專利名稱：：Replikin肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：總的來說，本發(fā)明涉及稱為Replikin的肽的種類和編碼此種肽的核酸。Replikin共享在氨基酸序列和編碼這些氨基酸序列的核苷酸序列內(nèi)限定的結(jié)構(gòu)特征。Replikin肽已與病毒和生物的快速復(fù)制相關(guān)。Replikin支架(Scaffold)是Replikin肽的種類的亞型。Replikin支架在流感病毒的毒抹中是高度保守的，所述流感病毒的毒株已與流行病有關(guān)且已與快速復(fù)制、毒力和宿主死亡率相關(guān)。本發(fā)明人目前已鑒定了在流感病毒毒林中高度保守的Replikin和Replikin支架中的氨基酸和相應(yīng)的核苷酸的置換模式。所鑒定的置換模式與毒力中的變化相關(guān)且用作流感流行病和大流行病的預(yù)示。
背景技術(shù)：
：快速復(fù)制是某些細(xì)菌、病毒和惡性腫瘤中的毒力的特征。于2001年10月26日提交的美國專利申請系列號09/984,057首先描述了Replikin作為保守氨基酸和核酸序列家族，其共有規(guī)定的序列結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于快速復(fù)制的惡性肺瘤、細(xì)菌、病毒、其他生物和與復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)且與快速復(fù)制和毒力相關(guān)。Replikin是氨基酸序列或編碼氨基酸序列的核酸序列，其中包含基序的氨基酸序列包含7至約50個氨基酸，所述基序由下述組成位于基序的第一個末端處的至少一個賴氨酸殘基和位于基序的第二個末端處的至少一個賴氨酸殘基或至少一個組氨酸殘基、定位與第二個賴氨酸殘基相距6至IO個殘基的至少一個賴氨酸殘基、至少一個組氨酸殘基以及至少6%的賴氨酸殘基。從蛋白質(zhì)組學(xué)的觀點(diǎn)來看，Replikin基序源自基于腦成膠質(zhì)細(xì)胞瘤惡性腫瘤中存在的神經(jīng)膠質(zhì)瘤肽序列的算法。在與健康人類基因組相比較神經(jīng)膠質(zhì)瘤所特有的肽中所觀察到的Replikin算法導(dǎo)致具有相關(guān)保守結(jié)構(gòu)和特定功能(在這種情況下為復(fù)制)的廣泛種類的蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)。隨后在不同的疾病包括流感、HIV、癌癥和番茄縮葉病毒中確定了毒力的增加與在蛋白質(zhì)中存在或在基因組中編碼的Replikin肽濃度中的增加的關(guān)聯(lián)。Replikin的存在隨后與生物中的快速復(fù)制現(xiàn)象相關(guān)，所述生物多種多才羊達(dá)酵母、藻類、植物、瘧疾、流感、雙粒(Gemini)縮葉番茄病毒、HIV和癌癥。除4全測快速復(fù)制生物中Replikin的存在之外，還發(fā)現(xiàn)1)Replikin濃度(蛋白質(zhì)的或基因組中編碼的每100個氨基酸的Replikin數(shù)目)和2)依賴快速復(fù)制的特定功能狀態(tài)中的Replikin組成，提供了關(guān)于下述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)Replikin定量地以及定性地與Replikin存在于其中的生物的復(fù)制速率相關(guān)。這些功能證據(jù)的實(shí)例包括在快速復(fù)制和在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中的毒力之間、流感病毒中的Replikin和流感大流行病以及流行病之間的預(yù)示之間發(fā)現(xiàn)的關(guān)系，以及Replikin濃度和HIV中的快速復(fù)制之間的關(guān)系。隨著時間過去已發(fā)現(xiàn)Replikin序列,且尤其是Replikin序列的基序的限定成分在快速復(fù)制的病毒和生物中以及在與復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)中是保守的。因?yàn)镽eplikin序列是保守的，所以它們提供了用于檢測傳染原的一致的靶。Replikin的這種保守也提供下述證據(jù)Replikin結(jié)構(gòu)其自身在其中它存在且保守的那些病毒和生物中的復(fù)制和存活中具有作用。同樣，在傳染原中鑒定的Replikin是用于開發(fā)針對那些傳染原的治療和疫苗的良好靶。Replikin支架是Replikin的亞型。Replikin支架肽已顯示在傳染原中是高度保守的且已與快速復(fù)制、毒力和宿主死亡率相關(guān)。Replikin支架肽是Replikin肽序列，其包括約16至約30個氨基酸，且進(jìn)一步包括(1)末端賴氨酸，優(yōu)選地包括與末端賴氨酸緊鄰的另外的賴氨酸；(2)末端組氨酸和與末端組氨酸緊鄰的組氨酸；(3)與另一個賴氨酸相距6至IO個氨基酸殘基的賴氨酸；和(4)至少6%的賴氨酸，其中Replikin支架肽是一系列保守的Replikin肽的成員，其在跨越時間、地理空間或流行病學(xué)發(fā)生的病毒或生物的個體分離物中鑒定，或例如通過遺傳漂移在共享遺傳信息的不同病毒或生物中鑒定。如上所述，被發(fā)現(xiàn)的第一個Replikin是神經(jīng)膠質(zhì)瘤Replikin,其在腦多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(神經(jīng)膠質(zhì)瘤)細(xì)胞蛋白質(zhì)中鑒定，被稱為毒曲菌素(malignin)。參見美國專利號7，189，800。已知神經(jīng)膠質(zhì)瘤Replikin不存在于正常健康人基因組中。設(shè)計(jì)為搜索神經(jīng)膠質(zhì)瘤Replikin的同源物的算法揭示同源物在超過4,000個蛋白質(zhì)序列中不是常見的。然而驚人的是，在所有腫瘤病毒以及藻類、植物、真菌、病毒和細(xì)菌復(fù)制蛋白中發(fā)現(xiàn)了同源物。參見于2002年7月8日提交的美國專利申請系列號10/189,437。同樣，Replikin跨越許多病毒和生物的存在與復(fù)制功能和快速復(fù)制相關(guān)。更廣泛的考察快速復(fù)制的病毒和生物以及復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)后，發(fā)現(xiàn)在基因組、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段中每100個氨基酸的Replikin數(shù)目與快速復(fù)制的功能現(xiàn)象相關(guān)。參見美國專利申請系列號10/189,437。在過去100年中的流感爆發(fā)中的流感病毒血凝素蛋白質(zhì)的氨基酸序列與流行病學(xué)數(shù)據(jù)的比較中進(jìn)一步證實(shí)了在Replikin濃度和快速復(fù)制之間的關(guān)聯(lián)。這種比較揭示1902至2001年由4種主要流感毒抹中的每一種中的一種引發(fā)流感流行病中的毒抹特異性流感Replikin的濃度中4至IO倍的增加。4種主要流感毒林是流感B、(A)H1N1、(A)H2N2和(A)H3N2。隨后證實(shí)濃度中的增加是由于在其消失后1至最高達(dá)64年至少一種特定Replikin組成的再現(xiàn)，加上新毒株特異性Replikin組成的出現(xiàn)。參見美國專利申請系列號10/860,050。已觀察到Replikin氨基酸結(jié)構(gòu)未突變或改變至與非R印likin氨基酸相同的程度。Replikin結(jié)構(gòu)在病毒和生物中以及在病毒和生物之間經(jīng)過時間推移是保守的。這種保守證實(shí)Replikin結(jié)構(gòu)在存活中具有重要10性。同樣，保守的Replikin結(jié)構(gòu)提供與存活有關(guān)的新的不變靶，其用于鑒定和治療感染或惡性肺瘤。已顯示Replikin在一系列病毒和生物包括細(xì)菌、病毒、植物和惡性腫瘤中是保守的。因?yàn)榕c存活功能太緊密相關(guān)的某些結(jié)構(gòu)顯然不能不斷改變，所以跨越細(xì)菌、病毒、植物和其他生物的保守Replikin結(jié)構(gòu)暗示Replikin密切涉及存活功能。Replikin是保守的還是相反易受廣泛自然突變的影響的考慮通過掃描各種口蹄疫病毒(FMDV)分離物的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行檢查，其中在這些病毒的蛋白質(zhì)中的突變已在數(shù)十年中在全世界得到充分記錄。就整個Replikin和特定Replikin中觀察到的每一個組分Replikin氨基酸殘基的存在視覺上檢查FMDV分離物的蛋白質(zhì)序列。并非如在相鄰氨基酸中發(fā)生的隨著時間過去實(shí)施廣泛置換，觀察到構(gòu)成Replikin結(jié)構(gòu)的氨基酸很少或才艮本不被置換，即與非Replikin序列相比較，Replikin結(jié)構(gòu)是保守的。在植物中例如在小麥泛蛋白活化酶E和在HIV的分離物中的反式激活蛋白(Tat)蛋白質(zhì)中觀察到相似的序列保守。參見美國專利申請系列號10/860,050。的不變耙是至關(guān)重i的。當(dāng)結(jié):以某;方式與該生物的i本存活機(jī)制關(guān)聯(lián)時，該結(jié)構(gòu)趨向于保守。變化的結(jié)構(gòu)提供多變的靶，這是用于避免攻擊者的良好策略，例如已針對先前結(jié)構(gòu)特異性產(chǎn)生且因此針對修飾形式無效的抗體。例如流感病毒使用這種策略，從而使得先前疫苗針對目前的強(qiáng)毒病毒可能是完全無效的。Replikin結(jié)構(gòu)的基本組分是組氨酸(h),其由于與氧化還原酶中的金屬基團(tuán)的頻繁結(jié)合以及在提供復(fù)制所需的能源中的可能功能而已知。隨著時間過去的Replikin序列的回顧暗示Replikin中的組氨酸結(jié)構(gòu)保持不變。同樣，Replikin結(jié)構(gòu)仍是用于破壞病毒或生物復(fù)制的更加吸引人的耙。包含Replikin的蛋白質(zhì)也經(jīng)常與氧化還原功能和蛋白質(zhì)合成或延長以及細(xì)胞復(fù)制有關(guān)。與基于金屬的氧化還原功能的結(jié)合，包含Replikin的神經(jīng)膠質(zhì)瘤毒曲菌素濃度在厭氧復(fù)制期間的富集以及抗毒曲菌素抗體在低濃度下的細(xì)胞毒性(皮克/細(xì)胞)都暗示Replikin與中央呼吸存活功能相關(guān)，其已發(fā)現(xiàn)較少受非Replikin氨基酸的突變特征的影響。參見美國專利申請系列號10/860,050。在快速復(fù)制的病毒和生物中，已確定了病毒或生物中的復(fù)制速率和存在的Replikin序列的濃度之間的關(guān)聯(lián)。在100個氨基酸內(nèi)的Replikin序列的濃度被稱為病毒或生物的Replikin計(jì)數(shù)。在流感病毒中，Replikin計(jì)數(shù)的增加已與過去100年中的流感流行病相關(guān)。例如，已確定血凝素蛋白質(zhì)中的毒林特異性R印likin濃度與流感流行病和大流行病的定量相關(guān)(圖6)。在上一個世紀(jì)的3次流感大流行病中的每一次中，H1N1、H2N2和H3N2，通過Replikin計(jì)數(shù)中的增加來回顧地預(yù)測大流行病，并且大流行病與Replikin計(jì)數(shù)中的增加回顧地相關(guān)。圖6-8和10-11。Replikin計(jì)數(shù)中的增加在4次H5N1流行病中的每一次中也已是預(yù)示的，即在1997年、2001年和2003-2004年(圖11)和2006年的流行病。直到那時仍沒有報(bào)道流感流行病與毒抹特異性病毒蛋白質(zhì)化學(xué)的先前相關(guān)。類似于在毒株特異性流行病出現(xiàn)前1至3年流感群中的毒抹特異性Replikin計(jì)數(shù)增加的發(fā)現(xiàn)，已發(fā)現(xiàn)在冠狀病毒核殼體蛋白中的Replikin計(jì)^:中的增加回顧:地預(yù)示2003年的SARS大流4亍病。冠狀病毒核殼體蛋白的R印likin計(jì)數(shù)如下增加1999年3.1(±1.8);2000年3.9(±1.2);2001年3.9(士1.3)和2002年5.1(±3.6)。這種大流行病前的增加支持富含Replikin的冠狀病毒負(fù)責(zé)2003年的SARS大流行病的發(fā)現(xiàn)。(參見圖8)。HIV病毒中的Replikin計(jì)數(shù)也已與快速復(fù)制和毒力相關(guān)。在HIV分離物中，發(fā)現(xiàn)緩慢生長的低效價HIV毒抹(NSI,"Bru",其在早期HIV感染中普遍)具有每100個氨基酸1.1(+/-1.6)Replikin的Replikin濃度，然而快速生長的高效價HIV毒抹(SI,"Lai",其在晚期HIV感染中普遍)具有每100個氨基酸殘基6.8(+/-2.7)Replikin的Replikin濃度。此外，由于重疊的Replikin,番茄縮葉雙粒病毒(其已在中國和世界的許多其他地區(qū)毀壞番茄農(nóng)作物)已顯示具有高Replikin計(jì)數(shù)。已觀察到在番茄縮葉病雙粒病毒中的Replikin計(jì)數(shù)達(dá)到高至每100個氨基酸20.7個Replikin。Replikin支架是最初在流感病毒的毒株中鑒定的Replikin種類的亞型。Replikin支架在流感的強(qiáng)毒毒4朱中高度保守。Replikin和Replikin支架已與快速復(fù)制和毒力相關(guān)，并且Replikin在流感病毒的新興毒抹中的存在和濃度目前用于預(yù)測即將出現(xiàn)的流感流行病。本領(lǐng)域需要鑒定導(dǎo)致增加的毒力和宿主死亡率的Replikin或Replikin支架內(nèi)的小變化的方法。本領(lǐng)域還需要保守的Replikin和Replikin支架序列，其是用于治療流感的高度強(qiáng)毒毒抹的靶。因此本領(lǐng)域進(jìn)一步需要用于制備疫苗和新興流感毒林中的其他治療的Replikin和Replikin支架氨基酸序列。發(fā)明概述本發(fā)明提供來自第一抹流感病毒的基本上分離的Replikin肽，其包括16至約30個氨基酸且進(jìn)一步包括(1)末端賴氨酸和任選地與末端賴氨酸緊鄰的賴氨酸；(2)末端組氨酸和與末端組氨酸緊鄰的組氨酸；(3)與另一個賴氨酸相距6至約IO個氨基酸的賴氨酸；和(4)至少6%的賴氨酸；其中與第二才朱流感病毒的Replikin序列相比較，第一林流感病毒的分離的R印likin序列包含置換，其中所述置換不是組氨酸的置換，且其中第二抹流感病毒的Replikin序列包括(1)16至約30個氨基酸；(2)末端賴氨酸和任選地與末端賴氨酸緊鄰的賴氨酸；(3)末端組氨酸和與末端組氨酸緊鄰的組氨酸；(4)與另一個賴氨酸相距6至約IO個氨基酸的賴氨酸；和(5)至少6%的賴氨酸，以及其中所述置換另外存在于第三林流感病毒中，且與第二林流感病毒相比較，在第三林流感病毒中的置換的存在與復(fù)制、毒力和宿主死亡率中的增加相關(guān)，且其中第三抹流感病毒包括Replikin序列，其包括(1)16至約30個氨基酸；(2)末端賴氨酸和任選地與末端賴氨酸緊鄰的賴氨酸；(3)末端組氨酸和與末端組氨酸緊鄰的組氨酸；(4)與另一個賴氨酸相距6至約IO個氨基酸的賴氨酸；和(5)至少6。/。的賴氨酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用第一^f朱流感病毒的Replikin序列中的不同氨基酸殘基進(jìn)行置換的第二抹流感病毒的Replikin序列中的氨基酸殘基定位與末端組氨酸相距5個氨基酸殘基。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，在第二林流感病毒的Replikin序列中的氨基酸殘基用除第一抹流感病毒的分離的Replikin序列中的亮氨酸之外的氨基酸殘基進(jìn)行置換。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述氨基酸用任何疏水性氨基酸即甲硫氨酸、異亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸或纈氨酸進(jìn)行置換。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述氨基酸用曱硫氨酸或異亮氨酸進(jìn)行置換。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述分離的Replikin序列從H5N1流感病毒中進(jìn)行分離。在另一個方面，本發(fā)明提供包括本發(fā)明的分離的流感病毒Replikin支架肽的疫苗。在另外一個方面，本發(fā)明提供針對本發(fā)明的分離的流感病毒Replikin支架肽的抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供來自第一抹流感病毒的分離的Replikin肽，其中所述第一抹流感病毒是流感病毒的新興毒抹，且其中所述分離的Replikin肽包括7至約50個氨基酸且通過下述進(jìn)行分離鑒定基序，所述基序由下述組成(1)位于所述分離的Replikin肽的第一個末端處的至少一個賴氨酸殘基和位于所述分離的Replikin肽的第二個末端處的至少一個賴氨酸殘基或至少一個組氨酸殘基；(2)定位與第二個賴氨酸殘基相距6至10個殘基的第一個賴氨酸殘基；(3)至少一個組氨酸殘基；和(4)至少6%的賴氨酸殘基其中與第二抹所述流感病毒中在其他方面相同的序列相比較，已發(fā)生位于鑒定基序的末端殘基之間的Replikin肽序列中的氨基酸中的置換，且其中與第二抹相比較，第一林流感病毒的鑒定基序的末端殘基之間的所述置換與快速復(fù)制和增加的毒力有關(guān)；選擇所述鑒定的基序且分離包括所述鑒定的基序的所述Replikin肽。本發(fā)明進(jìn)一步提供從流感H5N1毒抹中分離的流感Replikin肽。在另一個方面，本發(fā)明提供包括本發(fā)明的分離的流感病毒Replikin肽的疫苗。在另外一個方面，本發(fā)明提供針對本發(fā)明的分離的流感病毒Replikin肽的抗體。本發(fā)明還提供本發(fā)明的分離的Replikin肽，其中所述Replikin肽包括約29個氨基酸。所述分離的Replikin肽可以包括氨基酸序列KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLV[S]WGIHH，其中[S]可以是除亮氨酸之外的任何氨基酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，[S]可以是除亮氨酸之外的氨基酸。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，[S]可以是疏水性氨基酸，包括曱疏氨酸、異亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸或纈氨酸。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，[s]可以是甲硫氨酸或異亮氨酸。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，分離的流感Replikin肽從流感H5N1毒株中進(jìn)行分離。本發(fā)明還提供疫苗，其包括一個或多個上述所分離的序列、或其抗原子序列、或與上述任何所分離的序列或其抗原子序列結(jié)合的抗體。本發(fā)明提供預(yù)測在第一林流感病毒中的復(fù)制、毒力或宿主死亡率中的增加的方法，其包括(1)鑒定包括多個Replikin支架肽的流感病毒Replikin支架，其中所述Replikin支架包括從第一4朱流感病毒中分離的第一種Replikin支架肽、從第二才朱流感病毒中分離的第二種Replikin支架肽和從第三才朱中流感病毒中分離的第三種Replikin支架肽，(2)鑒定與第二種Replikin支架肽相比較，第三種Replikin支架肽中被置換的氨基酸，(3)確定與第二林流感病毒相比較，第三林流感病毒表現(xiàn)增加的復(fù)制、毒力或宿主死亡率，(4)確定與第二種Replikin支架相比較在第三種Replikin支架中被置換的氨基酸殘基與第二種Replikin支架相比較在第一種Replikin支架肽中也被置換，(5)使第一株流感病毒的Replikin計(jì)數(shù)與第一株流感病毒的早期分離物的Replikin計(jì)數(shù)比較，(6)確定第一林流感病毒的Replikin計(jì)數(shù)大于第一才朱流感病毒早期出現(xiàn)的分離物的Replikin計(jì)數(shù)，(7)預(yù)測與第二抹流感病毒相比較，第一抹流感病毒中的復(fù)制、毒力或宿主死亡率中的增加。在優(yōu)選實(shí)施方案中，與第二種Replikin支架相比較，在第一種Replikin支架中被置換的氨基酸殘基與第二種Replikin支架的末端組氨酸相距5個氨基酸殘基。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，與第二種Replikin支架相比較，在第一種Replikin支架中被置換的氨基酸殘基是除亮氨酸之外的任何氨基酸殘基。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，與第二種Replikin支架相比較，在第一種Replikin支架中被置換的氨基酸殘基是除亮氨酸之外的疏水性氨基酸。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，與第二種Replikin支架相比較，在第一種Replikin支架中被置換的氨基酸殘基是曱硫氨酸或異亮氨酸。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第一種、第二種和第三種Replikin支架包括29個氨基酸。在另外一個實(shí)施方案中，毒力中的增加指示大流行病。本發(fā)明還提供預(yù)測流感病毒的新興毒林中的毒力增加的方法，其包括鑒定來自流感病毒的第一種新興毒4^的Replikin肽，其中所述流感Replikin肽由7至約50個氨基酸組成，且其中所述流感Replikin肽包括基序，所述基序由下述組成(1)位于所述分離的Replikin肽的第一個末端處的至少一個賴氨酸殘基，和位于所述分離的Replikin肽的第二個末端處的至少一個賴氨酸殘基或至少一個組氨酸殘基；(2)定位與第二個賴氨酸殘基相距6至10個殘基的第一個賴氨酸殘基；(3)至少一個組氨酸殘基；和(4)至少6%的賴氨酸殘基其中與第二株流感病毒中相同序列相比較，已發(fā)生在基序的末端殘基之間的氨基酸中的置換，使在第三抹流感病毒中相同序列中的所述置換與和第二林流感病毒相比較第三抹流感病毒中的快速復(fù)制和增加的毒力相關(guān)，且預(yù)測第一林流感病毒的毒力中的增加。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，使用計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)預(yù)測第一林流感病毒中的復(fù)制、毒力或宿主死亡率中的增加的方法。附圖簡述圖1是描述Replikin在各種生物中的出現(xiàn)頻率的條形圖。圖2是概述本發(fā)明的一個方面的盒形圖(boxdiagram),其中使用計(jì)算機(jī)通過比較至少三林流感病毒的Replikin支架來執(zhí)行預(yù)測復(fù)制、毒力或宿主死亡率中的增加的方法。圖3是顯示響應(yīng)于暴露于識別子16-聚體所產(chǎn)生的抗毒曲菌素抗體的量的條形圖。圖4A是用普通光和熒光獲得的血涂片的照片。圖4B是用普通光和熒光獲得的血涂片的照片，舉例說明了2個白血病細(xì)胞的存在。圖4C是在抗毒曲菌素抗體的存在下神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的致密層的照片。圖4D和圖4E是在加入抗毒曲菌素抗體后30和45分鐘時獲得的在圖4C中的細(xì)胞層的照片。圖4F是顯示通過抗毒曲菌素抗體在體外抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長的條形圖。圖5是在外科手術(shù)前和后具有良性或惡性乳房疾病的患者血清中存在的抗毒曲菌素抗體的量的圖。圖6是顯示從1918年到2001年以逐年為基礎(chǔ)在流感B和流感A毒株、H1N1的血凝素中觀察到的Replikin濃度的曲線圖。圖7是從1950年到2001年以逐年為基礎(chǔ)在流感A毒抹，H2N2和H3N2，以及命名為H3N2(R)的由其組成成分Replikin限定的新興毒林的血凝素中觀察到的R印Iikin濃度的曲線圖。圖8是描述從1917年到2002年每年關(guān)于幾種病毒毒抹的Replikin計(jì)數(shù)的曲線圖，包括冠狀病毒核殼體Replikin。圖9是描述每年關(guān)于核殼體冠狀病毒分離物的平均Replikin計(jì)數(shù)的圖表。圖IO是描繪每年關(guān)于H5N1血凝素的R印likin計(jì)數(shù)的圖表。圖11是舉例說明在3次"禽流感(BirdFlu)"流行病爆發(fā)前的流感H5N1毒抹的血凝素蛋白中Replikin模式的濃度中的快速增加。圖11舉例說明在3次"禽流感，，流行病前的H5N1血凝素蛋白漸增的Replikin濃度("Replikin計(jì)數(shù)")。在H5N1流感中，在1997(El)年香港H5N1流行病前1995年至1997年增加的毒林特異性Replikin濃度(R印likin計(jì)數(shù)，平均值+ASD);在2001年(E2)流行病前從1999年到2001年的增加；和在2004年(E3)流行病前從2002年到2004年的增加。1999年的下降伴隨響應(yīng)于香港El流行病大量淘汰家禽而發(fā)生。圖12是舉例說明在不同蛋白質(zhì)中基本上固定的氨基酸位置中出現(xiàn)的Replikin支架的表。圖13是提供每年關(guān)于其可獲得氨基酸序列的流感B病毒的血凝素中存在的Replikin序列的表(1940-2001)。圖14是提供每年關(guān)于其可獲得氨基酸序列的流感病毒的HINI血凝素中存在的H1N1Replikin序列的表(1918-2000)。圖15是提供1957-2000年中流感H2N2病毒的血凝素中存在的Replikin序歹寸的表。圖16是提供每年關(guān)于其可獲得氨基酸序列的流感病毒的H3N2血凝素中存在的H3N2Replikin序列的表(1968-2000)。圖17是提供在流感病毒、SARS病毒和其他快速復(fù)制的病毒以及惡性腫瘤中的Replikin結(jié)構(gòu)與增加的宿主死亡率的關(guān)系的表。發(fā)明詳述定義如本文所使用的，Replikin肽或Replikin蛋白質(zhì)是包括7至約50個氨基酸的氨基酸序列，其包括(1)與第二個賴氨酸殘基相距6至IO個氨基酸殘基的至少一個賴氨酸殘基；(2)至少一個組氨酸殘基；(3)至少6%的賴氨酸殘基。相似地，Replikin序列是編碼Replikin肽的核酸序列。如本文所使用的，"Replikin支架，，指一系列保守的Replikin肽，其中每一個所述Replikin肽序列包括約16個至約30個氨基酸且進(jìn)一步包括(1)末端賴氨酸和任選地與末端賴氨酸緊鄰的賴氨酸；(2)末端組氨酸和與末端組氨酸緊鄰的組氨酸；(3)與另一個賴氨酸殘基相距6至10個氨基酸殘基的賴氨酸，以及(4)至少約6%的賴氨酸。"Replikin支架"還指一系列"Replikin支架"中的單個成員或多個成員。如本文所使用的，"早期出現(xiàn)的"病毒或生物是在收集該病毒或生物的另一個樣品的日期前某日從該病毒或生物的天然來源中收集的病毒或生物的樣品。"晚期出現(xiàn)的，，病毒或生物是在收集該病毒或生物的另一個樣品的日期后某日從該病毒或生物的天然來源中收集的病毒或生物的樣品。如本文所使用的，"新興毒抹"指相對于病毒的此種毒株早期出現(xiàn)的分離物或此種病毒的其他毒抹中的Replikin濃度，被鑒定為在其一個或多個蛋白質(zhì)序列中具有增加或漸增濃度的Replikin序列的病毒毒抹。Replikin增加或漸增濃度例如在流感病毒中在至少約6個月的時間段、且優(yōu)選在至少約1年的時間段、最優(yōu)選在至少約3年或更長的時間段發(fā)生，但可以為短得多的時間段。如本文所使用的，Replikin的"功能衍生物"是Replikin的片段、變體、類似物或化學(xué)衍生物，其保留與對于Replikin特異的抗體的至少部分免疫交叉反應(yīng)性。Replikin肽的片段指所述分子的任何亞型。變體肽可以通過直接化學(xué)合成進(jìn)行制備，例如使用本領(lǐng)域中眾所周知的方法。Replikin對于非天然蛋白質(zhì)的類似物基本上類似于完整蛋白質(zhì)或其片段。Replikin的化學(xué)衍生物包含另外的化學(xué)部分。如本文所使用的，"同源性"作為在給定replikin內(nèi)所有氨基酸的百分比，在由這些"限定"氨基酸維持的位置處對于限定replikin結(jié)構(gòu)的氨基酸即賴氨酸和組氨酸是關(guān)鍵的，并且對于在replikin結(jié)構(gòu)內(nèi)的其他氨基酸較不重要或根本不重要，如先前申請中對于HIVTAT蛋白質(zhì)所顯示的；保守是就這些相對不變的"限定"氨基酸而言定義的；在除"限定"氨基酸之外中的特定變化或置換是本申請的主題，其中這些被視為是非隨機(jī)的且本文所示例如與大流行病相關(guān)，并非與先前所認(rèn)為一樣無關(guān)重要；通過用給定功能的重復(fù)，它們顯示代表基本Replikin支架的亞型。如本文所使用的，"突變"指由氨基酸的置換導(dǎo)致的生物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)中的變化。相比之下，如本文所使用的，術(shù)語"保守"、"保守的"或相關(guān)的詞匯指由于缺乏置換特定氨基酸的保守。如本文所使用的，術(shù)語"肽"或"蛋白質(zhì)"指2個或更多個氨基酸的化合物，其中一個氨基酸的羧基與另一個的氨基聯(lián)合，形成肽鍵。所述術(shù)語肽也用于指編碼此種化合物的氨基酸序列。如本文所使用的，"分離的"或"合成的"肽或其生物學(xué)活性部分指這樣的肽，其在純化后基本上不含所述肽由之衍生的細(xì)胞或組織來源的細(xì)胞材料或其他污染蛋白質(zhì)或肽，或在通過任何方法進(jìn)行化學(xué)合成時，基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)藥品，或在通過重組基因技術(shù)合成時，基本上不含污染肽。分離可以在體內(nèi)、在體外來完成，并且目前通過蛋白質(zhì)組學(xué)軟件方法"在計(jì)算機(jī)芯片上"來完成。如本文所使用的，"Replikin計(jì)數(shù)，，或"Replikin濃度"指在蛋白質(zhì)或生物中每100個氨基酸的Replikin數(shù)目。已發(fā)現(xiàn)，與具有更低的Replikin計(jì)數(shù)的第二種早期或晚期出現(xiàn)的病毒毒抹或生物相比較，在第一抹病毒或生物中更高的Replikin計(jì)數(shù)與第一種病毒或生物更快的復(fù)制相關(guān)。I.與流感流行病和大流行病相關(guān)的增加的Replikin計(jì)數(shù)關(guān)于在過去100年中流感病毒蛋白質(zhì)序列和流感流行病學(xué)的研究提供預(yù)測流感中增加的復(fù)制和毒力的方法。來自流感病毒血凝素蛋白質(zhì)序列的歷史和當(dāng)前數(shù)據(jù)的回顧揭示，從1902年到2001年與流感流行病相關(guān)的毒抹中的4種主要流感毒林即流感B、(A)H1N1、(A)H2N2和(A)H3N2的每一種中的一種中毒4朱特異性流感Replikin的濃度中4至10倍的增加。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)與流行病有關(guān)的血凝素蛋白質(zhì)中的Replikin濃度中的增加是由于在其消失后1至最高達(dá)64年至少一種特定Replikin組成的再現(xiàn)，加上新毒4朱特異性R印likin組成的出現(xiàn)。在發(fā)現(xiàn)流感基因組中的Replikin前，在流感中先前僅已描述血清血凝素和抗體分類。尚未描述毒林特異性的保守肽序列。另外，尚未描述與流行病學(xué)證明的流行病或快速復(fù)制相關(guān)的任何毒林特異性肽序列的濃度和組成中的變化。同樣，用其預(yù)測在將來的流感季節(jié)中會占優(yōu)勢的毒抹，或開發(fā)用于疫苗的全病毒毒抹的每年混合物的毒抹特異性化學(xué)結(jié)構(gòu)是未知的。然而，觀察到的Replikin結(jié)構(gòu)的高度保守，由此相同結(jié)構(gòu)可以持續(xù)100年，或在消失1至64年后再現(xiàn)，指出先前被認(rèn)為由于流感蛋白質(zhì)中的氨基酸隨機(jī)置換而變化的更可能是由于Replikin的保守的組構(gòu)過程而變化的。由歷史數(shù)據(jù)看來，流感中Replikin濃度中的增加的監(jiān)控為預(yù)測未來流行病提供了工具。所述工具已有效地預(yù)測許多近期的流感爆發(fā)。例如，H3N2Replikin濃度中的近期急劇增加(1997年至2000年)——H3N2的歷史上最大的增加，以及1968年的高死亡率H3N2大流行病以及上次在1975年和1977年2次高死亡率流行病中可見的、但不存在了20-25年的特定Replikin組成的再現(xiàn)，一起預(yù)示2002年的H3N2流行病。流感B、H1N1、H2N2和H3N2中的大流行病特別有利地，我們已觀察到在所檢查的幾乎所有單個流感病毒毒抹的血凝素蛋白質(zhì)中存在至少一個Replikin/100個氨基酸。已觀察到在4種流感病毒流行毒抹，流感B、H1N1、H2N2和H3N2中的每一種的分離物的血凝素蛋白質(zhì)中出現(xiàn)的所述Replikin序列，關(guān)于可獲得氨基酸序列數(shù)據(jù)的每一年(1902-2001年)，顯示于圖13、14、15和16中。每個流感A毒抹已分別負(fù)責(zé)一次大流行病1918、1957和1968年。圖6和圖7中的數(shù)據(jù)顯示在所檢查的4種常見流感病毒的所有分離物的每一種流感血凝素蛋白中存在至少一個Replikin/100個氨基酸，從而暗示關(guān)于Replikin在維持復(fù)制的存活水平中的功能。在20世紀(jì)90年代，在H3N2毒抹的下降過程中，在很多H3N2的分離物中無Replikin，但在H3N2分離物中出現(xiàn)高濃度的新Replikin,這限定H3N2(R)毒抹的出現(xiàn)。參見圖16。在圖6和圖7中可見的Replikin濃度的幾種性質(zhì)是所有4種流感病毒毒林共同的。首先，濃度在這些年份中是周期性的，其中在2年至30年的時間段中出現(xiàn)上升和下降的單個循環(huán)。這種上升和下降與通過血凝素和神經(jīng)氨酸酶分類的個別流感病毒一朱優(yōu)勢的已知增加和減弱一致。其次，先前顯示負(fù)責(zé)大流行病的每個流感病毒毒林的Replikin峰濃度特別及個別地與3年大流行病中的每一個相關(guān)。例如，對于其中流感病毒抹H1N1顯示負(fù)責(zé)的1918年的大流行病，H1N1中Replikin的峰濃度獨(dú)立地出現(xiàn)(Pl);對于其中H2N2出現(xiàn)且顯示負(fù)責(zé)的1957年的大流行病，H2N2中Replikin的峰濃度出現(xiàn)(P2);并且對于其中H3N2出現(xiàn)且顯示為大流行病的原因的1968年的大流行病，H3N2中Replikin的峰濃度出現(xiàn)(P3)。第三，在緊隨上述3次大流行病中每一次后的年份中，特定Replikin濃度顯著下降，可能反映出在每種情況下產(chǎn)生的廣泛分布的免疫性。因此，這種大流行病后的下降對于緊隨其負(fù)責(zé)的大流行病(Pl)后的H1N1是特異性的，且不是在那時的所有毒抹的一般性質(zhì)。流感B中Replikin濃度的增加重復(fù)地與H1N1中的Replikin濃度中的減小同時出現(xiàn)，例如，1951年的EB1和1976年的EB2都與具有最高死亡率的流感B流行病相關(guān)。(Stuart-Harris等人，EdwardArnoldLtd.(1985)。第四，超過濃度中的初次峰增加的二次峰濃度在3次大流行病的每一次后15年后出現(xiàn)，且這種二次峰伴隨流行病在H1N1'流行病，年(El)中的1918年大流行病后15年；H2N2'流行病，年(E2)中的1957年大流行病后8年；和H3N2'流行病，年(E3)中的1968年大流行病后7年。這些特定Replikin的二次峰濃度可能反映毒林的恢復(fù)。第五，每個毒抹的特定Replikin濃度的峰頻繁地看來與一個或兩個其他抹的Replikin濃度中的下降相關(guān)，從而暗示毒抹之間對于宿主位點(diǎn)的竟?fàn)?。第六，存在關(guān)于每個毒抹的Replikin濃度在35年(H2N2)至60年(流感B)的時間段中下降的明顯總體趨勢。這種下降不能歸咎于疫苗的影響，因?yàn)樵诹鞲幸呙绲钠毡槭褂们埃瑥?940年到1964年在流感B的情況下它是明顯的。在流感B的情況下，可見從下降的Replikin恢復(fù)在l965年后發(fā)生，但Replikin濃度在l997年至2000年再次下降(圖6)。這與在最近的病例分離物中流感B的低出現(xiàn)相關(guān)。H1N1Replikin濃度在1978-1979年中達(dá)到峰值(圖6)，同時伴隨著H1N1毒抹的再現(xiàn)和流行，且隨后在1996年達(dá)到峰值，與H1N1流行病一致。(圖6)。H1N1Replikin濃度也在1997年至2000年下降，且H1N1毒抹的存在在這些年期間獲得的分離物中減少。對于H2N2Replikin,未發(fā)生從35年下降的恢復(fù)(圖7),且這與來自近期分離物的H2N2的不存在相關(guān)。對于H3N2,很多分離物的Replikin濃度在1996年至2000年的時間段期間下降至零，但其他H3N2分離物表現(xiàn)出Replikin濃度中顯著的、急劇的增加。這指出H3N2的亞抹的出現(xiàn)，其在本文中被命名為H3N2(R)。如上所述，圖6和7證實(shí)經(jīng)常在Replikin濃度達(dá)到峰值前觀察到1至3年的逐步增加。這種逐步增加在流行病發(fā)生前，這與Replikin峰同時發(fā)生。因此，這種特定毒抹的濃度中的逐步增加是特定毒林是引發(fā)流行病或大流行病的最可能候選者的信號。觀察到流感病毒的H3N2(R)毒抹中的Replikin濃度在1997年至2000年增加(圖7)。所產(chǎn)生的2002年中的流行病證實(shí)了在流行病前Replikin濃度中預(yù)示性的增加值。H3N2Replikin濃度中的3次相似的先前峰增加可見已在1968年(此時該毒抹第一次出現(xiàn))的基于H3N2的大流行病(圖7)中、以及在1972年和1975年的基于H3N2的流行病(圖7)中出現(xiàn)。這些大流行病和流行病的每一次都與過量死亡率相關(guān)。(Ailing等人，AmJ.Epidemiol.，113(1):30-43(1981))。因此，1997-2000年中H3N2Replikin的H3N2(R)亞種類濃度中的快速上升在統(tǒng)計(jì)學(xué)上代表臨近的嚴(yán)重流行病或大流行病的預(yù)警。這種預(yù)測被證明是正確的，因?yàn)樵?000年俄羅斯發(fā)生H3N2流行(圖7，E4);2001年12月的CDC報(bào)告說明，在2001年，H3N2是全世界最頻繁分離的流感病毒毒才朱。(MorbidityandMortalityWeeklyReports(MMWR)，CenterforDiseaseControl;50(48):1084-68(Dec.7，2001)。流感病毒B的毒林中的Replikin組成在流感病毒B毒株中鑒定的總共26種Replikin中(圖13),下述10種Replikin存在于1940-2001年檢查的每一種流感B分離物中。分別列出重疊的Replikin序列。KSHFANLK(SEQIDNO:^)KSHFANLKGTK(SEQIDNO:_)KSHFANLKGTKTRGKLCPK(SEQIDNO:—)HEKYGGLNK(SEQIDNO:_)HEKYGGLNKSK(SEQIDNO:)HEKYGGLNKSKPYYTGEHAK(SEQIDNO:_)HAKAIGNCPIWVK(SEQIDNO:)HAKAIGNCPIWVVKKTPLKLANGTK(SEQIDNO:)HAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAK(SEQIDNO:—)HAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLK(SEQIDNO:一)圖13和14指出與H1N1Replikin相比較，在流感B血凝素中的Replikin結(jié)構(gòu)看起來具有大得多的穩(wěn)定性。流感B不負(fù)責(zé)任何大流行病，并且它看起來沒有動物或禽類病原體庫(reservoir)(Stuart-Harris等人，EdwardArnoldLtd.,London(1985))。流感毒抹中的遺傳漂移在每次流感大流行病或流行病的情況中，出現(xiàn)新的Replikin。在給定分離物中的給定血凝素中沒有觀察到2種相同的Replikin。新Replikin的出現(xiàn)代表突變對從另一個動物或禽類庫轉(zhuǎn)移的程度是未知的。在每年的一些病例中，一種或多種原始Replikin結(jié)構(gòu)是保守的，而與此同時，新Replikin出現(xiàn)。例如，在流感病毒B血凝素中，在1919年至2001年5種Replikin—直是保守的，而26種Replikin在此相同時間段期間出現(xiàn)又消失(一些在幾年不存在后重現(xiàn))。特定Replikin結(jié)構(gòu)多年后的消失和再現(xiàn)暗示Replikin從另一個病毒宿主庫而不是通過從頭突變恢復(fù)。已認(rèn)為不同流感毒抹的活性中的變化與流感血凝素中的序列變化相關(guān)，后者依次是受一個或兩個知之甚少的過程影響的置換的產(chǎn)物i)抗原漂變，其被認(rèn)為是由于血凝素分子中的一系列點(diǎn)突變的累積，或ii)抗原漂移，其中的變化如此大以致于假定在人和非人宿主的病毒之間發(fā)生基因重排列。首先，現(xiàn)有數(shù)據(jù)暗示不同流感毒株的活性中的變化不是與非特異性序列變化相關(guān)，而是基于與流行病相關(guān)的毒抹特異性Replikin增加的濃度和復(fù)制中的毒抹特異性增加或與之相關(guān)。另外，檢查數(shù)據(jù)來可能考察哪些序列變化是由于"漂變"或"漂移"，并且哪些是由于保守、病原體庫中的貯存和再現(xiàn)。數(shù)據(jù)暗示Replikin濃度中與流行病相關(guān)的增加不是由于每個血凝素的現(xiàn)有Replikin的重復(fù)，而是由于在其消失后1至最高達(dá)59年至少一種Replikin組成的再現(xiàn)，加上僅在A毒林中新毒林特異性Replikin組成的出現(xiàn)(圖13-16)。因此，1951年和1977年的流感B流行病中的Replikin濃度中的增加不與流行病當(dāng)年的新Replikin組成的出現(xiàn)相關(guān)，而僅與在前些年已出現(xiàn)隨后消失的Replikin組成的再現(xiàn)相關(guān)(圖13)。相比之下，對于A毒林，除先前消失的病毒Replikin的再現(xiàn)外，還出現(xiàn)了新組成(例如，在1996年的流行病年中的H1N1中，除6種早期Replikin的再現(xiàn)之外，還出現(xiàn)10種新組成)。因?yàn)閮HA毒抹而不是流感B可接近非人動物和禽類病原體庫，所以全新的組成可能源自非人宿主病原體庫而不是源自現(xiàn)存的人Replikin的突變，所述人Replikin看起來與新組成不具有相似性，除了Replikin算法的"3點(diǎn)識別"的基本要求之外(圖13-17)。與B相比較H1N1更多產(chǎn)的特性，以及大流行病僅由3種A毒抹而不是由B毒抹產(chǎn)生的事實(shí)，兩者也可以成為人類A毒抹從非人病毒病原體庫接收新Replikin組成的能力的函數(shù)。一些Replikin在僅一年內(nèi)出現(xiàn)、消失，且至今未再現(xiàn)(圖13-16)。當(dāng)相同的Replikin序列再現(xiàn)時，其他Replikin消失1至最高達(dá)81年。關(guān)鍵的Replikin'k，和'h，氨基酸以及它們之間的間隔在很多年中在特定Replikin的持續(xù)存在期間是保守的，如圖13-16中對于下述毒抹特異性Replikin所示的10種流感B、單個HlNlReplikin和單個H3N2Replikin以及相同Replikin在不存在后的再現(xiàn)。盡管在Replikin結(jié)構(gòu)之內(nèi)或之外在剩余血凝素序列中的其他氨基酸的顯著取代或置換活性，但流感Replikin組氨酸(h)似乎從未這樣，且賴氨酸很少被取代。這種保守的實(shí)例在下述中可見在1918年至2000間恒定的H1N1Replikin"hp(v/i)tigecpkyv(r/k)(s/t)(t/a)k"(SEQIDNO:—)、在1975年至1998年恒定的H3N2Replikin"hcd(g/q)f(q,r)nekwdlf(v/i)er(s/t)k，，(SEQIDNO:—)，以及在1975年首次出現(xiàn)、消失25年且隨后在2000年再現(xiàn)的H3N2Replikin"hqn(s/e)(e/q)g(t/s)g(q/y)aad(l/q)kstq(a/n)a(i/l)d(q/g)I(n/t)(g/n)k,(l/v)n(r/s)vi(e/c)k"(SEQIDNO:—)。盡管很多氨基酸被置換，但在至多約50個氨基酸中2個賴氨酸、相隔6至10個殘基、1個組氨酸、最低限度6%的賴氨酸的基本Replikin結(jié)構(gòu)是保守的。完全隨機(jī)的置換將不允許這些H1N1和H3N2Replikin的持續(xù)，也不允許從1902年到2001年流感B中10種Replikin結(jié)構(gòu)的持續(xù)，也不允許1919年的18-聚體Replikin在不存在74年后在1993年中的再現(xiàn)。與隨機(jī)類型的置換不同，恒定性暗示有序控制的過程，或者最低限度，關(guān)鍵Replikin殘基的保護(hù)，從而使得它們以某種方式固定或結(jié)合賴氨酸可能與核酸結(jié)合、且組氨酸可能與呼吸氧化還原酶結(jié)合?？刂七@種保守的機(jī)制目前是未知的。II.保守和遺傳漂變?yōu)橐呙玳_發(fā)提供預(yù)警機(jī)制在H1N1Replikin的情況下，在與1918年大流行病相關(guān)的Pl峰中存在的2種Replikin在1933年的恢復(fù)E1峰中不存在，所述恢復(fù)El峰包含12種新Replikin。因此，恒定保守的Replikin單獨(dú)或組合是關(guān)于疫苗的最佳選擇。然而，伴隨濃度中一年的增加的甚至近期出現(xiàn)的Replikin經(jīng)常持續(xù)并對于另外一年或多年進(jìn)一步增加，在濃度峰和流行病中達(dá)到頂點(diǎn)，因此提供預(yù)警和用合成Replikin接種疫苗的時間(參見例如在20世紀(jì)90年代早期中的H1N1，圖6;還參見例如，H5N11995-2002年，圖10和圖11)。圖7、8、10和11中的數(shù)據(jù)證實(shí)流感蛋白質(zhì)序列中Replikin的存在和濃度與流感大流行病和流行病的出現(xiàn)之間的直接關(guān)聯(lián)。因此，流感病毒血凝素蛋白質(zhì)序列就Replikin的存在和濃度的分析提供流感大的靶。關(guān)于該數(shù)據(jù)再次值得注意的是，先前，用其預(yù)測在將來的流感季節(jié)中會占優(yōu)勢的毒抹，或開發(fā)用于疫苗的全病毒毒抹的每年混合物的毒林特異性化學(xué)結(jié)構(gòu)是未知的。類似于在毒林特異性流行病出現(xiàn)前1至3年流感群中的毒林特異性Replikin計(jì)數(shù)增加的發(fā)現(xiàn)，已鑒定在冠狀病毒核殼體蛋白的Replikin計(jì)數(shù)中的增加。冠狀病毒核殼體蛋白的R印likin計(jì)數(shù)如下增加1999年3.1(±1.8);2000年3.9(±1.2);2001年3.9(士1.3)和2002年5,1(±3.6)。這種大流行病前的增加支持冠狀病毒負(fù)責(zé)2003年SARS大流行病的發(fā)現(xiàn)。(參見圖8和表3)因此，監(jiān)控Replikin結(jié)構(gòu)和Replikin計(jì)數(shù)為下述提供方法開發(fā)針對如在流感和冠狀病毒毒抹中觀察到的1917-1918年鵝Replikin及其修飾和伴隨的Replikin的合成毒林特異性預(yù)防接種疫苗和抗體治療。圖9描述核殼體冠狀病毒蛋白質(zhì)的自動化Replikin分析，關(guān)于其的蛋白質(zhì)序列可在1962至2003年收集的分離物上獲得。每個個別蛋白質(zhì)由登記號代表且就Replikin的存在進(jìn)行分析。Replikin計(jì)數(shù)(每IOO個氨基酸的Replikin數(shù)目)作為自動化Replikin分析的部分進(jìn)行自動計(jì)算。對于每一年，每年的平均(士標(biāo)準(zhǔn)差(S.D.))Replikin計(jì)數(shù)針對當(dāng)年的所有Replikin計(jì)數(shù)進(jìn)行自動計(jì)算。在流行病前，在特定病毒毒抹(冠狀病毒)中特定蛋白(核殼體蛋白)增加的復(fù)制的預(yù)警的實(shí)例比得上在流感流4于病和大流行病前流感病毒的毒4朱中可見的增加(圖6、7、10和11)?？梢钥闯鯮eplikin計(jì)數(shù)從1999年到2000年上升，與在2002年底出現(xiàn)且持續(xù)至2003年的SARS冠狀病毒大流行病一致。圖8提供關(guān)于幾種病毒毒抹的Replikin計(jì)數(shù)的曲線圖，包括從1917年到2002年的冠a犬病毒才亥殼體Replikin。III.流感中的Replikin在關(guān)于其的序列可從1918年(所述毒林首次出現(xiàn)且引發(fā)當(dāng)年的大流行病時)到2000年獲得的每一種H1N1分離物中僅存在一種Replikin"hp(v/i)tigecpkyv-(r/k)(s/t)(t/a)k"。(圖14)("v/i"指出氨基酸v或i存在于不同年份的相同位置中。)盡管H1N1僅包括一種持續(xù)的Replikin,但H1N1看起來比流感B更多產(chǎn)。在82年中關(guān)于H1N1存在95種不同的Replikin結(jié)構(gòu)，與在62年中流感B分離物^又31種不同的Replikin形成對比(圖13和14)。新Replikin結(jié)構(gòu)數(shù)目中的增加在流行病的年份中出現(xiàn)(圖13-16),且與增加的總Replikin濃度相關(guān)(圖6、7、10和11)。流感H2N2Replikin:流感H2N2負(fù)責(zé)1957年的人大流行病。關(guān)于1957年的那種毒;^木中鑒定的20種R印ikin的3種在直至1995年P(guān)ubMed上可獲得用于檢查的每一種H2N2分離物中是保守的(圖15)。ha(k/q/m)(d/n)ilekthngk(SEQIDNO:_)ha(k/q/m)(d/n)ilekthngklc(k/r)(SEQIDNO:一)kgsnyp(v/i)ak(g/r)synntsgeqmliiwq(v/i)h(SEQIDNO:一)然而，與H1N1形成對比，在1961年中的H2N2開始中僅發(fā)現(xiàn)13種另外的Replikin。新Replikin出現(xiàn)的這種貧乏與在多年中的分離物中H2N2Replikins濃度中的下降和H2N2的出現(xiàn)相關(guān)。(圖7)。流感H3N2負(fù)責(zé)1968年的人大流行病。在1968年出現(xiàn)的5種Replikin在1977年后消失，但在20世紀(jì)90年代再現(xiàn)(圖16)。持續(xù)了22年的唯一Replikin結(jié)構(gòu)是hcd(g/q)f(q/r)nekwdlf(v/i)er(s/t)k,這在1977年首次出現(xiàn)且持續(xù)直至1998年。在20世紀(jì)90年代中期12種新H3N2Replikin的出現(xiàn)(圖16)與相同時間Replikin濃度中的增加相關(guān)(圖7)，還與在近期分離物中H3N2毒林的流行連同來自這些分離物中的一些的所有Replikin的同時消失相關(guān)(圖7)，這暗示新亞抹H3N2(R)的出現(xiàn)。H3N2(Fujian)的新毒抹在2003年11月和12月中的流行證實(shí)于2001年7月9日提交的美國臨時申請系列號60/303,396中首次進(jìn)行的這個預(yù)測。圖6、7、10和11顯示流感流行病和大流行病與流感病毒中增加的Repiikin濃度相關(guān)，這是由于至少一種Replikin在其消失后至59年再現(xiàn)。同樣，僅在A毒抹中，存在新毒抹特異性Replikin組成的出現(xiàn)(圖14-16，也參見圖6和7中關(guān)于H5N1流行病前的新RepUkin數(shù)目中的增加)。Replikin濃度中經(jīng)由單個蛋白質(zhì)內(nèi)個別Replikin的重復(fù)的增加看起來在流感病毒中不存在，但在其他生物可見。IV.鵝Replikin支架我們發(fā)現(xiàn)從1917年中的鵝分離的流感病毒血凝素中的R印likin(我們命名為鵝Replikin)在下一年中負(fù)責(zé)1918年大流行病的流感的H1N1毒林中出現(xiàn)，其中僅有如下的2個置換kkg(t/s)sypklsksy(t/v)nnkgkevlvlwgvhh。表1顯示流感1917我鳥Replikin(GP)隨后在85年中基本上是保守的，盡管存在多個次要置換和與其他流感毒林的明顯易位。我們已發(fā)現(xiàn)1917年流感GR證實(shí)幾種流感毒抹之間的顯著流動性，在H1N1(1918年的大流行病)、H2N2(1957-58年的大流行病)、H3N2(1968年的大流行病、2000年在中國和俄羅斯的流行病、2003的Fujian毒林流行病)和H5N1(1997年在中國的流行病)中出現(xiàn)。在1997年它的結(jié)構(gòu)在H1N2中精確地恢復(fù)為其1918年結(jié)構(gòu)KKGSSYPKLSKSYVNNKGKEVLVLWGVHH。與增加的毒力和宿主死亡率相關(guān)的Replikin序列為預(yù)測、鑒定、和治療流感病毒的新興毒林提供靶。表1顯示鵝Replikin。在接下來90年的關(guān)于流感毒抹的數(shù)據(jù)中的所述鵝Replikin及其同源物已顯示是流感病毒的新興毒林中的毒力的有用預(yù)測器。聯(lián)系在一起作為一個系列，鵝Replikin及其同源物擬合關(guān)于Replikin支架的算法，所述算法要求一系列保守的Replikin肽，其中每一個所述Replikin肽序列包含約16個至約30個氨基酸且進(jìn)一步包括(1)末端賴氨酸和任選地緊鄰末端賴氨酸的賴氨酸；(2)末端組氨酸和緊鄰末端組氨酸的組氨酸；(3)與另一個賴氨酸殘基相距6至IO個氨基酸殘基的賴氨酸；和(4)至少約6%的賴氨酸。V.與流感中增加的毒力相關(guān)的Replikin支架序列在流感分離物中的Replikin支架序列作為流感病毒的新興毒抹中的靶和治療有用，所述分離物具有與來自已證實(shí)增加的毒力或宿主死亡率的流感分離物的一種或多種Replikin支架序列中的置換相同的氨基酸中的置換。因此本發(fā)明提供來自第一林流感病毒的分離的Replikin支架肽，其包括16個至約30個氨基酸且進(jìn)一步包括(1)末端賴氨酸和任選地緊鄰末端賴氨酸的賴氨酸；(2)末端組氨酸和緊鄰末端組氨酸的組氨酸，(3)與另一個賴氨酸殘基相距6至約IO個氨基酸的賴氨酸；和(4)至少6%的賴氨酸其中與第二才朱流感病毒的Replikin支架序列相比較，第一4木流感病毒的分離的Replikin支架序列含有氨基酸置換，其中所述氨基酸的置換不是組氨酸的置換，且其中第二抹流感病毒的Replikin支架序列包括(1)16至約30個氨基酸；(2)末端賴氨酸和任選地緊鄰末端賴氨酸的賴氨酸，(3)末端組氨酸和緊鄰末端組氨酸的組氨酸；(4)與另一個賴氨酸殘基相距6至約IO個氨基酸的賴氨酸；和(5)至少6%的賴氨酸，以及其中所述置換另外存在于第三抹流感病毒的Replikin支架序列中，其包括(1)16至約30個氨基酸；(2)末端賴氨酸和任選地緊鄰末端賴氨酸的賴氨酸；(3)末端組氨酸和緊鄰末端組氨酸的組氨酸；(4)與另一個賴氨酸殘基相距6至約IO個氨基酸的賴氨酸；和(5)至少6%的賴氨酸；以及其中與第二林流感病毒相比較，第三林流感病毒中的置換的存在與復(fù)制、毒力或宿主死亡率中的增加相關(guān)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用第一林流感病毒的Replikin序列中的不同氨基酸殘基置換的第二抹流感病毒的Replikin序列中的氨基酸殘基定位與末端組氨酸相距5個氨基酸殘基。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第二林流感病毒的R印likin序列中的氨基酸殘基用第一林流感病毒的分離的Replikin序列中除亮氨酸之外的氨基酸殘基進(jìn)行置換。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述氨基酸被除亮氨酸之外的疏水性氨基酸置換。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述氨基酸被曱硫氨酸或異亮氨酸置換。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，分離的Replikin序列從H5N1流感病毒中進(jìn)行分離。本發(fā)明人已使用100年的流行病學(xué)數(shù)據(jù)確定，流感病毒中的Replikin濃度與病毒的毒力相關(guān)。使用相同的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，特別高度保守的Replikin序列的結(jié)構(gòu)也已與毒力和流行病相關(guān)。在相同的100年流行病學(xué)數(shù)據(jù)內(nèi)隨著時間過去的高度保守Replikin序列中個別序列變化的回顧已顯示回顧性和預(yù)期性預(yù)測能力。同樣已證實(shí)在鵝Replikin支架中的Replikin支架為治療包含鵝Replikin同源物的流感病毒的新興毒抹提供耙。例如，用稱為UTOPE的短合成Replikin序列和匙孔血藍(lán)蛋白佐劑補(bǔ)充的越南H5Nl的高致病性2004毒抹的29氨基酸Replikin支架肽(在表1中標(biāo)記為"2004H5N1越南，高致病的")當(dāng)皮下注射時在兔和雞中提供強(qiáng)免疫應(yīng)答。參見實(shí)施例7。表1提供鵝Replikin及其直至2006年的同源物。表1中的支架顯示恒定的長度、在氨基末端處恒定的賴氨酸和在羧基末端處恒定的組氨酸殘基在數(shù)十年中在固定支架中在不同的毒抹中是保守的。從1917年到2006年鵝Replikin的同源物在下述毒林中出現(xiàn)，包括各自負(fù)責(zé)1918年、1957年和1968年的3次大流行病的H1N1、H2N2和H3N2,具有在H1N2、H7N7、H5N2和H5N1之間的進(jìn)一步置換。在鵝Replikin中已出現(xiàn)的甚至某些置換趨向于為選擇性的且保持多年而不是隨機(jī)的。因此盡管通常假定氨基酸置換應(yīng)隨機(jī)發(fā)生，但事實(shí)上看起來流感中的并非所有置換都是隨機(jī)的。在數(shù)十年中的這種Replikin保守允許生產(chǎn)合成流感疫苗，所述合成流感疫苗可以快速地且廉價地預(yù)先制備且可以超過一年有效。因此，關(guān)于合成流感疫苗的靶是流感病毒中保守的Replikin支架。Replikin支架包括一系列保守肽，其包括約16至約30個氨基酸且進(jìn)一步包括(1)末端賴氨酸和緊鄰末端賴氨酸的殘基部分中任選的賴氨酸；(2)末端組氨酸和緊鄰末端組氨酸的殘基部分中的另一個組氨酸；(3)與至少一個其他賴氨酸殘基相距約6至約10個氨基酸殘基內(nèi)的至少一個賴氨酸；和(4)在16個至約30個氨基酸肽內(nèi)至少約6%的賴氨酸。Replikin支架肽也指一系列Replikin支架的個別成員或多個成員。關(guān)于合成流感疫苗的非限制性和優(yōu)選的靶是流感病毒Replikin支架，其包括約29個氨基酸的序列和緊鄰末端賴氨酸的賴氨酸。在另一個優(yōu)選的耙中，與Replikin支架的末端組氨酸相距5個氨基酸殘基的亮氨酸由另一種氨基酸置換。在另一個優(yōu)選的靶中，亮氨酸的置換用疏水性氨基酸進(jìn)行。在另一個優(yōu)選的靶中，亮氨酸的置換用曱硫氨酸或異亮氨酸進(jìn)行。關(guān)于合成流感疫苗的較不優(yōu)選的靶可以是在第一抹流感病毒中的外骨骼支架，其包括約29個氨基酸的第一種肽和(1)末端賴氨酸和緊鄰末端賴氨酸的賴氨酸；(2)末端組氨酸和緊鄰末端組氨酸的組氨酸；(3)與任何其他賴氨酸相距6至IO個氨基酸殘基內(nèi)無賴氨酸其中病毒的第一株或另一抹早期出現(xiàn)的樣品包括約29個氨基酸的Replikin支架。在表1中，鵝Replikin及其同源物的歷史可從1917年追蹤至現(xiàn)在的禽類H5N1病毒的爆發(fā)。表1證實(shí)在流感的強(qiáng)毒抹中鵝Replikin的"支架"同源物的保守。表1通過年或更小的時間段舉例說明鵝Replikin及其在其他流感Replikin中的同源物的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的存在的歷史。表1進(jìn)一步舉例說明在那些同源物中的氨基酸置換和Replikin結(jié)構(gòu)的某些氨基酸的保守的歷史，這對于Replikin的確定和由Replikin提供的快速復(fù)制的功能是必需的。表1:Replikin支架顯示與快速復(fù)制相關(guān)的流感病毒Replikin肽在89年保守中的有序置換，從1917年鵝流感Replikin和1918年人大流行病Replikin到2006年H5N1"禽流感"同源物毒抹H1N—流感鵝ReplikinHlNl人流感大流行病H1N1HONIH1N1H1N1H1N1H1N1H1N1H1N1H畫H1N1H1N1H1N1H1N1H1NIH1N1H1N1H1N1H1N1<c-------------29^^^w酸----------々〗年kkgtsypklsksytTmkgkevlvlwgvhli1917kk,sypklsksy^rmkgkevlvlwgvhh1918kk鳴sypklsksy^xmlcgfcevlvlwgvhh1930kkg^sypkl國sy^nnkgkevlvlwgvhh1933kkgtsypklsksytrmkgkevlvlwgvhh1976kkgtsypklsksyt皿kgkevlvlwgvhh1977kk,sypklsksyt皿kgkevlv^wgvhh1979kkg^sypklsksytimkgkevlvi|wgvhh1980kkgtsypklsksytnnkgkevlvlwgvhh1980kkg§sypklsJcsytrmkgkevlv§wgvlih1981kkgtsypklsksyt皿kgkevlvlwgvhh1981kkgtsypklsksytnnkgkevlvlwgvlih1985kkg^sypklsksytrmfcgkevlviwgvhh1991kkg一Ypklsksytrmkgkevlvi"wgvhh1992kkg^sypklsksytrmkgkevlviwgvhh1996kkg魯sypklsksyt'rm)cgkevlv;twgvhli1996kk,sypklsksy,nkgkevlvlwgvhh1997kkg一sypklsksy^nnkgkevlvlwgvlxh1998kkg^sypklsksy"tnnkgkevlv,wgvhl11999kkg咖sypklsksyt皿kgkevlv!iwgvhh2000kk,sypklsksyt皿kgkevlv||wgvliliJck,sypkl、sksyt,rmkgJcevlv義wgvhhkk,syp塌sks^rm,Jcevlvlw,hhkk,sypklsksy^rmk^lcevlv紫w,hhkkgts,ypl^1sksytrm,kevlvlwgvhh暑yp，lsksya、nn,Jcev1\1wgvhhs、syJn、nJ^kevl議lwgvhhH)wgvhli:辱hlw,hhllylwg頁hli;lvlwg一h!lvlw,hhlvlwg一hhilvlw,hl1llvlwg一hhlvlwg^hh|lvlwg||hllvlwg餐hh|lvlwg^hh2001H1N12002H1N11999H1N2流感2000H1N22001H1N22001H1N22002H1N22002H1N21957H2N2人流感大流行病1957H2N2人流感大流4亍病l968KBN2人流感大流行病!hh1979-2003H7N7'流遂'20021959197519811983198819961997l柳19992000200120012002200220022003200320032003200420042004200420042004房4200420052006H5N2H5NH5NH5NH5N:H5N.H5NH5NH5N:H5NH5NH5NH5NH5N'H5NH5NH5NH5N'H5NH5NH5NH5NH5NH5NH5NH5NH5NH5N流感流感(Scotland)(Wisconsin)(Minnesota)(Pennsylvania)(Scotland)(中國)(+國)(中國)(中國)(中國)(t國)(+國)(中國)(泰國)(越南)(越南)(泰國)(Sindong,中國)(中國)(越南，高致病的)(越南，"高致病的"越南，高致病的(泰國，高致病的)高致病的)高致病的)"高致病的"(泰國，(中國，(中國，曰本H5N1土耳其HSN1中國(安樣t)鷗),鵝)lv|wg|hh"OSHSN1印度尼西亞(高致病的)*與鵝Replikin氨基酸相同的殘基是無陰影的；氨基酸置換是淺色和深色陰影的以顯示跨越年份和毒抹的支架模式。在2004年和2006年H5N1、1957年H2N2、1968年H3N2和H7N7中在位置24處的置換是有方框的。表1的回顧舉例說明如果氨基酸的隨機(jī)置換在從1917年至今的流感強(qiáng)毒林中出現(xiàn)，那么鷸Replikin的某些構(gòu)架氨基酸在其中流行病發(fā)生的毒株中每年將不是保守的。然而，與起因于隨機(jī)置換的相反的是，32每年流感的強(qiáng)毒林在限定Replikin的那些位置處一直包含保守氨基酸。即，如果在限定Replikin的氨基酸之一(例如賴氨酸或組氨酸)中發(fā)生置換，那么將喪失Replikin的限定。然而，所述Replikin序列在超過85年中是保守的。因此，因?yàn)榇嬖谀承┌被嵩跀?shù)十年中的保守，所以置換就不能說成完全隨機(jī)的。置換的確在Replikin的限定不必要的氨基酸(即除賴氨酸或組氨酸之外的氨基酸)中發(fā)生置換的事實(shí)證實(shí)Replikin在毒林的致病性中的重要性。從表l可以進(jìn)一步注意到，當(dāng)置換的確發(fā)生時，可見它們在Replikin支架的某些顯著優(yōu)選的位置處發(fā)生。表1舉例說明在位置1、3-24和26-27處復(fù)發(fā)的置換。另外，盡管這些位置自始至終發(fā)生置換，但賴氨酸繼續(xù)在與第2個賴氨酸(其在這些強(qiáng)毒抹中未被置換)相距6至10個氨基酸的位置處存在。即使在29氨基酸序列段內(nèi)存在賴氨酸位置的置換時，如在1957年所見的，當(dāng)位置11處的K移動至位置10時，那個新位置已維持直至2005年，同樣使YP、AY、N(位置15)和LVLWG保存Replikin支架的同源結(jié)構(gòu)，除少數(shù)例外。重要的是指出在中國(安微)H5N1的2006林的Replikin支架中已出現(xiàn)額外的K。額外的K的這種存在顯示Replikin支架內(nèi)Replikin計(jì)數(shù)中的增加。2006中國(安微)毒抹具有6.6的Replikin計(jì)數(shù)(如下所述)。6.6的Replikin計(jì)數(shù)是對于H5N1毒抹以往觀察到的最高值，且在整個流感A毒抹中僅可與引起1918年大流行病的流感毒林的Replikin計(jì)數(shù)比較。如果這個初始2006年報(bào)告被重復(fù)且維持，那么它可能指出分別在2004年和2005年中的4.5和4.0計(jì)數(shù)將基本上增加，且預(yù)示H5N1"禽流感，，持續(xù)或增加的流行。當(dāng)Replikin支架退化為非Replikin序列但維持與Replikin支架的支架結(jié)構(gòu)的可鑒定同源性時，已回顧包含Replikin支架序列的流感病毒的早期強(qiáng)毒林以確定對復(fù)制速率和毒力的作用。已發(fā)現(xiàn)在Replikin支架中的內(nèi)部Ks和Hs的喪失(如與在末端處的那些不同)，從而使其不再代表在29個氨基酸內(nèi)例如小于2或3個包括的replikins，或者甚至根本不再是replikin,但保留外部"殼"，例如但不限于支架的29個氨基酸KKXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXHH,在流行病或爆發(fā)結(jié)束時一般喪失其高replikin計(jì)數(shù)及其毒力的分離物的病毒序列中經(jīng)常"(或不完全合成)，實(shí)際上和其在Replikin計(jì)數(shù)中的下降一道，用作為爆發(fā)或流行病的失敗的另一個指數(shù)，正如完全表現(xiàn)的支架的出現(xiàn)，具有內(nèi)部Ks和Hs,產(chǎn)生更多Replikin,及因此更高的Replikin計(jì)數(shù)(當(dāng)Replikin計(jì)數(shù)超過3且上升時，這種出現(xiàn)經(jīng)常發(fā)生)用作爆發(fā)或流行病的即將出現(xiàn)的指數(shù)。除這種實(shí)際用途之外，這種殼現(xiàn)象是下述的另一個"原理論證(proofofprinciple)，，證據(jù)Replikin支架是關(guān)鍵的病毒結(jié)構(gòu)元件，而不是在被認(rèn)識前，具有在爆發(fā)和流行病時與病毒"成功"密切相關(guān)的功能。例如，具有Replikin支架的特定流感種類早期出現(xiàn)的樣品隨后如下改變1)保持29個氨基酸的長度；2)保持最初2個氨基酸位置(1和2),即KK;3)保持最后2個氨基酸位置(28和29)，即HH;4)但不再存在與KK相距6至IO個氨基酸的K(Replikin的限定所需的)。同樣，所述支架不再是Replikin支架，但現(xiàn)在已是支架外骨骼。盡管Replikin支架與高Replikin計(jì)數(shù)和流行病的出現(xiàn)相關(guān)，但支架外骨骼與病毒休眠和流行病的減弱或結(jié)束相關(guān)。因此當(dāng)Replikin支架和特定病毒爆發(fā)減弱時，支架外骨骼表現(xiàn)為剩下作為殘基的退化結(jié)構(gòu)，因此是用于此目的有用的診斷結(jié)構(gòu)。這證實(shí)Replikin支架作為l)用于抗快速復(fù)制試劑諸如抗體或小抑制RNA的靶和2)抗病毒疫苗的基礎(chǔ)的啟示和用途。通過下述事實(shí)可見Replikin支架的完整性和保守存在優(yōu)選地固定的29氨基酸序列，其由兩個賴氨酸開始且由兩個組氨酸終止。較不優(yōu)選地，所述支架在長度上是16至約30個氨基酸。氨基酸置換不破壞支架結(jié)構(gòu)的Replikin支架中的置換看起來對于特定氨基酸無限制。然而，因?yàn)槟承┌被峁蚕韺﹄牡慕Y(jié)構(gòu)和功能具有相似作用的共同的化學(xué)性質(zhì)，所以假定用相似氨基酸置換對Replikin序列共有相似結(jié)構(gòu)作用的一個氨基酸比氨基酸經(jīng)由來自不同組的另一個氨基酸置換更有可能。氨基酸可以被分成4類，酸性、堿性、親水性和疏水性。假定在特定組中的氨基酸將更可能由其組內(nèi)的氨基酸而不是不同組中的氨基酸置換。具有酸性側(cè)鏈的酸性組包括天冬氨酸和谷氨酸。具有堿性側(cè)鏈的堿性組包括組氨酸、賴氨酸和精氨酸。具有極性中性側(cè)鏈的中性親水組包括天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、蘇氨酸、絲氨酸和半胱氨酸。具有非極性中性側(cè)鏈的疏水組包括甲疏氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、纈氨酸和亮氨酸。同樣，如在本發(fā)明內(nèi)預(yù)期的，在Replikin支架序列中的特定氨基酸的優(yōu)選置換將是與被置換氨基酸相同的氨基酸組內(nèi)的置換。例如，假定亮氨酸將更可能由曱硫氨酸而不是谷氨酸置換，且曱硫氨酸的置換將更可能不破壞肽的特定部分的某一功能。Replikin支架的H5N1流感保守已存在高死亡率H5N1"禽流感"在幾個國家中的目前爆發(fā)可能代表未到的流感大流行病的第一階段的擔(dān)心。有報(bào)告(UngchusakK等人NEngJMed2005Jan27;352(4):323-5)提示在H5N1第一種可能的人到人傳染中，"病毒基因的測序沒有鑒定到在病毒的血凝素的受體結(jié)合部位或其他主要特征中的變化。所有8種病毒基因區(qū)段的序列與來自泰國的近期禽類分離物的其他H5N1序列緊密聚簇"。系統(tǒng)發(fā)生分析暗示由于不存在"與人流感病毒的重排列"的證據(jù)，H5N1不是新變體。然而我們目前報(bào)道在特定H5N1蛋白質(zhì)序列中在位點(diǎn)處的3種近期變化，所述位點(diǎn)在最后2次H5N1流行病中未改變且事實(shí)上自從1959年已是保守的。以前，不存在與病毒流行病和休眠相關(guān)的蛋白質(zhì)化學(xué)。我們發(fā)現(xiàn)上個世紀(jì)的3次流感大流行病中的每一次——H1N1、H2N2和H3N2,回顧性地由病毒中特定種類的肽濃度中的增加預(yù)測且與病毒中特定種類的肽濃度中的增加相關(guān)，所述肽富含賴氨酸和組氨酸，與快速復(fù)制相關(guān)，稱為Replikin。我們目前已再次發(fā)現(xiàn)Replikin在3次H5N1流行病(在1997年、2001年和2003-2004年)中的每一次是預(yù)示性的(圖11)。它們在分離物中出現(xiàn)的每一年，目前可以如圖11中所示以每100個氨基酸計(jì)數(shù)Replikin,并且如表1中分析且比較它們的序列。為了計(jì)數(shù)可獲得的序列信息中的Replikin濃度，Replikin的分析可以人工完成，或在本發(fā)明的優(yōu)選方面通過軟件自動完成。在圖11中可見舉例說明3次"禽流感"流行病爆發(fā)前的流感H5N1毒抹的血凝素蛋白中的Replikin模式濃度中的快速增加的曲線圖。圖11的回顧舉例說明H5N1的血凝素蛋白質(zhì)中漸增的Replikin濃度("Replikin計(jì)數(shù)")在3次"禽流感"流行病之前。例如，在1995年至1997年中Replikin計(jì)數(shù)(平均值+ASD)中的增加在1997年的香港H5N1流行病(E1)之前。從1999年到2001年Replikin計(jì)數(shù)中的增加在2001年的流行病(E2)之前。且從2002年到2004年Replikin計(jì)數(shù)中的增加在2004年中的流行病(E3)之前。1999年中的下降伴隨響應(yīng)于香港中的El流行病大量淘汰家禽而發(fā)生。除在病毒蛋白質(zhì)中的Replikin總數(shù)目之外，每個Replikin經(jīng)過時間的結(jié)構(gòu)是提供信息的且為疫苗和其他治療例如抗體和小RNA提供輩巴。如上所述，表1顯示1917年(鵝Replikin)中被流感感染的鵝中首次觀察到的Replikin。恒定的長度、在氨基末端處恒定的賴氨酸和在羧基末端處的組氨酸殘基數(shù)十年在固定支架中在不同的毒抹中是保守的。從1917年到2006年鵝Replikin的同源物在下述毒才朱中出現(xiàn)，包括各自負(fù)責(zé)〗918年、1957年和19681年的3次大流行病的H1N1、H2N2和H3N2，且具有在H1N2、H7N7、H5N2和H5N1之間的進(jìn)一步置換。在鵝Replikin中已出現(xiàn)的甚至某些置換趨向?yàn)檫x擇性的且保持多年而不是隨機(jī)的。因此盡管通常假定氨基酸置換應(yīng)隨機(jī)發(fā)生，但事實(shí)上看起來流感中的并非所有置換都是隨機(jī)的。在數(shù)十年中這種Replikin保守允許生產(chǎn)合成流感疫苗，所述合成流感疫苗可以快速地且廉價地預(yù)先制備且可以超過一年有效。在1997年H5N1香港流行病中，人死亡率是約27%。在2004年，在亞洲報(bào)告已被H5N1感染的52個人大約70%死亡。最近，從2004年12月28日到2005年1月27日在越南的11個病例中9例死亡。盡管所述病毒的毒力看起來已增加，但被認(rèn)為在人與人間進(jìn)一步傳播所需的任何變化被認(rèn)為仍尚未發(fā)生。然而，我們目前已觀察到來自2004年的越南、泰國和中國中的分離物的鵝Replikin支架的位置編號18、24和28處的3個H5N1Replikin氨基酸殘基中的近期置換(參見表1)。在位置編號24處的置換自從H5N1在1959年出現(xiàn)后未發(fā)生，但存在于由其他毒抹引起的最后2次流感大流行病和由H7N7引起的近期烈性流行病中，所述其他毒林是1957年中的H2N2和1968年中的H3N2,一起負(fù)責(zé)超過兩百萬人死亡(參見表1)。盡管這些僅是可能的危險的暗示，但與圖11中所示上升的Replikin計(jì)數(shù)組合的關(guān)于置換的這些數(shù)據(jù)，以及此種Replikin數(shù)據(jù)與大流行病的過去相關(guān)，不會給出與得自該病毒不太可能在人與人之間傳播的系統(tǒng)發(fā)生分析的那種相同的再保證。表1證實(shí)Replikin支架在流感的強(qiáng)菌抹中的完整性。如上所述，可見Replikin支架退化成外骨骼支架以減少致病性。因此，通過下述事實(shí)可見Replikin支架的完整性和保守通常存在以2個賴氨酸開始且以2個組氨酸結(jié)束的固定的29氨基酸序列。本發(fā)明的一個方面是Replikin結(jié)構(gòu)和功能的組合，以跟蹤病毒的致病性或復(fù)制速率、流行病或大流行病，或者以預(yù)測流行病或大流行病的出現(xiàn)。這種組合的實(shí)例是本發(fā)明的Replikin算法用于計(jì)數(shù)流感毒林(例如1918年的毒抹和H5N1的目前H5N1毒林)中的Replikin計(jì)數(shù)中的增加的能力。1918年流感大流行病的Replikin計(jì)數(shù)和"禽流感"的目前爆發(fā)證實(shí)根據(jù)本發(fā)明且由通過本發(fā)明變得可能的這個示例性方面的預(yù)測能力。在印度尼西亞和越南的人H5N1毒抹中所發(fā)現(xiàn)的單個置換不存在于先前的H5N1毒抹中，但在歷史上存在于1957年(H2N2)和1968年(H3N2)的最近2次殺傷性的人大流行病中表1的上述回顧揭示了負(fù)責(zé)1957年的高死亡率流感大流行病的流感H2N2毒抹以及負(fù)責(zé)1968年的高死亡率流感大流行病的流感H3N2毒抹，都包含在鵝Replikin支架中在氨基酸編號24處的單個氨基酸置換。參見表l。申請人已最新發(fā)現(xiàn)并在本文中報(bào)道，印度尼西亞和越南的人中發(fā)現(xiàn)的H5N1病毒蛋白質(zhì)中的近期單個氨基酸置換也具有在鵝Replikin中在氨基酸編號24處的置換。從印度尼西亞和越南的人中近期分離的H5N1鵝Replikin肽是KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLV(M/I)WGIHH，其中H5N1的印度尼西亞毒林包含在位置24處的異亮氨酸，且H5N1的越南毒林包含在位置24處的甲硫氨酸。如上所述，申請人教導(dǎo)在氨基酸24處的置換預(yù)示增加的毒力和人類大流行病。在人中近期分離的H5N1的印度尼西亞毒林是重要的，因?yàn)镠5N1的鵝Replikin中在氨基酸編號24處的置換(本文命名為"S"置換)在所37有早期H5N1毒抹中不存在，但存在于1957年(H2N2)和1968年(H3N2)的最后2次高死亡率流感大流行病中。1957年和1968年的大流行病負(fù)責(zé)數(shù)百萬人的死亡。在位置24處的氨基酸置換同樣存在于具有一人死亡的近期(幸運(yùn)的是很短暫)H7N7爆發(fā)。參見表l。然而，在H5N1鵝Replikin中在位置24處的氨基酸置換在來自從1959年至今(2006年)的所有分析和記錄的H5N1分離物中不存在。在美國國家醫(yī)學(xué)圖書館(NationalLibraryofMedicine)(PubMed)中超過1200萬個條目的檢查檢測氨基酸序列中的S置換，并且借助FluForecast⑧軟件(參見www.Replikins.com)跟蹤其中S經(jīng)過多年出現(xiàn)的序列。在來自雞的近期H5N1分離物中未觀察到S置換。相反，最近僅在具有高死亡率的病例中來自人的H5N1分離物中觀察到S置換。在來自2004年的越南和2006年的印度尼西亞的人的分離物中觀察到S置換。參見表1。越南和印度尼西亞的人中的流行病學(xué)證據(jù)暗示在H5N1鵝Replikin中的S置換和人與人"簇，，相關(guān)，其中尚未確定從禽類到人的傳播且尚未排除人與人傳播。S置換暗示H5N1的人傳人可能已發(fā)生，盡管迄今為止不常發(fā)生。世界衛(wèi)生組織(WorldHealthOrganization)和美國疾病控制中心(U.S.CentersforDiseaseControl)發(fā)言人最近已宣布，在來自高死亡率H5N1印度尼西亞人病例的H5N1分離物中尚未觀察到"顯著的，，令人擔(dān)憂的序列變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為在可能發(fā)生人到人傳染前需要顯著的序列變化。同樣，"顯著的"序列變化被認(rèn)為關(guān)于人大流行病是必要的先決條件。S置換和人與人"簇"的近期相關(guān)暗示，出乎意料地，在H5N1的人與人傳播前由WHO和CDC所預(yù)期的"顯著的"序列變化可以在如前所預(yù)測的鵝Replikin支架內(nèi)的單個氨基酸變化中發(fā)現(xiàn)。盡管已發(fā)現(xiàn)鵝Replikin病毒肽在H1N1、H2N2、H2N3和H5N1中高度保守88年(從1917年至今)的事實(shí)，但在鵝Replikin內(nèi)在特別保守的位置——位置24處已鑒定了驚人的突變——S突變。如上文已確定的，蛋白質(zhì)中Replikin濃度中的增加已與快速復(fù)制和流行病相關(guān)。參見例如，圖6、7、8、lO和ll。發(fā)現(xiàn)上升的"Replikin計(jì)數(shù)"(每100個氨基酸的Replikin數(shù)目)與每一次主要流感流行病(上世紀(jì)的最后3次流感大流行病和從1997年至今的最后3次H5N1流行病)在數(shù)量上相關(guān)，且通常預(yù)先預(yù)示每一次主要流感流行病。參見圖6、7、8、10和11。單個置換例如S置換單獨(dú)地可能不是大流行病的唯一原因。然而，S置換的出現(xiàn)已是1957年和1968年中的最后2次高死亡率大流行病中的標(biāo)記。另外，唯一在人中且從未在雞中(至今)出現(xiàn)的H5N1中S置換，伴隨著高R印likin計(jì)數(shù)和高死亡率，整個地暗示H5N1可能的確在通向人類大流行病的道路上。暗示即將到來的人大流行病的更高可能性的證據(jù)與先前更令人鼓舞的估定(在鑒定S置換與高Replikin計(jì)數(shù)和高死亡率組合之前做出的)形成鮮明對比。同樣，即使當(dāng)S置換的詳細(xì)功能未完全了解時，該證據(jù)暗示與增加的Replikin計(jì)數(shù)組合的S置換的流行病學(xué)功能是顯然的。什么最終決定來自H5N1具體化的全力(full-force)大流行是否發(fā)生且何時發(fā)生仍是未知的。H5N1的最終置換結(jié)構(gòu)的信息的先前缺少(其可能是下次大流行病的試劑)已使生產(chǎn)合適的疫苗的努力停止。本文所公開的Replikin肽結(jié)構(gòu)和鵝Replikin支架為生產(chǎn)針對可能即將到來的大流行病的疫苗提供必要的方向。作為靶的S置換的Replikin支架在表l中標(biāo)記為"1957年H2N2人流感大流行病"、"1968年H3N2人流感大流行病"、"1979-2003年H7N7流感"、"2004年H5N1(越南,高致病的)"和"2006年H5N1印度尼西亞(高致病的)"的序列中提供通過流感病毒的新興毒抹中的Replikin支架中的預(yù)言性置換提供的用于合成疫苗的靶的非限制性實(shí)例。如上所述，與表1中的鵝Replikin和所/^開的全部其他序列相比4交，在1957年和1968年大流4于病毒斗朱中用異亮氨酸置換亮氨酸以及在1979-2003年H7N7毒林中用異亮氨酸置換亮氨酸提供下述預(yù)測權(quán)重在2004年越南的H5N1新興毒林中用甲硫氨酸近期置換亮氨酸和在2006年印度尼西亞的H5N1新興毒林中用異亮氨酸置換亮氨酸，將導(dǎo)致毒力中的持續(xù)增加。與人到人傳染的一些證據(jù)偶聯(lián)的越南和印度尼西亞中的高死亡率暗示毒力事實(shí)上已在這些置換毒抹中增加。因此，這些毒抹的置換的Replikin支架肽是用于開發(fā)合成疫苗的Replikin支架肽的非限制性優(yōu)選實(shí)施方案。本發(fā)明39的另一個非限制性實(shí)施方案是2004年從越南分離的置換H5N1和2006年從印度尼西亞分離的置換H5N1的Replikin支架肽，其中從末端組氨酸起的第5個位置由除亮氨酸之外的任何氨基酸殘基置換。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Replikin支架肽在從末端組氨酸起的第5個位置處用除亮氨酸之外的任何疏水性氨基酸置換。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，1957年H2N2大流行病毒才朱、1968年H3N2大流行病毒抹中和1979-2003年H7N7毒4朱的支架肽也為針對這些新興毒抹的合成疫苗提供同源靶。因此，本發(fā)明還^是供本發(fā)明的分離的Replikin肽，其中Replikin肽包含約29個氨基酸。所述分離的Replikin肽可以包含氨基酸序列KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLV[S]WGIHH,其中[S]可以是與第二林流感病毒相比較被置換的任何氨基酸，所述第二抹流感病毒否則包括約相同的Replikin肽序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，[S]可以是疏水性氨基酸。在更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，[S]可以是曱疏氨酸或異亮氨酸。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，上文體現(xiàn)的序列從流感的H5N1毒4^中進(jìn)行分離。VI.使用Replikin支架預(yù)測流感毒力中的增加的方法隨著時間過去Replikin支架的歷史數(shù)據(jù)為預(yù)測流感病毒的新興毒抹的毒力提供了工具。如果流感病毒的毒林的所述毒抹隨著時間過去在Replikin濃度中增加，那么它是流感病毒的新興毒抹且毒力中的增加是可預(yù)測的。如果流感病毒的新興毒株包括在Replikin支架肽中的氨基酸置換，其與歷史上已具有高度毒力的流感病毒毒抹的毒力和宿主死亡率中的增加相關(guān)，那么可以預(yù)測所述新興毒抹具有毒力中的增力口。因此，本發(fā)明提供預(yù)測流感病毒第一抹中的復(fù)制、毒力或宿主死亡率中的增加的方法，其包括(1)鑒定包括多個Replikin支架肽的流感病毒Replikin支架，其中所述Replikin支架包括從第一抹流感病毒中分離的第一種Replikin支架肽、從第二林流感病毒中分離的第二種Replikin支架肽和從第三才朱流感病毒中分離的第三種Replikin支架肽，(2)鑒定與第二種Replikin支架肽相比較，第三種Replikin支架肽中被置換的氨基酸，(3)確定與第二抹流感病毒相比較，第三林流感病毒表現(xiàn)增加的復(fù)制、毒力或宿主死亡率，(4)確定與第二種R印likin支架肽相比較在第三種Replikin支架中被置換的氨基酸殘基位于與第二種Replikin支架相比較在第一種Replikin支架肽中的氨基酸殘基置換相同的殘基位置，(5)使第一抹流感病毒的Replikin計(jì)數(shù)與第一林流感病毒的早期分離物的Replikin計(jì)凄t比4交，(6)確定第一林流感病毒的Replikin計(jì)數(shù)大于第一抹流感病毒的早期出現(xiàn)的分離物的Replikin計(jì)凄史，(7)預(yù)測與第二抹流感病毒相比較，第一株流感病毒中的復(fù)制、毒力或宿主死亡率中的增加。例如，如上所述和表1中所公開的，用1957年和1968年H2N2和H3N2的大流行病毒林中的異亮氨酸和在1979-2003年的H7N7毒林中的異亮氨酸置換在公開的Replikin支架中的鵝Replikin及其同源物中的亮氨酸提供下述預(yù)測權(quán)重在2004年越南的H5N1新興毒林中用曱硫氨酸近期置換亮氨酸和在2006年印度尼西亞的H5N1新興毒抹中用異亮氨酸置換亮氨酸，將導(dǎo)致毒力中的持續(xù)增加。如從高死亡率和人之間傳染的偶聯(lián)證據(jù)可見的，在越南和印度尼西亞毒抹中的毒力已明顯增加。因此，在本發(fā)明方法的非限制性優(yōu)選實(shí)施方案中，第一抹流感病毒的Replikin支架肽已經(jīng)歷亮氨酸對任何其他氨基酸的置換。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，置換已用除亮氨酸之外的任何性疏水氨基酸進(jìn)行。在更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，置換已用曱硫氨酸或異亮氨酸進(jìn)行。在另外一個優(yōu)選實(shí)施方案中，在第一林流感病毒的Replikin支架肽中的置換是在Replikin支架的位置24處或可替代的在從末端組氨酸起第5個殘基位置處。本發(fā)明還提供用于預(yù)測大流行病的方法，其包括分離和測序病毒DNA、就編碼的氨基酸序列掃描所得的序列、以及遵循本文所述的用于氨基酸序列的預(yù)測方法。核酸序列與氨基酸序列同源，如果其編碼氨基酸的序列的話。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，用于預(yù)測大流行病的方法包括掃描所得核酸序列、確定在鵝Replikin的位置24處的變化、以及基于在H5N1的鵝Replikin中的S置換的存在預(yù)測將來的大流行病。上述非限制性方法可以用于已發(fā)現(xiàn)或可能在下文公開的任何Replikin支架系列。VII.使用Replikin預(yù)測增加的流感毒力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還提供通過監(jiān)控Replikin序列中隨著時間過去、地理學(xué)或流行病學(xué)事件的變化來預(yù)測流感病毒的毒株中的復(fù)制、毒力或宿主死亡率中的增加的非限制性方法。預(yù)測流感病毒的毒林中的復(fù)制、毒力或宿主死亡率中增加的方法包括(1)鑒定第一4朱流感病毒，其中流感病毒的毒4朱的Replikin計(jì)數(shù)大于第一抹流感病毒早期出現(xiàn)的分離物的Replikin計(jì)數(shù)，(2)鑒定第一抹流感病毒中的第一種Replikin肽，(3)鑒定第二林流感病毒中的第二種Replikin肽，其要不是氨基酸置換則與第一種Replikin肽同源，其中所述氨基酸置換不在組氨酸殘基處進(jìn)行，(4)鑒定第三抹流感病毒中的第三種Replikin肽，其要不是氨基酸置換則與第二種Replikin肽同源，所述氨基酸置換在與第一種Replikin肽中氨基酸置換的相同位置處，(5)確定第三抹流感病毒表現(xiàn)超過第二林流感病毒的增加的復(fù)制、毒力或宿主死亡率，(6)預(yù)測第一林流感病毒將表現(xiàn)超過第二林流感病毒的增加的復(fù)制、毒力或宿主死亡率。在本方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述氨基酸置換不在賴氨酸殘基或組氨酸殘基處進(jìn)行。所述Replikin算法必須滿足所述第一種、第二種和第三種Replikin肽的每一種。本發(fā)明進(jìn)一步4是供從流感的H5N1毒才朱中分離出的流感Replikin肽。VIII.蟲下白斑病病毒中的同源支架序列本發(fā)明人已進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)與迄今為止與就Replikin檢查的所有其他病毒和生物(癡疾除外)相比較，白斑病蝦病毒具有特別高的Replikin計(jì)數(shù)。盡管Replikin已顯示是真菌、酵母、病毒、細(xì)菌、藻類和癌細(xì)胞中快速復(fù)制的基本伴隨物，但本發(fā)明人已提供Replikin在除藻類之外的海洋生物中存在的第一次證實(shí)。而且，與藻類一樣，Replikin的存在再次與快速感染有關(guān)。在蝦中，白斑病病毒已首先在東方國家、并且目前在西半球國家中毀滅了數(shù)百萬美元的蝦收獲。目前沒有有效的預(yù)防或治療。Replikin高死亡率海洋病毒疾病的其他實(shí)例已在魚類例如鯉魚中得到證實(shí)，且出血性疾病在鮭魚中得到證實(shí)，并且可能在海洋生態(tài)學(xué)和疾病中廣泛分布。奸白斑病綜合征病毒(WSSV)的核殼體蛋白的Replikin重復(fù)序列的存在解釋異常高的R印likin計(jì)數(shù)103.8。這種病毒Replikin計(jì)數(shù)比例如流感病毒的Replikin計(jì)數(shù)(其通常的范圍為小于1直至最高5或7)高得多，且僅可與在惡性瘧蟲(瘧疾)中觀察到的記錄Replikin計(jì)數(shù)111(迄今為止)比較。有趣的是，盡管蝦白斑病綜合征生物是病毒，并且惡性癡蟲是錐蟲，但二者在紅細(xì)胞中度過其生殖周期中基本部分，所述紅細(xì)胞是在奸(白斑病病毒)或人(癡疾)中的罕見宿主細(xì)胞，二者都是具有其宿主的高死亡率的暴發(fā)性快速宿主復(fù)制疾病，并且二者看起來都使用相同方法使其高Replikin計(jì)數(shù)增加至如此高的記錄，即Replikin重復(fù)和Replikin重疊。本發(fā)明人已確定病毒的R印likin支架部分中強(qiáng)毒流感病毒和白斑病病毒之間的關(guān)系。先前未暗示在這2種病毒之間的關(guān)系。盡管存在廣泛的置換，但本申請人的蝦白斑病綜合征病毒的幾種短Replikin的發(fā)現(xiàn)證實(shí)與流感病毒Replikin序列顯著的同源性，尤其是就長度以及關(guān)鍵的賴氨酸(k)和組氨酸(h)殘基(固定的支架或Replikin支架)而言，從而暗示在2個病毒組中使用Replikin生產(chǎn)的相似機(jī)制。43表2-壞白斑病支架1917H1N—流感鵝肽2002H1N1豬流感2000奸白斑病綜合征病毒2000壞白斑病綜合征病毒1968H3N2人流感大流行病1979-2003H7N7流感1957H2N2人流感大流行病1957H2N2人流感大流行病2002HSN2流感1959H5N1流感與原始1917年鵝Replikin殘基相同的殘基以中等泉色顯示。氨基酸置換以i.^l和^B顯示。另外，因?yàn)楹芏辔锓N(包括但不限于豬和禽類)已知為人流感傳染提供動物"病原體庫"，所以目前可以檢查海洋形式例如蝦病毒，具有可能用于例如豬流感和禽流感爆發(fā)的預(yù)警診斷利益。盡管在物種之間注意到一些流感病毒的相似性，且已知這些病毒物種間的轉(zhuǎn)移，但先前不存在測量病毒活性的定量方法。先前不可能就可以進(jìn)入不同物種內(nèi)的增加的活性檢查潛在的病原體庫；因此，提供預(yù)先的警告。目前可以就增加的病毒復(fù)制速率的證據(jù)及因而隨后可以轉(zhuǎn)移至其他物種的那個物種中的流行病的出現(xiàn)不斷地監(jiān)控在每個物種中的Replikin活性。這種數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持Replikin作為新類型的肽，具有其自身的歷史以及其宿主的快速復(fù)制和疾病的共有功能。具有關(guān)于其蝦宿主的高死亡率，白斑病綜合征病毒目前可以檢查其Replikin,作為病毒Replikin的早期形式或作為平行形態(tài)學(xué)分支，在任一情況下其可以很好地充當(dāng)關(guān)于禽類和動物Replikin的病原體庫，例如在流感病毒中的那些。如lavksa蹇glphlkvl攀ldvrgakgl1/ii1dv陽v§q11lil§vr1dvrgafccjl;総-r鱺眷眷q剩遂靄rma國tikr國s鬚tnqedl|其在流感和包含Replikin的其他生物中一樣，隨之而來的是這些Replikin發(fā)現(xiàn)在蟲下中的診斷和預(yù)防用途。IX.追溯至1918年大流行病的SARS病毒和H3N2-Fujian流感病毒Replikin中的同源序列某些SARS病毒Replikin肽與流感病毒分離物的幾個毒抹中的肽共享同源性，包括與鵝Replikin同源的Replikin支架序列的同源性。同源性從2006年中的強(qiáng)毒流感毒抹往回延伸至負(fù)責(zé)超過兩千萬人死亡的1918年流感大流行病的毒4朱中的序列。SARS冠狀病毒首次在2002-2003年流感季節(jié)中出現(xiàn)。來自流感GR和冠狀病毒Replikins(或來自一些未知的共有前體)的2002年SARSReplikins的雙重起源由下述事件暗示，所有事件都在2002年中發(fā)生1)從29到28個氨基酸的GR-H1N2Replikin序列中可見85年中首次濃縮(表3)(在目前流行病中從29到27個氨基酸的H3N2Fujian中發(fā)現(xiàn)相似的濃縮(表3));2)GR-H1N2的Replikin計(jì)數(shù)顯示與GR移出H1N2—致的顯著下降；3)冠狀病毒核殼體蛋白的Replikin計(jì)數(shù)顯示出顯著增加；和4)在2002-2003年出現(xiàn)的SARS冠狀病毒具有包含下述基序的Replikin:先前在GR1918和GR-H1N22001中可見的'kkg，和'k-k，；在流感GR-H1N22001中可見的'k-kk，、'kk，和'kl，；在禽支氣管炎冠狀病毒Replikin中可見的'kk，；和在豬流行性腹瀉冠狀病毒的Replikin中可見的'kk-kk-k，、'k國k，、'kk，、'kl，和'kt，(表3)。表3.從1917年到2003年不同流感毒抹中的鵝Replikin(GR)序列；2002-2003年SARS和H3N2-Fujian出現(xiàn)。與鵝RepUkin相關(guān)的Replikin'.Replikin病毒或其他生物連續(xù)氨基酸序列長度含有Replikin共有基序和/或位置--(氨基酸(除Fujian毒抹外的氨基酸置換--清楚背景數(shù)目)完全RepHHn)"濃縮的"指H1N2和H3N2-Fujian中序列長度的濃縮SE(J.IDJ購s森y^ja每fc財(cái)vfta的fe&vlva鄰伊毓743feH0s楚ypfe;uk疫yvffi3j&貧kevi夢:iw0v:fe為fn移YI!M淳3t然;Laafekk辨l^考:L幼,1day扭tfpptep缺dj^fe746747748749750'ettlgcj暴鬚leyk^^a鬚nvxmp穀kyJ^^a咖nvtmp嚴(yán)-醤):^113簾11^1:隱61,,.、—...，.，.，lri確g,fegs^vpdnenl簾tsg,議nv^a、glp騫llvlldvxg.3囊qlpl一ins囊^6fegsgvpdn，,tsqq翁Jii§lr，fxf|n||dgSlyvY^||Jtfe資aite1鬚hk^iw&'籲ir弓fv^^^dgflyvyfl紫eel魂yf簾n^|:rimpi|!flngf!"…I,lp埃dnli|,顏kr議f:r議、、&,NO.291917H1N_流感鵝Replikin(GR)291918H1N1人流感中的GR291958GRH2N2流感291964,1965,1968H2N2流感中的GR291976,'77,'80，'81,'85H1N1流感中的GR291996-2001H5N1流感中的GR291996H1N1流感中的GR291997,1998H1N1流感中的GR291999H1N2流感中的GR292000H1N2流感中的GR292001H1N2流感+的GR292001H1N2流感中的GR282002H1N2流感中的GR(濃縮的)212002-3人SARS核殼體蛋白1968-2001H3N2流感中的GR(完全的)1996H3N2Fujian流感(不完全的)754272003H3N2Fujian(濃縮24豬流行性腹瀉冠狀病毒27禽支氣管炎冠狀病毒272000奸白斑病綜合征病毒27禽支氣管炎冠狀病毒755202002-3人SARS刺突蛋白756142002-3人SARS核殼體蛋白202002-3人SARS刺突蛋白142002-3人SARS核殼體蛋白U2002-3人SARS刺突蛋白92002-3人SARS核殼體蛋白92002-3人SARS刺突蛋白72002-3人SARS核殼體蛋白11尼帕病毒，v-蛋白11亨德拉病毒，v-蛋白10新培斯病4"10EEL白血病10BRCA-1乳腺癌10卵巢癌10神經(jīng)膠質(zhì)瘤Replikin9天花病毒9HIVTAT蛋白8天花病毒8炭疽芽孢桿菌，HATPase8歐鮑拉病毒聚合酶續(xù)rs已翁c紫近期漸增的高Replikin計(jì)數(shù)峰，包括1917年鵝Replikin的存在，目前在H1N2中(表3),接近1917年R印likin計(jì)數(shù)，可以是就要來臨46的大流行病的警告，所述大流行病可能已開始，因?yàn)镾ARS病毒和H3N2-Fujian病毒是可見(圖17)與高死亡率相關(guān)的鵝Replikin的短Replikin衍生物的目前載體。因?yàn)轾ZReplikin具有至少85年的歷史，涉及大部分或全部的流感A毒抹和SARS,所以它及其組分是用于泛毒林保護(hù)的保守疫苗候選者。濃縮的短SARSReplikin,長7至21個氨基酸，與鵝Replikin相比較富含％賴氨酸和組氨酸，當(dāng)與長29個氨基酸的鵝Replikin的那種(2.5%)相比較時，與SARS的更高死亡率(10-55%)聯(lián)合發(fā)生。與SARS中的長Replikin混合的本文的短Replikin可能負(fù)責(zé)高死亡率。對于其他生物(例如歐鮑拉和天花病毒以及炭疽桿菌)的Replikin情況也是如此(表3)。這些短SARSReplikin顯示出與其他生物(例如天花、炭疽和歐鮑拉，其與甚至更高的未治療死亡率相關(guān))的短Replikin驚人的同源性(表3)。在與流感Replikin同源的SARS冠狀病毒中的Replikin檢測允許合成小SARS抗原用于疫苗。短合成疫苗可以快得多地以較少的費(fèi)用進(jìn)行生產(chǎn)，且應(yīng)該避免伴隨污染的副作用和免疫干擾，所述免疫干擾一般而言由目前的全病毒疫苗中數(shù)以千計(jì)不希望有的蛋白質(zhì)的多種表位引起。短神經(jīng)膠質(zhì)瘤Replikin'kagvaflhkk，被證明是用于合成的成功基礎(chǔ)。參見美國專利號6，242，578。它產(chǎn)生抗毒曲菌素抗體，其在皮克/細(xì)胞水平對于癌細(xì)胞是細(xì)胞毒性的，且與癌癥患者的存活定量地相關(guān)。我們合成了在核殼體、刺突和包膜蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的5種SARS短Replikin。參見實(shí)施例6。當(dāng)注射到兔內(nèi)時，我們發(fā)現(xiàn)這些合成短SARSReplikin也產(chǎn)生豐富的特異性抗體。例如，21氨基酸SARS核殼體Replikin抗體以大于1:204,800的稀度結(jié)合。因?yàn)槠渌死酶鞣N小肽達(dá)到強(qiáng)免疫應(yīng)答而無不希望有的副作用的先前未成功的嘗試，所述副作用由如在天花疫苗中的完整蛋白質(zhì)或數(shù)以千計(jì)的蛋白質(zhì)或核酸獲得，所以小合成Replikin抗原達(dá)到強(qiáng)免疫應(yīng)答的能力對于這些SARS疫苗的功效是重要的。我們檢查了流感和SARS病毒中的Replikin結(jié)構(gòu)與增加的死亡率的關(guān)系，其中結(jié)果如圖17中所示。在除流感和SARS之外的病毒中以及在細(xì)菌、癡疾和癌癥中，圖17的部分B中顯示的高死亡率生物中可見高死亡率與短或濃縮的Replikin序列的關(guān)系。支持Replikin結(jié)構(gòu)的統(tǒng)一概念以及Replikin與快速復(fù)制而不是任何細(xì)胞類型或傳染性生物的關(guān)系，加上基本Replikin結(jié)構(gòu)在廣泛范圍的病毒、細(xì)菌、疾疾和癌癥生物(其中復(fù)制對于繁殖和毒力至關(guān)重要)中的普遍，已觀察到下述同源序列注意在位置1和2中的"k"，注意"k"的比對，因?yàn)樗鼈儗⒊蔬f給DNA、RNA或其他受體或配體用于摻入或用于刺激快速復(fù)制，注意"雙k"和"多k"的頻率，注意在位置3中的"g"的頻率和最濃縮的縮短Replikin中的三聯(lián)體"kkg"、"hek"、"hdk"和"hkk"的出現(xiàn),其與最高死亡率生物、癌細(xì)胞和基因相關(guān)，與天花病毒、炭疽病毒、勞斯肉瘤病毒和多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(神經(jīng)膠質(zhì)瘤)、在結(jié)腸和乳腺癌中的c-src以及在黑素瘤和結(jié)腸癌中的c-yes—樣廣泛。還注意到關(guān)于在澳大利亞和東南亞中的2種近期新興的高死亡率病毒，尼帕病毒和亨德拉病毒幾乎相同的Replikin結(jié)構(gòu)。這2種病毒纟皮才艮道具有針對它們形成的相似或相同的抗體，但通過我們對它們的2種幾乎相同的Replikin的發(fā)現(xiàn)，到目前為止關(guān)于這點(diǎn)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)未知，關(guān)于這種相似抗體。表3還顯示我們已發(fā)現(xiàn)的2003年的5種SARSReplikin與1917年的流感鵝R印Hkin和2種冠狀病毒——禽支氣管炎冠狀病毒和豬流行性腹瀉病毒的關(guān)系。在表3和圖17中的第一種2003年人SARSReplikin顯示與下述的某些序列同源性流感病毒鵝1917和人1918R印likins到2002年中的流感H1N2的中間結(jié)構(gòu)(例如，參見在位置l、18和19中的Replikin"k")。1917鵝Replikin序列見于表3和圖17，直到1999年已在很大程度上保守，盡管在對于Replikin的限定并不至關(guān)重要的氨基酸中存在很多置換(置換以斜體表示)。隨后在2001年H1N2Replikin中發(fā)現(xiàn)原始29氨基酸1917Replikin序歹'j已幾乎精確地恢復(fù)至其1917-1918年的結(jié)構(gòu)。然而，2002H1N2流感Replikin已從29個氨基酸縮短至28個氨基酸，并且氨基酸kevl(i/v)wg(v/i)hh的"左移"是顯而易見的。在2003年，一種Replikin進(jìn)一步縮短(或壓縮)至第一個列出的2003人SARS病毒的21氨基酸Replikin。與鵝Replikin和1918年人大流行病Replikin的20.7%相比較，2003SARSReplikin的％k目前是38.1%(8/21)。與流感29氨基酸Replikin相比較，發(fā)現(xiàn)3種SARSReplikin分別進(jìn)一步縮短(或壓縮)至長19、11和9氨基酸的序列。在所示的SARS9氨基酸序列中，％k是44.4%(4/9)。伴隨SARSReplikin的縮短，與在1918年流感大流行病中的2.5%死亡率相比較，48在人中的SARS死亡率在年輕人中上升至10%，且在老年人中上升至55.5%。氨基酸序列在表3中顯示以強(qiáng)調(diào)流感R印likin85年(1917-2002年)的同源性和保守程度，關(guān)于其的證據(jù)首次在1917鵝Replikin中觀察到。以前從未觀察到此種保守。表3還舉例說明在2003人SARS病毒中的Replikin,加上與流感Replikin(其作為1917鵝R印likin和1918人大流行病流感Replikin首次出現(xiàn))具有同源性，顯示出與冠狀病毒禽支氣管炎病毒Replikin(例如，在位置1和2中的"k",以"h，，結(jié)束)和冠狀病毒急性腹瀉病毒Replikin(例如，在位置1和11中的"k",在Replikin末端處的"h")的某些序列同源性。與流感和冠狀病毒Replikins關(guān)聯(lián)的這種證據(jù)是重要的，因?yàn)镾ARS在香港中發(fā)生，如幾次近期流感流行病和早期流行病中一樣，并且SARS病毒已被分類為新冠狀病毒，部分因?yàn)樗慕Y(jié)構(gòu)，包括核殼體、刺突和包膜蛋白質(zhì)。某些流行病學(xué)證據(jù)也是相關(guān)的，因?yàn)镾ARS作為流行性肺炎在人中首次出現(xiàn)，其在其中存在糞便污水的嚴(yán)重后備(back-up)的擁擠的香港公寓房中爆發(fā)，這經(jīng)由通風(fēng)扇進(jìn)行空氣傳播。X.流感疫苗、療法和治療劑本發(fā)明還提供疫苗，其包含任何一種或多種上述分離的序列，或任何一種或多種上述分離的序列的任何抗原子序列，或者與任何一種上述分離的序列或其子序列結(jié)合的抗體。目前，用于流感的疫苗制劑在國際WHO和CDC會議上每年改變2次。疫苗制劑基于世界給定區(qū)域中的流感病毒毒林的最近優(yōu)勢的血清學(xué)證據(jù)。然而，在本發(fā)明之前，不存在流感病毒毒抹特異性氨基酸序列變化與流感流行病或大流行病出現(xiàn)的相關(guān)性。在流感病毒蛋白質(zhì)中的特定Replikin及其濃度的觀察提供流感大流行病和流行病的第一個特定定量早期化學(xué)關(guān)聯(lián)，并且提供用于生產(chǎn)和及時施用特定定制的流感疫苗，以治療在世界的特定區(qū)域中流感病毒的普遍新興或再現(xiàn)毒4朱。通過就Replikin的存在、濃度和/或保守分析流感病毒的毒林的分離物的蛋白質(zhì)序列，例如血凝素蛋白質(zhì)序列，可以預(yù)測流感病毒大流行病和流行病。此外，流感的此種夂暴發(fā)的嚴(yán)重性可以通過施用基于Replikin序列的流感肽疫苗而顯著減輕，所述Replikin序列被發(fā)現(xiàn)是病毒分離物中最豐富的或在給定時間段(例如約l至約3年)內(nèi)在病毒分離物中顯示出上升。本發(fā)明的流感肽疫苗可以包括在流感病毒毒林中觀察到的單個Replikin肽序列，或可以包括多個Replikin序列。優(yōu)選地，肽疫苗基于在給定時間段中顯示出濃度中的增加且對于至少那個時間段保守的一個或多個Replikin序列。例如，優(yōu)選的疫苗可以包括其是Replikin支架的成員的Replikin序列。Replikin支架的高度保守性質(zhì)結(jié)合Replikin支架序列與流感病毒的高度強(qiáng)毒抹的關(guān)聯(lián)使得Replikin支架序列成為用于合成疫苗的優(yōu)選序列。當(dāng)皮下施用給兔和雞時，鵝Replikin支架的成員已證明在提供強(qiáng)免疫應(yīng)答中有效。參見實(shí)施例7。本發(fā)明的疫苗可以包括與新Replikin肽組合的保守Replikin肽，或可以基于新Replikin肽序列。所述Replikin肽可以通過^f壬〗可方法進(jìn)行合成，包括化學(xué)合成或重組基因技術(shù)，且可以包括非Replikin序列，盡管基于僅包括R印likin序列的肽的疫苗是優(yōu)選的。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物也可以含有藥學(xué)上可接受的載體和/或佐劑。本發(fā)明的流感疫苗可以單獨(dú)或與抗病毒藥物(例如更昔洛韋；干擾素；白細(xì)胞介素；M2抑制劑，例如金剛烷胺，金剛乙胺；神經(jīng)氨酸酶抑制劑，例如扎那米韋和奧塞米韋；等)組合，以及與抗病毒藥物的組合聯(lián)合施用。本發(fā)明的流感疫苗可以施用于能夠在免疫應(yīng)答中產(chǎn)生抗體的任何動物。例如，本發(fā)明的流感疫苗可以被施用給兔、雞、豬或人。本發(fā)明的流感疫苗可以針對一系列流感毒抹或流感的特定毒抹。在根據(jù)本發(fā)明的非限制性方面，流感疫苗可以指向針對流感的動物或人毒抹的免疫應(yīng)答，所述毒抹包括流感B、(A)H1N1、(A)H2N2、(A)H3N2、H5N1或后來可能出現(xiàn)的病毒的任何人變體，以及主要在動物中的流感毒林例如目前的禽類H5N1。流感疫苗可以進(jìn)一步針對在流感蛋白質(zhì)的任何部分中的特定Replikin氨基酸序列。與UTOPEKKKKHKKKKH和眾所周知的匙孔血藍(lán)蛋白(Keyholelimpetcy肌in)佐劑共價連接的，包括H5N1病毒的Replikin支架KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHH的流感疫苗已在雞和兔中提供強(qiáng)免疫應(yīng)答。參見實(shí)施例7。50本發(fā)明的非限制性實(shí)施方案提供包括Replikin支架序列KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLV[S]WGIHH的流感疫苗，其中[S〗可以是與否則包含大約相同的Replikin肽序列的第二林流感病毒相比較被置換的任何氨基酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，[S]可以是疏水性氨基酸。在另外一個優(yōu)選實(shí)施方案中，[S]可以是曱硫氨酸或異亮氨酸。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，上文體現(xiàn)的序列從流感的H5N1毒4朱中進(jìn)行分離。在進(jìn)一步的非限制性方面，流感疫苗可以包括UTOPE例如KKKKH或KKKKHKKKKKH。在進(jìn)一步的備選方案中，疫苗可以包括佐劑例如眾所周知的匙孔血藍(lán)蛋白(本文用-KLH表示)的添加。在另外進(jìn)一步優(yōu)選的非限制性方面，流感疫苗可以包括流感H5N1的Replikin支架，其進(jìn)一步包括2個UTOPE和佐劑序列例如KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVMWGIHHKKKKHKKKKKHK-KLH或本發(fā)明的一個方面可以包括先前分離且在表1中且顯示為禽流感Replikin之一的Replikin支架序列，其被標(biāo)記為"2004H5N1越南，高致病的"或"2006印度尼西亞，高致病的"。伴隨皮下注射到兔和雞內(nèi)的100ug疫苗肽的施用，將預(yù)期抗體應(yīng)答為從小于1:50的未接種疫苗稀度到在接種疫苗后第3至4周中達(dá)到從1:120,000到大于1:240,000的稀度的峰值。合成Replikin疫苗(基于Replikin例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤Replikin(SEQIDNO:J"kagvaflhkk"或丙型肝炎Replikin(SEQIDNO:—)"hyppkpgcivpak，，、或HIVReplikins例如(SEQIDNO:—)"kcfncgkegh"或(SEQIDNO:)"kvylawvpahk")或優(yōu)選地基于在給定時間段中保守和/或新興或再現(xiàn)Replikin的流感疫苗可以用于增強(qiáng)抗體濃度，以溶解各自受病毒感染的細(xì)胞且細(xì)胞外釋放病毒，在其中化學(xué)治療隨后可以是有效的。當(dāng)尋求誘導(dǎo)將識別Replikin片段且與Replikin片段附著且從而導(dǎo)致細(xì)胞破壞的抗體時，優(yōu)選僅利用特定Replikin結(jié)構(gòu)。即使較大的蛋白質(zhì)序列在本領(lǐng)域中已知具有"復(fù)制相關(guān)功能"，但使用較大蛋白質(zhì)的疫苗通常已失敗或被證明是無效的。盡管本發(fā)明人不希望被束縛于單一理論，但本文的研究暗示現(xiàn)有技術(shù)疫苗是無效的，它不能以抗體和/或細(xì)胞免疫的形式產(chǎn)生足夠的免疫應(yīng)答，且因?yàn)樗鼈兓谳^大的蛋白質(zhì)序列的使用，所以不是保護(hù)性的。較大的蛋白質(zhì)序列總是具有一個或多個表位(可以誘導(dǎo)特異性抗體形成的獨(dú)立的抗原序列)；Replikin結(jié)構(gòu)通常包括這些潛在表位中的一個。通過用可能先占Replikin抗原的無關(guān)抗原刺激"充斥(flooding)"免疫系統(tǒng)，較大蛋白質(zhì)內(nèi)的其他表位的存在可以干擾針對Replikin的抗體的足夠形成。關(guān)于抗原首位(antigenicprimacy)的這種眾所周知現(xiàn)象的討論，參見例如，Webster,R.G.,J.Immunol,97(2):177-183(1966);和Webster等人，J.Infect.Dis.，134:48-58,1976;Klene誰n等人，Nature394:421-422(1998),由此由免疫系統(tǒng)呈遞且識別的第一種肽表位隨后占優(yōu)勢且產(chǎn)生針對其的抗體，即使同時呈遞其他肽表位。這是關(guān)于下述的另一個原因，在疫苗制劑中，重要的是在呈遞來自生物的其他表位之前，將恒定Replikin肽首先呈遞給免疫系統(tǒng)，從而使得Replikin并非先占而是留在免疫記憶中。定量測量針對Replikin疫苗的早期應(yīng)答在數(shù)天或幾周中定量測量針對Replikin疫苗的早期特異性抗體應(yīng)答的能力是超過其他疫苗的主要實(shí)際優(yōu)勢，對于所述其他疫苗僅在數(shù)月或數(shù)年后可以測量臨床應(yīng)答。佐劑依賴于宿主物種，各種佐劑可以用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答，所述佐劑包括但不限于，弗氏(完全和不完全)、礦物凝膠例如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)例如溶血卵磷脂、普郎尼克(pluronic)多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔血藍(lán)蛋白、二硝基酚和潛在有用的人佐劑，例如BCG和小棒桿菌(Corynebacteriumparvum)。除合成UTOPE其自身作為疫苗的用途之外，UTOPE還可以用作關(guān)于其4也Replikin疫苗或非Replikin疫苗的佐劑。UTOPES已"i正實(shí)當(dāng)施用于兔時，高％kReplikin產(chǎn)生最高的抗體應(yīng)答。由本發(fā)明人設(shè)計(jì)的這些合成肽被命名為通用合成表位，或"UTOPE's",且基于這些UTOPE的疫苗被命名為"UVAX"。推導(dǎo)的合成疫苗UVAX可以用作單獨(dú)的疫苗，或者當(dāng)與更特異性的Replikin疫苗或其他疫苗一起施用時用作佐劑。下述是推導(dǎo)的UTOPEs和UVAXs的實(shí)例設(shè)計(jì)的合成REPUKINSEQIDNO:(UTOPE或UVAX)KKKKHK—KKKHKK—KKHKKK—KHKKKK一KKKKKKH—KKKKKHK一KKKKHKK—KKKHKKK一KKHKKKK一KHKKKKK一HKKKKKK—識別子和/或Replikin肽可以施用于受試者，以誘導(dǎo)受試者的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗Replikin抗體。通常，將0.5至約2mg劑量優(yōu)選lmg劑量的每種肽施用于受試者，以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。若需要則可以施用后續(xù)劑量。置換的鑒定提供疫苗的早期開發(fā)用于生產(chǎn)流感病毒疫苗的先前基于卵和細(xì)胞的方法包含數(shù)以千計(jì)的不需要的蛋白質(zhì)，其可能產(chǎn)生不希望有的副作用，花費(fèi)6至9個月或更久來制備，且花費(fèi)更長的時間來試-驗(yàn)。FluForecast⑧目前允許提前1至3年毒林特異性警告流行病或大流行病正在接近，并且關(guān)鍵Replikin和置換的氨基酸"S"的發(fā)現(xiàn)允許在幾天內(nèi)快速制備更精確、潛在地更安全的合成疫苗用于測試。鑒定H5N1中的鵝Replikin的S-置換為技術(shù)人員開發(fā)針對未來的人大流行病的疫苗提供靶，所述大流行病起因于H5N1中的S-置換。疫苗可以包括下述序列KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLV[S]WGIHH的任何部分，其中在位置24(與末端組氨酸相距5個殘基)處的S-置53換可以代表任何氨基酸置換。在優(yōu)選實(shí)施方案中，S-置換代表除亮氨酸之外的氨基酸。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，S-置換代表除亮氨酸之外的任何疏水性氨基酸。在另外更優(yōu)選的實(shí)施方案中，置換代表曱硫氨酸或異亮氨酸。一個非限制性的疫苗實(shí)施方案包括序列KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLV[S]WGIHH的7至29個氨基酸。在另一個非卩艮制性實(shí)施方案中，疫苗包括序列KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHH的7至29個氨基酸。疫苗還可以可替代地包括佐劑，諸如匙孔血藍(lán)蛋白或任何其他佐劑和/或UTOPE，諸如KKKKHK或任何其他UTOPE。在另一個非限制性實(shí)施方案中，預(yù)期了針對序列KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHH的7至29氨基酸抗原子序列的抗體。預(yù)期具有本發(fā)明Replikin支架或Replikin序列的約7至約29個氨基酸的任何抗原子序列用于疫苗和刺激免疫系統(tǒng)以產(chǎn)生抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以開發(fā)針對序列KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLV[S]WGIHH的全部或任何部分的抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員同樣可以開發(fā)特別針對包含位置24的表位的抗體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，S-置換代表除亮氨酸之外的氨基酸。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，S-置換代表除亮氨酸之外的任何疏水性氨基酸。在另外更優(yōu)選的實(shí)施方案中，S-置換代表曱硫氨酸或異亮氨酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以開發(fā)針對例如包括序列KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLV(M/I)的序列的全部或^f壬何部分的抗體。針對具有S置換的鵝Replikin序列的抗體可以用于用針對所述序列的抗體治療來自H5N1的感染，或用于診斷禽類、動物或人中的H5N1的烈性感染。迄今為止已測試的所有Replikin序列已證實(shí)免疫原性特性。給兔注射來自毒曲菌素的16-聚體Replikin產(chǎn)生針對16-聚體Replikin的特異性抗體。U.S.6,242,578Bl的實(shí)施例6以及圖9A和9B。合成且對兔測試在SARS冠狀病毒的核殼體、刺突和包膜蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的SARSReplikins。定量免疫應(yīng)答。參見實(shí)施例6。命名為疫苗V120304U2的41氨基酸Replikin序列由本發(fā)明人從H5N1"禽流感"流感Replikins(在表1中標(biāo)記為"2004H5N1越南，高致病的")的29氨基酸Replikin支架進(jìn)行設(shè)計(jì)，其中在H5N1支架的C末端上添加2個UTOPE單位(KKKKHK)和在2個UTOPE單位的C末端上共價連接另外佐劑(匙孔血藍(lán)蛋白(表示為-KLH))。將100ng疫苗V120304U2皮下注射到兔和雞內(nèi)。在接種疫苗前和注射后1周至注射后8周時測量抗體應(yīng)答。在1周時注意到抗體應(yīng)答，并且在接種疫苗后第3至4周中達(dá)到峰值。峰值抗體應(yīng)答從1:120,000的稀度至大于1:240,000的稀度。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以開發(fā)針對本文討論的每一種Replikin序歹'J和Replikin支架序列的抗體。Replikin核普酸序歹寸ReplikinDNA或RNA可以具有用于i貪斷由病毒、細(xì)菌或其他Replikin編碼試劑感染引起的疾病的許多用途。例如，Replikin核苷酸序列可以用于活組織檢查的組織或血液的雜交測定中，例如DNA印跡或RNA印跡分析，包含原位雜交測定，以診斷例如在組織樣品或環(huán)境樣品中特定生物的存在。本發(fā)明還預(yù)期了試劑盒，其包含對于特定目的病原體中存在的特定R印likin特異的抗體，或包含與特定Replikin特異性雜交的核酸分子(有義或反義)，和任選地診斷所需的各種緩沖液和/或試劑。寡核糖核苷酸序列也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其包含發(fā)揮作用以抑制含Replikin或含識別子的mRNA翻譯的反義RNA和DNA分子以及核酶。反義RNA和DNA分子以及核酶均可通過本領(lǐng)域已知的任何方法來制備。可以將所述反義分子整合入廣泛多樣的載體內(nèi)用于遞送給受試者。技術(shù)人員可以容易地確定遞送的最佳途徑，盡管通常i.v.或i.m.遞送是常規(guī)的。劑量也可容易地確定。特別優(yōu)選的反義核酸分子是與在編碼例如流感病毒多肽的mRNA中包含的R印likin序列互補(bǔ)的那些，其中所述Replikin序列包括7至約50個氨基酸，其包括(1)定位與第二個賴氨酸殘基相距6至10個殘基的至少一個賴氨酸殘基；(2)至少一個組氨酸殘基；和(3)至少6%的賴氨酸殘基。更優(yōu)選的是與基因的編碼鏈中存在的Replikin或與編碼流感病毒血凝素蛋白質(zhì)的mRNA互補(bǔ)的反義核酸分子，其中所述反義核酸分子與編碼Replikin的核苷酸序列互補(bǔ)，所述Replikin已證實(shí)在6個月至一年或多年的時間段中保守和/或存在于流感病毒的毒林中，相對于其他流感毒林中的Replikin濃度，所述毒林顯示出Replikin濃度中的增加。Replikin濃度中的增加優(yōu)選在至少6個月的時間段，優(yōu)選約l年，最優(yōu)選約2或3年或更久中發(fā)生。類似地，與mRNA互補(bǔ)的反義核酸分子與編碼包括7至約50個氨基酸的Replikin序列的mRNA互補(bǔ)的那些，所述Replikin序列包括(1)定位與第二個賴氨酸殘基相距6至10個殘基的至少一個賴氨酸殘基；(2)至少一個組氨酸殘基；和(3)至少6%的賴氨酸殘基。同樣優(yōu)選的是與編碼Replikin支架的mRNA互補(bǔ)的核酸分子。更優(yōu)選的是與基因的編碼鏈或與編碼病毒的蛋白質(zhì)的mRNA互補(bǔ)的反義核酸分子。XI.計(jì)算機(jī)本發(fā)明還提供使用計(jì)算機(jī)用于預(yù)測流感病毒的新興毒抹中的毒力增加的方法。包括核苷酸和/或氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫還可以通過計(jì)算機(jī)就流感毒抹的存在進(jìn)行掃描，所述流感毒抹包含滿足用于預(yù)測流感病毒的新興毒株將具有增加的毒力的要求的Replikin和R印likin支架肽。圖2是可與本發(fā)明前述實(shí)施方案一起使用的計(jì)算機(jī)的方塊圖。所述計(jì)算機(jī)可以包括處理器、輸入/輸出設(shè)備和儲存可執(zhí)行程序指令的存儲器，所述指令代表前述實(shí)施方案的毒力預(yù)測方法。所述存儲器可以包括靜態(tài)存儲器、易失存儲器和/或非易失存儲器。所述靜態(tài)存儲器照常規(guī)可以是在磁性、或電或光儲存介質(zhì)上提供的只讀存儲器("ROM")。所述易失存儲器照常規(guī)可以是隨機(jī)存取存儲器("RAM")，且可以作為高速緩沖存儲器集成到所述處理器內(nèi)或作為分離的集成電路在所述處理器外部提供。所述非易失存儲器可以是電、磁性或光儲存介質(zhì)。下述實(shí)施例僅用于舉例說明本發(fā)明，并且不限制本文提供的本發(fā)明的全部范圍。應(yīng)當(dāng)理解在不背離本發(fā)明的精神和預(yù)期范圍的情況下，本發(fā)明的修改和變化由以上教導(dǎo)包含且在附加權(quán)利要求的范圍內(nèi)。實(shí)施例1用于Replikin的提取、分離和鑒定的過程，以及Replikin靶向、標(biāo)記或-皮壞含Replikin的生物的用途a)藻類下述藻類從百慕大群島水位點(diǎn)中收集，并在同一天提取或在-20。C下冷凍且在第二天提取。在冷室(于0-5°C)中在中性緩沖液，例如100cc.的0.005M磷酸鹽緩沖液pH7("磷酸鹽緩沖液，，)中，使藻類以1克等分試樣在韋林?jǐn)嚽衅髦袆驖{15分鐘，在3000rpm下離心，并且上清液通過全蒸發(fā)(perevaporation)進(jìn)行濃縮且在冷條件下針對磷酸鹽緩沖液進(jìn)行透析，以產(chǎn)生約15ml的體積。記錄這種提取溶液的體積，且獲取等分試樣用于蛋白質(zhì)分析，并且其余部分進(jìn)行分級分離以獲得pK范圍l-4的蛋白質(zhì)級分。分級分離的優(yōu)選方法是如下的層析使提取溶液在冷室(4°C)中在DEAE纖維素(Cellex-D)柱2.5x11.0cm上進(jìn)行分級分離，所述柱已用0.005M磷酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡。用下述溶液進(jìn)行逐步洗脫溶劑變化溶液1-使4.04gNaH2PCU和0.5gNaH2P04溶解于15升蒸餾水中(0.005摩爾，pH7);溶液2-使8.57gNaH2P04溶解于2，480ml蒸餾水中；溶液3-使17.1gNaH2P04溶解于2480ml蒸餾水中(0.05摩爾，pH4.7);溶液4-使59.65g.NaH2P04溶解于2470ml蒸餾水中(0.175摩爾)；溶液5-使101.6g.NaH2P04溶解于2455ml蒸餾水中(pH4.3);溶液6-使340.2g.NaH2P04溶解于2465蒸餾水中(l.O摩爾，pX-i4.1);溶液7-使283.63g.80%磷酸(H3P04)在2460ml蒸餾水中配制(1.0摩爾，pH1.0)。使6至10ml體積的提取溶液經(jīng)過柱上，并用溶液1覆蓋，附上300ml溶液1的槽且允許通過重力滴到柱上。收集3ml等分試樣的洗脫液，并在OD280處分析蛋白質(zhì)含量，直至待用溶液1取出的所有蛋白質(zhì)已從柱中取出。然后將溶液2應(yīng)用于柱，接著依次為溶液3、4、5、6和7,直至可以用每種溶液取出的所有蛋白質(zhì)從柱中取出。將來自溶液7的洗脫物組合，針對磷酸鹽緩沖液進(jìn)行透析，確定透析沉淀(dialysand)和透析液的蛋白質(zhì)含量，且通過凝膠電泳分析二者。在溶液7中獲得分子量3,000-25,000道爾頓的肽或蛋白質(zhì)的1個或2個條帶。例如,藻類墨西哥蕨藻(Caulerpamexicana)、4屯凹頂藻(Laurencia57obtura)、黑岡寸毛藻(Cladophexaprolifera)、馬尾藻(Sargassumnatans)、新娘藻(Caulerpaverticillata)、標(biāo)準(zhǔn)仙掌藻(Halimedatuna)和頭狀畫筆藻(Penicilloscapitatus),如上所述進(jìn)行提取和處理之后，全都顯示在溶液7洗脫物中在這個分子量區(qū)域中清晰的肽條帶，不含污染物。水解這些溶液7蛋白質(zhì)或它們的洗脫條帶，且確定氨基酸組成。具有6%或更大的賴氨酸組成的如此獲得的肽是Replikin前體。然后確定這些Replikin肽前體的氨基酸序列，且如美國專利6,242,578Bl中詳細(xì)描述的，通過水解和質(zhì)"i普分析法測定Replikins。滿足由"3點(diǎn)識別"法限定的標(biāo)準(zhǔn)的那些被鑒別為Replikins。這種程序還可以應(yīng)用于獲得酵母、細(xì)菌和任何植物Replikins。b)病毒使用與上文a)中用于藻類相同的提取和柱層析分離法，分離且鑒定病毒感染細(xì)胞中的Replikin。c)體內(nèi)和體外組織培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞使用與上文a)中用于藻類相同的提取和柱層析分離法，分離且鑒定腫瘤細(xì)胞中的Replikin。例如，從惡性腦瘤中分離的星形細(xì)胞膜抗原的Replikin前體、從組織培養(yǎng)中的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞、在組織培養(yǎng)中的MCF7乳房癌細(xì)胞以及組織培養(yǎng)中的P3J淋巴瘤細(xì)胞中分離的毒曲菌素(AglycolOB)，各自如上文a)中所述進(jìn)行處理，產(chǎn)生賴氨酸含量分別為9.1%、6.7%、6.7%和6.5%的Replikin前體。如U.S.6，242，578Bl中實(shí)施例10所述，AglycoIOB的水解和質(zhì)譜分析法產(chǎn)生氨基酸序列ykagvaflhkkndiide，16-聚體Replikin。實(shí)施例2:作為Replikins的診斷用途的實(shí)例在U.S.6，242，578Bl的圖2、3、4和7中顯示AglycoIOB或16-聚體Replikin可以用作抗原以捕獲且定量血清中存在其相應(yīng)抗體的量用于診斷目的。作為生產(chǎn)與Replikins附著的試劑用于標(biāo)記、營養(yǎng)或破壞目的的實(shí)例在U.S.6,242,578Bl的實(shí)施例6和圖9A和9B中顯示將16-聚體Replikin注射到兔內(nèi)以產(chǎn)生針對16-聚體Replikin的特異性抗體。作為標(biāo)記Replikins的試劑的用途的實(shí)例在U.S.6，242，578Bl的圖8和實(shí)施例6中顯示針對16-聚體Replikin的抗體標(biāo)記包含這種Replikin的特定細(xì)月包的用途。作為破壞R印likins的試劑的用途的實(shí)例在U.S.6，242，578Bl的圖9中顯示針對16-聚體Replikin的抗體抑制或破壞包含這種Replikin的特定細(xì)胞的用途。實(shí)施例3通過序列的目測掃描或通過使用基于本文所述的3點(diǎn)識別系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)程序，就Replikin的存在和濃度進(jìn)行流感病毒血凝素蛋白質(zhì)或神經(jīng)氨酸酶蛋白質(zhì)的分離物的序列數(shù)據(jù)分析。獲得流感病毒的分離物，且通過任何領(lǐng)域已知方法(例如，通過測序血凝素或神經(jīng)氨酸酶基因且由其獲得蛋白質(zhì)序列)獲得流感血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶蛋白質(zhì)的氨基酸序列。就新Replikin的存在、R印likin隨著時間過去的保守和每種分離物中Replikin的濃度來掃描序列。Replikin序列和濃度與早期(諸如，早約6個月至約3年)從分離物中獲得的氨基酸序列的比較，提供用于預(yù)測毒林出現(xiàn)的數(shù)據(jù)，所述毒林最可能是即將來臨的流感季節(jié)中的流感起因，并且形成關(guān)于季節(jié)性流感肽疫苗或基于核酸的疫苗的基礎(chǔ)。觀察到濃度中的增加，尤其是對于約6個月至約3年或更長的時間段，流感病毒的給定毒抹中Replikin濃度中的逐步增加是作為未來流感流行病或大流行病的可能原因的毒4朱出現(xiàn)的預(yù)測器。產(chǎn)生基于新興毒林中觀察到的Replikin的肽疫苗或基于核酸的疫苗。新興毒4木被鑒定為在時間段期間在血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶序列內(nèi)具有Replikin序列的濃度中的最高增加的流感病毒毒林。優(yōu)選地，所述肽或核酸疫苗基于或包括所觀察到的在新興毒林中保守的任何Replikin序列。保守的R印likins優(yōu)選是約2年且優(yōu)選更長時間存在于血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶蛋白質(zhì)序列中的那些Replikin序列。所述疫苗可以包括在新興毒林中鑒定的Replikin序列的任何組合。對于疫苗生產(chǎn)，鑒定為對有效疫苗有用的一種或多種Replikin肽通過任何方法進(jìn)行合成，所述方法包括化學(xué)合成和分子生物學(xué)技術(shù)，包括克隆、在宿主細(xì)胞中表達(dá)和由其純化。所述肽優(yōu)選地與藥學(xué)上可接受的載體以確定誘導(dǎo)針對其的治療抗體反應(yīng)的量混合。通常，所述劑量是約0.1mg至約10mg。所述流感疫苗優(yōu)選在"流感季節(jié)，，開始前施用于有此需要的患者。流59感季節(jié)一般在10月末發(fā)生且持續(xù)穿過4月末。然而，所述疫苗可以在一年期間的任何時間進(jìn)4亍施用。優(yōu)選地，所述流感疫苗每年施用一次，且基于在流感病毒的新興毒林中觀察到存在且優(yōu)選保守的Replikin序列。用于包括在流感疫苗中的另一種優(yōu)選Replikin是在不存在一年或多年后證實(shí)已在流感的毒抹中重新出現(xiàn)的Replikin。實(shí)施例4通過序列的目測掃描或通過使用基于本文所述的3點(diǎn)識別方法的計(jì)算機(jī)程序，就Replikin的存在和濃度進(jìn)行冠狀病毒核殼體、或刺突、或包膜或其他蛋白質(zhì)的分離物的序列數(shù)據(jù)分析。實(shí)施例5通過序列的目測掃描或通過使用基于本文所述的3點(diǎn)識別方法的計(jì)算機(jī)程序，就Replikin的存在和濃度進(jìn)行惡性瘧蟲抗原的分離物的序列數(shù)據(jù)分析。實(shí)施例6合成且對兔測試在SARS冠狀病毒中的核殼體、刺突和包膜蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的5種短SARSReplikins的氨基酸序列，以測試對于SARS冠狀病毒中的R印likin序列的免疫應(yīng)答。測試下述Replikin序列(1)2003人SARS核殼體(SEQIDNO:一)；(2)2003人SARS刺突蛋白質(zhì)(SEQIDNO:一)；(3)2003人SARS刺突蛋白質(zhì)(SEQIDNO:—);2003人SARS刺突蛋白質(zhì)；(SEQIDNO:—);(4)2003SARS包膜蛋白質(zhì)(SEQIDNO:—);和(5)2003人SARS核殼體蛋白(SEQIDNO:)。將每種合成的肽皮下注射到兔內(nèi)。測試的兔產(chǎn)生針對5種序列中每一種的可測量的特異性抗體，所述特異性抗體以大于1:10,0000的稀度結(jié)合。21氨基酸SARS核殼體Replikin抗體(SEQ.IDNO:—)顯示以大于l:204,800的稀度結(jié)合。因?yàn)槠渌死酶鞣N小肽達(dá)到強(qiáng)免疫應(yīng)答而無不希望有的副作用的先前未成功的嘗試，所述副作用由如在天花疫苗中的完整蛋白質(zhì)或數(shù)以千計(jì)的蛋白質(zhì)或核酸獲得，所以小合成Replikin抗原達(dá)到強(qiáng)免疫應(yīng)答的能力顯示對于這些SARS疫苗的功效是重要的。命名為疫苗V120304U2的41氨基酸Replikin序列由本發(fā)明人從H5N1"禽流感"流感Replikins(在表1中標(biāo)記為"2004H5N1越南，高致病的")的29氨基酸Replikin支架進(jìn)行設(shè)計(jì)，其中在H5N1支架的C末端上添加2個UTOPE單位(KKKKHK)和在2個UTOPE單位的C末端上共價連接另外佐劑(匙孔血藍(lán)蛋白(表示為-KLH))。將100ng疫苗V120304U2皮下注射到兔和雞內(nèi)。在接種疫苗前和注射后1周至注射后8周時測量抗體應(yīng)答。在1周時注意到抗體應(yīng)答，并且在接種疫苗后第3至4周中達(dá)到峰值。峰值抗體應(yīng)答從1:120,000的稀度至大于1:240,000的稀度。用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)來測定抗體滴度，其中使用在高結(jié)合96孔板上的固相中(0.1ug/100ul/孔)結(jié)合的肽-GGG(山羊y球蛋白)。血清首先稀釋50倍，然后以2倍連續(xù)稀度進(jìn)行進(jìn)一步稀釋。ELISA滴度結(jié)果從估計(jì)的稀釋因子來確定，所述稀釋因子起因于405nm處0.2的光密度，并得自連續(xù)稀釋曲線的非線性回歸分析。使用辣根過氧化物酶綴合的第二抗體和ABTS底物(ABTS是BoehringerMannheim.GmbH的注冊商標(biāo))來獲得檢測。表4中提供來自對2只雞和2只兔試驗(yàn)的結(jié)果。表5中提供來自對兔D4500試驗(yàn)的個別孔的結(jié)果。與實(shí)施例6所報(bào)告的結(jié)果組合，在兔或雞中對于抗體應(yīng)答的Replikin序列的總共6次試驗(yàn)中，所有6種序列提供可測量的抗體應(yīng)答并已證明抗原性。表4在第1天時用100嗎V120304U2注射的雞。在第18天時抗體生產(chǎn)的ELISA滴度<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>在第1天時用100pgV120304U2注射的兔。在第20天時抗體生產(chǎn)的ELISA滴度<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>在第1天時用100jugV120304U2注射的兔。關(guān)于在第7、20和28天時個別孔中的滴度的OD450結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>實(shí)施例8可以使用下述方法預(yù)測流感的突然出現(xiàn)的強(qiáng)毒抹。通過與流行病學(xué)數(shù)據(jù)相一致的目測掃描序列或通過使用基于本文描述的Replikin支架算法的計(jì)算機(jī)程序，就流感病毒的強(qiáng)毒林中Replikin支架的存在進(jìn)行流感病毒的分離物的序列和流感病學(xué)數(shù)據(jù)分析。如果分離的肽包括16至約30個氨基酸并進(jìn)一步包括下述，那么分離的流感病毒肽可以一見為Replikin支架肽(1)末端賴氨酸和任選地緊鄰末端賴氨酸的賴氨酸；(2)末端組氨酸和緊鄰末端組氨酸的組氨酸，(3)與另一個賴氨酸相距約6至約IO個氨基酸內(nèi)的賴氨酸；和(4)至少6%的賴氨酸。就與Replikin支架系列的其他成員共享且置換的序列掃描包含Replikin支架序列的分離序列，并通過流行病學(xué)毒力的水平進(jìn)行比較。通過爆發(fā)的程度和/或通過宿主死亡率百分比或經(jīng)由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法可以確定流行病學(xué)毒力。隨后就與高毒力爆發(fā)的關(guān)聯(lián)掃描個別Replikin支架肽內(nèi)的單個置換，所述高毒力爆發(fā)與個別Replikin支架肽已從其中分離的特定分離物相關(guān)。掃描基于在6個月至3年中增加的Replikin計(jì)數(shù)已顯示是新興毒林并且包含代表性Replikin支架肽的流感病毒的目前毒抹，以確定與早期出現(xiàn)的毒林中增加的毒力相關(guān)的置換目前是否存在于流感的新興毒抹中。如果存在與增加的毒力相關(guān)的個別置換，那么可以預(yù)測流感病毒的新興毒抹將具有增加的毒力。6權(quán)利要求1.一種來自第一株流感病毒的基本上分離的Replikin肽，其包括16至30個氨基酸且進(jìn)一步包括(1)末端賴氨酸和任選地與所述末端賴氨酸緊鄰的賴氨酸；(2)末端組氨酸和與所述末端組氨酸緊鄰的組氨酸，(3)與另一個賴氨酸相距6至10個氨基酸的賴氨酸；和(4)至少6％的賴氨酸其中與第二株流感病毒的Replikin序列相比較，所述第一株流感病毒的所述基本上分離的Replikin肽包含氨基酸置換，其中所述氨基酸置換不是組氨酸的置換，且其中所述第二株流感病毒的所述Replikin序列包括(1)16至30個氨基酸；(2)末端賴氨酸和任選地與所述末端賴氨酸緊鄰的賴氨酸，(3)末端組氨酸和與所述末端組氨酸緊鄰的組氨酸；(4)與另一個賴氨酸相距6至10個氨基酸的賴氨酸；和(5)至少6％的賴氨酸；以及其中第三株流感病毒包含Replikin序列，其包括(1)16至30個氨基酸；(2)末端賴氨酸和任選地與所述末端賴氨酸緊鄰的賴氨酸；(3)末端組氨酸和與所述末端組氨酸緊鄰的組氨酸；(4)與另一個賴氨酸相距6至10個氨基酸的賴氨酸；和(5)至少6％的賴氨酸；以及其中存在于所述第一株流感病毒的所述Replikin序列中的置換另外存在于所述第三株流感病毒的所述Replikin序列中，并且與所述第二株流感病毒相比較，所述第三株流感病毒中所述置換的存在與復(fù)制、毒力或宿主死亡率中的增加相關(guān)。2.權(quán)利要求1的RepUkin肽，其中所述纟皮置換的氨基酸殘基定位與所述第一株流感病毒的所述Replikin肽的所述末端組氨酸相距5個氨基酸殘基。3.權(quán)利要求2的Replikin肽，其中所述被置換的氨基酸殘基是除亮氨酸之外的任何氨基酸殘基。4.權(quán)利要求3的Replikin肽，其中所述被置換的氨基酸殘基是任何疏水性氨基酸。5.權(quán)利要求4的Replikin肽，其中所述被置換的氨基酸殘基是曱硫氨酸或異亮氨酸。6.權(quán)利要求5的Replikin肽，其包括序列KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLV[X]WGIHH，其中所述殘基[X]是除亮氨酸之外的任何氨基酸。7.權(quán)利要求6的Replikin肽，其中所述殘基[X]選自曱硫氨酸、異亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸和纈氨酸。8.權(quán)利要求7的Replikin肽，其中所述殘基[X]是甲硫氨酸或異亮氨酸。9.權(quán)利要求1的Replikin肽，其中所述分離的Replikin是H5N1流感病毒肽。10.—種疫苗，其包括權(quán)利要求1的Replikin肽。11.一種疫苗，其包括權(quán)利要求1的Replikin肽的抗原子序列，其中所述抗原子序列是權(quán)利要求1的Replikin肽的所述氨基酸序列的7至29個氨基酸殘基。12.—種疫苗，其包括KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLV[X]WGIHH的基本上分離的氨基酸序列，其中所述殘基[X]是除亮氨酸之外的任何氨基酸。13.權(quán)利要求12的疫苗，其中所述殘基[X]是除亮氨酸之外的任何疏水性氨基酸。14.權(quán)利要求13的疫苗，其中所述殘基[X]是甲硫氨酸或異亮氨酸。15.權(quán)利要求10的疫苗，其進(jìn)一步包括佐劑。16.權(quán)利要求10的疫苗，其進(jìn)一步包括UTOPE。17.—種基本上分離的抗體，其針對權(quán)利要求1的Replikin肽。18.—種針對權(quán)利要求1的Replikin肽的抗原子序列的基本上分離的抗體，其中所述抗原子序列包括權(quán)利要求1的Replikin肽的所述氨基酸序列的7至29個氨基酸殘基。19.一種來自第一株流感病毒的基本上分離的Replikin肽，其中所述第一抹流感病毒是流感病毒的新興毒林，且其中所述基本上分離的Replikin肽包括7至約50個氨基酸且通過下述進(jìn)4亍分離鑒定由下述組成的基序(1)位于所述Replikin肽的第一個末端處的至少一個賴氨酸殘基，和位于所述Replikin肽的第二個末端處的至少一個賴氨酸殘基或至少一個組氨酸殘基；(2)定位與第二個賴氨酸殘基相距6至10個殘基的第一個賴氨酸殘基；(3)至少一個組氨酸殘基；和(4)至少6%的賴氨酸殘基其中與第二抹所述流感病毒中在其他方面相同的序列相比較，已發(fā)生位于所述鑒定基序的末端殘基之間的Replikin肽序列中的一個氨基酸中的置換，其中賴氨酸或組氨酸尚未被置換，且其中與所述第二林相比較，所述第一林流感病毒的所述鑒定基序的末端殘基之間的所述置換與快速復(fù)制和增加的毒力有關(guān)；選擇所述鑒定基序且分離包括所述鑒定基序的所述Replikin肽。20.權(quán)利要求19的Replikin肽，其從流感病毒的H5N1毒林中分離。21.—種疫苗，其包括權(quán)利要求19的R印likin肽。22.—種包括抗原子序列的疫苗，所述抗原子序列包括權(quán)利要求19的Replikin肽的所述氨基酸序列的7至29個氨基酸殘基。23.—種基本上分離的抗體，其針對權(quán)利要求19的Replikin肽。24.—種針對權(quán)利要求19的Replikin肽的抗原子序列的基本上分離的抗體，其中所述抗原子序列包括權(quán)利要求19的Replikin肽的7至29個氨基酸殘基。25.—種預(yù)測第一抹流感病毒中的復(fù)制、毒力或宿主死亡率中的增加的方法，其包括(1)鑒定包括多個Replikin支架肽的流感病毒Replikin支架，其中所述Replikin支架包括從第一抹流感病毒中分離的第一種Replikin支架肽、從第二抹流感病毒中分離的第二種Replikin支架肽和從第三才朱流感病毒中分離的第三種Replikin支架肽，(2)鑒定與所述第二種Replikin支架肽相比較，所述第三種Replikin支架肽中被置換的一個氨基酸，其中所述置換氨基酸不是組氨酸，(3)確定與所述第二林流感病毒相比較，所述第三林流感病毒表現(xiàn)增加的復(fù)制、毒力或宿主死亡率，(4)確定與所述第二種Replikin支架相比較在所述第三種Replikin支架中被置換的氨基酸殘基與所述第二種Replikin支架相比較在所述第一種Replikin支架肽中也被置換；(5)使所述第一林流感病毒的Replikin計(jì)數(shù)與所述第一抹流感病毒早期出現(xiàn)的分離物的Replikin計(jì)數(shù)比較；(6)確定所述第一抹流感病毒的Replikin計(jì)數(shù)大于所述第一抹流感病毒早期出現(xiàn)的分離物的Replikin計(jì)數(shù)；(7)預(yù)測與所述第二抹流感病毒相比較，所述第一林流感病毒中的復(fù)制、毒力或宿主死亡率中的增加。26.權(quán)利要求25的方法，其中與所述第二種Replikin支架相比較，在所述第一種Replikin支架中被置換的氨基酸殘基放置與所述第二種Replikin支架的末端組氨酸相距5個氨基酸殘基。27.權(quán)利要求26的方法，其中所述被置換的氨基酸殘基是除亮氨酸之外的氨基酸殘基。28.權(quán)利要求27的方法，其中所述被置換的氨基酸殘基是除亮氨酸之外的疏水性氨基酸。29.權(quán)利要求28的方法，其中所述被置換的氨基酸殘基是甲硫氨酸或異亮氨酸。30.權(quán)利要求25的方法，其中所述第一種、第二種和第三種Replikin支架包括29個氨基酸。31.—種預(yù)測流感病毒的新興毒抹中的毒力中的增加的方法，其包括鑒定來自流感病毒的第一個新興毒抹的Replikin肽，其中所述流感病毒Replikin肽由7至約50個氨基酸組成，且其中所述流感病毒Replikin肽包括由下述組成的基序(1)位于所述分離的Replikin肽的第一個末端處的至少一個賴氨酸殘基和位于所述分離的Replikin肽的第二個末端處的至少一個賴氨酸殘基或至少一個組氨酸殘基；(2)定位與第2個賴氨酸殘基相距6至10個殘基的第1個賴氨酸殘基；(3)至少一個組氨酸殘基；和(4)至少6%的賴氨酸殘基其中與第二抹流感病毒中的相同序列相比較，已發(fā)生所述基序的末端殘基之間的氨基酸中的置換，且其中賴氨酸或組氨酸尚未被置換，使在第三抹流感病毒中相同序列中的所述置換與和所述第二抹流感病毒相比較所述第三抹流感病毒中的快速復(fù)制和增加的毒力相關(guān)，并且預(yù)測所述第一抹流感病毒的毒力中的增加。32.—種基本上分離的Replikin肽，其包括氨基酸序列KKXiX2X3YPTIKX4X5X6NNTNX7EDLLVXgWGIX9H,其中X!是N或G;X2是N或S;X3是A或T;X4是R或K;Xs是S或T;X6是任何氨基酸殘基；乂7是任何氨基酸殘基；Xs是除亮氨酸之外的任何氨基酸殘基；且Xg是H或Q。33.權(quán)利要求32的Replikin肽，其中X6是Y。34.權(quán)利要求32的Replikin肽，其中乂7是Q、I、M、V或H。35.權(quán)利要求32的Replikin肽，其中X7是Q或H。36.權(quán)利要求35的Replikin肽，其中X7是Q。37.權(quán)利要求32的Replikin肽，其中Xs是曱硫氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。38.權(quán)利要求37的R印likin肽，其中Xs是曱硫氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。39.權(quán)利要求38的Replikin肽，其中Xs是甲硫氨酸或異亮氨酸。40.權(quán)利要求39的Replikin肽，其中Xs是甲硫氨酸。41.權(quán)利要求39的Replikin肽，其中Xs是異亮氨酸。42.權(quán)利要求32的Replikin肽，其中Xg是H。43.權(quán)利要求32的Replikin肽，其中Xz是S;X3是T;X4是R;且X5是S。44.一種基本上分離的肽，其包括權(quán)利要求32的Replikin肽的抗原子序列，其中所述抗原子序列是權(quán)利要求32的Replikin肽的所述氨基酸序列的7至29個氨基酸殘基。45.—種疫苗，其包括權(quán)利要求32的基本上分離的Replikin肽。46.—種疫苗，其包括權(quán)利要求44的基本上分離的肽。47.—種基本上分離的抗體，其針對權(quán)利要求32的基本上分離的Replikin肽。48.—種基本上分離的抗體，其針對權(quán)利要求44的基本上分離的肽。49.一種基本上分離的核酸，其編碼權(quán)利要求1的Replikin肽。50.—種基本上分離的核酸，其編碼權(quán)利要求19的Replikin肽。全文摘要本發(fā)明提供分離的流感肽和核酸序列以及鑒定所述流感肽和核酸序列的方法，所述流感肽和核酸序列在預(yù)示快速復(fù)制和毒力的高度保守的Replikin和Replikin支架序列中具有氨基酸或核酸的置換模式。提供了預(yù)測新興流感毒株中毒力的方法，該方法包括鑒定具有預(yù)示性置換模式的肽和核酸序列。文檔編號C07K14/11GK101652385SQ200780027853公開日2010年2月17日申請日期2007年5月30日優(yōu)先權(quán)日2006年5月30日發(fā)明者埃琳諾爾·S·博戈奇,塞繆爾·博戈奇,塞繆爾·溫斯頓·博戈奇,安妮-埃琳諾爾·B·博爾沙尼申請人:塞繆爾·博戈奇;埃琳諾爾·S·博戈奇;塞繆爾·溫斯頓·博戈奇;安妮-埃琳諾爾·B·博爾沙尼