專利名稱：：Trail受體結(jié)合劑和其用途的制作方法TRAIL受體結(jié)合劑和其用途發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及TRAIL受體結(jié)合劑的制備和其用途。特別地，本發(fā)明涉及抗TRAIL受體抗體的制備，所述抗體識別TRAIL-R1和TRAIL-R2共有的共同抗原決定簇(即，表位)，以及它們用于TRAIL受體檢測和TRAIL受體介導(dǎo)的功能的調(diào)節(jié)的用途。
背景技術(shù)：
：TRAIL在上世紀(jì)90年代被鑒定。在TRAIL被發(fā)現(xiàn)后不久，人們注意到了它作為抗癌劑用于癌癥治療的潛力。這是基于TRAIL選擇性地殺死腫瘤細(xì)胞而不殺死正常細(xì)胞的能力。重要地，TRAIL的抗腫瘤效力可以通過許多當(dāng)前的癌癥療法(例如，化療和放射治療)來顯著地增強(qiáng)。另一方面，TRAIL可以致敏腫瘤細(xì)胞并提高腫瘤細(xì)胞對化療和放射治療的敏感性。因此，TRAIL與化療和放射治療的組合已經(jīng)被認(rèn)為是將來非常有效的抗腫瘤治療方法。TRAIL是TNF蛋白質(zhì)家族的成員。這個家族的一些蛋白質(zhì)的特征是它們誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力，例如TNF-a和Fas配體。然而，由于它們的有毒副作用，TNF-a和Fas配體沒有臨床應(yīng)用的價值。相比之下，TRAIL展現(xiàn)對肺瘤細(xì)胞的選擇性殺傷，它的臨床價值是明顯的。迄今為止，已經(jīng)鑒定了TRAIL的五種受體，其中的兩種DR4(TRAIL-R1)和DR5(TRAIL-R2)能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號，而其他三種DcRl(TRAIL-R3)、DcR2(TRAIL-R4)和護(hù)骨蛋白(osteoprotegerin,OPG)不轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號。TRAIL的所有五種受體在它們的細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中有顯著的同源性。DR4和DR5的細(xì)胞內(nèi)片段含有保守的功能結(jié)構(gòu)域，即所謂的"死亡結(jié)構(gòu)域"，其負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號。在幾年的研究之后，TRAIL的主要生物學(xué)功能已經(jīng)是公知的。TRAIL在對肺瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)督中起到重要作用?；罨腡淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞表達(dá)高水平的TRAIL,其為這些免疫活性細(xì)胞提供殺死腫瘤細(xì)胞的手段。動物研究表明，TRAIL的敲除導(dǎo)致腫瘤發(fā)生率隨年齡提高。因此，TRAIL的缺陷或不充分的表達(dá)可能是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素。由于TRAIL的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)功能是由它的受體介導(dǎo)的，對TRAIL受體系統(tǒng)已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究。早期研究提示許多正常細(xì)胞可以在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)TRAIL的死亡受體(TRAIL-R1和TRAIL-R2)。隨著抗死亡受體抗體的獲得，已經(jīng)相信的是，正常細(xì)胞和組織表達(dá)非常低水平的細(xì)胞表面TRAIL-R1和TRAIL-R2。相比之下，正常細(xì)胞和組織可能表達(dá)高水平的TRAIL-R3和TRAIL-R4。在正常細(xì)胞中不同的TRAIL受體的這種差異表達(dá)可能是正常細(xì)胞逃脫TRAIL殺傷的關(guān)鍵保護(hù)性機(jī)制。不同于正常細(xì)胞，大多數(shù)轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞表達(dá)高水平的TRAIL-R1和TRAIL-R2，而TRAIL-R3和TRAIL-R4的表達(dá)水平是非常低的。因而，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞對TRAIL介導(dǎo)的殺傷是敏感的。在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間TRAIL受體的差異表達(dá)很好地解釋了TRAIL的選4奪性。許多前臨床研究確認(rèn)了TRAIL是用于癌癥治療的安全的和有效的治療劑。已經(jīng)顯示的是，三聚化的可溶TRAIL的全身性施用在實(shí)驗動物中不產(chǎn)生毒性，又能夠誘導(dǎo)植入的腫瘤的退化。更加鼓舞人心的是，當(dāng)TRAIL與化療或放射治療組合時，它的抗腫瘤效力被顯著地增強(qiáng)。這種協(xié)同效應(yīng)已經(jīng)通過許多體外和體內(nèi)實(shí)驗展現(xiàn)。此外，TRAIL可以提高腫瘤細(xì)胞對化療和放射治療的敏感性。由于腫瘤細(xì)胞對化療和放射治療的抗性是癌癥治療中的主要障礙，TRAIL阻止或逆轉(zhuǎn)化學(xué)或輻射抗性的能力可能是將來的癌癥治療中顯著的進(jìn)步。然而，作為治療劑，TRAIL具有幾個缺點(diǎn)。首先，TRAIL具有至少五種受體，包括兩種死亡受體和誘辨受體，因而缺乏對受體的選擇性。特別地，當(dāng)癌細(xì)胞表達(dá)不同的死亡受體和誘何受體時，難以預(yù)測TRAIL的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)能力。第二，重組TRAIL具有非常短的體內(nèi)半衰期，其限制了TRAIL的體內(nèi)有效劑量和抗癌效力?；颊呓?jīng)常地接受重復(fù)的和大劑量的TRAIL是不方便的。第三，人們擔(dān)心重組TRAIL的某些形式具有潛在的肝細(xì)月包毒性。TRAIL作為治療劑的這些局限性導(dǎo)致了對TRAIL的替代物的開發(fā)。單克隆抗體可以選擇性地靶向TRAIL的死亡受體，其可能是癌癥治療的更有效和安全的策略。自產(chǎn)生第一個單克隆抗體以來的25年間，單克隆抗體已經(jīng)在癌癥治療中展現(xiàn)了很大的影響。大多數(shù)那些臨床上有效的單克隆抗體靶向在癌細(xì)胞表面高度表達(dá)的抗原或受體，并阻斷腫瘤生長所需的生長信號。這些抗體通過活化補(bǔ)體和抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)來殺死腫瘤細(xì)胞。此外，當(dāng)與放射性同位素、毒素或藥物綴合時，單克隆抗體可以用作追蹤分子，將這些治療劑帶往癌癥組織并增強(qiáng)抗癌效力。已經(jīng)成功地生產(chǎn)了TRAIL-R1或TRAIL-R2特異性單克隆抗體來替換TRAIL用于癌癥治療。幾種這樣的抗體已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗。初步的結(jié)果顯示這些抗體不僅具有強(qiáng)的抗癌效力，與TRAIL相比也是安全的。曰本醫(yī)藥公司Sankyo首先開發(fā)了一種抗TRAIL-R2抗體，TRA-8。Ichikawa等人使用了TRAIL-R2-Fc融合蛋白作為免疫原來免疫Balb/c小鼠。雖然TRA-8不誘導(dǎo)正常細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，許多腫瘤細(xì)胞對于TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是高度敏感的。雖然TRAIL-R2的mRNA廣泛地分布在正常的組織中，TRAIL-R2蛋白質(zhì)卻在正常的組織包括肝、肺、乳腺、腎臟、脾臟、卵巢、耳和胰腺中檢測不到。然而，這些組織中的癌細(xì)胞則表達(dá)高水平的TRAIL-R2蛋白質(zhì)。此外，正常的膠質(zhì)細(xì)胞和外周血細(xì)胞表達(dá)極低水平的TRAIL-R2,對于TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡不是敏感的，而膠質(zhì)瘤細(xì)胞和白血病細(xì)胞的水平表達(dá)高，并且對TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡非常敏感。在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡方面，TRA-8也展現(xiàn)了比TRAIL更高幾倍的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)能力。重要地，TRA-8不誘導(dǎo)正常肝細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。當(dāng)與化療或it射治療組合時，TRA-8的抗癌效力被顯著地增強(qiáng)。TRA-8當(dāng)前處于I期臨床試驗中。人類基因組科學(xué)(HumanGenomeSciences)進(jìn)行了抗TRAIL-R1抗體的I期試驗。初步數(shù)據(jù)表明，患者良好地耐受，在幾個患者中觀察到陽性應(yīng)答，表明抗TRAIL-R1是安全和有效的治療劑。能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的許多抗體對于TRAIL-R1或TRAIL-R2是特異性的。還才艮道了針對TRAIL-R1和TRAIL-R2的雙特異性抗體。(Lynch,US2002/0155109)由于腫瘤細(xì)胞可能選擇性地表達(dá)死亡受體的僅一種類型，因而，這些抗體具有有限的譜(spectrum),不能耙向所有的腫瘤細(xì)胞。同時，由于癌細(xì)胞可能差異表達(dá)兩種類型的受體并具有優(yōu)選的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這些抗體的殺傷活性變化很大。因而，本領(lǐng)域需要使用其他的抗TRAIL受體抗體用于TRAIL受體檢測和TRAIL受體介導(dǎo)的功能的調(diào)節(jié)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及識別TRAIL-R1和TRAIL-R2共有的共同抗原決定簇(即表位)的TRAIL受體結(jié)合劑(例如抗體)的制備，以及它們用于TRAIL受體檢測和TRAIL受體介導(dǎo)的功能的調(diào)節(jié)的用途。在一個方面，本發(fā)明提供了結(jié)合TRAIL受體1(TRAIL-R1)和/或TRAIL受體2(TRAIL-R2)的TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)，其中處于其可溶形式的所述TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)在低濃度下在表達(dá)TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的癌細(xì)胞中具有體內(nèi)和體外的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性。在一個實(shí)施方式中，所述TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)結(jié)合在至少一個細(xì)胞的表面表達(dá)的多肽TRAIL受體1(TRAIL-R1)和/或TRAIL受體2(TRAIL-R2)。在一個實(shí)施方式中，所述TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)結(jié)合TRAIL受體1(TRAIL-R1)和/或TRAIL受體2(TRAIL-R2)之間具有至少約百分之九十的氨基酸同源性的多肽區(qū)域。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)結(jié)合的氨基酸同源性的區(qū)域包含氨基酸序列VXDCTPWSD正CVHKE(SEQIDNO:44)，其中X是K或G，并且能夠誘導(dǎo)具有TRAIL-R1和/或TRAIL-R2受體的細(xì)胞的細(xì)胞死亡。在另一個方面，本發(fā)明提供了具有與CGMCC登錄號1665的小鼠-小鼠雜交瘤CTB003所產(chǎn)生的相同的表位特異性的TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)。在另一個方面，本發(fā)明提供了TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)或其抗原結(jié)合片段，至少包含HITMVVGPFA(SEQIDNO:11)的重鏈CDR3氨基酸序列或具有一個或多個保守性氨基酸替換的所述序列，其中所述TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)或其片段結(jié)合TRAIL受體1(TRAIL-R1)和/或TRAIL受體2(TRAIL-R2),并且在表達(dá)TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的癌細(xì)胞中具有體內(nèi)和體外的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)(或其抗原結(jié)合片段)綴合于癌癥治療劑，其中所述治療劑優(yōu)選地選自由胂瘤活化前體藥物(tumor-activatedprodrug)、放射性核素、化療藥物和毒素構(gòu)成的在另一個方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)的分離的核酸。在另一個方面，本發(fā)明提供了包含編碼本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)的分離的核酸的宿主細(xì)胞或載體。在另一個方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于治療癌癥的商業(yè)試劑盒，其包含處在容器中的本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)，所述商業(yè)試劑盒進(jìn)一步包含用于治療癌癥的化療劑和/或癌癥治療性TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)，其中所述化療劑和/或癌癥治療性TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)任選地被置入分別(separate)的容器中。在另一個方面，本發(fā)明提供了TRAIL-R1和TRAIL-R2的表位，包含氨基酸序列VXDCTPWSD正CVHKE(SEQIDNO:44)，其中X是K或G,所述表位被能夠結(jié)合TRAIL-R1和/或TRAIL-R2并且能夠誘導(dǎo)具有TRAIL-R1和/或TRAIL-R2受體的細(xì)胞的細(xì)胞死亡的TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)所識別。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了通過制備含有TRAIL-R1和TRAIL-R2的表位的免疫原而產(chǎn)生的TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)，所述免疫原包含氨基酸序列VXDCTPWSDIECVHKE(SEQIDNO:44),其中X是K或G，且所述表位被能夠結(jié)合TRAIL-Rl和/或TRAIL-R2并能夠誘導(dǎo)具有TRAIL-R1和/或TRAIL-R2受體的細(xì)胞的細(xì)胞死亡的TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)所識別。在另一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)在制備用于在表達(dá)TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的癌細(xì)胞中選擇性誘導(dǎo)細(xì)月包死亡的藥物中的用途。在另一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)在制備用于在表達(dá)TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的癌細(xì)胞中增強(qiáng)其他化療劑的抗癌活性的藥物的用途，其中所述治療劑是化療劑，其中所述治療劑選自由博來霉素、卡鉑、苯丁酸氦芥、順鉑、秋水仙堿、環(huán)磷酰胺、柔紅霉素、放線菌素、己烯雌酚、阿霉素(doxoribicin)、鬼臼乙叉武、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶脫氧核苷、美法侖、氨曱蝶呤、絲裂霉素C、巰嘌呤、紫杉醇、鬼臼口塞吩戒、6-硫代烏噪呤、長春新堿和長春堿構(gòu)成的組。在另一個方面，本發(fā)明提供了藥學(xué)有效量的本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)在制備用于治療癌癥的藥物中的用途，其中藥學(xué)有效量的TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)選擇性地誘導(dǎo)表達(dá)TRAIL-R1和/或TRAIL-R2多肽的癌細(xì)胞的細(xì)胞死亡。在另一個方面，本發(fā)明提供了藥學(xué)有效量的本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)作為藥物的用途。在另一個方面，本發(fā)明提供了在有需要的受試者中選擇性地誘導(dǎo)表達(dá)TRAIL-R1和/或TRAIL-R2多肽的細(xì)胞的細(xì)胞死亡的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)，從而選擇性地誘導(dǎo)表達(dá)TRAIL-R1和/或TRAIL-R2多肽的細(xì)胞的細(xì)胞死亡。在所述方法的一個實(shí)施方式中，表達(dá)TRAIL-R1和/或TRAIL-R2多肽的細(xì)胞是癌細(xì)胞。在所述方法的一個實(shí)施方式中，所述癌細(xì)胞選自由乳腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞和結(jié)腸直腸癌細(xì)胞構(gòu)成的組。附圖簡要說明附圖例示而不是限制性地描繪了優(yōu)選的實(shí)施方式。圖1.顯示來自雜交瘤CGMCC1665的免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列的示意圖。畫面A顯示了CTB003Vk核苷酸和氨基酸序列。畫面B顯示了CTB003VH核苷酸和氨基酸序列。CDR序列加有下劃線。圖2.顯示CTB003的特征的圖。含有人類TRAIL-R1和TRAIL-R2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的異二聚形式的重組人類IgGl-Fc融合蛋白，或含有TRAIL1、TRAIL-R2、TRAIL-R3或TRAIL-R4的同二聚形式的重組人類IgGl-Fc融合蛋白被固定在ELISA平板上，與各種濃度的CTB003溫育。在與HRP綴合的山羊抗小鼠IgGl反應(yīng)之后，添加TMB底物來進(jìn)行顯色反應(yīng)。通過CTB003與每種蛋白質(zhì)的OD值來測定結(jié)合能力。數(shù)據(jù)表示為OD450/650作為CTB003濃度(ng/ml)的函數(shù)。圖3.顯示在人類癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)中CTB003的劑量應(yīng)答關(guān)系的圖。人類癌細(xì)胞系的圖面圖面A.乳腺癌；圖面B.結(jié)腸癌；圖面C.胰腺癌；圖面D.卵巢癌；圖面E.前列腺癌；以及圖面F.肺癌與各種的濃度的CTB003溫育過夜。利用培養(yǎng)基對照作為100%細(xì)胞活力，通過ATPLite分析測定細(xì)胞活力。圖4.顯示在癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)中CTB003的時間依賴性應(yīng)答的圖。人類乳腺癌細(xì)胞(MDA231)和結(jié)腸癌細(xì)胞(Colo205)與1000ng/ml的CTB003溫育標(biāo)明的時間點(diǎn)，通過ATPLite分析測定細(xì)胞活力。數(shù)據(jù)表示為細(xì)胞活力(％)作為溫育時間(小時)的函數(shù)。圖5.顯示CTB003和阿霉素協(xié)同誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的圖。人類乳腺癌細(xì)胞系(BT474)在存在或不存在各種濃度的阿霉素的條件下與各種濃度的CTB003溫育過夜。通過ATPLite細(xì)胞活力分析測定細(xì)胞活力。圖面A顯示了作為CTB003濃度(ng/ml)的函數(shù)的細(xì)胞活力(％)的圖。圖面B顯示了各個處理組觀察到的細(xì)胞活力(％)的柱形圖。圖6.顯示CTB003和紫杉醇(Taxol)協(xié)同誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的圖。將人類結(jié)腸癌細(xì)胞系(SW620)在存在或不存在各種濃度的紫杉醇的條件下與各種濃度的CTB003溫育過夜。通過ATPLite細(xì)胞活力分析測定細(xì)胞活力。圖面A顯示了作為CTB003濃度(ng/ml)的函數(shù)的細(xì)胞活力(％)的圖。圖面B顯示了各個處理組觀察到的細(xì)胞活力(％)的柱形圖。圖7.顯示CTB003和順鉑協(xié)同誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的圖。將人類肺癌細(xì)胞系(A437)在存在或不存在各種濃度的順式鉑氨的條件下與各種濃度的CTB003溫育過夜。通過ATPLite細(xì)胞活力分析測定細(xì)胞活力。圖面A顯示了作為CTB003濃度(ng/ml)的函數(shù)的細(xì)胞活力(％)的圖。圖面B顯示了各個處理組觀察到的細(xì)胞活力(％)的柱形圖。圖8.顯示CTB003和CTP-ll協(xié)同誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的圖。將人類結(jié)腸癌細(xì)胞系(SW1116)在存在或不存在各種濃度的CTP-ll的條件下與各種濃度的CTB003溫育過夜。通過ATPLite細(xì)胞活力分析測定細(xì)胞活力。圖面A顯示了作為CTB003濃度(ng/ml)的函數(shù)的細(xì)胞活力(％)的圖。圖面B顯示了各個處理組觀察到的細(xì)胞活力(％)的柱形圖。圖9.顯示CTB003和吉西他濱(Gemcitabine)協(xié)同誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的圖。將人類胰腺癌細(xì)胞系(PANC1)在存在或不存在各種濃度的吉西他濱的條件下與各種濃度的CTB003溫育過夜。通過ATPLite細(xì)胞活力分析測定細(xì)胞活力。圖面A顯示了作為CTB003濃度(ng/ml)的函數(shù)的細(xì)胞活力(％)的圖。圖面B顯示了各個處理組觀察的細(xì)胞活力(％)的柱形圖。圖10.顯示CTB003和抗TRAIL-R1(CTB007)協(xié)同i秀導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的圖。將人類結(jié)腸癌細(xì)胞系(SW1116)在存在或不存在各種濃度的抗TRAIL-R1抗體(CTB007)的條件下與各種濃度的CTB003溫育過夜。通過ATPLite細(xì)胞活力分析測定細(xì)胞活力。圖面A顯示了作為CTB003濃度(ng/ml)的函數(shù)的細(xì)胞活力(％)的圖。圖面B顯示了各個處理組觀察到的細(xì)胞活力(％)的柱形圖。圖11.顯示CTB003和抗TRAIL-R2(CTB006)協(xié)同誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的圖。將人類結(jié)腸癌細(xì)胞系(SW1116)在存在或不存在各種濃度的抗TRAIL-R2抗體(CTB006)的情況下與各種濃度的CTB003溫育過夜。通過ATPLite細(xì)胞活力分析測定細(xì)胞活力。圖面A顯示了作為CTB003濃度(ng/ml)的濃度的函數(shù)的細(xì)胞活力(％)的圖。圖面B顯示了對各個處理組觀察的細(xì)胞活力(％)的柱形圖。圖12.表現(xiàn)CTB003的體內(nèi)抗腫瘤活性的圖。Balb/c棵鼠皮下接種人類乳腺癌細(xì)胞(MDA231)。接種后10天，小鼠接受200昭CTB003的腹膜內(nèi)(i.p.)注射，以三天的間隔每周兩次。處理重復(fù)進(jìn)行三周。每周測量腫瘤大小。數(shù)據(jù)表示為作為處理后的時間(天)的函數(shù)的腫瘤大小(cm3)。圖13.顯示在鼠異種移植體內(nèi)實(shí)驗?zāi)Ｐ椭惺骉RAIL受體結(jié)合劑CTB003對人類乳腺癌細(xì)胞系MDA231的生長的影響的時間依賴性的圖。數(shù)據(jù)表示為作為治療后的時間(天)的函數(shù)的腫瘤大小改變的百分比％。圖14.顯示在鼠異種移植體內(nèi)實(shí)驗?zāi)Ｐ椭惺骉RAIL受體結(jié)合劑CTB003對人類肝癌細(xì)胞系7402的生長的影響的時間依賴性的圖。數(shù)據(jù)表示為作為治療后的時間(天)的函數(shù)的腫瘤大小改變的百分比％。圖15.顯示在鼠異種移植體內(nèi)實(shí)驗?zāi)Ｐ椭惺骉RAIL受體結(jié)合劑CTB003對人類結(jié)腸癌細(xì)胞系Colo205的生長的影響的時間依賴性的圖。數(shù)據(jù)表示為作為治療后的時間(天)的函^:的腫瘤大小改變的百分比％。圖16.顯示在鼠異種移植體內(nèi)實(shí)驗?zāi)Ｐ椭惺骉RAIL受體結(jié)合劑CTB003對人類胰腺癌細(xì)胞系MIAcapa的生長的影響的時間依賴性的圖。數(shù)據(jù)表示為作為治療后的時間(天)的函數(shù)的腫瘤大小改變的百分比％。圖17.顯示與阿霉素組合的CTB003的殺腫瘤活性的直方圖。Balb/c棵鼠皮下接種人類乳腺癌細(xì)胞(MDA231)。接種后10天，小鼠首先接受100昭阿霉素的腹膜內(nèi)注射，一天后接受200嗎CTB003的腹膜內(nèi)注射。小鼠以三天的間隔每周兩次地處理。重復(fù)進(jìn)行處理兩周的時間。在最后一ii次治療后兩天測量腫瘤大小。數(shù)據(jù)表示為作為處理組(之前和之后)的函數(shù)的腫瘤大小(cm3)。顯示的處理組如下未處理(對照)；阿霉素；CTB003;和阿霉素+CTB003。圖18.顯示在人類MDA231乳腺癌異種移植模型中與抗TRAIL-R2(CTB006)組合的CTB003的殺肺瘤活性的直方圖。Balb/c棵鼠皮下接種人類乳腺癌細(xì)胞(MDA231)。接種后10天，小鼠接受200嗎CTB003和CTB006的腹膜內(nèi)注射。小鼠以三天的間隔每周兩次地進(jìn)行處理。處理重復(fù)進(jìn)行兩周的時間。在最后一次處理后兩天測量腫瘤大小。數(shù)據(jù)表示為作為處理組(之前和之后)的函數(shù)的腫瘤大小(cm3)。顯示的處理組是未處理(對照)；CTB003;CTB006;和CTB003+CTB006。圖19.顯示CTB003識別的TRAIL-R2的抗原表位的分析的圖。利用多肽抑制測定來確定TRAIL-R2中CTB003所識別的表位。將ELISA平板用TRAIL-R2-Fc融合蛋白包被，并與編碼TRAIL-R2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的不同部分的一系列多肽(A-G)溫育。數(shù)據(jù)表示為作為肽濃度(nM)的函數(shù)的、所觀察到的CTB003對TRAIL-R2的結(jié)合的最大結(jié)合的百分比(％)。圖20.顯示CTB003所識別的TRAIL-R1和TRAIL-R2的抗原表位的實(shí)驗確認(rèn)的圖。利用多肽抑制測定來確定TRAIL-R1和TRAIL-R2中CTB003所識別的表位。將ELISA平板用TRAIL-R1或TRAIL-R2-Fc融合蛋白包被，并將其在存在或不存在各種濃度的分別編碼TRAIL-R1和TRAIL-R2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的多肽(I和H)的條件下與CTB003溫育。數(shù)據(jù)表示為作為肽濃度(nM)的函數(shù)的、所觀察到的CTB003對TRAIL-Rl(圖面A)或TRAIL-R2(圖面B)的結(jié)合的最大結(jié)合的百分比(％)。圖21.顯示CTB003(鼠)和hCTB003(人源化、嵌合的)TRAIL受體結(jié)合劑的結(jié)合特征的比較的圖。將含有TRAIL-R1/TRAIL-R2異二聚體抗原的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的重組人類IgGl-Fc融合蛋白(圖面A)、TRAIL-Rl-Fc(圖面B)、TRAIL-R2-Fc(圖面C)、TRAIL-R3-Fc(圖面D)、TRAIL-R4-Fc(圖面E)或BSA(對照；圖面F)固定在ELISA平板上，與各種濃度(ng/ml)的CTB003(鼠)或hCTB003(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB003)溫育。與HRP綴合的山羊抗小鼠CTB003(鼠)IgGl反應(yīng)，或與HRP綴合的山羊抗人kappa反應(yīng)之后，添加TMB底物來進(jìn)行顯色反應(yīng)。通過CTB003或hCTB003與每種蛋白質(zhì)的OD值來測定結(jié)合能力。每個圖面(A-F)中的數(shù)據(jù)表示為作為抗體濃度(ng/ml)(即，CTB003濃度(ng/ml)或嵌合CTBOO3濃度(ng/ml))的函數(shù)的OD450/650。圖22.顯示CTB006(鼠)和hCTB006(人源化、嵌合的；也稱為嵌合的CTB006)TRAIL受體結(jié)合劑的結(jié)合特征的比較的圖。將含有TRAIL-R1/TRAIL-R2異二聚體抗原的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的重組人類IgGl-Fc融合蛋白(圖面A)、TRAIL-Rl-Fc(圖面B)、TRAIL-R2-Fc(圖面C)、TRAIL-R3-Fc(圖面D)、TRAIL-R4-Fc(圖面E)或BSA(對照；圖面F)固定在ELISA平板上，并與各種濃度(ng/ml)的CTB006(鼠)或hCTB006(人源化、嵌合的)溫育。與HRP綴合的山羊抗小鼠CTB006(鼠)IgG反應(yīng)，或與HRP綴合的山羊抗人kappa反應(yīng)之后，添加底物來進(jìn)行顯色反應(yīng)。通過CTB006或hCTB006與每種蛋白質(zhì)的OD值來測定結(jié)合能力。每個圖面(A-F)中的數(shù)據(jù)表示為作為抗體濃度(ng/ml)(即，CTB006濃度(ng/ml)或嵌合CTB006濃度(ng/mi))的函數(shù)的OD450/650。圖23.顯示CTB007(鼠)和hCTB007(人源化、嵌合的；也稱為嵌合的CTB007)TRAIL受體結(jié)合劑的結(jié)合特征的比較的圖。將含有TRAIL-R1/TRAIL-R2異二聚體抗原的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的重組人類IgGl-Fc融合蛋白(圖面A)、TRAIL-Rl-Fc(圖面B)、TRAIL-R2-Fc(圖面C)、TRAIL-R3-Fc(圖面D)、TRAIL-R4-Fc(圖面E)或BSA(對照；圖面F)固定在ELISA平板上，并與各種濃度(ng/ml)的CTB007(鼠)或hCTB007(人源化、嵌合的)溫育。與HRP綴合的山羊抗小鼠CTB003(鼠)IgG反應(yīng)，或與HRP綴合的山羊抗人kappa反應(yīng)之后，添加底物來進(jìn)行顯色反應(yīng)。通過CTB007或hCTB007與每種蛋白質(zhì)的OD值來測定結(jié)合能力。通過CTB007或hCTB007與每種蛋白質(zhì)的OD值來測定結(jié)合能力。每個圖面(A-F)中的數(shù)據(jù)表示為作為抗體濃度(ng/ml)(即，CTB007濃度(ng/ml)或嵌合CTB007濃度(ng/ml))的函數(shù)的OD450/650。圖24.顯示hCTB003(即，人源化、嵌合的CTB003;也稱為嵌合CTB003)所識別的TRAIL-R1和TRAIL-R2的抗原表位的確認(rèn)的圖。利用多肽抑制測定來確定TRAIL-R1和TRAIL-R2中hCTB003所識別的表位。將ELISA平板用TRAIL-R1或TRAIL-R2-Fc融合蛋白包被，在存在或不存在各種濃度的分別編碼TRAIL-R1和TRAIL-R2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的多肽(I和H)的條件下與CTB003溫育。數(shù)據(jù)表示為作為肽濃度(nM)的函數(shù)的、所觀察到的hCTB003對TRAIL-R1(圖面A)或TRAIL-R2(圖面B)的結(jié)合的最大結(jié)合的百分比(％)。圖25.比較本發(fā)明的鼠的和人源化的嵌合TRAIL受體結(jié)合劑對人類乳腺癌細(xì)胞系MDA231的體外生長的影響的圖。圖面A是作為CTB003(鼠)或hCTB003(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB003)的濃度(ng/ml)的函數(shù)的細(xì)胞活力(％)的圖。圖面B是作為CTB006(鼠)或hCTB006(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB006)的濃度(ng/ml)的函數(shù)的細(xì)胞活力(%)的圖。圖面C是作為CTB007(鼠)或hCTB007(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB007)的濃度(ng/ml)的函數(shù)的細(xì)胞活力(％)的圖。圖26.比較本發(fā)明的鼠的和人源化的嵌合TRAIL受體結(jié)合劑對人類結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系Colo205的體外生長的影響的圖。圖面A是作為CTB003(鼠)或hCTB003(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB003)的濃度(ng/m)的函數(shù)的細(xì)胞活力(％)的圖。圖面B是作為CTB006(鼠)或hCTB006(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB006)的濃度(ng/ml)的函數(shù)的細(xì)胞活力(％)的圖。圖面C是作為CTB007(鼠)或hCTB007(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB007)的濃度(ng/ml)的函數(shù)的細(xì)胞活力(％)的圖。圖27.比較本發(fā)明的鼠的和人源化的嵌合TRAIL受體結(jié)合劑對人類胰腺癌細(xì)胞系MIAcapa體外生長的影響的圖。圖面A是作為CTB003(鼠)或hCTB003(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB003)的濃度(ng/ml)的函數(shù)的細(xì)胞活力(％)的圖。圖面B是作為CTB006(鼠)或hCTB006(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB006)的濃度(ng/ml)的函數(shù)的細(xì)胞活力(%)的圖。圖面C是作為CTB007(鼠)或hCTB007(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB007)的濃度(ng/ml)的函數(shù)的細(xì)胞活力(％)的圖。圖28.比較本發(fā)明的鼠的和人源化的嵌合TRAIL受體結(jié)合劑對人類卵巢癌細(xì)胞系Caov3體外生長的影響的圖。圖面A是作為CTB003(鼠)或hCTB003(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB003)的濃度(ng/ml)的函數(shù)的細(xì)胞活力(％)的圖。圖面B是作為CTB006(鼠)或hCTB006(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB006)的濃度(ng/ml)的函數(shù)的細(xì)胞活力(%)的圖。圖面C是作為CTB007(鼠)或hCTB007(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB007)的濃度(ng/ml)的函數(shù)的細(xì)胞活力(％)的圖。圖29.比較本發(fā)明的鼠的和人源化的嵌合TRAIL受體結(jié)合劑對人類前列腺癌細(xì)胞系Dul45體外生長的影響的圖。圖面A是作為CTB003(鼠)或hCTB003(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB003)的濃度(ng/ml)的函數(shù)的細(xì)胞活力(％)的圖。圖面B是作為CTB006(鼠)或hCTB006(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB006)的濃度(ng/ml)的函數(shù)的細(xì)胞活力(%)的圖。圖面C是作為CTB007(鼠)或hCTB007(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB007)的濃度(ng/ml)的函數(shù)的細(xì)胞活力(％)的圖。圖30.比較本發(fā)明的鼠的和人源化的嵌合TRAIL受體結(jié)合劑對人類肺癌細(xì)胞系H2122體外生長的影響的圖。圖面A是作為CTB003(鼠)或hCTB003(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB003)的濃度(ng/ml)的函數(shù)的細(xì)胞活力(％)的圖。圖面B是作為CTB006(鼠)或hCTB006(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB006)的濃度(ng/ml)的函數(shù)的細(xì)胞活力(％)的圖。圖面C是作為CTB007(鼠)或hCTB007(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB007)的濃度(ng/ml)的函數(shù)的細(xì)胞活力(％)的圖。圖31.顯示人類TRAIL受體的選定區(qū)域的氨基酸序列比對的示意圖。圖32.顯示在差異表達(dá)TRAIL-R1和TRAIL-R2的腫瘤細(xì)胞中CTB003的結(jié)合和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性的圖。圖面A所示的圖表現(xiàn)了針對CTB003、CTB006和CTB007與Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞表面結(jié)合的流式細(xì)胞術(shù)分析所得的數(shù)據(jù)。圖面B所示的圖表現(xiàn)了針對CTB003、CTB006和CTB007與Ramos細(xì)胞的細(xì)胞表面結(jié)合的流式細(xì)胞術(shù)分析所得的數(shù)據(jù)。圖面C是顯示CTB003、CTB006和CTB007在Jurkat細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性的圖。圖面D是顯示CTB003、CTB006和CTB007在Ramos細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性的圖。圖面C和圖面D中是數(shù)據(jù)表示為作為抗體濃度(ng/ml)的函數(shù)的細(xì)胞活力(％)。發(fā)明詳述凝迷.要理解的是，下文以不同的詳略程度描述本發(fā)明的某些方面、模式、實(shí)施方式、變化形式和特征，以提供對本發(fā)明的實(shí)質(zhì)上的理解。本發(fā)明一般地提供了TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)，其可以同時結(jié)合兩種類型的死亡受體來提高它的抗胂瘤語和活性。本發(fā)明公開了這樣的作用劑，它們等同地(equally)結(jié)合TRAIL-R1和TRAIL-R2，并能夠誘導(dǎo)任何可表達(dá)單一類型的所述受體或兩種類型的所述受體的肺瘤細(xì)胞的凋亡。特別地，本發(fā)明提供了本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑結(jié)合的TRAIL-R1和/或-R2受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中TRAIL-R1和TRAIL-R2的共有"表位"的鑒定。這個表位大約處在跨越人類TRAIL-R1的aa218到aa233的氨基酸殘基(aa218-aa233;VKDCTPWSD正CVHKE,SEQIDNO:45)的結(jié)構(gòu)域中，或處在跨越人類TRAIL-R2的aal67到aal82的氨基酸殘基(aal67-aal82;VGDCTPWSDIECVHKE，SEQIDNO:46)的結(jié)構(gòu)域中。從而，本發(fā)明的各個方面涉及TRAIL受體結(jié)合劑的制備、表達(dá)和表征。本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑能夠單獨(dú)地或組合地用于^f企測測試樣品中的TRAIL受體多肽(也稱為目標(biāo)多肽)，以及用于調(diào)節(jié)TRAIL受體介導(dǎo)的功能。TRAIL受體結(jié)合劑能夠用于在有需要的受試者中診斷、預(yù)防和/或治療TRAIL受體相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)提供了抗死亡受體策略的獨(dú)特的生物學(xué)功能和廣泛的抗癌活性。雖然可溶的TRAIL已經(jīng)顯示在誘導(dǎo)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的凋亡方面是有效的，但由于它非常短的半衰期，它的殺傷活性似乎非常低，通常需要大的(和重復(fù)的)劑量。根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合劑與TRAIL及其他單特異性的抗TRAIL-R1或TRAIL-R2抗體相比在攜帶人類癌細(xì)胞系的動物中具有更高的藥物有效性。本發(fā)明的各個方面進(jìn)一步涉及診斷方法和試劑盒，它們使用本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑來鑒定具有醫(yī)學(xué)狀況傾向的個體或者對于藥物應(yīng)答性、副作用或最佳藥物劑量來對個體分類。在其他方面，本發(fā)明提供了TRAIL受體結(jié)合劑用于預(yù)防或治療TRAIL受體介導(dǎo)的病癥以及用于篩選和/或驗證配體(例如結(jié)合TRAIL受體多肽的小分子)等用途。因而，下文將說明這些方面的各種特定的實(shí)施方式。在以下附隨的說明中將闡述本發(fā)明的一個或多個實(shí)施方式的細(xì)節(jié)。雖然類似于或等同于在此描述的那些的任何方法和材料可以被用于本發(fā)明的實(shí)踐和測試，現(xiàn)在描述了優(yōu)選的方法和材料。根據(jù)說明書和權(quán)利要求書，本發(fā)明的其他特征、目的和益處將是明顯的。一般地，根據(jù)制造商的說明進(jìn)行酶促反應(yīng)和純化步驟。技術(shù)和操作一般根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方法和各種——:l殳參考文獻(xiàn)(一;l殳參見,Sambrook等人，Afo/ecw/"rC7o"/"gv」厶"6orafto^yA/awwa/，2d五dfColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork，1989)進(jìn)行，其在本申請文件全文中均有才是供。除非另外定義，此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義一般與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員通常所理解的相同。在本說明書和附隨的權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式"一種/個(a,an)"和"該(the)，，包括了復(fù)數(shù)的所指，除非文章內(nèi)容明確地另有所指。例如，提及"一種細(xì)胞"包括兩種或更多細(xì)胞的組合，等等。一般地，在此使用的命名法，和本文所描述的細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、有機(jī)化學(xué)、分析化學(xué)和核酸化學(xué)及雜交中的實(shí)驗方法是本領(lǐng)域公知和常用的。核酸和肽合成使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)。化學(xué)合成和化學(xué)分析使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)或其修改方案。在此引用的所有參考文獻(xiàn)在此為了所有目的通過將它們完全引用來合并在此，其程度與具體的，單獨(dú)的指示為了相同。遂^7的/,^.選用的生物化學(xué)和血液學(xué)術(shù)語的縮寫分別總結(jié)在下面的表1和表2中。表l:選用的生物化學(xué)術(shù)語ALT丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALP堿性磷酸酶CK肌酸磷酸激酶Y-GTY-谷氨酰氨基酰基轉(zhuǎn)移酶BUN血液尿素氮肌酸酐Alb白蛋白TP總蛋白Tchol總膽固醇TG甘油三酯Tbil總膽紅素Glu葡萄糖Na鈉Ca鈣K鉀CI氯17表2:選用的血液學(xué)術(shù)語<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>定乂.以下提供了在本說明書中使用的某些術(shù)語的定義。其他術(shù)語的定義可以在/〃wWratoio/TwwMWo/ogy,2ndEdition(Cruse，J.M.和Lewis,R.E.,Eds.,BocaRaton，F(xiàn)L:CRCPress,1995)中找到。本發(fā)明中涉及的術(shù)語"DR4"和"TRAIL-R1"、"DR5，，和"TRAIL-R2，，可以互換使用。除非另外表明，在本文中使用這些術(shù)語時是指人類蛋白質(zhì)和基因。如在此^(吏用的，術(shù)語本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)或TRAIL受體相關(guān)多肽的"生物學(xué)活性"，其抗體片段可以結(jié)合TRAIL-R1和/或TRAIL-R2,并且在癌細(xì)胞中具有體內(nèi)和體外細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性。如在此4吏用的，術(shù)語"TRAIL受體"是指TOP受體家族的成員。人類TRAIL受體是TRAIL的細(xì)胞表面受體(AP02配體)。迄今為止，已經(jīng)鑒定了TRAIL的五種受體，其中的兩種DR4(TRAIL-R1;CD261或死亡受體4)和DR5(TRAIL-R2;CD262或死亡受體5)能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號，而其他三種DcRl(TRAIL-R3;CD263或誘鉺受體1)、DcR2(TRAIL-R4;CD264或i秀何受體2)和護(hù)骨蛋白(osteoprotegerin,OPG)不轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號。三聚的TRAIL對TRAILRl或TRAILR2的結(jié)合通過這些受體的寡聚而誘導(dǎo)凋亡。TRAILRl和TRAILR2由細(xì)胞外的半富胱氨酸結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)死亡結(jié)構(gòu)域組成。TRAILR3和TRAILR4也具有細(xì)胞外的富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，但是TRAILR3缺乏細(xì)胞質(zhì)死亡結(jié)構(gòu)域，TRAILR4具有截短的死亡結(jié)構(gòu)域。TRAIL的所有五種受體在它們的細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中具有顯著的同源性。DR4和DR5的細(xì)胞內(nèi)區(qū)段含有一種保守的功能結(jié)構(gòu)域，即所謂的"死亡結(jié)構(gòu)域，，，其負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號。死亡結(jié)構(gòu)域?qū)Φ蛲鲂盘栟D(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)責(zé)。如在此使用的，向受試者施用試劑或藥物包括自我施用和由他人施用。還要理解的是，在此描述的醫(yī)學(xué)狀況的治療或預(yù)防的各種方式意圖是指"實(shí)質(zhì)上的"，其不但包括完全的治療或預(yù)防，還包括不及完全的治療或預(yù)防，其中實(shí)現(xiàn)了某些生物學(xué)或醫(yī)學(xué)上有意義的結(jié)果。如在此使用的，術(shù)語"氨基酸"包括天然存在的氨基酸和合成的氨基酸，以及按照與天然存在的氨基酸類似的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些氨基酸，以及后來被修飾的那些氨基酸，例如，羥脯氨酸、，羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是指具有與天然存在的氨基酸相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)一一即結(jié)合于氫、羧基、氨基和R基的a碳一一的化合物，例如高絲氨酸、正亮氨酸、曱硫氨酸亞砜、曱硫氨酸曱基锍。這種類似物具有修飾的R基團(tuán)(例如，正亮氨酸)或修飾的肽骨架，但是保持了與天然存在的氨基酸相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指具有與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)、但是以與天然存在的氨基酸類似的方式起作用的化合物。氨基酸在此可以通過它們公知的三字母符號或通過IUPAC-IUB生物化學(xué)術(shù)語委員會建議的單字母符號來指代。同樣地，核苷酸可以通過它們公認(rèn)的單字母代碼來指代。如在此使用的，術(shù)語"抗體"是指這樣的多肽，其包含來自免疫球蛋白基因的框架區(qū)域或其片段，其特異性地結(jié)合并識別抗原，例如TRAIL受體多肽。使用術(shù)語"抗體，，意圖包括完整抗體、包括單鏈的完整抗體，以及其抗原結(jié)合片段。術(shù)語"抗體"包括雙特異性抗體和多特異性抗體，只要它們展現(xiàn)了期望的生物學(xué)活性或功能。如在此使用的，術(shù)語"抗體相關(guān)的多肽"是指抗原結(jié)合性抗體片段，包合的可變區(qū)抗體分子的絞鏈區(qū)、CH,、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還包括可變區(qū)與絞鏈區(qū)、CH,、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的任何組合。能用作本發(fā)明的結(jié)合劑的抗體相關(guān)分子包括，例如，但不限于，F(xiàn)ab、Fab，和F(ab，)2、Fd、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、二硫橋連接的Fv(sdFv)和包含VL或VH結(jié)構(gòu)域的片段。實(shí)例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH!結(jié)構(gòu)域組成的單價的片段；(ii)F(ab')2片段，包含由絞鏈區(qū)的二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價的片段；(iii)由Vh和ell!結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單個臂的Vl和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人，Atowe341:544-546，1989)，其由VH結(jié)構(gòu)域組成；和(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。因而，"抗體片段"可以包含全長抗體的一部分，一般是抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的實(shí)例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。單鏈抗體分子可以包括具有多個單獨(dú)分子的聚合物，例如，二聚體、三聚體或其他聚合物。如在此使用的，術(shù)語"生物樣品，，是指源自于活細(xì)胞或被活細(xì)胞接觸過的樣品材料。術(shù)語"生物樣品"意圖包括從受試者分離的組織、細(xì)胞和生物液體，以及存在于受試者體內(nèi)的組織、細(xì)胞和液體。本發(fā)明的生物樣品包括，例如，但不限于，全血、血漿、精液、唾液、淚液、尿液、糞便材料、汗液、口腔的(buccal)、皮膚、腦脊液和毛發(fā)。生物樣品也可以從內(nèi)臟的活檢或從癌癥獲得。生物樣品可以從用于診斷或研究的受試者獲得，或者可以從未患病的個體獲得，作為對照或用于基礎(chǔ)研究。如在此使用的，術(shù)語"CDR移植的抗體，，是指這樣抗體，其中"受者"抗體的至少一個CDR被來自具有期望的抗原特異性的"供者"抗體的CDR"移植物"替換。如在此使用的，術(shù)語"嵌合抗體"是指這樣的抗體，其中利用重組DNA技術(shù)，來自一個物種的單克隆抗體的Fc恒定區(qū)(例如，小鼠Fc恒定區(qū))被來自另一個物種的抗體的Fc恒定區(qū)(例如，人類Fc恒定區(qū))替換。一般地，參見，Robinson等人，PCT/US86/02269;Akira等人，歐洲專利申請184,187;Taniguchi,歐洲專利申請171,496;Morrison等人，歐洲專利申請173,494;Neuberger等人，WO86/01533;Cabilly等人美國專利No.4,816,567;Cabilly等人,歐洲專利申請125,023;Better等人,Science240:1041-1043,1988;Liu等人，A^/^^/5WWSL484:3439-3443,1987;Liu等人，J/附"w"o/139:3521-3526,1987;Sun等人，戶raciVaf/爿cad84:214-218,1987;Nishimura等人，Ca"ce;ri^47:999-1005,1987;Wood等人，Nature314:446-449，1885;和Shaw等人，JA^/Ca"cer/"W80:1553-1559，1988。如在此使用的，術(shù)語"比較窗口"(comparisonwindow)是指這樣的區(qū)段，其具有選自由20到600個氨基酸或核苷酸、通常約50到約200個、更通常約100到約150個構(gòu)成的組的連續(xù)位置的任一數(shù)目的連續(xù)位置，某一序列與具有相同數(shù)目的連續(xù)位置的參考序列最佳比對之后，可以在該窗口中與參考序列相比較。如在此使用的，術(shù)語"共有FR"是指共有免疫球蛋白序列中的框架(FR)抗體區(qū)域?？贵w的FR區(qū)域不接觸抗原。如在此使用的，術(shù)語"共有序列"是指由在相關(guān)序列的家族中最經(jīng)常出現(xiàn)的氨基酸(或核苷酸)所形成的序列(參見，例如，Winnaker,toC/owejrVerlagsgesellschaft，Weinheim,Germany1987)。也就是說，在蛋白質(zhì)的家族中，共有序列中的每個位置均被家族中在該位置上最常出現(xiàn)的氨基酸所占據(jù)。如果兩個氨基酸出現(xiàn)頻度相等，則其中任一個均可以被包括在共有序列中。如在此使用的，術(shù)語"接觸，，當(dāng)用于細(xì)胞時是指將本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑、抗體、抗體組合物、細(xì)胞毒性試劑或細(xì)胞毒性模塊(moiety)、基因、蛋白質(zhì)和/或反義序列遞送給目標(biāo)細(xì)胞或置于目標(biāo)細(xì)胞的緊密鄰近處的過程。這種遞送可以是體外或體內(nèi)的，可以涉及重組載體系統(tǒng)的使用。如在此使用的，術(shù)語"細(xì)胞毒性模塊"是指當(dāng)接近細(xì)胞或被細(xì)胞吸收時抑制細(xì)胞生長或促進(jìn)細(xì)胞死亡的模塊。就此來說適合的細(xì)胞毒部分包括放射性戰(zhàn)劑或同位素(放射性核素)、化學(xué)毒性試劑，例如分化誘導(dǎo)物、抑制劑和小的細(xì)胞毒性藥物、毒素蛋白和其衍生物，以及核苦酸序列(或它們的反義序列)。因此，細(xì)胞毒性部分可以是，作為非限制性的例子，化療劑、光活化的毒素或放射性試劑。如在此使用的，術(shù)語"雙抗體，，是指具有兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)的小的抗體片段，該片段在相同的多肽鏈中含有相互連接的輕鏈可變域(VL)和重鏈可變域(VH)(Vh-Vl)。通過使用過短而不容許在同一鏈上兩個結(jié)構(gòu)域之間配對的接頭，結(jié)構(gòu)域被迫與另一鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對，并產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體在例如EP404,097;W093/11161和30Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中有更詳細(xì)的描述。如在此使用的，術(shù)語"效應(yīng)物細(xì)胞"是指免疫應(yīng)答的效應(yīng)物階段——與免疫反應(yīng)的認(rèn)知和活化階段相對——中涉及的免疫細(xì)胞。示例性的免疫細(xì)胞包括骨髓或淋巴來源的細(xì)胞，例如，淋巴細(xì)胞(例如，B細(xì)胞和T細(xì)胞，包括細(xì)胞溶解性T細(xì)胞(CTL))、殺傷細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞、多形核細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞。效應(yīng)物細(xì)胞表達(dá)特定的Fc受體并進(jìn)行特定的免疫功能。效應(yīng)物細(xì)胞可以誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)，例如，能夠誘導(dǎo)ADCC的嗜中性細(xì)胞。例如，表達(dá)FcaR的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞和淋巴細(xì)胞參與目標(biāo)細(xì)胞的特異性殺傷，并向免疫系統(tǒng)的其他成分呈遞抗原，或結(jié)合呈遞抗原的細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞也可以吞噬目標(biāo)抗原、目標(biāo)細(xì)胞、轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞或微生物。如在此使用的，術(shù)語"表位"是指能夠特異性結(jié)合到抗體的蛋白質(zhì)決定簇。表位通常由化學(xué)活性的表面分子群集(grouping)例如氨基酸或糖類側(cè)鏈組成，并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特性，以及特定的電荷特征。構(gòu)象和非構(gòu)象的表位的區(qū)別在于在變性溶劑的存在下與前者的結(jié)合會喪失，而與后者的結(jié)合不會喪失。在一個實(shí)施方式中，TRAIL-R1和TRAIL-R2的"表位"是本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑結(jié)合的、TRAIL-R1和/或R2受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的共有的區(qū)域。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，這個表位大約處在跨越SEQIDNO:45的TRAIL-R1的aa218到aa233的氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)域中，或處在跨越SEQIDNO:46的TRAIL-R2的aal67到aal82的氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)域中。為了篩選結(jié)合表位的TRAIL受體結(jié)合劑，可以進(jìn)行常規(guī)的交叉阻斷(cross-blocking)測定，例^t口在Antibodies,^a6orafto^yAfowwa/,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlow和DavidLane(1988)中描述的。這種分析可以用于確定測試的TRAIL受體結(jié)合劑是否結(jié)合與本發(fā)明的TRAIL-Rl和/或TRAIL-R2抗體相同的位點(diǎn)或表位。或者/并且，可以通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行表位作圖(epitopemapping)。例如，可以通過丙氨酸掃描來誘變抗體序列，以鑒定接觸殘基。在另一種方法中，與TRAIL-Rl和TRAIL-R2的不同區(qū)域相應(yīng)的肽可以用于與測試抗體、或與測試抗體及具有已被表征的或已知的表位的抗體進(jìn)行竟?fàn)帨y定。如在此使用的，術(shù)語組合物的"有效量"或"藥學(xué)有效量"或"治療有效量，，，是足以實(shí)現(xiàn)期望的治療和/或預(yù)防效果的量，例如，引起與被治療的疾病相關(guān)的癥狀的防止或減少的lt量，所述疾病例如與目標(biāo)多肽相關(guān)的疾病。施用給受試者的本發(fā)明的組合物的量將取決于疾病的類型和嚴(yán)重度，以及取決于個體的特征，例如一般健康狀態(tài)、年齡、性別、體重和對藥物的耐受性。還將取決于疾病的程度、嚴(yán)重度和類型。技術(shù)人員將能夠取決于這些和其他因素確定合適的劑量。本發(fā)明的組合物也可以相互組合、或與一種或多種其他的治療化合物組合地施用(例如，本發(fā)明的多特異性TRAIL受體結(jié)合劑可以與一種或多種單特異性TRAIL受體結(jié)合劑組合使用。如在此使用的，"表達(dá)"包括但不限于下面的一項或多項基因轉(zhuǎn)錄成前體mRNA;前體mRNA的剪接和其他加工來產(chǎn)生成熟mRNA;mRNA穩(wěn)定性；成熟mRNA翻譯成為蛋白質(zhì)(包括密碼子利用和tRNA可用性)；以及翻譯產(chǎn)物的糖基化和/或其他修飾，如果對于適合的表達(dá)和功能是需要的。如在此使用的，"融合多肽"包括TRAIL受體多肽其與之可操作連接的多肽，所述多肽具有與所述TRAIL受體多肽基本上不同源的多肽(例如，不同于TRAIL受體多肽、且來源于相同或不同生物體的多肽)相應(yīng)的氨基酸序列。如在此使用的，術(shù)語"基因"是指這樣的一段DNA,其含有RNA產(chǎn)物的受調(diào)節(jié)的生物合成的所有信息，包括啟動子、外顯子、內(nèi)含子和控制表達(dá)的其他翻譯的區(qū)域。如在此使用的，術(shù)語"基因型"是指在個體中一對同源染色體上的基因座中，存在于一個或多個多態(tài)性或突變位點(diǎn)中的、不分相的(unphased)5'到3'核香酸對序列。如在此使用的，基因型包括完全基因型和/或亞基因型(sub-genotype)。如在此使用的，術(shù)語"人類序列抗體"包括具有來自人類種系(germline)免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)(如果存在)的抗體。本發(fā)明的人類序列抗體可以包括不被人類種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外的隨機(jī)或定點(diǎn)誘變或通過體內(nèi)的體細(xì)胞突變而引入的突變)。這23些抗體可以在非人類轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生，例如如PCT/^布NO.WO01/14424和WO00/37504中所描述的。然而，如在此使用的，術(shù)語"人類序列抗體"不意圖包括這樣的抗體，其中源自另一個哺乳動物物種(例如小鼠)的CDR序列被移植到人類框架序列上(例如，人源化抗體)。如在此使用的，術(shù)語非人類(例如鼠)抗體的"人源化，，形式，是含有最少的來自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。大體上，人源化的抗體是人免疫球蛋白，在其中受者的高變區(qū)殘基被來自非人物種(供者抗體)一一例如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類一一的、具有期望的特異性、親和性和接受力(capadty)的高變區(qū)殘基所替代。在有些情況下，人免疫球蛋白的Fv骨架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基替代。此外，人源化抗體可以包含既不在受者抗體中存在也不在供者抗體中存在的殘基。進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步改善抗體性能，例如結(jié)合親和力。一般地，人源化抗體將包括至少一個可變域，一般地是兩個可變域的基本上全部(substantiallyall)，其中，所有的或基本上所有的高變環(huán)均對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，而所有的或基本上所有的FR區(qū)均是具有人免疫球蛋白序列的FR區(qū)，但FR區(qū)域可以包括一個或多個氨基酸替換以改善結(jié)合親和力。在FR區(qū)域中這些氨基酸替換的數(shù)目一般是在H鏈中不超過6個，在L鏈中不超過3個。人源化抗體任選地還將包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，一般地是人免疫球蛋白的恒定區(qū)的至少一部分。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)參見Jones等人，Nature321:522畫525(1986);Reichmann等人，Nature332:323-329(1988);andPresta,Curr.Op.Struct,Biol.2:593-596(1992)。本發(fā)明考慮了在此處描述的TRAIL-R1和/或TRAIL-R2結(jié)合抗體的"氨基酸序列修飾"。例如，可能希望改善抗體的結(jié)合親和力和/或其他生物學(xué)性質(zhì)。通過向抗體核酸中導(dǎo)入合適的核苷酸變化或通過肽合成來制備TRAIL-R1和/或TRAIL-R2結(jié)合抗體的氨基酸序列變體。這樣的修飾包括，例如，刪除、和/或插入和/或替換TRAIL-R1和/或TRAIL-R2結(jié)合抗體的氨基酸序列內(nèi)的殘基。只要獲得的抗體具有希望的性質(zhì)，可進(jìn)行刪除、插入和替換的任何組合來獲得感興趣的抗體。修飾還包括蛋白質(zhì)的糖基化模式的改變。一種有用的優(yōu)選誘變位置鑒定方法稱為"丙氨酸掃描i秀變"，如Cunningham和Wellsin>SWe"ce,244:1081-1085(1989)所描述的。然后篩選突變的抗體的希望的活性。本發(fā)明包括具有CGMCC登錄號1665的雜交瘤CTB003所定義的氨基酸序列中添加、刪除和/或替換了一個或多個氨基酸的抗體變體，只要所述抗體變體具有希望的性質(zhì)。如在此使用的，術(shù)語"高變區(qū)，，是指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)一般包含來自"互補(bǔ)決定區(qū)"或"CDR，，(例如，Vl中的殘基23-34(Ll)、50-56(L2)和89-97(L3)左右，和VH中的殘基31-35B(Hl)，50-65(H2)和95-102(H3)左右)(Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991))的氨基酸殘基；和/或來自"高變環(huán)，，(例如，VL中的殘基26-32(LI)，50-52(L2)和91-96(L3)和VH中的26-32(HI)，53-55(H2)和96-101(H3))(Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))的那些殘基。如在此使用的，術(shù)語"同一性，，或百分比"同一性"，當(dāng)在兩個或更多個核酸或多肽序列的上下文中使用時，是指這樣的兩個或更多個序列或子序列過人工比對或目視檢查(參見例如NCBI網(wǎng)站)所測定的，這些序列是相同的，或者具有指定百分比的相同的氨基酸殘基或核苷酸(即，當(dāng)以整個比較窗口或指定區(qū)域上的最大對應(yīng)度來進(jìn)行比較和比對時，在指定的區(qū)域(例如，編碼本文所述抗體的核苷酸序列，或本文所述抗體的氨基酸序列)上有約60%同一性、優(yōu)選的65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性)。然后這些序列被稱為"基本上同一的"。該術(shù)語還指，或者說可以用于，測試序列的互補(bǔ)序列(complement)。該術(shù)語還包括具有刪除和/或添加的序列，以及那些具有替換的序列。如下所述，優(yōu)選的算法可以考慮缺口等等。優(yōu)選地，同一性存在于至少約25個氨基酸或核苷酸長度的區(qū)域上，或者更優(yōu)選地，50-100個氨基酸或核苷酸長度的區(qū)域上。"分離的"或"純化的"多肽或其生物學(xué)活性部分基本上不含來自該TRAIL受體結(jié)合劑所來源的細(xì)胞或組織的細(xì)胞材料或其他污染多肽，或者，當(dāng)它們?yōu)榛瘜W(xué)合成時，基本上不含化學(xué)藥品前體或其他化學(xué)藥品。例如，作為分離的TRAIL受體結(jié)合劑的抗TRAIL受體抗體將不含有干擾該試劑的診斷或治療用途的材料。這樣的干擾材料可以包括酶、激素和其他蛋白質(zhì)性的或非蛋白質(zhì)性的溶質(zhì)。如在此使用的，用語"誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，，或"能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡"是指本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑使有活力的細(xì)胞變得沒有活力的能力。細(xì)胞死亡和細(xì)胞活力可以通過本領(lǐng)域的各種方法，例如錐蟲藍(lán)排出測定和其他細(xì)胞活力分析來測定。在本發(fā)明中，細(xì)胞死亡特別地由"凋亡，，或稱"細(xì)胞程序死亡"所誘導(dǎo)，其根據(jù)下列現(xiàn)象判定膜聯(lián)蛋白V的結(jié)合、DNA的片段化、細(xì)胞皺縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的擴(kuò)張、細(xì)胞破碎、和/或膜嚢(稱為凋亡體)的形成。有很多方法可用于評估與凋亡相關(guān)的細(xì)胞事件。例如，磷脂酰絲氨酸(PS)轉(zhuǎn)位可以通過膜聯(lián)蛋白結(jié)合來測量；DNA片段化可以通過DNA梯狀化(laddering)來評估；核/染色質(zhì)縮合以及DNA片段化可以通過亞二倍體細(xì)胞的任何提高來評估。目標(biāo)細(xì)胞是表達(dá)TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的細(xì)胞，優(yōu)選的，細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，例如，乳腺、結(jié)腸、卯巢、胃、子宮內(nèi)膜、內(nèi)皮、肝臟、腦、唾液腺、肺、腎臟、甲狀腺、胰腺或膀胱細(xì)胞。如在此使用的，術(shù)語"完整抗體"是指具有由二硫鍵互連的至少兩個重(H)鏈多肽和兩個輕(L)鏈多肽的抗體。每個重鏈由一個重鏈可變區(qū)(在此縮寫為HCVR或vh)和一個重鏈恒定區(qū)構(gòu)成。重鏈恒定區(qū)由三個結(jié)構(gòu)域，CH,、CH2和CH3構(gòu)成。每個輕鏈由一個輕鏈可變區(qū)(在此縮寫為LCVR或Vl)和一個輕鏈恒定區(qū)構(gòu)成。輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域d構(gòu)成。Vh和V^區(qū)域可以進(jìn)一步分成高可變性的區(qū)域，稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，這些互補(bǔ)決定區(qū)中間間隔著更為保守的區(qū)域，稱為框架區(qū)域(FR)。每個Vh和VL由三個CDR和四個FR組成，它們從氨基末端到羧基末端按以下順序排列FR!、CDR,、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白對宿主組織或因子的結(jié)合，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如效應(yīng)物細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(Clq)。如在此使用的，術(shù)語"免疫應(yīng)答"是指淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和上述細(xì)胞或肝臟產(chǎn)生的可溶大分子(包括抗體、細(xì)胞因子和補(bǔ)體)的協(xié)同動作，引起人體的癌性細(xì)胞、轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞、惡性黑色素瘤、侵入的病原體、病原體感染的細(xì)胞或組織的選擇性的損害、破壞或消滅；或者，在自體免疫或病理性炎癥的情況下，正常的人類細(xì)胞或組織的選擇性的損害、破壞或消滅。如在此使用的，術(shù)語"免疫交叉反應(yīng)性"和"免疫反應(yīng)性"可互換地使用，26是指與抗體特異性地反應(yīng)的抗原，所述抗體是利用相同的("免疫反應(yīng)性，，)或不同的("免疫交叉反應(yīng)性")抗原產(chǎn)生的。一般地，抗原是TRAIL受體多肽，其變體或子序列。如在此使用的，術(shù)語"免疫反應(yīng)條件，，是指這樣的條件，其容許針對抗原的特定表位而產(chǎn)生的抗體結(jié)合該表位，其結(jié)合的程度可檢測地大于(detectablygreaterthan)基本上所有結(jié)合其他表位的抗體，一般至少高于背景結(jié)合至少兩倍、優(yōu)選的高于背景至少五倍。免疫反應(yīng)條件取決于抗體結(jié)合反應(yīng)的模式，一般是在免疫分析方案中利用的那些條件。免疫分析模式和條"f牛臺々4苗述可參見,Harlow和Lane，^wf/6o(i/es，丄"6or"/o^yA/b"wa/(ColdSpringHarborPublications,NewYork,1988)。如在此使用的，術(shù)語"淋巴細(xì)胞"是指血液、淋巴和淋巴組織中存在的任何單核的、非巨噬細(xì)胞的白細(xì)胞，例如，B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞。如在此使用的，術(shù)語"醫(yī)學(xué)狀況"包括，但不限于，希望對其治療和/或預(yù)防的、表現(xiàn)為一種或多種生理和/或心理學(xué)的癥狀的任何狀況或疾病，包括早先和新近鑒定的疾病和其他病癥。如在此使用的，術(shù)語"調(diào)節(jié)物"包括抑制劑和活化劑。抑制劑是，例如，結(jié)合于、部分地或全部地阻斷刺激、降低、阻止、延遲活化、滅活、去致敏、或下調(diào)TRAIL受體多肽的活性的試劑，例如拮抗劑?；罨锸?，例如，結(jié)合于、刺激、提高、開放、活化、易化、增強(qiáng)活化、致敏或上調(diào)TRAIL受體多肽的活性的試劑，例如激動劑。調(diào)節(jié)物包括，例如，改變TRAIL受體多肽與下列物質(zhì)的相互作用的試劑結(jié)合活化劑或抑制劑的蛋白質(zhì)，受體，包括蛋白質(zhì)、肽、類脂、碳水化合物、多糖或上述物質(zhì)的組合，例如脂蛋白、糖蛋白等等。調(diào)節(jié)物包括天然存在的TRAIL受體多肽的遺傳修飾的型式，例如，活性改變的遺傳修飾型式，以及天然存在的和合成的配體、拮抗劑、激動劑、小化學(xué)分子等等。此處使用的術(shù)語"單克隆抗體"是指這樣的抗體，它獲自基本上同質(zhì)的抗體群體，即除了可能以少量存在的可能自然發(fā)生的突變之外，構(gòu)成所述群體的抗體個體是相同的。例如，單克隆抗體可以是衍生自單個克隆，包括任何真核、原核或噬菌體克隆的抗體，而不是來自產(chǎn)生該抗體的方法。單克隆抗體成分顯示對特定表位的單一的結(jié)合特異性和親和力。單克隆抗體是高度特異性的，針對單個的抗原性位點(diǎn)。此外，與常規(guī)的(多克隆的)抗體制品"~一它們通常包含對不同決定簇(表位)的不同抗體一一形成對照的是，每種單克隆抗體針對的是抗原上的單個決定簇。修飾語"單克隆"表明了抗體"是從實(shí)質(zhì)上同質(zhì)的抗體群體獲得的"這一特性，不能解釋為要求通過任何特別的方法生產(chǎn)抗體。單克隆抗體可以使用本領(lǐng)域已知的多種多樣的技術(shù)來制備，例如但不限于，雜交瘤、重組和噬菌體展示技術(shù)。例如，根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過由Kohler等人，A^/wre256:495(1975)首先描述的雜交瘤方法制備，或可以通過重組DNA方法制備(參見，例如，美國專利No.4,816,567)。"單克隆抗體，，也可以利用，例如，Clackson等人，A^wre352:624-628(1991)和Marks等人，J！Mo/.歷o/.222:58卜597(1991)中描述的技術(shù)從噬菌體抗體庫中分離。如在此使用的，術(shù)語"中和抗體"是指能夠消除或顯著地降低TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的至少一種(l種)生物學(xué)功能的抗體分子。如在此使用的，術(shù)語"核苦酸對，，是指在兩條核苷酸鏈之間相互結(jié)合的兩個核苷酸。如在此使用的，用術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"意圖包括與藥物施用相容的任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌化合物、等滲和吸收延遲化合物，等等。如在此使用的，術(shù)語"多克隆抗體，，是指來自至少兩種(2種)不同的抗體生產(chǎn)細(xì)胞系的抗體的制品。這個術(shù)語的使用包括至少兩種(2種)抗體的制品，其含有與抗原之不同表位或區(qū)域特異性結(jié)合的抗體。如在此使用的，術(shù)語"多核苷酸，，是指任何RNA或DNA,其可以是未修飾或修飾的RNA或DNA。多核普酸非限制性地包括單鏈和雙鏈DNA,單鏈和雙鏈區(qū)域混合物的DNA;單鏈和雙鏈RNA,單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物的RNA;以及包含DNA和RNA的雜交分子，其可以是單鏈，或更一般地是雙鏈，或是單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物。此外，多核苦酸指包含DNA或RNA或DNA與RNA兩者的三鏈區(qū)域。術(shù)語多核苷酸還包括含有一個或多個修飾的堿基的DNA或RNA,以及具有為了穩(wěn)定性或其他理由修飾的骨架。在特定的實(shí)施方式中，多核苷酸含有來自TRAIL受體基因的多核苷酸序列。如在此使用的，術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在此可互換地用來指包含通過肽鍵或修飾的肽鍵連接在一起的兩個或更多個氨基酸的聚合物，即，肽電子等排體。多肽既指短的鏈，通常稱為肽、糖肽或寡聚體；也指較長的鏈，一般稱作蛋白質(zhì)。多肽可以含有20種基因編碼的氨基酸之外的氨基酸。多肽包括通過翻譯后加工等自然過程所修飾的，或通過本領(lǐng)域公知的化學(xué)修飾技術(shù)所修飾的氨基酸序列。這些修飾在基礎(chǔ)教科書以及在更詳細(xì)的專著中，以及在大量研究文獻(xiàn)中有詳盡的記載。在特定的實(shí)施方式中，多肽含有來自TRAIL受體蛋白的多肽序列。如在此使用的，術(shù)語"重組"當(dāng)用來指例如細(xì)胞、或核酸、蛋白質(zhì)或載體時，表明該細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體已經(jīng)通過導(dǎo)入異源核酸或蛋白質(zhì)或天然核酸或蛋白質(zhì)的改變而被修飾，或者所述材料來自這樣修飾的細(xì)胞。因而，例如，重組細(xì)胞表達(dá)在該細(xì)胞的天然(非重組)形式中不存在的基因，或表達(dá)本應(yīng)異常表達(dá)、少量表達(dá)或根本不表達(dá)的天然基因。如在此使用的，用語"拯救受體結(jié)合表位"是指IgG分子(例如，IgG,、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc區(qū)域的一種表位，其是提高IgG分子的體內(nèi)血清半衰期的原因。為了提高抗體的血清半衰期，可以例如象美國專利5,739,277所描述的那樣向抗體(特別是抗體片段)中引入拯救受體結(jié)合表位。如在此使用的，術(shù)語"單鏈抗體"或"單鏈Fv(scFv)"是指Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域VL和VH的抗體融合分子。雖然Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域VL和VH由不同的基因編碼，但可以使用重組方法通過合成接頭來連接它們，所述接頭允許它們作為單一蛋白鏈產(chǎn)生，在該鏈中Vl和VH區(qū)域配對形成單價的分子(稱為單鏈Fv(scFv))。參見，例如，Bird等人,5We聰242:423-426，1988;andHuston等人，尸rac.iVaf/.爿cad5W.C/5^，85:5879-5883,1988)。對術(shù)語"抗體，，片段的提述包括了這種單鏈抗體。這種單鏈抗體可以通過重組技術(shù)或完整抗體的酶學(xué)或化學(xué)裂解來制備。如在此使用的，術(shù)語"小分子"是指這樣的一種成分(composition)，其具有低于約5kDa,更優(yōu)選低于約2kDa的分子量。小分子可以是，例如，核酸、肽、多肽、糖肽、擬肽、碳水化合物、類脂、脂多糖、這些物質(zhì)的組合，或其他有機(jī)或無機(jī)分子。如在此使用的，術(shù)語"特異性結(jié)合"是指TRAIL受體結(jié)合劑和抗原之間結(jié)合親和力為至少10"M的接觸。優(yōu)選的結(jié)合劑以至少約10々M、優(yōu)選1(T8M到1(T9M、10_1GM、1(T"M或10"2M的親和力結(jié)合。如在此使用的，用語"嚴(yán)格雜交條件"是指這樣的條件，在該條件下，探針將與其目標(biāo)子序列(其一般處于復(fù)雜的核酸混合物中)雜交，而不與其他的序列雜交。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，在不同環(huán)境中是不同的。較長的序列在較高的溫度下特異性雜交。對于核酸雜交的廣泛的指導(dǎo)可以在Tijssen，TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology—HybridizationwithNucleicProbes,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993)中找到。一般地，嚴(yán)格條件選4奪為比在確定的離子強(qiáng)度pH下特定序列的熱熔點(diǎn)(Tm)低約5-10°C。Tm可以是這樣的溫度(在確定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)，在該溫度下，在平衡狀態(tài)，與目標(biāo)互補(bǔ)的探針有50o/。與目標(biāo)序列雜交(由于目標(biāo)序列過量存在，在Tm時，平衡狀態(tài)下有50%的探針被占據(jù))。嚴(yán)格條件也可以通過添加去穩(wěn)定劑例如曱酰胺來達(dá)到。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號可以是至少兩倍于背景的雜交，優(yōu)選的10倍于背景的雜交。示例性的嚴(yán)格雜交條件可以是如下50%曱酰胺、5xSSC和1%SDS,在42。C溫育，或5xSSC、1%SDS、在65。C溫育，在0.2xSSC和0.1。/。SDS中在65。C洗滌。如在此使用的，術(shù)語"受試者"是指優(yōu)選所述受試者是哺乳動物，例如人類，但也可以是其他動物，例如家養(yǎng)動物(例如，狗、貓等等)、農(nóng)畜(例如，牛、羊、豬、馬，等等)以及實(shí)驗動物(例如，猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠，等等)。如在此使用的，術(shù)語"替換"是指在本領(lǐng)域中通用的突變之一。這些替換變體在TRAIL-R1和/或TRAIL-R2結(jié)合性抗體分子中至少一個氨基酸殘基被不同的殘基替換。替換突變的最感興趣的位點(diǎn)包括高變區(qū)，但也考慮FR改變。在以下表格中"優(yōu)選替換"的標(biāo)題下列出了"保守性替換"。如果這種替換引起生物學(xué)活性的變化，則可以引入更為實(shí)質(zhì)性的改變(如表3中稱為"示例替換"的那些，或者如下文按氨基酸類型進(jìn)一步描述的)，并篩選產(chǎn)物。表3:氨基酸替換初始?xì)埢纠鎿Q優(yōu)選替換Ala(A)val;leu;ilevalArg(R)lys;gin;asnlysAsn(N)gin;his;asp，lys;arggin30表3:氨基酸替換<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>特別優(yōu)選的替換變體類型包括對親本抗體的一個或多個高變區(qū)殘基的替換。一種方便地產(chǎn)生這種替換變體的方法包括利用噬菌體展示的親和成熟(affinitymaturity)。特別地，將幾個高變區(qū)位點(diǎn)(例如，6-7個位點(diǎn))突變來在每個位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨基酸替換。由此產(chǎn)生的抗體變體作為與封裝在每個顆粒中的、與M13的基因III產(chǎn)物的融合物，以單價形式展示在絲狀噬菌體顆粒上。然后篩選噬菌體所展示的變體的本文所公開的生物學(xué)活性(例如，結(jié)合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選的高變區(qū)位點(diǎn)，可以進(jìn)行丙氨酸掃描誘變來鑒定對于抗原結(jié)合性TRAIL-R1和/或-R2受體有顯著貢獻(xiàn)的高變區(qū)?；蛘?并且，分析抗原抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)來鑒定抗體和TRAIL-R1和/或-R2受體之間的接觸點(diǎn)可能是有益的。這類接觸殘基和鄰近殘基是根據(jù)在此描述的技術(shù)的進(jìn)行替換的候選對象。一旦產(chǎn)生了這類變體，則對一組變體如本文所述進(jìn)行篩選，在一種或多種相關(guān)的測定中具有相似或更優(yōu)性質(zhì)的抗體可以選擇用于進(jìn)一步的開發(fā)。本發(fā)明包括具有對CGMCC登錄號1665的雜交瘤CTB003所定義的免疫球蛋白重鏈或輕鏈的高變結(jié)構(gòu)域的一個或多個氨基酸替換、特別是保守性替換的抗體變體，只要該抗體變體具有希望的性質(zhì)。如在此使用的，術(shù)語"目標(biāo)細(xì)胞，，是指受試者(例如，人類或動物)中的任何細(xì)胞，其可以被本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑所靶向。如在此使用的，術(shù)語"治療劑"意圖指這樣的化合物，當(dāng)以有效量存在時，其對需要它的受試者產(chǎn)生期望的治療效果。如在此使用的，術(shù)語"治療(treating)"或"治療(treatment)，，或"緩解，，(alleviation)是指治療處理(therapeutictreating)以及預(yù)防或防范4晉施，其中的目標(biāo)是阻止或減緩(減輕)作為目標(biāo)的病理狀況或失調(diào)。如果受試者在根據(jù)本發(fā)明的方法接受治療量的本發(fā)明的TRAIL-R1和/或TRAIL-R2結(jié)合抗體之后，顯示該特定疾病的一個或多個體征和癥狀的可觀察的和/或可測量的降低或缺如，則稱受試者被成功地"治療"了表達(dá)TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的癌癥。例如，對于癌癥，癌細(xì)胞的數(shù)目的降^f氐或癌細(xì)胞的不存在；肺瘤大小的降低；腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制(即，減慢一定程度，優(yōu)選停止)；，腫瘤生長在一定程度上的抑制；與該特定癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀的癥狀的緩解時間的延長和/或在一定程度上的減輕；發(fā)病率和死亡率的降低，以及生活質(zhì)量的改善。如在此使用的，術(shù)語"可變，，是指在抗體之中可變區(qū)的某些片段在序列上廣泛地不同的事實(shí)。V結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)抗原結(jié)合，并決定特定抗體對其特定抗原的特異性。然而，可變性在可變區(qū)的整個氨基酸跨度上(acrosstheaminoacidspan)不是均勻分布的。相反，V區(qū)域的組成是這樣的幾個相對不變的、約15-30個氨基酸長的序列段，稱為框架區(qū)(FR)，以及將這些框架區(qū)分隔開來的、可變性極高的較短區(qū)域，稱為"高變區(qū)"，每個高變區(qū)長度約9-12個氨基酸。天然重鏈和輕鏈的每個可變區(qū)都包含四個FR，這些FR主要采取(3-片層結(jié)構(gòu)，通過三個高史區(qū)相互連接，這些高變區(qū)形成環(huán)，所述環(huán)連接所述beta-片層結(jié)構(gòu)，在某些情況下形成所述beta-片層結(jié)構(gòu)的部分。每個鏈中的高變區(qū)被FR緊密維系在一起，并且與來自另一個鏈的高變區(qū)一道對抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成起貢獻(xiàn)(參見Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD.(1991))。恒定域不直接涉及抗體與抗原的結(jié)合，但是顯示出各種效應(yīng)物功能，例如對抗體依賴細(xì)胞細(xì)胞毒性(ADCC)的參與。本發(fā)明的組合物本發(fā)窮的7TL4/丄愛沐碧合^/.在一個方面，本發(fā)明提供了TRAIL受體結(jié)合劑組合物，也稱為結(jié)合劑。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合劑是針對TRAIL受體多肽、其同源物或衍生物的完整抗體。感興趣的結(jié)合劑可以是特異性結(jié)合TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的、但"基本上"不結(jié)合其他TRAIL受體，例如TRAIL-R3或TRAIL-R4的試劑。也就是說，感興趣的抗體可不與其他TRAIL受體，例如TRAIL-R3或TRAIL-R4顯著地交叉反應(yīng)。在這種實(shí)施方式中，如通過熒光活化的細(xì)胞分選(FACS)分析、ELISA或放射免疫沉淀(RIA)所測定的，本發(fā)明的結(jié)合劑對這些蛋白質(zhì)的結(jié)合程度將是低于約10%，優(yōu)選的，低于5%、低于1%。對于本發(fā)明的結(jié)合劑，可以就其所識別或特異性結(jié)合的本發(fā)明多肽的表位或部分，例如TRAIL受體多肽的位于多肽表面的區(qū)域(例如親水性區(qū)域)來對其進(jìn)行描述或規(guī)定。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了TRAIL受體結(jié)合劑，例如針對包含氨基酸序列VXDCTPWSDIECVHKE(SEQIDNO:44)的TRAIL受體多肽(也稱為目標(biāo)多肽)的抗體或抗體相關(guān)多肽，其中氨基酸X優(yōu)選的選自K或G。這種結(jié)合劑具有獨(dú)特的功能特征。通過識別TRAIL-R1和TRAIL-R2共有的共同表位，所述結(jié)合劑能夠結(jié)合TRAIL-R1或TRAIL-R2中的一種類型，或TRAIL-R1和TRAIL-R2兩種類型。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑所結(jié)合的TRAIL-R1或TRAIL-R2受體多肽在一種或多種細(xì)胞的表面表達(dá)。所述結(jié)合劑在體內(nèi)和體外選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。癌細(xì)胞可以單獨(dú)表達(dá)TRAIL-R1或TRAIL-R2，或共表達(dá)兩者。根據(jù)它廣泛的抗癌活性，本發(fā)明作為用于凋亡信號傳導(dǎo)研究的試劑、以及作為有效針對表達(dá)TRAIL受體的細(xì)胞的治療劑具有實(shí)用性，所述細(xì)胞例如包括廣泛的癌細(xì)胞種類。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了表4中概述的TRAIL受體結(jié)合劑。表4:優(yōu)選的TRAIL受體結(jié)合劑結(jié)合劑類型說明表4:優(yōu)選的TRAIL受體結(jié)合劑<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>在表4(上文)中總結(jié)的與TRAIL受體結(jié)合劑相關(guān)的生物材料保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC),中國微生物菌種保藏管理委員會，北京郵政信箱2714，10080，中華人民共和國。詳見下面的表5。表5:生物保藏<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表5:生物保藏保藏物名稱材料曰期保藏號hCTB006LC(pcDNAIII-hCTB006畫LC)人類CTB006輕鏈的質(zhì)粒DNA2007年4月13日2002hCTB006HC(pcDNAIII-hCTB006-HC)人類CTB006重鏈的質(zhì)粒DNA2007年4月13曰2003hCTB007LC(pcDNAIII-hCTB007-LC)人類CTB007輕鏈的質(zhì)粒DNA2007年4月13曰2004hCTB007HC(pcDNAIII-hCTB007畫HC)人類CTB007重鏈的質(zhì)粒DNA2007年4月13曰2005在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種闡明TRAIL-R1和TRAIL-R2共有的其他拮抗性表位的方法，這些表位可以用于通過與TRAIL-R1和/或TRAIL-R2結(jié)合來產(chǎn)生凋亡誘導(dǎo)抗體。針對所述表位的結(jié)合劑可以具有不同的可變區(qū)或CDR區(qū)域，但應(yīng)當(dāng)具有本發(fā)明的抗體的結(jié)合特征和功能特征。作為產(chǎn)生靶向抗體的手段，可以生成顯示親水性和疏水性的區(qū)域的親水性分布圖，這樣的分布圖可以通過任何本領(lǐng)域公知的方法來生成，包括，例如，KyteDoolittle或HoppWoods方法，有或者沒有傅里葉變換(參見，例如Hopp和Woods,Jcad78:3824-3828(1981);Kyte和Doolittle，JMo/.5fo/.157:105-142(1982))。表位或多肽部分可以如本文中描述的那樣來具體指定，例如指定其N-末端和C-末端位置、大小(以連續(xù)氨基酸殘基數(shù)計)。本發(fā)明包括特異性結(jié)合本發(fā)明的多肽并容許其排除的結(jié)合劑。本發(fā)明包括特異性結(jié)合表位的結(jié)合劑，其中所述表位是構(gòu)象表位或非構(gòu)象表位。如上所述，構(gòu)象和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于在存在變性溶劑的情況下與前者的結(jié)合會喪失，而與后者的結(jié)合不會喪失。本發(fā)明的結(jié)合劑也可以基于它們的交叉反應(yīng)性來描述或具體指定。本發(fā)明包括不結(jié)合本發(fā)明的目標(biāo)多肽的任何其他類似物、直系同源物(ortholog)或同源物的結(jié)合劑。不結(jié)合與本發(fā)明的多肽具有低于95%、低于90%、低于85%、低于80%、低于75%、低于70%、低于65%、低于60%、低于55%以及低于50%的同一性(利用本領(lǐng)域已知的和在此描述的方法計算的)的結(jié)合劑也被包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明進(jìn)一步包括這樣的結(jié)合劑，其僅結(jié)合在嚴(yán)格雜交條件下(如在此描述的)與本發(fā)明的多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽。一個方面，本發(fā)明提供TRAIL受體結(jié)合劑(例如，抗體)，其結(jié)合TRAIL受體1(TRAIL-R1)多肽和/或TRAIL受體2(TRAIL-R2)多肽，其中所述結(jié)合劑(抗體)以它的可溶形式在低濃度下在表達(dá)TRAIL-R1和/或TRAIL-R2多肽的癌細(xì)胞中具有體內(nèi)和體外的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性。在一個實(shí)施方式中，所述TRAIL受體結(jié)合劑結(jié)合在至少一個(種)細(xì)胞(atleastonecell)的表面表達(dá)的TRAIL受體1(TRAIL-R1)多肽和/或TRAIL受體2(TRAIL-R2)多肽。也就是說，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑可以結(jié)合在單個(種)細(xì)胞上表達(dá)的TRAIL-R1和/或TRAIL-R2受體多肽，或結(jié)合在超過一個(種)細(xì)胞(例如，兩個(種)細(xì)胞)上表達(dá)的TRAIL-R1/-R2多肽。在一個實(shí)施方式中，所述TRAIL受體結(jié)合劑結(jié)合TRAIL受體1(TRAIL-R1)和/或TRAIL受體2(TRAIL-R2)之間至少百分之90氨基酸同源性(例如，同一性)的多肽區(qū)域。在一個實(shí)施方式中，所述TRAIL受體結(jié)合劑結(jié)合TRAIL受體1(TRAIL-R1)和/或TRAIL受體2(TRAIL-R2)之間具有至少百分之95氨基酸同源性(例如，同一性)的多肽區(qū)域。在一個實(shí)施方式中，所述TRAIL受體結(jié)合劑結(jié)合TRAIL受體1(TRAIL-R1)和/或TRAIL受體2(TRAIL-R2)之間具有至少百分之98氨基酸同源性(例如，同一性)的多肽區(qū)域。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑結(jié)合TRAIL-R1和TRAIL-R2多肽之間同源的區(qū)域，其中所述區(qū)域包含氨基酸序列VXDCTPWSD正CVHKE(SEQIDNO:44)，其中X是K或G。氨基酸同源性(例如，同一性)可以使用本領(lǐng)域已知的和在此描述的方法計算。本發(fā)明的結(jié)合劑也可以就它們的結(jié)合親和力來描述或具體指定。優(yōu)選的結(jié)合親和力包括具有低于5xl(T6M、1(T6M、5xl(T7M、10—7M、5xl(T8M、10—8M、5xl(T9M、1(T9M、5xl(T1()M、10-1()M、5xl0-uM、10"M、5xl(T12M、1(T12M、5xl0-13M、1(T13M、5xl(T"M、IO國"M、5xlO"5M和10"5M的離解常數(shù)或Kd的那些。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供這樣的TRAIL受體結(jié)合劑，其以不高于lxl0-s的Kd值，優(yōu)選的不高于約lxl0一的Kd值至少結(jié)合人類TRAIL-R1和/或TRAIL-R2。本發(fā)明的范圍內(nèi)的TRAIL受體結(jié)合劑包括，例如但不限于，特異性結(jié)合目標(biāo)多肽、其同源物、衍生物或片段的單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合36抗體、人源化抗體、雙抗體，以及人類單克隆抗體和人類多克隆抗體。如在此使用的，"TRAIL受體樣多肽"是指不同于TRAIL受體多肽但與本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑具有免疫反應(yīng)性的多肽。TRAIL受體樣多肽可以來自與TRAIL受體多肽相同的生物體或不同的生物體。TRAIL受體樣多肽可以由與TRAIL受體多肽相同的基因或不同的基因編碼。作為本發(fā)明的結(jié)合劑有用的抗體包括，例如但不限于，IgG(包括IgGj、IgG2、IgG""gG4)、IgA(包4舌IgA!和IgA2)、IgD、IgE或IgM,以及IgY。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合劑是針對TRAIL受體多肽其同源物或衍生物的抗體相關(guān)的多肽。一般地，結(jié)合劑的抗原結(jié)合區(qū)域，例如抗TRAIL受體結(jié)合區(qū)域，是本發(fā)明的結(jié)合劑的結(jié)合特異性和親和力中最關(guān)鍵的。在某些實(shí)施方式中，TRAIL受體結(jié)合劑是抗TRAIL受體多肽抗體，例如抗TRAIL受體多肽單克隆抗體、抗TRAIL受體多肽嵌合抗體和抗TRAIL受體多肽人源化抗體，它們已經(jīng)^^修飾，例如通過刪除、添加或替換抗體的一部分而被修飾。例如，抗TRAIL受體多肽抗體意圖提高抗體的半衰期，例如，血清半衰期、穩(wěn)定性或親和力。在一個實(shí)施方式中，通過產(chǎn)生雜交瘤來便利化對TRAIL受體多肽的特定結(jié)構(gòu)域特異性的抗體的選擇，所述雜交瘤結(jié)合具有這種結(jié)構(gòu)域的TRAIL受體多肽的片段。因而，本文也提供這樣的TRAIL受體結(jié)合劑，它們是對TRAIL受體多肽或其衍生物、片段、類似物或同源物內(nèi)期望的結(jié)構(gòu)域具有特異性的抗體。本發(fā)明進(jìn)一步包括這樣的抗體，它們是針對本發(fā)明的結(jié)合劑的抗獨(dú)特型。本發(fā)明的結(jié)合劑可以是單特異性、雙特異性、三特異性的，或更多特異性的。多特異性結(jié)合劑可以特異于本發(fā)明的TRAIL受體多肽的不同的表位，或可以既特異于本發(fā)明的TRAIL受體多肽，又特異于異源組分(compositions),例如異源多肽或固相支持材料。參見，例如，WO93/17715;WO92/08802;WO91/00360;WO92/05793;Tutt等人，//wmw"o/.147:60-69(1991);美國專利Nos.5,573,920,4,474,893，5,601,819，4,714,681，4,925,648;6,106,835;Kostelny等人，《//wmw"o/.148:1547-1553(1992)。本發(fā)明的結(jié)合劑可以來自任何動物來源，包括鳥類和哺乳動物。優(yōu)選的，結(jié)合劑是人類、鼠、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞的。本發(fā)明的結(jié)合劑適合于在有需要的場合(利用用于調(diào)節(jié)TRAIL受體多肽功能)向受試者施用。因而，本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供TRAIL受體結(jié)合劑組合物(compositions)，它們是TRAIL受體調(diào)節(jié)物，例如TRAIL受體多肽的功能拮抗劑或功能激動劑。本發(fā)明的目的還在于提供這樣的TRAIL受體結(jié)合劑成分，它們是TRAIL受體多肽的部分拮抗劑(partialantagonist)或部分激動劑(partialagonist)。同樣地，本發(fā)明包括抗TRAIL受體中和抗體，其結(jié)合TRAIL受體多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合劑將純化至(a)抗體如Lowry方法(Lowry等人，J歷o/.O^w.265.1951)所測定的超過95%重量；(2)達(dá)到通過使用旋轉(zhuǎn)杯測序儀足以獲得至少15個N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)達(dá)到利用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選的銀染色在還原或非還原條件下SDS-PAGE的均一。分離的結(jié)合劑包括原位存在于重組細(xì)胞內(nèi)的多肽，這是因為抗體的天然環(huán)境的至少一種成分將不會存在。然而通常地，TRAIL受體結(jié)合劑，例如分離的抗TRAIL受體抗體，將通過至少一個純化步驟來制備。本發(fā)明進(jìn)一步涉及在可用于鑒定、設(shè)計和生產(chǎn)作為TRAIL受體多肽的調(diào)節(jié)物起作用的化合物的、基于結(jié)構(gòu)的方法。本發(fā)明的結(jié)合劑可以單獨(dú)地或與其他組合物(compositions)組合地使用。例如，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑可以與本領(lǐng)域已知的一種或多種抗TRAIL受體單克隆抗體，例如但不限于Zhou等人，US2003/0198637;Zhou等人，US2003/0190687所描述的那些；以及抗TRAIL-R2抗體TRA-8(Sankyo)組合地使用。本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑可以進(jìn)一步在N或C末端重組地融合到異源多肽，或化學(xué)地綴合(包括共價和非共價地綴合)到多肽或其他組合物(compositions)。例如，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑可以重組地融合或綴合到可在4企測分析中作為標(biāo)記的分子和效應(yīng)分子，例如異源多肽、藥物或毒素。參見，例如，WO92/08495;WO91/14438;WO89/12624;美國專利No.5,314,995;和EP0396387。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑是抗TRAIL受體抗體或抗TRAIL受體抗體相關(guān)多肽，它們偶聯(lián)或綴合到一種或多種治療性或細(xì)胞毒性模塊來產(chǎn)生本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑綴合蛋白質(zhì)。本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑綴合蛋白質(zhì)可以用于修飾給定的生物應(yīng)答或產(chǎn)生生物應(yīng)答(例如，以募集效應(yīng)物細(xì)胞)。治療性模塊不應(yīng)被為限于經(jīng)典的化學(xué)治療劑。例如，治療性模塊可以是具有期望的生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或多肽。這些蛋白質(zhì)可以包括，例如，酶活性毒素，或其活性片段，如相思豆毒蛋白、篦麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，例如腫瘤壞死因子或干擾素-a;或生物應(yīng)答修飾物，例如，淋巴因子、白細(xì)胞介素-1("IL-r)、白細(xì)胞介素-2("IL-2")、白細(xì)胞介素-6("IL-6")、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子("GM-CSF，，)、粒細(xì)胞集落刺激因子("G-CSF,)、或其他生長因子。本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑的制備方法一疾/乾迷.首先，選擇目標(biāo)多肽，針對它可以產(chǎn)生(raise)本發(fā)明的結(jié)合劑(例如抗TRAIL受體抗體)。產(chǎn)生針對目標(biāo)多肽的結(jié)合劑的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。這樣的技術(shù)的實(shí)例包括，例如但不限于，涉及展示庫、人抗體轉(zhuǎn)基因小鼠(xenomouse)或人單抗轉(zhuǎn)基因小鼠(humabmouse)、雜交瘤等等的那些。在本發(fā)明的范圍內(nèi)的目標(biāo)多肽包括能夠展現(xiàn)抗原性的任何多肽或多肽衍生物。實(shí)例包括但不限于，蛋白質(zhì)(例如，受體、酶、激素、生長因子)、肽、糖蛋白、脂蛋白、TRAIL受體多肽，等等。示范性的目標(biāo)多肽還包括細(xì)菌、真菌和病毒病原體，其引起人類疾病，例如HIV、肝炎(曱型、乙型和丙型)、流感、皰瘆、賈第鞭毛蟲、瘧疾、利什曼蟲(Leishmania)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。其他目標(biāo)多肽是表達(dá)水平或組成與人類疾病或其他表型相關(guān)的人類蛋白質(zhì)。感興趣的其他目標(biāo)多肽包括腫瘤細(xì)胞抗原和病毒顆粒^元原。來使用，而且重組地工程化的抗體和抗體片段，例如，針對TRAIL受體多肽的抗體相關(guān)的多肽也是適合的。可以進(jìn)行在此闡述的技術(shù)的結(jié)合劑，例如，抗TRAIL受體抗體，包括單克隆的和多克隆的抗體，和抗體片段，例如Fab、Fab，、F(ab，)2、Fd、scFv、雙抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈和/或抗體片段。已經(jīng)描述了對于含抗體Fv的多肽，例如Fab，和F(ab，)2抗體片段的高產(chǎn)量產(chǎn)生有用的方法。參見美國專利No.5,648,237。一般地，結(jié)合劑從來源物種獲得。更特別地，獲得對目標(biāo)多肽抗原具有特異性的來源物種抗體的輕鏈、重鏈或兩者的可變部分的核酸或氨基酸序列。來源物種是任何對于產(chǎn)生本發(fā)明的結(jié)合劑或結(jié)合劑的文庫有用的物種，例如大鼠、小鼠、兔、雞、猴、人類，等等。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，TRAIL受體結(jié)合劑是抗TRAIL受體抗體。噬菌體或噬菌粒展示技術(shù)是得到本發(fā)明的結(jié)合劑的有用的技術(shù)。在本發(fā)明中有用的抗TRAIL受體抗體是"人類抗體，，(例如，分離自人類的抗體)或"人類序列抗體"。人類抗體可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法包括噬菌體展示方法來產(chǎn)生。也參見，美國專利4,444,887、4,716,111、5,545,806和5,814,318;以及WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735和WO91/10741。已經(jīng)描述了用于通過篩選多聚噬菌體(polyphage)顆粒來鑒定多聚體多肽復(fù)合物中的成員的編碼核酸序列的方法。Rudert等人，美國專利6,667，150。另外，可以產(chǎn)生重組免疫球蛋白。Cabilly,美國專利4,816,567;Cabilly等人，U.S.6,331,415和Queen等人，Proc.Nat，lAcad.Sci.USA86:10029-10033,1989。產(chǎn)生和克隆單克隆抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑優(yōu)選的具有高免疫反應(yīng)性，也就是說，正確折疊從而能特異性結(jié)合目標(biāo)抗原的抗體分子的百分比。編碼結(jié)合劑，例如本發(fā)明的抗體的序列的表達(dá)可以如下文所述在大腸桿菌(E.coli)中進(jìn)行。這樣的表達(dá)通常產(chǎn)生至少80%、90%、95%或99%的免疫反應(yīng)性。這些蛋白質(zhì)或基因的某些截短物能行使完整序列蛋白質(zhì)或基因的調(diào)節(jié)功能或酶功能。例如，可以通過能提供功能上等同的蛋白質(zhì)或基因的替換、添加、刪除或多聚體表達(dá)來改變編碼它們的核酸序列。由于核酸編碼序列的簡并性，編碼與天然存在的蛋白質(zhì)的序列基本上相同的氨基酸序列的其他序列可以在本發(fā)明的實(shí)踐中使用。這些序列包括但不限于包括編碼上述多肽的核酸序列的全部或部分的核酸序列，這樣的核酸序列的改變是通過用編碼序列內(nèi)的功能等同氨基酸殘基的不同密碼子進(jìn)行替換，由此產(chǎn)生沉默的改變(silentchange)。要理解的是，根據(jù)本發(fā)明的免疫球蛋白的核苦酸序列可以容忍最多達(dá)25%的序列同源性變異_一按照通過標(biāo)準(zhǔn)方法所計算的("CurrentMethodsinSequenceComparisonandAnalysis,"MacromoleculeSequencingandSynthesis,SelectedMethodsandApplications,pp.127-149,1998，AlanR.Liss,Inc.)——只要這種變體形成識別TRAIL-R1和TRAIL-R2的起作用的抗體。例如，多肽序列內(nèi)的一個或多個氨基酸殘基可以被替換40為作為功能等同物的、具有類似極性的其他氨基酸，從而產(chǎn)生沉默的改變。用于替換序列內(nèi)的氨基酸的氨基酸可以從被替換的氨基酸所屬的類別的其他成員中選擇。例如，非極性的(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和曱硫氨酸。極性的中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電的(堿性的)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電的(酸性的)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。本發(fā)明的范圍還包括在翻譯期間或之后被差異地修飾——例如通過糖基化、蛋白酶切割、與抗體分子或其他細(xì)胞配體連接等方式——的蛋白質(zhì)或其片段或衍生物。另外，可以對抑制劑的編碼核酸序列進(jìn)行體外或體內(nèi)突變來產(chǎn)生和/或破壞翻譯、起始和/或終止序列，或在編碼區(qū)域中產(chǎn)生變異，和/或形成新的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，或破壞先前存在的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，來促進(jìn)進(jìn)一步的體外修飾?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的用于誘變的任何技術(shù)，包括但不限于體外定點(diǎn)誘變J.Biol.Chem.253:6551,Tab接頭(Pharmacia)的使用等等。;^聲我A清和名瘦^的賴備.產(chǎn)生本發(fā)明的抗體或抗體片段的方法一般包括用純化的TRAIL受體多肽或用表達(dá)TRAIL受體多肽的細(xì)胞免疫受試者(一般是非人類受試者，例如小鼠或兔)。TRAIL受體多肽的任何免疫原性部分都可以被采用作為免疫原。合適的免疫原性制備物可以含有，例如，重組表達(dá)的TRAIL受體多肽或化學(xué)合成的TRAIL受體多肽?？梢允褂梅蛛x的TRAIL受體多肽或其部分或片段作免疫原，利用多克隆和單克隆抗體制備的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來產(chǎn)生結(jié)合TRAIL受體多肽或其部分或片段的TRAIL受體結(jié)合劑。可以使用全長TRAIL受體多肽，或者，作為選擇，本發(fā)明提供了TRAIL受體多肽片段作為免疫原的用途。TRAIL受體多肽包含SEQIDNO:1所示氨基酸序列的至少四個氨基酸殘基，并包括TRAIL受體多肽的表位，從而針對所述肽產(chǎn)生的抗體與所述TRAIL受體多肽形成特異性免疫復(fù)合物。優(yōu)選地，抗原肽包含至少5、8、10、15、20或30個氨基酸殘基。取決于用途并根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，更長的抗原肽有時比較短的抗原肽是更優(yōu)選的。一般地，免疫原將是長度至少約8個氨基酰殘基，優(yōu)選的至少約IO個?；鶜埢L度。給定表位的多聚體有時比單體更有效。如果需要，TRAIL受體多肽(或其片段)的免疫原性可以通過融合或綴合于半抗原例如鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)或卵清蛋白(OVA)來提高。許41多這類半抗原是本領(lǐng)域已知的。人們也可以組合TRAIL受體多肽和常規(guī)的佐劑，例如弗氏完全或不完全佐劑來提高受試者對所述多肽的免疫反應(yīng)。用于提高免疫反應(yīng)的各種佐劑包括，但不限于，弗氏(完全和不完全的)、礦物質(zhì)凝膠(例如，氫氧化鋁)、表面活性物質(zhì)(例如，溶血卵磷脂、普流尼克(pluronic)多元醇、聚陰離子、肽、油乳液、二硝基苯酚，等等)、人類佐劑例如卡介苗和短小棒狀桿菌(Cw7"eZwc&Ww/w;"rv"w)，或相似的免疫刺激性化合物。這些技術(shù)是本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的。為了方便起見，在本發(fā)明中免疫應(yīng)答常常被描述為"初次"或"二次"免疫反應(yīng)。初次免疫應(yīng)答，其也被描述為"保護(hù)性"免疫應(yīng)答，是指作為對于特定抗原(例如TRAIL受體多肽)的某種初次暴露(例如初次"免疫")的結(jié)果，在個體中產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。這種免疫可以，例如，作為對抗原(例如，來自某些展現(xiàn)或呈遞抗原的病原體的初次感染)的某種天然的暴露的結(jié)果而發(fā)生，也可以來自個體中某些腫瘤(例如惡性黑色素瘤)的癌細(xì)胞所呈遞的抗原。做為選擇，免疫的發(fā)生可以是用含有抗原的疫苗接種個體的結(jié)果。例如，疫苗可以是包含來自TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的一種或多種抗原的TRAIL受體疫苗。初次免疫應(yīng)答可以隨著時間減弱或衰減，甚至可以消失或至少變得太衰弱而不能被檢測。因而，本發(fā)明還涉及"二次，，免疫反應(yīng)，其在此還被描述為"記憶免疫反應(yīng)，，。術(shù)語二次免疫反應(yīng)是指在已經(jīng)產(chǎn)生初次免疫應(yīng)答之后在個體中引發(fā)的免疫反應(yīng)。因而，可以引發(fā)二次或免疫應(yīng)答，例如，來增強(qiáng)已經(jīng)變得減弱或衰減的現(xiàn)有免疫應(yīng)答，或來重建消失的或不能再被檢測的早先的免疫應(yīng)答。作為實(shí)例而不是為了限制，二次免疫應(yīng)答可以通過向個體重新導(dǎo)入引發(fā)初次免疫應(yīng)答的抗原，例如TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽(例如，通過重新施用疫苗)來引發(fā)。然而，針對抗原的二次免疫應(yīng)答也可以通過施用不含有實(shí)際的抗原的其他試劑來引發(fā)。例如，本發(fā)明提供了通過向個體施用TRAIL受體結(jié)合劑來強(qiáng)化二次免疫應(yīng)答的方法。在這樣的方法中，實(shí)際的抗原不必與TRAIL受體結(jié)合劑一起施用，含有TRAIL受體結(jié)合劑的組合物不必含有抗原。二次或記憶免疫應(yīng)答可以是體液的(抗體)應(yīng)答或細(xì)胞的應(yīng)答。二次或記憶體液反應(yīng)在抗原的初次呈遞時產(chǎn)生的記憶B細(xì)胞受到刺激時發(fā)生。延遲型超敏反應(yīng)(DTH)反應(yīng)是一種細(xì)胞的二次或記憶免疫應(yīng)答，其由CD4+細(xì)胞介導(dǎo)。對于抗原的第一次暴露致敏免疫系統(tǒng)，另外的暴露引起DTH。在合適的免疫之后，可以從受試者的血清制備TRAIL受體結(jié)合劑，例如，抗TRAIL受體多克隆抗體。如果需要，可以從哺乳動物(例如，從血液)分離針對TRAIL受體多肽的抗體分子，并進(jìn)一步通過公知的技術(shù)，例如多肽A層析來進(jìn)一步純化，以獲得IgG級分。卓^發(fā)我伴.在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，所述結(jié)合劑是抗TRAIL受體單克隆抗體。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，所述抗TRAIL受體單克隆抗體是人類抗TRAIL受體單克隆抗體。對于針對特定的TRAIL受體多肽或其衍生物、片段、類似物或同源物的單克隆抗體的制備，可以利用任何通過連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)來提供抗體分子的產(chǎn)生的技術(shù)。這些技術(shù)包括，但不限于，雜交瘤技術(shù)(參見,例如Kohler和Milstein,1975.Nature256:495-497);三源雜交瘤(trioma)技術(shù)；人類B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(參見，例如Kozbor等人，1983.Immunol.Today4:72)和EBV雜交瘤技術(shù)，來產(chǎn)生人類單克隆抗體(參見，例如Cole等人，1985.MONOCLONALANTIBOD正SANDCANCERTHERAPY,AlanR.Liss，Inc.,pp.77-96)。人類單克隆抗體可以在本發(fā)明的實(shí)踐中利用，可以通過使用人類雜交瘤(參見例如Cote等人，1983.ProcNatlAcadSciUSA80:2026-2030)或通過用EB病毒體外轉(zhuǎn)化人類B細(xì)胞(參見例如Cole等人，1985.MONOCLONALANTIBODIESANDCANCERTHERAPY,AlanR.Liss，Inc.，pp.77-96)來產(chǎn)生。例如，可以分離編碼抗體的區(qū)域的核酸的群體。利用來自編碼抗體的保守區(qū)域的序列的引物進(jìn)行PCR，從群體擴(kuò)增編碼抗體的部分的序列，然后從擴(kuò)增的序列重建編碼抗體或其片段(例如可變域)的DNA。這種擴(kuò)增的序列還可以融合于編碼其他蛋白質(zhì)(例如，噬菌體包殼，或細(xì)菌細(xì)胞表面蛋白質(zhì))的DNA，用于融合多肽在噬菌體或細(xì)菌上的表達(dá)或展示。然后可以將擴(kuò)增的序列加以表達(dá)，并根據(jù)，例如，所表達(dá)的抗體或其片段對TRAIL受體多肽上呈現(xiàn)的抗原或表位的親和力來加以進(jìn)一步選擇或分離。作為選擇，表達(dá)抗TRAIL受體單克隆抗體的雜交瘤可以通過免疫受試者，然后利用常規(guī)方法從受試者的脾臟分離雜交瘤來制備。參見，例如，Milstein等人(Galfre和Milstein,M"/zocfe五"zjmo/(1981)73:3-46)。利用標(biāo)準(zhǔn)方法篩選雜交瘤將產(chǎn)生具有不同的特異性(即，針對不同的表位)和親和力的單克隆抗體。具有希望的性質(zhì)(例如TRAIL受體結(jié)合)的選定的單克隆抗體可以如雜交瘤所表達(dá)的來使用，可以將它結(jié)合到聚乙二醇(PEG)等分子來改變它的性質(zhì)，或可以分離編碼它的cDNA,對其加以測序并以各種方式操作。可以向合成的杉于型體(dendromeric)樹添加反應(yīng)性的氨基酸側(cè)鏈，例如賴氨酸，來增強(qiáng)TRAIL受體多肽的免疫原性性質(zhì)。并且，CPG二核苷酸技術(shù)可以用于增強(qiáng)TRAIL受體多肽的免疫原性性質(zhì)。其他操作包括替換或刪除對于保存期間或在向受試者施用之后的抗體不穩(wěn)定性有貢獻(xiàn)的特定氨基?；鶜埢约坝H和成熟技術(shù)來改善TRAIL受體多肽的抗體的親和力。染i^f^j.在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合劑是通過雜交瘤產(chǎn)生的抗TRAIL受體單克隆抗體，所述雜交瘤包括從轉(zhuǎn)基因非人動物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的、具有包含人類重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組、融合到永生細(xì)胞的B細(xì)胞。雜交瘤技術(shù)包括本領(lǐng)域已知的那些，在Harlow等人，爿Z^fZ)ora/or>>Mawwa/ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY,349(1988);Hammerling等人，Mowoc/owa/爿w幼cxto爿mf!T-CW///y6nWomos,563-681(1981)中有所教導(dǎo)。產(chǎn)生雜交瘤和單克隆抗體的其他方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。^霧謬看^^^.如上所述，本發(fā)明的結(jié)合劑可以通過應(yīng)用重組DNA和噬菌體展示技術(shù)來產(chǎn)生。例如，本發(fā)明的結(jié)合劑，例如，抗TRAIL受體抗體，可以使用本領(lǐng)域已知的各種噬菌體展示方法來制備。在噬菌體展示方法中，功能性抗體結(jié)構(gòu)域被展示在噬菌體顆粒的表面，噬菌體顆粒攜帶編碼它們的多核苦酸序列。通過直接用抗原(一般是結(jié)合或被捕獲到固體表面或珠子上的抗原)進(jìn)行選擇，可以從抗體庫或組合抗體文庫(例如，人類或鼠的)選擇具有希望的結(jié)合性質(zhì)的噬菌體。這些方法中使用的噬菌體一般是絲狀噬菌體，包括fd和M13，.而Fab、Fv或二硫化鍵穩(wěn)定化的Fv抗體結(jié)構(gòu)域重組融合于噬菌體基因III或基因VIII蛋白質(zhì)。此外，方法可以調(diào)適用于構(gòu)建Fab表達(dá)庫(參見，例如Huse等人，Science,246:1275-1281,1989)來容許快速而有效地鑒定對TRAIL受體多肽(例如，多肽或其衍生物、片段、類似物或同源物)具有希望的特異性的單克隆Fab片段?？梢杂脕懋a(chǎn)生本發(fā)明的結(jié)合劑的噬菌體展示方法的其他實(shí)例包括在Huston等人，/Voc.A^/.爿cadt/,SJ.，85:5879-5883,1988;Chaudhary等人，/Voc.iVa"^cadSc/C/.S.A，87:1066-1070,1990;Brinkman等人，/mmw"o/.MeAoA182:41-50，441995;Ames等人，《//mww"o/.MeAoA184:177-186，1995;Kettleborough等人，五wr//廳畫/.24:952-958,1994;Persic等人，G騰187:9-18，1997;Burton等人，A/va"caw."/mmw"o/ogy57:191-280，1994;PCT/GB91/01134;WO90/02809;WO91/10737;WO92/01047;WO92/18619;WO93/11236;WO95/15982;WO95/20401;WO96/06213;WO92/01047(MedicalResearchCouncil等人)；WO97/08320(Morphosys);WO92/01047(CAT/MRC);W091/17271(Affymax);和美國專利5，698，426、5,223,409、5，403，484、5,580,717、5,427，卯8、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5，427，908、5,516,637、5,780,225、5，658，727和5,733,743中公開的那些。對于通過用二硫鍵連接多肽而在噬菌體顆粒的表面上展示多肽的方法已經(jīng)在Lohning,美國專利6，753，136中有所描述。如在上述參考文獻(xiàn)中描述的，在噬菌體選擇之后，可以從噬菌體分離抗體編碼區(qū)并用于產(chǎn)生完整的抗體，包括人類抗體、或任何其他希望的抗原結(jié)合片段，并在任何希望的宿主中表達(dá)，包括哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母和細(xì)菌。例如，也可以利用重組產(chǎn)生Fab、Fab，和F(ab，)2片段的技術(shù)，這些技術(shù)利用本領(lǐng)域已知的方法，例如在WO92/22324;Mulli腿等人，腸rec/zm々腦12:864-869,1992;和Sawai等人，JJi/34:26-34，1995;和Better等人，5We"ce240:1041-1043,1988中公開的那些。一般地，為了鑒定出維持了良好的結(jié)合活性的變體，可以將克隆到展體或抗體片段將存在于噬菌體或噬菌粒顆粒的表面上。參見，例如，BarbasIII等人，尸/zageZ)/5^/ay，Z^360n3/or7A/a"wa/(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，2001)。然而，這個過程可以使用其他載體模式，例如，將抗體片段文庫克隆到裂解性噬菌體載體(修飾的T7或LambdaZap系統(tǒng))中用于選擇和/或篩選。#逸的7TM/丄憂謬潛合豸的^這.如上所述，本發(fā)明的結(jié)合劑可以通過重組DNA技術(shù)的應(yīng)用來產(chǎn)生。編碼本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑的重組多核芬酸構(gòu)建體一般包括與抗TRAIL受體抗體鏈的編碼序列可操作地連接的表達(dá)控制序列，包括天然相關(guān)的或異源的啟動子區(qū)域。因而，本發(fā)明的另一個方面包括含有一個或多個編碼本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑的核酸序列的載體。對于本發(fā)明的一種或多種多肽的重組表達(dá)，通過本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)，并如以下詳述地，將含有編碼TRAIL受體結(jié)合劑的核苷酸序列的全部或一部分的核酸插入合適的克隆載體或表達(dá)載體(即，含有用于轉(zhuǎn)錄和翻"^所插入的多肽編碼序列的必需元件的載體)中。產(chǎn)生多樣性的載體群體的方法已經(jīng)由Lerner等人，美國專利No.6,291,160;6,680,192描述了。'一般地，在重組DNA技術(shù)中有用的表達(dá)載體通常是質(zhì)粒的形式。在本說明書中，"質(zhì)粒，，和"載體"可互換地使用，因為質(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明意圖包括行使等同功能的、從技術(shù)上說不屬質(zhì)粒的其他形式的表達(dá)載體，例如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷性逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。這種病毒載體可用于感染受試者和在受試者中表達(dá)化合物。優(yōu)選地，表達(dá)控制序列是能夠轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核宿主細(xì)胞的載體中的真核啟動子系統(tǒng)。一旦載體被摻入到合適的宿主中，宿主維持在適合于編碼TRAIL受體結(jié)合劑的核苷酸序列的高水平表達(dá)、以及TRAIL受體結(jié)合劑(例如交叉反應(yīng)性抗TRAIL受體抗體)的收集和純化的條件下。參見，一般地，美國申請No.20020199213。這些表達(dá)載體一般能夠在宿主生物體中作為游離體或作為宿主染色體DNA的組成部分進(jìn)行復(fù)制。通常，表達(dá)載體含有選擇標(biāo)記物，例如，氨千青霉素抗性或潮霉素抗性，以允許檢測被希望的DNA序列轉(zhuǎn)化了的那些細(xì)胞。載體還可以編碼對于指導(dǎo)細(xì)胞外抗體片段的分泌有用的信號肽，例如果膠酸裂合酶。參見美國專利5,576,195。本發(fā)明的重組表達(dá)載體包含編碼具有TRAIL受體結(jié)合性質(zhì)的核酸，該核酸處于適合于該核酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)的形式，意思是所述重組表達(dá)載體包括一種或多種基于表達(dá)用宿主細(xì)胞而選擇的、與要表達(dá)的核酸序列可操作連接的調(diào)節(jié)序列。在重組表達(dá)載體內(nèi)，"可操作連接的"意指感興趣的核芬酸序列以允許所述核苷酸序列表達(dá)的方式與調(diào)節(jié)序列連接(例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中，或者，當(dāng)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中時，在宿主細(xì)胞中)。術(shù)語"調(diào)節(jié)序列，，意圖包括啟動子、增強(qiáng)子和其他表達(dá)控制元件(例如，多聚腺香酸信號)。例如，在Goeddel，GENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGY185，AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)中描述了這些調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列包括在許多種類的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列的組成型表達(dá)的調(diào)節(jié)序列，和僅在某些宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的調(diào)節(jié)序列(例如，組織特異性調(diào)節(jié)序列)。本領(lǐng)域技術(shù)人員要理解46的是，表達(dá)載體的設(shè)計可能取決于一些因素，例如要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、希望的多肽表達(dá)水平，等等。作為重組多肽(例如，TRAIL受體結(jié)合劑)表達(dá)的啟動子有用的典型的調(diào)節(jié)序列包括，例如但不限于，3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。誘導(dǎo)型的酵母啟動子包括，尤其是，來自乙醇脫氬酶、異細(xì)胞色素C和負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子。在一個實(shí)施方式中，編碼本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑的多核苷酸與araB啟動子可操作地連接，并可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)。參見美國專利5,028,530。本發(fā)明的表達(dá)載體可以被導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生多肽或肽，包括由在此描述的核酸編碼的融合多肽(例如，TRAIL受體結(jié)合劑，等等)。本發(fā)明的另一個方面涉及表達(dá)TRAIL受體結(jié)合劑的宿主細(xì)胞，其含有編碼一種或多種TRAIL受體結(jié)合劑的核酸。本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以被設(shè)計用于TRAIL受體結(jié)合劑在原核或真核細(xì)胞中的表達(dá)。例如，TRAIL受體結(jié)合劑可以在細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞(利用桿狀病毒表達(dá)載體)、真菌細(xì)胞例如酵母、酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。在Goeddel,GENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGY185，AcademicPress,SanDiego，Calif.(1990)中進(jìn)一步討論了適合的宿主細(xì)胞。作為選擇，重組表達(dá)載體可以體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，例如，使用T7啟動子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶。已經(jīng)描述了通過隨機(jī)地產(chǎn)生的多核苷酸序列的表達(dá)，對制備篩選具有預(yù)定性質(zhì)的多肽例如TRAIL受體結(jié)合劑有用的方法。參見美國專利5,763,192、5，723，323、5,814,476、5，817,483、5，824，514、5,976,862、6,492,107、6,569,641。原核生物中的多肽表達(dá)最常見地在帶有載體的大腸桿菌中進(jìn)行，所述載體含有指導(dǎo)融合或非融合多肽表達(dá)的組成型或可誘導(dǎo)啟動子。融合載體向其中編碼的多肽添加許多氨基酸，通常添加到重組多肽的氨基末端。這些融合載體一般服務(wù)于三個目的(i)提高重組多肽的表達(dá)，(ii)提高重組多肽的溶解度，以及(iii)通過作為親和純化中的配體來幫助重組多肽的純化。通常，在融合物表達(dá)載體中，將蛋白酶水解位點(diǎn)導(dǎo)入到融合模塊和重組多肽的連接處，以允許在融合多肽的純化之后從融合模塊分離重組多肽。這些酶和它們的同源識別序列包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達(dá)載體包括,例如，pGEX(PharmaciaBiotechInc;SmithandJohnson,1988.Gene67:31-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly,Mass.)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway，N丄)，其分別將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合多肽或多肽A融合到目標(biāo)重組多肽。適合的誘導(dǎo)型非融合大腸桿菌載體的實(shí)例包括pTrc(Amrann等人，(1988)Gene69:301-315)和pETlid(Studier等人，GENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGY185,AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)60-89)。通過多肽融合來靶向組裝具有不同活性的肽或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生多功能多肽的方法已經(jīng)由Pack等人，美國專利6,294,353;6,692,935所描述。一種使大腸桿菌中的重組多肽(例如TRAIL受體結(jié)合劑)的表達(dá)最大化的策略是在蛋白水解該重組多肽的能力受損的宿主細(xì)菌中表達(dá)該重組多肽。參見，例如，Gottesman，GENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGY185,AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)119-128。另一個策略是改變要插入表達(dá)載體中的核酸的核酸序列，從而每個氨基酸的各自密碼子是在表達(dá)宿主(例如大腸桿菌)中優(yōu)先被利用的密碼子(參見，例如，Wada等人,1992.Nucl.AcidsRes.20:2111-2118)。本發(fā)明的這種核酸序列的改變可以通過標(biāo)準(zhǔn)的DNA合成技術(shù)來進(jìn)行。在另一個實(shí)施方式中，TRAIL受體結(jié)合劑表達(dá)載體是酵母表達(dá)載體。用于在酵母釀酒酵母(Saccharomycescerivisae)中表達(dá)的載體的實(shí)例包括pYepSecl(Baldari等人，1987.EMBOJ.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz,Ce//30:933-943，1982)、pJRY88(Schultz等人，54:113-123，1987)、pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,Calif.)和picZ(InVitrogenCorp,SanDiego,Calif.)。作為選擇，TRAIL受體結(jié)合劑可以使用桿狀病毒表達(dá)載體在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)?？捎糜谠谂囵B(yǎng)的昆蟲細(xì)胞(例如，SF9細(xì)胞)中表達(dá)多肽(例如TRAIL受體結(jié)合劑)的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等人，Mo/.CW/.歷o/.3:2156-2165，1983)和pVL系歹'J(LucklowandSummers,1989.Wra/，170:31-39)。在又一個實(shí)施方式中，編碼本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑的核酸使用哺乳動物表達(dá)載體在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。哺乳動物表達(dá)載體的實(shí)例包括但不限于，pCDM8(Seed，.A^wre329:840,1987)和pMT2PC(Kaufinan等人，6:187-195，1987)。當(dāng)在哺乳動物細(xì)胞中使用時，通常由病毒調(diào)節(jié)元件來提供表達(dá)載體的控制'功能。例如，常用的啟動子來源于多瘤48病毒(polyoma)、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒和猿猴病毒40。對于本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑的表達(dá)有用的原核和真核細(xì)胞的其他適合的表達(dá)系統(tǒng)。參見，例如，Sambrook等人，MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL.2nded.，ColdSpringHarborLaboratory,第16和17章，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1989.在另一個實(shí)施方式中，重組哺乳動物表達(dá)載體能夠指導(dǎo)核酸優(yōu)先地在特定細(xì)胞類型中表達(dá)(例如，使用組織特異性調(diào)節(jié)元件來表達(dá)核酸)。組織特異性調(diào)節(jié)元件是本領(lǐng)域已知的。適合的組織特異性啟動子的非限制性實(shí)例包括白蛋白啟動子(肝臟特異性；Pinkert等人，Dev.1:268-277,1987)、淋巴特異性啟動子(Calame和Eaton,A/v./mm43:235-275,1988)、特別是T細(xì)胞受體的啟動子(Winoto和Baltimore,EMBOJ.8:729-733,1989)和免疫球蛋白的啟動子(Banerji等人，1983.Ce〃33:729-740;Queen和Baltimore,Ce//33:741-748,1983.)、神經(jīng)元特異性啟動子((例如，神經(jīng)絲啟動子；Byrne和Ruddle，尸TOc.A^/.爿cad86:5473-5477,1989)、胰腺特異性啟動子(Edlund等人，1985.Science230:912-916)，和乳腺特異性啟動子(例如，乳清啟動子；美國專利4,873,316和歐洲申請公開264,166)。還包括發(fā)育性調(diào)節(jié)的啟動子，例如鼠hox啟動子(Kessel和Gmss,Scz'e"ce249:374-379,1990)和曱胎蛋白啟動子(Campes和Tilghman，.Ge腦Dev.3:537-546,1989)。本發(fā)明進(jìn)一步提供重組表達(dá)載體，其包含以反義方向克隆到表達(dá)載體中的本發(fā)明的編碼TRAIL受體結(jié)合劑的DNA分子。也就是說，DNA分子以這樣的方式與調(diào)節(jié)序列可操作地連接，從而能夠表達(dá)(通過DNA分子的轉(zhuǎn)錄)TRAIL受體結(jié)合劑mRNA的反義RNA分子。至于與按反義方向克隆的核酸可操作連接的調(diào)節(jié)序列，可以選擇指導(dǎo)反義RNA分子在各種細(xì)胞類型中的連續(xù)表達(dá)的調(diào)節(jié)序列，例如病毒啟動子或增強(qiáng)子，或可以選擇指導(dǎo)反義RNA的組成型、組織特異性或細(xì)胞類型特異性表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。反義表達(dá)載體可以是重組質(zhì)粒、噬菌?；驕p毒病毒的形式，其中反義核酸在高效調(diào)節(jié)區(qū)域的控制下產(chǎn)生，其活性可通過導(dǎo)入了該載體的細(xì)胞類型來測定。對于利用反義基因調(diào)節(jié)基因表達(dá)的論述。參見，例如，Weintraub等人，"AntisenseRNAasamoleculartoolforgeneticanalysis,"Reviews-TrendsinGenetics,Vol.1(1)1986。本發(fā)明的另一個方面涉及其中導(dǎo)入了本發(fā)明的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。術(shù)語"宿主細(xì)胞，，和"重組宿主細(xì)胞，，在此可互換地使用。要理解的是，該術(shù)語不僅僅指特定的受試者細(xì)胞，而且指這種細(xì)胞的子代或可能的子代。由于在后代中可能因突變或環(huán)境影響而出現(xiàn)某些改變，這種子代實(shí)際上可能不與母細(xì)胞完全相同，但仍然包括在此處使用的該術(shù)語的范圍內(nèi)。宿主細(xì)胞可以是任何原核或真核細(xì)胞。例如，TRAIL受體結(jié)合劑可以在細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞、酵母或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。哺乳動物細(xì)胞是用于表達(dá)編碼免疫球蛋白或其片段的核苷酸區(qū)段的優(yōu)選的宿主。參見Wi腿cker,F謂(7e廳7bC/o廳，(VCHPublishers，NY，1987)。本領(lǐng)域已經(jīng)開發(fā)了能夠分泌完整的異源蛋白質(zhì)的許多適合的宿主細(xì)胞系，包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系、各種COS細(xì)胞系、HeLa纟田胞、L細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞系。優(yōu)選地，所述細(xì)胞是非人類的。這些細(xì)胞的表達(dá)載體可以包括表達(dá)控制序列，例如復(fù)制起點(diǎn)，啟動子，增強(qiáng)子和必需的加工信息位點(diǎn)，例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)，RNA剪接位點(diǎn)，多聚腺苷酸位點(diǎn)，和轉(zhuǎn)錄終止子序列。Queen等人，/mmww/.Aev.89:49,1986。優(yōu)選的表達(dá)控制序列是來自內(nèi)源的基因、巨細(xì)胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒等等的啟動子。Co等人，J7mm朋o/.148:1149，1992.其他適合的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。可以通過常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA導(dǎo)入到原核或真核細(xì)胞中。如在此使用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)染"意指各種本領(lǐng)域已知的用于將外源核酸(例如DNA)導(dǎo)入宿主細(xì)胞的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化釣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電穿孔，基因槍(biolistics)或基于病毒的轉(zhuǎn)染可以用于其他細(xì)胞宿主。用于轉(zhuǎn)化哺乳動物的其他方法包括使用聚凝胺(polybrene)、原生質(zhì)體融合、脂質(zhì)體、電穿孔和顯微注射(一般參見，Sambrook等人，Mo/ecw/orC/o"/"g)?？梢栽赟ambrook等人(MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL.2nded.，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1989)和其他實(shí)驗手冊中找到轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的適合的方法。根據(jù)細(xì)胞宿主的種類，含有感興趣的DNA片段的載體可以通過公知的方法轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中。對于哺乳動物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，已知的是，取決于使用的表達(dá)載體和50轉(zhuǎn)染技術(shù)，僅小部分細(xì)胞可能將外源DNA整合到它們的基因組中。為了鑒定和選擇這些整合體，一般將編碼選擇標(biāo)記(例如，抗生素抗性)的基因與感興趣的基因一起導(dǎo)入宿主細(xì)胞。各種選擇標(biāo)記包括提供對藥物，例如G418、潮霉素和氨曱蝶呤的抗性的那些選擇標(biāo)記。編碼選擇標(biāo)記的核酸可以在編碼TRAIL受體結(jié)合劑的相同載體上導(dǎo)入宿主細(xì)胞，或可以在單獨(dú)的載體上導(dǎo)入?？梢酝ㄟ^藥物選擇來鑒定導(dǎo)入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(例如，納入了選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞將生存，而其他細(xì)胞將死亡)。包括本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑的宿主細(xì)胞，例如培養(yǎng)中的原核或真核宿主細(xì)胞，可以用于生產(chǎn)(即表達(dá))重組TRAIL受體結(jié)合劑。在一個實(shí)施方式中，所述方法包括在適合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(其中已經(jīng)導(dǎo)入了編碼TRAIL受體結(jié)合劑的重組表達(dá)載體)，從而產(chǎn)生TRAIL受體結(jié)合劑。在另一個實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞分離TRAIL受體結(jié)合劑的步驟。一旦被表達(dá)，從培養(yǎng)基和宿主細(xì)胞中純化TRAIL受體結(jié)合劑(例如抗TRAIL受體抗體pRNA抗TRAIL受體抗體相關(guān)多肽)的收集物(collections)。TRAIL受體結(jié)合劑可以根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法來純化，包括HPLC純化、柱層析、凝膠電泳，等等。在一個實(shí)施方式中，TRAIL受體結(jié)合劑通過Boss等人，美國專利4,816,397的方法在宿主生物體中產(chǎn)生。通常，抗TRAIL受體抗體鏈與信號序列一起表達(dá)，因而4皮釋放到培養(yǎng)基中。然而，如果宿主細(xì)胞天然地不分泌抗TRAIL受體抗體鏈，可以通過用溫和洗滌劑處理來釋^L抗TRAIL受體抗體^^連。重組多肽的純化是本領(lǐng)域公知的，包括硫酸銨沉淀、親和層析純化技術(shù)、柱層析、離子交換純化技術(shù)、凝膠電泳等等(一般參見Scopes,ProteinPurification(Springer-Verlag,N.Y.,1982)。編碼TRAIL受體結(jié)合劑的多核苦酸，例如抗TRAIL受體抗體編碼序列，可以摻入轉(zhuǎn)基因中，用于導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動物的基因組，隨后在該轉(zhuǎn)基因動物的乳汁中表達(dá)。參見，例如，美國專利5,741,957、5,304,489和5,849,992。適合的轉(zhuǎn)基因包括與來自乳腺特異性基因，例如酪蛋白或P-乳球蛋白的啟動子和增強(qiáng)子可操作連接的輕鏈和/或重鏈的編碼序列。為產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物，可以將轉(zhuǎn)基因顯微注射到受精的卵母細(xì)胞中，或可以摻入胚胎干細(xì)胞的基因組中，并這些細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移到去核的卵母細(xì)胞中。#鏈我#.在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合劑是單鏈抗TRAIL受體抗體。根據(jù)本發(fā)明，可以將一些技術(shù)加以調(diào)適用于生產(chǎn)對TRAIL受體多肽特異性的單鏈抗體(參見，例如，美國專利4,946,778)。可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的單鏈Fv和抗體的技術(shù)的實(shí)例包括在美國專利4,946,778和5,258,498;Huston等人，MdW""五，膨/ogy，203:46-88,1991;Shu，L.等人，尸rac.A^/.Jc^/.C/5L4，90:7995-7999，1993;和Skerra等人，5We"ce240:1038-1040,1988中公開的那些。嵌合我沐和人源化我謬.在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合劑是嵌合的抗TRAIL受體抗體。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合劑是人源化的抗TRAIL受體抗體。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，供者抗體和受者抗體是來自不同物種的單克隆抗體。例如，受者抗體是人類抗體(以使得它在人類中的抗原性最小化)，在這種情況下，如此產(chǎn)生的CDR移植的抗體被稱為"人源化，，抗體。可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的重組抗TRAIL受體抗體，例如包含人類和非人類部分的嵌合和人源化單克隆抗體，處在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。對于某些應(yīng)用，包括本發(fā)明的結(jié)合劑在人體中的體內(nèi)使用以及這些試劑用于體外檢測分析的應(yīng)用，優(yōu)選的是使用嵌合的、人源化的或人類抗TRAIL受體抗體。這些嵌合的和人源化的單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。這些有用的方法包括，例如但不限于，在國際申請PCT/US86/02269;美國專利5,225,539;歐洲專利184187,歐洲專利171496;歐洲專利173494;PCT國際公開WO86/01533;美國專利4,816,567;5,225,539;歐洲專利125023;Better等人，1988.5We"ce240:1041-1043;Liu等人，1987.尸rac,Ato/.v4cat/.S",.USA84:3439-3443;Liu等人，1987./wmw"o/.139:3521-3526;Sun等人，1987.尸rac.Ato/.5W.USA84:214-218;Nishimura等人，1987.CancerRes.47:999-1005;Wood等人，1985.Nature314:446-449;Shaw等人，1988./A^/.Ca"cw/""80:1553-1559);Morrison(1985)Science229:1202-1207;Oi等人(1986)腸!Tec—腦4:214;Jones等人，1986.Atowe321:552-525;Verhoeyan等人，1988.5We"ce239:1534;Morrison,5We"ce229:1202,1985.，Oi等人，倫rec—腦4:214，1986;Gillies等人，V./mmw"o/.MeAc^s,125:191-202,1989;美國專利No.5，807，715;和Beidler等人，1988,乂/附ww"o/.141:4053-4060中描述的方法。例如，抗體可以使用各種技術(shù)，包括CDR移植(EP0239400;WO91/09967;美國專利5,530,101;5,585,089;5,859,205;6,248,516;EP460167)、飾面(veneering)或表面重修(resurfacing)(EPO592106;EP0519596;PadlanE.A.，Mo/ecw/a〃聽畫/ogv，28:489-498，1991;Studnicka等人，iV她/w五"&恥en'"g7:805-814,1994;Roguska等人，91:969-973,1994)和鏈改組(chainshuffling)(美國專利NO.5,565,332)來人源化。在一個實(shí)施方式中，編碼鼠抗TRAIL受體單克隆抗體的cDNA用限制性內(nèi)切酶消化，所述限制性內(nèi)切酶被特別地選擇來移動編碼Fc恒定區(qū)的序列，替換編碼人類Fc恒定區(qū)的cDNA的相當(dāng)?shù)牟糠?參見Robinson等人，PCT/US86/02269;Akira等人，歐洲專利申請184,187;Taniguchi，歐洲專利申請171,496;Morrison等人，歐洲專利申請173,494;Neuberger等人，WO86/01533;Cabilly等人，美國專利4,816,567;Cabilly等人,歐洲專利申請125,023;Better等人(1988)Science240:1041-1043;Liu等人(1987)ProcNatlAcadSciUSA84:3439-3443;Liu等人(1987)JImmunol139:3521-3526;Sun等人(1987)iVocAto/爿cad5W84:214-218;Nishimura等人(1987)Owcwi&s47:999-1005;Wood等人(1985)A^wre314:446-449;andShaw等人(1988)/扁C眞er/"^80:1553-1559);美國專利6,180,370;美國專利6,300,064;6，696，248;6,706,484;6,828,422。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明容許構(gòu)建人源化的抗TRAIL受體抗體，其不太可能誘導(dǎo)人類抗d、鼠抗體(以下稱為"HAMA")應(yīng)答，而仍然具有有效的抗體效應(yīng)物功能。如在此使用的，術(shù)語"人類，，和"人源化的"，就抗體而言，涉及任何預(yù)計在人類受試者中引發(fā)治療上可耐受的弱免疫原性反應(yīng)的抗體。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了人源化的TRAIL-R1和/或TRAIL-R2雙特異性抗體，CTB003或hCTB003重鏈和輕鏈免疫J求蛋白。CDi我體.在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合劑是抗TRAIL受體CDR抗體。一般地，用于產(chǎn)生抗TRAIL受體CDR抗體的供者和受者抗體是來自不同物種的單克隆抗體；一般受者抗體是人類抗體(以使它在人體中的免疫原性最小化)，在這種情況下，如此產(chǎn)生的CDR移植的抗體被稱為"人源化的"抗體。移植物可以是受者抗體的單個Vh或VL內(nèi)的單個CDR(或甚至單個CDR的一部分)，或可以是Vh和Vt之一或兩者之內(nèi)的多個CDR(或其部分)。很多時候，受者抗體的所有可變域中的所有三個CDR都將被相應(yīng)的供者CDR替換，盡管人們只需要替換必需數(shù)目的CDR以允許產(chǎn)53生的CDR移一直抗體對MetAp3的充分結(jié)合。產(chǎn)生CDR移4直的抗體和人源化抗體的方法在Queen等人，美國專利5,585,089，美國專利5,693,761;美國專利5,693,762;和WinterU.S.5,225,539;以及EP0682040中有所教導(dǎo)。制各Vh和Vi多肽的有用方法在Winter等人，美國專利4,816,397;6,291,158;6,291,159;6,291,161;6，545，142;EP0368684;EP0451216;EPO120694中有所教導(dǎo)。在從同一家族和/或同一家族成員選擇了適合的候選框架區(qū)域之后，通過將來源物種的CDR移植到雜合框架區(qū)域中來產(chǎn)生重鏈和/或輕鏈可變區(qū)。，具有雜合(就上述兩個方面中的任一個而言)的可變鏈區(qū)域的雜合抗體或雜合抗體片段的組裝可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法來實(shí)現(xiàn)。例如，編碼在此描述的雜合可變域(即，基于目標(biāo)物種的框架和來源物種的CDR)的DNA序列可以通過寡核苷酸合成和/或PCR來產(chǎn)生。也可以使用適合的限制性內(nèi)切酶從來源物種抗體分離編碼CDR區(qū)域的核酸，并通過用適合的連接酶連接來將其連接到目標(biāo)物種框架中。作為選擇，可以通過定點(diǎn)誘變來改變來源物種抗體的可變鏈的框架區(qū)域。由于雜合體是從對應(yīng)于各個框架區(qū)域的多個候選物之中的選擇來構(gòu)建的，存在著許多可以依照本文描述的原則來進(jìn)行構(gòu)建的序列組合。因而，可以組裝雜合體的文庫，這樣的文庫的成員具有單個框架區(qū)域的不同組合。這種文庫可以是序列的電子數(shù)據(jù)庫集合或雜合體的實(shí)體集合。這個過程一般不改變位于被移植的CDR側(cè)面的受者抗體的FR。然而，相應(yīng)的供者抗體的FR，來改善產(chǎn)生的抗TRAIL受體CDR移植抗體的抗原結(jié)合親和力。優(yōu)選的替換位置包括鄰近CDR的氨基酸殘基，或者能夠與CDR相互作用的殘基(參見，例如，US5,585,089，特別是第12-16欄)?；蛘弑绢I(lǐng)域技術(shù)人員可以從供者FR開始，對它進(jìn)行修飾來使它更類似于受者FR或人類共有FR。產(chǎn)生這些修飾的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。特別地，如果產(chǎn)生的FR在該位置符合人類共有FR,或與這種共有FR有至少90%或更高的同一性，那么這樣做可能不會使得到的修飾的抗TRAIL受體CDR抗體的抗原性與具有完全人類FR的相同抗體相比發(fā)生顯著提高。融合蛋^.在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合劑是融合蛋白。本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑當(dāng)與第二種蛋白質(zhì)融合時，可以用作抗原標(biāo)簽。可以融54合到多肽的結(jié)構(gòu)域的實(shí)例不僅包括異源信號序列，還包括其他異源功能區(qū)域。融合不一定需要是直接的，可以通過接頭序列來融合。此外，本發(fā)明的融合蛋白也可以被工程化來改善TRAIL受體結(jié)合劑的特征。例如，可以將由其他氨基酸，特別是帶電氨基酸構(gòu)成的區(qū)域添加到TRAIL受體結(jié)合劑的N-末端，來改善在從宿主細(xì)胞純化或后續(xù)的處理和保存期間的穩(wěn)定性和持久性。并且，可以將肽模塊添加到TRAIL受體結(jié)合劑以便于純化。這些區(qū)域可以在TRAIL受體結(jié)合劑的最終制備之前予以去除。添加肽模塊以便于多肽的處理是本領(lǐng)域慣用的和常規(guī)的技術(shù)。本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑可以融合到標(biāo)記物序列，例如，便于融合多肽的純化的肽。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，標(biāo)記物氨基酸序列是六聚組氨酸肽，例如在pQE載體(QIAGEN,Inc.,9259EtonAvenue,Chatsworth,Calif.，91311)等中提供的標(biāo)簽，它們中許多是商業(yè)上可獲得的。如Gentz等人，/Voc.Ato/.Jcad6^486:821-824，1989中描述的，六聚組氨酸使得純化融合蛋白易于進(jìn)行。對于純化有用的另一個肽標(biāo)簽，"HA，，標(biāo)簽，對應(yīng)于來自流感血凝素蛋白質(zhì)的表位。Wilson等人，CW/37:767，1984。因而，這些上述融合物的任一種可以利用本發(fā)明的多核苷酸或多肽來工程化。并且，融合蛋白可以顯示增加的體內(nèi)半衰期。具有二硫鍵連接的二聚結(jié)構(gòu)(由于IgG)的融合蛋白，與單獨(dú)的單體型分泌蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段相比，在結(jié)合和中和其他分子方面可能是更有效的。Fountoulakis等人，J!歷0c/7e肌270:3958-3964，1995.類似地，EP-A-0464533(對應(yīng)于加拿大的2045869)公開了一些融合蛋白，它們包含免疫球蛋白的恒定區(qū)的不同部分以及另一種人類蛋白質(zhì)或其部分的。在很多情況下，融合蛋白中的Fc部分對于治療和診斷是有益的，因而可以產(chǎn)生，例如，改善的藥物動力學(xué)性質(zhì)。參見EP-A0232262。作為選擇，可能希望在表達(dá)、檢測和純化了融合蛋白之后刪除Fc部分。例如，如果融合蛋白被用作免疫的抗原，F(xiàn)c部分可能阻礙治療和診斷。在藥物發(fā)現(xiàn)中，例如，人類蛋白質(zhì)，如hlL-5已經(jīng)與Fc部分融合，為了高通量篩選分析來鑒定hIL-5的拮抗劑。Bennett等人，/Mo/ecw/wiecog"z'"o"8:52-58，1995;Johanson等人，7!所o/.Ozem.，270:9459-9471,1995。遞d7細(xì)應(yīng)4/i發(fā)謬的治《f冷l的4名瘦fcfe"www2/z加'o",臨床使用中的許多治療蛋白質(zhì)已經(jīng)顯示了引發(fā)不希望的抗體應(yīng)答，這些應(yīng)答在某些情況下伴隨著不良事件。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，通過鑒定重組抗TRAIL受體抗體、TRAIL受體多肽或TRAIL受體結(jié)合劑的氨基酸序列中對于給定物種的T細(xì)胞的一個或多個潛在的表位，并修飾所述氨基酸序列來消除至少一個T細(xì)胞表位，使得所述抗體、多肽或結(jié)合劑對于給定的物種具有非免疫原性或較低的免疫原性。這樣就消除了或降低了多肽或蛋白質(zhì)暴露于給定物種的免疫系統(tǒng)時所述多肽或蛋白質(zhì)的免疫原性。這樣的去免疫化對單克隆抗體和其他免疫球蛋白樣分子可能特別有益，例如，可以對小鼠衍生的免疫球蛋白加以去免疫以用于人類治療用途。對于去免疫多肽或蛋白質(zhì)的方法，參見，例如，Carr等人，美國專利申請20030153043;和DeGroot等人，AK^ias.朋d//wm朋7dravZms^13:539-541(1997);Schafer等人，F(xiàn)ac"'"e16:1880-1884(1998);DeGroot等人，Dev.112:71-80(2003);DeGroot等人，J^cc/we19:4385-4395(2001);Reijo腿andKwokMeAo&29:282-288;Novak等人，J/www"o/ogy166:6665-6670(2001)。在一個實(shí)施方式中，使用編碼作為融合蛋白的一部分的候選結(jié)合劑(其中這些融合蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá)時形成包涵體)的基因組DNA或EST來制備本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑。這種編碼作為融合蛋白的一部分的候選結(jié)合劑(其中這些融合蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá)時形成包涵體)的基因組DNA或EST的制備方法已經(jīng)有所描述，參見專利6,653,068;U.S.S.N.20040157291。例如，包涵體可用于產(chǎn)生特異性結(jié)合目標(biāo)(多)肽的結(jié)合配偶體，例如TRAIL受體結(jié)合劑。7TL4/丄f體潛合^/綴合f冷如上所述，在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑是抗TRAIL受體抗體或抗TRAIL受體抗體相關(guān)多肽，其偶聯(lián)或綴合于一種或多種治療性或細(xì)胞毒性模塊來產(chǎn)生本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑綴合蛋白。任選地，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑可用作TRAIL受體結(jié)合劑-細(xì)胞毒素綴合分子，例如用于腫瘤疾病治療的施用。一般地，治療模塊可以綴合于本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑，例如，通過任何合適的技術(shù)，同時適當(dāng)?shù)乜紤]藥物動力學(xué)穩(wěn)定性和降低對受試者的總體毒性的需要。治療性、細(xì)胞毒性、或標(biāo)記/顯象試劑(即，"模塊")可以直接或間接(例如通過接頭基團(tuán))偶聯(lián)于適合的TRAIL受體結(jié)合劑。當(dāng)模塊和TRAIL受體結(jié)合劑各自具有能夠相互起作用的功能基團(tuán)時，模塊和TRAIL受體結(jié)合劑之間的直接反應(yīng)是可能的。例如，親核基團(tuán)，例如氨基或巰基基團(tuán)，能夠與含有羰基的基團(tuán)例如肝或酸性鹵化物(acidhalide)反應(yīng)，或與含有良好的離去基團(tuán)(例如鹵素)的烷基(alkylgroup)反應(yīng)。作為選擇，可以使用適合的化學(xué)接頭基團(tuán)。接頭基團(tuán)可以起間隔區(qū)的作用，使所述模塊遠(yuǎn)離所述TRAIL受體結(jié)合劑，以避免對結(jié)合能力的干擾。接頭基團(tuán)也可以用來提高所述模塊或TRAIL受體結(jié)合劑上的取代基的化學(xué)反應(yīng)性，并從而提高偶聯(lián)效率?；瘜W(xué)反應(yīng)性的提高也可以使得本不可能使用的模塊或模塊上的功能基團(tuán)變得容易使用。適合的連接化學(xué)包括馬來酰亞胺基接頭和烷基卣接頭(其與抗體模塊上的巰基反應(yīng))和琥珀酰亞胺基接頭(其與抗體模塊上的伯胺反應(yīng))。幾個伯胺和巰基基團(tuán)存在于免疫球蛋白上，其他的基團(tuán)可以設(shè)計到重組免疫球蛋白分子中。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，各種雙官能或多官能試劑，包括同官能和異官能的(例如，在PierceChemicalCo.,Rockford，Ill.的目錄中描述的那些)，可以用作接頭基團(tuán)。結(jié)合可以例如通過氨基、羧基、巰基或氧化的糖殘基來進(jìn)行(參見，例如，美國專利4,671,958)。作為備選的偶聯(lián)方法，可以，例如，經(jīng)由糖基化位點(diǎn)處的氧化的糖基團(tuán)將模塊偶聯(lián)到本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑上，如在美國專利5,057,313和5,156,840中描述的。結(jié)合TRAIL受體結(jié)合劑到所述部分上的又一個可選擇的方法是通過使用非共價結(jié)合配對，例如，鏈霉抗生物素蛋白/生物素，或抗生物素蛋白/生物素。在這些實(shí)施方式中，將所述配對的一個成員共價結(jié)合到TRAIL受體結(jié)合劑，結(jié)合配對的另一個成員共價結(jié)合到所述模塊上。^T襲,fb/eavaWe)如果本發(fā)明的免疫綴合物的細(xì)胞毒性或治療模塊在沒有TRAIL受體結(jié)合劑部分時效力更強(qiáng)，則可能希望是使用這樣的接頭基團(tuán)，其在內(nèi)在化到細(xì)胞中的期間或當(dāng)時可裂解，或在細(xì)胞外環(huán)境中可隨著時間逐漸地裂解。已經(jīng)描述了許多不同的可裂解接頭基團(tuán)。在細(xì)胞內(nèi)將細(xì)胞毒性模塊從這些接頭基團(tuán)上釋放的實(shí)例包括，例如，但不限于，通過二硫鍵的還原來裂解(例如，美國專利4,489,710)、通過對光不穩(wěn)定鍵的照射(例如，美國專利4,625,014)、通過衍生化的氨基酸側(cè)鏈的水解(例如，美國專利4,638,045)、通過血清補(bǔ)體介導(dǎo)的水解(例如，美國專利4,671,958),和酸催化的水解(例如，美國專利4,569，789)。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑與超過一種治療性、細(xì)胞毒性和/或顯像模塊結(jié)合。通過多衍生化(poly-derivatizing)本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑，可以同時地實(shí)現(xiàn)幾種細(xì)胞毒策略，可以將TRAIL受體結(jié)合劑制成對幾種可視化技術(shù)有用的造影劑，或可以對治療性抗體加以標(biāo)記以用于通過可視化技術(shù)來追蹤。在一個實(shí)施方式中，將細(xì)胞毒性模塊的多個分子連接到一個TRAIL受體結(jié)合劑上。在一個實(shí)施方式中，將本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑與至少兩種模塊的混合物偶聯(lián)，所述模塊選自由細(xì)胞毒性模塊、治療模塊、和標(biāo)記/顯像模塊構(gòu)成的組。也就是說，多于一種類型的模塊可以連接到一個TRAIL受體結(jié)合劑上。例如，治療模塊，例如多核苷酸或反義序列，可以與細(xì)胞毒性或放射毒性模塊一起綴合于TRAIL受體結(jié)合劑，以提高化學(xué)或放射毒性治療的有效性，以及降低獲得希望的治療效果所必需的劑量。不考慮特定的實(shí)施方式，可以以各種方式制備與多于一種模塊所成的免疫綴合物。例如，可以將多于一種模塊直接偶聯(lián)到TRAIL受體結(jié)合劑上，或者可以使用提供多個附接位點(diǎn)的接頭(例如，樹枝狀聚合物(dendrimers))。作'為選擇，可以使用具有容納多于一種細(xì)胞毒模塊的容量的載體。如上文說明的，TRAIL受體結(jié)合劑可以以各種方式攜帶所述模塊，包括直接或經(jīng)由接頭基團(tuán)的共價鍵合，和非共價的締合。在一個實(shí)施方式中，TRAIL受體結(jié)合偶聯(lián)的蛋白質(zhì)可以與封裝載體組合。這在化學(xué)毒性治療實(shí)施方式中是特別有用的，因為它們可以容許治療組合物隨著時間逐漸地釋放TRAIL受體結(jié)合劑化學(xué)毒性模塊，同時將它濃縮在目標(biāo)細(xì)胞的附近。與放射###綏合的7TL4/丄f沐潛合游.在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑與細(xì)胞毒性模塊偶聯(lián)，所述細(xì)胞毒性模塊是放射性核素。優(yōu)選用作本發(fā)明的細(xì)胞毒性模塊的放射性核素是適合于藥理學(xué)施用的放射性核素。這些放射性核素包括'231、125I、131I、9GY、211At、67Cu、186Re、188Re、212Pb、和212Bi。碘和砹同位素是用于本發(fā)明的治療組合物中的更優(yōu)選的放射性核素，關(guān)于它們的用途已經(jīng)積累了大量的文獻(xiàn)。1311是特別優(yōu)選的，其他的P-輻射發(fā)射性核素也是，它們具有幾毫米的有效范圍。123I、125I、1311或^At可以與TRAIL受體結(jié)合劑綴合，用于利用幾種已知的綴合試劑的組合物和方法中，所述已知的綴合試劑包括非水溶性跌化試劑(lodogen)、3-[^At]砹代苯曱酸(astatobenzoate)N-琥珀酰亞胺酯、3-[1311]碘代苯曱酸N-琥珀酰亞胺酯(SIB)和5-[1311]碘-3-吡啶羧酸N-琥珀酰亞胺酯(SIPC)?？梢栽谏鲜鲧畲噭┲欣萌魏蔚馔凰亍Ｆ渌派湫院怂乜梢酝ㄟ^核醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的適合的螯合試劑綴合到本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑上。化夢毒'/i禊塊.在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑與化學(xué)毒性模塊偶聯(lián)。在本發(fā)明中有用的優(yōu)選的化學(xué)毒性試劑包括，但不限于，小分子藥物，例如氨曱蝶呤，和嘧啶和"票呤類似物。優(yōu)選的化學(xué)毒素分化誘導(dǎo)物包括佛波醇酯和丁酸?；瘜W(xué)毒性模塊可以直接綴合于本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑經(jīng)由化學(xué)接頭綴合于細(xì)胞毒性模塊。在另一個實(shí)施方式中，模塊被封裝在載體中，載體則偶聯(lián)于本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑。蛋力,#^在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑與蛋白質(zhì)毒素模塊偶聯(lián)。用作本發(fā)明的細(xì)胞毒性模塊的優(yōu)選的毒素蛋白質(zhì)包括，例如但不限于，放線菌或鏈霉菌抗生素、duocarmycin、紫杉醇(taxol)、細(xì)胞松弛素(cytochalasin)B、短桿菌肽D(gramicidinD)、溴化乙4定(ethidiumbromide)、依米丁(emetine)、絲裂霉素C(mitomycin)、鬼臼乙叉甙(etoposide)、鬼臼p塞口分戒(tenoposide)、長春新石威(vincristine)、長春石成(vinblastine)、-火水仙石威(colchicin)、阿霉素(doxorubicin),柔紅霉素(daunorubicin)、二鞋炭疽菌素二酉同(dihydroxyanthracindidne)、米4乇蒽酉昆(mitoxantrone)、光斗申霉素(mithramycin)、》文線菌素D(actinomycinD)、1-去氫睪酉同(1-dehydrotestosterone)、津唐皮質(zhì);敫素(glucocorticoids)、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)和其類似物或同源物。用作細(xì)胞毒性模塊的優(yōu)選的毒素蛋白質(zhì)進(jìn)一步包括蓖麻毒蛋白(ricin)、相思豆毒蛋白(abrin)、白喉毒素(diphtheriatoxin)、霍亂毒素(choleratoxin)、白樹毒素(gelonin)、假單胞菌外毒素(Pseudomonasexotoxin)、志賀氏菌毒素(Shigellatoxin)、商P^^t病毒蛋白(pokeweedantiviralprotein)和醫(yī)學(xué)生物化學(xué)領(lǐng)域已知的其他毒素蛋白質(zhì)。由于這些毒素試劑可能在受試者中引發(fā)不希望的免疫應(yīng)答，如果血管內(nèi)注射尤為如此，因此優(yōu)選是將它們封裝在載體中用于偶聯(lián)到本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑，例如本發(fā)明的抗TRAIL受體抗體和抗體相關(guān)多肽。躇活'/^毒,在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑與酶活性毒素結(jié)合。酶活性毒素可以是細(xì)菌或植物來源的，或這種毒素的酶活性片段("A鏈")。在本發(fā)明中有用的的酶活性毒素和其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素(modeccin)A鏈、a-帚曲菌素(a-sarcin)、油桐(」/ewn'tes1》ra^')蛋白質(zhì)、石竹素(dianthin)蛋白質(zhì)、美洲商陸/acc"麵eWc畫)蛋白質(zhì)(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(M9monfcac/zara^'a)抑制物、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、月巴皂草(Sa/7ao加n》q^cz'"a/W抑制物、白樹毒素(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素和伊諾霉素本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑與細(xì)胞毒性模塊的綴合物可以使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備。這些試劑的實(shí)例有SPDP;IT;亞氨酸酯(諸如鹽酸二曱基己二酰亞胺酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對疊氮苯曱酰基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯曱酰基)乙二胺)、二異氰酸酯(諸如曱苯2,6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。毒素的溶解性部分(lysingportion)可以與抗體(例如TRAIL受體結(jié)合劑)的Fab片段連接。治^V^^塊.在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑與治療模塊偶聯(lián)。本發(fā)明的治療部分包括，例如但不限于，抗代謝物(例如，氨曱蝶呤(methotrexate)、巰噤呤(6-mercaptopurine)、6-硫代鳥。票呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺(5-fluorouracildecarbazine)),烷化劑(例如，氮芥(mechlorethamine)、塞替派瘤可寧(thioepachlorambucil),美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine，BSNU)和洛莫司汀(lomustine,CCNU)、環(huán)石舞酰胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈唑霉素(streptozotocin)、絲裂霉素C(mitomycinC)禾口"頃式二氯二胺4白(cis畫dichlorodiamineplatinum)(II)(DDP)順鈾)，蒽環(huán)類抗生素(anthracyclines)(例如，柔紅霉素(daunorubicin)(舊稱道諾霉素(daunomycin))和阿霉素(doxorubicin))，抗生素(例如,放線菌素D(dactinomycin)(舊稱放線菌素(actinomycin))、博來霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)和氨茴霉素(anthramycin)(AMC))、阿霉素(doxorubicin)(亞德里亞霉素(adriamycin))、順鉑、硫酸博來霉素(bleomycinsulfate)、卡莫司汀(carmustine)、瘤可寧(chlorambucil)、環(huán)碌酰胺鞋基脲(cyclophosphamidehydroxyurea)或蓖麻毒蛋白A(ricinA)，和抗有絲分裂試齊'J(例如，長春新石威(vincristine)和長春石咸(vinblastine))。60將這種治療模塊綴合到本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑的技術(shù)是公知的，參見,侈寸嗦口,Arnon等人，"MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy"，inMonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy,Reisfeld等人(編)，pp.243-56(AlanR.Liss,Inc.1985);Hellst醒等人，"AntibodiesForDrugDelivery",inControlledDrugDelivery(2ndEd,)，Robinson等人(編)，pp.623-53(MarcelDekker,Inc.1987);Thorpe,"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview",inMonoclonalAntibodies'84:BiologicalAndClinicalApplications,Pinchera等人(編)，pp.475-506(1985);"Analysis,Results,AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy"，inMonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy,Baldwin等人(編)，pp.303-16(AcademicPress1985),和Thorpe等人，"ThePreparationAndCytotoxicPropertiesOfAntibody-ToxinConjugates",/wmw朋/.iev.,62:119-58(1982)。標(biāo)記的7TM/丄f沐潛合教在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑與標(biāo)記模塊，即可檢測基團(tuán)結(jié)合。綴合于本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑的特定的標(biāo)記物或可檢測基團(tuán)不是本發(fā)明的關(guān)鍵方面，只要它不顯著地影響本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑對TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的特異性結(jié)合?？蓹z測基團(tuán)可以是具有可檢測的物理或化學(xué)性質(zhì)的任何材料。這些可檢測標(biāo)記在免疫分析和顯像領(lǐng)域已經(jīng)得到了良好的開發(fā)，一般地，在這些方法中有用的幾乎任何標(biāo)記物都可以用于本發(fā)明中。因而，標(biāo)記物是可由分光的、光化學(xué)的、生物化學(xué)的、免疫化學(xué)的、電的、光學(xué)的或化學(xué)的手段檢測的任何組合物(composition)。在本發(fā)明中有用的標(biāo)記物包括磁性珠子(例如，DynabeadsTM)、熒光染料(例如，異硫氰酸熒光素、Texas紅、羅丹明，等等)、放射性標(biāo)記物(例如，3H、14C、35S、125I、121I、112In、"mTc),其他的顯像試劑，例如微泡(microbubbles)(用于超聲波顯像)、18F、"C、150、(用于正電子發(fā)射層析成像)、99mTC、'"In(用于單光子發(fā)射層析成像)、酶(例如，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和其他通常在ELISA中使用的酶)，和量熱標(biāo)記物，例如膠體金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠，等等)珠子。描述了這些標(biāo)記物的用途的專利包括美國專利3,817,837;3,850,752;3,939,350;3,996,345;4,277,437;4，275，149和4,366,241,為了所有目的通過引用將它們每一個完全并入本文。也參見HandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals(6thEd.，MolecularProbes,Inc.,EugeneOR.)。標(biāo)記物可以才艮據(jù)本領(lǐng)域公知的方法直接或間接地偶聯(lián)到測定系統(tǒng)的希望組分上。如上所指出，可以使用各種各樣的標(biāo)記物，標(biāo)記物的選擇取決于需要的敏感性、與化合物綴合的便利性、穩(wěn)定性要求、可用的測試設(shè)備和處置規(guī)定。非放射性標(biāo)記通常通過間接的方式來附接。一般地，配體分子(例如生物素)共價地結(jié)合于分子。配體然后連接于抗配體(例如，鏈霉抗生物素蛋白)分子，抗配體本身可被檢測或者共價結(jié)合于信號系統(tǒng)，例如，可檢測的酶、熒光化合物，或化學(xué)發(fā)光化合物?？梢允褂枚喾N配體和抗配體。當(dāng)配體具有天然的抗配體時，例如，生物素、曱狀腺素和可的松，它可以與標(biāo)記的、天然存在的抗配體結(jié)合使用。作為選擇，任何半抗原性或抗原性化合物可以用于與抗體，例如抗TRAIL受體抗體組合。分子也可以直接綴合于信號發(fā)生化合物，例如，與酶或熒光基團(tuán)綴合。作為標(biāo)記物感興趣的酶將主要是水解酶，特別是磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或氧化還原酶，特別是過氧化物酶。作為標(biāo)記模塊有用的熒光化合物包括但不限于，例如，熒光素和它的衍生物，羅丹明和它的衍生物、丹磺酰、傘形酮，等等。作為標(biāo)記模塊有用的化學(xué)發(fā)光化合物包括，但不限于，例如，螢光素和2,3-二氫酞漆二酮(2，3-dihydrophthalazinediones)，例如，魯米諾。對于可以使用的各種標(biāo)記和信號產(chǎn)生系統(tǒng)的綜述，參見，美國專利4,391,904。才企測標(biāo)記物的方法是本領(lǐng)域4支術(shù)人員公知的。因而，例如，當(dāng)標(biāo)記物是放射性標(biāo)記時，檢測的手段包括閃爍計數(shù)器或放射自顯影中的感光膠片。當(dāng)標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物時，它可以通過用合適波長的光線激發(fā)熒光染料并檢測產(chǎn)生的焚光來檢測。熒光可以通過目視、通過感光膠片、通過使用電子探測器例如電荷耦合器件(CCD)或光電倍增器等等來檢測。類似地，筒單的比色標(biāo)記物可以僅通過觀察與標(biāo)記物相關(guān)的顏色來檢測。因而，在各種浸漬測定中，綴合的金常常呈現(xiàn)粉色，而各種綴合的珠子呈現(xiàn)珠子的顏色。某些測定模式不需要使用標(biāo)記的成分。例如，凝集測定可以用于檢測目標(biāo)抗體，例如抗TRAIL受體抗體的存在。在這種情況下，抗原包被的顆粒通過包含目標(biāo)抗體的樣品來凝聚。在這種形式中，沒有組分需要被標(biāo)記，目標(biāo)抗體的存在通過筒單的目測檢查來檢測。藥#*合#^潔賴身.本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑可以摻入適合于施用的藥物組合物中。藥物組合物一般包含至少一種TRAIL受體結(jié)合劑和處于適合于向受試者施用的形式的藥學(xué)上可接受的載體。藥學(xué)上可接受的載體部分地根據(jù)要施用的特定組合物，以及根據(jù)用于施用組合物的特定方法來確定。因而，存在著各種各樣的適合的藥物組合物的制劑用于施用所述4元體纟且合4勿(參見,例^口，ie/mV2gto"，s尸/zarmacew"'ca/<Sc/e"c&,MackPublishingCo.,Easton，PA18thed.,1990)。藥物組合物一般地被配制為無菌的，基本上等滲的，并完全符合美國食品和藥品管理局的所有的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)規(guī)范(GMP)規(guī)則。術(shù)語"藥學(xué)上可接受的"、"生理學(xué)上可耐受的"和其語法上的變體，當(dāng)涉及組合物、載體、稀釋劑和試劑時，可互換使用，表明所述材料能夠施用給受試者而不產(chǎn)生阻止所述組合物的施用的程度的不良生理影響。例如，"藥學(xué)上可接受的賦形劑"是指在制備一般安全、無毒、可取的藥物組合物中有用的賦形劑，并且包括對于獸醫(yī)學(xué)用途以及人類藥物用途可接受的賦形劑。這些賦形劑可以是固體、液體、半固體，或?qū)τ跉忪F劑組合物來說，是氣體。"藥學(xué)上可接受的鹽和酯，，是指藥學(xué)上可接受的并具有希望的藥理學(xué)性質(zhì)的鹽和酯。這些鹽包括在酸性質(zhì)子存在于TRAIL受體結(jié)合劑中時可以形成、并能夠與無機(jī)或有機(jī)堿反應(yīng)的鹽。適合的無機(jī)鹽包括與堿金屬，例如鈉和鉀、鎂、鈣和鋁形成的無機(jī)鹽。適合的有機(jī)鹽包括與有機(jī)堿，例如胺i成，例如，乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-曱基葡糖胺等等形成的有機(jī)鹽。這些鹽還包括與無機(jī)酸(例如，鹽酸和氫溴酸)和有機(jī)酸(例如，乙酸、檸檬酸、順丁烯二酸和烷烴和芳烴-磺酸，例如曱磺酸和苯磺酸)形成的酸加成鹽。藥學(xué)上可接受的酯包括從存在于TRAIL受體結(jié)合劑上的羧基、磺酰氧基、和膦羧基(phosphonoxy)基團(tuán)形成的酯，例如，d.6烷基酯。當(dāng)存在兩個酸性基團(tuán)時，藥學(xué)上可接受的鹽或酯可以是單酸單鹽或酯，或二鹽或酯；類似地，當(dāng)存在超過兩個酸性基團(tuán)時，某些或者所有這些基團(tuán)可以被鹽化或酯化。本發(fā)明中述及的TRAIL受體結(jié)合劑可以以未鹽化或未酯化的形式存在，或處于鹽化和/或酯化形式，對這樣的TRAIL受體結(jié)合劑的提述意圖包括最初的(未鹽化和未酯化的)化合物和它的藥學(xué)上可接受的鹽或和酯。并且，本發(fā)明中提述的某些TRAIL受體結(jié)合劑可以以超過一種立體異構(gòu)形式存在，這種TRAIL受體結(jié)合劑的提述意圖包括所有單立體異構(gòu)體和這些立體異構(gòu)體的所有混合物(無論是外消旋的還是相反)。對于本發(fā)明的特定藥物和組合物，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將不難確定施用的合適的時間、順序和劑量。這些載體或稀釋劑的優(yōu)選的實(shí)例包括，但不限于，水、鹽水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。也可以使用脂質(zhì)體和非水媒介物，例如不揮發(fā)油。這些介質(zhì)和化合物用于藥學(xué)活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域公知的。除非任何常規(guī)的介質(zhì)或化合物與TRAIL受體結(jié)合劑不相容，本發(fā)明考慮其在治療組合物中的使用。補(bǔ)充的活性化合物也可以摻入到組合物中。本發(fā)明的藥物組合物被配制以適合于它預(yù)期的施用途徑。本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑組合物可以通過胃腸外的、表面的、靜脈內(nèi)的、口服的、皮下的、動脈內(nèi)的、皮內(nèi)的、穿表皮的、直腸的、顱內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、鼻內(nèi)的、肌肉內(nèi)的途徑，或作為吸入物來施用。免疫原性劑如TRAIL受體多肽的最典型的施用途徑是皮下途徑，而其他途徑可以是同樣有效的。第二最常規(guī)的途徑是肌內(nèi)注射。這種類型的注射最一般地在手臂或腿部肌肉中進(jìn)行。在本發(fā)明的某些方法中，試劑被直接注射到積累了沉積物(deposits)特定的組織中，例如顱內(nèi)注射。靜脈內(nèi)輸注或肌肉內(nèi)注射(intramuscularinjectiononintravenousinfusion)對于TRAIL受體結(jié)合劑，例如抗TRAIL受體抗體的施用是優(yōu)選的。在某些方法中，本發(fā)明的特定的TRAIL受體結(jié)合劑直接注射到顱骨中。在某些方法中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑作為持續(xù)釋放組合物或裝置，例如MedipadTM設(shè)備來施用。本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑任選地可以與其他試劑組合地施用，所述其他試劑在治療各種疾病，包括各種TRAIL受體相關(guān)疾病中是至少部分有效的。在向受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)施用的情況下，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑也可以與提高本發(fā)明的試劑對血腦屏障的跨越的其他試劑一起施用。用于胃腸外的、皮內(nèi)的或皮下施用的溶液或懸浮液可以包括以下的成分無菌的稀釋劑例如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)油類、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成的溶劑；抗菌化合物例如苯曱醇或?qū)αu基苯曱酸曱酯；抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氬鈉；螯合化合物例如乙二胺四乙酸(EDTA);緩沖劑例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及用于調(diào)整張度的化合物例如氯化鈉或葡萄糖。使用酸或堿，例如鹽酸或氫氧化鈉，可以調(diào)節(jié)pH值。胃腸外的制品可以封裝到由玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多劑量小瓶中。適合于可注射使用的藥物組合物一般包括無菌水溶液(在水可溶時)或分散體，以及用于無菌可注射溶液或分散體的臨時制備的無菌粉劑。對于靜脈內(nèi)施用，適合的載體包括，生理鹽水、抑菌水、克列莫佛(Cremophor)ELTM(BASF;Parsippany，N丄)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物應(yīng)當(dāng)是無菌的，并應(yīng)當(dāng)具有易于通針(easysyringeability)的程度的流動性。它在制造和儲存條件下必須是穩(wěn)定的，并且必須保持不受抗微生物例如細(xì)菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等等)、以及其適合的混合物。適當(dāng)?shù)牧鲃有钥梢酝ㄟ^下述方式維持例如，通過使用包衣例如卵磷脂；在分散體的情況下通過維持所需的粒子大??；以及通過使用表面活性劑?？梢酝ㄟ^各種抗菌和抗真菌化合物，例如，對羥苯曱酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等等，來實(shí)現(xiàn)對微生物作用的防護(hù)。在很多情況下，組合物中優(yōu)選包括等滲化合物，例如，糖類、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化鈉。通過在組合物中包括延遲吸收的化合物，例如單硬脂酸鋁和明膠，可以實(shí)現(xiàn)可注射組合物的延長的吸收?？梢酝ㄟ^將TRAIL受體結(jié)合劑以所需的量摻入到具有一種上文列舉的成分或上文列舉的成分的組合的適合的溶劑中，根據(jù)需要，繼之以過濾滅菌，來制備無菌可注射溶液。一般地，通過將結(jié)合劑摻入到含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)以及來自以上列舉那些的其他所需成分的無菌運(yùn)載體中，來制備分散體。對于用于制備無菌可注射溶液其無菌粉劑來說，制備方法是通過真空干燥和凍干產(chǎn)生粉劑，這樣的粉劑包含活性成分以及任何期望的成分，后者來自所述成分的事先經(jīng)無菌過濾的溶液。本發(fā)明的試劑可以以儲庫注射劑(depotinjection)或植入制劑的形式施用，這樣的試劑可以配制成允許活性成分的持續(xù)或脈沖釋放的形式。口服組合物一般包括惰性稀釋劑或可食用的載體。它們可以包裝入膠嚢中或壓縮成片劑。對于口服治療施用來說，粘合劑可以與賦形劑混合，以片劑、錠劑或膠嚢的形式使用?？诜M合物也可以施用液體載體制備來用作漱口水，其中所述液體載體中的化合物口服地應(yīng)用并被吸入和吐出或吞咽。可以包括藥學(xué)上相容的結(jié)合化合物、和/或佐劑材料作為組合物的一部分。片劑、藥丸、膠嚢、錠劑等等可以含有任何以下的成分，或性質(zhì)類似的化合物粘合劑，例如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，例如淀粉或乳糖，崩解化合物，例如海藻酸、乙醇酸淀粉鈉(Primogel)或玉米淀粉；潤滑劑，例如硬脂酸鎂或氫化植物油(STEROTES);助流劑，例如膠體二氧化硅；甜味化合物，例如蔗糖或糖精；調(diào)味化合物，例如薄荷、水楊酸曱酯或橙味劑。對于通過吸入施用，TRAIL受體結(jié)合劑來自壓縮容器或分配器的氣溶膠噴霧來施用，所述容器或分配器含有適合的推進(jìn)劑，例如氣體，如二氧化碳，或來自噴霧器。全身性施用也可以通過穿粘膜或穿表皮的方式。對于穿粘膜或穿表皮施用，適合于需透過的障礙物的滲透劑可以用于制劑中。這種滲透劑一顧二是本領(lǐng)域已知的，包括，例如，對于穿粘膜施用，洗滌劑、膽汁鹽、和夫西地酸衍生物。穿粘膜施用可以通過使用鼻噴霧或栓劑來實(shí)現(xiàn)。對于穿表皮施用，如本領(lǐng)域一般已知的，將TRAIL受體結(jié)合劑配制到軟膏劑(ointments)、油膏劑(salves)、凝膠劑或乳膏劑中。TRAIL受體結(jié)合劑也可以制備為用于直腸遞送的栓劑(例如，具有常規(guī)的栓劑基質(zhì)，例如可可脂和其他甘油酯)或滯留灌腸劑(retentionenemas)的形式的藥物組合物。在一個實(shí)施方式中，使用載體制備TRAIL受體結(jié)合劑，所述載體將保護(hù)所述TRAIL受體結(jié)合劑對抗機(jī)體的快速清除，例如控釋制劑，包括植入物和微封裝的遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾?、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯(polyorthoesters)和聚乳酸。這類配制劑的制備方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。這些才才并牛也可以自AlzaCorporation和NovaPharmaceuticals,Inc商購。月旨質(zhì)體懸液(包括帶有針對病毒抗原的單克隆抗體的、靶向受感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)也可以用作藥學(xué)上可接受的載體。這些可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來制備，例如，如美國專利No.4,522,811中描述的。特別有利的是以單位劑型配置口服的或胃腸外的組合物，以便于施用和劑量的均勻化。在此使用的單位劑型是指適合作為單位劑量用于要治療的受試者的、物理上離散的單位；每個單位含有經(jīng)過計算可產(chǎn)生期望治療效果的預(yù)定量的結(jié)合劑以及與之結(jié)合的藥物載體。本發(fā)明的單位劑型的規(guī)格由下列因素決定并且直接依賴于它們結(jié)合劑的獨(dú)特特征和要實(shí)現(xiàn)的特定治療效果、以及用于治療受試者的TRAIL受體結(jié)合劑配制技術(shù)的固有限制。本發(fā)明的核酸分子可以插入到載體中，用作基因治療載體?？梢酝ㄟ^，例如，靜脈內(nèi)注射、局部施用(參見，例如，美國專利5,328,470)或通過立體定向(stereotactic)注射(參見，例如Chen等人，1994.7Va//.^co^.5W.USA91:3054-3057)將基因治療載體遞送給受試者。基因治療載體的藥物制劑可以包括處在可接受的稀釋劑中的基因治療載體，或可以包含內(nèi)部包埋有基因遞送載體的緩釋基質(zhì)。作為選擇，當(dāng)可以從重組細(xì)胞完整地產(chǎn)生整個基因遞送載體時，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，藥物配制劑可以包括一個或多個產(chǎn)生該基因遞送系統(tǒng)的細(xì)胞。所述藥物組合物可以與施用說明書一起裝入容器、包裝袋或分配器中。本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑的鑒定和表征,;t和/威謬遂本發(fā)'效的潛合游的才法.對于鑒定和篩選結(jié)合劑一一例如具有對TRAIL受體多肽的期望的特異性的抗TRAIL受體抗體和抗TRAIL受體抗體相關(guān)多肽一一有用的方法，包括本領(lǐng)域已知的任何免疫介導(dǎo)的技術(shù)。免疫應(yīng)答的成分可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員^^知的各種方法體外地檢測。例如，(1)可以將細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞與放射活性標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞溫育，通過放射性的釋放檢測這些目標(biāo)細(xì)胞的裂解；(2)可以將輔助T淋巴細(xì)胞與抗原和抗原呈遞細(xì)胞溫育，通過標(biāo)準(zhǔn)方法測量細(xì)胞因子的合成和分泌(WindhagenA;等人，7mmwmXy，2:373-80，1995);(3)可以將抗原呈遞細(xì)胞與完整的蛋白質(zhì)抗原溫育，通過T'淋巴細(xì)胞活化分析或生物物理學(xué)方法檢測所述抗原在MHC上的呈遞(Harding等人，iVoc.Ato/.5W.，86:4230-4,1989);(4)可以將肥大細(xì)胞與能交聯(lián)它們的Fc-epsilon受體的試劑溫育，并通過酶免疫分析來測量組胺釋放(Siraganian等人，TIPS,4:432-437,1983);和(5)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。類似地，在模型生物(例如，小鼠)或人類受試者中免疫應(yīng)答的產(chǎn)物可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員7>知的各種的方法來纟企測。例如，(l)響應(yīng)于疫苗接種的抗體產(chǎn)生可以通過當(dāng)前臨床實(shí)驗室中使用的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如ELISA來容易地;險測；(2)免疫細(xì)胞向炎癥部位的遷移可以通過在皮膚表面劃痕并置于無菌容器上來捕獲劃痕部位上的遷移細(xì)胞來檢測(Peters等人，5/ood，72:1310-5,1988);(3)響應(yīng)于促細(xì)胞分裂劑或者混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的外周血單個核細(xì)胞增殖可以使用3H-胸腺嘧啶核苷來測定；(4)PBMC中粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他吞噬細(xì)胞的吞噬力可以通過將PMBC與標(biāo)記的顆粒一起置于孔中來測量(Peters等人，72:1310-5，1988);和(5)免疫系統(tǒng)細(xì)胞的分化可以通過用針對CD分子例如CD4和CD8的抗體標(biāo)記PBMC并測量表達(dá)這些標(biāo)記物的PBMC的級分來測量。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑利用候選結(jié)合劑在可復(fù)制的遺傳包裝體(replicablegeneticpackages)的表面上展示來選擇。參見，例如，美國專利5,514,548;5,837,500;5,871,907;5，885，793;5，969，108;6,225,447;6,291,650;6,492,160;EP585287;EP605522;EP616640;EP1024191;EP589877;EP774511;EP844306。已經(jīng)描述了可用于生產(chǎn)/選擇含有編碼具有希望特異性的結(jié)合分子的噬菌粒基因組的絲狀噬菌體顆粒的方法。參見，例如，EP774511;US5871907;US5969108;US6225447;US6291650;US6492160。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑利用候選結(jié)合劑在酵母宿主細(xì)胞的表面上展示來選擇?？捎糜谕ㄟ^酵母表面展示分離scFc多肽的方法已經(jīng)由Kieke等人，PraW"1997Nov;10(11):1303-10描述了。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑利用核糖體展示來選擇。利用核糖體展示鑒定肽庫中的配體的方法已經(jīng)由Mattheakis等人，Proc.A^/.爿cac/.Sc/.tZSJ91:9022-26,1994;和Hanes等人，iVoc.Ato/.爿cac/.5W.USA94:4937-42,1997描述了。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑利用候選結(jié)合劑的tRNA展示來選擇。利用tRNA展示體外選擇配體的方法已經(jīng)由Merryman等人，Chem.Biol.,9:741-46，2002描述了。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑利用RNA展示來選擇。利用RNA展示選擇肽和蛋白質(zhì)的方法已經(jīng)由Roberts等人Prac.iVaf/爿cadS"',L^SL4，94:12297-302,1997;和Nemoto等人，F(xiàn)五^S丄故.，414:405-8，1997描述了。利用非天然RNA展示庫選擇肽和蛋白質(zhì)的方法已經(jīng)由Frankel等人，Cwr.(9/7/".所o/.，13:506-12，2003描述了。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑在革蘭氏陰性細(xì)菌的周質(zhì)中表達(dá)，并與標(biāo)記的TRAIL受體多肽混合。參見WO02/34886。在表達(dá)具有對TRAIL受體多肽的親和力的重組多肽的克隆中，與結(jié)合劑結(jié)合的標(biāo)記的TRAIL受體多肽的濃度被提高，從而可以將細(xì)胞與文庫的其余部分分離，如在Harvey等人，尸rac.淑/」c^.>SW.22:9193-982004和美國專利7>開2004/0058403中描述的。在選擇希望的TRAIL受體結(jié)合劑之后，考慮可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)，例如，原核或真核細(xì)胞表達(dá)等等來大規(guī)沖莫地產(chǎn)生它。TRAIL受體結(jié)合劑(例如但不限于抗TRAIL受體雜合抗體或片段)可以通過利用常規(guī)技術(shù)來構(gòu)建編碼這樣的抗體重鏈的表達(dá)載體來產(chǎn)生，所述重鏈中，為保持原始物種抗體的結(jié)合特異性所必需的CDR和(如有必要的話)可變區(qū)框架的最小部分(根據(jù)在此描述的技術(shù)來工程化)來自于來源物種抗體，而抗體的其余部分來源于目標(biāo)物種免疫球蛋白(其可以如本文所述的加以操作)，從而產(chǎn)生用于表達(dá)雜交抗體重鏈的載體。7T"/丄f傳潛合的^/量在一個實(shí)施方式中，TRAIL受體結(jié)合測定是指一種測定模式，其中將TRAIL受體多肽和TRAIL受體結(jié)合劑在適合于TRAIL受體多肽和TRAIL受體結(jié)合劑之間的結(jié)合的條件下混合，并評估TRAIL受體多肽和TRAIL受體結(jié)合劑之間的結(jié)合的量。將結(jié)合的量與合適的對照進(jìn)行比較，其中所述對照可以是在不存在TRAIL受體多肽的情況下的結(jié)合量、存在非特異性免疫球蛋白組合物(composition)的情況下的結(jié)合量，或二者皆是。結(jié)合量可以通過任何適合的方法來評估。結(jié)合測定方法包括，例如，ELISA、放射受體結(jié)合測定、閃爍迫近測定、細(xì)胞表面受體結(jié)合測定、熒光能量轉(zhuǎn)移測定、液相層析、膜過濾測定，等等。用于結(jié)合TRAIL受體結(jié)合劑的TRAIL受體多肽的直接測量的生物物理學(xué)測定有，例如，核磁共振、熒光、熒光偏振、表面等離子體共振(BIACOR芯片)等等。通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測定方法測定特異性結(jié)合，例如，放射性配體結(jié)合測定、ELISA、FRET、免疫沉淀、SPR、NMR(2D-NMR)、質(zhì)譜法，等等。如果候選TRAIL受體結(jié)合劑的特異性結(jié)合比不存在候選TRAIL受體結(jié)合劑的情況下觀察到的結(jié)合大至少百分之一，則候選TRAIL受體結(jié)合劑作為本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑是有用的。69本發(fā)明還提供了TRAIL受體多肽和TRAIL受體結(jié)合劑的共結(jié)晶(co-crystals)作為測定分子間相互作用的方法。適合于TRAIL受體結(jié)合劑和TRAIL受體多肽之間結(jié)合的條件將取決于化合物和它的配體，可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地測定。f傳潛合^/^#夢活遂的^/量本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑，例如抗TRAIL受體抗體和抗TRAIL受體抗體相關(guān)多肽，可以被具體指定為生物學(xué)活性的激動劑或拮抗劑，其含有本文所公開的特定活性。例如，作為TRAIL受體結(jié)合劑的TRAIL受體激動劑和拮抗劑可以利用本領(lǐng)域已知的方法來產(chǎn)生。參見，例如，WO96/40281;美國專利No.5,811,097;Deng等人，祝ood92:1981-1988，1998;Chen等人，Ca訓(xùn)rL,58:3668-3678,1998;Harrop等人，《//www"o/.161:1786-1794,1998;Zhu等人，Ca"cer^es.，58:3209-3214，1998;Yoon等人，J/mmw"o/.，160:3170-3179，1998;Prat等人，JCW/.5W.，111:237-247,1998;Pitard等人，//wmw"o/.Mef/zoA,205:177-190,1997;Liautard等人，C^ofe.w&，9:233-241,1997;Carlson等人，J所o/.CAew.，272:11295-11301,1997;Taryman等人，iVeww,14:755-762，1995;Muller等人，lw"匿,6:1153-1167，1998;Bartunek等人，Qvtoh>7em，8:14-20，1996。生物學(xué)活性，即TRAIL受體結(jié)合劑的激動劑或拮抗劑性質(zhì)，可以利用任何被開發(fā)用于測量TRAIL受體多肽的生物學(xué)活性的常規(guī)體內(nèi)和體外測定來表征。本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑的用途y潔迷.本發(fā)明的結(jié)合劑在涉及TRAIL受體多肽的定位和/或定量的本領(lǐng)域已知方法中是有用的(例如，用于測量適合的生物學(xué)樣品中的TRAIL受體多肽的水平，用于診斷方法，用于為所述多肽顯像，等等。)。在一個實(shí)施方式中，含有抗體衍生的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的TRAIL受體結(jié)合劑作為藥理學(xué)活性組合物(以下稱"治療劑")是有用的。本發(fā)明的結(jié)合劑對于通過標(biāo)準(zhǔn)凈支術(shù)，例如親和層析或免疫沉淀來分離TRAIL受體多肽是有用的。本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑可以有助于純化來自生物樣品例如細(xì)胞的天然的免疫反應(yīng)性TRAIL受體多肽或免疫反應(yīng)性TRAIL受體樣多肽、以及在宿主系統(tǒng)中表達(dá)的重組產(chǎn)生的免疫反應(yīng)性TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽。此外，TRAIL受體結(jié)合劑可以用于才全測免疫反應(yīng)性TRAIL受體多肽或免疫反應(yīng)性TRAIL受體樣多肽(例如，在細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中或細(xì)胞上清液中)以評估免疫反應(yīng)性多肽的表達(dá)豐度和表達(dá)模式。本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑可以用于診斷來監(jiān)視組織中免疫反應(yīng)性TRAIL受體和/或免疫反應(yīng)性TRAIL受體樣免疫反應(yīng)性多肽的水平，作為臨床測試程序的一部分，用來，例如，確定給定治療方式的效力。如上所述，通過偶聯(lián)(即，物理地連接)本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑到可檢測的物質(zhì)，可以使檢測更容易。7TM/丄^沐/應(yīng)^這的^^刺.一種示例性的用于檢測生物樣品中TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的有無的方法包括從測試受試者獲得生物樣品，使所述生物樣品接觸能夠檢測TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑，從而4企測TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽在所述生物樣品中的存在。TRAIL受體結(jié)合劑的實(shí)例是能夠結(jié)合TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的、針對SEQIDNO:1產(chǎn)生的抗體，優(yōu)選的具有可^r測標(biāo)記的抗體。術(shù)語"標(biāo)記的"對于結(jié)合劑而言意圖包括通過將結(jié)合劑與可檢測物質(zhì)偶聯(lián)(即，物理連接)而直接標(biāo)記該結(jié)合劑，以及通過與直4妻被標(biāo)記的另一個化合物反應(yīng)而間接標(biāo)記該結(jié)合劑。間4妄標(biāo)記的實(shí)例包括使用熒光標(biāo)記的第二抗體檢測第一抗體，和用生物素對DNA的末端標(biāo)記，使得它可以用熒光標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白加以;險測。本發(fā)明的檢測方法可以用于體外和體內(nèi)檢測生物樣品中的TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽。用于檢測TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的體外技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、Western印跡、免疫沉淀和免疫熒光。此外，用于檢測TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的體內(nèi)技術(shù)包括向受試者中導(dǎo)入標(biāo)記的TRAIL受體結(jié)合劑，例如抗TRAIL受體抗體。例如，可以用放射性標(biāo)記物標(biāo)記抗體，所述放射性標(biāo)記物在受試者中的存在和位置可以通過標(biāo)準(zhǔn)顯像技術(shù)來檢測。在一個實(shí)施方式中，所述生物樣品含有來自測試受試者的多肽分子。^^溯Z;t和i謬.本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑可以用來利用基于抗體的技術(shù)分析生物樣品中TRAIL受體多肽水平或TRAIL受體樣多肽水平。例如，可以用標(biāo)準(zhǔn)的免疫組織學(xué)方法來研究組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)。Jalkanen,M.等人，/CW/.歷o/.101:976-985,1985;Jalkanen，M.等人，/Ce〃.Ao/,105:3087-3096，1987。對于檢測蛋白質(zhì)基因表達(dá)有用的其他基于抗體的方法包括免疫分析，例如，酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)和》t射免疫分析(RIA)。適合的抗體分析標(biāo)記物是本領(lǐng)域已知的，包括酶標(biāo)記物，例如，葡萄糖氧化酶，和放射性同位素或其他放射性試劑，例如，碘(1251,1211)、碳("C)、硫(35S)、氖(3H)、銦(1I2In)和锝(99mTc),以及熒光標(biāo)記物，例如熒光素和羅丹明，以及生物素。除了分析生物樣品中的分泌的TRAIL受體多肽水平或TRAIL受體樣多肽水平之外，分泌的TRAIL受體多肽水平或TRAIL受體樣多肽水平也可以通過顯像來體外檢測。用于TRAIL受體多肽水平或TRAIL受體樣多肽的體內(nèi)顯像的TRAIL受體結(jié)合劑，例如，抗TRAIL受體抗體標(biāo)記物或標(biāo)示物包括可通過X射線照相術(shù)、NMR或ESR檢測的那些。對于X射線照相術(shù)，適合的標(biāo)記物包括放射性同位素，例如鋇或銫，其產(chǎn)生可檢測的輻射，但對受試者不是明顯有害的。NMR和ESR的適合的標(biāo)示物包括具有可檢測的特征性自旋的標(biāo)示物，例如，氘，其可以通過標(biāo)記相關(guān)scFv克隆的營養(yǎng)物來摻入到TRAIL受體結(jié)合劑中。將已經(jīng)用合適的可檢測顯像模塊一一例如放射性同位素(例如，mI、112In、"mTc)、放射不透明物質(zhì)、或可通過核磁共振檢測的材料一一標(biāo)記的TRAIL受體結(jié)合劑導(dǎo)入(例如，通過胃腸外、皮下或腹膜內(nèi)導(dǎo)入)受試者中。本領(lǐng)域中要理解的是，受試者的體格(size)和使用的顯像系統(tǒng)將決定產(chǎn)生診斷圖像所需的顯像模塊的量。對于放射性同位素模塊來說，對于人類受試者，注射的放射性的量通常范圍將是約5到20毫居里的"mTc。標(biāo)記的TRAIL受體結(jié)合劑然后將優(yōu)先地積累在細(xì)胞中含有特異性目標(biāo)多肽的"j立置。侈'H口,在S.W.Burchiel等人，7"wmor7wag/wg.'77zei^flfi/oc/zem/ca/Defect"o/Ca"cer13(1982)中描述了體內(nèi)腫瘤顯像。因而，本發(fā)明提供了醫(yī)學(xué)狀況的診斷方法，其涉及(a)通過測量個體的細(xì)胞或體液中本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑的結(jié)合來測定多肽的表達(dá)；(b)將基因表達(dá)的水平與標(biāo)準(zhǔn)的基因表達(dá)水平相比較，與標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平相比所分析的多肽基因表達(dá)水平方面的提高或降低指示醫(yī)學(xué)狀況。,街^it:本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合組合物(compositions)在診斷方法中是有用的。因而，本發(fā)明提供了利用在診斷受試者中TRAIL受體相關(guān)醫(yī)學(xué)狀況中有用的本發(fā)明的結(jié)合劑的方法?？梢赃@樣地選擇本發(fā)明的結(jié)合劑，使得它們對TRAIL受體多肽具有任何水平的表位結(jié)合特異性以及非常高的結(jié)合親和力。一般地，結(jié)合劑的結(jié)合親和力越高，在免疫測定中可以實(shí)施越嚴(yán)格的洗滌條件，來除去非特異性結(jié)合的材料而不移除目標(biāo)多肽。因而，在診斷測定中有用的本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑通常具有至少108、109、10，IO"或1012M"的結(jié)合親和力。進(jìn)一步地，理想的是用作診斷試劑的TRAIL受體結(jié)合劑具有足夠的動力學(xué)啟動速率(kineticon-rate)以在至少12小時、優(yōu)選的至少五(5)小時、更優(yōu)選的至少一(1)小時中在標(biāo)準(zhǔn)條件下達(dá)到平衡。本發(fā)明的某些方法采用了本發(fā)明的抗TRAIL受體抗體的多克隆制備物以及抗TRAIL受體抗體組合物(compositions)作為診斷試劑，其他方法采用了單克隆分離物。相比由一種單克隆抗TRAIL受體抗體組成的組合物(composition),多克隆混合物的使用具有許多優(yōu)勢。通過結(jié)合到TRAIL受體多肽、多克隆抗TRAIL受體抗體或其他多肽上的多個位點(diǎn)，可以產(chǎn)生比結(jié)合到TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽上單個位點(diǎn)的單克隆更強(qiáng)的(用于診斷的)信號。進(jìn)一步地，多克隆制備物可以結(jié)合到原型目標(biāo)序列的多種變體(例如，等位變體、種間變體、抹系變體、藥物誘導(dǎo)的逃逸變體(escapevariant))，而單克隆抗體僅可以結(jié)合原型序列或較上述范圍為窄的變體。然而，在存在或潛在存在近相關(guān)抗原的情況下，單克隆的抗TRAIL受體抗體對于檢測單一抗原是有利的。在采用根據(jù)上述方法制備的多克隆人類抗TRAIL受體抗體的方法中，制備物一般包含具有針對目標(biāo)多肽的不同表位特異性的TRAIL受體結(jié)合劑(例如抗體)的配列(assortment)。在某些采用單克隆抗體的方法中，理想的是具有不同的表位結(jié)合特異性的兩種抗體。表位結(jié)合特異性上的差異可以通過竟?fàn)幮越Y(jié)合測定法來測定。雖然作為人類抗體的TRAIL受體結(jié)合劑可以用作任何類型的樣品的診斷試劑，它們作為對于人類生物樣品的診斷試劑是最有用的。TRAIL受體結(jié)合劑可以用于在各種標(biāo)準(zhǔn)的測定模式中檢測給定的TRAIL受體多肽。這些才莫式包括免疫沉淀、Western印跡、ELISA、放射免疫測定和免疫測定分析(immunometricassay)。參見Harlow&Lane,J油'6oW&y，^Z^60rafo"7TWam^/(ColdSpringHarborPublications,NewYork,1988);美國專利3,791,932;3,839,153;3,850,752;3,879,262;4,034,074，3,791,932;3,817,837;3,839,153;3,850,752;3,850,578;3,853,987;3,867,517;3,879,262;3,901,654;3，935，074;3,984,533;3,996,345;4,034,074;和4,098,876。生物樣品可以從受試者的任何組織或體液獲得。利4,376,110，4,486,530,5,914,241和5,965,375。這些分析使用固定到固相上的一種TRAIL受體結(jié)合劑，例如，抗TRAIL受體抗體或抗TRAIL受體抗體的群體，以及另一種抗TRAIL受體抗體或抗TRAIL受體抗體的群體。一般地，對溶液抗TRAIL受體抗體或抗TRAIL受體抗體的群體加以標(biāo)記。如果使用抗體群體，所述群體一般含有結(jié)合于目標(biāo)多肽的不同表位特異位點(diǎn)的抗體。因而，對于固相和溶液抗體可以4吏用相同的群體。如果使用抗TRAIL受體單克隆抗體，則對于固體和液相使用具有不同的結(jié)合特異性的第一和第二TRAIL受體單克隆抗體。固相和溶液抗體可以順序地或同時地與目標(biāo)抗原接觸。如果固相抗體首先接觸，則分析稱為正向分析。反之，如果溶液抗體首先接觸，則分析稱為反向分析。如果目標(biāo)與兩種抗體同時地接觸，則分析稱為同時分析。在使抗TRAIL受體抗體接觸TRAIL受體多肽之后，將樣品溫育一定時期，通常從約10分鐘到約24小時，通常是約1小時。然后進(jìn)行洗滌步驟來除去樣品中沒有特異性地結(jié)合于用作診斷試劑的抗TRAIL受體抗體的成分。當(dāng)固相抗體和溶液抗體在不同的步驟中結(jié)合時，可以在任一或兩個結(jié)合步驟之后進(jìn)行洗滌。在洗滌之后對結(jié)合加以定量，定量一般通過檢測連接到固相上的標(biāo)記物來進(jìn)行，其中所述標(biāo)記物是通過被標(biāo)記的溶液抗體的結(jié)合而連接到固相的。通常，對于給定的一對抗體或一對抗體群體，以及給定的反應(yīng)條件，從含有已知濃度的目標(biāo)抗原的樣品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的內(nèi)插來讀取被測試的樣品中TRAIL受體多肽的濃度。被分析物可以根據(jù)在平衡狀態(tài)結(jié)合的標(biāo)記溶液抗體的量，或通過在達(dá)到平〗耔之前一系列時間點(diǎn)上結(jié)合的標(biāo)記溶液抗體的動力學(xué)測量來測量。這種曲線的斜率是樣品中TRAIL受體多肽的濃度的度量。用于上述方法的適合的支持物包括，例如，硝酸纖維素膜、尼龍膜和衍生化的尼龍膜，以及顆粒，例如瓊脂糖、基于葡聚糖的凝膠、浸漬片(dipsticks)、顆粒、微球體、磁性顆粒、試管、微量滴定孔、SEPHADEX(AmershamPharmaciaBiotech,PiscatawayN.J,)等等。固定可以通過吸附或通過共價附接來實(shí)現(xiàn)。任選地，抗TRAIL受體抗體可以連接到接頭分子，例如，生物素，用于附接于結(jié)合在表面上的接頭，例如抗生物素蛋白上。^^W屋夢.本發(fā)明還涉及預(yù)測醫(yī)學(xué)(predictivemedicine)的領(lǐng)域，其中為了預(yù)后(預(yù)測)目的使用診斷分析、預(yù)后分析、藥物基因組學(xué)以及監(jiān)控臨床試驗等來預(yù)防性地處理個體。因而，本發(fā)明的一個方面涉及用于確定生物樣品(即，血液、血清、細(xì)胞、組織)中TRAIL受體多肽表達(dá)的診斷分析，以確定受試者是否患有與異常的TRAIL受體多肽表達(dá)相關(guān)的疾病或病癥，或具有發(fā)生這樣的病癥的風(fēng)險。本發(fā)明還提供了預(yù)后(或預(yù)測)分析，用于確定個體是否存在發(fā)展出與TRAIL受體多肽表達(dá)或活性相關(guān)的病癥的風(fēng)險。這些分析可以用于預(yù)后或預(yù)測目的，以便在以TRAIL受體多肽為特征、或與TRAIL受體多肽相關(guān)的病癥發(fā)作之前預(yù)防性地處理個體。此外，在本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑對TRAIL受體多肽相對于對其多態(tài)型具有更高親和力的情況下(反之亦TRAIL受體多肽的多態(tài)型。在受試者的特定組織中(或在血液中)某些多肽的水平可能是當(dāng)給定藥物施用給受試者時該藥物的毒性、效力、清除速率或代謝速率的指示。在此描述的方法也可以用于測定這樣的多肽在受試者中的水平以幫助預(yù)測這些受試者對這些藥物的反應(yīng)。本發(fā)明的另一個方面提供了一種方法來測定個體中TRAIL受體多肽的表達(dá)，從而為該個體選擇合適的治療性或預(yù)防性化合物(在此稱為"藥物基因組學(xué)")。利用藥物基因組學(xué)，可以根據(jù)個體的基因型選擇用于個體的治療或預(yù)防性處理的化合物(例如藥物)(例如，檢查個體的基因型來確定個體對于特定化合物的響應(yīng)能力)。本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑與TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的結(jié)合，例如，可以被利用來鑒定具有發(fā)生與TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽表達(dá)或活性相關(guān)的病癥(如上文描述的)的風(fēng)險的受試者。作為選擇，可以利用預(yù)后分析來鑒定具有或存在風(fēng)險發(fā)生所述疾病或病癥的受試者。因而，本發(fā)明提供了一種方法來鑒定與異常的TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽表達(dá)或活性相關(guān)的疾病或病癥，其中從受試者獲得測試樣品，檢測TRAIL受體結(jié)合劑，其中TRAIL受體結(jié)合劑的改變的存在是受試者具有或有風(fēng)險發(fā)生與異常的TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽表達(dá)或活性相關(guān)的疾病或病癥的診斷依據(jù)。如在此使用的，"測試樣品"是指從感興趣的受試者獲得的生物樣品。此外，在此描述的預(yù)后分析可以用于確定受試者是否可以施用化合物(例如,激動劑、拮抗劑、擬肽(peptidomimetics)、多肽、肽、核酸、小分75子或其他藥物候選物)來治療與異常的TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽表達(dá)或活性相關(guān)的疾病或病癥。例如，這種方法可用于確定是否可以用化合物有效地治療受試者的TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽相關(guān)的病癥。因而，本發(fā)明提供了確定是否可以用化合物有效地治療受試者的與異常的TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽表達(dá)或活性相關(guān)的病癥的方法，其中獲得測試樣品，利用TRAIL受體結(jié)合劑才全測TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽(例如，其中TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的存在是可以施用所述化合物來治療該受試者的與異常的TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽表達(dá)或活性相關(guān)的病癥的診斷依據(jù))。從受試者獲得血液或組織樣品，測定其中TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的水平，并與獲自沒有所述疾病的個體的血液樣品或相同組織類型的樣品中存在的水平相比較。與獲自健康受試者的樣品相比，在獲自懷疑患有TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽相關(guān)疾病的受試者的樣品中TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的過高豐度(或過低豐度)是在被測試的受試者中與TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽相關(guān)的疾病的指示。作出陽性診斷可能需要進(jìn)一步的測試。在許多疾病中，某些TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽分子的過量表達(dá)(或減量表達(dá))的程度是受試者是否患有可能響應(yīng)于特定種類的治療或處理的疾病的指示。因而，；險測樣品中TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的方法可以用作預(yù)后的方法，例如，來評估受試者所述治療或處理應(yīng)答的可能性。測定來自所述受試者的適合的組織或血液樣品中相關(guān)的預(yù)后性多肽的水平，并與適合的對照——例如患有相同疾病但是對治療應(yīng)答良好的受試者中的水平一一相比較。與對照相比在樣品中預(yù)后性多肽過量表達(dá)(或減量表達(dá))的程度可以是受試者將不會良好地應(yīng)答處理或治療的可能性的預(yù)示。相對于對照的過量表達(dá)(或減量表達(dá))越多，受試者將對治療有應(yīng)答的可能性越小。已經(jīng)知道，在多種疾病中，本文中稱為"預(yù)測性多肽"的某些目標(biāo)多肽的過量表達(dá)(或減量表達(dá))的程度是受試者是否將發(fā)病的指示。因而，檢測樣品中TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的方法可以用作預(yù)測受試者是否將發(fā)生疾病的方法。測定來自處于發(fā)生疾病的風(fēng)險中的受試者的適合的組織或血液樣品中相關(guān)的預(yù)測性多肽的水平，并與適合的對照——例如76不具有發(fā)生所述疾病的風(fēng)險的受試者中的水平一一相比較。與對照相比在樣品中預(yù)測性多肽過量表達(dá)(或減量表達(dá))的程度可以是受試者將發(fā)生疾病的可能性的預(yù)示。相對于對照的過量表達(dá)(或減量表達(dá))越多，受試者將發(fā)生疾病的可能性越高。在此描述的方法可以，例如，通過利用包含在此描述的至少一種探針試劑(例如TRAIL受體結(jié)合劑)的預(yù)包裝的診斷試劑盒來進(jìn)行，所述試劑盒可以在例如臨床醫(yī)療設(shè)施中方便地使用來診斷表現(xiàn)涉及TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的疾病或病狀的癥狀或家族史的受試者。此外，其中表達(dá)TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的任何細(xì)胞類型或組織均可以在本文描述的預(yù)后分析中加以利用。TRAIL受體結(jié)合劑的預(yù)防性和治療性用途.凝迷.本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑對于預(yù)防或治療疾病是有用的。具體地，本發(fā)明提供了用于治療有患病癥的風(fēng)險(或?qū)Σ“Y易感)，或患有病癥的受試者的預(yù)防性和治療性方法，其中所述病癥與異常的TRAIL受體結(jié)合劑表達(dá)或活性相關(guān)。因而，本發(fā)明提供了預(yù)防和/或治療受試者中TRAIL受體相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況的方法，包括向需要的受試者施用有效量的TRAIL受體結(jié)合劑。例如，可以給受試者施用本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑組合物，以替代(replace)TRAIL受體多肽(例如胰島素)的缺乏或降低的水平，來補(bǔ)充另一種多肽(例如抗TRAIL受體抗體)的缺乏或降低的水平，來抑制多肽(例如癌基因)的活性，來活化TRAIL受體多肽的活性(例如通過與受體結(jié)合)，來通過與膜結(jié)合受體竟?fàn)幱坞x的配體(例如消炎中使用的可溶TNF受體)而降低膜結(jié)合受體的活性，來產(chǎn)生期望的應(yīng)答(例如血管生長)。本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑在涉及受試者中的多種病癥的預(yù)防性和治療性應(yīng)用中是有用的，這些病癥包括但不限于涉及骨細(xì)胞的發(fā)育、分化和活化的病癥；血液循環(huán)中的細(xì)胞例如紅細(xì)胞和血小板的疾病或病理；各種免疫學(xué)病癥和/或病理；肺部的疾病和病癥；自身免疫和炎癥性疾病；心血管疾病；代j射疾??；生殖疾病、腎臟疾病、4唐尿病、腦外傷、癌癥生長和轉(zhuǎn)移；病毒感染、癌癥治療、牙周疾??；組織再生；急性淋巴母細(xì)胞性白血病；膠質(zhì)瘤；神經(jīng)疾病；神經(jīng)變性病癥；阿爾茨海默氏??；帕金森氏??；和造血功能障礙。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，使藥學(xué)有效量的抗TRAIL-R1和TRAIL-R2抗體通過與目標(biāo)細(xì)胞接觸來誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。識別TRAIL-R1和TRAIL-R2的抗體或識別TRAIL-R1和TRAIL-R2的人源化抗體的藥學(xué)有效量是施用給個體足以引起期望效果的量。施用藥學(xué)上有效量的TRAIL-R1和TRAIL-R2識別抗體的期望效果包括目標(biāo)細(xì)胞的死亡、目標(biāo)細(xì)胞的生長抑制、TRAIL-R1和TRAIL-R2的刺激、以及在目標(biāo)細(xì)胞中與TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的結(jié)合。目標(biāo)細(xì)胞是表達(dá)TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的細(xì)胞，包括異常生長的細(xì)胞，例如人類癌瘤細(xì)胞(carcinomacell)和白血病細(xì)胞。還包括具有病理狀況的細(xì)胞，這樣的病理狀況包括細(xì)胞增殖異常或失調(diào)的病理狀況，例如惡性癌癥或良性癌癥(benigncancer)。從而，在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗TRAIL受體結(jié)合劑在預(yù)防或治療有需要的受試者中癌癥的生長和/或轉(zhuǎn)移的方法中是有用的，所述癌癥例如但不限于，乳腺癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、腦癌、胰腺癌、以及結(jié)腸直腸癌。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑具有體外凋亡誘導(dǎo)活性，其中所述結(jié)合劑可以在等于或低于10嗎/ml的濃度下誘導(dǎo)至少30%的細(xì)胞死亡，優(yōu)選的至少50%、70%、90%,更優(yōu)選100%的細(xì)胞死亡。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑具有體內(nèi)凋亡誘導(dǎo)活性，其中結(jié)合劑當(dāng)用等于或低于10mg/kg體重的劑量治療時可以在人類癌癥異種移植模型中降〗氐至少30%腫瘤大小，優(yōu)選的，至少50%、70%、90%,更優(yōu)選100%的肺瘤大小。當(dāng)體內(nèi)用于治療時，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑，例如抗TRAIL受體抗體以有效量(即，具有期望的治療效果的量)施用給所述受試者。它們通常將胃腸外地施用。劑量和給藥方案將取決于TRAIL受體相關(guān)疾病或病癥的程度、使用的特定TRAIL受體結(jié)合劑的特征，例如它的治療指數(shù)，受試者和受試者的病史。有利的是，TRAIL受體結(jié)合劑在l-2周的時間內(nèi)連續(xù)地進(jìn)行靜脈內(nèi)施用來治療血管系統(tǒng)中的細(xì)胞，以及皮下和腹膜內(nèi)施用來治療局部的淋巴結(jié)。任選地，在輔助治療的過程中進(jìn)行施用，輔助治療例如聯(lián)合放射、化療的循環(huán)，或腫瘤壞死因子、干擾素或其他細(xì)胞保護(hù)或免疫調(diào)節(jié)試劑的施用。因而，本發(fā)明的結(jié)合劑和在輔助治療中有用的化合物可以向需要其施用的受試者同時地和連續(xù)地施用。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑可以用于增強(qiáng)治療性抗體，特別是抗TRAIL-R1或抗TRAIL-R2單特異性抗體的治療效力。本發(fā)明的抗體還與致敏劑(sensitizer)共同起作用。在此使用的致敏劑被定義為包括任何誘導(dǎo)凋亡的刺激物，包括有機(jī)分子，例如化療劑和放射試劑，其可以顯著地增強(qiáng)本發(fā)明的抗體的效力。另一方面，本發(fā)明的抗體可以用于增強(qiáng)化療和放射治療的治療效力。并且，它可以用于預(yù)防或逆轉(zhuǎn)(reverse)腫瘤細(xì)胞對化療和放射治療的抗性的發(fā)展。本發(fā)明的抗體還作為致敏劑起作用，以促進(jìn)由TRAIL-R1或TRAIL-R2的單特異性抗體誘導(dǎo)的癌細(xì)胞的凋亡。在惡性腫瘤治療的情境中，本發(fā)明的抗體，特別是CTB003和hCTB003,能夠誘導(dǎo)大多數(shù)TRAIL敏感腫瘤細(xì)胞的凋亡。CTB003展現(xiàn)體內(nèi)的強(qiáng)殺腫瘤活性。在此詳述的大部分腫瘤細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞表面TRAIL-R1和/或TRAIL-R2,它們對CTB003或hCTB003誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的敏感性與它們對TRAIL的敏感性相似(parallel)。CTB003或hCTB003繞過了誘餌受體來誘導(dǎo)凋亡。產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的小鼠-小鼠雜交瘤CTB003已經(jīng):帔保藏，分配了登錄號CGMCC1665。理解的是，對于論爭的人類TRAIL-R1和/或TRAIL-R2雙特異性單克隆抗體CTB003和hCTB003詳述的技術(shù)和結(jié)果完全可以擴(kuò)展到并適用于類似種類的雙特異性抗體。這種優(yōu)點(diǎn)一般地擴(kuò)展到本發(fā)明的人源化雙特異性抗體。對于胃腸外施用，TRAIL受體結(jié)合劑將與藥學(xué)上可接受的胃腸外賦形劑相結(jié)合配制成單位可注射劑型(溶液，懸浮液，乳劑)。這些賦形劑是本身無毒的，并且無治療性。使用抗TRAIL受體IgM抗體對于某些應(yīng)用是優(yōu)選的。然而，IgG分子由于更小，比IgM分子更有能力定位到某些類型的感染細(xì)胞。有證據(jù)表明，體內(nèi)的補(bǔ)體激活產(chǎn)生了多種生物學(xué)效果，包括炎癥性反應(yīng)的誘導(dǎo)和巨噬細(xì)月包的活4b(Unanue禾口Benecerraf，TextbookofImmunology,2ndEdition,Williams&Wilkins，p.218(1984))。伴隨炎癥的提高的血管舒張可以提高各種試劑定位到受感染細(xì)胞中的能力。因此，本發(fā)明指定的類型的TRAIL受體抗體組合可以通過多種方式治療性地-使用。另外，抗原，例如純化的TRAIL受體多肽，其片,殳或類似物(Hakomori，力朋.iev./mwww/.2:103，1984)或與這些抗原相關(guān)的抗獨(dú)特型抗體(Nepom等人，Proc.A^/.爿cadSc/.t/6L481:2864，1985;Koprowski等人，Prac.7V^/.^cad81:216,1984)可以用于在人類受試者中誘導(dǎo)主動免疫應(yīng)答。這樣的應(yīng)答包括形成能夠活化人類補(bǔ)體的抗體，以實(shí)現(xiàn)期望的生物學(xué)效果，例如破壞目標(biāo)細(xì)胞。疾4々4癥.對于以TRAIL受體多肽水平或生物學(xué)活性提高(相對于不患有所述疾病或病癥的受試者)為特征的疾病和病癥，可以用拮抗(即，降低或抑制)活性的基于TRAIL受體結(jié)合劑的治療化合物來加以治療，所述化合物可以以治療性或預(yù)防性的方式施用。可以利用的治療化合物包括，但不限于(i)前述的TRAIL受體結(jié)合劑；和(ii)編碼TRAIL受體結(jié)合劑的核酸。對于以TRAIL受體多肽水平或生物學(xué)活性降低(相對于不患有所述疾病或病癥的受試者)為特征的疾病和病癥，可以用提高TRAIL受體活性(即，是TRAIL受體活性激動劑)的基于TRAIL受體結(jié)合劑的治療化合物來加以治療劑包括但不限于，提高生物利用率的TRAIL受體結(jié)合劑。提高或降低的水平可以容易地通過定量TRAIL受體結(jié)合劑誘導(dǎo)的肽和/或RNA來檢測，定量是通過獲得受試者的組織樣品(例如來自活檢組織)并體外分析它的RNA或肽水平，表達(dá)的TRAIL受體多肽的結(jié)構(gòu)和/或活性(或前述多肽的mRNA)。本領(lǐng)域公知的方法包括但不限于，免疫測定(例如通過Western印跡分析，免疫沉淀、繼而十二烷基石克酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳，免疫細(xì)胞化學(xué)，等等)和/或雜交測定來^r測mRNA的表達(dá)(例如Northern測定、斑點(diǎn)印跡、原位雜交，等等)。^^才法.在一個方面中，本發(fā)明提供了一種方法，通過向所述受試者施用調(diào)節(jié)TRAIL受體多肽表達(dá)或至少一種TRAIL受體多肽活性的TRAIL受體結(jié)合劑，來預(yù)防受試者中與異常的TRAIL受體表達(dá)或活性相關(guān)的疾病或狀況。處于由異常的TRAIL受體多肽表達(dá)或活性引起或促發(fā)的疾病的風(fēng)險中的受試者可以通過例如在此描述的診斷或預(yù)后分析的任何或組合來鑒定。在預(yù)防性的應(yīng)用中，針對有風(fēng)險發(fā)生或易感于疾病或狀況(即免疫疾病)的受試者施用TRAIL受體結(jié)合劑的藥物組合物或藥物，施用的量以足夠消除或降低疾病風(fēng)險、降低疾病嚴(yán)重度、或延遲疾病的發(fā)作，包括疾病的生物化學(xué)、組織學(xué)和/或行為癥狀，疾病的并發(fā)癥，以及在疾病的發(fā)展期間呈現(xiàn)的中間病理表型。預(yù)防性TRAIL受體結(jié)合劑的施用可以發(fā)生在出現(xiàn)異常的特征癥狀之前，從而預(yù)防疾病或病癥，或者延遲其發(fā)展。取決于異常的類型，例如，可以用TRAIL受體結(jié)合劑作為TRAIL受體激動劑或TRAIL受體拮抗劑來治療所述受試者。合適的化合物可以根據(jù)在此描述的篩選分析來確定。本發(fā)明的另一個方面包括為治療目的調(diào)節(jié)受試者中TRAIL受體多肽表達(dá)或活性的方法。本發(fā)明的調(diào)節(jié)方法包括用本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑接觸細(xì)胞，所述試劑調(diào)節(jié)與細(xì)胞相關(guān)的TRAIL受體多肽活性中的一種或多種活性。在治療應(yīng)用中，對懷疑患有或已經(jīng)患有疾病的受試者施用組合物或藥物，施用的量足夠治愈、或至少部分地延滯所述疾病的癥狀(生物化學(xué)的、組織學(xué)的和/或行為的)，包括它的并發(fā)癥和疾病的發(fā)展中的中間病理表型。足夠?qū)崿F(xiàn)治療或預(yù)防性治療的量被定義為治療或預(yù)防有效量。在此描述了調(diào)節(jié)TRAIL受體多肽活性的化合物，可以包括，例如編碼TRAIL受體結(jié)合劑或TRAIL受體結(jié)合劑相關(guān)多肽的核酸。在一個實(shí)施方式中，TRAIL受體結(jié)合劑刺激一種或多種TRAIL受體多肽活性。這種刺激性化合物的實(shí)例包括TRAIL受體結(jié)合劑和已經(jīng)被導(dǎo)入細(xì)胞中、編碼TRAIL受體結(jié)合劑的核酸分子。在另一個實(shí)施方式中，TRAIL受體結(jié)合劑抑制一種或多種TRAIL受體多肽活性。這些調(diào)節(jié)方法可以在體外進(jìn)行(例如通過將細(xì)胞和TRAIL受體結(jié)合劑一起培養(yǎng))，或作為選擇，在體內(nèi)進(jìn)行(例如通過向受試者施用所述TRAIL受體結(jié)合劑)。因而，本發(fā)明提供一種方法來治療患有TRAIL受體相關(guān)疾病或病癥的個體，所述疾病或病癥以TRAIL受體多肽或編碼TRAIL受體多肽的核酸分子的異常的表達(dá)或活性為特征。在一個實(shí)施方式中，所述方法包括施用TRAIL受體結(jié)合劑(例如通過在此描述的篩選分析方法鑒定的化合物)，所述結(jié)合劑調(diào)節(jié)(例如上調(diào)或下調(diào))TRAIL受體多肽表達(dá)或活性，或組合TRAIL受體結(jié)合劑。在另一個實(shí)施方式中，所述方法包括施用TRAIL受體結(jié)合劑或編碼TRAIL受體結(jié)合劑的核酸分子，作為補(bǔ)償降低的或異常的TRAIL受體多肽表達(dá)或活性的療法。在TRAIL受體多肽被異常下調(diào)的情況中，對TRAIL受體多肽活性的刺激是期望的。差于77M/￡受體錯合效的治《刺的i^學(xué)效耒的確;t在本發(fā)明的各81種實(shí)施方式中，進(jìn)行適合的體外或體內(nèi)測定來確定基于特異性TRAIL受體結(jié)合劑的治療劑的效果，并確定受試者中受影響組織的治療是否需要使用所述治療劑。在各種實(shí)施方式中，可以使用受試者的病癥中涉及的代表性的細(xì)胞類型來進(jìn)行體外測定，以確定給定的基于TRAIL受體結(jié)合劑的治療劑是否對所述細(xì)胞類型發(fā)揮期望的效果。在人類受試者中測試之前，用于治療的化合物可以在適合的動物模型系統(tǒng)中測試，包括但不限于大鼠、小鼠、雞、牛、猴、兔，等等。類似地，對于體內(nèi)測試，在向人類受試者施用之前，可以使用本領(lǐng)域已知的任何動物模型系統(tǒng)。治#才襲和|放游#某些組合物包括多種(例如兩種或更多)本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑的組合。在某些組合物中，組合物的每一種TRAIL受體結(jié)合劑都是結(jié)合一種或多種TRAIL受體多肽的獨(dú)特的、預(yù)先選擇的表位的單克隆抗體或人類序列抗體。對于本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑，例如抗TRAIL受體抗體或抗TRAIL受體抗體—細(xì)胞毒素綴合物而言，其用于治療本文所述的TRAIL受體相關(guān)狀況和疾病的有效劑量取決于許多不同的因素而變化，包括施用的方式、目標(biāo)部位、受試者的生理狀態(tài)、受試者是人類還是動物、使用的其他藥物、以及治療是預(yù)防性還是治療性的。通常，受試者是人類，但非人哺乳動物包括轉(zhuǎn)基因哺乳動物也可以被治療。治療劑量需要被滴定以優(yōu)化安全性和效力。一般地，本發(fā)明的組合物(compositions)的足以實(shí)現(xiàn)治療或預(yù)防效果的有效量，范圍為從約0.000001mg/千克體重/天到約10,000(100)mg/千克體重/天。優(yōu)選的，劑量范圍從約0.0001mg/千克體重/天到約100mg/千克體重/天。對于施用TRAIL受體結(jié)合劑，例如抗TRAIL受體抗體，劑量范圍從約0.0001到100mg/kg宿主體重，更通常地0.01到5mg/kg宿主體重每周、每兩周或每三周。例如劑量可以是1mg/kg體重或10mg/kg體重每周、每兩周或每三周，或在1-10mg/kg每周、每兩周或每三周的范圍內(nèi)。在一個實(shí)施方式中，抗體的單個劑量的范圍是0.1-10,000微克/千克體重。在一個實(shí)施方式中，載體中的抗體濃度為每個遞送的立方厘米0.2到2000微克。示范性的治療方式需要每兩周施用一次，或每月一次，或每3到6個月一次。在某些方法中，具有不同的結(jié)合特異性的兩種或更多TRAIL受體結(jié)合劑同時地施用，在這種情況下，施用的每種抗體的劑量落入所標(biāo)明的范圍內(nèi)。TRAIL受體結(jié)合劑，例如抗TRAIL受體抗體通常在多種場合施用。單次給藥之間的間隔可以是每周、每月或每年。間隔也可以是不規(guī)則的，通過測量受試者中抗體的血液水平來指示。在某些方法中，調(diào)節(jié)劑量來實(shí)現(xiàn)血漿TRAIL受體結(jié)合劑(例如抗TRAIL受體抗體)濃度為1-1000嗎/ml,在某些方法中25-300|ig/ml。作為選4爭，TRAIL受體結(jié)合劑(例如抗TRAIL受體抗體)可以作為持續(xù)釋放配制劑施用，在這種情況下需要的施用頻率較低。劑量和頻率取決于受試者中TRAIL受體結(jié)合劑的半衰期而變化。一般地，人類抗TRAIL受體抗體顯示的半衰期最長，接著是人源化抗TRAIL受體抗體、嵌合抗TRAIL受體抗體、和非人類抗TRAIL受體抗體。施用的應(yīng)用中，用一段較長的時間以相對低頻率的間隔施用相對低的劑量。某些受試者終身持續(xù)接受治療。在治療應(yīng)用中，有時是需要相對短間隔的相對高劑量，直到疾病的發(fā)展被降低或終止，優(yōu)選地，直到受試者顯示疾病的癥狀的部分或完全改善。此后，本專利可以施用預(yù)防性的方案(thepatentcanbeadministeredaprophylacticregime)。編碼TRAIL受體免疫原的核酸的劑量范圍是從約10ng到1g、100ng到100mg、1嗎到10mg或30-300嗎DNA每位受試者。傳染性病毒載體的劑量為每劑10-100或更多個病毒顆粒不等。毒#.優(yōu)選地，在此描述的有效量(例如劑量)的TRAIL受體結(jié)合劑將提供治療益處而不產(chǎn)生對受試者的實(shí)質(zhì)上的毒性。在此描述的TRAIL受體結(jié)合劑的毒性可以在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒瀯游镏欣脴?biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序，例如通過測定LDso(對50%的群體致死的劑量)或LD咖(對100%的群體致死的劑量)來確定。毒性作用的和治療作用之間的比例是治療指數(shù)。利用這些細(xì)胞培養(yǎng)測定和動物研究獲得的數(shù)據(jù)，可制定對人類使用無毒的劑量范圍。在此描述的TRAIL受體結(jié)合劑的劑量優(yōu)選地處于一定范圍的循環(huán)濃度內(nèi)，所述濃度包括毒性很小或沒有毒性的有效劑量。取決于采用的劑型和使用的給藥途徑，劑量可以在這個范圍內(nèi)變動。可以由醫(yī)師個人根據(jù)受試者的狀況選擇確切的配方、給藥途徑和劑量。參見，例如Fingl等人，In:77^/Vzarmaco/ogica/o/7T7era/eiz/7'cs，Ch.1(1975)。試,i/盆本發(fā)明的范圍還涵蓋包含本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑組合物(compositions)(例如抗體細(xì)胞毒素綴合物、單克隆抗體、人類序列抗體、人類抗體、多特異性和雙特異性分子)和使用說明書的試劑盒。所述試劑盒對于檢測生物樣品中TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的存在是有用的。例如所述試劑盒可包含能夠結(jié)合生物樣品中TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的、經(jīng)標(biāo)記的TRAIL受體結(jié)合劑；用于測定樣品中TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的量的手段；以及用于將TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的量與標(biāo)準(zhǔn)品比較的手段。試劑盒成分(例如試劑)可以包裝在適合的容器中。所述試劑盒可以進(jìn)一步包括使用該試劑盒檢測TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的說明。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物試劑盒(compositionkit)包含本發(fā)明的抗體與疾病抑制化合物的組合，其中所述化合物是抗腫瘤藥物，例如放射性同位素、化療劑、治療性抗體或細(xì)胞因子。提供以下實(shí)施例以進(jìn)一步說明本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式。這些實(shí)施例決不應(yīng)看作是限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由附隨的權(quán)利要求確定。實(shí)施例實(shí)施例1.本發(fā)明的鼠TRAIL受體結(jié)合劑的制備和表征的一般方法具體而言，可以通過培養(yǎng)雜交瘤獲得TRAIL-R1和/或TRAIL-R2雙特異性單克隆抗體CTB003,所述雜交瘤是通過用人類TRAIL-R1和/或TRAIL-R2免疫小鼠，隨后使來自該小鼠的脾臟細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合來獲得雜交瘤。單克隆抗體的制備涉及以下步驟1.用作抗原的蛋白質(zhì)的純化；2.抗體產(chǎn)生細(xì)胞的制備在最后免疫動物之后，收集血清樣品，分析特異性抗體產(chǎn)生的滴度以確定是否已經(jīng)產(chǎn)生了抗體生產(chǎn)細(xì)胞。3.骨髓瘤細(xì)胞的制備；4.使所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合；5.選擇產(chǎn)生期望的抗體的雜交瘤；6.制備單細(xì)胞克隆(克隆)；7.培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞用于單克隆抗體的大規(guī)模制備；8.純化所述單克隆抗體9.分析單克隆抗體的生物學(xué)活性和特異性。以下參照上述步驟詳述了本發(fā)明的抗體的制備過程。用于制備本發(fā)明的抗體的這種方法意圖僅是制備方法的說明，而不是對其的限制?？梢宰裱渌阎倪^程。A.抗原的制備本發(fā)明利用了包含TRAIL-R1和TRAIL-R2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的異二聚化重組蛋白質(zhì)作為免疫原來誘導(dǎo)同時識別這兩種受體的抗體。將編碼TRAIL-R1和TRAIL-R2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的cDNA與編碼人類IgGl的Fc部分的cDNA融合。將融合的cDNA進(jìn)一步克隆到表達(dá)載體pcDNAIII(Invitrogen)中。用表達(dá)載體pcDNAIII-TRAIL-Rl-Fc和pcDNAIII-TRAIL-R2-Fc共轉(zhuǎn)染QBI-293A細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時，通過蛋白A層析來純化培養(yǎng)上清液中分泌的融合蛋白質(zhì)。作為選擇，包含SEQIDNO:15和/或SEQIDNO:16的氨基酸序列的肽，可以通過已知的方法例如Sanger方法化學(xué)合成，并用作抗原。B:單克隆抗體的制備a:小鼠的免疫將步驟(a)中制備的免疫原與佐劑，例如弗氏完全或不完全佐劑混合。其他適合的實(shí)驗動物可以包括大鼠、豚鼠、兔、犬、雞、馬、豬、牛和綿羊。免疫實(shí)驗動物的適合的給藥途徑包括皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)和肌肉內(nèi)注射，其中皮下的和腹膜內(nèi)注射是優(yōu)選的。免疫任選地可以通過單次劑量，或通過合適的間隔的幾次重復(fù)劑量來進(jìn)行。免疫的動物的抗體生產(chǎn)可以通過抗原特異性抗體的血清水平來確定。當(dāng)達(dá)到高的抗體滴度時，動物可以用作抗體生產(chǎn)細(xì)^^的制備的來源。一般地，抗體生產(chǎn)細(xì)胞可以在免疫原的最后注射之后3-5天時收集。分析血清抗體滴度的方法包括各種公知的技術(shù)，例如放射免疫測定(在下文中稱為"RIA")、固相酶免疫測定(下文中稱為"ELISA")、熒光抗體測定和^C動凝集測定，出于^r測靈敏度、速度、精確性和自動化的潛力的原因，RIA和ELISA是優(yōu)選的。通過ELISA測定抗體滴度首先，使純化或部分純化的TRAIL-Rl-Fc/TRAIL-R2-Fc吸附到固相表面，例如96孔ELISA平板的表面上。在封閉任何剩余的表面之后，使孔表面與經(jīng)過連續(xù)稀釋的小鼠血清樣品接觸。添加作為第二抗體的酶標(biāo)記的抗小鼠抗體，來結(jié)合小鼠抗體。通過測定由于底物等等的改變產(chǎn)生的顏色顯示的吸光度變化來評估抗體滴度。b:骨髓瘤細(xì)胞的制備用來自確立的小鼠細(xì)胞系的細(xì)胞充當(dāng)骨髓瘤細(xì)胞的來源，這些細(xì)胞包括P3X63Ag8U.1(P3畫U1)、P3/NSI/l-Ag4隱l(NS-1)、Sp2/0陽Ag14(SP-2)、P3X63Ag8.653和P3X63Ag8(X63)，它們可以從ATCC獲得。將選擇的細(xì)胞系連續(xù)轉(zhuǎn)移到合適的培養(yǎng)基例如8-氮烏嘌呤培養(yǎng)基中。8-氮鳥嘌呤培養(yǎng)基包括Iscove'sModifiedDulbecco's培養(yǎng)基(以下稱為"IMDM，，)或Dulbecco'sModifiedEagle培養(yǎng)基(以下稱為"DMEM，，)。RPMI-1640培養(yǎng)基補(bǔ)充有谷氨酰胺、2-巰基乙醇、慶大霉素、胎牛血清(以下稱為"FCS，，)和8-氮鳥噤呤。c:纟田月包禹蟲合獲自動物的任何適合部分的淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞是產(chǎn)生抗體的前體細(xì)胞。淋巴細(xì)胞或漿細(xì)胞來源包括脾臟、淋巴結(jié)、外周血，或其任何適合的組合，脾臟細(xì)胞是最常見的來源。在最后一次強(qiáng)化注射之后，從存在抗體生產(chǎn)細(xì)胞的淋巴組織制備單一的淋巴細(xì)胞懸浮液。融合技術(shù)包括用無血清培養(yǎng)基(例如RPMI1640)或磷酸鹽緩沖鹽水(以下稱為"PBS")洗滌脾臟和骨髓瘤細(xì)胞，使得脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的數(shù)量比例大約在5:1和10:1之間，然后離心。在棄去上清液之后，充分地疏松沉降的細(xì)胞，在攪拌下滴加含有50%(w/v)聚乙二醇(m.w.1,000到4,000)1ml的無血清培養(yǎng)基。隨后，慢慢地添加10ml的無血清培養(yǎng)基，然后離心。再次棄去上清液，將離心沉降的細(xì)胞懸浮在適量的含有次黃噤呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(以下稱為"HAT，，)的HAT培養(yǎng)基中。d:雜交瘤的選擇在融合之后，任何未融合的骨髓瘤細(xì)胞和任何骨髓瘤-骨髓瘤融合物均不能在HAT培養(yǎng)基中存活。另一方面，抗體生產(chǎn)細(xì)胞相互的融合物以及抗體生產(chǎn)細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的雜交瘤均可以存活，但前者僅具有有限的壽命。因而，在HAT培養(yǎng)基中繼續(xù)溫育，可導(dǎo)致僅期望的雜交瘤被選擇。所得的雜交瘤生長成菌落，然后轉(zhuǎn)移到缺乏氨基蝶呤的HAT培養(yǎng)基(HT培養(yǎng)基)中。此后，從培養(yǎng)上清液耳又出等分來測定抗體滴度，例如通過ELISA。e:雜交瘤的克隆然后，通過利用步驟b中描述的類似的方法測定抗體滴度，將已經(jīng)顯示產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤轉(zhuǎn)移到另一個平板用于克隆。適合的克隆方法包括有限稀釋方法，其中雜交瘤被稀釋到平板的每個孔含有一個細(xì)胞，然后加以培養(yǎng)；軟瓊脂方法，其中在軟瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)之后回收集落；利用微型機(jī)械手來分離單個細(xì)胞用于培養(yǎng)的方法；和"分選-克隆，，，其中通過細(xì)胞分選儀分離單個細(xì)胞。例如，對展現(xiàn)抗體滴度的每個孔，重復(fù)2-4次根據(jù)限制稀釋方法的克隆操作，選擇具有穩(wěn)定的抗體滴度的克隆作為抗體生產(chǎn)雜交瘤。作為本發(fā)明的抗體的基礎(chǔ)的小鼠-小鼠雜交瘤CTB003于2006年3月28曰在CGMCC保藏，登錄號CGMCC1665。f:單克隆抗體的制備和純化通過細(xì)胞培養(yǎng)的單克隆抗體的制備在獲得穩(wěn)定的抗體生產(chǎn)雜交瘤之后，可以對所選的雜交瘤培養(yǎng)物擴(kuò)大培養(yǎng)。然后收獲來自大規(guī)模培養(yǎng)的上清液，通過適合的方法純化，例如親和層析和凝膠過濾。雜交瘤還可以在同基因的小鼠(例如BALB/c小鼠或nu/nu小鼠)的腹膜內(nèi)生長，來獲得大量地含有抗TRAIL-R1和TRAIL-R2單克隆抗體的腹水。g:單克隆抗體的表征單克隆抗體的同種型和亞類可以通過ELISA來測定?？贵w濃度的測定可以通過Folin-Lowry方法進(jìn)行，或根據(jù)280nm的吸光度/1.4(OD280)=免疫球蛋白lmg/ml)來計算。.C:單克隆抗體的特異性的分析為了獲得結(jié)合TRAIL-R1和TRAIL-R2而不結(jié)合其他TRAIL受體例如TRAIL-R3和TRAIL-R4的單克隆抗體，用以下重組蛋白質(zhì)包被ELISA平板1.TRAIL-R1和TRAIL-R2異二聚體抗原，2.TRAIL-Rl-Fc融合抗原，3)TRAIL-R2-Fc融合抗原，4.TRAIL-R3-Fc融合抗原，5.TRAIL-R4-Fc融合抗原，和BSA作為陰性對照。在與各種濃度的純化抗體溫育之后，添加HRP綴合的山羊抗小鼠IgG。在TMB底物反應(yīng)之后，在ELISA酶標(biāo)儀中記錄光密度。利用光密度值評估抗體與相應(yīng)的抗原的結(jié)合。CTB003展現(xiàn)了對TRAIL-R1/TRAIL-R2異二聚體抗原以及TRAIL-Rl-Fc或TRAIL-R2-Fc融合抗原的劑量依賴性結(jié)合，但是不結(jié)合TRAIL-R3-Fc、TRAIL-R4-Fc融合抗原和BSA,表明CTB003是識別TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的抗體。87D.單克隆抗體的功能的分析a:體外的人類惡性腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)將一組人類癌細(xì)胞系與各種濃度的抗體溫育過夜，利用抗體處理之后的細(xì)胞活力來確定殺傷活性。b:體內(nèi)的CTB003殺腫瘤活性在人類腫瘤細(xì)胞異種移植模型中評估CTB003的殺腫瘤活性。用人類癌細(xì)胞皮下接種棵鼠。在可見的腫瘤生長之后，對帶有腫瘤的小鼠腹膜內(nèi)注射CTB003。用處理之后腫瘤大小的降低程度評估體內(nèi)殺肺瘤活性。E.抗體序列的分析從雜交瘤細(xì)胞分離總RNA用作模板。利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。利用一組15個VH5'引物和一個CH3'引物進(jìn)行PCR來獲得編碼免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)的cDNA。利用一組8個VK5，引物和一個CK3，引物進(jìn)行PCR來獲得編碼免疫球蛋白輕鏈的可變區(qū)的cDNA。將PCR產(chǎn)物進(jìn)一步克隆到TA克隆載體(Invitrogen)中。挑取五個獨(dú)立的克隆并測序。通過CDR1、CDR2和CDR3序列的高變異性和它們在重鏈中的位置來確定CDR1、CDR2和CDR3序列。F.抗體識別表位的的鑒定一系列抗原的制備抗原組包含抗體識別的全部或部分抗原表位。這些抗原可以通過多肽的化學(xué)合成或通過重組DNA技術(shù)來獲得。在確定了含有表位的區(qū)域之后，通過進(jìn)一步縮短含有表位的多肽來實(shí)現(xiàn)精確的作圖。此外，可以通過使用含有表位的多肽的竟?fàn)幮砸种茰y定來確認(rèn)表位。實(shí)施例2.TRAIL-R1和TRAIL-R2抗原的異二聚形式的制備1.TRAIL-R1和TRAIL-R2cDNA的克隆通過以下RT-PCR方法克隆編碼人類TRAIL-R1和TRAIL-R2蛋白質(zhì)的DNA，該方法使用a)模板利用TRIzol試劑(GibcoBRL)提取HeLa細(xì)胞的總RNA。利用第一鏈cDNA合成試劑盒(AmershamPharmaciaBiotech),根據(jù)試劑盒提供的使用手冊來獲得PCR反應(yīng)的模板。b)PCR引物合成以下寡核苷酸引物用于PCR:885'-gacgatgcccgatctactttaaggg扁3'(DR5pl:SEQIDNO.:49);5'-ccactgggtgatgttggatggg誦3'(DR5p2:SEQIDNO.:50);5'-gacgatgcccgatctactttaaggg畫3'(DR4pl:SEQIDNO.:51);5'-gacgatgcccgatctactttaaggg畫3'(DR4p2:SEQIDNO.:52);c)PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)溶液的組成模板cDNA,總共33pi的反應(yīng)物中的5引物DR5pl，10pmol;引物DR5p2，10pmol;lOx.濃縮的PCR緩沖液(試劑盒提供的)，lOpl;dNTPs(各2.5mM),4以及Taq聚合酶(Promega),5單位。添加無菌蒸餾水到溶液中達(dá)到100^的總體積。如下進(jìn)行PCR反應(yīng)。首先將溶液在94。C加熱2分鐘，之后將加熱到94°C30秒、52°C1分鐘和72。C3分鐘的循環(huán)重復(fù)40次。在這個過程完成之后，將反應(yīng)溶液在72。C加熱10分鐘。由此獲得的擴(kuò)增的DNA片段在含有0.25嗎/ml溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠上予以分離。確定條帶含有期望的DNA片,殳，利用GeneClean試劑盒(BIO101)回收。d)PCR產(chǎn)物的TA克隆'DNA片段使用TA克隆試劑盒(Invitrogen，CA)克隆。如下進(jìn)行將從PCR反應(yīng)溶液回收的DNA片段，與TA克隆試劑盒提供的50ngpCR2.1載體一起，與1(il的10x連接酶反應(yīng)緩沖液(6mMTris-HCl(pH7.5)、6mM氯化鎂、5mM氯化鈉、7mM.(3-巰基乙醇、O.lmMATP、2mMDTT、1mM亞精胺、和0.1mg/ml牛血清白蛋白)混合，該緩沖液中已經(jīng)添加了4單位的T4DNA連接酶(1pl)?；旌衔锏目傮w積用無菌去離子水調(diào)整到10|_il,所得的連接酶溶液在14。C溫育15小時。在這段時間以后，將2pl的連接酶反應(yīng)溶液添加到50pi的感受態(tài)大腸桿菌菌林TOP10F中，該菌林由TA克隆試劑盒提供，并根據(jù)使用手冊制備為感受態(tài)，產(chǎn)生的混合物在冰上保持30分鐘，然后在42。C30秒，再次在冰上5分鐘。然后，將含有2%v/v胰蛋白胨、0.5%(w/v)酵母提取物、0.05%w/v氯化鈉、2.5mM氯化鉀、1mM氯化鎂和20mM葡萄糖的500pl培養(yǎng)基(以下稱為"SOC"培養(yǎng)基)添加到培養(yǎng)物中，將混合物在37。C搖動培養(yǎng)1小時。在這之后，將培養(yǎng)物涂布在含有100嗎/ml的L-肉湯瓊脂平板(1%v/v胰蛋白胨、0.5%w/v酵母提取物、0.5%w/v氯化鈉、0.1%w/v葡萄糖和0.6%w/v細(xì)菌瓊脂(Difco))上。選擇平板上出現(xiàn)的氨千青霉素抗性菌落，用鉑接種環(huán)刮下，在含有100嗎/ml氨千青霉素的L-肉湯培養(yǎng)基中200rpm振蕩下37。C培養(yǎng)過夜。溫育之后，通過離心收獲細(xì)胞，用堿法從中制備質(zhì)粒DNA。將編碼TRAIL-R1或TRAIL-R2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的cDNA進(jìn)一步克隆到含有編碼人類IgGl的Fc部分的cDNA的pcDNA3表達(dá)載體(Invitrogen,CA)中。從而，獲得了編碼TRAIL-Rl-Fc或TRAIL-R2-Fc融合蛋白的融合cDNA。2.TRAIL-Rl-Fc和TRAIL-R2-Fc融合蛋白的表達(dá)和純化用pcDNAIII-TRAIL-Rl-Fc和pcDNAIII-TRAIL-R2-Fc共轉(zhuǎn)染QBI-293A細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染48小時之后收獲培養(yǎng)基。將收集自上述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的總共500ml上清液用于蛋白A-SepharoseCL-4B親和層析(Pharmacia)。流速是2ml/分鐘。在培養(yǎng)物上清液通過之后，用50mlPBS洗滌柱子。用洗脫緩沖液(O.IM甘氨酸(PH2.4)、0.15MNaCl)來洗脫蛋白質(zhì)。在OD280nm測量每個洗脫級分(1ml)的光密度。收集OD280〉0.1的級分。在添加100^的中和緩沖液(1MTris-HCLpH8.5)之后，將洗脫物單獨(dú)地置于透析管中，洗脫物在4。C相對于l升的PBS(pH7.5)透析。透析緩沖液更換兩次。將純化的蛋白質(zhì)濃縮到lmg/ml，在-80。C保存。蛋白質(zhì)的純度通過SDS-PAGE測定大于95°/。。在非還原條件下，純化的蛋白質(zhì)的分子量是90kD,而在還原條件下，分子量是45kD。3.重組TRAIL-Rl-Fc和TRAIL-R2融合蛋白的表征ELISA平板用PBS中的2昭/ml山羊抗人IgG在4。C過夜來包被。在用PBS洗滌三次之后，平板用3。/。BSAPBS在室溫下封閉1小時。添加10嗎/ml純化的融合蛋白，在37。C溫育1小時。在用PBS洗滌三次之后，添加2jig/ml單克隆抗丁RAIL-R1和抗TRAIL-R2抗體在37。C再過一個小時。通過用PBS洗滌三次來除去未結(jié)合的抗體，然后在37。C添加HRP-綴合的山羊抗小鼠IgG30分鐘。在用PBS洗滌三次之后，添加TMB底物緩沖液10分鐘，然后通過添加2NH2S04停止反應(yīng)。在ELISA酶標(biāo)儀中使用450nm/650nm的雙波長記錄光密度的值。結(jié)果總結(jié)在表6中?？筎RAIL-R1和抗TRAIL-R2單克隆抗體與純化的90融合蛋白反應(yīng)，但不與人類IgG反應(yīng)。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>異二聚的TRAIL-R1和TRAIL-R2融合物的表征將ELISA平板用1嗎/ml的抗TRAIL-R1(CTB007)或抗TRAIL-R2(CTB006)在4°C包被過夜。用PBS洗滌三次之后，用3。/。BSAPBS封閉平板。然后在37。C添加100ng/ml的純化的二聚TRAIL-R1/TRAIL-R2融合蛋白1小時。用PBS洗滌三次之后，添加100ng/ml的HRP綴合的抗TRAIL-R1和抗TRAIL-R2抗體另一小時。用PBS洗滌三次之后，添加TMB底物緩沖液IO分鐘，然后通過添加2NHzS04停止反應(yīng)。在ELISA酶標(biāo)儀中使用450nm/650nm的雙波長記錄光密度的值。表7中的結(jié)果顯示，當(dāng)包被抗體是抗TRAIL-R1時，HRP綴合的抗TRAIL-R2與融合蛋白反應(yīng)。類似地，當(dāng)包被抗體是抗TRAIL-R2時，HRP綴合的抗TRAIL-R1與融合蛋白也反應(yīng)。相比之下，與抗體對TRAIL-R1/TRAIL-R1或TRAIL-R2/TRAIL-R2的反應(yīng)表現(xiàn)為弱反應(yīng)。這些結(jié)果表明大部分純化的蛋白質(zhì)是處于TRAIL-R1/TRAIL-R2的異二聚形式。<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>實(shí)施例3.針對人類TRAIL-R1和TRAIL-R2的單克隆抗體的產(chǎn)生1.免疫6-8周齡的雌性Balb/c小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,Me.)用親和純化的人類TRAIL-R1和TRAIL-R2-Fc融合蛋白免疫。對于初次爪墊免疫，將融合蛋白(50呢)在弗氏完全佐劑(Difco,Detroit,Mich.)中乳化。然后不含佐劑的50jig融合蛋白注射四次來強(qiáng)化免疫小鼠，注射每兩天進(jìn)行一次。在最后一次注射之后三天，收集來自局部淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞。2.細(xì)胞融合從淋巴結(jié)制備單細(xì)胞懸浮液，以2:1的比例與NS1骨髓瘤細(xì)胞混合。產(chǎn)生的混合物用PRMI-1640洗滌三次。然后將一毫升37。C預(yù)熱的50%(w/v)聚乙二醇1500(BoehringerManheim)緩慢地添加到試管中，使用移液管的尖端一直攪動沉淀。隨后，慢慢地添加預(yù)熱到37。C的50ml無血清RPMI培養(yǎng)基。然后將產(chǎn)生的混合物離心，棄去上清液，添加含有12%(v/v)FCS的50mlHAT培養(yǎng)基，同時用移液管的尖端輕輕地攪動。懸浮液以100pi/孔分配到96孔細(xì)胞微量培養(yǎng)板上，在5%(v/v)C02的氣氛中37。C溫育7-10天。3.單克隆抗體的篩選將ELISA平板用1嗎/ml的異二聚TRAIL-R1和TRAIL-R2-Fc融合蛋白在4。C包被過夜。用PBS洗滌三次之后，用3。/。BSAPBS在室溫下封閉平板l小時。然后添加100)il雜交瘤培養(yǎng)上清液，在37。C經(jīng)過1小時。用PBS洗滌三次之后，添加HRP綴合的抗小鼠IgG抗體，經(jīng)過30分鐘。用PBS洗滌三次之后，添加TMB底物緩沖液，經(jīng)過10分鐘，然后通過添加2NH2S04終止反應(yīng)。在ELISA酶標(biāo)儀中使用450nm/650nm的雙波長記錄光密度值。對所有陽性克隆進(jìn)行二次確認(rèn)篩選來排除TRAIL-R1或TRAIL-R2單特異性克隆以及與人類IgGl反應(yīng)的假陽性克隆。將ELISA平板分別用1嗎/ml的異二聚TRAIL-R1和TRAIL-R2-Fc融合蛋白、TRAIL-Rl-Fc、TRAIL-R2-Fc或人類IgGl在4°C包被過夜。用PBS洗涂三次之后，用3%BSAPBS在室溫下封閉平板1小時。然后添加100^雜交瘤培養(yǎng)上清液，37。C經(jīng)過1小時。用PBS洗滌三次之后，然后添加HRP偶聯(lián)的抗小鼠IgG抗體，經(jīng)過30分鐘。用PBS洗滌三次之后，添加TMB底物緩沖液，經(jīng)過10分鐘，然后通過添加2NH2S04終止反應(yīng)。在ELISA酶標(biāo)儀中使用450nm/650nm的雙波長記錄光密度值。在所有的250個陽性克隆中，大約40%與TRAIL-Rl-Fc反應(yīng)，25%與TRAIL-R2-Fc反應(yīng)，其余的與人類IgGl反應(yīng)。僅僅一個稱為CTB003的克隆與異二聚的TRAIL-R1和TRAIL-R2-Fc融合蛋白、TRAIL-Rl-Fc、TRAIL-R2-Fc反應(yīng)，而不與人類IgGl反應(yīng)。因此，選擇CTB003作為針對TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的雙特異性克隆。4.通過有限稀釋克隆最初的CTB003雜交瘤細(xì)胞用含有12%FCS的RPMI-1640稀釋到每ml0.3個細(xì)胞，在存在105個Balb/c小鼠的胸腺細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下在兩個96孔平板中培養(yǎng)。7-10天后，收集100pl的培養(yǎng)上清液，如上所述通過ELISA測定抗體產(chǎn)生。通過有限稀釋來將陽性克隆亞克隆三次?？寺〉腃TB003保持了與TRAIL-R和TRAIL-R2的反應(yīng)性，而不與人類IgGl反應(yīng)，因而確認(rèn)了它的雙特異性反應(yīng)性。CTB003雜交瘤克隆已經(jīng)保藏到GCMCC，登錄號GCMCC1665。通過小鼠免疫球蛋白同種型測試試劑盒，CTB003的同種型被確定為鼠的IgGlkappa。5.CTB003單克隆抗體的純化從培養(yǎng)上清液純化CTB003:將培養(yǎng)上清液加到蛋白G-SepharoseCL-4B親和層析(Pharmacia)。流速是2ml每分鐘。在培養(yǎng)物上清液通過之后，用50mlPBS洗滌柱子。用洗脫緩沖液(0.1M甘氨酸(pH2.4)、0.15MNaCl)來洗脫蛋白質(zhì)。在OD280nm測量每個洗脫級分(1ml)的光密度。收集OD280>0.1的級分。在添加100pl的中和緩沖液(1MHis-HCLpH8.5)之后，洗脫物單獨(dú)地置于透析管中，洗脫物在4。C相對于l升的PBS(pH7.5)透析。透析緩沖液更換兩次。純化的蛋白質(zhì)濃縮到1mg/ml，滅菌并在-4。C保存待用。實(shí)施例4.CTB003對TRAIL受體的結(jié)合特異性由于針對TRAIL和針對TNFR家族的其他蛋白質(zhì)的所有受體有顯著的同源性，通過ELISA來測定示例性抗體CTB003對TRAIL-R1和TRAIL-2的特異性，其中使用一組以上描述的可溶形式的TRAIL受體作為抗原。ELISA平板用含1|ig/ml的下列重組蛋白質(zhì)的PBS在4°C包^皮過夜1.TRAIL-R1和TRAIL-R2異二聚抗原，2.TRAIL-Rl-Fc融合抗原，3.TRAIL-R2-Fc融合抗原，4.TRAIL-R3-Fc融合抗原，5.TRAIL-R4-Fc融合抗原，或BSA作為陰性對照。在用PBS洗滌三次之后，平板用3%BSAPBS在室溫下封閉1小時。平板用各種濃度的純化的CTB003在37。C溫育一小時。用PBS洗滌三次，然后添加HRP綴合的抗小鼠IgG抗體，經(jīng)過30分鐘。用PBS洗滌三次之后，添加TMB底物緩沖液，經(jīng)過10分鐘，然后通過添加2NH2S04終止反應(yīng)。在ELISA酶標(biāo)儀中使用450nm/650nm的雙波長記錄光密度的值。CTB003展現(xiàn)了與TRAIL-R1/TRAIL-R2異二聚體抗原以及TRAIL-Rl-Fc或TRAIL-R2-Fc融合抗原的劑量依賴性結(jié)合。在測試的抗體濃度的范圍內(nèi)，CTB003不與TRAIL-R3-Fc、TRAIL-R4-Fc融合抗原和BSA反應(yīng)(圖2)。實(shí)施例5.CTB003的體外凋亡i秀導(dǎo)活性1.人類癌細(xì)胞系使用一組人類癌細(xì)胞系評估CTB003的體外凋亡誘導(dǎo)活性，包括三種人類乳腺癌細(xì)胞系(圖3,圖面A);三種人類結(jié)腸癌細(xì)胞系(圖3，圖面B);三種人類胰腺癌細(xì)胞系(圖3，圖面C);三種人類卵巢癌細(xì)胞系(圖3,圖面D);三種人類前列腺癌細(xì)胞系(圖3，圖面E);三種人類肺癌細(xì)胞系(圖3,圖面F)。通過流式細(xì)胞計測試，所有的細(xì)胞系都是TRAIL-R1和TRAIL-R2細(xì)胞表面表達(dá)陽性的。(所有的細(xì)胞購自ATCC)。2.ATPLite分析來測定細(xì)胞活力在96孔平板中將每孔1,000個目標(biāo)細(xì)胞在存在七種濃度的10倍稀釋CTB003的條件下培養(yǎng)，其中CTB003最高濃度是1000ng/ml，最低濃度0.01ng/ml。在37。C培養(yǎng)過夜之后，根據(jù)廠家的說明書(PackardInstruments,Meriden,Conn.)使用ATPLite試劑盒測定細(xì)胞活力添加50pl的細(xì)胞裂解緩沖液，然后添加50pl的底物緩沖液。將反應(yīng)物在發(fā)光讀數(shù)器中計數(shù)。細(xì)胞活力計算為(處理細(xì)胞的cmp/對照細(xì)胞的cmp)xl00%。3.CTB003對腫瘤細(xì)胞的劑量依賴性殺傷這些結(jié)果表明，CTB003對大多數(shù)測試的人類肺瘤細(xì)胞展現(xiàn)了可變的殺傷活性。在三種測試的人類乳腺癌細(xì)胞系中，兩種細(xì)胞系的活力在處理之后被降低到低于10°/。(圖3，圖面A)。所有三種結(jié)腸細(xì)胞系的活力低于10%(圖3，圖面B)。雖然所有人類胰腺癌細(xì)胞系對于CTB003是敏感的，三種人類胰腺癌細(xì)胞系中的兩種對于CTB003是更加敏感的。在用1000ng/ml的CTB003處理之后，存在的活細(xì)胞低于5%(圖3，圖面C)。雖然所有的人類卵巢癌細(xì)胞對于CTB003是敏感的，三種人類卵巢癌細(xì)胞中的兩種是更加敏感的(圖3，圖面D)。所有三種人類前列腺癌系對CTB003是敏感的(圖3,圖面E)。三種人類肺癌系中的兩種對于CTB003處理是敏感的，而另外一種細(xì)胞系似乎對CTB003有抗性。結(jié)果表明，CTB003在測試的大多數(shù)類型的人類癌細(xì)胞中具有殺傷活性。4.CTB003對腫瘤細(xì)胞的時間依賴性殺傷將人類結(jié)腸癌細(xì)胞(Colo205)或人類乳腺癌細(xì)胞(MDA231)以每孔1000個細(xì)胞在存在1000ng/mlCTB003的情況下在96孔平板中培養(yǎng)標(biāo)明的時間點(diǎn)。在每個時間點(diǎn)結(jié)束時通過ATPLite分析測定細(xì)胞活力。用1000ng/mlCTB003處理細(xì)胞之后，在4、8、12和24小時的時點(diǎn)測定處理的Cok)205和MDA231的細(xì)胞活力。結(jié)果表明CTB003的殺傷活性是時間依賴性的。兩種細(xì)胞系的活細(xì)胞在處理后4h降低到低于50%,處理后24小時低于5%(圖4)。實(shí)施例6.CTB003與化療藥物的協(xié)同殺傷1.人類癌細(xì)胞系''為了確定CTB003與化療劑的協(xié)同殺傷活性，挑選了一組與其他癌細(xì)胞系相比對CTB003介導(dǎo)的殺傷的敏感性較低的人類癌細(xì)胞系。選擇用于研究的細(xì)胞系包括人類乳腺癌細(xì)胞(BT474)、人類結(jié)腸癌細(xì)胞(SW620)、人類肺癌細(xì)胞(A437)、人類結(jié)腸癌細(xì)胞(SW1116)和人類胰腺癌細(xì)胞(Pane1)。所有的細(xì)胞購自ATCC。2.化療藥物測試的化療藥物包括阿霉素、紫杉醇(Taxol)、順鉑和CTP-11和吉西他濱。3.ATPLite分析來測定細(xì)胞活力在96孔平板中，將每孔l，OOO個目標(biāo)細(xì)胞在存在四種濃度的10倍稀釋CTB003的情況下與三種不同濃度的化療藥物培養(yǎng)，CTB003的最高濃度是1000ng/ml，最低濃度10ng/ml。在37。C培養(yǎng)過夜之后，根據(jù)廠家的說明書(PackardInstruments,Meriden，Conn.M吏用ATPLitei式劑盒測定細(xì)月包活力添加50pl的細(xì)胞裂解緩沖液，然后添加50^的底物緩沖液。將反應(yīng)物在發(fā)光讀數(shù)器中計數(shù)。細(xì)胞活力計算為(處理細(xì)胞的cmp/對照細(xì)胞的cmp)xl00%。4.CTB003和阿霉素對人類乳腺癌細(xì)胞(BT474)的協(xié)同殺傷在不存在阿霉素的情況下，CTB003展現(xiàn)對BT474細(xì)胞的弱的殺傷活性。使用單獨(dú)的1000ng/mlCTB003，細(xì)胞活力僅降低20%。然而，阿霉素以劑量依賴性方式協(xié)同地增強(qiáng)CTB003殺傷。在存在O.l^M阿霉素的情況下，細(xì)胞活力降低到低于25%，而用更高濃度的阿霉素(0.5和l.OpM),細(xì)胞活力在相同濃度的CTB003下低于5%(圖5，圖面A)。圖5、圖面B中呈現(xiàn)了CTB003與阿霉素的協(xié)同效應(yīng)。以從培養(yǎng)基對照孔獲得的ATPLite計數(shù)作為100%細(xì)胞活力，如下計算處理孔中細(xì)胞活力的百分比處理孔的計數(shù)除以對照孔的計數(shù)，然后乘以100%。結(jié)果表示為三個復(fù)孔的平均值。5.CTB003和紫杉醇(Taxol)對人類結(jié)腸癌細(xì)胞(SW620)的協(xié)同殺傷在不存在紫杉醇的情況下，CTB003展現(xiàn)了對SW620細(xì)胞的弱的殺傷活性。使用單獨(dú)的1000ng/mlCTB003，細(xì)胞活力僅降低20%。然而，紫杉醇以劑量依賴性方式協(xié)同地增強(qiáng)CTB003殺傷。在存在0.2紫杉醇的情況下，細(xì)胞活力降低到低于25%，而用更高濃度的阿霉素(1.0[xM)，細(xì)胞活力在相同濃度的CTB003下低于5%(圖6,圖面A)。CTB003與紫杉醇的協(xié)同效應(yīng)在圖6、圖面B中呈現(xiàn)。利用從培養(yǎng)基對照孔獲得的ATPLite計數(shù)作為100%細(xì)胞活力，如下計算處理孔中細(xì)胞活力的百分比處理孔的計數(shù)除以對照孔的計數(shù)，然后乘以100%。結(jié)果表示為三個復(fù)孔的平均值。6.CTB003和順鉑對人類肺癌細(xì)胞(A437)的協(xié)同殺傷在不存在順鉑的情況下，CTB003對A437細(xì)胞不具有殺傷活性。相比之下，順鉑以劑量依賴性方式協(xié)同地增強(qiáng)CTB003殺傷。在存在50jLiM順鉑的情況下，細(xì)胞活力降至低于20%(圖7,圖面A)。CTB003與順鉑的協(xié)同效應(yīng)在圖7、圖面B中呈現(xiàn)。以從培養(yǎng)基對照孔獲得的ATPLite計數(shù)作為100%細(xì)胞活力，如下計算處理孔中細(xì)胞活力的百分比處理孔的計數(shù)除以對照孔的計數(shù)，然后乘以100%。結(jié)果表示為三個復(fù)孔的平均值。7.CTB003和CTP-11對人類結(jié)腸癌細(xì)胞(SW1116)的協(xié)同殺傷在不存在CTP-ll的情況下，CTB003展現(xiàn)對SW1116細(xì)胞的弱的殺傷活性。使用單獨(dú)的1000ng/mlCTB003，細(xì)胞活力僅降低10%。然而，CTP-ll96以劑量依賴性方式協(xié)同地增強(qiáng)CTB003殺傷。在存在5|iMCTP-ll的情況下，細(xì)胞活力降低到50%,而用更高濃度的CTP-ll(20pM),細(xì)胞活力在相同濃度的CTB003下低于25%(圖8,圖面A)。CTB003與CTP-ll的協(xié)同效應(yīng)在圖8、圖面B中呈現(xiàn)。以從培養(yǎng)基對照反應(yīng)孔獲得的ATPLite計數(shù)作為100%細(xì)胞活力，如下計算處理孔中細(xì)胞活力的百分比處理孔的計數(shù)除以對照孔的計數(shù)，然后乘以100%。結(jié)果表示為三個復(fù)孔的平均值。8.CTB003和吉西他濱對人類胰腺癌細(xì)胞(Panc-1)的協(xié)同殺傷在不存在吉西他濱的情況下，CTB003不能殺傷Panc-l細(xì)^>。然而，吉西他濱以劑量依賴性方式協(xié)同地增強(qiáng)CTB003殺傷。在存在1吉西他濱的情況下，細(xì)胞活力降低25%，而用更高濃度的吉西他濱(10pM),細(xì)胞活力在相同濃度的CTB003下低于25%(圖9，圖面A)。CTB003與吉西他濱的協(xié)同效應(yīng)在圖9、圖面B中呈現(xiàn)。以從培養(yǎng)基對照孔獲得的ATPLite計數(shù)作為100%細(xì)胞活力，如下計算處理孔中細(xì)胞活力的百分比處理孔的計數(shù)除以對照孔的計數(shù)，然后乘以100%。結(jié)果表示為三個復(fù)孔的平均值。實(shí)施例7.CTB003與抗TRAIL-R1或抗TRAIL-R2單特異性單克隆抗體的協(xié)同殺傷活性1.人類癌細(xì)胞系為了測定CTB003與抗TRAIL-R1或抗TRAIL-R2單特異性抗體的協(xié)同殺傷活性，選擇人類結(jié)腸癌細(xì)胞系(SW1116)。單獨(dú)的CTB003或抗TRAIL-R1或抗TRAIL-R2不誘導(dǎo)SW1116細(xì)胞中的細(xì)胞殺傷。2.單特異性抗TRAIL-R1或抗TRAIL-R2抗體CTB007是針對TRAIL-R1的單克隆抗體，其誘導(dǎo)表達(dá)TRAIL-R1的腫瘤細(xì)胞的凋亡。CTB006是針對TRAIL-R2的單克隆抗體，其誘導(dǎo)表達(dá)TRAIL-R2的腫瘤細(xì)胞的凋亡。3.ATPLite分析來測定細(xì)胞活力在96孔平板中，將每孔1,000個目標(biāo)細(xì)胞在存在四種濃度的10倍稀釋CTB003的情況下與三種不同濃度的抗TRAIL-R1或抗TRAIL-R2抗體培養(yǎng)，CTB003的最高濃度是1000ng/ml，最低濃度10ng/ml。在37。C培養(yǎng)16h之后，根據(jù)廠家的說明書(PackardInstruments,Meriden,Conn.H吏用ATPLite試劑盒測定細(xì)胞活力添加50jil的細(xì)胞裂解緩沖液，然后添加50^的底物緩沖液。將反應(yīng)物在發(fā)光讀數(shù)器中計數(shù)。細(xì)胞活力計算為(處理細(xì)胞的cmp/對照細(xì)胞的cmp)x100%。4.CTB003和CTB007對人類結(jié)腸癌細(xì)胞(SW1116)的協(xié)同殺傷在不存在CTB007的情況下，CTB003展現(xiàn)對SW1116細(xì)胞的弱的殺傷活性。使用單獨(dú)的1000ng/mlCTB003,細(xì)胞活力僅降低10%。然而，CTB007以劑量依賴性方式協(xié)同地增強(qiáng)了CTB003殺傷。在存在10ng/mlCTB007的情況下，細(xì)胞活力降低到50%，而用更高濃度的CTB007(100ng/ml)，細(xì)胞活力在相同濃度的CTB003下低于25%(圖10,圖面A)。CTB003與CTB007的協(xié)同效應(yīng)在圖10、圖面B中呈現(xiàn)。以從培養(yǎng)基對照孔獲得的ATPLite計^t作為100%細(xì)胞活力，如下計算處理孔中細(xì)胞活力的百分比處理孔的計數(shù)除以對照孔的計數(shù)，然后乘以100%。結(jié)果表示為三個復(fù)孔的平均值。5.CTB003和CTB006對人類結(jié)腸癌細(xì)胞(SW1116)的協(xié)同殺傷在不存在CTB007的情況下，CTB003展現(xiàn)對SW1116細(xì)胞的弱的殺傷活性。使用單獨(dú)的1000ng/mlCTB003,細(xì)胞活力僅降低10%。然而，CTB006以劑量依賴性方式協(xié)同地增強(qiáng)了CTB003殺傷。在存在10ng/mlCTB006的情況下，細(xì)胞活力降低到50%，而用更高濃度的CTB006(100ng/ml)，細(xì)胞活力在相同濃度的CTB003下低于25%(圖11，圖面A)。CTB003與CTB006的協(xié)同效應(yīng)在圖11、圖面B中呈現(xiàn)。以從培養(yǎng)基對照孔獲得的ATPLite計數(shù)作為100%細(xì)胞活力，如下計算處理孔中細(xì)胞活力的百分比處理的反應(yīng)孔的計數(shù)除以對照孔的計數(shù)，然后乘以100%。結(jié)果表示為三個復(fù)孔的平均值。實(shí)施例8.體內(nèi)的CTB003殺腫瘤活性1.人類癌細(xì)胞系用于產(chǎn)生人類癌癥的鼠異種移植模型的人類癌細(xì)胞系是a)MDA231人類乳腺癌細(xì)胞系；b)7402人類肝癌細(xì)胞系；c)Colo205人類結(jié)腸癌細(xì)胞系；和d)MIAcapa人類胰腺癌細(xì)胞系。所有細(xì)胞購自ATCC,在補(bǔ)充有10%FCS的DMEM中培養(yǎng)。2.異種移植模型用&107個人類癌細(xì)胞皮下接種六(6)至8周齡的Balb/c棵鼠。在腫瘤接種后7-14天(因接種的腫瘤細(xì)胞系而不同)，超過90%的小鼠長出了活肺瘤塊。將荷瘤小鼠隨機(jī)地分成兩個組一個是未處理的對照組，另一個是CTB003處理的組。人類癌癥腫瘤生長通過腫瘤的大小來評估。在接種之后，每周地測量腫瘤大小。3.用CTB003處理異種移植小鼠對荷瘤小鼠以三天的間隔每周兩次腹膜內(nèi)注射200嗎的CTB003。治療在三周內(nèi)重復(fù)六次。4.人類乳腺癌異種移植模型中CTB003的體內(nèi)抗腫瘤活性在未處理的組中，胂瘤倍增時間(tumordoublingtime)是約7天。在用CTB003處理之后，腫瘤大小快速地降低。在兩個劑量的處理之后，在處理組中七只小鼠中的三只發(fā)生了完全的腫瘤消退。在另外三只和一只小鼠中分別觀察到腫瘤大小的超過70%和50%的降低。在四個劑量的處理之后，所有七只小鼠中發(fā)生了完全的腫瘤'消退。相比之下，在未處理的對照組的所有小鼠中腫瘤大小繼續(xù)增長。這些結(jié)果表明，CTB003具有強(qiáng)的抗腫瘤效力(圖12)。在另一個實(shí)驗中，評估MDA231異種移植模型中CTB003的抗腫瘤效力直到癌細(xì)胞接種后的49天，未處理組中100%(8/8)的小鼠顯示了腫瘤大小的繼續(xù)增長，而CTB003處理的小鼠的大多數(shù)(7/8)顯示了腫瘤的完全消退(圖13)。因而，在人類癌癥(例如人類乳腺癌)的體內(nèi)模型中，當(dāng)給受試者施用本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑時，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑顯示了治療效益(例如腫瘤生長的抑制)。因而，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑及其同源物和功能等同物(例如hCTB003)，當(dāng)以有效量施用于有需要的受試者時，在預(yù)防或治療人類癌癥(例如人類乳腺癌)的方法中是有用的。5.人類肝癌異種移植模型中CTB003的體內(nèi)抗腫瘤活性在7402人類肝癌異種移植模型中，CTB003展現(xiàn)了顯著的抑制活性。在未處理組中腫瘤倍增時間是約10天，相比之下，CTB003處理組中是35天(圖14)。因而，在人類癌癥(例如人類肝癌)的體內(nèi)模型中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑當(dāng)施用于受試者時顯示了治療效益(例如腫瘤生長的抑制)。因而，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑及其同源物和功能等同物(例如hCTB003),當(dāng)以有效量施用于有需要的受試者時，在預(yù)防或治療人類癌癥(例如人類肝癌)的方法中是有用的。6.人類結(jié)腸癌異種移植模型中CTB003的體內(nèi)抗胂瘤活性在Colo205人類結(jié)腸癌異種移植模型中，與未處理組中100%的肺瘤進(jìn)展相比，CTB003實(shí)現(xiàn)了100%的完全腫瘤消退(圖15)。因而，在人類癌癥(例如人類結(jié)腸癌(例如結(jié)腸直腸癌))的體內(nèi)模型中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑當(dāng)施用于受試者時顯示了治療效益(例如肺瘤生長的抑制)。因而，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑，以及其同源物和功能等同物(例如hCTB003)，當(dāng)有效量施用于有需要的受試者時，在預(yù)防或治療人類癌癥(例如人類結(jié)腸癌)的方法中是有用的。7.人類胰腺癌異種移植模型中CTB003的體內(nèi)抗腫瘤活性在MIAcapa人類胰腺癌異種移植模型中，CTB003展現(xiàn)顯著的抑制活性。在未處理的組中觀察到的腫瘤倍增時間為約14天，相比之下，CTB003處理的組中為70天(圖16)。因而，在人類癌癥(例如胰腺癌)的體內(nèi)才莫型中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑當(dāng)施用于受試者時顯示了治療效益(例如胂瘤生長的抑制)。因而，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑及其同源物和功能等同物(例如hCTB003)當(dāng)以有效量施用于有需要的受試者時，在預(yù)防或治療人類癌癥(例如人類胰腺癌)的方法中是有用的?？偟膩碚f，在多種人類癌癥(例如人類乳腺癌；人類肝癌；人類結(jié)腸癌；人類胰腺癌)的體內(nèi)模型中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑當(dāng)施用給受試者時顯示了治療效益(例如與未處理的對照受試者中觀察到的肺瘤生長相比，腫瘤細(xì)胞生長的降低)。這些癌癥共有TRAIL-R1和/或TRAIL-R2多肽表達(dá)的生物學(xué)特征。如以上討論的，細(xì)胞(包括癌細(xì)胞)上功能性TRAIL-R1和/或TRAIL-R2多肽的活化可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡(例如凋亡性細(xì)胞死亡)。因而，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑及其同源物和功能等同物(例如hCTB003),當(dāng)以有效量施用于有需要的受試者時，在預(yù)防或治療表達(dá)表達(dá)TRAIL-R1和/或TRAIL-R2多肽的人類癌細(xì)胞的方法中是有用的，所述癌細(xì)胞包括但不限于乳腺癌；肝癌；結(jié)腸癌；胰腺癌。實(shí)施例9.CTB003和阿霉素的協(xié)同的體內(nèi)抗腫瘤效力1.人類癌細(xì)胞系人類乳腺癌細(xì)胞系(MDA231)用于棵鼠中異種移植模型的制備。2.異種移植模型用1><107個人類MDA231乳腺癌細(xì)胞皮下接種六(6)至8周齡的Balb/c100棵鼠。在肺瘤接種后7-10天，超過90%的小鼠長出了活腫瘤塊。將荷瘤小鼠隨機(jī)分成四組第一組是未處理的對照組，第二組是用阿霉素單獨(dú)處理的；第三組是用CTB003單獨(dú)處理的，第四組是用阿霉素和CTB003組合處理的。通過測量腫瘤的大小來評估人類乳腺癌胂瘤生長。在接種之后，每周測量小鼠中的腫瘤大小。3.用CTB003和阿霉素處理異種移植小鼠100嗎每劑的阿霉素以三天的間隔每周兩次地腹膜內(nèi)注射三次。200嗎每劑的CTB003以三天的間隔每周兩次腹膜內(nèi)注射總共六劑。阿霉素在CTB003注射之前一天給藥。4.CTB003和阿霉素的協(xié)同的體內(nèi)抗腫瘤效力在未處理的組中，腫瘤倍增時間是約7天。在用單獨(dú)的阿霉素處理之后，觀察到腫瘤抑制作用，但是與處理前相比腫瘤大小的降低不顯著。在CTB003處理的組中，腫瘤大小快速地降低。在兩個劑量的處理之后，在處理組中七只小鼠中的三只發(fā)生了完全的腫瘤消退。在另外三只和一只小鼠中分別觀察到腫瘤大小的超過70%和50%的降低。在四個劑量處理之后所有七只小鼠中都發(fā)生了幾乎完全的腫瘤消退。當(dāng)用CTB003和阿霉素處理小鼠時，在兩輪的處理之后，在七只小鼠的五只中發(fā)生了完全的腫瘤消退，其它小鼠中的腫瘤大小顯著地小于用單獨(dú)的CTB003處理的小鼠中觀察到的腫瘤大小。由于單獨(dú)給予阿霉素幾乎未顯示效果，因此CTB003和阿霉素聯(lián)合處理中完全腫瘤消退的顯著增加表明CTB003和阿霉素具有體內(nèi)的協(xié)同抗腫瘤效力(圖17)。因而，在人類癌癥(例如人類乳腺癌)的體內(nèi)模型中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑當(dāng)與另一種化療劑(例如阿霉素)組合施用給受試者時，顯示了協(xié)同的治療效益(例如腫瘤生長的抑制作用)。因而，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑及其同源物和功能等同物(例如hCTB003)，當(dāng)以有效量與一種或多種化療劑(例如阿霉素)組合施用于有需要的受試者時，在預(yù)防或治療人類癌癥(例如人類乳腺癌)的方法中是有用的。實(shí)施例10.CTB003和CTB006的協(xié)同的體內(nèi)抗腫瘤效力1.人類癌細(xì)胞系人類乳腺癌細(xì)胞系(MDA231)用于在制備棵鼠中的異種移植模型。2.異種移植模型用1><107個人類MDA231乳腺癌細(xì)胞皮下接種六(6)至8周齡的Balb/c棵鼠。在腫瘤接種后7-10天，超過90%的小鼠長出了活腫瘤塊。將荷瘤小鼠隨機(jī)分成四組第一組是未處理的對照組，第二組是用CTB006單獨(dú)處理的；第三組是用CTB003單獨(dú)處理的，第四組是用CTB006和CTB003聯(lián)合處理的。通過測量肺瘤的大小來評估人類乳腺癌腫瘤生長。在接種之后，每周測量小鼠中的腫瘤大小。3.用CTB003和CTB006處理異種移4直小鼠CTB003處理的組中帶有腫瘤的小鼠以三天的間隔每周兩次地腹膜內(nèi)注射100|igCTB003三次。CTB003處理的組中帶有腫瘤的小鼠以三天的間隔每周兩次地腹膜內(nèi)注射200嗎CTB003。在三周內(nèi)重復(fù)進(jìn)行處理六次。同時地纟合予兩種抗體。4.CTB003和阿霉素的體內(nèi)抗腫瘤效力在未處理的組中，肺瘤倍增時間是約7天。在用單獨(dú)的CTB006處理之后，觀察到腫瘤抑制作用，但是與處理前相比腫瘤大小降低不是顯著的。在CTB003處理的組中，腫瘤大小快速地降低。在兩個劑量的處理之后，在處理組中七只小鼠中的三只觀察到完全的腫瘤消退。在另外三只和一只小鼠中分別觀察到腫瘤大小的超過70°/。和50%的降低。在四個劑量處理之后所有七只小鼠中發(fā)生了完全的肺瘤消退。當(dāng)用CTB003和CTB006的組合處理小鼠時，在兩輪的處理之后，在七只小鼠的四只中發(fā)生了完全的腫瘤消退，處理組中其余小鼠的肺瘤大小顯著地小于單獨(dú)的CTB003處理組中觀察到的肺瘤大小。這些結(jié)果表明，CTB003和CTB006具有協(xié)同的體內(nèi)抗腫瘤效力(圖18)。因而，在人類癌癥(例如人類乳腺癌)的體內(nèi)模型中，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑當(dāng)與另一種TRAIL受體結(jié)合劑(例如CTB006)組合施用給受試者時，顯示了協(xié)同的治療效益(例如腫瘤生長的抑制作用)。因而，本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑及其同源物和功能等同物(例如hCTB003)當(dāng)以有效量與另一種TRAIL受體結(jié)合劑(例如CTB006;hCTB006)組合施用于有需要的受試者時，在預(yù)防或治療人類癌癥(例如人類乳腺癌)的方法中是有用的。102實(shí)施例11.CTB003的重鏈和輕鏈的可變區(qū)的序列的分析1.編碼CTB003的重鏈和輕鏈的可變區(qū)的cDNA的克隆從CTB003雜交瘤分離總RNA。通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,將其作為PCR模板用于克隆編碼CTB003的重鏈和輕鏈的可變區(qū)的cDNA。2.PCR寡核苷酸引物的合成a)15種重鏈可變區(qū)引物(含有Sfil限制性位點(diǎn))如下VH1(49mer):5'-GGAACCCTTTGGCCCAGCCGGCCATGGCCIDNO.:53)VH2(衡er):5，-GGAACCCTTTGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTTCACCTGCAGCA(A或G)TC-3，(SEQIDNO.:54)VH3(49mer):5'-GGAACCCTTTGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGT(A或G)CAGCTGAAGGAGTC-3，(SEQIDNO.:55)VH4(49mer):5'匿GGAACCCTTTGGCCCAGCCGGCCATGGCCCVH5(49mer):5，-GGAACCCTTTGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGATCCAGTTGGT(A或C或G)CAGTC-3，(SEQIDNO，:57)VH6(49mer):5，-GGAACCCTTTGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGAAG(C或G)A(C或G)TC-3，(SEQIDNO.:58)VH7(49mer):5'畫GGAACCCTTTGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAG(C或G)(G或T)GGTGGAGTC-3，(SEQIDNO.:59)VH8(49mer):5，-GGAACCCTTTGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAGTGAARSTTGAGGAGTC-3，(SEQIDNO.:60)VH9(49mer):5'-GGAACCCTTTGGCCCAGCCGGCCATGGCCGA(G或T)GT(C或G)(A或C或G)AGCTTCAGGAGTC匿3，(SEQIDNO.:61)VHIO(49mer):5，-GGAACCCTTTGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGAA(C或G)(C或G)TGGTGGAATC-3，(SEQIDNO.:62)VHll(49mer):5'畫GGAACCCTTTGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGAAGCTG(A或G)TGGA(A或G)TC-3，(SEQIDNO.:63)VH12(49mer):5，-GGAACCCTTTGGCCCAGCCGGCCATGGCCG103A(A或G)GTGAAGCTG(A或G)TGGAGTC-3，(SEQIDNO.:64)VH13(49mer):5，-GGAACCCTTTGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAGTGCAGCTGTTGGAGAC畫3，(SEQIDNO,:65)VH14(49mer):5，-GGAACCCTTTGGCCCAGCCGGCCATGGCCGA(A或G)GTGAAGCTTCTC(C或G)AGTC-3，(SEQIDNO.:66)VH15(48mer):5，腳GGAACCCTTTGGCCCAGCCGGCCATGGCCCA(A或G)GTTACTCTGAAAGAGT-3，(SEQIDNO.:67)b)IgG恒定區(qū)引物IgGCH(20mer):5，-TARCCYTTGACMAGGCATCC-3，(SEQIDNO.:68)c)8種輕鏈可變區(qū)引物VK1(32mer):5，-TATTCGTCGACGGATATTGTGATGAC(C或G或T)CAG(A或G或T)C-3，(SEQIDNO.:69)VK2(32mer):5，-TATTCGTCGACGGAT(A或G)TT(G或T)TGATGACCCA(A或G)AC-3，(SEQIDNO.:70)VK3(32mer):5，-TATTCGTCGACGGAAAATGTGCTCACCCAGTC-3，(SEQIDNO.:71)VK4(32mer):5,-TATTCGTCGACGGA(C或T)ATTGTGATGACACAGTC畫3，(SEQIDNO.:72)VK5(32mer):5'畫TATTCGTCGACGGACATCCAGATGACACAGAC-3，(SEQIDNO.:73)(C或T)CA(A或G)TC畫3，(SEQIDNO.:74)VK7(32mer):5'畫TATTCGTCGACGGACATCCAGATGAC(C或T)CA(A或G)TC-3，(SEQIDNO,:75)VK8(32mer):5，-TATTCGTCGACGCAAATTGTTCTCACCCAGTC-3，(SEQIDNO.:76)d)Kappa輕鏈恒定區(qū)引物IgGCK(18mer):5'畫CGTTCACTGCCATCAATC畫3'(SEQIDNO.:77)3,PCR反應(yīng)為了獲得編碼CTB003的重鏈可變區(qū)的cDNA,設(shè)置總共15個PCR反104應(yīng)，為獲得編碼輕鏈可變區(qū)的cDNA設(shè)置8個反應(yīng)。PCR反應(yīng)溶液的組成模板cDNA5)u1,1Opmol5'引物VH1-VH15或VK1-VK8,10pmol3，引物CH或CK,10^110x濃縮的PCR緩沖液，4)ildNTP(各2.5mM)，5單位的Taq聚合酶(Promega)。添加無菌蒸餾水至溶液達(dá)到100pi的總體積。如下進(jìn)行PCR反應(yīng)。首先將溶液在94。C加熱2分鐘，之后重復(fù)40次加熱到94。C30秒、52°C1分鐘和72。C3分鐘的循環(huán)。在這個過程完成之后，將反應(yīng)溶液在72。C加熱10分鐘。將由此獲得的擴(kuò)增的DNA片段在含有0.25嗎/ml的溴化乙4t的1%瓊脂糖凝月交上分離。利用GeneClean試劑盒(BIO101)回收確定含有期望的DNA片段的條帶。4.PCR產(chǎn)物的TA克隆DNA片段使用TA克隆試劑盒(Invitrogen,CA)克隆?？寺∪缦逻M(jìn)行從PCR反應(yīng)溶液回收DNA片段，與TA克隆試劑盒提供的50ngpCR2.1載體一起，與1的10x連接酶反應(yīng)緩沖液(6mMTris-HCl(pH7.5)、6mM氯化鎂、5mM氯化鈉、7mM.卩-巰基乙醇、O.lmMATP、2mMDTT、1mM亞精胺、和0.1mg/ml牛血清白蛋白)混合，所述緩沖液中已經(jīng)添加了4個單位的T4DNA連接酶(1pl)?；旌衔锏目傮w積用無菌去離子水調(diào)整到10)il，所得的連接酶溶液在14。C溫育15小時。在這以后，將2ial的連接酶反應(yīng)溶液添加到50jil的感受態(tài)大腸桿菌菌4朱TOP10F中，所述菌^^由TA克隆試劑盒提供，根據(jù)使用手冊制備為感受態(tài)，將所得混合物在冰上保持30分鐘，然后在42。C保持30秒，再次在冰上保持5分鐘。然后，將含有2%v/v胰蛋白胨、0.5%(w/v)酵母提取物、0.05。/。w/v氯化鈉、2.5mM氯化鉀、1mM氯化鎂和20mM葡萄糖的500pl培養(yǎng)基(以下稱為"SOC"培養(yǎng)基)添加到培養(yǎng)物中，將混合物在37。C振蕩培養(yǎng)1小時。在這之后，將培養(yǎng)物涂布在L-肉湯瓊脂平板(1%v/v胰蛋白胨、0.5%w/v酵母提取物、0.5%w/v氯化鈉、0.1%w/v葡萄糖和0.6%w/v細(xì)菌瓊脂(Difco))上。選取平板上出現(xiàn)的氨千青霉素抗性菌落，用鉑接種環(huán)刮下，在含有100嗎/ml氨千青霉素的L-肉湯培養(yǎng)基中在200rpm振蕩下37。C培養(yǎng)過夜。溫育之后，通過離心收獲細(xì)胞，通過i咸法從中制備質(zhì)粒DNA。5.序列分析隨才幾挑選五個單獨(dú)的TA克隆。純化DNA并利用M13引物雙方向地測序。6.結(jié)果利用VH1和VK1引物，PCR反應(yīng)產(chǎn)生了特異性DNA產(chǎn)物。輕鏈和重鏈的可變區(qū)的序列在圖1中列出。實(shí)施例12.CTB003識別的表位的分析1.編碼TRAIL-R2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的多肽的合成肽A.TRAIL-R2(aa52-aa81)ESALITQQDLAPQQRAAPQQKRSSPSEGLC(SEQIDNO.:6)肽B.TRAIL-R2(aa72-aa101)KRSSPSEGLCPPG朋ISEDGRDCISCKYGQ(SEQIDNO.:78)肽C.TRAIL-R2(aa92-aa121)RDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDS(SEQIDNO.:79)肽D.TRAIL-R2(aal12-aal41)FCLRCTRCDSGEVELSPCTTT脂TVCQCEE(SEQIDNO.:80)肽E.TRAIL-R2(aal32-aa161)TRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCP(SEQIDNO.:81)肽F.TRAIL-R2(aal54-aa183)RKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSD正CVHKES(SEQIDNO.:82)肽G.TRAIL-R2(aal64-aa193)MVKVGDCTPWSD正CVHKESGTKHSGEAPA(SEQIDNO.:83)2.竟?fàn)幮砸种艵LISAELISA平板用含1昭/mlTRAIL-R2-Fc融合蛋白的PBS在4°C包被過夜。用PBS洗滌三次之后，用3°/。BSAPBS在室溫下封閉平板1小時。分別添加1|ag/ml的CTB003及各種濃度的TRAIL-R2多肽A、B、C、D、E、F、G,在37。C1小時。通過用PBS洗滌三次來除去未結(jié)合的抗體，然后在37。C添加HRP-綴合的山羊抗小鼠IgGl經(jīng)過30分鐘。在用PBS洗滌三次之后，添加TMB底物緩沖液，經(jīng)過10分鐘，然后通過添加2NH2S04終止反應(yīng)。在ELISA酶標(biāo)儀中使用450nm/650nm的雙波長記錄光密度的值。以不存在肽的情況下的OD值作為CTB003對TRAIL-R2的最大結(jié)合。各種濃度的肽對CTB003與TRAIL-R2的結(jié)合的竟?fàn)幮砸种朴嬎銥橄鄬ψ畲蠼Y(jié)合的百分比。3.結(jié)果如圖19中所示，不同于被測試的其他肽(即，肽A-E),肽F和肽G以劑量依賴性方式抑制CTB003與TRAIL-R2的結(jié)合。因而，CTB003識別的表位位于TRAIL-R2的aa163到aa211之間。4.編碼TRAIL-R2和TRAIL-R1的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的多肽的合成.為了進(jìn)一步確認(rèn)CTB003的表位，比較了TRAIL-R1和TRAIL-R2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列同源性。在TRAIL-R2的aa167到aa182之間和TRAIL-R1的aa218到aa233之間鑒定了一個高度同源的區(qū)域，而在TRAIL-R3和TRAIL-R4(圖31)的相應(yīng)區(qū)域中則沒有這樣的區(qū)域。因而，我們假定CTB003中被TRAIL-R1和TRAIL-R2同時識別的表位位于這個區(qū)域中。為了檢驗這種假定，合成了肽H和肽I，如下肽H.TRAIL-R2(aal67-aa182)VGDCTPWSD正CVHKE(SEQIDNO.:46)肽LTRAIL-Rl(aa218畫aa233)VKDCTPWSD正CVHKE(SEQIDNO.:45)5.竟?fàn)幮砸种艵LISAELISA平板用含1嗎/mlTRAIL-R1或TRAIL-R2-Fc融合蛋白的PBS在4。C包被過夜。用PBS洗滌三次之后，用3。/。BSAPBS在室溫下封閉平板1小時。添加1fig/ml的CTB003并分別添加不同濃度的多肽H和多肽I，在37。C1經(jīng)過小時。通過用PBS洗滌三次來除去未結(jié)合的抗體，然后在37。C添加HRP-綴合的山羊抗小鼠IgGl，經(jīng)過30分鐘。用PBS洗滌三次之后，添加TMB底物緩沖液，經(jīng)過10分鐘，然后通過添加2NH2S04終止反應(yīng)。在ELISA酶標(biāo)儀中使用450nm/650nm的雙波長記錄光密度的值。以不存在肽的情況下的OD值作為CTB003對TRAIL-R1或TRAIL-R2的最大結(jié)合。各種濃度的肽對CTB003與TRAIL-R2的結(jié)合的竟?fàn)幮砸种票挥嬎銥橄鄬ψ畲蠼Y(jié)合的百分比。6.結(jié)果如圖20,圖面A所示，肽H或I都以劑量依賴性方式抑制了CTB003對TRAIL-R1的結(jié)合。同樣地，如在圖20，圖面B中所示，肽H或I以劑量依賴性方式抑制了CTB003對TRAIL-R2的結(jié)合。因而，CTB003識別的表位位于TRAIL-R2的aa167到aa182和TRAIL-R1的aa218到aa233之間(即，TRAIL-R1和TRAIL-R2間的序列同源性區(qū)域)。就申請人所知，這是該區(qū)域首次被鑒定為TRAIL-R1和TRAIL-R2多肽共有的表位，可以用該區(qū)域作為耙標(biāo)來產(chǎn)生拮抗劑抗體，用于誘導(dǎo)表達(dá)TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的癌細(xì)胞的凋亡。實(shí)施例13.本發(fā)明的小鼠-人類嵌合的CTB003、CTB006和CTB007TRAIL受體結(jié)合劑的制備和表征I.小鼠-人類嵌合CTB003、CTB006和CTB007TRAIL受體結(jié)合劑的制備鼠可變區(qū)基因.用于小鼠-人類嵌合抗體的構(gòu)建的輕鏈和重鏈可變區(qū)來自小鼠-小鼠雜交瘤CTB003(CGMCCNO.1665)、CTB006(CGMCCNO.1691)或CTB007(CGMCCNO.1733)。將這些重鏈和輕鏈克隆用作PCR誘變的模板，來引入用于克隆到TA克隆載體中的限制性位點(diǎn)。人類IgGl恒定區(qū)cDNA的克隆.利用分離自人類外周血單個核細(xì)胞的總RNA，通過RT-PCR來克隆編碼人類IgGl重鏈和輕鏈恒定區(qū)的cDNA克隆。在確認(rèn)序列之后，將cDNA克隆到表達(dá)載體(pcDNAIII)中。嵌合CTB003、CTB006和CTB007表達(dá)載體的構(gòu)建.以來自如上所述的雜交瘤的克隆的重鏈和輕鏈可變區(qū)cDNA作為模板進(jìn)行PCR。通過PCR所使用的引物來引入用于連接到已經(jīng)以正確的閱讀框插入了人類IgGl重鏈或輕鏈恒定區(qū)的cDNA的pcDNAIII表達(dá)載體中的限制性位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物首先連接到pCRII中，在大腸桿菌中克隆，然后再次測序來確保在引入新限制性位點(diǎn)的期間沒有發(fā)生突變。將輕鏈和重鏈可變區(qū)產(chǎn)物分別克隆到Ig表達(dá)載體的Drain和BsiWI(kappa輕鏈)和Mlul和Nhel(gamma1重鏈)位點(diǎn)。產(chǎn)生的完整的表達(dá)載體命名為pcDNAIII-hCTB003LC、pcDNAIII畫hCTB003HC、pcDNAIII-hCTB006LC、pcDNAIII陽hCTB006HC、pcDNAIII-hCTB007LC、pcDNAIII-hCTB007HC。這些cDNA克隆和表達(dá)載體于2007年4月13日保藏在中國普通微生物菌種保藏中心(GCMCC)。轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞用于嵌合抗體的表達(dá)和抗體生產(chǎn)克隆的選擇配對的質(zhì)粒pcDNAIII-hCTB003LC和pcDNAIII畫hCTB003HC;pcDNAIII隱hCTB006LC和pcDNAIII畫hCTB006HC;或pcDNAIII-hCTB007LC和pcDNAIII-hCTB007HC,單獨(dú)地通過DNA-脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染導(dǎo)入中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。筒要地，2嗎的質(zhì)粒DNA與8nl的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine)(Gibco，Gaithersberg,Md.)在1ml的無血清培養(yǎng)基的最終體積中混合。容許轉(zhuǎn)染混合物在37。C溫育5h。洗滌細(xì)胞，添加新鮮培養(yǎng)基，溫育細(xì)胞48h。收獲細(xì)胞，重懸浮在含有G418(400jig/ml;Gibco)的培養(yǎng)基中，以不同的稀釋度鋪板在12孔平板上。通過酶聯(lián)免疫吸附測定(EUSA)來測定在抗生素選擇下生長的細(xì)胞的嵌合抗體生產(chǎn)。ELISA平板用2嗎的TRAIL-Rl-Fc或TRAIL-R2-Fc融合蛋白包被，培養(yǎng)上清液中mAbs(即，單克隆抗體)的結(jié)合用HRP綴合的山羊抗人類kappa輕鏈特異性抗體(SoutherBiotech，Birmingham,Alabama)來測定。嵌合抗體的純化通過蛋白A親和層析(Pharmacia)從組織培養(yǎng)上清液中純化嵌合的IgG抗體。來自轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的500ml的培養(yǎng)物上清液以2ml每分鐘的流動速度通過蛋白A瓊脂糖柱。在培養(yǎng)物上清液通過之后，用50lmPBS洗滌柱子。用洗脫緩沖液(0.1M甘氨酸(pH2.4)、0.15MNaCl)來洗脫蛋白質(zhì)。測量每個洗脫級分(1ml)的OD280nm光密度。收集OD280>0.1的級分。添加100pi的中和緩沖液(1MHis-HCLpH8.5)之后，將洗脫物單獨(dú)地置于透析管中，洗脫物在4T:相對于1升的PBS(pH7.5)透析。透析緩沖液更換兩次。純化的蛋白質(zhì)濃縮到1mg/ml，滅菌并在-4。C保存待用。通過10Q/。SDS-PAGE測定，人類嵌合抗體的純度大于95%。II.嵌合的CTB003、CTB006和CTB007對TRAIL受體的結(jié)合特征通過ELISA將嵌合的CTB003、CTB006和CTB007對TRAIL受體的結(jié)合活性與它們的親本鼠抗體相比較。ELISA平板用含1pg/ml以下重組蛋白質(zhì)的PBS在4。C包被過夜1.TRAIL-R1和TRAIL-R2異二聚抗原，2.TRAIL-Rl-Fc融合抗原，3.TRAIL-R2-Fc融合抗原，4.TRAIL-R3-Fc融合抗原，5.TRAIL-R4-Fc融合抗原，或BSA作為陰性對照。在用PBS洗滌三次之后，平板用3。/。BSAPBS在室溫下封閉1小時。平板與各種濃度的純化的嵌合或親本鼠抗體在37。C溫育一小時。通過用PBS洗滌三次來除去未結(jié)合的抗體，然后對于鼠抗體添加HRP綴合的山羊抗小鼠IgGl，或?qū)τ谌祟惽逗峡贵w添加HRP綴合的山羊抗人kappa，在37。C經(jīng)過30分鐘。用PBS洗滌三次之后，添加TMB底物纟爰沖液經(jīng)過10分鐘，然后通過添加2NH2S04終止反應(yīng)。在ELISA酶標(biāo)儀中用450nm/650nm的雙波長記錄光密度的值。嵌合的CTB003展現(xiàn)了對TRAIL-R1/TRAIL-R2異二聚體抗原(圖21，圖面A)以及TRAIL-Rl-Fc(圖21，圖面B)或TRAIL-R2-Fc(圖21,圖109面C)融合抗原的劑量依賴性結(jié)合，且其結(jié)合動力學(xué)與對親本鼠CTB003所觀察到的結(jié)合特征幾乎不能區(qū)分。在測試的抗體濃度的范圍內(nèi)，嵌合的CTB003不與TRAIL-R3-Fc(圖21,圖面D)、TRAIL-R4-Fc(圖21,圖面E)融合抗原或BSA(圖21,圖面F)反應(yīng)。嵌合的CTB006和嵌合的CTB007的特征分別總結(jié)在圖22和23中。這些結(jié)合劑的人源化嵌合形式的結(jié)合特征基本上不能與它們對應(yīng)的鼠親本對應(yīng)物相區(qū)別。也就是說，嵌合的CTB006展現(xiàn)了對TRAIL-R1/TRAIL-R2異二聚體抗原(圖22，圖面A)以及TRAIL-R2-Fc(圖22，圖面C)融合抗原的劑量依賴性結(jié)合，結(jié)合動力學(xué)非常類似于親本CTB006。在測試的抗體濃度的范圍內(nèi)，嵌合的CTB006不與TRAIL-Rl-Fc(圖22，圖面B)、TRAIL-R3-Fc(圖22，圖面D)、TRAIL-R4-Fc(圖22，圖面E)融合抗原或BSA(圖22,圖面F)反應(yīng)。嵌合的CTB007展現(xiàn)了對TRAIL-R1/TRAIL-R2異二聚體抗原(圖23,圖面A)以及TRAIL-Rl-Fc(圖23,圖面B)融合抗原的劑量依賴性結(jié)合，結(jié)合動力學(xué)非常類似于親本CTB007的那些。在測試的抗體濃c的范圍內(nèi)，CTB007不與TRAIL-R2-Fc(圖23，圖面C)、TRAIL-R3-Fc(圖23，圖面D)、TRAIL-R4-Fc(圖23，圖面E)融合抗原或BSA(圖23，圖面F)反應(yīng)。類似于在實(shí)施例12中描述的研究，在互反實(shí)驗中用TRAIL-R1和TRAIL-R2融合多肽進(jìn)行竟?fàn)幮砸种艵LISA來進(jìn)一步對人類嵌合CTB003的表位特異性加以定位。如圖24，圖面A所示，肽H或I都以劑量依賴性方式抑制了人源化嵌合的CTB003對TRAIL-R1的結(jié)合。同樣地，如在圖20，圖面B中所示，肽H或I以劑量依賴性方式抑制人源化嵌合的CTB003對TRAIL-R2的結(jié)合。因而，人源化嵌合的CTB003所識別的表位位于TRAIL-R2的aa167到aa182和TRAIL-R1的aa218到aa233之間(即，TRAIL-R1和TRAIL-R2之間具有序列同源性的區(qū)域)。顯著地，人源化嵌合的CTB003結(jié)合劑的結(jié)合特征基本上不能與鼠CTB003相區(qū)別。為了確定這些結(jié)合劑是否共有相同的生物學(xué)性質(zhì)，如下所述在許多癌細(xì)胞系中將嵌合的CTB003的體外凋亡誘導(dǎo)活性與鼠CTB003進(jìn)行了比較。III。嵌合^CriMj、CT80M和亡謬爭話'/S使用一組人類癌細(xì)胞系來于評估嵌合的CTB003、CTB006和CTB007的體外凋亡誘導(dǎo)活性，包括人類乳腺癌細(xì)胞系，MDA231;人類結(jié)腸癌細(xì)胞系，Colo205;人類胰腺癌細(xì)胞系，MIAcapa;人類卵巢癌細(xì)胞系，CaOvc3;人類前列腺癌細(xì)胞系，Dul45;和人類肺癌細(xì)胞系，H2122。用ATPLite分析測定細(xì)胞活力和每種抗體的IC50。在96孔平板中，將每孔1,000個目標(biāo)細(xì)胞在存在七種濃度的10倍稀釋嵌合抗體或它們的相應(yīng)親本鼠抗體的情況下培養(yǎng)，抗體最高濃度是1000ng/ml，最低濃度0.01ng/ml。在37。C培養(yǎng)過夜之后，根據(jù)廠家的說明書(PackardInstruments,Meriden,Conn.)使用ATPLite試劑盒測定細(xì)胞活力添加50的細(xì)胞裂解緩沖液，然后添加50pl的底物緩沖液。反應(yīng)物在發(fā)光讀數(shù)器中計數(shù)。細(xì)胞活力計算為(處理細(xì)胞的cmp/對照細(xì)胞的cmp)xl00%。產(chǎn)生了劑量依賴性殺傷曲線。IC50通過線性回歸來計算。結(jié)果表示為三個重復(fù)培養(yǎng)物的平均值士SD。表8.嵌合抗體與親本鼠抗體的殺傷活性的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table>所有六種測試的人類癌細(xì)胞系，包括MDA231人類乳腺癌細(xì)胞(圖25)、Colo205人類結(jié)腸癌細(xì)胞(圖26)、MIAcapa人類胰腺癌細(xì)胞(圖27)、Caov3人類卵巢癌細(xì)胞(圖28)、Dul45人類前列腺癌細(xì)胞(圖29)和H2122人類肺癌細(xì)胞，對于鼠CTB003和人類嵌合CTB003(圖面A)或鼠CTB006和嵌合的CTB006(圖面B)或鼠CTB007和嵌合的CTB007(圖面C)所誘導(dǎo)的凋亡是同樣地敏感的。重組嵌合抗體展現(xiàn)了與它們相應(yīng)的親本鼠抗體相似的劑量應(yīng)答關(guān)系。這些結(jié)果表明，所有工程化的嵌合抗體保持了它們的鼠親本抗體的凋亡誘導(dǎo)活性。人類嵌合的和鼠抗體的凋亡誘導(dǎo)活性在表8中以IC50表示，其顯示在所有測試的人類癌癥細(xì)胞中，重組嵌合的CTB003、CTB006和CTB007展現(xiàn)了與它們的鼠親本抗體非常相似的IC50。根據(jù)在人源化嵌合CTB003和鼠CTB003之間觀察到的共有的結(jié)合特征和體外生物學(xué)應(yīng)答，我們認(rèn)為，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識到，人源化的嵌合CTB003也將如鼠CTB003—樣產(chǎn)生體內(nèi)的腫瘤生長抑制作用。因而，本發(fā)明的結(jié)合劑(例如hCTB003)當(dāng)以有效量施用給有需要的受試者(包括人類受試者)時在抑制腫瘤生長的方法中是有效的。實(shí)施例14.CTB003在非人靈長類中的臨床前毒性研究在北京國家藥物安全評估和研究中心(中國北京)在非人靈長類中評估了CTB003的全身毒性。對體重4.5kg的4-5月齡的雄性恒河猴以40mg/kg劑量靜脈內(nèi)輸注CTB003。CTB003以3mg/ml溶于PBS中，總輸注體積是每kg體重20ml。輸注速率是每分鐘5滴，輸注在90分鐘內(nèi)完成。從處理前第7天開始到處理后15天止，每天^r查受處理動物的一般生理狀況。在處理前第7天和在處理后0、3、7和14天沖企查體重、體溫、EKG、血液學(xué)參數(shù)、血液生物化學(xué)參數(shù)。在處理之后，動物的一般身體狀況看起來是正常的。體重稍有增高，體溫保持在正常范圍之內(nèi)(表9)。表9.CTB003的靜脈內(nèi)施用對體重和體溫的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table>在處理后所有測試的血液學(xué)參數(shù)(表10)沒有顯著的改變，生物化學(xué)測量值在處理后保持正常(表ll)。結(jié)果表明，CTB003以40mg/kg的全身性施用在恒河猴中得到了良好的耐受。表10.CTB003的靜脈內(nèi)施用對血液學(xué)參數(shù)的影響天RBC(1012/L)Hb(g/1)Hct(%)MCV(fl)MCH(pg)MCHC(g/1)RDW(%)-75.471330.42377.324.331513.4I5.561470.43076.726.234212.245.441400.42377.725.733112.785.431390.41776.825.633312.7155.291330.40576.625.132812.7天Plat(l(^/L)MPV(fl)PDW(%)Ret%(%)Ret#(109/L)WBC(109/L)NE陽74937.415,91.240.07147.51913548.015.70.670.03978.32943748.015.60.690.03928.02683598.216.21.210.06827.817153988.115.60.850.04657.028天LYMOEOBA———-771811————1630—--—46740————8693110———1564260———_表l1.CTB003的靜脈內(nèi)施用對生物化學(xué)參數(shù)的影響^Ii7IE7ISTcholBUN113<table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table>常的。體重沒有改變，體溫保持在正常范圍之內(nèi)(表12)。表12.CTB006或CTB007的全身性施用對體重和體溫的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table>在用CTB006(表D)或CTB007(表")處理后所有測試的血液學(xué)參數(shù)沒有顯著改變，所有的生物化學(xué)測量值(表15和16)保持正常，只是在處理后血漿ALT和AST中輕微和短暫的增加，其在處理后7天回到正常。表13.CTB006的全身性施用對血液學(xué)參數(shù)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table>37930o———77571o———146230o———表l5.CTB006的靜脈內(nèi)施用對生物化學(xué)參數(shù)的影響天ALT(U/L)AST(U/L)ALP(U/L)TP(g/1)Alb(g/1)Tchol(mmol/1)BUN(mmol/1)-7722922380.545,24.687.690451418576.644.64.267.9419816217272.241.43.777.413833815973.642.03.928.137672318274.743.04.277.6414482011269.943.53.476.54天Tbil((xmo1/1)Glu(mmol/1)Grea(pmol/l)CK(U/L)Na(mmol/1)K(mmol/1)CI(mmol/1)-74.65.2249.01841405.69904.04.8849.21831455.110014.74.3548.74461455.41076.76.1351.44521508.41076.85.3350.61581474.1105144.75.8042.11371464.3110天TG(mmol/1)G-GT(U/L)——————70.4732—一一———00,2130——————10.4827—————30.5635—————70.3935—————140.2041———————表16.CTB007的靜脈內(nèi)施用對生物化學(xué)參數(shù)的影響天ALTASTALPTPAlbTcholBUN<table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table>聚丙烯酰胺凝月交電泳("SDS-PAGE")中在還原條件下分離。在電泳之后，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚乙二烯二氟化物膜("PVDF")上。在轉(zhuǎn)移之后，用洗滌緩沖液25mMNaCl、10mM硼酸鈉緩沖液(pHS.0)洗滌PVDF膜，然后在染色溶液(50%v/v曱醇、20%v/v乙酸和0.05%(w/v)考馬斯亮藍(lán))中洗滌5分鐘來確定蛋白質(zhì)條帶的位置。然后用90%(v/v)含水曱醇脫色PVDF膜，將早先在PDVF膜上定位的與重鏈相應(yīng)的條帶(具有較低泳動能力的條帶)和與輕鏈相應(yīng)的條帶(具有較高泳動能力的條帶)切下，并用去離子水洗滌。利用蛋白質(zhì)測序儀(PROCISE491,ABI，USA)通過Edman自動化方法來測定重鏈和輕鏈的N-末端氨基酸序列。測得與CTB003的重鏈相應(yīng)的N-末端氨基酸序列為Glu陽Val-His-Leu-Val-Glu畫Ser-Gly-Gly-Gly畫Leu畫Val-Arg畫Pro畫Gly-Gly-Ser(SEQIDNO.:84)測得與CTB003的輕鏈相應(yīng)的條帶的N-末端氨基酸序列為Ala-Thr-Met-Arg-Leu-Pro-Ala-Gln-Leu-Leu-Gly-Leu-Leu-Met-Leu-Trp-Val-Ser(SEQIDNO.:85)測得與CTB006的重鏈相應(yīng)的N-末端氨基酸序列為Gln-Val-Gln-Leu-Gln-Gln-Pro-Gly-Pro-Glu-Leu-Val-Lys-Pro-Gly-Ala-Ser(SEQIDNO.:86)測得與CTB006的輕鏈相應(yīng)的條帶的N-末端氨基酸序列為Asp-Ile-Val畫Met-Thr-Gln國Ser畫His畫Lys-Phe畫Met-Ser-Thr-Ser-Val-Gly(SEQIDNO.:87)測得與CTB007的重鏈相應(yīng)的N-末端氨基酸序列為Glu-Val-Gln國Leu畫Gln陽Gln-Ser-Gly-Ala-Glu-Leu-Val-Lys-Pro-Gly-Ala畫Ser(SEQIDNO.:88).測得與CTB007的輕鏈相應(yīng)的條帶的N-末端氨基酸序列為Asp-Ile網(wǎng)Gln-Met-Thr-Gln-Ser畫Pro-Ala-Ser-Leu-Ser-Val-Ser-Val(SEQIDNO.:89),實(shí)施例17.CTB003相關(guān)的序列以下提供了CTB003相關(guān)的序列。鼠CTB003輕鏈可變區(qū)核酸序列在下文的表17中顯示。表17.鼠CTB003輕鏈可變區(qū)核酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table>鼠CTB003輕鏈可變區(qū)核酸和氨基酸序列在下文的表19中顯示。表19.鼠CTB003輕鏈可變區(qū)核酸和氨基酸序列GACATCCAGATGACCCAATCTTCATCCTCCTTTTCTGTATCTCTAGGAGACAGAGTCACC~DI(JMT(JSSSSFSVSLGDRVTATTACTTGCAAGGCAGGTGAGGACATATATAATCGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAITCKAGEDIYNRLAWY()QKPGGAAATGCTCCTAGGCTCTTAATATCTGGTGCAACCAATTTGGAAACTGGGGTTCCTTCAGNAPRLLISGATNLETGVPSAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGAAAGGATTACACTCTCAGCATTACCAGTCTTCAGACTRFSGSGSGKDYTLSITSLQTGAAGATGTTGCTACTTATTACTGTCAACAGTATTGGAGTACTCCGCTCSEQIDNO.:1EDVATYYCQQYWSTPLSEQIDNO.:2鼠的CTB003輕鏈CDR1核酸和氨基酸序列在下文的表20中顯示。表20.~鼠CTB003輕鏈CDR1氨基酸序列KAGEDIYNRLASEQIDNO.:3鼠的CTB003輕鏈CDR2核酸和氨基酸序列在下文的表21中顯示。表21.鼠CTB003輕鏈CDR2氨基酸序列GATNLETSE(JIDNO.:4鼠的CTB003輕鏈CDR3核酸和氨基酸序列在下文的表22中顯示。表22.~~鼠CTB003輕鏈CDR3氨基酸序列QQYWSTPLSEQIDNO.:5鼠CTB003重鏈可變區(qū)核酸序列在下文的表23中顯示。表23.鼠CTB003重鏈可變區(qū)核酸序列GAGGTGCATCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAGGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTGATGGTGGTGGTATCACCTACTATCCAGACACAATGAAGGGCCGACTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAATACCCTGTCCCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACATATTACTATGGTGGTAGGACCCTTTGCTSEQIDNO.:7_鼠CTB003重鏈可變區(qū)氨基酸序列在下文的表24中顯示。表24.~鼠CTB003重鏈可變區(qū)氨基酸序列EVHVESGGGLVRPGGSKSCAAsGFAFSSYDMSWVRQTPEKREWVAYISDGGGITYYPDTMKGRTISRDNAKNTSQMSSKSEDTAMYYCARHITMVVGPFASE(JIDNO.:8鼠的CTB003重鏈可變區(qū)核酸和氨基酸序列在下文的表25中顯示。表25.鼠CTB003重鏈可變區(qū)核酸和氨基酸序列GAGGTGCATCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAGGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCEVHLVESGGGLVRPGGSLKLTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCGCTTTCAGTAGCTATGACATGTCTTGGGTTCGCCAGACTSCAASGFAFSSYDMSWVRQTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTGATGGTGGTGGTATCACCTACTATPEKRLEWVAYISDGGGITYYCCAGACACAATGAAGGGCCGACTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAATACCCTGTCCPDTMKGRLTISRDNAKNTLSCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACATATTLqMSSLKSEDTAMYYCARHIACTATGGTGGTAGGACCCTTTGCTSEQIDNO.:7TMVVGPFASE(jIDNO.:8_鼠的CTB003重鏈CDRl氨基酸序列在下文的表26中顯示。表26.~鼠CTB003重鏈CDRl氨基酸序列SYDMSSEQIDNO.:9鼠的CTB003重鏈CDR2氨基酸序列在下文的表27中顯示。表27.~鼠CTB003重鏈CDR2氨基酸序歹'JYISDGGGITYYPDTMKGSEQIDNO.:10鼠的CTB003重鏈CDR3氨基酸序列在下文的表28中顯示。表28.~鼠CTB003重鏈CDR3氨基酸序列HITMVVGPFASEQIDNO.:11人類嵌合CTB003輕鏈核酸序列在下文的表29中顯示。表29.人類嵌合CTB003輕鏈核酸序列ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGTGACATCCAGATGACTCAGTCTTCATCCTCCTTTTCTGTATCTCTAGGAGACAGAGTCACCGGAAATGCTCCTAGGCTCTTAATATCTGGTGCAACCAGTTTGGAAACTGGGGTTCCTTCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGAAAGGATTACACTCTCAGCATTACCAGTCTTCAGACTGAAGATGTTGCTACTTATTACTGTCAACAGTATTGGAGTACTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCTGTGGCTGCACCATCTGTCGATATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTTACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGSEQIDNO.:12人類嵌合CTB003輕鏈氨基酸序列在下文的表30中顯示。表30.人類嵌合CTB003輕鏈氨基酸序列MRLPAQGMWVSGSSGDIQMTQSSSSFSVsGDRVTITcKAsEDIYNRAwYQQKPGNAPRISGATsETGVPSRFSGSGSGKDYTSITSLQTEDVATYYCQQYWsTLTFGAGTKEKRAVAApSVDIFPPSDEQKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAQSGNSQESVTEQDsKDSTYsSSTLTSKADYEKHKVYAcEVTHQGSSPVTKSFNRGEc*SEQIDNO.:13人類嵌合CTB003輕鏈核酸和氨基酸序列在下文的表31中顯示。表31.人類嵌合CTB003輕鏈核酸和氨基酸序列ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGTMRLPACILLGLLMLWVSGSSGGACATCCAGATGACTCAGTCTTCATCCTCCTTTTCTGTATCTCTAGGAGACAGAGTCACCDI(JMTQSSSSFSVSLGDRVTATTACTTGCAAGGCAAGTGAGGACATATATAATCGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAITCKASEDIYNRLAWYQ(JKPGGAAATGCTCCTAGGCTCTTAATATCTGGTGCAACCAGTTTGGAAACTGGGGTTCCTTCAGNAPRLLISGATSLETGVPSAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGAAAGGATTACACTCTCAGCATTACCAGTCTTCAGACTRFSGSGSGKDYTLSITSLQTGAAGATGTTGCTACTTATTACTGTCAACAGTATTGGAGTACTCCGCTCACGTTCGGTGCTEDVATYYC()QYWSTPLTFGAGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCTGTGGCTGCACCATCTGTCGATATCTTCCCGCCAGTKLELKRAVAAPSVDIFPPSDEqiKSGTASVVCLLNNFYCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGPREAKVQWKVDNALQSGNSQGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGESVTEqDSKDSTYSLSSTLTCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTTACCCATCAGGGCLSKADYEKHKVYACEVTH()GCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGSEQIDNO.:12LSSPVTKSFNRGEC*SE(jIDN0.:13人類嵌合CTB003重鏈核酸序列在下文的表32中顯示。表32.人類嵌合CTB003重鏈核酸序列ATGGGGA麗TTGGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGTTATATTAGAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCATCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAGGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCGCTTTCAGTAGCTATGACATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTGATGGTGGTGGTATCACCTACTATCCAGACACAATGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAATACCCTGTCCCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACATATTACTATGGTGGTAGGACCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCATGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGASEQIDNO.:14_人類嵌合CTB003重鏈氨基酸序列在下文的表33中顯示。表33.人類嵌合CTB003重鏈氨基酸序列MGXGLSWVFVVIEGVQCEVHVESGGGVRPGGSKScAAsGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISDGGGITYYPDTMKGRFTISRDNAKNTS123<table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table>實(shí)施例18.CTB006相關(guān)的序列以下提供了CTB006相關(guān)的序列。鼠CTB006輕鏈可變區(qū)核酸序列在下文的表35中顯示。_表35.鼠CTB006輕鏈可變區(qū)核酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table>鼠CTB006輕鏈可變區(qū)氨基酸序列在下文的表36中顯示。表36.~鼠CTB006輕鏈可變區(qū)氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table>鼠CTB006輕鏈可變區(qū)核酸和氨基酸序列在下文的表37中顯示。表37.鼠CTB006輕鏈可變區(qū)核酸和氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table>鼠CTB006輕鏈CDR3氨基酸序列在下文的表40中顯示。<table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table>鼠CTB006重鏈可變區(qū)核酸序列在下文的表41中顯示。<table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table>鼠CTB006重鏈可變區(qū)氨基酸序列在下文的表42中顯示。<table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table>1QVQQ(JPGPEVKPGASVRM21sCKAsGYTFTSYFIHWVKQR41pGQGEWIGWIYPGNVNTKY61sEKFKGKATTADKSSSTAY81MQFSSLTSEDSAVYFCARGE101AGYFDSEQIDNO.:22鼠的CTB006重鏈可變區(qū)核酸和氨基酸序列在下文的表43中顯示。表43.鼠CTB006重鏈可變區(qū)核酸和氨基酸序列1CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATG1QVQLQQPGPELVKPGASVRM61TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTACTTTATACATTGGGTGAAGCAGAGG21SCKASGYTFTSYFIHWVKOR121CCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAATGTTAATACTAAGTAC41PGQGLEWIGWIYPGNVNTKY181AGTGAGAAGTTCAAGGGTAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTAC61SEKFKGKATLTADKSSSTAY241ATGCAGTTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGGGGAG81MQFSSLTSEDSAVYFCARGE301GCTGGGTACTTTGACSEQIDNO.:21101AGYFDSE(JIDNO.:22鼠CTB006重鏈CDR1氨基酸序列在下文的表44中顯示。表44.鼠CTB006重鏈CDR1氨基酸序列SYFIHSE(jIDNO.:23_鼠CTB006重鏈CDR2氨基酸序列在下文的表45中顯示。表45.鼠CTB006重鏈CDR2氨基酸序歹'JWIYPGNVNTKYSEKFKGSE(jIDNO.:24鼠CTB006重鏈CDR3氨基酸序列在下文的表46中顯示。表46.鼠CTB006重鏈CDR3氨基酸序列GEAGYFDSE(jIDNO.:25人類嵌合CTB006輕鏈核酸序列在下文的表47中顯示。_表47.人類嵌合CTB006輕鏈核酸序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage128</formula>141SDEOLKSGTASVVCLLNNFY481CCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAG161PREAKVQWKVDNALQSGNSQ541GAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACG181ESVTEQDSKDSTYSLSSTLT601CTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTTACCCATCAGGGC201LSKADYEKHKVYACEVTHQG661CTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGSEQIDNO.:26221_LSSPVTKSFNRGEC*SE(jIDNO.:27人類嵌合CTB006重鏈核酸序列在下文的表50中顯示。表50.人類嵌合CTB006重鏈核酸序列一1ATGGAGTTGGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGTTATATTAGAAGGTGTCCAGTGTGAG61GTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATGTCC121TGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTACTTTATACATTGGGTGAAGCAGAGGCCT181GGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAATGTTAATACTAAGTACAGT241GAGAAGTTCAAGGGTAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATG301CAGTTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGGGGAGGCT361GGGTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCTAGCACCAAG421GGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCC481CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC541GCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCC601CTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC661GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC721AAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTC781CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGA'CACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGC841GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGC901GTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGT961GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGC1021AAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGG1081CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAAC1141CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG1201GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC1261GGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCATGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC1321GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC1381TCCCTGTCTCCGGGTAAATGASEQIDNO.:28人類嵌合CTB006重鏈氨基酸序列在下文的表51中顯示。表51.人類嵌合CTB006重鏈氨基酸序歹寸1MEGSWVFVVILEGVQCE21VQQQSGPEVKPGASVRMS41CKAsGYTFTSYFIHWVKQRP61GQGEWIGWIYPGNVNTKYS81EKFKGKATTADKSsSTAYM101QFSSTSEDSAVYFcARGEAmGYFDYWGQGTTTVsSASTK129<table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage131</formula>1381TCCCTGTCTCCGGGTAAATGASEQIDNO.:28461SLSPGK*SE(JID亂29實(shí)施例19.CTB007相關(guān)的序列以下提供了CTB007相關(guān)的序列。鼠CTB007輕鏈可變區(qū)核酸序列在下文的表53中顯示。表53.鼠CTB007輕鏈可變區(qū)核酸序列"IGACATCCAGATGACCCAATCTCCAGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCACC61ATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTAATTTAGAATGGTATCAGCAGAAACAG121GGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATGCTGCAACAAACTTAGCAGATGGTGTGCCATCA181AGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTATTCCCTCAAGATCAACAGCCTGCAGTCT241GAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGGGTACTTGGSE(jIDNO.:30鼠CTB007輕鏈可變區(qū)氨基酸序列在下文的表54中顯示。表54.鼠CTB007輕鏈可變區(qū)氨基酸序列1DIQMTQSPASSVSVGETVT21ITCRAsENIYSNEWYQQKQ41GKSPQVYAATNADGVPS61RFSGsGSGTQYSKINSLdS81EDFGsYYCQHFWGTWSEQIDNO.31鼠CTB007輕鏈可變區(qū)核酸和氨基酸序列在下文的表55中顯示。表55.鼠CTB007輕鏈可變區(qū)核酸和氨基酸序列—1GACATCCAGATGACCCAATCTCCAGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCACC1DIQMT(JSPASLSVSVGETVT61ATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTAATTTAGAATGGTATCAGQG/UACAG21ITCRASENIYSNLEWYQQKQ121GGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATGCTGCAACAAACTTAGCAGATGGTGTGCCATCA41GKSP(JLLVYAATNLADGVPS181AGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTATTCCCTCAAGATCAACAGCCTGCAGTCT61RFSGSGSGTdYSLKINSL(JS241GAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGGGTACTTGGSEQIDNO.:30_^_EDFGSYYC(jHFWGTWSE(jIDNO.:31鼠CTB007輕鏈CDRl氨基酸序列在下文的表56中顯示。表56.鼠CTB007輕鏈CDRl氨基酸序列RASENIYSNLESEQIDNO.:32'鼠CTB007輕鏈CDR2氨基酸序列在下文的表57中顯示。表57.鼠CTB007輕鏈CDR2氨基酸序列AATNLADSE(jIDNO.:33一鼠CTB007輕鏈CDR3氨基酸序列在下文的表58中顯示。表58.鼠CTB007輕鏈CDR3氨基酸序列QHFWGTWSEQIDNO.:34鼠CTB007重鏈可變區(qū)核酸序列在下文的表59中顯示<表59.鼠CTB007重鏈可變區(qū)核酸序列1GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTG61TCCTGCACAGCTTCGGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGG121CCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATAT181GACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTAC241CTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCCTATTACTAC301GTTAGTAACGCCTGGTTTACTSEQIDNO.:35鼠CTB007重鏈可變區(qū)氨基酸序列在下文的表60中顯示,表60.鼠CTB007重鏈可變區(qū)氨基酸序列l(wèi)EVQLQQSGAELVKPGASVK21SCTASGFNIKDTYMHWVKQR41PEQGLEWIGRIDPANGNTKY61DPKFOGKATITADTSSNTAY81LQLSSLTSEDTAVYYCAYYY101VSNAWFTSEQIDNO.:36鼠的CTB007重鏈可變區(qū)核酸和氨基酸序列在下文的表61中顯示'表61.鼠CTB007重鏈可變區(qū)核酸和氨基酸序列1GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTG1EVQLQQSGAELVKPGASVKL61TCCTGCACAGCTTCGGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGG21SCTASGFNIKDTYMHWVKQR121CCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATAT41PEC!GLEWIGRIDPANGNTKY181GACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTAC61DPKF(JGKATITADTSSNTAY241CTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCCTATTACTAC81L(!LSSLTSEDTAVYYCAYYY301GTTAGTAACGCCTGGTTTACTSEQIDNO.:35101VSNAWFTSE()IDNO.:36鼠CTB007重鏈CDRl氨基酸序列在下文的表62中顯示,表62.鼠CTB007重鏈CDRl氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table>SEQIDNO.:38鼠CTB007重鏈CDR3氨基酸序列在下文的表64中顯示。表64.鼠CTB007重鏈CDR3氨基酸序列YYVSNAWFTSEQIDNO.:39人類嵌合CTB007輕鏈核酸序列在下文的表65中顯示。_表65.人類嵌合CTB007輕鏈核酸序列1ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGT61GACATCCAGATGACCCAATCTCCAGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCACC181241301GAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGGGTACTTGGACGTTCGGTGGAGGC361ACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGTGGCTGCACCATCTGTCGATATCTTCCCGCCATCT421GATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCC481AGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAG541AGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTG601AGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTTACCCATCAGGGCCTG661AGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGASEQIDNO.:40人類嵌合CTB007輕鏈氨基酸序列在下文的表66中顯示。表66.人類嵌合CTB007輕鏈氨基酸序歹'j1MRPAQGMwVSGSSG21DIQMTQSPASLSVsVGETVT41ITCRAsENIYSNEWYQQKQ61GKSPQVYAATNADGVPs81RFSGSGSGTQYSKINSLQs101EDFGsYYCQHFWGTWTFGGG121TKEIKRAVAAPSVDIFPPS141DEQKSGTASVVCLNNFYP161REAKVQWKVDNALQSGNSQE181SV丁EQDsKDSTYSSSTLT201SKADYEKHKVYACEVTH(JG221SSPVTK.SFNRGEC承SEQIDNO.:41人類嵌合CTB007輕鏈核酸和氨基酸序列在下文的表67中顯示。表67.人類嵌合CTB007輕鏈核酸和氨基酸序列1ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGT1MRLPA(JLLGLLMLWVSGSSG61GACATCCAGATGACCCAATCTCCAGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCACC21DIdMTQSPASLSVSVGETVT41ITCRASENIYSNLEWYQQKQ134<table>tableseeoriginaldocumentpage135</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage136</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage137</column></row><table>1381AGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGASEQIDNO.:42461SLSLSPGK*SE(JIDNO.:43實(shí)施例20.CTB003和hCTB003識別的表位的分析要理解的是，對于本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑(例如CTB003和hCTB003)識別的共同的表位，可以進(jìn)一步分析其氨基酸序列VXDCTPWSDIECVHKE(SEQIDNO:44)的亞區(qū)(片段)或同源物，上述序列中，X如本文規(guī)定的是K或G，當(dāng)其被本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑結(jié)合時可以在體內(nèi)或體外系統(tǒng)的表達(dá)TRAIL-R1和/或TRAIL-R2受體多肽的細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞(例如癌細(xì)胞)凋亡。通過本領(lǐng)域已知的方法制備選擇候選肽(selectcandidatepeptides)，它們是氨基酸序列VXDCTPWSDIECVHKE(SEQIDNO:44)的片段或同源物。在如下所述的竟?fàn)幮訣LISA中測試這些候選物肽抑制TRAIL受體結(jié)合劑結(jié)合TRAIL受體(例如TRAIL-R1和TRAIL-R2)的能力。竟?fàn)幮砸种艵LISAELISA平板用含1昭/mlTRAIL-R1或TRAIL-R2-Fc融合蛋白的PBS在4。C包被過夜。用PBS洗滌三次之后，用3。/。BSAPBS在室溫下封閉平板1小時。將1pg/ml的CTB003或hCTB003(TRAIL受體結(jié)合劑)分別與各種濃度的候選物肽一起添加，在37。C經(jīng)過1小時。通過用PBS洗滌三次來除去未結(jié)合的TRAIL受體結(jié)合劑，然后在37。C添加HRP綴合的山羊抗小鼠IgGl,經(jīng)過30分鐘。用PBS洗滌三次之后，添加TMB底物緩沖液，經(jīng)過10分鐘，然后通過添加2NH2S04終止反應(yīng)。在ELISA酶標(biāo)儀中使用450nm7650nm的雙波長記錄光密度的值。以不存在候選肽的情況下的OD值作為CTB003(或hCTB003;TRAIL受體結(jié)合劑))對TRAIL-R1或TRAIL-R2的最大結(jié)合。各種濃度的候選肽對CTB003與TRAIL-R2的結(jié)合的竟?fàn)幮砸种朴嬎銥橄鄬ψ畲蠼Y(jié)合的百分比。結(jié)果和解釋如果候選肽以濃度依賴性方式抑制TRAIL受體結(jié)合劑與TRAIL-R1和TRAIL受體結(jié)合劑與TRAIL-R2兩者的結(jié)合，則該候選肽代表了TRAIL受體結(jié)合劑(例如CTB003或hCTB003)所共同識別的區(qū)域。此外，可以將候選序列作為靶標(biāo)來產(chǎn)生抗性抗體，以誘導(dǎo)表達(dá)TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的138癌細(xì)胞的凋亡。進(jìn)一步的，可以在本發(fā)明的體外和體內(nèi)模型中測試該候選肽來確定所述候選肽是否能夠抑制TRAIL受體結(jié)合劑介導(dǎo)的細(xì)胞生長(例如腫瘤生長)抑制。實(shí)施例21.CTB003對差異表達(dá)TRAIL-R1和TRAIL-R2的腫瘤細(xì)胞的CTB003的結(jié)合和凋亡誘導(dǎo)活性腫瘤細(xì)胞可能以不同的水平表達(dá)細(xì)胞表面TRAIL-R1和TRAIL-R2，因而，針對TRAIL-R1或TRAIL-R2的單特異性抗體單獨(dú)施用時，可能無法結(jié)合所有的腫瘤細(xì)胞并誘導(dǎo)其凋亡。為了確定CTB003是否具有比單特異性TRAIL-R1或TRAIL-R2抗體更廣泛的結(jié)合和凋亡誘導(dǎo)活性，在兩個代表性的細(xì)胞系人類T白血病細(xì)胞和人類B淋巴瘤細(xì)胞中進(jìn)行了研究。人類T白血病細(xì)胞(Jurkat)僅表達(dá)TRAIL-R2而不表達(dá)TRAIL-R1。人類B淋巴瘤細(xì)胞(Ramos)表達(dá)高水平的TRAIL-R1，但表達(dá)低水平的TRAIL-R2。它們還展現(xiàn)對TRAIL-R1或TRAIL-R2單特異性抗體誘導(dǎo)的凋亡的不同的敏感性。CTB003的細(xì)胞表面結(jié)合的流式細(xì)胞分析從細(xì)胞培養(yǎng)基中收集lxl(^個單細(xì)胞，用FACS緩沖液(含有5°/。FCS，0.1%NaN3,pH7.4的PBS)洗滌兩次。用20jil的10嗎/mlCTB003、CTB006或CTB007在冰上溫育細(xì)胞30分鐘。用1mLFACS緩沖液洗滌兩次之后，將細(xì)胞進(jìn)一步與PE綴合的山羊抗小鼠IgGl抗體在水上溫育30分鐘。用1mlFACS緩沖液洗滌兩次之后，將細(xì)胞重懸浮在0.5ml的FACS緩沖液中，通過FACScan流式細(xì)胞計分析10,000個活細(xì)胞。ATPLite分析來測定細(xì)胞活力在96孔平板中，將每孔l，OOO個目標(biāo)細(xì)胞在存在四種濃度(最高濃度1000ng/ml，最低濃度10ng/ml)的10倍稀釋的CTB003、CTB006或CTB007的情況下培養(yǎng)。在37。C培養(yǎng)16h之后，利用ATPLite試劑盒根據(jù)廠家的說明書(PackardInstruments,Meriden,Conn.)測定每個培養(yǎng)物的細(xì)胞活力添加50pl的細(xì)胞裂解緩沖液，然后添加50(il的底物緩沖液。將反應(yīng)物在發(fā)光讀數(shù)器中計數(shù)。細(xì)胞活力計算為(處理細(xì)胞的cmp/對照細(xì)胞的cmp)xlOO%。結(jié)果Jurkat細(xì)胞被CTB006而不是CTB007陽性染色(圖32,圖面A)，表明139Jurkat僅表達(dá)TRAIL-R2而不表達(dá)TRAIL-R1。雖然Jurkat細(xì)胞不表達(dá)TRAIL-R1,它們卻被CTB003等同地染色。相比之下，Ramos細(xì)胞被CTB007或CTB003強(qiáng)烈地染色，但僅被CTB006微弱地染色(圖32，圖面B),表明Ramos細(xì)胞主要地表達(dá)TRAIL-R1。這些結(jié)果表明，CTB003具有對腫瘤細(xì)胞表面的等同的結(jié)合能力，而與這些細(xì)胞的TRAIL-R1或TRAIL-R2的水平差異無關(guān)。Jurkat細(xì)胞對CTB006和CTB003誘導(dǎo)的凋亡的敏感性相似，但是在測試的抗體濃度范圍內(nèi)對CTB007完全無應(yīng)答(圖32，圖面C)。相比之下，Ramos細(xì)胞對于CTB006或CTB007誘導(dǎo)的凋亡不敏感(圖32，圖面D),但是對CTB003誘導(dǎo)的凋亡是相對敏感的。這些結(jié)果表明，CTB003能用來誘導(dǎo)僅差異地表達(dá)一種類型的死亡受體的腫瘤細(xì)^9包的凋亡。因而，結(jié)合TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑(例如CTB003或hCTB003),與僅結(jié)合TRAIL-R1或TRAIL-R2的試劑相比，在癌癥患者的治療中具有更大的臨床利用的優(yōu)勢，因為患者的原發(fā)肺瘤細(xì)胞中TRAIL受體的表達(dá)和功能預(yù)計將會有很大的變異。等同物本發(fā)明不被本申請中描述的具體實(shí)施方式所限制，這些實(shí)施方式是為了單獨(dú)地例示本發(fā)明的個別方面而提供的?？梢赃M(jìn)行對本發(fā)明的許多修改和變化而不背離它的精神和范圍，這對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。除了在此列舉的那些，在本發(fā)明的范圍內(nèi)的功能等效方法和設(shè)備根據(jù)以上的描述對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。這些修飾和變化意圖落入附隨的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本發(fā)明將僅由附隨的權(quán)利要求的用語、以及這些權(quán)利要求聲明的等同物的完整范圍來限制。要理解的是，本發(fā)明不限于特定的方法、試劑、化合物組成或生物系統(tǒng)，這些理所當(dāng)然是可以變化的。還需要理解的是，在此使用的專有名詞僅是用于描述本發(fā)明的特定實(shí)施方式的目的，不意味著限制本發(fā)明。140權(quán)利要求1.一種結(jié)合TRAIL受體1(TRAIL-R1)和TRAIL受體2(TRAIL-R2)的抗體，其中所述抗體以其可溶形式在低濃度下在表達(dá)TRAIL-R1或TRAIL-R2多肽的癌細(xì)胞中具有體內(nèi)和體外的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性。2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體結(jié)合在至少一個細(xì)胞的表面表達(dá)的TRAIL受體1(TRAIL-R1)多肽和TRAIL受體2(TRAIL-R2)多肽。3.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體結(jié)合TRAIL受體1(TRAIL-R1)多肽和TRAIL受體2(TRAIL-R2)多肽之間具有至少約90%的氨基酸同源性的多肽區(qū)域。4.根據(jù)權(quán)利要求3的抗體，其中所述區(qū)域包含氨基酸序列VXDCTPWSD正CVHKE(SEQIDNO:44),其中X是K或G,并且能夠誘導(dǎo)具有TRAIL-R1和TRAIL-R2受體的細(xì)胞的細(xì)胞死亡。5.—種抗體，其具有與CGMCC登錄號1665的小鼠-小鼠雜交瘤CTB003所產(chǎn)生抗體相同的表位特異性。6.—種抗體或其抗原結(jié)合片段，至少包含HITMVVGPFA(SEQIDNO:11)的重鏈CDR3氨基酸序列或具有一個或多個保守性氨基酸替換的該序列，其中所述抗體或其片段結(jié)合TRAIL受體1(TRAIL-R1)和TRAIL受體2(TRAIL-R2),并在表達(dá)TRAIL-R1和TRAIL-R2的癌細(xì)胞中具有體內(nèi)和體外的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何抗體或抗原結(jié)合片段，其與癌癥治療劑綴合，其中所述治療劑優(yōu)選地選自由腫瘤活化的前體藥物、放射性核素、化療藥物和毒素構(gòu)成的組。8.—種分離的核酸，其編碼權(quán)利要求1-6的任一項的抗體。9.一種宿主細(xì)胞或載體，其包含權(quán)利要求8的分離的核酸。10.—種組合物，其包含權(quán)利要求1-7的任一項的抗體和藥學(xué)上可接受的載體。11.一種用于治療癌癥的商業(yè)試劑盒，其在容器中包含權(quán)利要求1-7的任一項的抗體，所述商業(yè)試劑盒進(jìn)一步包含用于治療癌癥的化療劑和癌癥治療抗體，其中所述化療劑和癌癥治療抗體任選地置于分別的容器中。12.—種TRAIL-Rl和TRAIL-R2的表位，包含氨基酸序列VXDCTPWSD正CVHKE(SEQIDNO:44),其中X是K或G，并且該表位被這樣的抗體所識別，所述抗體能夠結(jié)合TRAIL-R1和TRAIL-R2，并能夠誘導(dǎo)具有TRAIL-R1和TRAIL-R2受體的細(xì)胞的細(xì)胞死亡。13.—種通過制備含有權(quán)利要求12的所述表位的免疫原而產(chǎn)生的抗體。14.權(quán)利要求1-7和權(quán)利要求10的任一項的抗體在制備用于在表達(dá)TRAIL-R1和TRAIL-R2的癌細(xì)胞中選擇性誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的藥物中的用途。15.權(quán)利要求1-7和權(quán)利要求10的任一項的抗體在制備用于在表達(dá)TRAIL-R1和TRAIL-R2的癌細(xì)胞中增強(qiáng)其他治療劑的抗癌活性的藥物中的用途，其中所述治療劑是化療劑，其中所述治療劑選自由博來霉素、卡鉑、瘤可寧、順鉑、秋水仙堿、環(huán)磷酰胺、柔紅霉素、放線菌素、己烯雌酚、阿霉素、鬼臼乙叉甙、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶脫氧核苷、美法侖、氨曱蝶呤、絲裂霉素C、巰嘌呤、紫杉醇、鬼臼噻吩甙、6-硫代鳥嘌呤、長春新堿和長春石威構(gòu)成的纟且。16.藥學(xué)有效量的權(quán)利要求l-7和權(quán)利要求10的任一項的抗體用于制備治療癌癥的藥物的用途，其中所述藥學(xué)有效量的抗體選擇性地誘導(dǎo)表達(dá)TRAIL-R1和TRAIL-R2多肽的癌細(xì)胞的細(xì)胞死亡。17.藥學(xué)有效量的權(quán)利要求1-7的任一項的抗體作為藥物的用途。18.—種在有需要的受試者中選擇性地誘導(dǎo)表達(dá)TRAIL-R1和TRAIL-R2多肽的細(xì)胞的細(xì)胞死亡的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的權(quán)利要求l-7任一項的抗體，從而選擇性地誘導(dǎo)表達(dá)TRAIL-R1和TRAIL-R2多肽的細(xì)胞的細(xì)胞死亡。19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述表達(dá)TRAIL-R1和TRAIL-R2多肽的細(xì)胞是癌細(xì)胞。20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述癌細(xì)胞選自由乳腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞和結(jié)腸直腸癌細(xì)胞構(gòu)成的組。全文摘要本發(fā)明一般涉及TRAIL受體結(jié)合劑的制備和其用途。特別地，本發(fā)明涉及抗TRAIL受體抗體的制備，所述述抗體識別TRAIL-R1和TRAIL-R2受體共有的共同抗原決定簇(即，表位)，以及它們用于TRAIL受體檢測和TRAIL受體介導(dǎo)的功能的調(diào)節(jié)的用途。TRAIL受體結(jié)合劑對于在人類癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是有用的。這些靶標(biāo)可以表達(dá)TRAIL-R1或TRAIL-R2之一或二者。本發(fā)明提供了本發(fā)明的TRAIL受體結(jié)合劑在癌癥治療中的用途。文檔編號C07K16/18GK101479296SQ200780024115公開日2009年7月8日申請日期2007年4月29日優(yōu)先權(quán)日2006年4月30日發(fā)明者征余,敏周,揚(yáng)宋,沈恩允,賈冼釗申請人:北京同為時代生物技術(shù)有限公司