專利名稱：5’-修飾的雙環(huán)核酸類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了 5，-修飾的雙環(huán)核苷及由其制備的低聚化合物和組合物。 更具體地，本發(fā)明提供了與位于5'位的其它基團(tuán)形成2'-0-CH2-4'橋的核苷， 以及由其制備的低聚體或組合物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該5'-基團(tuán)具有可 形成f^或〖》異構(gòu)體的特定構(gòu)型。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的低聚化合物 和組合物與目標(biāo)RNA的一部分雜交以使該目標(biāo)RNA喪失正常功能。
背景技術(shù)：
反義技術(shù)是用于減少一種或多種特定基因產(chǎn)物表達(dá)的有效手段，因而 被證明在治療、診斷和研究應(yīng)用中具有獨(dú)特的用途?；瘜W(xué)修飾的核苷常用 于整合入反義序列中以增強(qiáng)一種或多種屬性，例如耐核酸酶屬性。該類化 學(xué)修飾的基團(tuán)包括雙環(huán)核脊，其中該核苷的呋喃糖部分包含了連接呋喃糖 上兩個(gè)原子而形成雙環(huán)環(huán)系統(tǒng)的橋。該種雙環(huán)核苷具有各種名稱，如雙環(huán) 核酸或鎖核酸分別稱為BNA和LNA。已經(jīng)制備出了各種BNA，并在專利文獻(xiàn)和科技文獻(xiàn)中有報(bào)道，例如參
見Singh等人，Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin等人， Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt等人，Pro" Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar等人，Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Wengel等人，1998年9月14日提交的PCT國際申請 PCT/DK98/00303(1999年3月25日公開為WO 99/14226); Singh等人,J. Org. Chem.， 1998, 63, 10035-10039，各文獻(xiàn)的全文在此引用作為參考。已授權(quán)的 美國專利和公開的申請的范例包括，例如美國專利6,770,748、 6,268,490和 6,794,499以及公開的美國申請20040219565、 20040014959、 20030207841、 20040192918、 20030224377、 20040143114、 20030087230和20030082807， 各文獻(xiàn)的全文在此引用作為參考。
已經(jīng)制備出了各種5，-修飾的核苷，并在專利文獻(xiàn)和科技文獻(xiàn)中有報(bào)道， 例如參見Mikhailov等人，Nucleosides and Nucleotides, 1991， 10, 393-343; Saha等人，J. Org. Chem.， 1995， 60, 788-789; Beigleman等人,Nucleosides and Nucleotides, 1995， 14, 901-905; Wang, 等人，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1999， 9, 885-890;以及1994年10月13日公開的PCT國 際申請WO 94/22890 ，各文獻(xiàn)的全文在此引用作為參考。
因此，對通過反義機(jī)制特異性地調(diào)節(jié)基因表達(dá)的藥劑仍有著長期未能 滿足的需求。此處公開的5'-修飾的BNA和由其制備得到的反義化合物可 用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)途徑，包括依賴于RNaseH、 RNAi和dsRNA酶等作用機(jī) 制，以及基于目標(biāo)降解或目標(biāo)占用的其它反義機(jī)制的調(diào)節(jié)基因表達(dá)途徑。 本領(lǐng)域的技術(shù)人員在獲知本公開后將能夠在不進(jìn)行額外實(shí)驗(yàn)的情況下鑒 定、制備和開發(fā)用于這些用途的反義化合物。發(fā)明概述
本發(fā)明才是供了具有下式的雙環(huán)核苷:
1
O
:、
i
T2
其中
Bx是雜環(huán)堿基部分；
T！和T2之一為H或羥基保護(hù)基團(tuán)，而1和T2的另 一個(gè)為H、羥基保 護(hù)基團(tuán)或反應(yīng)性磷基團(tuán)；
Z是C廣C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C廣C6烷基、取代的
CrC6烯基、取代的CrC6炔基或取代的酰基(-C(O)-);
其中各個(gè)取代的基團(tuán)被獨(dú)立選自卣素、C廣C6烷基、取代的C廣C6烷基、 C2-Q烯基、取代的C2-Qs烯基、CVC6炔基、取代的C2-C6炔基、OJ!、 S J、、
NJJ2 、 N3 、 COOL 、 CN 、 0陽C(O)NJ山、N(H)C^NH)NR,R2或 N(H)C(=X)N(H)J2的取代基團(tuán)單取代或多取代，其中X為O或S;且
J和J2各自獨(dú)立為H、 C廣C6烷基、取代的C廣C6烷基、C2-C6烯基、取
代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基、C廣C6氨烷基、取代的C!-C6 氨烷基或保護(hù)基團(tuán)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，Z是取代的C廣C6烷基。在另一實(shí)施方式中，Z是 取代的亞甲基，其中優(yōu)選的取代基團(tuán)包括一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立選自F、 NJ山、
13N3、 CN、 OJi、 SJb 0腸C(二0)NJJ2、 N(H)C^NH)NJ山或N(H)C(0)N(H)J2
的基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方式中，Ji和J2各自獨(dú)立為H或Q-C6烷基。
在一個(gè)實(shí)施方式中，z是甲基、乙基或甲氧基甲基。在另一實(shí)施方式中， Z是甲基。在另一實(shí)施方式中，Z是乙烯基。在另一實(shí)施方式中，Z是fL代 的?；Ｔ诹硪粚?shí)施方式中，Z是C(二0)NJ,J2。
在一個(gè)實(shí)施方式中，T!和T2中至少一個(gè)是羥基保護(hù)基團(tuán)，其中羥基保 護(hù)基團(tuán)的優(yōu)選列表包括乙?；?、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四 氫吡喃基、1-乙氧基乙基、l-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基甲硅烷乙基、對 氯苯基、2，4-二硝基苯基、千基、苯甲?；?、對苯基苯甲?；?、2,6-二氯千 基、二苯基甲基、對硝基千基、三苯基甲基(三苯甲基)、4,4'-二甲氧三苯甲 基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基 二苯基甲硅烷基、三苯甲硅烷基、三異丙基甲硅烷基、苯甲?；姿狨ァ?氯乙?；⑷纫阴；⑷阴；⑿挛祯；?-芴基甲;&^炭酸脂、甲磺 酸鹽、甲苯磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲 氧三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、9-苯基黃嘌呤-9-基(Pixyl)以及9-(對甲氧 基苯基)黃噤呤-9-基(MOX)。更優(yōu)選的羥基保護(hù)基團(tuán)的列表包括乙?；⑶?基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基以及4,4'-二甲氧三苯 甲基。
在一個(gè)實(shí)施方式中，丁2是反應(yīng)性磷基團(tuán)，其中反應(yīng)性磷基團(tuán)的優(yōu)選列 表包括二異丙基氰基乙氧基亞磷酰胺和H-膦酸酯。
在一個(gè)實(shí)施方式中，T2是二異丙基氰基乙氧基亞磷酰胺而T!是4,4'-二 甲氧三苯甲基。
在一種實(shí)施方式中，該Z基團(tuán)呈f7 ,構(gòu)型在一個(gè)實(shí)施方式中，該Z基團(tuán)呈P入構(gòu)型:
O
i
丁2
本發(fā)明還提供了具有至少 一個(gè)下式單體的低聚化合物:
其中
Bx是雜環(huán)>喊基部分；
T3為H，幾基保護(hù)基團(tuán)，連接的共軛基團(tuán)或與核苷、核苷酸、寡核苷、 寡核苷酸、單體亞基或低聚化合物連接的核苷間連接基團(tuán)；
T4為H，羥基保護(hù)基團(tuán)，連接的共軛基團(tuán)或與核苷、核苷酸、寡核苷、 寡核普酸、單體亞基或低聚化合物連接的核苷間連接基團(tuán)；
15Z是C廣C6烷基、C2-Cs烯基、CVC6炔基、取代的C廣C6烷基、取代的
C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基或取代的酰基(《(=0)-);
其中各個(gè)取代的基團(tuán)被獨(dú)立選自卣素、C廣C6烷基、取代的C廣C6烷基、
C2-C6烯基、取代的CVC6烯基、CVC6炔基、取代的C2-C6炔基、OJ" SJ^
NJJ2 、 N3 、 COOJ! 、 CN 、 0隱C(二0)NJ]J2 、 N(H)C(二NH)NR,R2或 N(H)C(=X)N(H)J2的取代基團(tuán)單取代或多取代，其中X為O或S;
J,和J2各自獨(dú)立為H、 C廣Q烷基、取代的C廣C6烷基、C2-C6烯基、取
代的CrC6烯基、CrC6炔基、取代的C2-C6炔基、d-C6氨烷基、取代的C廣C6 氨烷基或保護(hù)基團(tuán)；且
其中T3和T4中的至少一個(gè)為與核苷、核苷酸、寡核苷、寡核苷酸、單 體亞基或低聚化合物連接的核普間連接基團(tuán)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，Z是取代的C廣C6烷基。在另一實(shí)施方式中，Z是 取代的亞甲基，其中優(yōu)選的取代基團(tuán)包括一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立選自F、 NJ山、 N3、 CN、 OJi、 SJ,、 0-C^O)NJj2、 N(H)C(二NH)NJiJ2或N(H)C(0)N(H)J2
的基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方式中，J!和J2各自獨(dú)立為H或d-C6烷基。
在一個(gè)實(shí)施方式中，Z是甲基、乙基或甲氧基甲基。在另 一實(shí)施方式中，
Z是甲基。在另一實(shí)施方式中，Z是乙烯基。在另一實(shí)施方式中，Z是取代 的?；?。在另一實(shí)施方式中，Z是C(二0)NJ口2。
在一種實(shí)施方式中，T3是H或幾基保護(hù)基團(tuán)。在另一實(shí)施方式中T3 是與核苷、核苷酸或單體亞基連接的核苷間連接基團(tuán)。在進(jìn)一步的實(shí)施方 式中T3是與寡核苷或寡核苷酸連接的核苷間連接基團(tuán)。在另一實(shí)施方式中 T3是與低聚化合物連接的核苷間連接基團(tuán)。在一種實(shí)施方式中，T4是H或幾基保護(hù)基團(tuán)。在另一實(shí)施方式中T4 是與核苷、核苷酸或單體亞基連接的核苷間連接基團(tuán)。在進(jìn)一步的實(shí)施方 式中T4是與寡核普或寡核苷酸連接的核苷間連接基團(tuán)。在另一實(shí)施方式中
T4是與低聚化合物連接的核苷間連接基團(tuán)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了具有至少一個(gè)單體的低聚化合物，其中該Z
基團(tuán)呈(i )構(gòu)型
T3
在一個(gè)實(shí)施方式中 基團(tuán)呈(5)構(gòu)型
提供了具有至少一個(gè)單體的低聚化合物，其中該Z
<formula>formula see original document page 17</formula>
在一個(gè)實(shí)施方式中T3和T4中的至少 一個(gè)包含選自磷酸二酯或硫代磷酸 酯的核普間連接基團(tuán)。在另一實(shí)施方式中，該低聚化合物中的各核苷間連 接基團(tuán)分別獨(dú)立為磷酸二酯或硫代磷酸酯。
在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了具有至少一個(gè)由至少兩個(gè)相鄰的本發(fā)明的 5，-取代的雙環(huán)核苷單體形成的區(qū)域的低聚化合物。在另一實(shí)施方式中，提供了具有至少兩個(gè)由至少兩個(gè)相鄰的本發(fā)明的5'-耳又代的雙環(huán)核苷單體形成 的區(qū)域的低聚化合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，提供了具有至少兩個(gè)分離 的由至少兩個(gè)相鄰的本發(fā)明的5'-取代的雙環(huán)核苷單體形成的區(qū)域的低聚化 合物，其組成帶間隙的低聚化合物。
在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了包含長度約8至約40個(gè)核苷和/或修飾的核
普或類似物的低聚化合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，低聚化合物包含長度
約8至約20個(gè)核苷和/或修飾的核香或類似物。在更進(jìn)一步的實(shí)施方式中， 低聚化合物包含長度約10至約16個(gè)核苷和/或修飾的核苷或類似物。在另 一實(shí)施方式中，低聚化合物包含長度約10至約14個(gè)核脊和/或修飾的核苷 或類似物。
本發(fā)明還提供了抑制基因表達(dá)的方法，其包括將一種或多種細(xì)胞、組 織或動物與本發(fā)明的低聚化合物相接觸。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了 5，-修飾的雙環(huán)核苷及由其制備的低聚化合物。更具體地， 本發(fā)明才是供了具有5，-修飾的雙環(huán)呋喃核糖基糖部分的核苷(此處也稱為5，-修飾的雙環(huán)核普或5，-修飾的BNA)及由其制備的低聚體和組合物。在優(yōu)選 的實(shí)施方式中，修飾該5，位的基團(tuán)具有可形成f^或〖》手性的特定構(gòu)型。該 化合物還可以以IUPAC命名法進(jìn)行描述，例如該5'-CH3取^代的雙環(huán)核酸尿 嘧啶DMT亞磷酰胺可以命名為(li ,3/ ，4凡75)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基 氨基)-膦氧基]-1-[1-(&/ 或外消旋時(shí)沒有符號)-(4,4，-二甲氧三苯甲基)氧基-乙基]-3-(尿嘧啶-l-基)-2,5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(例如尿嘧啶DMT亞磷酰 胺)，其中該乙基的1號石友位置為(i )、 (5)或外消旋，且該顯示為尿嘧啶-l-基的雜環(huán)堿基可被此處所述的任意雜環(huán)堿基所取代。本發(fā)明的5，-修飾的 BNA可用于增強(qiáng)整合了它們的低聚化合物的目標(biāo)屬性。本發(fā)明的低聚化合 物還可用作診斷應(yīng)用中的引物和探針。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的5'-修飾的雙環(huán)核苷具有如下結(jié)構(gòu)
其中星號獨(dú)立地表示羥基、保護(hù)的鞋基、將該5，-修飾的雙環(huán)核苷連接 至單體或低聚體的核普間鍵合、反應(yīng)性磷基團(tuán)、任選連接的共軛基團(tuán)或者 此處討論的或可用于反義技術(shù)的其它基團(tuán)。
一方面，可通過在實(shí)施例部分闡述的方法中取代商業(yè)可獲得的(或合成 的)Grignard試劑來制備各種取代的(5'-Z)BNA。例如，參見實(shí)施例l，步驟 C，其中甲基溴化鎂被用作Grignard試劑以提供該5'-CH3-BNA類似物。還 可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的功能類似的碳同系化反應(yīng)導(dǎo)入取代基團(tuán)。硝 基甲烷的加成以及通過環(huán)氧化物的同系化描述于G.; Middleton, P. J. Tetrahedron Lett. 1996, 37, 2739-2742 (還可參見Wang等人，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1999, 9, 885-890;以及Saha等人，J. Org. Chem., 1995, 60, 788-789)中。此外，可在加成后利用適當(dāng)功能化的Grignard或其它 試劑以提供進(jìn)一步官能化的類似物。例如，使用烯丙基或乙烯基溴化鎂試 劑可以導(dǎo)入雙鍵，其可被功能化為許多的不同基團(tuán)，包括例如鹵甲基、甲 氧基甲基、適當(dāng)保護(hù)的羥基甲基、氨基甲基以及各種其它官能團(tuán)功能化。在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明的5'-修飾的雙環(huán)核苷可用于在一個(gè)或多個(gè) 位置修飾未經(jīng)修飾的低聚化合物。該種修飾的低聚化合物可描述為具有特 定的基序?？稍诒景l(fā)明中使用的基序包括但不限于帶間隙的基序、半修飾
(hemimer)基序、阻斷修飾(blockmer)基序、全修飾基序、定點(diǎn)修飾基序以及 交替基序。結(jié)合這些基序還可采用多種接頭，包括但不限于單用或聯(lián)合使 用磷酸二酯和硫代磷酸酯鍵合。6-修飾的雙環(huán)核苷的定位和連接策略的使用 可簡單地優(yōu)化，以提供針對特定耙標(biāo)形成的最佳活性。
教導(dǎo)了代表性基序的制備的代表性美國專利包括但不限于5,013,830、 5,149,797、 5,220,007、 5,256,775、 5,366,878、 5,403,711 、 5,491,133、 5,565,350、 5,623,065、 5,652,355、 5,652,356;以及5,700,922，其中的某些與本申請被共 同擁有，其全文分別在此引用作為參考。基序在2005年6月2日提交并于 2005年12月22日公開為WO 2005/121371的國際申請PCT/US2005/019219 以及于2005年6月2日提交并于2005年12月22日公開為WO 2005/121372 的PCT/US2005/019220中也有公開，其全文分別在此引用作為參考。
術(shù)語"穩(wěn)定的化合物"和"穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)"指具有足夠穩(wěn)固性而可從反應(yīng)混 合物分離至有用的純度，并制成有效的治療劑的化合物。此處僅涉及穩(wěn)定 的化合物。
此處描述的化合物內(nèi)選定的取代基團(tuán)以遞歸度表示。上下文中的"遞歸 取代基"指可以引用其本身的另 一 實(shí)例的取代基。由于該種取代基的遞歸 性，理論上，在任意給定權(quán)利要求中可出現(xiàn)大量取代基。醫(yī)藥化學(xué)和有機(jī) 化學(xué)的領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可理解該種取代基的總數(shù)受目標(biāo)化合物的預(yù)期 屬性的合理限制。該種屬性包括例如但不限于分子量、溶解性或logP等 物理屬性，針對目標(biāo)把標(biāo)的活性等應(yīng)用屬性，以及合成容易度等實(shí)施屬性。遞歸取代基為本發(fā)明的目標(biāo)方面。醫(yī)藥和有機(jī)化學(xué)的普通技術(shù)人員可 以理解該種取代基的多功能性。根據(jù)在本發(fā)明的權(quán)利要求所示的遞歸取代 基的程度，可根據(jù)上文所述確定其總數(shù)。
此處所用的術(shù)語"取代基"和"取代基團(tuán)"包括通常加成至其它基團(tuán)或母 體化合物以增強(qiáng)目標(biāo)屬性或產(chǎn)生目標(biāo)效果的基團(tuán)。取代基團(tuán)可以是保護(hù)或 未保護(hù)的，并可加成至母體化合物的一個(gè)或多個(gè)可用位點(diǎn)。取代基團(tuán)還可 進(jìn)一步被其它取代基團(tuán)所取代并且可以直接或通過連接基團(tuán)(例如烷基或烴 基基團(tuán))連接至母體化合物。該種基團(tuán)包括但不限于卣素、羥基、烷基、 烯基、炔基、?；?-C(O)Raa)、羧基(-C(O)O-Raa)、脂肪族基團(tuán)、脂環(huán)族基團(tuán)、 烷氧基、取代的氧基(-O-Raa)、芳基、芳烷基、雜環(huán)、雜芳基、雜芳基烷基、
氨基(-NRbbIU、亞氨基^NRbb)、酰氨基(-C(O)N-RbbRcc或-N(Rbb)C(O)Raa)、 疊氮基(-N3)、硝基(-N02)、氰基(-CN)、脲基(-OC(O)NRbbRcc或 -N(Rbb)C(O)ORaa)、脲基(-N(Rbb)C(O)NRbbRcc)、硫脲基(-N(Rbb)C(S)NRbbRcc)、 胍基(-N(Rbb)C^NRbb)NRbbRce)、 脒基(-C^NRbb)NRbbR^ 或 -N(Rbb)C(NRbb)Raa)、硫醇(-SRbb)、亞磺酰(-S(O)Rbb)、磺酰(-S(0)2Rbb)、磺胺 基(-S(0)2NRbbRcc或-N(Rbb)-S(0)2Rbb)以及共軛基團(tuán)。其中R肌、Rbb和Rcc分 別獨(dú)立為H，任選連接的化學(xué)官能團(tuán)或具有包括但不限于H、烷基、烯基、 炔基、脂肪族、烷氧基、?；?、芳基、芳烷基、雜芳基、脂環(huán)族、雜環(huán)和 雜芳基烷基的其它取代基團(tuán)。
連接基團(tuán)或雙功能連接部分，如本領(lǐng)所知的那些連接基團(tuán)或雙功能連 接部分可使用于本發(fā)明。連接基團(tuán)可用于將化學(xué)官能團(tuán)、共軛基團(tuán)、報(bào)道 基團(tuán)和其它基團(tuán)連接至母化合物的選定位點(diǎn)。 一般而言，雙功能連接部分 包含具有兩個(gè)官能團(tuán)的烴部分。所選的官能團(tuán)之一結(jié)合母體分子或目標(biāo)化200 合物而所選的另 一基團(tuán)基本結(jié)合任意選定的基團(tuán)，例如化學(xué)官能團(tuán)或共軛 基團(tuán)。在一些實(shí)施方式中，該接頭包含鏈結(jié)構(gòu)或重復(fù)單元如乙二醇或氨基 酸單元的寡聚體。在雙功能連接部分中常用的官能團(tuán)的范例包括但不限于 用于與親核基團(tuán)反應(yīng)的親電子試劑以及用于與親電子反應(yīng)的親核試劑。在 一些實(shí)施方式中，雙功能連接部分包括氨基、羥基、羧酸、硫醇、不飽和 鍵(例如，雙或三鍵)等。雙功能連接部分的部分非限制性范例包括8-氨基
-3,6-二氧雜辛酸(八00)，琥珀酰亞胺4-[N-甲基馬來酸]-l-羧環(huán)己烷(SMCC) 以及6-氨基己酸(AHEX或AHA)。其它的連接基團(tuán)包括但不限于取代的 CVdo烷基、取代的或未取代的C2-do烯基或取代的或未取代的C2-do炔基， 其中優(yōu)選取代基團(tuán)的非限制性列表包括羥基、氨基、烷氧基、羧基、苯甲 基、苯基、硝基、石克醇、辟J克氧基、卣素、烷基、芳基、燁基以及炔基。
術(shù)語"烴基"包括包含C、 O、 H的基團(tuán)，包括具有任意飽和度的直鏈、 支鏈和環(huán)狀基團(tuán)。該種烴基基團(tuán)可包括一個(gè)或多個(gè)選自N、 O和S的雜原 子并可進(jìn)一步被一個(gè)或多個(gè)取代基團(tuán)單或多取代。
此處所用的術(shù)語"烷基，，指含有最多二十四個(gè)碳原子的飽和直鏈或支鏈 烴基。烷基基團(tuán)的范例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、異丙基、 正己基、辛基、癸基、十二烷基等。烷基基團(tuán)通常包含l至約24個(gè)碳原子， 更通常包含1至約12個(gè)碳原子(CVCu烷基)，更優(yōu)選包含1至約6個(gè)碳原 子。此處所用的術(shù)語"低級烷基"包含1至約6個(gè)碳原子。此處所用的烷基任 選包含一個(gè)或多個(gè)進(jìn)一步的耳又代基團(tuán)。
此處所用的術(shù)語"烯基"指含有最多二十四個(gè)碳原子并至少具有 一 個(gè)碳-碳雙鍵的直鏈或支鏈烴基。烯基基團(tuán)的范例包括但不限于乙烯基、丙烯 基、丁烯基、l-甲基-2-丁烯-l-基、1,3-丁二烯等二烯等。蜂基基團(tuán)通常包含
222至約24個(gè)碳原子，更通常包含2至約12個(gè)碳原子，更優(yōu)選包含2至約6 個(gè)^5友原子。此處所用的烯基任選地包含一個(gè)或多個(gè)進(jìn)一步的取代基團(tuán)。
此處所用的術(shù)語"炔基"指含有最多二十四個(gè)碳原子并至少具有 一 個(gè)碳-碳三鍵的直鏈或支鏈烴基。炔基基團(tuán)的范例包括但不限于乙炔基、1-丙炔 基、l-丁炔基等。炔基基團(tuán)通常包含2至約24個(gè)碳原子，更通常包含2至 約12個(gè)碳原子，更優(yōu)選包含2至約6個(gè)碳原子。此處所用的炔基任選地包 含一個(gè)或多個(gè)進(jìn)一步的耳又代基團(tuán)。
此處所用的術(shù)語"氨烷基"指氨基取代的烷基。該術(shù)語包括在任何位置具 有氨基取代基的CH^2烷基基團(tuán)，其中該烷基基團(tuán)將該氨烷基連接至母體 分子。氨烷基基團(tuán)的烷基和/或氨基部分可以用取代基團(tuán)進(jìn)一步取代。
此處所用的術(shù)語"脂肪族"指最多包含二十四個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烴 基，其中任意兩個(gè)碳原子之間的飽和度為單、雙或三鍵。脂肪族基團(tuán)優(yōu)選 包含1至約24個(gè)碳原子，更通常包含1至約12個(gè)碳原子，更優(yōu)選包含1 至約6個(gè)碳原子。脂肪族基團(tuán)的直鏈或支鏈可被包括氮、氧、疏和磷等一 個(gè)或多個(gè)雜原子所中斷。該種被雜原子中斷的脂肪族基團(tuán)包括但不限于聚 烷氧基，例如聚亞烷基二醇、聚胺和聚亞胺。此處所用的脂肪族基團(tuán)任選 地包括其它取代基團(tuán)。
術(shù)語"脂環(huán)族的"或"脂環(huán)基"指環(huán)狀的環(huán)系統(tǒng)，其中該環(huán)為脂肪族環(huán)。該 環(huán)系統(tǒng)可包含一個(gè)或多個(gè)環(huán)，其中至少一個(gè)環(huán)為脂肪族環(huán)。優(yōu)選的脂肪環(huán) 包括環(huán)中具有約5至約9個(gè)石友原子的環(huán)。此處所用的脂肪環(huán)任選地包括其 它取代基團(tuán)。
此處所用的術(shù)語"烷氧基"指在烷基基團(tuán)和氧原子之間形成的基團(tuán)，其中 該氧原子用于連接該烷氧基基團(tuán)和母體分子。烷氧基基團(tuán)的范例包括但不
23限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁 氧基、正戊氧基、新戊氧基、正己氧基等。此處所用的烷氧基團(tuán)任選地包 括其它取代基團(tuán)。
此處所用的術(shù)語"卣素"指選自氟、氯、溴和碘的原子。
此處所用的術(shù)i吾"芳基"指具有一個(gè)或多個(gè)芳環(huán)的單或多環(huán)碳環(huán)系統(tǒng)基。
示范性的芳基基團(tuán)包括但不限于苯基、萘基、四氫化萘基、茚滿基、茚 基等。優(yōu)選的芳基環(huán)系統(tǒng)在一個(gè)或多個(gè)環(huán)中具有約5至約20個(gè)碳原子。此 處所用的芳基基團(tuán)任選地包括其它取代基團(tuán)。
此處所用的術(shù)語"芳烷基"和"芳基烷基"指在烷基基團(tuán)和芳基基團(tuán)形成 的基團(tuán)，其中該烷基基團(tuán)用于連接該芳烷基基團(tuán)和母體分子。范例包括但 不限于千基、苯乙基等。此處所用的芳烷基基團(tuán)任選地包括與烷基、芳 基或兩者連接以形成基團(tuán)的取代基團(tuán)。
此處所用的術(shù)語"雜環(huán)基"指包含至少一個(gè)雜原子并且是不飽和、部分飽 和或完全飽和的單或多環(huán)的環(huán)系統(tǒng)，包括雜芳基基團(tuán)。雜環(huán)還包括稠環(huán)系 統(tǒng)，其中一種或多種稠環(huán)包含至少一個(gè)雜原子而其它環(huán)可包含一個(gè)或多個(gè) 雜原子或任選地不包含雜原子。雜環(huán)基團(tuán)通常包括至少一個(gè)選自疏、氮或 氧的原子。雜環(huán)基團(tuán)的范例包括[1,3]二氧戊環(huán)、吡咯烷基、吡唑，林基、吡 唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、噁唑烷基、異噁唑烷基、 嗎啉基、四氬瘞唑基、異四氫口塞唑基、p奎喔啉基、噠溱酮基、四氫呋喃基 等。此處所用的雜環(huán)基團(tuán)任選地包括其它取代基團(tuán)。
此處所用的術(shù)語"雜芳基"指包含單或多環(huán)芳香族環(huán)、環(huán)系統(tǒng)或稠環(huán)系統(tǒng) 的基團(tuán)，其中至少一個(gè)環(huán)為芳環(huán)且包含一個(gè)或多個(gè)雜原子。雜芳基還包括 稠環(huán)系統(tǒng)，包括其中一個(gè)或多個(gè)稠環(huán)不含有雜原子的系統(tǒng)。雜芳基基團(tuán)通
24常包括一個(gè)選自硫、氮或氧的環(huán)原子。雜芳基基團(tuán)的范例包括但不限于 P比咬基、吡"秦基、嘧咬基、吡P各基、吡唑基、。米唑基、，塞唑基、噪唑基、 異噁唑基、"塞二唑基、噁二唑基、苯石克基、咬喃基、四氫P奎P林基、異四氫 喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、喹喔啉基等。雜芳基基團(tuán)可直接或通 過脂肪族基團(tuán)或雜原子等連接部分連接至母體分子。此處所用的雜芳基基 團(tuán)任選地包括其它取代基團(tuán)。
此處所用的術(shù)語"雜芳基烷基"指具有可將雜芳基烷基基團(tuán)連接至母體
分子的烷基的如前文所定義的雜芳基基團(tuán)。范例包括但不限于吡啶甲基、 嘧啶乙基、萘啶丙基(napthyridinylpropyl)等。此處所用的雜芳基烷基基團(tuán)任 選地包括其它取代基團(tuán)。
本發(fā)明中采用的術(shù)語"單或多環(huán)結(jié)構(gòu)"包括具有稠和或連接的環(huán)的單或 多環(huán)環(huán)系統(tǒng)，并包括單獨(dú)選自脂肪族、脂環(huán)族、芳基、雜芳基、芳烷基、 芳基烷基、雜環(huán)、雜芳基、雜芳香基、雜芳基烷基的單獨(dú)和混合環(huán)系統(tǒng)。 該種單或多環(huán)結(jié)構(gòu)包含一致或變化的飽和度(包括完全飽和、部分包含或完 全不飽和)的環(huán)。各個(gè)環(huán)可包含形成雜環(huán)的選自C、 N、 O和S的環(huán)原子以 和僅含有以混合基序存在的C環(huán)原子的環(huán)，例如，苯并咪唑，其中一個(gè)環(huán) 僅具有石友環(huán)原子而該稠環(huán)具有兩個(gè)氮原子。單或多環(huán)結(jié)構(gòu)可進(jìn)一 步被取代
基團(tuán)取代，例如，具有連接至其中一個(gè)環(huán)的兩個(gè)=0的鄰苯二甲酰亞胺。在 其它方面，單或多環(huán)結(jié)構(gòu)可直接通過環(huán)原子、通過取代基團(tuán)或雙功能連接 部分連接母體分子。
此處所用的術(shù)語"?；?指從有機(jī)酸去除幾基基團(tuán)形成的并具有通式 -C(O)-X的基團(tuán)，其中X通常為脂肪族、脂環(huán)族或芳香族。范例包括脂肪 族羰基、芳香羰基、脂肪磺酰、芳香磺酰、脂肪族亞磺酰、芳香磷酸鹽、基基團(tuán)任選地包括其它取代基團(tuán)。術(shù)語"氧 基"指基團(tuán)(=0)。
此處所述的化合物(例如，5，-修飾的雙環(huán)核苷)可通過例如如下文實(shí)施例 所示的任意適用的有機(jī)合成技術(shù)來制備。眾多該類技術(shù)已為本領(lǐng)域公知。
然而，許多已知才支術(shù)在Compendium of Organic Synthetic Methods (John Wiley & Sons, New York) Vol. 1, Ian T. Harrison和Shuyen Harrison (1971); Vol. 2, Ian T. Harrison和Shuyen Harrison (1974》Vol. 3, Louis S. Hegedus禾口 Leroy Wade (1977); Vol. 4, Leroy G. Wade Jr., (1980); Vol. 5, Leroy G. Wade Jr. (1984);和Vol. 6, Michael B. Smith;以及March, J., Advanced Organic Chemistry, 3rd Edition, John Wiley & Sons, New York (1985》Comprehensive Organic Synthesis. Selectivity, Strategy & Efficiency in Modern Organic Chemistry, In 9 Volumes, Barry M. Trost,主編，Pergamon Press, New York (1993); Advanced Organic Chemistry, Part B: Reactions and Synthesis, 4th Ed.; Carey和Sundberg; Kluwer Academic/Plenum Publishers: New York (2001); Advanced Organic Chemistry, Reactions, Mechanisms, and Structure, 2nd Edition, March, McGraw Hill (1977); Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, 4th Edition, Greene, T.W.,和Wutz, P.G.M., John Wiley & Sons, New York (2007); 以及Comprehensive Organic Transformations, 2nd Edition, Larock， R.C., John Wiley & Sons, New York (1999)中有說明。
在本發(fā)明的一方面，低聚化合物可通過共價(jià)連接一個(gè)或多個(gè)共軛基團(tuán) 進(jìn)行修飾。 一般而言，共軛基團(tuán)修飾所連接的低聚化合物的一種或多種屬 性，包括但不限于藥效動力學(xué)、藥代動力學(xué)、結(jié)合、吸收、細(xì)胞分布、細(xì) 胞攝取、儲存和清除。共軛基團(tuán)常用于化學(xué)領(lǐng)域并直接或通過任選部分或
26連接基團(tuán)連接至母體化合物，如低聚化合物。共軛基團(tuán)的優(yōu)選列表包括但 不限于插入劑、報(bào)道分子、布洛芬等藥物基團(tuán)、聚胺、聚酰胺、聚乙蟑乙 二醇、^J逸、聚醚、膽固醇、石克膽固醇、膽酸部分、葉酸、脂、磷脂、生 物素、吩溱、菲啶、蒽醌、金剛烷、吖啶、熒光素、若丹明、香豆素和染 料。
此處所用的術(shù)語"保護(hù)基團(tuán)"指本領(lǐng)域中已知的在合成過程中保護(hù)反應(yīng) 性基團(tuán)，包括但不限于羥基、氨基和硫醇基團(tuán)以避免發(fā)生不需要的反應(yīng)的 可變化學(xué)部分。保護(hù)基團(tuán)通常可以選擇性地和/或正交地使用以在其它位點(diǎn) 的反應(yīng)中保護(hù)位點(diǎn)，并可隨后去除以留下未保護(hù)基團(tuán)或供進(jìn)一步反應(yīng)。本
4貞i或已知的^f呆護(hù)基團(tuán) 一般J也4苗述于Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, 4th Edition, Greene, T. W.,和Wutz, P.G.M., John Wiley & Sons, New York (2007)。
基團(tuán)可作為前體選擇性地結(jié)合至本發(fā)明的低聚化合物。例如，氨基基 團(tuán)可以作為疊氮基團(tuán)結(jié)合至本發(fā)明的化合物，該疊氮基團(tuán)可在合成的目標(biāo) 位點(diǎn)上化學(xué)轉(zhuǎn)化為氨基基團(tuán)。 一般來說，基團(tuán)可被保護(hù)或作為對反應(yīng)惰性 的前體存在，該反應(yīng)修飾母體分子其它部位的反應(yīng)以在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間轉(zhuǎn)化成 為其最終基團(tuán)。其它對代表性保護(hù)或前體基團(tuán)的討論參見Agrawal,等人, Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Eds, Humana Press; New Jersey, 1994; Vol. 26 pp. 1-72。
羥基保護(hù)基團(tuán)的范例包括但不限于叔丁基、叔丁氧基甲基、曱氧基 甲基、四氫吡喃基、1-乙氧基乙基、l-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基甲硅烷乙 基、對氯苯基、2,4-二硝基苯基、千基、2,6-二氯千基、二苯基甲基、對硝 基千基、雙(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、 2-三甲基甲硅烷乙基、三異丙基甲硅烷基、[(三異丙基甲硅烷基)氧基甲基(TOM)、單甲氧基三苯甲基、二
甲氧三苯甲基(DMT)、三甲氧基三苯甲基、l-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基 (FPMP)、 9-苯基黃噤呤-9-基(Pixyl)以及9-(對甲氧基苯基)黃噤呤-9-基 (MOX)、三苯基甲基(三苯甲基)、4，4'-二甲氧三苯甲基、三甲基甲硅烷基、 三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯 甲硅烷基、苯甲?；姿狨?、乙酸鹽、氯乙酸鹽、三氯乙酸鹽、三氟乙酸 鹽、新戊酸鹽(pivaloate)、苯酸鹽、對苯基苯酸酯、9-勞基甲基碳酸脂、甲 磺酸鹽以及甲苯磺酸鹽。其中優(yōu)選的羥基保護(hù)基團(tuán)包括但不限于千基、 2,6-二氯千基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、苯甲酰基、 甲磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、二甲氧三苯甲基(DMT)、 9-苯基黃嘌呤-9-基(Pixyl) 以及9-(對甲氧基苯基)黃噤呤-9-基(MOX)。
氨基保護(hù)基團(tuán)的范例包括但不限于氨基甲酸鹽保護(hù)基團(tuán)，例如2-三 甲基硅乙氧基羰基(Teoc)、 l-甲基-l-(4-二苯基基)-乙氧基羰基(Bpoc)、叔丁 氧基羰基(BOC)、烯丙氧基羰基(Alloc)、 9-苐基甲氧基羰基(Fmoc)、以及苯 甲氧基羰基(Cbz);酰胺保護(hù)基團(tuán)，例如甲?；⒁阴；?、三卣代乙?；?、 苯甲?；?、以及硝基苯乙酰基；磺酰胺保護(hù)基團(tuán)，例如2-硝基苯磺?；?； 以及亞胺和環(huán)狀酰亞胺保護(hù)基團(tuán)，例如苯二甲酰亞胺和二疏琥珀?；?。 硫醇保護(hù)基團(tuán)的范例包括但不限于三苯甲基(trityl)、苯甲基(Bn)等。 在部分優(yōu)選的實(shí)施方式中，可以通過用任選保護(hù)的含磷核苷間鍵合連 接核苷來制備低聚化合物。含磷核苷間鍵合(例如磷酸二酯和硫代磷酸酯鍵 合)的代表性保護(hù)基團(tuán)包括(3-氰乙基、二苯基硅乙基、S-氰丁歸基、氰對二 甲苯基(CPX)、 N-甲基-N-三氟乙酰乙基(META)、乙酰氧基苯氧基乙基(APE) 以及丁烯-4-基基團(tuán)。例如參見美國專利4,725,677以及Re. 34,069 ((3-氰乙基);
28Beaucage， S丄.和Iyer, R.P.， Tetrahedron, 49 No. 10， pp. 1925- 1963 (1993); Beaucage, S丄.和Iyer, R.P., Tetrahedron, 49 No. 46, pp. 10441-10488 (1993); Beaucage, S丄.和Iyer, R.P., Tetrahedron, 48 No. 12, pp. 2223-2311 (1992)。
此處所用的術(shù)語"正交地保護(hù)"指以不同類別的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的功能基 團(tuán)，其中各類別的保護(hù)基團(tuán)可以以任意順序并在所有其它類別存在的情況 下去除(例如，Barany, G.和Merrifield, R.B., J. Am. Chem. Soc, 1977, 99, 7363; idem, 1980, 102,3084.)。正交保護(hù)已在自動寡核香酸合成等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng) 用。功能基團(tuán)可在一種或多種不受去阻斷過程影響的其它保護(hù)功能基團(tuán)的 存在下被去阻斷。該去阻斷的功能基團(tuán)以某種形式反應(yīng)，在一些位點(diǎn)處其 它的正交保護(hù)基團(tuán)在不同的反應(yīng)條件組合下被去除。這允許采用選擇性化 學(xué)方法以產(chǎn)生目標(biāo)化合物或低聚化合物。
本發(fā)明提供了具有可用于形成核苷間鍵合(例如，例如磷酸二酯和硫代 磷酸酯核苷間鍵合)的反應(yīng)性磷基團(tuán)的化合物。該種反應(yīng)性磷基團(tuán)已為本領(lǐng) 域所知并包含處于P""l pv價(jià)態(tài)的磷原子，包括但不限于亞磷酰胺、H-膦 酸酯、磷酸三酯和含磷的手性助劑。優(yōu)選合成的固相合成采用亞磷酰胺(P111 化學(xué))作為反應(yīng)性亞磷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，中間體亞磷酸化合物隨后 通過已知的方法被氧化成pv狀態(tài)以獲得磷酸二酯或硫代磷酸酯核普酸間鍵 合。附加的活性磷酸鹽和亞磷酸披露于Tetrahedron Report Number 309 (Beaucage和Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223-2311)。
可用于本發(fā)明的低聚化合物的特定范例包括含有修飾的(例如，非天然 存在的)核香間鍵合的寡核苷酸。通過磷原子的存在或缺失可定義核苷間鍵 合的兩個(gè)主要類別。具有磷原子的修飾的核苷間鍵合包括但不限于疏代 磷酸酯，手性硫代磷酸酯，二疏代磷酸酯，磷酸三酯，氨烷基磷酸三酯，甲基和其它烷基磷酸酯包括3'-亞烴基磷酸酯、5'-亞烴基磷酸酯以及手性磷 酸酯，亞磷酸酯，磷酰胺包括3'-氨基磷酰胺和氨烷基磷酰胺，疏羰基磷酰 胺，硫羰基烷基磷酸酯，硫羰基烷基磷酸三酯，具有正常3'-5'鍵合的硒代
磷酸酯和硼代磷酸酯，其2'-5'連接的類似物，以及具有反轉(zhuǎn)極性的硒代磷 酸酯和硼代磷酸酯，其中一種或多種核苷酸間鍵合為3'至3'、 5'至5'或2'至 2'鍵合。具有反轉(zhuǎn)極性的寡核苷酸可在3'-最末端鍵合處包含單個(gè)3'至3'鍵 合，即可以是無堿基(核堿基缺失或該位置被羥基取代)的單個(gè)反轉(zhuǎn)核苷殘 基。包括多種鹽、混合鹽和游離酸的形式。
教導(dǎo)上迷含磷鍵合的代表性美國專利包括但不限于U.S.: 3,687,808、 4,469,863、 4,476,301、 5,023,243、 5,177,196、 5,188,897、 5,264,423、 5,276,019、 5,278,302、 5,286,717、 5,321,131、 5,399,676、 5,405,939、 5,453,496、 5,455,233、 5,466,677、 5,476,925、 5,519,126、 5,536,821、 5,541,306、 5,550,111、 5,563,253、 5,571,799、 5,587,361、 5,194,599、 5,565,555、 5,527,899、 5,721,218、 5，672，697 以及5,625,050，其中的一些與本申請被共同擁有，其全文分別在此引用作 為參考。
不具有磷原子的修飾的核普間鍵合包括但不限于由短鏈烷基或環(huán)烷 基核苷間鍵合，混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵合，或者一個(gè)或多個(gè)
短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵合構(gòu)成的核苷間鍵合。這包括具有硅氧烷骨架； 疏化物、亞砜和砜骨架；甲縮醛和石克甲縮醛骨架；亞甲基甲縮醛和疏甲縮 醛骨架；核糖乙酰骨架；含烯烴骨架；氨基磺酸鹽骨架；亞甲基亞胺和亞 甲基肼基骨架；磺酸鹽和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和其它具有混合的N、 O、 S和CH2的組成部分的核普間鍵合。
30教導(dǎo)了上述寡核香酸的制備的代表性美國專利包括但不限于U.S.: 5,034,506、 5,166,315、 5,185,444、 5,214,134、 5,216,141、 5,235,033、 5,264,562、 5,264,564、 5,405,938、 5,434,257、 5,466,677、 5,470,967、 5,489,677、 5，541,307、 5,561,225、 5,596,086、 5,602,240、 5,610,289、 5,602,240、 5,608,046、 5,610,289、 5,618,704、 5,623,070、 5,663,312、 5,633,360、 5,677,437、 5,792,608、 5,646,269 以及5,677,439，其中的一些與本申請被共同擁有，其全文分別在此引用作 為參考。
此處描述的化合物包含一個(gè)或多個(gè)不對稱中心，并因此形成了對映4本， 非對映體，以及其它立體異構(gòu)形式，其從絕對立體化學(xué)而言可定義為(R)-或(S)-, a或p，或是(D)-或(L)-(如針對氨基酸等時(shí))。本發(fā)明意在包括所有 該種可能的異構(gòu)體，以及它們的外消旋形式和光學(xué)純的形式。光學(xué)異構(gòu)體 可通過上述的過程由其相應(yīng)的光學(xué)活性前體制備，或通過拆分外消旋混合 物進(jìn)行制備。該種拆分可在拆分劑的存在下，通過色譜或重復(fù)結(jié)晶或這些 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知技術(shù)的組合進(jìn)行。有關(guān)拆分進(jìn)一步的細(xì)節(jié)可參見 Jacques,等人,Enantiomers, Racemates, and Resolutions (John Wiley & Sons, 1981)。當(dāng)此處所述的化合物包含烯烴雙鍵、其它不飽和性、或其它幾何不 對稱中心時(shí)，除非另行指明，該化合物意在同時(shí)包括E和Z幾何異構(gòu)體或 順式(cis-)和反式(trans-)異構(gòu)體。同樣地，同樣意在包括所有的互變異構(gòu)形 式。此處所示的任意碳-碳雙鍵的構(gòu)型僅為便利目的被選擇，若非文中指明， 并非意在指定特定的構(gòu)型；因此，此處任意描述為反式的碳-碳雙鍵或碳-雜原子雙鍵可以是順式、反式或任意比例的兩者的混合物。
本發(fā)明的上下文中的術(shù)語"低聚化合物"指至少具有 一個(gè)區(qū)能與核酸分 子雜交的聚合物。術(shù)語"低聚化合物"包括寡核苷酸、寡核苷酸類似物和寡核
31苷以及核普酸模擬物和/或包含核酸和非核酸成分的混合聚合物。低聚化合 物通?？删€性地制備，但也可連接或以其它方式制備成環(huán)狀，且還可包括 分支。低聚化合物可形成雙鏈構(gòu)建體，例如，雙鏈雜交以形成雙鏈組合物。 該雙鏈組合物可連接或分離并可在末端包含懸掛。 一般而言，低聚化合物 包含連接的單體亞基的骨架，其中該連接的單體亞基直接或間接地連接至
從而提供非堿基位點(diǎn)。該鍵合結(jié)合單體亞基、糖部分或替代物，且該雜環(huán) 堿基部分可被獨(dú)立修飾。包括或不包括雜環(huán);威基的鍵合-糖單元可被肽核酸 中的單體等模擬物取代。在低聚化合物的各個(gè)位點(diǎn)修飾或取代部分或全部 單體的能力可形成大量可能的基序。
如本領(lǐng)域所知，核苷是石咸基-糖組合。核香的石咸基部分通常為雜環(huán)石威基 部分。該種雜環(huán)i咸基最常見的兩種類別為嘌呤和嘧啶。核苷酸為進(jìn)一步包 含連接至核苷糖部分的磷酸酯基團(tuán)的核苷。對于包含呋喃戊糖的核苷，該 磷酸酯基團(tuán)可被連接至糖的2'、 3'或5'羥基部分。在形成聚核苷酸時(shí)，該磷
酸酯基團(tuán)共價(jià)連接彼此相鄰的核苷以形成線性聚合化合物?？赏ㄟ^雜交或 通過形成共價(jià)鍵連接該線性聚合結(jié)構(gòu)的相應(yīng)末端以形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，然而， 通常開放的線性結(jié)構(gòu)是理想的。在寡核苷酸結(jié)構(gòu)中，磷酸酯基團(tuán)通常形成
寡核苷酸的核苷間鍵合。RNA和DNA的常見核苷間鍵合為3'至5'磷酸二酯 鍵合。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"寡核苷酸"指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核 酸(DNA)的單體或聚合物。該術(shù)語包括由天然存在的核堿基、糖和共價(jià)核苷
間鍵合構(gòu)成的寡核苷酸。術(shù)語"寡核苷酸類似物"指具有一個(gè)或多個(gè)非天然存 在部分的寡核脊酸。該種非天然存在的寡核普酸通常比天然存在的形式更理想，因?yàn)榍罢呔哂欣纾瑥?qiáng)化細(xì)胞攝取、對核酸靶標(biāo)增強(qiáng)的親和力以及 在核酸酶存在下提高的穩(wěn)定性等優(yōu)良屬性。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"寡核苷"指由不帶磷原子的核苷間鍵合連接 的核苷序列。該種類型的核苷間鍵合包括短鏈烷基、環(huán)烷基、混合雜原子 烷基、混合雜原子環(huán)烷基、 一種或多種短鏈雜原子以及一種或多種短鏈雜 環(huán)。這種核苷間鍵合包括但不限于硅氧烷、疏化物、亞砜、砜、乙酰、 甲縮醛、石克甲縮醛、亞甲基甲縮醛、辟L甲縮醛、烯烴基、氨基磺酸鹽、亞 甲基亞胺、亞甲基肼基、磺酸鹽、磺酰胺、酰胺，和其它具有混合的N、 O、
S和CH2的組成部分的核苷間鍵合。
教導(dǎo)了上述寡核苷酸的制備的代表性美國專利包括但不限于U.S.: 5,034,506、 5,166,315、 5,185,444、 5,214,134、 5,216,141、 5,235,033、 5,264,562、 5,264,564、 5,405,938、 5,434,257、 5,466,677、 5,470,967、 5,489,677、 5,541,307、 5,561,225、 5,596,086、 5,602,240、 5,610,289、 5,602,240、 5,608,046、 5,610,289、 5,618,704、 5,623,070、 5,663,312、 5,633,360、 5,677,437、 5,792,608、 5,646,269 以及5，677,439,其中的一些與本申請被共同擁有，其全文分別在此引用作 為參考。
此處所用的術(shù)語"核堿基"或"雜環(huán)堿基部分"與"核酸堿基或其模擬物" 同義。 一般而言，核堿基為含有一個(gè)或多個(gè)能與核酸堿基氫鍵結(jié)合的原子 或原子組合的任意結(jié)構(gòu)。術(shù)語雜環(huán)堿基部分包括嘌呤、嘧啶、雜環(huán)堿基、 修飾的堿基、修飾的核堿基以及天然的和非天然存在的核堿基。
此處所用的"未修飾的"或是"天然的"核堿基包括嘌呤堿基腺噤呤(A)和 鳥嘌呤(G)，以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾的核 石威基包括但不限于其它合成的和天然的核石威基，例如5-甲基胞嘧啶
33(5-me-C)、 5-羥基甲基胞嘧啶、黃噤呤、次黃噤呤和2-氨基腺嘌呤。修飾的 核堿基還可包括其中嘌呤或嘧啶堿基被其它雜環(huán)，例如7-去氮-腺嘌呤、7-去氮鳥苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮取代的核堿基。其它的核堿基包括披露 于美國專利3,687,808的核堿基；披露于The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J丄,ed. John Wiley & Sons, 1990的核石威基；披露于Englisch等人，Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613的核堿基;以及披露于Sanghvi, Y.S., Chapter 15， Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, B., ed" CRC Press, 1993的核i威基。
修飾的核堿基包括但不限于此處定義的通用堿基、疏水堿基、混雜 堿基、大小擴(kuò)增的堿基以及氟化堿基。某些這些核堿基可特別地用于提高 本發(fā)明的低聚化合物的結(jié)合親和力。這包括5-取代的嘧啶，6-氮雜嘧啶以 及N-2、 N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶 和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代基已顯示可以提高核酸雙鏈穩(wěn)定性 0.6-1.2。C (Sanghvi, Y.S.， Crooke, S.T.和Lebleu, B.， eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278)，并且是目前優(yōu) 選的堿基取代基，特別是在結(jié)合2'-0-甲氧基乙基糖修飾時(shí)。
教導(dǎo)了特定的上述指出的修飾核堿基以及其它修飾的核堿基的制備的 代表性美國專利包括但不限于上述U.S. 3,687,808以及U.S.: 4,845,205、 5,130,302、 5,134,066、 5,175,273、 5,367,066、 5,432,272、 5,457,187、 5,459,255、 5,484,908、 5,502,177、 5,525,711、 5,552,540、 5,587,469、 5,594,121、 5,596,091、 5,614,617、 5,645,985、 5,830,653、 5,763,588、 6,005,096、以及5,681,941，
34其中的一些與本申請被共同擁有，其全文分別在此引用作為參考；以及美 國專利5,750,692,其與本申請被共同擁有，其全文分別在此引用作為參考。
除了具有至少一個(gè)5，-修飾的BNA修飾的核苷，本發(fā)明的低聚化合物 還可包含一種或多種具有修飾的糖部分的附加核苷。呋喃基糖環(huán)可以以多 種方式修飾，包括用取代基取代，橋連形成BNA以及用S或N(R)等雜原 子取代4'-0。教導(dǎo)了該種修飾糖的制備的部分代表性美國專利包括但不限 于U.S.: 4,981,957、 5,118,800、 5,319,080、 5,359,044、 5，393,878、 5,446,137、 5,466,786、 5,514,785、 5,519,134、 5,567,811 、 5,576,427、 5,591,722、 5,597,909、 5,610,300、 5,627,053、 5,639,873、 5,646,265、 5,658,873、 5,670,633、 5,792,747、 5,700,920、 6,600,032以及于2005年6月2日提交并于2005年12月22日 公開為WO 2005/121371的國際申請PCT/US2005/019219,其中的一些與本 申請被共同擁有，其全文分別在此引用作為參考。優(yōu)選的修飾糖的代表性 列表包括但不限于具有2'-F、 2'-OCH2或2'-0(CH2)rOCH3取代基團(tuán)的取代 糖；4'J克代修飾的糖以及雙環(huán)修飾的糖。
本發(fā)明的低聚化合物還可包含一種或多種具有修飾的糖部分的附加核 苷。呋喃基糖環(huán)可以以多種方式修飾，包括用取代基取代，橋連形成BNA 以及用S或N(R)等雜原子取代4'-0。教導(dǎo)了該種修飾糖的制備的部分代表 性美國專利包括但不限于U.S.: 4,981,957、 5,118,800、 5,319,080、 5,359,044、 5,393,878、 5,446，137、 5,466,786、 5,514,785、 5,519,134、 5,567,811、 5,576,427、 5,591,722、 5,597,909、 5,610,300、 5,627,053、 5,639,873、 5,646,265、 5,658,873、 5,670,633、 5,792,747、 5,700,920、 6,600,032以及于2005年6月2日提交并 于2005年12 月 22日公開為WO 2005/121371 的國際申請 PCT/US2005/019219，其中的一些與本申請被共同擁有，其全文分別在此引用作為參考。優(yōu)選的修飾糖的代表性列表包括但不限于具有2'-F、 2'-OCH2
或2'-0(CH2)2-OCH3取代基團(tuán)的取代糖；4'-硫代修飾的糖以及雙環(huán)修飾的糖。
此處所用的術(shù)語"核苷模擬物"意在包括那些用于在低聚化合物的一個(gè) 或多個(gè)位點(diǎn)替代糖或糖和;咸基而非鍵合的結(jié)構(gòu)，例如，具有嗎啉或雙環(huán)[3.1.0] 己基糖模擬物(例如，具有磷酸二酯鍵合的非呋喃糖)的核香模擬物。術(shù)語"糖 替代物"與含義更廣的術(shù)語"核苷模擬物"略微重疊，但僅指糖單元(呋喃糖環(huán)) 的替代。術(shù)語"核苷酸模擬物"意在包括用于在低聚化合物的一個(gè)或多個(gè)部分 替代核苷和鍵合的結(jié)構(gòu)，例如，肽核酸或嗎啉(被-N(H)-CtO)-O-或其它非-磷酸二酯鍵合連接的嗎啉)。
如本發(fā)明所述的低聚化合物可包含長度約8至約80個(gè)核脊和/或修飾核 苷或模擬物。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可理解本發(fā)明包含長度為8、 9、 10、
11、12、13、14、15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、
27、28、29、30、31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、
43、44、45、46、47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、
59、60、61、62、63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、
75、76、77、78、79或80或其任意范圍內(nèi)的核苦和/或修飾核香或模擬物
的低聚化合物。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的低聚化合物為長度8至40的核苷和/或修 飾核苷或模擬物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可理解本發(fā)明包含長度為8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39或40或其任意范 圍內(nèi)的核苦和/或修飾核苦或模擬物的低聚化合物。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明的低聚化合物為長度8至20的核普和/或修
飾核苷或模擬物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可理解其包含長度為8、 9、 10、 11、
12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20或其任意范圍內(nèi)的核普和/或修飾 核苷或模擬物的低聚化合物。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的低聚化合物為長度10至16的核苷和/或 修飾核普或模擬物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可理解其包含長度為10、 11、 12、
13、 14、 15或16或其任意范圍內(nèi)的核苷或修飾核香或模擬物的低聚化合物。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的低聚化合物為長度IO至14的核苷和/或 修飾核苷或模擬物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可理解其包含長度為10、 11、 12、 13或14或其任意范圍內(nèi)的核苷和/或修飾核苷或模擬物。
本發(fā)明的 一 方面，修飾和未修飾的核苷及其模擬物可參照文獻(xiàn)描述的 適當(dāng)DNA(Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal (1993), Humana Press)和/或RNA(Scaringe, Methods (2001)， 23, 206-217; Gait等人, Applications of Chemically synthesized RNA in RNA:Protein Interactions, Ed. Smith (1998), 1-36; Gallo等人，Tetrahedron (2001), 57, 5707-5713)合成方法 進(jìn)行低聚。固相合成的其它方法可參見Caruthers的美國專利4,415,732、 4,458,066、 4,500,707、 4,668,777、 4,973,679和5,132,418,以及Koster的美 國專利4,725,677以及Re. 34,069。
常規(guī)用于基于支持介質(zhì)的低聚化合物和相關(guān)化合物合成的商用設(shè)備由 多家供應(yīng)商(包括，例如，Applied Biosystems (Foster City, CA))出售。本領(lǐng) 域已知的任何其它該類合成方法均可附加地或替代性地采用。適用的固相 技術(shù)(包括自動合成技術(shù))的描迷可見F. Eckstein (ed.), Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, Oxford University Press, New York (1991)。
37隨著對RNAi的^是入的增加，RNA和相關(guān)類似物的合成相對DNA和 相關(guān)類似物的合成有所上升。目前在商業(yè)上采用的主要RNA合成策略包括 5'-0-DMT-2'-0-叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、 5'-0-DMT-2'-0-[ 1 (2-氟苯 基)-4-甲氧基哌啶-4-基](FPMP) 、 2'-0-[(三異丙基甲硅烷基)氧基]甲基 (2'-0-CHrO-Si(iPr)3 (TOM)、以及5'-0-硅醚-2'-ACE (5'-0-二(三甲基硅氧基) 環(huán)十二烷氧基硅醚(DOD)-2'-0-二(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)。目前^是供 RNA產(chǎn)品的主要的公司包括Pierce Nucleic Acid Technologies' Dharmacon Research Inc.、 Ameri Biotechnologies Inc.和Integrated DNA Technologies, Inc. 。 Princeton Separations公司所銷售的RNA合成活化劑據(jù)宣傳可以特別 地減少與TOM和TBDMS化學(xué)物質(zhì)的偶合次數(shù)。該種活化劑也適用于本發(fā) 明。
用于商業(yè)RNA合成的主要基團(tuán)為
TBDMS = 5'-0-DMT-2'-0-叔丁基二甲基甲硅烷基
TOM = 2'-0-[(三異丙基甲硅烷基)氧基]甲基
DOD/ACE = (5'-0-二(三甲基硅氧基)環(huán)十二烷氧基硅醚-2'-0-雙(2-乙酰 氧基乙氧基)甲基
FPMP = 5'-0-DMT-2'-0-[l(2-氟苯基)-4-甲氧基派啶-4-基]。
所有前述的RNA合成策略均適用于本發(fā)明。上述策略的混合，例如一 策略采用5'-保護(hù)基團(tuán)而另一策略采用2'-0-保護(hù)基團(tuán)也適用于本發(fā)明。
在本發(fā)明的上下文中，"雜交"指低聚化合物互補(bǔ)鏈的配對。在本發(fā)明中，
之間的氫4建結(jié)合，其可以是Watson-Crick 、 Hoogsteen或反向Hoogsteen氳
38鍵結(jié)合。例如，腺噤呤和胸腺嘧啶為通過形成氫鍵進(jìn)行配對的互補(bǔ)核苷石威 基。雜交可在多種條件下進(jìn)行。
如果低聚化合物與目標(biāo)核酸的結(jié)合干擾該目標(biāo)核酸的正常功能而導(dǎo)致 活性喪失，且具有足夠的互補(bǔ)性程度，從而避免在需要特異性結(jié)合的情況 下(即在體內(nèi)測定或治療的生理?xiàng)l件下和在進(jìn)行體外測定的條件下)該低聚 化合物與非目標(biāo)核酸序列發(fā)生非特異性結(jié)合，則該低聚化合物是可特異性 地雜交的。
此處所用的"互補(bǔ)"指兩個(gè)堿基核香在任意位置下精確配對的能力。例 如，如果在低聚化合物某一位置的核普堿基能夠與目標(biāo)核酸(該目標(biāo)核酸為
DNA、 RNA或寡核苷酸分子)的某一位置的核苷堿基氫鍵結(jié)合，則該寡核苷
酸和目標(biāo)核酸之間的氫鍵結(jié)合的位置被認(rèn)為是互補(bǔ)位置。當(dāng)各分子中的互 補(bǔ)位置被可以彼此氫鍵結(jié)合的核苷堿基占據(jù)時(shí)，該低聚化合物和其它DNA、
RNA或寡核苷酸分子彼此是互補(bǔ)的。術(shù)語"可特異性雜交"和"互補(bǔ)"為是指 足量核苷堿基精確配對或互補(bǔ)的程度足以使寡核苷酸和目標(biāo)核酸之間形成 穩(wěn)定且特異性的結(jié)合。
在本領(lǐng)域中可以理解，低聚化合物的序列不需要與其目標(biāo)核酸的序列 具有100%的互補(bǔ)性以達(dá)到可特異性可雜交。此外，寡核苷酸可在一個(gè)或多
結(jié)構(gòu))。本發(fā)明的低聚化合物與其耙向的目標(biāo)核酸序列中的目標(biāo)區(qū)域具有至 少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、或至少約99%的序 列互補(bǔ)性。例如，當(dāng)?shù)途刍衔?0個(gè)核苷中有18個(gè)與目標(biāo)區(qū)域互補(bǔ)時(shí)， 該低聚化合物應(yīng)該是可特異性雜交的，且表示具有90%互補(bǔ)性。在該范例 中，剩余的非互補(bǔ)核普堿基可以成簇或散布在互補(bǔ)核苷堿基中，不需要彼
39此鄰近或與互補(bǔ)核苷堿基鄰近。同樣地，如果長度為18個(gè)核苷堿基的低聚化合物具有側(cè)翼連接兩個(gè)與目標(biāo)核酸完全互補(bǔ)的區(qū)域的4個(gè)非互補(bǔ)性核苷
堿基，則該低聚化合物與目標(biāo)核酸具有77.8Q/Q的總體互補(bǔ)性，并因而包含
在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。低聚化合物與目標(biāo)核酸的互補(bǔ)性百分比可通過本領(lǐng)
域已知的BLAST程序(基本的局部對比排列搜索工具)和PowerBLAST程序常規(guī)地測定(Altschul等人，J. Mol. Biol., 1990， 215, 403-410; Zhang和Madden, Genome Res" 1997, 7， 649-656)。
本發(fā)明進(jìn)一步包括了如反義低聚化合物、反義寡核苷酸、核酶、外源指導(dǎo)序列(EGS)、寡核苷酸、選擇性剪切體、引物、探針等低聚化合物，以及與目標(biāo)核酸的至少一個(gè)部分雜交的其它低聚化合物。因此，這些低聚化合物可以以單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾低聚化合物的形式引入，并可包含內(nèi)部或末端突起或環(huán)等結(jié)構(gòu)元件。本發(fā)明的低聚化合物一旦引入系統(tǒng)后，就可引發(fā)一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用以實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)核酸的修飾。
本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了與核酸靶標(biāo)雜交并通過募集核酸內(nèi)切酶降解該耙標(biāo)的單鏈低聚體。該種酶的非限制性范例之一為RNAse H， 一種裂解RNA:DNA雙鏈的RNA鏈的細(xì)胞內(nèi)切酶。本領(lǐng)域已知"類DNA"單鏈低聚化合物引發(fā)RNAse H。 RNAse H的激活可導(dǎo)致RNA靶標(biāo)的裂解，從而大大增強(qiáng)寡核苷酸-介導(dǎo)的基因表達(dá)抑制的效率。其它的核糖核酸酶(例如屬于RNAse III和核糖核酸酶L酶家族的核糖核酸酶)也推定具有類似的作用。
盡管低聚化合物的一種形式為單鏈反義寡核苷酸，但已經(jīng)表明在許多物種中引入雙鏈結(jié)構(gòu)，例如雙鏈RNA(dsRNA)分子可誘導(dǎo)基因或其相關(guān)基因產(chǎn)物強(qiáng)的和特異性反義-介導(dǎo)的功能降低。該現(xiàn)象同時(shí)存在于植物和動物，并被認(rèn)為與病毒防御和轉(zhuǎn)座子沉默具有進(jìn)化性聯(lián)系。在一些實(shí)施方式中，在篩選調(diào)節(jié)選定蛋白表達(dá)的其它低聚化合物中可采用"適當(dāng)?shù)哪繕?biāo)片段"。"調(diào)節(jié)劑"為降低或提高編碼蛋白的核酸分子的表達(dá)，且至少包含一個(gè)與適當(dāng)?shù)哪繕?biāo)片段互補(bǔ)的8-核苷堿基部分的低聚化合
物。該篩選方法包括如下步驟將編碼蛋白的核酸分子的適當(dāng)目標(biāo)片段與
一種或多種候選調(diào)節(jié)劑接觸，和選擇一種或多種提高或降低編碼蛋白的核酸分子的表達(dá)的候選調(diào)節(jié)劑。 一旦顯示候選調(diào)節(jié)劑能夠調(diào)節(jié)(例如，提高或降低)編碼肽的核酸分子的表達(dá)，則該調(diào)節(jié)劑就可用于該肽的功能的進(jìn)一步考察研究，或如本發(fā)明所述用作研究、診斷、或治療劑。
本發(fā)明的適當(dāng)目標(biāo)片段還可與其各自的本發(fā)明的互補(bǔ)性反義低聚化合物組合形成穩(wěn)定的雙鏈寡核苷酸。本領(lǐng)域已顯示該種雙鏈寡核苷酸部分可
調(diào)節(jié)目標(biāo)表達(dá)并通過反義機(jī)制調(diào)節(jié)翻譯和RNA加工。此外，該雙鏈部分還可進(jìn)行化學(xué)修飾(Fire等人，Nature, 1998, 391, 806-811; Timmons和Fire,Nature 1998, 395, 854; Timmons等人，Gene, 2001, 263, 103-112; Tabara等人，Science, 1998, 282, 430-431; Montgomery等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 1998, 95, 15502-15507; Tuschl等人，Genes Dev., 1999， 13， 3191-3197;Elbashir等人，Nature, 2001， 411, 494-498; Elbashir等人，Genes Dev. 2001,15, 188-200)。例如，已經(jīng)表明該種雙鏈部分可通過雙鏈的反義鏈與靶標(biāo)進(jìn)行的經(jīng)典雜交來抑制該把標(biāo)，從而引發(fā)目標(biāo)的酶降解(Tijsterman等人,Science, 2002, 295, 694-697)。
本發(fā)明的低聚化合物還可用于藥物發(fā)現(xiàn)和靶標(biāo)驗(yàn)證領(lǐng)域。本發(fā)明包括將此處所確定的低聚化合物和靶標(biāo)用于藥物發(fā)現(xiàn)過程中以闡明蛋白與疾病狀態(tài)、表型或癥狀之間存在的關(guān)系。這些方法包括檢測或調(diào)節(jié)目標(biāo)肽，包括將樣本、組織、細(xì)胞或生物體與本發(fā)明的低聚化合物接觸，檢測在處理
41一定時(shí)間后的目標(biāo)處的核酸或蛋白水平和/或相關(guān)的表型或化學(xué)終點(diǎn)，并任
過程使用的未知基因的功能，或者確定特定基因產(chǎn)物作為特定疾病、癥狀或表型治療或預(yù)防把標(biāo)的效果。
核苷修飾對RNAi活性的作用參照現(xiàn)有文獻(xiàn)進(jìn)行了評估(Elbashir等人,Nature(2001), 411, 494-498; Nishikura等人，Cell (2001), 107， 415- 416;以及Bass等人，Cell (2000)， 101,235-238)。
本發(fā)明的低聚化合物可用于診斷、治療、預(yù)防并可作為研究試劑和試劑盒。此外，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常使用能夠以超強(qiáng)特異性抑制基因表達(dá)的反義寡核普酸來闡明特定基因的功能或區(qū)分生物途徑各種組分的功
作差異分析和/或組合分析的工具來闡明細(xì)胞和組織內(nèi)表達(dá)的基因的部分或整個(gè)補(bǔ)體的表達(dá)模式。低聚化合物也可在有利于基因擴(kuò)增或檢測的條件下分別被有效地用作引物和探針。這些引物和探針可用于需要特異性檢測編碼蛋白的核酸分子的方法中，并可用于核酸分子擴(kuò)增以供檢測或在進(jìn)一步研究中使用。本發(fā)明的反義寡核苷酸，特別是引物和探針與核酸的雜交可通過本領(lǐng)已知的方法進(jìn)行檢測。該種方法可包括將酶結(jié)合至寡核苷酸，對該寡核苷酸進(jìn)行放射性標(biāo)記或任何其它適用的檢測方法。還可制備使用檢測在樣本中選定蛋白水平的這種檢測裝置的試劑盒。
作為一個(gè)非限制性范例，將用一種或多種低聚化合物處理的細(xì)胞或組
基因的表達(dá)水平差異分析所生成的模式，因?yàn)檫@些模式涉及例如所檢測基因的疾病相關(guān)性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、細(xì)胞定位、表達(dá)水平、大小、結(jié)構(gòu)或功能。這些分析可在影響表達(dá)模式的其它化合物或低聚化合物存在或不存在的情況下對刺激的或未刺激的細(xì)胞進(jìn)行。
本領(lǐng)域已知的基因表達(dá)分析方法的范例包括DNA陣列或微陣列
(Brazma和Vilo, FEBS Lett.， 2000, 480, 17-24; Celis,等人，F(xiàn)EBS Lett, 2000,480， 2-16)， SAGE(基因表達(dá)系列分析)(Madden,等人，Drug Discov. Today,2000, 5， 415-425), READS(消化的cDNAs的限制性酶擴(kuò)增)(Prashar和Weissman， Methods Enzymol., 1999， 303， 258-72), TOGA(總基因表達(dá)分析)(Sutcliffe,等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A" 2000, 97, 1976-81),蛋白陣列和蛋白組學(xué)(Celis,等人，F(xiàn)EBS Lett" 2000, 480, 2-16; Jimgblut,等人,Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10),表達(dá)序列標(biāo)記(EST)測序(Celis,等人,FEBS Lett" 2000, 480, 2-16; Larsson,等人，J. BiotechnoL, 2000, 80, 143-57),消減RNA指紋(SuRF) (Fuchs,等人，Anal. Biochem" 2000, 286, 91-98;Larson,等人，Cytometry, 2000, 41, 203-208),消減克隆，差異展示(DD)(Jurecic and Belmont, Curr. Opin. Microbiol., 2000, 3, 316-21),比較基因組雜交(Camlli，等人，J. Cell Biochem. Suppl., 1998, 31， 286-96), FISH(熒光原位雜交)技術(shù)(Going and Gusterson, Eur. J. Cancer, 1999, 35, 1895-904)以及質(zhì)譜方法(To, Comb. Chem. High Throughput Screen, 2000, 3， 235-41)。
本發(fā)明已對其某些實(shí)施方式進(jìn)行了特定描述，以下實(shí)施例僅用于闡述本發(fā)明，并非意在對其進(jìn)行限制。
實(shí)施例1
43(1及，3凡4及，78)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基1-1-[1-(8)-(4，4'-二甲氧三苯甲基)氧基-乙基-3-(尿嘧啶-1-基)-2，5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(19a)的制備
<formula>formula see original document page 44</formula>路線1 (a) TBSC1, Et3N, DMAP, CH2C12,室溫，16h (b)草酰氯，DMSO, Et3N，CH2C12, -78°C至室溫(c) MeMgBr, CeCl3, THF, -78°C (d)異丁酰氯，Et3N, DMAP,CH2C12,室溫，16h (e) 70% HFA比p定，室溫，16h (f)曱基磺酰氯，Et3N, DMAP,
CH2CI2 (g) AcOH, Ac20，濃H2S04 (h)尿嘧啶，BSA, TMSOTf, CH3CN,回流，2h(i) NaOH, 7jc, 二噪烷(j)異丁酸酐，DMAP,吡啶(k) Pd/C, H2氣球(1) TBSC1,咪唑，DMF (m) K2C03， MeOH (n) DMTC1, 2,6-二甲基吡啶，吡啶，45°C (o)Et3N.3HF, Et3N, THF (p) (iPr2N)2POCH2CH2CN,四唑，NMI, DMF。
A) 化合物4的制備
將叔丁基二甲基甲硅烷氯(6.24 g, 40.7 mmol)的二氯甲烷溶液(10 mL)在10分鐘內(nèi)通過加液漏斗添加至化合物2(12 g， 38.8 mmol,參照Mo ffatt等人，J. Org. Chem. 1979， 44, 1301的方法進(jìn)行制備)、三乙胺(11.44 mL, 81.5mmol)以及4-二甲基氨乙基吡咬(0.47 g， 3.9 mmol)的冷((TC)CH2Cl2溶液(184mL)中。添加完成后，將反應(yīng)逐漸加熱至室溫，并繼續(xù)攪拌16小時(shí)。以CH2Cl2稀釋反應(yīng)物，依次以5。/。HCl水溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02,以10%的EtOAc/己烷-20% EtOAc/己烷-30。/oEtOAc/hexane洗脫)純化提供白色固體狀的化合物3(11.53g，59%)和化合物4(3.93 g， 22%)。
B) 化合物5的制備
將二甲亞石風(fēng)(1.84 mL， 26.0 mmol)加入到草酰氯(1.14 mL， 13.0 mmol)的CH2Cl2(70mL)冷(-78。C)溶液中。將該溶液在-78"C下攪拌30分鐘，然后通過插管添加化合物4(3.93 g， 9.3 mmol)的CH2C12(20 mL)溶液。繼續(xù)攪拌45分鐘并向反應(yīng)中添加三乙胺((5.48 mL， 39.0 mmol)。將反應(yīng)物繼續(xù)攪拌40分鐘，然后注入CH2Cl2，并依次以5% HC1水溶液，飽和NaHC03，鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮得到化合物5，其可在不作任何純化下用于下一步驟。
C) 化合物6a和化合物6b的制備
45將氯化鈰111(4.57 g， 18.6 mmol)的THF溶液(55 mL)在室溫下攪拌90分鐘。在冰浴中冷卻反應(yīng)物，在5分鐘內(nèi)添加甲基溴化鎂(13.3 mL的1MTHF溶液)，然后繼續(xù)攪拌90分鐘。將粗化合物5(由前面獲得)的THF溶液(l5 mL)加入反應(yīng)物。繼續(xù)攪拌90分鐘后，以飽和NH4C1溶液終止反應(yīng)并注入EtOAc。依次以5。/qHC1水溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌，干燥(Na2S04)有機(jī)相并真空濃縮。通過柱層析(Si02,依次以CHCl3;3。/。丙酮/CHCl3;最后以5Q/o丙酮/CHCl3洗脫)純化得到化合物6a(2.25 g， 55%，來自化合物4)和化合物6b(1.84g， 45%,來自化合物4)。
6a &雨R (300 MHz, CDC13) 5: 7.44-7.29 (m, 5H), 5.68 (d, 1H, /二 3.8),4.76 (d, 1H, J= 12.0), 4.62 (d, 1H, J= 12.0), 4.58 (m, 1H), 4.44 (d, 1H， /= 10.3),4.08 (d, 1H, /= 5.3), 3.95 (m, 1H), 3.81 (d, 1H， /= 10.3), 2.84 (d, 1H, J= 7.5),1.60 (s, 3H), 1.30 (s, 3H), 1.20 (d, 3H, /= 6.4), 0.88 (s， 9H), 0.08 (s, 3H), 0.05(s, 3H)。
6b NMR (300 MHz, CDC13) S: 7.39-2.29 (m, 5H), 5.73 (d, 1H, /= 3.9),4.76 (d， 1H,J: 11.7), 4.58 (m, 1H,部分重疊)，4.56 (d, 1H, 11.7), 4.16 (d,1H, /= 5.2), 4.14-4.04 (m, 3H), 2.43 (d, 1H， 3.8), 1.62 (s, 3H), 1.32 (s, 3H),1.17 (d, 3H, /= 6.52), 0.88 (s, 9H), 0.08 (s, 3H), 0.05 (s, 3H)。
D) 化合物7a的制備
向化合物6a(2.29 g， 5.3 mmol)，三乙胺(1.06 mL， 7.6 mmol)和4-二甲基-氨基吡啶(77 mg， 0.6mmol)的冰((TC)CH2Cl2溶液(6 mL)中添加異丁酰氯(0.67 mL， 6.3mmo1)。室溫?cái)嚢?6小時(shí)后，將該反應(yīng)物注入EtOAc,并依次以5。/。HCl水溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮得到化合物7a，其可在不作任何純化下用于下一步驟。
46E) 化合物8a的制備
將70% HF/吡咬(1.25 mL)加入聚丙烯管中的粗品化合物7a的THF溶液 (25mL)中。在室溫下攪拌16小時(shí)后再向反應(yīng)添加三乙胺(1.25 mL)。 10分 鐘后，將反應(yīng)物注入EtOAc，并以水、鹽水萃取，干燥(Na2S04)并過濾。再 向該EtOAc溶液添加三乙胺(1.25 mL),然后真空濃縮該反應(yīng)物得到化合物 8a，其可在不作任何純化下用于下一步驟。
F) 化合物9a的制備
向粗品化合物8a、三乙胺(l.l mL， 7.8 mmol)和4-二甲基氨基吡啶(60 mg， 0.5 mmol)的冷(0。C)CH2Cl2溶液(21 mL)中添加甲烷磺酰氯(0.46 mL， 5.8 mmol)。室溫?cái)嚢鑜小時(shí)后，將該反應(yīng)物注入CHCl3，并依次以5。/qHC1水 溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮得到化合 物9a，其可在不作任何純化下用于下一步驟。
G) 化合物10a的制備
將濃H2S04(1滴)加入到溶于冰醋酸(9 mL)和乙酸酐(1.3 mL)的粗品化 合物9a中。室溫?cái)嚢?小時(shí)后，將反應(yīng)物注入EtOAc，依次以水、飽和 NaHC03、鹽水洗滌，干燥(Na2S04)有機(jī)相并真空濃縮。柱層析(Si02，以40
為99%)。
H) 化合物lla的制備
將WO-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(3.9 mL， 15.7 mmol)加入到化合物 10a(2.7 g, 5.2 mmol)和尿嘧咬(0.73 g, 6.5 mmol)的MeCN懸浮液(16 mL)中。 在40。C下加熱15分鐘以獲得澄清溶液，向反應(yīng)物中添加三甲基甲硅烷基三 氟甲磺酰鹽(1.23mL， 6.8mmo1)?；亓?小時(shí)后，將反應(yīng)物冷卻至室溫并注入EtOAc。以飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮得 到化合物lla,其可在不作任何純化下用于下一步驟。 I)化合物12a的制備
將NaOH溶液(2M, 11 mL)添加至溶于1,4-二噪烷:1120 (1:1, 12 mL)的 粗品化合物lla中。室溫?cái)嚢?6小時(shí)后，以5% HC1水溶液(pH 7)中和該 反應(yīng)物，并以25Q/o吡啶/EtOAc混合物進(jìn)行萃fL。然后以50%鹽水、鹽水洗 滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02， 5% MeOH/CHCl3)純化 得到白色固定狀的化合物12a(1.56 g，由化合物10a為83%)。 ipiNMR (300 MHz， CDC13)S: 8.48(s， br, 1H), 7.71 (d， 1H, J=8.2)， 7.40-7.29 (m， 5H)， 5.71 (d, 1H， ^8.3)， 5.67 (s， 1H)， 4.67 (d, 2H, /=11.5)， 4.54 (d， 1H， 7=11.5)， 4.48 (s， 1H), 4.19 (m， 1H)， 4.03 (s， 1H， >/=7.8)， 3.91 (s， 1H)， 3.76 (d, 1H, J=7.8), 1.32 (d， 3H， J=6.6)。
J)化合物13a的制備
將異丁酸酐(0.86 mL， 5.2 mmol)添加至化合物12a(1.56 g， 4.3 mmol) 和4-二甲基氨基吡啶(10 mg)的冰((TC)吡啶溶液(8.6 mL)中。將反應(yīng)攪拌16 小時(shí)，同時(shí)逐漸加溫至室溫。將反應(yīng)物注入EtOAc,以鹽水萃取有機(jī)相， 干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02, 50。/oEtOAc/己烷)純化提供白色固 體狀的化合物13a(1.68g，卯％)。
K)化合物14a的制備
將MeOH(20 mL)小心添加至PdVC(10% w/w， 190 mg)和化合物13a (1.68 g， 3.9 mmol)的混合物中。將上述混合物用H2氣球氫化16小時(shí)。用 硅藻土過濾去除催化劑，濃縮纟是4共化合物13a和14a的粗品混合物。重復(fù)上
48述步驟直至在反應(yīng)混合物中無法檢測(TLC)到化合物13a。柱層析(Si02， 7% MeOH/CHCl3)純化提供白色固體狀的化合物14a (1.35 g， 92%)。 L)化合物15a的制備
將叔丁基二甲基甲硅烷基氯(1.95 g， 13.0 mmol)添加至化合物14a(1.35 g， 4 mmol)和咪唑(1.76 g， 25.9 mmol)的DMF溶液(8 mL)中。室溫?cái)嚢?6 小時(shí)后，將反應(yīng)物注入EtOAc，以鹽水萃fL，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱 層析(5% MeOH/CHCl3)純化提供白色固體狀的化合物15a( 1.63 g ， 90%)。
M) 化合物16a的制備
向化合物16a的MeOH (20 mL)溶液中添加K2CO3(0.99 g， 7.1 mmol)。 室溫?cái)嚢?6小時(shí)后，濃縮該反應(yīng)物并通過柱層析(Si02, 10%MeOH/CHCl3) 純化得到白色固體狀的化合物16a( 1.15 g ， 75%)。
N) 化合物17a的制備
將4,4'-二甲氧三苯甲基氯(DMTCl) (2.53 g， 7.5 mmol)加入到化合物16a (1.15 g， 3.0 mmol)和2,6畫二甲基p比p定(0.87 mL, 7.5 mmol)的晚嚏溶液(20 mL) 中。將反應(yīng)物在45°C下加熱24小時(shí)，然后再添加DMTC1 (0.43 g， 1.3 mmol) 和2，6-二甲基吡啶(0.15 mL ， 1.27 g)。再在45 °C下加熱24小時(shí)后，將反應(yīng) 物注入EtOAc，以鹽水萃取，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，25% EtOAc/ 己烷-50o/oEtOAc/己烷)純化提供黃色泡沫狀的化合物17a(2.0g, 97%)。 17a 'HNMR(300MHz，CDCl3)5: 8.75 (s,br， 1H)，8.09 (d， lH，/= 8.2), 7.49-7.19 (m， 9H)， 6.82 (m， 4H)， 5.68 (s， 1H)， 5.66 (d， 1H， 《/=8.2，部分重疊)， 4.33 (s, 1H)， 4.24 (s, 1H), 3.86 (d， 1H， ^7.6)， 3.80 (s， 6H)， 3.72 (m, 2H)， 0.96 (d， 3H， ^6.5)， 0.77 (s, 9H), 0.03 (s， 3H)， -0.10 (s， 3H)。
N) 化合物18a的制備
49在聚丙烯管中向化合物17a(1.09 g， 1.6 mmol)和三乙胺(0.45 mL, 3.2 mmol)的THF(8mL)溶液中添加三乙胺三氫氟酸鹽(1.29mL, 8.0mmol)。室 溫?cái)嚢?8小時(shí)后，將反應(yīng)物注入EtOAc，依次以水、飽和NaHC03、鹽水 洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02，以25%丙酮 /CHCl3-40。/o丙酮/CHCl3洗脫)純化提供白色泡沫狀的化合物18a(0.79 g， 86%)。
O) (U ，3W，4i ，7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧 基-1-[1-(5)-(4，4'-二甲氧三苯甲基)氧基-乙基-3-(尿嘧啶-1-基)-2，5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1庚烷，化合物19a的制備
將2-氰乙基A^V'-四異丙基亞磷酰胺(0.43,mL， 2.0 mmol)加入到化合物 18a(0.78g, 1.4mmo1)、四哇(76.0mg， l.lmmol)和甲基-咪唑(28 (iL, 0.3 mmol)的DMF溶液(7 mL)中。室溫?cái)嚢?小時(shí)后，將反應(yīng)物注入EtOAc ， 依次以90%鹽水、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02， 以60% EtOAc/己烷-75"5/0 EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體狀的化合物 19a(0.91g， 87%)。 19a 31P NMR (300 MHz, CDC13) 5: 149.1 ， 148.5。
實(shí)施例2
(U ，3及，4J ，75)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基H-[l-(W)-(4，4'畫二 甲氧三苯甲基)氧基-乙基-3-(尿嗜啶-1-基)-2，5-二氧雜-雙環(huán)2.2.1庚烷，化合 物19b的制備(路線1)
A) 化合物7b的制備
向化合物6b(1.90 g, 4.4匪o1)、三乙胺(0.88mL， 6.3 mmol)和4-二甲 基-氨基吡啶(53 mg, 0.4mmol)的水(0。C)CH2Cl2溶液(5 mL)中添加異丁酰氯(0.55 mL, 5.2mmol)。室溫?cái)嚢?6小時(shí)后，將該反應(yīng)物注入EtOAc,并依 次以5。/。HCl水溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真 空濃縮得到化合物7b,其可在不作任何純化下用于下一步驟。
B) 化合物8b的制備
將70% HF/吡啶(2.0 mL)加入聚丙烯管中的粗品化合物7b的THF溶液 (30mL)中。在室溫下攪拌16小時(shí)后，向反應(yīng)添加三乙胺(2.0mL)。 10分鐘 后，將反應(yīng)物注入EtOAc，并以水、鹽水萃取，干燥(Na2S04)并過濾。再向 該EtOAc溶液添加三乙胺(2.0mL)，然后真空濃縮該反應(yīng)物得到化合物8b, 其可在不作任何純化下用于下一步驟。
C) 化合物9b的制備
向粗品化合物8b、三乙胺(0.88 mL, 6.3 mmol)和4-二甲基氨基吡啶(53 mg， 0.4 mmol)的冷(0。C)CH2Cl2溶液(16 mL)中添加甲烷磺酰氯(0.40 mL， 5.2 mmol)。室溫?cái)嚢鑜小時(shí)后，將該反應(yīng)物注入CHCl3，并依次以5。/。HCl水 溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮得到化合 物9b，其可在不作任何純化下用于下一步驟。
D) 化合物10b的制備
將濃H2S04(1滴)加入溶于冰醋酸(9 mL)和乙酸酐(1.3 mL)的粗品化合 物9b中。室溫?cái)嚢?小時(shí)后，將反應(yīng)物注入EtOAc，依次以水、飽和NaHC03、 鹽水洗滌，干燥(Na2S04)有機(jī)相并真空濃縮。柱層析(Si02,以40%的EtOAc/ 己烷洗脫)純化提供無色油狀的化合物10b(2.0 g，由6b為90%)。
E) 化合物llb的制備
將WO-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(2.73 mL， 11.0 mmol)加入到化合物 10b(2.0 g, 3.9 mmol)和尿嘧啶(0.52 g， 4.6mmol)的CH3CN懸浮液(l 1 mL)
51中。在40。C下加熱15分鐘以獲得澄清溶液，向反應(yīng)物中添加三甲基甲硅烷
基三氟甲磺酰鹽(0.87mL， 4.8mmo1)。回流2小時(shí)后，將反應(yīng)物冷卻至室溫 并注入EtOAc。以飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃 縮得到化合物llb，其可在不作任何純化下用于下一步驟。
F) 化合物12b的制備
將NaOH溶液(2M， 8.0 mL)添加至粗品化合物lib的1，4-二噪烷:1120 (1:1， 8mL)溶液中。室溫?cái)嚢?6小時(shí)后，以5% HC1水溶液(pH 7)中和該 反應(yīng)物，并以25%吡啶/EtOAc混合物進(jìn)行萃取。然后以50%鹽水、鹽水 洗滌該有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02， 5% MeOH/CHCl3) 純化提供白色固體狀的化合物12b(1.30 g，由化合物10b為98%)。 12b〗H N證(300 MHz, CDC13)S: 8;0(s， br， IH)， 7.52 (d， 1H， J=8.2), 7.43-7.29 (m, 5H)， 5.72 (d， 1H， 《/=8.2)， 5.64 (s, IH)， 4.68 (d， 1H， 《/=11.5)， 4,59 (s, IH)， 4.51 (d, 1H, 7=11.5)， 4.31 (m, 1H，部分重疊)，4.24 (d， 1H， 7=8.1), 3.96 (d, 1H， 7=8.1)， 3.79 (s， 1H), 2.25 (d， 1H， ^5.2)， 1.34 (d, 3H, /=6.6)0
G) 化合物13b的制備
將異丁酸酐(0.60 mL， 3.6 mmol)添加至化合物12b(l,08 g， 3.0 mmol) 和4-二甲基氨基吡啶(5 mg)的水((TC)吡啶溶液(6 mL)中。將反應(yīng)攪拌16小 時(shí)，同時(shí)逐漸升溫至室溫。將反應(yīng)物注入EtOAc,并以鹽水萃取，干燥(Na2S04) 并真空濃縮得到化合物13b，其可在不作任何純化下用于下一步驟。
H) 化合物14b的制備
將MeOH (20 mL)小心添加至Pd/C (10% w/w， 170 mg)和化合物13b的 混合物中。將上述混合物用H2氣球氫化16小時(shí)。用硅藻土過濾去除催化
52劑，濃縮拐:供化合物13b和14b的粗品混合物。重復(fù)上述步驟直至在反應(yīng) 混合物中無法檢測(TLC)到化合物13b。柱層析(Si02， 7% MeOH/CHCl3)純 化^是供白色固體狀的化合物14b (0.84 g，由化合物12b為83%)。 I)化合物15b的制備
將叔丁基二甲基甲硅烷基氯(1.49 g， 9.9 mmol)添加至化合物14b (0.84 g， 2.5 mmol)和咪唑(1.35 g， 19.9 mmol)的DMF溶液(5 mL)中。室溫?cái)嚢?6 小時(shí)后，將反應(yīng)物注入EtOAc，以鹽水萃取，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱 層析(5% MeOH/CHCl3)純化提供白色固體狀的化合物15b (0.92 g， 81%)。
J)化合物16b的制備
向化合物15b的MeOH溶液(IO mL)添加K2CO3(0.70 g， 5.1 mmol)。室 溫?cái)嚢?6小時(shí)后，濃縮該反應(yīng)物并在90%鹽水和25n/。吡咬/EtOAc之間進(jìn) 行分配。收集有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮^^f共化合物16b，其可在不
作進(jìn)一步純化下用于下一步驟。 K) 化合物17b的制備
將4,4'-二甲氧三苯甲基氯(DMTC1) (1.87 g， 5.5 mmol)加入到化合物16b (0.71 g, 1.8 mmol)和2,6-二甲基吡啶(0.64 mL， 5.5 mmol)的吡啶溶液(20 mL) 中。在45。C下加熱48小時(shí)后，將反應(yīng)物注入EtOAc，以鹽水萃取，干燥 (Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02, 25% EtOAc/己烷-500/。 EtOAc/己烷)純化提 供黃色泡沫狀的化合物17b(1.29 g,由化合物15b為93% )。17b 'HNMR(300 MHz, CDC13)S: 8.70(s， br， 1H), 7.61 (d, 1H， J=8.2)， 7.49-7.16 (m， 9H)， 6.82 (d, 4H， 7=8.9), 5.63 (s， 1H), 5.56 (d， 1H， 7=8.2)， 4.25 (s， 1H)， 3.97 (d， 1H， 《/=8.1)， 3.85 (s， 1H), 3.79 (s， 6H)， 3.70 (d， 1H, 7=8.1)， 3.58 (m, 1H)， 1.12 (d, 3H， J=6.6), 0.79 (s， 9H)， 0.01 (s, 3H)， -0.01 (3H)。L) 化合物18b的制備
在聚丙烯管中向化合物17b (0.89 g, 1.3 mmol)和三乙胺(0.46 mL， 3.3 mmol)的THF(6.5mL)溶液中添加三乙胺三氳氟酸鹽(1.06mL, 6.5 mmol)。 室溫?cái)嚢?8小時(shí)后，將反應(yīng)物注入EtOAc，依次以水、飽和NaHC03、鹽 水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02，以30%丙酮 /CHCl3-45Q/o丙酮/CHCl3洗脫)純化提供白色泡沫狀的化合物18b(0.73 g， 98%) 0
M) (l/ ，3W，4R，7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧 基-1-[1-(及)-(4，4，-二甲氧三苯甲基)氧基-乙基-3-(尿嘧啶-1-基)-2，5-二氧雜-雙環(huán)[2,2.1庚烷，化合物19b的制備
將2-氰乙基AW'-四異丙基亞磷酰胺(0.60 mL， 1.9 mmol)加入到化合物 18b (0.73 g, 1.3 mmol)、四唾(71 mg， 1.0 mmol)和TV-甲基。米哇(26 ^L， 0.3 mmol)的DMF溶液(6 mL)中。室溫?cái)嚢?小時(shí)后，將反應(yīng)物注入EtOAc ， 依次以90%鹽水、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02， 以10。/o丙酮/CHCl3-15Q/o丙酮/CHCl3洗脫)純化提供白色固體狀的化合物19b (0.89g， 91%)。 19b31PNMR(300MHz， CDC13) 5: 149.4， 148.6。
實(shí)施例3
(1/ ，3及，4及，7^)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基-1-[1-(5)-(4，4'-二 甲氧三苯甲基)氧基-乙基-3-H-7V-苯甲酰基-胞嘧啶-l-基)-:2，5-二氧雜-雙環(huán) [2.2.1]庚烷，化合物24a的制備國TO、 0 f^N冊z e DMTO-、 ^ f^y^HBz
X y、-N ~—^ Xj ^v^
H:ClV 6 》、d O
23a 歸C、 zv ,P、
織
路線2(a) 1,2,4-三唑，P0C13， Et3N, CH3CN (b)氨水，二噪烷(c)苯甲酸 酐，DMF (d) Et3N.3HF， Et3N, THF(e) (iPr2N)2POCH2CH2CN, NMI,四唾，DMF
A) 化合物20a的制備
將三氯氧磷(0.98 mL， 10.5 mmol)逐滴添加至1,2,4-三唾(3.10 g, 44.9 mmol)冷((TC)的CH3CN懸浮液(17 mL)中。攪拌10分鐘后，向反應(yīng)物中加 入三乙胺(7.4 mL， 51.8 mmol)，繼續(xù)攪拌30分鐘。將化合物17a(0.91 g， 1.3 mmol)的CH3CN溶液(8 mL)添加至反應(yīng)物中，繼續(xù)在室溫下攪拌4小時(shí)。 將該反應(yīng)物注入EtOAc，以H20、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥 (Na2S04)并濃縮得到粗品化合物20a,其可在不作任何純化下用于下一步驟。
B) 化合物21a的制備
國TO
測TO—
TBS0"C5、
脇 21 b
DMTO.
-隨2
S幼
效
O
55將氨水溶液(4 mL)添加至化合物20a的1,4-二噁烷溶液(20 mL)中。室溫 攪拌16小時(shí)后，將反應(yīng)物真空濃縮。柱層析(Si02，以5Q/。的MeOH/CHCl3 洗脫)純化提供白色固體狀的化合物21a(0.80 g，由化合物17a為89%)。
C) 化合物22a的制備
向化合物21 a(0.80 g, 1.2 mmol)的WiV-二甲基甲酰胺溶液(3 mL)中添加 苯甲酸酐(0.41g， 1.8mmol)。室溫?cái)嚢?6小時(shí)后，將反應(yīng)物在高真空下濃 縮。柱層析(Si02,以50% EtOAc/己烷洗脫)純化得到化合物22a(0.81 g,88%)。
D) 化合物23a的制備
向化合物22a(0.81 g， 1.1 mmol)和三乙胺(0.35 mL, 2.5 mmol)的THF 溶液(7 mL)中添加三乙胺三氳氟酸鹽(l.OO mL， 6.1 mmol)。室溫?cái)嚢?8小 時(shí)后，將反應(yīng)物注入EtOAc,依次以H20、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)相， 干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以90。/。EtOAc/己烷洗脫)純化得到化合 物23a(0.68g, 99%)。
E) (1/ ，3及，4凡75)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧 基-l-[H"-(4，4'-二甲氧三苯甲基)氧基-乙基I-3-(4-iV-苯甲?；?胞嘧啶-l-基)-2，5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1庚烷，化合物24a的制備
將2-氰乙基iV，iV'-四異丙基亞磷酰胺(0.48 mL， 1.5mmol)加入到化合物 23a(0.68 g, 1.0 mmol)、四哇(56 mg, 0.81mmol)和TV-甲基咪唾(20 |aL, 0.3 mmol)的DMF溶液(5 mL)中。室溫?cái)嚢?小時(shí)后，將反應(yīng)物注入EtOAc ， 依次以90%鹽水、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02， 以60% EtOAc/己烷90% EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體狀的化合物 24a(0.73g, 84%)。 24a 31P NMR (300 MHz， CDC13) S: 149.4, 148.6。
56實(shí)施例4
(U ，3及，4及，75)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基-l-[l-(及H4，4'-二 甲氧三苯甲基)氧基-乙基-3-(4-7V-苯甲?；?胞嘧啶-l-基)-2，5-二氧雜-雙環(huán) [2.2.1庚烷，化合物24b的制^(路線2)
A) 化合物20b的制備
將三氯氧磷(L3 mL, 14.0 mmol)逐滴添加至1，2,4-三唑(4.10 g， 59.5 mmol)的冷(0。C)CH3CN懸浮液(30 mL)中。攪拌10分鐘后，向反應(yīng)中加入 三乙胺(9.80mL， 70.0mmo1)，繼續(xù)攪拌30分鐘。將化合物17b(1.20 g， 1.8 mmol)的CH3CN溶液(IO mL)添加至反應(yīng)中，繼續(xù)在室溫下攪拌4小時(shí)。將 該反應(yīng)物注入EtOAc，以H20、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04) 并濃縮得到粗品化合物20b，其可在不作任何純化下用于下一步驟。
B) 化合物21b的制備
將氨水溶液(5 mL)添加至三唑(triazolide)20b(由上文獲得)的1,4-二噁烷 溶液(25mL)中。室溫?cái)嚢?6小時(shí)后，將反應(yīng)物濃縮得到化合物21b，其在 高真空下干燥24小時(shí)，并不經(jīng)純化直接用于下一步驟。
C) 化合物22b的制備
向化合物21b (0.80 g， 1.2 mmol)的A^W-二甲基曱酰胺溶液(3 mL)中添 加苯甲酸酐(0.59g， 2.6mmo1)。室溫?cái)嚢?6小時(shí)后，將反應(yīng)物在高真空下 濃縮。柱層析(Si02，以50。/。EtOAc/己烷洗脫)純化得到化合物22b(1.36g， 由化合物17b為87%)。
D) 化合物23b的制備
向化合物23b(1.35 g， 1.7 mmol)和三乙胺(0.57 mL， 4.1 mmol)的THF 溶液(12 mL)中添加三乙胺三氳氟酸鹽(1.66 mL， 10.2 mmol)。室溫?cái)嚢?8小時(shí)后，將反應(yīng)物注入EtOAc，依次以1120、飽和NaHCCb、鹽水洗滌有機(jī) 相，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以含于氯仿的20%至40%丙酮洗 脫)純化得到化合物23b( 1.03 g, 90%)。
E) (1/ ，3及，4及，75)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧 基-1-[1-(及)-(4，4，- 二甲氧三苯甲基)氧基-乙基-3-(4-^-苯甲?；?胞嘧啶-l-基)-2，5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1庚烷，化合物24b的制備
將2-氰乙基7V，7V'-四異丙基亞磷酰胺(0.73 mL，2.3 mmol)加入化合物23b (1.03 g， 1.53 mmol)、四唾(85 mg， 1.2mmol)和7V-甲基口米哇(31 |iL, 0.38 mmol) 的DMF溶液(7.7 mL)中。室溫?cái)嚢?小時(shí)后，將反應(yīng)物注入EtOAc，依次 以90%鹽水、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02， 以60%至90%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體狀的化合物24b(1.22 g, 91%)。 24b31PNMR(300MHz， CDC13) 5: 149.5, 148.8。
實(shí)施例5
(1/ ，3及，4及，75)-7-2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基1-1-[1-(5)-(4，4'-二 甲氧三苯甲基)氧基-乙基-3-(6-7\^-苯甲?；汆堰?9-基)-2，5- 二氧雜-雙環(huán) [2.2.1庚烷，化合物33a的制備
58<formula>formula see original document page 59</formula>
路線3 (a) 6-jV-Bz隱腺噤呤，BSA, TMSOTf (b) K2C03, MeOH (c) TMSC1 ， 吡啶然后為BzCl,氨水(d)異丁酸酐，DMAP，吡啶，16h，室溫(e)10%Pd/C， hb氣球，24h至48(f)TBSCl，咪唑，DMF,室溫，48h(g)K2C03, MeOH,室 溫，16h(h)DMTCl， 2,6-二甲基吡啶,吡咬，45°C, 48h (i) Et3N.3HF, Et3N, THF, 室溫，48h (j) (iPr2)NPO(CH2)2CN， NMI,四唑，DMF
在回流的二氯乙烷中以6-iV-Bz-腺噤呤、BSA和TMSOTf通過化合物 10a的Vorbruggen反應(yīng)制備化合物25a。將25a與氫氧化鈉在二噁烷/水中 繼續(xù)反應(yīng)，然后以苯甲酰氯再保護(hù)4-氨基基團(tuán)得到核普化合物26a。通過所示的以化合物lla制備化合物19a的相同步驟由核苷化合物26a制備亞磷酰 胺，化合物33a。
實(shí)施例6
(li ，3及，4W，7S)-7-[2-氦基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基H-[l-(及)-(4，4'畫二 甲氧三苯甲基)氧基-乙基]-3-(6-7V-苯甲?；汆溥?9-基)-2，5-二氧雜-雙環(huán) [2.2.11庚烷，化合物33b的制4K路線3)
在回流的二氯乙烷中以6-7V-Bz-腺噤呤、BSA和TMSOTf通過化合物 10b的Vorbruggen反應(yīng)制備化合物25b。將25b與氫氧化鈉在二噁烷/水中 繼續(xù)反應(yīng)，然后以苯甲酰氯再保護(hù)4-氨基基團(tuán)得到核苷化合物26b。通過所 示的以化合物lib制備化合物19b的相同步驟由核苷化合物26b制備亞磷 酰胺，化合物33b。
實(shí)施例7
(11 ，3及，4及，75>7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基-1-[1-("-(4，4，-二 甲氧三苯甲基)氧基-乙基-3-(2-A^異丁酰鳥嘌呤-9-基)-2，5- 二氧雜-雙環(huán) [2.2.1庚烷，化合物42a的制備路線4(a)2-氨基-6-氯p票呤，BSA, TMSOTf, DCE,回流；(b) 3-羥基丙腈， NaH， THF, 4h; (c)異丁酸酐，DMAP，吡啶；(d)Pd/C, H2氣球；(e) TBSC1,咪 唑，DMF，室溫；(f)K2C03， MeOH,室溫，16h (g) DMTC1， 2,6-二甲基吡啶， 吡啶，45°C, 48h(h)Et3N.3HF, Et3N, THF,室溫，48h (i) (iPr2)NPO(CHs)2CN, NMI，四唑，DMF在回流的二氯乙烷中以2-氨基-6-氯噤呤、BSA和TMSOTf通過化合物 10a的Vorbruggen反應(yīng)制備化合物34a。核普34a與3-羥基丙腈和氫化鈉的 反應(yīng)提供了環(huán)化的核香35a。通過所示的以化合物lla制備化合物19a的相 同步驟由核苷化合物35a制備亞磷酰胺，化合物42a。
實(shí)施例8
(W，3及，4及，7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基H-[l-(if)-(4，4'國二 甲氧三苯甲基)氧基-乙基-3-(2-^-異丁酰鳥嘌呤-9-基)-2，5- 二氧雜-雙環(huán) [2.2.1庚烷，化合物42b的制備(路線4)
在回流的二氯乙烷中以2-氨基-6-氯噪呤、BSA和TMSOTf通過化合物 10b的Vorbruggen反應(yīng)制備化合物34b。核苷34b與3-羥基丙腈和氫化鈉 的反應(yīng)4是供了環(huán)化的核苷35b。通過所示的以化合物lib制備化合物19b的 相同步驟由核苷化合物35b制備亞磷酰胺，化合物42b。
實(shí)施例9
化合物48的制備N邵 Nap 48 鵃
路線5 (a) NapBr， NaH, DMF (b) AcOH, H20 (c) NaI04， 二噁烷，水(d)
HCHO， NaOH,水，THF (e) TBDPSC1 ， Et3N， CH2C12 (f) TBAF, THF
A) 化合物44的制備
在三口燒瓶(500 mL)中將市售的1,2;5,6-二-0-異亞丙基-a-D-呋喃阿洛 糖，化合物43， (135 g, 519.0 mmol)和2-(溴甲基)-萘(126 g， 570.0 mmol) 溶解于DMF(500mL),并在冰浴中冷卻該反應(yīng)物。將氫化鈉(60。/。w/w, 29 g， 727.0 mmol)小心添加(每10分鐘6 g)至反應(yīng)中，在添加完成后再行攪拌 60分鐘。此時(shí)，TLC分析顯示不再有起始的糖43。將該反應(yīng)物小心注入碎 冰中(約500 g)，并劇烈攪拌所得的漿液直至所有的冰融化。通過過濾收集 所得的白色固體，并懸浮于水中。使用機(jī)械攪拌器劇烈攪拌該懸浮液30分
63鐘，然后過濾采集該固體，并懸浮于己烷中。劇烈攪拌該懸浮液30分鐘，
然后過濾收集該固體，空氣干燥4-6小時(shí)，然后以P20s高真空干燥16小時(shí)， 得到供白色固體狀的化合物44(206.0 g， 99%)。 NMR (300 MHz， CDC13) 5:7.85(m， 4H)， 7.48 (m， 3H)， 5.74 (s， 1H)， 4.92 (d， 1H， 7=11.7)， 4.75 (d， 1H， /=11.6), 4.58 (m， 1H)， 4.36 (m， 1H)， 4.15 (m， 1H)， 4.03-3.86 (m， 3H)， 1.61 (s， 3H)， 1.36 (s， 9H)。
B) 化合物45的制備
將化合物44 (200.0 g， 0.5摩爾)分成小份加入乙酸(2.2 L)和水(740 mL) 的溶液中。將反應(yīng)物在室溫下攪拌16小時(shí)，隨后的TLC分析(30。/。EtOAc/ 己烷)顯示了 44的完全消耗。然后減壓濃縮該反應(yīng)物直至去除大部分乙酸。 將剩余溶液注入攪拌中的EtOAc (1 L)和水(l L)的混合物。然后向上述混合 物添加固體KOH直至該水層呈強(qiáng)堿性(pHH2)。然后分離有機(jī)層，以飽和 重碳酸鈉溶液、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04),過濾并減壓濃縮得到黃色 泡沫狀的化合物45,其可在不作任何純化下使用。
C) 化合物46的制備
將Nal04 (107.0 g)的水(3 L)溶液在40分鐘內(nèi)添加至攪拌(機(jī)械攪拌器) 中的化合物45(由前文得到的粗品)的二噁烷溶液(1.5 L)中。60分鐘后將該 反應(yīng)混合物注入EtOAc(1.5L),分離有機(jī)層，以水(1L)、鹽水(l L)洗滌， 干燥(Na2S04)并濃縮得到黃色油狀的化合物46,其可在不作任何純化下使 用。
D) 化合物47的制備
將化合物46(由前面獲得的粗品)溶解于THF(500 mL)和H20 (500 mL) 的混合物中，并將反應(yīng)物在冰浴中冷卻。將2N NaOH (600 mL)和甲醛(250mL, 37%水溶液)添加至該反應(yīng)物，繼續(xù)在室溫下攪拌3天。然后將該反應(yīng) 物注入EtOAc (1 L)，并以水(l L)、鹽水(l L)洗滌，減壓蒸發(fā)至剩余約200 mL 的EtOAc(該過程中形成白色沉淀)。將己烷(300 mL)添加至該沉淀物，并將 該混合物放置16小時(shí)，然后過濾收集白色固體，以己烷洗滌，通過P205 真空干燥得到白色固體狀的化合物47(124g,由44為66%)。 'HNMR(300 MHz, CDC13) S: 7.85 (m, 4H), 7,48 (m, 3H), 5.75 (d， 1H, /= 3,9), 4.96 (d, 1H. /= 11.8), 4.75 (d, 1H, J= 11.8), 4.66 (m, 1H), 4.26 (d, 1H, /= 5.2), 3.95 (m, 2H), 3.79 (m, 1H), 3.63 (m, 1H), 2.39 (m, 1H, OH), 1.66 (s, 3H), 1.34 (s， 3H)。 E) 化合物48和49的制備
將叔丁基二苯基氯硅烷(305.0 mmol， 84.0 mL)添加至攪拌中的化合物 47(278.0mmo1， 100.0 g)和三乙胺(305 mmol， 43.0 mL)的冷(0。C)二氯甲烷溶 液(600 mL)中。添加完成后，將反應(yīng)加熱至室溫，并繼續(xù)攪拌16小時(shí)。將 MeOH (50 mL)加入反應(yīng)物(以去除過量的TBDPSC1),并在室溫下繼續(xù)攪拌 2小時(shí)。然后以氯仿稀釋該反應(yīng)物，并以10。/oHCl、飽和NaHC03、鹽水洗 滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并濃縮得到稠油。將己烷(150mL加入該油，對該 混合物超聲直至得到溶液?，F(xiàn)在向溶液中加入少量6(之前通過色譜分離)。 放置16小時(shí)后，再向該厚漿液添加己烷，并過濾收集固體。然后將該固體 重懸浮于己烷，并劇烈攪拌30分鐘。過濾收集該固體以在高真空干燥16 小時(shí)后才是供6(80.5 g， 48%)。合并濾出液，并減壓濃縮。將所得的油重新溶 解于最小量的己烷，并通過硅填料(以溶于己烷的20% EtOAc洗脫)。合并 還有產(chǎn)物6的組分，濃縮并如上文結(jié)晶得到白色固體狀的第二批6(20 g， 12%)。用溶于己烷的50% EtOAc進(jìn)一步洗脫該硅膠填料得到稠油狀的純化 合物48 (40.0g， 24%)。此外還分離得到稠油狀的48和49(約15 g， 9%)的
65混合物。二醇48; NMR (300 MHz， CDC13) S: 7.83 (m， 4H), 7.56 (m, 7H), 7.30 (m, 6H), 5.80 (s， 1H), 4.97 (d, 1H, /= 11.4), 4.70 (m, 2H), 4.46 (m， 1H), 3.92-3.66 (m, 4H), 2.39 (m, 1H, OH), 1.67 (s, 3H), 1.37 (s, 3H)， 0.92 (s, 9H). 二醇7; 'H NMR (300 MHz, CDC13) 5: 7.9-7.3 (m, 17H), 5.71 (d, 1H, /= 3.9), 4.86 (d, 1H, /= 12.2), 4.74 (d, 1H, /= 12.2)， 4.56 (m， 1H), 4.22 (d, 1H, J= 11.1), 4.18 Cm, 1H), 4.07 (d, 1H, /= 11.1), 4.02 (dd, 1H, /= 4.2， 12.0), 3.64 (dd， 1H， /= 9.4, 11.9), 1.89 (m， 1H), 1.25 (s, 6H), 1.05 (s, 9H)。 F)由化合物49回收化合物47
將四丁基氟化銨(70 mL溶于THF的1M溶液)添加入攪拌中的二醇49 (62.7mmo1, 37.5 g)的;4K0。C)THF溶液(250 mL)中，然后使反應(yīng)物逐漸升溫 至室溫。繼續(xù)攪拌72小時(shí)后，將反應(yīng)物真空濃縮，并將殘留物傾倒在碎冰 中。以額外的THF(3倍)洗滌該燒瓶，并加入上述懸浮液。傾析去除上清液， 將底部的固體加入攪拌中的己烷(200mL)和水(200mL)的混合物。攪拌2小 時(shí)后，過濾收集該絮狀固體，以額外的水和己烷洗滌并高真空干燥，得到 白色固體狀的化合物47(20 g, 89%)。
實(shí)施例10 化合物60的制備路線6 (a)新戊酰氯，DIPEA, DMAP, CH2C12 (b) 70% HF/吡咬，THF (c)草 酰氯，DMAP, Et3N, CH2C12 (d)乙雄基溴化鎂，THF (e) NaOH, MeOH,水(f) TsCl, 吡啶(g)異丁?；?DIPEA, DMAP, CH2C12
A) 化合物51的制備
將新戊酰氯(25 mmol, 3.0 mL)逐滴加入化合物48 (16.7 mmol, 10.0 g)、 二異丙基乙胺(25.0 mmol, 4.4 mL)和二甲基氨甲基吡啶(2.5 mmol， 0.30 g) 的冷((TC)二氯甲烷溶液(35 mL)中。室溫?cái)嚢?6小時(shí)后，以氯仿稀釋反應(yīng) 物，以5。/。HCl、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并濃縮得 到粗品化合物51，其可在不作進(jìn)一步純化下使用。B) 化合物52的制備
將70% HF/吡^定(4.2 mL)加入粗品51(來自上文)的冷(0。C)溶液中。在室 溫下攪拌16小時(shí)后再向反應(yīng)添加70MHF/吡啶(2.5 mL)。再在室溫下攪拌2 天后，向該反應(yīng)物小心添加三乙胺(7.5mL)。攪拌1小時(shí)后，以NaHC03小 心終止該反應(yīng)，直至pHMO。以EtOAc稀釋反應(yīng)物，并以鹽水進(jìn)一步洗滌 有機(jī)層，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以溶于己烷的25至40% EtOAc 洗脫)純化得到油狀的化合物52(7.01 g，由化合物48為95%)。
C) 化合物53的制備
將DMSO(3.30mL， 46.7 mmol)加入到草酰氯(23.3 mmol， 2.0mL)的二 氯甲烷(120 mL)冷(-78。C)溶液中。攪拌30分鐘后，通過插管向反應(yīng)物添加 溶于二氯甲烷(30mL)的化合物52(15.6 mmol， 6.91 g)中。在-78。C下攪拌45 分鐘后，添加三乙胺(70.0 mmol， 9.60 mL)并使反應(yīng)物升溫至0°C 。此時(shí)的 TLC分析顯示沒有起始物質(zhì)化合物52,因此以氯仿稀釋反應(yīng)物，以10% HC1、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并濃縮得到化合物53, 其可在不作進(jìn)一步純化下使用。
D) 化合物54和55的制備
將乙烯基溴化鎂(溶于THF的1M溶液，31.1 mL)緩慢加入到化合物53 的冷(-78。C)THF溶液(120 mL)中。-78°C下攪拌2小時(shí)后，以飽和NH4C1終 止反應(yīng)，并以EtOAc稀釋反應(yīng)物。以10% HC1、飽和NaHC03、鹽水洗滌 該有機(jī)層，干燥(Na2S04)并濃縮得到化合物54和化合物55的混合物，其可 在不作進(jìn)一步純化下使用。
E) 化合物56和57的制備
68將NaOH (4M， 12.5 mL)溶液添加入到化合物54和化合物55的二。惡烷 /甲醇(30 mL/10 mL)溶液中。室溫?cái)嚢?小時(shí)后，減壓蒸發(fā)溶劑，并將殘留 物溶解于EtOAc。然后以水，鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層 析(Si02，以溶于己烷的33至40% EtOAc洗脫)純化得到油狀的化合物 57(2.42 g,由53為40%)。提高洗脫液(溶于己烷的60% EtOAc)的極性得到 化合物56 (0.82 g，由化合物53為14%)。 57 & NMR (300 MHz, CDC13) 5: 7.94-7.73 (m， 4H)， 7.60-7.46 (m, 3H), 6.04-5.85 (m, 1H), 5.69 (d, 1H, J= 3.6), 5.36 (d, 1H， J= 17.3), 5.24 (d, 1H, /= 10.6)， 4.97 (d, 1H, /= 11.7)， 4.74 (d， 1H, /= 11.7), 4.59 (m, 1H), 4.33 (m, 2H), 4.19 (d, 1H, /= 11.9), 3.85 (d， 1H, /= 1 1.9), 1.65 (s, 3H), 1.34 (s, 3H)。
F) 化合物58的制備
將甲苯磺酰氯(9.3 nmol， 1.77 g)加入到化合物57(2.43 g， 6.29 mmol)的 冷(0。C)吡啶溶液(12.6 mL)中。在0。C下攪拌8小時(shí)后，用水終止該反應(yīng)并 以EtOAc稀釋。依次以5% HC1、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥 (Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以溶于己烷的15%至25%的EtOAc洗脫) 純化得到白色固體狀的化合物58(2.58g,760/0)。同樣分離未反應(yīng)的57(0.39 g，腦)。
G) 化合物59的制備
將異丁酰氯(6.9 mmol， 0.73 mL)加入到化合物58 (4.6 mmol， 2.48 g)、 二異丙基乙胺(6.9mmo1， 0.88 mL)和二甲基氨甲基吡啶(0.68 g， 83mg)的冷 ((TC)二氯甲烷溶液(9mL)中。在0。C下2小時(shí)后，向該反應(yīng)物添加額外的異 丁酰氯(6.9mmo1, 0.73 mL)和二異丙基乙胺(6.9 mmol， 0.88 mL)。在0。C下 另外2小時(shí)后，向該反應(yīng)物添加額外的異丁酰氯(6.9mmo1， 0.73 mL)和二異丙基乙胺(6.9 mmol， 0.88 mL)，在0°C下攪拌該反應(yīng)物16小時(shí)。小心向反 應(yīng)中添加水以去除任意未反應(yīng)的?；龋⒃谑覝叵吕^續(xù)攪拌1小時(shí)。然 后以氯仿稀釋該反應(yīng)物，并以5。/oHCl、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)層， 干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以溶于己烷的25%EtOAc洗脫)純化提 供油狀的化合物59(2,2g， 83%)。在純化后還可分離未反應(yīng)的58(0.31 g， 13%)。
H) 化合物60的制備
將濃辟u酸(3-4滴)加入到溶于醋酸(ll mL)和乙酸酐(3 mL)的化合物 59(3.6 mmol， 2.20g)的溶液中。室溫?cái)嚢?小時(shí)后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中(不加 熱)高真空下去除溶劑，并將殘留物溶解于EtOAc。然后以飽和NaHC03、 鹽水小心洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并濃縮得到化合物60，其在高真空下 以P205干燥，并可在不作任何純化下使用。60LCMS:M+23計(jì)算值677.2， 測得值677.1; LC保留時(shí)間為2.05分鐘。
實(shí)施例11
(li ，3i ，4R，ZSV7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基H-[l-CS)-(4，4，-二 甲氧三苯甲基)氧基-(3-丙烯基)-3-(尿嘧啶-1-基)-2，5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1庚烷 (69)的制備他P'-Cf 、Ac 1
O
0H
62
然
郎
路線7(a)尿嘧啶，BSA, TMSOTf, CH3CN (b) NaOH, 二噁烷，水(c)BzCl， 吡啶(d) DDQ, CH2Cl2 ，水(e) TBSCl ，咪唑，DMF (f) t-BuNH2或氨水(g) DMTCl, 吡啶，2,6-二甲基吡啶(h)Et3N.3HF, Et3N， THF (i) (JPr2N)2POCH2CH2CN,四唑， 雨I， DMF
A) 化合物61的制備
將WO-雙-三曱硅烷酰胺(18.0 mmol, 4.4mL)加入到化合物60 (3.6 mmol，由前面得到的粗產(chǎn)品)和尿嘧啶(7.2 mmol， 0.81 g)的乙腈懸浮液(18
71
丄
鉍
*、omL)中，將懸浮液溫和加熱(使用空氣加熱槍)直至得到溶液。在冰浴中冷卻
該反應(yīng)物，并將TMSOTf(7.2mmo1, 1.3mL)添加至反應(yīng)。添加完成后，去 除冰浴并將反應(yīng)物回流2小時(shí)，然后將其冷卻至室溫，以EtOAc稀釋并以 飽和NaHC03溶液小心終止。以鹽水進(jìn)一步洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并濃 縮得到化合物61，其可在不作任何純化下使用。
B) 化合物62的制備
將NaOH (2M, 7.2 mL)溶液添加至粗品化合物61 (由前面得到)的冷(O°C) 二噁烷溶液(10mL)中。0。C下2小時(shí)后，向反應(yīng)中添加額外的NaOH(2M， 10 mL)。室溫下攪拌16小時(shí)后，以5% HC1 (pH 4-5)酸化反應(yīng)物，以EtOAc 稀釋，并以水、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并濃縮。形成白色沉淀，用 醚小心洗滌，高真空干燥得到核苷化合物62 (0.97 g， 64%)。通過柱層析 (Si02，以溶于氯仿的25%丙酮洗脫)得到額外數(shù)量的部分純化化合物62 (0.10 g， 7%)。
C) 化合物63的制備
向化合物62 (2.0 mmol, 0.85 g)的吡啶溶液(4 mL)添加苯甲酸酐(2.8 mmol， 0.64 g)。在室溫下攪拌6小時(shí)后，用水終止該反應(yīng)并以EtOAc稀釋。 以飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以 溶于己烷的50%EtOAc洗脫)純化得到白色固體狀的化合物63 (1.069 g,定量)。
D) 化合物64的制備
向溶于二氯甲烷(19 mL)和水(l mL)的化合物64 (1.9 mmol， 1.0 g)的溶 液中添加DDQ(3.8mmo1， 0.86 g)。室溫?cái)嚢?4小時(shí)后將反應(yīng)物減壓濃縮。 將殘留物溶解于EtOAc，并以水、10%亞石克酸氫鈉、飽和NaHC03、鹽水洗200780026 滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02,以溶于己烷的75%的EtOAc 洗脫)純化得到化合物64(0.74g，定量)。
E) 化合物65的制備
將TBSCl(5.8mmo1， 0.87 g)添加至化合物64 (1.9 mmol， 0.75 g)和咪唾 (11.6 mmol, 0.79 g)的DMF溶液(5 mL)中。室溫下攪拌16小時(shí)后，以EtOAc 稀釋反應(yīng)物，并以水、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02， 溶于己烷的50% EtOAc)純化提供白色泡沫狀的化合物65 (0.89 g, 94%)。
F) 化合物66的制備
將化合物65 (1.6 mmol ， 0.8 mmol)溶解于氨的甲醇溶液(7M， 25 mL)中。 在密封容器中45。C下加熱4天后，減壓去除溶劑。柱層析(Si02，溶于氯仿 的2至4%的甲醇)純化得到白色固體狀的化合物66 (0.65 g,定量)。66 & 麗R (300 MHz, CDC13) S: 8.57 (s， br, 1H), 7.84 (d, 1H, J= 8.2), 6.10-5.96 (m, 1H), 5.74 (d, 1H， /= 8.2), 5.64 (s, 1H), 5.41-5,44 (m, 2H), 4.35 (m, 1H), 4.26 (s, 1H), 4.13 (s, 1H)， 3.95 (d, 1H, J= 7.8), 3.66 (d, 1H, 7.8), 2.04 (d, 1H, /= 4.3), 0.90 (s, 9H), 0.11 (s, 3H), 0.10 (s, 3H)。
G) 化合物67的制備
將化合物66 (0.25 mmol， 0.1 g)、 DMTC1 (0.63 mmol， 0.21 g)和2,6-二 甲基吡啶(0.63mmo1, 73 (xL)的吡啶溶液在45°C下加熱10天。將反應(yīng)物冷 卻至室溫并以EtOAc稀釋。以飽和重石炭酸鈉、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04) 并減壓濃縮。柱層析(Si02，以溶于己烷的15%至45%的EtOAc洗脫)純化 得到白色固體狀的化合物67 (0.16 g， 93%)。67 ^NMR (300 MHz, CDC13) 5: 8.92 (s, br, 1H), 8.26 (d, 1H, /= 8.2), 7.53-7.24 (m, 9H), 6.97-6.78 (m, 4H), 6.08-5.88 (m, 1H), 5.73 (s， 1H), 5.68 (d, 1H， /= 8.2), 4.83 (s, 1H, J= 11.0), 4.58
73(d, 1H， /= 17.3), 4.37 (s, 1H), 4.04 (d, 1H, /= 9.5)， 3.84 (s, 6H， 3.78， m, 1H，部 分重疊)，3,55 (d, 1H, /= 7.9), 0.83 (s, 9H), 0.11 (s, 3H), 0.00 (s, 3H)。
H) 化合物68的制備
向化合物67 (0.22 mmol， 0.15 g)和三乙胺(0.54 mmol， 75 (iL)的THF溶 液(2 mL)中添加三乙胺三氫氟酸鹽(1.3 mmo1,0.21 mL)。室溫下攪拌2天后， 以EtOAc稀釋反應(yīng)物，并以飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04) 并濃縮。LCMS: M+23;計(jì)算值607.2，測得值607.2; LC保留時(shí)間為 3.51分鐘。
I) 化合物69的制備
亞磷酰胺化合物69可參照實(shí)施例1中由化合物18a制備亞磷酰胺19a 的步驟由化合物68制備得到。
實(shí)施例12
(1/ ，3及，4及，75)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基-1-[1-(5)-(4，4'-二 甲氧三苯甲基)氧基-(3-丙烯基)-3-(4-7V-苯甲酰基-胞嘧啶-l-基)-2，5-二氧雜國 雙環(huán)2,2.1庚烷(73)的制備
74亞磷酰胺73可參照實(shí)施例3中由化合物17a制備亞磷酰胺24a的相同 的一般步驟由化合物67制備得到。
實(shí)施例13
(1^，3及，41 ，7外7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)-膦氧基-l-[HS)-(4，4'國二 甲氧三苯甲基)氧基-(3-丙烯基)-3-(4^-苯甲酰基-胞嘧啶-1-基)-2,5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1庚烷(73)的制備的替代途徑
l 、、OD附
NHBz h
res、cTo
71
NH82
Hcf、0
72
\\ JODWT
73
路線8(a)POCl3, 1,2,4-三唑，Et3N, CH3CN (b)氨水(c)Bz20， DMF (d)
Et3N.3HF, Et3N, THF (e) (iPr2N)2POCH2CH2CN，四唑，NMI， DMF
3
o<formula>formula see original document page 76</formula>C—終Bz》
路線9 (a)N-苯甲?；?胞嘧咬，BSA，TMSOTf (b)NaOH,MeOH,水(c) BzCl, 吡啶(d) DDQ, CH2CI2,水(e) TBSC1,咪唑，DMF (f) t-BuNH2或氨水(g) DMTCl, 2,6- 二甲基吡啶，吡啶(h)Et3N.3HF， Et3N, THF (i) (iPr2N)2POCH2CH2CN,四 "坐，NMI， DMF
化合物73可參照實(shí)施例11中由化合物60制備亞磷酰胺化合物69的 相同的一般步驟制備得到。化合物60與N-苯甲?；?胞嘧啶、BSA和 TMSOTf在回流乙腈中進(jìn)行Vorbrugen反應(yīng)提供核香化合物74 。以NaOH 水溶液處理74可引起環(huán)化形成化合物75。以溶于吡啶的BzCl保護(hù)5'-羥基基團(tuán)和環(huán)外胺得到化合物76。進(jìn)一步處理化合物76為亞磷酰胺化合物71
的步驟類似于所述的由化合物63制備亞磷酰胺化合物69的制備步驟。 實(shí)施例14
(1/ ，3及，4及，7^-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基-1-[1-(^)-(4，4，-二 甲氧三苯甲基)氧基-(3-丙烯基)-3-(6-N-苯甲酰基腺嘌呤-9-基)-2,5- 二氧雜-雙環(huán)[2,2.1庚烷(88)的制備
效效
路線10 (a)iV-苯甲?；?腺噤呤，BSA, TMSOTf (b) NaOH， MeOH,水(c) BzCl，吡啶(d)DDQ， CH2C12, Jc(e)TBSCl,咪唑，DMF (f) t-BuNH2或氨水(g)DMTC1 ， 2,6- 二甲基吡啶，吡啶(h) Et3N.3HF , Et3N , THF (i) (iPr2N)2POCH2CH2CN,四唑，NMI, DMF
化合物88可參照實(shí)施例11中由化合物60制備亞磷酰胺化合物69的 相同的一般步驟制備得到?；衔?0與N-苯甲?；?腺噤呤、BSA和 TMSOTf在回流二氯乙烷中進(jìn)行Vorbmgen反應(yīng)^是供核苷化合物80。以 NaOH水溶液處理80可引起環(huán)化形成化合物81。以溶于吡咬的BzCl保護(hù) 5'-羥基基團(tuán)和環(huán)外胺得到化合物82。進(jìn)一步處理化合物82為亞磷酰胺化合 物88的步驟類1
實(shí)施例15
(1/ ，3及，4及，75>7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基-1-[1-(^-(4，4'-二 甲氧三苯甲基)氧基-(3-丙烯基)-3-(2-7V-異丁酰鳥嘌呤-9-基)-2，5- 二氧雜-雙 環(huán)[2.2.1庚坑(97)的制備<formula>formula see original document page 79</formula>路線11(a)2-氨基-6-氯噤呤，BSA， TMSOTf (b) 3-羥基丙腈，NaH， THF (c) TMSC1,吡啶，異丁酰氯，(d)BzCl，吡啶(e)DDQ, CH2C12,水(f)TBSCl，咪 唑，DMF (g) t-BuNH2或氨水(h) DMTC1 ， 2,6-二甲基吡啶，吡啶(i) Et3N.3HF, Et3N， THF(j)(iPr2N)2POCH2CH2CN,四唑，NMI， DMF 化合物97可參照實(shí)施例11中由化合物60制備亞磷酰胺化合物69的 相同的一般步驟制備得到。化合物60與2-氨基-6-氯嘌呤、BSA和TMSOTf 在回流二氯乙烷中進(jìn)行Vorbmgen反應(yīng)提供核苷化合物89。以3-羥基丙腈 和氫化鈉處理89可引起環(huán)化形成化合物90。瞬時(shí)將5'羥基基團(tuán)保護(hù)為三甲 硅烷醚后以異丁酰氯保護(hù)環(huán)外氨基基團(tuán)。在水檢查條件下對三甲硅烷醚脫保護(hù)，然后將5'幾基基團(tuán)保護(hù)為苯酸酯(苯甲?；龋拎?得到化合物91。
將化合物91進(jìn)一步處理為亞磷酰胺化合物97的步驟類似于所述的由化合 物63制備亞磷酰胺化合物69的步驟。
實(shí)施例16
(1/ ，3及，4及，7^-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-1-[1-(5)-(4，4，-二 甲氧三苯甲基)氧基-(3-丙基)l-3-(選擇的堿基，任選地被保護(hù))-2，5-二氧雜-雙環(huán)[2,2.1庚烷(110-113)的制備
86, Bx - U
94, Bx = 6-(沐isobu》
鄉(xiāng)，Bx = U 99, Bx - C-(A/-Bz》 纖8x = A扭Bzf ,M,Bx = G~,sobu
、0瞎
182, Bx U
1M,Bx-A-(W-B'z) 鄉(xiāng)，Bx G-(W-lsobu》
糊，Bx = U
10 , Bx-G-《W-teo&u)
、ODMT
m bx=u
1"H,8)( = CKW-Bz》 112,8x = A-(沐B2！
路線12(a)Pd/C， H2氣球(b)DMTCl， 2,6-二甲基吡啶，吡啶(c)Et3N.3HF:
Et3N, THF(d)(iPr2N)2POCH2CH2CN，四唑，NMI， DMF
A) 化合物98的制備
將活性炭上的鈀(5 mg)和溶于MeOH (2 mL)的化合物66(0.25 mmol， 0.10 g)的混合物以氫氣球氫化。1小時(shí)后，以硅藻土過濾該反應(yīng)物，并以EtOAc洗滌濾床。減壓蒸發(fā)溶劑得到98，其在高真空下進(jìn)一步干燥并在不
經(jīng)純化下使用。
B) 化合物102的制備
將化合物98 (0.25 mmol， 0.1 g)、 DMTC1 (0.63 mmol， 0.21 g)和2，6-二 甲基吡啶(0.63 mmol， 73 (iL)的吡啶溶液在45°C下加熱7天。將反應(yīng)物冷 卻至室溫并以EtOAc稀釋。以飽和重碳酸鈉、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04) 并減壓濃縮。柱層析(Si02，以溶于己烷的15%至45%的EtOAc洗脫)純化 得到白色固體狀的化合物102 (0.10 g, 58%)。 102 (^HNMR (300 MHz, CDC13) S: 9.1 (s, br, 1H), 8.26 (d, 1H, /= 8.2), 7.42-7.20 (m, 9H), 6.84-6.78 (m， 4H)， 5.69 (s， 1H), 5.66 (d, 1H,重疊)，4.33 (s, 1H), 4.32 (s, 1H), 3.85 (d, 1H, /= 7.5), 3.8 (s, 6H), 3.75 (d, 1H, /= 7.5), 3.42 (d, 1H， 《/= 8.2)， 1.65 (m， 1H), 1.47 (m, 1H), 0.79 (s, 9H)， 0.25 (t, 3H， /= 7.5), 0.02 (s, 3H), -0.18 (s, 3H)。
C) 化合物110的制備
亞磷酰胺化合物110可參照實(shí)施例1中由化合物17a制備亞磷酰胺化 合物19a的相同的一般步驟由化合物102制備得到。亞磷酰胺化合物 111-113可由核苷化合物79、 85和94制備得到。使用石友上的鈀和氫對該雙 鍵氫化以分別提供化合物98-101。將5'羥基基團(tuán)保護(hù)為二甲氧三苯甲醚， 然后去除甲硅烷基保護(hù)基團(tuán)，并通過亞磷?；磻?yīng)得到亞磷酰胺化合物 110-113。
實(shí)施例17
化合物116a, 116b, 116c和116d的制備<formula>formula see original document page 82</formula>路線13 (a) NaH, BomCl, DMF (b) Os04, NaI04, 二噁烷，水(c) NaBH4, MeOH
A) 化合物114a的制備
將氫化鈉(60% ， 1.0 mmol ， 40 mg)加入到化合物66 (0.25 mmol ， 0.10 g) 和千氧基甲基氯(BomCl， 0.75 mmol， 0.1 mL)的冷(0。C)DMF溶液(l mL)中。 1小時(shí)后，以水終止反應(yīng)，并以EtOAc稀釋。然后以水、鹽水洗滌有機(jī)相， 干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，溶于己烷的30n/oEtOAc)純化該殘留物 得到白色固體狀的化合物114a (0.15 g， 93%)。
B) 化合物115a的制備將四氧化鋨(2.5%溶于異丙醇，0.12mL)的溶液添加至化合物114a(0.17 g， 0.11 g)、高碘酸鈉(0.70mmo1， 0.15 g)和2-6-二甲基吡啶(0.12 mL)溶于 二噁烷(2 mL)和水(0.5 mL)的混合物中。室溫?cái)嚢?6小時(shí)后，以EtoAC稀 釋反應(yīng)物，以水、10°/^克代>晚酸鈉、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并濃縮 得到粗品化合物115a，其可在不作進(jìn)一步純化下使用。
C) 化合物116a的制備
將硼氫化鈉(25 mg)添加至粗品化合物115a(由前面得到)的MeOH溶液 (1 mL)中。室溫下攪拌l小時(shí)后，以EtOAc稀釋反應(yīng)物，并以10。/oHCl、 飽和重碳酸鈉、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02,以 溶于己烷的50%EtOAc洗脫)純化殘留物得到油狀的化合物116a (73 mg， 由115a為65%)。 116a (!H雇R (300 MHz, CDC13) 5: 7.69 (d， 1H, /= 8.2), 7.49-7.24 (m, 10H), 5.77 (d, IH, /= 8.2), 5.61 (s, IH), 5.47 (m, 2H)， 4.98 (d, 1H， /= 6.9)， 4.84 (d, 1H， /= 6.9)， 4.80 (d, IH, /= 11.8), 4.69 (s, 2H), 4.66 (d， IH, J= 11.8), 4.29 (s, IH)， 4.03 (s， IH), 3.96-3.79 (m, 3H), 3.67 (m, IH)， 3.22 (m, IH), 0.87 (s, 9H), 0.07 (s, 3H), 0.04 (s， 3H)。
D) 化合物116b-d的制備
將化合物79、 85和94與千氧基甲基氯和氫化鈉反應(yīng)分別才是供核苷化 合物114b-d。斷裂四氧化鋨的雙鍵得到醛化合物115b-d。使用硼氫化鈉進(jìn) 一步還原醛官能團(tuán)以分別提供化合物116b-d。
實(shí)施例18
核苷117a-d至128a-d的制備A)化合物127a (R = Me)的制備
將氳化鈉(60%， 0.23 mmol, 9 mg)加入化合物116a (0.11 mmol， 73 mg) 和碘甲烷(0.57 mmol， 40 ^L)的冷((TC)DMF溶液(0.25 mL)。在0°C下攪拌1 小時(shí)后，用水終止該反應(yīng)并以EtOAc稀釋。然后以鹽水洗滌有機(jī)相，干燥 (Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02,以溶于己烷的20Q/Q至40y。EtOAc洗脫)純化得到油狀的化合物127a(27mg, 37%)。 127a ('HNMR(300 MHz, CDC13) S: 7.79 (d, 1H, /= 8.2), 7.45-7.28 (m， 10H), 5.74 (d， 1H, J= 8.2), 5.62 (s, 1H), 5.48 (m, 2H), 4.90 (m, 2H), 4.74 (d, 1H, J= 11.9), 4.69 (s, 1H)， 4.60 (s, 1H, J= 11.9), 4.29 (s， 1H)， 4.04 (s, 1H), 4.04 (m, 1H,重疊)，3.99 (d, 1H, /= 8,3), 3.84 (d, 1H, /= 8.2), 3.72-3.48 (m, 2H), 3.35 (s， 3H), 0.87 (s， 9H)， 0.07 (s, 3H)， 0.04 (s, 3H)。
B)化合物117a-d至123a-d的制備
通過用氟化劑(例如DAST)以二氯甲烷為溶劑處理化合物116a-d來制 備化合物117a-d?；衔?18a-d可通過首先以Dess-Martin高價(jià)碘或在Swern 條件下氧化化合物116a-d的伯羥基基團(tuán)然后以DAST處理所得的醛制備得 到。化合物119a-d可通過首先以Dess-Martin高{介硤或在Swern條件下氧化 化合物116a-d的伯羥基然后在冰醋酸和還原劑(例如，硼氬化氰鈉)存在下 以伯或仲胺還原胺化所得的醛制備得到?；衔?20a-d可通過將化合物 116a-d的羥基基團(tuán)轉(zhuǎn)化為疏代碳酸脂衍生物后通過采用nBu3SnH的自由基 脫氧步驟制備得到?；衔?21a-d可通過先將化合物116a-d的羥基基團(tuán)轉(zhuǎn) 化為離去基團(tuán)(甲磺酸、甲苯磺酸、卣化物)然后以過量的疊氮化鈉加熱制備 得到?；衔?24a-d可通過先將化合物116a-d的伯醇氧化為羧酸，然后在 HATU或任意其它肽偶合劑的存在下與胺反應(yīng)制備得到?；衔?25a-b可 通過用羰基二咪唑活化化合物116a-d的羥基基團(tuán)后與胺反應(yīng)制備得到?；?合物126a-d可通過在Swern或Dess-Martin條件下氧化化合物116a-d的伯 醇，然后與適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)金屬試劑反應(yīng)制備得到。化合物127b-d(127a在部分 A制備得到，R = CH3)可通過以適當(dāng)?shù)膲A基將化合物116b-d的幾基基團(tuán)去 質(zhì)子化后，以烷基化試劑去除陰離子后制備得到?；衔?28a-d可通過將化合物116a-d的羥基基團(tuán)轉(zhuǎn)化為離去基團(tuán)后以疏醇親核體置換制備得到。
酸酯反應(yīng)制備得到?；衔?23a-d可通過還原化合物121a-d的疊氮基團(tuán)并 與FmocNCS反應(yīng)提供活化的硫脲制備得到。fmoc活化硫醇在EDC存在下 進(jìn)一 步與胺反應(yīng)可提供取代的胍。去除fmoc保護(hù)基團(tuán)可釋放化合物123a-d。
實(shí)施例19
亞磷酰胺141-144的制備
Bom
備
129,8x-U
131,8x = A-(沐Bz》 132, Bx G《W-lsobu)
鄰MT
133，Bx = U
1沐Bx-G-卦tsobu)
、ODMT
137, Bx = U
138, Bx
140,8x G#Wsobu)
》
141, Bx=U
142, Bx = C"<W-Bz》
143, BpA*Bz》
路線15 (a) Pd/C， H2 (b) DMTC1, 2,6-二甲基吡啶，吡咬(c) Et3N.3HF, Et3N,
THF (d) (iPr2N)2POCH2CH2CN,四唾，NMI, DMF
A)化合物129的制備(Z = CH2OMe)
86將活性炭載鈀(3 mg)和溶于MeOH (1 mL)的化合物127a (0.04 mmol，27 mg)的混合物以氫氣球氫化。24小時(shí)后，以硅藻土過濾該反應(yīng)物，并以EtOAc 洗滌濾床。減壓蒸發(fā)溶劑，并將殘留物溶解于MeOH (1 mL)和三乙胺(2滴) 中。室溫?cái)嚢?小時(shí)后，減壓去除溶劑得到129。 129 (111 NMR (300 MHz, CDC13) 5: 7.89 (d， 1H, /= 8.2)， 5.75 (d， 1H, J= 8.2), 5.63 (s, 1H), 4.22 (s, 1H), 4.17 (s, 1H), 4.08 Cm， 1H), 3.98 (d, 1H, J= 7.6), 3.71 (d， 1H, /= 7.6), 3.60 (t, 1H, /= 9.1), 3.44 (s, 3H), 3.42 (m, 1H，重疊)，0.88 (s, 9H)， 0.10 (s, 3H), 0.09 (s, 3H)。
B) 化合物141的制備
化合物129可參照實(shí)施例1中由化合物16a制備亞磷酰胺化合物19a 的相同的 一般步驟轉(zhuǎn)化為亞磷酰胺化合物141。
C) 化合物142-144的制備
化合物130-132可采用碳載催化性鈀和氫氣氫化千氧基甲基保護(hù)基團(tuán) 后制備得到。將5'羥基基團(tuán)保護(hù)為二甲氧三苯甲醚，然后去除甲硅烷基保 護(hù)基團(tuán)，并通過亞磷?；磻?yīng)4是供亞磷酰胺化合物142-144。
實(shí)施例20
核苷亞磷酰胺的合成
核苷亞磷酰胺可參照此處和本領(lǐng)域(例如但不限于美國專利6,426,220 和PCT公開WO 02/36743)所述的方法進(jìn)行制備。
實(shí)施例21
寡核苷酸和寡核苷的合成如本發(fā)明所述的低聚化合物可通過公知的固相合成技術(shù)進(jìn)行常規(guī)制
備。進(jìn)行該種合成的設(shè)備已由多家銷售商出售，例如，Applied Biosystems (Foster City, CA)。本領(lǐng)域已知的任何其它該類合成方法均可附加地或替代 性地采用。使用類似技術(shù)制備寡核普酸如硫代磷酸酯和烷基化衍生物是眾 所周知的。
寡核苷酸未取代和取代的磷酸二酯(PO)寡核苷酸可用被碘氧化的標(biāo) 準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)產(chǎn)品在自動DNA合成儀(Applied Biosystems model 394)上
合成得到。
除以下區(qū)別外疏代磷酸酯(P二S)的合成類似于磷酸二酯寡核苷酸采用 溶于乙腈的10% w/v的3,H-l,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物溶液進(jìn)行硫雜 化以氧化亞磷酸鍵合。該石克雜化反應(yīng)步驟的時(shí)間提高至180秒并繼以常規(guī) 的帶帽步驟。從CPG柱裂解之后在55。C下于濃縮氫化銨中(12-16小時(shí))去 封閉，然后以>3體積的乙醇從1M NH4OAc溶液中沉淀回收寡核苷酸。亞 磷酸寡核苷酸可參照美國專利5,508,270的描述進(jìn)行制備。
烷基磷酸酯寡核苦酸可參照美國專利4,469,863的描述進(jìn)行制備。
3'-脫氧-3'-亞甲基磷酸酯寡核香酸可參照美國專利5,610,289或 5,625,050的描述進(jìn)行制備。
亞磷酰胺寡核苷酸可參照美國專利5,256,775或5,366,878的描述進(jìn)行 制備。
烷基硫代磷酸酯寡核苷酸可參照公布的PCT申請PCT/US94/00902和 PCT/US93/06976(分別公開為WO 94/17093和WO 94/02499)的描述進(jìn)行制備。
883'-脫氧-3'-氨基磷酰胺酯寡核香酸可參照美國專利5,476,925的描述進(jìn) 行制備。
磷酸三酯寡核苷酸可參照美國專利5,023,243的描述進(jìn)行制備。 硼烷磷酸酯寡核普酸可參照美國專利5,130,302和5,177,198的描述進(jìn) 行制備。
寡核苷酸亞甲基甲亞胺基連接的寡核苷(還被認(rèn)為是MMI連接的寡 核苷)，亞甲基二甲基肼連接的寡核苷(還被認(rèn)為是MDH連接的寡核苷)，和 亞甲基羰基氨基連接的寡核苷(還被認(rèn)為是酰胺-3連接的寡核苷)，和亞甲基 氨基羰基連接的寡核苷(還被認(rèn)為是酰胺-4連接的寡核苷)，以及具有例如替 代的MMI和P=0或P=S鍵合的混合骨架低聚化合物可參照美國專利 5,378,825、 5,386,023、 5,489,677、 5，602,240和5,610,289的描述進(jìn)行制備。
甲縮醛和疏甲縮醛連接的寡核脊可參照美國專利5,264,562和5,264,564 的描述進(jìn)行制備。
乙撐氧連接的寡核苷可參照美國專利5,223,618的描述進(jìn)行制備。
實(shí)施例22 寡核苷分離
從可控孔玻璃固相載體上裂解之后在55°C下的濃縮氫化銨中去封閉 12-16小時(shí)，以大于3體積的乙醇從lMNH4OAc溶液中沉淀回收寡核普酸 或核苷。合成的寡核苷酸可通過電噴霧質(zhì)譜(分子量測定)和毛細(xì)管凝膠電泳 進(jìn)行分析。在合成中獲得的硫代磷酸酯和磷酸二酯鍵合的相對數(shù)量可通過 正確的分子量相對-16 amu產(chǎn)品(+/-32 +/-48)的比例進(jìn)行確定。在某些研究中 寡核苷酸通過HPLC進(jìn)行純化，例如Chiang等人,J. Biol. Chem. 1991, 266,
8918162- -18171的描述。HPLC-純化材料所得的結(jié)果通常類似于從非-HPLC
純化材料獲得的結(jié)果。
實(shí)施例23
寡核苷酸合成一96孔板形式
寡核苷酸可通過固相p(m)亞磷酰胺化學(xué)產(chǎn)品在能夠在96-孔形式中同
時(shí)裝配96個(gè)序列的自動化合成儀中合成得到。磷酸二酯核普酸間鍵合可通過碘水溶液氧化得到。硫代磷酸酯核苷酸間鍵合可通過溶于無水乙腈的3,H-1,2苯并二疏醇-3-酮l,l-二氧化物(Beaucage試劑^克化得到。標(biāo)準(zhǔn)的堿基保護(hù)的(3-氰乙基-二異丙基亞磷酰胺可從銷售商(例如PE-AppliedBiosystems, Foster City, CA，或Pharmacia, Piscataway, NJ)處購得。非標(biāo)準(zhǔn)核苷可參照標(biāo)準(zhǔn)和專利方法進(jìn)行合成。它們作為堿基保護(hù)的(3-氰乙基二異丙基亞磷酰胺進(jìn)行使用。
寡核苷酸從載體上裂解之后在加熱后的溫度(55-6(TC)下的濃縮NH40H中去保護(hù)12-16小時(shí)，并在真空下干燥所釋放的產(chǎn)品。將干燥的產(chǎn)品重新懸浮于無菌水中提供主平板，所有的分析和測試平板樣本均通過機(jī)械移液器由該主平板稀釋得到。
實(shí)施例24
采用96-孔板形式進(jìn)行寡核苷酸分析
各微孔中的寡核香酸濃度可通過稀釋樣本和UV吸收光譜測定。單個(gè)產(chǎn)品的全長完整性可在96-孔形式(Beckman P/ ACETM MDQ)中或針對單獨(dú)制備的樣本在商用毛細(xì)管電泳設(shè)備(例如，Beckman P/ACE 5000, ABI 270)上通過毛細(xì)管電泳(CE)進(jìn)行評價(jià)。堿基和骨架組成可采用電噴霧質(zhì)譜對低 聚化合物進(jìn)行質(zhì)譜分析確定。所有的測試平板均從主平板中采用單和多道
機(jī)械移液器稀釋得到。如果平板上至少85%的低聚化合物具有至少85%全 長，則可認(rèn)為該平板可接受。
實(shí)施例25
細(xì)胞培養(yǎng)和寡核苷酸處理
低聚化合物對目標(biāo)核酸表達(dá)的作用可在任意細(xì)胞中進(jìn)行測試，只要該 目標(biāo)核酸以可檢測的水平存在。這可通過例如PCR或Northern印跡分析等 方法常規(guī)測定。來自多種組織和物種的細(xì)胞系可從美國典型菌種保藏中心 (ATCC, Manassas, VA)獲得。
下列提供的細(xì)胞類型僅是為了說明的目的，也可常規(guī)地采用其它細(xì)胞 類型，只要所述目標(biāo)在所選的細(xì)胞型中得到表達(dá)。這可通過本領(lǐng)域常規(guī)的 方法例如Northern印跡分析、核酸核酶保護(hù)測定法或PR-PCR等進(jìn)行簡便 的測定。
b.END細(xì)胞小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞系b.END由Max Plank研究所的Werner Risau博士提供。細(xì)胞常規(guī)地培養(yǎng)在添加了 10X胎牛血清(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)的高糖DMEM中(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)。通過胰蛋白酶化進(jìn)行常規(guī)的細(xì)胞傳代，并在匯合度達(dá)到約 90%時(shí)稀釋。將細(xì)胞以大約3000細(xì)胞/微孔的密度接種至96-孔板 (Falcon-Primaria #353872, BD Biosciences, Bedford, MA)，從而用于包括但不 限于低聚化合物轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
涉及用低聚化合物處理細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)
91當(dāng)細(xì)胞達(dá)到適當(dāng)?shù)膮R合度時(shí)，采用所述的轉(zhuǎn)染方法用低聚化合物對其 進(jìn)行處理。
UPOFECTIN
當(dāng)細(xì)胞達(dá)到65-75%匯合度時(shí)，用寡核苷酸對其進(jìn)行處理。將寡核苷酸 與 LIPOFECTINTM(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)在 Opti-MEMTM-l減血清培養(yǎng)基(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)中 混合，以實(shí)現(xiàn)寡核普酸的目標(biāo)濃度，且LIPOFECTINTM的濃度為每100nM 寡核苷酸2.5嗎/mL或3 pg/mL。將該轉(zhuǎn)染混合物在室溫下孵育約0.5小時(shí)。 細(xì)胞生長于96-孔板時(shí)，以100 )iL OPTI-MEMtm-1洗滌微孔一次，然后以 130pL的轉(zhuǎn)染混合物處理。類似地，生長于24-孔板或其它標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)板 中的細(xì)胞可使用適當(dāng)體積的培養(yǎng)基和寡核香酸進(jìn)行處理。重復(fù)兩次或三次 處理細(xì)胞并取得數(shù)值。在37。C下處理約4-7小時(shí)后，以新鮮培養(yǎng)基替換含 轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基。寡核脊酸處理后16-24小時(shí)采集細(xì)胞。
本領(lǐng)域已知的其它適用轉(zhuǎn)染試劑包括但不限于CYTOFECTINtm、 LIPOFECTAMINETM、 OLIGOFECTAMINEtm和FUGENEtm。本領(lǐng)域已知 的其它適用的轉(zhuǎn)染方法包括但不限于電穿孔。
實(shí)施例26
寡核苷酸抑制目標(biāo)表達(dá)的分析
目標(biāo)表達(dá)的反義調(diào)節(jié)可通過本領(lǐng)域已知的多種方法進(jìn)行測定。例如， 目標(biāo)mRNA水平可通過，例如，Northern印跡分析、竟?fàn)幮跃酆厦告準(zhǔn)椒?應(yīng)(PCR)或?qū)崟r(shí)PCR進(jìn)行定量。目前采用實(shí)時(shí)定量PCR是理想的?？蓪?細(xì)胞RNA或poly(A)+mRNA進(jìn)行RNA分析。本發(fā)明的一種RNA分析方
92法采用了此處其它實(shí)施例中描述的總細(xì)胞RN A 。 RN A分離的方法已為本領(lǐng) 域公知。Northern印跡分析通常是本領(lǐng)域的常規(guī)方法。實(shí)時(shí)定量(PCR)通過 來自PE誦Applied Biosystems, Foster City, CA的ABI PRISM 7600、 7700或 7900序列檢測系統(tǒng)并參照生產(chǎn)商說明得以便利地實(shí)現(xiàn)。
目標(biāo)的蛋白水平可通過本領(lǐng)域公知的多種方法進(jìn)行定量，例如免疫沉 淀、Western印跡分析(免疫印跡)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或熒光激活細(xì) 胞分類(FACS)。針對目標(biāo)的抗體可從多種來源例如抗體的MSRS目錄(Aerie Corporation, Birmingham, MI)中鑒定并獲得，或者可通過本領(lǐng)域公知的常規(guī) 單克隆或多克隆抗體生成方法制備得到。制備多克隆抗血清的方法可參見， 例3口 ， Ausubel, F.M.等人,Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.12.1-11.12.9, John Wiley & Sons, Inc., 1997。單克隆抗體的制備可參 見,侈'J4口 ， Ausubel, F.M.等人,Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.4.1 -11.11.5, John Wiley & Sons, Inc., 1997 。
免疫沉淀法是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，并可參見例如，Ausubel, F.M.等人, Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.16.1-10.16.11, John Wiley & Sons, Inc., 1998。Western印跡(免疫印跡)分析是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法， 并可參見伊J4口 ， Ausubel, F.M.等人,Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.16.1-10.80.21, John Wiley & Sons, Inc., 1997。酶聯(lián)免疫吸附 測定(ELISA)是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，并可參見例如，Ausubel, F.M.等人, Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.4.1-11.2.22, John Wiley & Sons, Inc., 1991。
實(shí)施例27目標(biāo)抑制劑的表型測定和體內(nèi)研究的設(shè)計(jì)
一旦目標(biāo)抑制劑通過此處披露的方法進(jìn)行鑒定，則該低聚化合物可進(jìn)一步在一個(gè)或多個(gè)表型測定中進(jìn)行考察，其中每個(gè)測定具有預(yù)示對特定疾病狀態(tài)或癥狀進(jìn)行治療的效力的可檢測終點(diǎn)。
表型測定，其中適用的試劑盒和試劑已為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，并在此處用于考察目標(biāo)與健康和疾病的作用和/或關(guān)聯(lián)。代表性的表型測定(可從多個(gè)銷售商中購得)包括測定細(xì)胞活性，細(xì)胞毒性，擴(kuò)增或細(xì)胞存活的測定
(Molecular Probes, Eugene或PerkinElmer, Boston, MA)， 基于蛋白的測定包括酶法觀'J定(Panvera, LLC, Madison, WI; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ;Oncogene Research Products, San Diego, CA), 細(xì)月包調(diào)節(jié),4言號津爭導(dǎo)，炎癥，氧化過程以及凋亡(Assay Designs Inc., Ann Arbor, MI)，甘油三酸酯積累(Sigma-Aldrich, St. Louis，MO)，血管生成測定，管道形成測定，細(xì)胞因子和浮丈素測定以及4戈詢十測定(Chemicon International Inc., Temecula， CA;Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)。
在一個(gè)非限制性范例中，用體外研究鑒定的目標(biāo)抑制劑和對照化合物以通過上述方法測定的最佳濃度處理經(jīng)測定適于特定表型測定的細(xì)胞(即選擇用于乳腺癌研究的MCF-7細(xì)胞，用于肥胖研究的脂肪細(xì)胞)。在處理末期，通過一種或多種特別針對該測定的方法分析處理的和未處理的細(xì)胞以確定表型結(jié)果和終點(diǎn)。
表型終點(diǎn)包括細(xì)胞形態(tài)隨時(shí)間或處理劑量的變化以及如蛋白、脂質(zhì)、核酸、激素、糖或金屬等細(xì)胞成分的變化。細(xì)胞狀態(tài)(包括pH、細(xì)胞周期階段、細(xì)胞對生物指示劑的攝取和排除)的測量通常是目標(biāo)終點(diǎn)。
94對處理后的細(xì)胞中 一種或多種基因表達(dá)的測量同樣可用作目標(biāo)抑制劑的效力或功效的指示?？赏瑫r(shí)檢測處理的和未處理的細(xì)胞中的標(biāo)志基因或懷疑與特定疾病狀態(tài)、癥狀或表型有關(guān)的基因。
此處所述的體內(nèi)研究中的個(gè)體對象為溫血脊推動物，包括人。
實(shí)施例28RNA分離
為、,
Poly(A)十mRNA可參照Miura等人，(Clin. Chem., 1996， 42， 1758-1764)分離。其它的poly(A)+mRNA分離方法為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。簡言之，對于生長于96-孔板的細(xì)胞，去除生長培養(yǎng)基并分別以200 冷PBS洗滌每個(gè)微孔。向每個(gè)微孔添加60 [iL裂解緩沖液(IO mM Tris-HCl, pH 7.6, 1 mMEDTA, 0.5 MNaCl, 0.5%NP-40, 20 mM氧釩-核糖核香復(fù)合物)，輕柔搖動平板并在室溫下孵育五分鐘。將55 pL裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至涂覆了寡聚d(T)的96-孔板(AGCT Inc., Irvine CA)中。將平板在室溫下孵育60分鐘，以200 pL洗滌緩沖液(IO mM Tris-HCl pH 7.6, 1 mM EDTA, 0.3 M NaCl)洗滌3次。末次洗滌后，以紙巾吸去過量的洗滌緩沖液，然后空氣干燥5分鐘。將預(yù)熱至70。C的60 nL洗脫緩沖液(5 mM Tris-HCl pH 7.6)添加至各微孔，將平板在9(TC熱板上孵育5分鐘，然后將洗脫物轉(zhuǎn)移至新鮮的96-孔板。
生長于100 mm或其它標(biāo)準(zhǔn)平板的細(xì)胞也可采用適當(dāng)〗本積的所有溶液進(jìn)行類似處理。
g 為、,
95總RNA可采用由Qiagenlnc. (Valencia, CA)購得的RNEASY 96TM試劑盒和緩沖液并參照生產(chǎn)商的推薦方法進(jìn)行分離。簡言之，對于生長于96-孔板的細(xì)胞，去除生長培養(yǎng)基并分別以200 冷PBS洗滌每個(gè)微孔。向每個(gè)微孔添加150 [iL緩沖液RLT并將平板劇烈搖動20秒。將150 |iL的70%乙醇添加至各微孔，然后通過三次上下吸液混合內(nèi)含物。隨后將樣本轉(zhuǎn)移至裝配了廢物采集盤并連接至真空源的QIAVACTM集流腔中所連接的RNEASY 96tm孔板上。抽真空1分鐘。將500 |iL緩沖液RW1添加至RNEASY 96tm板的各微孔中并孵育15分鐘，再次抽真空1分鐘。再次將500 緩沖液RW1添加至RNEASY 96頂板的各微孔中并再次抽真空2分鐘。然后將1 mL的緩沖液RPE添加至RNEASY 96預(yù)板的各微孔中并抽真空90秒鐘。重復(fù)用緩沖RPE洗滌，再次吸真空3分鐘。然后從QIAVACtm集流腔取走平板并用紙巾吸干。重新將平板連接至裝配了含1.2 mL采集管的采集管架的QIAVACtm集流腔。然后通過向各微孔中移取140 pL無RNAse的水，孵育1分鐘，抽真空3分鐘洗脫RNA。
重復(fù)移液和洗脫步驟可通過QIAGEN Bio-Robot 9604 (Qiagen, Inc.,ValenciaCA)自動完成。簡言之，溶解培養(yǎng)平板上的細(xì)胞之后，將平板轉(zhuǎn)移至進(jìn)行移液、DNAse處理和洗脫步驟的機(jī)械平臺上。
實(shí)施例29
目標(biāo)mRNA水平的實(shí)時(shí)定量PCR分析
目標(biāo)mRNA水平可采用ABI PRISM 7600、 7700或7900序列檢測系統(tǒng)(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)并參照生產(chǎn)商的說明通過實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)現(xiàn)定量。這是一個(gè)閉管、非凝膠式熒光檢測系統(tǒng)，其允許對聚合
96酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)高通量定量。與擴(kuò)增產(chǎn)物在PCR完成后定
量的標(biāo)準(zhǔn)PCR不同，在實(shí)時(shí)定量PCR中的產(chǎn)物在其積累時(shí)定量。這一點(diǎn)可通過在PCR反應(yīng)中包含特異性地在正向和反向PCR引物之間退火的寡核苷酸探針以及包含兩個(gè)熒光燃料得以實(shí)現(xiàn)。報(bào)告染料(例如，F(xiàn)AM或JOE,來自 PE-Applied Biosystems， Foster City, CA, Operon Technologies Inc.,Alameda, CA或Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA)被連接至探針的5'端而淬火染料(例如，TAMRA，來自PE-Applied Biosystems, FosterCity, CA， Operon Technologies Inc., Alameda, CA 或 Integrated DNATechnologies Inc., Coralville, IA)被連接至探針的3'端。當(dāng)探針和染料完整時(shí)，報(bào)告染料的發(fā)射被3'端淬火染料接近而猝熄。在擴(kuò)增過程中，探針退火至目標(biāo)序列可生成能被Taq聚合酶的5'-核酸外切酶活性裂解的底物。在PCR擴(kuò)增周期的延伸階段，Taq聚合酶對探針的裂解從探針的剩余部分(并從而由淬火部分)釋放了報(bào)告染料，從而生成了序列特異性熒光信號。在每一個(gè)周期中，附加的報(bào)告染料分子從其相應(yīng)的探針中裂解，并可通過整合在ABIPRISMTM序列檢測系統(tǒng)中的激光鏡頭定期監(jiān)測熒光強(qiáng)度。在每一個(gè)測定中，一系列包含來自未處理對照樣本的mRNA系列稀釋物平行反應(yīng)可生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，它可用于對測試樣本的進(jìn)行反義寡核苷酸處理后的抑制百分比進(jìn)行定量。
在定量PCR分析之前，通過GAPDH擴(kuò)增反應(yīng)評價(jià)對被測定的目標(biāo)基因具有特異性的引物-探針組的"多重"能力。在復(fù)用過程中，在單個(gè)樣本中同時(shí)擴(kuò)增目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因GAPDH。在該分析中，從未處理細(xì)胞中分離的mRNA被系列稀釋。各稀釋物可在僅對GAPDH、僅對基因("單重")或?qū)烧?多重)具有特異性針的引物-探針組的存在下擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增之后，可同時(shí)從單重和多重樣本生成作為稀釋函數(shù)的GAPDH和目標(biāo)mRNA信號的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果從多重樣本中生成的GAPDH和目標(biāo)信號的斜率和相關(guān)系數(shù)均小于從單重樣本所得相應(yīng)數(shù)值的10%之內(nèi)，則該對目標(biāo)具有特異性的引物-探針組可認(rèn)為具有多重性。其它PCR方法已為本領(lǐng)域所知。
RT和PCR試劑可從Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA)獲得。RT，實(shí)時(shí)PCR可通過向含有30 總RNA溶液(20-200 ng)的96-孔板添加20 PCR混合物(2.5 X無MgCl2 PCR緩沖液，6.6 mM MgCl2, dATP、dCTP、dCTP和dGTP各375 pM,正向引物和反向引物各375 nM, 125 nM探針，4單位RNA酶抑制劑，1.25單位PLATINUM Taq, 5單位MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶以及2.5XR0X染料)得以實(shí)現(xiàn)。RT反應(yīng)可通過在48。C下孵育30分鐘得以實(shí)現(xiàn)。在95 °C下孵育10分鐘以激活PLATINUM T叫，進(jìn)行40個(gè)周期的兩步PCR法如下進(jìn)行95X:下進(jìn)行15秒(變性)后在60。C下進(jìn)行1.5分鐘(退火/延伸)。
通過RT得到基因目標(biāo)量，通過GAPDH(—種表達(dá)恒定的基因)表達(dá)水平或通過以RIBOGREEN (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR)定量總RNA來歸一化實(shí)時(shí)PCR。 GAPDH表達(dá)可通過與目標(biāo)、多重同時(shí)或單獨(dú)運(yùn)行用實(shí)時(shí)RT-PCR進(jìn)行定量。總RNA可采用RiboGreen RNA定量試劑(MolecularProbes, Inc. Eugene, OR)進(jìn)行定量。通過RIBOGREENtm迸行RNA定量的方法可參見Jones, L. J"等人，(Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374)。
在該測定中，170 |iL的RIBOGREENTM工作試劑(RIBOGREENTM試劑以1:350稀釋于10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5)以移液管移入含有30|iL純化細(xì)胞RNA的96-孔板。該平板在激發(fā)485 nm和發(fā)射530 nm下以CytoFl匿4000 (PE Applied Biosystems)讀耳又。
98實(shí)施例30
目標(biāo)特異性引物和探針
探針和引物可采用公開的序列信息設(shè)計(jì)成與目標(biāo)序列雜交。 例如，對于人PTEN，可通過公開的序列信息(GENBANKTM登記號 U92436.1 ， SEQ ID NO: l)設(shè)計(jì)下列引物-探針組
正向引物AATGGCTAAGTGAAGATGACAATCAT (SEQ ID NO: 2) 反向引物TGCACATATCATTACACCAGTTCGT (SEQ ID NO: 3) 以及PCR探針
FAM畫TTGCAGCAATTCACTGTAAAGCTGGAAAGG陽TAMRA (SEQ ID NO: 4)，其中FAM為熒光染料而TAMRA為淬火染料。
實(shí)施例31
目標(biāo)蛋白水平的Western印跡分析
Western印跡分析(免疫印跡分析)可采用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。在寡核苷酸處 理后16-20小時(shí)采集細(xì)胞，以PBS洗滌一次，懸浮于Laemmli緩沖液(IOO 微孔)，煮沸5分鐘并上樣至16% SDS-PAGE凝膠。在150V下跑膠1.5小 時(shí)，并轉(zhuǎn)移到膜上進(jìn)行western印跡。采用適當(dāng)?shù)尼槍δ繕?biāo)的一抗，以及針 對該 一 抗的放射標(biāo)記或熒光標(biāo)記的二抗。采用PHOSPHORIMAGER (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA)顯示條帶。
實(shí)施例32
99用SVPD處理過的5'-(^)和(R)-CH3-BNA修飾的低聚體的核酸酶穩(wěn)定
性
5'-CHrBNA修飾的低聚體的核酸酶穩(wěn)定性可采用蛇毒磷酸二酯酶 (SVPD)進(jìn)行測定。各低聚體制備為含有以下成分的500 pL混合物5 pL 100 (iM低聚體；溶于SVPD緩沖液(50 mM Tris-HCl， pH 7.5, 8 mM MgCl2)的50 (iL 0.5單位/mL磷酸二酯酶，其最終濃度0.05單位/mL; 445 }iL SVP緩沖 液。將樣本在37。C下于水浴中孵育。在第1和2天添加新鮮的酶，并在第 0、 1、 2和4天取等份(100[iL)。在等份取出后立即添加EDTA以終止酶活 性。在IP HPLC/MS上分析樣本。
,ro NO, 腦s柳.
,92747 仍/392746 05/392745
(15/392753
組成(5，-3，)
CsUsTAGCACTGGCCyjs
CjfUiTAQCACTGGCCgJ及
QU鋒CICACTGGCC線
第4日的全長％
>幼 >幼 鄰-50 3(MW
所有的核苷間鍵合為磷酸二酯，下標(biāo)S和R表示同樣具有4'-CHrO-2' 橋基團(tuán)的5'-CHrBNA核苷的5'碳原子處的構(gòu)型。下標(biāo)e表示2'-0-MOE核 苷，而下標(biāo)l表示4'-CH2-0-2'修飾的核苷。含有5-甲基取代的BNA的化合 物(392746和392747)比含有未取代BNA的化合物(392745)具有明顯的提
SEQID騰. 艦S NO,
05/392747 05/392746 05/3節(jié)5 05/392753
組成％ 24小時(shí)
100% l腦 67%
58%
組成％ 48小時(shí)
, 90% 56% 46%
組成％ 96小時(shí)
S2% 84%. 鄉(xiāng) 36%.實(shí)施例33
以SVPD處理過的5'-(5>CH3和2'-0-MOE修飾的低聚體的核酸酶穩(wěn)
定性
5'-CH3-BNA修飾的低聚體的核酸酶穩(wěn)定性可采用蛇毒磷酸二酯酶 (SVPD)進(jìn)行測定。各低聚體制備為含有以下成分的90 pL混合物5 |iL低 聚體(2iiL 5(iM低聚體和3 5' "P-標(biāo)記的低聚體)，75 (iL H20，以及10 1 OX緩沖液(500 mM Tris-HCl, 700 mM NaCl，以及140 mM MgCl2 ， pH 8.6)。 在0分鐘，從上述制備的低聚體樣本取出9 |iL并添加至10 |iL終止緩沖液 (6.67 M尿素，16.67%甲酰胺和83.3 mM EDTA)中然后添加1 |iL H20并在 100°C下加熱2.5至3分鐘。通過添加9 jiL SVPD (0.5單位/mL)啟動測定。 最終的酶濃度為0.05單位/mL。將每等份的10 低聚體動力學(xué)溶液添加至 lO(iL終止緩沖液并按如上所述熱滅活。取l、 3、 9、 27、 80、 240和1290 分鐘為動力學(xué)時(shí)間點(diǎn)。通過12Q/丙烯酰胺PAGE在45瓦特/凝膠下跑2小 時(shí)分析樣本。
組成(5，-3，)
S武Q ID NO, 腦S NO.
06/395421
07/395427 訴/71S7
修飾
TTTTTTTTTTUiUi
TTTTmTTTUsUs
TTTTTTTTTTTT
2M3-MOB 4'-CHr02'
5，-(S)-CH3BNA 未修飾的(2'-H〗
所有的核苷間鍵合為磷酸二酯，下標(biāo)S表示同樣具有4'-CH2-0-2'橋基
團(tuán)的5'-CH3-BNA核苷的5'碳原子處的構(gòu)型，下標(biāo)e表示2'-0-MOE核苷， 而下標(biāo)1表示4'-CHrO-2'BNA。所有的非下標(biāo)T為2'-H。該5-甲基取代的
101fn含MOE化合
物(395421)具有明顯的提高。
SEQ腦聽,組成％組成％組成％組成％組成％
ISIS M仏3分鐘27分鐘80分鐘240分鐘1290分鐘
06/395421《8, 27.917.211.69,0
07/欲42332.64,72,52.22.2
糊95427100.091,686.676,0
06〃1573,21,22力1.70,9.
實(shí)施例34
耙向PTEN的5'-(5)-CH3-BNA和5'-(if)-CH3-BNA 2-10-2帶間隙低聚 體體外研究
如本發(fā)明所述，合成低聚化合物并在一定劑量范圍內(nèi)檢測其減少PTEN 表達(dá)的能力。采用此處所述的方法以0.3125、 0.0625、 1.25、 2.5、 5、 10或 20 nM濃度的5'-CH3-BNA修飾的低聚體處理b.END細(xì)胞。如此處其它實(shí)施 例所述，PTEN的表達(dá)水平可通過實(shí)時(shí)PCR測定并對RIBOGREEN 歸一 化。下文列表顯示了在20 nM的藥物濃度下PTEN mRNA相對未處理的對 照細(xì)胞的下降百分比(o/。UTC)。所得的劑量-響應(yīng)曲線可用于測定如下所示的 392747的IC50。在pH 7的100 mM磷酸鹽緩沖液，O.l mM EDTA中260 nm 下使用4 |iM 5'-CH3-BNA修飾的低聚體和4pM互補(bǔ)RNA測定溫度。
SEQIBNO. 組成(5，-3，) ％UTCIC 溫度《€
艦S膽.
03/392746 C及UgTAOCACTGGCQUif 75 47.3
05房2747CAGCACTGGCQ lfe 28 8,6 57.0所有的核苷間鍵合為硫代磷酸酯，下標(biāo)R和S表示同樣具有4'-CH2-0-2' 橋基團(tuán)的5'-CH3-BNA核苷的5'碳原子處的構(gòu)型。
實(shí)施例35
把向PTEN的5'-(5)-CH3-BNA和5'-(i )-CH3-BNA 2-10-2帶間隙低聚 體體內(nèi)研究
在3周中每周兩次向六周大的Balb/c小鼠(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)注射劑量為0.5或2 |imol/kg的耙向PTEN的修飾的低聚體(5-(S) 或5-(R))。在最后一次施用后48小時(shí)處死小鼠。將肝組織勻漿化并按照此 處所述通過實(shí)時(shí)PCR對mRNA水平定量，從而與未處理對照水平進(jìn)行比較 (%UTC)。
SEQIDMO. 組成(5，-3，) 劑量 ％UTC
/ISIS NO*
鹽水100
05/39274656
05/3927460.571
0懇:92747C^U^TAGCACTGGCCsU^2.028
05/39274 as91
所有的核苷間鍵合為硫代磷酸酯，下標(biāo)R和S表示同樣具有4'-CH2-0-2' 橋基團(tuán)的5'-CH3-BNA核苷的5'碳原子處的構(gòu)型。
實(shí)施例36
耙向PTEN的5'-(5)-CH3-BNA2-10-2帶間隙低聚體體內(nèi)研究
在向六周大的Balb/c小鼠(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)注射劑 量為1、 2、 4或8 (imol/kg的耙向PTEN的5'-(S)-CHrBNA修飾的低聚體一20 次。在施用后72小時(shí)處死小鼠。將肝組織勻漿化并按照此處所述通過實(shí)時(shí)
PCR對mRNA水平定量，從而與未處理對照水平進(jìn)行比較(。/。UTC)。
SEQIDMO, 組成(5，-3，) 劑量 萑UTTC
/ISIS NO. 爭繊o〗/k緊〗
鹽水 100
05/392747 Cs'UiTAOCACTGGCQsl^ 1 92
仍/392 4 CsUsTAGCACTGGCC函2 :65
05/392747 QsUsTAGCACTGGC戦4 33
05/392747 <^USTAGCACTGGC€SU5 8 13
所有的核苷間鍵合為硫代磷酸酯，下標(biāo)S表示同樣具有4'-CH2-0-2'橋 基團(tuán)的5'-CH3-BNA核香的5'碳原子處的構(gòu)型。
實(shí)施例37
在三周、多劑量體內(nèi)研究中把向PTEN的5'-(S)-CH3-BNA和2'-0-MOE
帶間隙低聚體
在三周中每周兩次向六周大的Balb/c小鼠(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)注射劑量為3.2、 1.0、 0.32或0.1 nmol/kg(以下僅顯示了 3.2和1 pmol/kg的數(shù)據(jù))的粑向PTEN的5-(5>CHrBNA(2-10-2, 14-mer)、 4'-CH2-O-2'-BNA(2-10-2, 14-mer)和2'-O-MOE(5-10-5, 20-mer)修飾的低聚體 (6-(5)或6-(/ ))。在最后一次施用后48小時(shí)處死小鼠。將肝組織勻漿化并按 照此處所述通過實(shí)時(shí)PCR對mRNA水平定量，從而與未處理對照水平進(jìn)行 比較(。/。UTC)。處死后測定血漿化學(xué)和肝重。
104組成(5，-3，)劑量%otcalt
;is悠no,
鹽水
05/392747C，'AGCACTGGCC函1517-5
05/3狡747CMJCACTGGCC5US153213
08/訴2063M*QTsTAOCACTGGCM*C〗Ti3.24.2
膨3鄉(xiāng)63脇Ci眾AGCACTGGC版QT〗12641.0
09/n綱7T G M^^t rp ^r.歸鬆?wèi)鬗愁^^f4l浩。15341,3
;^/"H廣i A T ， T i*- * A
所有的的核苷間鍵合為硫代磷酸酯，下標(biāo)S表示同樣具有4'-CH2-0-2' 橋基團(tuán)的5'-CHrBNA核苷的5'碳原子處的構(gòu)型，下標(biāo)1表示4'-CHrO-2'BNA，下標(biāo)e表示2'-0-MOE核香，且MeC表示5'-甲基胞嘧啶核普。在研 究的最高點(diǎn)，含4'-CH2-0-2' BNA (392063)的低聚體的高劑量組(3.2 pmol/Kg 劑量組)的動物顯示了明顯升高的肝重(相對鹽水為153%)。與之相反，含 5-(5>CH3 BNA (392747， 3.2 |xmol/Kg劑量組)低聚體的肝重為鹽水組的121 % 。含2'-0-MOE( 116847 ， 1.0 pmol/Kg劑量組)低聚體的肝重為鹽水組的116 %。該實(shí)施例證明了 5'-(S)-CHrBNA修飾允許設(shè)計(jì)出ALT水平相對 4'-CH2-0-2' BNA修飾的化合物有顯著提升的反義低聚體。
實(shí)施例38
粑向PTEN的5'(S)-Me-BNA和4'-CHrO-2' BNA 2-10-2帶間隙低聚 體體內(nèi)研究
向六周大的Balb/c小鼠(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)注射劑量 為2.5、 5、 10或20 nmol/kg(僅顯示了 5和10 (imol/kg的數(shù)據(jù))的把向PTEN 的修飾的5'-(S)-CH3 (396569)、 4'-CHrO-2， BNA 2-10-2帶間隙低聚體一 次。 在施用后66小時(shí)處死小鼠。將肝組織勻漿化。
105200 SEQIDNO. 組成(5，-3') 劑量 亂￥
艦S肌 (,艦g)
鹽水 4L3
UsCsATGGCTGCAGCytJsW ll!.O
10/3船《U録TGOCTGCAO賜 5 54,0
11/392056T嚴(yán)C!ATOGCTOCAGMt:ff3 10 925.0
li/3簡6T嚴(yán)C,ATGOCTGCAC^C〗T, 5 373.0
所有的的核苷間鍵合為疏代磷酸酯，下標(biāo)S表示同樣具有4'-CH2-0-2' 橋基團(tuán)的5'-CHrBNA核苷的5'碳原子處的構(gòu)型，下標(biāo)1表示4'-CH2-0-2' 核苷且MeC表示5'-甲基胞嘧啶核苷。
對于上述寡核苷， 一種(Isis No. 392056)在5'碳原子處不包含手性的核 普，而396569則包含該核香。396569包含5'(S)-Me單體，且與在5'位不具 有取代基的392056相比，在肝臟具有明顯更小的毒性。
實(shí)施例39
把向PTEN的5'(S)國Me-BNA、 2'畫0畫MOE和4'-CH2-0-2， BNA 2誦14國2
帶間隙低聚體體內(nèi)研究
在向六周大的Balb/c小鼠(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)注射劑 量為2或10 pmol/kg的耙向PTEN的5'-CHrBNA修飾低聚體一次。在施用 后72小時(shí)處死小鼠。將肝組織勻漿化并按照此處所述通過實(shí)時(shí)PCR對 mRNA水平定量，從而與未處理對照水平進(jìn)行比較(o/oUTC)。
106S即DNO.
腦:S肌 12/394420 12/394425 13/400521
組成(5，-3，)
!CcTeGCTAGCCTCTOGATTeTe
CCTAGCCTCTGGATT〗Ti CsUsGCTAGCCTCTGGATUsUs
修飾
2'吞MOE
4'-CHr02' B脆
5'-(S)-CH3
鵬NO.劑量%OT€AJLT
鹽水鵬％3&5
39442079%30.3
3944201026%銀3
3斜4252腦41.2
39442S102453.2
40052r21屬36*7
40,103,8%152
所有的的核苷間鍵合為硫代磷酸酯，下標(biāo)R和S表示同樣具有 4'-CH2-0-2'橋基團(tuán)的5'-CHrBNA核苷的5'碳原子處的構(gòu)型，下標(biāo)e表示 2'-0-MOE核苷，下標(biāo)1表示4'-CH2-0-2'核苷而MeC表示5'-甲基胞嘧啶核苷。
在高劑量組(10微摩爾/Kg)下，含5'(S)-Me修飾的寡核苷400521基本 與394425等效。然而，與394425 (2453.2)相比，400521的ALT提升較小 (152)，這清楚地表明5'位取代可產(chǎn)生很大提高了的療效指數(shù)。
10權(quán)利要求
1. 具有如下結(jié)構(gòu)式的雙環(huán)核苷其中Bx是雜環(huán)堿基部分；T1和T2之一為H或羥基保護(hù)基團(tuán)，而T1和T2的另一個(gè)為H、羥基保護(hù)基團(tuán)或反應(yīng)性磷基團(tuán)；Z是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基或取代的酰基(-C(＝O)-)；其中各個(gè)取代的基團(tuán)被獨(dú)立選自鹵素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基、OJ1、SJ1、NJ1J2、N3、COOJ1、CN、O-C(＝O)NJ1J2、N(H)C(＝NH)NR1R2或N(H)C(＝X)N(H)J2的取代基團(tuán)單取代或多取代，其中X為O或S；且J1和J2各自獨(dú)立為H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基、C1-C6氨烷基、取代的C1-C6氨烷基或保護(hù)基團(tuán)。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中Z是取代的C廣C6烷基。
3. 如權(quán)利要求2所述的化合物，其中Z是取代的亞甲基。
4. 如權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的化合物，其中每一個(gè)取代基團(tuán)獨(dú)立為F、 NJ,J2、 N3、 CN、 OJ、 SJi、 0-C(:0)NW2、 N(H)C(:NH)W2或N(H)C(=0)N(H)J2。
5. 如權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的化合物，其中J！和L各自獨(dú)立為H或C廣C6烷基。
6. 如權(quán)利要求l所述的化合物，其中Z是甲基、乙基或甲氧基甲基。
7. 如權(quán)利要求1所述的化合物，其中Z是甲基。
8. 如權(quán)利要求1所述的化合物，其中Z是乙烯基。
9. 如權(quán)利要求l所述的化合物，其中Z是取代的?；?。
10. 如權(quán)利要求9所述的化合物，其中Z是C(K))NJ!J2。
11. 如權(quán)利要求1-10任意一項(xiàng)所述的化合物，其中至少Ti和T2之一為鞋基保護(hù)基團(tuán)。
12. 如權(quán)利要求ll所述的化合物，其中所述羥基保護(hù)基團(tuán)各自獨(dú)立選 自乙?；⑹宥』?、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氫吡喃基、1-乙氧基乙基、l-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基甲硅烷乙基、對氯苯基、2，4-二硝基苯基、 千基、苯甲?；?、對苯基苯甲?；?、2,6-二氯千基、二苯基甲基、對硝基千 基、三苯基甲基(trityl)、 4,4'-二甲氧三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲 硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯甲硅烷基、三苯甲硅烷基、 三異丙基甲硅烷基、苯甲?；姿狨?、氯乙?；?、三氯乙?；?、三氟乙酰 基、新戊?；?、9-勞基甲l^友酸脂、甲磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、 三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、9-苯基黃嘌呤-9-基(Pixyl)以及9-(對甲氧基苯基)黃嘌呤-9-基(MOX)。
13. 如權(quán)利要求ll所述的化合物，其中Ti為乙酰基、千基、叔丁基二 甲基甲硅烷基、叔丁基-二苯基甲硅烷基或4,4'-二甲氧三苯甲基。
14. 如權(quán)利要求1-10任意一項(xiàng)所述的化合物，其中T2為反應(yīng)性磷基團(tuán)。
15. 如權(quán)利要求14所述的化合物，其中所述反應(yīng)性磷基團(tuán)為二異丙基 氰基乙氧基亞磷酰胺或H-膦酸酯。
16. 如權(quán)利要求15所述的化合物，其中T2為二異丙基氰基乙氧基亞磷 酰胺，而1為4,4'-二甲氧三苯甲基。
17. 如權(quán)利要求1 -16任意 一 項(xiàng)所述的化合物，其中該Z基團(tuán)為卩"-構(gòu)型<formula>formula see original document page 5</formula>
18.如權(quán)利要求l-16任意一項(xiàng)所述的化合物，其中該Z基團(tuán)為(^-構(gòu)型:<formula>formula see original document page 5</formula>
19.具有至少一個(gè)如下結(jié)構(gòu)式單體的低聚化合物:<formula>formula see original document page 5</formula>其中Bx是雜環(huán)^威基部分；T3為H，羥基保護(hù)基團(tuán)，連接的共軛基團(tuán)或與核苷、核苷酸、寡核苷、 寡核苷酸、單體亞基或低聚化合物連接的核苷間連接基團(tuán)；T4為H，鞋基保護(hù)基團(tuán)，連接的共軛基團(tuán)或與核普、核苷酸、寡核苷、 寡核香酸、單體亞基或低聚化合物連接的核苷間連接基團(tuán)；Z是C廣C6烷基、CVC6烯基、C2-C6炔基、取代的C廣C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基或取代的酰基(《(=0)-);其中各個(gè)取代的基團(tuán)被獨(dú)立選自囟素、C廣C6烷基、取代的C廣C6烷基、CVC6烯基、取代的CVC6烯基、C2-C6炔基、取代的CVC6炔基、OJ" SJ,、NJ,J2 、 N3 、 COOh 、 CN 、 0-C(0)NJ^ 、 N(H)C(二NH)NRiR2或 N(H)C(=X)N(H)J2的取代基團(tuán)單取代或多取代，其中X為O或S;Ji和J2各自獨(dú)立為H、 C廣C6烷基、取代的C廣C6烷基、CVC6烯基、取代的C2-C6雄基、CrC6炔基、取代的C2-C6炔基、d-C6氨烷基、取代的C廣C6 氨烷基或保護(hù)基團(tuán)；且其中至少T3和T4之一為與核苷、核苷酸、寡核苷、寡核苷酸、單體亞 基或低聚化合物連接的核苷間連接基團(tuán)。
20. 如權(quán)利要求19所述的低聚化合物，其中Z是取代的C廣C6烷基。
21. 如權(quán)利要求20所述的低聚化合物，其中Z是取代的亞甲基。
22. 如權(quán)利要求19-21任意一項(xiàng)所述的化合物，其中所述取代基團(tuán)各自 獨(dú)立為F、 NJ!J2、 N3、 CN、 OJ,、 SJ!、 0-C(喝W2、 N(H)C(:NH)W2 或N(H)C^O)N(H)J2。
23. 如權(quán)利要求22所述的低聚化合物，其中^和J2各自獨(dú)立為H或
24. 如權(quán)利要求19所述的低聚化合物，其中Z是甲基、乙基或甲氧基 甲基。
25. 如權(quán)利要求24所述的低聚化合物，其中Z是甲基。
26. 如權(quán)利要求19所述的低聚化合物，其中Z是乙烯基。
27. 如權(quán)利要求19所述的低聚化合物，其中Z是取代的酰基。
28. 如權(quán)利要求27所述的低聚化合物，其中Z是C(二0)NJJ2。
29. 如權(quán)利要求19-28任意一項(xiàng)所述的低聚化合物，其中T3為H或羥 基保護(hù)基團(tuán)。
30. 如權(quán)利要求19-29任意一項(xiàng)所述的低聚化合物，其中T4為H或羥 基保護(hù)基團(tuán)。
31. 如權(quán)利要求19-28任意一項(xiàng)所述的低聚化合物，其中T3為與核苷、 核苷酸或單體亞基連接的核苷間連接基團(tuán)。
32. 如權(quán)利要求19-28或31任意一項(xiàng)所述的低聚化合物，其中丁4為與 核苷、核苦酸或單體亞基連接的核苷間連接基團(tuán)。
33. 如權(quán)利要求19-28、 30或32任意一項(xiàng)所述的低聚化合物，其中T3 為與寡核苷或寡核苷酸連接的核苷間連接基團(tuán)。
34. 如權(quán)利要求19-28、 31或33任意一項(xiàng)所述的低聚化合物，其中T4 為與寡核苷或寡核苷酸連接的核苷間連接基團(tuán)。
35. 如權(quán)利要求19-28、 30、 32或34任意一項(xiàng)所述的低聚化合物，其 中T3為與低聚化合物連接的核苷間連接基團(tuán)。
36. 如權(quán)利要求19-28、 31、 33或35任意一項(xiàng)所述的低聚化合物，其中T4為與低聚化合物連接的核苷間連接基團(tuán)。
37. 如權(quán)利要求19-36任意一項(xiàng)所述的低聚化合物，其中所述結(jié)構(gòu)式的 至少一個(gè)單體的z基團(tuán)為(i )-構(gòu)型
38.如權(quán)利要求19-36任意一項(xiàng)所述的低聚化合物，其中所述結(jié)構(gòu)式的 至少一個(gè)單體的z基團(tuán)為(5)-構(gòu)型<formula>formula see original document page 9</formula>
39. 如權(quán)利要求19-38任意一項(xiàng)所述的低聚化合物，其中T3和T4中至 少一個(gè)包含選自磷酸二酯或疏代磷酸酯的核普間連接基團(tuán)。
40. 如權(quán)利要求19-39任意一項(xiàng)所述的低聚化合物，其中各核普間連接 基團(tuán)獨(dú)立地為磷酸二酯或硫代磷酸酯。
41. 如權(quán)利要求19-40任意一項(xiàng)所述的低聚化合物，其包含所述結(jié)構(gòu)式 的至少兩個(gè)相鄰單體的至少 一個(gè)區(qū)。
42. 如權(quán)利要求19-41任意一項(xiàng)所述的低聚化合物，其包含所述結(jié)構(gòu)式 的至少兩個(gè)相鄰單體的至少兩個(gè)區(qū)。
43. 如權(quán)利要求42所述的低聚化合物，其包括帶間隙的低聚化合物。
44. 如權(quán)利要求19-42任意一項(xiàng)所述的低聚化合物，其包含長度為約8 至約40個(gè)核苷和/或修飾核苷或模擬物。
45. 如權(quán)利要求19-42任意一項(xiàng)所述的低聚化合物，其包含長度為約8 至約20個(gè)核苷和/或修飾核苷或模擬物。
46. 如權(quán)利要求19-42任意一項(xiàng)所述的低聚化合物，其包含長度為約10 至約16個(gè)核苷和/或修飾核苷或模擬物。
47. 如權(quán)利要求19-42任意一項(xiàng)所述的低聚化合物，其包含長度為約10 至約14個(gè)核苷和/或修飾核苷或模擬物。
48. 抑制基因表達(dá)的方法，其包括將一種或多種細(xì)胞、組織或動物與如 權(quán)利要求19至47任意一項(xiàng)所述的低聚化合物相接觸。
全文摘要
本發(fā)明提供了5’-修飾的雙環(huán)核苷類似物以及包含至少一種該類核苷類似物的低聚化合物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中該核苷類似物在5’位碳原子處具有(R)或(S)-手性。這種雙環(huán)核苷類似物可用于增強(qiáng)低聚化合物的屬性，包括如增強(qiáng)耐核酸酶性。
文檔編號C07H19/04GK101490074SQ200780026285
公開日2009年7月22日 申請日期2007年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月11日
發(fā)明者埃里克·E·斯威茲, 巴特·巴爾克利申, 普內(nèi)特·P·塞思 申請人:Isis藥物公司