專(zhuān)利名稱(chēng)：：涉及zpa多肽的方法和組合物的制作方法涉及ZPA多肽的方法和組合物發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明致力于ZPA多肽，與ZPA多肽相關(guān)的抗體、核酸分子、拮抗劑、激動(dòng)劑和組合物，以及制備和使用它們的方法，包括用于診斷和治療哺乳動(dòng)物中的凋亡相關(guān)病癥的方法。本發(fā)明還致力于內(nèi)在凋亡途徑的模型系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
：不受控制的細(xì)胞生長(zhǎng)是多種細(xì)胞類(lèi)型中許多疾病的原因。例如，當(dāng)衍生自正常組織的異常性或贅生性的細(xì)胞(它們?cè)鲋承纬赡[瘤塊)的數(shù)目增加時(shí)即發(fā)生癌。腫瘤細(xì)胞常常侵入鄰近組織，而且能經(jīng)由稱(chēng)為轉(zhuǎn)移的過(guò)程通過(guò)血液或淋巴系統(tǒng)擴(kuò)散至局部淋巴結(jié)和較遠(yuǎn)的部位。在癌性生長(zhǎng)中，細(xì)胞在正常細(xì)胞不會(huì)生長(zhǎng)的條件下增殖。癌本身表現(xiàn)為極其多種形式，以不同程度的4曼入性和攻擊性為特征。惡性腫瘤(癌)是美國(guó)第二位死因，僅次于心臟病(Boring等，CACancelJ.Clin.43:7(1993))。已經(jīng)有許多研究致力于發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖性病癥(諸如癌)的新治療方法。盡管有最新的進(jìn)展，但是非常需要鑒定和理解調(diào)控細(xì)胞增殖的新細(xì)胞靶物的功能，也非常需要開(kāi)發(fā)備選的或更多的有效治療方法以及治療劑和診斷劑。還需要開(kāi)發(fā)備選的療法和方法用于治療特定細(xì)胞類(lèi)型和用于治療由異常細(xì)胞增殖引起的或與之相關(guān)的疾病，諸如癌。開(kāi)發(fā)抗癌療法的一種方法是研究凋亡機(jī)制，其也稱(chēng)為程序性細(xì)胞死亡。對(duì)決定細(xì)胞命運(yùn)的凋亡機(jī)制的有力控制是生物體發(fā)育、體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞損傷應(yīng)答所需要的。此類(lèi)途徑的失調(diào)常常導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病。例如，許多癌選擇性抑制促凋亡途徑和/或增強(qiáng)促存活途徑，從而規(guī)避宿主以調(diào)節(jié)生長(zhǎng)為意圖的應(yīng)答(Kirkin等，BiochimBiophysActa1644(2-3):229-249(2004);LeBlanc等,NatureMed.8:2274-281(2002);Cory和Adams,TrendsBiochem.Sci.26:61-66(2001))。因此，了解和治療多種疾病，包括癌癥、自身免疫性疾病和變性病癥，必需了解凋亡(Strasser,Nat.Rev.Immunol.5:189-200(2005);Strasser等,BiochimBiophysActa1333:F151-178(1997》。7已經(jīng)描述了哺乳動(dòng)物中的兩種凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑(Anderson等，Nat.Rev.DrugDiscov.4(5):399-409(2005)):外在途徑(extrinsicpathway),通常由TNF家族的死亡誘導(dǎo)性配體起始；和內(nèi)在途徑(intrinsicpathway),其主要響應(yīng)于由Bcl-2家族介導(dǎo)的胞內(nèi)刺激(Strasser等，Nat.Rev.Imm.5:189-200(2005);Bomer，Mol.Immunol.39:615-647(2003))，但是也由外在途徑的組分激活。Bcl-2蛋白的特征在于四個(gè)獨(dú)特的a-螺旋序列基序，稱(chēng)為Bcl-2同源性(BH)結(jié)構(gòu)域BH1-BH4。在有些情況中，Bcl-2蛋白還具有使它們定位至線(xiàn)粒體外膜、核被膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)三者的胞質(zhì)面的C-末端跨膜區(qū)(Borner，Mol.Immunol.39:615-647(2003))。Bcl-2蛋白家族成員可以分為三組(i)促存活Bcl-2樣蛋白(例如Bcl-2、Bc1-xl、Bcl-w、Mcl-l、Al/Bfl-1、NR-13、BHRF1、LMW5-HL、ORF16、v-Bcl-2(KSHV)、E1B-19K、CED陽(yáng)9、Boo/DIVA/Bcl2-L畫(huà)10和Bcl-B);(ii)促凋亡多結(jié)構(gòu)域蛋白(例如Bax、Bak、Bok/Mtd和Bcl-xs);和(iii)僅含BH3的促凋亡蛋白(例如Bik/Nbk、Blk、Hrk/DP5、BNip3、BimL/Bod、Bad、Bid、EGL-1、Noxa、Puma/Bbc3和Bmf)(出處同前)。大多數(shù)促存活成員含有所有四種BH結(jié)構(gòu)域，而大多數(shù)多結(jié)構(gòu)域促凋亡蛋白缺乏BH4結(jié)構(gòu)域。在未受刺激的細(xì)胞中，促存活和促凋亡多結(jié)構(gòu)域家族成員之間的相互作用阻止Bax樣蛋白在線(xiàn)粒體膜上寡聚化，并且阻止其起始凋亡程序。在受到刺激后，僅含BH3的蛋白通過(guò)與促存活蛋白二聚化而減輕對(duì)Bax樣蛋白的抑制，這釋》文促凋亡多結(jié)構(gòu)域蛋白來(lái)中和(compromise)線(xiàn)粒體膜電位并起始凋亡。先前的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明Bcl-2家族的數(shù)個(gè)成員對(duì)于正常發(fā)育至關(guān)重要(Lindsten等，Mol.Cell.6:1389-1399(2000);Motoyama等，Science267:1506-1510(1995);Veis等，Cell75:229-240(1993);Rinkenberger等,GenesDev.14:23-27(2000))。然而，該蛋白家族在發(fā)育過(guò)程中的功能大部分是未知的即使在具有顯著發(fā)育效應(yīng)的Bcl-2相關(guān)基因敲除中，起始性凋亡信號(hào)和響應(yīng)于該信號(hào)而激活的僅含BH3的蛋白也都是未知的。通過(guò)與Bcl-2的序列相似性，已經(jīng)在脊推動(dòng)物中鑒定出Bcl-2家族的許多新成員，Bcl-2是該家族中以其在B細(xì)胞淋巴瘤中的作用來(lái)命名的齊名成員(eponymousmember)(Tsujimoto等，Science228:1440-1443(1985))。然而，由于Bcl-2家族成員對(duì)于發(fā)育和調(diào)節(jié)至關(guān)重要，該蛋白家族中一個(gè)或多個(gè)成員的畸變或缺失常常引起阻止它們的功能重要性得以表征的病理，或?qū)е乱婚_(kāi)始就無(wú)法存活的動(dòng)物。能從生長(zhǎng)的最早階段起監(jiān)測(cè)發(fā)育和調(diào)節(jié)變化的模型系統(tǒng)將為解決涉及Bd-2基因家族在凋亡中作用的問(wèn)題提供關(guān)鍵的工具。斑馬魚(yú)(/^m'oren'o)已經(jīng)用作多種生物學(xué)途徑的有用沖莫型系統(tǒng)。斑馬魚(yú)可以充當(dāng)研究凋亡的優(yōu)越模型，這不僅因?yàn)轸~(yú)發(fā)育迅速，而且斑馬魚(yú)胚胎在胚胎發(fā)生的大部分時(shí)間始終保持透明，還因?yàn)榇嬖诳捎玫恼故井惓５蛲龅耐蛔冃桶唏R魚(yú)品系(參見(jiàn)例如Cole和Ross,Devel.Biol.240:123-142(2001))。因?yàn)橐呀?jīng);險(xiǎn)查過(guò)斑馬魚(yú)中的凋亡模式，所以凋亡細(xì)胞的才全測(cè)和凋亡的一般動(dòng)力學(xué)在該生物體中是已知的(出處同前)。然而，負(fù)責(zé)斑馬魚(yú)中那些凋亡模式的生化途徑尚未表征。仍未解決的問(wèn)題是內(nèi)在凋亡途徑在斑馬魚(yú)中是否發(fā)揮功能。將斑馬魚(yú)建立為通過(guò)內(nèi)在途徑進(jìn)行凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的模型的先決條件是證明Bcl-2家族的主要成員存在于斑馬魚(yú)中。已有數(shù)項(xiàng)研究試圖鑒定斑馬魚(yú)中的Bcl-2家族成員。Inohara和Nunez發(fā)現(xiàn)了許多斑馬魚(yú)基因與哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)外在途徑成員(諸如胱天蛋白酶)同源，但是只鑒定出八個(gè)推定與內(nèi)在途徑Bcl-2家族中僅僅六個(gè)成員(Bcl-xL、Mcl畫(huà)l、NR-13、Bax、BNIP3和Bad)有關(guān)的斑馬魚(yú)基因(Inoham和Nunez，CellDeathDiff.7:509-510(2000))。Coultas等通過(guò)tblastn徹底搜索了斑馬魚(yú)非冗余和ESTGenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，僅僅鑒定出另外三個(gè)僅含BH3的Bcl-2家族成員Bid、Noxa和Bmf(Coultas等，CellDeathDiffer.9:1163-1166(2002))。事實(shí)上，該小組特別評(píng)論了使用翻譯的BLAST搜索(translatedBLASTsearch)在斑馬魚(yú)中鑒定Bik、Bim和Puma的失敗(出處同前)。在Aouacheria等使用PSI-BLAST和tblastn徹底搜索了Ensemble和GenBank核苷酸和蛋白質(zhì)序列之后，他們最近確認(rèn)了這一觀察結(jié)果(Aouacheria等，Mol.Biol.Evol.22(12):2395-416(2005》。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于調(diào)查體內(nèi)和體外凋亡的新模型系統(tǒng)(modelsystem),并且提供了用于鑒定調(diào)控凋亡的藥劑(agent)的方法。本發(fā)明還提供了新的治療劑、診斷劑，以及通過(guò)靶向凋亡，特別是內(nèi)在凋亡途徑，來(lái)治療或預(yù)防凋亡相關(guān)疾病(包括癌)的方法。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了斑馬魚(yú)4足凋亡("ZPA")多肽和多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了具有選自SEQIDNO:1、5、7和9的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽是斑馬魚(yú)Bcl-2相關(guān)("B2R")促凋亡多肽。在另一9個(gè)實(shí)施方案中，提供了具有SEQIDNO:1的氨基S吏序列的多肽，其中所述多肽是斑馬魚(yú)B2R多結(jié)構(gòu)域促凋亡多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了具有選自SEQIDN0:5、7和9的氨基S交序列的多肽，其中所述多肽是斑馬魚(yú)B2R僅含BH3的促凋亡多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了具有選自SEQIDNO:2、6、8和10的核香S吏序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼斑馬魚(yú)B2R促凋亡多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了具有SEQIDNO:l的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述多核香酸編碼斑馬魚(yú)B2R多結(jié)構(gòu)域促凋亡多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了具有選自SEQIDNO:6、8和10的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼斑馬魚(yú)B2R僅含BH3的促凋亡多肽。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種或多種凋亡相關(guān)蛋白是轉(zhuǎn)基因的斑馬魚(yú)。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中一種或多種選自SEQIDNO:2、6、8和10的多核苦酸是缺失的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中一種或多種選自SEQIDNO:2、6、8和10的多核苷酸的表達(dá)相對(duì)于野生型斑馬魚(yú)中的所述一種或多種多核苷酸的表達(dá)是受到調(diào)控的。在一個(gè)方面，所述表達(dá)是升高的。在另一個(gè)方面，所述表達(dá)是降低的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中一種或多種選自SEQIDNO:1、5、7和9的多肽是不表達(dá)的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中一種或多種選自SEQIDNO:1、5、7和9的多肽的表達(dá)相對(duì)于野生型斑馬魚(yú)中所述一種或多種多肽的表達(dá)是受到調(diào)控的。在一個(gè)方面，所述表達(dá)是升高的。在另一個(gè)方面，所述表達(dá)是降低的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中一種或多種內(nèi)源性B2R^基因是用來(lái)自另一種生物體的B2R基因?qū)?yīng)物(counterpart)替換的。在一個(gè)方面，所述對(duì)應(yīng)物是哺乳動(dòng)物的。在另一個(gè)方面，所述對(duì)應(yīng)物是人的。在另一個(gè)方面，所有內(nèi)源性B2R基因是用來(lái)自另一種生物體的B2R^基因?qū)?yīng)物替換的。在一個(gè)方面，所述對(duì)應(yīng)物是哺乳動(dòng)物的。在另一個(gè)方面，所述對(duì)應(yīng)物是人的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中一種或多種內(nèi)源性?xún)?nèi)在凋亡途徑基因是用來(lái)自另一種生物體的內(nèi)在凋亡途徑基因?qū)?yīng)物替換的。在一個(gè)方面，所述對(duì)應(yīng)物是哺乳動(dòng)物的。在另一個(gè)方面，所述對(duì)應(yīng)物是人的。在另一個(gè)方面，所述一種或多種內(nèi)源性?xún)?nèi)在凋亡途徑基因選自SEQIDNO:2、6、8和10。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中所有內(nèi)源性?xún)?nèi)在凋亡途徑基因是用來(lái)自另一種生物體的內(nèi)在凋亡途徑基10因?qū)?yīng)物替換的。在一個(gè)方面，所述對(duì)應(yīng)物是哺乳動(dòng)物的。在另一個(gè)方面，所述對(duì)應(yīng)物是人的。在另一個(gè)方面，所述內(nèi)源性?xún)?nèi)在凋亡途徑基因包括SEQIDNO:2、6、8和10。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了凋亡模型系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了凋亡模型系統(tǒng)，其包含如任一前述實(shí)施方案中所述的斑馬魚(yú)。在一個(gè)方面，所述模型系統(tǒng)是內(nèi)在凋亡途徑的模型系統(tǒng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了體外凋亡模型系統(tǒng)，其包含至少一種由選自SEQIDNO:1、5、7和9的氨基酸序列編碼的多肽。在一個(gè)方面，所述模型系統(tǒng)是內(nèi)在凋亡途徑的模型系統(tǒng)。在另一個(gè)方面，所述;f莫型系統(tǒng)是外在凋亡途徑的沖莫型系統(tǒng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了體外凋亡模型系統(tǒng)，其包含至少一種由選自SEQIDNO:2、6、8和10的核苦酸序列編碼的多核苷酸。在一個(gè)方面，所述模型系統(tǒng)是內(nèi)在凋亡途徑的模型系統(tǒng)。在另一個(gè)方面，所述模型系統(tǒng)是外在凋亡途徑的模型系統(tǒng)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑒定結(jié)合ZPA多肽的化合物的方法，包括使ZPA多肽與化合物接觸，并測(cè)定該化合物是否結(jié)合ZPA多肽。在某些ZPA多肽與化合物接觸，并測(cè)定該化合物是否調(diào)控ZPA多肽的活性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑒定調(diào)控凋亡的藥劑的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了鑒定降低或阻止凋亡的藥劑的方法，包括對(duì)斑馬魚(yú)施用至少一種藥劑，并測(cè)定是否降低或阻止了凋亡。在一個(gè)方面，所述方法進(jìn)一步包括在施用所述至少一種藥劑之前測(cè)定斑馬魚(yú)中凋亡的存在或量。在另一個(gè)方面，所述方法進(jìn)一步包括在施用所述至少一種藥劑之前在斑馬魚(yú)中刺激凋亡。在另一個(gè)方面，所述藥劑降低或阻止通過(guò)內(nèi)在凋亡途徑的凋亡。在另一個(gè)方面，所述藥劑降低或阻止通過(guò)外在凋亡途徑的凋亡。在另一個(gè)方面，所述斑馬魚(yú)中一種或多種B2R蛋白的表達(dá)和/或活性相對(duì)于野生型斑馬魚(yú)中所述一種或多種B2R蛋白的表達(dá)和/或活性是升高的。在另一個(gè)方面，所述斑馬魚(yú)中一種或多種B2R蛋白是不表達(dá)的。在另一個(gè)方面，所述斑馬魚(yú)中一種或多種B2R蛋白的表達(dá)和/或活性相對(duì)于野生型斑馬魚(yú)中所述一種或多種B2R蛋白的表達(dá)和/或活性是降低的。在另一個(gè)方面，所述藥劑選自抗體、抗原結(jié)合性抗體片段、適體(aptamer)和小分子。在另一個(gè)方面，所述斑馬魚(yú)是幼體(larval)斑馬魚(yú)。在另一個(gè)方面，所述測(cè)定步驟包括顯微鏡檢查細(xì)胞生存力(viability)。在另一個(gè)方面，所述測(cè)定步驟包括測(cè)定胱天蛋白酶活化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了鑒定起始和/或刺激凋亡的藥劑的方法，包括對(duì)斑馬魚(yú)施用至少一種藥劑，并測(cè)定是否起始或升高了凋亡。在一個(gè)方面，所述方法進(jìn)一步包括在施用所述至少一種藥劑之前測(cè)定斑馬魚(yú)中凋亡的存在或量。在另一個(gè)方面，所述方法進(jìn)一步包括在施用所述至少一種藥劑之前在斑馬魚(yú)中阻止和/或降低凋亡。在另一個(gè)方.面，所述藥劑起始和/或刺激通過(guò)內(nèi)在凋亡途徑的凋亡。在另一個(gè)方面，所述藥劑起始和/或刺激通過(guò)外在凋亡途徑的凋亡。在另一個(gè)方面，所述斑馬魚(yú)中一種或多種B2R蛋白的表達(dá)和/或活性相對(duì)于野生型斑馬魚(yú)中所述一種或多種B2R蛋白的表達(dá)和/或活性是升高的。在另一個(gè)方面，所述斑馬魚(yú)中一種或多種B2R蛋白是不表達(dá)的。在另一個(gè)方面，所述斑馬魚(yú)中一種或多種B2R蛋白的表達(dá)和/或活性相對(duì)于野生型斑馬魚(yú)中所述一種或多種B2R蛋白的表達(dá)和/或活性是降低的。在另一個(gè)方面，所述藥劑選自抗體、抗原結(jié)合性抗體片段、適體和小分子。在另一個(gè)方面，所述斑馬魚(yú)是幼體斑馬魚(yú)。在另一個(gè)方面，所述測(cè)定步驟包括顯微鏡檢查細(xì)胞生存力。在另一個(gè)方面，所述測(cè)定步驟包括測(cè)定胱天蛋白酶活化。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑒定用于調(diào)控凋亡的藥劑的其它方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了鑒定用于阻止或降低凋亡的藥劑的方法，包括使至少一種由選自SEQIDNO:1、5、7和9的氨基S臾序列編碼的多肽與藥劑接觸，并測(cè)定該藥劑阻斷或降低所述至少一種多肽活性的能力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了鑒定用于阻止或降低凋亡的藥劑的方法，包括使包含至少一種由選自SEQIDNO:2、6、8和10的核苷酸序列編碼的多核苷酸的細(xì)月包與藥劑接觸，并測(cè)定該藥劑阻止或降低所述至少一種多核苷酸表達(dá)的能力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了鑒定用于起始或刺激凋亡的藥劑的方法，包括使至少一種由選自SEQIDNO:1、5、7和9的氨基酸序列編碼的多肽與藥劑接觸，并測(cè)定該藥劑刺激或提高所述至少一種多肽活性的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了鑒定用于起始或刺激凋亡的藥劑的方法，包括使包含至少一種由選自SEQIDNO:2、6、8和10的核苷酸序列編碼的多核苷酸的細(xì)胞與藥劑接觸，并測(cè)定該藥劑刺激或提高所述至少一種多核苷酸表達(dá)的能力。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療凋亡相關(guān)病癥的方法，包括對(duì)患者施用至少一種由選自SEQIDNO:1、5、7和9的氨基酸序列編碼的多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療凋亡相關(guān)病癥的方法，包括對(duì)需要此類(lèi)治療的患者施用有效量的至少一種由選自SEQIDN0:1、5、7和9的氨基酸序列編碼的多肽，由此治療所述患者中的凋亡相關(guān)病癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療凋亡相關(guān)病癥的方法，包括對(duì)患者施用由選自SEQIDNO:1、5、7和9的氨基酸序列編碼的至少一種多肽的激動(dòng)劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療凋亡相關(guān)病癥的方法，包括對(duì)需要此類(lèi)治療的患者施用有效量的由選自SEQIDNO:1、5、7和9的氨基酸序列編碼的至少一種多肽的激動(dòng)劑，由此治療所述患者中的凋亡相關(guān)病癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療凋亡相關(guān)病癥的方法，包括對(duì)患者施用由選自SEQIDNO:1、5、7和9的氨基S吏序列編碼的至少一種多肽的拮抗劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療凋亡相關(guān)病癥的方法，包括對(duì)需要此類(lèi)治療的患者施用有效量的由選自SEQIDNO:1、5、7和9的氨基S吏序列編碼的至少一種多肽的拮抗劑，由此治療所述患者中的凋亡相關(guān)病癥。在一個(gè)方面，所述拮抗劑選自適體、抗體、抗原結(jié)合性抗體片段和小分子。在另一個(gè)方面，所述凋亡相關(guān)病癥選自細(xì)月包增殖性病癥(cellproliferativedisorder)、病毒性凋亡病癥(viralapoptosisdisorder)、自身免疫性病癥(autoimmunedisorder)、血液學(xué)病癥(hematologicdisorder)和神經(jīng)學(xué)病癥(neurologicaldisorder)。在一個(gè)方面，所述凋亡相關(guān)病癥是癌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療凋亡相關(guān)病癥的方法，包括對(duì)患者施用至少一種選自下組的多肽由SEQIDNO:2、6、8和10的多核苷S交序列編碼的多肽。在一個(gè)方面，所述凋亡相關(guān)病癥選自細(xì)胞增殖性病癥、病毒性凋亡病癥、自身免疫性病癥、血液學(xué)病癥和神經(jīng)學(xué)病癥。在一個(gè)方面，所述凋亡相關(guān)病癥是癌。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于調(diào)控凋亡的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于提高凋亡的組合物，該組合物包含由選自SEQIDNO:1、5、7和9的氨基酸序列編碼的多肽。在一個(gè)方面，所述組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)可接受載體(pharmaceuticallyacceptablecarrier)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于提高凋亡的組合物，該組合物包含由選自SEQIDNO:1、5、7和9的氨基酸序列編碼的多肽的激動(dòng)劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于降低或阻止凋亡的組合物，該組合物包含SEQIDNO:1、5、7和9中一種或多種的拮抗劑。在一個(gè)方面，所述拮抗劑選自抗體、抗原結(jié)合性抗體片段、適體和小分子。在另一個(gè)方面，所述組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)可接受載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于降低或阻止凋亡的組合物，該組合物包含降低或抑制SEQIDNO:2、6、8和10中的一種或多種表達(dá)的藥劑。在一個(gè)方面，所述組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)可接受載體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療需要治療的受試者中凋亡相關(guān)病癥的方法，包括施用至少一種本發(fā)明的組合物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療需要治療的受試者中凋亡相關(guān)病癥的方法，包括施用有效量的至少一種本發(fā)明的組合物，由此治療所述患者中的凋亡相關(guān)病癥。在某些實(shí)施方案中，所述凋亡相關(guān)病癥選自細(xì)胞增殖性病癥、病毒性凋亡病癥、自身免疫性病癥、血液學(xué)病癥和神經(jīng)學(xué)病癥。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測(cè)受試者中的凋亡相關(guān)病癥的存在、嚴(yán)重性和/或?qū)Φ蛲鱿嚓P(guān)病癥的素因(predisposition)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，凋亡相關(guān)病癥的存在通過(guò)檢測(cè)來(lái)自受試者的細(xì)胞中ZPA多肽的存在或量來(lái)檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)凋亡相關(guān)病癥的素因通過(guò)檢測(cè)來(lái)自受試者的細(xì)胞中ZPA多肽的存在或量來(lái)檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，凋亡相關(guān)病癥的嚴(yán)重性通過(guò)檢測(cè)來(lái)自受試者的細(xì)胞中ZPA多肽的存在或量來(lái)檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，凋亡相關(guān)病癥的存在通過(guò)^r測(cè)來(lái)自受試者的細(xì)胞中ZPA多肽同系物(homolog)的存在或量來(lái)檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)凋亡相關(guān)病癥的素因通過(guò)檢測(cè)來(lái)自受試者的細(xì)胞中ZPA多肽同系物的存在或量來(lái)檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，凋亡相關(guān)病癥的嚴(yán)重性通過(guò)4t測(cè)來(lái)自受試者的細(xì)胞中ZPA多肽同系物的存在或量來(lái)檢測(cè)。在某些方面，所述凋亡相關(guān)病癥選自細(xì)胞增殖性病癥、病毒性凋亡病癥、自身免疫性病癥、血液學(xué)病癥和神經(jīng)學(xué)病癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，凋亡相關(guān)病癥的存在通過(guò)檢測(cè)來(lái)自受試者的細(xì)胞中ZPA多核香酸的存在或表達(dá)量(presenceoramountofexpression)來(lái)檢觀'〗。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)凋亡相關(guān)病癥的素因通過(guò)檢測(cè)來(lái)自受試者的細(xì)胞中ZPA多核苷酸的存在或表達(dá)量來(lái)檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，凋亡相關(guān)病癥的嚴(yán)重性通過(guò)檢測(cè)來(lái)自受試者的細(xì)胞中ZPA多核苦酸的存在或表達(dá)量來(lái)檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，凋亡相關(guān)病癥的存在通過(guò)^r測(cè)來(lái)自受試者的細(xì)胞中ZPA多核普酸同系物的存在或表達(dá)量來(lái)檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)凋亡相關(guān)病癥的素因通過(guò)檢測(cè)來(lái)自受試者的細(xì)胞中ZPA多核苷酸同系物的存在或表達(dá)量來(lái)檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，凋亡相關(guān)病癥的嚴(yán)重性通過(guò)檢測(cè)來(lái)自受試者的細(xì)胞中ZPA多核苷酸同系物的存在或表達(dá)量來(lái)檢測(cè)。在某些方面，14所述凋亡相關(guān)病癥選自細(xì)〗包增殖性病癥、病毒性凋亡病癥、自身免疫性病癥、血液學(xué)病癥和神經(jīng)學(xué)病癥。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明還以任何有用組合提供了本文所述化合物和組合物的試劑盒和制品。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含一種或多種本發(fā)明的組合物和對(duì)用途的說(shuō)明或用法說(shuō)明書(shū)(instructionsforuse)的試劑盒。在一個(gè)方面，所述用途是治療用途。在另一個(gè)方面，所述用途是診斷用途。在另一個(gè)方面，所述用途是研究用途。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含體外內(nèi)在凋亡途徑模型系統(tǒng)和對(duì)其用途的說(shuō)明或用法說(shuō)明書(shū)的試劑盒。在一個(gè)方面，所述用途是診斷用途。在另一個(gè)方面，所述用途是研究用途。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含斑馬魚(yú)內(nèi)在凋亡途徑模型系統(tǒng)和對(duì)其用途的說(shuō)明或用法說(shuō)明書(shū)的試劑盒。在一個(gè)方面，所述用途是診斷用途。在另一個(gè)方面，所述用途是研究用途。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制品，該制品包含(a)包含一種或多種ZPA多肽、激動(dòng)劑和拮抗劑的組合物，(b)裝有所述組合物的容器；和(c)貼在容器上的標(biāo)簽(label)或包括在容器中的包裝插頁(yè)(packageinsert),其涉及所述組合物在治療凋亡相關(guān)病癥中的用途。附圖簡(jiǎn)述圖l顯示隱蔽馬爾科夫模型(HiddenMarkovModel,HMM)的查準(zhǔn)率-查全率(precision-recall)圖，其從PROSITE樣式和矩陣構(gòu)建，如實(shí)施例l(b)所述。PROSITE樣式的查準(zhǔn)率和查全率由菱形表示；將不同得分時(shí)的樣式衍生HMM的查準(zhǔn)率和查全率繪制成線(xiàn)；沙漏表示本文中所4吏用的HMM分?jǐn)?shù)閾值時(shí)的查準(zhǔn)率和查全率。圖2顯示已知的和候選的Bcl-2相關(guān)("B2R")蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域比對(duì)，如實(shí)施例2所述。具有相似物理化學(xué)性質(zhì)的氨基酸用類(lèi)似的陰影標(biāo)示，與標(biāo)準(zhǔn)ClustalX顏色才羊式(colorpattem)—致。圖3A描述已知的和候選的斑馬魚(yú)B2R蛋白與人(h)、小鼠(m)和雞(gg)對(duì)應(yīng)物的比對(duì)，如實(shí)施例2(g)所述。促存活蛋白表現(xiàn)為最頂部和中部無(wú)陰影的部分；僅含BH3的蛋白表現(xiàn)為最底部無(wú)陰影的部分；而剩下的有陰影的部分是多結(jié)構(gòu)域促凋亡蛋白。圖3B顯示根據(jù)基因分組的人、小鼠和斑馬魚(yú)僅含BH3的蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域比對(duì)，如實(shí)施例2所討論。具有相似物理化學(xué)性質(zhì)的氨基酸用類(lèi)似的陰影標(biāo)示。圖3C和3D描述的是實(shí)施例3(a)所述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖3C描述的是時(shí)期(stage)特異性RT-PCR的電泳結(jié)果，其顯示直至受精后(hpf)72小時(shí)，大多數(shù)斑馬魚(yú)Bcl-2家族成員以與母體基值一致的水平(atconsistentlevelsformthematernalcontribution)表達(dá)。圖3D描述的是組織特異性RT-PCR的電泳結(jié)果，其顯示多個(gè)斑馬魚(yú)Bcl-2家族成員在多種成體斑馬魚(yú)組織中的表達(dá)。圖4A和4B描述的圖顯示體內(nèi)異位斑馬魚(yú)B2R蛋白表達(dá)的結(jié)果，如實(shí)施例3(b)所述。除了zBad、zBokl和zBok2,各個(gè)促凋亡zBcl-2家族成員的異位表達(dá)以劑量依賴(lài)性方式誘導(dǎo)死亡。圖4C顯示亮視野顯微圖像(左側(cè)小圖)和對(duì)注射了合成斑馬魚(yú)B2R蛋白或綠色萸光蛋白(GFP)對(duì)照的斑馬魚(yú)胚胎中活化的胱天蛋白酶-3的免疫熒光染色(右側(cè)小圖)，如實(shí)施例3(b)所述。圖4D顯示的圖描繪自實(shí)施例3(c)所述實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)。將存活胚胎的百分比相對(duì)于異位表達(dá)的斑馬魚(yú)B2R蛋白的所示組合作圖。圖示的頂部顯示對(duì)于每種組合枱r驗(yàn)的胚胎總數(shù)。圖5A-5F描述實(shí)施例3(d)所述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖5A顯示對(duì)異位表達(dá)斑馬魚(yú)促存活B2R蛋白(zBlpl、zMcl-la、zMcl-lb或zBlp2)之一或?qū)φ?WT(未注射)或GFP)的未處理的(左側(cè)小圖)或經(jīng)伽馬照射的(右側(cè)小圖)斑馬魚(yú)胚胎中胱天蛋白酶-3活性的免疫染色。圖5B顯示對(duì)注射了單獨(dú)的p53的嗎啉代(morpholino)或單獨(dú)的對(duì)照嗎啉代或與zBax或zBak的嗎啉代的組合的未處理的(左側(cè)小圖)或經(jīng)伽馬照射的(右側(cè)小圖)斑馬魚(yú)中胱天蛋白酶-3活性的免疫染色。圖5C顯示定量來(lái)自zBax和zBak的單敲低和雙敲低(knockdown)的熒光的圖。圖5D顯示對(duì)注射了對(duì)照嗎啉代或斑馬魚(yú)僅含BH3的B2R蛋白(zBid、zBadl、zBmfl、zNoxa、zPuma或zBik)的嗎啉代的未處理的(左側(cè)小圖)或經(jīng)伽馬照射的(右側(cè)小圖)斑馬魚(yú)胚胎中胱天蛋白酶-3活性的免疫染色。圖5E顯示對(duì)未注射或注射了對(duì)照嗎啉代或p53的嗎啉代的未處理的(左側(cè)小圖)或經(jīng)伽馬照射的(右側(cè)小圖)斑馬魚(yú)胚胎中胱天蛋白酶-3活性的免疫染色。圖5F以圖描述對(duì)未處理或經(jīng)對(duì)照或p53嗎啉代處理的經(jīng)伽馬照射的斑馬魚(yú)胚胎中zPuma或zNoxa轉(zhuǎn)錄增加的定量PCR分析結(jié)果。圖6A描述實(shí)施例3(e)所述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。該圖顯示的圖描述經(jīng)過(guò)嗎啉代敲低zMcl-la、zMcl-lb和/或Blp2的斑馬魚(yú)胚胎的百分比存活。圖6B和6C描述實(shí)施例3(f)所述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。該圖顯示的圖描述經(jīng)過(guò)嗎啉代敲低zMcl-la和/或zMcl-lb以及Apo2L誘導(dǎo)的凋亡(用斑馬魚(yú)Apo2L直向同系物DLlb,或者用另一種Apo2L途徑相關(guān)分子諸如zDLla、zDL2、zDL3、zTNFl、zTNF2或zFasL)的斑馬魚(yú)胚胎的百分比存活。發(fā)明詳述申請(qǐng)人使用定制的搜索技術(shù)鑒定了先前未知的與Bcl-2蛋白家族相關(guān)的五個(gè)斑馬魚(yú)基因，其中四個(gè)代表先前未在斑馬魚(yú)中鑒定的Bcl-2家族成員Bak、Bik、Puma和Bim。申請(qǐng)人還在本文中首次表征了某些斑馬魚(yú)Bcl-2相關(guān)("B2R，，)蛋白的功能活性，并且證明了斑馬魚(yú)中內(nèi)在凋亡途徑的存在和功能，以及將斑馬魚(yú)用作內(nèi)在凋亡途徑的模型系統(tǒng)的效用。申請(qǐng)人的發(fā)明允許鑒定阻止、降低、起始和/或刺激凋亡的新藥劑和治療劑(thempeutics)，以及研究Bcl-2基因和/或內(nèi)在凋亡途徑在凋亡相關(guān)病癥中的作用的方法。申請(qǐng)人的發(fā)明還提供了治療與異常凋亡有關(guān)或由異常凋亡引起的疾病或病癥的新治療劑禾。方法。如本文所述，SEQIDNO:l、3、5、7和9(分別由SEQIDNO:2、4、6、8和10編碼)與涉及內(nèi)在凋亡途徑的Bcl-2蛋白家族的某些人成員同源。SEQIDNO:l是與人Bak(—種多結(jié)構(gòu)域促凋亡蛋白)具有序列同一性的斑馬魚(yú)蛋白。SEQIDNO:3是與人Bad(—種僅含BH3的促凋亡蛋白)具有序列同一性的斑馬魚(yú)蛋白。SEQIDNO:5是與人Bik(—種僅含BH3的促凋亡蛋白)具有序列同一性的斑馬魚(yú)蛋白。SEQIDNO:7是與人Puma(—種僅含BH3的促凋亡蛋白)具有序列同一性的斑馬魚(yú)蛋白。SEQIDNO:9是與Bmf(—種僅含BH3的促凋亡蛋白)具有序列同一性的斑馬魚(yú)蛋白。申請(qǐng)人還鑒定了人Bim(—種僅含BH3的促凋亡蛋白)的斑馬魚(yú)同系物，但是如實(shí)施例2(d)所述，該基因由于當(dāng)前斑馬魚(yú)基因組構(gòu)建中的明顯錯(cuò)誤(apparenterror)而無(wú)法克隆。SEQIDNO:2、6、8和10(編碼SEQIDNO:1、5、7和9的蛋白質(zhì))先前作為斑馬魚(yú)基因組計(jì)劃的一部分得到鑒定，但是在申請(qǐng)人的工作之前尚未(1)將它們鑒定為編碼人Bcl-2家族成員的同系物，或(2)暗示它們編碼一種或多種凋亡途徑的成員。如本文所述，申請(qǐng)人通過(guò)序列同一性/相似性和通過(guò)功能分析二者，將SEQIDNO:l、5、7和9分別鑒定為人Bak、Bik、Puma和Bmf的斑馬魚(yú)同系物。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了選自SEQIDNO:l、3、5、177和9的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)是斑馬魚(yú)B2R多結(jié)構(gòu)域促凋亡蛋白或僅含BH3的促凋亡蛋白；含有所述蛋白質(zhì)的組合物；和使用所述蛋白質(zhì)和組合物的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了選自SEQIDNO:2、4、6、8和10的多核苷酸，所述多核普酸編碼斑馬魚(yú)B2R多結(jié)構(gòu)域促凋亡蛋白或僅含BH3的促凋亡蛋白；包含所述多核苦酸的組合物；和使用所述多核苷酸和組合物的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了變體蛋白質(zhì)，其相對(duì)于選自SEQIDNO:1、3、5、7和9的序列包含一處或多處氨基酸添加、缺失或突變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了變體多核苦酸，其相對(duì)于選自SEQIDNO:2、4、6、8和10的序列包含一處或多處核香酸添加、缺失或突變。本發(fā)明的蛋白質(zhì)、變體蛋白質(zhì)、核酸和變體核酸可以用于治療目的。例如，本發(fā)明的一種或多種ZPA("斑馬魚(yú)促凋亡")蛋白或其變體可以用作治療劑來(lái)治療期望提高凋亡的凋亡相關(guān)病癥(例如細(xì)胞增殖性病癥)。本發(fā)明還提供了組合物，其包含本發(fā)明的一種或多種ZPA和藥學(xué)可接受載體，任選包括一種或多種其它治療劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種或多種ZPA核酸或其變體可以用作治療劑來(lái)治療期望提高凋亡的凋亡相關(guān)病癥，例如通過(guò)在需要此類(lèi)治療的受試者中表達(dá)所述核酸，使得一種或多種ZPA蛋白在患者細(xì)胞中表達(dá)。將斑馬魚(yú)的蛋白質(zhì)和核酸用作治療劑可能優(yōu)于任何哺乳動(dòng)物同系物，例如因?yàn)橛|發(fā)抗自身反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)較小。本發(fā)明的ZPA蛋白還可用在鑒定起始、刺激、抑制或阻斷凋亡的藥劑的方法中?？梢酝ㄟ^(guò)其起始或刺激內(nèi)在凋亡途徑中的一種或多種ZPA蛋白活性的能力來(lái)鑒定所述一種或多種ZPA蛋白的激動(dòng)劑。此類(lèi)刺激可以是例如通過(guò)活化ZPA蛋白或通過(guò)干擾正常情況下抑制ZPA蛋白活性的一種或多種分子，合適的激動(dòng)劑包括但不限于抗體和小分子。相反，可以通過(guò)其阻斷或抑制內(nèi)在凋亡途徑中的一種或多種ZPA蛋白活性的能力來(lái)鑒定所述一種或多種ZPA蛋白的拮抗劑。此類(lèi)抑制可以是例如通過(guò)阻止ZPA蛋白結(jié)合一種或多種配體或把物或通過(guò)阻止ZPA蛋白本身的活性，合適的拮抗劑包括抗體和抗原結(jié)合性抗體片段、適體和小分子。測(cè)量?jī)?nèi)在凋亡途徑中ZPA蛋白活性的某些適宜測(cè)定法在本文中有描述。可以使用ZPA蛋白激動(dòng)劑作為治療劑來(lái)治療期望提高凋亡的凋亡相關(guān)病癥，而可以使用ZPA蛋白拮抗劑作為治療劑來(lái)治療期望降低凋亡的凋亡相關(guān)病癥。內(nèi)在凋亡途徑響應(yīng)于指導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的胞內(nèi)信號(hào)。該途徑的失調(diào)能導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)牡蛲龌虻蛲龅牟贿m當(dāng)缺乏，兩者中的任何一種都可能導(dǎo)致病癥(諸如癌)。因此，需要更好的了解凋亡途徑，以及能擾動(dòng)其中一種或多種途徑成分的表達(dá)和/或活性并能方便地檢驗(yàn)反響的模型系統(tǒng)。在本文所述的對(duì)ZPA蛋白的鑒定和分析之外，申請(qǐng)人還證明了斑馬魚(yú)中存在內(nèi)在凋亡途徑，其類(lèi)似于先前在哺乳動(dòng)物中表征的內(nèi)在凋亡途徑。因此，本發(fā)明還提供了使用斑馬魚(yú)作為模型系統(tǒng)來(lái)研究凋亡的方法。在有些實(shí)施方案中，提供了轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中一種或多種ZPA蛋白的表達(dá)和/或活性相對(duì)于野生型斑馬魚(yú)是受到調(diào)控的。此類(lèi)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)可以服務(wù)于闡明斑馬魚(yú)凋亡途徑的正常運(yùn)轉(zhuǎn)方式，并且提供在篩選具有激動(dòng)性或拮抗性凋亡活性的藥劑中使用的工具。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中一種或多種ZPA蛋白是用來(lái)自其它生物體的其對(duì)應(yīng)物替換的，由此產(chǎn)生模型系統(tǒng)來(lái)評(píng)估輔因子、環(huán)境因素、或序列和結(jié)構(gòu)中的修飾是否影響特定凋亡途徑組分的機(jī)能以及影響達(dá)到何種程度。在有些實(shí)施方案中，所有斑馬魚(yú)內(nèi)在凋亡途徑蛋白(即所有B2R蛋白)是用來(lái)自另一種生物體(即哺乳動(dòng)物或人)的內(nèi)在凋亡途徑組分遺傳替換的。此類(lèi)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)提供了用于研究?jī)?nèi)在凋亡途徑的工具，對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn)和操作遠(yuǎn)遠(yuǎn)易于在其它生物體中能進(jìn)行的。在有些實(shí)施方案中，檢驗(yàn)在缺失可能千擾分析的其它途徑或刺激時(shí)內(nèi)在凋亡途徑成員之間的生化相互作用可能是有用的。因此，本發(fā)明還提供了體外模型系統(tǒng)，由此在體外重建斑馬魚(yú)內(nèi)在凋亡途徑，任選伴有一種或多種輔因子、試劑、抑制劑和/或刺激物(stimulator)。在一個(gè)方面，體外模型系統(tǒng)包含在活性或量方面經(jīng)修飾的一種或多種ZPA蛋白。在另一個(gè)方面，體外才莫型系統(tǒng)包含在活性或量方面經(jīng)修飾的一種或多種B2R蛋白。在另一個(gè)方面，體外模型系統(tǒng)包含一種或多種ZPA蛋白變體。在另一個(gè)方面，體外模型系統(tǒng)包含一種或多種B2R蛋白變體。在另一個(gè)方面，體外模型系統(tǒng)缺乏至少一種ZPA蛋白。在另一個(gè)方面，體外模型系統(tǒng)缺乏至少一種B2R蛋白。在另一個(gè)方面，至少一種ZPA蛋白是用來(lái)自另一種生物體的對(duì)應(yīng)物蛋白替換的。在另一個(gè)方面，至少一種B2R蛋白是用來(lái)自另一種生物體的對(duì)應(yīng)物蛋白替換的。本文所述ZPA蛋白和核酸也可用于檢測(cè)受試者中的凋亡相關(guān)病癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)4企測(cè)來(lái)自受試者的細(xì)胞中ZPA多肽或ZPA多肽同系物的存在或量來(lái)檢測(cè)凋亡相關(guān)病癥的存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)來(lái)自受試者的細(xì)胞中ZPA多肽或ZPA多肽同系物的存在或量來(lái)檢測(cè)對(duì)凋亡相關(guān)病癥的素因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)^f企測(cè)來(lái)自受試者的細(xì)胞中ZPA多肽或ZPA多肽同系物的存在或量來(lái)檢測(cè)凋亡相關(guān)病癥的嚴(yán)重性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)來(lái)自受試者的細(xì)胞中ZPA多核苷酸或ZPA多核苷酸同系物的存在或表達(dá)量來(lái)檢測(cè)凋亡相關(guān)病癥的存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)來(lái)自受試者的細(xì)胞中ZPA多核苷酸或ZPA多核苷酸同系物的存在或表達(dá)量來(lái)檢測(cè)對(duì)凋亡相關(guān)病癥的素因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)來(lái)自受試者的細(xì)胞中ZPA多核苷酸或ZPA多核芬酸同系物的存在或表達(dá)量來(lái)檢測(cè)凋亡相關(guān)病癥的嚴(yán)重性。制品。例如，提供了試劑盒，其包含一種或多種本發(fā)明的組合物和對(duì)用途(例如治療、診斷和/或研究用途)的說(shuō)明。在另一個(gè)實(shí)例中，提供了試劑盒，其包含體外或斑馬魚(yú)內(nèi)在凋亡途徑模型系統(tǒng)，以及對(duì)其在研究中或在篩選調(diào)控凋亡的藥劑中的用途的說(shuō)明。本文提供了這些方法、組合物、模型系統(tǒng)、試劑盒和制品的詳細(xì)內(nèi)容。定義術(shù)語(yǔ)"Bd-2相關(guān)蛋白"、"Bcl-2相關(guān)多肽"和"B2R蛋白"在用于本文時(shí)包括天然序列多肽、多肽變體、及天然序列多肽和多肽變體的片段(其在本文中有進(jìn)一步定義)，除非另有說(shuō)明。B2R蛋白可以從多種物種(例如人類(lèi))獲得，通過(guò)使用依照本發(fā)明的抗體，或通過(guò)重組或合成方法，包括使用保藏的核酸分子。在某些實(shí)施方案中，B2R蛋白是從斑馬魚(yú)得到的。乂人斑馬魚(yú)得到的B2R蛋白稱(chēng)為"zB2R蛋白"。B2R蛋白包括但不限于Bcl-2樣存活因子(包括但不限于Bc12、Bc1-xl、Bcl-w、Mcl-l、Al/Bfl-1、NR-13、BHRJF1、LMW5-HL、ORF16、v-Bcl-2(KSHV)、E1B-19K、CED隱9、Boo/DIVA/Bcl2-L陽(yáng)10、Bcl-B);促凋亡的多結(jié)構(gòu)域因子(包括但不限于Bax、BpR、Bak、Bok/Mtd、Bcl-Rambo、Bcl-xs、和Bcl-G);和促凋亡的僅含BH3的因子(BH3-onlyfactor)(包括但不限于Bik/Nbk、Blk、Hrk/DP5、BNIP3、BimL/Bod、Bad、Bid、EGL-1、Noxa、PUMA/Bbc3、Bmf、Bnipl、Bnip2、和Bnip3)。zB2R蛋白包括但不限于促存活因子(包括但不限于zBlpl、zBlp2、zMcl-la、zMcl-lb、和zNR13);促凋亡的多結(jié)構(gòu)域因子(包括但不限于zBak、zBax、zBokl、和zBok2);和促凋亡的僅含BH3的因子(包括但不限于zBadl、zBad2、zBid、zBik、zBmfl、aBmf2、zNoxa、zPuma、和zBim)。術(shù)語(yǔ)"斑馬魚(yú)促凋亡蛋白"、"斑馬魚(yú)促凋亡多肽"、"ZPA多肽"和"ZPA蛋白"在本文中可互換使用，包括天然序列多肽、多肽變體、及天然序列多肽和多肽變體的片段(其在本文中有進(jìn)一步定義)，除非另有說(shuō)明。ZPA蛋白可以從斑馬魚(yú)獲得，通過(guò)使用依照本發(fā)明的抗體或通過(guò)重組或合成方法，包括使用保藏的核酸分子。ZPA蛋白包括本文中所鑒定的斑馬魚(yú)蛋白，例如zBak(SEQIDNO:1)、zBik(SEQIDNO:5)、zBim、zPuma(SEQIDNO:7)、和zBmf2(SEQIDNO:9)。術(shù)語(yǔ)"內(nèi)在凋亡途徑"或"內(nèi)在途徑"在本文中可互換使用，指胞內(nèi)起始的、導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的細(xì)胞生化途徑。術(shù)語(yǔ)"外在凋亡途徑"和"外在途徑"在本文中可互換-使用，指胞外起始的、導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的細(xì)胞生化途徑。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"斑馬魚(yú)"指認(rèn)為屬于斑馬！丹(Dflm'oren'o)屬和種的任何魚(yú)或魚(yú)品系。"天然序列"多肽或"天然，，多肽指與衍生自自然界的多肽(例如抗體)具有相同氨基酸序列的多肽。"天然序列"多肽指與衍生自自然界的多肽(例如抗體)具有相同氨基酸序列的多肽。此類(lèi)天然序列多肽可以從自然界分離，或者可通過(guò)重組或合成手段生成。如此，天然序列多肽可以具有天然存在人類(lèi)多肽、斑馬魚(yú)多肽、或來(lái)自任何其它物種的多肽的氨基酸序列。"天然序列，，ZPA多肽或"天然"ZPA多肽包含與衍生自自然界的相應(yīng)ZPA多肽具有相同氨基酸序列的多肽。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼天然序列斑馬魚(yú)ZPA蛋白zPuma的核酸序列可見(jiàn)于SEQIDNO:8和實(shí)施例2(e)。此類(lèi)ZPA多肽可以從自然界分離，或者可通過(guò)重組或合成手^1生成。術(shù)語(yǔ)"天然序列，，或"天然，，ZPA多肽或蛋白明確涵蓋ZPA蛋白的天然存在的截短或分泌形式、天然存在的變體形式(例如可變剪接形式)和天然存在的等位變體。在某些實(shí)施方案中，本文中所公開(kāi)的天然序列ZPA多肽是包含本文所列全長(zhǎng)氨基酸序列的成熟的或全長(zhǎng)的天然序列多肽。本文中所公開(kāi)的各種ZPA多肽的"信號(hào)肽，，的大致位置可見(jiàn)于本說(shuō)明書(shū)和/或附圖。還認(rèn)識(shí)到，在有些情況中，從分泌型多肽上切割下信號(hào)序列不是全然一致的，導(dǎo)致超過(guò)一種的分泌性種類(lèi)。本發(fā)明涵蓋這些成熟多肽及編碼21它們的多核苷酸，其中信號(hào)肽在本文中所鑒定的信號(hào)肽C端邊界任一側(cè)不超過(guò)大約5個(gè)氨基酸內(nèi)遭到切割。"ZPA多肽變體"或"ZPA蛋白變體"指與本文中所公開(kāi)的全長(zhǎng)天然序列ZPA多肽序列或本文中所公開(kāi)的全長(zhǎng)ZPA多肽序列的任何片段(諸如那些由僅僅代表全長(zhǎng)ZPA多肽的完整編碼序列一部分的核酸編碼的)具有至少約80。/。氨基酸序列同一性的ZPA多肽。此類(lèi)ZPA多肽變體包括例如在全長(zhǎng)天然氨基酸序列的N-或C-末端添加或刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的ZPA多肽。通公開(kāi)的全長(zhǎng)ZPA多肽序列的任何明確限定片段具有至少約80%的氨基酸序列同一性，或者至少約810/。、82%、83°/。、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。通常，ZPA變體多肽的長(zhǎng)度為至少約10個(gè)氨基酸，或者長(zhǎng)度為至少約20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210個(gè)氨基酸，或更多。4壬選的是，ZPA變體多肽與天然ZPA多肽序列相比具有不超過(guò)一處保守氨基酸替代，或者與天然ZPA多肽序列相比具有不超過(guò)2、3、4、5、6、7、8、9或10處保守氨基酸替代。關(guān)于本文中所鑒定的ZPA多肽序列的"百分比(％)氨基酸序列同一性"定義為對(duì)比序列并在必要時(shí)卩1入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時(shí)，候選序列中與特定ZPA多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測(cè)定百分比氨基酸序列同一性目的的對(duì)比可以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式進(jìn)行，例如使用公眾可得到的計(jì)算機(jī)軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可決定用于測(cè)量對(duì)比的適宜參數(shù)，包括對(duì)所比較序列全長(zhǎng)獲得最大對(duì)比所需的任何算法。然而，為了本發(fā)明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2獲得的。ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序由Genentech公司編寫(xiě)，源代碼已經(jīng)連同用戶(hù)文檔一起^R交給美國(guó)版權(quán)局(USCopyrightOffice,WashingtonD.C.,20559)，并以美國(guó)版權(quán)注冊(cè)號(hào)TXU510087注冊(cè)。公眾可通過(guò)Genentech公司(SouthSanFrancisco,California)得到ALIGN-2程序，或者可以自公眾可得到的源代碼匯編。ALIGN2程序應(yīng)當(dāng)編譯成在UNIX操作系統(tǒng)(例如數(shù)碼UNIXV4.0D)上使用。所有序列比較22參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定且不變。在采用ALIGN-2來(lái)比較氨基酸序列的情況中，給定氨基酸序列A相對(duì)于(to)、與(with)、或針對(duì)(against)給定氨基酸序列B的Q/。氨基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對(duì)于、與、或針對(duì)給定氨基酸序列B的某一。/。氨基酸序列同一性的給定氨基1^列A)如下計(jì)算分?jǐn)?shù)X/Y乘100其中X是由序列對(duì)比程序ALIGN-2在該程序的A和B對(duì)比中評(píng)分為相同匹配的氨基酸殘基數(shù)，且其中Y是B中的氨基酸殘基總數(shù)。可以領(lǐng)會(huì)，若氨基酸序列A的長(zhǎng)度與氨基酸序列B的長(zhǎng)度不相等，則A相對(duì)于B的。/。氨基酸序列同一性將不等于B相對(duì)于A的。/。氨基酸序列同一性。除非另有具體iJt明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是如上一段所述使用ALIGN-2計(jì)算機(jī)程序獲得的。在用于本文時(shí)，"保守同線(xiàn)性"(conservedsynteny)指自斑馬魚(yú)基因座進(jìn)化得到的人類(lèi)基因座的證據(jù)，例如ZPA基因和認(rèn)為與該ZPA基因同源的人類(lèi)基因的一側(cè)或兩側(cè)的相似鄰近基因。"ZPA變體多核苦酸，，或"ZPA變體核S吏序列，'意指編碼本文中所定義至少約80。/。核酸序列同一性的核酸分子。通常，ZPA變體多核苷酸與編碼本文中所公開(kāi)的全長(zhǎng)天然序列ZPA多肽序列或本文中所公開(kāi)的全長(zhǎng)ZPA多肽序列的任何片段的核酸序列具有至少約80%的核酸序列同一性，或者至少約81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的核酸序列同一性。變體不涵蓋天然核苦酸序列。通常，ZPA變體多核苷酸的長(zhǎng)度為至少約5個(gè)核苷酸，或者長(zhǎng)度為至少約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620或625個(gè)核苷酸，其中在此語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)"約"意指所述核苷酸序列長(zhǎng)度加上或減去該所述長(zhǎng)度的10%。關(guān)于本文中所鑒定的ZPA編碼核酸序列的"百分比(％)核酸序列同一性"定義為對(duì)比序列并在必要時(shí)S1入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，候選序列中與感興趣ZPA核酸序列中的核香酸相同的核香酸的百分率。為測(cè)定百分比核酸序列同一性目的的序列對(duì)比可以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式進(jìn)行，例如使用公眾可得到的計(jì)算機(jī)軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。然而，為了本發(fā)明的目的，％核@交序列同一性值是使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2獲得的。ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序由Genentech公司編寫(xiě)，源代碼已經(jīng)連同用戶(hù)文檔一起提交給美國(guó)版權(quán)局(USCopyrightOffice,WashingtonD.C.,20559)，并以美國(guó)版權(quán)注冊(cè)號(hào)TXU510087注冊(cè)。公眾可通過(guò)Genentech乂^司(SouthSanFrancisco,California)得到ALIGN-2程序，或者可以從公眾可得到的源代碼匯編。ALIGN2程序應(yīng)當(dāng)編譯成在UNIX操作系統(tǒng)(例如數(shù)碼UNIXV4.0D)上使用。所有序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定且不變。在采用ALIGN-2來(lái)比較核S吏序列的情況中，給定核酸序列C相對(duì)于(to)、與(with)、或針對(duì)(against)給定核酸序列D的。/。核酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對(duì)于、與、或針對(duì)給定核SH序列D的某一。/。核酸序列同一性的給定核酸序列C)如下計(jì)算分?jǐn)?shù)W/Z乘100其中W是由序列對(duì)比程序ALIGN-2在該程序的C和D對(duì)比中評(píng)分為相同匹配的核香酸數(shù)，且其中Z是D中的核苷酸總數(shù)?？梢灶I(lǐng)會(huì)，若核酸序列C的長(zhǎng)度與核酸序列D的長(zhǎng)度不相等，則C相對(duì)于D的。/。核酸序列同一性將不等于D相對(duì)于C的。/。核酸序列同一性。除非另有具體說(shuō)明，本文中所使用的所有％核酸序列同一性值都是如上一段所述使用ALIGN-2計(jì)算機(jī)程序獲得的。在其它實(shí)施方案中，ZPA變體多核苷酸指編碼ZPA多肽且能夠例如在嚴(yán)的核酸分子。ZPA變體多肽可以是那些由ZPA變體多核苷酸所編碼的。術(shù)語(yǔ)"全長(zhǎng)編碼區(qū)"在述及編碼ZPA多肽的核酸使用時(shí)指編碼本發(fā)明全長(zhǎng)ZPA多肽的核苷酸序列(在本文中常常在起始和終止密碼子之間(含起始和終止密碼子)顯示)。"分離的"，在用于描述本文中所公開(kāi)的各種ZPA多肽時(shí)，意指已經(jīng)鑒定且與/自其天然環(huán)境的一種成分分開(kāi)和/或回收的多肽。多肽的天然環(huán)境的污染物成分指通常會(huì)干擾其診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，將多肽純化至(1)足以通過(guò)使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得至少15個(gè)殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(2)根據(jù)使用考馬斯藍(lán)和/或銀染色的非還原性或還原性條件下的SDS-PAGE，達(dá)到同質(zhì)。既然ZPA多肽的天然環(huán)境的至少一種成分不會(huì)存在，那么分離的多肽包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位多肽。然而，分離的多肽通常通過(guò)至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備。"分離的"ZPA多肽編碼核酸或其它多肽編碼核酸指已經(jīng)鑒定且與多肽編碼核酸的天然來(lái)源中通常與之關(guān)聯(lián)的至少一種污染物核酸分子分開(kāi)的核酸分子。分離的多肽編碼核酸分子不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)它時(shí)的形式或背景。分離的多肽編碼核酸分子因此與存在于天然細(xì)胞中時(shí)的特定多肽編碼核酸分子有區(qū)別。然而，分離的多肽編碼核酸分子包括通常表達(dá)該多肽的細(xì)胞中所包含的多肽編碼核酸分子，例如當(dāng)所述核酸分子在所述細(xì)胞中的染色體定位不同于它在天然細(xì)胞中的染色體定位時(shí)。術(shù)語(yǔ)"控制序列，，指在特定宿主生物體中表達(dá)可操作連接的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適于原核生物的控制序列包括啟動(dòng)子、任選的操縱基因序列、和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子、多腺苷酸化信號(hào)、和增強(qiáng)子。若一段核酸與另一段核酸序列處于功能性相互關(guān)系中，則它是"可操作連"l妾的"。例如，若前序列(presequence)或分泌前導(dǎo)(secretoryleader)的DNA表達(dá)成參與多肽分泌的前蛋白質(zhì)(preprotein)，則它與該多肽的DNA可操作連接；若啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與該序列可操作連接；或者，若核糖體結(jié)合位點(diǎn)的位置促進(jìn)翻譯，則它與編碼序列可操作連接。一般而言，"可操作連接的"意味著相連的DNA序列是相鄰的，而且在分泌前導(dǎo)的情況中意味著相鄰且處于閱讀狀態(tài)。然而，增強(qiáng)子不必相鄰。連接可以通過(guò)在方便的限制性位點(diǎn)處的連接來(lái)實(shí)現(xiàn)。若沒(méi)有此類(lèi)位點(diǎn)，則依照常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。雜交反應(yīng)的"嚴(yán)格性，，容易為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所確定，并且通常取決于探針長(zhǎng)度、洗滌溫度和鹽濃度憑經(jīng)驗(yàn)計(jì)算。一般而言，較長(zhǎng)的探針需要較高的溫度用于正確的退火，而較短的探針則需要較低的溫度。當(dāng)互補(bǔ)鏈存在于低于它們解鏈溫度的環(huán)境中時(shí)，雜交通常取決于變性DNA重新退火的能力。探針和可雜交的序列之間的期望同源性程度越高，就可使用越高的相對(duì)溫度。作為結(jié)果，推出，更高的相對(duì)溫度趨向于使反應(yīng)條件更加嚴(yán)格，而更Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyIntersciencePublishers,(1995)。如本文中所定義的，"嚴(yán);f各條件，，或"高嚴(yán)格條件，，可以定義如下(1)對(duì)于洗滌使用低離子強(qiáng)度和高溫，例如0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉，50°C;(2)在雜交期間使用變性劑，諸如曱酰胺，例如，50%(v/v)曱酰胺及0.1。/。牛血清清蛋白/0.1%Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液pH6.5及750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉的，42。C，或(3)在使用50%曱酰胺，5xSSC(0,75MNaCl,0.075M檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH6.8),0.1%焦磷酸鈉，5xDenhardt氏溶液，超聲處理的鮭精DNA(50昭/ml),0.1。/。SDS和10。/。硫酸右旋糖苷的溶液中于42。C雜交過(guò)夜，于42。C在0.2xSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中洗滌10分鐘，接著是于55。C由含有EDTA的O.lxSSC組成的10分鐘高嚴(yán)^f各洗滌。"中等嚴(yán)格條件，，可規(guī)定為如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,NewYork:ColdSpringHarborPress,1989所4苗述的，而且包括使用與上文所述那些相比較不嚴(yán)格的洗滌溶液和雜交條件(例如溫度、離子強(qiáng)度和。/。SDS)。中等嚴(yán)格條件的一個(gè)例子是在含20%曱酰胺、5xSSC(150mMNaCl，15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5xDenhardt氏溶液、10%硫酸右旋糖苷和20mg/ml變性的剪切的鮭精DNA的溶液中于37。C溫育過(guò)夜，然后于約37-50。C在lxSSC中洗滌濾膜。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到如何根據(jù)適應(yīng)諸如探針長(zhǎng)度等因素的需要來(lái)調(diào)整溫度、離子強(qiáng)度等。術(shù)語(yǔ)"帶表位標(biāo)簽的"在用于本文時(shí)指包含ZPA多肽或抗ZPA抗體且其與"標(biāo)簽多肽，，融合的嵌合多肽。標(biāo)簽多肽具有足夠殘基以提供表位而可制備針對(duì)其的抗體，但又足夠短使得其不干擾與其融合的多肽的活性。在某些實(shí)施方案中，標(biāo)簽多肽還是相當(dāng)獨(dú)特的，使得其抗體基本上不與其它表位發(fā)生交叉反應(yīng)。合適的標(biāo)簽多肽通常具有至少6個(gè)氨基酸殘基，通常在約8個(gè)和約50個(gè)氨基酸殘基之間(在某些實(shí)施方案中，在約10個(gè)和約20個(gè)氨基酸殘基之間)。涵蓋帶表位標(biāo)簽的本發(fā)明多肽和抗體。關(guān)于ZPA多肽的"有生物學(xué)活性的，，和"生物學(xué)活性"和"生物學(xué)特征"指(l)具有在體內(nèi)或回體啟動(dòng)或剌激凋亡的能力；(2)具有特異性結(jié)合內(nèi)在凋亡途徑的上游和/或下游成員的能力；和/或(3)具有以其它方式調(diào)控ZPA信號(hào)傳導(dǎo)或ZPA活性的能力，除非另有說(shuō)明。關(guān)于經(jīng)修飾ZPA多肽的"有生物學(xué)活性的"和"生物學(xué)活性"和"生物學(xué)特征，，指(l)具有在體內(nèi)或回體啟動(dòng)或刺激凋亡的能力；(2)具有特異性結(jié)合內(nèi)在凋亡途徑的上游和/或下游成員的能力；和/或(3)具有以其它方式調(diào)控ZPA信號(hào)傳導(dǎo)或ZPA活性的能力，除非另有說(shuō)明。關(guān)于本發(fā)明的抗ZPA抗體的"有生物學(xué)活性的"和"生物學(xué)活性，，和"生物學(xué)特征，，指(l)具有部分或完全阻斷、抑制或中和天然ZPA多肽的生物學(xué)活性的能力(或是拮抗方式或是阻斷方式)；(2)具有特異性結(jié)合ZPA多肽的能力；和/或(3)具有調(diào)控ZPA信號(hào)傳導(dǎo)或ZPA活性的能力，除非另有說(shuō)明。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體以至少luM或更低、100nM或更低、50nM或更低、10nM或更低、5nM或更低、lnM或更低的親和力結(jié)合ZPA蛋白。在用于本文時(shí)，"抗體可變域，，指抗體分子的輕鏈和重鏈中包含互補(bǔ)決定區(qū)(CDR;即CDR1、CDR2、和CDR3)和框架區(qū)(FR)氨基酸序列的那部分。VH指重鏈可變域。Vj旨輕鏈可變域。依照本發(fā)明所使用的方法，歸為CDR和FR的氨基酸4立置是依,照Kabat，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.,1987和1991定義的?？贵w或抗原結(jié)合片段的氨基酸編號(hào)方式也依照Kabat的。在用于本文時(shí)，"密碼子集"指用于編碼期望變體氨基酸的一套不同核苷酸三聯(lián)體序列?？梢酝ㄟ^(guò)例如固相合成來(lái)合成一套寡核苷酸，其包括呈現(xiàn)密碼子集所提供的核苷酸三聯(lián)體的所有可能組合并編碼一組期望氨基酸的序列。一種標(biāo)準(zhǔn)形式的密碼子命名是IUB代碼，其是本領(lǐng)域已知的且在本文中有描述。"異源DNA，，指導(dǎo)入宿主細(xì)胞的任何DNA。DNA可以衍生自多種來(lái)源，包括基因組DNA、cDNA、合成DNA、及這些的融合物和組合物。DNA可以包括來(lái)自與宿主或受體細(xì)胞相同的細(xì)胞或細(xì)胞類(lèi)型的DNA,或者來(lái)自不同細(xì)胞類(lèi)型(例如來(lái)自哺乳動(dòng)物或植物)的DNA。DNA可以任選的包含標(biāo)志物或選擇基因，例如抗生素抗性基因、溫度抗性基因等。涵蓋包含編碼本發(fā)明多肽和抗體的異源DNA的宿主細(xì)胞及其用途。在用于本文時(shí)，"文庫(kù)"或"庫(kù)"指眾多多肽(例如抗體或抗體片段序列)，或者編碼這些序列的核酸，這些序列在根據(jù)本發(fā)明方法導(dǎo)入這些序列的變體氨基酸組合方面是不同的。"噬菌體展示，，是一種將變體多肽作為與外殼蛋白的融合蛋白展示在噬菌體(例如絲狀噬菌體)顆粒表面上的技術(shù)。噬菌體展示的效用在于能對(duì)隨機(jī)化蛋白質(zhì)變體的大型文庫(kù)快速且高效分選那些以高親和力結(jié)合靶分子的序列的實(shí)情。肽和蛋白質(zhì)文庫(kù)在噬菌體上的展示已經(jīng)用于對(duì)數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的多肽篩選那些具有特異性結(jié)合特性的多肽。多價(jià)噬菌體展示法已經(jīng)用于展示小隨機(jī)肽和小蛋白質(zhì)，其通過(guò)與絲狀噬菌體的基因ni或基因vm融合來(lái)實(shí)現(xiàn)。Wells和Lowman,Op/".3:355-362(1992),及其中所引用的參考文獻(xiàn)。在單價(jià)噬菌體展示中，將蛋白質(zhì)或肽文庫(kù)與基因m或其一部分融合，并在存在野生型基因m蛋白時(shí)以低水平表達(dá)，使得噬菌體顆粒展示一個(gè)拷貝的融合蛋白或者不展示融合蛋白。親合效應(yīng)(avidityeffect)相對(duì)于多價(jià)噬菌體得到了降低，使得分選基于內(nèi)在的配體親和力，而且使用噬菌粒載體，這簡(jiǎn)化了DNA操作。Lowman和Wells，Me^zo血'Jc麵;am'o"toMeAcxis五"^wo/ogv3:205-0216(1991)。"噬菌粒"是具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(例如ColEl)和一個(gè)拷貝的噬菌體基因區(qū)間的質(zhì)粒載體。噬菌?？衫萌魏我阎删w，包括絲狀噬菌體和X類(lèi)噬菌體。質(zhì)粒一般也包含抗生素抗性的可選擇標(biāo)志物?？寺∪脒@些載體的DNA區(qū)段可以像質(zhì)粒一起而擴(kuò)增。在給容納這些載體的細(xì)胞提供生成噬菌體顆粒所必需的所有基因時(shí)，質(zhì)粒的復(fù)制模式變成滾環(huán)復(fù)制，以生成質(zhì)粒DNA的一條鏈的拷貝，并包裝噬菌體顆粒。噬菌粒可形成感染性或非感染性噬菌體顆粒。此術(shù)語(yǔ)包括這樣的噬菌粒，它們包含與異源多肽基因連接成基因融合物的噬菌體外殼蛋白基因或其片段，使得異源多肽展示在噬菌體顆粒的表面上。術(shù)語(yǔ)"嗟菌體載體"指包含異源基因且能夠復(fù)制的雙鏈復(fù)制型噬菌體。噬菌體載體具有容許噬菌體復(fù)制和噬菌體顆粒形成的噬菌體復(fù)制起點(diǎn)。噬菌體可以是絲狀噬菌體，諸如M13、fl、fd、Pf3噬菌體或其衍生物，或者是X類(lèi)噬菌體，諸如X、21、cp80、cp81、82、424、434等或其衍生物。術(shù)語(yǔ)"蛋白聚糖"指如下分子，其中至少一個(gè)糖胺聚糖側(cè)鏈共價(jià)附著至該分子的蛋白質(zhì)核心。依照本發(fā)明的蛋白聚糖合成缺陷細(xì)胞系包括半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I缺陷的細(xì)胞系。依照一個(gè)實(shí)施方案，所述細(xì)胞系是CHO-psbg細(xì)胞系。術(shù)語(yǔ)"拮抗劑"指部分或完全阻斷、抑制或中和天然ZPA多肽的生物學(xué)活性和特異性結(jié)合天然ZPA多肽的任何分子。依照一個(gè)實(shí)施方案，拮抗劑是多肽。依照另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的抗體可抑制拮抗劑結(jié)合天然ZPA多肽。術(shù)語(yǔ)"小分子拮抗劑"指分子量為1500道爾頓或更低且是依照本發(fā)明的拮抗劑的任何分子。依照一個(gè)實(shí)施方案，小分子拮抗劑小于大約500道爾頓。依照一個(gè)實(shí)施方案，拮抗劑在表達(dá)至少一種天然ZPA多肽的細(xì)胞中阻斷、抑制、降低或中和凋亡。合適的拮抗劑包括天然ZPA多肽的氨基酸序列變體、抗體、抗原結(jié)合性抗體片段、本發(fā)明的肽、適體等。用于鑒定ZPA多肽的拮抗劑的方法可包括使ZPA多肽接觸候選拮抗劑分子并測(cè)量一種或多種與ZPA多肽有關(guān)的生物學(xué)活性的可^r測(cè)變化。術(shù)語(yǔ)"適體"指能夠結(jié)合靶分子(諸如ZPA多肽)的核酸分子。適體的生成和治療用途是本領(lǐng)域已完全確立的。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.5,475,096,以及Macugen⑧(Eyetech,NewYork)用于治療年齡相關(guān)黃斑變性的治療功效。術(shù)語(yǔ)"強(qiáng)化劑，，(potentiator)和"激動(dòng)劑"指增強(qiáng)天然ZPA多肽的生物學(xué)活性的任何分子，其中所述強(qiáng)化劑啟動(dòng)和/或刺激凋亡。在一個(gè)實(shí)施方案中，激動(dòng)劑特異性結(jié)合天然ZPA多肽并增強(qiáng)該天然ZPA多肽的生物學(xué)活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，激動(dòng)劑刺激編碼天然ZPA多肽的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，使得天然ZPA多肽的表達(dá)升高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，激動(dòng)劑抑制天然ZPA多肽的抑制劑的正常發(fā)揮功能。應(yīng)當(dāng)理解，前述實(shí)施方案并不互相排斥，使得激動(dòng)劑可以例如特異性結(jié)合天然ZPA多肽并增強(qiáng)該天然ZPA多肽的生物學(xué)活性，同時(shí)還抑制天然ZPA多肽的抑制劑的正常發(fā)揮功能。用于鑒定ZPA多肽的激動(dòng)劑的方法可包括使結(jié)合ZPA的分子接觸ZPA多肽和候選激動(dòng)劑并測(cè)量一種或多種與ZPA多肽有關(guān)的生物學(xué)活性的可檢測(cè)變化(例如胱天蛋白酶活化升高或凋亡的速率或量增加)。"處理"或"治療，，或"緩和"指治療性處理及預(yù)防性或防范性措施二者，其中目標(biāo)是預(yù)防或減緩(減輕)所針對(duì)的病理學(xué)狀況或病癥。需要治療的受試者包括早就患有病癥的受試者以及傾向于患上病癥的受試者或要預(yù)29防病癥的受試者。這些術(shù)語(yǔ)表明，如果本文中的治療性和預(yù)防性用途改善、減輕或降低與疾病有關(guān)的癥狀、并發(fā)癥或其它問(wèn)題，或者改善、減輕或降低與疾病有關(guān)的癥狀、并發(fā)癥或其它問(wèn)題的發(fā)作機(jī)會(huì)或頻率，那么它們是成功的。如果在依照本發(fā)明的方法接受治療量的拮抗劑后，患者在如下一項(xiàng)或多項(xiàng)中顯示出可觀察和/或可測(cè)量的降低或消失，那么受試者或哺乳動(dòng)物成功"治療"了癌癥癌細(xì)胞數(shù)降低或癌細(xì)胞消失；腫瘤體積縮??；癌細(xì)胞浸潤(rùn)入周?chē)鞴?包括癌傳播入軟組織和骨)受到抑制(即一定程度的減緩，優(yōu)選停止)；腫瘤轉(zhuǎn)移受到抑制(即一定程度的減緩，優(yōu)選停止)；腫瘤生長(zhǎng)受到一定程度的抑制；和/或一種或多種與特定癌癥有關(guān)的癥狀得到一定程度的減輕；發(fā)病率和死亡率降低；及生命質(zhì)量提高。就抗ZPA抗體或ZPA結(jié)合性寡肽可預(yù)防癌細(xì)胞生長(zhǎng)和/或殺死現(xiàn)有癌細(xì)胞而言，它可以是細(xì)胞抑制性的和/或細(xì)胞毒性的。這些征候或癥狀的減輕還可以由患者感受到。如果在依照本發(fā)明的方法接受治療量的拮抗劑或激動(dòng)劑后，患者在一項(xiàng)或多項(xiàng)與異常凋亡有關(guān)的癥狀中顯示出可觀察和/或可測(cè)量的凋亡調(diào)控和/或一定程度的緩解，和生活質(zhì)量的改善，那么受試者或哺乳動(dòng)物成功"治療"了凋亡相關(guān)病癥。用于評(píng)估疾病的成功治療和改善的上述參數(shù)可以容易的通過(guò)內(nèi)科醫(yī)師所熟悉的規(guī)程來(lái)測(cè)量。對(duì)于癌癥療法，可通過(guò)例如評(píng)估疾病進(jìn)展時(shí)間(timetodiseaseprogression,TTP)和/或測(cè)定響應(yīng)率(responserate,RR)來(lái)測(cè)量功爻文。專(zhuān)爭(zhēng)移可通過(guò)分期測(cè)試(stagingtest)來(lái)測(cè)定，及通過(guò)骨掃描及鈣水平和其它酶的測(cè)試以測(cè)定是否傳播到骨。還可進(jìn)行CT掃描以查明是否傳播到骨盆及該區(qū)域中的淋巴結(jié)。分別使貢糊^%*線(xiàn):過(guò)€7知方法進(jìn)#^*水，測(cè)量來(lái)^是否轉(zhuǎn)移到肺和肝。用于監(jiān)測(cè)疾病的其它已知方法包括經(jīng)直腸超聲檢查(TRUS)和經(jīng)直腸針吸活組織檢查(TRNB)等其它本領(lǐng)域公知的方法。"長(zhǎng)期，，施用指與短期模式相反，以連續(xù)模式施用藥劑，從而將初始治療效果(活性)維持較長(zhǎng)一段時(shí)間。"間歇"施用指不是無(wú)間斷連續(xù)進(jìn)行的治療，而是本質(zhì)上周期性的。為了治療癌癥、減輕癌癥癥狀或診斷癌癥目的，"哺乳動(dòng)物"指歸入哺乳類(lèi)的任何動(dòng)物(也稱(chēng)作"患者")，包括人，家畜和牲畜，及動(dòng)物園、運(yùn)動(dòng)或?qū)櫸飫?dòng)物，諸如犬、貓、牛、馬、綿羊、豬、山羊、家兔等。在某些實(shí)施方30案中，哺乳動(dòng)物指人。與一種或多種其它治療劑"聯(lián)合"施用包括同時(shí)(共同)施用和任何次序的序貫施用。"載體"在用于本文時(shí)包括藥學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，它們?cè)谒捎玫膭┝亢蜐舛葘?duì)暴露于它們的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物是無(wú)毒的。通常，生理學(xué)可接受載體是pH緩沖水溶液。生理學(xué)可接受載體的例子包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明月交或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴(lài)氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA;糖醇，諸如甘露醇或山梨醇；成鹽反荷離子，諸如鈉；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN⑧、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS⑧。"固相，，或"固體支持物"意指本發(fā)明的抗體、拮抗劑或多肽可粘著或附著其上的非水性基質(zhì)。本文中所涵蓋的固相的例子包括那些部分或完全由玻璃(例如可控孔徑玻璃)、多糖(例如瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和聚珪氧烷(silicone)制成的固相。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)語(yǔ)境，固相可包括測(cè)定板的孔；在其它實(shí)施方案中，它指純化柱(例如親和層析柱)。此術(shù)語(yǔ)還包括離散顆粒的不連續(xù)固相，諸如美國(guó)專(zhuān)利No.4，275,149中所記載的。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"免疫粘附素"指將異源蛋白質(zhì)("粘附素")的結(jié)合特異性與免疫球蛋白恒定域的效應(yīng)器功能聯(lián)合起來(lái)的抗體樣分子。在結(jié)構(gòu)上，免疫粘附素包括不同于抗體的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)(即是"異源"的)、具有期望結(jié)合特異性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定域序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分典型的是至少包含受體或配體的結(jié)合位點(diǎn)的連續(xù)氨基酸序列(諸如天然ZPA蛋白的一部分)。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以從任何免疫球蛋白獲得，諸如IgG-l、IgG-2、IgG-3或IgG-4亞型、IgA(包括IgA-l和IgA-2)、IgE、IgD、或IgM。"脂質(zhì)體"指由各種類(lèi)型的脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑構(gòu)成的，可用于對(duì)哺乳動(dòng)物投遞藥物(諸如ZPA多肽、ZPA抗體或ZPA結(jié)合性寡肽)的小嚢泡。脂質(zhì)體的成分通常排列成雙層形式，與生物膜的脂質(zhì)排列相似。本文中所公開(kāi)的多肽、抗體、拮抗劑或組合物的"有效量，，指足以實(shí)現(xiàn)明確規(guī)定的目的的量。"有效量，，可以憑經(jīng)驗(yàn)和通過(guò)與所規(guī)定的目的有關(guān)的已4口方法來(lái)確定。術(shù)語(yǔ)"治療有效量"指在哺乳動(dòng)物(也稱(chēng)作受試者)中有效"治療"疾病或病癥的本發(fā)明抗體、多肽或拮抗劑的量。在癌癥的情況中，藥物的治療有效量可降低癌細(xì)胞數(shù)；縮小胂瘤體積；抑制(即一定程度的減緩，優(yōu)選停止)癌細(xì)胞浸潤(rùn)入周?chē)鞴?；抑?即一定程度的減緩，優(yōu)選停止)腫瘤轉(zhuǎn)移；一定程度的抑制腫瘤生長(zhǎng)；和/或一定程度的減輕一種或多種與癌癥有關(guān)的癥狀。參見(jiàn)本文中"治療"的定義。就藥物可預(yù)防癌細(xì)胞生長(zhǎng)和/或殺死現(xiàn)有癌細(xì)胞的程度而言，它可以是細(xì)胞抑制性的和/或細(xì)胞毒性的。本發(fā)明多肽、抗體、拮抗劑或組合物的"細(xì)胞毒性量，，指能夠在體外或在體內(nèi)引起細(xì)胞(尤其是腫瘤，例如癌細(xì)胞)破壞的量。本發(fā)明多肽、抗體、拮抗劑或組合物為了抑制例如贅生性細(xì)胞生長(zhǎng)的"細(xì)胞毒性量"可以憑經(jīng)驗(yàn)和通過(guò)本領(lǐng)域已知方法來(lái)確定。術(shù)語(yǔ)"抗體，，以最廣義使用，明確覆蓋例如單一抗ZPA多肽單克隆抗體(包括激動(dòng)性、拮抗性和中和性抗體)、具有多表位特異性的抗ZPA多肽抗體組合物、多克隆抗體、單鏈抗ZPA多肽抗體、及抗ZPA多肽抗體片段(見(jiàn)下文)，只要它們特異性結(jié)合天然ZPA多肽和/或展現(xiàn)出本發(fā)明的生物學(xué)活性或免疫學(xué)活性。短語(yǔ)抗體的"功能性片段或類(lèi)似物"指與所述及的抗體具有共同的定性生物學(xué)活性的化合物。例如，抗ZPA多肽抗體的功能性片段或類(lèi)似物可以是能特異性結(jié)合ZPA分子的功能性片段或類(lèi)似物。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體能阻止或?qū)嵸|(zhì)性降低ZPA分子誘導(dǎo)凋亡的能力。術(shù)語(yǔ)"免疫球蛋白"(Ig)在本文中與"抗體"可互換使用。"分離的抗體"指已經(jīng)鑒定且與/自其天然環(huán)境的一種成分分開(kāi)和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染物成分指將會(huì)干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，將抗體純化至(l)根據(jù)Lowiy法的測(cè)定，抗體重量超過(guò)95%,最優(yōu)或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE及使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選的銀染色，達(dá)到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會(huì)存在，那么分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過(guò)至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備?；镜?鏈抗體單元是由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)構(gòu)成的異四聚體糖蛋白(IgM抗體由5個(gè)基本的異四聚體單元及稱(chēng)作J鏈的另外多肽組成，因此包含10個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)；而分泌型IgA抗體可聚合而形成包含2-5個(gè)基本的4鏈單元及J鏈的多價(jià)裝配物)。在IgG的情況中，4鏈單元通常是約150,000道爾頓。每條輕鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈相連，而兩條重鏈通過(guò)一個(gè)或多個(gè)二硫4定彼此相連，二硫鍵的數(shù)目取決于重鏈的同種型。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在N-末端具有一個(gè)可變域(Vh)，接著是三個(gè)(對(duì)于ci和Y鏈)或四個(gè)(對(duì)于p和s同種型)恒定域(Ch)。每條輕鏈在N-末端具有一個(gè)可變域(VO，接著是其另一端的一個(gè)恒定域(co。Vl與Vh排列在一起，而cl與重鏈第一恒定域(CHl)排列在一起。認(rèn)為特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變域之間形成界面。一個(gè)VH和一個(gè)Vt—起配對(duì)而形成一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。關(guān)于不同類(lèi)別抗體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，參見(jiàn)例如BasicandClinicalImmunology,第8^反,DanielP.Stites,AbbaI.Terr禾口TristramG.Parslow(編)，Appleton&Lange,Norwalk，CT，1994，第71頁(yè)和第6章。根據(jù)其恒定域氨基酸序列，來(lái)自任何脊推動(dòng)物物種的輕鏈可歸入兩種截然不同類(lèi)型中的一種，稱(chēng)作卡帕(K)和拉姆達(dá)(人)。根據(jù)其重鏈恒定域(CH)氨基酸序列，免疫球蛋白可歸入不同的類(lèi)別或同種型。有五類(lèi)免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分別具有稱(chēng)作a、5、￡、y和p的重鏈。根據(jù)Ch序列和功能的相對(duì)較小差異，Y和a類(lèi)可進(jìn)一步分為亞類(lèi)，例如人類(lèi)表達(dá)下列亞類(lèi)IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。術(shù)語(yǔ)"可變的"指可變域中的某些區(qū)段在抗體間序列差異廣泛的實(shí)情。V結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)抗原結(jié)合并限定特定抗體對(duì)其特定抗原的特異性。然而，變異性并非均勻分布于可變域跨越的110個(gè)氨基酸。事實(shí)上，V區(qū)由15-30個(gè)氨基酸，稱(chēng)作框架區(qū)(FR)的相對(duì)不變異的區(qū)段及將框架區(qū)分開(kāi)的每個(gè)長(zhǎng)度為9-12個(gè)氨基酸，稱(chēng)作"高變區(qū)"的極度變異的較短區(qū)域組成。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個(gè)FR，它們大多采取(3-折疊片構(gòu)象，通過(guò)三個(gè)形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成P-折疊片結(jié)構(gòu)一部分的高變區(qū)連接。每條鏈中的高變區(qū)通過(guò)FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的開(kāi)》成(參見(jiàn)Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda:MD(1991))。恒定域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)器功能，諸如抗體依賴(lài)性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)中抗體的參與。術(shù)語(yǔ)"高變區(qū)"在用于本文時(shí)指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)一般包含來(lái)自"互補(bǔ)決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(例如Vl中的大約殘基24-34(Ll)、50-56(L2)和89-97(L3)附近及Vh中的大約殘基31-35(Hl)、50-65(H2)和95-102(H3)附近(在一個(gè)實(shí)施方案中，Hl在大約殘基31-35附近)；Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD.(1991))和/或那些來(lái)自"高變環(huán)"的殘基(例如VL中的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及VH中的殘基26-32(Hl)、53-55(H2)和96-101(H3);Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體，，在用于本文時(shí)指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各抗體個(gè)體是相同的，除了可以以極小量存在的可能的天然存在突變形式外。單克隆抗體是高度特異性的，針對(duì)單一抗原性位點(diǎn)。此外，與包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。在它們的特異性之外，單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)在于它們可以在未受到其它抗體污染的情況中合成。修飾語(yǔ)"單克隆，，不應(yīng)解釋為要求通過(guò)任何特定方法來(lái)生成抗體。例如，可用于本發(fā)明的單克隆抗體可通過(guò)最初由Kohler等，Nature256:495(1975)記載的雜交瘤方法來(lái)制備，或者可通過(guò)重組DNA方法在細(xì)菌、真核動(dòng)物或植物細(xì)胞中制備(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.4,816,567)。"單克隆抗體，，還可使用例如Clackson等，Nature352:624-628(1991);Marks等，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)和下文實(shí)施例中記載的技術(shù)從噬菌體抗體庫(kù)分離。單克隆抗體在本文中包括"嵌合，，抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類(lèi)別或亞類(lèi)的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類(lèi)別或亞類(lèi)的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類(lèi)抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出本發(fā)明的生物學(xué)活性(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.4,816,567;Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。本文中感興趣的嵌合抗體包括包含衍生自非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(例如舊大陸猴類(lèi)(OldWorldMonkey)、猿等)的可變域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列的"靈長(zhǎng)類(lèi)化"抗體。"完整抗體"指包含抗原結(jié)合位點(diǎn)以及CL和至少重鏈恒定域CHl、CH2和Ch3的抗體。恒定域可以是天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列變體。在某些實(shí)施方案中，完整抗體具有一項(xiàng)或多項(xiàng)效應(yīng)器功臺(tái)匕"抗體片段"包含完整抗體的一部分，優(yōu)選完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙抗體；線(xiàn)性抗體(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5,641,870,實(shí)施例2;Zapata等，ProteinEng.8(10):1057-1062(1995));單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。表述"線(xiàn)性抗體"一般指Zapata等，ProteinEng,8(10):1057-1062(1995)中所描述的抗體。簡(jiǎn)言之，這些抗體包含一對(duì)串聯(lián)的Fd區(qū)段(VH-CH1-VH-CH1),該區(qū)段與互補(bǔ)的輕鏈多肽一起形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)。線(xiàn)性抗體可以是雙特異性的或單特異性的。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱(chēng)作"Fab"片段，和一個(gè)殘余"Fc，，片段，其名稱(chēng)反映了它易于結(jié)晶的能力。Fab片段由一條完整輕鏈及一條重鏈的可變域(VH)和第一恒定域(CHl)組成。每個(gè)Fab片段對(duì)于抗原結(jié)合是單價(jià)的，即它具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。胃蛋白酶處理抗體產(chǎn)生一個(gè)較大F(ab')2片段，它粗略相當(dāng)于兩個(gè)通過(guò)二石克鍵相連的Fab片段，具有二價(jià)抗原結(jié)合活性且仍能夠交聯(lián)抗原。Fab，片段因在Ch1結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基而與Fab片段有所不同，包括一個(gè)或多個(gè)來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸。Fab，-SH是本文中對(duì)其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab，的稱(chēng)謂。F(ab')2抗體片段最初是作為成對(duì)Fab，片段生成的，在Fab，片段之間具有鉸鏈半胱氨酸。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。Fc片段包含通過(guò)二硫鍵保持在一起的所有兩條重鏈的羧基末端部分?？贵w的效應(yīng)器功能是由Fc區(qū)中的序列決定的，該區(qū)還是受到在某些類(lèi)型的細(xì)胞上找到的Fc受體(FcR)所識(shí)別的部分。"Fv，，是包含完整抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。該片段由緊密、非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。從這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的折疊結(jié)構(gòu)中散發(fā)出六個(gè)高變環(huán)(重鏈和輕鏈各3個(gè)環(huán)),其貢獻(xiàn)出供結(jié)合抗原的氨基酸殘基并賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變域(或是只包含三個(gè)對(duì)抗原特異性的CDR的半個(gè)Fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，只是親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。"單鏈Fv"，也可縮寫(xiě)為"sFv"或"scFv"，是包含連接成一條多肽鏈的抗體VH和Vt結(jié)構(gòu)域的抗體片段。在某些實(shí)施方案中，sFv多肽在VH和V^結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得sFv形成抗原結(jié)合期望的結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv的綜述參見(jiàn)Pliickthun,ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113巻,Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315,1994;Borrebaeck1995,見(jiàn)下文。術(shù)語(yǔ)"雙抗體"指通過(guò)在VH和Vt結(jié)構(gòu)域之間使用短接頭(約5-10個(gè)殘基)構(gòu)建sFv片段(見(jiàn)上一段)而制備的小型抗體片段，由于接頭短，使得V結(jié)構(gòu)域?qū)嵭墟滈g而非鏈內(nèi)配對(duì)，導(dǎo)致二價(jià)片段，即具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的片段。雙特異性雙抗體是兩個(gè)"交叉"sFv片段的異二聚體，其中兩種抗體的VH和V^結(jié)構(gòu)域存在于不同多肽鏈上。雙抗體更完整的描述于例如EP404,097;WO93/11161;Hollingeretal"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。非人(例如嚙齒類(lèi))抗體的"人源化"形式指最低限度包含衍生自非人抗體的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有期望抗體特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)(諸如小鼠、大鼠、家兔或非人靈長(zhǎng)類(lèi))的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。通常，人源化抗體包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)基本上整個(gè)如下可變域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc),通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見(jiàn)Jones等，Nature321:522-525(1986);Riechmann等，Nature332:323-329(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。"物種依賴(lài)性抗體"(例如哺乳動(dòng)物抗人IgE抗體)指如下抗體，其對(duì)來(lái)自第一哺乳動(dòng)物物種的抗原的結(jié)合親和力強(qiáng)于其對(duì)該抗原來(lái)自第二哺乳動(dòng)物物種的同系物的結(jié)合親和力。通常，物種依賴(lài)性抗體"特異性結(jié)合，，人類(lèi)抗原(即具有不超過(guò)約lx1(T7M、不超過(guò)約lx1(T8M、和不超過(guò)約lx10-9M的結(jié)合親和力(Kd))，但是對(duì)該抗原來(lái)自第二非人哺乳動(dòng)物物種的同系物具有比其對(duì)人類(lèi)抗原的結(jié)合親和力弱至少約50倍、或至少約500倍、或至少約IOOO倍的結(jié)合親和力。物種依賴(lài)性抗體可以是上文定義的各種類(lèi)型抗體，而且在某些實(shí)施方案中，是人源化抗體或人抗體。"ZPA結(jié)合寡肽"指結(jié)合，優(yōu)選特異性結(jié)合本文所述ZPA多肽的寡肽。ZPA結(jié)合寡肽可使用已知的寡肽合成方法學(xué)而化學(xué)合成，或者可使用重組技術(shù)來(lái)制備和純化。ZPA結(jié)合寡肽的長(zhǎng)度通常是至少約5個(gè)氨基酸，或者長(zhǎng)度為至少約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、卯、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100個(gè)氨基酸或更多，其中此類(lèi)寡肽能夠結(jié)合，優(yōu)選特異性結(jié)合本文所述ZPA多肽。ZPA結(jié)合寡肽可使用已知技術(shù)無(wú)需過(guò)多實(shí)驗(yàn)就得以鑒定。在這點(diǎn)上，注意到用于對(duì)寡肽文庫(kù)篩選能夠特異性結(jié)合多肽靶物的寡肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.5，556，762,5,750,373，4,708,871，4,833,092，5,223,409，5,403,484，5,571,689,5,663,143;PCT公開(kāi)號(hào)WO84/03506和WO84/03564;Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:3998-4002(1984);Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:178-182(1985);Geysen等，于SyntheticPeptidesasAntigens,130-149(1986);Geysen等，J,Immunol.Meth,102:259-274(1987);Schoofs等,J.Immunol.140:611-616(1988);Cwirla，S.E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6378(1990);Lowman,H.B.等,Biochemistry30:10832(1991);Clackson，T.等，Nature352:624(1991);Marks,J.D.等,J.Mol.Biol.222:581(1991);Kang,A.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8363(1991);及Smith,G.P.,CurrentOpin.Biotechnol.2:668(1991))。"結(jié)合"感興趣抗原例如ZPA多肽的本發(fā)明多肽、抗體、拮抗劑或組合物指以足夠親和力結(jié)合該抗原，使得該多肽、抗體、拮抗劑或組合物可作為診斷劑和/或治療劑用于靶向表達(dá)該抗原的細(xì)胞或組織且不顯著與其它蛋白質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)的多肽、抗體、拮抗劑或組合物。在此類(lèi)實(shí)施方案中，根據(jù)熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分析或;故射免疫沉淀(RIA)的測(cè)定，多肽、抗體、拮抗劑或組合物結(jié)合"非耙物"蛋白質(zhì)的程度將小于該多肽、抗體、拮抗劑或組合物對(duì)其特定靶物蛋白質(zhì)的結(jié)合的約10%。對(duì)于多肽、抗體、拮抗劑或組合物對(duì)靶分子的結(jié)合，術(shù)語(yǔ)"特異結(jié)合，，或"特異性結(jié)合，，特定多肽或特定多肽靶物上的表位或?qū)ζ?特異，，意味著該結(jié)合與非特異相互作用有可測(cè)量的差異。特異結(jié)合可通過(guò)例如測(cè)定分子的結(jié)合并與對(duì)照分子的結(jié)合比較來(lái)測(cè)量，所述對(duì)照分子通常是結(jié)構(gòu)相似但沒(méi)有結(jié)合活性的分子。例如，特異結(jié)合可通過(guò)與對(duì)照分子的竟?fàn)巵?lái)測(cè)定，所述對(duì)照分子與靶物相似，例如過(guò)量的未標(biāo)記靶物。在這種情況中，若經(jīng)標(biāo)記靶物與探針的結(jié)合受到過(guò)量未標(biāo)記靶物的竟?fàn)幮砸种?，則指示特異結(jié)合。術(shù)語(yǔ)"特異結(jié)合"或"特異性結(jié)合"特定多肽或特定多肽靶物上的表位或?qū)ζ?特異"在用于本文時(shí)可表現(xiàn)為例如分子對(duì)耙物的Kd為至少約10"M，或至少約10^M,或至少約10"M，或至少約10^M，或至少約10_8]^,或至少約10^M，或至少約10^M，或至少約10—11M，或至少約10"M或更大。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"特異結(jié)合"指如下結(jié)合，其中分子結(jié)合特定多肽或特定多肽上的表位，而基本上不結(jié)合任何其它多肽或多肽表位(例如非ZPA蛋白)。應(yīng)當(dāng)理解，特異性結(jié)合斑馬魚(yú)天然ZPA多肽的抗體也可結(jié)合ZPA多肽的非斑馬魚(yú)多肽同系物。"抑制(腫瘤細(xì)胞)生長(zhǎng)"的多肽、抗體、拮抗劑或組合物或者"生長(zhǎng)抑制性"多肽、抗體、拮抗劑或組合物指導(dǎo)致可測(cè)量的癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的多肽、抗體、拮抗劑或組合物。在某些實(shí)施方案中，生長(zhǎng)抑制性多肽、抗體、拮抗劑或組合物與適宜對(duì)照相比對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制超過(guò)20%、大約20%到大約50%、和超過(guò)50%(例如大約50%到大約100%)，所述對(duì)照通常是未用所測(cè)試的多肽、抗體、拮抗劑或組合物處理的腫瘤細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案0.5nM到200nM時(shí)測(cè)量，其中生長(zhǎng)抑制在腫瘤細(xì)胞暴露于抗體后1-1O天測(cè)定。體內(nèi)肺瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制可以以多種方式測(cè)定，諸如下文實(shí)驗(yàn)實(shí)施例部分所描述的。如果抗ZPA抗體大約l嗎/kg到大約100mg/kg體重的施用導(dǎo)致在距首次施用抗體大約5天到3個(gè)月內(nèi)(例如大約5-30天內(nèi))腫瘤體積縮小或腫瘤細(xì)胞增殖減少，那么該抗體在體內(nèi)是生長(zhǎng)抑制性的?？贵w"效應(yīng)器功能"指那些可歸于抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc區(qū))且隨抗體同種型而變化的生物學(xué)活性?？贵w效應(yīng)器功能的例子包括Clq結(jié)合和補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體)下調(diào)；和B細(xì)月包活4匕。"抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性"或"ADCC"指其中結(jié)合到某些細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如天然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上存在的Fc受體(FcR)上的分泌型Ig使得這些細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞能夠特異性結(jié)合攜帶抗原的靶細(xì)胞，隨后用細(xì)胞毒素殺死耙細(xì)胞的細(xì)胞毒性形式。該抗體"武裝"(arm)細(xì)胞毒性細(xì)胞，而且是此類(lèi)殺傷作用絕對(duì)要求的。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，NK細(xì)胞，只表達(dá)FcyRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcYRI、FcYRII和FcYRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev,Immunol.9:457-92(1991)第464頁(yè)表3總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為了評(píng)估感興趣分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC測(cè)定法，諸如美國(guó)專(zhuān)利No.5，500,362或5,821，337中所記載的?？捎糜诖祟?lèi)測(cè)定法的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞?；蛘?另外，可在體內(nèi)評(píng)估感興趣分子的ADCC活性，例如在動(dòng)物才莫型中，諸如Clynes等，PNAS(USA)95:652-656(1998)中所披露的。"Fc受體"或"FcR"描述結(jié)合抗體Fc區(qū)的受體。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)cR是天然序列人FcR。此外，F(xiàn)cR可以是結(jié)合IgG抗體的FcR(y受體)，包括FqRI、FcYRII和FcYRIII亞類(lèi)的受體，包括這些受體的等位變體和可變剪接形式。FcyRII受體包括FcyRIIA("活化受體")和FcyRIIB("抑制受體")，它們具有相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在于其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?；罨荏wFcyRIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體FcyRIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(綜述參見(jiàn)Dagron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR的綜述參見(jiàn)Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991);Capel等，Immunomethods4:25-34(1994);及deHaas等,J.Lab.Clin.Med.126:330-341(1995)。術(shù)語(yǔ)"FcR，，在本文中涵蓋其它FcR，包括那些未來(lái)將會(huì)鑒定的。該術(shù)語(yǔ)還包括新生兒受體，F(xiàn)cRn,其負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyer等，J.Immunol.117:587(1976)及Kim等，J.Immunol.24:249(1994))。"人效應(yīng)細(xì)胞，，指表達(dá)一種或多種FcR并行使效應(yīng)器功能的白細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，該細(xì)胞至少表達(dá)Fc7Rin并行使ADCC效應(yīng)器功能。介導(dǎo)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性細(xì)胞，優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞可以從天然來(lái)源分離，例如血液。"補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性，，或"CDC"指存在補(bǔ)體時(shí)對(duì)靶細(xì)胞的溶解。經(jīng)典補(bǔ)體途徑的激活是由補(bǔ)體系統(tǒng)第一組分(Clq)結(jié)合如下抗體(適宜亞類(lèi)的)起始的，該抗體結(jié)合至其關(guān)聯(lián)抗原。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可進(jìn)行CDC測(cè)定法，例如如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods202:163(1996)中所記載的。"凋亡相關(guān)病癥"指由異?；蚴д{(diào)凋亡引起的、因異?；蚴д{(diào)凋亡延長(zhǎng)的、或以異常或失調(diào)凋亡為特征的生理疾患或疾病狀態(tài)。凋亡相關(guān)病癥包括但不限于細(xì)胞增殖性病癥、病毒性凋亡病癥、自身免疫性病癥、血液學(xué)病癥、神經(jīng)學(xué)病癥、和以凋亡速率不當(dāng)?shù)母呋騘[氐為特征的其它病癥。術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞增殖性病癥"和"增殖性病癥"指與一定程度的異常細(xì)胞增殖有關(guān)的病癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞增殖性病癥指癌癥。異常凋亡是異常細(xì)胞增殖的一個(gè)原因。已經(jīng)將許多癌癥與一種或多種促凋亡蛋白(例如p53和fas)的失活或促存活蛋白(例如Bcl-2)的過(guò)度生成或失調(diào)聯(lián)系起來(lái)。術(shù)語(yǔ)"癌癥，，和"癌性"指向或描述特征通常為細(xì)胞生長(zhǎng)不受調(diào)控的生理疾患。癌癥的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤、和白血病或淋巴樣惡性肺瘤。此類(lèi)癌癥的更具體例子包括鱗狀細(xì)胞癌(例如上皮鱗狀細(xì)胞癌)、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺的&，癌、和肺的鱗癌)、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃癌(包括胃腸癌)、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、曱狀腺癌、肝癌、肛門(mén)癌、陰莖癌、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤和B細(xì)胞淋巴瘤、腦瘤和腦癌、以及頭頸癌、及相關(guān)轉(zhuǎn)移。"月中瘤"在用于本文時(shí)指所有贅生性細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，無(wú)論是惡性的或者是良性的，及所有癌前的和癌性的細(xì)胞和組織。術(shù)語(yǔ)"病毒性凋亡病癥，，指向或描述患者中由病毒感染引起的或作為病毒感染結(jié)果的異常凋亡。該術(shù)語(yǔ)包括由感染性病毒直接引起的異常凋亡(例如降低的或阻斷的凋亡)，以及由應(yīng)答病毒感染而發(fā)生的或因病毒自身而發(fā)生的過(guò)度、不受控制或錯(cuò)誤靶向的免疫系統(tǒng)功能引起的異常凋亡(例如升高的細(xì)胞死亡)二者。由感染性病毒直接引起的異常(降低的)凋亡的例子包括但不限于埃巴二氏病毒所致Bc1-2樣蛋白(促存活B2R多肽)和Bcl-2生成刺激物的生成，使得受感染細(xì)胞不發(fā)生凋亡；乳頭瘤病毒所致p53(促凋亡多肽)的失活或降解，使得受感染細(xì)胞不發(fā)生凋亡；和牛痘病毒所致促凋亡ICE樣蛋白酶抑制物的生成，使得受感染細(xì)胞不發(fā)生凋亡。由病毒感染引起的異常(升高的)凋亡的例子有fas在受感染輔助T細(xì)胞表面的不當(dāng)表達(dá)，這引起那些細(xì)胞發(fā)生過(guò)早凋亡，由此消除免疫系統(tǒng)的重要成分。由應(yīng)答病毒感染而發(fā)生的過(guò)度、不受控制或錯(cuò)誤靶向的免疫系統(tǒng)功能引起的異常凋亡的例子包括無(wú)意地(inadvertent)殺死受感染細(xì)胞附近的未感染細(xì)胞，因?yàn)楦浇募?xì)胞可能也已被誘導(dǎo)而在細(xì)胞表面表達(dá)fas,如此成為循環(huán)中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞所致凋亡途徑活化的破壞作用的耙物。術(shù)語(yǔ)"自身免疫性病癥，，指源于且針對(duì)個(gè)體自身組織的非惡性疾病或病癥。自身免疫性病癥典型的是特征為自身反應(yīng)性免疫細(xì)胞不能被免疫系統(tǒng)破子的活性，或者降低促凋亡因子的表達(dá)或活性。自身免疫性疾病在本文中明確排除惡性或癌性疾病或疾患，尤其排除B細(xì)胞淋巴瘤、急性成淋巴細(xì)^^白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、毛細(xì)胞白血病和慢性成髓細(xì)胞白血包括銀屑病和皮炎(例如特應(yīng)性皮炎)；系統(tǒng)性硬皮病和硬化；與炎性腸病有關(guān)的應(yīng)答(諸如克羅恩氏(Crohn)病和潰瘍性結(jié)腸炎)；呼吸窘迫綜合征(包括成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS));皮炎；腦膜炎；腦炎；葡萄膜炎；結(jié)腸炎；腎小球腎炎；過(guò)敏狀況，諸如濕疹和哮喘及牽涉T細(xì)胞浸潤(rùn)和慢性炎性應(yīng)答的其它狀況；動(dòng)脈粥樣硬化；白細(xì)胞粘著缺陷；類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；系統(tǒng)性紅斑狼瘉(SLE)(包括但不限于狼瘡腎炎、皮膚狼瘡)；糖尿病(例如I型糖尿病或胰島素依賴(lài)性糖尿病)；多發(fā)性硬化；雷諾氏(Reynaud)綜合征；自身免疫性曱狀腺炎；橋本氏(Hashimoto)曱狀腺炎；變應(yīng)性腦脊髓炎；斯耶格倫氏(Sjogren)綜合征；幼發(fā)型糖尿病；通常在結(jié)核病、結(jié)節(jié)病、多肌炎、肉芽腫病和血管炎中發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞因子和T-淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)性超敏感性有關(guān)的免疫應(yīng)答；惡性貧血(阿狄森氏(Addison)病)；牽涉白細(xì)胞滲出的疾??；中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎性病癥；多器官損傷綜合征；溶血性貧血(包括但不限于冷球蛋白血癥或庫(kù)姆斯氏(Coombs)陽(yáng)性貧血)；重癥肌無(wú)力；抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病；抗腎小球基膜病；抗磷脂綜合癥；過(guò)敏性神經(jīng)炎；格雷夫斯氏(Graves)病；朗-伊二氏(Lambert-Eaton)肌無(wú)力綜合癥；大皰性類(lèi)天皰瘡；天皰瘡；自身免疫性多種內(nèi)分泌腺??；萊特氏(Reiter)病；僵人綜合癥；貝切特氏(Behcet)?。痪藜?xì)胞動(dòng)脈炎；免疫復(fù)合物腎炎；IgA腎?。籌gM多神經(jīng)??；免疫性血小板減少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板減少癥等。術(shù)語(yǔ)"血液學(xué)病癥，，指向或描述特征為血細(xì)胞異常生成或不當(dāng)血流的疾病或病癥。血液學(xué)病癥包括但不限于與慢性疾病有關(guān)的貧血、再生障礙性貧血、慢性嗜中性細(xì)胞減少、和骨髓增生異常綜合征、心肌梗死等等。術(shù)語(yǔ)"神經(jīng)學(xué)病癥"或"神經(jīng)學(xué)疾病"指向或描述典型特征為神經(jīng)組織衰退或神經(jīng)組織的細(xì)胞間通訊衰退的中樞和/或周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)和/或特定神經(jīng)元疾病或病癥。神經(jīng)學(xué)病癥的例子包括但不限于神經(jīng)變性疾病(包括但不限于Lewy體疾病、脊髓灰質(zhì)炎后綜合征、Shy-Draeger綜合征、色素性視網(wǎng)膜炎(retinitispigmentosum)、梯:欖體腦橋小腦萎縮、帕金森氏病、脊髓性月幾萎縮、多系統(tǒng)萎縮、肌萎縮側(cè)索硬化、紋狀體黑質(zhì)變性、t病(包括但不限于阿耳茨海默病和核上性麻痹)、朊病毒病(包括，但不限于，牛海綿樣腦病、綿羊瘙癢病、克-雅二氏(Creutzfeldt-Jakob)綜合征、庫(kù)魯病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、慢性消耗性疾病、和致命性家族性失眠癥)、延髓性麻痹、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病、和神經(jīng)系統(tǒng)異型變性疾病(包括但不限于卡納萬(wàn)(Canavan)病、亨庭頓氏(Huntington)病、神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥、亞歷山大氏(Alexander)病、圖雷特氏(Tourette)綜合征、Menkes巻發(fā)綜合征、科凱恩(Cockayne)綜合征、Halervorden-Spatz綜合征、拉福拉(Lafom)病、Rett綜合征、肝豆?fàn)詈俗冃?、Lesch-Nyhan綜合征、和Unverricht-Lundborg綜合征)、癡呆(包括但不限于皮克氏(Pick)病)、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、缺血性和缺氧性腦損傷、及外傷性和興奮性中毒性腦損傷。"誘導(dǎo)細(xì)胞死亡"或"誘導(dǎo)凋亡"的本發(fā)明多肽、抗體、拮抗劑或組合物指引起可存活細(xì)胞變得不能存活的多肽、抗體、拮抗劑或組合物。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是癌細(xì)胞，例如乳房/乳腺、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、結(jié)腸、曱狀腺、胰或膀胱細(xì)胞。體外細(xì)胞死亡可在不存在補(bǔ)體和免疫效應(yīng)細(xì)胞時(shí)測(cè)定，以區(qū)分由抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)或補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。如此，用于細(xì)胞死亡的測(cè)定法可使用熱滅活血清(即不含補(bǔ)體)在不存在免疫效應(yīng)細(xì)胞時(shí)進(jìn)行。為了確定本發(fā)明的多肽、抗體、拮抗劑或組合物是否能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，可相對(duì)于未處理細(xì)胞評(píng)估膜完整性的喪失，它是通過(guò)碘化丙啶(propidiumiodide)(PI)、錐蟲(chóng)藍(lán)(參見(jiàn)Moore等，Cytotechnology17:1-11(1995))或7AAD的攝取來(lái)評(píng)估的。"表達(dá)ZPA的細(xì)胞"指表達(dá)內(nèi)源的或轉(zhuǎn)染的ZPA多肽的細(xì)胞。"表達(dá)ZPA的癌"指包含生成ZPA多肽的細(xì)胞的癌。"過(guò)表達(dá)"ZPA多肽或其同系物的癌指與同一組織類(lèi)型的非癌性細(xì)胞相比，具有顯著更高水平的ZPA多肽或其同系物的癌。此類(lèi)過(guò)表達(dá)可以是由基因擴(kuò)增或者是由轉(zhuǎn)錄或翻譯升高引起的?？稍谠\斷或預(yù)后測(cè)定法中通過(guò)評(píng)估細(xì)胞中的ZPA蛋白質(zhì)或ZPA蛋白質(zhì)同系物水平的升高(例如通過(guò)免疫組織化學(xué)測(cè)定法等)來(lái)確定ZPA多肽或ZPA多肽同系物過(guò)表達(dá)。或者/另外，可測(cè)量細(xì)胞中編碼ZPA多肽或ZPA多肽同系物的核酸或mRNA水平，例如通過(guò)焚光原位雜交，使用對(duì)應(yīng)于編碼ZPA的核酸或其互補(bǔ)鏈的基于核酸的探針(FISH;參見(jiàn)WO98/45479,1998年10月公布)；Southem印跡；Northem印跡；或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，諸如實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)。在上述測(cè)定法之外，熟練從業(yè)人員可利用多種體內(nèi)測(cè)定法。例如，可以將哺乳動(dòng)物身體內(nèi)的細(xì)胞暴露于內(nèi)在化抗體，該抗體任選用可檢測(cè)標(biāo)記物(例如》欠射性同位素)標(biāo)記，并評(píng)估該抗體對(duì)哺乳動(dòng)物中ZPA多肽或ZPA多肽同系物的結(jié)合，例如通過(guò)對(duì)放射性的外部掃描或分析取自先前暴露于抗體的哺乳動(dòng)物的活檢。術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記物"在用于本文時(shí)指與多肽、抗體、拮抗劑或組合物直接或間接偶聯(lián)，以生成"帶標(biāo)記物的，，或"經(jīng)標(biāo)記的，，多肽、抗體、拮抗劑或組合物的可檢測(cè)化合物或組合物。標(biāo)記物可以是自身可檢測(cè)的(例如放射性同位素標(biāo)記物或焚光標(biāo)記物)，或者在酶標(biāo)記物的情況中，可催化可檢測(cè)的底物化合物或組合物的化學(xué)改變。術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞毒劑，，在用于本文時(shí)指抑制或防止細(xì)胞的功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)意圖包括放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P"和Lu的放射性同位素；化療劑，例如曱氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、長(zhǎng)春花生物堿類(lèi)(vincaalkaloids)(長(zhǎng)春新石威(vincristine)、長(zhǎng)春石威(vinblastine)、依4乇泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin),美法侖(melphalan)、絲裂霉素(mitomycin)C、笨丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅霉素(daunorubicin)或其它嵌入劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；和毒素，諸如小分子毒素或者細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體；及下文披露的各種抗腫瘤藥或抗癌藥。下文記載了其它細(xì)胞毒劑。殺腫瘤藥引起腫瘤細(xì)胞的破壞。"化療劑"指可用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎╊?lèi)(alkylatingagents),諸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide);石黃酉臾力克基西旨類(lèi)(alkylsulfonates),i者長(zhǎng)口白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan),口口底泊舒凡(piposulfan);氮丙"定類(lèi)(aziridines)，i者^(guò)口苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和烏瑞替派(uredepa);乙撐亞胺類(lèi)(ethylenimines)和曱基蜜胺類(lèi)(methylamelamines)，包括六曱蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撐石危代石粦酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三輕曱蜜胺(trimethylolomelamine);番篇枝內(nèi)酯類(lèi)(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));喜樹(shù)堿(camptothecin)(包括合成類(lèi)似物托泊替康(topotecan));莒蘚抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多來(lái)新(adozelesin)、卡折來(lái)新(carzelesin)和比折來(lái)新(bizelesin)合成類(lèi)似物)；隱藻素類(lèi)(cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成類(lèi)似物，KW-2189和CB1-TM1);艾才留塞〉各素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;》每綿4中素(spongistatin);氮芥類(lèi)(nitrogenmustards)，i者如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(c.hlornaphazine)、月旦石粦酰胺(cholophosphamide)、對(duì)偉莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基曱胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮齊(novembichin)、苯芥月旦甾酉孚(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲石粦胺(trofosfamide)、尿嘧咬氮芥(uracilmustard);亞硝脲類(lèi)(nitrosoureas)，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司、汀(fotemustine)、〉各莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素類(lèi)，諸如烯二炔類(lèi)抗生素(enediyne)(例如加利車(chē)霉素(calicheamicin),尤其是加利車(chē)霉素YlI和加利車(chē)霉素coIl(參見(jiàn)例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994));蒽環(huán)類(lèi)抗生素(dynemicin)，包括dynemicinA;二碳膦酸鹽化合物(bisphosphonate),諸如氯膦酸鹽；埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團(tuán)和相關(guān)色蛋白烯二炔類(lèi)抗生素發(fā)色團(tuán))、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線(xiàn)菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來(lái)霉素(bleomycin)、放線(xiàn)菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線(xiàn)菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達(dá)比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(lèi)(mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、口票呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代i射物類(lèi)，諸如曱氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類(lèi)似物,諸如二甲葉酸(denopterin)、曱氨喋呤(methotrexate)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三曱曲沙(trimetrexate);。票呤類(lèi)似物，諸如氟達(dá)拉濱(fludarabine)、6-巰基噤呤(mercaptopurine)、硫咪噪呤(thiamiprine)、石克鳥(niǎo)噤呤(thioguanine);嘧口定類(lèi)似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofbr)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苦(dideoxyuridine)、去氧氟尿苦(doxifluridine)、依i若他濱(enocitabine)、氟尿苦(floxuridine);雄激素類(lèi)，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酉臾屈4也力,酉同(dromostanolonepropionate)、表石克名,酉孚(epitiostano1)、美力,火克(mepitiostane)、睪內(nèi)酉旨(testolactone);抗腎上腺類(lèi)，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米4乇坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);葉酸補(bǔ)充齊寸，諸如亞葉酸(folinicacid);醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid);恩尿嘧咬(eniluracil);安吖口定(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依達(dá)曲沙(edatraxate);地磷酰胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地吖醌(diaziquone);elfornithine;依利醋銨(elliptiniumacetate);埃坡霉素(epothilone);依托格魯(etoglucid);硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼達(dá)明(lonidamine);美登木素生物石威類(lèi)(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocin);米4乇脈月宗(mitoguazone);米4乇蒽醌(mitoxantrone);莫哌達(dá)醇(m叩idamol);二胺硝吖啶(nitracrine);噴司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);p比柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);鬼臼酸(podophyllinicacid);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);PSK⑧多糖復(fù)合物(JHSNaturalProducts,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);才艮零素(rhizoxin);西佐口南(sizofiran);蟲(chóng)累^走錯(cuò)(spirogermanium);纟田交《連孑包菌酉同酸(tenuazonicacid);三亞胺醌(triaziquone);2,2'，2"-三氯三乙胺；單端孢菌素類(lèi)(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疾孑包菌素(verrucarin)A、牙干孑包菌素(roridin)A和蟲(chóng)它行菌素(anguidin));烏拉坦(urethan);長(zhǎng)春地辛(vindesine);達(dá)卡巴漆(dacarbazine);甘露莫司、汀(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol);咪泊溴步克(pipobroman);gacytosine;阿4t月包香(arabinoside)("Ara-C");環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide);塞替派(thiotepa);類(lèi)紫杉醇類(lèi)(taxoids),例如TAXOL⑧帕利^f也塞(paclitaxel)(Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N丄)、ABRAXANETM帕利他塞的無(wú)克列莫佛、清蛋白改造的納米茅貞斗立齊'j型(AmericanPharmaceuticalPartners,Schaumberg，Illinois)禾口TAXOTERE⑧多西他塞(doxetaxel)(Rh6ne-PoulencRorer，Antony,France));苯丁酸氮芥(chlorambucil);GEMZAR吉西他濱(gemcitabine);6-石克鳥(niǎo)嘌呤(thioguanine);巰基。票p令(mercaptopurine);曱氨p萊p令(methotrexate);4白類(lèi)似、物，i者^(guò)p")頁(yè)4白(cisplatin)禾口卡4白(carboplatin);長(zhǎng)春石威(vinblastine);4白(platinum);依托泊苷(etoposide)(VP-16);異環(huán)磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);長(zhǎng)春新石成(vincristine);NAVELBINE⑧長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine);能滅瘤(novantrone);替尼泊芬(teniposide);依達(dá)曲沙(edatrexate);道i若霉素(daunomycin);氨基蟲(chóng)萊卩令(aminopterin);希羅達(dá)(xeloda);〈尹本膦商臾鹽(ibandronate);CPT-11;拓樸異構(gòu)酶抑制劑RFS2000;二氟曱基鳥(niǎo)氨酸(DMFO);類(lèi)視黃酸類(lèi)(retinoids),諸如視黃酸(retinoicacid);卡培他濱(capecitabine);及任何上述物質(zhì)的藥學(xué)可接受鹽、酸或衍生物。該定義還包括作用于調(diào)控或抑制激素對(duì)腫瘤作用的抗激素劑諸如抗雌激素類(lèi)和選擇性雌激素受體調(diào)控物類(lèi)(SERM),包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和FARESTON⑧托瑞米芬(toremifene);抑制在腎上腺中調(diào)控雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、AROMASIN⑧依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔峻(fadrozole)、RIVISOR伏羅唑(vorozole)、FEMARA來(lái)曲唑(letrozole)和ARIMIDEX阿那曲唑(anastrozole);抗雄激素類(lèi)，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊環(huán)核香胞嘧啶類(lèi)似物)；反義寡核普酸，特別是抑制牽涉異常(aberrant)細(xì)胞增殖的信號(hào)途經(jīng)中的基因表達(dá)的反義寡核苷酸，諸如例如PKC-a、Ralf和H-Ras;核酶，諸如VEGF表達(dá)抑制劑(例如ANGIOZYME⑧核酶)和HER2表達(dá)抑制劑；疫苗，諸如基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID⑧疫苗；PROLEUKINrIL-2;LURTOTECAN⑧拓樸異構(gòu)酶l抑制劑；ABARELIX⑧rmRH;及任何上述物質(zhì)的藥學(xué)可接受鹽、酸或衍生物。"生長(zhǎng)抑制劑，，在用于本文時(shí)指在體外或在體內(nèi)抑制細(xì)胞，尤其是癌細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物或組合物。因此，生長(zhǎng)抑制劑可以是顯著降低處于S期的細(xì)胞百分比的藥劑。生長(zhǎng)抑制劑的例子包括阻斷細(xì)胞周期行進(jìn)(處于S期以外的位置)的藥劑，諸如誘導(dǎo)G1停滯和M期停滯的藥劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長(zhǎng)春藥類(lèi)(vincas)(長(zhǎng)春新堿(vincristine)和長(zhǎng)春石成(vinblastine))、紫杉烷類(lèi)(taxanes)、和拓樸異構(gòu)酶II抑制劑諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epimbicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博來(lái)霉素(bleomycin)。那些阻滯G1的藥劑也溢出進(jìn)入S期停滯，例如DNA烷化劑類(lèi)諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼+》(prednisone)、達(dá)卡巴口秦(dacarbazine)、雙氯乙基曱胺(mechlorethamine)、順鉑(cisplatin)、曱氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧咬(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可參見(jiàn)TheMolecularBasisofCancer,Mendelsohn和Israel編，第1章，題為"Cellcycleregulation,oncogenes,andantieioplasticdrugs",Murakaini等，WBSaunders,Philadelphia,1995,尤其是第13頁(yè)。紫杉烷類(lèi)(帕利他塞(paclitaxd)和多西他賽(docetaxel))是衍生自紫杉樹(shù)的抗癌藥。衍生自歐洲紫杉的多西他賽(TAXOTERE,Rhone-PoulencRorer)是帕利他塞(TAXOL⑧，Bristol-MyersSquibb)的半合成類(lèi)似物。帕利他塞和多西他賽促進(jìn)由微管蛋白二聚體裝配成微管并通過(guò)防止解聚使微管穩(wěn)定，導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞中有絲分裂的抑制。"多柔比星(Doxorubicin)"是一種蒽環(huán)類(lèi)抗生素。多柔比星的完整化學(xué)名是(8S-順式)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脫氧-a-L-來(lái)蘇-吡喃己糖基)氧基]-7,8，9,10-四氫-6,8，11-三羥基-8-(羥基乙?；?-1-曱氧基-5,12_萘二酮。(8S-cis)-10-[(3-amino-2,3，6-trideoxy-a-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7，8,9，10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5，12-naphthacenedione術(shù)語(yǔ)"包裝插頁(yè)，，用于指通常包括在治療用產(chǎn)品的商業(yè)包裝中的說(shuō)明書(shū)，它們包含有關(guān)涉及此類(lèi)治療用產(chǎn)品應(yīng)用的適應(yīng)征、用法、劑量、施用、禁忌癥和/或警告的信息。本發(fā)明的組合物和方法ZPA多肽變體在本文所述全長(zhǎng)天然序列ZPA多肽之外，涵蓋可制備ZPA多肽變體。ZPA多肽變體可通過(guò)將適宜的核苦酸改變引入ZPA核酸和/或通過(guò)合成期望ZPA多肽來(lái)制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)，氨基酸改變可改變ZPA多肽的翻譯后加工，諸如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置或者改變膜錨定特征?？稍诒疚乃鎏烊蝗L(zhǎng)序列ZPA多肽中或在ZPA多肽的各個(gè)結(jié)構(gòu)域中進(jìn)行變異，例如使用例如美國(guó)專(zhuān)利No.5,364,934所述的保守和非保守突變的任何技術(shù)和指導(dǎo)方針。變異可以是編碼ZPA多肽的一個(gè)或多個(gè)密碼子的替代、刪除或插入，其導(dǎo)致ZPA多肽的氨基酸序列與天然序列ZPA多肽相比的改變。任選的是，變異是通過(guò)ZPA多肽的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域中至少一個(gè)氨基酸為任何其它氨基酸所替代。通過(guò)比較ZPA多肽的序列與同源已知蛋白質(zhì)分子的序列，并將高同源區(qū)中進(jìn)行的氨基S臾序列改變的數(shù)目最小化，可發(fā)現(xiàn)確定哪些氨基酸殘基可插入、替代或刪除而不會(huì)對(duì)期望活性有不利影響的方針。氨基酸替代可以是將一種氨基酸用具有相似結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)特性的另一種氨基酸替代的結(jié)果，諸如用絲氨酸替代亮氨酸，即保守氨基酸替代。插入或刪除可任選在約1個(gè)至5個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)。可通過(guò)在序列中系統(tǒng)進(jìn)行氨基酸插入、刪除或替代，并對(duì)所得變體測(cè)試由全長(zhǎng)或成熟天然序列展示的活性來(lái)確定可容許的變異。在具體的實(shí)施方案中，感興趣的保守替代見(jiàn)表l標(biāo)題"優(yōu)選替代"下所示。如果此類(lèi)替代導(dǎo)致生物學(xué)活性的改變，那么可引入表l中稱(chēng)為"例示替代"的更實(shí)質(zhì)性改變，或者如下文關(guān)于氨基酸類(lèi)別進(jìn)一步所述的，并篩選產(chǎn)物。表l原始?xì)埢咎娲鷥?yōu)選替代Ala(A)val;leu;ilevalArg(R)lys;gln;asnlysAsn(N)gin;his;lys;argginAsp(D)glugluCys(C)ssrssrGln(Q)3sn3snGlu(E)aspaspGly(G)pro;alaalaHis(H)asn;gin;lys;argargIle(I)leu;val;met;ala;phe;正亮氛酸leuLeu(L)正亮氨酸；ile;val;met;ala;pheileLys(K)arg;gin;asnargMet(M)leu;phe;ileleuPhe(F)leu;val;ile;ala;tyrleuPro(P)alaalaSer(S)thrthrThr(T)ssrssrTrp(W)tyr;phetyrTyr(Y)trp(phe^thr^serpheVal(V)ile;leu;met;phe;ala;正亮氛酸leu的效果上顯著不同的替代來(lái)實(shí)現(xiàn)(a)替代區(qū)域的多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如作為折疊片或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)處分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積。根據(jù)共同的側(cè)鏈特性，天然存在殘基可如下分組(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile;(2)中性、親水性的Cys、Ser、Thr;(3)酸性的:Asp、Glu;(4)石成性的Asn、Gln、His、Lys、Arg;(5)影響鏈取向的殘基Gly、Pro;和(6)芳香力矣的Trp、Tyr、Phe。非保守替代將需要用這些類(lèi)別之一中的一個(gè)成員替換另一個(gè)類(lèi)別的。還可以將此類(lèi)替代殘基引入保守替代位點(diǎn)，或者引入剩余(非保守)位點(diǎn)。變異可使用本領(lǐng)域知道的方法來(lái)進(jìn)行，諸如寡核苷酸介導(dǎo)的(定點(diǎn))誘變、丙氨酸掃描、及PCR誘變。可對(duì)所克隆的DNA進(jìn)行定點(diǎn)誘變(Carter等,Nucl.AcidsRes.13:4331(1986);Zoller等，Nucl.AcidsRes.10:6487(1987))、盒式誘變(Wells等，Gene34:315(1985))、限制性選擇誘變(restrictionselectionmutagenesis)(Wells等，Philos.Trans.R.Soc.LondonSerA317:415(1986))或其它已知技術(shù)以產(chǎn)生ZPA變體DNA。還可采用掃描氨基酸分析來(lái)鑒定沿著鄰近序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，掃描用氨基酸中有相對(duì)較小的中性氨基酸。此類(lèi)氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通常是這組中的優(yōu)選掃描用氨基酸，因?yàn)樗?3-碳上的側(cè)鏈，而且不大可能改變變體的主鏈構(gòu)象(Cunningham和Wells,Science244:1081-1085(1989))。丙氨酸通常也是優(yōu)選的，因?yàn)樗亲畛Ｒ?jiàn)的氨基酸。另外，常常在隱蔽位置和暴露位置都能發(fā)現(xiàn)它(Creighton，TheProteins,W.H.Freeman&Co.,N.Y.;Chothia，J.Mol.Biol.150:1(1976))。如果丙氨酸替代不產(chǎn)生足夠量的變體，那么可使用等排(isoteric)氨基酸。ZPA多肽的修飾對(duì)ZPA多肽的共價(jià)修飾包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。一種類(lèi)型的共價(jià)修飾包括使ZPA多肽的靶氨基酸殘基與有機(jī)衍生化試劑反應(yīng)，該有機(jī)衍生化試劑能夠與ZPA多肽的選定側(cè)鏈或者N-或C-末端殘基起反應(yīng)。用雙功能試劑進(jìn)行的衍生化可用于例如使ZPA多肽與不溶于水的支持基質(zhì)或表面交聯(lián)，以用于抗ZPA抗體的純化方法，反之亦然。常用的交聯(lián)劑包括例如l，l-雙(重氮-乙?；?-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯例如與4-疊氮水楊酸形成的酉旨、同雙功能亞氨酸酯包括二琥珀酰亞氨基酯諸如3,3'-二石克代雙(琥珀酰亞氨基丙酸酯)、雙功能馬來(lái)酰亞胺諸如雙-忖-馬來(lái)酰亞氨基-1，8-辛烷和諸如3-[(對(duì)-疊氮笨基)二^5克代]丙酰亞氨酸曱酯等試劑。其它修飾包括谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰殘基分別脫酰胺為相應(yīng)的谷氨酰和天冬氨酰殘基，脯氨酸和賴(lài)氨酸的羥基化，絲氨?；蛱K氨酰殘基的羥基的磷酸化，賴(lài)氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的a-氨基的曱基化(T.E.Creighton,Proteins:StructureandMolecularProperties,W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco,pp.79-86(1983)),N-末端胺的乙?；?，及任何C-末端羧基的酰胺化。本發(fā)明范圍內(nèi)所包括的對(duì)ZPA多肽的另一類(lèi)共價(jià)修飾包括改變多肽的天然糖基化樣式。"改變天然糖基化樣式"在本文中意圖指刪除一個(gè)或多個(gè)在天然序列ZPA多肽中發(fā)現(xiàn)的碳水化合物模塊(moiety)(或是通過(guò)消除潛在糖基化位點(diǎn)，或是通過(guò)以化學(xué)和/或酶促手段刪除糖基化)，和/或添加一個(gè)或多個(gè)在天然序列ZPA多肽中不存在的糖基化位點(diǎn)。另外，此短語(yǔ)包括天然蛋白質(zhì)糖基化中的定性改變，牽涉所存在的各種碳水化合物模塊的本質(zhì)和比例的改變。向ZPA多肽中添加糖基化位點(diǎn)可通過(guò)改變氨基酸序列而實(shí)現(xiàn)。改變可通過(guò)例如向天然序列ZPA中添加或替代一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基來(lái)進(jìn)行(用于O-連接的糖基化位點(diǎn))。可任選通過(guò)DNA水平的變化來(lái)改變ZPA氨基酸序列，特別是通過(guò)在預(yù)先選擇的堿基處突變編碼ZPA多肽的DNA，從而產(chǎn)生將翻譯成期望氨基酸的密碼子。增加ZPA多肽上碳水化合物模塊數(shù)的另一種方法是通過(guò)使糖苷與多肽化學(xué)或酶促偶聯(lián)。本領(lǐng)域?qū)Υ祟?lèi)方法有描述，例如1987年9月11日公布的WO87/05330及Aplin和Wriston，CRCCritRev.Biochem.,pp.259-306(1981)。消除ZPA多肽上存在的碳水化合物模塊可通過(guò)化學(xué)或酶促方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，或者通過(guò)編碼充當(dāng)糖基化靶物的氨基酸殘基的密碼子的突變替代來(lái)實(shí)現(xiàn)。化學(xué)脫糖基化技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，而且記載于例如Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys.259:52(1987)及Edge等，Anal,Biochem.118:131(1981)。酶促切割多肽上的碳水化合物模塊可通過(guò)使用多種內(nèi)切和外切糖苷酶來(lái)實(shí)現(xiàn)，記載于Thotakura等，Meth.Enzymol.138:350(1987)。對(duì)ZPA多肽的另一類(lèi)共價(jià)修飾包括，以美國(guó)專(zhuān)利No.4,640,835;4,496,689;4,30U44;4,670,417;4,791，192或4,179,337所列方式,將ZPA多肽與多種非蛋白質(zhì)性質(zhì)的聚合物之一連接，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化亞烷基(polyoxyalkylene)。還可以形成嵌合分子的方式修飾本發(fā)明的ZPA多肽，所述嵌合分子包含與另一種異源多肽或氨基酸序列融合的ZPA多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，此類(lèi)嵌合分子包括ZPA多肽與將該ZPA多肽靶向投遞至各種組織的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的融合物。一方面，將ZPA多肽靶向腦，穿越血腦屏障，使用例如人免疫缺陷病毒TAT蛋白的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Schwarze等，1999，Science285:1569-72)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，此類(lèi)嵌合分子包括ZPA多肽與標(biāo)簽多肽的融合物，所述標(biāo)簽多肽提供了抗標(biāo)簽抗體可選擇性結(jié)合的表位。表位標(biāo)簽通常位于ZPA多肽的氨基或羧基末端。此類(lèi)帶表位標(biāo)簽形式的ZPA多肽的存在可使用針對(duì)所述標(biāo)簽多肽的抗體來(lái)檢測(cè)。而且，表位標(biāo)簽的提供使ZPA多肽易于使用抗標(biāo)簽抗體或另一類(lèi)結(jié)合所述表位標(biāo)簽的親和基質(zhì)通過(guò)親和純化來(lái)純化。多種標(biāo)簽多肽及其各自抗體是本領(lǐng)域已知的。例子包括多組氨酸(poly-his)或多-組氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)標(biāo)簽；流感HA標(biāo)簽多肽及其抗體12CA5(Field等，Mol.Cell,Biol.8:2159-2165(1988));c-myc標(biāo)簽及其抗體8F9，3C7，6E10,G4,B7和9E10(Evan等，MolecularandCellularBiology5:3610-3616(1985));及單純皰滲病毒糖蛋白D(gD)標(biāo)簽及其抗體(Paborsky等，ProteinEngineering3(6):547-553(1990))。其它標(biāo)簽多肽包括Flag肽(Hopp等，BioTechnology6:1204-1210(1988));KT3表位肽(Martin等，Science255:192-194(1992));a-微管蛋白表位肽(Skinner等，J.Biol.Chem.266:15163-15166(1991));及T7基因10蛋白肽標(biāo)簽(Lutz-Freyermuth等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA87:6393-6397(1990》。在一個(gè)備選實(shí)施方案中，嵌合分子可包括ZPA多肽與免疫球蛋白或免疫球蛋白特定區(qū)域的融合物。對(duì)于二價(jià)形式的嵌合分子(也稱(chēng)為"免疫粘附素")，此類(lèi)融合物可以是與IgG分子Fc區(qū)的融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白融合物包含IgGl分子的鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)，或者包含IgGl分子的鉸鏈區(qū)、CH1區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)。關(guān)于免疫球蛋白融合物的制備還可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5,428,130。ZPA多肽的制備下面的描述主要涉及通過(guò)培養(yǎng)用包含編碼ZPA多肽的核酸的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞來(lái)生成ZPA多肽。當(dāng)然涵蓋可采用本領(lǐng)域已知的備選方法來(lái)制備部分(參見(jiàn)例如Stewart等，Solid-PhasePeptideSynthesis,W.H.FreemanCo"SanFrancisco,CA,1969;Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963》。體外蛋白質(zhì)合成可使用手工技術(shù)或通過(guò)自動(dòng)化來(lái)進(jìn)行。自動(dòng)化合成可例如使用AppliedBiosystems肽合成儀(FosterCity,CA)依照制造商的說(shuō)明書(shū)來(lái)完成。ZPA多肽的各個(gè)部分可分開(kāi)化學(xué)合成，并使用化學(xué)或酶促方法組合以生成全52長(zhǎng)ZPA多肽。宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化將宿主細(xì)胞用本文所述用于ZPA多肽生成的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化，并在為了誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化子、或擴(kuò)增編碼期望序列的基因而恰當(dāng)調(diào)整的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件，諸如培養(yǎng)基、溫度、pH等等，可以由熟練技術(shù)人員無(wú)需過(guò)多實(shí)驗(yàn)就選擇。通常，用于使細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)力最大化的原理、方案和實(shí)用j支術(shù)可參見(jiàn)MammalianCellBiotechnology:APracticalApproach,M.Butler編，IRLPress,1991和Sambrook等，見(jiàn)上文。轉(zhuǎn)乘方法是普通技術(shù)人員所知道的，例如CaP04處理和電穿孔。根據(jù)所用宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化使用對(duì)此類(lèi)細(xì)胞適宜的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行。采用氯化鈣的鈣處理，如Sambrook等，見(jiàn)上文所述，或電穿孔通常用于原核生物或具有堅(jiān)固細(xì)胞壁屏障的其它細(xì)胞。4吏用根瘤土壤桿菌(jgra&cfen^m^me/a"era)進(jìn)行的感染用于某些植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，如Shaw等，Gene23:315(1983)和1989年6月29曰公布的WO89/05859所述。對(duì)于沒(méi)有此類(lèi)細(xì)胞壁的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可采用Graham和vanderEb,Virology52:456-457(1978)的磷酸鈣沉淀法。哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的一般情況參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.4,399,216。進(jìn)入酵母的轉(zhuǎn)化通常依照VanSolingen等，J.Bact.130:946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)76:3829(1979)的方法來(lái)進(jìn)行。然而，也可使用用于將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的其它方法，諸如核顯微注射、電穿孔、細(xì)菌原生質(zhì)體與完整細(xì)胞的融合、或聚陽(yáng)離子例如polybrene或聚鳥(niǎo)氨酸。關(guān)于用于轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的多種技術(shù)見(jiàn)Keown等，MethodsinEnzymology185:527-537(1990)和Mansour等，Nature336:348-352(1988)。適于克隆或表達(dá)本文載體中的DNA的宿主細(xì)胞包括原核生物、酵母或高等真核細(xì)胞。合適的原核生物包括但不限于真細(xì)菌，諸如革蘭氏陰性或陽(yáng)性生物體，例如腸桿菌科，諸如大腸桿菌。多種大腸桿菌菌株是公眾可獲得的，諸如大腸桿菌K12菌抹MM294(ATCC31,446);大腸桿菌X1776(ATCC31,537);大腸桿菌菌林W3110(ATCC27,325);和K5772(ATCC53,635)。其它合適的原核生物宿主細(xì)胞包括腸桿菌科(Enterobacteriaceae),諸如埃希氏菌屬(^&c/zen'cWa)例如大腸桿菌或大腸埃希氏菌(Eco//)、腸桿菌屬(^>2fero6a"er)、歐文氏菌屬(五nv/m^)、克雷伯氏菌屬(《/e&/e〃<3)、變形菌屬(7Vo&z^)、沙、門(mén)氏菌屬(ASW/wowe〃a)"f列i口鼠4另寒沙、門(mén)氏菌(Sa/wo"e〃az^p/n'mwn'ww)、沙雷氏菌屬(5"e/T(3/7'of)例3口津占質(zhì)沙雷氏菌(5"era/7'am<arcaycflra)、和志賀氏菌屬(6Tz/ge〃a)，以及芽孑包斥干菌屬(5ac/〃/)諸如枯草芽孢桿菌(5.和地衣芽孢桿菌(5.//c/zem/o腦;s)(例如1989年4月12日公布的DD266,710中公開(kāi)的地衣芽孢桿菌41P)、假單胞菌屬(尸^wfifomo"w)諸如銅綠*1單月包菌(aerag/"osa)、和鏈霉菌屬(5^eptom;/cw)。這些例子是例示性的而非限制性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，菌株W3110是宿主或親本宿主，因?yàn)樗怯糜谥亟MDNA產(chǎn)物發(fā)酵的常用宿主菌林。在某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞分泌最小量的蛋白水解酶。例如，可以修飾菌抹W3U0，在編碼對(duì)宿主而言?xún)?nèi)源的蛋白質(zhì)的基因中產(chǎn)生遺傳突變，此類(lèi)宿主的例子包括大腸桿菌W3110菌抹1A2，其具有完整基因型to^4;大腸桿菌W3110菌林9E4，其具有完整基因型to"^p&3;大腸桿菌W3110菌株27C7(ATCC55,244)，其具有完整基因型to"」p&3p/20J(^^F-tocVMow;r^W;大腸桿菌W3110菌抹37D6，其具有完整基因型to"^j9&3p/zoJ五"fb^F-/ac」/6PompTV&7//vGA;a"。大腸桿菌W3110菌林40B4，它是具有非卡那霉素抗性&g尸刪除突變的菌抹37D6;及具有1990年8月7日公告的美國(guó)專(zhuān)利No.4，946,783中公開(kāi)的突變型周質(zhì)蛋白酶的大腸桿菌菌抹?；蛘?，體外克隆方法，例如PCR或其它核酸聚合酶反應(yīng)也是合適的。在原核生物以外，真核微生物，諸如絲狀真菌或酵母也是ZPA多肽編碼載體的合適克隆或表達(dá)宿主。酉良酒#唐酵母(iSacc/zaramyc&scerev/s/fle)是常用的低等真核宿主微生物。其它的包括粟酒裂殖糖酵母(Sc;^asacc/wram7c";om^)(Beach和Nurse，Nature290:140(1981);EP139,383,1985年5月2日公布)；克魯維酵母屬(K/w;/veram_ycas)宿主(美國(guó)專(zhuān)利No.4,943,529;Fleer等，Bio/Technology9:968-975(1991))諸如例如乳酸克魯維酵母(K/acfe)(MW98-8C,CBS683,CBS4574;Louvencourt等，J.Bacteriol.154(2):737-742(1983))、脆壁克魯維酵母(尺/ragz仏)(ATCC12，424)、保加利亞克魯維酵母(KW,'簡(jiǎn))(ATCC16,045)、威克克魯維酵母(尺.w/cfe畫(huà)")(ATCC24,178)、K.wato'(ATCC56,500)、果蠅克魯維酵母(K^wo//n7wwm)(ATCC36,906;VandenBerg等，Bio/Technology8:135(1990》、耐熱克魯維酵母(尺Aermoto/erara)、和馬克思克魯維酵母(Kmarx/a"w);亞羅酵母屬(ferraw/a)(EP402,226);巴斯德畢赤酵母(尸/c/z/a)(EP183,070;Sreekrishna等，J.BasicMicrobiol.28:265-278(1988));假絲酵母屬(CW油);瑞氏木霉(Zh'c/zofiferwareew'a)(EP244,234);并且并造月永孑包菌(A/ewrospora;crawa)(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:5259-5263(1979));許旺酵母屬(/Sc/7而朋/ow;;cej1)諸如許旺酵母(5b/z麗朋/ow^yc&socc/dewtofc)(EP394,538，1990年10月31曰公布);和絲狀真菌諸如例如脈孢菌屬(A^wraypora)、青霉屬(尸e由'〃/w附)、彎頸霉屬(7b/，c歸膽)(WO91/00357，1991年1月10日公布)、和曲霉屬(Aper^〃w)宿主諸如構(gòu)巢曲霉(Am'血/ara)(Balance等,Biochem.Biophys.Res.Commun.112:284-289(1983);Tilburn等，Gene26:205-221(1983);Yelton等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470-1474(1984))和黑曲霉(A"/gw)(Kelly和Hynes,EMBOJ.4:475-479(1985))。曱基營(yíng)養(yǎng)型酵母(Methylotropicyeast)適于本發(fā)明，包括但不限于能夠在甲醇上生長(zhǎng)的、選自以下屬的酵母漢遜氏酵母屬(/7""化"w/a)、假絲酵母屬(Ow^c/a)、克勒克氏酵母屬(X/oecfera)、畢赤氏酵母屬CP/c/n'a)、糖酵母屬0Sacc/7aram;;c")、球擬酵母屬(7^w/o戸&)、和紅酵母屬(i/zodoton^0。作為這類(lèi)酵母的例子的具體物種列表可參見(jiàn)C.Anthony,TheBiochemistryofMethylotrophs,269(1982)。適用于表達(dá)ZPA多肽編碼核酸的宿主細(xì)胞衍生自多細(xì)胞生物體。無(wú)脊推動(dòng)物細(xì)胞的例子包括昆蟲(chóng)細(xì)胞諸如果蠅S2和夜蛾Sf9,以及植物細(xì)胞。有用哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的例子包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)和COS細(xì)胞。更具體的例子包括用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(COS-7,ATCCCRL1651);人胚腎系(293或?yàn)榱嗽趹腋∨囵B(yǎng)中生長(zhǎng)而亞克隆的293細(xì)胞，Graham等，J.GenVirol.36:59(1977));中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞ADHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980));小鼠塞托利(sertoli)細(xì)胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980));人肺細(xì)胞(W138,ATCCCCL75);人肝細(xì)胞(HepG2，HB8065);和小鼠乳腺腫瘤(MMT060562,ATCCCCL51)。認(rèn)為適宜宿主細(xì)胞的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。復(fù)制型載體的選擇和使用可以將編碼本發(fā)明多肽或抗體的核酸(例如cDNA或基因組DNA)插入復(fù)制型載體用于克隆(DNA擴(kuò)增)或表達(dá)。多種載體是公眾可得到的。載體可以是例如質(zhì)粒、粘粒、病毒顆?；蚴删w的形式?？梢酝ㄟ^(guò)多種規(guī)程將適宜的核酸序列插入載體。通常，使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將DNA插入適宜的限制性?xún)?nèi)切核酸酶位點(diǎn)。載體構(gòu)件通常包括但不限于下列一種或多種信號(hào)序列(如果所述序列要分泌的話(huà))、復(fù)制起點(diǎn)、一種或多種標(biāo)志基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子、和轉(zhuǎn)錄終止序列。包含一種或多種這些構(gòu)件的合適載體的構(gòu)建采用技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)。本發(fā)明多肽或抗體不僅可以直接重組生產(chǎn)，而且可以作為與異源多肽的融合多肽來(lái)生成，所述異源多肽可以是在成熟蛋白質(zhì)或多肽的N-末端具有特定切割位點(diǎn)的信號(hào)序列或其它多肽。通常，信號(hào)序列可以是載體的構(gòu)件，或者它可以是插入載體的多肽或抗體編碼DNA的一部分。信號(hào)序列可以是原核信號(hào)序列，選自例如堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp或熱穩(wěn)定的腸毒素II前導(dǎo)序列。為了酵母分泌，信號(hào)序列可以是例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列、a因子前導(dǎo)序列(包括糖酵母和克魯維酵母的a因子前導(dǎo)序列，后者見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No，5,010,182)、或酸性磷酸酶前導(dǎo)序列、白色假絲酵母葡糖淀粉酶前導(dǎo)序列(EP362,179，1990年4月4日公布)、或19卯年11月15日公布的WO90/13646中記載的信號(hào)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，可以使用哺乳動(dòng)物信號(hào)序列來(lái)指導(dǎo)蛋白質(zhì)的分泌，諸如來(lái)自相同或相關(guān)物種的分泌型多肽的信號(hào)序列，以及病毒分泌前導(dǎo)序列。表達(dá)和克隆載體都包含使載體能夠在一種或多種所選擇的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。已知多種細(xì)菌、酵母和病毒的此類(lèi)序列。來(lái)自質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)適合于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，2^粒起點(diǎn)適合于酵母，而各種病毒起點(diǎn)(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆載體。表達(dá)和克隆載體通常將包含選擇基因，也稱(chēng)為選擇標(biāo)志。典型的選擇基因編碼如下蛋白質(zhì)(a)賦予抗生素或其它毒素抗性，例如氨千青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四環(huán)素；(b)補(bǔ)足營(yíng)養(yǎng)缺陷；或(c)提供不能由復(fù)合培養(yǎng)基獲得的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物，例如編碼芽孢桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。適于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的選擇標(biāo)志的例子是能夠鑒定有能力攝取多肽或抗體編碼核酸的細(xì)胞的選擇標(biāo)志，諸如DHFR或胸苷激酶。在采用野生型DHFR時(shí)，適宜的宿主細(xì)胞是DHFR活性缺陷的CHO細(xì)胞系，其制備和繁殖記載于Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980)。適用于酵母的選擇基因?yàn)榇嬖谟诮湍纲|(zhì)粒YRp7中的f/^7基因(Stinchcomb等，Nature282:39(1979);Kingsman等，Gene7:141(1979);Tschemper等，Gene10:157(1980》。&/7基因?yàn)槿狈υ谏彼嶂猩L(zhǎng)能力的酵母突變抹，例如ATCCNo.44076或PEP4-1提供了選擇標(biāo)志(Jones，Genetics85:12(1977))。表達(dá)和克隆載體通常包含與本發(fā)明多肽或抗體編碼核酸序列可操作連接的啟動(dòng)子以指導(dǎo)mRNA合成。受到多種潛在宿主細(xì)胞識(shí)別的啟動(dòng)子是已知的。適用于原核宿主的啟動(dòng)子包括P-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang等,Nature275:615(1978);Goeddel等，Nature281:544(1979))、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Goeddel，NucleicAcidsRes.8:4057(1980);EP36,776)、和雜合啟動(dòng)子諸如tac啟動(dòng)子(deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25(1983))。用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動(dòng)子還將包含與編碼本發(fā)明多肽或抗體的DNA可操作連接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。適用于酵母宿主的啟動(dòng)序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等,J.Biol.Chem.255:2073(1980))或其它糖酵解酶(Hess等，J.Adv.EnzymeReg.7:149(1968);Holland,Biochemistry17:4900(1978))的啟動(dòng)子，諸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡糖激酶。作為具有由生長(zhǎng)條件控制轉(zhuǎn)錄的額外優(yōu)點(diǎn)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的其它酵母啟動(dòng)子是醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動(dòng)子區(qū)。適用于酵母表達(dá)的載體和啟動(dòng)子進(jìn)一步記載于EP73，657。在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中由載體轉(zhuǎn)錄核酸受到例如自病毒諸如多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日公布的UK2,211,504)、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽類(lèi)肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝病毒和猿病毒40(SV40)基因組得到的啟動(dòng)子；異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子例如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子；及熱休克啟動(dòng)子的控制，倘若此類(lèi)啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容的話(huà)?？赏ㄟ^(guò)在載體中插入增強(qiáng)子序列來(lái)提高高等真核生物對(duì)編碼本發(fā)明多肽或抗體的DNA的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子是DNA順式作用元件，通常大約10至300bp,作用于啟動(dòng)子以提高其轉(zhuǎn)錄。現(xiàn)在知道來(lái)自哺乳動(dòng)物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、曱胎蛋白和胰島素)的許多增強(qiáng)子序列。然而，通常使用來(lái)自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。例子包括SV40復(fù)制起點(diǎn)晚期一側(cè)的增強(qiáng)子(bp100-270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、多瘤病毒復(fù)制起點(diǎn)晚期一側(cè)的增強(qiáng)子、和腺病毒增強(qiáng)子?？梢詫⒃鰪?qiáng)子剪接入載體，位于本發(fā)明多肽或抗體編碼序列的5'或3'位置，但是優(yōu)選位于啟動(dòng)子的5'位點(diǎn)。用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲(chóng)、植物、動(dòng)物、人、或來(lái)自其它多細(xì)胞生物體的有核細(xì)胞)的表達(dá)載體還將包含終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。此類(lèi)序列通?？梢宰哉婧嘶虿《綝NA或cDNA非翻譯區(qū)的5'端和偶爾的3'端獲得。這些區(qū)域包含在編碼多肽或抗體的mRNA的非翻譯部分中轉(zhuǎn)錄成多腺普酸化片段的核苷酸區(qū)段。適合在改動(dòng)后在重組脊推動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中合成本發(fā)明多肽或抗體的其它方法、載體和宿主細(xì)胞記載于Gething等，Nature293:620-625(1981);Mantei等,Nature281:40-46(1979);EP117,060;及EP117,058。檢測(cè)基因擴(kuò)增/表達(dá)基因的擴(kuò)增和/或表達(dá)可以在樣品中直接測(cè)量，例如根據(jù)本文提供的序列，使用適宜的標(biāo)記探針，通過(guò)常規(guī)的Southern印跡、對(duì)mRNA轉(zhuǎn)錄定量的Northern印跡(Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:5201-5205(1980))、點(diǎn)印跡(DNA分析)或原位雜交。或者，可采用能識(shí)別特定雙鏈體的抗體，所述雙鏈體包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體、及DNA-RNA雜合雙鏈體或DNA-蛋白質(zhì)雙鏈體。繼而可標(biāo)記抗體，并可進(jìn)行測(cè)定法，其中將雙鏈體結(jié)合至表面，從而在雙鏈體在表面上形成時(shí)，可檢測(cè)與雙鏈體結(jié)合的抗體的存在?；蛘撸赏ㄟ^(guò)免疫學(xué)方法測(cè)量基因表達(dá)，諸如細(xì)胞或組織切片的免疫組化染色和細(xì)胞培養(yǎng)物或體液的測(cè)定法，以直接對(duì)基因產(chǎn)物的表達(dá)定量。可用于免疫組化染色和/或樣品液體測(cè)定法的抗體可以是單克隆的或多克隆的，而且可以在任何哺乳動(dòng)物中制備，或者可以是合成的(例如本發(fā)明的單克隆抗的合成肽或針對(duì)與ZPA多肽編碼DNA融合且編碼特定抗體表位的外源序列來(lái)制備抗體。ZPA多肽的純化可以從培養(yǎng)液或從宿主細(xì)胞裂解物中回收各種形式的ZPA多肽。如果是58膜結(jié)合的，那么可使用合適的去污劑溶液(例如Triton-XTM100)或通過(guò)酶促切割使其自膜釋放。ZPA多肽編碼核酸表達(dá)中所采用的細(xì)胞可通過(guò)多種物理或化學(xué)手段破裂，諸如凍融循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破裂、或細(xì)胞溶解劑。依照一個(gè)實(shí)施方案，期望從重組細(xì)胞蛋白質(zhì)或多肽純化ZPA多肽。下面的規(guī)程是合適純化規(guī)程的例示在離子交換柱上的分級(jí)；乙醇沉淀；反相HPLC;在硅土或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂諸如DEAE上的層析；層析聚焦；SDS-PAGE;硫酸銨沉淀；使用例如SephadexG-75的凝膠過(guò)濾；蛋白ASepharose柱以除去污染物諸如IgG;及用以結(jié)合帶表位標(biāo)簽形式ZPA多肽的金屬螯合柱?？刹捎枚喾N蛋白質(zhì)純化方法，此類(lèi)方法是本領(lǐng)域已知的，并記載于例如Deutscher，MethodsinEnzymology,182(1990);Scopes,ProteinPurification:PrinciplesandPractice,Springer-Verlag，NewYork(1982)。純化步驟的選4奪將取決于例如所用生成過(guò)程的性質(zhì)和所產(chǎn)生的具體ZPA多肽。依照一個(gè)實(shí)施方案，ZPA多肽使用本發(fā)明抗體通過(guò)親和層析來(lái)純化。測(cè)定對(duì)細(xì)胞增殖的抑制本發(fā)明的一種或多種ZPA多肽和/或激動(dòng)劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的抑制活性可以使用本文所描述的測(cè)定法和本領(lǐng)域已知的其它測(cè)定法來(lái)測(cè)量。腫瘤和癌癥(例如乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌等)的動(dòng)物模型包括非重組的和重組的(轉(zhuǎn)基因的)動(dòng)物二者。非重組動(dòng)物;漠型包括例如嚙齒類(lèi)，例如鼠模型。此類(lèi)模型可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入同基因小鼠來(lái)生成，例如皮下注射、尾靜脈注射、脾植入、腹膜內(nèi)植入、腎嚢下植入、或同位(orthopin)植入，例如將結(jié)腸癌細(xì)胞植入結(jié)腸組織。參見(jiàn)例如1997年9月18日公布的PCT公開(kāi)號(hào)W097/33551。肺瘤學(xué)研究中最常用的動(dòng)物物種大概是免疫缺陷型小鼠，特別是棵鼠。具有胸腺發(fā)育不全/不發(fā)育的棵鼠可成功充當(dāng)人腫瘤異種移植物宿主的觀察結(jié)果導(dǎo)致其用于該目的的廣泛應(yīng)用。已經(jīng)將常染色體隱性咖基因?qū)肟檬蟮臉O其多種獨(dú)特同基因異系品系，包括例如ASW、A/He、AKR、BALB/c、B10丄P、C17、C3H、C57BL、C57、CBA、DBA、DDD、1/st、NC、NFR、NFS、NFS/N、NZB、NZC、NZW、P、腿和SJL。另外，在棵鼠以外已經(jīng)培育了極其多種具有遺傳性免疫學(xué)缺陷的其它動(dòng)物并用作胂瘤異種移植物的接受者。更多詳情參見(jiàn)例如TheNudeMouseinOncologyResearch,E.Boven和B.Winograd編，CRCPress,Inc.,1991。導(dǎo)入此類(lèi)動(dòng)物的細(xì)胞可以衍生自已知的腫瘤/癌細(xì)胞系，諸如任何上文所列肺瘤細(xì)胞系及例如B104-1-1細(xì)胞系(經(jīng)"ew原癌基因轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定NIH-3T3細(xì)胞系)；經(jīng)ras轉(zhuǎn)染的NIH-3T3細(xì)胞；Caco-2(ATCCHTB-37);或中等分化的II期人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系HT-29(ATCCHTB-38);或者衍生自胂瘤和癌?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)條件/人接受手術(shù)的患者獲得腫瘤或癌細(xì)胞的樣品，其中牽涉在液氮中冷凍和保存。Karmali等，Br.J.Cancer,48:689-696(1983)?？梢酝ㄟ^(guò)多種規(guī)程將腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物，諸如棵鼠。小鼠中的表皮下(subcutaneous,s.c.)空間非常適于腫瘤植入。可以表皮下移植實(shí)心塊、針吸活檢(通過(guò)使用套管針)、或細(xì)胞懸浮液形式的腫瘤。對(duì)于實(shí)心塊或套管針植入，將合適大小的腫瘤組織碎片導(dǎo)入表皮下空間。自原發(fā)瘤或穩(wěn)定肺瘤細(xì)胞系新鮮制備細(xì)胞懸浮液，并表皮下注射。也可以以真皮下(subdermal)植入物的形式注射腫瘤細(xì)胞。在此位置，接種體沉積在真皮結(jié)締組織的下部與表皮下纟且織之間。乳腺癌的動(dòng)物模型可以通過(guò)例如將大鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞("ew癌基因最初就是自其分離的)或經(jīng)"ew轉(zhuǎn)染的NIH-3T3細(xì)胞植入棵鼠來(lái)生成，基本上如Drebin等，Proc.Nat,Acad.Sci.USA,83:9129-9133(1986)所述。類(lèi)似的，結(jié)腸癌的動(dòng)物^^莫型可以通過(guò)使結(jié)腸癌細(xì)胞在動(dòng)物(例如棵鼠)中傳代而導(dǎo)致肺瘤在這些動(dòng)物中出現(xiàn)來(lái)生成。人結(jié)腸癌在棵鼠中的同位移植物模型已有記載，例如Wang等，CancerResearch54:4726-4728(1994)及To。等，CancerResearch55:681-684(1995)。此模型基于所謂的"METAMOUSE"(Anticancer,Inc.,SanDiego,California).可以切下在動(dòng)物中生成的腫瘤并在體外培養(yǎng)。然后可以將來(lái)自體外培養(yǎng)物的細(xì)胞傳給動(dòng)物。此類(lèi)腫瘤可充當(dāng)進(jìn)一步測(cè)試或藥物篩選的靶物?；蛘?，可以分離源自傳代的肺瘤，并對(duì)來(lái)自傳代前細(xì)胞和一輪或多輪傳代后分離的細(xì)胞的RNA分析感興趣基因的差異表達(dá)。此類(lèi)傳代技術(shù)可以用任何已知的腫瘤或癌細(xì)胞系來(lái)實(shí)施。例如，MethA、CMS4、CMS5、CMS21和WEHI-164是BALB/c雌性小鼠的化學(xué)誘導(dǎo)纖維肉瘤(DeLeo等，J.Exp.Med.,146:720(1977))，其為研究各種藥劑的抗肺瘤活性提供了高度可控制的模型系統(tǒng)。Palladino等，J.Immunol.,138:4023-4032(1987)。簡(jiǎn)言之，使肺瘤細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)物中在體外繁殖。在注射入動(dòng)物前，將細(xì)胞系在緩沖液中清洗和懸浮，細(xì)胞密度為大約10xl()S到10xl(f細(xì)胞/ml。然后給動(dòng)物皮下感染10-10(V1細(xì)胞懸浮液，腫瘤出現(xiàn)需要l-3周。另外，小鼠Lewis肺(3LL)癌(其是最徹底研究的實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤之一)可以用作調(diào)查用腫瘤模型。在此腫瘤模型中的功效已經(jīng)與在診斷有小細(xì)胞肺癌(SCCL)的人類(lèi)患者治療中的有益效果聯(lián)系起來(lái)。在注射來(lái)自患病小鼠的腫瘤碎片或在培養(yǎng)物中維持的細(xì)胞后，此腫瘤可以導(dǎo)入正常小鼠。Zupi等，Br.J.Cancer,41:suppl.4，30(1980)。有證據(jù)表明，胂瘤可以始自甚至單一細(xì)胞的注射，而且非常高比例的受感染胂瘤細(xì)胞存活。關(guān)于此肺瘤模型的更多信息參見(jiàn)Zacharski,Haemostasis16:300-320(1986)。評(píng)估測(cè)試化合物在具有所植入胂瘤的動(dòng)物模型中的功效的一種方式是在治療前后測(cè)量腫瘤的大小。傳統(tǒng)上，所植入腫瘤的大小用游標(biāo)卡尺在二維或三維上測(cè)量。限于二維的測(cè)量不能精確反映腫瘤的大小；因此，通常使用數(shù)學(xué)公式將其換算成相應(yīng)的體積。然而，腫瘤大小的測(cè)量是非常不精確的。(specificgrowthdelay)來(lái)描述。腫瘤生長(zhǎng)描述中的另一項(xiàng)重要變量是腫瘤體積倍增時(shí)間。用于計(jì)算和描述腫瘤生長(zhǎng)的計(jì)算機(jī)程序也是可獲得的，諸如Rygaard和Spang-Thomsen,Proc.6thInt.WorkshoponImmune-DeficientAnimals,Wu和Sheng編，Basel,1989,p.301所報(bào)告的程序。然而，應(yīng)當(dāng)注意，治療之后的壞死和炎性應(yīng)答實(shí)際上可導(dǎo)致腫瘤大小的增大，至少在最初時(shí)。因此，需要通過(guò)形態(tài)測(cè)定方法和流式細(xì)胞術(shù)分析的組合來(lái)仔細(xì)監(jiān)測(cè)這些變化。另外，重組(轉(zhuǎn)基因)動(dòng)物模型可使用用于生成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過(guò)將本文中所鑒定的ZPA基因的編碼部分導(dǎo)入感興趣動(dòng)物的基因組來(lái)改造?？沙洚?dāng)轉(zhuǎn)基因操作對(duì)象的動(dòng)物包括但不限于小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、綿羊、山羊、豬、斑馬魚(yú)和非人靈長(zhǎng)類(lèi)，例如狒狒、黑猩猩和猴。本領(lǐng)域已知的用于將轉(zhuǎn)基因?qū)氪祟?lèi)動(dòng)物的技術(shù)包括原核顯微注射(pronucleicmicroinjection)(美國(guó)專(zhuān)利No.4,873,191);逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移入種系(例如VanderPutten等，Pro"Natl.Acad.Sci.USA,82:6148-615(1985));胚胎干細(xì)胞中的基因?qū)ぐ?Thompson等，Cell,56:313-321(1989));胚胎電穿孔(Lo，Mol.Cell.Biol.，3:1803-1814(1983));及精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Lavitrano等，Cell,57:717-73(1989))。綜述參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.4,736,866。為了本發(fā)明的目的，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包括那些只在其部分細(xì)胞中攜帶轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物("馬賽克動(dòng)物"或"鑲嵌動(dòng)物")。轉(zhuǎn)基因可作為單一轉(zhuǎn)基因或者串聯(lián)物例如頭-頭或頭-尾串聯(lián)物整合。還可能如下將轉(zhuǎn)基因選擇性導(dǎo)入特定細(xì)胞類(lèi)型，例如Lasko等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:6232-636(1992)的技術(shù)。轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的表達(dá)可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)。例如，Southem印跡分析或PCR擴(kuò)增可用于驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因的整合。然后可使用諸如原位雜交、Northem印跡分析、PCR或免疫細(xì)胞化學(xué)的技術(shù)分析mRNA表達(dá)水平。對(duì)動(dòng)物進(jìn)一步檢驗(yàn)肺瘤或癌癥發(fā)生/發(fā)展的征候。或者，可構(gòu)建具有缺陷的或改變的編碼本文中所鑒定的ZPA多肽的基因的"敲除"動(dòng)物(例如斑馬魚(yú))，原因是編碼ZPA多肽的內(nèi)源基因和導(dǎo)入動(dòng)物胚胎細(xì)胞的編碼同一多肽的改變的基因組DNA之間的同源重組。例如，編碼特定ZPA多肽的cDNA可依照已建立的技術(shù)用于克隆編碼該多肽的基因組DNA。可以將編碼特定ZPA多肽的基因組DNA的一部分刪除或用另一基因替換，諸如可用于監(jiān)測(cè)整合的、編碼選擇標(biāo)志的基因。類(lèi)似的，可以構(gòu)建具有缺陷的或改變的編碼ZPA多肽內(nèi)源同系物的基因的、斑馬魚(yú)以外的敲除動(dòng)物，原因是編碼ZPA同系物的內(nèi)源基因和導(dǎo)入動(dòng)物胚胎細(xì)胞的編碼同源ZPA多肽的改變的基因組DNA之間的同源重組。典型的，載體中包含數(shù)千堿基未改變的側(cè)翼DNA(5'和3'末端都有)。關(guān)于同源重組載體的描述參見(jiàn)例如Thomas和Capecchi,Cell,51:5(B(1987)。將載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞系(例如通過(guò)電穿孔)，并選擇其中所導(dǎo)入DNA與內(nèi)源DNA發(fā)生同源重組的細(xì)胞(參見(jiàn)例如Li等,Cell,69:915(1992))。然后將所選細(xì)胞注射入動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)的胚泡以形成聚集嵌合體(參見(jiàn)例^口Bradley,于TeratocarcinomasandEmbryonicStemCells:APracticalApproach,E.J.Robertson編,IRL,Oxford,1987，pp.113-152)。然后可將嵌合胚胎植入合適的假孕雌性代孕動(dòng)物，并使胚胎足月產(chǎn)生"敲除"動(dòng)物。在其生殖細(xì)胞中包含同源重組DNA的后代可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定，并用于繁殖其中動(dòng)物的所有細(xì)胞都包含同源重組DNA的動(dòng)物。敲除動(dòng)物可以在例如由于缺乏一種或多種ZPA多肽而形成病理狀況和具有抵御某些病理狀況的能力方面表4i?？梢詷?gòu)建"敲除"動(dòng)物(例如斑馬魚(yú))，其中選擇性阻止編碼ZPA多肽的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，可以使用沉默RNA或嗎啉代(morpholinos)來(lái)阻斷一種或多種ZPA多肽的翻譯。在此類(lèi)動(dòng)物中，編碼ZPA多肽的基因保持完整，但是該基因所編碼的蛋白質(zhì)沒(méi)有生成。特異性結(jié)合本文中所鑒定的ZPA多肽的抗體和其它藥物候選物的功效也可以在自發(fā)性動(dòng)物腫瘤的治療中測(cè)試。適于此類(lèi)研究的靶物是貓口腔鱗狀細(xì)胞癌(SCC)。貓口腔SCC是高度侵入性的惡性腫瘤，是最常見(jiàn)的貓口腔惡性腫瘤，占此物種中所報(bào)告的口腔肺瘤的超過(guò)60%。它罕見(jiàn)轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處部位，盡管此低轉(zhuǎn)移發(fā)生率可僅僅反映具有此胂瘤的貓的短存活時(shí)間。這些肺瘤通常不適于手術(shù)，主要因?yàn)樨埧谇坏慕馄?。目前，此腫瘤沒(méi)有有效的治療方法。在進(jìn)入研究前，每只貓進(jìn)行完整臨床檢查和活檢，并進(jìn)行計(jì)算斷層照相法(CT)掃描。將診斷有舌下口腔鱗狀細(xì)胞腫瘤的貓排除出研究。舌可因?yàn)榇祟?lèi)肺瘤而變得癱瘓或麻痹，而且，即使治療殺死了腫瘤，動(dòng)物可能不能自己進(jìn)食了。每只貓?jiān)诟L(zhǎng)的一段時(shí)間里重復(fù)治療。在治療期間的每天和每次后續(xù)復(fù)查時(shí)拍攝腫瘤照片。治療后，每只貓進(jìn)行另一次CT掃描。此后每8周評(píng)估CT掃描和胸透照片。對(duì)數(shù)據(jù)評(píng)估存活、應(yīng)答和毒性與對(duì)照組相比的差異。陽(yáng)性應(yīng)答可要求腫瘤消退的證據(jù)，優(yōu)選有生活質(zhì)量的改善和/或壽命延長(zhǎng)。另夕卜，也可以測(cè)試其它自發(fā)性動(dòng)物胂瘤，諸如犬、貓和狒狒的纖維肉瘤、腺癌、淋巴瘤、軟骨瘤或平滑肌肉瘤。其中，犬和貓中的乳腺腺癌是優(yōu)選的模型，因?yàn)樗耐庥^和表現(xiàn)與人的非常相似。然而，此模型的應(yīng)用受限于此類(lèi)型腫瘤在動(dòng)物中的罕見(jiàn)發(fā)生。轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的構(gòu)建轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)可以如本文所描述的或者如本領(lǐng)域所公知的來(lái)構(gòu)建(參見(jiàn)侈'H口Westerfield,TheZebrafishBook.Aguideforthelaboratoryuseofzebrafish(Daniorerio).第4版，Univ.ofOregonPress:Eugene，2000)?？梢詫⑥D(zhuǎn)基因構(gòu)建物導(dǎo)入斑馬魚(yú)細(xì)胞(例如在l-4個(gè)細(xì)胞的發(fā)育階段)，然后讓所注射的胚胎發(fā)育，直至?xí)r間上適于檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因的效果。轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物可以是線(xiàn)性的或環(huán)狀的多核苷酸，而且任選可以包括本文中其它地方所描述的調(diào)控序列。將轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物導(dǎo)入斑馬魚(yú)胚胎細(xì)胞的方法包括但不限于顯微注射、電穿孔、顆粒槍轟擊、病毒感染、和經(jīng)脂質(zhì)體。轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物中可以包括報(bào)告分子，以易于測(cè)定轉(zhuǎn)基因在成年斑馬魚(yú)中的存在(例如GFP或一些其它可容易鑒定的標(biāo)記物)；在構(gòu)建物中不包括報(bào)告物的情況中，可以對(duì)斑馬魚(yú)核酸(例如自成年斑馬魚(yú)的尾部切樣分離的)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因的存在，通過(guò)眾所周知的遺傳方法(geneticmethod),諸如PCR或Southern印跡。任何品系和/或品種的實(shí)驗(yàn)室或商品化斑馬魚(yú)都可用于本文所述方法。在一些實(shí)施方案，斑馬魚(yú)來(lái)自自交系(包括但不限于SJD、C32和WIK)。在一例如基本上沒(méi)有載黑色素細(xì)胞沉積(例如白化突變體)或irridiphore沉積(例如royorbison,透明突變體)的"非著色，，(non-pigmented)突變型斑馬魚(yú)。用于評(píng)估凋亡活性的測(cè)定法可用于測(cè)量本發(fā)明激動(dòng)劑、前身、和拮抗劑的促凋亡或抗凋亡活性的測(cè)定法包括實(shí)施例3的測(cè)定法或本領(lǐng)域已知的其它合適測(cè)定法，諸如下文所包括的那些。凋亡活性的測(cè)定法包括例如細(xì)胞毒性測(cè)定法(例如測(cè)量膜通透性升高的輻射度測(cè)量或非輻射度測(cè)量測(cè)定法，或測(cè)量線(xiàn)粒體代謝活性降低的色度測(cè)量測(cè)定法)；測(cè)量DNA斷裂的測(cè)定法(包括但不限于原位缺刻翻譯(ISNT)和TdT介導(dǎo)的X-dUTP缺刻末端標(biāo)記(TUNEL)(Cole和Ross,Devel.Biol.240:123-142(2001)));測(cè)量作為細(xì)胞死亡先兆的細(xì)胞組織和包裝變化(例如膜不對(duì)稱(chēng)的改變)的測(cè)定法(包括但不限于磷脂酰絲氨酸的易位(Nicoletti等，"CommonMethodsforMeasuringApoptoticCellDeathbyFlowCytometry",ThePurdueCytometryCD-ROMVolume3，J.Parker,C.Stewart,Guest編，J.PaulRobinson,Publisher.PurdueUniversity,WestLafayette,1997,ISBNl-890473畫(huà)02-2)，及細(xì)胞色素C或AIF自線(xiàn)粒體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的釋放)；及測(cè)量一種或多種導(dǎo)致凋亡的生化級(jí)聯(lián)的測(cè)定法(包括但不限于胱天蛋白酶活化(見(jiàn)例如實(shí)施例3)和聚-ADP-核糖聚合酶(PARP)的切割)。凋亡活性的測(cè)定法可以對(duì)單細(xì)胞和/或細(xì)胞群實(shí)施?？贵w結(jié)合研究抗體結(jié)合研究可使用已知測(cè)定法進(jìn)行，諸如竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定法、直接和間接三明治式測(cè)定法、及免疫沉淀測(cè)定法。Zola，MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques,CRCPress,Inc.,1987,pp.147-158。竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定法依賴(lài)于經(jīng)標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品與測(cè)試樣品分析物竟?fàn)幣c有限64量的抗體結(jié)合的能力。測(cè)試樣品中靶蛋白質(zhì)的量與變成與抗體結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)品的量成反比。為了便于測(cè)定變成結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)品的量，可以使抗體在竟?fàn)幹盎蛑蟛蝗芙?，使得與抗體結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)品和分析物可方便的與仍然未結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)品和分析物分開(kāi)。三明治式測(cè)定法牽涉使用兩種抗體，各自能夠結(jié)合待;險(xiǎn)測(cè)蛋白質(zhì)的不同免疫原性部分或表位。在三明治式測(cè)定法中，使測(cè)試樣品分析物受到固定化在固相支持物上的第一抗體的結(jié)合，此后使第二抗體結(jié)合分析物，如此形成不溶性三元復(fù)合物。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.4,376,110。第二抗體自身可以是用可檢測(cè)模塊標(biāo)記的(直接三明治式測(cè)定法)，或者可以使用用可檢測(cè)模塊標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體測(cè)量(間接三明治式測(cè)定法)。例如，三明治式測(cè)定法的一種類(lèi)型是ELISA測(cè)定法，在這種情況中可檢測(cè)模塊是酶?？梢詫?shí)施竟?fàn)幮訣LISA測(cè)定法以對(duì)多肽、激動(dòng)劑或拮抗劑篩選特異性結(jié)合ZPA多肽的多肽、激動(dòng)劑或拮抗劑，該結(jié)合可以被本發(fā)明的單克隆抗體所抑制。在一個(gè)例子中，可以遵循本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行竟?fàn)幮訣LISA測(cè)定法?？梢詫⑷L(zhǎng)或截短形式的天然ZPA蛋白(2ug/ml，在PBS中)在微量滴定板上4。C過(guò)夜或室溫2小時(shí)包被?？梢詫⒖追忾]，即通過(guò)添加65pl1。/。BSA達(dá)30分鐘，接著40ul1%Tween20達(dá)另30分鐘。接著，可以將孔用PBS-0.05%Tween20清洗5次?？梢詫⒏鞣N濃度的抗體(在ELISA緩沖液中)在孔中于室溫溫育30分鐘。然后，可以將待測(cè)試的多肽或抗體添加至不同的孔達(dá)10分鐘，其濃度通常會(huì)在缺乏抗體時(shí)產(chǎn)生90%結(jié)合能力。接著，可以將孔用PBS-0.05%Tween20清洗5次。結(jié)合可以通過(guò)本領(lǐng)域已知方法來(lái)定量。對(duì)于免疫組化，組織樣品可以是新鮮的或冷凍的，或者可以是例如在石蠟中包埋的且用防腐劑諸如福爾馬林固定的?；诩?xì)胞的腫瘤測(cè)定法增殖性病癥(諸如腫瘤)的基于細(xì)胞的測(cè)定法和動(dòng)物模型可用于檢驗(yàn)本發(fā)明拮抗劑的抑制活性。適宜的測(cè)定法是本領(lǐng)域已知的。例如，可以將已知牽涉增殖性病癥的細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞用一種或多種本文所述ZPAcDNA轉(zhuǎn)染，并分析這些cDNA在存在或缺乏拮抗劑時(shí)抑制生長(zhǎng)的能力。如果增殖性病癥是癌癥，那么合適的腫瘤細(xì)胞包括例如穩(wěn)定的腫瘤細(xì)胞系，諸如B104-1-1細(xì)65胞系(經(jīng)^m原癌基因轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定NIH-3T3細(xì)胞系)和經(jīng)ras轉(zhuǎn)染的NIH-3T3細(xì)胞，其可以用ZPA序列轉(zhuǎn)染并監(jiān)測(cè)腫瘤發(fā)生性生長(zhǎng)。然后此類(lèi)經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系可用于測(cè)試多克隆或單克隆抗體或者抗體組合物通過(guò)對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)揮細(xì)胞抑制性或細(xì)胞毒性活性或者通過(guò)介導(dǎo)抗體依賴(lài)性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)而抑制肺瘤發(fā)生性細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。另外，衍生自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如上文所述)中的腫瘤的原代培養(yǎng)物可用于本文中的基于細(xì)胞的測(cè)定法，盡管優(yōu)選穩(wěn)定的細(xì)胞系。從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物衍生連續(xù)細(xì)胞系的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)例如Small等,Mol.Cell.Biol"5:642-648(1985))。基因療法下文描述了可改善疾病癥狀的方法和組合物。本文所述ZPA多肽(包括ZPA多肽變體)、及本發(fā)明的拮抗劑和抗體可依照本發(fā)明通過(guò)各自的體內(nèi)表達(dá)(其常常稱(chēng)為基因療法)而得以采用。例如，可以使用這些方法在細(xì)胞中表達(dá)ZPA多肽變體。依照一個(gè)實(shí)施方案，用于表達(dá)ZPA多肽(包括變體)的方法或載體牽涉靶向劑的使用，以將包含ZPA多肽或核酸分子的媒介指導(dǎo)至期望組織。有兩種主要方法使核酸(任選包含在載體中)進(jìn)入哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，即體內(nèi)(/"Wvo)和回體OjcWvo)。對(duì)于體內(nèi)投遞，通常在需要ZPA多肽的部位(即ZPA多肽的合成部位(如果知道的話(huà))和需要ZPA多肽生物學(xué)活性的部位(例如傷口))將核酸直接注射入哺乳動(dòng)物。對(duì)于回體治療，取出哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，將核酸導(dǎo)入這些分離的細(xì)胞，并將經(jīng)過(guò)修飾的細(xì)胞或是直接施用于哺乳動(dòng)物，或是例如裝入多孔膜內(nèi)并植入哺乳動(dòng)物(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.4,892,538和5，283，187)。有多種技術(shù)可用于將核酸導(dǎo)入可存活細(xì)胞。這些技術(shù)根據(jù)是將核酸轉(zhuǎn)移入體外培養(yǎng)細(xì)胞還是體內(nèi)轉(zhuǎn)移入感興趣宿主的細(xì)胞而有所變化。適于在體外將核酸轉(zhuǎn)移入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的技術(shù)包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸鈣沉淀法等。轉(zhuǎn)導(dǎo)牽涉復(fù)制缺陷型重組病毒(包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒)顆粒與細(xì)胞受體的結(jié)合，接著顆粒所包含的核酸導(dǎo)入細(xì)胞。常用于回體投遞基因的載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒。常用的體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒或非病毒載體(諸如腺病毒、慢病毒、I型單純皰滲病毒或腺伴隨病毒(AAV))和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)(可用于脂質(zhì)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的脂質(zhì)有例如DOTMA、DOPE和DC-Choi;參見(jiàn)例如Tonkinson等，CancerInvestigation,14(1):54-65(1996))進(jìn)4亍的轉(zhuǎn)染。此類(lèi)載體用于合成可用作投遞藥劑(諸如本發(fā)明的拮抗劑和核酸分子)的媒介的病毒。基因療法中最常用的載體是病毒，例如腺病毒、AAV、慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒。病毒載體(諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)包含至少一種轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子/增強(qiáng)子或基因座限定元件(locus-definingelement)、或通過(guò)其它手段(諸如可變剪接、核RNA輸出、或信使的翻譯后修飾)控制基因表達(dá)的其它元件。另外，病毒載體(諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)包含在存在編碼ZPA多肽的基因的情況中轉(zhuǎn)錄時(shí)與其可操作連接且充當(dāng)翻譯起始序列的核酸分子。此類(lèi)載體構(gòu)建物還包含包裝信號(hào)、長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)或其部分、及適于所用病毒的正鏈和負(fù)鏈引物結(jié)合位點(diǎn)(如果病毒載體中原先沒(méi)有這些的話(huà))。另外，此類(lèi)載體通常包含信號(hào)序列，供ZPA多肽自它所在宿主細(xì)胞分泌。在某些實(shí)施方案中，用于此目的的信號(hào)序列是哺乳動(dòng)物信號(hào)序列，包括但不限于ZPA多肽的天然信號(hào)序列。任選的是，載體構(gòu)建物還可包含指導(dǎo)多腺苷酸化的信號(hào)，以及一種或多種限制性位點(diǎn)和翻譯終止序列。舉例而言，此類(lèi)載體通常會(huì)包含5'LTR、tRNA結(jié)合位點(diǎn)、包裝信號(hào)、第二條DNA鏈合成的起點(diǎn)、和3'LTR或其部分?？墒褂梅遣《镜钠渌d體，諸如陽(yáng)離子脂質(zhì)、聚賴(lài)氨酸和樹(shù)狀聚體。在有些情況中，希望與靶向靶細(xì)胞的藥劑一起提供核酸源，所述藥劑諸如對(duì)細(xì)胞表面膜蛋白或靶細(xì)胞特異的抗體、靶細(xì)胞上受體的配體等。在采用脂質(zhì)體時(shí)，與胞吞作用相關(guān)細(xì)胞表面膜蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)可用于靶向和/或促進(jìn)攝入，例如對(duì)特定細(xì)胞類(lèi)型具有向性的衣殼蛋白或其片段、在循環(huán)中發(fā)生內(nèi)在化的蛋白質(zhì)的抗體、及靶向細(xì)胞內(nèi)定位和延長(zhǎng)細(xì)胞內(nèi)半衰期的蛋白質(zhì)。受體介導(dǎo)的胞吞技術(shù)記載于例如Wu等，J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987);Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:3410-3414(1990)。關(guān)于目前已知的基因標(biāo)記和基因治療方案的綜述參見(jiàn)Anderson等，Science256:808-813(1992)。還可參見(jiàn)W093/25673及其引用的參考文獻(xiàn)。合適的基因療法和制備逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒和結(jié)構(gòu)蛋白的方法可參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.5,681,746。4全測(cè)ZPA突變本發(fā)明還涉及編碼ZPA多肽的基因作為診斷劑的用途。檢測(cè)到突變型ZPA多肽可指示發(fā)生凋亡相關(guān)病癥的傾向。檢測(cè)到斑馬魚(yú)組織中的ZPA多肽水平超過(guò)正常斑馬魚(yú)中相同組織的水平也可指示發(fā)生凋亡相關(guān)病癥的傾向。'類(lèi)似的，在斑馬魚(yú)以外的生物體中^r測(cè)到突變型ZPA多肽同系物可指示發(fā)生凋亡相關(guān)病癥的傾向。；險(xiǎn)測(cè)到生物體(例如哺乳動(dòng)物)組織中的ZPA多肽同系物水平超過(guò)正常生物體中相同組織的水平也可指示發(fā)生凋亡相關(guān)病癥的傾向。在編碼ZPA多肽人同系物的基因中攜帶突變的個(gè)體可通過(guò)多種技術(shù)在DNA水平檢測(cè)。用于診斷的核酸可以自哺乳動(dòng)物的細(xì)胞獲得，諸如血液、尿液、唾液、組織活檢、和尸檢材料?；蚪MDNA可以直接用于檢測(cè)，或者可以在分析前通過(guò)PCR酶促擴(kuò)增(Saiki等，Nature,324:163-166(1986))。RNA或cDNA也可以用于相同目的。例如，與編碼ZPA多肽的核酸互補(bǔ)的PCR引物可用于鑒定和分析ZPA多肽人同系物中的突變。例如，刪除和插入可以通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物與正常基因型相比的大小變化來(lái)檢測(cè)。點(diǎn)突變可以通過(guò)所擴(kuò)增DNADNA序列的雜交來(lái)鑒定。可以通過(guò)RNA酶A消化或解鏈溫度差異而將完全匹配序列與錯(cuò)配雙鏈體區(qū)分開(kāi)?；贒NA序列差異的遺傳測(cè)試可通過(guò)檢測(cè)DNA片段在有或無(wú)變性劑的凝膠中的電泳泳動(dòng)率改變來(lái)實(shí)現(xiàn)。小段序列刪除和插入可通過(guò)高分辨率凝膠不同DNA片段的泳動(dòng)率根據(jù)其特定解鏈或部分解鏈溫度而在凝膠中不同位置受到阻滯。參見(jiàn)例如Myers等，Science,230:1242(1985)。特定位置的序列變化也可以通過(guò)核酸酶保護(hù)測(cè)定法(諸如RNA酶和S1保護(hù))或化學(xué)切割法(例如Cotton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:4397-4401(1985))來(lái)揭示。如此，特定DNA序列的檢測(cè)可以通過(guò)下列方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，諸如雜交、RNA酶保護(hù)、化學(xué)切割、直接DNA測(cè)序、或限制酶的使用(例如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP))、和基因組DNA的Southern印跡。在更常規(guī)的凝膠電泳和DNA測(cè)序之外，ZPA多肽中的突變也可以通過(guò)原位分析來(lái)4全測(cè)。氺企測(cè)ZPA多肽或核酸水平ZPA多肽或核酸分子的水平可以例如使用本文中所公開(kāi)的試劑聯(lián)合本領(lǐng)域已知方法(諸如原位雜交、RT-PCR、Northern印跡、Western印跡)或者使用本文中所提供的實(shí)施例和試劑來(lái)檢測(cè)。類(lèi)似的，與ZPA多肽或核酸分子同源的多肽或核酸分子的水平可以例如使用本文中所公開(kāi)的試劑聯(lián)合本領(lǐng)域已知方法(諸如原位雜交、RT-PCR、Northern印跡、Westem印跡)或者使用本文中所提供的實(shí)施例和試劑來(lái)檢測(cè)?？梢圆捎镁?fàn)帨y(cè)定法，其中將對(duì)ZPA多肽特異性的抗體附著至固體支持物，并讓經(jīng)標(biāo)記的ZPA多肽和衍生自宿主的樣品(其包含至少一種與一種或多種ZPA多肽同源的多肽)經(jīng)過(guò)固體支持物，可以將所檢測(cè)到的附著至固體支持物的標(biāo)記物的量與樣品中至少一種與一種或多種ZPA多肽同源的多肽的數(shù)量聯(lián)系起來(lái)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用特異性結(jié)合本文所述ZPA多肽的抗體來(lái)監(jiān)測(cè)ZPA多肽水平或ZPA多肽同系物水平。藥物候選物的篩選測(cè)定法本發(fā)明涵蓋篩選化合物以鑒定模擬ZPA多肽活性(激動(dòng)劑)或阻止ZPA多肽效應(yīng)(拮抗劑)的化合物的方法。一般而言，通過(guò)各種條件下的溫育或接觸，使ZPA多肽暴露于藥物候選物。拮抗劑藥物候選物的篩選測(cè)定法設(shè)計(jì)成鑒定與天然ZPA多肽特異性結(jié)合或復(fù)合的化合物。此類(lèi)篩選測(cè)定法包括可適應(yīng)化學(xué)文庫(kù)高通量篩選，使之特別適于鑒定小分子藥物候選物的測(cè)定法。測(cè)定法可以多種形式進(jìn)行，包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合測(cè)定法、生化篩選測(cè)定法、免疫測(cè)定法和基于細(xì)胞的測(cè)定法，聯(lián)合ZPA多肽、其片段、或表達(dá)ZPA多肽或其片段的細(xì)胞。拮抗劑的所有測(cè)定法的共同之處在于它們要求使藥物候選物接觸由本文中所鑒定的核酸編碼的ZPA多肽，接觸的條件和時(shí)間足以容許這兩種成分相互作用。在結(jié)合測(cè)定法中，相互作用指結(jié)合，而且可分離或檢測(cè)反應(yīng)混合物中形成的復(fù)合物。例如，可以在有或無(wú)候選拮抗劑時(shí)實(shí)施ZPA多肽與在一種或多種生化途徑中在正常情況下與之相互作用的多肽的結(jié)合來(lái)評(píng)估拮抗劑是否阻斷ZPA多肽與在正常情況下與之相互作用的多肽的結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將由本文中所鑒定的基因編碼的ZPA多肽或藥物候選物通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)附著固定化在固相(例如微量滴定板)上。非共價(jià)附著通常是通過(guò)用ZPA多肽溶液包被固相并干燥來(lái)實(shí)現(xiàn)的?；蛘?，可以使用對(duì)待固定化ZPA多肽特異性的固定化抗體(例如單克隆抗體)將它錨定至固相表面。測(cè)定法如下進(jìn)行，將非固定化成分(它可以用可檢測(cè)標(biāo)記物標(biāo)記)添加至固定化成分(例如含錨定成分的經(jīng)包纟皮表面)。當(dāng)反應(yīng)完成時(shí)，除去未反應(yīng)成分，例如通過(guò)清洗，并檢測(cè)錨定在固相表面上的復(fù)合物。若最初非固定化的成分?jǐn)y帶可檢測(cè)標(biāo)記物，則檢測(cè)到固定化在表面上的標(biāo)記物指示發(fā)生了復(fù)合。若最初非固定化的成分不攜帶標(biāo)記物，則可通過(guò)例如使用經(jīng)過(guò)標(biāo)記的特異性結(jié)合固定化復(fù)合物的抗體來(lái)檢測(cè)復(fù)合。如果候選化合物與特定ZPA多肽相互作用但不結(jié)合它，那么它與該多肽的相互作用可通過(guò)已知用于檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法來(lái)測(cè)定。此類(lèi)測(cè)定法包括傳統(tǒng)方法，諸如例如交聯(lián)、免疫共沉淀、及經(jīng)由梯度或?qū)游鲋墓布兓Ａ硗?，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用可通過(guò)使用Fidds及其同事描述的基于酵母的遺傳系統(tǒng)(Fields和Song,Nature(London),340:245-246(1989);Chien等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:9578-9582(1991))如Chevmy和Nathans,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5789-5793(1991)所7〉開(kāi)的來(lái)監(jiān)測(cè)。許多轉(zhuǎn)錄激活物(諸如酵母GAL4)由兩個(gè)物理上離散的模塊結(jié)構(gòu)域組成，一個(gè)起DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的作用，另一個(gè)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的功能。前述出版物中記載的酵母表達(dá)系統(tǒng)(通常稱(chēng)為"雙雜交系統(tǒng)")利用了這種特性，采用兩種雜合蛋白，在其中之一中靶蛋白質(zhì)與GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合，在另一中候選活化蛋白質(zhì)與激活結(jié)構(gòu)域融合。GALl-Z"cZ報(bào)道基因在GAL4激活的啟動(dòng)子控制下的表達(dá)依賴(lài)于GAL4活性經(jīng)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的重建。含相互作用多肽的菌落用P-半乳糖苷酶的顯色底物來(lái)檢測(cè)。使用雙雜交技術(shù)來(lái)鑒定兩種特定蛋白質(zhì)之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的完整試劑盒(MATCHMAKER)可從Clontech購(gòu)得。此系統(tǒng)還可延伸至對(duì)參與特定蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的作圖以及指出對(duì)這些相互作用至關(guān)重要的氨基酸殘基。干擾ZPA多肽與另一蛋白質(zhì)(包括另一ZPA多肽)間結(jié)合的化合物可如下測(cè)試通常在足以容許兩種蛋白質(zhì)相互作用和結(jié)合的條件和時(shí)間下制備包含ZPA多肽和另一蛋白質(zhì)的反應(yīng)混合物。為了測(cè)試候選化合物抑制結(jié)合的能力，在缺乏和存在測(cè)試化合物時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。另外，可以向第三份反應(yīng)混合物中加入安慰劑，作為陽(yáng)性對(duì)照。如上所述監(jiān)測(cè)混合物中存在的ZPA多肽和另一多肽之間的結(jié)合(復(fù)合物形成)。對(duì)照反應(yīng)中形成復(fù)合物但含有測(cè)試化合物的反應(yīng)混合物中沒(méi)有形成復(fù)合物表明，該測(cè)試化合物干擾ZPA多肽與另一多肽的相互作用。依照一個(gè)實(shí)施方案，實(shí)施本文所述測(cè)定法以測(cè)試本發(fā)明的拮抗劑?；蛘?，可以通過(guò)將ZPA多肽和潛在拮抗劑與未標(biāo)記的ZPA多肽在適于竟?fàn)幮砸种茰y(cè)定法的條件下混合來(lái)檢測(cè)拮抗劑。ZPA多肽可以諸如通過(guò)放射性或比色法來(lái)標(biāo)記，使得所結(jié)合的ZPA多肽分子的數(shù)目可用于測(cè)定潛在拮抗劑的效力。ZPA多肽可以通過(guò)多種手段來(lái)標(biāo)記，包括碘化或包含位點(diǎn)特異性蛋白質(zhì)激酶的識(shí)別位點(diǎn)。在固定和溫育后，將載玻片進(jìn)行放射自顯影分析。藥物候選物包括抗ZPA抗體，包括但不限于多克隆和單克隆抗體和抗體片段、單鏈抗體、抗獨(dú)特型抗體、和嵌合或人源化形式的此類(lèi)抗體或片段、以及人抗體和抗體片段。或者，藥物候選物可以是密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，例如竟?fàn)幮砸种苾?nèi)源ZPA多肽或內(nèi)源ZPA多肽同系物的作用的突變形式ZPA多肽。施用方案、進(jìn)度表、劑量和配制劑本文中的分子及其拮抗劑在藥學(xué)上可用作上文所列各種病癥和疾病的預(yù)防劑和治療劑。本發(fā)明的多肽、激動(dòng)劑或拮抗劑的治療用組合物如下制備供貯存，即以?xún)龈蓜┬突蛩芤旱男问?，將具有適宜純度的期望分子與任選的藥學(xué)可接受的載體、貝武形劑或穩(wěn)、定劑混合(Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版，Osol,A.編，1980)?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對(duì)接受者是無(wú)毒的，包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和曱硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二曱基芐基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；酚、丁醇或苯曱醇；對(duì)羥基苯甲酸烷基酯，諸如對(duì)羥基苯曱酸曱酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間曱酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴(lài)氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA;糖類(lèi)，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相反離子，諸如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN"tm、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。此類(lèi)載體的其它例子包括離子交換劑、礬土(氧化鋁)、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白質(zhì)諸如人血清清蛋白、緩沖物質(zhì)諸如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、鹽或電解質(zhì)諸如硫酸魚(yú)精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、硅膠、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、基于纖維素的物質(zhì)、和聚乙二醇。用于表面或局部的或基于凝膠的形式的激動(dòng)劑或拮抗劑的載體包括多糖諸如曱基纖維素或羧曱基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇、和木蠟醇。對(duì)于所有施用，適當(dāng)使用常規(guī)貯存(depot)形式。此類(lèi)形式包括例如微膠嚢、納米膠嚢、脂質(zhì)體、硬膏劑、吸入形式、鼻腔噴霧、舌下片劑、和持續(xù)釋放制劑。ZPA多肽或激動(dòng)劑或拮抗劑通常在此類(lèi)媒介中以大約O.lmg/ml到100mg/ml的濃度進(jìn)行配制。另一種配制劑包括將ZPA多肽或其激動(dòng)劑或拮抗劑4參入所形成顆粒。此類(lèi)顆?？捎糜谡{(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和血管發(fā)生。另外，腫瘤^(曼入和轉(zhuǎn)移可以用這些顆粒來(lái)調(diào)控。的通過(guò)在凍干和重建之前或之后經(jīng)無(wú)菌濾膜過(guò)濾來(lái)實(shí)現(xiàn)。ZPA多肽通常以?xún)龈尚问交蛞匀芤嘿A存，如果全身施用的話(huà)。如果是凍干形式，ZPA多肽或其激動(dòng)劑或拮抗劑通常聯(lián)合其它成分一起配制，臨使用時(shí)用適當(dāng)?shù)南♂寗┲亟?。ZPA多肽或激動(dòng)劑或拮抗劑的液體配制劑的例子是裝在單劑藥瓶中用于皮下注射的無(wú)菌、清澈、無(wú)色、無(wú)防腐處理(unpreserved)的溶液。主要根據(jù)多肽的類(lèi)型和適應(yīng)癥，適于重復(fù)使用的經(jīng)過(guò)防腐處理的藥物組合物可包含例如以下各項(xiàng)a.ZPA多肽或其激動(dòng)劑或拮抗劑；b.能夠?qū)H維持在多肽或其它分子在溶液中的最大穩(wěn)定性的范圍內(nèi)(例如大約pH4-8)的緩沖劑；c.洗滌劑/表面活性劑，主要用于穩(wěn)定多肽或分子免于攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集；d.等滲調(diào)控劑(isotonifier);e.防腐劑，選自酚、苯甲醇和苯乙銨面化物，例如氯化物；和f.水。如果所采用的洗滌劑是非離子型的，那么它可以是例如聚山梨醇酯(例如POLYSORBATE(TWEENTM)20、80等)或泊洛沙姆(例如POLOXAMER188)。非離子型表面活性劑的使用容許配制劑暴露于剪切面應(yīng)力而不引起多肽變性。另外，此類(lèi)含表面活性劑配制劑可用于氣霧劑裝置，諸如肺部給藥和無(wú)針頭噴射注射槍(參見(jiàn)例如EP257,956)中所使用的那些?？梢源嬖诘葷B調(diào)控劑以確保ZPA多肽或其激動(dòng)劑或拮抗劑的液體組合物的等滲性，等滲調(diào)控劑包括多羥基糖醇，例如三羥基的或更高級(jí)的糖醇，諸如甘油、赤蘚糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。這些糖醇可以單獨(dú)的或聯(lián)合的使用?；蛘?，可以使用氯化鈉或其它適宜無(wú)機(jī)鹽，使得溶液等滲。緩沖劑可以是例如乙酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或磷酸鹽緩沖液，取決于期望的pH。本發(fā)明的一種類(lèi)型的液體配制劑的pH緩沖在大約4-8的范圍內(nèi)，優(yōu)選大致生理pH。防腐劑，酚、苯曱醇和苯乙銨卣化物(例如氯化物)是可采用的已知抗微生物劑。治療用ZPA多肽、激動(dòng)劑、和/或拮抗劑組合物通常置于具有無(wú)菌存取口的容器中，例如具有皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或藥瓶。在某些實(shí)施方案中，配制劑可以以重復(fù)的靜脈內(nèi)(i.v.)、皮下(s.c.)或肌肉內(nèi)(i.m.)注射，或者作為適于鼻內(nèi)或肺內(nèi)投遞的氣霧劑劑型(關(guān)于肺內(nèi)投遞參見(jiàn)例如EP257,956)來(lái)施用。ZPA多肽、其激動(dòng)劑、和/或拮抗劑還可以持續(xù)釋放制劑的形式施用。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有蛋白質(zhì)的固體疏水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)以定型產(chǎn)品的形式存在，例如薄膜或微膠嚢。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-曱基丙烯酸酯)，如Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)和Langer,Chem.Tech.，12:98-105(1982)所述，或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國(guó)專(zhuān)利No.3,773,919;EP58,481)、L-谷氨酸和L-谷氨酸Y乙酯的共聚物(Sidman等，Biopolymers，22:547-556(1983))、不可降解的乙烯-乙酸乙烯(Langer等，見(jiàn)上文)、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LupronDepot(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球體)、及聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP133,988)。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能夠釋放分子1OO天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的時(shí)間較短。當(dāng)膠嚢化蛋白質(zhì)在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間維持時(shí)，它們可能由于暴露于37。C的潮濕環(huán)境而變性或聚集，導(dǎo)致生物學(xué)活性損失和免疫原性可能改變?？筛鶕?jù)相關(guān)機(jī)制來(lái)設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定化合理策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是經(jīng)由硫醇-二硫化物互換而形成分子間S-S鍵，那么可通過(guò)^務(wù)飾巰基、自酸性溶液凍干、控制濕度、釆用適宜添加劑和開(kāi)發(fā)特定的聚合物基質(zhì)組合物來(lái)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定化。持續(xù)釋放的ZPA多肽、激動(dòng)劑和/或拮抗劑組合物還包括用脂質(zhì)體捕獲(entrap)的ZPA多肽、激動(dòng)劑和/或拮抗劑。包含ZPA多肽、抗體、激動(dòng)劑和/或拮抗劑的脂質(zhì)體通過(guò)本身已知的方法來(lái)制備DE3,218,121;Epstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688-3692(1985);Hwang等，Proc,Natl.Acad.Sci.USA,77:4030-4034(1980);EP52,322;EP36,676;EP88,046;EP143,949;EP142,641;日本專(zhuān)利申請(qǐng)83-118008;美國(guó)專(zhuān)利No.4，485,045和4，544，545;及EP102,324。任選的是，脂質(zhì)體是小的(大約200-800埃)單層的類(lèi)型，其中脂質(zhì)含量大于大約30mol.%膽固醇，所選擇的比例根據(jù)最佳療法進(jìn)行調(diào)整。ZPA多肽、其激動(dòng)劑和/或拮抗劑的治療有效劑量當(dāng)然會(huì)取決于某些因素有所變化，諸如待治療(包括預(yù)防)的病癥，施藥的方法，用于治療的化合物的類(lèi)型，所牽涉的任何輔療法或共療法(co-therapy)，患者的年齡、體重、一般醫(yī)學(xué)狀況、醫(yī)學(xué)史等，而且它的確定完全在執(zhí)業(yè)醫(yī)師的技術(shù)范圍內(nèi)。因而，治療學(xué)家有必要根據(jù)獲得最大治療效果的需要而確定劑量和調(diào)整施用路徑。臨床醫(yī)師會(huì)施用ZPA多肽、其抗體、激動(dòng)劑和/或拮抗劑，直至達(dá)到對(duì)所討論疾患的治療實(shí)現(xiàn)期望效果的劑量。例如，如果目標(biāo)是治療癌癥，那么所述量應(yīng)是抑制癌生長(zhǎng)的量。根據(jù)上述指導(dǎo)方針，有效劑量一般在大約0.001到大約1.0mg/kg、大約0.01-1.0mg/kg、和/或大約0.01-0.1mg/kg的范圍內(nèi)。對(duì)于治療凋亡相關(guān)病癥時(shí)的非口服使用，以大約0.01-50mg、大約0.05-20mg、和/或大約l-20mg每kg體重，每天l-3次，靜脈內(nèi)注射的形式施用ZPA多肽、其激動(dòng)劑和/或拮抗劑是有利的。對(duì)于口服施用，在某些實(shí)施方案中，以大約5mg-lg和/或大約10-100mg每kg體重，每天l-3次施用基于ZPA分子。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，內(nèi)毒素污染應(yīng)保持在最低限度，即安全水平，例如少于0.5ng/mg蛋白質(zhì)。此外，對(duì)于人類(lèi)施用，配制劑優(yōu)選達(dá)到FDA辦公室和生物制劑標(biāo)準(zhǔn)關(guān)于無(wú)菌、熱原性、一般安全性、和純度的要求。有待用于組織再建的包含ZPA多肽、激動(dòng)劑和/或拮抗劑的藥物組合物的劑量方案由主治醫(yī)師確定，要考慮影響多肽作用的各種因素，例如期望形成的組織重量的量，損傷的部位，受損傷組織的狀況，傷口的大小，受損傷組織的類(lèi)型(例如骨)，患者的年齡、性別和食譜，任何感染的嚴(yán)重程度，施藥時(shí)間，和其它臨床因素。劑量可以隨用于重建的基質(zhì)的類(lèi)型和在藥物組合物中包含其它蛋白質(zhì)而變化。例如，向最終組合物中添加其它已知生長(zhǎng)因子(諸如IGF-I)也會(huì)影響劑量。可以通過(guò)定期評(píng)估組織/骨生長(zhǎng)和/或修復(fù)，例如X射線(xiàn)、組織形態(tài)測(cè)定和四環(huán)素標(biāo)記來(lái)監(jiān)測(cè)*。ZPA多肽、拮抗劑和/或激動(dòng)劑的施用路徑依照已知方法，例如通過(guò)注射或輸注，經(jīng)由靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、大腦內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、表面或吸入路徑，或者通過(guò)下文所述持續(xù)釋放系統(tǒng)。也適當(dāng)?shù)氖?，ZPA多肽、其激動(dòng)劑和/或拮抗劑通過(guò)腫瘤內(nèi)、腫瘤周?chē)?、損傷內(nèi)/病灶內(nèi)、或損傷周?chē)?病灶周?chē)窂绞┯?，以發(fā)揮局部以及全身治療效果。如果采用肽或小分子作為拮抗劑或激動(dòng)劑，那么它優(yōu)選以液體或固體的形式口服的或非口服的施用給哺乳動(dòng)物。形成鹽且可用于下文的分子的藥學(xué)可接受鹽的例子包括石咸金屬鹽(例如鈉鹽、鉀鹽)、堿土金屬鹽(例如鈣鹽、鎂鹽)、銨鹽、有機(jī)堿鹽(例如吡啶鹽、三乙胺鹽)、無(wú)機(jī)酸鹽(例如鹽酸、硫酸、硝酸)、和有機(jī)酸鹽(例如乙酸鹽、草酸鹽、對(duì)曱苯磺酸鹽)。在制備和施用多肽、激動(dòng)劑和/或拮抗劑時(shí)要考慮本發(fā)明的ZPA多肽、其激動(dòng)劑和/或拮抗劑的期望作用的位置。當(dāng)期望作用位于細(xì)胞內(nèi)時(shí)，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供了要被導(dǎo)入細(xì)胞的多肽、激動(dòng)劑和/或拮抗劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽、蛋白質(zhì)性質(zhì)的激動(dòng)劑和/或蛋白質(zhì)性質(zhì)的拮抗劑的胞內(nèi)表達(dá)通過(guò)將編碼多肽、蛋白質(zhì)性質(zhì)的激動(dòng)劑和/或蛋白質(zhì)性質(zhì)的拮抗劑的核酸(缺少在正常情況下與編碼此類(lèi)分子的基因相連的野生型前導(dǎo)序列和分泌信號(hào))導(dǎo)入靶細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)?？墒褂萌魏螌⒑怂釋?dǎo)入細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法，包括但不限于顯75微注射，彈道式注射(ballisticinjection),電穿孔，磷酸釣沉淀，脂質(zhì)體以及使用攜帶感興趣核酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒和痘苗病毒載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)染。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了內(nèi)在化分子。多肽可具有某些增強(qiáng)將其投遞入細(xì)胞的特性，或可被修飾以具有此類(lèi)特性。用于實(shí)現(xiàn)這一目的的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。例如，陽(yáng)離子化、脂轉(zhuǎn)染或脂質(zhì)體可用于將抗體^:遞入細(xì)胞。將pH(低)插入肽("pHLIP")與待易位的分子偶聯(lián)(例如通過(guò)二石JU定，參見(jiàn)例如Reshetnyak等，Proc.Natl.Acad.Sci.103(17):6460-6465(2006))并降低細(xì)胞夕卜pH也可促進(jìn)分子進(jìn)入細(xì)胞的易位。在使用片段時(shí)，履行期望功能的最小片段通常是有利的。例如，缺乏膜錨區(qū)但保留抗凋亡活性的ZPA多肽可能是有利的，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)導(dǎo)入優(yōu)于野生型多肽。此類(lèi)肽可化學(xué)合成和/或通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的方法增強(qiáng)調(diào)控物多肽、激動(dòng)劑和拮抗劑進(jìn)入靶細(xì)胞。例如，某些序列諸如衍生自HIVTat或觸角足(Antennapedia)同源結(jié)構(gòu)域蛋白的那些序列能夠指導(dǎo)異源蛋白穿過(guò)細(xì)胞膜從而有效地?cái)z入。參見(jiàn)例如Chen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:4325-4329(1999)。當(dāng)ZPA多肽、激動(dòng)劑和/或拮抗劑的期望活性的位置在腦中時(shí)，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供了穿越血腦屏障的ZPA多肽、激動(dòng)劑和/或拮抗劑。某些神經(jīng)變性疾病與血腦屏障通透性升高有關(guān)，使得抗體或抗原結(jié)合片段能容易的導(dǎo)入腦中。當(dāng)血腦屏障保持完整時(shí)，本領(lǐng)域存在著一些用于轉(zhuǎn)運(yùn)分子穿越該血腦屏障的已知方法，包括但不限于物理方法、基于脂質(zhì)的方法以及基于受體和通道的方法。將ZPA多肽、激動(dòng)劑和/或拮抗劑轉(zhuǎn)運(yùn)穿越血腦屏障的物理方法包括但不限于完全繞過(guò)血腦屏障或通過(guò)在血腦屏障中產(chǎn)生開(kāi)口。繞過(guò)方法包括但不限于直接注射入腦(參見(jiàn)例如Papanastassiou等，GeneTherapy9:398-406(2002))、間質(zhì)輸注/對(duì)流增強(qiáng)的才殳遞(convection-enhanceddelivery)(參見(jiàn)例如Bobo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:2076-2080(1994))和在腦中植入4殳遞裝置(參見(jiàn)例如Gill等，NatureMed.9:589-595(2003);及GliadelWafers,GuildfordPharmaceutical^在屏障中產(chǎn)生開(kāi)口的方法包括但不限于超聲波(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2002/0038086)、滲透壓(例如通過(guò)施用高滲的甘露醇(Neuwelt，E.A"ImplicationoftheBlood-BrainBarrieranditsManipulation,巻1&2，PlenumPress,N.Y(1989)))、通過(guò)例如緩激肽或透化劑A-7透化(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.5,112,596;5，268，164;5，506,206和5,686，416)、及用包含編碼ZPA多肽、蛋白質(zhì)性質(zhì)的激動(dòng)劑和/或蛋白質(zhì)性質(zhì)的拮抗劑的基因的載體轉(zhuǎn)染跨越血腦屏障的神經(jīng)元(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2003/0083299)?；谥|(zhì)的將ZPA多肽、激動(dòng)劑和/或拮抗劑轉(zhuǎn)運(yùn)穿越血腦屏障的方法包括但不限于將ZPA多肽、激動(dòng)劑和/或拮抗劑包嚢入偶聯(lián)有與血腦屏障血管內(nèi)皮上的受體結(jié)合的抗體結(jié)合片段的脂質(zhì)體(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20020025313),以及將ZPA多肽、激動(dòng)劑和/或拮抗劑包被在低密度脂蛋白顆粒(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20040204354)或載脂蛋白E(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20040131692)中?；谑荏w和通道的將ZPA多肽、激動(dòng)劑和/或拮抗劑轉(zhuǎn)運(yùn)穿越血腦屏障的方法包括但不限于使用糖皮質(zhì)激素阻斷劑來(lái)提高血腦屏障的通透性(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2002/0065259;2003/0162695;和2005/0124533);活化鉀通道(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2005/0089473);抑制ABC藥物運(yùn)栽體(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2003/0073713);用轉(zhuǎn)鐵蛋白包被所述分子并調(diào)控一種或多種轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的活性(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2003/0129186);以及陽(yáng)離子化所述分子(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.5,004,697)。組合療法ZPA多肽或其激動(dòng)劑或拮抗劑在預(yù)防或治療凋亡相關(guān)病癥中的效力可以通過(guò)系列施用活性劑或聯(lián)合另一種對(duì)那些目的有效的藥劑(或是在同一組合物中或是作為分開(kāi)的組合物)施用活性劑來(lái)提高。例如，對(duì)于細(xì)胞增殖性病癥的治療，ZPA多肽和/或ZPA多肽激動(dòng)劑療法可以聯(lián)合細(xì)胞增殖的其它抑制劑的施用，諸如細(xì)胞毒劑。另外，用于治療癌癥的ZPA多肽和/或激動(dòng)劑可以聯(lián)合上文所述細(xì)胞毒劑、化療劑、或生長(zhǎng)抑制劑。而且，對(duì)于癌癥治療，合適的是，ZPA多肽和/或其激動(dòng)劑系列施用，或者聯(lián)合放射治療，無(wú)論牽涉照射或施用放射性物質(zhì)。如果是治療癌癥，那么可能希望還施用針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的抗體，諸如結(jié)合ErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4或VEGF受體中的一種或多種的抗體?；蛘?另外，兩種或多種結(jié)合本文中所公開(kāi)的同一抗原或者兩種或多種不同抗原的抗體可以共施用于患者。有時(shí)，還給患者施用一種或多種細(xì)胞因子可能是有益的。在一個(gè)實(shí)施方案中，將本文所述ZPA多肽和/或其激動(dòng)劑與生長(zhǎng)抑制劑共施用。例如，可以首先施用生長(zhǎng)抑制劑，接著是本發(fā)明的ZPA多肽和/或其激動(dòng)劑。然而，也涵蓋同時(shí)施用或首先施用本發(fā)明的ZPA多肽和/或其激動(dòng)劑。生長(zhǎng)抑制劑的合適劑量就是當(dāng)前所用的那些，而且可以由于生長(zhǎng)抑制劑與本文所述多肽和激動(dòng)劑的聯(lián)合作用(協(xié)同)而降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，在組合療法中攻擊腫瘤的血管形成。將本發(fā)明的ZPA多肽和/或其激動(dòng)劑與抗體(例如抗VEGF)以治療有效劑量施用于攜瘤患者，所述治療有效劑量是通過(guò)例如觀察到肺瘤或其轉(zhuǎn)移灶(如果有的話(huà))的壞死而確定的。繼續(xù)此療法，直至不再觀察到進(jìn)一步的有益效果或臨床檢查沒(méi)有顯示出腫瘤或任何轉(zhuǎn)移灶的痕跡的時(shí)間。然后，單獨(dú)的或聯(lián)合輔助劑的施用TNF，所述輔助劑諸如a-、p-或y-干擾素、抗HER2抗體、heregulin、抗heregulin抗體、D-因子、白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子(GM-CSF)、或促進(jìn)腫瘤中微血管凝結(jié)(coagulation)的藥劑(諸如抗蛋白C抗體、抗蛋白S抗體、或C4b結(jié)合蛋白(參見(jiàn)1991年2月21日公布的WO91/01753))、或者加熱或輻射。與ZPA多肽或其拮抗劑聯(lián)合施用的治療劑的有效量取決于醫(yī)師或獸醫(yī)的判斷。完成劑量施用和調(diào)整以實(shí)現(xiàn)對(duì)待治療疾患的最大控制。劑量還取決于諸如待使用的治療劑的類(lèi)型和所治療的特定患者等因素。典型的是，所采用的量與所給予的治療劑在沒(méi)有ZPA多肽時(shí)施用所使用的劑量相同。制品包含可用于診斷或治療上文所述病癥的一種或多種ZPA多肽或其激動(dòng)劑或拮抗劑的制品(諸如試劑盒)包括至少一個(gè)容器和標(biāo)簽。合適的容器包括例如瓶子、小管、注射器和試管。容器可以由各種材料制成，諸如玻璃或塑料。容器中裝有有效診斷或治療疾患的組合物，而且可具有無(wú)菌存取口(例如容器可以是具有皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或小管)。組合物中的活性劑是一種或多種ZPA多肽或其激動(dòng)劑或拮抗劑。容器上或與容器相關(guān)的標(biāo)簽指明該組合物用于it斷或治療所選擇的疾患。制品還可包括第二容器，其中裝有藥學(xué)可接受緩沖劑，諸如磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏(Ringer)溶液和/或右旋糖溶液。它還可包括商業(yè)和使用者立場(chǎng)上所期望的其它物質(zhì)，包括其它緩沖劑、稀釋劑、濾器、針頭、注射器和帶有使用說(shuō)明書(shū)的包裝插頁(yè)。制品還可以包括裝有另一種上文所述活性劑的第二或第三容器。多克隆抗體用于制備多克隆抗體的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。多克隆抗體可在哺乳動(dòng)物中生成，例如通過(guò)一次或多次注射免疫劑和根據(jù)需要的佐劑。通常，免疫劑和/或佐劑將通過(guò)多次皮下或腹膜內(nèi)注射而注射到哺乳動(dòng)物中。免疫劑可包括ZPA多肽或其融合蛋白。將免疫劑與已知在所免疫哺乳動(dòng)物中有免疫原性的蛋白質(zhì)偶聯(lián)可能是有用的。此類(lèi)免疫原性蛋白質(zhì)的例子包括但不限于匙孔i戚血藍(lán)蛋白、血清清蛋白、牛曱狀腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑。可采用的佐劑的例子包括弗氏完全佐劑和MPL-TDM佐劑(單磷?；|(zhì)A或合成的海藻糖dicorynomycolate)。免疫方案可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員無(wú)需過(guò)多實(shí)驗(yàn)做出選擇。單克隆抗體抗ZPA抗體可以是單克隆抗體。單克隆抗體可以例如使用雜交瘤法制備，諸如Kohler和Milstein，Nature256:495(1975)所記載的，或者可以通過(guò)重組DNA方法(美國(guó)專(zhuān)利No.4,816,567)來(lái)制備，或者可通過(guò)本文實(shí)施例部分中所描述的方法來(lái)生成。在雜交瘤法中，小鼠、倉(cāng)鼠或其它適宜的宿主動(dòng)物通常用免疫劑免疫以引發(fā)生成或能夠生成將特異性結(jié)合免疫劑的抗體的淋巴細(xì)胞?；蛘?，可以在體外免疫淋巴細(xì)胞。免疫劑將通常包括ZPA多肽或其融合蛋白。通常，或是使用外周血淋巴細(xì)胞("PBL，，)，若希望人起源的細(xì)胞，或是使用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞，若希望非人哺乳動(dòng)物來(lái)源。然后，使用合適的融合劑，諸如聚乙二醇，將淋巴細(xì)月包與？;jc生^f匕細(xì)胞系融合以形成雜交瘤細(xì)月包(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,NewYour,AcademicPress(1986),pp.59-103)。永生化細(xì)胞系通常是轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是嚙齒類(lèi)、牛和人起源的骨髓瘤細(xì)胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。雜交瘤細(xì)胞可在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有抑制未融合的永生化細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的一種或多種物質(zhì)。例如，如果親本細(xì)胞缺乏酶次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT),那么用于雜交瘤的培養(yǎng)基通常將含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷("HAT培養(yǎng)基，，)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細(xì)胞生長(zhǎng)。79例示性的永生化細(xì)胞系是那些高效融合、支持選定的抗體生成細(xì)胞穩(wěn)定的高水平的表達(dá)抗體、并對(duì)諸如HAT培養(yǎng)基等培養(yǎng)基敏感的細(xì)胞系。在某些實(shí)施方案中，永生化細(xì)胞系是鼠源骨髓瘤系，可從例如索爾克研究所細(xì)胞分配中心(SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiege,California,USA)和美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Manassas,Virginia,USA)獲得。用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系也已有描述(Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984);Brodeur等，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,MarcelDekker，Inc.，NewYork(1987)pp.51-63)。然后可對(duì)雜交瘤細(xì)胞在其中培養(yǎng)的培養(yǎng)基測(cè)定針對(duì)ZPA多肽的單克隆抗體的存在。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)免疫沉淀或通過(guò)體外結(jié)合測(cè)定法，諸如放射免疫測(cè)定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA),測(cè)定由雜交瘤細(xì)胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。此類(lèi)技術(shù)和測(cè)定法是本領(lǐng)域已知的。單克隆^t體的結(jié)合親和力可通過(guò)例如Munson和Pollard，Anal.Biochem.107:220(1980)的Scatchard分析來(lái)測(cè)定。在鑒定得到期望的雜交瘤細(xì)胞后，該克隆可通過(guò)有限稀釋規(guī)程進(jìn)行亞克隆，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)(Goding，見(jiàn)上文)。適于這一目的的培養(yǎng)基包括例如Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基。或者，雜交瘤細(xì)胞可在哺乳動(dòng)物中作為腹水進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)?？赏ㄟ^(guò)常規(guī)免疫球蛋白純化流程，諸如例如蛋白A-Sepharose、羥磚灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體自培養(yǎng)基或腹水分離或純化。單克隆抗體還可通過(guò)重組DNA技術(shù)來(lái)生成，諸如美國(guó)專(zhuān)利No.4,816,567中所述。編碼本發(fā)明單克隆抗體的DNA易于使用常規(guī)規(guī)程分離和測(cè)序(例如使用能夠特異性結(jié)合編碼鼠源抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞可充當(dāng)此類(lèi)DNA的來(lái)源。一旦分離，可將DNA置于表達(dá)載體中，然后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到不另外產(chǎn)生免疫球蛋白蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞中，諸如猿COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以在重組宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。還可以^奮飾DNA,例如通過(guò)替代，即用人重鏈和輕鏈恒定域的編碼序列替換同源鼠源序列(美國(guó)專(zhuān)利No.4,816,567;Morrison等，見(jiàn)上文)，或者通過(guò)共價(jià)接合免疫球蛋白編碼序列和非免疫球蛋80列。可用此類(lèi)非免疫球蛋白多肽替代本發(fā)明抗體的恒定域，或者可用它替代本發(fā)明抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變域以產(chǎn)生嵌合二價(jià)抗體。抗體可以是單價(jià)抗體。用于制備單價(jià)抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，一種方法牽涉免疫球蛋白輕鏈和經(jīng)修飾重鏈的重組表達(dá)。重鏈通常在Fc區(qū)中的任何點(diǎn)截短，從而防止重鏈交聯(lián)。或者，相關(guān)半胱氨酸殘基用另一種氨基酸殘基替代或者刪除，從而防止交聯(lián)。體外方法也適于制備單價(jià)抗體。消化抗體以生成其片段，特別是Fab片段，可使用本領(lǐng)域已知技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。人抗體和人源化抗體抗ZPA抗體還可以包括人源化抗體或人抗體。非人(例如鼠)抗體的人源化形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體的其它抗原結(jié)合子序列)。人源化抗體包括人免疫球蛋白(受體抗體)中的CDR殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠或家兔的CDR殘基替換的抗體。在有些情況中，將人免疫球蛋白的Fv框架殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。人源化抗體還可包含在受體抗體和輸入CDR或框架序列中都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的殘基。通常，人源化抗體會(huì)包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)基本上整個(gè)如下可變域，其中所有或基本上所有CDR對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白共有序列的FR。人源化抗體還可包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)(Jones等，Nature321:522-525(1986);Riechmann等，Nature332:323-329(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992))。用于人源化非人抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。通常，人源化抗體中引入了一個(gè)或多個(gè)來(lái)自非人來(lái)源的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱(chēng)作"輸入"殘基，它們通常取自"輸入，，可變域。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法進(jìn)行(Jones等，Nature321:522-525(1986);Riechmann等,Nature332:323-327(1988);Verhoeyen等，Science239:1534-1536(1988》,即用嚙齒類(lèi)CDR或CDR序列替代人抗體的相應(yīng)序列。因而，此類(lèi)"人源化"抗體是嵌合抗體(美國(guó)專(zhuān)利No.4,816,567)，其中基本上少于整個(gè)人可變域用來(lái)81自非人物種的相應(yīng)序列替代。在實(shí)踐中，人源化抗體通常是其中一些CDR殘基和可能的一些FR殘基用來(lái)自嚙齒類(lèi)抗體中類(lèi)似位點(diǎn)的殘基替代的人抗體。作為人源化的替代方法，可生成人抗體。例如，現(xiàn)在有可能生成這樣的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)，它們?cè)谌狈?nèi)源性免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫后生成人抗體完整全集。例如，已經(jīng)記載了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合刪除導(dǎo)致內(nèi)源性抗體生成的完全抑制。將大量人種系免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)移入此類(lèi)種系突變小鼠將導(dǎo)致在抗原攻擊后生成人抗體。參見(jiàn)例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551(1993);Jakobovits等,Nature362:255-258(1993);Bruggemann等,YearinImmuno.7:33(1993);美國(guó)專(zhuān)利No.5，545,806，5,569,825,5，591，669(都屬于GenPharm);5,545,807;及WO97/17852?；蛘撸梢匀缦律扇丝贵w，即將人免疫球蛋白基因座導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，例如內(nèi)源免疫球蛋白基因已經(jīng)部分或完全滅活的小鼠。在攻擊后，觀察到人抗體的生成在所有方面與在人中看到的密切相似，包括基因重排、裝配、和抗體全集。這種方法記載于例如美國(guó)專(zhuān)利No.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;和5，661,016，及下列科學(xué)出版物Marks等，Bio/Technology,10:779-783(1992);Lonberg等，Nature,368:856-859(1994);Morrison,Nature,368:812-813(1994);Fishwild等，NatureBiotechnology,14:845-851(1996);Neuberger,NatureBiotechnology,14:826(1996);Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol"13:65-93(1995)?；蛘撸删w展示技術(shù)(McCafferty等，Nature348:552_553(l"0))可用于在體外從來(lái)自未免疫供體的免疫球蛋白可變域(V)基因全集生成人抗體和抗體片段。依照這種技術(shù)，將抗體可變域基因以符合讀碼框的方式克隆入絲狀噬菌體諸如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因，并在噬菌體顆粒表面上展示為功能性抗體片段。因?yàn)榻z狀噬菌體顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，以抗體的功能特性為基礎(chǔ)進(jìn)行的選擇也導(dǎo)致編碼展示那些特性的抗體的基因得到選擇。如此，噬菌體模擬B細(xì)胞的一些特性。噬菌體展示可以以多種形式進(jìn)行，綜述參見(jiàn)例如Johnson,KevinS.和Chiswell，DavidJ.,CurrentOpinioninStructuralBiology3:564-571(1993)。V基因區(qū)段的數(shù)種來(lái)源可用于噬菌體展示。Clackson等，Nature352:624-628(1991)從衍生自經(jīng)免疫小鼠脾的小型V基因隨機(jī)組合文庫(kù)中分離出大量不同的抗ti惡唑酮抗體。可基本上遵循Marks等，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等，EMBOJ.12:725-73482(1993)所記栽的技術(shù)，自未免疫人供體構(gòu)建V基因全集和分離針對(duì)大量不同抗原(包括自身抗原)的抗體。還可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5，565,332和5，573，905。如上所述，還可通過(guò)體外活化B細(xì)胞來(lái)生成人抗體(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5,567,610和5,229,275)。人抗體還可以使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來(lái)生產(chǎn)，包括噬菌體展示庫(kù)(Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol"227:381(1991);Marks等，J.Mol.Biol"222:581(1991))。CoIe等和Boerner等的技術(shù)也可用于制備人單克隆抗體(Cole等,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.77(淺5)及Boerner等，J.Immunol"147(1):86-95(1991》。雙特異性抗ZPA抗體雙特異性抗體指對(duì)至少兩種不同抗原具有結(jié)合特異性的單克隆抗體，任選單克隆的人抗體或人源化抗體。在本案中，結(jié)合特異性之一是針對(duì)ZPA多肽，結(jié)合特異性之另一是針對(duì)任何其它抗原。用于構(gòu)建雙特異性抗體的方法在本領(lǐng)域是已知的。傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組生產(chǎn)基于兩對(duì)免疫球蛋白重鏈/輕鏈的共表達(dá)，其中兩種重鏈具有不同的特異性(Millstein和Cuello,Nature305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨才幾分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過(guò)親和層析步驟來(lái)進(jìn)行正確分子的純化。類(lèi)似的規(guī)程披露于1993年5月13日公布的WO93/08829及Traunecker等，EMBOJ.10:3655-3659(1991)?？梢詫⒕哂衅谕Y(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變域與免疫球蛋白恒定域序列融合。在某些實(shí)施方案中，與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定域進(jìn)行融合。在某些實(shí)施方案中，在至少一種融合物中存在包含輕鏈結(jié)合所必需的位點(diǎn)的重鏈第一恒定區(qū)(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和，在需要時(shí)，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開(kāi)的表達(dá)載體，并共轉(zhuǎn)染入合適的宿主生物體。關(guān)于生成雙特異性抗體的進(jìn)一步詳情參見(jiàn)例如Suresh等，MethodsinEnzymology121:210(1986)。還記載了從重組細(xì)胞培養(yǎng)物直接生成和分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny等，J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。將來(lái)自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過(guò)基因融合83與兩種不同抗體的Fab'部分連接?？贵w同二聚體在鉸鏈區(qū)還原以形成單體，然后重新氧化以形成抗體異二聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚體。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)記載的"雙抗體，，技術(shù)提供了構(gòu)建雙特異性抗體片段的替代機(jī)制。該片段包含通過(guò)接頭相連的VH和VL，所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)。因而，迫使一個(gè)片段上的VH和VL結(jié)構(gòu)域與另一個(gè)片段上的互補(bǔ)VL和VH結(jié)構(gòu)域配對(duì)，由此形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。還報(bào)道了通過(guò)使用單鏈Fv(sFv)二聚體構(gòu)建雙特異性抗體片段的另一種策略。參見(jiàn)Gmber等，J.Immunol.152:5368(1994)。涵蓋具有超過(guò)兩個(gè)效價(jià)的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt等，J.Immunol.147:60(1991)。.異源偶if關(guān)抗體異源偶聯(lián)抗體由兩種共價(jià)連接的抗體構(gòu)成。此類(lèi)抗體建議例如用于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國(guó)專(zhuān)利No.4,676,980)及用于治療HIV感染(WO91/00360;WO92/200373;EP03089)。涵蓋可在體外使用合成蛋白質(zhì)化學(xué)的已知方法制備抗體，包括那些涉及交聯(lián)劑的方法。例如，可使用二硫^:交換反應(yīng)或通過(guò)形成硫醚鍵來(lái)構(gòu)建免疫毒素。適于此目的的試劑的例子包括亞氨基硫醇西旨(iminothiolate)和4-巰基丁酰亞氨酸曱酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)及例如美國(guó)專(zhuān)利No.4,676,980中所公開(kāi)的。效應(yīng)器功能工程改造可能希望在效應(yīng)器功能方面修飾本發(fā)明的抗體，從而增強(qiáng)例如抗體在治療癌癥中的效力。例如，可向Fc區(qū)中引入半胱氨酸殘基，從而使得在該區(qū)中形成鏈間二辟^鍵。如此生成的同二聚體抗體可具有改善的內(nèi)在化能力和/或提高的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和抗體依賴(lài)性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)。參見(jiàn)Caron等，丄Exp.Med.176:1191-1195(1992)及Shopes，J.Immunol.148:2918-2922(1992)。具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性的同二聚體抗體還可使用如Wolff等，CancerResearch53:2560-2565(1993)中描述的異雙功能交聯(lián)劑來(lái)制備?；蛘?，抗體可改造成具有雙重Fc區(qū)，由此可具有增強(qiáng)的補(bǔ)體溶解和ADCC能力。參見(jiàn)Stevenson等，Anti-CancerDrugDesign3:219-230(1989)。免疫偶聯(lián)物本發(fā)明還關(guān)于包含偶聯(lián)有細(xì)胞毒劑的抗體的免疫偶聯(lián)物，所述細(xì)胞毒劑諸如化療劑、毒素(例如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶聯(lián)物)。上文已經(jīng)描述了可用于生成此類(lèi)免疫偶聯(lián)物的化療劑。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來(lái)自銅綠^f艮單胞菌(i^ewcfomowasaerag/wosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin)A鏈、a-帚曲霉素(sarcin)、油桐(j/ew故^/oW")毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(尸/^to/aca)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momorafcac/wra""a)抑制物、麻瘋初于毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、月巴急草Oapao"fln'aofc/"afe)抑制物、白樹(shù)毒蛋白(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依諾霉素(enomycin)和單端孑包菌素(trichothecenes)。多種放射性核素可用于生成放射偶聯(lián)抗體。例子包括犯Bi、131I、131In、^Y和186Re?？贵w和細(xì)胞毒劑的偶聯(lián)物可使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來(lái)制備，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，亞氨基硫烷(IT),亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二曱酯)、活性酯類(lèi)(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(lèi)(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對(duì)-疊氮苯甲?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對(duì)-重氮苯曱酰基)乙二胺)、二異氰酸酯(諸如曱苯2,6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如l,5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如Vitetta等，Science238:1098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標(biāo)記的l-異硫氰酸苯曱基-3-曱基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與抗體偶聯(lián)的例示性螯合劑。參見(jiàn)WO94/11026。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將抗體與"受體"(諸如鏈霉親合素)偶聯(lián)從而用于腫瘤預(yù)先靶向，其中對(duì)患者施用抗體-受體偶聯(lián)物，接著使用清除劑由循環(huán)中清除未結(jié)合的偶聯(lián)物，然后施用與細(xì)胞毒劑(例如放射性核苷酸)偶聯(lián)的"配體"(例如親合素)。免疫脂質(zhì)體本文中所公開(kāi)的抗體還可配制成免疫脂質(zhì)體。含有抗體的脂質(zhì)體可通過(guò)本領(lǐng)域已知方法來(lái)制備，諸如參見(jiàn)Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688(1985);Hwang等,Pro"Natl.Acad.Sci.USA77:4030(1980);及美國(guó)專(zhuān)利No.4,485，045和4,544,545。循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)的脂質(zhì)體4皮露于美國(guó)專(zhuān)利No.5,013,556。可用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物通過(guò)反相蒸發(fā)法生成特別有用的脂質(zhì)體。將脂質(zhì)體擠過(guò)具有設(shè)定孔徑的濾器，產(chǎn)生具有期望直徑的脂質(zhì)體?？扇鏜artin等，J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中所述，將本發(fā)明抗體的Fab，片段經(jīng)二硫化物交換反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián)。任選在脂質(zhì)體中包含化療劑(諸如多柔比星(Doxorubicin))。參見(jiàn)Gabizon等，J.NationalCancerInst.81(19):1484(1989)?？贵w的藥用組合物定的其它分子，可以藥用組合物的形式施用以治療上文和下文所述各種病癥?？墒褂弥D(zhuǎn)染試劑(lipofectin)或脂質(zhì)體將本發(fā)明的多肽、核酸分子、抗體、拮抗劑或組合物投遞入細(xì)胞。在使用抗體片段時(shí)，可以使用特異性結(jié)合靶蛋白質(zhì)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的最小抑制性片段。例如，基于抗體的可變區(qū)序列，可設(shè)計(jì)保留結(jié)合靶蛋白質(zhì)序列的能力的肽分子。此類(lèi)肽可化學(xué)合成和/或通過(guò)重組DNA技術(shù)生成(參見(jiàn)例如Marasco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:7889-7893(1993))。本文中的配制劑還可含有超過(guò)一種所治療具體適應(yīng)癥所必需的活性化合物，優(yōu)選活性互補(bǔ)且^L此沒(méi)有不利影響的。或者/另外，組合物還可包含增強(qiáng)其功能的藥劑，諸如例如細(xì)胞毒劑、化療劑或生長(zhǎng)抑制劑。合適的是，此類(lèi)分子以對(duì)于預(yù)定目的有效的量組合存在?；钚猿煞诌€可包載于例如通過(guò)凝聚技術(shù)或通過(guò)界面聚合制備的微膠嚢中(例如分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯)微膠嚢)、在膠狀藥物投遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠嚢)、或在粗滴乳狀液中。此類(lèi)技術(shù)公開(kāi)于例如Remington'sPharmaceuticalSciences,見(jiàn)上文。用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無(wú)菌的。這可容易的通過(guò)使用無(wú)菌濾膜過(guò)濾來(lái)實(shí)現(xiàn)。可制備持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有抗體的固體疏水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)是定型產(chǎn)品的形式，例如薄膜或^4#續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-曱基丙烯酸西旨)或聚(乙烯醇))、聚交酉旨(美國(guó)專(zhuān)利No.3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸丫-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRONDEPOTtm(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能夠釋放分子達(dá)100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的時(shí)間較短。當(dāng)膠嚢化抗體在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間維持時(shí)，它們可能由于暴露于37。C的潮濕環(huán)境而變性或聚集，導(dǎo)致生物學(xué)活性損失和免疫原性可能改變。可以根據(jù)相關(guān)機(jī)制來(lái)設(shè)計(jì)合理的穩(wěn)定化策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是經(jīng)由硫醇-二硫化物互換而形成分子間S-S鍵，那么可通過(guò)修飾巰基、自酸性溶液凍干、控制濕度、采用適宜添加劑和開(kāi)發(fā)特定的聚合物基質(zhì)組合物來(lái)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定化。使用抗ZPA抗體或其片段的治療方法涵蓋ZPA多肽的抗體可用于治療上文所述多種凋亡相關(guān)病癥。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，依照已知方法將本發(fā)明的抗體施用于哺乳動(dòng)物(例如人類(lèi))，諸如靜脈內(nèi)施用(像推注或持續(xù)一段時(shí)間的連續(xù)輸注)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、表面、或吸入路徑。在制備和施用抗體時(shí)要考慮本發(fā)明抗體的結(jié)合把物的位置。當(dāng)結(jié)合耙為細(xì)胞內(nèi)分子時(shí)，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供了要被導(dǎo)入結(jié)合靶所處的細(xì)胞的抗體或其抗原結(jié)合片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以作為胞內(nèi)抗體(intrabody)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。術(shù)語(yǔ)"胞內(nèi)抗體"在用于本文時(shí)指一種在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)且能夠與靶分子選擇性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合部分，如Marasco，GeneTherapy4:11-15(1997);Kontermann,Methods34:163-170(2004);美國(guó)專(zhuān)利No.6,004,940和6，329,173;及美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2003/0104402和PCT公開(kāi)號(hào)WO2003/077945中所述。胞內(nèi)抗體的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)通過(guò)將編碼期望抗體或其抗原結(jié)合部分的核酸(缺少在正常情況中與編碼抗體或抗原結(jié)合片段的基因相連的野生型前導(dǎo)序列和分泌信號(hào))導(dǎo)入靶細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。可使用任何將核酸導(dǎo)入細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法，包括但不限于顯微注射，彈道式注射(ballisticinjection),電穿孔，磷酸鉤沉淀，脂質(zhì)體以及使用攜帶有感興趣核酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒和痘苗病毒載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)染。可將一種或多種編碼整個(gè)或部分本發(fā)明抗ZPA抗體的核酸投遞至靶細(xì)胞，使得一種或多種胞內(nèi)抗體得以表達(dá)，從而能夠在細(xì)胞內(nèi)與ZPA蛋白結(jié)合并調(diào)控一條或多條ZPA介導(dǎo)的細(xì)胞途徑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了內(nèi)在化抗體?？贵w可具有某些增強(qiáng)將抗體投遞入細(xì)胞的特性，或可被修飾以具有此類(lèi)特性。用于實(shí)現(xiàn)這一目的的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。例如，已知抗體的陽(yáng)離子化能促進(jìn)其被細(xì)胞攝取(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.6,703,019)。脂轉(zhuǎn)染或脂質(zhì)體也可用于將抗體投遞入細(xì)胞。在使用抗體片段的情況中，與靶蛋白結(jié)合域特異性結(jié)合的最小抑制性片段通常是有利的。例如，基于抗體的可變區(qū)序列，可設(shè)計(jì)保留與靶蛋白序列結(jié)合的能力的肽分子。此類(lèi)肽可化學(xué)合成和/或通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。參見(jiàn)例如Marasco等，Proc.Natl.Acad.Sci,USA,90:7889-7893(1993)?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的方法增加抗體進(jìn)入靶細(xì)胞。例如，某些序列(諸如衍生自HIVTat或觸角足(Antennapedia)同源結(jié)構(gòu)域蛋白的那些序列)能夠指導(dǎo)異源蛋白穿越細(xì)胞膜的有效攝入。參見(jiàn)例如Chen等，Proc.Natl,Acad.Sci.USA,96:4325-4329(1999)。當(dāng)結(jié)合靶位于腦中時(shí)，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供了穿越血腦屏障的抗體或其抗原結(jié)合片段。某些神經(jīng)變性疾病與的血腦屏障通透性升高有關(guān)，使得抗體或抗原結(jié)合片段能容易的導(dǎo)入腦中。當(dāng)血腦屏障保持完整時(shí)，本領(lǐng)域存在著一些用于轉(zhuǎn)運(yùn)分子穿越該血腦屏障的已知方法，包括但不限于物理方法、基于脂質(zhì)的方法、以及基于受體和通道的方法。全繞過(guò)血腦屏障或通過(guò)在血腦屏障中產(chǎn)生開(kāi)口。繞過(guò)方法包括但不限于直接注射入腦(參見(jiàn)例如Papanastassiou等，GeneTherapy9:398-406(2002))、間質(zhì)專(zhuān)命注/只十;危增強(qiáng)的才殳遞(convection-enhanceddelivery)(參見(jiàn)例長(zhǎng)口Bobo等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:2076-2080(1994))和在腦中植入投遞裝置(參見(jiàn)例如Gill等，NatureMed.9:589-595(2003);及GliadelWafersTM,GuildfordPharmaceutical^在屏障中產(chǎn)生開(kāi)口的方法包括但不限于超聲波(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2002/0038086)、滲透壓(例如通過(guò)施用高滲的甘露醇(Neuwelt,E.A"ImplicationoftheBlood-BrainBarrieranditsManipulation,巻l&2，PlenumPress,N.Y.(1989)))、通過(guò)例如緩激肽或透化劑A-7透化(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.5,112,596，5,268,164，5,506，206和5,686，416)、及用包含編碼抗體或抗原結(jié)合片段的基因的載體轉(zhuǎn)染跨越血腦屏障的神經(jīng)元(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利7>開(kāi)號(hào)2003/0083299)。限于將抗體或抗原結(jié)合片段包嚢入偶聯(lián)有與血腦屏障血管內(nèi)皮上的受體結(jié)合的抗體結(jié)合片段的脂質(zhì)體(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20020025313),以及將抗體或抗原結(jié)合片段包被在低密度脂蛋白顆粒(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)7>開(kāi)號(hào)20040204354)或載脂蛋白E(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利申"i貪公開(kāi)號(hào)20040131692)中?；谑荏w和通道的將抗體或抗原結(jié)合片段轉(zhuǎn)運(yùn)穿越血腦屏障的方法包括但不限于使用糖皮質(zhì)激素阻斷劑來(lái)提高血腦屏障的通透性(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2002/0065259;2003/0162695;和2005/0124533);活化鉀通道(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2005/0089473);抑制ABC藥物運(yùn)載體(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2003/0073713);用轉(zhuǎn)鐵蛋白包^^皮抗體并調(diào)控一種或多種轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的活性(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2003/0129186),以及陽(yáng)離子化抗體(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.5,004,697)?？梢詫⑵渌委煼桨概c如上所述本發(fā)明抗體的施用組合。例如，如果抗體用于治療癌癥，那么有待用此類(lèi)抗體治療的患者還可接受放療。或者/另外，可以將化療劑施用于患者?？梢勒罩圃焐痰恼f(shuō)明書(shū)使用此類(lèi)化療劑的制備和服藥時(shí)間表，或者憑熟練技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)確定。此類(lèi)化療劑的制備和服藥時(shí)間表還可參見(jiàn)ChemotherapyService,M.C.Perry編，Williams&Wilkins:Baltimore,MD,1992。化療劑可以在抗體施用之前或之后，或者可以同時(shí)給予?？贵w可以聯(lián)合抗雌激素化合物諸如他莫昔芬或EVISTATM或者抗孕酮諸如奧那司酮(參見(jiàn)EP616812),采用此類(lèi)分子的已知?jiǎng)┝俊Ｈ绻贵w用于治療癌癥，那么它們可以任選與針對(duì)一種或多種腫瘤相關(guān)抗原的抗體(諸如結(jié)合ErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4或VEGF受體中的一種或多種的抗體)一起施用。這些還包括上文所列藥劑。而且，合適的是，抗體系列施用，或者聯(lián)合放射治療，無(wú)論牽涉照射或施用放射性物質(zhì)?；蛘?另外，兩種或多種結(jié)合本文中所公開(kāi)的同一抗原或者兩種或多種不同抗原的抗體可以共施用于患者。在一個(gè)實(shí)施方案中，將本文中的抗體與生長(zhǎng)抑制劑共施用。例如，可以首先施用生長(zhǎng)抑制劑，接著是本發(fā)明的抗體。然而，也涵蓋同時(shí)施用或首先施用本發(fā)明的抗體。生長(zhǎng)抑制劑的合適劑量就是當(dāng)前所用的那些，而且可以由于生長(zhǎng)抑制劑與本文抗體的聯(lián)合作用(協(xié)同)而降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，在組合療法中攻擊腫瘤的血管形成。將抗ZPA多肽抗體和另一種抗體(例如抗VEGF)以治療有效劑量施用于攜瘤患者，所述治療有效劑量是通過(guò)例如觀察到腫瘤或其轉(zhuǎn)移灶(如果有的話(huà))的壞死而確定的。繼續(xù)此療法，直至不再觀察到進(jìn)一步的有益效果或臨床檢查沒(méi)有顯示出腫瘤或任何轉(zhuǎn)移灶的痕跡的時(shí)間。然后，單獨(dú)的或聯(lián)合輔助劑的施用TNP,所述輔助劑諸如a-、(3-或y-干擾素、抗HER2抗體、heregulin、抗heregulin抗體、D-因子、白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子(GM-CSF)、或促進(jìn)腫瘤中微血管凝結(jié)(coagulation)的藥劑(諸如抗蛋白C抗體、抗蛋白S抗體、或C4b結(jié)合蛋白，參見(jiàn)1991年2月21日公布的WO91/01753)、或者加熱或輻射。由于輔助劑的效力有所不同，因此可能希望通過(guò)常規(guī)形式的矩陣篩選(matrixscreening)來(lái)比較它們對(duì)胂瘤的影響。重復(fù)抗ZPA多肽抗體和TNF的施用，直至實(shí)現(xiàn)期望的臨床效果?；蛘撸瑢⒖筞PA多肽抗體與TNF和任選的輔助劑一起施用。在實(shí)體瘤發(fā)現(xiàn)于四肢或易于與大循環(huán)(generalcirculation)分離的其它部位的情況中，將本文所述治療劑施用至分離的腫瘤或器官。在其它實(shí)施方案中，將FGF或PDGF拮抗劑(諸如抗FGF或抗PDGF中和性抗體)與抗ZPA多肽抗體一起施用于患者。為了預(yù)防或治療凋亡相關(guān)病癥，本發(fā)明的抗體的合適劑量取決于所要治療的病癥的類(lèi)型(如上文所限定的)、疾病的嚴(yán)重程度和病程、施用抗體是出于預(yù)防目的還是治療目的、之前的治療、患者的臨床史和對(duì)抗體的應(yīng)答、以及主治醫(yī)師的判斷?？贵w適合于在一次或一系列的治療中施用于患者。例如，取決于病癥的類(lèi)型和嚴(yán)重程度，約lpg/kg-50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)抗體是施用于患者的初始候選劑量，無(wú)論是例如通過(guò)一次或多次分開(kāi)的施用或通過(guò)連續(xù)輸注。取決予上述因素，典型的日劑量或周劑量可在約l嗎/kg-100mg/kg或更多的范圍內(nèi)。對(duì)于持續(xù)數(shù)天或更長(zhǎng)時(shí)間的重復(fù)施90用，取決于病情，治療重復(fù)或持續(xù)直至出現(xiàn)病癥癥狀得到期望的抑制為止。然而，可使用其它劑量方案。通過(guò)常規(guī)技術(shù)和測(cè)定法(包括例如放射線(xiàn)照相腫瘤成像)易于監(jiān)測(cè)該治療的進(jìn)展。具有抗體的制品還提供了制品，其包括裝有抗體的容器和標(biāo)簽。此類(lèi)制品在上文中有描述，其中活性劑是抗ZPA抗體。使用抗體對(duì)凋亡相關(guān)病癥的診斷和預(yù)后針對(duì)一種或多種ZPA多肽的抗體可用于凋亡相關(guān)病癥的診斷和/或預(yù)后確定。例如，針對(duì)一種或多種ZPA多肽的抗體可用作腫瘤診斷劑或預(yù)后劑。例如，抗體(包括抗原結(jié)合性抗體片段)可定性地或定量地用于檢測(cè)基因(包括編碼ZPA多肽的基因)的表達(dá)，或是在完整細(xì)胞中或是在細(xì)胞裂解物中。在某些實(shí)施方案中，抗體配備有可檢測(cè)標(biāo)記物，例如熒光標(biāo)記物，而且結(jié)合可以通過(guò)顯微鏡檢查術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、熒光測(cè)定法、或其它本領(lǐng)域已知技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)。此類(lèi)結(jié)合測(cè)定法基本上如上所述實(shí)施。本文中所引用的所有出版物(包括專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng))都完整收入本文作為參考。除非另有說(shuō)明，實(shí)施例中提及的商品化試劑依照制造商的說(shuō)明書(shū)使用。下文實(shí)施例和整篇說(shuō)明書(shū)中以ATCC編號(hào)所鑒別的那些細(xì)胞的來(lái)源是美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Manassas，VA)。除非另有說(shuō)明，本發(fā)明采用重組DNA技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程，諸如上文和以下教科書(shū)中所i己載的Sambrook等,見(jiàn)上文；Ausubel等,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenPublishingAssociatesandWileyInterscience,N.Y"1989;Innis等,PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress,Inc.,N.Y"1990;Harlow等,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,1988;Gait，OligonucleotideSynthesis,IRLPress,Oxford,1984;Freshney,AnimalCellCulture,1987;Coligan等，CurrentProtocolsinImmunology,1991。貫穿本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)，詞語(yǔ)"包含"、"包括"、"含有"或其變化形式應(yīng)當(dāng)理解為意味著包括所述成分或成分組，但不排除任何其它成分或成分組。認(rèn)為前述書(shū)面描述足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明。提供以下實(shí)施例僅出于例示目的，并非意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)際上，根據(jù)上面的描述，在本文所顯示和描述之外，本發(fā)明的多種修飾對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的，而且在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。實(shí)施例實(shí)施例l:推定的斑馬魚(yú)Bcl-2家族成員的鑒定先前已經(jīng)使用傳統(tǒng)序列搜索方法學(xué)在斑馬魚(yú)中鑒定了人Bcl-2家族中某些成員的同系物(Inohara和Nunez,CellDeathDiff.7:509-510(2000);Coultas等，CellDeathDiff.9:1163-1166(2002);Aouacheria等，Mol.Biol.Evol.22(12):2395-2416(2005))。盡管經(jīng)過(guò)數(shù)個(gè)小組的巨大努力，哺乳動(dòng)物內(nèi)在凋亡途徑中多種重要蛋白質(zhì)的等同物尚未在斑馬魚(yú)中發(fā)現(xiàn)(出處同前)。申請(qǐng)人懷疑斑馬魚(yú)中新的和分歧的(divergent)Bcl-2基因的存在不會(huì)在最常用的序列數(shù)據(jù)庫(kù)中出現(xiàn)并且無(wú)法通過(guò)傳統(tǒng)的基于序列的搜索輕易地發(fā)現(xiàn)。因此對(duì)這些序列進(jìn)行了全面搜索，該搜索既使用傳統(tǒng)BLAST和PROSITE搜索定制的序列數(shù)據(jù)庫(kù)，又使用定制的隱蔽馬爾科夫模型連同Unison數(shù)據(jù)庫(kù)(http:〃unison-db.org)進(jìn)行基于特征的數(shù)據(jù)庫(kù)探礦(databasemining)。。a.BLAST/PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)^T先前由其它小組進(jìn)行的BLAST和PROSITE搜索未能鑒定包括Bak、Bik、Bim和PUMA在內(nèi)的數(shù)種Bcl-2家族成員的斑馬魚(yú)同系物(Inohara和Nunez,CellDeathDiff.7:509-510(2000);Coultas等，CellDeathDiff.9:1163-1166(2002);Aouacheria等，Mol.Biol.Evol.22(12):2395-2416(2005》。為了調(diào)查用于這些在先研究的數(shù)據(jù)庫(kù)是否不夠大，構(gòu)建了包含136,655個(gè)斑馬魚(yú)氨基酸序列的定制數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)BLAST(2.2.10版)和PROSITE(版本18)搜索技術(shù)，使用缺省自變量(defaultargument)和Bcl-2家族的已知人、小鼠和雞成員作為查詢(xún)對(duì)象來(lái)查詢(xún)所述定制數(shù)據(jù)庫(kù)。此搜索鑒定了多個(gè)序列，其中兩個(gè)在先前對(duì)斑馬魚(yú)中Bcl-2相關(guān)序列的類(lèi)似搜索中未得到鑒定。第一個(gè)序列(Ensembl:ENSDARP00000040899(SEQIDNO:1))與人Bax在51。/。的序列上為33。/。同一的，e值為le-14。沒(méi)有PROSITEBH摸式可與ENSDARP00000040899比對(duì)(align)，并且Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)(可從www.ensembl.org獲4尋；Birney等，NucleicAcidsRes.34:D556-561(2006))將該基因注釋為假設(shè)的(hypothetical)。第二個(gè)序列(XP—693331(SEQIDNO:3))與人Bad在68。/。的序列上是33%同一的，e值為1.3。使用PROSITE樣式進(jìn)行的搜索未鑒定出任何已知的斑馬魚(yú)Bcl-2家族成員，并且使用單獨(dú)的PROSITE樣式未鑒定出新的斑馬魚(yú)序列。b.基于特征的數(shù)據(jù)庫(kù)揮》廣即使使用為斑馬魚(yú)序列量身定制的序列數(shù)據(jù)庫(kù)(實(shí)施例l(a)中所述)，也僅僅鑒定了一個(gè)新的推定的Bcl-2家族成員。因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)BLAST和PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)搜索顯然無(wú)法鑒定其它斑馬魚(yú)Bcl-2成員，所以考慮到一種可能性，即家族成員在斑馬魚(yú)和人中可能具有差異顯著的整體堿基序列，但是仍然享有共同的功能。為了論證(address)這種可能性，采用了基于特征的序列探礦?；谔卣鞯奶降V可鑒定與一組具體特征匹配的序列。(1)基于特征的探礦序列源在Unison數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行基于特征的探礦。簡(jiǎn)而言之，Unison包含來(lái)自許多源凄t據(jù)庫(kù)的無(wú)冗余序列概覽(non-redundantcompendiumofsequences)和在相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)經(jīng)過(guò)廣泛預(yù)先計(jì)算的蛋白質(zhì)組學(xué)預(yù)測(cè)(http:〃unison-db.org)。Unison計(jì)劃、非專(zhuān)有數(shù)據(jù)和預(yù)測(cè)、工具和互聯(lián)網(wǎng)界面已經(jīng)AcademicFreeLicense授權(quán)發(fā)布，并且可以從http:〃unison-db.org/下載或使用。在本研究進(jìn)行時(shí)，Unison包括650萬(wàn)個(gè)不同序列，包括136,655個(gè)不同斑馬魚(yú)序列，其來(lái)自RefSeq數(shù)據(jù)庫(kù)(Wheeler等，Nucl.AcidRes.34:D173-180(2006》、UniProt/Swiss-Pro和UniProt/TrEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)(Wu,Nucl.AcidsRes.34:Dl87-191(2006))、及Ensembl版本35(Birney等，NucleicAcidsRes.34:D556-561(2006》。(2)用于Bcl-2和BH結(jié)構(gòu)域的定制隱蔽馬爾科夫模型的構(gòu)建從PROSITE樣式和矩陣構(gòu)建了多重序列比對(duì)(Sigrist等，BriefBioinform.3:265-274(2002))。對(duì)于樣式PS01080(BH1)、PS01258(BH2)、PS01259(BH3)和PS01260(BH4)，并且對(duì)于矩陣PS50063(BH4)，將假陰性序列手動(dòng)摻入得自PROSITE網(wǎng)站(http:〃us.expasy.org/cgi-bin/nicedoc.popdoc00829)的真陽(yáng)性序列的比對(duì)。對(duì)于PS50062(Bcl-2)矩陣，對(duì)所述三個(gè)假陰性的手動(dòng)比對(duì)不明顯，因此只使用了真陽(yáng)性。使用來(lái)自HMMERv.23.2的hmmbuild(隱蔽馬爾科夫模型建立)和hmmcalibrate(隱蔽馬爾科夫模型校準(zhǔn))程序(Eddy,Bioinformatics14:755-763(1998))，結(jié)合缺省自變量，將所述比對(duì)用于建立"總體，，隱蔽馬爾科夫模型(HMM)。為了評(píng)估查全率(recall)和查準(zhǔn)率(precision)，也為了測(cè)定合適的得分閾值，將六個(gè)構(gòu)建的HMM與UniProt/Swiss-Prot序列數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)(圖1)。結(jié)果證明了所構(gòu)建的HMM在合適的得分閾值下具有改進(jìn)的查全率且不損失查準(zhǔn)率。從該結(jié)果如下選才奪HMM比^^H尋分截留值BH1:21;BH2'.13;BH3:12;BH4:22;BH4矩陣20;和Bcl2矩P車(chē)20。4吏用Unison的基于蔟的更新才匡架(cluster-basedupdateframework)對(duì)全吾卩136,655個(gè)斑馬魚(yú)序列運(yùn)行hmmsearch(隱蔽馬爾科夫才莫型搜索)結(jié)果。計(jì)算對(duì)全部斑馬魚(yú)序列的HMM比對(duì)并且使用Unison的自動(dòng)更新工具加載入U(xiǎn)nison的內(nèi)部拷貝。還使用TMHMMv.2.0c(Krogh等，J.Mol.Biol.305:567-580(2001))以缺省選項(xiàng)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析。一旦加載了結(jié)果，基于特征的揮)戶(hù)即會(huì)牽涉框架化SQL查詢(xún)以呈現(xiàn)預(yù)先計(jì)算的蛋白組學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果的合理結(jié)合(conjugation)。使用以上定義的得分標(biāo)準(zhǔn)創(chuàng)建查詢(xún)來(lái)鑒定與任何HMM比對(duì)的全部斑馬魚(yú)序列。該查詢(xún)鑒定出每一個(gè)與已知的Bcl-2家族成員在基因組上有交疊的序列。進(jìn)一步分析了四個(gè)最有希望的候選基因，先前未將這些基因鑒定為5妊馬魚(yú)Bcl-2家族成員。實(shí)施例2:所鑒定序列的分析進(jìn)一步分析每個(gè)推定的Bcl-2相關(guān)("B2R")斑馬魚(yú)基因(實(shí)施例l(a)中描述的自BLAST搜索鑒定的ENSDARP0000040899和XP—693331，和實(shí)施例l(b)中描述的自基于特征的探礦鑒定的ENSDARP00000066976、FGENESH00000065416、FGENESH00000065416和FGENESH00000082230)以指派具體身份，即作為Bcl-2家族的特定成員。對(duì)每個(gè)序列進(jìn)行BLAST搜索，并且與最同源的已鑒定的序列比對(duì)，得到e值、得分、百分比同一性和百分比覆蓋率(參見(jiàn)表2)。測(cè)定在所編碼蛋白質(zhì)內(nèi)推定的跨膜結(jié)構(gòu)域的存在或缺失。還檢查了斑馬魚(yú)基因組內(nèi)的鄰近基因，從而能評(píng)估任何保守的同線(xiàn)性(參見(jiàn)表2)。a.zBak(ENSDARP00000040899)Bax在51%的序列上是33%同一的，具有l(wèi)e-14的e值(參見(jiàn)表2)。ENSDARP00000040899的氨基酸序列及其編碼核苷酸序列如下所示。ENSDARP00000040899:FIVSRFQKT(SEQIDNO:1)ENSDARG00000030881:TACTGCTGGGTGGCTTCATCGTCTCGAGATTTCAGAAAACCTGA(SEQIDN0:2)Ensembl將ENSDARP00000040899注釋為假設(shè)的，沒(méi)有歸于任何身^f分。沒(méi)有PROSITEBH樣式可與該序列比對(duì)。在實(shí)施例l(b)構(gòu)建的各HMM中，Bcl-2、BH1、BH2和BH3HMM各自與該序列比對(duì)，這些比對(duì)具有分別為33、14、6.1和2.4的得分,以及分別為7.5e-7、0.031、110和1300的e值。還將該序列與數(shù)種已知的或建議的(proposed)Bcl-2家族成員的BH3結(jié)構(gòu)域比對(duì)，并且使用Jalview2.05(Clamp等，Bioinformatics12:426-427(2004))檢查(圖2)。盡管BH3HMM與ENSDAR00000040899的比對(duì)纟尋分不佳，但是該序列顯示出與其它Bcl-2家族成員BH3結(jié)構(gòu)域在性質(zhì)上的良好相似性，以及在全部非保守的位置上看似合理的(plausible)氨基酸替代(參見(jiàn)圖2)。TMHMM分析還預(yù)測(cè)了所述序列在大約氨基酸180-202含有跨膜結(jié)構(gòu)域。通過(guò)使用公眾可獲得的ENSEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)(在ww.ensembl.org上可得到；Birney等，NucleicAcidsRes.34:D556-561(2006》，將斑馬魚(yú)基因的側(cè)翼基因與人功能性同系物的側(cè)翼基因比較，來(lái)檢查ENSDAR00000040899和本文描述的全部其它序列是否存在保守同線(xiàn)性關(guān)系。若在斑馬魚(yú)基因的一側(cè)或兩側(cè)存在多于一個(gè)側(cè)翼基因具有同樣在人基因側(cè)翼的人等同物，則認(rèn)定該斑馬魚(yú)基因與人基因享有保守同線(xiàn)性關(guān)系。ENSDAR00000040899與人Bak不呈保守同線(xiàn)性關(guān)系，但是與人Bax為保守同線(xiàn)性關(guān)系。ENSDAR00000040899還包含在候選斑馬魚(yú)Bcl-2家族成員針對(duì)人Bcl-2序列的比對(duì)以及反向的比對(duì)中，使用BLAST來(lái)鑒定互逆最佳BLAST比對(duì)(reciprocalbestBLASTalignment)、成對(duì)同一'l"生(pairwiseidentify)和比乂于;f隻蓋率(alignmentcoverage)(表2)。盡管候選序列與人Bax的比對(duì)獲得了最佳e值，但是最佳的整體序列覆蓋率卻由與人Bak的比對(duì)獲得。盡管BH2和BH3HMM比對(duì)的得分不突出，但是將以下結(jié)果結(jié)合在一起，即在Bcl-2和BHl的得分出眾的背景下存在這些結(jié)構(gòu)域，不存在預(yù)測(cè)的BH4結(jié)構(gòu)域，BH3結(jié)構(gòu)域與其它Bcl-2成員的BH3結(jié)構(gòu)域有相似性，預(yù)測(cè)有TM結(jié)構(gòu)域，以及互逆BLAST分析，則說(shuō)明ENSDAR00000040899是Bcl-2家族的促凋亡成員，最可能是Bak的功能同系物。b.zBad2(XP一693331)如實(shí)施例1(a)所述，通過(guò)BLAST搜索定制的斑馬魚(yú)序列數(shù)據(jù)庫(kù)還鑒定了XP693331。XP693331的氨基酸序列和編碼它的mRNA序列如下所示。XP693331:(SEQIDNO:3)XM_688239(核苦酸367-804):CAGAGAATGA(SEQIDN0:4)XP一693331的GenBank注釋預(yù)測(cè)該序列與僅含BH3的促凋亡蛋白Bad相似。XP一693331與人Bad的比對(duì)顯示這兩種蛋白質(zhì)在72。/。的序列上具有33。/o同一性。相對(duì)于BH3結(jié)構(gòu)域的HMMer得分是12.6，e值為1.3。對(duì)XP—693331的TMHMM分析顯示預(yù)測(cè)在該序列中沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域，與人Bad類(lèi)似。獲得了XP—69333l的克隆(OpenBiosystems),并且在斑馬魚(yú)基因組內(nèi)鑒定了周?chē)男蛄?。與XP—693331相鄰的基因不同于與人Bad相鄰的基因，因此XP—693331與人Bad沒(méi)有保守同線(xiàn)性關(guān)系。然而，先前將另一個(gè)斑馬魚(yú)基因(AI332008)鑒定為與人Bad具有顯著同源性并且與人bad是同線(xiàn)性的(Inohara和Nunez，CellDeathDiff.7:509-510(2000);Coultas等，CellDeathDiff.9:1163-1166(2002》。XP一693331與所述先前鑒定的序列是大約32。/。同一的。因此，上述數(shù)據(jù)說(shuō)明XP一693331是與人Bad有關(guān)的Bcl-2家族成員。因?yàn)橄惹耙阎粋€(gè)與人Bad具有序列相似性和保守同線(xiàn)性的斑馬魚(yú)基因，所以將XP—69333l命名為"zBad2，，，作為第二個(gè)與人Bad具有同一性的斑馬魚(yú)基因。c.zBik(ENSDARP00000066976)通過(guò)如實(shí)施例1(b)所述基于特征的數(shù)據(jù)庫(kù)探礦將斑馬魚(yú)序列ENSDARP00000066976鑒定為B2R蛋白。ENSDARP00000066976的氨基酸序列和編碼它的核苷酸序列如下所示。ENSDARP00000066976:WNEYEG(SEQIDNO:5)ENSDARG00000045549:TGTAAACTGGAATGAGTATGAAGGCTGA(SEQIDNO:6)BLAST搜索定制的斑馬魚(yú)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(如實(shí)施例1(a)中所述)未鑒定出ENSDARP00000066976。對(duì)該序列的TMHMM分析預(yù)測(cè)了跨膜結(jié)構(gòu)域的存在，自大約氨基酸130-149。ENSDARP00000066976與BH1、BH2和BH4HMM不匹配。該序列確實(shí)與BH3HMM匹配，得分為18，e值為0.023。BH3相關(guān)區(qū)和跨膜結(jié)構(gòu)域的存在以及BH1、BH2和BH4相關(guān)區(qū)的缺失說(shuō)明了ENSDARP00000066976可能是Bcl-2蛋白中促凋亡的僅含BH3的亞家族的成貝。斑馬魚(yú)基因組中的ENSDARP00000066976序列與人Bik享有保守同線(xiàn)性關(guān)系。將ENSDARP00000066976推定的BH3區(qū)與先前已知的人斑馬魚(yú)Bcl-2基因比較(參見(jiàn)圖2)。ENSDARP00000066976的BH3結(jié)構(gòu)域與人Bid的BH3結(jié)構(gòu)域最相似，盡管與人Bik具有同線(xiàn)性和BLAST相似性(圖3B)。然而，基于對(duì)兩個(gè)序列的比較，ENSDARP00000066976缺乏推定的胱天蛋白酶切割位點(diǎn)，而人Bid含有該位點(diǎn)。BH3結(jié)構(gòu)域的存在、BH結(jié)構(gòu)域的缺失、對(duì)跨膜結(jié)98構(gòu)域的預(yù)測(cè)、整體的序列相似性、和同線(xiàn)性關(guān)系分析均說(shuō)明了Bcl-2亞家族成員。d.zBim(FGENESH00000065416)通過(guò)如實(shí)施例l(b)所述基于特征的數(shù)據(jù)庫(kù)探礦將斑馬魚(yú)序列FGENESH00000065416鑒定為B2R蛋白。BLAST搜索定制的斑馬魚(yú)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(如實(shí)施例l(a)所述)未鑒定出FGENESH00000065416。FGENESH00000065416與BH1、BH2和BH4HMM不匹配。該序列確實(shí)與BH3HMM匹配，得分為18，e值為0.023。BH3相關(guān)區(qū)和跨膜結(jié)構(gòu)域的存在以及BH1、BH2和BH4相關(guān)區(qū)的缺失說(shuō)明了FGENESH00000065416可能是Bcl-2蛋白中促凋亡的僅含BH3的亞家族的成員。與FGENESH00000065416序列的BLAST比對(duì)顯示，該序列N-末端的一半與人Bim在人Bim的47。/。上是32。/。同一的，e值為9e-7，進(jìn)一步支持了3夸FGENESH00000065416認(rèn)定為Bcl-2蛋白中促凋亡的僅含BH3的亞家族的成員。然而，F(xiàn)GENESH00000065416的C-末端的一半與發(fā)育調(diào)控的RNA結(jié)合蛋白1最相似(32%同一性)，發(fā)育調(diào)控的RNA結(jié)合蛋白l是小鼠和大鼠的RNA結(jié)合蛋白，推定與神經(jīng)發(fā)育有關(guān)。在同一連續(xù)區(qū)域內(nèi)并列有Bim同源性和與無(wú)關(guān)蛋白/功能的同源性可能歸因于斑馬魚(yú)基因組內(nèi)的裝配錯(cuò)誤。事實(shí)上，無(wú)法從所述完整序列或單獨(dú)的Bim樣片段擴(kuò)增RNA產(chǎn)物。盡管存在明顯的裝配錯(cuò)誤，但是BH3結(jié)構(gòu)域的存在、其它BH結(jié)構(gòu)域的缺失、和序列相似性說(shuō)明了至少FGENESH00000065416的N-末端部分與人Bim同源。e.zPuma(FGENESH00000078270)通過(guò)如實(shí)施例1(b)所述基于特征的數(shù)據(jù)庫(kù)探礦將斑馬魚(yú)序列FGENESH00000078270鑒定為B2R蛋白。FGENESH00000078270的氨基酸序列和編碼它的核苷酸序列(登錄號(hào)CN323956)如下所示。FGENESH00000078270:99LVSDT歸LYQHGLR(SEQIDNO:7)FGENESH00000078270:GACACCATCAATGCCCTCTACCAGCACGGCCTCAGATGA(SEQIDNO:8)BLAST搜索定制的斑馬魚(yú)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(如實(shí)施例l(a)所述)未鑒定出FGENESH00000078270。TMHMM分析預(yù)測(cè)此序列無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)威。FGENESH00000078270與BHl、BH2和BH4HMM不匹配。該序列確實(shí)與BH3HMM匹配，得分為13,e值為0.77。根據(jù)BLAST比對(duì)，F(xiàn)GENESH00000078270與人Puma相似，顯示出25%的同一性和2.1el的e值。對(duì)斑馬魚(yú)基因組中FGENESH00000078270周?chē)幕虻蔫b定說(shuō)明了FGENESH00000078270與人Puma享有保守同線(xiàn)性關(guān)系。BH3相關(guān)區(qū)的存在以及BH1、BH2和BH4相關(guān)區(qū)和跨膜結(jié)構(gòu)域的缺失，再結(jié)合序列相似性和保守同線(xiàn)性，有力地說(shuō)明了FGENESH00000078270是Bel-2蛋白中促凋亡的僅含BH3的亞家族的成員，更具體而言與人Puma直向同源。f.zBmf2(FGENESH00000082230)通過(guò)如實(shí)施例l(b)所述基于特征的數(shù)據(jù)庫(kù)探礦將斑馬魚(yú)序列FGENESH00000082230鑒定為B2R蛋白。FGENESH00000082230的氨基酉餅列和編碼它的核苷酸序列如下所示。FGENESH00000082230:RDAGISVEVQIGRKLREMGDQFQQEHLQLIILDETRYRI(SEQIDNO:9)FGENESH00000082230:CTGATTATATTAGATGAAACCAGATACAGGATTTAA(SEQIDNO:10)BLAST搜索定制的斑馬魚(yú)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(如實(shí)施例1(a))所述未鑒定出FGENESH00000082230。TMHMM分析預(yù)測(cè)此序列無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。FGENESH00000082230與BH1、BH2和BH4HMM不匹配。該序列確實(shí)與BH3HMM匹配，得分為18.6，e值為0.02。根據(jù)BLAST比對(duì)，F(xiàn)GENESH00000082230與人Bmf相似(在該分子的42。/。上有41。/。同一性，e值為2.1el)。比對(duì)還顯示了FGENESH00000082230含有推定的動(dòng)力蛋白輕鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域，類(lèi)似于人Bmf(Day等，BiochemJ,377:597-605(2004))。對(duì)斑馬魚(yú)基因組中FGENESH00000082230周?chē)幕虻蔫b定說(shuō)明了FGENESH00000082230與人Bmf還享有保守同線(xiàn)性關(guān)系。BH3相關(guān)區(qū)的存在以及BH1、BH2和BH4相關(guān)區(qū)和跨膜結(jié)構(gòu)域的缺失，再結(jié)合序列相似性和保守同線(xiàn)性，有力地說(shuō)明了FGENESH00000082230是Bcl-2蛋白中促凋亡的僅含BH3的亞家族的成員，更具體而言與人Bmf直向同源。已經(jīng)在斑馬魚(yú)中鑒定了與人Bmf同源的另一個(gè)斑馬魚(yú)基因(Coultas等，CellDeathDiff.9:1163-1166(2002);登錄號(hào)BI891121)。但是該基因與人Bmf不享有保守同線(xiàn)性，不像FGENESH00000082230。FGENESH00000082230和BI891121之間的相似性在該分子的27%上為43%。因此，將FGENESH00000082230命名為zBmf2以將其與較早鑒定的基因區(qū)別開(kāi)來(lái)。表2:斑馬魚(yú)中推定的Bcl-2家族成員的特征指派蛋白質(zhì)登錄號(hào)e值得分%同一性%覆蓋率人基因是否為同線(xiàn)性zBimFGENESH000000654169e-7553247Bim是zBakENSDARP000000408994e-5502586Bak否le-14813351Bax曰疋zBaxENSDARP000000236872e陽(yáng)6542968Bak否2e陽(yáng)471895198Bax否zBikENSDARP00000066976L41e4204712Bik是zPumaFGENESH000000782702.1el302549Puma是zBmf2FGENESH000000822300.011424142Bmf是zBad2XP6933318e-12643372Bad否g.關(guān)于斑馬魚(yú)B2R基因的綜合觀察總的來(lái)說(shuō)，先前已知的和本文鑒定的Bcl-2家族基因的斑馬魚(yú)同系物與它102們的人對(duì)應(yīng)物非常相像(表3),其中多結(jié)構(gòu)域Bcl-2家族成員具有最高的相似程度(圖3A)。僅含BH3的斑馬魚(yú)蛋白與人基因趨異最大(圖3A)，整體相似性范圍從27%(zPuma)到46。/。(zBad和zBmf2)(參見(jiàn)表3)。但是，已知的是僅含BH3的蛋白與脊推動(dòng)物Bcl-2亞家族趨異最大。而就BH3結(jié)構(gòu)域本身觀察到了程度高得多的相似性，范圍在66-79%(表3;圖邛)。表3:斑馬魚(yú)和人B2R蛋白的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table>ND表示未測(cè)定。括號(hào)內(nèi)的百分比表示僅就BH3結(jié)構(gòu)域內(nèi)的。/o同源性。實(shí)施例3:Bcl-2候選基因的實(shí)驗(yàn)^^iE實(shí)施例1和2中的研究論證了以上鑒定的蛋白質(zhì)與某些Bcl-2家族成員享有同源性，并且可能是內(nèi)在凋亡途徑的成員。為了確認(rèn)這些命名指派，在斑馬魚(yú)中評(píng)估每個(gè)蛋白質(zhì)的功能。a.斑馬魚(yú)B2Rj^因的表ii^式為了評(píng)估先前已知的和本文鑒定的斑馬魚(yú)B2R蛋白的正常表達(dá)，在特定發(fā)育階段和特定成體組織中通過(guò)RT-PCR分析編碼各個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA(圖3C和3D)。從斑馬魚(yú)國(guó)際資源中心(ZebrafishInternationalResourceCenter)獲得成體圖賓根長(zhǎng)鰭魚(yú)(Tubingenlong-fmfish)。魚(yú)的祠養(yǎng)依照斑馬魚(yú)手冊(cè)(Westerfield，TheZebrafishBook.Aguideforthelaboratoryuseofzebrafish(Daniorerio),第4版，Univ.ofOregonPress,Eugene(2000))進(jìn)行。依照制造商的說(shuō)明書(shū)，在指定的時(shí)間點(diǎn)從脫去絨毛膜的野生型斑馬魚(yú)胚胎分離了RNA(100ng),使用QiaShredder(Qiagen)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，繼而用RNAeasyMini試劑盒(Qiagen)純化，使用DNA酶I消化。從成體雌性斑馬魚(yú)分離了成體組織，以類(lèi)似于從胚胎組織提取的方式從這些組織提取了RNA(50ng)。將GAPDH作為輸入RNA量(amountofinputRNA)的對(duì)照包括在內(nèi)。在0.8。/。的e凝膠(e-gel，Invitrogen)上解析所得產(chǎn)物并照相。除了zBik和zBok,所有所檢驗(yàn)的斑馬魚(yú)B2R基因均進(jìn)行母體表達(dá)(在1000個(gè)細(xì)胞的階段)(圖3C)。在合子轉(zhuǎn)錄起始之后(受精后大約5小時(shí))，以相當(dāng)一f丈的(consistent)7K平表達(dá)了zBadl、zBik、zBad、zBmfl、zNoxa、zBax、zMcl陽(yáng)la、zMcl-lb、zBlpl和zNR13(圖3C)。相反，zBak、zBmf2和zBlp2的轉(zhuǎn)錄顯著降低，之后在發(fā)育中的晚些時(shí)候再次升高(圖3C)。zBok2進(jìn)行了強(qiáng)烈的母體表達(dá)，但是在稍后的胚胎發(fā)育中基本上不存在(圖3C)。在所檢驗(yàn)的七種成體斑馬魚(yú)組織中，卵巢顯示出了對(duì)每個(gè)基因的大量轉(zhuǎn)錄，P余了zBmf2(圖3D)。相反，肝僅顯示出了對(duì)zBid、zMcl-la和zMcl-lb的微弱表達(dá)(圖3D)。斑馬魚(yú)僅含BH3的基因中的數(shù)個(gè)僅在少數(shù)幾種組織中表達(dá)(圖3D)。b.推定的斑馬魚(yú)B2R蛋白的體內(nèi)凋亡效應(yīng)對(duì)每種先前已知的和本文鑒定的斑馬魚(yú)B2R基因激活內(nèi)在凋亡途徑的能力進(jìn)行了評(píng)估。使用標(biāo)準(zhǔn)方案將斑馬魚(yú)cDNA定向克隆入表達(dá)載體pCS108(Fletcher等，GeneExpr.Patterns5(2):225-30(2004);http:〃tropicalis.berkeley.edu/home/genomic_resources/Ests/vectors/csl08.pdf.，日期為2001年8月13日)。用于克隆的引物如下(均為5，到3，)zBak正向GGGGGTTGTTGTAAAGTACAGTGO(SEQIDNO:65)zBak反向TCAGGTTTTCTGAAATCTCGAGACG(SEQIDNO:66)zBik正向ACTGTACTGAGACACATCACAGCAACA(SEQIDNO:67)zBik反向TCAGCCTTCATACTCATTCCAG(SEQIDNO:68)zPuma正向CTAACTGAGTACTCATCTAATGAATTAACACCGCT(SEQIDNO:69)zPuma反向TCATCTGAGGCCGTGCTGGTAGAG(SEQIDNO:70)zBmfl正向ATGGATGAGGACGAGGATGAT(SEQIDNO:71)zBmfl反向TCACCTGCGGTTCTCTCTG(SEQIDNO:72)zBmf2正向ATGGATGATGAGGAGGATGAAC(SEQIDNO:73)zBmf2反向TTAAATCCTGTATCTGGTTTCATCTA(SEQIDNO:74)zBadl正向CTTCCACAACACTTCCACTGGATAC(SEQIDNO:75)zBadl反向TTCACTGTCAGTCACTCTGCGGGGC(SEQIDNO:76)zBlpl正向GCCGAATTCCACCATGTCTTACTATAACCGAGAACTG(SEQIDNO:77)zBlpl反向GGCCTCGAGTCACAGGCGTTTCTGTGCAATGAGTCC(SEQIDNO:78)zBlp2正向ATGGCTAACGAAATTAGC(SEQIDNO:79)zBlp2反向TCACTTCTGAGCAAAAAAGGC(SEQIDNO:80)zBok1正向ATGGAGATGTTGCGCCGCT(SEQIDNO:81)zBokl反向TCATTTCTCTCTCAGCAGGTAGAAAAC(SEQIDNO:82)zBok2正向ATGAACGTGTTCGCGCGCT(SEQIDNO:83)zBok2反向GCGCAAGTCTACTTCGTCAGGTA(SEQIDNO:84)zMcl-la正向AAGGGGCTGCAGCTGGACG(SEQIDNO:85)zMcl-la反向AGCGGGGCTCAGGTCAGTACAG(SEQIDNO:86)zMcl-1b正向CATCTTCGATTGATTTGATT(SEQIDNO:87)zMcl-lb反向ATAGTTTGAAAGTTCTGAATCC(SEQIDNO:88)zNRl3正向ATGTCCTGTTGGTTGAGGG(SEQIDNO:89)zNRl3反向TCAGCGTACTAAGAGGAAGGT(SEQIDNO:90)zBad2的克隆從OpenBiosystems獲得。通過(guò)AmbionmMessagemMachineTM(Ambion)依照制造商的i兌明生成zBid、zBadl、zBmfl、zBmf2、zPuma、zBik、zNoxa、zBak和zBax的力口巾冒合成mRNA，并經(jīng)由NucAway離心柱(spincolumn)(Ambion)純化。將所4尋信^f吏RNA在含0.2。/o酚紅的lxDanieu氏溶液中稀釋至適當(dāng)濃度(范圍在O.llmg/mL至3.5x10—5mg/mL)。給l-4細(xì)胞階段的胚胎使用Nanoliter2000(WorldPrecisionInstruments)微量注射器注射4.6nL所述稀釋的mRNA溶液。賦予(castto)卵裂球的淡粉色是來(lái)自注射溶液的殘留酚紅。注射編碼大多數(shù)僅含BH3的促凋亡蛋白或多結(jié)構(gòu)域促凋亡Bcl-2蛋白的合成mRNA導(dǎo)致了劑量依賴(lài)性凋亡，其特征在于卯裂球和印黃細(xì)胞的裂變(圖4A和4B)。在注射了多至500pg這些合成mRNA的早期胚胎中，zBad、zBokl和zBok2未誘導(dǎo)顯著的凋亡。為了確認(rèn)斑馬魚(yú)促凋亡B2R基因的異位表達(dá)通過(guò)調(diào)用(engage)凋亡途徑殺死了胚胎，給胚胎注射低劑量的各種合成mRNA,并通過(guò)免疫組織化學(xué)來(lái)監(jiān)測(cè)凋亡效應(yīng)物胱天蛋白酶-3的活化程度。在1-4細(xì)胞階段給斑馬魚(yú)胚胎注射500pgGFP、500pgzBad、100pgzBid、20pgzBik、0.8pgzBmfl、4pgzBmf2、20pgzNoxa、20pgzP飄a、20pgzBak或20pgzBax。將經(jīng)注射的胚胎在受精后10小時(shí)在4%多聚曱醛的PBS溶液中在室溫固定大約4小時(shí)或在4。C固定過(guò)夜。接著將胚胎在曱醇中脫水至少2小時(shí)。再水化之后，用水洗滌胚胎，在丙酮中于-20。C透化7分鐘，再次用水洗滌。將胚胎用含有0.5。/。Tween的PBS(PBST)再洗滌幾次。將洗過(guò)的胚胎在含有5%胎牛血清、2mg/mLBSA的PBST中在室溫封閉2小時(shí)。將胚胎與按照1:500在封閉溶液中稀釋的家兔抗活化胱天蛋白酶-3抗體(Pharmingen)—起在4。C溫育過(guò)夜。其后將胚胎在PBST中洗滌幾次，之后與按照1:500在封閉溶液中稀釋的二抗在室溫溫育2小時(shí)，所述二抗為山羊抗家兔Cy3(JacksonImmunology)。再用PBST洗涂胚胎，之后用LeicaMZFL3熒光顯《數(shù)鏡顯像。與野生型和模擬注射的(mock-injected)胚胎相比，促凋亡B2R蛋白的異位表達(dá)導(dǎo)致了胱天蛋白酶-3活性的劇烈升高，說(shuō)明了Bax樣和僅含BH3的B2R蛋白的異位表達(dá)啟動(dòng)了斑馬魚(yú)胚胎中的凋亡程序(圖4C)。僅有的例外是zBad、zBokl和zBok2,它們?cè)诋愇槐磉_(dá)時(shí)同樣沒(méi)有啟動(dòng)凋亡(圖4A和4C)。c.斑馬魚(yú)B2R蛋白誘導(dǎo)的凋亡的拯救如果斑馬魚(yú)胚胎中斑馬魚(yú)促凋亡B2R蛋白的異位表達(dá)經(jīng)由類(lèi)似于哺乳動(dòng)物凋亡途徑的機(jī)制誘導(dǎo)了凋亡，那么應(yīng)該有可能通過(guò)共表達(dá)促存活B2R蛋白來(lái)防止致死。使用實(shí)施例3(b)中所列的引物和方案克隆了zMcl-la、zMcl-lb、zBlpl和zBlp2中的每一個(gè)。同樣依照實(shí)施例3(b)中所述的方案，為zMcl-la、zMcl-lb、zBlpl和zBlp2中的每一個(gè)制備了合成mRNA，并共注射入斑馬魚(yú)胚胎，B2R蛋白mRNA注射量如下500pg每種促存活mRNA、500pgzBid、20pgzBmfl、100pgzBmf2、50pgzNoxa、100pgzBik、100pgzPuma、100pgzBax和100pgzBak。結(jié)果示于圖4D。與zMcl-la、zMcl-lb、zBlpl或zBlp2的共表達(dá)拯救了因zBid、zBik、zBmfl、zBmf2、zNoxa、zPuma或zBax的異位表達(dá)而誘導(dǎo)的凋亡(圖4D)。然而，zBak的異位表達(dá)得到了與zMcl-la、zMcl-lb或zBlpl的共表達(dá)的拯救，而未得到與zBlp2的共表達(dá)的拯救(圖4D)，說(shuō)明了zBak不與zBlp2進(jìn)行相互作用。人Blp2是已知的Bc1-2同系物。先前的研究已經(jīng)表明人Bak不與人Bcl-2進(jìn)行相互作用。因此，zBlp2無(wú)法拯救zBak誘導(dǎo)的凋亡進(jìn)一步支持了將ENSDARP00000040899定為人zBak的斑馬魚(yú)直向同系物的指派。d.體內(nèi)響應(yīng)于伽馬輻射的斑馬魚(yú)B2R^因?yàn)榱苏{(diào)查斑馬魚(yú)B2R基因在對(duì)外源凋亡刺激物的應(yīng)答中的作用，對(duì)胚胎進(jìn)行伽馬照射。已知伽馬照射在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中經(jīng)由內(nèi)在途徑觸發(fā)凋亡，導(dǎo)致胱天蛋白酶-3活性以p53依賴(lài)性方式升高(Gong等，CellGrowthDiffer.10(7):491-502(1999))。因此對(duì)斑馬魚(yú)促存活分子保護(hù)斑馬魚(yú)胚胎免于伽馬輻射介導(dǎo)的凋亡的能力進(jìn)行了檢查。在受精后大約7小時(shí)在lmL胚胎培養(yǎng)基中用50Gy伽馬照射劑量照射胚胎。其后將胚胎移至組織培養(yǎng)皿中極大量的胚胎培養(yǎng)基中并在28.5。C溫育直至進(jìn)一步的分析。每種斑馬魚(yú)促存活B2R基因(zBlpl、zMcl-la、zMcl-lb和zBlp2)的異位表達(dá)，如實(shí)施例3(b)中所述(調(diào)整為500pg注射)，保護(hù)了胚胎免于伽馬照射誘導(dǎo)的凋亡(圖5A)。因此伽馬輻射經(jīng)由內(nèi)在途徑觸發(fā)了斑馬魚(yú)胚胎中的凋亡，類(lèi)似于其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的效應(yīng)。為了測(cè)定哪些斑馬魚(yú)B2R基因負(fù)責(zé)介導(dǎo)伽馬輻射對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的凋亡效應(yīng)，使用嗎啉代方法對(duì)促凋亡B2R斑馬魚(yú)基因進(jìn)行了翻譯敲低?；谒鼈兿P(guān)聯(lián)mRNA介導(dǎo)的拯救異位表達(dá)的zNoxa的能力，對(duì)每種促存活B2R^因的嗎啉代進(jìn)行選擇?；谒鼈冋汝P(guān)聯(lián)mRNA異位表達(dá)的能力，對(duì)每種促凋亡B2R基因的嗎啉代進(jìn)行選擇。由于對(duì)于zBokl、zBok2或zBad無(wú)法驗(yàn)證嗎啉代的功效(因?yàn)檫@些基因在異位表達(dá)時(shí)未誘導(dǎo)凋亡，參見(jiàn)圖4A和4C),在敲低分析中不包括這些基因。嗎啉代設(shè)計(jì)在每種轉(zhuǎn)錄物的翻譯起始位點(diǎn)周?chē)?Nasevicius和Ekker，Nat.Genet.26:216-220(2000》，并從GeneTools獲得。嗎啉代("MO")序列如下(均為5'至3，)zMcl-laMO:GCCTAAAATCCAAACTCAGAGCCAT(SEQIDNO:91)zMcl-lbMO:TGTCGTTGTTTCTTCCAGCGAACAT(SEQIDNO:92)zBlplMO:AGGTTGTTGCTCGTTCTCCGATGTC(SEQIDNO:93)zBlp2MO:GTCATAGCTAATTTCGTTAGCCATG(SEQIDNO:94)zBaxMO:TGAAAATAAGCGAACTGAAGAAGAC(SEQIDNO:95)zBakMO:ATTTTTCGGCTAAAACGTGTATGGG(SEQIDNO:96)zBidMO:GGTCAAAGTTCCTGTTGAAGTCCAT(SEQIDNO:97)zBmfMO:ACACATCATCCTCGTCCTCATCCAT(SEQIDNO:98)zNoxaMO:CTTTCTTCGCCATTTCAGCAAGTTT(SEQIDNO:99)zPumaMO:TGCTTTCCATCTCTGGTCGGGCCAT(SEQIDNO:100)zBikMO:CTACAAACAAGGACACAATGGTGGA(SEQIDNO:101)p53MO:GCGCCATTGCTTTGCAAGAAT丁G(SEQIDNO:102)對(duì)照MO:CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA(SEQIDNQ:103)對(duì)照嗎啉代設(shè)計(jì)成恢復(fù)正常人(3珠蛋白mRNA序列信息，其含有突變的卩珠蛋白生成障礙性貧血(betathalassemia)剪接位點(diǎn)，并且預(yù)期這種對(duì)照嗎啉代在斑馬魚(yú)胚胎中沒(méi)有效果。p53嗎啉代依照Langheinrich等，Curr.Biol.I2:2023-2028(2002)。將嗎啉代在1XDanieu氏溶液十0.2。/。酚紅中稀釋至lmg/mL。注射總共4.6ng或9.2ng嗎啉代。在使用了兩種嗎啉代的組合的實(shí)驗(yàn)中，每種嗎啉代注射4.6ng。當(dāng)實(shí)驗(yàn)包括與雙重嗎啉代注射樣品的比較時(shí)，向單一嗎啉代注射添加額外的4.6ng對(duì)照嗎啉代，使得每種樣品均注射9.2ng嗎啉代。使用Nanoliter2000(WorldPrecisionInstruments)微量注射器給l-4細(xì)胞階段的胚胎注射4.6nL稀釋的嗎啉代。在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞類(lèi)型中，需要Bax或Bak來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)大多數(shù)凋亡刺激物(Wei等，Science292:727-730(2001》。為了測(cè)定zBax和zBal(在斑馬魚(yú)中是否在功能上是冗余的，將針對(duì)zBax和zBak的嗎啉代單獨(dú)地或成對(duì)地注射入胚108胎，繼而對(duì)胚胎進(jìn)行伽馬照射。zBax的翻譯敲低足以保護(hù)胚胎免受伽馬輻射的影響(圖5B和5C)。在小部分的卵(clutches)中，需要zBax和zBak二者的敲J氐來(lái)消除伽馬照射誘導(dǎo)的胱天蛋白酶-3活化。一些胱天蛋白酶-3活性保留在了注射了zBax和zBak嗎啉代的經(jīng)照射胚胎中(圖5B和5C)，可能是因?yàn)椴煌耆那玫突蚺咛ブ写嬖诘哪阁w蛋白質(zhì)的功能。zBax似乎主要負(fù)責(zé)響應(yīng)于伽馬照射來(lái)執(zhí)行凋亡程序。數(shù)種僅含BH3的促凋亡基因的翻譯敲低揭示了當(dāng)zPuma翻譯受損時(shí)，胱天蛋白酶-3的活化響應(yīng)于伽馬照射而劇烈降低(圖5D)。zNoxa受損也大大降低了胱天蛋白酶-3的活化，但并不像zPuma失活那樣徹底。這種效應(yīng)反映了p53敲低的保護(hù)作用(圖5E)，并且得到在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行的先前研究的支持，這些研究表明Puma是伽馬照射誘導(dǎo)的凋亡的主要介導(dǎo)物(Erlacher等，Blood106:4131-4138(2005);Jeffers等，CancerCell4:321-328(2003))。采取定量PCR分析來(lái)更好地了解zNoxa和zPuma在伽馬照射過(guò)程中的作用。使用7500RealTimePCRSystem(實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng))(AppliedBiosystems)依照制造商的說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行Taqma分析。用于每個(gè)基因的引物和探針序列如下所示(5，至3，)zGAPDH正向TGCGTTCGTCTCTGTAGATGT(SEQIDNO:104)zGAPDH反向GCCTGTGGAGTGACACTGA(SEQIDNO:105)zGAPDH探針TGTGTGTGTGTGTTAGTTTCTTTTGACAGTATTTG(SEQIDNO:106)zNoxa正向CGAACCTGTGACAGAAACTTG(SEQIDNO:107)zNoxa反向CTGCGCGCACTCTACTACA(SEQIDNO:108)zNoxa探針CGGTTTGCTCTTTCTTCGCCATTTC(SEQIDNO:109)zP畫(huà)正向GAACACACGGGTTACAAAAGAC(SEQIDNO:110)zP飄反向GAAAATTCCCAGAGTCTGTAAGTG(SEQIDNO:111)zP飄探針ACGAGTGCAGGCGCTCTCCTT(SEQIDNO:112)在受精后大約30分鐘收集胚胎并保持在胚胎培養(yǎng)基中用于進(jìn)一步的分析。使用OneStepRT-PCR試劑盒(Qiagen)依照制造商的說(shuō)明通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增了每種B2R基因的編碼區(qū)。對(duì)多個(gè)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序以核實(shí)正確的編碼序列。通過(guò)TopoTA(Invitrogen)克隆入質(zhì)粒pCRII(Invitrogen)來(lái)克隆每種擴(kuò)增序列。在受精后7小時(shí)用50Gy照射胚胎，并在受精后10小時(shí)收集RNA。定量PCR分析揭示了在zNoxa轉(zhuǎn)錄上調(diào)3-4倍時(shí)，zPuma轉(zhuǎn)錄響應(yīng)于伽馬照射上調(diào)了幾乎1OO倍(圖5F)。沒(méi)有其它斑馬魚(yú)的僅含BH3的基因顯示出響應(yīng)于伽馬照射的轉(zhuǎn)錄增加。zPuma的上調(diào)是p53依賴(lài)性的(圖5F)，使得p53的敲低降低了zPuma的上調(diào)。這說(shuō)明了在斑馬魚(yú)中伽馬照射誘導(dǎo)了p53活性，p53活性繼而在轉(zhuǎn)錄上上調(diào)了zPuma。已知在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中Puma上調(diào)可活化Bax和Bak(Liu等，Biochem.Biophys.Res.Commun.310(3):956-62(2003))，結(jié)合以上數(shù)據(jù)說(shuō)明zBax對(duì)于響應(yīng)于伽馬照射誘導(dǎo)凋亡是關(guān)鍵的。因此，伽馬照射斑馬魚(yú)胚胎觸發(fā)了內(nèi)在凋亡途徑，該途徑特別由p53、zPuma和zBax介導(dǎo)。e.在正常發(fā)育過(guò)程中敲低斑馬魚(yú)促存活B2R蛋白已經(jīng)確定了內(nèi)在凋亡途徑在斑馬魚(yú)中存在并有功能，將斑馬魚(yú)內(nèi)在凋亡途徑與已知的哺乳動(dòng)物內(nèi)在途徑系統(tǒng)比較。對(duì)斑馬魚(yú)促存活B2R基因進(jìn)行嗎啉代敲低，并監(jiān)測(cè)獲得的對(duì)發(fā)育中的胚胎的效應(yīng)。依照實(shí)施例3(d)中描述的方法學(xué)，使嗎啉代針對(duì)zMcl-la、zMcl-lb和zBlp2的翻譯起始位點(diǎn)。zBlp2的敲低對(duì)早期斑馬魚(yú)發(fā)育沒(méi)有明顯的影響(圖6A)。zBlp2敲低的魚(yú)的總體形態(tài)學(xué)正常。沒(méi)有因?yàn)閦Blp2敲低而存在胱天蛋白酶-3活性的升高。類(lèi)似地，zMcl-la或zMcl-lb的敲低也對(duì)魚(yú)胚胎的存活沒(méi)有明顯作用。然而，同時(shí)敲低zMcl-la和zMcl-lb導(dǎo)致了在受精后8小時(shí)可變的但卻是顯著的生存力降低(圖6A)。任一zMcl基因與zBlp2組合的成對(duì)敲低對(duì)存活沒(méi)有影響(圖6A)。因此，只有同時(shí)削弱zMcl-l的兩個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)錄才會(huì)顯著影響經(jīng)注射的斑馬魚(yú)胚胎的存活。值得注意的是，先前的研究已經(jīng)證明了在小鼠中哺乳動(dòng)物Mcl-l的葛tP余是才直入前至丈死的(pre-implantationlethal)(Rinkenberger等，GenesDev.14:23-27(2000》。f.斑馬魚(yú)促存活B2R蛋白和Apo2L信號(hào)傳導(dǎo)注射了zMcl-la和zMcl-lb嗎啉代二者的斑馬魚(yú)胚胎顯示出了大范圍(significantrange)的生存力(實(shí)施例3(e))。這種生存力的范圍似乎隨著一窩卵(clutch)的整體"健康"而改變。關(guān)于可變性的一種可能的解釋是zMcl-1a/b可能保護(hù)早期斑馬魚(yú)胚胎免受內(nèi)源或環(huán)境凋亡刺激。先前已經(jīng)暗示了Mcl-l在數(shù)種細(xì)胞系中介導(dǎo)對(duì)Apo2L誘導(dǎo)的凋亡的敏感性(Henson等，J.CellBiochem.89:1177-1192(2003);Taniai等，CancerRes.64:3517-3524(2004);Wirth等,CancerRes.65:7393-7402(2005);Kobayashi等，Gastroenterology128:2054-2065(2005))。因此，研究了zMcl-la和zMcl-lb敲低對(duì)Apo2L誘導(dǎo)的外在凋亡途徑的影響。如實(shí)施例3(e)中所述進(jìn)行了zMcl-1a和zMcl-1b的敲低。如實(shí)施例3(b)中所述使用以下引物序列克隆了斑馬魚(yú)Apo2L同系物zDLlb和其它TNF相關(guān)基因zDLla正向ACCATGATGGTCCCGGCGAACAGCCGC(SEQIDNO:113)zDLla反向ACTTTACAGATCCAATCGGAAAGCTCC(SEQIDNO:114)zDLlb正向ATCATGGTGCAGCCTAAAAATCGT(SEQIDNO:115)zDL1b反向CCCTCAGAGGTCAAACAGGAAGGC(SEQIDNO:116)zDL2正向CACGCGATGGTCAGCATGACAAGC(SEQIDNO:117)zDL2反向TACTGACTAGCTCACCAGAAATGC(SEQIDNO:118)zDL3正向ACCATGACATCCAACCTTCCTATCGGT(SEQIDNO:119)zDL3反向AGTTTATTTAATCATGAATGCCCCAAA(SEQIDNO:120)zFasL正向ATGAGTGCTAACTTCGGCCACTCG(SEQIDNO:121)zFasL反向TCAGTGGATCTTAAAGAGGCCGAA(SEQIDNO:122)zTNFl正向GCAACCATGAAGCTTGAGAGTCGGGCGTTT(SEQIDNO:123)zTNFl反向TTTCGTTCACAAACCAAACACCCCAAAGAA(SEQIDNO:124)zTNF2正向ATGGTGAGATACGAAACAACATTA(SEQIDNO:125)zTNF2反向ATTAAATCACAACGCGAACACCCCGAAGAA(SEQIDNO:126)如實(shí)施例3(b)中所述生成了合成的zDLlbmRNA并將其注射入斑馬魚(yú)胚胎。在野生型胚胎中，斑馬魚(yú)Apo2L直向同系物zDLlb的異位表達(dá)對(duì)早期胚胎生存力的影響很小(圖6B)。然而，當(dāng)將zMcl-la和zMcl-lb的敲低與zDLlb的異位表達(dá)組合時(shí)，胚胎迅速經(jīng)受大量的凋亡性死亡(圖6B)。該效應(yīng)為zMcl-1a和zMcl-lb的情況所特有，因?yàn)閷Mcl-1a或zMcl-lb中任何一個(gè)的敲低與zBlp2聯(lián)合沒(méi)有提高對(duì)zDL1b誘導(dǎo)的凋亡的敏感性(圖6B)。6C)。例如，zDLla異位表達(dá)與zMcl-la和zMcl-lb雙重翻譯敲低聯(lián)合導(dǎo)致了與zDUb幾乎一樣強(qiáng)烈的斑馬魚(yú)胚胎存活的降低(圖6C)。雙重敲低還顯著地降低了異位表達(dá)zDL3時(shí)的存活(圖6C)。當(dāng)zDL2、zTOFl或zTNF2表達(dá)與雙重zMcl-la/b翻譯敲低配對(duì)時(shí)，在存活百分比上獲得了顯著較少的降低(圖6C)。單獨(dú)的zFasL或與zMcl-1a和zMcl-1b的敲低組合的zFasL均未誘導(dǎo)凋亡。胚胎細(xì)胞上zTNFl、zTNF2和zFasL的受體的表達(dá)尚未確定。因此，zMcl-la和zMd-lb共同保護(hù)了斑馬魚(yú)胚胎免于zDUa和zDLlb(Apo2L)誘導(dǎo)的凋亡，并且具有雖然d、一些但仍然是顯著的免于zDL3誘導(dǎo)的凋亡的保護(hù)作用。權(quán)利要求1.一種多肽，其具有選自SEQIDNO1、5、7和9的氨基酸序列或其變體，其中所述多肽是斑馬魚(yú)Bcl-2相關(guān)(B2R)多結(jié)構(gòu)域促凋亡多肽或斑馬魚(yú)B2R僅含BH3的促凋亡多肽。2.—種多核苦酸，其具有選自SEQIDNO:2、6、8和10的核苷酸序列或其變體，其中所述多核香酸編碼斑馬魚(yú)B2R僅含BH3的促凋亡多肽。3.—種轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中一種或多種由選自SEQIDNO:2、6、8和10的核芬酸序列編碼的多核芬酸是缺失的。4.一種轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中一種或多種選自SEQIDNO:2、6、8和10的多核苷酸的表達(dá)相對(duì)于野生型斑馬魚(yú)中所述一種或多種多核苷酸的表達(dá)是受到調(diào)控的。5.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中所述表達(dá)是升高的。.6.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中所述表達(dá)是降低的。7.—種轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中一種或多種選自SEQIDNO:1、5、7和9的多肽是不表達(dá)的。8.—種轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中一種或多種選自SEQIDNO:1、5、7和9的多肽的表達(dá)相對(duì)于野生型斑馬魚(yú)中所述一種或多種多肽的表達(dá)是受到調(diào)控的。9.權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中所述表達(dá)是升高的。10.權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中所述表達(dá)是降低的。11.一種轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中一種或多種內(nèi)源性斑馬魚(yú)促凋亡(ZPA)基因是用變體ZPA基因或用來(lái)自另一種生物體的ZPA基因?qū)?yīng)物替換的。12.權(quán)利要求ll的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中所述對(duì)應(yīng)物是哺乳動(dòng)物的。13.權(quán)利要求ll的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中所述對(duì)應(yīng)物是人的。14.權(quán)利要求ll的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中所有內(nèi)源性ZPA基因是用來(lái)自另一種生物體的ZPA^因?qū)?yīng)物替換的。15.—種轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中一種或多種內(nèi)源性?xún)?nèi)在凋亡途徑基因是用內(nèi)在凋亡途徑基因變體或來(lái)自另一種生物體的內(nèi)在凋亡途徑基因?qū)?yīng)物替換的。16.權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中所述對(duì)應(yīng)物是哺乳動(dòng)物的。17.權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中所述對(duì)應(yīng)物是人的。18.權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中所有內(nèi)源性?xún)?nèi)在凋亡途徑基因是用來(lái)自另一種生物體的內(nèi)在凋亡途徑基因?qū)?yīng)物替換的。19.權(quán)利要求11或權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，其中所述一種或多種內(nèi)源性ZPA基因選自SEQIDNO:2、6、8和10。20.—種凋亡模型系統(tǒng)，其包含權(quán)利要求3-19中任一項(xiàng)的斑馬魚(yú)。21.—種體外凋亡模型系統(tǒng)，其包含至少一種由選自SEQIDNO:2、6、8和IO的核普酸序列編碼的多核苦酸。22.權(quán)利要求20或權(quán)利要求21的模型系統(tǒng)，其中所述凋亡模型系統(tǒng)是內(nèi)在凋亡途徑的模型系統(tǒng)。23.—種體外凋亡模型系統(tǒng)，其包含一種或多種選自SEQIDNO:1、5、7和9的多肽。24.權(quán)利要求23的凋亡模型系統(tǒng)，其中所述模型系統(tǒng)是內(nèi)在凋亡途徑的模型系統(tǒng)。25.權(quán)利要求23的凋亡模型系統(tǒng)，其中所述模型系統(tǒng)是外在凋亡途徑的模型系統(tǒng)。26.—種鑒定結(jié)合ZPA多肽的化合物的方法，其包括使ZPA多肽與化合物接觸，并測(cè)定該化合物是否結(jié)合該ZPA多肽。27.—種鑒定調(diào)控ZPA多肽活性的化合物的方法，其包括使ZPA多肽與化合物接觸，并測(cè)定該化合物是否調(diào)控該ZPA多肽的活性。28.—種鑒定降低或防止凋亡的藥劑的方法，其包括對(duì)斑馬魚(yú)施用至少一種藥劑，并測(cè)定是否降低或防止了凋亡。29.權(quán)利要求28的方法，其進(jìn)一步包括在施用所述至少一種藥劑之前測(cè)定斑馬魚(yú)中凋亡的存在或量。30.權(quán)利要求28的方法，其進(jìn)一步包括在施用所述至少一種藥劑之前在斑馬魚(yú)中刺激凋亡。31.權(quán)利要求28的方法，其中所述藥劑降低或防止通過(guò)內(nèi)在凋亡途徑的凋亡。32.權(quán)利要求28的方法，其中所述藥劑降低或防止通過(guò)外在凋亡途徑的凋亡o33.權(quán)利要求28的方法，其中所述斑馬魚(yú)中一種或多種ZPA蛋白的表達(dá)和/或活性相對(duì)于野生型斑馬魚(yú)中該一種或多種ZPA蛋白的表達(dá)和/或活性是升高的。34.權(quán)利要求28的方法，其中所述斑馬魚(yú)中一種或多種ZPA蛋白是不表達(dá)的。35.權(quán)利要求28的方法，其中所述斑馬魚(yú)中一種或多種ZPA蛋白的表達(dá)和/或活性相對(duì)于野生型斑馬魚(yú)中該一種或多種ZPA蛋白的表達(dá)和/或活性是降低的。36.權(quán)利要求28的方法，其中所述作用劑選自抗體、抗體片段、適體和小分子。37.權(quán)利要求28的方法，其中所述斑馬魚(yú)是幼體斑馬魚(yú)。38.權(quán)利要求28的方法，其中所述測(cè)定步驟包括顯微鏡檢查細(xì)胞生存力。39.權(quán)利要求28的方法，其中所述測(cè)定步驟包括測(cè)定胱天蛋白酶活化。.40.—種鑒定起始和/或刺激凋亡的藥劑的方法，其包括對(duì)斑馬魚(yú)施用至少一種藥劑，并測(cè)定是否起始或升高了凋亡。41.權(quán)利要求40的方法，其進(jìn)一步包括在施用所述至少一種藥劑之前測(cè)定斑馬魚(yú)中凋亡的存在或量。42.權(quán)利要求40的方法，其進(jìn)一步包括在施用所述至少一種藥劑之前在斑馬魚(yú)中防止和/或降4氐凋亡。43.權(quán)利要求40的方法，其中所述藥劑起始和/或刺激通過(guò)內(nèi)在凋亡途徑的凋亡。44.權(quán)利要求40的方法，其中所述藥劑起始和/或刺激通過(guò)外在凋亡途徑的凋亡。45.權(quán)利要求40的方法，其中所述斑馬魚(yú)中一種或多種ZPA蛋白的表達(dá)和/或活性相對(duì)于野生型斑馬魚(yú)中該一種或多種ZPA蛋白的表達(dá)和/或活性是升高的。46.權(quán)利要求40的方法，其中所述斑馬魚(yú)中一種或多種ZPA蛋白是不表達(dá)的。47.權(quán)利要求40的方法，其中所述斑馬魚(yú)中一種或多種ZPA蛋白的表達(dá)和/或活性相對(duì)于野生型斑馬魚(yú)中該一種或多種ZPA蛋白的表達(dá)和/或活性是降低的。48.權(quán)利要求40的方法，其中所述藥劑選自抗體、抗原結(jié)合性抗體片段、適體和小分子。49.權(quán)利要求40的方法，其中所述斑馬魚(yú)是幼體斑馬魚(yú)。50.權(quán)利要求40的方法，其中所述測(cè)定步驟包括顯微鏡檢查細(xì)胞生存力。51.權(quán)利要求40的方法，其中所述測(cè)定步驟包括測(cè)定胱天蛋白酶活化。52.—種治療凋亡相關(guān)病癥的方法，其包括對(duì)患者施用至少一種由選自SEQIDN0:1、5、7和9的氨基S^列編碼的多肽。53.—種治療凋亡相關(guān)病癥的方法，其包括對(duì)患者施用由選自SEQIDNO:1、5、7和9的氨基酸序列編碼的至少一種多肽的拮抗劑。54.權(quán)利要求53的方法，其中所述拮抗劑選自適體、抗體、抗原結(jié)合性抗體片段和小分子。55.—種治療凋亡相關(guān)病癥的方法，其包括對(duì)患者施用由選自SEQIDNO:1、5、7和9的氨基酸序列編碼的至少一種多肽的激動(dòng)劑。56.—種治療凋亡相關(guān)病癥的方法，其包括對(duì)患者施用至少一種選自下組的多肽由SEQIDNO:2、6、8和10的多核苷i^f列編碼的多肽。57.權(quán)利要求52-56中任一項(xiàng)的方法，其中所述凋亡相關(guān)病癥選自細(xì)胞增殖性病癥、病毒性凋亡病癥、自身免疫性病癥、血液學(xué)病癥和神經(jīng)學(xué)病癥。58.—種鑒定防止或降低凋亡的藥劑的方法，其包括使至少一種由選自SEQIDNO:l、5、7和9的氨基酸序列編碼的多肽與所述藥劑接觸，并測(cè)定該藥劑阻斷或降低所述至少一種多肽的活性的能力。59.—種鑒定起始或剌激凋亡的藥劑的方法，其包括使至少一種由選自SEQIDNO:l、5、7和9的氨基酸序列編碼的多肽與所述藥劑接觸，并測(cè)定該藥劑刺激或提高所述至少一種多肽的活性的能力。60.—種鑒定防止或降低凋亡的藥劑的方法，其包括使包含至少一種由選自SEQIDNO:2、6、8和10的核苷酸序列編碼的多核苷酸的細(xì)胞與所述藥劑接觸，并測(cè)定該藥劑防止或降低所述至少一種多核苷酸的表達(dá)的能力。61.—種鑒定起始或刺激凋亡的藥劑的方法，其包括使包含至少一種由選自SEQIDNO:2、6、8和10的核苷酸序列編碼的多核苷酸的細(xì)胞與所述藥劑接觸，并測(cè)定該藥劑刺激或提高所述至少一種多核苷酸的表達(dá)的能力。62.—種提高凋亡的組合物，其包含由選自SEQIDNO:1、5、7和9的氨基酸序列編碼的多肽或其激動(dòng)劑。63.—種降低或防止凋亡的組合物，其包含SEQIDNO:1、5、7和9中一種或多種的拮抗劑。64.權(quán)利要求63的組合物，其中所述拮抗劑選自抗體、抗原結(jié)合性抗體片段、適體和小分子。65.—種降低或防止凋亡的組合物，其包含降低或抑制SEQIDNO:2、6、8和10中一種或多種的表達(dá)的藥劑。66.權(quán)利要求62-65中任一項(xiàng)的組合物，其進(jìn)一步包含藥學(xué)可接受載體。67.—種治療需要治療的受試者中凋亡相關(guān)病癥的方法，其包括對(duì)所述受試者施用權(quán)利要求62-65中任一項(xiàng)的組合物。68.權(quán)利要求67的方法，其中所述凋亡相關(guān)病癥選自細(xì)胞增殖性病癥、病毒性凋亡病癥、自身免疫性病癥、血液學(xué)病癥和神經(jīng)學(xué)病癥。69.—種檢測(cè)凋亡相關(guān)病癥的存在或嚴(yán)重性或檢測(cè)對(duì)凋亡相關(guān)病癥的素因的方法，其包括^r測(cè)有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生凋亡相關(guān)病癥的受試者中ZPA多肽同系物的存在或量。70.—種檢測(cè)凋亡相關(guān)病癥的存在或嚴(yán)重性或檢測(cè)對(duì)凋亡相關(guān)病癥的素因的方法，其包括檢測(cè)有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生凋亡相關(guān)病癥的患者中ZPA多核苷酸同系物的存在或表達(dá)量。71.—種試劑盒，其包含權(quán)利要求62-65中任一項(xiàng)的組合物和對(duì)用途的說(shuō)明。72.—種試劑盒，其包含權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的體外凋亡模型系統(tǒng)和對(duì)用途的說(shuō)明。73.—種制品，其包含(a)權(quán)利要求62-65中任一項(xiàng)的組合物，(b)裝有所述組合物的容器；和(c)貼在所述容器上的標(biāo)簽或包括在所述容器中的包裝插頁(yè)，其涉及所述組合物在治療凋亡相關(guān)病癥中的用途。全文摘要本發(fā)明提供了ZPA多肽，與ZPA多肽相關(guān)的抗體、核酸分子、拮抗劑、激動(dòng)劑、增效劑和組合物，以及鑒定、制備和使用它們的方法，這些可用于治療和預(yù)防疾病，以及醫(yī)學(xué)診斷和研究。本發(fā)明還為內(nèi)在凋亡途徑提供了模型系統(tǒng)。文檔編號(hào)C07K14/46GK101479295SQ200780024026公開(kāi)日2009年7月8日申請(qǐng)日期2007年5月3日優(yōu)先權(quán)日2006年5月4日發(fā)明者埃麗卡·克拉茨,基蘭·穆克亞拉,里斯·哈特,阿維·J·阿什克納齊申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司