專利名稱：：用于氧輸送的組合物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本申請涉及H-NOX蛋白和使用它們輸送氧的方法。H-NOX蛋白提供了一種新的治療工具，用于向人類輸送02，并用于獸醫(yī)的目的向動物輸送02。
背景技術(shù)：
：當(dāng)前的血庫系統(tǒng)具有內(nèi)在的風(fēng)險和嚴(yán)重的局限性。血液分型錯誤、免疫原性、細(xì)菌試劑的傳播、和諸如HIV-1和肝炎的病毒感染將威脅生命的危險擺在輸血患者的面前。此外，受限的供血者可用性、對特殊血型的需求、紅細(xì)胞短暫的保存期、和對冷凍的需要都限制了患者輸血的可達(dá)性。穩(wěn)定的血液代用品的開發(fā)能消除目前血庫系統(tǒng)的風(fēng)險，并在大多數(shù)情況下提高患者輸血的可用性。因此，向器官和組織輸送氧氣(02)以緩解由于失血或缺氧引起的癥狀是主要的治療目標(biāo)。在美國，沒有基于血紅蛋白的療法被批準(zhǔn)用于人類。潛在的療法包括多種人工02載體(由Spahn,D.R.等人(2005)，"Artificial02carriers:statusin2005，"C"/r/)to,'w.D&s'.11(31):4099-4114綜述)，例如工程改造的血紅蛋白(例如，美國專利號6,022,849)。然而，一些潛在的血液代用品，如基于血紅蛋白的血液代用品，由于它們與一氧化氮(NO)的反應(yīng)性而受限。具體而言，NO在體內(nèi)多種重要過程的調(diào)控中作為化學(xué)信使發(fā)揮作用，包括祌經(jīng)傳導(dǎo)、炎癥、血小板凝集和胃腸及血管平滑肌緊張度的調(diào)節(jié)。NO直接與結(jié)合到血紅蛋白的02反應(yīng)，形成高鐵血紅43蛋白和硝酸鹽。血紅素鐵和NO都通過結(jié)合的氧原子被氧化，并且反應(yīng)發(fā)生地如此迅速以至于沒有觀察到02被NO代替(參見，例如美國專利號6,455,676)。由于NO被持續(xù)地產(chǎn)生并消耗，體內(nèi)有天然的NO周轉(zhuǎn)(turnover)。當(dāng)給予無細(xì)胞的血紅蛋白時，NO產(chǎn)生與消耗之間的平衡通過與無細(xì)胞的血紅蛋白的反應(yīng)而被改變。NO與結(jié)合到血紅蛋白的02之間的氧化反應(yīng)是不可逆的，導(dǎo)致NO、02和血紅蛋白的破壞。因為亞硝酰血紅蛋白解離的半衰期是5-6小時，NO結(jié)合到?jīng)]有02結(jié)合的血紅蛋白在生理時標(biāo)中是有效不可逆的，由此有效失活作為無細(xì)胞02載體的血紅蛋白?！㎞O分子與血紅蛋白反應(yīng)，它被從信號分子庫中消除，由此引起某些不利狀況。例如，NO與血紅蛋白(有或沒有02結(jié)合)的結(jié)合可以阻止血管舒張并潛在地導(dǎo)致高血壓，這有時在某些細(xì)胞外血紅蛋白溶液給藥后被觀察到。介導(dǎo)某些炎癥反應(yīng)也需要NO。例如，由內(nèi)皮產(chǎn)生的NO抑制血小板凝集。結(jié)果，由于NO被無細(xì)胞的血紅蛋白(具有或沒有02結(jié)合)結(jié)合，血小板凝集可能增加。隨著血小板凝集，它們釋放有效的血管收縮化合物，如血栓垸A2和血清素。這些化合物可與由血紅蛋白清除引起的降低的NO水平協(xié)同起作用，以產(chǎn)生顯著的血管收縮。除了抑制血小板凝集，NO也抑制中性粒細(xì)胞(neutrophil)附著于細(xì)胞壁，該附著反過來可導(dǎo)致細(xì)胞壁損傷。內(nèi)皮細(xì)胞壁損傷已經(jīng)在某些血紅細(xì)胞溶液輸注中觀察到?；谘t蛋白的血液代用品的另一個主要缺點是它們對02的高親和性。該高親和性限制了血紅蛋白在期望的位置(如外周組織)以臨床有用的速率釋放氧氣的能力?？蛇x地，在到達(dá)微血管床之前由主動脈中較低親和性的基于血紅蛋白的血液代用品引起的02釋放可能由于高氧性血管收縮反應(yīng)而引起血管收縮(Winslow假設(shè))。此外，基于血紅蛋白的血液代用品受到無細(xì)胞的血紅蛋白從血漿中快速清除的限制，所述清除是由于從血漿中清除無細(xì)胞的血紅蛋白的血紅蛋白受體的存在所致。無細(xì)胞的血紅蛋白也可能引起腎臟中毒，可能是由于腎小球中的NO耗盡，引起收縮和后續(xù)的機(jī)能障礙。由于目前血液代用品的局限性和捐獻(xiàn)血液的長期缺乏，仍對其它或替代性的用于輸送氧的療法存在顯著的興趣和需要。具體而言，具有較低NO反應(yīng)性和/或較長的血漿保留時間的血液代用品是期望的。也需要02結(jié)合解離常數(shù)或解離速率(offrate)適合于具體臨床或工業(yè)應(yīng)用的氧載體。其中02載體是期望的示例性工業(yè)應(yīng)用包括細(xì)胞在培養(yǎng)基中的生長，這通常被到達(dá)細(xì)胞的02量限制。發(fā)明概述本發(fā)明部分基于這樣驚人的發(fā)現(xiàn)野生型和突變H-NOX蛋白具有比血紅蛋白低得多的NO反應(yīng)性，并因此是理想的02載體。如果希望，突變可以被引入H-NOX蛋白，以改變它們對02和NO配體的結(jié)合，以進(jìn)一步優(yōu)化H-NOX蛋白作為02載體的應(yīng)用?！矫?，本發(fā)明以突變H-NOX蛋白為特征。因此，在一些實施方式中，本發(fā)明提供了具有至少一個突變的分離的H-NOX蛋白，與相應(yīng)野生型H-NOX蛋白的02解離常數(shù)或NO反應(yīng)性比較，所述突變改變了02解離常數(shù)或NO反應(yīng)性。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在血紅蛋白的02解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)，并且突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC下在約2nM到約50pM之間，在20'C下在約50nM到約10pM之間，在20'C下在約20nM到約2pM之間，在20'C下在約100nM到約1.9^M之間，在20'C下在約150nM到約1^M之間，或者在2(TC下在約100nM到約255nM之間。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C下小于約80nM，例如在20"C下在約20nM到約75nM之間。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少100倍，例如，比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少1000倍。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20'C下小于約700s—、例如，在20。C下小于約600s"、500s"、400s人300s-1、200s"、100s"、75s"、50s"、25s-1、20s-1、10s-1、50s-1、3s-1、2s-1、1.8s-1、1.5s-1、1.2s-1、1.0s-1、0.8s-1、0.7s"或0.6s—1。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白對氧的k。ff(k解離)在20°C下在約0.01到約200s—1之間，例如在約1.0s—1到約16.0s"之間。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20。C下在約100nM到約1.9pM之間，并且突變H-NOX蛋白對氧的k。ff在20。C下在約1.35s—1到約14.5s—1之間。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37"下小于約1h"。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白對氧的k巡在20。C下在約1.35s—1到約14.5s—1之間，并且突變H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C下小于約1h\在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白對氧的k。ff在20。C下在約1.35s—1到約14.5s—1之間，并且突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20。C下小于約700s"(例如，在20'C下小于約600s—1、500s—1、100s—、20s"或1.8s")。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37'C下小于約1h—'，并且突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在2(TC下小于約700s"(例如，在20。C下小于約600s"、500s"、100s—1、20s—1或1.8s-1)。在一些實施方式中，本發(fā)明的特征在于具有至少一個突變的分離的H-NOX蛋白，與相應(yīng)野生型H-NOX蛋白相比，所述突變改變對氧的k礎(chǔ)或NO反應(yīng)性。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白對氧的k。ff在20'C在約0.01s"到約200s"之間，并且突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白在20'C具有小于或等于約0.65s—1(例如，在2(TC在約0.21s"到約0.65s—1之間)的對氧的k。ff。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白由騰沖嗜熱厭氧菌(7:加gcw7g^^)蛋白衍生并在2(TC具有約1.35S—1到約18s"的對氧koff。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少100倍，例如，比血紅蛋白低至少IOOO倍。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在2(TC小于約700s"，例如在20。C小于約600s-1、500s-1、400s-1、300s-1、200s-1、100s-1、75s-1、50s-1、25s"、20s-1、10s-1、50s-1、3s"、2s"、1.8s-1、1.5s-1、1.2s-1、1.0s"、0.8s"、0.7s-1或0.6s-1。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20。C在約lnM到約lmM之間，在20。C在約2nM到約50pM之間，在2(TC在約50nM到約10|nM之間，或在2(TC在約100nM到約1.9pM之間。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約1h—1。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約100nM到約1.9之間，并且突變H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37'C小于約lh—、在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約100nM到約1.9pM之間，并且突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在2(TC小于約700s"(例如在2(TC小于約600s—1、500s—1、100s—'、20s"或1.8s")。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37'C小于約1h"，并且突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在2(TC小于約700s—k例如在20'C小于約600s-'、500s-'、100s"、20s"或1.8s-"。在多種實施方式中，本發(fā)明的特征在于具有至少一個突變的分離的H-NOX蛋白，與相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白的02解離常數(shù)或NO反應(yīng)性相比，所述突變改變02解離常數(shù)或NO反應(yīng)性。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在血紅蛋白的02解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)，并且突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20。C在約100nM到約255nM之間。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2CTC小于80nM，例如在20'C在約20nM到約75nM之間。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少100倍，例如比血紅蛋白低至少1000倍。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白在20'C具有小于或等于約0.65s"(例如，在20'C在約0.21s—1到約0.65s"之間)的對氧k必。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的對氧koff在2(TC在約1.35s"到約2.9s—'之間。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的對氧k必在20。C在約5.8s—1到約19s—1之間。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白在4"C下在空氣中是穩(wěn)定的。在一些實施方式中，本發(fā)明的特征在于具有至少一個突變的分離的H-NOX蛋白，與相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白相比，所述突變改變對氧的k。ff或NO反應(yīng)性。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的對氧的k。ff在2(TC小于或等于約0.65s—'，且突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的對氧k。ff在20。C在約0.21s—1至U約0.65s-1之間。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)46性低至少100倍，例如比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少IOOO倍。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在2(TC小于約700s—1，例如在20'C小于約600s-1、500s-1、400s-1、300s"、200s-1、100s-1、75s-1、50s-1、25s-1、20s"、10s"、50s"、3s-'、2s-1、1.8s"、1.5s"、1.2s-1、1.0s"、0.8s"、0.7s"或0.6s"。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約100nM到約1.9之間。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約1h"。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約100nM到約1.9pM之間，并且突變H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約1h"。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約100nM到約1.9iaM之間，并且突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20。C小于約700s"(例如在20°C小于約600s"、500s—1、100s—1、20s-1、1.8s—'或0.7)。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約1h"，并且突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20。C小于約700s"(例如在20。C小于約600s"、500s"、100s"、20s-1、1.8s"或0.7)。在多種實施方式中，本發(fā)明的特征在于分離的H-NOX蛋白，所述蛋白選自騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L-P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9Y、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9N、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74E、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y-Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXP115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXR135Q、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140A、騰沖嗜熱厭氧菌I75F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌I75F、騰沖嗜熱厭氧菌L144F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌L144F、丄2F9W-F142Y、脫硫脫硫弧菌(".cfe#w/ca/w)H-NOX(728-899)、脫硫脫硫弧菌H-NOXY139L、卩l(xiāng)(l-385)、(31(1-385)H45Y、(31(1-385)1145H、卩1(1-194)、卩1(1-194)1145Y、(31(1-194)L9W-I145Y、(32(1-217)、(32(1-217)1142Y、肉毒梭菌(C.H-NOX(l-175)、肉毒梭菌H-NOX(l-186)、丙酮丁醇梭菌(C.ace/o^0^'cww)H-NOX(l-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-183)和線蟲(C.e/egam)H-NOXGCY-35(l-252)。在一些實施方式中，pl或|32蛋白衍生自褐鼠(i."wwg/c^)或智人sap/era)pl或卩2蛋白。在多種實施方式中，本發(fā)明的特征在于分離的H-NOX蛋白，所述蛋白選自騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXI5A、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXI5L、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXI5L-P115A、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXW9F-Y140L、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXW9F-Y140H、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXW9F-N74A、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOX47W9Y、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXW9N、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXW9H、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXN74E、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXN74A、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXN74H、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXN74A-Y140H、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXF78Y-Y140F、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXP115A、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXR135Q、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXY140H、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXY140A、騰沖厭氧嗜熱菌I75F-His6、騰沖厭氧嗜熱菌I75F、騰沖厭氧嗜熱菌L144F-His6、騰沖厭氧嗜熱菌L144F、嗜肺軍團(tuán)菌(Z.戶ewmopM/a)2F9W-F142Y、脫硫脫硫弧菌H-NOX(728-899)、脫硫脫硫弧菌H-NOXY139L、(31(1-385)1145H、(31(1-194)、卩1(1-194)1145Y、(31(1-194)L9W-I145Y、(32(1-217)、卩2(1-217)1142Y、肉毒梭菌H-NOX(l-175)、肉毒梭菌H-NOX(l-186)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-183)和線蟲H-NOXGCY-35(l-252)。在一些實施方式中，卩l(xiāng)或卩2蛋白衍生自褐鼠或智人pl或(32蛋白。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在智人(/fowc^op/era)血紅蛋白a的02解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)，例如02解離常數(shù)在智人血紅蛋白a的02解離常數(shù)的0.1到10倍之間，或在0.5到2倍之間。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比智人血紅蛋白a的NO反應(yīng)性低至少10倍，例如比智人血紅蛋白a的NO反應(yīng)性低至少100倍或1000倍。在分離的H-NOX的一些實施方式中，與其從中衍生的H-NOX蛋白比較，所述H-NOX蛋白包含一個或多個突變(例如l、2、3、4、5、6、7、8、9或10個突變)。在分離的H-NOX蛋白的多個實施方式中，與其從中衍生的H-NOX蛋白相比，所述H-NOX蛋白包含少于20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3或2個突變。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白具有至少一個遠(yuǎn)側(cè)袋突變(distalpocketmutation)。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白具有至少一個不在遠(yuǎn)側(cè)袋中的突變。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白具有至少一個突變，其中對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Ile5、Trp9、Asn74、Pro115或Argl35或卩l(xiāng)(l-385)的1145的殘基被任何其它氨基酸代替。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白具有至少兩個突變，其中至少一個突變是對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Ile5、Trp9、Asn74、Pro115或Argl35或卩l(xiāng)(l-385)的1145的殘基被任何其它氨基酸代替。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白中的突變對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌的I5A突變、I5L突變、W9F突變、Y140F突變、Y140H突變、W9FY140H雙突變或F78YY140F雙突變，或pl的I145Y突變。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白中的突變對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌的W9Y突變、W9H突變、W9N突變、N74H突變、N74E突變、N74A突變、P115A突變、R135Q突變、I5LP115A雙突變、N74AY140H雙突變或W9FN74A雙突變。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述H-NOX蛋白中的至少一個C-末端氨基酸(例如至少約50個連續(xù)的C-末端氨基酸或約25個到約200個連續(xù)的C-末端氨基酸)已經(jīng)被移除。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白衍生自哺乳動物蛋白(如人類蛋白，如(31)。在分離的H-NOX蛋白的各種實施方式中，所述H-NOX蛋白衍生自細(xì)菌蛋白(如騰沖嗜熱厭氧菌蛋白)。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白被共價結(jié)合到另一個分子或部分，例如聚乙二醇。血紅素可以結(jié)合或可以不結(jié)合到H-NOX蛋白。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，氧被結(jié)合至H-NOX蛋白。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白是融合蛋白，其包括H-NOX結(jié)構(gòu)域和另一蛋白的部分或全部，如白蛋白(如人血清白蛋白)。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y/Y140L、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX或嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOXF142Y。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是褐鼠(32(1-217)、褐鼠(31(1-194)、褐鼠)31(1-385)或褐鼠卩1(1-385)I145Y。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F或智人(31H-NOX(1-385)I145Y。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H、智人卩l(xiāng)1140Y或智人卩l(xiāng)I145Y。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F、野生型嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOX、智人卩l(xiāng)H-NOXI140Y、野生型智人卩l(xiāng)H-NOX、褐鼠sGCpiH-NOX(1-385)、褐鼠sGC卩l(xiāng)H-NOX(1-385)U45Y、褐鼠sGC卩l(xiāng)H-NOXH105G、褐鼠sGC|31H-NOXHI05F、褐鼠sGC(31H-NOXI145Y、野生型褐鼠卩l(xiāng)H陽NOX、野生型黑腹果蠅(￡.騰/a"ga愈。卩l(xiāng)H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PAH-NOX、野生型線蟲GCY-35H-NOX、野生型點形念珠藻(TV.戸"",/o，e)H-NOX、野生型新月柄桿菌(C.H-NOX、野生型沙雷氏菌(S.o股Wem^)H-NOX或野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOXF142Y、野生型嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOX、智人(31H-NOXI140Y、智人BlI145Y、野生型智人卩l(xiāng)H-NOX、褐鼠sGCpiH-NOX(1-385)、褐鼠sGC(31H-NOX(1-385)I145Y、褐鼠sGC卩l(xiāng)H-NOXH105G、褐鼠sGC(31H-NOXH105F、褐鼠sGC卩l(xiāng)H-NOXI145Y、野生型褐家鼠(31H-NOX、野生型黑腹果蠅(31H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PAH-NOX、野生型線蟲GCY-35H-NOX、野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX或野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是下列蛋白的任何一種，所述蛋白按其基因名稱、接著是它們的物種縮寫和Genbank標(biāo)識符加以列出(例如從2006年5月21日、2006年5月22日、2007年5月21日、2007年5月22日起可獲得的以下蛋白序列)Npun5905—Npu一23129606、alr2278—Ana—17229770、S02144—Sone—24373702、Mdegl343—Mde—23027521、VCA0720一VchJ5601476、CC2992—Ccrl6127222、Rsph2043—Rhsp一22958463(gi:46192757)、Mmcl0739—Mcsp22999020、Tar4—Tte_20807169、Ddes2822—Dde一23475919、CAC3243—Cac—15896488、gcy-31一Cel7568389、CG14885一Dm—24647455、GUCY1B3—Hs—4504215、HpGCS-betal—Hpu1—14245738、Gycbetal00B—Dm—24651577、CG4154—Dm—24646993(gi:NP—650424.2、gi:62484298)、gcy-32—Ce一13539160,gcy-36Ce—17568391(gi:32566352、gi:86564713)、gcy陽35—Ce-l7507861(gi:71990146)、gcy-37_Ce—17540904(gi:71985505)、GCYla3—Hs—20535603、GCYla2-Hs—899477或GYCa-99B—Dm—729270(gi:68067738)(Lakshminarayan等人(2003)'"Ancientconserveddomainssharedbyanimalsolubleguanylylcyclasesandbacterialsignalingproteins,"5M7Ge"ww'cr4:5-13)。這些名稱中使用的物種縮寫包括Ana-魚腥藻(」m^ae"aSp);Ccr-新月柄桿菌(Qra/oto"wcmy""^s1);Cac-丙酮丁醇梭菌(C/oWn.<i/wOTacetoZw(y/z.cwn);Dde—月兌硫脫硫弓瓜菌(￡)esw//ov/6〃'oc/eyw//wn.ca">si);Mcsp—趨石茲細(xì)菌某禾中(iWog"etococcwss;,);Mde—M/cra6w/^/ertfegradara;Npu—點形念珠藻(jVatoc戸"c"/orae);Rhsp—球形紅細(xì)菌(朋otfo6"c化r—);Sone-沙雷氏菌(S/zewa"e〃aone/cfem/s);Tte—騰沖嗜熱厭氧菌(777e7'腦a"aera6acfe〃e"gco"gm^);Vch-霍舌L弧菌(柳〃'oc/zo/erae);Ce-線蟲(Cae"w/a6af/toe/egara);Dm-黑腹果蠅；Hpul—馬糞海膽(//em/ce"fra^pw/c/zem>m);Hs-智人。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是以下H-NOX蛋白的任何一種，所述蛋白按照它們的生物體名稱和Pfam數(shù)據(jù)庫登錄號列出(例如從2006年5月21日、2006年5月22日、2007年5月21日、2007年5月22日起可獲得的以下蛋白序列)線蟲種(O^w/zaMtoZ^'gg^e)Q622M5CAEBR、線蟲種Q61P44CAEBR、線蟲種Q61R54—CAEBR、線蟲種Q61V90—CAEBR、線蟲種Q61A94CAEBR、線蟲種Q60TP4—CAEBR、線蟲種Q60M10—CAEBR、線蟲(Caew^/wkZ/toe/ega/)GCY37_CAEEL、線蟲GCY31CAEEL、線蟲GCY36—CAEEL、線蟲GCY32—CAEEL、線蟲GCY35CAEEL、線蟲GCY34_CAEEL、線蟲GCY33—CAEEL、弓背青鮪(Oo^'twcwv/"oft^)Q7T040—ORYCU、弓背青鏘Q75WF0—ORYCU、青魚將(Or_yz/oy)P79998—ORYLA、青鏘Q7ZSZ5—ORYLA、黑青斑河豚(T"raotfo"m'grav/〃Vfo)Q4SW38—TETNG、黑青斑河豚Q4RZ94—TETNG、黑青斑河豚Q4S6K5—TETNG、紅鰭東方飩(Fwgwn^Wp")Q90VY5—FUGRU、非洲爪蟾(Xe"ojmyQ6INK9—XENLA、智人Q5T8J7_HUMAN、智人GCYA2—HUMAN、智人GCYB2—HUMAN、智人GCYB1—HUMAN、大猩猩(Gwv7/"gori〃")Q9Nl93—9PRIM、猩猩(Po"go;7ygOTaews)Q5RAN8_PONPY、黑猩猩(frag/o辦r^)Q9N192—PANTR、獼猴(vWaa^aww/a/to)Q9N194_MACMU、白掌長臂猿(/fy/o6a^y/a/")Q9N191一HYLLA、小鼠(ww"w/tw)Q8BXH3—MOUSE、小鼠GCYB1_M0USE、小鼠Q3UTI4—MOUSE、小鼠Q3UH83—MOUSE、小鼠Q6XE41—MOUSE、小鼠Q80YP4—MOUSE、褐鼠Q80WX7—RAT、褐鼠Q80WX8—RAT、褐鼠Q920Q1—RAT、褐鼠Q54A43—RAT、褐鼠Q80WY0—RAT、褐鼠Q80WY4—RAT、褐鼠Q8CH85—RAT、褐鼠Q80WY5—RAT、褐鼠GCYB1—RAT、褐鼠Q8CH90—RAT、褐鼠Q91XJ7—RAT、褐鼠Q80WX9—RAT、褐鼠GCYB2—RAT、褐鼠GCYA2—RAT、家犬(Cam's/ww'toW5)Q4ZHR9_CANFA、西藏黃牛(5^town^)GCYBl—BOVIN、野豬(Swncra/a)Q4ZHR7—PIG、雙斑蟋(G"〃m&>wa//aft)Q59HN5—GRYBI、煙草天蛾(M""t/wcaw;cto)077106—MANSE、煙草天蛾076340—MANSE、意大利蜂(^w\y;we〃^ra)Q5UAF0—APIME、意大利蜂Q5FAN0—APIME、意大利蜂Q6L5L6—APIME、岡比亞疙蚊strPEST(爿w^/ze/^gt/wW"estrPEST)Q7PYK9_ANOGA、岡比亞癥蚊strPESTQ7Q9W6—ANOGA、岡比亞瘧蚊strPESTQ7QF31—ANOGA、岡比亞瘧蚊strPESTQ7PS01_ANOGA、岡比亞瘧蚊strPESTQ7PFY2—ANOGA、岡比亞瘧蚊Q7KQ93—ANOGA、黑腹果蠅Q24086—DROME、黑腹果蠅GCYH—DROME、黑腹果蠅GCY8E—DROME、黑腹果蠅GCYDA—DROME、黑腹果蠅GCYDB—DROME、黑腹果蠅Q9VA09—DROME、擬暗果蠅("mwpMa;wew^ofccwra)Q29CE1—DROPS、擬暗果蠅Q296C7—DROPS、擬暗果蠅Q296C8—DROPS、擬暗果蠅Q29BU7—DROPS、海蝸牛(Jp/"/aca/;ybr"/ca)Q7YWK7—APLCA、馬糞海膽Q95NK5—HEMPU、萊茵衣藻(C/z/aw;^owo"ayw/"/zaWr〃)Q5YLC2—CHLRE、魚腥藻Q8YUQ7—ANASP、黃桿菌BBFL7(F/av由"e"'a6a"eW臓朋F丄7)Q26GR8—9BACT、ra/7e房夠wkATCC7朋755Q1VQE5—9FLAO、海洋y蛋白菌(marinegammaproteobacterium)HTCC2207Q1YPJ5_9GAMM、海洋y蛋白菌HTCC2207Q1YTK4—9GAMM、新月柄桿菌Q9A451—CAUCR、隱藏嗜酸菌(c/^;^ww)JF-5Q2DG60—ACICY、球形紅細(xì)菌Q3J0U9—RHOS4、&7/da"wpoweray/Q5LPV1一SILP0、脫氮副球菌(i^racoccMofem'的;/kww)PD1222Q3PC67—PARDE、礎(chǔ)"力"c/er面,Q3QNY2—9RHOB、Ja畫油'"^Q28ML8—JANSC、Magw"ococcMMC-1Q3XT27—9PROT、嗜肺軍團(tuán)菌(丄egw"e〃ai7"eww^/H7a)Q5WXP0—LEGPL、嗜肺軍團(tuán)菌Q5WTZ5—LEGPL、嗜肺軍團(tuán)菌Q5X268—LEGPA、嗜肺軍團(tuán)菌Q5X2R2—LEGPA、嗜肺軍團(tuán)菌嗜肺亞種aeg/we〃ap"ewwop/n7awfop;wewnop/H7")Q5ZWM9—LEGPH、嗜肺軍團(tuán)菌嗜肺亞種Q5ZSQ8—LEGPH、嗜冷細(xì)菌(Co/we〃/a/wyc/z^y/^raea)Q47Y43—COLP3、a/7""/7caT6cQ3CSZ5—ALTAT、沙雷氏菌Q8EF49—SHEON、Sacc/wrap/wgiwtfegrac/ara51Q21E20—SACD2、S"cc/zara—ifegradaraQ21ER7—SACD2、柳〃'oa"gwW,S14Q1ZWE5—9VIBR、創(chuàng)傷弧菌(W6〃'ovw/"訴aw)Q8DAE2—VIBVU、溶藻弧菌(W6〃'ofl/g/"o/,'cra)12G01Q1VCP6—VIBAL、弧菌(PW"o^)DAT722Q2FA22—9VIBR、副溶血弧菌(ra^/opara/wewo/W/a^)Q87NJ1—VIBPA、費(fèi)氏弧菌(ra^/oy^c/zen')Q5E1F5_VIBF1、創(chuàng)傷弧菌Q7MJS8—VIBVY、發(fā)光細(xì)菌(尸/wto6artm'ww^)Q2C6Z5—9GAMM、//afe〃acte乂wm^Q2SFY7—HAHCH、海洋螺旋菌某種((9cetmo5/^W〃ww^)MED92Q2BKV0一9GAMM、海洋桿菌某種(Ocefl"o6"cfer印)RED65Q1N035—9GAMM、脫硫脫硫弧菌(Dew/》v/6r,'otfefw//wn'caw)Q310U7_DESDG、奧氏嗜熱鹽絲菌(//a/o//ermW/z〃';cow"z7)H168Q2AIW5—9FIRM、騰沖嗜熱厭氧菌Q8RBX6_THETN、CaW/"〃w/ow'ptorracc/ara(y"cwsDSM8903Q2ZH17—CALSA、丙酮丁醇梭菌Q97E73—CLOAB、j/fa^)/u7wmeto仏Vefi^e"esQYMFQ3C763—9CLOT、破傷風(fēng)梭菌(C/o'"nWww^tow')Q899J9一CLOTE和拜氏梭菌NCIMB8052(C7a^Www6")'en'wyb'vVC7MBQ2WVN0—CLOBE。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是褐鼠sGC卩l(xiāng)H-NOXC78S或褐鼠sGC卩l(xiāng)H-NOXC78E。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白在Y-S-R基序中不具有突變，所述基序包括人H-NOX的Tyrl35、Serl37和Argl39?！矫?，本發(fā)明以編碼本文所述的任何一種或多種突變H-NOX蛋白的重組核酸為特征。在特定的實施方式中，所述核酸包括圖2-4D或8A-8DD中所示任何核酸的片段或完整核酸序列。在一些實施方式中，所述核酸編碼融合蛋白，該融合蛋白包括H-NOX結(jié)構(gòu)域和另一蛋白的部分或全部，例如白蛋白(如人血清白蛋白)。在一些實施方式中，所述核酸包括至少約50、100、150、200、300、400、500、600、700、800或更多個連續(xù)的來自H-NOX核酸的核苷酸，并且與其所衍生的H-NOX核酸相比，含有一個或多個突變(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個突變)。在多種實施方式中，與其從中衍生的H-NOX核酸相比，突變H-NOX核酸含有少于下列任一數(shù)目的突變約20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3或2個。本發(fā)明也以編碼突變H-NOX蛋白的任何核酸的簡并變體(degeneratevariant)為特征。而在另一方面，本發(fā)明提供了包含任何一種或多種本文所述突變H-NOX核酸的載體。另一方面，本發(fā)明以包含任何一種或多種本文所述突變H-NOX核酸的細(xì)胞為特征。一方面，本發(fā)明以包含本文所述的任何載體的細(xì)胞為特征?！矫?，本發(fā)明以產(chǎn)生H-NOX蛋白的方法為特征。該方法包括在適合突變H-NOX蛋白產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)具有編碼任何一種或多種本文所述的突變H-NOX蛋白的核酸的細(xì)胞。在一些實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步包括純化突變H-NOX蛋白的步驟。52—方面，本發(fā)明以藥物組合物為特征，所述藥物組合物包括一種或多種H-NOX蛋白，例如本文所述的任何野生型或突變H-NOX蛋白。在一些實施方式中，藥物組合物包括藥學(xué)上可接受量的本文所述的H-NOX蛋白和藥學(xué)上可接受的載體。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約lnM和約lmM之間，并且該H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在2(TC小于約700s"(例如，在2(TC小于約600s"、500s"、100s"、20s"或1.8s")。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約20nM到約2pM之間，并且該H-NOX蛋白的對氧k。ff在20。C在約1.0s—1到約16.0s—'之間。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20。C在約20nM到約2nM之間，并且該H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37'C小于約lh"。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約20nM到約2pM之間，并且該H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20。C小于約700s'1(例如，在20。C小于約600s"、500s"、100s"、20s"或1.8s")。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的對氧k巡在2(TC在約1.0s"到約16.0s"之間，并且X蛋白的血紅素自氧化速率在37'C小于約1h"。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的對氧k。ff在2(TC在約1.0s"到約16,0s—1之間，并且該H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20。C小于約700s-1(例如，在20。C小于約600s"、500s"、100s人20s"或1.8s")。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含藥學(xué)上可接受量的H-NOX蛋白和藥學(xué)上可接受載體。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在血紅蛋白的02解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)，并且H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的對氧k說在20。C在約0.01到約200s"之間，其中H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍。在藥物組合物的一些實施方式中，H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在智人血紅蛋白cx的02解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)，例如02解離常數(shù)在智人血紅蛋白a的02解離常數(shù)的0.1到10倍或0.5到2倍之間。在藥物組合物的一些實施方式中，H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比智人血紅蛋白a的NO反應(yīng)性低至少10倍，例如，比智人血紅蛋白a的NO反應(yīng)性低至少100倍或1000倍。在藥物組合物的一些實施方式中，H-NOX蛋白是野生型蛋白。在藥物組合物的一些實施方式中，H-NOX蛋白是如本文所述的突變蛋白。在藥物組合物的各種實施方式中，H-NOX蛋白具有至少一個突變，與相應(yīng)野生型蛋白相比，所述突變改變02解離常數(shù)、對氧k。ff、血紅素自氧化速率、NO反應(yīng)性、NO穩(wěn)定性或前述任何兩種或多種。在藥物組合物的一些實施方式中，H-NOX蛋白選自野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L-P15A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9Y、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9N、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74E、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y-Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXPI15A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXR135Q、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140A、騰沖嗜熱厭氧菌F75F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌F75F、騰沖嗜熱厭氧菌L144F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌L144F、嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOXF142Y、野生型嗜肺軍團(tuán)菌1H-N0X、野生型嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOX、嗜肺軍團(tuán)菌2F9W-FI42Y、野生型脫硫脫硫弧菌H-NOX、脫硫脫硫弧菌H-NOX(728-899)、脫硫脫硫弧菌H-NOXY139L、野生型智人plH-NOX、智人|31U45Y、智人(31(1-385)、智人卩1(1-385)1145Y、智人(31(1-385)1145H、智人卩1(1-194)、智人(31(1-194)1145Y、智人(31(1-194)L9W-I145Y、智人|32(1-217)、智人(32(1-217)1142Y、智人卩l(xiāng)H-NOXH105G、智人(31H-NOXH105F、野生型褐鼠卩l(xiāng)H-NOX、褐鼠卩l(xiāng)(l-385)、褐鼠(31(1-385)1145Y、褐鼠卩1(1-385)1145H、褐鼠(31(1-194)、褐鼠卩1(1-194)1145Y、褐鼠|31(1-194)L9W-I145Y、褐鼠(32(1-217)、褐鼠(32(1-217)1142Y、褐鼠卩l(xiāng)H-NOXH105G、褐鼠PlH-NOXH105F、肉毒梭菌H-NOX(l-175)、肉毒梭菌H-NOX(l-186)、野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-183)、野生型線蟲GCY-35H-NOX、線蟲H-NOXGCY-35(l-252)、野生型黑腹果蠅(31H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PA、野生型黑腹果蠅CG14886、野生型黑腹果蠅CG4154;野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、野生型小鼠H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型家牛H-NOX、野生型褐鼠；野生型非洲爪蟾H-NOX、野生型青雜H-NOX、野生型O.c鵬'ra/wH-NOX、野生型紅鰭東方飩H-NOX、野生型岡比亞按蚊H-NOX、野生型煙草天蛾H-NOX;野生型線蟲gcy-31、線蟲gcy-32、野生型線蟲gcy-33、野生型線蟲gcy-34、野生型線蟲gcy-35、野生型線蟲gcy-36、野生型線蟲gcy-37;野生型霍亂弧菌H-NOX、野生型費(fèi)氏弧菌H-NOX和野生型點形念珠藻H-NOX。在藥物組合物的一些實施方式中，所述藥物組合物包括一種或多種脂質(zhì)體或納米顆粒，其包含或封裝了H-NOX蛋白。在藥物組合物的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H。在藥物組合物的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y/Y140L、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX或嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOXF142Y。在藥物組合物的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是褐鼠(32(1-217)、褐鼠(31(1-194)、褐鼠(31(1-385)或褐鼠卩1(1-385)1145Y。在藥物組合物的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F或智人(31H-NOX(1-385)1145Y。在一些實施方式中，H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H、智人卩l(xiāng)I140Y或智人(31IM5Y。在藥物組合物的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F、野生型嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOX、智人卩l(xiāng)H-NOXU40Y、野生型智人plH-NOX、褐鼠sGC卩l(xiāng)H-NOX(1-385)、褐鼠sGCplH-NOX(1-385)1145Y、褐鼠sGC(31H-NOXH105G、褐鼠sGC(31H陽NOXH105F、褐鼠sGCplH-NOX1145Y、野生型褐鼠(31H-NOX、野生型黑腹果蠅plH-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PAH-NOX、野生型線蟲GCY-35H-NOX、野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX或野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX。在藥物組合物的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOXF142Y、野生型嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOX、智人plH-NOX1140Y、智人Bl1145Y、野生型智人plH-NOX、褐鼠sGC卩l(xiāng)H-NOX(1-385)、褐鼠sGC(31H-NOX(1-385)1145Y、褐鼠sGC(31H-NOXH105G、褐鼠sGC卩l(xiāng)H-NOXH105F、褐鼠sGC卩l(xiāng)H-NOX1145Y、野生型褐鼠(31H-NOX、野生型黑腹果蠅piH-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PAH-NOX、野生型線蟲GCY-35H-NOX、野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX或野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX。在藥物組合物的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是下列H-NOX蛋白的任何一種，所述蛋白按它們的基因名稱、接著是它們的物種縮寫和Genbank標(biāo)識符加以列出(例如從2006年5月21日、2006年5月22日、2007年5月21日、2007年5月22日起可獲得的以下蛋白序列)Npun5905—Npu—23129606、alr2278—AnaJ7229770、S02144—Sone—24373702、Mdegl343—Mde—23027521、VCA0720—Vch—15601476、CC2992一Ccrl6127222、Rsph2043一Rhsp一22958463(gi:46192757)、Mmc10739一Mcsp—22999020、Tar4—Tte_20807169、Ddes2822一Dde一23475919、CAC3243—Cac_l5896488、gcy-31—Ce—17568389、CG14885_Dm—24647455、GUCYlB3一Hs—4504215、HpGCS-betal一Hpul一14245738、Gycbetal00B—Dm一24651577、CG4154—Dm一24646993(gi:NP一650424.2、gi:62484298)、gcy-32一Ce—13539160,gcy-36一Ce—17568391(gi:32566352、gi:86564713)、gcy-35—Ce陽l7507861(gi:719卯146)、gcy-37—Ce—17540904(gi:71985505)、GCYla3—Hs_20535603、GCYla2-Hs—899477或GYCa-99B—Dm_729270(gi:68067738)(Lakshminarayan"(2003)"Ancientconserveddomainssharedbyanimalsolubleguanylylcyclasesandbacterialsignalingproteins,"5MGGenow,'"4:5-13)。這些名稱中使用的物種縮寫包括Ana-魚腥藻(^"Ww"aSp);Ccr—新月柄桿菌(Ow/o6flcto"cmsre"似j0;Cac-丙酮丁醇梭菌(C7o欲W訓(xùn)臟fo6w一c廳)；Dde—脫硫脫硫弧菌(D謹(jǐn)^/bv/6r/0^,鵬'oms0;Mcsp—趨磁細(xì)菌某禾中(Magwetococciw);Mde—Af/croZw/6^rtfegrac/ara;Npu—點形念珠藻(Mwtocpimc",,);Rhsp-球形紅細(xì)菌(—am油5);Sone-沙雷氏菌(幼，a"etoo股i'cfe"s!'s);Tte-騰沖嗜熱厭氧菌(TTzeraocmaera^cfe/-加gc0"gem7S);Vch-霍舌L弧菌(附〃'oc/zo/erae);Ce-線蟲；Dm—黑腹果蠅；Hpul-馬糞海膽(//e柳'ce"raft^;w/c&m'wi^);Hs—智人。在藥物組合物的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是褐鼠sGCplH-NOXC78S或褐鼠sGC|31H-NOXC78E。在藥物組合物的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是以下H-NOX蛋白的任何一種，所述蛋白質(zhì)按照它們的生物體名稱和Pfam數(shù)據(jù)庫登錄號列出(例如從2006年5月21日、2006年5月22日、2007年5月21日、2007年5月22日起可獲得的以下蛋白序列)線蟲種(Cae"oAW力fc6hg^ae)Q622M5—CAEBR、線蟲種Q61P44—CAEBR、線蟲種Q61R54—CAEBR、線蟲種Q61V90—CAEBR、線蟲種Q61A94—CAEBR、線蟲種Q60TP4—CAEBR、線蟲種Q60M10—CAEBR、線蟲(Cae"w/wM/fce/egara)GCY37—CAEEL、線蟲GCY31—CAEEL、線蟲GCY36—CAEEL、線蟲GCY32—CAEEL、線蟲GCY35—CAEEL、線蟲GCY34—CAEEL、線蟲GCY33—CAEEL、弓背青鏘(cwrw'"W^)Q7T040—ORYCU、弓背青鏘Q75WF0—ORYCU、青鏘(0少z/ay/a/^^)P79998—ORYLA、青鏘Q7ZSZ5J3RYLA、黑青斑河豚(r"raocto""z'grawV^fa)Q4SW38—TETNG、黑青斑河豚Q4RZ94—TETNG、黑青斑河豚Q4S6K5—TETNG、紅鰭東方飩(Fwgwn^r/p")Q卯VY5—FUGRU、非洲爪蟾(Ze"叩^/"ev/s)Q6INK9—XENLA、智人Q5T8J7—HUMAN、智人GCYA2_HUMAN、智人GCYB2—HUMAN、智人GCYB1—HUMAN、大猩猩(Go"7/ago〃7/a)Q9N193—9PRIM、猩猩(wgwaews)Q5RAN8—PONPY、黑猩猩(戶a"的g/o辦to)Q9N192_PANTR、獼猴(iWacacaww/a加)Q9N194—MACMU、白掌長臂猿(Z/y/o6ato)Q9N191一HYLLA、小鼠(Mwsmwscw/ws)Q8BXH3一MOUSE、小鼠GCYBl一MOUSE、小鼠Q3UTI4—MOUSE、小鼠Q3UH83—MOUSE、小鼠Q6XE41—MOUSE、小鼠Q80YP4_MOUSE、褐鼠Q80WX7_RAT、褐鼠Q80WX8—RAT、褐鼠Q920Q1—RAT、褐鼠Q54A43—RAT、褐鼠Q80WY(^RAT、褐鼠Q80WY4—RAT、褐鼠Q8CH85—RAT、褐鼠Q80WY5—RAT、褐鼠GCYB1一RAT、褐鼠Q8CH卯—RAT、褐鼠Q91XJ7—RAT、褐鼠Q80WX9—RAT、褐鼠GCYB2—RAT、褐鼠GCYA2—RAT、家犬(C""h/"w///"^)Q4ZHR9_CANFA、西藏黃牛(5osGCYBl—BOVIN、野豬(Smjcto/")Q4ZHR7一PIG、雙斑蟋(G/^/ZmWwacw/加^)Q59HN5—GRYBI、煙草天蛾(Ma"血c"化;cto)077106—MANSE、煙草天蛾76340—MANSE、意大利蜂(柳仏/era)Q5UAF0—APIME、意大利蜂Q5FAN0—APIME、意大利蜂Q6L5L6—APIME、岡比亞瘧蚊strPEST""op/ze/^gaw6/aestrPEST)Q7PYK9一ANOGA、岡比亞瘧蚊strPESTQ7Q9W6—ANOGA、岡比亞瘧蚊strPESTQ7QF31—ANOGA、岡比亞瘧蚊strPESTQ7PS01—ANOGA、岡比亞瘧蚊strPESTQ7PFY2—ANOGA、岡比亞瘧蚊Q7KQ93—ANOGA、黑腹果蠅Q24086—DROME、黑腹果蠅GCYH—DROME、黑腹果蠅GCY8E—DROME、黑腹果56蠅GCYDA—DROME、黑腹果蠅GCYDB—DROME、黑腹果蠅Q9VA09—DROME、擬暗果蠅(Z)myo;/n7cf戸ew/oofccwr")Q29CE1—DROPS、擬暗果蠅Q296C7—DROPS、擬暗果蠅Q296C8—DROPS、擬暗果蠅Q29BU7—DROPS、海蝸牛(^/，/aca/z/ow/ca)Q7YWK7—APLCA、馬糞海膽Q95NK5—HEMPU、萊茵衣藻(CW"OT_y^ww"aym'"/z"W///)Q5YLC2—CHLRE、魚腥藻Q8YUQ7—ANASP、黃桿菌BBFL7(F/aw)Zwc/m'"6""e"'畫朋FZ7)Q26GR8—9BACT、尸，/zra,xwsto，/sATCC7W7WQ1VQE5—9FLAO、海洋y蛋白菌(marinegammaproteobacterium)HTCC2207Q1YPJ5—9GAMM、海洋y蛋白菌HTCC2207Q1YTK4—9GAMM、新月柄桿菌Q9A451—CAUCR、隱藏嗜酸菌JF-5(^"'^M/wwa7;7/w附JF-5)Q2DG60—ACICY、球形紅細(xì)菌Q3J0U9—RHOS4、57//c沾a"w;wwera力Q5LPV1_SILP0、脫氮副球菌(i^racocciwcfemY"yca"s)PD1222Q3PC67—PARDE、S/"c/to"erw:TM/似0Q3QNY2一9RHOB、Ja朋mc/na印Q28ML8jANSC、Mag"etococa^^MC-1Q3XT27—9PROT、嗜肺軍團(tuán)菌aeg/owe〃a/7mwOTo;fe7")Q5WXP0—LEGPL、嗜月巿軍團(tuán)菌Q5WTZ5—LEGPL、嗜肺軍團(tuán)菌Q5X268JLEGPA、嗜肺軍團(tuán)菌Q5X2R2—LEGPA、嗜肺軍團(tuán)菌嗜肺亞種aeg/o"e〃a;"ewmo/^7a，e膽op層a)Q5ZWM9—LEGPH、嗜肺軍團(tuán)菌嗜肺亞種Q5ZSQ8—LEGPH、嗜冷細(xì)菌(Co/we〃/ajw_yc/^eo^raea)Q47Y43—COLP3、大西洋假交替單胞菌(/V^oa/^ra,"o"asa,/a加'ca)T6cQ3CSZ5—ALTAT、沙雷氏菌Q8EF49—SHEON、&cc/wrap/wgws(5fegrat/離Q21E20一SACD2、&cc/"ra;7/，s(iegrai/騰Q21ER7一SACD2、M6n'o朋g^ftwzS14Q1ZWE5一9VIBR、創(chuàng)傷弧菌(W6"'ora/"^c^)Q8DAE2—VIBVU、溶藻弧菌(K泊"'oa/gi"o(y"ciw)12G01Q1VCP6—VIBAL、弧菌某種(^)DAT722Q2FA22—9VIBR、副溶血弧菌(W6n'opara/z"ewo/,—c^)Q87NJ1—VIBPA、費(fèi)氏弧菌(W6〃'o力sc/^n')Q5E1F5—VIBF1、創(chuàng)傷弧菌Q7MJS8_VIBVY、發(fā)光菌某種(P/wto^"m'i^)Q2C6Z5—9GAMM、c/ze乂we"^Q2SFY7—HAHCH、海洋螺旋菌某種(0ce朋05p/n7/wm^)MED92Q2BKV0—9GAMM、海洋桿菌某種(Oceaw&a"er5p)RED65Q1N035—9GAMM、脫硫脫硫弧菌(Dew//ovA/"/oa^w//w〃'cara)Q310U7—DESDG、奧氏嗜熱鹽絲菌(/fo/oAewwAn'xorcm'Z)H168Q2AIW5—9FIRM、騰沖嗜熱厭氧菌Q8RBX6—THETN、CaW/ce〃w/ow>wptor^cc/z"ra(yricz^DSM8903Q2ZH17—CALSA、丙酮丁醇梭菌Q97E73—CLOAB、j汰a/^7,7wsmeto〃z>ec%e"MQYMFQ3C763—9CLOT、破傷風(fēng)梭菌(C/o欲Wwm時am')Q899J9—CLOTE和拜氏梭菌M:/M萬朋52Q2WVN0—CLOBE。在一些藥物組合物的實施方式中，所述H-NOX蛋白在Y-S-R基序中不具有突變，所述基序包括人H-NOX的Tyrl35、Serl37和Argl39。除非上下文另外明確說明或規(guī)定，本文所述的所有野生型和突變H-NOX蛋白可被用于本文所述的任何藥物組合物中。H-NOX蛋白可具有或可不57具有血紅素和/或結(jié)合氧，并且可共價結(jié)合或可不共價結(jié)合于另一個分子或部分，如聚乙二醇。在一些實施方式中，H-NOX蛋白是融合蛋白，其包括H-NOX結(jié)構(gòu)域和另一蛋白如白蛋白(如人血清白蛋白)的部分或全部?！矫妫景l(fā)明提供了使用H-NOX蛋白向個體(例如，哺乳動物，如靈長類(如人、猴、大猩猩、猿、狐猴等)、牛、馬、豬、狗或貓)輸送氧的方法。在一些實施方式中，個體患有心血管疾病、神經(jīng)疾病、腫瘤缺氧、失血或受傷或者處于心血管疾病、神經(jīng)疾病、腫瘤缺氧、失血或受傷的風(fēng)險。示例性的心血管指征包括心肌梗死(如ST段抬高型心肌梗死)、心臟麻痹、鐮狀細(xì)胞性貧血、圍術(shù)期缺血(peri叩erativeischemia)、外周血管阻塞和血管成形術(shù)。示例性的神經(jīng)指征包括缺血性中風(fēng)、腦外傷和脊髓傷。對于腫瘤缺氧的治療，H-NOX蛋白可以被用作例如實體瘤(如，具有不良轉(zhuǎn)移前預(yù)后的個體)的放射治療佐劑，或作為表面腫瘤(如直腸癌、肺癌或皮膚癌，或在其它可接近表面或位置中的癌癥)的PDT治療佐劑。H-NOX蛋白作為輸血替代選擇的應(yīng)用包括外傷(如戰(zhàn)場、災(zāi)難救援或事故)、手術(shù)(例如腹部動脈瘤手術(shù)、整形外科手術(shù)如髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)、或產(chǎn)生高失血的任何其它手術(shù))、出血、出血性休克、血液稀釋和血液延伸用途(bloodextensionuse)(如補(bǔ)充自體供應(yīng)(supplementingauto-donation))。創(chuàng)傷修復(fù)應(yīng)用的實例包括輻射后創(chuàng)傷修復(fù)(如高壓氧效應(yīng))、術(shù)后恢復(fù)修復(fù)、糖尿病潰瘍修復(fù)和燒傷。因此，在一些實施方式中，本發(fā)明提供了向個體(如人)輸送氧的方法，其通過以足以向個體輸送有效量的氧的量，給予需要它的個體H-NOX蛋白。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20。C在約lnM到約lmM之間，并且H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20°C小于約700s"(例如，在20°C小于約600s"、500s"、100s—1、20s—'或1.8s")。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在血紅蛋白的02解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)，并且H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍。在該方法的一些實施方式中，氧在給予個體H-NOX蛋白之前被結(jié)合到H-NOX蛋白。在該方法的一些實施方式中，氧在在給予個體H-NOX蛋白之前沒有被結(jié)合到H-NOX蛋白，并且H-NOX蛋白將氧從該個體中的一個位置運(yùn)輸?shù)皆搨€體中的另一個位置。在該方法的一些實施方式中，H-NOX蛋白被給予到個體的血液。在該方法的一些實施方式中，H-NOX蛋白被給予到個體的血液、傷口、腫瘤、缺氧組織或缺氧器官。在該方法的一些實施方式中，個體遭受失血或處于失血的風(fēng)險。在該方法的一些實施方式中，H-NOX蛋白被給予個體至少兩次。在該方法的一些實施方式中，H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在智人血紅蛋白a的02解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)，例如02解離常數(shù)是智人血紅蛋白a的02解離常數(shù)的0.1到10倍或0.5到2倍。在該方法的一些實施方式中'H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比智人血紅蛋白a的NO反應(yīng)性低至少10倍，例如，比智人血紅蛋白cc的NO反應(yīng)性低至少100倍或1000倍。在該方法的一些實施方式中，H-NOX蛋白是野生型蛋白。在該方法的一些實施方式中，H-NOX蛋白是本文所述的突變蛋白。在該方法的多種實施方式中，H-NOX蛋白具有至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變02解離常數(shù)、對氧k。ff、血紅素自氧化速率、NO反應(yīng)性或前述的任何兩種或多種。在該方法的一些實施方式中，H-NOX蛋白選自野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L-P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9Y、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9N、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74E、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y-Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXP1I5A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXR135Q、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140A、騰沖嗜熱厭氧菌I75F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌I75F、騰沖嗜熱厭氧菌L144F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌L144F、嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOXF142Y、野生型嗜肺軍團(tuán)菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOX、嗜肺軍團(tuán)菌2F9W-F142Y、野生型脫硫脫硫弧菌H-NOX、脫硫脫硫弧菌H-NOX(728-899)、脫硫脫硫弧菌H-NOXY139L、野生型智人|31H-NOX、智人plI145Y、智人卩1(1-385)、智人卩1(1-385)I145Y、智人pl(l-385)U45H、智人卩1(1-194)、智人(31(1-194)1145Y、智人(31(1-194)L9W-I145Y、智人卩2(1-217)、智人(J2(1-217)I142Y、智人piH-NOXH105G、智人piH-NOXH105F、野生型褐鼠卩l(xiāng)H-NOX、褐鼠j31(l-385)、褐鼠卩l(xiāng)(l-385)1145Y、褐鼠卩1(1-385)U45H、褐鼠卩1(1-194)、褐鼠卩1(1-194)I145Y、褐鼠(31(1-194)L9W-I145Y、褐鼠卩2(1-217)、褐鼠卩2(1-217)I142Y、褐鼠卩l(xiāng)H-NOXH105G、褐鼠卩l(xiāng)H-NOXH105F、肉毒梭菌H-NOX(l-175)、肉毒梭菌H-NOX(l-186)、野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-183)、野生型線蟲GCY-35H-NOX、線蟲H-NOXGCY-35(l-252)、野生型黑腹果蠅(31H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PA、野生型黑腹果蠅CG14886、野生型黑腹果蠅CG4154;野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、野生型小鼠H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型家牛H-NOX、野生型褐鼠；野生型非洲爪蟾H-NOX、野生型青鏘H-NOX、野生型(9.c訓(xùn)'va;toH-NOX、野生型紅鰭東方飩H-NOX、野生型岡比亞按蚊H-NOX、野生型煙草天蛾H-NOX;野生型線蟲gcy-31、線蟲gcy-32、野生型線蟲gcy-33、野生型線蟲gcy-34、野生型線蟲gcy-35、野生型線蟲gcy-36、野生型線蟲gcy-37;野生型霍亂弧菌H-NOX、野生型費(fèi)氏弧菌H-NOX和野生型點形念珠藻H-NOX。在該方法的一些實施方式中，一種或多種脂質(zhì)體或納米顆粒包含或封裝H-NOX蛋白。在該方法的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H。在該方法的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y/Y140L、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX或嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOXF142Y。在該方法的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是褐鼠(32(1-217)、褐鼠(31(1-194)、褐鼠)31(l-385)或褐鼠(31(1-385)I145Y。在該方法的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F或智人piH-NOX(1-385)II45Y。在一些實施方式中，H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H、智人(31I140Y或智人(31U45Y。在該方法的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXYI40F、野生型嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOX、智人(31H-NOXI140Y、野生型智人|31H-NOX、褐鼠sGC卩l(xiāng)H-NOX(1-385)、褐鼠sGC卩l(xiāng)H-NOX(1-385)I145Y、褐鼠sGC(31H-NOXH105G、褐鼠sGC卩l(xiāng)H-NOXH105F、褐鼠sGCpiH-NOXU45Y、野生型褐鼠卩l(xiāng)H-NOX、野生型黑腹果蠅(31H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PAH-NOX、野生型線蟲GCY-35H-NOX、野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX或野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX。在所述方法的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOXF142Y、野生型嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOX、智人(31H-NOX1140Y、智人Bl1145Y、野生型智人卩l(xiāng)H-NOX、褐鼠sGC卩l(xiāng)H-NOX(1-385)、褐鼠sGC卩l(xiāng)H-NOX(1-385)1145Y、褐鼠sGC卩l(xiāng)H-NOXH105G、褐鼠sGC(31H-NOXH105F、褐鼠sGC卩l(xiāng)H-NOX1145Y、野生型褐鼠卩l(xiāng)H-NOX、野生型黑腹果蠅(31H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PAH-NOX、野生型線蟲GCY-35H-NOX、野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX或野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX。在該方法的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是以下H-NOX蛋白的任何一種，所述蛋白以它們的基因名稱、接著是它們的物種縮寫和Genbank標(biāo)識符加以列出(例如從2006年5月21日、2006年5月22日、2007年5月21日、2007年5月22日起可用的以下蛋白序歹U):Npun5905一Npu一23129606、alr2278—Ana一l7229770、S02144—Sone一24373702、Mdeg1343—Mde_23027521、VCA0720一Vch—15601476、CC2992—Ccr—16127222、Rsph2043—Rhsp—22958463(gi:46192757)、Mmc10739Mcsp—22999020、Tar4_Tte—20807169、Ddes2822—Dde一23475919、CAC3243一Cac一l5896488、gcy-31—Ce一l7568389、CG14885一Dm一24647455、GUCY1B3—Hs—4504215、HpGCS-betal—Hpu1—14245738、Gycbetal00B—Dm—24651577、CG4154—Dm—24646993(gi:NP一650424.2、gi:62484298)、gcy-32一Ce一13539160,gcy-36—Ce—17568391(gi:32566352、gi:86564713)、gcy-35—Ce-17507861(gi:71990146)、gcy-37—Ce—17540904(gi:71985505)、GCYlot3—Hs—20535603、GCYla2-Hs一899477或GYCa-99B—Dm—729270(gi:68067738)(Lakshminarayan"(2003)"Ancientconserveddomainssharedbyanimalsolubleguanylylcyclasesandbacterialsignalingproteins,"Si/GGe"om/"4:5-13)。這些名稱中使用的物種縮寫包括Ana-魚腥藻(J"akenaCcr-親jf月才丙桿菌(Qra/o6a"ercmyce"/ws);Cac-丙酮丁醇梭菌(C7o血'(i/,"c加6w一c);Dde-脫硫脫硫弧菌(Z^w^/bv/Zv/o^few^-,'c"ay);Mcsp—趨磁細(xì)菌某禾中(A/ag"etococci^);Mde—M/cra6w/6i/^/"degradam1;Npu—點形念珠藻(jVostoc;ra打cfi/brme);Rhsp—球形紅細(xì)菌(iWotfo6acferxp/7aera/(ie5");Sone—沙雷氏菌(幼ewa"e〃ao朋/fife"w'^);Tte—騰沖嗜熱厭氧菌(T72emocmafera6a"er加gro"gmy&);Vch-霍舌L弧菌(附〃》c/w/erae);Ce-線蟲；Dm—黑腹果蠅；Hpul-馬糞海月旦(He;w'ceWra加s;w/d2em-wws);Hs—智人。在該方法的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是以下H-NOX蛋白的任何一種，所述H-NOX蛋白按照它們的生物體名稱和Pfam數(shù)據(jù)庫登錄號列出(例如從2006年5月21日、2006年5月22日、2007年5月21日、2007年5月22閂起可用的以下蛋白序列)線蟲禾中(Cae離/7a6麵6n'gg彥)Q622M5—CAEBR、線蟲禾中Q61P44_CAEBR、線蟲種Q61R54—CAEBR、線蟲種Q61VW_CAEBR、線蟲種Q61A94—CAEBR、線蟲種Q60TP4—CAEBR、線蟲種Q60M10—CAEBR、線蟲(Cae"oAa6cfttoe/egara)GCY37一CAEEL、線蟲GCY31一CAEEL、線蟲GCY36_CAEEL、線蟲GCY32—CAEEL、線蟲GCY35—CAEEL、線蟲GCY34—CAEEL、線蟲GCY33—CAEEL、弓背青鏘(Oyz/似cwm'"ortw)Q7T040_ORYCU、弓背青鏘Q75WF0—ORYCU、青鏘(Oyz!'asto《;pes)P799980RYLA、青鯔Q7ZSZ5—ORYLA、黑青斑河豚(r"raocfo"m'growWtfo)Q4SW38—TETNG、黑青斑河豚Q4RZ94_TETNG、黑青斑河豚Q4S6K5—TETNG、紅鰭東方飩(Fwg"n^r/p")Q90VY5—FUGRU、非洲爪蟾(義e"o;ws/aevi's)Q6INK9—XENLA、智人Q5T8J7—HUMAN、智人GCYA2—HUMAN、智人GCYB2—HUMAN、智人GCYB1_HUMAN、大猩猩(Go"7/ago"'〃a)Q9N193一9PRIM、猩猩(尸o"go尸7gmaeM)Q5RAN8—PONPY、黑猩猩(P朋^og/o辦f^)Q9N192_PANTR、獼猴(Afacacaww/"加)Q9N194—MACMU、白掌長臂猿(//;Vo6"/e"ar)Q9N191一HYLLA、小鼠附mcw/m)Q8BXH3一MOUSE、小鼠GCYBl—MOUSE、小鼠Q3UTI4一MOUSE、小鼠Q3UH83_MOUSE、小鼠Q6XE41—MOUSE、小鼠Q80YP4_MOUSE、褐鼠Q80WX7—RAT、褐鼠Q80WX8—RAT、褐鼠Q920Q1—RAT、褐鼠Q54A43—RAT、褐鼠Q80WY0—RAT、褐鼠Q80WY4—RAT、褐鼠Q8CH85—RAT、褐鼠Q80WY5—RAT、褐鼠GCYB1—RAT、褐鼠Q8CH90—RAT、褐鼠Q91XJ7—RAT、褐鼠Q80WX9—RAT、褐鼠GCYB2—RAT、褐鼠GCYA2—RAT、家犬(Ca"^/aw&a^)Q4ZHR9—CANFA、西藏黃牛(5^GCYB1—BOVIN、野豬(S^"ra/a)Q4ZHR7—PIG、雙斑61蟋(6/wacw/flft)Q59HN5—GRYBI、煙草天蛾(Ma"t/wcawxto)077106—MANSE、煙草天蛾076340—MANSE、意大利蜂()Q5UAF0—APIME、意大利蜂Q5FAN0—APIME、意大利蜂Q6L5L6—APIME、閃比亞瘧蚊strPEST(strPEST)Q7PYK9—ANOGA、岡比亞癥蚊strPESTQ7Q9W6—ANOGA、岡比亞瘧蚊strPESTQ7QF31—ANOGA、岡比亞癥蚊strPESTQ7PS01—ANOGA、岡比亞培蚊strPESTQ7PFY2—ANOGA、岡比亞培蚊Q7KQ93—ANOGA、黑腹果蠅Q24086—DROME、黑腹果蠅GCYH—DROME、黑腹果蠅GCY8E—DROME、黑腹果蠅GCYDA—DROME、黑腹果蠅GCYDB—DROME、黑腹果蠅Q9VA09—DROME、擬暗果蟲場(pew心oZwcwra)Q29CE1JDR0PS、擬暗果蠅Q296C7—DROPS、擬暗果蠅Q296C8—DROPS、擬暗果蠅Q29BU7—DROPS、海蝸牛(^/jw'ac^y^w'o/)Q7YWK7—APLCA、馬糞海膽Q95NK5—HEMPU、萊茵衣藻(CA/twy^owo"cww/"/za^r〃)Q5YLC2—CHLRE、魚腥藻Q8YUQ7_ANASP、黃桿菌BBFL7(F/aw6a"en'a6a"en'ww3AFZ7)Q26GR8—9BACT、P^c/rayfec^to^m、ATCC7卯755Q1VQE5—9FLAO、海洋y蛋白菌(marinegammaproteobacteri^)HTCC2207Q1YPJ5—9GAMM、海洋y蛋白菌HTCC2207Q1YTK4—9GAMM、新月柄桿菌Q9A451—CAUCR、隱藏嗜酸菌JF-5"ck^/n7/wwco;/^wmJF-5)Q2DG60_ACICY、球形紅細(xì)菌Q3J0U9—RHOS4、57//"力a"er/omerajz'Q5LPV1—SILPO、脫氮畐'j球菌(尸"racoccz^tfew'^訴cara)PD1222Q3PC67一PARDE、S/""力a"errM/(W(9Q3QNY2—9RHOB、Ja朋^c/n'a印Q28ML8—JANSC、Magnetococctw^MC-1Q3XT27_9PROT、嗜肺軍團(tuán)菌(丄eg/o"dto，rawo;7Ma)Q5WXP0JJEGPL、嗜肺軍團(tuán)菌Q5WTZ5一LEGPL、嗜肺軍團(tuán)菌Q5X268—LEGPA、嗜肺軍團(tuán)菌Q5X2R2—LEGPA、嗜肺軍團(tuán)菌嗜肺亞種(ieg/ow//a/wewmo;^//"wfopp"ewwo;W/a)Q5ZWM9—LEGPH、嗜月巿軍團(tuán)菌嗜月市亞種Q5ZSQ8—LEGPH、嗜冷細(xì)菌(Co/weWapwc/^o^raea)Q47Y43—COLP3、i^Woa//eramomwa"a油'caT6cQ3CSZ5—ALTAT、沙雷氏菌Q8EF49—SHEON、Sacc/z歸一agm(iegr油raQ21E20—SACD2、S""cc/z婦—agwstfegrac/應(yīng)Q21ER7—SACD2、J^w'oS14Q1ZWE5—9VIBR、創(chuàng)傷弧菌(vw/"折cws)Q8DAE2一VIBVU、溶藻弧菌(W6n'oa/g/"o(yric^)12G01Q1VCP6—VIBAL、弧菌(W6n'o5p)DAT722Q2FA22_9VIBR、副溶血弧菌(P%n'op。rak/emo/_y"'CM)Q87NJ1—VIBPA、費(fèi)氏弧菌(W6n'o)Q5E1F5_VIBF1、創(chuàng)傷弧菌Q7MJS8—VIBVY、發(fā)光細(xì)菌(P/zo"6a"en'wm^)Q2C6Z5—9GAMM、//We〃acteywem/sQ2SFY7—HAHCH、海洋螺旋菌某種(Ocea"asp/n7/wws;)MED92Q2BKV0一9GAMM、海洋桿菌某種(Oce朋o6a"erRED65Q1N035一9GAMM、脫硫脫硫弧菌(D，//oWZ)"'oa^孝"'c麵)Q310U7—DESDG、奧氏嗜熱鹽絲菌(7fo歸簡o細(xì)'xo謂7)H168Q2AIW5—9FIRM、騰沖嗜熱厭氧菌Q8RBX6—THETN、CaW/ce〃w/ow'rwptor62■racc/MTO/yricMDSM8903Q2ZH17—CALSA、丙酮丁醇梭菌Q97E73—CLOAB、J/to/^pW/Mweto〃^^ge"^QYMFQ3C763_9CLOT、破傷風(fēng)梭菌(C/oW〃'tfem/"a剛')Q899J9—CLOTE和拜氏梭菌NCIMB8052(C/oW"W/ww6e^n'wc/b'WC/似5^52)Q2WVN0_CLOBE。在該方法的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是褐鼠sGC卩l(xiāng)H-NOXC78S或褐鼠sGC卩l(xiāng)H-NOXC78E。在該方法的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白在Y-S-R基序中不具有突變，所述基序包括人H-NOX的Tyr135、Serl37和Argl39。除非上下文另外明確說明或規(guī)定，本文所述的所有野生型和突變蛋白及所有藥物組合物可被用在本文所述的輸送氧的任何方法中。H-NOX蛋白可具有或可不具有血紅素和/或結(jié)合氧，并且可共價結(jié)合于或可不共價結(jié)合于另一個分子或部分，如聚乙二醇。在一些實施方式中，H-NOX蛋白是融合蛋白，其包括H-NOX結(jié)構(gòu)域域和另一蛋白如白蛋白(如人血清白蛋白)的部分或全部?！矫?，本發(fā)明以包括一種或多種H-NOX蛋白的試劑盒為特征。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了試劑盒，其包括H-NOX蛋白和使用該試劑盒向個體輸送氧的說明書。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約lnM到約lmM之間，并且H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20°C小于700s'1(如，在20'C小于約600s—1、500s"、100s"、20s"或1.8s")。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在血紅蛋白的02解離常數(shù)的2個數(shù)量級以內(nèi)，并且H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在20。C在約lnM到約lmM之間，并且H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20'C小于700s—1(如，在20。C小于約600s"、500s"、100s"、20s"或1.8s—1)。在一些實施方式中，H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H。除非上下文另外明確說明或規(guī)定，本文所述的所有野生型和突變蛋白及所有藥物組合物可被用在本文所述的任何試劑盒中。H-NOX蛋白可具有或可不具有血紅素和/或結(jié)合氧，并且可共價結(jié)合于或可不共價結(jié)合于另一個分子或部分，如聚乙二醇。在一些實施方式中，H-NOX蛋白是融合蛋白，其包括H-NOX結(jié)構(gòu)域和另一蛋白如白蛋白(如人血清白蛋白)的部分或全部。—方面，本發(fā)明的特征在于用作藥物的H-NOX蛋白(例如本文所述的任何野生型或突變蛋白)。在一些實施方式中，本發(fā)明的特征在于在向個體輸送氧的方法中使用的H-NOX蛋白。在一些實施方式中，H-NOX蛋白被用于治療任何輸送02對其有益的癥狀，例如心血管疾病、神經(jīng)疾病、腫瘤缺氧、失血或受傷。在一些實施方式中，本發(fā)明的特征在于H-NOX蛋白(例如本文所述的任何野生型或突變蛋白)在藥物一一例如向個體輸送氧的藥物一的制備中的用途。在一些實施方式中，本發(fā)明以H-NOX蛋白在向個體輸送氧中的用途為特征。在一些實施方式中，H-NOX蛋白被用于治療任何輸送02對其有益的癥狀，例如心血管疾病、神經(jīng)疾病、腫瘤缺氧、失血或受傷。附圖簡述圖1A是NO結(jié)合H-NOX蛋白和02結(jié)合H-NOX蛋白的遠(yuǎn)側(cè)袋殘基三維結(jié)構(gòu)圖(血紅素之上)。NO結(jié)合H-NOX蛋白和02結(jié)合H-NOX蛋白的血紅素配位殘基也被顯示(血紅素之下)。圖1A是基于由Pellicena,P.等人(2004年8月31日)，"CrystalStructureofAnOxygen-BindingHemeDomainRelatedtoSolubleGuanylateCyclases,"尸racA^/.^c^/Sc/U&4101(35):12854-12859報道的騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的三維結(jié)構(gòu)。圖IB是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX三維結(jié)構(gòu)的立體側(cè)視圖，顯示了H-NOX結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特征。該蛋白折疊由帶狀圖(ribbondiagram)表示。血紅素、雙氧配體和近端組氨酸以球棒模型顯示。a-螺旋根據(jù)圖5B所示的命名法被標(biāo)記為A-G。(3-折疊被標(biāo)記為1-4。圖IB來自Pellicena,P."a/.(2004年8月31日)."CrystalStructureofAnOxygen-BindingHemeDomainRelatedtoSolubleGuanylateCyclases,"Prac層.加t/5W園101(35):12854陽12859。圖1C-1H是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的三維結(jié)構(gòu)圖，顯示了騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX中的示例性遠(yuǎn)側(cè)袋殘基。圖1C-lH中所示的以下殘基是組成H-NOX遠(yuǎn)側(cè)袋的主要?dú)埢鵗hr4、Ile5、Thr8、Trp9、Trp67、Asn74、Ile75、Phe78、Phe82、Tyrl40和Leul44，它們被包含在螺旋A、D、E和G中。圖1C-1H使用PYMOL(DeLanoScientific,LLP)創(chuàng)建。圖2是結(jié)合或被預(yù)測結(jié)合02和NO的下列H-NOX蛋白的序列對比多數(shù)(Majority)(SEQIDNO:l)、Ce.gcy-31(SEQIDNO:2)、Ce.gcy-33(SEQIDNO:3)、Ce.gcy-35(SEQIDNO:4)、Dm.CG14885HNOX(SEQIDNO:5)、Dm.CG4154麗OX(SEQIDNO:6)、Ms,Beta3HNOX(SEQIDNO:7)、7YHNOX(SEQIDNO:8)和CaHNOX(SEQIDNO:9)。預(yù)測這些H-NOX蛋白結(jié)合02以及NO，因為它們在對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Y140的位置上具有酪氨酸。圖2中使用的氨基酸編號以H-NOX結(jié)構(gòu)域或全長蛋白中的第一個氨基酸起始，作為第l個殘基。在MegAlign程序中使用默認(rèn)參數(shù)產(chǎn)生該對比。圖2中使用的縮寫在下文關(guān)于圖4A-4D進(jìn)行描述。圖3A-3D是結(jié)合或被預(yù)測結(jié)合NO而非02的下列H-NOX蛋白的序列對比多數(shù)(Majority)(SEQIDNO:IO)、Dm.sGCpi蛋白(SEQIDNO:ll)、sGC卩l(xiāng)蛋白(SEQIDNO:12)、hs.sGC卩l(xiāng)蛋白(SEQIDNO:13)、hs.(32蛋白(SEQIDNO:14)、Ms.sGC(31蛋白(SEQIDNO:15)、Mm.sGC卩l(xiāng)蛋白(SEQIDNO:16)、Np.卩l(xiāng)HD樣(SEQIDNO:17)、Tr.sGC卩l(xiāng)蛋白(SEQIDNO:18)、岡比亞按蚊(Anopheles—gambiae)|XP—310919(SEQIDNO:19)、蜜蜂(Apis一melUfera)|NP_001011632(SEQIDNO:20)、Bt.sGC卩l(xiāng)蛋白(SEQIDNO:21)、萊茵衣藻(Chlamydomonas一reinhardtii)|AAR02(SEQIDNO:22)、弓背青鏘(Oryzias_curvinotus)|BAC98396(SEQIDNO:23)、中華青鏘(Oryzias一latipes)IBAA76691(SEQIDNO:24)、紫球海膽(Strongylocentrotus_purpuratus)|X(SEQIDNO:25)和野豬(Susscrofa),P_001018042+(SEQIDNO:26)。該對比使用MegAlign程序中的默認(rèn)參數(shù)產(chǎn)生。圖3A-3D中使用的縮寫在下文中關(guān)于圖4進(jìn)行描述。圖4A-4D是來自圖2和圖3A-3D的H-NOX蛋白的序列對比多數(shù)(Majority)(SEQIDNO:27)、Dm.sGC卩l(xiāng)蛋白(SEQIDNO:ll)、sGC(31蛋白(SEQIDNO:12)、hs.sGC|31蛋白(SEQIDNO:13)、hs.p2蛋白(SEQIDNO:14)、Mm.sGC|31蛋白(SEQIDNO:16)、Np.(31HD樣(SEQIDNO:17)、Tr.sGC|31蛋白(SEQIDNO:18)、萊茵衣藻(Chlamydomonas—reinhardtii)1AAR02(SEQIDNO:22)、弓背青鏘(Oryzias—curvinotus)|BAC98396(SEQIDNO:23)、紫球海膽(Strongylocentrotus_purpuratus)|X(SEQIDNO:25)、野豬(Susscrofa),P—001018042(SEQIDNO:26)、gcy-31a(SEQIDNO:2)、gcy-33(SEQIDNO:3)、Ca.HNOX(SEQIDNO:9)、T.卩l(xiāng)HD樣(SEQIDNO:8)、Ms.sGc卩3蛋白(SEQIDNO:7)、CG14885(SEQIDNO:5)和Dm.sGC短變體(SEQIDNO:6)。該對比使用MegAlign程序中的默認(rèn)參數(shù)產(chǎn)生。對于圖2-4D，"Dm.sGC(31蛋白"表示黑腹果蠅piH-NOX;"sGC(31蛋白"表示褐鼠piH-NOX;"hs.sGC卩l(xiāng)蛋白"表示智人卩l(xiāng)H-NOX;"hs.(32蛋白"表示智人)32H-NOX;"Mm.sGC(31蛋白"表示小鼠(ilH-NOX;"Np.卩1HD樣"表示球形念珠藻H-NOX;"Tr.sGC卩l(xiāng)蛋白"表示紅鰭東方飩卩l(xiāng)H-NOX;"閃比亞按蚊(Anopheles—gambiae)|XP_310919"表示岡比亞按蚊卩l(xiāng)H-NOX;"蜜蜂(Apis—mellifera)|NP—001011632"表示蜜蜂卩l(xiāng)H-NOX;"Bt.sGC卩l(xiāng)蛋白"表示西藏黃牛(31H-NOX;"萊茵衣藻(Chlamydomonas—reinhardtii)1AAR02"表示萊茵衣藻(31H-NOX;"弓背青鏘(Oryzias—curvinotus)|BAC98396表示弓背青鏘卩l(xiāng)H-NOX;"青鏘(Oryzias—latipes)|BAA76691"表示中華青辦(31H-NOX;"紫球海膽(Strongylocentrotus_purpuratus)|X"表示紫球海膽(31H-NOX;"野豬(Susscrofa),P—001018042+"表示野豬卩l(xiāng)H-NOX;"gcy-31a"表示線蟲Gcy-3laH-NOX;"gcy-33"表示線蟲Gcy-33H-NOX;"gcy-35"表示線蟲Gcy-35H-NOX;"Ca.HNOX"表示丙酮丁醇梭菌H-NOX;"T.(31HD樣"表示騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX;"Ms.sGcp3蛋白"表示煙草天蛾(33H-NOX;"CG14885"表示黑腹果蠅CG14885H-NOX;"Dm.sGC短變體，，表示黑腹果蠅Gcy-88-E-SH-NOX并且"Dm.CG4154HNOX"表示黑腹果蠅CG4154H-NOX。圖5A是H-NOX家族成員的序列對比。序列編號為騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的編號。突變殘基由"V"示出，極高保守殘基由"s"示出。騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Y140由"H"示出。在其它H-NOX蛋白中可穩(wěn)定Fe"-02復(fù)合體的預(yù)測的遠(yuǎn)側(cè)袋酪氨酸殘基對于線蟲GCY-35是位置70;在黑腹果蠅CG14885-PA中是位置140;線蟲GCY-35的位置138;丙酮丁醇梭菌的位置140;根據(jù)騰沖嗜熱厭氧菌編號。登錄號為智人卩l(xiāng)[gi:2746083](SEQIDNO:28)、褐鼠卩l(xiāng)[gi:27127318](SEQIDNO:29)、黑腹果蠅卩l(xiāng)[gi:861203](SEQIDNO:30)、黑腹果蠅CG14885-PA[gi:23171476](SEQIDNO:31)、線蟲GCY-35[gi:527828G6](SEQIDNO:32)、點形念珠藻[gi:23129606](SEQIDNO:33)、新月柄桿菌[gi:16127222](SEQIDNO:34)、沙雷氏菌[gi:24373702](SEQIDNO:35)、嗜肺軍團(tuán)菌(ORF2)[CUCGC—272624](SEQIDNO:36)、丙酮丁醇梭菌[gi:15896488](SEQIDNO:37)和騰沖嗜熱厭氧菌[gi:20807169](SEQIDNO:38)。使用程序MegAlign,Lasergene,DNAStar(參見萬維網(wǎng)"dnastar.com/products/megalign.php")產(chǎn)生對比。Clustal-W默認(rèn)參數(shù)被使用。圖5B是示例性H-NOX結(jié)構(gòu)域的序列對比。該對比頂部的二級結(jié)構(gòu)注釋和編號對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌的H-NOX結(jié)構(gòu)域。(x-螺旋由螺旋表示，而P-折疊由箭頭表示。遠(yuǎn)側(cè)袋由a-螺旋aA、(xD、aE和aG界定。Pubmed/NCBI登錄號如下Ther—tengcongensisgi|2080716|(SEQIDNO:39)、Clos—acetobutylicumgi|15896488|(SEQIDNO:40)、Clos—tetaniGI:75543260(SEQIDNO:41)、Desu一desulfuricansgi23475919.(SEQIDNO:42)、Vibr—vulnificusgi|27361734|(SEQIDNO:43)、Caul—crescentusgi卩6127222l(SEQIDNO:44)、Micr一degradansgil23027521」(SEQIDNO:45)、Vibr_choleraegi卩560147靴SEQIDNO:46)、Shew—oneidensisgi|243737。2|(SEQIDNO:47)、Rat—betal一sGCgi|27127318|(SEQIDNO:48)、Rat一beta2—sGCgi|2195663$|(SEQIDNO:49)、Nost_punctiformegi|2312960$|(SEQIDNO:50)和Nost—sp.gi|1722977Q|(SEQIDNO:51)。共有序列顯示在圖5B的底部(SEQIDNO:52)。對比使用程序MULTALIN(Corpet,F.(1988)M/c/e/c^c/血Wey.16:10881-10890)產(chǎn)生，并且圖5B使用程序ESPRIPT(Gouet,P.Wa/.(1999)說o/"/orw油'"15:305—308)制作。圖6A和6B是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX結(jié)構(gòu)域的血紅素環(huán)境的三維結(jié)構(gòu)圖。圖6A和6B來自Pellicena,P.等人(2004年8月31日)'"CrystalStructureofAnOxygen-BindingHemeDomainRelatedtoSolubleGuanylateCyclases,"尸raciVaW.,101(35):12854-12859。圖7A-7F是對于57H-NOX(圖7A)、7>Y140L(圖7B)、77W9F-Y140L(圖7C)、7YF78Y-Y140L(圖7D)、12H-NOX和"F142Y(圖7E)以及(31(1-385)和pi(l-385)I145Y(圖7F)，在暴露于空氣^^-02復(fù)合物；每個圖的底部圖線)之前和之后，在厭氧還原作用(FeU未連接復(fù)合物；每個圖的頂部圖線)后H-NOX蛋白的UV-可見光光譜圖。除了丄2F142Y和卩1(1-385)I145Y的Fe"和Fe"-02復(fù)合物之外，野生型丄2H-NOX和卩1-(1-385)H-NOX在還原反應(yīng)和暴露于空氣之后的光譜分別顯示在圖7E和7F中的中間圖線，顯示出這些蛋白在加入遠(yuǎn)側(cè)袋酪氨酸之前不結(jié)合02。在每個圖左上角書寫的兩個或三個數(shù)字代表圖中圖線峰的波長。這些數(shù)字以其中相應(yīng)的圖線在圖中垂直出現(xiàn)的順序進(jìn)行垂直書寫。例如，圖7A中的430nm值表示該圖中頂部圖線的波長的峰(其代表Fe"未連接復(fù)合物)，而圖7A66中416nm值表示該圖中底部圖線的波長的峰(其代表Fe11-02復(fù)合物)。在空氣存在的情況下，波長的偏移表示該蛋白質(zhì)結(jié)合02。在空氣存在的情況下，500到600nm間雙峰的形成也表示02結(jié)合。圖7A-7F來自Boon,E.M.等人(2005)，"MolecularBasisForNOSelectivityinSolubleGuanylateCyclase,"淑臟C/z綴5/o/.1:53-59。圖8A-8DD包括編碼H-NOX蛋白的示例性核酸的多核苷酸序列和相應(yīng)H-NOX蛋白的氨基酸序列(SEQIDNOS:53-162)。發(fā)明詳述本發(fā)明部分基于這樣驚人的發(fā)現(xiàn)H-NOX蛋白具有比血紅蛋白低得多的NO反應(yīng)性。由于通過內(nèi)源性NO使H-NOX蛋白失活的較低可能性，和通過H-NOX蛋白清除內(nèi)源性NO的較低可能性，這一內(nèi)在的低NO反應(yīng)性(和高NO穩(wěn)定性)使得野生型和突變H-NOX蛋白成為理想的血液替代物。重要地，遠(yuǎn)側(cè)袋酪氨酸在一些H-NOX蛋白中的存在(Pdlicena,R等人(August31，2004)，"CrystalStructureofAnOxygen-BindingHemeDomainRelatedtoSolubleGuanylateCyclases,"尸racA^/.JcadSc/[/&41(M(35):12854-12859)暗示了不理想的、高NO反應(yīng)性，表明用作血液替代物不可取。例如，通過類推，結(jié)核分枝桿菌(MycW"cto"/wn妯erc"/o&)血紅蛋白，帶有結(jié)構(gòu)上類似的遠(yuǎn)側(cè)袋酪氨酸，與NO反應(yīng)極其迅速，并被分支桿菌(ik/yo6a"^7Yw)用于有效清除和避免由感染的宿主產(chǎn)生的防御性NO(Ouellet,H.等人(2002年4月30日)，"TruncatedHemoglobinHbNProtectsMycobacteriumBovisFromNitricOxide,"Ato/.爿cad.,S'"'./S爿99(9):5902-5907)。然而，我們吃驚地發(fā)現(xiàn)，H-NOX蛋白實際上具有比血紅蛋白低得多的NO反應(yīng)性，使它們用作血液替代物成為可能。此外，令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，結(jié)合NO而不結(jié)合02的H-NOX蛋白可以通過單個氨基酸突變的引入被轉(zhuǎn)化為結(jié)合NO和02的H-NOX蛋白。因此，H-NOX蛋白對02和NO的親和性以及H-NOX蛋白分辨02和NO配體的能力可以通過一個或多個氨基酸突變的引入而被改變，允許H-NOX蛋白被修改成以期望親和力結(jié)合02或NO。其它突變可以被引入，以進(jìn)一步改變對02和/或NO的親和性。H-NOX蛋白家族可以因此被操縱，以顯示出改善的或優(yōu)化的02輸送動力學(xué)和熱力學(xué)特征。例如，突變H-NOX蛋白已經(jīng)被產(chǎn)生，其帶有改變的對02結(jié)合的解離常數(shù)和/或解離速率，這改善了H-NOX蛋白對多種臨床和工業(yè)應(yīng)用的有用性。調(diào)整H-NOX蛋白結(jié)合和輸送02的能力是解決和克服當(dāng)前02載體主要缺點的治療途徑。因此，本發(fā)明提供了用于氧輸送的蛋白質(zhì)、組合物、試劑盒及方法。使用H-NOX蛋白進(jìn)行02輸送有很多益處。外傷和手術(shù)后輸血的主要作用是輸送02。理想的血液替代物避免了傳統(tǒng)血液的挑戰(zhàn)病毒污染、配型要求、有限的使用期和有限的可用性。血紅蛋白基血液替代物的主要限制是它們對02的高親和性和它們與NO反應(yīng)的傾向性。如上文提到，即使低水平的NO破壞也可對血管和器官的緊張性靜止?fàn)顟B(tài)(tonicrestingstate)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，并導(dǎo)致高血壓和胃腸不良應(yīng)激。此外，在與NO反應(yīng)的過程中，血紅蛋白在臨床相關(guān)時幀(clinicallyrelevanttimeframe)內(nèi)失去其輸送02的能力。己經(jīng)進(jìn)行了多種嘗試，以將第一代血紅蛋白基氧載體(hemoglobin-basedoxygencarriers,HBOC)的毒性減到最小，包括分子內(nèi)和分子間交聯(lián)("BIoodSubstitutes,"R.Winslowed.AcademicPress,2006)。盡管這些修飾克服了一些與血紅蛋白外滲相關(guān)的嚴(yán)重毒性問題，但是由于高NO反應(yīng)性，氧結(jié)合的破壞仍存在。這些第二代HBOC顯示出降低的氧親和性，具有接近紅細(xì)胞p50值的p50值，但它們已經(jīng)在臨床試驗中失敗。由Winslow和同事提出了一種替代假設(shè)具有合適粘度和膠體滲透壓的低p50HBOC比高p50HBOC更適合用于無細(xì)胞氧輸送(Tsai,A.G,等人(2003)，"Targeted02DeliverybyI0W-P50hemoglobin:ANewBasisforO2Therapeutics,"爿肌J.尸/z戸'o/.C7rc.尸/z"/。/.285:H1411-H1419;Winslow(2007)."RedCellSubstitutes,",'"http://emato/ogy44:51-59)。這類HBOC的NO反應(yīng)性是否成為臨床試驗中的問題仍有待觀察。工程改造H-NOX蛋白以在最小的NO反應(yīng)性下結(jié)合并輸送02，提供了用于血液替代物中的新的血液氣態(tài)02載體，其中H-NOX蛋白輸送02而不清除NO，或通過NO被鈍化為02載體。這些H-NOX蛋白、組合物、試劑盒和方法在本文中進(jìn)一步描述。H-NOX蛋白H-iv欣歪A家應(yīng)M"除非另有說明，任何野生型或突變H-NOX蛋白可以被用在本文所述的組合物、試劑盒及方法中。如本文所使用，"H-NOX蛋白"是指具有H-NOX結(jié)構(gòu)域(命名為血紅素-一氧化氮和氧(Heme-MtricoxideandOXy卿)結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的蛋白質(zhì)。除H-NOX結(jié)構(gòu)域之外'H-NOX蛋白可以含有或可以不含有一個或多個其它結(jié)構(gòu)域。H-NOX蛋白是高度保守的、良好表征的血紅素蛋白家族的成員(Iyer,L.M.等人(2003年2月3日)"AncientConservedDomainsSharedbyAnimalSolubleGuanylylCyclasesAndBacterialSignalingProteins,"5MCGe"畫/cs4(1):5;Karow,D.S.,等人(2004年8月10曰)"SpectroscopicCharacterizationoftheSolubleGuanylateCyclase-LikeHemeDomainsFromVibrioCholeraeAndThermoa腦robacterTengcongensis,"傷0c/^柳'W743(31):10203-10211;Boon,E.M..等人(2005)."MolecularBasisForNOSelectivityinSolubleGuanylateCyclase,"AtoweC7z綴腸/.1:53-59;Boon,E.M..等人(2005年10月)."LigandDiscriminationinSolubleGuanylateCyclaseandtheH-NOXFamilyofHemeSensorProteins,"C臟O;/".C/亂腸/.9(5):441-446;Boon,E.M..等人(2005)'"LigandSpecificityofH-NOXDomains:FromsGCtoBacterialNOSensors,"/./離g.腸c/z泄99(4):892-902)。H-NOX蛋白也被稱為Pfam07700蛋白或HNOB蛋白(Pfam-蛋白結(jié)構(gòu)域家族對比和隱蔽馬爾科夫模型(HiddenMarkovModels)的數(shù)據(jù)庫，Copyright(C)1"6-200668ThePfamConsortium;GNULGPLFreeSoftwareFoundation,Inc.,59TemplePlace-Suite330,Boston,MA02111-1307,USA)。在一些實施方式中，H-NOX蛋白具有，或被預(yù)測具有包含6個a-螺旋、接著是2個(3-折疊、接著是1個a-螺旋、接著是2個P-折疊的二級結(jié)構(gòu)。H-NOX蛋白可以是能夠結(jié)合血紅素的脫輔基蛋白質(zhì)或帶有血紅素結(jié)合的全蛋白質(zhì)。H-NOX蛋白可以共價地或非共價地結(jié)合血紅素基團(tuán)。一些H-NOX蛋白結(jié)合NO而非02，但其它結(jié)合NO和02。來自已經(jīng)被分離的兼性需氧微生物的H-NOX結(jié)構(gòu)域結(jié)合NO而非02。來自專性需氧原核生物、線蟲和黑腹果蠅的H-NOX蛋白結(jié)合NO和02。哺乳動物具有兩種H-NOX蛋白(31和P2。小鼠、大鼠、牛和人的H-NOX序列對比顯示出這些物種享有>99%的同一性。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的H-NOX結(jié)構(gòu)域或整個H-NOX蛋白與天然存在的騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX蛋白或天然存在的sGC蛋白(例如，天然存在的sGCpi蛋白)的相應(yīng)區(qū)域具有至少約下列任何一種的同一性10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、95、97、98、99或99.5%。如本文進(jìn)一步討論，相對于相應(yīng)的天然存在的H-NOX蛋白，H-NOX蛋白可任選地包含一個或多個突變。在一些實施方式中，H-NOX蛋白包括除H-NOX結(jié)構(gòu)域以外的一個或多個結(jié)構(gòu)域。在具體的實施方式中，H-NOX蛋白包括一個或多個結(jié)構(gòu)域，或來自另一蛋白質(zhì)的整個序列。例如，H-NOX蛋白可以是融合蛋白，其包括H-NOX結(jié)構(gòu)域和另一蛋白的部分或全部，如白蛋白(諸如人血清白蛋白)。在一些實施方式中，只有H-NOX結(jié)構(gòu)域存在。來自騰沖嗜熱厭氧菌的原核02-結(jié)合H-NOX的晶體結(jié)構(gòu)(Nioche,P..等人(2004年11月26日)"FemtomolarSensitivityofaNOSensorFromClostridiumBotulinum,"5We臟306(5701):1550-1553;Pellicena,P..等人(2004年8月31曰)."CrystalStructureofAnOxygen-BindingHemeDomainRelatedtoSolubleGuanylateCyclases,"PracAto/.[/&4101(35):12854-12859)表明，酪氨酸側(cè)鏈羥基基團(tuán)形成到FeU-02部分的關(guān)鍵H鍵。該遠(yuǎn)側(cè)袋氫鍵網(wǎng)絡(luò)——主要包括Y140，穩(wěn)定F^-02復(fù)合體(圖6B)。該酪氨酸不存在于排斥02并只結(jié)合NO的H-NOX蛋白中。例如，該氫鍵網(wǎng)絡(luò)被預(yù)測不存在于來自sGC和需氧原核生物的H-NOX蛋白中，表明這在由這些血紅素蛋白顯示岀的針對02的顯著配體選擇性中是關(guān)鍵的分子因素。圖7A-7G清楚地表明，在結(jié)合NO但不結(jié)合02的野生型H-NOX蛋白的遠(yuǎn)側(cè)袋中酪氨酸的添加可以使突變H-NOX蛋白能夠結(jié)合02。因此，在H-NOX血紅素折疊的遠(yuǎn)側(cè)血紅素袋中的酪氨酸發(fā)揮開關(guān)一樣的作用，以打開或關(guān)閉02結(jié)合。如圖6A和6B所示，卟啉的結(jié)構(gòu)被高度扭曲。如圖6A所示，保守的Y-S-R基序使氫鍵合與血紅素基團(tuán)的丙酸側(cè)鏈相互作用。圖6B，保守的H102是血紅素的近側(cè)配體(圖6B)。如本文所使用，"蛋白質(zhì)"包括無論從天然來源分離、由重組技術(shù)產(chǎn)生或化學(xué)合成的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)片段。蛋白質(zhì)可具有一種或多種修飾，例如翻譯后修飾(如糖基化等)或任何其它修飾(如聚乙二醇化等)。蛋白質(zhì)可包含一個或多個非天然存在的氨基酸(例如，如帶有側(cè)鏈修飾的氨基酸)。在各種實施方式中，H-NOX蛋白具有至少約50、100、150、181、200、250、300、350、400或更多個氨基酸。在一些實施方式中，H-NOX蛋白可包括約50到約600個氨基酸，例如約100到約500個氨基酸、約150到約400個氨基酸、約150到約300個氨基酸、或約175到約200個氨基酸。i^-7V股激微蕭來自任何屬或種的H-NOX蛋白可以被用在本文所述的組合物、試劑盒和方法中。在各種實施方式中，H-NOX蛋白是來自哺乳動物(例如，靈長類(如人、猴、大猩猩、猿、狐猴等)、牛、馬、豬、犬科或貓科)、昆蟲、酵母或細(xì)菌的蛋白質(zhì)，或衍生自這類蛋白質(zhì)。示例性的哺乳動物H-NOX蛋白包括野生型人和大鼠可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(如P1亞基)。H-NOX蛋白的實例包括野生型哺乳動物H-NOX蛋白，如智人、小鼠、家犬、西藏黃牛和褐鼠H-NOX蛋白，和野生型非哺乳動物的脊椎動物H-NOX蛋白，例如非洲爪蟾、中華青鏘、acwnVW船和紅鰭東方飩。非哺乳動物野生型NO-結(jié)合H-NOX蛋白的實例包括黑腹果蠅、岡比亞按蚊和煙草天蛾的野生型H-NOX蛋白；非哺乳動物野生型02-結(jié)合H-NOX蛋白的實例包括線蟲gcy-31、gcy-32、gcy-33、gcy-34、gcy-35、gcy-36和gcy-37;黑腹果蠅CG14885、CG14886和CG4154;以及煙草天蛾卩-3的野生型H-NOX蛋白；原核野生型H-NOX蛋白的實例包括騰沖嗜熱厭氧菌、霍亂弧菌、費(fèi)氏弧菌、點形念珠藻、脫硫脫硫弧菌、嗜肺軍團(tuán)菌1、嗜肺軍團(tuán)菌2和丙酮丁醇梭菌的野生型H-NOX蛋白。示例性H-NOX蛋白的NCBI登錄號包括以下智人pi[gi:2746083]、褐鼠卩l(xiāng)[gi:27127318]、黑腹果蠅卩l(xiāng)[gi:861203]、黑腹果蠅CG14885-PA[gi:23171476]、線蟲GCY-35[gi:52782806]、點形念珠藻[gi:23129606]、新月柄桿菌[gi:16127222]、沙雷氏菌[gi:24373702]、嗜肺軍團(tuán)菌(ORF2)[CUCGC—272624]、丙酮丁醇梭菌[gi:15896488]和騰沖嗜熱厭氧菌[gi:20807169]。示例性的H-NOX蛋白也包括以下H-NOX蛋白，其按照它們的基因名、接著是它們的種屬縮寫和Genbank識別碼加以列出(例如從2006年5月21日、2006年5月22日、2007年5月21日或2007年5月22日起可用的以下蛋白序列，它們各自通過引用由此并入其全部內(nèi)容)Npun5905一Npu—23129606、alr2278—Ana—17229770、S02144—Sone一24373702、Mdegl343一Mde—23027521、VCA0720一Vch一l5601476、CC2992一Ccr—16127222、Rsph2043一Rhsp—22958463(gi:46192757)、Mmcl0739—Mcsp—22999020、Tar4—Tte—20807169、Ddes2822一Dde一23475919、CAC3243—CacJ5896488、gcy-31—Ce一17568389、CG14885—Dm—24647455、GUCY1B3—Hs一4504215、HpGCS-betal一Hpul一14245738、Gycbetal00B_Dm—24651577、CG4154—Dm一24646993(gi:NP650424.2、gi:62484298)、gcy-32一Ce一13539160、gcy-36一Ce一l7568391(gi:32566352、gi:86564713)、gcy-35—Ce-17507861(gi:719卯146)、gcy-37—Ce一17540904(gi:71985505)、GCYla3—Hs—20535603、GCYla2-Hs一899477或GYCa陽99B一Dm729270(gi:68067738)(Lakshminarayan"a/.(2003)."Ancientconserveddomainssharedbyanimalsolubleguanylylcyclasesandbacterialsignalingproteins,"BM74:5-13)。這些名稱中使用的物種縮寫包括Ana-魚腥藻(爿"akewaS戶)；Ccr-ff月柄桿菌(Gra/ok"ercmsceWRy);Cac—丙酮丁醇梭菌(C7(wW(i/讓ac"o6w一c羅)；Dde-脫硫脫硫弧菌(Z)esw(/bW6n'otfe/(/^7'c<ms");Mcsp_趨磁細(xì)菌某禾中(Afogwetococcws);Mde—A/jfcraZw/^n/erdegra(ia似；Npu—念珠藻(A^toc/7""c咖rwe);Rhsp—球形紅細(xì)菌(i/w^bZ)""er—加ra/tfey);Sone—沙雷氏菌(幼e糊"e/Zflo腦'cfe艦、)；Tte_騰沖嗜熱厭氧菌(77jermoa"c(冊6""er^2gcw7gm\y);Vch-霍亂弧菌(W6n'oc/w/erae);Ce-線蟲；Dm-黑腹果蠅；Hpul—馬類海月旦(//eOTZcew/ro^mpw/c/^rr/wws);Hs—智人。其它示例性的H-NOX蛋白包括以下H-NOX蛋白，它們按照它們的生物體名稱和Pfam數(shù)據(jù)庫登錄號排列(例如從2006年5月21日、2006年5月22日、2007年5月21日或2007年5月22日起可用的以下蛋白序列，它們各自通過引用由此并入其全部內(nèi)容)線蟲種(Cae/w^cr6&to)Q622M5—CAEBR、線蟲種Q61P44—CAEBR、線蟲種Q61R54—CAEBR、線蟲種Q61V90—CAEBR、線蟲種Q61A94—CAEBR、線蟲種Q60TP4—CAEBR、線蟲種Q60M10_CAEBR、線蟲(Cae"o^a6^toe/egara)GCY37—CAEEL、線蟲GCY31—CAEEL、線蟲GCY36—CAEEL、線蟲GCY32—CAEEL、線蟲GCY35—CAEEL、線蟲GCY34_CAEEL、線蟲GCY33—CAEEL、弓背青鏘(OyzZascwW"Wws)Q7T040—ORYCU、弓背青鏘Q75WF0—ORYCU、青鏘(C^z/^/a^^)P79998—ORYLA、青鏘Q7ZSZ5—ORYLA、黑青斑河豚(r"raodo""/graWrZfifa)Q4SW38—TETNG、黑青斑河豚Q4RZ94—TETNG、黑青斑河豚Q4S6K5—TETNG、紅鰭東方飩(Fwgwra6Wp")Q90VY5_FUGRU、非洲爪蟾(JTewopra/aev")Q6INK9—XENLA、智人Q5T8J7—HUMAN、智人GCYA2—HUMAN、智人GCYB2—HUMAN、智人GCYB1—HUMAN、大猩猩(Go〃7/ago"〃a)Q9N193一9PRIM、猩猩(戶o"go/^gwoew)Q5RAN8_PONPY、黑猩猩(尸朋Zrog/ot^w)Q9N192—PANTR、獼猴(Macacaww/a加)Q9N194—MACMU、白掌長臂猿(/fy/o6af")Q9N191一HYLLA、小鼠(Mws附w"w/m)Q8BXH3一MOUSE、小鼠GCYB1—MOUSE、小鼠Q3UTI4一MOUSE、小鼠Q3UH83—MOUSE、小鼠Q6XE41—MOUSE、小鼠Q80YP4—MOUSE、褐鼠Q80WX7—RAT、褐鼠Q80WX8_RAT、褐鼠Q920Q1—RAT、褐鼠Q54A43—RAT、褐鼠Q80WY0—RAT、褐鼠Q80WY4—RAT、褐鼠Q8CH85—RAT、褐鼠Q80WY5—RAT、褐鼠GCYB1—RAT、71褐鼠Q8CH90—RAT、褐鼠Q91XJ7—RAT、褐鼠Q80WX9—RAT、褐鼠GCYB2—RAT、褐鼠GCYA2—RAT、家犬(Ca"^/awi/^^)Q4ZHR9—CANFA、西藏黃牛(5cwGCYB1_B0—VTN、野豬(SwHcra/a)Q4ZHR7_PIG、雙斑蟋(G^〃m6,'macw/aft^)Q59HN5_GRYBI、煙草天蛾(7kfom/wca)077106—MANSE、煙草天蛾O76340_MANSE、意大利蜂(we〃z/era)Q5UAF0—APIME、意大利蜂Q5FAN0_APIME、意大利蜂Q6L5L6—APIME、岡比亞瘧蚊strPEST"w/^e/^gawWaestrPEST)Q7PYK9—ANOGA、岡比亞癥蚊strPESTQ7Q9W6—ANOGA、岡比亞5g蚊strPESTQ7QF31—ANOGA、岡比亞癥蛟strPESTQ7PS01—ANOGA、岡比亞柜蚊strPESTQ7PFY2—ANOGA、岡比亞疙蚊Q7KQ93—ANOGA、黑腹果蠅Q24086—DROME、黑腹果蠅GCYH—DROME、黑腹果蠅GCY8E—DROME、黑腹果蠅GCYDA—DROME、黑腹果蠅GCYDB—DROME、黑腹果蠅Q9VA09—DROME、擬暗果蠅(DrawpMa戸ewtfoofccwra)Q29CE1JDROPS、擬暗果蠅Q296C7—DROPS、擬暗果蠅Q296C8—DROPS、擬暗果蠅Q29BU7—DROPS、海蝸牛(^;(vw'aca/z/om/ca)Q7YWK7—APLCA、馬糞海膽Q95NK5—HEMPU、萊茵衣藻(CWawWowo"^m'"/iaato')Q5YLC2—CHLRE、魚腥藻Q8YUQ7—ANASP、黃桿菌BBFL7(尸/扁6""e〃'"6ac/m'廳朋尸丄7)Q26GR8一9BACT、P一—e房tor—ATCC700755Q1VQE5—9FLAO、海洋y蛋白菌(w"〃'"egawwa/ra/eoZ)ac/e〃'ww)HTCC2207Q1YPJ5—9GAMM、海洋y蛋白菌HTCC2207Q1YTK4—9GAMM、新月柄桿菌Q9A451—CAUCR、隱藏嗜酸菌JF-5(cryp加/wJF-5)Q2DG60—ACICY、球形紅細(xì)菌Q3J0U9—RHOS4、5Y/,'d6a"wpowera;//Q5LPV1—SILPO、脫氮副球菌(Paracocc^t/em'的/;aww)PD1222Q3PC67—PARDE、礎(chǔ)dtow^rM7,Q3QNY2一9RHOB、Ja畫油'aQ2歸L8一JANSC、Mag"etococcM印MC-1Q3XT27一9PROT、嗜肺軍團(tuán)菌aeg/o""/a;weww^/z,7fl)Q5WXP0—LEGPL、嗜肺軍團(tuán)菌Q5WTZ5—LEGPL、嗜肺軍團(tuán)菌Q5X268—LEGPA、嗜肺軍團(tuán)菌Q5X2R2—LEGPA、嗜肺軍團(tuán)菌嗜肺亞種aeg/o"e〃ap"ewwo;/n'/a戶e"歸pMa)Q5ZWM9一LEGPH、嗜肺軍團(tuán)菌嗜肺亞種Q5ZSQ8—LEGPH、嗜冷細(xì)菌(C(5/M'e腸"c/2/"eo^畫)Q47Y43一COLP3、尸se油a〃eramo顧a"贈'c"T6cQ3CSZ5—ALTAT、沙雷氏菌Q8EF49—SHEON、&^c/2"ra;/^g^Agmc^raQ21E20SACD2、S"cc/zarap/wgi^血gradaraQ21ER7—SACD2、W6〃'o""gwWw/wS14Q1ZWE5—9VIBR、創(chuàng)傷弧菌(W6〃'ovw/myk^)Q8DAE2_VIBVU、溶藻弧菌(aZg/"o(yf/cm)12G01Q1VCP6—VIBAL、弧菌(W&"'osp)DAT722Q2FA22—9VIBR、副溶血弧菌(ra^o戸ra/za，o/,'c^)Q87NJ1一VIBPA、費(fèi)氏弧菌(W6Wo,cte〃')Q5E1F5_VIBF1、創(chuàng)傷弧菌Q7MJS8J/IBVY、發(fā)光細(xì)菌(尸/wtok"en'wwS/C4Q2C6Z5—9GAMM、//a/e〃ac/^'wera"Q2SFY7JHAHCH、海洋螺旋菌某種(<9cea"(w^yi//www)MED92Q2BKV0一9GAMM、海洋桿菌某種(Ocecmo6a"erRED65Q1N035—9GAMM、脫硫脫硫弧菌(D^wZ/ovAn'ocfe5^//w"c<my)Q310U7—DESDG、奧氏嗜熱鹽絲菌(//fl/W/^mo^n';cowm'/)H168Q2AIW5—9FIRM、騰沖嗜熱厭氧菌Q8RBX6JTHETN、CaW/ce〃w/冊'n^/orsacc/zara(y"'a^DSM8903Q2ZH17—CALSA、丙酮丁醇梭菌Q97E73—CLOAB、J汰a/^/n7wsw"a〃^￡//ge"MQYMFQ3C763一9CLOT、破傷風(fēng)梭菌(C/oWn'&wm^to"/)Q899J9JXOTE和拜氏梭菌NCIMB8052(C/oWn'Www6e^W"cyb'AC7MBW5力Q2WVN0—CLOBE。使用本文所述的Pfam數(shù)據(jù)庫，基于屬于H-NOX蛋白家族的這些蛋白質(zhì)的標(biāo)識，預(yù)測這些序列編碼H-NOX蛋白?？蛇m合用于本文所述的藥物組合物和方法的另外的H-NOX蛋白和核酸可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行鑒定。例如，基于它們的一級結(jié)構(gòu)和/或預(yù)測的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)與已知H-NOX蛋白和核酸的相似性，標(biāo)準(zhǔn)序列對比和/或結(jié)構(gòu)預(yù)測程序可以被用于識別另外的H-NOX蛋白和核酸。例如，Pfam數(shù)據(jù)庫使用定義的對比算法(definedalignmentalgorithms)和隱蔽馬爾科夫模型(例如Pfam21.0)將蛋白質(zhì)分類為家族，如H-NOX蛋白家族(Pfam-蛋白結(jié)構(gòu)域家族對比和隱蔽馬爾科夫模型的數(shù)據(jù)庫，Copyright(C)1996-2006ThePfamConsortium;GNULGPLFreeSoftwareFoundation,Inc.,59TemplePlace-Suite330,Boston,MA02111-1307,USA)。標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫，例如swissprot-trembl數(shù)據(jù)庫(萬維網(wǎng)地址為"expasy.org",SwissInstituteofBioinformaticsSwiss-ProtgroupCMU-1rueMichelServetCH-1211Geneva4，Switzerland),也可以被川于鑒定H-NOX蛋^家族的成員。H-NOX蛋白的二級和/或三級結(jié)構(gòu)可以使用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)構(gòu)預(yù)測程序的默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行預(yù)測，例如PredictProtein(630West,168Street,BB217,NewYork,N.Y.10032,USA)?？蛇x地'H-NOX蛋白的實際二級和/或三級結(jié)構(gòu)可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法確定。在一些實施方式中，H-NOX蛋白在相應(yīng)的位置上具有與騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX中以下遠(yuǎn)側(cè)袋殘基的任何一個相同的氨基酸Thr4、Ik5、Thr8、Trp9、Trp67、Asn74、Ile75、Phe78、Phe82、Tyrl40、Leul44或前述兩個或多個的任何組合。在一些實施方式中，基于它們氨基酸序列的序列對比，H-NOX蛋白在與騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Proll5或Argl35相應(yīng)的位置上分別具有脯氨酸或精氨酸。在一些實施方式中，H-NOX蛋白具有對應(yīng)于褐鼠(31H-NOX的Hisl05的組氨酸。在一些實施方式中，H-NOX蛋白具有，或被預(yù)測具有包含6個ct-螺旋、接著是2個卩-折疊、接著是l個a-螺旋、接著是2個(3-折疊的二級結(jié)構(gòu)。該二級結(jié)構(gòu)對于H-NOX蛋白已經(jīng)被報道。如果希望，新鑒定的H-NOX蛋白可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行檢測，以確定其是否結(jié)合血紅素。H-NOX蛋白作為02載體起作用的能力可以通過使用標(biāo)準(zhǔn)方法——例如本文所述的那些——確定H-NOX蛋白是否結(jié)合02加以檢測。如果希望，本文所述突變的一個或多個可以被引入H-NOX蛋白以優(yōu)化其作為02載體的特性。例如，一個或多個突變可以被引入，以改變其02解離常數(shù)、對氧k。ff、血紅素自氧化速率、NO反應(yīng)性、NO穩(wěn)定性或前述兩個或多個的任何組合。標(biāo)準(zhǔn)73技術(shù)，例如本文所述的那些，可以被用于測量這些參數(shù)。如本文所討論，突變H-NOX蛋白(如下文討論的I類和II類突變)可從這些或其它天然野生型來源序列(例如，圖2-4D或8A-8DD所列的序列或本文所述的任何其它序列)通過誘變進(jìn)行衍生。如本文所使用，"從......衍生(或衍生自)"涉及一個或多個突變被引入其中的蛋白質(zhì)的來源。例如，"從哺乳動物蛋白質(zhì)衍生的"蛋白質(zhì)指的是將一個或多個突變引入野生型(即，天然存在的序列)哺乳動物蛋白序列產(chǎn)生的目標(biāo)蛋白質(zhì)。效歸欣船如本文進(jìn)一步討論，H-NOX蛋白可包含一個或多個突變，例如與相應(yīng)野生型蛋白的那些相比，改變02解離常數(shù)、對氧k。ff、血紅素自氧化速率、NO反應(yīng)性、NO穩(wěn)定性或前述兩種或多種的任何組合的突變。由于本文提供的教導(dǎo)，使用本文所述且普通技術(shù)人員已知的技術(shù)，可通過隨機(jī)誘變，接著經(jīng)驗篩選需要的或期望的解離常數(shù)、解離速率、NO反應(yīng)性、穩(wěn)定性、生理相容性或前述兩種或多種的任何組合，來產(chǎn)生工程化的H-NOX蛋白組?？蛇x地，誘變可以選擇性地靶向特定區(qū)域或殘基，例如H-NOX蛋白的實驗確定或預(yù)測的三維結(jié)構(gòu)中明顯的遠(yuǎn)側(cè)袋殘基(本文圖1A;并參見，例如，Boon,E.M.Wa/.(2005)."MolecularBasisForNOSelectivityinSolubleGuanylateCyclase,"Ato,C7zemZca/腸/ogy1:53-59'其通過引用由此并入其全部內(nèi)容，特別是涉及野生型和突變H-NOX蛋白的序列)或通過序列對比鑒定的進(jìn)化上保守的殘基(本文圖2-4;并參見，例如，BootiE.M.""(2005)."MolecularBasisForNOSelectivityinSolubleGuanylateCyclase,"胸贓C^m'ca/別o/ogy1:53-59，其通過引用由此并入其全部內(nèi)容，特別是涉及野生型和突變H-NOX蛋白的序列)。如本文所使用，"突變蛋白"意指與天然存在的蛋白質(zhì)相比，具有一個或多個突變的蛋白質(zhì)。在一種實施方式中，突變蛋白具有與所有天然存在的蛋白質(zhì)的序列不同的序列。在各種實施方式中，突變蛋白的氨基酸序列與天然發(fā)生的蛋白的相應(yīng)區(qū)域的序列具有至少約下列任一同一性10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、95、97、98、99或99.5%。在一些實施方式中，突變蛋白是含有來自全長蛋白的至少約下列任何個數(shù)的連續(xù)氨基酸的蛋白片段25、50、75、100、150、200、300或400個。例如，可以使用帶有其中指定的默認(rèn)參數(shù)的序列分析軟件(例如GeneticsComputerGroup的序列分析軟件包(S叫uenceAnalysisSoftwarePackage),UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter,1710UniversityAvenue,Madison,WI53705)測量序列同一性。該軟件程序通過對各種氨基酸置換、刪除和其它修飾賦予同源性程度來匹配相似序列。如本文所使用，"突變"意指在天然發(fā)生的參考核酸或氨基酸序列中的改變。示例性的核酸突變包括插入、缺失、移碼突變、沉默突變、無義突變或錯義突變。在一些實施方式中，核酸突變不是沉默突變。示例性的蛋白突變包括一個或多個氨基酸的插入(如2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸的插入)、一個或多個氨基酸的缺失(如N-末端、C-末端和/或內(nèi)部殘基的缺失，例如至少約下列任何個數(shù)的氨基酸的缺失5、io、15、25、50、75、100、150、200、300或更多個，或者大約下列任何個數(shù)的氨基酸的缺失5、10、15、25、50、75、100、150、200、300或400個)、一個或多個氨基酸的置換(如2、3、4、5、6、7、8、9或IO個氨基酸的置換)、或前述兩種或多種的組合。H-NOX蛋白的示例性功能截短包括)31序列的殘基1-385。在一些實施方式中，與天然發(fā)生的蛋白質(zhì)相比，突變蛋白具有至少一個氨基酸改變。在一些實施方式中，突變核酸序列編碼與天然發(fā)生的蛋白質(zhì)相比具有至少一個氨基酸改變的蛋白質(zhì)。在一些實施方式中，核酸不是天然發(fā)生的核酸的簡并版本，所述天然發(fā)生的核酸編碼與天然發(fā)生的蛋白質(zhì)具有相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在提到特定氨基酸突變中使用的命名法首先確定野生型氨基酸，接著是殘基編號，而最后是取代氨基酸。例如，Y140L表示在殘基編號140上的酪氨酸被亮氨酸置換。"進(jìn)化上保守的突變"是一種蛋白質(zhì)中的氨基酸被同一蛋白質(zhì)家族中另一種蛋白質(zhì)相應(yīng)位置上的氨基酸置換。示例性的進(jìn)化上保守的突變(也表示為I類突變)列于表1A。在表1A中，突變根據(jù)人piH-NOX的序列進(jìn)行編號/注釋，但對有所有H-NOX序列都是類似的。因此，任何其它H-NOX蛋白中的對應(yīng)位置可以被突變?yōu)橹赋龅臍埢?。例如，人plH-NOX的Phe4可以被突變?yōu)槔野彼?，由于其它H-NOX蛋白在該位置具有酪氨酸。對應(yīng)的苯丙氨酸殘基可以被突變?yōu)槠渌魏蜨-NOX蛋白中的酪氨酸。在具體實施方式中，一個或多個突變被限定為進(jìn)化上保守的殘基。在一些實施方式中，一個或多個突變可包括至少一個進(jìn)化上保守的突變和至少一個非進(jìn)化上保守的突變。如果希望，鑒于本文提供的教導(dǎo)'這些突變H-NOX蛋白經(jīng)受對NO/02解離常數(shù)、NO反應(yīng)性、穩(wěn)定性和生理相容性的經(jīng)驗篩選。表IA.示例性的靶向進(jìn)化上保守的殘基的I類H-NOX突變F4YQ30GI145YF4LE33PI145HH7GN61GK151EA8EC78HI157FL9WA109FE183F在一些實施方式中，所述突變?yōu)檫h(yuǎn)側(cè)袋突變，例如a-螺旋A、D、E或G中殘基的突變(PdUcena,P.等人(2004年8月31日)."CrystalStructureofAnOxygen-BindingHemeDomainRelatedtoSolubleGuanylateCyclases,"PtociVa".75101(35):12854-12859)。示例性的遠(yuǎn)側(cè)袋突變(也表示為II類突變)列于表1B。在表1B中，突變根據(jù)人P1H-NOX的序列進(jìn)行編號勝釋，但對于所有H-NOX序列都是類似的。因為若干取代在每個所描述的殘基處提供了可行的突變，在每個指出位置的殘基可以被改變?yōu)槿魏纹渌烊换蚍翘烊淮嬖诘陌被?表示為"X")。這類突變可以產(chǎn)生具有各種期望親和力、穩(wěn)定性和反應(yīng)性特征的H-NOX蛋白。表IB.示例性的靶向遠(yuǎn)側(cè)袋殘疾的II類H-NOX突變V8XM73XI145XL9XF77XI149XF70XC78X在具體實施方式中，所述突變?yōu)檠t素遠(yuǎn)側(cè)袋突變。如本文所述，在H-NOX家族的NO-結(jié)合成員中阻止02結(jié)合的關(guān)鍵分子決定因素是血紅素的遠(yuǎn)側(cè)袋中氫鍵供體的缺乏。因此，在一些實施方式中，所述突變改變H-NOX結(jié)構(gòu)域和遠(yuǎn)側(cè)袋內(nèi)配體之間的氫鍵結(jié)合。在一些實施方式中，所述突變破壞遠(yuǎn)側(cè)袋的氫鍵供體和/或相對于對應(yīng)的野生型H-NOX結(jié)構(gòu)域賦予降低的02配體結(jié)合。示例性的遠(yuǎn)側(cè)袋殘基包括騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的hr4、11e5、Thr8、Trp9、Trp67、Asn74、Ile75、Phe78、Phe82、Tyrl40和Leul44以及任何其它H-NOX蛋白中對應(yīng)的殘基。不在遠(yuǎn)側(cè)袋中的殘基也可影響血紅素基團(tuán)的三維結(jié)構(gòu)；該結(jié)構(gòu)再影響02和NO與血紅素基團(tuán)中鐵的結(jié)合。因此，在一些實施方式中，H-NOX蛋白在遠(yuǎn)側(cè)袋之外具有一個或多個突變?？梢员煌蛔兊辉谶h(yuǎn)側(cè)袋中的殘基的實例包括騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Proll5和Argl35。在一些實施方式中，所述突變在近側(cè)袋(proximalpocket)中，所述近側(cè)袋包括Hisl05,其作為連接到血紅素鐵的殘基。在一些實施方式中，當(dāng)存在兩個或多個突變時，至少一個突變在遠(yuǎn)側(cè)袋之中，并且至少一個突變在遠(yuǎn)側(cè)袋之外(例如，在近側(cè)袋中的突變)。在一些實施方式中，所有的突變都在遠(yuǎn)側(cè)袋中。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的氨基酸序列與由自然界中生物體產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的序列不相同。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的氨基酸序列與在2006年5月21日或2006年5月22日于任何數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的序列(例如預(yù)測為或巳知為H-NOX核酸或氨基酸序列的所有已知序列)不相同。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的氨基酸序列與在2007年5月21日或2007年5月22日于任何數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的序列(例如預(yù)測為或已知為H-NOX核酸或氨基酸序列的所有已知序列)不相同。為了降低從人以外來源衍生的H-NOX蛋白的免疫原性，H-NOX蛋白中的氨基酸可以被突變?yōu)槿薍-NOX中的對應(yīng)氨基酸。例如，非人H-NOX蛋白四級結(jié)構(gòu)表面上的一個或多個氨基酸可以被突變?yōu)槿薍-NOX蛋白中的相應(yīng)氨基酸。在一些變異中，一個或多個表面氨基酸的突變可與兩個或多個遠(yuǎn)側(cè)袋殘基的突變-遠(yuǎn)側(cè)袋外的一個或多個殘基的突變(如，近側(cè)袋中的突變)或前述兩種或多種的組合進(jìn)行組合。示例性的突變顯示于表2。此外，表2中所列殘基的任何一個可以被突變?yōu)槿魏纹渌被帷１景l(fā)明也涉及本文所述突變的任何組合，例如雙突變、三突變或更高的多突變。例如，本文所述突變的任何一種的組合可以在同一H-NOX蛋白中進(jìn)行。注意，在其它哺乳動物或非哺乳動物H-NOX蛋白的等價位置上的突變也被本發(fā)明包括。如果希望，除表2中提到的殘基以外的殘基也可以被突變。示例性的突變H-NOX蛋白包含一個或多個突變，其相對于對應(yīng)的野生型H-NOX結(jié)構(gòu)域賦予改變的02或NO配體-結(jié)合，并可作為生理相容的哺乳動物02血液氣體載體起作用。在表2和所有隨后的表格中，突變的殘基編號表示在被描述的特定H-NOX蛋白的序列中的位置。例如，騰沖嗜熱厭氧菌I5A指的是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX第五個位置上的異亮氨酸被丙氨酸置換。相同的異亮氨酸到丙氨酸的突變可以在任何其它H-NOX蛋白的相應(yīng)殘基中進(jìn)行(該殘基可以是或可以不是其它H-NOX蛋白序列中的第五個殘基)。由于哺乳動物P1H-NOX結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列最多有兩個氨基酸不同，所以，當(dāng)被引入野生型大鼠P1H-NOX蛋白時產(chǎn)生期望突變H-NOX蛋白的突變也被預(yù)期當(dāng)在被引入來自其它哺乳動物如人的野生型|31H-NOX蛋白中時產(chǎn)生期望的突變H-NOX蛋白。表2.來自騰沖嗜熱厭氧菌(r/)、嗜肺軍團(tuán)菌(1/7)、脫硫脫硫弧菌(iW)、霍亂弧菌(K)、點形念珠藻(A>)、肉毒桿菌(CZO、丙酮丁醇梭菌(C)、大鼠、人、蠕蟲GCY-35(1-252)線蟲(O)的示例性H-NOX突變丄p其它細(xì)菌大鼠人丄2加H-NOXKcH-NOX卩1(1-385)卩1(1-385)H-NOX關(guān)ox(728-899)WH-NOX卩1(1-385)卩1(1-385)H-NOXF142YY139LI145YI145YHis67H5A丄2F9W-關(guān)OX&1(1-385)(31(1-385)F142Y(1-175)I145HI145H7YI5LH-NOX(31(1-385)卩1(1-385)H-NOX(1-186)C78YC78YI5L-OH-NOXpi(l-194)|31(1-194)P115AF142Y(1-197):r,W9FCaH-NOX卩l(xiāng)H105F(31H105F(1-183)7YW9F-卩l(xiāng)腦5G卩l(xiāng)H105GY140LW9F-(31(1-194)卩1(1-194)Yl備I145YI145Y)31(1-194)pl(l-194)W9F-N7L9W-I145L9W-I1454AYYW9Y卩2(1-217)卩2(l-217)77W9N(32(1-217)卩2(1-217)I142YI142Y77W9H7YN74E7YN74AT,N74Hr,N74A-Y140H7!fI75FHis67YF78Y-Y140L7YF78Y-Y140F7YP115A7YR135QHis67YY140F77Y140LYl催7YY140A7YL144FHis6if-7VOAT歪力游參濃野生型或突變H-NOX蛋白的任何一種都可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行修飾和/或配制，以增強(qiáng)治療或工業(yè)應(yīng)用。例如并且尤其是應(yīng)用到異源工程H-NOX蛋白時，本領(lǐng)域內(nèi)已知各種方法用于將這樣的試劑與免疫監(jiān)視隔離，包括交聯(lián)、聚乙二醇化、糖修飾等(例如，Rohlfs,R.J.等人(1998年5月15日)"ArterialBloodPressureResponsestoCell-FreeHemoglobinSolutionsAndTheReactionWithNitric78頁Oxide,"J.腸/.273(20):12128-12134;Migita,R.等人(1997年6月)，"BloodVolumeAndCardiacIndexinRatsAfterExchangeTransfusionWithHemoglobin-BasedOxygenCarriers,",/./)/my/o/.82(6):1995-2002;Vandegriff,K.D.""/.(2004年8月15日)"KineticsofNOand02BindingtoaMaleimidePoly(ethyleneglycol)-ConjugatedHumanHaemoglobin,"iwc'/2e附J".382(Pt1):183-189，它們各自通過引用由此并入其全部內(nèi)容，尤其是關(guān)于蛋白質(zhì)的修飾)，以及普通技術(shù)人員已知的其它技術(shù)。將H-NOX蛋白與諸如人血清白蛋白的人蛋白融合可以提高血清半衰期、粘度和膠體滲透壓(colloidaloncoticpressure)。在一些實施方式中，H-NOX蛋白在其合成過程之中或之后被修飾，以降低其免疫原性和/或提高其血漿保留時間。H-NOX蛋白也可以被包封(例如在脂質(zhì)體或納米顆粒中包封)。微教〃突妙掘X歪鋪特,如本文所述，提供NO和02解離常數(shù)范圍、02k。ff范圍、NO反應(yīng)性范圍、和穩(wěn)定性范圍的大量不同的H-NOX突變蛋白已經(jīng)被產(chǎn)生。為了提供有效的血液氣體載體，H-NOX蛋白可被用于在功能上代替或補(bǔ)充內(nèi)源性02載體，例如血紅蛋白。因此，在一些實施方式中，與諸如血紅蛋白的內(nèi)源性02載體相比，H-NOX蛋白具有相似或提高的02結(jié)合速率、02解離速率、02結(jié)合的解離常數(shù)、NO穩(wěn)定性、NO反應(yīng)性、自氧化速率、血漿保留時間或前述兩種或多種的任何組合。如本文所使用，"血紅蛋白"表示來自被良好表征的血紅蛋白家族的蛋白或其突變體，它們是紅細(xì)胞中含鐵的02輸送金屬蛋白。純化的、無基質(zhì)人血紅蛋白具有約200-500nM的對02動力學(xué)KD。該值是亞基依賴性的。如本文所使用，"k。ff"表示解離速率，例如02或NO從蛋白質(zhì)釋放的速率。較低數(shù)值的低k。ff表示較低的解離速率。在各種實施方式中，H-NOX蛋白的對Cbk。ff在2(TC在約0.01到約200s—1之間，例如，約0.1到約200s—'、約0.1到lOOs"、約1.0到約16.0s"、約1.35到約23.4s"、約1.34到約18s"、約1.35到約14.5s"、約0.21到約23.4s"、約1.35到約2.9s"、約2到約3s"、約5到約15,或約0.1到約ls—1。在一些實施方式中，H-NOX蛋白在2(TC具有小于或等于約0.65s—1的對氧k。ff(例如，在20。C在約0.21s"到約0.65s—1之間)。"k。n"表示結(jié)合速率，例如02或NO與蛋白質(zhì)的結(jié)合速率。較低數(shù)值的低k。n表示較低的結(jié)合速率。在各種實施方式中，H-NOX蛋白的對02kon在2(TC在約0.14到約60pM"s"之間，例如，約6到約6(VNfV1、約6到12(aNfV1、約15到約60pNfV1、約5到約18pM—V1或約6到約15(iM"s—1。"解離常數(shù)"表示"動力學(xué)解離常數(shù)"或"計算的解離常數(shù)"。"動力學(xué)解離常數(shù)"或"KD"表示動力學(xué)解離速率(k。ff)與動力學(xué)結(jié)合速率(k。n)的比率，例如使用標(biāo)準(zhǔn)方法(例如，標(biāo)準(zhǔn)光譜法、停流法或閃光光解法)——包括普通技術(shù)人79員已知的和/或本文所述的方法——被測定為絕對值的Kd値。"計算的解離常數(shù)，，或"計算Kd"指的是基于測量的k。ff的動力學(xué)解離常數(shù)的近似值。k。n的值通過動力學(xué)Kd和k。ff之間的相關(guān)性導(dǎo)出，如本文所述。在各種實施方式中，H-NOX蛋白結(jié)合02的動力學(xué)或計算的Kd在約lnM到lmM之間，例如，在20。C約2nM到約2pM、約2pM到約lmM、約lOOuM到約lpM、約9|iiM到約50(jM、約lOOpM到約lmM、約50nM到約10pM、約2nM到約50一、約100nM到約1.9pM、約150nM到約1|liM,或約lOOnM到約255nM、約20nM到約2pM、20nM到約75nM、約ljiM到約2^M、約2|iM到約10pM、約2pM到約9pM或約100nM到500nM。在一些實施方式中，02結(jié)合的動力學(xué)或計算的Kd在2(TC小于約下列值的任何一個100nM、80nM、50nM、30nM、25nM、20nM或10nM。在各種實施方式中，H-NOX蛋白結(jié)合02的動力學(xué)或計算的Kd是相同條件下(例如，在20°C)血紅蛋白的約0.01到約100倍，例如在相同條件下(例如，在20。C)血紅蛋白的約O.l到約IO倍，或約0.5到約2倍。在多種實施方式中，H-NOX蛋白結(jié)合NO的動力學(xué)或計算的Ko是相同條件下(例如，在20'C)血紅蛋白的約0.01到約100倍，例如在相同條件下(例如，在20'C)血紅蛋白的約0.1到約10倍，或約0.5到約2倍。如本文所使用，"氧親和性"是一個定性術(shù)語，其指氧結(jié)合到蛋白質(zhì)的血紅素部分的強(qiáng)度。所述親和性受對氧k。ff和k。n兩者的影響。數(shù)值上較低的氧Ko值表示較高的親和力。"NO親和性"是一個定性術(shù)語，其指NO結(jié)合到蛋白質(zhì)(例如，結(jié)合血紅素基團(tuán)或結(jié)合氧，所述氧結(jié)合到與蛋白質(zhì)結(jié)合的血紅素基團(tuán))的強(qiáng)度。所述親和性受對NOk。ff和k。n兩者的影響。數(shù)值上較低的NOKD值表示較高的親和性。如本文所使用，"NO穩(wěn)定性"指的是蛋白質(zhì)在氧存在的情況下對NO氧化的穩(wěn)定性或抗性。例如，蛋白質(zhì)在氧存在下結(jié)合到NO時不被氧化的能力是蛋白質(zhì)的NO穩(wěn)定性的指示。在一些實施方式中，在WC下溫育約1、2、4、6、8、10、15或20小時的任何一段時間后，小于約50、40、30、10或5%中的任何一個百分比的H-NOX蛋白被氧化。如本文所使用，"NO反應(yīng)性"指的是在2nM蛋白質(zhì)的濃度下，在氧存在的情況下，在血紅素結(jié)合蛋白的血紅素中的鐵被NO氧化的速率。單位為s"的較低數(shù)值的NO反應(yīng)性表示較低的NO反應(yīng)性。在多種實施方式中，H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在2(rC小于約700s-1，例如，在2(TC小于約600s人500s"、400s"、300s"、200s-'、100s"、75s"、50s"、25s"、20s入10s"、50s"、3s-1、2s"、1.8s-1、1.5s"、1.2s-1、1.0s"、0.8s"、0.7s"或0.6s'1。在多種實施方式中，H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在2(TC在約0.1到約600s"之間，例如，在2(TC在約0.5到約400s"、約0.5到約100s"、約0.5到約50s"、約0.5到約10s"、約1到約5s"或約0.5至lj約2.1s—1之間。在多種實施方式中，在相同條件下，如在20。C，H-NOX蛋白的反應(yīng)性比血紅蛋白的反應(yīng)性至少低約10、100、1,000或IO，OOO倍。如本文所使用，"自氧化速率"指的是在血紅素結(jié)合蛋白的血紅素中鐵被自氧化的速率。單位為s—'的較低數(shù)值的自氧化速率表示較低的自氧化速率。在多種實施方式中，H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約1.0h—1，例如在37。C小于約下列值的任何一個0.9h:0.8h—1、0.7h—1、0.6h—1、0.5h—'、0.4h—1、0.3h"、0.2h—1、0.1h"或0.05h—1。在多種實施方式中，H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37°C，在約0,006到約5.0h"之間，例如在37°C，約0.006到約1.0h"、約0.006到約0.9h'1或約0.06到約0.5h"。在多種實施方式中，突變H-NOX蛋白具有(a)在血紅蛋白的2個數(shù)量級之內(nèi)的02或NO解離常數(shù)、結(jié)合速率(對02或NO的k。n)或解離速率(對02或NO的k。ff)，(b)分別具有比sGC(31弱(例如，至少弱約10倍、100倍或1000倍)的NO親和力，(c)比血紅蛋白低至少1000倍的與結(jié)合O2的NO反應(yīng)性，(d)比血紅蛋白高至少2、10、100或1000倍的體內(nèi)血漿保留時間，或(e)前述兩種或多種的任何組合。示例性的適當(dāng)02載體提供了在血紅蛋白的兩個數(shù)量級之內(nèi)的解離常數(shù)，即在約0.01到100倍之間，例如在血紅蛋白的解離常數(shù)的約0.1到10倍之間，或約0.5到2倍之間。各種已建立的技術(shù)可被用于量化解離常數(shù)，例如本文所述的技術(shù)(Boon,E.M.等人(2005)，"MolecularBasisForNOSelectivityinSolubleGuanylateCyclase,"AtowreC/ze肌傷o/.1:53-59;Boon,E.M.等人(2005年10月)."LigandDiscriminationinSolubleGuanylateCyclaseandtheH-NOXFamilyofHemeSensorProteins,"Cwr(9p/".CAe附.說'o/.9(5):441-446;Boon,E.M.等人(2005)."LigandSpecificityofH-NOXDomains:FromsGCtoBacterialNOSensors,"http://"org.歷oc/zew.99(4):892-902),Vandegriff,K.D.等人(August15,2004)"KineticsofNOand02BindingtoaMaleimidePoly(ethyleneglycol)-ConjugatedHumanHaemoglobin,"fflw/zem./382(Pt1):183-189，它們的每個都在此被完整引入作為參考，尤其是涉及解離常數(shù)的測量)，以及普通技術(shù)人員已知的那些技術(shù)。示例性的02載體為帶有結(jié)合02的H-NOX蛋白提供了低的或最小的NO反應(yīng)性，例如比血紅蛋白低的NO反應(yīng)性。在一些實施方式中，NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低得多，例如低至少約IO、100、1,000或10,000倍。多種己建立的技術(shù)可被用于量化NO反應(yīng)性(Boon,E.M.等人(2005)."MolecularBasisForNOSelectivityinSolubleGuanylateCyclase,"AtoweCtem.所o/.1:53-59;Boon,E.M.等人(2005年10月)."LigandDiscriminationinSolubleGuanylateCyclaseandtheH陽NOXFamilyofHemeSensorProteins,"CwwOp/".CTze附.S/o/.9(5):441-446;Boon,E.M.等人(2005)."LigandSpecificityofH-NOXDomains:FromsGCtoBacterialNOSensors,"http://"org.歷oc/ze附.99(4):892-902),Vandegriff,K.D.等人(2004年8月15日)"KineticsofNOandO2BindingtoaMaleimidePoly(ethyleneglycol)-ConjugatedHumanHaemoglobin,"382(Pt1):183-189，它們的每個都在此被完整引入作為參考，尤其是涉及NO反應(yīng)性的測量)，以及普通技術(shù)人員已知的那些技術(shù)。因為野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX具有這樣的低NO反應(yīng)性，所以其它野生型H-NOX蛋白和突變H-NOX蛋白可具有相似的低NO反應(yīng)性。例如，騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H具有與野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX相似的NO反應(yīng)性。此外，適當(dāng)?shù)?2載體提供了高的或最大的穩(wěn)定性，特別是體內(nèi)穩(wěn)定性。多種穩(wěn)定性量度可以被使用，例如氧化穩(wěn)定性(如，對自氧化或NO氧化的穩(wěn)定性)、溫度穩(wěn)定性和體內(nèi)穩(wěn)定性。多種已建立的技術(shù)可被用于量化穩(wěn)定性，例如本文所述的技術(shù)(Boon,E.M.等人(2005)."MolecularBasisForNOSelectivityinSolubleGuanylateCyclase,"AtowwC/ze肌歷o/.1:53-59;Boon,E.M.等人(2005年10月)."LigandDiscriminationinSolubleGuanylateCyclaseandtheH-NOXFamilyofHemeSensorProteins,"Cwrr.Opm.CAem.9(5》441-446;Boon,E.M.等人(2005)."LigandSpecificityofH-NOXDomains:FromsGCtoBacterialNOSensors,"J./"wg.說oc/zem.99(4):892-902)，以及普通技術(shù)人員已知的那些技術(shù)。對于血漿、血液或組織中的體內(nèi)穩(wěn)定性，示例性的穩(wěn)定性量度包括保留時間、清除速率和半衰期。來自嗜熱生物體的H-NOX蛋白被預(yù)期在高溫下穩(wěn)定。在多種實施方式中，血漿保留時間比血紅蛋白的血漿保留時間高至少約2、10、100或1000倍(例如，Bobofchak,K.M.等人(2003年8月)."ARecombinantPolymericHemoglobinWithConformational,Functional,AndPhysiologicalcharacteristicsofaninvivo02transporter,",4m../.P/v,由/./fe""Oc'.P/m'/o/.285(2):H549-H561)。普通技術(shù)人員將認(rèn)識到，基于血紅蛋白的血液代用品受到來自血漿的無細(xì)胞血紅蛋白的快速清除的限制，該快速清除的原因在于存在將無細(xì)胞血紅蛋白從血漿中除去的血紅蛋白受體。由于血漿中沒有H-NOX蛋白的受體，野生型和突變H-NOX蛋白被預(yù)期具有比血紅蛋白更長的保留時間。如果希望，血漿保留時間可以通過聚乙二醇化或交聯(lián)H-NOX蛋白，或使用標(biāo)準(zhǔn)方法(如本文所述的那些和普通技術(shù)人員已知的那些)將H-NOX蛋白與另一蛋白融合而提高。在多種實施方式中，H-NOX蛋白在20。C具有約lnM到約lmM之間的02解離常數(shù)，并且在相同條件下，如在2(TC，具有比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少約10倍的NO反應(yīng)性。在一些實施方式中，H-NOX蛋白在20。C具有在約lnM到約lmM之間的02解離常數(shù)，和在20。C小于約700s"(例如，在2(TC小于約600s—1、500s—1、100s"、20s—1或1.8s—1)的NO反應(yīng)性。在一些實施方式中，H-NOX蛋白具有在血紅蛋白的02解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)的02解離常數(shù)，并且在相同條件下，如在20。C，具有比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少約10倍的NO反應(yīng)性。在一些實施方式中，H-NOX蛋白在20。C具有約0.01到約200s"之間的對氧k。ff，以及在相同條件下，如在2(TC，比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少約10倍的NO反應(yīng)性。在一些實施方式中，H-NOX蛋白在20。C具有小于約0.65s—1(例如，在20°C在約0.21s"到約0.64s—1之間)的對氧k。ff，以及在相同條件下，如在20。C，比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少約10倍的NO反應(yīng)性。在具體實施方式中，H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20°C，在約2nM到約50pM、約50nM到約10pM、約100nM到約1.9(iM、約150nM到約lpM或約100nM到約255nM之間。在多種實施方式中，H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C小于約80nM，例如在20°C，在約20nM到約75nM之間。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在相同條件下——例如在2(TC下——比血紅蛋白的NO反應(yīng)性至少低約100倍或低約1000倍。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20。C小于約700s-1,例如在20。C小于約600s"、500s.'、400s"、300s"、200s"、100s"、75s"、50s—'、25s"、20s"、10s"、5s"、3s"、2s"、1.8s"、1.5s"、1.2s"、l.Os"、0.8S-'、0.7s"或0.6s"。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的對氧k。ff在20'C在0.01到200s—1之間，例如約0.1到約200s—1、約0.1到約lOOs.1、約1.35到約23.4s—1、約1.34到約18s—\約1.35到約14.5s—1、約0.21到約23.4s—1、約2到約3s—、約5到約15s"、約0.1到約ls"。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約100nM到約1.9)iM之間，并且H-NOX蛋白的對氧k。ff在20'C在約1.35s"到約14.5s—1之間。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約lh"，例如小于約下列值的任何一個0.9h"、0,8h-1、0.7h"、0.6h"、0.5h"、0.4h"、0.3h"、0.2h"或0.1h"。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的對氧k。ff在2(TC在約L35s"到約14.5s—1之間，并且H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約lh\在一些實施方式中，H-NOX蛋白的對氧k礎(chǔ)在20。C在約1.35s"到約14.5s"之間，并且H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在2(TC小于約700s—1(例如，在20°(:小于約6005-1、500s人100s"、20s"或1.8s—1)。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約1h—1，并且H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20'C小于約700s—1(例如在20'C小于約600s.1、500s"、100s.1、20s"或1.8s-1)。在一些實施方式中，H-NOX蛋白溶液的粘度在1到4厘泊(cP)之間。在一些實施方式中，H-NOX蛋白溶液的膠體滲透壓在20到50mmHg之間。表3列出了野生型和突變H-NOX蛋白的示例性大小、氧親和度、自氧化穩(wěn)定性、NO反應(yīng)速率和修飾。在表3中，載體大小指的是修飾的(如，聚乙二醇化)或未修飾的H-NOX蛋白的分子量。表3:H-NOX蛋白的示例性實施方式載體大小氧親和性穩(wěn)定性(自氧化)NO反應(yīng)性顆粒修飾>1MD<1nM1小時0.01到0.1交聯(lián)0.5kD到1MDlnM到100nMlh到12h0.1到1聚乙二醇化O.lkD至ij0.5kD100nM到lpM12h到48h1到10包封0.01kD到O.lkDlpM到10pM48h到2周10至lj100對于特定突變體的示例性數(shù)據(jù)被報告于表4-12。在表4-12中，pi和P2指的是從大鼠H-NOX蛋白衍生的蛋白。由于哺乳動物P1H-NOX結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中最多兩個氨基酸不同，所以，對于其它哺乳動物PlH-NOX蛋白如人PlH-NOX中相應(yīng)突變預(yù)期得到相似的結(jié)果。如表4所示，將一個或多個突變引入野生型H-NOX蛋白允許自氧化速率和02解離速率被改變。如果希望，自氧化速率或02解離速率可以通過組合表4中所列單突變或雙突變的任何一種，或通過引入一個或多個另外的突變到H-NOX蛋白而被進(jìn)一步改變，如本文所述。表4.野生型和II類突變H-NOX蛋白的自氧化穩(wěn)定性、02結(jié)合性質(zhì)(例如02解離的速率)和遠(yuǎn)側(cè)袋氫鍵合殘基被列出<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>85<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>a該構(gòu)建體對氧化穩(wěn)定(由37。C下的自氧化速率^^[h"]評價)和/或?qū)ρt素?fù)p失穩(wěn)定。b02-結(jié)合活性通過02在2(TC從血紅素解離的速率加以評估(s")。e在37'C24小時后，仍沒有自氧化的跡象。d只有一小部分蛋白與02形成復(fù)合體，報告的速率表示該群體的動力學(xué)。e蛋白質(zhì)結(jié)合02，但A:,未確定。f盡管相對穩(wěn)定，但蛋白質(zhì)隨著氧化而沉淀，使得難以測定L。S由于不穩(wěn)定或迅速氧化而不適用。h"不穩(wěn)定的構(gòu)建體"表示蛋白質(zhì)在測試條件下立即氧化。'"稍微較穩(wěn)定"表示蛋白質(zhì)在數(shù)分鐘到數(shù)小時的時間段內(nèi)發(fā)生氧化，但在測試條件下超過24小時后不保持穩(wěn)定。表5顯示了通過引入一個或多個突變，H-NOX蛋白中02結(jié)合速率a。n)、02解離速率a。ff)、02解離常數(shù)(尺D)和自氧化速率a。x)的改變。在一些實施方式中，表5中所列的單或雙突變的任何一種與另一突變(例如表5中的另一突變或本文所述的任何其它突變)組合，以進(jìn)一步改變02結(jié)合速率、02解離速率、02解離常數(shù)、自氧化速率或前述兩種或多種的組合。表5.組胺酰-連接的FeU血紅素蛋白的02結(jié)合動力學(xué)常數(shù)蛋白質(zhì)"onkd扎ox參考文獻(xiàn)7YH-NOX89.7±6.213.6±1.01.22±0.097YP115A21.2士2.110.4±1.10.22±0.01j7H5A~800.82±0.030.7j打I5L~麵9.50±0.640.6j7H5L-P115A~300.28±0.010.6j7YW9F305±316.02±0.621.84±0.17ZYY140Ff15.7±1.415.7±9.80.05JYY140L~2000成對的20.1±2.00.1917YY140H~5005.03±0.690.87j86<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>表6顯示了H-NOX蛋白中的02結(jié)合速率、02解離速率、02、自氧化速率、NO反應(yīng)性和Fe11—02復(fù)合體的穩(wěn)定性可通過引入一個或多個突變加以改變。在一些實施方式中，表6中所列的單或雙突變的任何一種與另一突變(例如表6中的另一突變或本文所述的任何其它突變)組合，以進(jìn)一步改變H-NOX蛋白的02結(jié)合速率、02解離速率、02、自氧化速率、NO反應(yīng)性或Fe"—02復(fù)合體的穩(wěn)定性。普通技術(shù)人員將理解，引入一個或多個另外的突變，如本文所述的那些突變，可被用于進(jìn)一步改變這些值。表6.H-NOX蛋白中的02結(jié)合速率、02解離速率、02自氧化速率、NO反應(yīng)性和Fe"-02復(fù)合體的穩(wěn)定性<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>"20。C下O2結(jié)合血紅素的速率OM-V);b20。C下O2從血紅素解離的速率(S");C37。C下血紅素自氧化速率(h");d對于NO反應(yīng)性的確定在20'C，純化蛋白(7YWTHNOX、7YY140HHNOX、智人血紅蛋白(HsHb))以2M濃度在緩沖液A中制備，并且一氧化氮(NO)以200M的濃度在緩沖液A中(緩沖液A:50mMHepes,pH7.5,50mMNaCl)進(jìn)行制備。使用停流光譜法，蛋白質(zhì)被迅速與NO以l:l比例混合，混合時間(integrationtime)為0.00125秒。最大變化的波長被擬合成單指數(shù)，主要測量NO氧化的限速步驟。反應(yīng)的終產(chǎn)物對于H-NOX蛋白為鐵-NO，而對于HsHb為鐵-水合物(ferric-aquo)。，寸于/^Hb，蛋白質(zhì)與NO的反應(yīng)如此迅速，以至于反應(yīng)在實驗的死時間(deadtime)(0.001秒)內(nèi)完成?；贓ich，R.R"(1996)"MechanismofNO-InducedOxidationofMyoglobinandHemoglobin,"5/oc/麵勿35:6976-6983，血紅蛋白的NO反應(yīng)性在2(TC約為7,000s"。表7顯示了02結(jié)合的解離常數(shù)可以通過突變H-NOX蛋白中一個或多個殘基而被顯著改變。這些示例性H-NOX蛋白的動力學(xué)Kd但在20。C在21.20nM到1000000.00nM的范圍內(nèi)。如果希望，02結(jié)合的解離常數(shù)可以通過組合表7中所列單或雙突變的任何一種，或通過引入一個或多個另外的突變到H-NOX蛋白而被進(jìn)一步改變，如本文所述。表7.按02結(jié)合的解離常數(shù)值排列的野生型和突變H-NOX蛋白以及參考蛋白<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>表8顯示了02結(jié)合的解離速率可以通過突變H-NOX蛋白中一個或多個殘基而被明顯改變。這些示例性H-NOX蛋白的解離速率在20。C下在0.21s—1到23.4s—1的范圍內(nèi)。如果希望，02結(jié)合的解離速率可以通過組合表8中所列單或雙突變的任何一種，或通過引入一個或多個另外的突變到H-NOX蛋白而被進(jìn)一步改變，如本文所述。表8.按02結(jié)合的解離速率值排列的野生型和突變H-NOX蛋白以及<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>表9顯示了02結(jié)合的結(jié)合速率可以通過突變H-NOX蛋白中一個或多個殘基而被明顯改變。這些示例性H-NOX蛋白的結(jié)合速率在2(TC下在60pM—'s—1到0.14^VfV的范圍內(nèi)。如果希望，02結(jié)合的結(jié)合速率可以通過組合表9中所列單或雙突變的任何一種，或通過引入一個或多個另外的突變到H-NOX蛋白中而被進(jìn)一步改變，如本文所述。表9.按02結(jié)合的結(jié)合速率值排列的野生型和突變H-NOX蛋白以及參考蛋白蛋白質(zhì)konV1)±他Hb卩60他Hba50HemAT-B32SwMb177YY140F15.71.4r,H-NOX13.617YP115A10.41.17YW9F6.020.62UF142Y0.40.14坊FixL0.147YW9F-N74A非常慢aIWH-NOX非常慢a(31(1-385)I145Y非常慢aa"非常慢"表示比血紅蛋白慢，例如比血紅蛋白慢大約一到兩個數(shù)量級。表10顯示了示例性H-NOX突變對02和NO結(jié)合的影響。表10中所列的Fe-未連接形式的每個數(shù)字是用于單峰(其被列在卩和a列之間)。當(dāng)02或NO結(jié)合時，該單峰分成兩個峰，P和a(其被分別列于p和a列下方)。如果希望，02或NO結(jié)合可以通過組合表10中所列單或雙突變的任何一種，或通過引入一個或多個另外的突變到H-NOX蛋白中而被進(jìn)一步改變，如本文所述。表10:—些組胺酰-連接的Fe"血紅素蛋白復(fù)合體的UV-可見光峰的位置a蛋白質(zhì)Soret(索雷)PaFeH未連接的復(fù)合體sGC431555(31(1-385)I145Y4295497YH-NOX43156577W9F-Y140L430560H-NOX429568H-NOX430555丄2H-NOX42855791<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>'nm(2(TC下)表11包含一些Fe(11)、Fe(III)、Fe(II)-NO和Fe(II)-02復(fù)合體的UV-可見光峰的位置。當(dāng)血紅蛋白或H-NOX蛋白厭氧時，其在431nm處具有一個Soret(索雷)峰，并且其處于未連接的狀態(tài)。如果H-NOX蛋白未結(jié)合02，那么當(dāng)02被加入時，該Soret峰不改變。如果H-NOX確實結(jié)合了02，那么當(dāng)02被加入時，其Soret峰將移動到414nm和418nra之間，這與血紅蛋白中發(fā)生的移動相同，表明02結(jié)合到血紅素。氧化的H-NOX(Fe(III))或以6配位態(tài)結(jié)合NO的H-NOX的Soret峰可能與儲存或使用后H-NOX蛋白的狀態(tài)相關(guān)。如果H-NOX蛋白未結(jié)合NO，那么當(dāng)NO被加入時，該Soret峰不改變。如果H-NOX蛋白結(jié)合了NO并形成6配位的亞鐵-亞硝?；?ferrous-nitrosyl)復(fù)合體，那么當(dāng)NO被加入時，其Soret峰將移動到420nm和424nm之間。如果H-NOX蛋白結(jié)合了NO并形成5配位的亞鐵-亞硝?；鶑?fù)合體，則Soret峰將移動到399nm。如果希望，02或NO結(jié)合可以通過組合表11中所列單或雙突變的任何一種，或通過引入一個或多個另外的突變到H-NOX蛋白中而被進(jìn)一步改變，如本文所述。表ll.一些Fe(II)、Fe(III)、Fe(II)-NO和Fe(II)-02復(fù)合體的UV-可見光峰的位<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>W.A."表示由于在較長波長下的低信號，不可指定的a和卩譜帶。<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>表12包含示例性騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX蛋白的自氧化速率。如果希望，自氧化速率可以通過組合表12中所列任何突變，或通過引入一個或多個另外的突變到H-NOX蛋白中而被進(jìn)一步改變，如本文所述。在表12中的2nm和3nm值是指UV-可見光Soret峰在觀察的時間段內(nèi)偏移2到3nm;這樣極小的改變可能是由于自氧化。表12.騰沖嗜熱厭氧菌(7Y)H-NOX蛋白的自氧化速率<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>熊74E在4'C下非常緩慢(2nm)，在RT下緩慢77W9N在4'C下穩(wěn)定，在RT下非常緩慢(3nm)7YwtHis6穩(wěn)定IYI75F-His6穩(wěn)定7YL144F-His6穩(wěn)定穩(wěn)定"表示在至少24小時后，血紅素氧化的缺乏"RT"表示室溫。H-NOX核酸本發(fā)明也以編碼本文所述的任何突變H-NOX蛋白的核酸為特征。如本文所使用，"核酸"指的是單鏈或雙鏈形式的兩個或多個脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸，并且除非另有限制，包含天然發(fā)生核苷酸的類似物，其以與天然發(fā)生的核苷酸相似的方式與核酸雜交。在一些實施方式中，所述核酸為重組核酸。"重組核酸"表示一種目標(biāo)核酸，其不含一個或多個在所述目標(biāo)核酸從中衍生的生物體的天然發(fā)生的基因組中位于所述目標(biāo)核酸側(cè)翼的核酸(如基因)。在一些實施方式中，H-NOX核酸被可操作地連接到另一核酸，所述另一核酸編碼另一蛋白的全部或部分，以便該重組核酸編碼融合蛋白，所述融合蛋白包括H-NOX蛋白(如，具有或不具有來自H-NOX蛋白另一結(jié)構(gòu)域的H-NOX結(jié)構(gòu)域)，以及諸如人血清白蛋白的另一蛋白的全部或部分。該術(shù)語因此包括，例如被摻入載體、摻入自主復(fù)制質(zhì)粒或病毒、或摻入原核生物或真核生物基因組DNA的重組DNA，或者作為獨(dú)立于其它序列的單獨(dú)分子(如，cDNA、基因組DNA片段或通過PCR或限制性核酸內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的cDNA片段)存在的重組DNA。本發(fā)明也以含有一個或多個編碼本文所述的任何突變H-NOX蛋白的核酸的載體為特征。如本文所使用，"載體"表示能夠輸送，并任選地在宿主細(xì)胞中表達(dá)一個或多個目標(biāo)核酸的構(gòu)建體(construct)。載體的實例包括，但不限于，質(zhì)粒、病毒載體、DNA或RNA表達(dá)載體、黏粒和噬菌體載體。在一些實施方式中，載體包含在表達(dá)調(diào)控序列調(diào)控下的核酸。"表達(dá)調(diào)控序列"表示指導(dǎo)目標(biāo)核酸轉(zhuǎn)錄的核酸序列。表達(dá)調(diào)控序列可以是啟動子，例如組成型或誘導(dǎo)型啟動子，或者增強(qiáng)子。該表達(dá)控制序列被可操作地連接到待轉(zhuǎn)錄的核酸片段。在具體實施方式中，所述核酸包括圖2-4D或8A-8DD中所示的任何核酸的片段或完整核酸序列。在一些實施方式中，所述核酸包括至少約50、100、150、200、300、400、500、600、700、800或更多個連續(xù)的來自H-NOX核酸的核苷酸，并且與其所衍生的H-NOX核酸相比包含一個或多個突變(例如，1、2、953、4、5、6、7、8、9或10個突變)。在多種實施方式中，與其從中衍生的H-NOX核酸相比，突變H-NOX核酸包含少于約任何20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3或2個突變。本發(fā)明也以編碼突變H-NOX蛋白的任何核酸的簡并變體(degeneratevariant)為特征。本發(fā)明也包括含有至少一種編碼本文所述突變H-NOX蛋白的核酸的細(xì)胞或細(xì)胞群。示例性的細(xì)胞包括昆蟲、植物、酵母、細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞。這些細(xì)胞可用于使用標(biāo)準(zhǔn)方法——如本文所述的那些方法——生產(chǎn)突變H-NOX蛋白。H-NOX蛋白的制劑本文所述的任何野生型或突變H-NOX蛋白可被用于藥物組合物或非藥物組合物的配制。如下文進(jìn)一步討論，這些制劑在多種治療應(yīng)用和工業(yè)應(yīng)用中有用。在一些實施方式中，所述藥物組合物包括一種或多種野生型或突變H-NOX蛋白(例如本文所述的任何H-NOX野生型或突變蛋白)和藥學(xué)上可接受的載體。在多種實施方式中，H-NOX蛋白是分離的或純化的蛋白質(zhì)。"藥學(xué)上可接受的載體"是表示任何這樣的物質(zhì)——當(dāng)與活性成分結(jié)合時，基于普通技術(shù)人員的知識，其允許所述成分保持生物活性并且不引起不可接受的免疫反應(yīng)(如嚴(yán)重的過敏或過敏性休克)。實例包括，但不限于，任何標(biāo)準(zhǔn)藥物載體，例如磷酸緩沖鹽溶液、水、乳液如油/水乳液、和各種類型的潤濕劑。用于氣霧劑或腸胃外給藥的示例性的稀釋劑是磷酸緩沖鹽水或生理(0.9%)鹽水。包含這類載體的組合物通過已知的傳統(tǒng)方法(參見，例如ie/w'"gto"k尸/wrw"cewrica/5We"cM,18thedition,A.Gennaro，ed.,MackPublishingCo.，Eastern,PA,1990;禾口iem/"gto",77ze5We""尸ra"/ceo/i^armflc_y20thEd.MackPublishing,2000，它們在此被完整引入作為參考，尤其是涉及制劑的部分)進(jìn)行配制。盡管本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何合適載體可被用于本發(fā)明的藥物組合物，載體的類型將根據(jù)給藥方式而改變。組合物可以被配制，用于任何合適的給藥方式，包括，例如靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、囊內(nèi)(intravesicular)、吸入、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、氣管內(nèi)、經(jīng)粘膜、眼內(nèi)、鞘內(nèi)或經(jīng)皮給藥。對于腸胃外給藥，例如皮下注射，載體可包括，例如水、鹽水、醇、脂肪、蠟或緩沖液。對于經(jīng)口給藥，可利用上述載體的任何一種，或者固體載體，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖或碳酸鎂。生物可降解微球(例如，聚乳酸、聚甘醇酸(polylactatepolyglycolate))也可被用作載體。在一些實施方式中，所述藥物組合物或非藥物組合物包括緩沖液(如中性緩沖鹽水、磷酸緩沖鹽水等)、糖(如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、糊精等)、抗氧化劑、螯合劑(如EDTA、谷胱甘肽等)、防腐劑、對于結(jié)合和/或運(yùn)輸氧有用的96另一種化合物、非活性成分(如穩(wěn)定劑、填料等)或前述兩種或多種的組合。在一些實施方式中，所述組合物被配制為凍干物。H-NOX蛋白也可能使用公知的技術(shù)包封入脂質(zhì)體或納米顆粒中?？梢员挥糜贖-NOX蛋白的其它示例性制劑由例如美國專利號6,974,795和6,432,918進(jìn)行了描述，其在此被完整引入作為參考，尤其是關(guān)于蛋白質(zhì)制劑的部分。本文所述的組合物可作為持續(xù)釋放制劑(例如，諸如膠囊或海綿的制劑，其在給藥后產(chǎn)生化合物的緩慢釋放)的一部分進(jìn)行給藥。這樣的制劑通?？墒褂霉募夹g(shù)加以制備，并通過例如經(jīng)口、直腸、皮下植入進(jìn)行給藥，或通過在期望的目標(biāo)部位植入進(jìn)行給藥。持續(xù)釋放制劑可含有分散于載體基質(zhì)中和/或包含于被速率控制膜包圍的儲庫(reservoir)中的H-NOX蛋白。這類制劑中使用的載體是生物相容的，并且也可以是生物可降解的。在一些實施方式中，所述制劑提供了相對恒定水平的H-NOX蛋白釋放。包含在持續(xù)釋放制劑中的H-NOX蛋白的量取決于植入部位、釋放速率和期望的釋放持續(xù)時間、以及待治療或預(yù)防的病癥的本質(zhì)。在一些實施方式中，藥物組合物包含有效量的野生型或突變H-NOX蛋白。術(shù)語"有效量"意思是本文所述一種或多種蛋白的這樣的量"^~基于執(zhí)業(yè)專門醫(yī)師的知識，與其功效和毒性的參數(shù)結(jié)合，其在給定的治療形式中應(yīng)該有效。如本領(lǐng)域所知，有效量可以是一個或多個劑量。如臨床中所理解，與另一種藥物、化合物或藥物組合物一起，藥物組合物的有效劑量可能達(dá)到或可能不會達(dá)到。因此，有效量可以在給予一種或多種治療試劑的背景下加以考慮，并且如果與一種或多種其它試劑結(jié)合，期望或有益的結(jié)果可以或已經(jīng)達(dá)到，則單一藥劑可以被認(rèn)為以有效量給藥。血紅蛋白作為血液替代物的示例性劑量為每千克患者體重約10mg到約5克或更高的胞外血紅蛋白。因此，在一些實施方式中，給予人的有效量的H-NOX蛋白在數(shù)克到超過約350克之間。H-NOX蛋白的其它示例性劑量包括在適當(dāng)?shù)妮斪⑺俾省缂s0.5ml/min(參見，例如Winslow,R.Chapter12/"BloodSubstitutes)下大約4.4、5、10或13G/DL(其中G/DL是H-NOX蛋白溶液在輸注進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)之前的濃度)的任何一個?？梢岳斫?，每種劑型的各個劑量中包含的活性成分的單位含量本身不需要構(gòu)成有效量，因為必要的有效量可通過多次給藥的組合效果達(dá)到。包含在藥物組合物中H-NOX蛋白量的選擇取決于使用的劑型、治療的病癥、以及根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定的要達(dá)到的具體目的。示例性的組合物包括遺傳工程改造的重組H-NOX蛋白，其可被分離或純化，所述重組H-NOX蛋白質(zhì)包含一個或多個突變，所述突變相對于對應(yīng)野生型H-NOX蛋白整體上賦予改變的02或NO配體結(jié)合，并作為生理上相容的哺乳動物血液氣體載體起作用。例如，本文所述的突變H-NOX蛋白。本發(fā)明也提供了包含一種或多種野生型或突變H-NOX蛋白或主要由97其組成的血液代用品。用于配制血液代用品的合適的緩沖劑和其它成分在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。為了減輕或防止被給予藥物組合物的人類對象的免疫反應(yīng)，人H-NOX蛋白(野生型人蛋白質(zhì)或一個或多個突變已經(jīng)被引入其中的人蛋白質(zhì))或其它非抗原性H-NOX蛋白(如，哺乳動物H-NOX蛋白)可以被使用。為了降低或消除從人以外來源衍生的H-NOX蛋白的免疫原性，H-NOX蛋白中的氨基酸可以被突變?yōu)槿薍-NOX中的對應(yīng)氨基酸。例如，非人H-NOX蛋白四級結(jié)構(gòu)表面上的一個或多個氨基酸可以被突變?yōu)槿薍-NOX蛋白中的相應(yīng)氨基酸。H-NOX蛋白的治療應(yīng)用本文所述的任何野生型或突變H-NOX蛋白(如，分離或純化的H-NOX蛋白)或藥物組合物可被用于治療應(yīng)用。對于待治療的具體適應(yīng)征，基于期望的02結(jié)合速率、02解離速率、02結(jié)合的解離常數(shù)、NO穩(wěn)定性、NO反應(yīng)性、自氧化速率、血漿保留時間或前述兩種或多種的任何組合，可以選擇具體的H-NOX蛋白，用于這類應(yīng)用。H-NOX蛋白可以被用于治療心血管疾病、神經(jīng)疾病、腫瘤缺氧、失血或創(chuàng)傷。例如，02-結(jié)合H-NOX蛋白可以被用在其中紅細(xì)胞或血漿膨脹藥目前被使用的大多數(shù)情況。具體而言，H-NOX蛋白可以被用作紅細(xì)胞替代物，用于外傷(如，戰(zhàn)場、災(zāi)難救援或事故)、出血、出血性休克、手術(shù)(如，腹腔動脈瘤手術(shù)、諸如髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的整形外科手術(shù)、或產(chǎn)生高失血的任何其它手術(shù))、血液稀釋、血液延長使用(bloodextensionuseX如，補(bǔ)充自體供應(yīng)(auto-donation))及其中血容量損失或02攜帶能力降低的任何其它情況的治療。創(chuàng)傷修復(fù)應(yīng)用的實例包括輻射后創(chuàng)傷修復(fù)(如高壓氧效果)、手術(shù)后創(chuàng)傷修復(fù)、糖尿病性潰瘍修復(fù)和燒傷。氧結(jié)合H-NOX也可以在自體血液輸回個體之前，在自體血液預(yù)供應(yīng)期間或之后被用于臨時增加02輸送(例如，血液的替代，所述血液在其中個體血液被除去并被保存的手術(shù)過程中被除去，用于在手術(shù)結(jié)束時或恢復(fù)期內(nèi)再輸注)。在一些實施方式中，由于大H-NOX蛋白分子的存在，H-NOX蛋白也作為提供滲透壓的簡單體積擴(kuò)張劑(simplevolumeexpander)起作用。因為細(xì)胞外H-NOX蛋白在血管中的分布不受紅細(xì)胞大小限制，本發(fā)明的H-NOX蛋白可以被用于向紅細(xì)胞不能穿透的區(qū)域輸送02。這些區(qū)域可以包括位于紅細(xì)胞流閉塞下游的任何組織區(qū)域，例如一個或多個血栓、鐮狀細(xì)胞性閉塞、動脈閉塞、外周血管閉塞、血管成形術(shù)球囊、手術(shù)器械、遭受氧不足或缺氧的組織等的下游區(qū)域。此外，所有類型的組織缺血可以使用H-NOX蛋白治療。這樣的組織缺血包括，例如，圍手術(shù)期缺血、中風(fēng)、中風(fēng)前兆(emergingstroke)、短暫性缺血發(fā)作、心肌頓抑和冬眠、急性或不穩(wěn)定心絞痛、心絞痛前兆(emergingangina)和心肌梗死(如ST段抬高心肌梗死)?？梢允褂肏-NOX蛋白治療的其它示例性的心血管指征包括心臟停搏和鐮狀細(xì)胞性貧血。示例性的耙指征包括功能性血紅蛋白缺乏的病癥，例如其中霜要血液替代物或02載體的病癥，包括失血、缺氧等。H-NOX蛋白也可以被用作治療癌癥的放射療法或化學(xué)療法的輔助物。在一些實施方式中，H-NOX蛋白被用作實體瘤(如，具有較差轉(zhuǎn)移前預(yù)后的個體)的放療佐劑，或作為表面腫瘤(如直腸癌、肺癌或皮膚癌，或在另一種可及表面或位置中的癌癥)的PDT療法佐劑。H-NOX蛋白通過在患有貧血的患者中提供額外的氧攜帶能力可以被用于治療貧血。示例性的神經(jīng)性指征包括缺血性中風(fēng)、外傷性腦損傷和脊髓損傷。該方法和組合物適用于急性(向組織或特定部位提供快速氧，如急性心肌梗死、急性局部或全身組織氧和、或輸血)和慢性(如從心肌梗死急性恢復(fù)后)狀況。在多種實施方式中，本發(fā)明以向個體(例如，哺乳動物，如靈長類(如人、猴、大猩猩、猿、狐猴等)、牛、馬、豬、犬科或貓科)輸送02的方法為特征，該方法通過給予需要它的個體足以向該個體輸送02的量的野生型或突變H-NOX蛋白進(jìn)行。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了攜帶或向諸如哺乳動物的個體輸送血液氣體的方法，其包括向該個體(如，哺乳動物)的血液輸送(如輸血等)一種或多種H-NOX組合物的步驟。用于向血液或組織(如，哺乳動物血液或組織)輸送02載體的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。在多種實施方式中，所述H-NOX蛋白是能夠結(jié)合血紅素的脫輔基蛋白或是具有血紅素結(jié)合的全蛋白質(zhì)。在向個體施用H-NOX蛋白之前，H-NOX蛋白可具有或可不具有結(jié)合的血紅素。在一些實施方式中，02在其被輸送到個體之前結(jié)合到H-NOX蛋白。在其它實施方式中，在給予所述個體所述蛋白之前，氧未被結(jié)合到H-NOX蛋白，并且H-NOX蛋白將02從該個體中的一個位置運(yùn)輸?shù)皆搨€體中的另一個位置。本發(fā)明的方法可以被用于治療任何個體。對于本文的應(yīng)用，除非另外清楚指出，如本文所使用，"個體"意思是哺乳動物，包括但不限于，靈長類(如，人、猴、大猩猩、猿、狐猴等)、牛、馬、豬、犬科和貓科。因此，本發(fā)明可用于人類藥物和獸醫(yī)環(huán)境，包括在農(nóng)業(yè)牲畜和家養(yǎng)寵物中的用途。所述個體可已經(jīng)被診斷患有、被懷疑患有或處于發(fā)展某種指征的風(fēng)險，例如心血管疾病、神經(jīng)疾病、缺氧(如，腫瘤缺氧)、失血或創(chuàng)傷。該個體可顯示出一種或多種與該指征相關(guān)的癥狀。該個體可以是遺傳上易于發(fā)展這類病癥或以其它方式易于發(fā)展這類病癥。如本文所使用，"需要它的(inneedthereof)"包括患有病癥或疾病(例如，心血管疾病、神經(jīng)疾病、諸如腫瘤缺氧的缺氧、失血或創(chuàng)傷)或?qū)υ摬“Y或疾病"有風(fēng)險，，的個體。如本文所使用，"有風(fēng)險的"個體是有發(fā)展諸如心血管疾病、神經(jīng)疾病、缺氧(如，腫瘤缺氧)、失血或創(chuàng)傷的病癥風(fēng)險的個體。"有風(fēng)險的"個體可能患有或可能未患有可檢測的疾病或病癥，并且在本文所述的治療方法之前，可能顯示出或可能未顯示出可檢測的疾病。"有風(fēng)險的"表示個體具有一個或多個所99謂的風(fēng)險因素，它們是與疾病或病癥的發(fā)展相關(guān)的并且是本領(lǐng)域己知的可測量參數(shù)。具有一個或多個這些風(fēng)險因素的個體比沒有這些風(fēng)險因素的個體發(fā)展所述疾病或病癥的概率更高。這些風(fēng)險因素包括，但不限于年齡、性別、種族、飲食、先前的疾病史、前體疾病(precursordisease)的存在、基因的(genetic)(即遺傳的(hereditary))考慮因素和環(huán)境暴露。在軍事區(qū)或戰(zhàn)場中或附近存在的手術(shù)，或使個體易于失血(如，血友病)的病癥是失血的示例性風(fēng)險因素。這些方法可以被用于治療或延近02輸送對其有益的任何病癥。"治療(treatment)"或"治療(treating)"表示用于獲得有益或期望結(jié)果——包括臨床結(jié)果——的方法。出于本發(fā)明的目的，有益或期望的結(jié)果包括，但不限于與病癥(例如，但不限于心血管疾病、神經(jīng)疾病、諸如腫瘤缺氧的缺氧、失血或創(chuàng)傷)相關(guān)的癥狀的緩解、與病癥相關(guān)的癥狀程度的減弱、或與病癥相關(guān)的癥狀惡化的預(yù)防。在一些實施方式中，比起與當(dāng)前可用的療法相關(guān)的副作用，使用一種或多種本文公開的蛋白質(zhì)進(jìn)行的治療未伴隨有副作用或伴隨有更少的副作用。如本文所使用，"延遲"疾病或病癥的發(fā)展表示延遲、阻礙、減緩、阻止、穩(wěn)定和/或推遲諸如心血管疾病、神經(jīng)疾病、缺氧(如，腫瘤缺氧)、失血或創(chuàng)傷的疾病或病癥的發(fā)展。延遲可以具有各種時間長度，取決于所述疾病的歷史和/或正治療的個體。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知，實際上，足夠或明顯的延遲可以包括預(yù)防，因為個體不發(fā)展所述疾病或病癥。例如，當(dāng)與不使用所述方法比較時，所述方法可降低在給定時幀中疾病發(fā)展的概率和/或減輕所述疾病在給定時幀中的程度。在一些實施方式中，這樣的比較基于使用統(tǒng)計上顯著個數(shù)的對象進(jìn)行的臨床研究。疾病發(fā)展可以是使用標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)可檢測的。發(fā)展也可指初始不可檢測的疾病的發(fā)展，并包括發(fā)生、復(fù)發(fā)和發(fā)病。具有相對低的對02KD(例如小于約80nM或小于約50nM)的野生型和突變H-NOX蛋白被預(yù)期對治療具有低氧張力的組織(例如腫瘤、一些創(chuàng)傷、或者其中氧張力非常低——如p50低于lmmHg——的其它區(qū)域)特別有用。這類H-NOX蛋白對02的高親和性可提高02保持與H-NOX蛋白結(jié)合的時間長度，由此降低H-NOX蛋白到達(dá)待治療組織之前釋放的02量。盡管不意圖受限于具體理論，無細(xì)胞的紅細(xì)胞替代物作為復(fù)蘇液(resuscitationfluid)的用途被認(rèn)為受02載體的p50影響。例如，被稱為MP4的聚乙二醇化血紅蛋白基02載體似乎比一些較低親和性的血紅歪白基02載體更有效地向微血管輸送02。MP4被報告具有50mmHG的p50(大約100到200nmKD)，并且無基質(zhì)血紅蛋白的p50為14mmHg(400nmKD)。由于MP4能夠在組織中輸送氧(P025到lOmmHg)，可能的是，適于向缺氧組織輸送02的對載體的02親和性小于約5mmHg，并且可能小于約2mmHg，其大致對應(yīng)于小于約80nm的KD。這些值表明MP4已經(jīng)被工程改造為具有比天然血紅蛋白高的02親和性(低p50)。從平衡的觀點來看，這表明高親和性02結(jié)合蛋白在輸送02到低02張力的區(qū)域如外周血管中可能更成功。在一些直接輸送帶有結(jié)合02的H-NOX蛋白到身體中特定部位(如組織、器官、創(chuàng)傷或腫瘤)的實施方式中，對02k。ff比KD值重要，因為02已經(jīng)結(jié)合到所述蛋白質(zhì)(使得k。n較不重要)并且氧需要在身體中特定部位處或附近處被釋放(以受k。ff影響的速率釋放)。在一些實施方式中，當(dāng)H-NOX蛋白在紅細(xì)胞存在的情況下存在于循環(huán)中時，k。ff也是重要的，其中它們促進(jìn)02從紅細(xì)胞的擴(kuò)散，并且可能延長稀釋的紅細(xì)胞向血管中迸一步的點運(yùn)輸02的能力。在輸送在個體血流中循環(huán)的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白在肺中結(jié)合02并在身體的一個或多個其它泣置釋放02。對于這些應(yīng)用中的一些，Ko值比k。ff更重要，因為02結(jié)合處于平衡或接近平衡。在極端血液稀釋的一些實施方式中，當(dāng)H-NOX蛋白是主要的02載體時，KD比k。ff更重要，因為隨著其在循環(huán)系統(tǒng)中運(yùn)動，H-NOX蛋白將不斷地結(jié)合并釋放02。由于血紅蛋白具有14mmHg的p50，紅細(xì)胞(其像電容器一樣起作用)具有30mmHg的p50，并且HBOCs已經(jīng)發(fā)展到在5mmHg到90mmHg的范圍內(nèi)，H-NOX蛋白的最優(yōu)KD范圍可因此對一些應(yīng)用來說在2mmHg到100mmHg之間。H-NOX蛋白也可以被用于成像(imaging)。具體而言，光成像(例如，光學(xué)相干斷層掃描(叩ticalcoherencetomography);參見，例如Villard,J,W.(2002)"UseofaBloodSubstitutetoDetermineInstantaneousMurineRightVentricularThickeningwithOpticalCoherenceTomography,"CVn:"/ato"105:1843-1849，其在此被完整引入作為參考，尤其是關(guān)于光學(xué)相干斷層掃描)被紅細(xì)胞變模糊。用H-NOX溶液灌注使得循環(huán)系統(tǒng)和血管壁的圖像更清晰，因為H-NOX蛋白比紅細(xì)胞小得多。本發(fā)明的H-NOX蛋白和藥物組合物可以通過任何常規(guī)手段給予個體，例如通過經(jīng)口、局部、眼內(nèi)、鞘內(nèi)、肺內(nèi)、氣管內(nèi)或氣溶膠給藥；通過經(jīng)皮或粘膜吸收；或通過注射(如，皮下、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、囊泡內(nèi)或肌內(nèi)注射)。H-NOX蛋白也可以被包含在大體積腸胃外溶液中，用作血液代用品。在示例性的實施方式中，H-NOX蛋白被施用至個體的血液(例如，施用至血管，如靜脈、動脈或毛細(xì)血管)、創(chuàng)傷、腫瘤、缺氧組織或缺氧器官。在一些實施方式中，所述組合物的持續(xù)連續(xù)釋放制劑被使用。H-NOX蛋白的給藥可以進(jìn)行例如數(shù)秒到數(shù)小時的時間期間，這取決于給藥目的。例如，作為血液輸送載體，示例性的給藥時程是盡可能迅速。其它示例性的時程包括大約10、20、30、40、60、90或120分鐘的任何一個。H-NOX溶液作為血液替代物的示例性輸注速率為從約30mL/小時到約13,260mL/小時'例如約100mL/小時到約3,000mL/小時。H-NOX蛋白的示例性總劑量為約900mg/kg，在20分鐘內(nèi)以13,260mL/小時加以施用。對于豬，H-NOX蛋白的示例性總劑量約為18.9克。示例性的給藥頻率包括，但不限于，每周至少l、2、3、4、5、6或7101次(即每天一次)。在一些實施方式中，H-NOX蛋白每天至少給藥2、3、4或6次。H-NOX蛋白可以在例如數(shù)天或數(shù)周的時間段內(nèi)給藥。在一些實施方式中，H-NOX蛋白被給藥更長的時間段，例如數(shù)月或數(shù)年?；诮o藥醫(yī)師的判斷，所述組合物的給藥頻率可以在療程內(nèi)加以調(diào)整。如上文所述，H-NOX蛋白劑量的選擇取決于使用的劑型、給藥的頻率和次數(shù)、治療的病癥和根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定的所要達(dá)到的具體目的。在一些實施方式中，給予人的H-NOX蛋白的有效量在數(shù)克到超過約350克之間。在一些實施方式中，兩種或多種不同的H-NOX蛋白被同時、順序或共同給藥。在一些實施方式中，用于02瑜送的另一種化合物或療法與一種或多種H-NOX蛋白的給藥同時、順序、或共同給予。H-NOX蛋白可以被使用的其它示例性治療應(yīng)用由例如美國專利號6,974,795和6,432,918描述，其在此被完整引入作為參考，特別是關(guān)于02載體的治療應(yīng)用。H-NOX蛋白的工業(yè)應(yīng)用本文所述的H-NOX蛋白和組合物也可以被用于多種體外或工業(yè)應(yīng)用(參見，例如美國專利號6,455,676，其在此被完整引入作為參考，特別是關(guān)于體外或工業(yè)應(yīng)用)。對于特定的應(yīng)用，基于期望的02結(jié)合速率、02解離速率、02結(jié)合的解離常數(shù)、NO穩(wěn)定性、NO反應(yīng)性、自氧化速率、半衰期或前述兩種或多種的任何組合，可以選擇特定的H-NOX蛋白用于這類應(yīng)用。在工業(yè)應(yīng)用的多種實施方式中，H-NOX蛋白是能夠結(jié)合血紅素的脫輔基蛋白或帶有血紅素結(jié)合的全蛋白質(zhì)。H-NOX蛋白可以被用作，例如，分析儀器的參考標(biāo)準(zhǔn)，所述分析儀器需要這類參考標(biāo)準(zhǔn)。通過H-NOX蛋白進(jìn)行的02輸送可以被用于通過維持或提高體外02水平，在細(xì)胞培養(yǎng)中增強(qiáng)細(xì)胞生長。對于這些應(yīng)用，H-NOX蛋白可以被加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，以向所述培養(yǎng)基(和向培養(yǎng)基中的細(xì)胞)輸送02。在一些實施方式中，02在其被加入到細(xì)胞培養(yǎng)基之前被結(jié)合到H-NOX蛋白。在其它實施方式中，02在被加入到細(xì)胞培養(yǎng)基之前沒有被結(jié)合到H-NOX蛋白，并且H-NOX蛋白將02從培養(yǎng)基中的一個位置運(yùn)輸?shù)脚囵B(yǎng)基中的另一個位置?？蛇x地，細(xì)胞可以被遺傳修飾來編碼H-NOX蛋白，以提高由細(xì)胞獲得的02量。例如，表達(dá)目標(biāo)化合物(例如，用在藥物應(yīng)用中的小分子或蛋白質(zhì))的細(xì)胞可以被遺傳修飾，使其尤其是在低02條件下也產(chǎn)生促進(jìn)細(xì)胞生長的H-NOX蛋白(Sullivanefa/.(2006)."TargetedOxygenDeliverywithinHepaticHollowFiberBioreactorsviaSupplementationofHemoglobin-BasedOxygenCarriers,"_fii'ofec/mo/./Vog.22:1374-87;Frey"a/.(2001)."DissectionofCentralCarbonMetabolismofHemoglobin-ExpressingEsc/ze"'c/n.aCo//by13CNuclearMagneticResonanceFluxDistributionAnalysisinMicroaerobicBioprocesses,"yipp/fec/￡>rw>o"we"to/102&Wogy67(2):680-687)。而且，H-NOX蛋白可被用于從需要02去除的溶液中除去02。含有H-NOX蛋白的試劑盒也提供了包含本文所述任何H-NOX蛋白及適當(dāng)包裝的制品和試劑盒。在一些實施方式中，本發(fā)明包括試劑盒，其具有(i)H-NOX蛋白(例如，本文所述的野生型或突變H-NOX蛋白或本文所述的它們的制劑)和(ii)使用該試劑盒向個體輸送02的說明。在多種實施方式中，本發(fā)明以試劑盒為特征，所述試劑盒具有(i)H-NOX蛋白(例如，本文所述的野生型或突變H-NOX蛋白或本文所述的它們的制劑)和(ii)將該試劑盒用于本文所述的任何工業(yè)應(yīng)用(例如，H-NOX蛋白作為分析儀器的參考標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用，所述分析儀器需要這樣參考標(biāo)準(zhǔn)；通過保持或提高體外02水平而增強(qiáng)細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞生長；向溶液中加入02;或從溶液中除去02)的說明。用于本文所述組合物的適當(dāng)包裝在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，并且包括，例如，小瓶(如，密封的小瓶)、器皿、安瓿、瓶、罐、軟包裝(如，密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。這些制品可進(jìn)一步被滅菌和/或密封。也提供了包含本文所述組合物的單位劑型。這些單位劑型能夠以單或多單位劑量被儲存在適當(dāng)?shù)陌b中，并也可被進(jìn)一步滅菌和密封。本發(fā)明的試劑盒中提供的說明通常是在標(biāo)簽或包裝內(nèi)頁(例如，該試劑盒中包含的紙張)上的書面說明，但是機(jī)器可讀的說明書(例如，磁盤或光盤上攜帶的說明書)也是可接受的。涉及H-NOX蛋白應(yīng)用的說明通常包括關(guān)于目的治療或工業(yè)應(yīng)用的劑量、給藥方案和給藥途徑。試劑盒可進(jìn)一步包括選擇適于治療的個體的描述。容器可以是單位劑量、批量包裝(例如，多劑量包裝)或亞單位劑量。例如，含有足夠劑量本文所公開的H-NOX蛋白的試劑盒也可被提供，以向個體提供延長時間段的有效治療，例如，約下列值的任何一個一周、2周、3周、4周、6周、8周、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月或更長時間。試劑盒也可包括多單位劑量的H-NOX蛋白和使用說明，并以足以用于藥房——例如醫(yī)院藥房和配藥藥房(compoundingpharmacies)——存儲和使用的量進(jìn)行包裝。在一些實施方式，試劑盒包括干燥(例如，凍干)組合物，其能夠被重構(gòu)、重懸浮或再水化，通常形成穩(wěn)定的H-NOX蛋白水混懸液。產(chǎn)生H-NOX蛋白的示例性方法本發(fā)明也提供了產(chǎn)生本文所述任何突變H-NOX蛋白的方法。在一些實施方式中，所述方法包括在適合突變H-NOX蛋白產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)具有編碼突變H-NOX蛋白的核酸的細(xì)胞。在多種實施方式中，突變H-NOX也被純化(例如，從細(xì)胞或培養(yǎng)基中純化H-NOX蛋白)。如上文所述，數(shù)個野生型H-NOX蛋白和核酸的序列是已知的并且可以被用于產(chǎn)生本發(fā)明所述的突變H-NOX蛋白和核酸。用于重組H-NOX蛋白的突變、表達(dá)和純化的技術(shù)由例如Boon,E.M.Wa/.(2005)."MolecularBasisForNOSelectivityinSolubleGuanylateCyclase,"iVa,w;-eC/zem/ca/歷o/ogy1:53-59禾口Karow,D.S."a/.(2004年8月10日)"SpectroscopicCharacterizationofTheSolubleGuanylateCyclase-LikeHemeDomainsFromVibrioCholeraeAndThermoanaerobacterTengcongensis,"5/oc/2em/s^743(31):10203-10211中描述，其在此被完整引入作為參考，特別是關(guān)于重組H-NOX蛋白的突變、表達(dá)和純化。這些技術(shù)或其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以被用于產(chǎn)生任何突變H-NOX蛋白。具體而言，本文所述的突變H-NOX蛋白可以通過本領(lǐng)域己知的多種方法產(chǎn)生。突變可以通過氨基酸的化學(xué)修飾發(fā)生在氨基酸水平，或通過編碼給定氨基酸的核苷酸序列的改變發(fā)生在密碼子水平。在蛋白質(zhì)的任何給定位置處的氨基酸取代可以通過改變編碼該氨基酸的密碼子而實現(xiàn)。這可以通過定點誘變，使用下歹U進(jìn)行，例如(i)Amersham技術(shù)(Amershammutagenesiskit,Amersham,Inc.,Cleveland,Ohio),其基于Tavlor,J.W.Wa/.(1985年12月20日)"TheUseofPhosphorothioate陽ModifiedDNAinRestrictionEnzymeReactionstoPrepareNickedDNA,"M/c/e/c7"13(24):8749-8764;Tavlor,J.W.etal.(1985年12月20日)"TheRapidGenerationofOligonucleotide-DirectedMutationsatHighFrequencyUsingPhosphorothioate-ModifiedDNA,"A^cfe/cJ"'^13(24):8765-8785;Nakamaye,K.L."a/.(1986年12月22日)"InhibitionofRestrictionEndonucleaseNciICleavagebyPhosphorothioateGroupsanditsApplicationtoOligonucleotide-DirectedMutagenesis,"jVm由'c'to.14(24):9679-9698;禾口Dente"a/.(1985).在DNACloning,Glover,Ed.,IRLPress,pages791-802中的方法；(ii)Promega試劑盒(PromegaInc.,Madison,Wis.);或(iii)Biorad試劑盒(BioradInc.,Richmond,Calif.)，其基于Kunkel,T.A.(1985年1月)"R叩idAndEfficientSite-SpecificMutagenesisWithoutPhenotypicSelection,"iVoc.iVar/.爿cck/.Sd.82(2):488-492;Kunkel,T.A.(1987)."RapidAndEfficientSite-SpecificMutage加sisWithoutPhenotypicSelection,"/Ue//w<i.y154:367-382;Kunkel,美國專利4,873,192，它們的每一個都在此被引入作為參考，特別是關(guān)于蛋白質(zhì)誘變。誘變也可以通過其它商業(yè)可得的或非商業(yè)手段進(jìn)行，例如使用帶有突變核苷酸的定點誘變的那些手段。定點誘變也可以使用基于PCR的誘變進(jìn)行，例如在Zhengbin"a/.(1992).PCRMethodsandApplications,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork中205-207頁；Jones,D.H.""/.(19卯年2月)."ARapidMethodForSite-SpecificMutagenesisAndDirectionalSubcloningbyUsingthePolymeraseChainReactiontoGenerateRecombinantCircles,"歷她c/zw'拜518(2):178-183;Jones,D.H."a/.(1991年1月)."ARapidMethodForRecombinationAndSite-SpecificMutagenesisbyPlacingHomologousEndsonDNAUsingPolymeraseChainReaction,"10(l):62-66中描述的那些，它們中的每一個都在此被引入作為參考，特別是關(guān)于蛋白質(zhì)誘變。定點誘變也可以使用盒式誘變，利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)進(jìn)行。突變H-NOX核酸可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)被摻入載體，例如表達(dá)載體。例如，限制性酶可以被用于切割突變H-NOX核酸和載體。接著，被切割的突變H-NOX核酸和被切割的載體的匹配末端可以被連接。產(chǎn)生的載體可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如，電穿孔)被插入細(xì)胞(例如，昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞)，用于編碼的H-NOX蛋白的表達(dá)。具體而言，異源蛋白質(zhì)已經(jīng)被表達(dá)在許多生物表達(dá)系統(tǒng)中，例如昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞。因此，合適的生物蛋白表達(dá)系統(tǒng)可以被用于產(chǎn)生大量重組H-NOX蛋白。在一些實施方式中，所述H-NOX蛋白(如，突變或野生型H-NOX蛋白)是分離的蛋白質(zhì)。如本文所使用，"分離的蛋白質(zhì)"表示從一種或多種組分分離的蛋白，所述蛋白質(zhì)與所述組分天然相關(guān)，所述組分包括，例如核酸、脂質(zhì)和其它蛋白質(zhì)。分離的蛋白質(zhì)也不存在于蛋白質(zhì)文庫中，例如具有2、5、10、20、50或更多種不同蛋白質(zhì)的文庫。分離的蛋白質(zhì)也可以通過，例如編碼該蛋白質(zhì)的核酸的表達(dá)或通過該蛋白質(zhì)的化學(xué)合成而獲得。如果希望，H-NOX蛋白可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行純化。如本文所使用，"純化的蛋白質(zhì)"表示，已經(jīng)從在產(chǎn)生蛋白質(zhì)時存在的一種或多種組分中分離的蛋白質(zhì)(例如，突變或野生型H-NOX蛋白)。在一些實施方式中，所述蛋白質(zhì)至少不含按重量計約60%的當(dāng)產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)時存在的其它組分。在多種實施方式中，所述蛋白質(zhì)按重量計至少約75%、90%或99%純。純化的蛋白質(zhì)可以通過，例如從天然來源、重組表達(dá)系統(tǒng)或化學(xué)合成的反應(yīng)混合物進(jìn)行純化(如，提取)而獲得。示例性的純化方法包括免疫沉淀、柱層析例如免疫親和層析、磁珠免疫親和純化、和使用板結(jié)合抗體淘選、以及普通技術(shù)人員己知的其它技術(shù)。純度可以通過任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行測定，例如，通過柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析。在一些實施方式中，純化的蛋白質(zhì)被摻入本發(fā)明所述的藥物組合物或被用于本發(fā)明所述的方法。本發(fā)明所述的藥物組合物可具有添加劑、載體或除純化的蛋白質(zhì)以外的其它組分。實施例實施例一一其旨在純粹是本發(fā)明的示例并因此不應(yīng)該被認(rèn)為以任何方式限制本發(fā)明——還描述并詳述了上面討論的本發(fā)明的方面和實施方式。這些實施例并不旨在表示以下實驗是所進(jìn)行的全部的或唯一的實驗。除非另外說明，溫度以攝氏度表示并且壓力等于或接近大氣壓。105實施例1:野生型和突變H-NOX蛋白的產(chǎn)生使用標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生、表達(dá)和純化野生型和突變H-NOX蛋白，基本上如Boon,E.M."a/.(2005)."MolecularBasisForNOSelectivityinSolubleGuanylateCyclase,"脂,C7簡'ca/S油gy1:53-59禾口Karow,D.S."a/.(August10,2004)"SpectroscopicCharacterizationofTheSolubleGuanylateCyclase-LikeHemeDomainsFromVibrioCholeraeAndThermoanaerobacterTengcongensis，"歷oc/zewWo;43(31):10203-10211中所描述，它們在此都被完整引入作為參考，特別是關(guān)于重組H-NOX蛋白的誘變、表達(dá)和純化。使用來自Strategene(LaJolla,CA)的QuickChange⑧方案進(jìn)行誘變。蛋白質(zhì)在細(xì)胞培養(yǎng)中的表達(dá)及后續(xù)的蛋白質(zhì)純化根據(jù)Karow,D.S."a/.(2004年8月10曰)"SpectroscopicCharacterizationofTheSolubleGuanylateCyclase-LikeHemeDomainsFromVibrioCholeraeAndThermoanaerobacterTengcongensis，"傷oc/zew^y43(31》10203-10211所述進(jìn)行。實施例2:突變H-NOX蛋白作為氧輸送載體的表征幼力學(xué)Kd:koff與kon的比率測定野生型和突變H-NOX蛋白的幼力學(xué)Kd信，基本上如Boon,E.M.cr/.(2005)."MolecularBasisForNOSelectivityinSolubleGuanylateCyclase,"Wa化wC/z，/ca/所o/ogy1:53-59所述進(jìn)行，其在此被完整引入作為參考，特別是涉及02結(jié)合速率、02解離速率、02結(jié)合的解離常數(shù)、自氧化速率和NO解離速率。U(D2翁合遂萄使用閃光光解法在20。C下測量02對血紅素的結(jié)合。由于非?？斓某蓪χ亟M動力學(xué)(geminaterecombinationkinetics),不可能閃蒸出(flashoff)Fe11—02復(fù)合體；因此，F(xiàn)e11-CO復(fù)合體用560nm的激光(Hewlett-Packard,PaloAlto,CA)進(jìn)行閃光光解，產(chǎn)生5-配位的Fe"中間體，在不同波長下追蹤分子02與該Fe"中間體的結(jié)合。通過用lOmM連二亞硫酸鹽進(jìn)行厭氧還原，接著在PD-lO柱(Millipore，Inc.,Billerica,MA)上進(jìn)行脫鹽而制備蛋白質(zhì)樣品。該樣品隨后在受控氣氛的石英小池(quartzcuvette)中在50mMTEA、50mMNaCl、pH7.5的緩沖液中被稀釋到20^M的血紅素，石英小池的尺寸為100pL到lmL并且徑長為lcm。CO氣體在該小池的頂部空間流動10分鐘，以形成Fe"-CO復(fù)合物，該復(fù)合物的形成通過UV-可見光譜(Soret最大值為423nm)加以確認(rèn)。該樣品隨后被用于測量閃光光解后但仍在1大氣壓的CO氣體下的CO-再結(jié)合動力學(xué)，或在閃光光解之前，它被打開并在空氣中攪拌30分鐘，充分對緩沖液充氧，以觀察Or再結(jié)合事件。在多個波長對時間下，觀察02與血紅素的結(jié)合。使用IgorPro軟件(Wavemetrics,Inc.,Oswego,OR;最新2005版)將這些跡線以單指數(shù)擬合。該速率獨(dú)立于觀測波長，但依賴于02濃度。UV-可見光光譜從頭到尾被使用，以確認(rèn)所有的復(fù)合物和中間體(Cary3K,Varian,Inc.PaloAlto，CA)。瞬時吸收數(shù)據(jù)使用Dmochowski，I.J."a/.(2000年8月31曰)"EnantiomericDiscriminationofRu-SubstratesbyCytochromeP450cam,".//朋rg歷o^柳.SI(3):221-228所述的儀器進(jìn)行采集，其在此被完整引入作為參考，特別是關(guān)于儀器操作。該儀器具有20ns的反應(yīng)時間，并且數(shù)據(jù)以200兆樣每秒(megasamples-1)的速率被數(shù)字化。為了測量k。ff，蛋白質(zhì)(5pM血紅素)的Fe"-02復(fù)合物，在無氧的50mMTEA、50mMNaCl、pH7.5的緩沖液中稀釋，與等體積含有各種濃度連二亞硫酸鹽和/或飽和CO氣體的相同緩沖液(無氧)迅速混合。在裝備有設(shè)置為20'C的NeslabRTE-100恒溫浴的HI-TECHScientificSF-61停流分光光度計上獲取數(shù)據(jù)(TGKScientificLTD.,BradfordOnAvon,UnitedKingdom)。02從血紅素的解離被監(jiān)控為在437nm——Fe11-Fe^-Ch差示光譜中的最大值——或425nm——Fe"-Fe"-CO差示光譜中的最大值——處吸光度的增加。最終的跡線使用軟件擬合成單指數(shù)，該軟件是所述儀器的一部分。每個實驗進(jìn)行最少6次，并且得到的速率被平均。測量的解離速率獨(dú)立于連二亞硫酸鹽濃度(測試了100、50、25、10、5和2.5mM連二亞硫酸鹽)且獨(dú)立于作為被還原物質(zhì)的阱(trap)的飽和CO,兩者都在lOmM連二亞硫酸鹽存在和不存在的情況下。通過使用上述k。ff與k。n的測量結(jié)果計算k。ff與k。n的比率，確定動力學(xué)Kd。#,麵為測量計算的KD，對如上所述獲得的k。ff值和動力學(xué)Ko值進(jìn)行繪圖。k必與動力學(xué)KD之間的線性關(guān)系通過方程(y=mx+b)加以定義。然后，k。ff值沿圖線插入，以使用Excel:MAC2004(Microsoft,Redmond,WA)得到計算的Ko。在沒有測量的k。n的情況下，該插值提供了使k。ff與Ko相關(guān)的方法。自氧化速率為測量自氧化速率，蛋白質(zhì)樣品被無氧還原，隨后在有氧的50mMTEA、50mMNaCl、pH7.5的緩沖液中被稀釋到5pM血紅素。然后，這些樣品在裝備有設(shè)置到37。C的NeslabRTE-100恒溫浴的Cary3E分光光度計中溫育，并定期掃描(Cary3E,Varian,Inc.,PaloAlto,CA)。通過在對時間繪制的并使用Excel:MAC2004(Microsoft,Redmond,WA)以單指數(shù)擬合的Fem-Fe"差示光譜中的最大值與最小值之間的差確定自氧化速率。1與NO反應(yīng)的速率使用在緩沖液A中以2pM濃度制備的純化蛋白(7YWTHNOX、7>Y140HHNOX和智人血紅蛋白(HsHb))和在緩沖液A中以200pM制備的NO測量NO反應(yīng)性(緩沖液A:50mMHepes,pH7.5、50mMNaCl)。在裝備有設(shè)置為20。C的NeslabRTE-100恒溫浴的HI-TECHScientificSF-61停流分光光度計上獲取數(shù)據(jù)(TGKScientificLTD.,BradfordOnAvon,英國)。所述蛋白質(zhì)與NO以1:1的比例迅速混合，混合時間0.00125秒。使用軟件將最大變化的波長擬合成單指數(shù)，該軟件是光度計的一部分，主要測量NO氧化的限速步驟。該反應(yīng)的終產(chǎn)物對于H-NOX蛋白是三價鐵-NO，而對于HsHb為三價鐵-水合物。p50測量如果希望，突變或野生型H-NOX蛋白的p50值可以如Guarnone,R.W(1995年9月/10月)."PerformanceCharacteristicsofHemox-AnalyzerForAssessmentofTheHemoglobinDissociationCurve,"/7ae廳/o/(9g/"/80(5):426-430所述加以測量，其在此被完整引入作為參考，特別是關(guān)于p50值的測量。使用血氧分析儀(HemOx-Analyzer)測定p50值。測量室起始于0%氧并緩慢上升，遞增至100%氧。該室中的氧探針測量氧飽和百分比。第二探針(UV-可見光)測量兩個吸收波長，調(diào)諧至血紅素蛋白(如，諸如與血紅素復(fù)合的H-NOX的蛋白質(zhì))的UV-可見光光譜的a和p峰。這些吸收峰隨著血紅素蛋白結(jié)合氧而線性升高。然后，繪制從未結(jié)合至100%結(jié)合的百分?jǐn)?shù)變化對氧百分?jǐn)?shù)值的圖，以產(chǎn)生曲線。p50是該曲線上的點，在該點50%血紅素蛋白結(jié)合氧。具體而言，血氧-分析儀(Hemox-Analyzer)(TCSScientificCorporation,NewHope,PA)通過將50pL血液或血紅素蛋白暴露于提高的氧氣分壓并用氮?dú)馐蛊淙パ?，來確定氧血紅素蛋白(oxyhemoprotein)解離曲線(oxyhemoproteindissociationcurve,ODC)。Clark氧電極檢測氧張力的變化，該變化被記錄在x-y坐標(biāo)記錄儀的x軸上。所產(chǎn)生的氧血紅素蛋白分?jǐn)?shù)的增長通過雙波長分光光度法在560nm和576nm同時監(jiān)測，并顯示在y軸上。從前中靜脈(antemedialvein)取血樣，用肝素抗凝，并在濕冰上保持在4。C，直到測定。在5pL的Hemox溶液中稀釋50pL全血，該溶液是制造商提供的緩沖液，其保持溶液的pH值在7.4±0.01。該樣品-緩沖液被吸入作為血氧-分析儀的一部分的小池，并且混合物的溫度被平衡并帶到37。C;該樣品隨后用空氣充氧到100%。調(diào)整p02值之后，該樣品用氮?dú)馊パ?；在去氧的過程中，曲線被記錄在圖紙上。p50值使用作為血氧-分析儀一部分的軟件在x軸上外推為這樣的點，在該點上02飽和度為50%。完成記錄所需的時間約為30分鐘。任何H-NOX蛋白的p50值可以與血紅蛋白的p50值比較，作為H-NOX蛋白相比于血紅蛋白對02的相對親和性的指示。表13列出了先前報告的血紅蛋108白的p50值。表13.血紅蛋白突變體及其報告的氧親和性<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>粘度測量如果希望，H-NOX溶液的粘度可以使用帶有的CPE-40圓錐軸(conespindle)的錐板式流變計(型號DV-III,Brookfield;Middleboro,MA)以200/s的剪切速率進(jìn)行測量。在血液稀釋氧輸送實驗中給予的粘度在1到4厘泊(cP)之間的溶液被報告為安全(Winslow，R.M."a/.(2004年10月)."ComparisonofPEG-ModifiedAlbuminAndHemoglobininExtremeHemodilutionintheRat,",/卻p/尸/油/.97(4):1527-1534，美國專利號6,974,795和6,432,918，它們中的每一個都在此被完整引入作為參考，特別是關(guān)于粘度測量)。因此，在一些實施方式中，H-NOX蛋白溶液的粘度在1禾B4cP之間。膠體滲透壓測量如果希望，膠體滲透壓可以使用膠體滲透壓計(型號4420，Wescor;Logan,UT)，根據(jù)制造商的說明進(jìn)行測量。測量膠體滲透壓的示例性方法在Vandegriff,K,D."fl/.(1997年11月)."ColloidOsmoticPropertiesofModifiedHemoglobins:ChemicallyCross-LinkedVersusPolyethyleneGlycolSurface-Conjugated,"d肌69(l):23-30，萬維網(wǎng)地址為"anaesthesiamcq.com/FluidBook/fl2_4.php";美國專利號6,974,795和6,432,918中進(jìn)行描述，它們中的每個都在此被完整引入作為參考，特別是關(guān)于測量膠體滲透壓。在血液稀釋氧輸送實驗中給予的、膠體滲透壓在20到50mmHg之間的溶液被報告為安全(Winslow,R.M."a/.(2004年10月)."ComparisonofPEG-ModifiedAlbuminAndHemoglobininExtremeHemodilutionintheRat，"■/P/yAs/o/.97(4):1527-1534)。因此，在一些實施方式中，H-NOX蛋白溶液的膠體滲透壓在20和50mmHg之間。實施例3:02載體H-NOX突變體的手術(shù)模型一組02載體H-NOX突變體和在大鼠中極端血液稀釋情況下的H-NOX的比較為評估H-NOX突變體在手術(shù)模型中運(yùn)輸02的能力，對已建立的方法(Winslow,R.M.a/.(October2004)."ComparisonofPEG-ModifiedAlbuminAndHemoglobininExtremeHemodilutionintheRat,"/^j!7p/.尸/^w'o/.97(4):1527-1534，其在此被完整引入作為參考，特別是關(guān)于手術(shù)模型)的改編可以使用連續(xù)交換輸血(continuousexchangetransfusion)在大鼠中進(jìn)行。馴化的雄性Sprague-Dawley大鼠通過肌肉內(nèi)注射含有氯胺酮(ketamine)(40mg/kg)、乙酰丙嗪(ac鄰romazine)(0.75mg/kg)和甲苯噻嗪(xylazine)(3mg/kg)的混合物的嚙齒類動物混合物(rodentcocktail)進(jìn)行麻醉。由聚乙烯管制成的導(dǎo)管被植入兩根股骨動脈和一根股骨靜脈。該導(dǎo)管在尾基部被表面化并被尾鞘覆蓋，用于保護(hù)和將來進(jìn)入。手術(shù)創(chuàng)口閉合后，動物回到它們的籠中，并在實驗開始前使它們醒來并恢復(fù)24h。在恢復(fù)期，動物可以自由獲取食物和水。對于血液動力學(xué)的測量，股動脈導(dǎo)管通過活塞和23號針連接到壓力傳感器，并且以100Hz連續(xù)采樣動脈壓。在Bayer型號248血?dú)夥治鰞x(blood-gasanalyzer)中，使用IOO卞I肝素化的血液樣品測量動脈pH、PC02和P02。使用YSI乳酸鹽分析儀(YellowSpringsInstitute,YellowSprings,OH)，在股動脈血中測量乳酸?？侰02、標(biāo)準(zhǔn)碳酸氫鹽(HCO)和過剩堿(BE)從PC02、pH和Hb濃度進(jìn)行計算。完全清醒的動物(對于每個治療組11=5)被置于Plexiglas限制器中。動脈和靜脈導(dǎo)管分別用200和lOOpl的肝素化鹽水(100U/ml)沖洗。動脈和靜脈導(dǎo)管被連接到輸注泵(Labconco型號4262000,KansasCity,MO)，并且交換輸血以0.5ml/min的速率進(jìn)行100分鐘。因此，被交換溶液的總體積為50ml或2.5個血容量。操作蠕動泵，以便血液以與輸注測試物完全相同的速率被除去。測試溶液在輸入前在水浴中被加熱到37。C并在輸注過程中通過加熱墊保溫。在100分鐘交換期的結(jié)束時，存活的動物在安樂死之前被觀察額外的70分鐘。每10分鐘采集血樣(0.3ml)，用于血液學(xué)和血-氣分析。治療組包括被給予一種或多種H-NOX蛋白的動物，所述H-NOX蛋白先前已經(jīng)被測試了NO或02解離常數(shù)、NO-反應(yīng)性、穩(wěn)定性、生理相容性或前述兩種或多種的組合。紅細(xì)胞H-NOX和噴他淀粉(pentastarch)治療組分別提供了陽性和陰性對照。110客觀終末點(Objectiveendpoint)包括存活和厭氧代謝的起始，以酸堿紊亂和乳酸積累為信號。與對照組相比存活率提高(例如，產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)上顯著增加的存活率)的H-NOX蛋白可用于在極端血液稀釋的條件下氧和組織。這類H-NOX蛋白被預(yù)期也可用于治療其它輸送02對其有益的指征。實施例4:02載體H-NOX突變體的外傷模型比較02載體H-NOX突變體和重組血紅蛋白溶液對出血性休克大鼠模型中血壓、腸血流和腸充氧(GutOxygenation)的效果為評估H-NOX突變體在外傷模型中運(yùn)輸02的能力，對己建立的方法(Winslow,R.M."a/.(January2005)."EffectsofRecombinant-HemoglobinSolutionsrHb2.0andrHbl.lonBloodPressure,IntestinalBloodFlow,AndGutOxygenationinaRatModelofHemorrhagicShock,"../丄c/，C7/"Mg(i.145(l):21-32，其在此被完整引入作為參考，特別是關(guān)于外傷的動物模型)可以在固定壓力(40mmHg)、出血性休克并復(fù)蘇的大鼠模型中進(jìn)行。利用腹膜內(nèi)注射90mg/kg氯胺酮、0.5mg/kg美托咪定(medetomidine)和0.005mg/kg硫酸阿托品的混合物，麻醉Wistar大鼠。使用由置于大鼠直腸內(nèi)的溫度探針熱控制的加熱墊，保持每只大鼠的體溫在36.5'C和37.5t:之間。此外，使用置于大鼠上方40到50cm處的陶瓷加熱燈補(bǔ)償熱量損失。對于機(jī)械換氣，進(jìn)行了氣管切開術(shù)并且將3.5-cm長的6F聚氯乙烯管置入氣管內(nèi)0.5cm并用縫合線固定。改造的嬰兒呼吸機(jī)被用于給動物通氣。為使通氣液(ventilatoryfluid)損失最小，濕氣過濾器被置于通氣管之前。該過濾器的側(cè)口被用于利用二氧化碳分析儀(capnograph)監(jiān)控呼氣末(end-tidal)的C02。調(diào)節(jié)諸如吸氣相(0.25-0.35)和呼吸率(50-75次呼吸/分鐘)的通氣參數(shù)，以在手術(shù)期間保持動脈PC02值在35和45mmHg之間，如通過采集基線血液樣品所檢測到的。直到實驗結(jié)束，沒有進(jìn)行進(jìn)一步的調(diào)節(jié)。使用0.5x0.9-mm聚乙烯靜脈導(dǎo)管對血管進(jìn)行插管。所述導(dǎo)管充滿含有25IU肝素的0.9%NaCl溶液。右側(cè)頸動脈導(dǎo)管被截短到20cm并安裝到壓力傳感器，用于平均動脈壓(MAP)和心率的連續(xù)監(jiān)控。使用下式計算MAP:(收縮壓-舒張壓)/3+舒張壓。此外，頸靜脈被插入導(dǎo)管，以利用15mL/kg/hRinger's乳酸鹽和5mL/kg/h維持麻醉液(maintenanceanesthesia)(在Ringer's乳酸鹽中的50mg/kg/h氯胺酮)進(jìn)行流體支持(fluidsupport)。股動脈被插入導(dǎo)管，以進(jìn)行抽血和動脈血-氣取樣。股靜脈被插入導(dǎo)管，用于復(fù)蘇液的輸入和靜脈血-氣采樣。對每只大鼠進(jìn)行正中線剖腹術(shù)(midlinelaparotomy):腹部用莎倫包裝膜(Saranwrap)覆蓋，防止體液的揮發(fā)。在保鮮膜上刺出小孔，以允許光纖進(jìn)入，用于微循環(huán)P02測量。回盲腸靜脈(ileocecalvein)也用0.8-mm聚乙烯導(dǎo)管進(jìn)行插管，用于腸系膜靜脈血采樣。m使用先前描述的氧依賴性鈀-卟啉熒光猝滅技術(shù)測量腸道微血管P02。2.5到3小時的手術(shù)后，與HSA溶液(50mg，在10mL4。/o的白蛋白溶液、4mmol/L鈀-P卜啉溶液中，用HC1調(diào)整pH到7.4)偶聯(lián)(coupled)的鈀(11)中位-四(4-羧基-苯基)葉啉以12mg/kg體重的劑量、9.6mL/kg/hr的速率輸注15分鐘。用光脈沖激發(fā)鈀-P卜啉引起具有及時衰變(decayintime)的磷光發(fā)射，所述磷光發(fā)射與氧濃度在數(shù)量上相關(guān)(Vanderkooi,J.M.Wa/.(April25,1987)"AnOpticalMethodforMeasurementofDioxygenConcentrationBasedUponQuenchingofPhosphorescence,"/.及W.CT^m.262(12):5476-5482)。使用置于回腸近側(cè)部上方的光纖進(jìn)行微血管P02測量。閃光燈在輸入鈀-卟啉之前被記錄，并且反巻積算法(deconvolutionalgorithm)被用于計算氧濃度。在輸注鈀-卟啉溶液和45分鐘穩(wěn)定之后，從股動脈、股靜脈和腸系膜靜脈中取出基線血液樣品(0.2mL/樣品)，用于血-氣測定。在血-氣分析儀和血氧分析儀中分析血液樣品。通過在含肝素(25IU/mL血液)的3-mL注射器中以約lmL/min的速率從股動脈中抽取血液若干分鐘，直到MAP為大約40mmHg，誘導(dǎo)出血性休克。使用進(jìn)一步的血液抽取或血液輸入，保持MAP在這一水平45分鐘。正好在復(fù)蘇之前，從股動脈、股靜脈和腸系膜靜脈抽取血液樣品(0.2mL/樣品)，用于血-氣測定，并且相似量的大鼠血液(出血性休克期間采集的)被再輸注。該休克期之后，動物被隨機(jī)分配到8個不同的復(fù)蘇組之一。使用野生型或突變H-NOX蛋白或使用另一種02載體，例如重組血紅蛋白溶液rHbl.l(Baxter)、rHb2.0(Baxter)、無血清血紅蛋白(標(biāo)準(zhǔn)溶液)、MP4(Sangart)、hemopure(—種攜氧藥)(Biopure)或多聚體血紅蛋白(polyheme)—(NorthfieldLabs)(Raat,N.J."W.(January2005).,〃,a6dM"/.145(1):21-32;儲液濃度100mg/mL)進(jìn)行復(fù)蘇，所有都以20mL/kg(2g/kg)的劑量、60mL/kg/h的速率進(jìn)行輸注。以相同劑量(20mL/kg)和速率輸注的HSA(B.4。/。白蛋白溶液)被用作復(fù)蘇期間對壓力和流動的體積效應(yīng)的對照。當(dāng)復(fù)蘇完成時，在30、60、90和120分鐘后從股動脈、股靜脈和腸系膜靜脈中抽取0.2-mL血液樣品，并且每次輸回相似量的大鼠血液。與由另一種02載體(例如rHbl.l、rHb2.0、無血清血紅蛋白、MP4、hemospan或多聚體血紅蛋白)引起的或由滲透上(oncotically)匹配的HAS引起的相比，復(fù)蘇后引起相同或較小的(例如實質(zhì)性或明顯較小的)全身血管收縮、相同或較小的MAP升高、或相同或較小的腸系膜血管阻力(MVR)升高的H-NOX被用于治療出血性休克。這些H-NOX蛋白被預(yù)期也可用于治療其它輸送02對其有益的指征。前述實施例和詳細(xì)描述通過闡述的方式而非通過限制的方式給出。本說明書中引用的所有出版物、專利申請和專利通過引用并入本文，如同每個單獨(dú)的出版物、專利申請或?qū)＠痪唧w地并各自地被指出通過引用而并入。盡管出于清楚理解的目的，前述發(fā)明已經(jīng)通過舉例說明和實施例的方式以一些細(xì)節(jié)進(jìn)行了描述，但考慮根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言非常明顯的是，可以對本發(fā)明進(jìn)行某些變化和修改而不背離所附權(quán)利要求書的精神或范圍。除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義是本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的那些。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也將理解，與本文所描述的那些相似或等價的任何方法及材料也可以用于實施或測試本發(fā)明。對于本文中的使用，除非另外明確指出，術(shù)語"一種/一個(a)"、"一種/一個(an)"及類似表達(dá)的使用指的是一個(種)或多個(種)。提到"大約"，本文的值或參數(shù)包括(并描述了)涉及該值或參數(shù)本身的實施方式。例如，提到"大約X"的描述包括"X"的描述。應(yīng)該理解，本文描述的本發(fā)明的方面和實施方式包括"包含(comprising)"、"由......組成(consisting)"和"主要由......組成(consistingessentiallyof)"的方面和實施方式。權(quán)利要求1.一種藥物組合物，其包含(i)藥學(xué)上可接受量的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在血紅蛋白的O2解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍，和(ii)藥學(xué)上可接受的載體。2.權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約100nM到約255nM之間。3.權(quán)利要求1和2任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC小于約80nM。4.權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20。C在約20nM到約75nM之間。5.權(quán)利要求1-4中任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少100倍。6.權(quán)利要求5中所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少1,000倍。7.權(quán)利要求l-6任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在20'C小于或等于約0.65s—'。8.權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在20°C在約0.21s"到約0.65s—1之間。9.權(quán)利要求l-6任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在2(TC在約1.35s"到約2.9s—1之間。10.權(quán)利要求1-9任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白在4°C下在空氣中是穩(wěn)定的。11.權(quán)利要求l-10任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為突變蛋白。12.權(quán)利要求1-11任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個遠(yuǎn)側(cè)袋突變。13.權(quán)利要求l-12任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個不在遠(yuǎn)側(cè)袋中的突變。14.權(quán)利要求1-13任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變02解離常數(shù)、對氧k。ff、血紅素自氧化速率和/或NO反應(yīng)性。15.權(quán)利要求l-14任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白選自野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX15A、騰沖嗜熱厭氧菌H-N0XI5L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L-P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9Y、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9N、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74E、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y-Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXP115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXR135Q、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140A、騰沖嗜熱厭氧菌175F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌I75F、騰沖嗜熱厭氧菌L144F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌L144F、嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOXF142Y、野生型嗜肺軍團(tuán)菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOX、嗜肺軍團(tuán)菌2F9W-F142Y、野生型脫硫脫硫弧菌H-NOX、脫硫脫硫弧菌H-NOX(728-899)、脫硫脫硫弧菌H-NOXY139L、野生型智人piH-NOX、智人卩1I145Y、智人卩1(1-385)、智人pi(l-385)I145Y、智人(31(1-385)1145H、智人(31(1-194)、智人卩1(1-194)I145Y、智人卩1(1-194)L9W陽I145Y、智人(32(1-217)、智人卩2(1-217)I142Y、智人plH-NOXH105G、智人(31H-NOXH105F、野生型褐鼠卩l(xiāng)H-NOX、褐鼠卩1(1-385)、褐鼠(31(1-385)1145Y、褐鼠(31(1-385)U45H、褐鼠(31(1-194)、褐鼠|31(1-194)1145Y、褐鼠(31(1-194)L9W-I145Y、褐鼠卩2(1-217)、褐鼠卩2(1-217)I142Y、褐鼠卩l(xiāng)H-NOXH105G、褐鼠piH-NOXH105F、肉毒梭菌H-NOX(l-175)、肉毒梭菌H-NOX(l-186)、野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-183)、野生型線蟲GCY-35H-NOX、線蟲H-NOXGCY-35(l-252)、野生型黑腹果蠅plH-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PA、野生型黑腹果蠅CG14886、野生型黑腹果蠅CG4154;野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、野生型小鼠H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型家牛H-NOX、野生型褐鼠；野生型非洲爪蟾H-NOX、野生型青鏘H-NOX、野生型0.c腦Vaft^H-NOX、野生型紅鰭東方飩H-NOX、野生型岡比亞按蚊H-NOX、野生型煙草天蛾H-NOX;野生型線蟲gcy-31、線蟲gcy-32、野生型線蟲gcy-33、野生型線蟲gcy-34、野生型線蟲gcy-35、野生型線蟲gcy-36、野生型線蟲gcy-37;野生型霍亂弧菌H-NOX、野生型費(fèi)氏弧菌H-NOX和野生型點形念珠藻H-NOX。16.權(quán)利要求l-15任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白是哺乳動物蛋白質(zhì)或衍生自哺乳動物蛋白質(zhì)。17.權(quán)利要求16所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為人蛋白或衍生自人蛋白。18.權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其中所述人蛋白質(zhì)是pi或衍生自卩l(xiāng)。19.權(quán)利要求l-15任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為細(xì)菌蛋白或衍生自細(xì)菌蛋白。20.權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為騰沖嗜熱厭氧菌蛋白或衍生自騰沖嗜熱厭氧菌蛋白。21.權(quán)利要求1-20任一項所述的藥物組合物，其中氧結(jié)合到所述H-NOX蛋白。22.權(quán)利要求1-21任一項所述的藥物組合物，其包含一種或多種含有所述H-NOX蛋白的脂質(zhì)體或納米顆粒。23.權(quán)利要求1-22任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白是權(quán)利要求279-397中任一項所述的突變H-NOX蛋白。24.—種藥物組合物，其包含(i)藥學(xué)上可接受量的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約lnM到約lmM之間，并且其中所述1^0乂蛋白的1^0反應(yīng)性在201:小于約7003-1，禾叩i)藥學(xué)上可接受的載體。25.權(quán)利要求24所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約2nM到約50^M之間。26.權(quán)利要求25所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約50nM到約10|_iM之間。27.權(quán)利要求25所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20"C在約20nM到2pM之間。28.權(quán)利要求24-27任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍。29.權(quán)利要求28中所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少100倍。30.權(quán)利要求29中所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少1000倍。31.權(quán)利要求24-30任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性小于約1.0s—]。32.權(quán)利要求24-31任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在20。C在約1.0s"到約16.0s—1之間。33.權(quán)利要求24-32任一項所述的藥物組合物，其中所述蛋白的對氧k。ff在2(TC小于或等于約0.65s"。34.權(quán)利要求33所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在20。C在約0.21s-'到約0.65s"之間。35.權(quán)利要求24-34任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約lh—1。36.權(quán)利要求24-35任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約20nM到2pM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在20。C在約1.0s"到約16.0s"之間。37.權(quán)利要求24-36任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20。C在約20nM到2pM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37'C小于約lh—'。38.權(quán)利要求24-37任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約20nM到2pM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20'C小于約700s—1。39.權(quán)利要求24-38任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在20。C在約1.0s-1到約16.0s—1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37'C小于約lh—、40.權(quán)利要求24-39任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在20。C在約1.0s-1到約16.0s—1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20'C小于約700s"。41.權(quán)利要求24-40任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約lh—1，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在2(TC小于約700s-1。42.權(quán)利要求24-41任一項所述的藥物組合物，其中血紅素結(jié)合到所述H-NOX蛋白。43.權(quán)利要求24-42任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為突變蛋白。44.權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個遠(yuǎn)側(cè)袋突變。45.權(quán)利要求43和44的任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個不在遠(yuǎn)側(cè)袋中的突變。46.權(quán)利要求24-45任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變02解離常數(shù)、對氧k。ff、血紅素自氧化速率和/或NO穩(wěn)定性。47.權(quán)利要求24-46任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變NO反應(yīng)性。48.權(quán)利要求24-47任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白選自野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX15A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L-P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9Y、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9N、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74E、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y-Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXP115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXR135Q、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140A、騰沖嗜熱厭氧菌I75F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌I75F、騰沖嗜熱厭氧菌L144F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌L144F、嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOXF142Y、野生型嗜肺軍團(tuán)菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOX、嗜肺軍團(tuán)菌2F9W-F142Y、野生型脫硫脫硫弧菌H-NOX、脫硫脫硫弧菌H-NOX(728-899)、脫硫脫硫弧菌H-NOXY139L、野生型智人(31H-NOX、智人卩1I145Y、智人卩1(1-385)、智人(31(1-385)1145Y、智人pi(l-385)1145H、智人卩1(1-194)、智人(31(1-194)H45Y、智人卩1(1-194)L9W-I145Y、智人卩2(1-217)、智人(32(1-217)1142Y、智人卩l(xiāng)H-NOXH105G、智人卩l(xiāng)H-NOXH105F、野生型褐鼠(31H-NOX、褐鼠(31(1-385)、褐鼠卩1(1-385)1145Y、褐鼠(31(1-385)1145H、褐鼠卩1(1-194)、褐鼠卩1(1-194)I145Y、褐鼠卩1(1-194)L9W-I145Y、褐鼠卩2(1-217)、褐鼠卩2(1-217)I142Y、褐鼠卩l(xiāng)H-NOXH105G、褐鼠(31H-NOXH105F、肉毒梭菌H-NOX(l-175)、肉毒梭菌H-NOX(l-186)、野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-183)、野生型線蟲GCY-35H-NOX、線蟲H-NOXGCY-35(l-252)、野生型黑腹果蠅plH-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PA、野生型黑腹果蠅CG14886、野生型黑腹果蠅CG4154;野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、野生型小鼠H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型家牛H-NOX、野生型褐鼠；野生型非洲爪蟾H-NOX、野生型青賄H-NOX、野生型(9.c固》atoH-NOX、野生型紅鰭東方魚屯H-NOX、野生型岡比亞按蚊H-NOX、野生型煙草天蛾H-NOX;野生型線蟲gcy-31、線蟲gcy-32、野生型線蟲gcy-33、野生型線蟲gcy-34、野生型線蟲gcy-35、野生型線蟲gcy-36、野生型線蟲gcy-37;野生型霍亂弧菌H-NOX、野生型費(fèi)氏弧菌H-NOX和野生型點形念珠藻H-NOX。49.權(quán)利要求24-48任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為哺乳動物蛋白或衍生自哺乳動物蛋白。50.權(quán)利要求49所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為人蛋白或衍生自人蛋白。51.權(quán)利要求50所述的藥物組合物，其中所述人蛋白為(31或衍生自P1。52.權(quán)利要求24-48任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為細(xì)菌蛋白或衍生自細(xì)菌蛋白。53.權(quán)利要求52所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為騰沖嗜熱厭氧菌蛋白或衍生自騰沖嗜熱厭氧菌蛋白。54.權(quán)利要求24-53任一項所述的藥物組合物，其中氧結(jié)合到所述H-NOX蛋白。55.權(quán)利要求24-54任一項所述的藥物組合物，其包含一種或多種包含所述H-NOX蛋白的脂質(zhì)體或納米顆粒。56.權(quán)利要求24-55任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為權(quán)利要求279-397的任一項所述的突變H-NOX蛋白。57.—種藥物組合物，其包含(i)藥學(xué)上可接受量的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約lnM到約lmM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20。C小于約700s'1，并且其中所述H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H，和(ii)藥學(xué)上可接受的載體。58.權(quán)利要求57所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白不是智人piI140Y。59.權(quán)利要求57和58的任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約2nM到約50pM之間。60.權(quán)利要求59所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約50nM到約lO^M之間。61.權(quán)利要求59所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約20nM到2pM之間。62.權(quán)利要求57-61任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍。63.權(quán)利要求62所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少100倍。64.權(quán)利要求63中所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少1,000倍。65.權(quán)利要求57-64任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性小于約1.0s—1。66.權(quán)利要求57-65任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的對氧k說在20。C在約1.0s"到約16.0s"之間。67.權(quán)利要求57-66任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在20'C小于或等于約0.65s—]。68.權(quán)利要求67所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的對氧koff在2(TC在約0,21s"到約0.65s—1之間。69.權(quán)利要求57-68任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約lh"。70.權(quán)利要求57-69任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約20nM到2pM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在20'C在約1.0s"到約16.0s-1之間。71.權(quán)利要求57-70任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約20nM到2|iM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37'C小于約lh"。72.權(quán)利要求57-71任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約20nM到2pM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20。C小于約700s—1。73.權(quán)利要求57-72任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在2(TC在約1.0s"到約16.0s"之間，并且其中所述X蛋白的血紅素自氧化速率在37'C小于約lh—、74.權(quán)利要求57-73任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在20。C在約1.0s—1到約16.0s—1之間，并且其中所述X蛋白的NO反應(yīng)性在20。C小于約700s"。75.權(quán)利要求57-74任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約lh—1，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20。C小于約700s-1。76.權(quán)利要求57-75任一項所述的藥物組合物，其中血紅素結(jié)合到所述H-NOX蛋白。77.權(quán)利要求57-76任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為突變蛋白。78.權(quán)利要求77所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個遠(yuǎn)側(cè)袋突變。79.權(quán)利要求77和78的任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個不在遠(yuǎn)側(cè)袋中的突變。80.權(quán)利要求57-79任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變02解離常數(shù)、對氧k。ff、血紅素自氧化速率和/或NO穩(wěn)定性。81.權(quán)利要求57-80任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變NO反應(yīng)性。82.權(quán)利要求57-81任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白選自野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-N0X、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L-P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9Y、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9N、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74E、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y-Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXP115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXR135Q、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140A、騰沖嗜熱厭氧菌I75F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌I75F、騰沖嗜熱厭氧菌LI44F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌U44F、嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOXF142Y、野生型嗜肺軍團(tuán)菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOX、嗜肺軍團(tuán)菌2F9W-F142Y、野生型脫硫脫硫弧菌H-NOX、脫硫脫硫弧菌H-NOX(728-899)、脫硫脫硫弧菌H-NOXY139L、野生型智人(31H-NOX、智人(311145Y、智人pl(l-385)、智人卩1(1-385)1145Y、智人卩1(1-385)U45H、智人卩1(1-194)、智人卩1(1-194)1145Y、智人(31(1-194)L9W-I145Y、智人(32(1-217)、智人(32(1-217)IM2Y、智人(31H-NOXH105G、智人piH-NOXH105F、野生型褐鼠|31H-NOX、褐鼠(31(1-385)、褐鼠(M(l-385)1145Y、褐鼠(31(1-385)1145H、褐鼠(31(1-194)、褐鼠j31(l-194)1145Y、褐鼠(31(1-194)L9W-I145Y、褐鼠|32(1-217)、褐鼠(32(1-217)1142Y、褐鼠卩l(xiāng)H-NOXH105G、褐鼠plH-NOXH105F、肉毒梭菌H-NOX(]-175)、肉毒梭菌H-NOX(卜186)、野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-183)、野生型線蟲GCY-35H-NOX、線蟲H-NOXGCY-35(l-252)、野生型黑腹果蠅PlH-NOX、野生型黑腹果蠅CG4885-PA、野生型黑腹果蠅CG14886、野生型黑腹果蠅CG4154;野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、野生型小鼠H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型家牛H-NOX、野生型褐鼠；野生型非洲爪蟾H-NOX、野生型青鏘H-NOX、野生型O.cw〃Vaft^H-NOX、野生型紅鰭東方飩H-NOX、野生型岡比亞按蚊H-NOX、野生型煙草天蛾H-NOX;野生型線蟲gcy-31、線蟲gcy-32、野生型線蟲gcy-33、野生型線蟲gcy-34、野生型線蟲gcy-35、野生型線蟲gcy-36、野生型線蟲gcy-37;野生型霍亂弧菌H-NOX、野生型費(fèi)氏弧菌H-NOX和野生型點形念珠藻H-NOX。83.權(quán)利要求57-82任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為哺乳動物蛋白質(zhì)或由哺乳動物蛋白質(zhì)衍生。84.權(quán)利要求83所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為人蛋白質(zhì)或由人蛋白質(zhì)衍生。85.權(quán)利要求84所述的藥物組合物，其中所述人蛋白質(zhì)為pi或由pi衍生。86.權(quán)利要求57-82任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為細(xì)菌蛋白或由細(xì)菌蛋白衍生。87.權(quán)利要求86所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為騰沖嗜熱厭氧菌蛋白或由騰沖嗜熱厭氧菌蛋白衍生。88.權(quán)利要求57-87任一項所述的藥物組合物，其中氧結(jié)合到所述H-NOX蛋白。89.權(quán)利要求57-88任一項所述的藥物組合物，其包括一種或多種包含所述H-NOX蛋白的脂質(zhì)體或納米顆粒。90.權(quán)利要求57-89任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為權(quán)利要求279-397的任一項所述的突變H-NOX蛋白。91.一種向個體輸送氧的方法，包括以足夠輸送有效量的氧到所述個體的量給需要它的個體施用H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在血紅蛋白的02解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍。92.權(quán)利要求91所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20°C在約100nM到約255nM之間。93.權(quán)利要求91所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20°C小于約80nM。94.權(quán)利要求93所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20°C在約20nM到約75nM之間。95.權(quán)利要求91-94任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少100倍。96.權(quán)利要求95中所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少1，000倍。97.權(quán)利要求91-96任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在20'C小于或等于約0.65s—1。98.權(quán)利要求97所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在20'C在約0.21s—1到約0.65s—'之間。99.權(quán)利要求91-96任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的對氧k必在2(TC在約1.35s—1到約2.9s—1之間。100.權(quán)利要求91-99任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白在4。C下在空氣中是穩(wěn)定的。101.權(quán)利要求91-100任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為野生型H-NOX蛋白。102.權(quán)利要求91-100任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為突變蛋白。103.權(quán)利要求102所述的方法，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個遠(yuǎn)側(cè)袋突變。104.權(quán)利要求102和103的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個不在遠(yuǎn)側(cè)袋中的突變。105.權(quán)利要求91-104任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變02解離常數(shù)、對氧k必、血紅素自氧化速率和/或NO反應(yīng)性。106.權(quán)利要求91-105任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白選自野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX15A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX15L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L-P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9Y、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9N、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74E、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y-Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXP115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXR135Q、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140A、騰沖嗜熱厭氧菌I75F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌F75F、騰沖嗜熱厭氧菌L144F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌L144F、嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOXF142Y、野生型嗜肺軍團(tuán)菌1H-N0X、野生型嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOX、嗜肺軍團(tuán)菌2F9W-F142Y、野生型脫硫脫硫弧菌H-NOX、脫硫脫硫弧菌H-NOX(728-899)、脫硫脫硫弧菌H-NOXY139L、野生型智人(31H-NOX、智人卩l(xiāng)1145Y、智人(31(1-385)、智人(31(1-385)1145Y、智人|31(1-385)U45H、智人pi(l-194)、智人卩1(1-194)U45Y、智人(31(1-194)L9W-I145Y、智人卩2(l-217)、智人(32(1-217)1142Y、智人(31H-NOXH105G、智人卩l(xiāng)H-NOXH105F、野生型褐鼠piH-NOX、褐鼠卩l(xiāng)(l-385)、褐鼠(31(1-385)1145Y、褐鼠|31(1-385)1145H、褐鼠(31(1-194)、褐鼠(31(1-194)1145Y、褐鼠(31(1-194)L9W-I145Y、褐鼠(32(1-217)、褐鼠卩2(1-217)1142Y、褐鼠plH-NOXH105G、褐鼠(31H-NOXH105F、肉毒梭菌H-NOX(l-175)、肉毒梭菌H-NOX(l-186)、野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-183)、野生型線蟲GCY-35H-NOX、線蟲H-NOXGCY-35(l-252)、野生型黑腹果蠅(31H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PA、野生型黑腹果蠅CG14886、野生型黑腹果蠅CG4154;野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、野生型小鼠H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型家牛H-NOX、野生型褐鼠；野生型非洲爪蟾H-NOX、野生型青鏘H-NOX、野生型O.cwn'ra加H-NOX、野生型紅鰭東方飩H-NOX、野生型岡比亞按蚊H-NOX、野生型煙草天蛾H-NOX;野生型線蟲gcy-31、線蟲gcy-32、野生型線蟲gcy-33、野生型線蟲gcy-34、野生型線蟲gcy-35、野生型線蟲gcy-36、野生型線蟲gcy-37;野生型霍亂弧菌H-NOX、野生型費(fèi)氏弧菌H-NOX和野生型點形念珠藻H-NOX。107.權(quán)利要求91-106任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為哺乳動物蛋白質(zhì)或由哺乳動物蛋白質(zhì)衍生。108.權(quán)利要求107所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為人蛋白質(zhì)或由人蛋白質(zhì)衍生。109.權(quán)利要求108所述的方法，其中所述人蛋白質(zhì)為pl或由(31衍生。110.權(quán)利要求91-106任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為細(xì)菌蛋白質(zhì)或由細(xì)菌蛋白質(zhì)衍生。111.權(quán)利要求110所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為騰沖嗜熱厭氧菌蛋白或由騰沖嗜熱厭氧菌蛋白衍生。112.權(quán)利要求91-111任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白被施用到所述個體的血液。113.權(quán)利要求91-112任一項所述的方法，其中所述個體為人。114.權(quán)利要求91-113任一項所述的方法，其中所述個體遭受失血或有失血的風(fēng)險。115.權(quán)利要求91-114任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白被施用到所述個體至少兩次。116.權(quán)利要求91-115任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為權(quán)利要求279-397的任一項所述的突變H-NOX蛋白。117.—種向個體輸送氧的方法，包括以足夠輸送有效量的氧到所述個體的量向需要它的個體施用H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20匸在約lnM到約lmM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20'C小于約700s"。118.權(quán)利要求117所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約2nM到約50pM之間。119.權(quán)利要求118所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約50nM到約lOpM之間。120.權(quán)利要求118所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20。C在約20nM到2pM之間。121.權(quán)利要求117-120任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍。122.權(quán)利要求121中所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少100倍。123.權(quán)利要求122中所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少1,000倍。124.權(quán)利要求117-123任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性小于約1.0s—、125.權(quán)利要求117-123任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在2(TC在約1.0s"到約16.0s"之間。126.權(quán)利要求117-125任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的對氧k礎(chǔ)在20'C小于或等于約0.65s"。127.權(quán)利要求126所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在2(TC在約0.21s—1到約0.65s—1之間。128.權(quán)利要求117-127任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約lh—1。129.權(quán)利要求117-128任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約20nM到2pM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在2(TC在約l.Os"到約16.0s—1之間。130.權(quán)利要求117-129任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約20nM到2pM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約lh—1。131.權(quán)利要求117-130任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約20nM到2pM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在2(TC小于約700s—1。132.權(quán)利要求117-131任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在20。C在約l.Os"到約16.0s-'之間，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約lh-1。133.權(quán)利要求117-132任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的對氧k說在2(TC在約1.0s—1到約16.0s"之間，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在2CTC小于約700s—]。134.權(quán)利要求117-133任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約lh"，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20°C小于約700s-1。135.權(quán)利要求117-134任一項所述的方法，其中血紅素結(jié)合到所述H-NOX蛋白。136.權(quán)利要求117-135任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為突變蛋白。137.權(quán)利要求136所述的方法，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個遠(yuǎn)側(cè)袋突變。138.權(quán)利要求135和136的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個不在遠(yuǎn)側(cè)袋中的突變。139.權(quán)利要求117-138任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變02解離常數(shù)、對氧k。ff、血紅素自氧化速率、N0反應(yīng)性和/或N0穩(wěn)定性。140.權(quán)利要求117-139任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白選自野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-N0X、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX15A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX15L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L-P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9Y、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9N、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74E、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y-Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXP115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXR135Q、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140A、騰沖嗜熱厭氧菌I75F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌I75F、騰沖嗜熱厭氧菌L144F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌L144F、嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOXF142Y、野生型嗜肺軍團(tuán)菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOX、嗜肺軍團(tuán)菌2F9W-F142Y、野生型脫硫脫硫弧菌H-NOX、脫硫脫硫弧菌H-NOX(728-899)、脫硫脫硫弧菌H-NOXY139L、野生型智人(31H-NOX、智人(31I145Y、智人卩1(1-385)、智人pl(l-385)1145Y、智人(31(1-385)1145H、智人(31(1-194)、智人(31(1-194)U45Y、智人(31(1-194)L9W-I145Y、智人(32(1-217)、智人(32(1-217)1142Y、智人plH-NOXH105G、智人(31H-NOXH105F、野生型褐鼠卩l(xiāng)H-NOX、褐鼠卩1(1-385)、褐鼠卩1(1-385)1145Y、褐鼠pl(l-385)U45H、褐鼠卩1(1-194)、褐鼠卩1(1陽194)I145Y、褐鼠卩1(1-194)L9W-I145Y、褐鼠(32(1-217)、褐鼠卩2(1-217)I142Y、褐鼠卩l(xiāng)H-NOXH105G、褐鼠(31H-NOXH105F、肉毒梭菌H-NOX(l-175)、肉毒梭菌H-NOX(l-186)、野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-183)、野生型線蟲GCY-35H-NOX、線蟲H-NOXGCY-35(l-252)、野生型黑腹果蠅卩l(xiāng)H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PA、野生型黑腹果蠅CG14886、野生型黑腹果蠅CG4154;野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、野生型小鼠H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型家牛H-NOX、野生型褐鼠；野生型非洲爪蟾H-NOX、野生型青鏘H-NOX、野生型O.cwn'ra/^H-NOX、野生型紅鰭東方飩H-NOX、野生型岡比亞按蚊H-NOX、野生型煙草天蛾H-NOX;野生型線蟲gcy-31、線蟲gcy-32、野生型線蟲gcy-33、野生型線蟲gcy-34、野生型線蟲gcy-35、野生型線蟲gcy-36、野生型線蟲gcy-37;野生型霍亂弧菌H-NOX、野生型費(fèi)氏弧菌H-NOX和野生型點形念珠藻H-NOX。141.權(quán)利要求117-140任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為哺乳動物蛋白質(zhì)或由哺乳動物蛋白質(zhì)衍生。142.權(quán)利要求141所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為人蛋白質(zhì)或由人蛋白質(zhì)衍生。143.權(quán)利要求142所述的方法，其中所述人蛋白質(zhì)為(31或由J31衍生。144.權(quán)利要求117-143任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為細(xì)菌蛋白質(zhì)或由細(xì)菌蛋白質(zhì)衍生。145.權(quán)利要求144所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為騰沖嗜熱厭氧菌蛋白或由騰沖嗜熱厭氧菌蛋白衍生。146.權(quán)利要求117-145任一項所述的方法，其中在對所述個體施用所述H-NOX蛋白之前氧被結(jié)合到所述H-NOX蛋白。147.權(quán)利要求117-145任一項所述的方法，其中在對所述個體施用所述H-NOX蛋白之前氧沒有被結(jié)合到所述H-NOX蛋白，并且其中所述H-NOX蛋白將氧從所述個體中的一個位置運(yùn)輸?shù)剿鰝€體中的另一個位置。148.權(quán)利要求117-147任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白被施用到所述個體的血液、缺氧組織或缺氧器官。149.權(quán)利要求117-148任一項所述的方法，其中所述個體為人。150.權(quán)利要求117-149任一項所述的方法，其中所述個體患有，或有心血管疾病、出血性休克、血液稀釋或失血的風(fēng)險。151.權(quán)利要求117-150任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白被施用到所述個體至少兩次。152.權(quán)利要求117-151任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為權(quán)利要求279-397任一項所述的突變H-NOX蛋白。153.—種向個體輸送氧的方法，包括以足夠輸送有效量的氧到所述個體的量向需要它的個體施用H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20°C在約lnM到約lmM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在2(TC小于約700s—、并且其中所述H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H。。154.權(quán)利要求153所述的方法，其中所述H-NOX蛋白不是智人(311140Y。155.權(quán)利要求153和154的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約2nM到約50nM之間。156.權(quán)利要求155所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約50nM到約10pM之間。157.權(quán)利要求155所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20。C在約20nM到2pM之間。158.權(quán)利要求153-157任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍。159.權(quán)利要求158中所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少100倍。160.權(quán)利要求159中所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少1,000倍。161.權(quán)利要求153-160任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性小于約1.0s—1。162.權(quán)利要求153-161任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在20。C在約1.0s"到約16.0s—1之間。163.權(quán)利要求153-161任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的對氧k礎(chǔ)在2(TC小于或等于約0.65s—1。164.權(quán)利要求163所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的對氧k必在2(TC在約0.21s—1到約0.65s—1之間。165.權(quán)利要求153-164任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約lh人166.權(quán)利要求153-165任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約20nM到2pM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在20'C在約1.0s"到約16.0s"之間。167.權(quán)利要求153-166任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20。C在約20nM到2pM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37'C小于約lh—'。168.權(quán)利要求153-167任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約20nM到2pM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在2(TC小于約700s"。169.權(quán)利要求153-168任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在2(TC在約1.0s"到約16.0s—1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37t:小于約lh—1。170.權(quán)利要求153-169任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的對氧k必在20'C在約1.0s"到約16.0s—1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在2(TC小于約700s—'。171.權(quán)利要求153-170任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約lh"，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20°C小于約700s—、172.權(quán)利要求153-171任一項所述的方法，其中血紅素結(jié)合到所述H-NOX蛋白。173.權(quán)利要求153-172任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為突變蛋白。174.權(quán)利要求173所述的方法，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個遠(yuǎn)側(cè)袋突變。175.權(quán)利要求173和174的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個不在遠(yuǎn)側(cè)袋中的突變。176.權(quán)利要求153-175任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變02解離常數(shù)、對氧k。ff、血紅素自氧化速率和/或NO穩(wěn)定性。177.權(quán)利要求153-176任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變NO反應(yīng)性。178.權(quán)利要求153-177任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白選自野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX15A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L-P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9Y、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9N、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74E、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y-Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXP1I5A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXR135Q、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140A、騰沖嗜熱厭氧菌I75F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌I75F、騰沖嗜熱厭氧菌L144F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌L144F、嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOXF142Y、野生型嗜肺軍團(tuán)菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOX、嗜肺軍團(tuán)菌2F9W-F142Y、野生型脫硫脫硫弧菌H-NOX、脫硫脫硫弧菌H-NOX(728-899)、脫硫脫硫弧菌H-NOXY139L、野生型智人卩l(xiāng)H-NOX、智人卩1I145Y、智人pl(l-385)、智人pl(l-385)I145Y、智人(31(1-385)1145H、智人(51(1-194)、智人pl(l-194)I145Y、智人(31(1-194)L9W-I145Y、智人卩2(1-217)、智人卩2(1-217)1142Y、智人(31H-NOXH105G、智人卩l(xiāng)H-NOXH105F、野生型褐鼠(31H-NOX、褐鼠卩1(1-385)、褐鼠(31(1-385)1145Y、褐鼠(31(1-385)1145H、褐鼠卩(1-194)、褐鼠]31(1-194)1145Y、褐鼠JM(1-194)L9W-I145Y、褐鼠(32(1-217)、褐鼠(32(1-217)1142Y、褐鼠(31H-NOXH105G、褐鼠卩l(xiāng)H-NOXH105F、肉毒梭菌H-NOX(l-175)、肉毒梭菌H-NOX(l-186)、野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-183)、野生型線蟲GCY-35H-NOX、線蟲H-NOXGCY-35(l-252)、野生型黑腹果蠅piH-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PA、野生型黑腹果蠅CG14886、野生型黑腹果蠅CG4154;野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、野生型小鼠H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型家牛H-NOX、野生型褐鼠；野生型非洲爪蟾H-NOX、野生型青鏘H-NOX、野生型<9.c腦'v加wH-NOX、野生型紅鰭東方飩H-NOX、野生型岡比亞按蚊H-NOX、野生型煙草天蛾H-NOX;野生型線蟲gcy-31、線蟲gcy-32、野生型線蟲gcy-33、野生型線蟲gcy-34、野生型線蟲gcy-35、野生型線蟲gcy-36、野生型線蟲gcy-37;野生型霍亂弧菌H-NOX、野生型費(fèi)氏弧菌H-NOX和野生型點形念珠藻H-NOX。179.權(quán)利要求153-178任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為哺乳動物蛋白質(zhì)或由哺乳動物蛋白質(zhì)衍生。180.權(quán)利要求179所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為人蛋白質(zhì)或由人蛋白質(zhì)衍生。181.權(quán)利要求180所述的方法，其中所述人蛋白質(zhì)為pl或由pi衍生。182.權(quán)利要求153-178任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為細(xì)菌蛋白質(zhì)或由細(xì)菌蛋白質(zhì)衍生。183.權(quán)利要求182所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為騰沖嗜熱厭氧菌蛋白或由騰沖嗜熱厭氧菌蛋白衍生。184.權(quán)利要求153-183任一項所述的方法，其中氧在對所述個體施用所述H-NOX蛋白之前被結(jié)合到所述H-NOX蛋白。185.權(quán)利要求153-183任一項所述的方法，其中氧在對所述個體施用所述H-NOX蛋白之前沒有被結(jié)合到所述H-NOX蛋白，并且其中所述H-NOX蛋白將氧從所述個體中的一個位置運(yùn)輸?shù)剿鰝€體中的另一個位置。186.權(quán)利要求153-185任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白被施用到所述個體的血液、缺氧組織或缺氧器官。187.權(quán)利要求153-186任一項所述的方法，其中所述個體為人。188.權(quán)利要求153-187任一項所述的方法，其中所述個體遭受患有心血管疾病、出血性休克、血液稀釋或失血，或有心血管疾病、出血性休克、血液稀釋或失血的風(fēng)險。189.權(quán)利要求153-188任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白被施用到所述個體至少兩次。190.權(quán)利要求153-189任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為權(quán)利要求279-397任一項所述的突變H-NOX蛋白。191.試劑盒，其包含(i)藥學(xué)上可接受量的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在血紅蛋白的02解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍，和(ii)藥學(xué)上可接受的載體。192.權(quán)利要求191所述的試劑盒，在2(TC在約100nM到約255nM之間。193.權(quán)利要求191所述的試劑盒，在20。C小于約80nM。194.權(quán)利要求193所述的試劑盒，在20'C在約20nM到約75nM之間。其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)195.權(quán)利要求191-195任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少100倍。196.權(quán)利要求195中所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少1,000倍。197.權(quán)利要求193-196任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在2(TC小于或等于約0.65s—、198.權(quán)利要求197所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在20°C在約0.21s"到約0.65s—1之間。199.權(quán)利要求191-196任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在20。C在約1.35s-1到約2.9s"之間。200.權(quán)利要求191-199任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白在4。C下在空氣中是穩(wěn)定的。201.權(quán)利要求191-200任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白為野生型H-NOX蛋白。202.權(quán)利要求191-200任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白為突變蛋白。203.權(quán)利要求202所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個遠(yuǎn)側(cè)袋突變。204.權(quán)利要求202和203任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個不在遠(yuǎn)側(cè)袋中的突變。205.權(quán)利要求191-204任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變02解離常數(shù)、對氧koff、血紅素自氧化速率和/或NO反應(yīng)性。206.權(quán)利要求191-205任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白選自野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L-P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9Y、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9N、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74E、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y-Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXP115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXR135Q、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140A、騰沖嗜熱厭氧菌175F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌I75F、騰沖嗜熱厭氧菌L144F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌L144F、嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOXF142Y、野生型嗜肺軍團(tuán)菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOX、嗜肺軍團(tuán)菌2F9W-F142Y、野生型脫硫脫硫弧菌H-NOX、脫硫脫硫弧菌H-NOX(728-899)、脫硫脫硫弧菌H-NOXY139L、野生型智人(31H-NOX、智人(31I145Y、智人(31(1-385)、智人(31(1-385)1145Y、智人卩1(1-385)1145H、智人pl(l-194)、智人(31(1-194)1145Y、智人pl(l-194)L9W-I145Y、智人卩2(1-217)、智人(32(1-217)1142Y、智人卩l(xiāng)H-NOXH105G、智人卩l(xiāng)H-NOXH105F、野生型褐鼠(31H-NOX、褐鼠卩1(1-385)、褐鼠(31(1-385)1145Y、褐鼠(31(1-385)1145H、褐鼠卩1(1-194)、褐鼠卩1(1-194)I145Y、褐鼠pi(l-194)L9W-I145Y、褐鼠(32(1-217)、褐鼠卩2(1-217)I142Y、褐鼠卩l(xiāng)H-NOXH105G、褐鼠(31H-NOXH105F、肉毒梭菌H-NOX(l-175)、肉毒梭菌H-NOX(l-186)、野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-183)、野生型線蟲GCY-35H-NOX、線蟲H-NOXGCY-35(l-252)、野生型黑腹果蠅|31H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PA、野生型黑腹果蠅CG14886、野生型黑腹果蠅CG4154;野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、野生型小鼠H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型家牛H-NOX、野生型褐鼠；野生型非洲爪蟾H-NOX、野生型青鏘H-NOX、野生型0.c^w加H-NOX、野生型紅鰭東方飩H-NOX、野生型岡比亞按蚊H-NOX、野生型煙草天蛾H-NOX;野生型線蟲gcy-31、線蟲gcy-32、野生型線蟲gcy-33、野生型線蟲gcy-34、野生型線蟲gcy-35、野生型線蟲gcy-36、野生型線蟲gcy-37;野生型霍亂弧菌H-NOX、野生型費(fèi)氏弧菌H-NOX和野生型點形念珠藻H-NOX。207.權(quán)利要求191-206任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白為哺乳動物蛋白質(zhì)或由哺乳動物蛋白質(zhì)衍生。208.權(quán)利要求207所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白為人蛋白質(zhì)或由人蛋白質(zhì)衍生。209.權(quán)利要求208所述的試劑盒，其中所述人蛋白質(zhì)為|31或由|31衍生。210.權(quán)利要求191-206任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白為細(xì)菌蛋白質(zhì)或由細(xì)菌蛋白質(zhì)衍生。211.權(quán)利要求210所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白為騰沖嗜熱厭氧菌蛋白或由騰沖嗜熱厭氧菌蛋白衍生。212.權(quán)利要求191-211任一項所述的試劑盒，其中氧結(jié)合所述H-NOX蛋白。213.權(quán)利要求191-212任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為權(quán)利要求279-397的任一項所述的突變H-NOX蛋白。214.試劑盒，其包含(i)H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約lnM到約lmM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在2(TC小于約700s"，和(ii)使用所述試劑盒向個體輸送氧的說明。215.權(quán)利要求214所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約2nM到約50pM之間。216.權(quán)利要求215所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約50nM到約10pM之間。217.權(quán)利要求214所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20。C在約20nM到2pM之間。218.權(quán)利要求214-217任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍。219.權(quán)利要求218中所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少100倍。220.權(quán)利要求219中所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少1,000倍。221.權(quán)利要求214-220任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性小于約l.Os"。222.權(quán)利要求214-221任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在20。C在約1.0s"到約16.0s"之間。223.權(quán)利要求214-222任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的對氧k必在20。C小于或等于約0.65s"。224.權(quán)利要求223所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的對氧k。仔在2(TC在約0.2ls"到約0.65s"之間。225.權(quán)利要求214-224任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37'C小于約lh"。226.權(quán)利要求214-225任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約20nM到2pM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在20'C在約l.Os"到約16.0s—1之間。227.權(quán)利要求214-226任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約20nM到2jliM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約lh人228.權(quán)利要求214-227任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約20nM到2pM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在2(TC小于約700s—、229.權(quán)利要求214-228任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的對氧k巡在20。C在約l.Os"到約16.0s'1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約lh—1。230.權(quán)利要求214-229任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的對氧k巡在20。C在約1.0s—1到約16.0s—1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20'C小于約700s—、231.權(quán)利要求214-230任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約lh"，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在2(TC小于約700s—、232.權(quán)利要求214-231任一項所述的試劑盒，其中血紅素結(jié)合到所述H-NOX蛋白。233.權(quán)利要求214-232任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白為突變蛋白。234.權(quán)利要求233所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個遠(yuǎn)側(cè)袋突變。235.權(quán)利要求233和234的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個不在遠(yuǎn)側(cè)袋中的突變。236.權(quán)利要求214-235任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變02解離常數(shù)、對氧k。ff、血紅素自氧化速率和/或NO穩(wěn)定性。237.權(quán)利要求214-236任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變NO反應(yīng)性。238.權(quán)利要求214-237任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白選自野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L-P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9Y、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9N、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74E、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y-Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXP115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXR135Q、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140A、騰沖嗜熱厭氧菌I75F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌I75F、騰沖嗜熱厭氧菌L144F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌L144F、嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOXF142Y、野生型嗜肺軍團(tuán)菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOX、嗜肺軍團(tuán)菌2F9W-F142Y、野生型脫硫脫硫弧菌H-NOX、脫硫脫硫弧菌H-NOX(728-899)、脫硫脫硫弧菌H-NOXY139L、野生型智人卩l(xiāng)H-NOX、智人(31I145Y、智人(31(1-385)、智人(31(1-385)U45Y、智人(31(1-385)1145H、智人(31(1-194)、智人(31(1-194)U45Y、智人pi(l-194)L9W-I145Y、智人卩2(1-217)、智人(32(1-217)1142Y、智人(31H-NOXH105G、智人(31H-NOXH105F、野生型褐鼠plH-NOX、褐鼠卩l(xiāng)(l-385)、褐鼠(31(1-385)U45Y、褐鼠(31(1-385)1145H、褐鼠卩1(1陽194)、褐鼠卩1(1-194)I145Y、褐鼠|31(1-194)L9W-I145Y、褐鼠卩2(1-217)、褐鼠(32(1-217)1142Y、褐鼠卩l(xiāng)H-NOXH105G、褐鼠卩l(xiāng)H-NOXH105F、肉毒梭菌H-NOX(l-175)、肉毒梭菌H-NOX(l-186)、野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(I-183)、野生型線蟲GCY-35H-NOX、線蟲H-NOXGCY-35(1-252)、野生型黑腹果蠅(31H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PA、野生型黑腹果蠅CG14886、野生型黑腹果蠅CG4154;野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、野生型小鼠H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型家牛H-NOX、野生型褐鼠；野生型非洲爪蟾H-NOX、野生型青鏘H-NOX、野生型0.cwWra加H-NOX、野生型紅鰭東方飩H-NOX、野生型岡比亞按蚊H-NOX、野生型煙草天蛾H-NOX;野生型線蟲gcy-31、線蟲gcy-32、野生型線蟲gcy-33、野生型線蟲gcy-34、野生型線蟲gcy-35、野生型線蟲gcy-36、野生型線蟲gcy-37;野生型霍亂弧菌H-NOX、野生型費(fèi)氏弧菌H-NOX和野生型點形念珠藻H-NOX。239.權(quán)利要求214-238任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白為哺乳動物蛋白質(zhì)或由哺乳動物蛋白質(zhì)衍生。240.權(quán)利要求239所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白為人蛋白質(zhì)或由人蛋白質(zhì)衍生。241.權(quán)利要求240所述的試劑盒，其中所述人蛋白質(zhì)為(31或由(31衍生。242.權(quán)利要求214-238任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白為細(xì)菌蛋白質(zhì)或由細(xì)菌蛋白質(zhì)衍生。243.權(quán)利要求242任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白為騰沖嗜熱厭氧菌蛋白或由騰沖嗜熱厭氧菌蛋白衍生。244.權(quán)利要求214-243任一項所述的試劑盒，其中氧結(jié)合到所述H-NOX蛋白。245.權(quán)利要求214-244任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為權(quán)利要求279-397任一項所述的突變H-NOX蛋白。246.試劑盒，其包含(i)H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約lnM到約lmM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20。C小于約700s"，并且其中所述H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H，和(ii)使用所述試劑盒向個體輸送氧的說明。247.權(quán)利要求246所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白不是智人卩l(xiāng)簡Y。248.權(quán)利要求246和247的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約2nM到約50pM之間。249.權(quán)利要求248所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約50nM到約10(aM之間。250.權(quán)利要求248所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約20nM到2pM之間。251.權(quán)利要求246-250任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍。252.權(quán)利要求251中所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少100倍。253.權(quán)利要求252中所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少1,000倍。254.權(quán)利要求246-253任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性小于l.Os"。255.權(quán)利要求246-254任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在20'C在約1.0s"到約16.0s"之間。256.權(quán)利要求246-254任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的對氧k必在2(TC小于或等于約0.65s"。257.權(quán)利要求256所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在20°C在約0.21s"到約0.65s—1之間。258.權(quán)利要求246-257任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37"C小于約lh—'。259.權(quán)利要求246-258任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20。C在約20nM到2pM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的對氧k。ff在2(TC在約1.0s"到約16.0s—1之間。260.權(quán)利要求246-259任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20。C在約20nM到2pM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37'C小于約lh—、261.權(quán)利要求246-260任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20。C在約20nM到2pM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20'C小于約700s"。262.權(quán)利要求246-261任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的對氧k巡在20。C在約1.0s—1到約16.0s"之間，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約lh—1。263.權(quán)利要求246-262任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的對氧k必在20。C在約1.0s-1到約16.0s"之間，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20'C小于約700s-1。264.權(quán)利要求246-263任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約lh入并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20'C小于約1.8s—1。265.權(quán)利要求246-264任一項所述的試劑盒，其中血紅素結(jié)合到所述H-NOX蛋白。266.權(quán)利要求246-265任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白為突變蛋白。267.權(quán)利要求266所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個遠(yuǎn)側(cè)袋突變。268.權(quán)利要求266和267的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個不在遠(yuǎn)側(cè)袋中的突變。269.權(quán)利要求246-268任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變02解離常數(shù)、對氧k。ff、血紅素自氧化速率和/或NO穩(wěn)定性。270.權(quán)利要求246-269任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白包含至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變NO反應(yīng)性。271.權(quán)利要求246-270任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白選自野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX15A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L-P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9Y、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9N、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74E、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y-Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXP115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXR135Q、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140A、騰沖嗜熱厭氧菌I75F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌I75F、騰沖嗜熱厭氧菌L144F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌L144F、嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOXF142Y、野生型嗜肺軍團(tuán)菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOX、嗜肺軍團(tuán)菌2F9W-F142Y、野生型脫硫脫硫弧菌H-NOX、脫硫脫硫弧菌H-NOX(728-899)、脫硫脫硫弧菌H-NOXY139L、野生型智人(31H-NOX、智人卩1I145Y、智人卩1(1-385)、智人(31(1-385)1145Y、智人(31(1-385)1145H、智人卩1(1-194)、智人卩1(1-194)I145Y、智人卩1(1-194)L9W-I145Y、智人卩2(1-217)、智人(32(1-217)H42Y、智人piH-NOXH105G、智人卩l(xiāng)H-NOXH105F、野生型褐鼠卩l(xiāng)H-NOX、褐鼠(31(1-385)、褐鼠|31(l-385)U45Y、褐鼠(31(1-385)I145H、褐鼠pl(l-194)、褐鼠|31(1-194)U45Y、褐鼠卩1(1-194)L9W-I145Y、褐鼠{32(1-217)、褐鼠)32(1-217)1142Y、褐鼠j31H-NOXH105G、褐鼠|31H-NOXH05F、肉毒梭菌H-NOX(l-175)、肉毒梭菌H-NOX(l-186)、野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-183)、野生型線蟲GCY-35H-NOX、線蟲H-NOXGCY-35(l-252)、野生型黑腹果蠅(31H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PA、野生型黑腹果蠅CG14886、野生型黑腹果蠅CG4154;野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、野生型小鼠H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型家牛H-NOX、野生型褐鼠；野生型非洲爪蟾H-NOX、野生型青鏘H-NOX、野生型0.cw/vatoH-NOX、野生型紅鰭東方飩H-NOX、野生型岡比亞按蚊H-NOX、野生型煙草天蛾H-NOX;野生型線蟲gcy-31、線蟲gcy-32、野生型線蟲gcy-33、野生型線蟲gcy-34、野生型線蟲gcy-35、野生型線蟲gcy-36、野生型線蟲gcy-37;野生型霍亂弧菌H-NOX、野生型費(fèi)氏弧菌H-NOX和野生型點形念珠藻H-NOX。272.權(quán)利要求246-271任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白為哺乳動物蛋白質(zhì)或由哺乳動物蛋白質(zhì)衍生。273.權(quán)利要求272所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白為人蛋白質(zhì)或由人蛋白質(zhì)衍生。274.權(quán)利要求273所述的試劑盒，其中所述人蛋白質(zhì)為(31或由(31衍生。275.權(quán)利要求246-271任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白為細(xì)菌蛋白質(zhì)或由細(xì)菌蛋白質(zhì)衍生。276.權(quán)利要求275所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白為騰沖嗜熱厭氧菌蛋白或由騰沖嗜熱厭氧菌蛋白衍生。277.權(quán)利要求246-276任一項所述的試劑盒，其中氧結(jié)合到所述H-NOX蛋白。278.權(quán)利要求246-277任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為權(quán)利要求279-397任一項所述的突變H-NOX蛋白。279.—種分離的H-NOX蛋白，其包含至少一個突變，與相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白相比，所述突變改變02解離常數(shù)或NO反應(yīng)性，其中所述突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在血紅蛋白的02解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)，其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍，并且其中所述H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y/Y140L、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX或嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOXF142Y。280.權(quán)利要求279所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白不是野生型嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOX、野生型智人(31H-NOX、野生型褐鼠卩l(xiāng)H-NOX、野生型黑腹果蠅piH-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PAH-NOX、野生型線蟲GCY-35H-NOX、野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX或野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX。281.權(quán)利要求279和280的任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約2nM到約50pM之間。282.權(quán)利要求281所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約50nM到約lO^M之間。283.權(quán)利要求282所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約lOOnM到約1.9pM之間。284.權(quán)利要求283所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約150nM到約l|aM之間。285.權(quán)利要求279-283任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20。C在約100nM到約255nM之間。286.權(quán)利要求279-283任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C小于約80nM。287.權(quán)利要求286所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約20nM到約75nM之間。288.權(quán)利要求279-287任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少100倍。289.權(quán)利要求288所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少1,000倍。290.權(quán)利要求279-289任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在2(TC小于約700s"。291.權(quán)利要求279-290任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的對氧k。ff在20'C在約0.01到約200s'1之間。292.權(quán)利要求279-291任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約lOOnM到約1.9pM之間，并且其中所述突變H-NOX蛋白的對氧k。ff在2(TC在約1.35s'1到約14.5s—1之間。293.權(quán)利要求279-292任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37'C小于約lh—、294.權(quán)利要求279-293任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的對氧k。ff在20。C在約1.35s"到約14.5s"之間，并且其中所述突變H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37°C小于約lh—1。295.權(quán)利要求279-294任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的對氧k。ff在2(TC在約1.35s—1到約14.5s"之間，并且其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20°C小于約700s—1。296.權(quán)利要求279-295任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約lh"，并且其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20°C小于約700s—1。297.權(quán)利要求279-296任一項所述的分離的H-NOX蛋白，包含至少一個遠(yuǎn)側(cè)袋突變。298.權(quán)利要求279-297任一項所述的分離的H-NOX蛋白，包含至少一個不在遠(yuǎn)側(cè)袋中的突變。299.權(quán)利要求279-298任一項所述的分離的H-NOX蛋白，包含至少一個突變，其中對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Ile5、Trp9、Asn74、Pro115或Arg135的殘基被任何其它氨基酸置換。300.權(quán)利要求279-299任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其包含至少兩個突變，其中至少一個突變是對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的IIe5、Tip9、Asn74、Pro115或Argl35的殘基被任何其它氨基酸置換。301.權(quán)利要求279-300任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌的I5A突變、I5L突變、W9F突變、Y140H突變或F78YY140F雙突變。302.權(quán)利要求279-301任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌的W9Y突變、W9H突變、W9N突變、N74H突變、N74A突變、PU5A突變、R135Q突變、15LP115A雙突變或W9FN74A雙突變。303.權(quán)利要求279-302任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為哺乳動物蛋白質(zhì)。304.權(quán)利要求303所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為人蛋白質(zhì)。305.權(quán)利要求304所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為)31。306.權(quán)利要求279-302任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為細(xì)菌蛋白質(zhì)。307.權(quán)利要求306所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為騰沖嗜熱厭氧菌蛋白。308.權(quán)利要求279-307任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F或智人(31H-NOX(1-385)1145Y。309.權(quán)利要求279-308任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H或智人pl1140Y。310.權(quán)利要求279-309任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白被共價連接到另一分子或部分。311.權(quán)利要求310所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白被共價連接到聚乙二醇。312.分離的H-NOX蛋白，其包含至少一個突變，與相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白相比，所述突變改變02解離常數(shù)或NO反應(yīng)性，其中所述突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在血紅蛋白的02解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)，其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍，并且其中所述H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX或嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOXF142Y。313.權(quán)利要求312所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F、野生型嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOX、智人(31H-NOXI140Y、野生型智人卩l(xiāng)H-NOX、褐鼠sGC(31H-NOX(1-385)、褐鼠sGC卩l(xiāng)H-NOX(1-385)1145Y、褐鼠sGCplH-NOXH105G、褐鼠sGCJ31H-NOXH105F、褐鼠sGC(31H-NOXI145Y、野生型褐鼠卩l(xiāng)H-NOX、野生型黑腹果蠅卩l(xiāng)H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PAH-NOX、野生型線蟲GCY-35H-NOX、野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX或野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX。314.權(quán)利要求312和313的任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約100nM到約255nM之間。315.權(quán)利要求312和313任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在小于約80nM。316.權(quán)利要求315所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約20nM到約75nM之間。317.權(quán)利要求312-316任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少100倍。318.權(quán)利要求317所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少1,000倍。319.權(quán)利要求312-318任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的對氧k。ff在2(TC小于或等于約0.65s"。320.權(quán)利要求319所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的對氧k。ff在2(TC在約0.21s-1到約0.65s—1之間。321.權(quán)利要求312-318任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的對氧k。ff在2(TC在約1.35s"到約2.9s—1之間。322.權(quán)利要求312-318任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的對氧k。ff在2(TC在約5.8s—1到約19s—1之間。323.權(quán)利要求312-322任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白在4'C下在空氣中是穩(wěn)定的。324.權(quán)利要求312-323任一項所述的分離的H-NOX蛋白，包含至少一個遠(yuǎn)側(cè)袋突變。325.權(quán)利要求312-324任一項所述的分離的H-NOX蛋白，包含至少一個不在遠(yuǎn)側(cè)袋中的突變。326.權(quán)利要求312-325任一項所述的分離的H-NOX蛋白，包含至少一個突變，其中對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Ile5、Asn74、Pro115或Argl35的殘基被任何其它氨基酸置換。327.權(quán)利要求312-326任一項所述的分離的H-NOX蛋白，包含至少兩個突變，其中至少一個突變是對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Ile5、Trp9、Asn74、Phe78、Proll5或Arg135的殘基被任何其它氨基酸置換。328.權(quán)利要求312-327任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的I5A突變、I5L突變、Y140H突變或F78YY140F雙突變。329.權(quán)利要求312-328任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的W9Y突變、W9H突變、W9N突變、N74H突變、N74A突變、P115A突變、R135Q突變、I5LP115A雙突變或W9FN74A雙突變。330.權(quán)利要求312-329任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為哺乳動物蛋白質(zhì)。331.權(quán)利要求330所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為人蛋白質(zhì)。332.權(quán)利要求331所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為卩l(xiāng)。333.權(quán)利要求312-332任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為細(xì)菌蛋白質(zhì)。334.權(quán)利要求333所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為騰沖嗜熱厭氧菌蛋白。335.權(quán)利要求312-334任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H或智人(311140Y。336.權(quán)利要求312-335任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白被共價連接到另一分子或部分。337.權(quán)利要求336所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白被共價連接到聚乙二醇。338.分離的H-NOX蛋白，其包含至少一個突變，與相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白相比，所述突變改變對氧k。ff或NO反應(yīng)性，其中所述突變H-NOX蛋白的對氧k必在2(TC在約0.01到約200s—1之間，其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍，并且其中所述突變H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y/Y140L、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX或嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOXF142Y。339.權(quán)利要求338所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白不是野生型嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOX、野生型智人piH-NOX、野生型褐鼠卩l(xiāng)H-NOX、野生型黑腹果蠅(31H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PAH-NOX、野生型線蟲GCY-35H-NOX、野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX或野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX。340.權(quán)利要求338和339的任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的對氧k礎(chǔ)在20'C小于或等于約0.65s"。341.權(quán)利要求340所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的對氧k。ff在20。C在約0.21s"到約0.65s—1之間。342.權(quán)利要求338-341任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約lnM到約lmM之間。343.權(quán)利要求338-342任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20'C在約2nM到約50|iM之間。344.權(quán)利要求338-343任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20。C在約50nM到約lOpM之間。345.權(quán)利要求338-344任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20。C在約100nM到約1.9pM之間。346.權(quán)利要求338-345任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少100倍。347.權(quán)利要求346所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少1,000倍。348.權(quán)利要求338-347任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20°C小于約700s—1。349.權(quán)利要求338-348任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約lh"。350.權(quán)利要求338-349任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約100nM至U1.9pM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37'C小于約lh—1。351.權(quán)利要求338-350任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約100nM到約1.9^M之間，并且其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20"C小于約700s—1。352.權(quán)利要求338-351任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37'C小于約lh"，并且其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20'C小于約700s—1。353.權(quán)利要求338-352任一項所述的分離的H-NOX蛋白，包含至少一個遠(yuǎn)側(cè)袋突變。354.權(quán)利要求338-353任一項所述的分離的H-NOX蛋白，包含至少一個不在遠(yuǎn)側(cè)袋中的突變。355.權(quán)利要求338-354任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其包含至少一個突變，其中對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Ile5、Trp9、Asn74、Prol15或Argl35，或卩l(xiāng)(l-385)的1145的殘基被任何其它氨基酸置換。356.權(quán)利要求338-355任一項所述的分離的H-NOX蛋白，包含至少兩個突變，其中至少一個突變是對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Ile5、Trp9、Asn74、Pro115或Argl35，或pi(l-385)的1145的殘基被任何其它氨基酸置換。357.權(quán)利要求338-356任一項所述的分離的H-NOX蛋白，包含對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌的I5A突變、15L突變、W9F突變、Y140F突變、Y140H突變、W9FY140H雙突變或F78YY140F雙突變，或(31的I145Y突變的突變。358.權(quán)利要求338-357任一項所述的分離的H-NOX蛋白，包含對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌的W9Y突變、W9H突變、W9N突變、N74H突變、N74E突變、N74A突變、P115A突變、R135Q突變、15LP115A雙突變、N74AY140H雙突變或W9FN74A雙突變的突變。359.權(quán)利要求338-358任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為哺乳動物蛋白質(zhì)。360.權(quán)利要求359所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為人蛋白質(zhì)。361.權(quán)利要求360所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為卩l(xiāng)。362.權(quán)利要求338-361任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為細(xì)菌蛋白質(zhì)。363.權(quán)利要求362所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為騰沖嗜熱厭氧菌蛋白。364.權(quán)利要求338-363任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的對氧k。ff在2(TC在約1.35s"到約18s"之間。365.權(quán)利要求338-364任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F或智人piH-NOX(1-385)I145Y。366.權(quán)利要求338-365任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H或智人卩l(xiāng)I140Y。367.權(quán)利要求338-366任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白被共價連接到另一分子或部分。368.權(quán)利要求367所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白被共價連接到聚乙二醇。369.分離的H-NOX蛋白，其包含至少一個突變，與相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白相比，所述突變改變對氧koff或NO反應(yīng)性，其中所述突變H-NOX蛋白的對氧k近在20。C小于0.65s—1，并且其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍。370.權(quán)利要求369任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOXF142Y、野生型嗜肺軍團(tuán)菌2H-NOX、智人卩l(xiāng)H-NOXH40Y、野生型智人(31H-NOX、褐鼠sGCf31H-NOX(1-385)、褐鼠sGC(31H-NOX(1-385)H45Y、褐鼠sGC卩l(xiāng)H-NOXH105G、褐鼠sGC(31H-NOXH105F、褐鼠sGCpiH-NOXH45Y、野生型褐鼠(31H-NOX、野生型黑腹果蠅piH-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PAH-NOX、野生型線蟲GCY-35H-NOX、野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX或野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX。371.權(quán)利要求369和370的任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的對氧k。ff在2(TC在約0.21s"到約0.65s"之間。372.權(quán)利要求369-371任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約100nM到約1.9pM之間。373.權(quán)利要求369-372所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少100倍。374.權(quán)利要求373所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少1,000倍。375.權(quán)利要求369-374任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20'C小于約700s"。376.權(quán)利要求369-375任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約lh—1。377.權(quán)利要求369-376任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在2(TC在約100nM到約1.9|liM之間，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37。C小于約lh—1。378.權(quán)利要求369-377任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在20。C在約100nM到約1.9pM之間，并且其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性小于0.7s—、379.權(quán)利要求369-378任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37'C小于約lh"，并且其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20'C小于約700s—1。380.權(quán)利要求369-379任一項所述的分離的H-NOX蛋白，包含至少一個遠(yuǎn)側(cè)袋突變。381.權(quán)利要求369-380任一項所述的分離的H-NOX蛋白，包含至少一個不在遠(yuǎn)側(cè)袋中的突變。382.權(quán)利要求369-381任一項所述的分離的H-NOX蛋白，包含至少一個突變，其中對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Ile5、Asn74、Pro115或Argl35的殘基被任何其它氨基酸置換。383.權(quán)利要求369-382任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其包含至少兩個突變，其中至少一個突變是對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Ile5、Trp9、Asn74、Phe78、Proll5或Arg135的殘基被任何其它氨基酸置換的突變。384.權(quán)利要求369-383任一項所述的分離的H-NOX蛋白，包含對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的I5A突變的突變。385.權(quán)利要求369-384任一項所述的分離的H-NOX蛋白，包含對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的N74H突變、N74E突變、N74A突變、P115A突變或I5LP115A雙突變的突變。386.權(quán)利要求369-385任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為哺乳動物蛋白。387.權(quán)利要求386所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為人蛋白質(zhì)。388.權(quán)利要求387所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為(31。389.權(quán)利要求369-388任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為細(xì)菌蛋白質(zhì)。390.權(quán)利要求389所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為騰沖嗜熱厭氧菌蛋白。391.權(quán)利要求369-390任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H或智人(311140Y。392.權(quán)利要求369-391任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白被共價連接到另一分子或部分。393.權(quán)利要求392所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白被共價連接到聚乙二醇。394.分離的H-NOX蛋白，其選自騰沖嗜熱厭氧菌H-N0XI5A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX15L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L-P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9Y、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9N、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74E、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y-Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXP115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXR135Q、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140A、騰沖嗜熱厭氧菌I75F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌I75F、騰沖嗜熱厭氧菌L144F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌L144F、丄2F9W-F142Y、脫硫脫硫弧菌H-NOX(728-899)、脫硫脫硫弧菌H-NOXY139L、(31(1-385)、(31(1-385)1145Y、(31(1-385)1145H、卩1(1-194)、(31(1-194)1145Y、pl(l-194)L9W-I145Y、卩2(1-217)、(32(1-217)1142Y、肉毒梭菌H-NOX(l-175)、肉毒梭菌H-NOX(l-186)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-183)和線蟲H-NOXGCY-35(l-252)。395.分離的H-NOX蛋白，其選自騰沖厭氧嗜熱菌H-NOX15A、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOX15L、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXI5L-P115A、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXW9F-Y140L、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXW9F-Y140H、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXW9F-N74A、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXW9Y、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXW9N、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXW9H、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXN74E、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXN74A、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXN74H、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXN74A-Y140H、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXF78Y-Y140F、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXPI15A、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXR135Q、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXY140H、騰沖厭氧嗜熱菌H-NOXY140A、騰沖厭氧嗜熱菌175F-His6、騰沖厭氧嗜熱菌H5F、騰沖厭氧嗜熱菌L144F-His6、騰沖厭氧嗜熱菌L144F、嗜肺軍團(tuán)菌2F9W-F142Y、脫硫脫硫弧菌H-NOX(728-899)、脫硫脫硫弧菌H-NOXY139L、(31(1-385)1145H、卩1(1-194)、卩1(1-194)I145Y、(31(1-194)L9W-I145Y、(32(1-217)、(32(1-217)I142Y、CbH-NOX(l-175)、CbH-NOX(l-186)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(l-183)和線蟲H-NOXGCY-35(l-252)。396.權(quán)利要求279-395任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的02解離常數(shù)在智人血紅蛋白01的02解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)。397.權(quán)利要求279-396任一項所述的分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比智人血紅蛋白a的NO反應(yīng)性低至少10倍。398.編碼權(quán)利要求279-397的任一項所述的H-NOX蛋白的重組核酸。399.載體，其包含權(quán)利要求398所述的核酸。400.細(xì)胞，其包含權(quán)利要求398所述的核酸。401.細(xì)胞，其包含權(quán)利要求399所述的載體。402.產(chǎn)生H-NOX蛋白的方法，包括在適合所述蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)含有核酸的細(xì)胞，所述核酸編碼權(quán)利要求279-397任一項所述的H-NOX蛋白。403.權(quán)利要求402所述的方法，進(jìn)一步包括純化所述H-NOX蛋白的步驟。全文摘要本發(fā)明涉及用于氧輸送的組合物及方法。H-NOX蛋白被突變?yōu)轱@示出改善的或優(yōu)化的血液氣體O₂輸送動力學(xué)和熱力學(xué)性質(zhì)。工程H-NOX蛋白包含突變，所述突變相對于對應(yīng)的野生型H-NOX結(jié)構(gòu)域賦予改變的O₂或NO配體-結(jié)合，并可作為生理相容的哺乳動物血液O₂氣體載體起作用。本發(fā)明也提供了藥物組合物、試劑盒及方法，它們使用野生型或突變H-NOX蛋白，用于治療輸送O₂對其有益的任何病癥。文檔編號C07K14/00GK101495506SQ200780027798公開日2009年7月29日申請日期2007年5月21日優(yōu)先權(quán)日2006年5月22日發(fā)明者E·M·博恩,E·魏納特,J·A·溫格,M·A·馬萊塔,S·P·L·卡瑞申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會