHC03，pH9.0)中的100jliL6.25mg/mLHGF(R&DSystems,CatalogNo.294-HGN-025)包被Wallac96孔DELFIA分析平板(Wallac公司，CatalogNo.AAAND-0001)16小時(shí)。然后，在室溫下將該分析平板用PBS中的200juL5%的非脫脂奶粉封閉1小時(shí)。通過將升高濃度的處于研究中的抗體(O.033-667nM，3倍系列稀釋)加入到含5%非脫脂奶粉的PBS中的2nMc-Met(R&DSystems,CatalogNo.358-MT/CF)中，在分開的板中制備該抗體。將每個(gè)孔中的IOOML的樣品轉(zhuǎn)移至分析平板中，并在4X:下溫育過夜。然后，將該分析平板用PBS-0.1%Tween20洗滌3次，并在室溫下，與100nL/孔的2g/mL生物素標(biāo)記的抗人c-Met的抗體(R&DSystems,CatalogNo.BAF358)溫育，其中所述的抗人c-Met的抗體在含5。/。非脫脂奶粉的PBS中中制備。然后，將所得平板用PBS-0.1。/。Tween20洗滌3次，并在室溫下，與在DELFIA分析緩沖液(Wallac，CatalogNo.4002-0010)中以1:1000稀釋的Eu標(biāo)記的鏈霉親和素(Wallac，CatalogNo,1244-360)溫育1小時(shí)。將所得平板用DELFIA洗滌液(Wallac，CatalogNo.4010-0010)洗滌3次，并在室溫下，在攪拌條件下與100jliL/孔的DELFIA增強(qiáng)溶液(Wallac#4001-0010)溫育15分鐘。使用銪示蹤法，在Victor3V儀器(PerkinElmer)上讀取所述平板。計(jì)算ICs。的值，并總結(jié)于表6中。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>這些結(jié)果表明，除了3B6以外的所有抗體(即，1D3、1A3、2B8、3A12、1F3、3D11和2F8)有效地中和HGF與c-Met的結(jié)合。b.中和4MBr-5細(xì)胞中HGF刺激產(chǎn)生的BrdU的引入將1QjaL12.5nM的hHGF分配到96孔組織培養(yǎng)微孔板(CostarCatalogNo.3903)的每個(gè)孔中。將10jjl濃度為6667、2222、740、247、82、27、9.1、3.0、1.0和0.33nM的系列稀釋的抗體加入每個(gè)孔中。然后在室溫下，將HGF-抗體混合物溫育30分鐘。將培養(yǎng)在F-UK(ATCC530-2004)、15%FBS(Gibco10438-026)、30ng/mLEGF(SigmaE9644)以及1。/。青霉素/鏈霉素(PS，GibcoCatalogNo.15140-122)中的猴支氣管上皮細(xì)胞4MBr-5(ATCC，CCL208)用胰蛋白酶(GibcoCatalogNo.25200-056)解離，并以75,000細(xì)胞/mL重懸于分析培養(yǎng)基(f-12k、2.5%fbs、1%ps)中，然后將80mL細(xì)胞懸浮液分配到HGF-抗體混合物中。將所得的細(xì)胞在37。C、5y。C02下溫育。48小時(shí)后，加入10jliL100iaM的BrdU(RocheCatalogNo.1669915)。72小時(shí)后，除去培養(yǎng)基，用電吹風(fēng)干燥所述平板，并用BrdUELISA(RocheCatalogNo.1669915)根據(jù)制造商提供的說明書進(jìn)行處理。使用SynergyHT平讀取器(Bio-Tek)對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行定量。所得數(shù)據(jù)與GraphPadPrism(GraphPadSoftware)中斜率可變的反曲劑量應(yīng)答(sigmoidaldoseresponse)曲線相擬合，所述曲線的等式為y=底值+(頂值-底值)/(l+l(T(log(EC50-x^曲線斜率))。在相同的樣品中，每個(gè)試驗(yàn)都重復(fù)至少3次，并且平均ECs。值示于表7中。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>表7中的結(jié)果表明，所有的抗體(1A3、1D3、1F3、2B8、2F8、3A12、3B6和3D11)都抑制HGF誘導(dǎo)的4MBr-5細(xì)胞增殖。實(shí)施例8—抗hHGF抗體的抗擴(kuò)散活性本實(shí)施例描述了實(shí)施例1制備的抗體抑制HGF誘導(dǎo)的擴(kuò)散活性的能力的特征。HGF誘導(dǎo)了MDCK細(xì)胞(ATCC，Manassas,VA，CatalogNo.CCL-34)簇的"擴(kuò)散"(運(yùn)動(dòng)性)。將MDCK細(xì)胞以每孔4xl(^個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔Costar組織培養(yǎng)平板(CorningIncorporated,Corning,NY3CatalogNo.3595)中，其中每個(gè)孔裝有80nL的包含10%胎牛血清(InvitrogenCatalogNo.10438026)和1%青霉素-鏈霉素(InvitrogenCatalogNo.15140122)的MEM(ATCCManassas,VA，CatalogNo.30-2003)。將待研究的每種抗體在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的MEM中稀釋成6,667nM。然后，將每種不同的抗體稀釋液、以及含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素但不含有抗體的MEM分別與等體積的含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的MEM、以及IOOng/mlHGF(R&DSystemsCatalogNo.294-HGN-025)混合。在25匸下，將抗體/HGF稀釋液溫育30分鐘。將20juL的每種抗體/HGF稀釋液分別加入到各個(gè)孔中，使得最終的抗體濃度為666.7nM，而最終的HGF濃度為10ng/ml。然后，在37C、5%002下，將MDCK細(xì)胞溫育24小時(shí)。溫育24小時(shí)后，將MDCK細(xì)胞小心地用每孔100|iL的水冷的PBS(InvitrogenCatalogNo.14190144)洗滌1次，并用每孔100jaL的水冷的甲醇固定，同時(shí)在25t:下?lián)u動(dòng)10分鐘。然后將平板用蒸餾水小心地洗滌1次。將每個(gè)孔中加入100jaL的結(jié)晶紫溶液，其由0.5%的結(jié)晶紫(Sigma，St.Louis,M0，CatalogNo.C3886)和50%的溶于蒸餾水中的乙醇構(gòu)成，并將細(xì)胞在25匸下?lián)u動(dòng)溫育20分鐘。將使用結(jié)晶紫溶液染色后，將所得的細(xì)胞用蒸餾水小心地洗滌3次。然后，向每個(gè)孔中加入PBS以防止樣品干燥。使用LeicaDMIRB顯微鏡(LeicaMicrosystemsGmbH，Wetzler,Germany)、DC500照相機(jī)(LeicaMicrosystemsGmbH,Wetzler，Germany)和MagnaFire2.1C軟件(Optronics,Goleta，CA)對(duì)細(xì)胞成像，并評(píng)定樣品的擴(kuò)散水平。所得的結(jié)果總結(jié)于表8中。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>-不抑制+++極強(qiáng)，接近完全抑制++強(qiáng)烈抑制+可檢測(cè)程度的抑制表8所示的結(jié)果表明，抗體2B8比其他抗體更能抑制HGF誘導(dǎo)的擴(kuò)散?？贵w1D3和3B6顯示出中等水平的抑制；抗體U3顯示出低于中等水平的抑制；抗體1F3和2F8顯示出低水平的抑制；而抗體3A12和3D11幾乎不產(chǎn)生抑制或檢測(cè)不到抑制。實(shí)施例9—對(duì)HGF刺激的c-Met磷酸化的抑制本實(shí)施例描述了實(shí)施例1制備的抗體抑制PC-3細(xì)胞中HGF刺激的c-Met磷酸化的能力的特征。HGF誘導(dǎo)了PC-3細(xì)胞(ATCCNo.CRL-1435)中Met的磷酸化。將PC-3細(xì)胞以每孔4.5xl(T個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔Costar組織培養(yǎng)平板(CorningCatalogNo.3595)的每個(gè)孔中，其中每個(gè)孔裝有IOOiuL的包含10。/。胎牛血清(InvitrogenCatalogNo.10438026)和1%青霉素-鏈霉素(InvitrogenCatalogNo.15140122)的F-12K(ATCC，Manassas,VA，CatalogNo.30-2004)。在37X:、5%C02下經(jīng)過24小時(shí)之后，除去培養(yǎng)基，并用不含血清但含有1%青霉素-鏈霉素的F-12K漂洗細(xì)胞1次。然后將細(xì)胞在IOO的含有1°/。青霉素-鏈霉素的無血清F-12K中溫育24小時(shí)。在含有1%青霉素-鏈霉素的無血清F-12K中制備待研究的每種抗體的以下IO種不同的稀釋液6667nM、2222nM、741nM、247nM、82.3nM、27.4nM、9.1nM、3.0nM、1.0nM和0.3nM。將每種抗體稀釋液、以及不含抗體的含有1%青霉素-鏈霉素的無血清F-UK分別與等體積的含有1%青霉素-鏈霉素的無血清F-UK和500ng/mLHGF(R&DSystemsCatalogNo.294-HGN-025)混合。在25C下，將這些抗體/HGF的稀釋液溫育30分鐘。由此得到最終濃度為1.25nM的HGF。然后，將PC-3細(xì)胞用含有1。/。青霉素-鏈霉素的無血清F-UK漂洗1次。接著向細(xì)胞中加入70mL含有1%青霉素-鏈霉素的無血清F-12K，然后再加入10jaL含有10mMNa3VO4(SigmaCatalogNo.S6508)的含有1%青霉素-鏈霉素的無血清F-12K。然后，將細(xì)胞在3"TC、5%C02下溫育60分鐘。溫育后，將20jliL的每種抗體/HGF分別加入各個(gè)孔中，得到HGF的最終濃度為50ng/mL，每種抗體的最終濃度如下666.7nM、222.2nM、74.1nM、24.7nM、8.23nM、2.74nM、0.91nM、0.30nM、0.10nM和0.03nM。然后，將細(xì)胞在37"C、5%0)2下溫育10分鐘，其后除去培養(yǎng)基/抗體/HGF的混合物，并將平板放在水上。接著，用每孔100mL的含有1mMNaJ04的水冷的pbs(InvitrogenCatalogNo.14190144)漂洗細(xì)胞1次。然后，將細(xì)胞在4"C下，在每孔100)iL冰冷的裂解緩沖劑中溫育30分鐘，所述的裂解緩沖劑由1%OmniPurTritonX-100(MERCKKGaA，Darmstadt,Germany,CatalogNo.9410)、50mMTris-HClpH8.0、100mMNaCl、0.3mMNa3V04、lx蛋白酶抑制劑混合物(SigmaCatalogNo.P8340)以及l(fā)x磷酸酶抑制劑混合物2(SigmaCatalogNo.5726)構(gòu)成。將生物素標(biāo)記的抗人HGF-R(c-met)的抗體(R&DSystemsCatalogNo.BAF358)在包含1%胎牛血清(SigmaCatalogNo.A2153)的DELFIA分析緩沖液(PerkinElmer，Turku,Finland,CatalogNo.4002-0010)中稀釋至濃度為2jug/mL，并將50的這種稀釋液加入到黃色鏈霉親和素微孔平板(PerkinElmerCatalogNo.AAAND-0005)的每個(gè)孔中。然后，在25。C下將所述平板與抗體搖動(dòng)溫育30分鐘。溫育后，用DELFIA洗滌液(PerkinElmerCatalogNo.4010-0010)洗滌所述平板，并將80pL每種不同的PC-3細(xì)胞裂解物分別加入經(jīng)洗滌的鏈霉親和素微孔平板的各個(gè)孔中。將含有PC-3細(xì)胞裂解物的鏈霉親和素微孔平板在25C下?lián)u動(dòng)溫育60分鐘，然后用DELFIA洗滌液洗滌。將100pL稀釋有600ng/mL亂FIAEu-NlP-Tyr-100抗體(PerkinElmerCatalogNo.AD0159)的含有1%胎牛血清的DELFIA分析緩沖液中加入之前與PC-3細(xì)胞裂解物溫育的經(jīng)洗滌的鏈霉親和素微孔平板中。將該平板在25匸下?lián)u動(dòng)溫育60分鐘。將所述平板用DELFIA洗滌液洗滌最后1次。然后，將200pL的DELFIA增強(qiáng)溶液(PerkinElraerCatalogNo.4001-0010)加入到經(jīng)洗滌的鏈霉親和素微孔平板的各個(gè)孔中，并將該板在"'C下在黑暗中搖動(dòng)溫育5分鐘。然后，使用銪示蹤法，在Victor3V儀器(PerkinElmer)上測(cè)定信號(hào)。使用Prism4forWindows(GraphPadSoftware，Inc.，SanDiego,CA)和反曲劑量應(yīng)答等式計(jì)算EC5。的值。以nM計(jì)的作為ECs。而總結(jié)出的結(jié)果列于表9中。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>表9中的數(shù)據(jù)表明，所有的8個(gè)抗體都是PC-3細(xì)胞中HGF誘導(dǎo)的c-Met磷酸化的有效抑制劑。實(shí)施例10—U87MG異種移植物模型中的腫瘤抑制在U87MG異種移植物模型中測(cè)試本發(fā)明的小鼠單克隆抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力。在37。C下在含有5%0)2和95%空氣的氣氛中培養(yǎng)條件下擴(kuò)增U87MG細(xì)胞(ATCC)，其中使用的培養(yǎng)基包括含有10%胎牛血清、100單位/mL青霉素和100|ig/mL鏈霉素的Dulbecco"ModifiedEagle培養(yǎng)基(DMEM)。通過使用胰蛋白酶-EDTA分離培養(yǎng)亞壁上的細(xì)胞對(duì)細(xì)胞進(jìn)行次級(jí)培養(yǎng)和維持。通過胰蛋白酶消化作用來收集接近匯合的細(xì)胞，然后將50%Matrigel(BDBiosciences;catalogno.356237)中的5x106個(gè)細(xì)胞皮下注射到7周齡雌性ICRSCID小鼠(TaconicLabs)的肩胛骨之間的背部上側(cè)的區(qū)域中。使用卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)直徑(L)和短直徑(W)(mm)。如下計(jì)算肺瘤的體積(vol.):體積(min3)=LxW2/2。當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)到大約200mm3時(shí)，將帶有腫瘤的小鼠隨機(jī)分成5組，每組10只小鼠。其中的一組小鼠接受PBS。其他4組中的每組小鼠接受抗體1A3、1D3、1F3或2B8中的一種抗體。所有抗體的劑量均為1mg/kg體重，每周2次，并通過腹膜內(nèi)注射5個(gè)劑量。每星期記錄2次腫瘤的體積和小鼠的體重。利用學(xué)生t檢驗(yàn)分析腫瘤生長(zhǎng)的抑制。結(jié)果總結(jié)于圖6和表10中。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>在2B8治療組中，取得了部分衰退(參見圖6)。在1A3治療組和1F3治療組中觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的生長(zhǎng)抑制(參見表10)。1D3的腫瘤生長(zhǎng)抑制為51%,其p值為0.075。沒有觀察到明顯的體重?fù)p失。實(shí)施例11—U118異種移植物模型中胂瘤的抑制在U118異種移植物模型中測(cè)試抗體1A3、1D3、1F3和2B8抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力。按照實(shí)施例10(上述實(shí)施例)中針對(duì)U87MG細(xì)胞所述增值U118細(xì)胞(ATCC)。如上文實(shí)施例10所述建立皮下腫瘤模型，不同之處在于所用的小鼠為7周齡的雌性NCr棵鼠(Taconic)，并且當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)至大約80mm3時(shí)開始治療。如同在U87MG模型中那樣，所有抗體的劑量均為lmg/kg體重，每周2次，并通過腹膜內(nèi)注射4個(gè)劑量。每星期記錄2次腫瘤的體積和小鼠的體重。利用學(xué)生t檢驗(yàn)分析胂瘤生長(zhǎng)的抑制。結(jié)果總結(jié)于圖7和表11中。表ll<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>在2B8和1A3治療組中觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的生長(zhǎng)抑制(參見圖7)。在1F3和1D3組中有適度的腫瘤的生長(zhǎng)抑制，其P值小于0.05(在本研究中，這種情況被定義為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著)(參見表ll)。沒有觀察到明顯的體重?fù)p失。實(shí)施例12—小鼠單克隆抗體的人源化本實(shí)施例描述了賢淑鼠2B8抗體的人源化，以及所得人源化抗體的特征。通過兩種方法使小鼠2B8重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)"人源化"。A.人源化方法1在第一種方法中，根據(jù)在Hwang等人(2005)METHODS36:35-42;Tan等人(2002)J.IMMUNOL.169:1119-1125;以及美國(guó)專利序號(hào)6，881，557中所述的"超級(jí)人源化"，設(shè)計(jì)3個(gè)人源化的重鏈可變區(qū)和2個(gè)人源化的kappa輕鏈可變區(qū)。根據(jù)CDR的長(zhǎng)度和氨基酸的組成來確定每個(gè)小鼠2B8CDR的Chothia正規(guī)結(jié)構(gòu)類型(Chothiacanonicalstructuralclass)。根據(jù)在InternationalImmunogenticsInformationSystem(IMGT)網(wǎng)址(在環(huán)球網(wǎng)的imgt.cines.frandbiocheni.unizh.ch/antibody/Sequences/index.html上可得)中描述的已知的人種系可變區(qū)參照等位基因來鑒定由相同的Chothia正規(guī)結(jié)構(gòu)類型的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)構(gòu)成的人種系可變區(qū)。通過計(jì)算CDR氨基酸殘基之間的百分同一性或相似性，將這些相同結(jié)構(gòu)類型的人種系可變區(qū)與小鼠2B8可變區(qū)比較。選擇與小鼠2B8CDR殘基同一性和/或相似性最高的那些人種系可變區(qū)，用于CDR移植。在將小鼠2B8CDR殘基用于替換在小鼠2B8CDR和人種系CDR之間不同的相應(yīng)人種系可變區(qū)殘基時(shí)，保留人種系可變區(qū)的框架殘基。然后，將與2B8小鼠J區(qū)最相似的人J區(qū)加入到"超級(jí)人源化"的可變區(qū)的羧基端。接著，將信號(hào)序列加入到"超級(jí)人源化"的可變區(qū)的氨基端，并將這些氨基酸序列轉(zhuǎn)化為核酸序列。利用基因合成PCR方法(Young等人，(2004)NUCL.ACIDSRES.32:e59)構(gòu)建完整的可變區(qū)核酸序列，并使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)將其克隆到含有人恒定IgGl(Glm(17，1)同種異型)或Kappa(Km(3)同種異型(等位基因2))區(qū)(可變區(qū)的下游)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(基于pcDNA3.2DEST(Invitrogen))中。使所有的4條重鏈IgGl抗體(嵌合體2B8和3條人源化的重鏈(Hu2B8Hvl-f.1、Hu2B8Hv5-a.1和Hu2B8Hv5-51.1))與所有的3條kappa鏈抗體(嵌合體2B8和2條人源化的輕鏈(Hu2B8Kvl-39.l和Hu2B8Kv3-15.1))的可能的組合表達(dá)，從而產(chǎn)生12種不同的抗體蛋白質(zhì)。然后，按照以下所述測(cè)定嵌合體、嵌合/人源化的抗體、以及人源化的抗體與人HGF的結(jié)合，并將結(jié)果總結(jié)于圖8中。表12A中列出了免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈的可變區(qū)的每一種可能組合。表12A<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>表12B中列出了免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈的每一種可能組合。表12B<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>含有全長(zhǎng)免疫球蛋白重鏈和輕鏈(含有人源化的可變區(qū))的兩種可能的抗體構(gòu)建設(shè)計(jì)如下sh2B8-9(Glm(17，1))=hu2B8Hv5-51.1(+IgGl恒定區(qū)(Glm(17，1)同種異型)(SEQIDN0，171)+hu2B8Kv1-39.1(+Kappa恒定區(qū)(Kffl(3)同種異型(等位基因2)))(SEQID肌177);sh2B8-12(Glm(17，1))=hu2B8Hv5-51.1(+IgGl恒定區(qū)(Glm(17，1)同種異型))(SEQIDNO,171)+hu2B8Kv3-15.1(+Kappa恒定區(qū)(Km(3)同種異型(等位基因2)))(SEQIDNO.181)。編碼每一種人源化抗體的核酸序列以及限定每一種人源化抗體的蛋白質(zhì)序列總結(jié)如下。在該部分中，每個(gè)可變區(qū)的最后一個(gè)核苷酸為由可變區(qū)/恒定區(qū)連接體產(chǎn)生的下一個(gè)密碼子的第一個(gè)堿基。該核苷酸包含在可變區(qū)內(nèi)，這是因?yàn)槠涫峭怙@子的一部分。以下列出的恒定區(qū)的氨基酸序列包含了該連接體密碼子的翻譯產(chǎn)物。(1)編碼全長(zhǎng)嵌合體2B8重鏈(小鼠可變區(qū)和人IgGl恒定區(qū))(同種異型Glm(17，l))的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEQIDNO.154)i1211812413013S1421481541SOISSI72.17818419019611021108111411201126113211381atgggatggagcta仁atcatcctc仁仁t:ttg1gtagcaacagrctacagatgr七ccactcccaggagaagttcacaactcagcaggtagca_tctgccctgggctggcgccctgaaacgtgaatcttcctcttcctgcgtggtggtgcaa^ggtctgggcagccccaaccsggtcagacggctccta_a>cgftcttctctctccctgt;agcagcctggttgactactgcggtcttcccgcctggtc站ccagcggcgtgcgtggtgeu:acaaigcccagtggacgtgagtgcataatgcgcg仁cctcsccc貼c的agcgagaaccacaa^tgggcsgcctcttcctctsLcatgctccgtctccgggt站cttcaccacctgaggactctgggccaaggccctggcacccggactetcttccgtgccctcccaacaccaagccacgaagaccctcccagccggtgtacacccagcaagctcgatgcatgag3tgatdctggatgrcgcggtctattaccactctcaagcsgcttggcctgaggtcaccgcgg^ggctgcccccatggcttctatctacaagaccaaccgtggacsgctctgcacaggacttcagtactgggtgaaacggtcatac&ctgtgcaagccgtctcctctgacggtgtcteicagtcctcgcacccagacaagttgagccagttcaactgcgcctcccgtagagcaggtggasgctgtcctcsgaggcctgtggaactcaagga_ctctaccta^catctgcgtacgtggaccagca^cgtacggagta^csaggctgsccssgcgccgt的aggctggactccgc3gc3gggg(2)限定了全長(zhǎng)嵌合體2B8重鏈(嵌合體2B8IgGl(Glm(17,1)同種異型)的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEQIDNO.155)1qvqlgqpgaelvkpgtsvklsckasgytfttywmhwnqrpgqglewigeinptnghtriy61nekfkskatltvdkssstaymglssltsedsavyycarnyvgsifdywgggttltvssas121tkgpsvfplapsskstsggtaalgrclv!kdyfpepvtvsvm曰galtsgvhtfpavlqssgl181yslsswtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggps241vflfppkpkdtlmisrtpevtcwvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynst301yrwsvltvlhgdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsirdelt3S1knqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwgq421gnvfscsvmhealhnhytgkslslspgk(3)編碼全長(zhǎng)嵌合體2B8輕鏈(小鼠可變區(qū)和人恒定區(qū))(嵌合體2B8Kappa(Km(3)))的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEQI腦，156)1atggaatcacagactctqg仁cttcata匕cca匕ac匕gctctggttata匕ffgtgc仁gatggg61aacattgtaatgacccaatctcccaaatccatg仁eca仁gtcsgtaggagagagggtcacc121ttgagctgcaaggccagtgagaatgtggtttcttatgtatcctggtatcaac這gaaacca181gcgcagtctcetaaactgctgatatacgggrgc這tcrcaaccgg站cactggggtccccgat241cgcttcacaggcagt的atctgcaacagatttcactctgaccatcagcagtgtgcg的ct301gaagaccttgcagattatcactgtgggcagagttacaactatccgtacacgttcggaggg361gggsccaggctggaaateiaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgcca421tctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctat481cccagagaggccaaagtacagtggaaggtgg5taacgccctccaatcgggtaactcccag541gagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctatcagcctcagcagcgccctgacg601ctg3gc:aaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggc661ctgagctcgcccgtcac貼agagcttcaacagg的agagtgttga(4)限定了全長(zhǎng)嵌合體2B8輕鏈(嵌合體2B8Kappa(Km(3)))的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEQIDNO.157)1nivmtqspksmsmsvgrerv仁lsckasenwsyvswyq;cjkpagspklliygasnrnfcgvpd6工rftgsgsatdftltissvxaedladyhcgqsynypytfgggtrleikrtvaapsvfifpp121sdeglksgtaswcllmxfypreeUcvqw]cvdnalqsgnsqesvteqdlsJcdstyslsstlt181lskadyekhkvyacevthqg1sspv仁J^sfnrgec(5)編碼人源化Hu2B8Hvl-f.1重鏈可變區(qū)的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEQIDNO.158)1atggactgcacetggaggatcctcctcttggtggcag:cagctacaggcacccacgccgag:61gtccagctggtacagtctggggctgaggtgaagaagcctggggctacagtgaaaatctcc121tgeaaggtttctggatacaccttcaccacctactggatgcactgggtgeaacaggcccct81ggaaaagggcttgagtggatgg忌agagattaatcetaceaacggtoatactaactacaat241gagaagttceagggeagagtcaccataaccgcggacacgtctacagacacagcctacatg301gagctgagcagectgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcaacaaactatgtt361ggtagcatctttgactactggggccaaggaaccctggtcaccgtctcctcag(6)限定了人源化Hu2B8Hvl-f.1重鏈可變區(qū)的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEQIDNO.159)1evqlvqsgaevkkpgatvkisckvsgytfttywmhwvqqapgkglewrngeinptnghtny61nekfqgrvtitadtstdtayme〗ssrsedtavyycatnyvgsifdywgqgtlvtvss(7)編碼人IgGl重鏈恒定區(qū)(Glm(17，1)同種異型)的核酸序列(SEQIDNO.160)1cctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggg61gcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgt121ggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcag181gactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgecctccagcagcttgggcacccagacct241acatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagccca301aatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggac361cgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctg421aggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggt481acgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca541gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaagg601agtacaagtgeaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcca661aagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagc721tgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcg781ccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgc841tggactccgacggctccttcttectctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggc901agcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgc961agaagagcctctccctgtctccgggtaaatga(8)限定了人IgGl重鏈恒定區(qū)(Glm(17，l)同種異型)的蛋白盾M(SEQIDN0.16D。第一個(gè)氨基酸得自可變區(qū)的最后一個(gè)核苷酸與IgGl重鏈序列的開始2個(gè)核苷酸的翻譯產(chǎn)物。1astkgpsvfylapsskstsggtaalgclvkdyfpqpvtvswnsgaltsgvhtfpavlqss61glysisswtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellgg121psvfifypkpkdtlmisrtpevtcvwdvshedpevkfirwyvdgvevhnaktkpreeqyn181styrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytippsrde241ltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrw301qqgnvfscsvmhealhnhytqkslsspgk(9)編碼全長(zhǎng)重鏈人源化Hu2B8Hylf.1可變區(qū)和人IgGl(Glm(17,1)同種異型)重鏈恒定區(qū)的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序蘊(yùn)(SEQIDNO.162)61121181241301361421481541SOI"17217818419019S110211081120113211381atggactgcacctggaggratcc仁cctct仁gg仁ggcagcacjctacaggcacccacgccgaggtccsgctggtgca_aggtttggaa貼gggcgagaagttccgsgctgagcagccctgggctaacgtg汪6itcttcctcttcctgcgtggtggcgtgtggtcAtgcaaggtcttgggagagcactctccctgttacagtctggctggat^cac仁仁gag仁ggatagggcagagtgcctgagatccggtcttcccgcctggtcaaccagcggcgtgcgtggtgac汪ca^gccceigacacatgccccccca333cctggacgtgaggcgtcctca_cgcctgscctgatgggcagcctcttcctctacatgctccgtctccgggtaaggctgaggtgcttca_cca_cctgaggacacgcctggcacccggacta^cttcaccgtgcccscgtcctgcEiccctcccagccggtgtacscccctggtceia^cag"caagctc貼gaagcctgtsctggatgcgccgtgtatt3ccctggtcacccgaaccggccggctgtccagcagcttgggcacctg33cctcatgatctcctgaggtcacccatcgagactgccccceitggcttctatcaccgtggacagggctacagt:actgggtgcaactgtgcaacccgtctcctcgcaec仁ct;ggtgacggtgtctacagtcctcgcacccagactcctggggggcccgggatgacgcctcccgtagagcaggtggaaastctccacaggcccct貼actstgrttagcctccacc巧gactctacca站tcttgtaccgtcagtctgaggtcacagctgeiccaagcgccgtggaggctgga^ctccgcagcsgggg(10)限定了全長(zhǎng)重鏈人源化Hu2B8Hvlf.1可變區(qū)和人IgGlf鏈恒定區(qū)(Glm(17，1)同種異型)的蛋白盾序列(沒有信號(hào)序列)(SE0IDNO.163)1evqlvqsgae61ne)cfqgrvti121tkgpsvfp1^181yslsswtvp241vflfppkpkd301yrwsvltvl361knqvsltclv421g;nvfscsvmhvkkpgatvkitadtstdtaypsskstsgg仁ssslgtqtyitltnis:rtpevhgdwlngkeykgfypsdiavsckvsgytftmelsslrsedaalgclvkdycnvnhkpsiittcvwdvshekc]cvsrikalptavyycatnyfpepvtvswidpevkfnwyvpgkglev7ingevgrsifdywggccJkthtcppcdgvevhnaktkgqprepcivysdgsfflyskinptnghtnygtlvtvssasfpavlqssglpapellggpskpreeqynsttlppsrdeltltvdksrwgg(11)編碼人源化Hu2B8Hv5a.1重鏈可變區(qū)的核酸序列(下劃錢的為信號(hào)序列)(SE0IDNO.164)1atggggtcaaccgccatcctcgccctcctcgtggctgttctceaaggagtctgtgccgaa61gtgcagctggtgcagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaggatctcc121tgtaagggttctggatacagctttaccacctactggatgcactgggtgcgccagatgccc181gggaaaggcctggagtggatgggggagattaatectaccaacggtcatactaactacaat241ccgtccttccaaggccacgtcaccatctcagctgacaagtccatcagcactgcctacctg301cagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgccatgtattactgtgcgagaaactatgtt361ggtageatctttgactactggggccaaggaaccctggtcaccgtctcctcag(12)限定了人源化Hu2B8Hv5a,l重鏈可變區(qū)的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEQIDNO.165)1evqlvqsgaevkkpgeslrisckgsgysfttywmhwvrqmpgkglewrngei叩tnghtny61npsfqghvtisadksistaylqwsslkasdtarnyycarnyvgsifdywgqgtlvtvss(13)編碼全長(zhǎng)人源化Hu2B8Hv5a,1重鏈可變區(qū)和人IgGl(Glm(17，1)同種異型)重鏈恒定區(qū)的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序蘊(yùn)卿IDNO.166)6i1211812413013614214815416016617217818419019611021108111411201126113211381atggggtcaaccgcca仁cc仁cgccc仁cc:tcctggctgttctccaaggagtctgtgccgaagtgcsgctggggga^sggccccgtccttcccag仁ggagcaggtagcstctaagggcccatgccctgggctggcgrccctgatccctcagcattcctcttccggcgtggaggcgtgtggtcatgc的gg匕cttgggagagcag"acggctcc:tctctccctgttgcagtctggctggatacagtggagtggstttgactactgcggtcttcccgcctggtcaaccagcggcgtgcgtggtgacacaagcccagtggacgtgaggcgtcctcacgcctgacctgatgggcagcctcttcctctacatgctccg仁ctccgggts這agcaga_ggtgctttaccaccgggggagattcaccatctcacctggcacccgga_ctacttcgcacaccttccgrtgccctccaiccgtgcccacctcccagcccctggtcaaacagcaagctcga仁gcatgagaa^aagcccggctgacaagtgccatgtatteiccctggtcacccgaaccggccggctgtccagcagcttggcctgaggtcaccgcgggaggctgcccccatggcttctatcaccgtggacsgggagtctctactgggtgcgacggtcatacccsfccsgcacsctgtgcgragccgtctcctcgcacctctggtgacggtgtctacagtc:ctcgcacccagactcctgggrgggcccggaccccagttcaactgtg貼tggrca^cgcctcccgtgaggatctcctgcctacctg*gggcscagcggtggaactcaaggactctaccta_cstctgcaccgtcagtcgtacgtggaccagcacgtaccgc:cgtggaggcagcaigggg"gcag這agagc(14)限定了全長(zhǎng)人源化Hu2B8Hv5a.1重鏈可變區(qū)和人IgGl(Glm(17，1)同種異型)重鏈恒定區(qū)的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEOIDNO.167)1evqlvqsgae61npsfqghvti121t)cgpsvfpla181ysisswtvp241vflfppkpkd301yrwsvltvlvkkpgesl:risadksistay*psskstsggrtssslgtqtyitlmisrtpevliq;dwlxigkeyscJcgsgysf仁lqwsslkasdaalgclv)tdycnvrih)cpsnttywmhwvrqmtarnyycarnyfpepvtvswnkvdkkv印kspgkglewxngevgsifdywggcdkthtcppckgqprepqvyinptngh仁nygtlv匕vssasfpavlgssgltlppsrcielt361knqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwgg421gnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(15)編碼人源化Hu2B8Hv5-51.1重鏈可變區(qū)的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEQIDNO.168)1atggggtcaaccgccatcctcgccctcctcctggctgttctccaaggagtctgtgccgaa61gtgcagctggtgcagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaagatctcc121tgtaagggttctggatacagctttaccacctactggatgcactgggtgcgccagatgccc181gggaaaggcctggagtggatgggggagattaatcctaccaacggtcatactaactacaat241ccgtccttccaaggccaggtcaccatctcagctgacaagtccatcagcactgcctacctg301cagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgccatgtattactgtgcgagaaactatgtt361ggtagcatctttgactactggggccaaggaaccctggtcaccgtctcctcag(16)限定了人源化Hu2B8Hv5-51.1重鏈可變區(qū)序列的蛋白盾岸列(沒有信號(hào)序列)(SEOIDNO.169)1evqivqsgaevkkpgeslkisckgsgysfttywmhwvrqmpgkglewmgei叩tnghtny61npsfqgqvtisadksistaylqwsslkasdtamyycarnyvgsifdywgqgtlvtvss(17)編碼全長(zhǎng)人源化Hu2B8Hv5-51.1重鏈可變區(qū)和人IgGl(Glm(17，1)同種異型)重鏈恒定區(qū)的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序蘊(yùn)(SEQIDNO.170)atggggtcaaccgccatcctcgccctcctcctggctgttctccaaggagtcfcgtgccgraa6112118124130136142148154160166172178184190136110211081114112011261gtgcagctggtgt貼ggg仁tccgtccttccc3gtgg3gcaggtagcatctaEtgggcccatgccctgggctggcgccctgatccctcagcattcctcttcctgcgtggrtggggfcgtggaggcgtgtggtcagggcagcccctgggagagcagacggctcc仁tgcagtctggtggagtggataaggccaggtcggtcttcccgcctggtcaaccagcggc:gtgcgtggtgacacacatgccctggacgtgagtgcatsatgcgcg仁cctcacgagaaccacagcctgacctgagcagaggtgctttsccaccctcgrgacaccgggccaa^ga^cctggcacccggactacttcgcacaccttccgtgccctccca3cscc貼gccacgaagaccctcccagcccctggtcaaatactggatgcgctg3ca^gtgccatgtattaccctggt仁Htcctccaagacccgaaccggccggctgtccagcagcttgggtgg^c站g汰ctca>tg^tctcctgaggtcaccgcgggaggcccatcgagactgcccccatggcttctstcaccgtggacaactgggtgcgacggtcatacactgtgcgaLgccgtctcctcgcacctdtggtgacggtgtctacagtcctctcctggg的gcccggaccccagttc站ctgcccggg3tgaccagcgaicatcgcctcccgtagagcaggtgccagatgccctgcctacctggggcscsgcggtggaactcaaggactctaccaaatcttgtaccgtcagtctgaggtcacagtacgtggaccagcacgtSLCggagtac站ggctgax:caagcgccgtggaggctggactccgcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcscaaccactacacgCagaagagC1381ctctccct:gt:ctccgggtaaatga33ya(18)限定了全長(zhǎng)人源化Hu2B8Hv5-51,1重鏈可變區(qū)和人IgGl(Glm(17，1)同種異型)重鏈恒定區(qū)的蛋白盾岸列(沒有信號(hào)岸列)(SEOIDNO.171)1evqlvqsgaevkkpgeslkisckgsgysfttywmhwvrqmpgkglewmgeinptnghtny61npsfqgqvtisadksistaylqwsslJcasdtamyycarnyvgsifdywgcjgtlvtvssas121tkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlgssgl181ysl8swtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkveplcscdkthtcppcpapellggps241vflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdv曰hedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynst301yrwsvltvlhgdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdelt3SIknqvsltclvkgfypsdiavewesngqperxnykttppvldsdgsfflyskltvdksrwgq421gnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(19)編碼人源化Hu2B8Kvl-39.1Kappa鏈可變區(qū)的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEQIDNO.172)。兩個(gè)可能的起始ATG以大些字母示出。1ATGgacATGagggtccccgctcagctcctgg明ctcctgctactctggctccgaggtgce61旦幽幽aeatccagatgacecagtctccal:cctocctgtctgcatctgtaggagacaga121gtcaccateacttgcaaggccagtgagaatgtggtttcttatgtatcctggtatcagcag181aaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatggggcatccaaccggaacactggggtc241ccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctg301caacctgaagattttgcaacttactactgtgggcagagttacaactatccgtacacgttt361ggccaggggaccaagctggagateaaac(20)限定了人源化Hu2B8Kvl-39.1Kappa鏈可變區(qū)的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEQIDNO.173)1dicjmtqspssIsasvgdrvtitckasenvvsyvswyqqkpgkapklliygasnrntgvps61rfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycgqsynypytfgqgtkleik(21)編碼人Kappa鏈恒定區(qū)(Km(3)同種異型)(等位基因2)的核酸序列(SEQIDNO.174)1gaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctg61gaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagt121ggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggaca181gcaaggacagcacctacagcctcagcagcacectgacgctgagcaaagcagactacgaga241aacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaaga301gcttcaacaggggagagtgttga(22)限定了人Kappa鏈恒定區(qū)(Km(3)同種異型)(等位基因2)的蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO.175)。第一個(gè)氨基酸得自可變區(qū)最后一個(gè)核苷酸和Kappa輕鏈序列的開始兩個(gè)核苷酸的翻譯產(chǎn)物。1rtvaapsvfifppsdeqlksgtaswclinnjfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqd<51skdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(23)編碼全長(zhǎng)人源化Hu2B8KvI-39.1輕鏈可變區(qū)和人Kappa鏈恒定區(qū)(Km(3)同種異型)(等位基因2)的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序M1(SEQIDNO.176)1a匕ggacatgagggtccccgctcagctcctggggctcctgctactctggctccgaggtgcc61agratgtgacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgc汪tctgtaggagacaga121gtcaccatcsct仁gca丑ggccagtgagaatgtggtttcttatgtatcctggtatcagcag181貼accagggaaagcccctaagctcctgatctatg*ggrgrcatccaaccggaacactggggtc241ccatcaaggttcag仁ggcagtgg汪tctgggacagatttcactctcaccatc汪gcagtctg301caacctgaagattttgcaacttactactgtgggcagagttacaactatccgtacacgttt361ggccaggggaccaagctggagatcaaacgaactgtggcrtgcaccatctgtcttcatcttc421ccgcca匕ctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataac481ttctatcccagagaggccaaagtacagtgg"aaggtggataacgccctccaatcgggtaac541tcccaggagsgtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagca^caccSOIctgacgctga^gcsa^gcagact3cgagaaac3caaag仁ctscgrcctgcgsagtcacccsu:66flcagggcctgagctcgcc:cgtcacaaagagcttca汪caggggagagtgttg*a(24)限定了全長(zhǎng)人源化Hu2B8KvI-39.1輕鏈可變區(qū)和人Kappa鏈恒定區(qū)(Km(3)同種異型)(等位基因l)的蛋白質(zhì)序列卿IDNO.177)1diqmtqspsslsasvgdxvtitckasenwsyvswyqqkpgkapklliygasnrntgvps61rfsgssfsgtdftlt丄sslqpedfatyycggsynypytfgggtkleikrtvaapsvfif卯121sdeglksgtaswcllnnfypreakvgwkvdnalqsgnsgesvteqdskdstyslsstlt181ls〗cadyekhkvyacevthqgIsspvtksfnrgec(25)編碼人源化Hu2B8Kv3-15.1輕鏈可變區(qū)的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEQIDNO.178)1gtggaagccccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccactgga6〗gaaatagtgatgacgcagtctccagccaccctgtctgtgtctccaggggaaagagccacc121ctctcctgcaaggccagtgagaatgtggtttcttatgtatcctggtaccagcagaaacct181ggccaggctcccaggetcctcatctatggggcatccaaccggaacactggtatcccagcc241aggttoagtggcagtgggtctgggacagagttcactctcaccatcagcagcctgcagtct301gaagattttgcagtttattactgtgggcagagttacaactatccgtacacgtttggccag361gggaccaagctggagatcaaac(26)限定了人源化Hu2B8Kv3-15.1輕鏈可變區(qū)的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEQIDNO.179)61rfsgsgsgteftltisslqsedfavyycgqsynypytfgqgtkleik(27)編碼全長(zhǎng)人源化Hu2B8Kv3-15.1輕鏈可變區(qū)和人Kappa鏈恒定區(qū)(Km(3)同種異型)(等位基因2)的核酸(下劃線的為信號(hào)序列)(SEQIDNO.180)1atggaagccccagcgcagcttctcttcctcc仁gctactctggctcccagataccactgga51gaaatagtgatgacgcagtctccagccaccctgtctgtgtctccaggggasagagccacc121ctctcctgcaaggccagtgagaatgtggtttcttatgtatcctggtaccagcagaaacct181ggccaggctcccaggctcctcatctatggggcatccaaccggaacactggtatcccagcc241aggttcagtggcagtgggtctgggacagagttcactctcaccatcagcagcctgcagtct301gaagattttgcagtttattactgtgggcagagttacaactatccgtacacgtttggrccag361gggaccaagctggagatc站acgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgcca421fcctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgrtgtgcctgctgaataacttctat481cccagragagrgccaaagtaca2rtg"gaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccag541gagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacg601ctgagcaaagcagactgicgag&aacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggc661ctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttga(28)限定了人源化Hu2B8Kv3-15.1輕鏈可變區(qū)和人Kappa鏈恒定區(qū)(Kin(3)同種異型)(等位基因2)的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序麼(SEQIDNO.181)1eivmtqspatlsvspgeratlsckasenwsyvswyqqkpgqaprlliygasnrntgipaGlrfsgsgsgteftltisslqsedfavyycgqsynypytfgqgtkleikrtvaapsvfifpp121sdeqlksgtaswcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstlt181lskadyekhkvyacevthqglsspvtksfn巧ec為了方便，表13提供了本部分中討論的抗體的全長(zhǎng)序列與序列表中列出的那些序列之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系的索引表。表13<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>B.人源化方法2用于減小小鼠2B8抗體免疫原性的第二種人源化方法是基于Studnicka等人(1994)PROTEINENG.7:805-814中所述的方法。鑒定出與小鼠2B8的重鏈可變區(qū)和kappa鏈可變區(qū)的同一性最高(在氨基酸的水平上)的重鏈和kappa鏈人種系可變區(qū)。根據(jù)殘基變化影響結(jié)合或免疫原性的可能的風(fēng)險(xiǎn)，將在小鼠與人之間不同的殘基轉(zhuǎn)換成人的序列。在重鏈可變區(qū)(產(chǎn)生LR2B8HC)和kappa可變區(qū)(產(chǎn)生LR2B8LC),將低風(fēng)險(xiǎn)的殘基(即，在其變化時(shí)可能不影響抗原的結(jié)合而且還會(huì)減小潛在的免疫原性的殘基)變?yōu)槿说陌被?。此外，在重鏈可變區(qū)(產(chǎn)生LRMR2B8HC)和kappa可變區(qū)(產(chǎn)生LRMR2B8LC)中，將低風(fēng)險(xiǎn)和中等風(fēng)險(xiǎn)的殘基(即，在其變化時(shí)稍有可能影響抗原的結(jié)合但是還會(huì)減小潛在的免疫原性的殘基)變?yōu)槿说陌被?。將人IgGl重鏈恒定區(qū)(Glm(3)同種異型(等位基因l))加入到兩個(gè)經(jīng)改造的人重鏈可變區(qū)的羧基末端，并將人Kappa恒定區(qū)(Km(3)同種異型(等位基因l))加入到兩個(gè)經(jīng)改造的人輕鏈可變區(qū)的羧基末端，由此產(chǎn)生四個(gè)經(jīng)改造的人抗體鏈。首先，通過基因合成的方法合成可變區(qū)核酸序列，然后將該序列加入到人恒定區(qū)序列中。將這些經(jīng)改造的人抗體克隆到哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)表達(dá)載體中，而后以四種可能的重鏈加輕鏈的組合表達(dá)蛋白質(zhì)。如下所述，使用常規(guī)的技術(shù)測(cè)定嵌合體、嵌合體/人源化抗體、或人源化抗體與人HGF的結(jié)合。編碼每一種人源化抗體的核酸序列和限定每一種人源化抗體的蛋白質(zhì)序列總結(jié)如下。在該部分中，每個(gè)可變區(qū)的最后一個(gè)核普酸是由可變區(qū)/恒定區(qū)連接體所產(chǎn)生的下一個(gè)密碼子的第一個(gè)堿基。該核苷酸包含在可變區(qū)中，這是因?yàn)槠錇橥怙@子的一部分。以下所列的恒定區(qū)的氨基酸序列包含該連接體密碼子的翻譯產(chǎn)物。(1)編碼人源化LR2B8HC重鏈可變區(qū)的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEQIDNO.182)1atgggctggtcatatattattctctttcttgttgctaocgctaccgatetecactcteaa61gtccaactcgtacaaccaggcgctgaagtcgtaaaacccggaacatctgttaaactctca121tgcaaagcctcaggatacactttcacaacttactggatgcattgggtcaatcaagccccc181ggacaaggcctcgaatggattggcgaaattaacccaactaaeggacatactaattataat241gaaaaatttaagggcaaagctacactcaccgtcgataaatcaacctctacagcttatatg301gaactttcatccctgagatcagaagatacagccgtetaetattgcgccagaaactacgta361ggatcaatattcgattactggggtcaaggcactctcctcacagtcagctcag(2)限定了人源化LR2B8HC重鏈可變區(qū)的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序麼(SEQIDNO.183)1qvqlvqpgaewkpgtsvklsckasgytfttywmhwvnqapgqglewigeinptnghtny61nekfkgkatltvdkststaymelsslrsedtavyycarnyvgsifdywgqgtlltvss(3)編碼人IgGl重鏈恒定區(qū)(Glm(3)同種異型)(等位基因l)的核酸序列(SEQIDNO.184)1ccagcaeaaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggg61gcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgt121ggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtectacagtcetcag181gactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacc;cagacct241acatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagccca301aatcttgtgacaaaactcacacatgtccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggac361cgtcagtcttcctcttccccceaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccetg421aggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggt481acgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca541gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaagg601agtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcea661aagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggaga721tgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcg781ccgtggagtgggagagcaatgggcagccgg祖aacaactacaagaccacgcctcccgtgc841tggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggc901agcaggggaacgtcttctcatgctocgtgatgcatgaggetctgcacaaccactacacgc961agaagagcctctccctgtccccgggtaaatga(4)限定了人IgGl重鏈恒定區(qū)(Glm(3)同種異型)(等位基因l或2)的蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO.185)。第一個(gè)氨基酸得自可變區(qū)最后一個(gè)核苷酸和IgGl重鏈序列的開始兩個(gè)核苷酸的翻譯產(chǎn)物。1astkgpsvQjlapsskstsggtaalgclvkdyj^epvtvswnsgaltsgvh飾avlqss61glyslsswtvpssslgtqtyienvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellgg121psvflfppkpkdtlmisrtpevtcwvdvshedpevkfhwyvdgvevhnaktkpreeqyn181styrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsree241mtknqvsltcIvkgfypsdiavewesngqpe皿ykttppvldsdgsfflyskltvdksrw301qqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(5)編碼全長(zhǎng)重鏈人源化LR2B8HC重鏈可變區(qū)和人IgGl重鏈恒定區(qū)(Glm(3)同種異型)(等位基因1)的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序蘊(yùn)(SEQIDNO.1atgggctggt186)1211812413S1gtcc站ctcgtgcaaagcct421aagggcccat481gccctgggct541ggcgccctga5S1aacg仁g&atc721gacaaaactc781ttcctcttcc841tgcgtgg"tgg301ggcgtggagg961cgtgtggtca1021tgca^gtct1081gggcEigcccc1141aaccaggtca1201tgggaga_gca1261gacggc仁cct1321aacgtcttct1381ctctccctgttctc仁t仁c仁tgt仁gctaccgctaccgatgtgcactctcaaagggca站gcccctgagatctcgattactgcggtcttc;ccgcctggtca^gcgtggtgacacaagcccagcccca^a^cctggacgtgsgtgcat站tgcgcgtcctC3cgcctgacctgtcttcctctaccccgggrtaacgctgaagtctttcacaacttacactcacccgtgccctcccgtcctgcaccctcccagcccctggtcaaatagcaagctcgtaaaacccgrgccgtctactcccgaaccggccggctgtccgcacctgaacctcatgatctcctgagg"tcaccgcgggaggctgccccc這tggcfctctatcaccgtggacagaacatctgtattgggtcaaacgga^atscattgcgccagcagtcagctcgcacctctggtgscggtgtcgcacccsigacgagttgagcctcctggggggagttcsactgagcagtacaaccagcgacatcgcctcccgt叫agcaggtgt站actctcatcaagcccccagcttata^tga祖ctacgt3gggcacagcggtggaactcasiggactctscctacatctgccaa^tcttgtaccgtcagtcgtacgtggscgga_gtacasgcgccgtggaggctggactccgcagcagggggcagaagagc(6)限定了全長(zhǎng)重鏈人源化LR2B8HC重鏈可變區(qū)和人IgGl重鏈恒定區(qū)(Glm(3)同種異型)(等位基因1)的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEQIDNO.187)1qyqlvqpgae121tkgpsvfpla181yslsswtvp241vf工fppkp]cd301yrwsvl仁vl361knqvsltclv421gnvfscsvmhtlmisrtpevsctosgytftmelsslarsecicmmhkpsntslslspgktywmhwvngafpepvtvsvmkvdk:rvep)csdpevkfnwyvnyk;ttppvldpggg工ewigevg曰ifdywggsgaltsgvhtcdkthtcppcdgvevhnaktJcgqp:repqvysdgsfflyskinp仁ngh仁nyfpavlgssglpapellggpskp;reeqyns仁ltvdksrwgg(7)編碼人源化LRMR2B8HC重鏈可變區(qū)的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEQIDNO.188)1atgggtt鵬catatattatactctttctc咖gccaccgccaccgacgtacactctcag61gttcaactcgtacaacecggcgccgaagtcaagaaaccaggaacatcagtcaaactctca121tgtaaagcaagcggatacacctttactacttattggatgcattgggtaagacaagccccc181ggacaaggactcgaatggataggcgaaataaatcccactaatggacatacaaattataat241caaaaatttcaaggacgcgctacactcaccgtcgataaatcaacctcaaccgcatacatg301gaactcagctccctccgatccgaagacactgccgtttattattgtgccagaaactatgta361ggatctattttcgattactggggacaaggaacacttctcaccgtaagctcag(8)限定了人源化LRMR2B8HC重鏈可變區(qū)的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEQIDNO.189)1qvqlvqpgaevkkpgtsvklsckasgytfttywmhwvrqapgqglewigeinptnghtny61nqkfqgratltvdkststayme〗sslrsedtavyycamyvgsifdywgqgtlltvss(9)編碼全長(zhǎng)重鏈人源化LRMR2B8HC重鏈可變區(qū)和人IgGl重鏈恒定區(qū)(Glm(3)同種異型)(等位基因l)的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEQIDNO.190)1atgggttgqtcstatattstactctttctcgtagccaccgccaccrgacgt這cactctcsg121181241301361421481S416016617217818419019611021108111411201126113211381gg3tctsttta^gggcccatgccctgggctggcgccctgatccctca_gcaaacgtgaatcttcctcttcctgcgtggtggggcgtggaggcgtgtggtcatgca^ggtcttgggagagcactctccctgtccctccg"atcgcctggtc站ccagcggcgtgcgtggtgacacacatgtcctggacgtgagtgcataatgcgcgtcctcscgcctgacctgratgggcagcctcttcctctacatgctccgtctttactactcgaagacactcctggcacccggactacttcgcacaccttccgtgccctccaccgtgcccac33ggacacccgtcctgcacggtgtacacctattggatgcgtcgaXaaatgccgtttattcccgaaccggccggctgtccagcagcttggctcatgatcfccagga_ctggccccatcgagaggcttctatctacaagaccagaacatcagtattgggtaagattgtgccagccgtaagctcgcacctctggtgacggtgtcg&gttgagcctcctggggggcccggaccccagttcraactgagcagtacaatgeiELtggcaaccagrcgacatcgcctcccgtagagcaggtgacca_cta_cax:ax:aagcccc:c貼attata^tcgcatacatgaaactatgtasgccagcacagggc3c3gcggtggaactca3ggactct3cctacatctgccaaatcttgtaccgtcagtctgaggtcaca_gtacgtggaccagcacgteicggagtac站gcgccgtggaggcagaagagc(10)限定了全長(zhǎng)重鏈人源化LRMR2B8HC重鏈可變區(qū)和人IgGl重鏈恒定區(qū)(Glm(3)同種異型)(等位基因l)的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序蘊(yùn)(SEQIDNO.191)lqvqlvqpgaevkkpgtsvklsckasgytfttywmhwvrqapgqglewigeinptnghtny61nqkfggratltvdkststaymelsslrsedtavyycarnyvgsifdywgqgtlltvssas121tkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssgl181yslsswtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggps241vflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvsiiedpevJcfnwyvdgvevhnaJctJcpreeqynst301yrwsvltvlhq;dwliigkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemt361kngvsltc:工vkgfypsdiavewesnggpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqg421gnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(11)編碼人源化LR2B8LC輕鏈可變區(qū)的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEQIDNO.192)1at戰(zhàn)'aaagtc叫acccttgta加atctctattcttctttggttgtatggagcagacg^c61gacattgtgatgacccaatcccccgatagtatggccatgagtgtaggagaaagagteacc121cttaattgcaaagcctccgaaaatgtcgttteatatgtgtettggtatcaacaaaaaccc〗8]ggccaatcacccaaacttctcatatacggcgcttcaaacagaaacacaggcgttcccgac241agatttagtggatccggateagctacagatttcacccttaccatcagttcagttcaagca301gaagacgttgcagactateattgcggacaatcttataaetacccttacacattcggacaa(12)限定了人源化LR2B8LC輕鏈可變區(qū)的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEQIDNO.193)1divmtqspdsmamsvgervtlnckasenwsyvswyqqkpgqspklliygasnrntgvpd61rfsgsgsatdftltissvqaedvadyhcgqsynypytfgqgtkleik(13)編碼人Kappa鏈恒定區(qū)(Km(3)同種異型)(等位基因1)的核酸序列(SEQIDNO.194)Igtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctg61gaaptgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagt121ggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggaca181gcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgaga241aacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaaga301gcttcaacaggggagagtgttag(14)限定了人Kappa鏈恒定區(qū)(Km(3)同種異型)(等位基因1)的蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO.195)。第一個(gè)氨基酸得自可變區(qū)最后一個(gè)核苷酸和Kappa輕鏈序列的開始兩個(gè)核苷酸的翻譯產(chǎn)物。1rtvaapsvfi:^)psdeqlksgtaswcllnrrfypreakvqv/kvdnalqsgnsqesvteqd61skdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksftirgec(15)編碼全長(zhǎng)人源化LR2B8LC輕鏈可變區(qū)和人Kappa鏈恒定區(qū)(Km(3)同種異型)(等位基因l)的核酸序列(SEQIDNO.196)工atgqraaagtcagacccttgtattcatctctattct仁ctttggttgtatggsgcagacggc61geicattgtgatgacccaatcccccgatagtatggccatgagtgtaggagstsiag汰gtcacc121cttaattgcaaagcctccgaaaatgtcgtttcatatgtgtcttggtatca曰caaaaaccc181ggccaatcacccaaacttctcatatacggcgcttcaaacagaaacacaggcgttcccgac241agatttagtggatccggatcagctacagatttcacccttaccatcagttc3gttcaagca301g^agacgttgcagactatcattgcggacaatcttataactacccttacacattcggacaa3S1ggaaccaaactcgaaatt站acgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgcca421tctgatgagrcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaata在cttctat481cccagragaggccaaagteicagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccag541gsgagtgtcacagagcaggecagcaaggscagcacctacagcctcagcagcaccctgacg601ctgagcaaagcagactacgaga站cac幼agtctacgcctgcgstetgtca_cccatcagggc,661ctgagctcgcccgtcac貼agagcttceiacaggggagagtgttag(16)編碼人源化LR2B8LC輕鏈可變區(qū)和人Kappa鏈恒定區(qū)(Km(3)同種異型)(等位基因l)的蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO.197)1divmtcjspdejmanasvgervtlnckaseiwvsyvswyqgkpgcjs沐lliygasnratgvpdSirfsgsgsatdftltissvgaedvndyhcgqsynypytfgqgtkleikrtvaapsvfifpp121sdeglksgtaswcllnnfypreakvqwkvdnalgsgnsgesvteqdskdstyslsstlt181lskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(17)編碼人源化LRMR2B8LC輕鏈可變區(qū)的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEQIDNO.198)1atggaatcpcaaacccttgttttcatctctatccttctctggctttat明cgccgacgga61gacatcgtaatgacacaatcccctgactctcttgctatgagcttgggcgaaegagtaaca121cttaactgcaaagcatccgaaaatgtcgtatcttacgtatcctggtatcagcaaaaacct18]ggtcaaagtcctaaacttcttatatatggtgcaagtaatcgtgaaagtggcgtcecagac24]agatttagcggttcaggttcagcaaetgactttacacttacaatttctagcgttcaggcc301gaagacgttgcagactatoattgtggacaatcttataactatccttatactttcggacaa361ggcactaaacttgaaattaaac(18)限定了人源化LRMR2B8LC輕鏈可變區(qū)的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEQIDNO.199)1divmtqspdslamslgervtlnckasenwsyvswyqqkpgqspklliygasnresgvpd61rfsgsgsatdftltissvqaedvadyhcgqsynypytfgqgtkleik(19)編碼全長(zhǎng)人源化LRMR2B8LC輕鏈可變區(qū)和人Kappa鏈恒定區(qū)(Km(3)同種異型)(等位基因1)的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序蘊(yùn)(SEQIDNO.200)1atggaatcccaaaccct:tgttttcatctctatccttctctggctttatggcgccgacgga61gacatcgtaatgacacaatcccctgactc仁ct仁gctatgagcttgggcgaaegagtaaca121ettaactgeaaagcatccgaaaatgtcgtatettaegtatcctggtatcagcaaaaacct181ggtcaaagtcctaaacttcttatatatggtgcaagtaatcgtgaaagtggcgtcccagac241agatttagcggttcaggttcagcaactgactttacacttacaatttctagcgttcaggcc301gaagacgttgcagactatcattgtggacaatcttataactatccttatactttcggacaa361ggcactaaacttgaaattaaaegtaeggtggctgcaccatc仁gtcttcatcttcccgcca421tctgatgagcagttgaaatctggaactgeetctgttgtgtgcctgctgaataacttctat481cccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctecaategggtaactcccag541gagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgSOlctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggc661ctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag(20)限定了全長(zhǎng)人源化LRMR2B8LC輕鏈可變區(qū)和人Kappa鏈恒定區(qū)(Km(3)同種異型)(等位基因1)的蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO.201)1divmtqspdslamslgervtlnckasenwsyvswyqqkpgqspklliygasnresgvpd61rfsgsgsatdftltissvqaedvadyhcgqsynypytfgqgtkleikrtvaapsvfifpp121sdeqlksgtaswcllnnfypreakvqwkvdnalgsgnsqesvteqdskdstyslsstlt181Iskadyekhkvyacevthgglsspvtksfnrgec為了方便，表14提供了本部分中討論的抗體的全長(zhǎng)序列與序列表中列出的那些序列之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系的索引表。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>表15總結(jié)了通過在上文中描述的本實(shí)施例的人源化方法1和人源化方法2制備的人源化2B8抗體的重鏈CDR序列(Kabat定義)。表15<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>表16總結(jié)了通過在上文中描述的本實(shí)施例的人源化方法1和人源化方法2制備的人源化2B8抗體的輕鏈CDR序列(Kabat定義)。表16<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>C.人源化2B8抗體的結(jié)合親和力使用BIAcoreTIOO裝置通過表面等離子體共振來評(píng)估抗體結(jié)合親和力以及相互作用的動(dòng)力學(xué)。使用胺偶聯(lián)(BIAcore，CatalogNo.BR-1000-50),根據(jù)制造商的建議，通過標(biāo)準(zhǔn)的偶聯(lián)方法將小鼠抗人免疫球蛋白(JacksonI瞧noResearchLabs,209-005-098)固定于羧甲基化的葡聚糖CM4的傳感器芯片(BIAcore，CatalogNo.BR-1005-34)上。在25。C下，使用PBS(GIBCO，CatalogNo.14040-133)作為運(yùn)行緩沖劑進(jìn)行分析，所述PBS含有0.05%表面活性劑P20(BIAcore，CatalogNo.BR-1000-54)、2mg/mLBSA(EMD，CatalogNo.2930)以及10mg/mLCM-葡聚糖的鈉鹽(Fluka，CatalogNo.86524)。抗體被捕獲在流速為10liL/min的單個(gè)流動(dòng)的細(xì)胞上。用于每種抗體的注射時(shí)間是可變的，從而使每個(gè)循環(huán)中捕獲大約20RU的抗體。以60|iL/min的速度向參照表面(沒有被捕獲的抗體)和活性表面(捕獲了待測(cè)試的抗體)上依次注射緩沖劑或稀釋于運(yùn)行緩沖劑中的HGF(R&DSystems,CatalogNo.294-HGN-025),時(shí)間為2分鐘。根據(jù)濃度，對(duì)解離相監(jiān)測(cè)15或90分鐘。然后在開始另一個(gè)循環(huán)之前，使用lOmMpH2.0的甘氨酸-HCl(BIAcore，CatalogNo.BR-1003-55)使所述的表面再生，其中所述甘氨酸-HC1在3分鐘內(nèi)以60pL/min的流速注入。所測(cè)試的HGF的濃度為1，88、3.75和7.5nM。利用BIAevalutation軟件的動(dòng)力學(xué)函數(shù)及推薦的差級(jí)，確定動(dòng)力學(xué)參數(shù)。每種抗體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)(ka(結(jié)合速率常數(shù))，kd(解離速率常數(shù))和K。(平衡解離常數(shù)))總結(jié)于圖8中。圖8總結(jié)的結(jié)果表明，超級(jí)人源化重鏈(Hu2B8Hv5a.1、Hu2B8Hv5-51.1或Hu2B8Hvl-f.1)和輕鏈(Hu2B8Kvl-39.1或Hu2B8Kv3-15.1)的某些組合保持了與嵌合體2B8(小鼠可變區(qū)與人恒定區(qū))和2B8相同的與HGF的結(jié)合親和力(KD)(表5)。D.互斥結(jié)合分析使用BIAcoreT100裝置通過表面等離子體共振技術(shù)來評(píng)估與HGF的互斥結(jié)合。使用胺偶聯(lián)(BIAcore，CatalogNo.BR-1000-50)，根據(jù)制造商的建議，通過標(biāo)準(zhǔn)的偶聯(lián)方法將小鼠抗人免疫球蛋白(JacksonImmunoResearchLabs，209-005-098)固定于羧甲基化的葡聚糖CM5的傳感器芯片(BIAcore，CatalogNo.BR-1006-68)上。在25。C下，使用PBS(GIBCO，CatalogNo.14040-133)作為運(yùn)行緩沖劑來進(jìn)行分析，所述PBS舍有0.05%表面活性劑P20(BIAcore，#BR-1000—54)、2mg/mLBSA(EMD，CatalogNo.2930)以及10mg/mLCM-葡聚糖的鈉鹽(Fluka，CatalogNo.86524)。人源化的抗體被捕獲在流速為30mL/min的單個(gè)流動(dòng)的細(xì)胞上。用于每種抗體的注射時(shí)間是可變的，從而使每個(gè)循環(huán)中捕獲大約150RU的抗體。以30jaL/min的速度向捕獲的人源^化的抗體上注射稀釋于運(yùn)行緩沖劑中的最終濃度為7.5|ig/mL的HGF(R&DSystems,CatalogNo.294-HGN-025),時(shí)間持續(xù)90秒。監(jiān)測(cè)HGF的結(jié)合，隨后以30yL/min的速率注入小鼠2B8抗體或多克隆山羊抗HGF的抗體(R&DSystems,AF294)，時(shí)間持續(xù)3分鐘。然后在開始另一個(gè)循環(huán)之前，使用10mMpH2.0的甘氨酸-HCl(BIAcore，CatalogNo.BR-1003-55)使所述的表面再生，其中所述甘氨酸-HCl是在3分鐘內(nèi)以60uL/min的流速注入。所得結(jié)果總結(jié)于圖9中。圖9中總結(jié)的結(jié)果表明，人源化的2B8抗體和嵌合體2B8抗體二者都抑制了小鼠2B8與HGF的結(jié)合。這些結(jié)果證明，人源化的抗體仍如同原始的2B8抗體結(jié)合相同的HGF表位。實(shí)施例13—人源化的2B8變體的制備a.HUMANENGINEERED抗體將密碼子和表達(dá)優(yōu)化的低風(fēng)險(xiǎn)的以及低風(fēng)險(xiǎn)至中等風(fēng)險(xiǎn)的經(jīng)改造的人輕鏈(分別為L(zhǎng)R2B8LC和LRMR2B8LC)和重鏈(分別為L(zhǎng)R2B8HC和LRMR2B8HC)同步克隆到X0MA的瞬時(shí)抗體表達(dá)載體中，該載體含有人Kappa和Gamma-1恒定區(qū)結(jié)構(gòu)模塊(module)。通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HEK293E細(xì)胞中產(chǎn)生4種經(jīng)改造的人2B8變體。所產(chǎn)生的4種抗體如下HE2B8-1=LR2B8HC(+IgGl恒定區(qū)(Glm(3)同種異型(等位基因l))(SEQIDNO.187)+LR2B8LC(+Kappa恒定區(qū)(Km(3)同種異型(等位基因l)))(SEQIDNO.197)HE2B8-2=LR2B8HC(+IgGl恒定區(qū)(Glm(3)同種異型(等位基因l))(SEQIDNO.187)+LRMR2B8LC(+Kappa恒定區(qū)(Km(3)同種異型(等位基因l)))(SEQIDNO.201)HE2B8-3=LRMR2B8HC(+IgGl恒定區(qū)(Glm(3)同種異型(等位基因l))(SEQIDNO.191)+LR2B8LC(+Kappa恒定區(qū)(Km(3)同種異型(等位基因l)))(SEQIDNO.197)HE2B8-4=L讓2B8HC(+IgGl恒定區(qū)(Glm(3)同種異型(等位基因l))(SEQIDNO.191)+LRMR2B8LC(+Kappa恒定區(qū)(Km(3)同種異型(等位基因l)))(SEQIDNO.201)將輕鏈和重鏈共轉(zhuǎn)染到XOMA的懸浮適應(yīng)HEK293E細(xì)胞中，所述細(xì)胞培養(yǎng)在2升的搖瓶的IS293培養(yǎng)基(IrvineScientific,Irvine,CA)中。在搖瓶中24小時(shí)后，對(duì)200mL的轉(zhuǎn)染細(xì)胞離心，然后重懸于40mL的新鮮培養(yǎng)基中并轉(zhuǎn)移至Integra燒瓶(WilsonWolfManufacturing公司，MN)中，用于生產(chǎn)。溫育7天后，將細(xì)胞懸浮液從Integra瓶中取出，離心，并保留培養(yǎng)物上清液。在蛋白質(zhì)A離心柱(Pro-Chem)上純化培養(yǎng)物上清液中的抗體，然后用PBS透析，再進(jìn)行濃縮和除菌過濾。b.SUPERHUMANIZEDTm抗體利用HindIII和EcoRI限制性位點(diǎn)，將全長(zhǎng)Hu2B8_Hv5-51.1+人IgGl恒定區(qū)(Glm(3)同種異型)cDNA克隆到pEE6.4(LonzaBiologies,Berkshire,UK)中。利用HindIII和EcoRI限制性位點(diǎn)，將全長(zhǎng)Hu2B8_Kvl-39.1可變區(qū)+人Kappa恒定區(qū)cDNA、以及全長(zhǎng)Hu2B8-Kv3-15.1可變區(qū)+人Kappa恒定區(qū)cDNA分別克隆到pEE14.4(LonzaBiologies)中。通過Notl/SalI消化，移取hCMV-MIE啟動(dòng)子+全長(zhǎng)Hu2B8-Hv5-51.l+人IgGl恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域(Glm(3)同種異型)c醒+SV40polyA片段(在pEE6.4中)，并通過Notl/Sall位點(diǎn)，插入到任一個(gè)Kappa鏈pEE14.4載體中，由此產(chǎn)生2個(gè)不同的表達(dá)載體，每一貫都同時(shí)表達(dá)重鏈和輕鏈，從而產(chǎn)生以下抗體sh2B8-9(Glm(3))=hu2B8Hv5-51.1(+IgGl恒定區(qū)(Glm(3)同種異型)(等位基因2))(SEQIDNO.210)+hu2B8Kvl-39.1(+Kappa恒定區(qū)(Km(3)同種異型(等位基因2)))(SEQIDNO:177)sh2B8-12(Glm(3))=hu2B8Hv5-51.1(+IgGl恒定區(qū)(Glm(3)同種異型)(等位基因2))(SEQIDNO.210)+hu2B8Kv3-15.1(+Kappa恒定區(qū)(Km(3)同種異型(等位基因2)))(SEQIDNo.181)以下列出編碼人IgGl重鏈恒定區(qū)Glm(3)同種異型(等位基因2)以及每種全長(zhǎng)重鏈序列的核酸序列、以及限定了人IgGl重鏈恒定區(qū)Glm(3)同種異型(等位基因2)以及每種全長(zhǎng)重鏈序列的蛋白質(zhì)序列。輕鏈序列與實(shí)施例12中所述的相同。(1)編碼人IgGl重鏈恒定區(qū)(Glm(3)同種異型)(等位基因2)的核酸序列(SEQIDNO.207)1cctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggg61gcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgt121ggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcag181gactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacct241acatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagccca301aatcttgtgacaaaactcacacatgeccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggac361cgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctg421aggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggt481acgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca54]gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggaetggctgaatggcaagg601agtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaagaccatctcca661aagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggaga721tgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcg781ecgtggagtgggagagcaatgggcagceggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgc841tggactccgacggctccttcttectctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggc901agcaggggaacgtcttctcatgetccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgc961agaagagcctctccctgtctccgggtaaatga(2)限定了人IgGl重鏈恒定區(qū)(Glm(3)同種異型)(等位基因l或2)的蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO.208)。第一個(gè)氨基酸得自可變區(qū)最后一個(gè)核苷酸和IgGl重鏈序列的開始兩個(gè)核苷酸的翻譯產(chǎn)物。1astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtf^pavlqss61glyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellgg121psvflfjppkpkdtlmisrtpevtcwvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyn181styrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnka!pap〗ektislcakgqprepqvytlppsree241mtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrw301qqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(3)編碼含有人源化的Hu2B8Hv5-51.1重鏈可變區(qū)和人IgGl重鏈恒定區(qū)Glm(3)同種異型(等位基因2)的全長(zhǎng)鏈的核酸序列(下劃線的為信號(hào)序列)(SEQIDNO.209)1atgggcytcaaccgrccatcctcgcccfccct:cctggctgttctccaagg叫tctgtgcqraa61gtgcagctgg121tgtaagggtt181gggaaaggcc241ccgtccttcc301cagtggagcs361ggtagcatct421aag的cccat481gccctgggct661sacgtgaatc7217818419019611021108111411201126113211381ttcctcttcctgcgtggtggtgcaaggtctgggcagcccctgggagagcagacggctcc:taacgtcttctctctccctgrttgcagtctgggcctgaaggcttgactactgcggtcttcccccsgcggcgtaca^gcccagtggscgtgagccsac的agcgcctgacctgatgggcagcctcttcctctacatgctccgtctccgggtaaagcagaggtgctcggacaccgggccaaggscctggcaccccgtgccctccaccgtgcccacctccc:agcc3tg3aaaaagcccgtactggatgcgccatgtattaccctggtca仁cctccaagaccggctgtccagcagcttgggtggacaagagcacctgaax:c仁catgatctcctgaggtcacccatcgagactgcccccatggcttctatcgctctgcacaggga_gtctctactgtgcgagccgtctcctcgcacctctggrgagttgagcctcctggggggagttcaactgagcagtac站tgaatggcaaagacc曰tctccgcctcccgtccagatgccctgcctacctg站actatgttagcctccaccgggcacagcggtggaactcaaggactctacctacstctgcceiaatcttgtgtacgtggaccagcacgtacc這aagccaaacgccgtggaggctggactcc(4)限定了含有人源化的Hu2B8Hv5-51.1重鏈可變區(qū)和人IgGl重鏈恒定區(qū)Glm(3)同種異型(等位基因2)的全長(zhǎng)重鏈的蛋白質(zhì)序列(沒有信號(hào)序列)(SEQIDNO.210)levglvgsgaevkkpgesl]cisc3cgsgysft61npsfggqvtisadksistaylqwsslkasd121tkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdy181yslsswtvpssslgtgtyicnvnhkpsnt241vflfpp)cpk:dtirtdsirtpevtcvwdvshe301yrwsvltvlhgdwlng"keyJccJcvsnkalp361knqysltclv*kgfypsdiav421gnvfscsvmhealhiihytgkewesngqpenslslspgktywmhwvxqmtamyycarnyfp鄰vtvswnkvdkrvepksdpevkfnwyvnykttppvldvgsifdywggsgaltsgvhtdgvevhnaktsdgsfflyskinptnghtriygtlvtvssmsfpavlqssglpapellggpskpreeqynsttlppsreemt1tvd3csrwgg將每個(gè)雙表達(dá)載體都轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，并使用含有10%胎牛血清的DMEM進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，將細(xì)胞用含有4mML-谷氨酰胺的無血清培養(yǎng)基ISGR0TM(IrvineScientific,SantaAna,CA)洗滌，并用該培養(yǎng)基代替原來的培養(yǎng)基。每天收集上清液，并用新的培養(yǎng)基代替收集的上清液，如此持續(xù)10天。將培養(yǎng)物上清液離心，過濾(0.45jam)并濃縮10-100倍。在ProSepvA樹脂(Millipore)上純化抗體，并用PBS透析，再進(jìn)行濃縮和除菌過濾。實(shí)施例14—人源化2B8變體的結(jié)合特性實(shí)施例13中制備的人源化的抗體以及實(shí)施例3中制備的重組HGF蛋白質(zhì)通過它們結(jié)合hHGF的能力來表征。使用BIAcoreT100裝置通過表面等離子體共振來分析抗體以評(píng)估其結(jié)合hHGF和實(shí)施例3中討論的融合蛋白質(zhì)的能力。使用胺偶聯(lián)(BIAcore，CatalogNo.BR-1000-50),才艮據(jù)制造商提供的說明書通過標(biāo)準(zhǔn)的偶聯(lián)方法將每種抗體固定于羧曱基化的葡聚糖CM5的傳感器芯片(BIAcore，CatalogNo.BR-1006-68)上。在25。C下，使用PBS(GIBCO，CatalogNo.14040-133)作為運(yùn)行緩沖劑來進(jìn)行分析，所述PBS含有0.05%表面活性劑P20(BIAcore，CatalogNo.R-1000-54)、2mg/mLBSA(EMD，CatalogNo.2930)和10mg/mLCM-葡聚糖的鈉鹽(Fluka，CatalogNo.86524)。將含有不同HGF融合蛋白質(zhì)的上清液或得自經(jīng)空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清液以30jaL/min的流速注射到每種抗體上，時(shí)間持續(xù)3分鐘。在注射完畢后30秒時(shí)，在基線上，以共振單位(RU)測(cè)定所得的結(jié)合。將結(jié)合與稀釋于運(yùn)行緩沖劑中的人HGF(R&DSystems,CatalogNo.294-HGN-025)相比較。通過將結(jié)合與對(duì)照表面相比較，監(jiān)測(cè)到不存在特異性的結(jié)合。結(jié)果總結(jié)于表17中。表17<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>表17中的結(jié)果表明，每種基于人源化的2B8的抗體以及所有的3中小鼠-人-小鼠嵌合體都結(jié)合rhHGF。實(shí)施例15_人源化2B8變體的結(jié)合親和力使用表面等離子體共振測(cè)定表15中列出的抗體的結(jié)合親和力以及相互作用的動(dòng)力學(xué)。使用胺偶聯(lián)(BIAcore，CatalogNo.BR-1000-50)，根據(jù)制造商提供的說明書通過標(biāo)準(zhǔn)的偶聯(lián)方法將小鼠抗人免疫球蛋白(JacksonLabs，CatalogNo.209-005)固定于羧甲基化的葡聚糖CM4的傳感器芯片(BIAcore，CatalogNo.BR-1006-68)上。在25C下，使用含有0.05%表面活性劑P20(BIAcore，CatalogNo.BR-1000-54)和2mg/mLBSA(EMD，CatalogNo.2930)的PBS(GIBCO，CatalogNo.14040-133)進(jìn)行分析?？贵w被捕獲在流速為10jiL/min的單個(gè)流動(dòng)的細(xì)胞上。用于每種抗體的注射時(shí)間是可變的，從而使每個(gè)循環(huán)中捕獲大約20RU的抗體。以60mL/min的速度向參照表面(沒有被捕獲的抗體)和活性表面(捕獲了待測(cè)試的抗體)上依次注射緩沖劑或稀釋于運(yùn)行緩沖劑中的HGF(R&DSystems,CatalogNo.294-HGN-025)，時(shí)間持續(xù)2分鐘。根據(jù)濃度，對(duì)解離相監(jiān)測(cè)15或90分鐘。然后在開始另一個(gè)循環(huán)之前，使用10mMpH2.2的甘氨酸-HCl(BIAcore,CatalogNo.BR-1003-54)使所述的表面再生，其中所述的甘氨酸-HC1是在3分鐘內(nèi)以60pL/min的流速注入的。所測(cè)試的HGF的濃度為0.46nM至7.5nM。利用BIAevalutationTM軟件的動(dòng)力學(xué)函數(shù)及推薦的差級(jí)，確定動(dòng)力學(xué)參數(shù)。每種抗體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)(ka(結(jié)合速率常數(shù))，kd(解離速率常數(shù))以及K。(平衡解離常數(shù)))總結(jié)于表18中。表18<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>這些數(shù)據(jù)表明，人源化的抗體具有快的結(jié)合速率OO、極慢的解離速率(U和極高的親和力(Kd)。具體而言，所述抗體的親和力為2.0-12pM。實(shí)施例16—比較25。C下和37匸下的結(jié)合親和力使用表面等離子體共振，在不同的條件下測(cè)定抗體HE2B8-4、sh2B8-9、sh2B8-12以及小鼠2B8的結(jié)合親和力以及相互作用的動(dòng)力學(xué)。使用胺偶聯(lián)(BIAcore，CatalogNo.BR-1000-50)，根據(jù)制造商提供的說明書通過標(biāo)準(zhǔn)的偶聯(lián)方法將小鼠抗人免疫球蛋白(JacksonLabs,CatalogNo.209-005)或兔抗小鼠免疫球蛋白(BIAcore，CatalogNo.BR-1005-14)固定于羧甲基化的葡聚糖CM4的傳感器芯片(BIAcore，CatalogNo.BR-1006-68)上。在25T下測(cè)定抗體sh2b8-9和sh2B8-12時(shí)，使用CM5傳感器芯片(BIAcore，CatalogNo.BR-1006-68)。在251C和37C下，使用含有0.05%表面活性劑P20(BIAcore，CatalogNo.BR-1000-54)和2mg/mLBSA(EMD，CatalogNo.2930)的PBS(GIBCO，CatalogNo.14040-133)作為運(yùn)行緩沖劑來進(jìn)行分析?？贵w被捕獲在流速為10jjL/min的單個(gè)流動(dòng)的細(xì)胞上。用于每種抗體的注射時(shí)間是可變的，從而使每個(gè)循環(huán)中捕獲大約20RU的抗體。以60pL/min的速度向參照表面(沒有被捕獲的抗體)和活性表面(捕獲了待測(cè)試的抗體)上依次注射緩沖劑或稀釋于運(yùn)行緩沖劑中的HGF(R&DSystems,CatalogNo.294-HGN-025)，時(shí)間持續(xù)2分鐘。根據(jù)濃度，對(duì)解離相監(jiān)測(cè)15或90分鐘。然后在開始另一個(gè)循環(huán)之前，使用lOmMpH2.2的甘氨酸-HCl(BIAcore，CatalogNo.BR-1003-54)使小鼠抗人免疫球蛋白傳感器芯片的表面再生，其中所述的甘氨酸-HC1是在3分鐘內(nèi)以60juL/min的流速注入的。在開始另一個(gè)循環(huán)之前，4吏用10mMpH1.7的甘氨酸-HCl(BIAcore，CatalogNo.BR-1003-54)使兔抗小鼠免疫球蛋白傳感器芯片的表面再生，其中所述的甘氨酸-HC1是在3分鐘內(nèi)以60juL/min的流速注入的。所測(cè)試的HGF的濃度為0.46nM至7.5nM。利用BIAevaluation軟件的動(dòng)力學(xué)函數(shù)及推薦的差級(jí)，確定動(dòng)力學(xué)參數(shù)。每種抗體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)(ka(結(jié)合速率常數(shù))，kd(解離速率常數(shù))以及K。(平衡解離常數(shù)))總結(jié)于表19中。表19<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table>如所預(yù)計(jì)的那樣，結(jié)合速率常數(shù)隨著溫度的升高而升高。另人驚奇地是，解離常數(shù)沒有隨著溫度的相應(yīng)升高而明顯改變。因此，總體的平衡解離常數(shù)(K。)比生理溫度(37。C)下的平衡解離常數(shù)小大約1.4至3倍(親和力更高)。實(shí)施例17—人源化的2B8變體的中和活性表征實(shí)施例14制備的抗體的(a)抑制hHGF與c-Met結(jié)合的能力以及(b)抑制4MBr-5細(xì)胞中由引入的BrdU所刺激產(chǎn)生的HGF的能力。按照以下所述進(jìn)行HGF-Met的結(jié)合抑制分析(中和分析)。通過ELISA檢測(cè)抗體抑制hHGF與c-Met結(jié)合的能力。具體而言，在4X:下，將Wallac96孑LDELFIA分析平板(Wallac/〉司，CatalogNo.AAAND-OOOl)用100|aL碳酸鹽包被緩沖劑(15mMNa2C03和34mMNa跳，pH9.0)中的6.25ng/mLHGF(R&DSystems,CatalogNo.294-HGN-025)包被16小時(shí)。然后，在室溫下將該分析平板用200jaLPBS中的5%非脫脂奶粉封閉1小時(shí)。在單獨(dú)的分析平板中，通過將濃度升高的處于研究中的抗體(O.033-250nM，2倍系列稀釋)加入到2nM生物素標(biāo)記的c-Met中來制備該抗體，其中所述的c-Met溶于含有5%由非脫脂奶粉的PBS中。根據(jù)制造商提供的說明書，以10:1的生物素c-Met的比例(Pierce,CatalogNo.21335)對(duì)c-Met(R&DSystems,CatalogNo.358-MT/CF)進(jìn)行生物素標(biāo)記。將每孔中的IOO|iL樣品轉(zhuǎn)移至分析平板中，并在室溫下溫育2小時(shí)。然后，將所得分析平板用PBS-0.l%Tween20洗滌3次，并在室溫下，與Eu標(biāo)記的鏈霉親和素(Wallac，CatalogNo.1244-360)溫育1小時(shí),其中Eu標(biāo)記的鏈霉親和素以1:1000的比例稀釋于DELFIA分析緩沖液(Wallac，CatalogNo.4002-0010)中。將所得板用DELFIA洗滌液(Wallac,CatalogNo.4010-0010)洗滌3次，并在室溫下與100|iL/孔的DELFIA增強(qiáng)溶液(Wallac#4001-0010)攪拌溫育15分鐘。使用銪示蹤法，在Victor3V儀器(PerkinElmer)上讀取所述平板。使用Prism計(jì)算IC5。的值。所得的ICs。值示于表20中。表20<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>表20的結(jié)果表明，所測(cè)試的人源化的抗體有效地中和HGF與c-Met的結(jié)合。此外，在實(shí)施例7(b)所述的細(xì)胞增殖分析中，對(duì)表17中的抗體也進(jìn)行了測(cè)試。結(jié)果總結(jié)于表21中。表21<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>表212的結(jié)果表明，所有測(cè)試的人源化的抗體都抑制HGF誘導(dǎo)的4MBr-5細(xì)胞的增殖。實(shí)施例18—人源化2B8變體的抗擴(kuò)散活性在實(shí)施例8所述的抗擴(kuò)散分析中，對(duì)表17中的抗體進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果總結(jié)于表22中。表22對(duì)HGF誘導(dǎo)的MDCK細(xì)胞擴(kuò)散的抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>+++極強(qiáng)，接近完全抑制++強(qiáng)烈抑制+可檢測(cè)程度的抑制表22中的結(jié)果表明，所有測(cè)試的人源化抗體對(duì)HGF誘導(dǎo)的擴(kuò)散的抑制程度都與小鼠單克隆抗體2B8的抑制程度相同。實(shí)施例19一對(duì)HGF刺激的c-Met磷酸化的抑制在實(shí)施例9所述的c-Met磷酸化分析中，對(duì)表17中的抗體進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果總結(jié)于表23中。表23<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>表23的結(jié)果表明，所有測(cè)試的人源化的抗體都是PC-3細(xì)胞中HGF誘導(dǎo)的c-Met磷酸化的有效抑制劑。實(shí)施例20—U87MG異種移植物模型中的腫瘤抑制在U87MG異種移植物模型中，測(cè)試本發(fā)明的人源化單克隆抗體抑制肺瘤生長(zhǎng)的能力。在37'C下在含有5%C02和95%空氣的氣氛的培養(yǎng)中擴(kuò)增U87MG細(xì)胞(ATCC)，其中包括含有10%胎牛血清、100單位/mL青霉素和100jag/mL鏈霉素的Dulbecco'sModifiedEagle培養(yǎng)基(DMEM)的培養(yǎng)基。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行次級(jí)培養(yǎng)，并通過使用胰蛋白酶-EDTA移取培養(yǎng)皿壁上的細(xì)胞進(jìn)行維持。通過胰蛋白酶消化來收集接近匯合的細(xì)胞，隨后將50°/。Matrigel(BDBiosciences;catalogno.356237)中的5乂106個(gè)細(xì)胞皮下注射到7周齡雌性ICRSCID小鼠(TaconicLabs)的肩胛骨之間的背部上側(cè)的區(qū)域中。使用卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)直徑(L)和短直徑(W)(mm)。如下計(jì)算腫瘤的體積(vol.):體積(mm3)-LxW2/2。當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)到大約200mni3時(shí)，將帶有腫瘤的小鼠隨機(jī)分成5組，每組10只小鼠。一組小鼠接受PBS，一組小鼠接受人IgG對(duì)照。其他4組中的每組小鼠接受人源化的抗體(HE2B8-1、HE2B8-2、HE2B8-3和HB2B8-4)中的一種。所有抗體的劑量均為0.25mg/kg體重，每周2次，并通過腹膜內(nèi)注射5個(gè)劑量。每星期記錄2次腫瘤的體積和小鼠的體重。利用學(xué)生t檢驗(yàn)分析腫瘤生長(zhǎng)的抑制。所測(cè)試的人源化的抗體在體內(nèi)是有活性的。HE2B8-1的腫瘤生長(zhǎng)抑制為57%，其p值為0.02;HE2B8-2的腫瘤生長(zhǎng)抑制為61%，其p值為0.02;HE2B8-3的腫瘤生長(zhǎng)抑制為85%，其p值為0.0004;而HE2B8-4的腫瘤生長(zhǎng)抑制為74%，其p值為0.001。沒有觀察到明顯的體重?fù)p失。在肋側(cè)皮下接種U87MG腫瘤的雌性NCR棵鼠(TaconicLabs)中，如上所述進(jìn)行隨后的研究。每組小鼠(每組IO只)都以0.5mg/kg的量接受以下治療中的一種PBS載體對(duì)照、huIgG對(duì)照、HE2B8-4或sh2B8-9。在最少5個(gè)星期內(nèi)，每周2次腹膜內(nèi)給予治療。每個(gè)治療組都表現(xiàn)為相似的腫瘤衰退，其中sh2B8-9的腫瘤生長(zhǎng)抑制為113%，HE2B8-4的胂瘤生長(zhǎng)抑制為115%，而最短的肺瘤生長(zhǎng)延遲為30天。所述兩種治療的耐受性均良好，并且明顯的體重沒有損失。通過引用并入本文為所有目的，本文所提及的每份專利文獻(xiàn)和科學(xué)文章的全部公開內(nèi)容均以引用方式并入本文。等價(jià)物本發(fā)明可以表現(xiàn)為其他具體形式，而不脫離本發(fā)明的精神或基本特征。因此，上迷實(shí)施方案在任何情況下都被認(rèn)為是示意性的，而不是限定本文所述的發(fā)明。因此，本發(fā)明的范圍由所附的權(quán)利要求書而不是上述說明來表明，并且在與權(quán)利要求等價(jià)的意義和范圍內(nèi)的所有改變都被認(rèn)為包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種結(jié)合人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的分離的結(jié)合蛋白質(zhì)，其包含(a)包含結(jié)構(gòu)CDRL1-CDRL2-CDRL3的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其中(i)CDRL1包含氨基酸序列SEQIDNO.18(2B8)，(ii)CDRL2包含氨基酸序列SEQIDNO.206(LRMR2B8LC)，以及(iii)CDRL3包含氨基酸序列SEQIDNO.20(2B8)；以及(b)免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，其中所述免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和所述免疫球蛋白重鏈可變區(qū)一起限定了用于結(jié)合人HGF的單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。2.權(quán)利要求1所述的結(jié)合蛋白質(zhì)，其中CDRU、CDRu和CDRl3被插在人或人源化的免疫球蛋白框架區(qū)之間。3.權(quán)利要求1或2所述的結(jié)合蛋白質(zhì)，其中所述結(jié)合蛋白質(zhì)為抗體或其抗原結(jié)合片段。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的分離的結(jié)合蛋白質(zhì)，其包含SEQIDNO.193(LR2B8LC輕鏈可變區(qū))或SEQIDNO.199(LRMR2B8LC輕鏈可變區(qū))所示的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。5.權(quán)利要求4所述的分離的結(jié)合蛋白質(zhì)，其包含SEQIDNO.197(LR2B8LC+Kappa恒定區(qū)(km(3)同種異型)(等位基因l))或SEQIDNO.201(LRMR2B8LC+Kappa恒定區(qū)(km(3)同種異型)(等位基因l))所示的免疫球蛋白輕鏈序列。6.—種結(jié)合人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的分離的結(jié)合蛋白質(zhì)，其包含(a)包含結(jié)構(gòu)CDFU-CDRH2-CDRH3的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，其中(i)CDRm包含氨基酸序列SEQIDNO.15(2B8)，(ii)CDRH2包含選自SEQIDNO.204(LR2B8HC)和SEQIDNO.205(LRMR2B8HC)中的序列，以及(iii)CDRh3包含氛基酸序列SEQIDN0.17(2B8);以及(b)免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其中所述免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和所述免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)一起限定了用于結(jié)合人HGF的單個(gè)結(jié)合位占<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>7.權(quán)利要求6所述的結(jié)合蛋白質(zhì)，其中CDRH1、CDRm和CDRh3被插在人或人源化的免疫球蛋白框架區(qū)之間。8.權(quán)利要求7所述的結(jié)合蛋白質(zhì)，其中所述結(jié)合蛋白質(zhì)為抗體或其抗原結(jié)合片段。9.權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所述的分離的結(jié)合蛋白質(zhì)，其包含SEQIDNO.183(LR2B8HC重鏈可變區(qū))或SEQIDNO.189(LRMR2B8HC重鏈可變區(qū))所示的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)。10.權(quán)利要求9所述的分離的結(jié)合蛋白質(zhì)，其包含SEQIDNO.187(LR2B8HC+IgGl恒定區(qū)(Glm(3)同種異型)(等位基因l))或SEQIDNO.191(LRMR2B8HC+IgGl恒定區(qū)(Glm(3)同種異型)(等位基因l))所示的免疫球蛋白重鏈序列。11.權(quán)利要求6所述的分離的結(jié)合蛋白質(zhì)，其進(jìn)一步包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含結(jié)構(gòu)CDRu-CDRl廣CDRl3,其中(i)CDRu包含氨基酸序列SEQIDN0.18(2B8)，(ii)CDRu包含氨基酸序列SEQIDNO.19(2B8)或SEQIDNO.206(LRMR2B8LC)，以及(iii)CDR,3包含氨基酸序列SEQIDN0.20(2B8)，其中所述免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和所述免疫球蛋白重鏈可變區(qū)一起限定了用于結(jié)合人HGF的單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。12.權(quán)利要求l、6或11中任一項(xiàng)所述的結(jié)合蛋白質(zhì)，其中所述抗體為單克隆抗體。13.—種分離的核酸，其包含編碼權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。14.一種分離的核酸，其包含編碼權(quán)利要求6-10中任一項(xiàng)所述的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。15.—種表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求13或14所述的核酸序列。16.—種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求15所述的表達(dá)載體。17.—種制備結(jié)合蛋白質(zhì)的方法，該方法包括(i)在一定條件下培養(yǎng)權(quán)利要求16所述的宿主細(xì)胞，使得該宿主細(xì)胞表達(dá)所述免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和/或所述免疫球蛋白重鏈可變區(qū)；以及(ii)收集所述免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和/或所述免疫球蛋白重鏈可變區(qū)。18.權(quán)利要求l-ll中任一項(xiàng)所述的分離的結(jié)合蛋白質(zhì)，其中所述結(jié)合蛋白質(zhì)與人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子結(jié)合的ka為4.0x10—5s—1或更低。19.權(quán)利要求18所述的分離的結(jié)合蛋白質(zhì)，其中kd為3.0x10—5s—1或更低。20.權(quán)利要求19所述的分離的結(jié)合蛋白質(zhì)，其中kd為2.0x10—5s—1或更低。21.權(quán)利要求l-ll中任一項(xiàng)所述的分離的結(jié)合蛋白質(zhì)，其中所述結(jié)合蛋白質(zhì)與人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子結(jié)合的K。為20pM或更低。22.權(quán)利要求21所述的分離的結(jié)合蛋白質(zhì)，其中K。為10pM或更低。23.權(quán)利要求22所述的分離的結(jié)合蛋白質(zhì)，其中K。為5pM或更低。24.—種抑制或減少腫瘤細(xì)胞增殖的方法，其包括將所述的細(xì)胞暴露于有效量的權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的結(jié)合蛋白質(zhì)，從而抑制或減少所述肺瘤細(xì)胞的增殖。25.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞為人腫瘤細(xì)胞。26.—種抑制或減少哺乳動(dòng)物中肺瘤生長(zhǎng)的方法，該方法包括將哺乳動(dòng)物暴露于有效量的權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的結(jié)合蛋白質(zhì)，從而抑制或減少所述腫瘤的增殖。27.—種治療哺乳動(dòng)物中腫瘤的方法，該方法包括施用有效量的權(quán)利要求l-ll中任一項(xiàng)所述的結(jié)合蛋白質(zhì)。28.權(quán)利要求26或27所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為人。全文摘要本發(fā)明申請(qǐng)?zhí)峁┮环N結(jié)合肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)(特別是人HGF)并中和其活性的結(jié)合蛋白質(zhì)家族。所述結(jié)合蛋白質(zhì)可以用作診斷劑和/或治療劑。就其治療活性而言，所述結(jié)合蛋白質(zhì)可用于治療某些HGF應(yīng)答的紊亂，例如某些HGF應(yīng)答的腫瘤。文檔編號(hào)C07K16/22GK101460520SQ200780020105公開日2009年6月17日申請(qǐng)日期2007年6月1日優(yōu)先權(quán)日2006年6月2日發(fā)明者A·霍維茲,B·伊特麥德-吉爾伯森,C·克尼赫,J·久里斯,L·布勞爾特,M·韓,S·K·賴特,W·M·溫斯頓,杰林申請(qǐng)人:Aveo制藥公司;Xoma技術(shù)有限公司