專(zhuān)利名稱：：利用包含非編碼可檢測(cè)標(biāo)記的質(zhì)量標(biāo)簽試劑進(jìn)行的分析物測(cè)定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及與使用質(zhì)鐠技術(shù)進(jìn)行分析物測(cè)定相關(guān)的方法、混合物、試劑盒和組合物。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及通過(guò)質(zhì)譜分析來(lái)測(cè)定分析物。在多個(gè)實(shí)施方案中，所M譜分析可以與電泳分離技術(shù)聯(lián)用。分析物可以是任何目的分子。(天然和/或合成)分析物的非限制性實(shí)例包括但不僅限于蛋白質(zhì)、肽、核酸、糖、脂質(zhì)、氨基酸、維生素、類(lèi)固醇、前列腺素類(lèi)和/或其它質(zhì)量小于1500道爾頓(Da)的小分子?？墒褂锚?dú)特的標(biāo)記試劑來(lái)測(cè)定分析物，所述標(biāo)記試劑使得能夠?qū)?fù)雜混合物中的分析物進(jìn)行相對(duì)和/或絕對(duì)定量。所述標(biāo)記試劑可在同分異構(gòu)和/或同量異位(isobaric)組中使用以分析復(fù)雜的樣品混合物，其中所述標(biāo)記試劑可以是同分異構(gòu)的和/或同量異位的。下述同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記試劑是已知的，其包含報(bào)告物部分、平衡物(或連接物)部分和反應(yīng)基團(tuán)，其中在該組成物的與分析物反應(yīng)后的形式中所述反應(yīng)基團(tuán)可被該分析物取代。包含這三種要素的標(biāo)記試劑和被標(biāo)記分析物的實(shí)例例如已經(jīng)公開(kāi)于以下文獻(xiàn)中已公開(kāi)的共同未決并且共同擁有的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)US2004-0219685Al、US2005-0114042Al、US2005-0147982Al、US2005-0147985Al、US2005-0147987Al、US2005-0148771Al、US2005-0148773Al和US2005-0148774Al。同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記試劑組可用于標(biāo)記例如兩種或更多種不同樣品的分析物，其中組中的不同標(biāo)記試劑均具有相同的粗略質(zhì)量(grossmass),但可以獨(dú)特地編碼每種l艮告物部分，使得該組中的每種報(bào)告物部分具有獨(dú)特的粗略質(zhì)量并產(chǎn)生具有獨(dú)特粗略質(zhì)量的相應(yīng)特征離子(signatureion)。由于該組中所有的試劑均具有相同的粗略質(zhì)量但包含獨(dú)特粗略質(zhì)量的報(bào)告物部分，因此所述平衡物(或連接物)部分一般(但不一定)也包含一個(gè)或多個(gè)重原子同位素，由此來(lái)"平衡"每種獨(dú)特才艮告物的質(zhì)量，使得該組中每種報(bào)告物/連接物組合具有相同的粗略質(zhì)量。本文描述了可在同分異構(gòu)和/或同量異位組中使用的新標(biāo)記試劑，其中所述標(biāo)記試劑包含非編碼的可檢測(cè)標(biāo)記。圖la展示了本發(fā)明示例性標(biāo)記試劑(和被標(biāo)記分析物)的要素以及關(guān)于該分子在質(zhì)鐠儀中可能的斷裂特征的一些信息。如圖所示，連接物部分可以線性或分支模式與標(biāo)記試劑(或被標(biāo)記分析物)的要素連接。在同分異構(gòu)和/或同量異位組中使用時(shí)，組中標(biāo)記試劑的多種非編碼可檢測(cè)標(biāo)記可以全部均具有以下特征1)可獨(dú)立檢測(cè)；2)包含相同的粗略質(zhì)量；和3)包含相同的凈電荷。因此，本文公開(kāi)的標(biāo)記試劑可同時(shí)包含可通過(guò)非質(zhì)鐠方法獨(dú)立檢測(cè)的部分以及可在質(zhì)鐠儀中獨(dú)立檢測(cè)的不同部分。特別地，本文所述的新標(biāo)記試劑可用于例如與質(zhì)譜分析聯(lián)用的電泳分離方法中，其中所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記的特性可用于在電泳分離時(shí)和/或電泳分離后定位和/或定量被標(biāo)記分析物的混合物，并且其中質(zhì)鐠法可用于鑒定和/或定量樣品中的目的分析物或其片段。在一些實(shí)施方案中，所述標(biāo)記試劑和/或被標(biāo)記分析物可以是與支持物結(jié)合的。圖lb展示了本發(fā)明示例性的與支持物結(jié)合的標(biāo)記試劑(和與支持物結(jié)合的被標(biāo)記分析物)的要素以及關(guān)于該分子在質(zhì)鐠儀中斷裂特征的一些信息。如圖所示，連接物部分可以線性或分支模式與支持物上結(jié)合的標(biāo)記試劑(或與支持物結(jié)合的被標(biāo)記分析物)的要素連接。本發(fā)明的實(shí)施方案特別適用于復(fù)雜樣品混合物的多重分析。例如，本發(fā)明的一些實(shí)施方案可用于蛋白質(zhì)組分析和/或基因組分析以及用于與基因組和/或蛋白質(zhì)組分析相關(guān)的關(guān)聯(lián)性研究。本發(fā)明的一些實(shí)施方案可用于小分子分析，例如脂質(zhì)、類(lèi)固醇、維生素、前列腺素和/或M酸分析?？梢允褂猛之悩?gòu)和/或同量異位試劑的實(shí)驗(yàn)分析包括但不僅限于時(shí)程研究、生物標(biāo)記研究、多重蛋白質(zhì)組分析、多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)實(shí)驗(yàn)(mudpitexperiment)、親和捕獲測(cè)定(affinitypull-down)、翻譯后修飾(post-translationalmodification,PTM)測(cè)定(參閱如已公開(kāi)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.US2005-0208550Al)和多重對(duì)照實(shí)驗(yàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，下文描述的附圖僅用于說(shuō)明目的。這些附圖并不旨在以任何方式限制本發(fā)明教導(dǎo)的范圍。圖la是以其要素形式表示的示例性標(biāo)記試劑的多種斷裂特征的圖示。圖lb是以其要素形式表示的示例性的與支持物結(jié)合的標(biāo)記試劑的特定斷裂特征的圖示。圖2a是以通式表示的多種標(biāo)記試劑的特定斷裂特征的圖示。圖2b是多種標(biāo)記試劑的特定斷裂特征的圖示。圖2c是多種標(biāo)記試劑的特定斷裂特征的圖示。圖3a是以通式表示的多種被標(biāo)記分析物的特定斷裂特征的圖示。圖3b是多種被標(biāo)記分析物的特定斷裂特征的圖示。圖3c是多種與支持物結(jié)合的被標(biāo)記分析物的特定斷裂特征的圖示。圖3d是已從固相支持物上釋放的多種被標(biāo)記分析物的特定斷裂特征的圖示。圖4a是示例性同量異位化合物的圖示。圖4b是示例性同分異構(gòu)同量異位化合物的圖示。圖5是可由某些基于N-甲基P底喚的報(bào)告物部分產(chǎn)生的多種可能的報(bào)告物離子(特征離子)的圖示。圖6是使用與支持物結(jié)合的標(biāo)記試劑來(lái)制備與支持物結(jié)合的被標(biāo)記分析物、1^從該固相支持物上釋放所示被標(biāo)記分析物的方法的圖示。圖7是合成多種活性酯的方案的圖示。圖8a是用于式II和III標(biāo)記試劑的可能的同位素編碼策略的圖示。圖8b是用于式ir和nr標(biāo)記試劑的可能的同位素編碼策略的圖示。圖9a展示了代表性標(biāo)記試劑的預(yù)計(jì)合成途徑的一部分。圖9b展示了代表性標(biāo)記試劑的預(yù)計(jì)合成途徑的其余部分(相對(duì)于圖9a)。圖10a至10d展示了合成編碼的N-Fmoc、N，-甲基乙基二胺的多個(gè)步^^。圖11展示了合成經(jīng)編碼的報(bào)告物/連接物部分的一部分。圖12展示了合成經(jīng)編碼的報(bào)告物/連接物部分的一部分。圖13a展示了代表性標(biāo)記試劑的預(yù)計(jì)合成途徑的一部分。圖13b展示了代表性標(biāo)記試劑的預(yù)計(jì)合成途徑的其余部分(相對(duì)于圖13a)。圖14展示了所提出的非編碼可檢測(cè)標(biāo)記的合成途徑。本申請(qǐng)中引用的所有文獻(xiàn)和類(lèi)似材料(包括但不僅限于專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、文章、書(shū)籍、論文和網(wǎng)頁(yè))無(wú)論其形式如何均明確地通過(guò)參考整體并入本文用于任何和所有目的。定義A于v^^^:說(shuō)坊4^芽^,摔炎^7"迷定義/^:^適^W,^^^語(yǔ)^摔逸括4《炎多^;，乂之。A于)醉禪^:說(shuō)銀泉炎^^^^我w要《力'殆厚辨，在錄7迷定乂與任它爻斧廣逸括為摩才芽辨w任^r遞過(guò)參孝^A本^:辨^:斧,尹該詢語(yǔ)^法^^敎辨橫況T，摔,惑^i"r迷定乂^^,餘#銀確措^*反辨含義^辨如在席斧處初炎^該4語(yǔ)時(shí)義斧^義本丈#"4"辨^法看措"斧/4",餘#^#說(shuō)坊4者4炎>^"々/減"坊i不合適的緣況T。本義中不^數(shù)量艱定^者炎^"一"廣V，9^;t措"一個(gè)4,個(gè)"，餘#^#說(shuō)銀44^炎>^"一個(gè)4/個(gè)"適^'，況T。"6括"、"逸舍"，^r互^炎^，##砉4艱夢(mèng)/。#，在一個(gè)4>個(gè),滋才黃種潘迷#炎^7^語(yǔ)"6含"辨'，況7,本銀試戎術(shù)乂^摔^^^^,在一些4傳緣況T,摩迷關(guān)滋才黃^r炎^語(yǔ)擴(kuò)"#丄洽...逸成"；^/4"由…i成"4^^迷。還應(yīng)^理莽，4一些姿滋才黃哞，5^紫辨義一減迷^f^些動(dòng)羋付^:^并不^"要，^要本發(fā)'勞辨教f^^r,滋,就^f。而i，在一些-滋才黃尹'^"以^^進(jìn)^兩個(gè)或^,個(gè)翔4動(dòng)來(lái)a)本文使用的"分析物"指可以測(cè)定的任何目的分子。分析物的非限制性實(shí)例包括但不僅限于蛋白質(zhì)、肽、核酸(例如DNA或RNA)、JLS^酸、糖、脂質(zhì)、類(lèi)固醇、維生素(例如維生素D2(有時(shí)稱為麥角鈣化醇)、維生素D3(有時(shí)稱為膽釣化醇)、維生素82、維生素B6、維生素A、維生素A2、維生素E、維生素K及^f《謝物)、前列腺素和其它W量低于1500道爾頓(Da)的小分子。分析物的來(lái)源或含有分析物的樣品并無(wú)P艮制，因?yàn)樗蓙?lái)自，來(lái)源。所述分析物可以是天然或合成的。分析物的來(lái)源或含有分析物的樣品的非限制性實(shí)例包括但不僅P艮于細(xì)胞或組織或者其培養(yǎng)物(或其繼代培養(yǎng)物)。分析物來(lái)源的非限制性實(shí)例包括但不僅限于粗制或經(jīng)處理的細(xì)胞裂解物、體液、組織提取物、細(xì)lfe^取物或者分離處理(例如色鐠分離、1D電泳分離、2D電泳分離或毛細(xì)管電泳分離)的級(jí)分(或部分)。體液包括但不僅限于血、尿、排泄物、M液、腦液、羊水、淋巴液或來(lái)自腺體分泌物的流體。我們用"經(jīng)處理的細(xì)胞SJ^物"*^示除了^#細(xì);3^斤需的處理以夕卜，該細(xì)胞^物ai^h理以對(duì)收集的材^Mi行其它處理。例如，所述樣品可以是包含一種或多種分析物的細(xì)胞絲物，所述分析物A^—種或多種蛋白7jC解缺理所述細(xì)胞^J^物以消化前體JMW或蛋白質(zhì)而形成的。b)除了在其使用語(yǔ)境中明確表示并非如此以外(例如提到其它的特定結(jié)構(gòu)時(shí))，"酯"表示酯和/或;危酯。c)本文使用的"可切割連接物"指與固相支持物共價(jià)連接的部分，它將標(biāo)記試劑或被標(biāo)記分析物與支持物可切割地連接起來(lái)，其中所述可切割連接物中的至少一個(gè)鍵可通過(guò)光、熱或化學(xué)試劑(為消除疑義，"化學(xué)試劑"旨在包括酶)處理進(jìn)行切割，從而從該支持物上釋放該標(biāo)記或被標(biāo)記分析物或者其片段。d)本文使用的"斷裂"指共價(jià)鍵的斷開(kāi)。e)本文使用的"片段"指斷裂產(chǎn)物，或"斷裂"指導(dǎo)致斷裂的^Mt。i)本文使用的"7JC合物形式"指化合物的任何水合狀態(tài)或者化合物的多于一種水合狀態(tài)的混合物。例如，本文所述標(biāo)記試劑可以是半7JC合物、一水合物、二7jc合物等。此外，例如，本文所述標(biāo)記試劑的樣品可以同時(shí)包含一水合物、二水合物和半水合物的形式。g)本文使用的鹵素基團(tuán)或鹵素指-F(氟)、-C1(氯)、-Br(溴)或-I(碘)。h)本文中涉及化合物使用時(shí)，"同位素富集的"指富集了一種或多種重原子同位素(例如穩(wěn)定同位素，例如氘(即2H)、13C、15N、lsO、MS、37C1或"Br)的4t^(例如才射己試劑)。同位素富集的4t^可以是以合成方式富集的。在一些實(shí)施方案中，也可以^^不穩(wěn)定的同位素(例如"C或311)。"富集的，，指重原子同位素的量超過(guò)了天然同位素豐度。在多個(gè)實(shí)施方案中，同位素富集的^^可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個(gè)同位素富集位點(diǎn)。由于同位素富集不是100%有效，因此化合物樣品中可能有富集程度較低并具有較低質(zhì)量的雜質(zhì)。類(lèi)似地，由于過(guò)富集(例如不想要的富集)和天然同位素豐度，化合物樣品中可能有質(zhì)量較大的雜質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，每種摻入的重原子同位素在同位素富集位點(diǎn)可以至少80%的同位素純度存在。在一些實(shí)施方案中，每種摻入的重原子同位素在同位素富集位點(diǎn)可以至少93%的同位素純>^存在。在一些實(shí)施方案中，每種摻入的重原子同位素在同位素富集位點(diǎn)可以至少96%的同位素純度存在。在一些實(shí)施方案中，每種摻入的重原子同位素在同位素富集位點(diǎn)可以至少98%的同位素純度存在。i)本文使用的"同位素富集位點(diǎn)"指化合物中重原子同位素替代輕形式原子(例如13C替代12C、180替代"O、15N替代"N或者氘替代氫)的位置。j)本文中涉及化合物時(shí)使用的"輕"指該化合物未富集重原子同位素。本文中涉及原子時(shí)使用的"輕"指該原子的最低質(zhì)量同位素。本文中涉及化合物時(shí)使用的"重"指該化合物富集了至少一種重原子同位素。本文中涉及原子時(shí)使用的"重"指該原子的重質(zhì)量同位素。k)本文使用的"標(biāo)記試劑，，指適于標(biāo)記分析物以用于測(cè)定的部分。術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記"與術(shù)語(yǔ)"標(biāo)簽"和"標(biāo)志"以及其它等同術(shù)語(yǔ)及短語(yǔ)意義相同。例如，被標(biāo)記分析物也可以稱為有標(biāo)簽的分析物或有標(biāo)志的分析物。因此，術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記"、"標(biāo)簽"、"質(zhì)量標(biāo)簽"、"標(biāo)志"和這些術(shù)語(yǔ)的衍生形式是等同的并可互換，指適于對(duì)分析物進(jìn)行標(biāo)記或標(biāo)志以用于測(cè)定的部分。有時(shí)，標(biāo)記試劑可稱為標(biāo)簽試劑或質(zhì)量標(biāo)簽試劑。1)本文使用的"天然同位素豐度"指基于同位素在自然界中的天然出現(xiàn)率而可見(jiàn)于化合物中的一種或多種重同位素的水平(或分布)。例如，得自活植物材料的天然化合物可含有約1.08%的13C(相對(duì)于12C)。m)本文使用的同量異位物是具有相同標(biāo)稱粗略質(zhì)量而在結(jié)構(gòu)上不可區(qū)分(除了同位素含量和/或重原子同位素分布以外)的化合物。為消除任何疑義，圖4a的化合物1-4就本文所述定義而言是同量異位的。相比之下，本文使用的同分異構(gòu)體是具有相同標(biāo)稱粗略質(zhì)量而在結(jié)構(gòu)上可區(qū)分的化合物。示例性異構(gòu)的同量異位物示于圖4b。n)本文使用的"支持物"、"固相支持物"、"固相載體"或"樹(shù)脂"指任何固相材料。固相支持物涵蓋諸如"支持物"、"合成支持物"、"固相"、"表面"、"膜"和/或"支持物"的術(shù)語(yǔ)。固相支持物可由有機(jī)聚合物構(gòu)成，例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯醚和聚丙烯酰胺以及它們的共聚物和接枝物。固相支持物還可以是無(wú)機(jī)的，例如玻璃、二氧化硅、可控孔徑玻璃(controlled-pore-glass，CPG)或者>^相二氧化珪。固相支持物的構(gòu)造可以為珠、球、微粒、顆粗、凝膠、膜或表面的形式。表面可以是平的、基本平的或者是不平的。固相支持物可以是多孔的或者不是多孔的，并可具有膨脹或非膨脹的特征。固相支持物可以構(gòu)建為孔、凹坑或其它容器、管、圖案或單元的形式。多個(gè)固相支持物可以設(shè)置為不同位置上的陣列，其對(duì)試劑的自動(dòng)遞送是可尋址的，或者通過(guò)檢測(cè)方法和/或設(shè)備而尋址。o)本文使用的"與支持物結(jié)合"指以共價(jià)方式固定在固相支持物上的化合物。p)本文使用的"樣品或其級(jí)分"或"樣品級(jí)分"可用于表示樣品的級(jí)分。該樣品的級(jí)分可通過(guò)簡(jiǎn)單地取出樣品的級(jí)分來(lái)產(chǎn)生，或者可通過(guò)實(shí)施使樣品分成兩個(gè)或更多個(gè)級(jí)分的分離方法來(lái)產(chǎn)生。除非i兌明書(shū)的內(nèi)容表明為其它含義，否則這些短語(yǔ)均為等同的并可互換，指以任一類(lèi)型方法來(lái)產(chǎn)生樣品的級(jí)分(或部分)。q)本文使用的"特征離子"和"報(bào)告物離子"可互換，均指在質(zhì)鐠儀中通過(guò)斷裂標(biāo)記試劑或被標(biāo)記分析物而由報(bào)告物部分產(chǎn)生的具有獨(dú)特質(zhì)量的特征離子。特征離子或報(bào)告物離子可用于鑒定用于標(biāo)記分析物的獨(dú)特標(biāo)記試劑，并可將其在MS/MS分析中的峰強(qiáng)度與所分析樣品(或其級(jí)分)中所存在的被標(biāo)記分析物的量相關(guān)聯(lián)。本文使用的特征離子或報(bào)告物離子有時(shí)僅稱為報(bào)告物。本文所使用的報(bào)告物部分有時(shí)也僅僅指報(bào)告物。應(yīng)該理解，報(bào)告物部分指連接在標(biāo)記試劑、被標(biāo)記分析物或其片段上的基團(tuán)，而才艮告物離子指在連接該報(bào)告物部分與所述標(biāo)記試劑、被標(biāo)記分析物或其片段的鍵斷^所產(chǎn)生的片段離子。因此，使用"報(bào)告物"的情況表示其暗含的含義。還應(yīng)該理解，短語(yǔ)"獨(dú)特的報(bào)告物部分"與"獨(dú)特質(zhì)量的報(bào)告物部分"是等同的并可互換，而"獨(dú)特的報(bào)告物離子"或"獨(dú)特的特征離子"則與"獨(dú)特質(zhì)量的報(bào)告物離子"或"獨(dú)特質(zhì)量的特征離子"是等同的并可互換。r)本文使用的術(shù)語(yǔ)"鹽形式"包括化合物的鹽或化合物鹽的混合物。此外，化合物的兩性形式也包括在術(shù)語(yǔ)"鹽形式，，中。具有胺或其它堿性基團(tuán)的化合物的鹽可通過(guò)例如與合適的有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸(比如鹽酸、氫溴酸、醋酸、高氯酸等，包括其任意組合)反應(yīng)得到。具有季銨基團(tuán)的化合物還可含有反陰離子，比如氯離子、溴離子、碘離子、乙酸根、高氯酸根等(包括其任意組合)。具有羧酸或其它酸性官能團(tuán)的化合物的鹽可通過(guò)使所述化合物與合適的堿(例如氫氧化物堿)進(jìn)行反應(yīng)而制得。因此，酸性官能團(tuán)的鹽可具有反陽(yáng)離子，例如鈉、鉀、鎂、釣等(包括其任意組合)。s)本文使用的術(shù)語(yǔ)"類(lèi)固醇"旨在包括但不僅限于皮質(zhì)醇、11-去氧皮質(zhì)醇(化合物S)、皮質(zhì)酮、睪酮、表睪酮、去氧甲基睪酮、四氫孕三烯酮(THG)、雌二醇、雌酮、4-羥基雌酮、2-甲H&雌酮、2-羥基雌酮、16-酮基雄二醇、16a-羥基雌酮、2-羥基雌酮-3-甲醚、潑尼松、潑;M^龍、孕烯醇酮、孕酮、去氫表維酮(DHEA)、170H孕烯醇酮、170H孕酮、170H孕酮、雄酮、表雄酮、A4雄烯二酮(D4A)、豆甾醇、以及膽固醇。t)本文使用的"合成化合物"指通過(guò)對(duì)過(guò)程進(jìn)行操作(包括操作天然存在的途徑)而產(chǎn)生的化合物。因此，可使用合成化學(xué)技術(shù)產(chǎn)生合成化合物。然而，本文使用的"合成化合物"還旨在包括通過(guò)例如酶促方法產(chǎn)生的化合物，所述方法包括如向生物(如細(xì)菌或酵母)中添加同位素富集的化合物，所述同位素富集的化合物可改變它們從而產(chǎn)生本文所述同位素富集的標(biāo)記試劑或該標(biāo)記試劑的中間體。u)本文使用的"以合成方式富集"或"合成富集"指操作合成或天然方法來(lái)產(chǎn)生合成化合物，例如本文所述同位素富集的標(biāo)記試劑或所述標(biāo)記試劑的中間體。v)公認(rèn)的是，原子或分子的質(zhì)量可以取近似，常近似到最接近的整數(shù)原子質(zhì)量單位或最接近的原子質(zhì)量單位的十分之一或百分之一。本文中所用的"粗略質(zhì)量"指在一定范圍內(nèi)的絕對(duì)質(zhì)量和近似質(zhì)量，在所述范圍內(nèi)使用質(zhì)量接近的不同原子類(lèi)型的同位素，使得對(duì)于平衡所述報(bào)告物和/或連接物部分的質(zhì)量的目的(使得在同分異構(gòu)和/或同量異位的標(biāo)記試劑的組和試劑盒中所述報(bào)告物/連接物組合的粗略質(zhì)量是相同的)它們?cè)诠δ苌鲜堑葍r(jià)的，而不論所用的不同同位素類(lèi)型在質(zhì)量上的極小差異是否能被檢測(cè)到。例如，常見(jiàn)的疏同位素的粗略質(zhì)量為32(實(shí)際質(zhì)量31.9720)和34(實(shí)際質(zhì)量33.9678)，常見(jiàn)的氧同位素的粗略質(zhì)量是16.0(實(shí)際質(zhì)量15.9949)和18.0(實(shí)際質(zhì)量17.9992)，常見(jiàn)的碳同位素的粗略質(zhì)量是12.0(實(shí)際質(zhì)量12.00000)和13.0(實(shí)際質(zhì)量13.00336)，最常見(jiàn)的氮同位素的粗略質(zhì)量是14.0(實(shí)際質(zhì)量14.0031)和15.0(實(shí)際質(zhì)量15.0001)。雖然這些值是近似的，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，如果在組中一種標(biāo)記的同位素富集位點(diǎn)使用180同位素(或34S同位素)，則(比粗略質(zhì)量16.0的氧同位素)多出的兩個(gè)質(zhì)量單位可在例如含有160(或"S同位素)的不同標(biāo)己中以如下方式進(jìn)行4卜償，即在該標(biāo)記中的其它位點(diǎn)摻入兩個(gè)碳13C原子來(lái)代替兩個(gè)12C原子、摻入兩個(gè)151>[原子來(lái)代替兩個(gè)14]\原子，或者甚至摻入一個(gè)"C原子和一個(gè)151\原子來(lái)代替一個(gè)12C和一個(gè)14N,來(lái)補(bǔ)償所述18CX或34S同位素)。這樣，該組中兩種不同的標(biāo)記可具有相同的粗略質(zhì)量，因?yàn)槭褂脙蓚€(gè)碳"C原子(代替兩個(gè)"C原子)、兩個(gè)"N原子(代替兩個(gè)"N原子)、一個(gè)"C原子和一個(gè)15N原子(代替12C和"N)或者使用一個(gè)180原子(代替一個(gè)"O原子，或者用一個(gè)"S代替一個(gè)^S)的實(shí)際差異極小，這樣在該組或試劑盒的所有標(biāo)記中實(shí)現(xiàn)2道爾頓的質(zhì)量增加，而不損害該分析的性質(zhì)。這可參考圖4a來(lái)說(shuō)明。在圖4a中，化合物3(圖4a;分子式C513CHu15N20)的報(bào)告物/連接物組合含有兩個(gè)15N原子和一個(gè)13C原子，總理論質(zhì)量為130.085。相比之下，同量異位物1(圖4a;分子式C,CHnN0)含有一個(gè)MO和一個(gè)"C,總理論質(zhì)量為130.095。盡管報(bào)告物/連接物部分可存在輕微的^J"質(zhì)量差異(質(zhì)量分別為130.095和130.085),但^ft^物1和3可以是^重原子同位素含量不同而在結(jié)構(gòu)上不可區(qū)分的同量異位物。然而，化合物1和3的才艮告物/連，部^^t^發(fā)明目的而言的^as^質(zhì)量均為130.1，因?yàn)闊o(wú)論質(zhì)i棘的靈^A否足以測(cè)量同量將物1和3所產(chǎn)生報(bào)告物離子之間^t質(zhì)量的微小差異，姊不損害分析。參考圖4b類(lèi)^i^說(shuō)明了兩種同分異構(gòu)試劑，其中化^詠5和6中報(bào)告物/連，部分的質(zhì)量分別為144.111和144.100。對(duì)于本發(fā)明目的，這些^^的報(bào)告物/連，部分的粗略質(zhì)量均為144.1，因?yàn)闊o(wú)論質(zhì)i沐的靈lt^l否足以測(cè)量4^物5和6所產(chǎn)生報(bào)告物離子之間鍵對(duì)質(zhì)量的微小差異，i^P不損害分析。從圖4a和圖4b中可明顯看出，結(jié)構(gòu)中相同重原子同位素的分布不是產(chǎn)生同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記試劑組時(shí)的惟一考量因素。有可能混合重原子同位素的類(lèi)型來(lái)實(shí)現(xiàn)期望粗略質(zhì)量的同分異構(gòu)體和/或同量異位物。這樣，重原子同位素的選擇(組合)及其分布在產(chǎn)生可用于本發(fā)明實(shí)施方案的同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記試劑時(shí)都可以考慮。W)本文使用的術(shù)語(yǔ)"烷基"指完全飽和的直鏈或支鏈的C2-Q烴或環(huán)狀CVC8烴(即環(huán)烷基例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基或環(huán)己基亞曱基(cyclohexylmethylenegroup))。本文使用的術(shù)語(yǔ)"烷基，，指可以被取代或未取代的基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"烷基"還旨在表示烷基鏈中一個(gè)或多個(gè)亞曱基被雜原子(如-O-、-Si-或-S-)替換的化合物。在一些實(shí)施方案中，烷基可以是完全飽和的直鏈或支鏈的c2-c6烴或環(huán)狀cvc6烴。x)本文使用的術(shù)語(yǔ)"亞烷基"指包含連接至少兩個(gè)部分的至少兩個(gè)連接點(diǎn)的直鏈或支鏈的烷基鏈或環(huán)狀烷基(例如-(CH+(亞甲基)、-{CH2CH2}-(亞乙基)、CH3等，其中大括號(hào)表示連接點(diǎn)。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"亞烷基"指可以被取代或未取代的基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"亞烷基"還旨在表示亞烷基的烷基鏈中一個(gè)或多個(gè)亞甲基(如果有的話)被雜原子(如-O-、-Si-或-S-)替換的化合物。在一些實(shí)施方案中，亞烷基可以是CVd。烴。在一些實(shí)施方案中，亞烷基可以是CVC6烴。y)本文使用的術(shù)語(yǔ)"烯基，，指包含一個(gè)或多個(gè)雙鍵的直鏈或支鏈的CrC8烴或環(huán)狀CVCs烴。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"烯基"指可以被取代或未取代的基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"烯基"還旨在表示烯基的烷基鏈中一個(gè)或多個(gè)亞甲基(如果有的話)被雜原子(如-O-、-Si-或-S-)替換的化合物。在一些實(shí)施方案中，烯基可以是包含一個(gè)或多個(gè)雙鍵的直鏈或支鏈的CrC6烴或環(huán)狀CVC6烴。z)本文使用的術(shù)語(yǔ)"亞烯基"指包含連接至少兩個(gè)部分的兩個(gè)連接點(diǎn)的烯基。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"亞烯基"指可以被取代或未取代的基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"亞烯基"還旨在表示亞烯基的烷基鏈中一個(gè)或多個(gè)亞曱基(如果有的話)被雜原子(如-O-、-Si-或-S-)替換的化合物。aa)本文使用的術(shù)語(yǔ)"炔基"指包含一個(gè)或多個(gè)三鍵的直鏈或支鏈的CrC8烴或環(huán)狀C3-Q烴。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"炔基"指可以被取代或未取代的基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"炔基"還旨在表示炔基的烷基鏈中一個(gè)或多個(gè)亞甲基(如果有的話)被雜原子(如-O-、-Si-或-S-)替換的化合物。在一些實(shí)施方案中，炔基可以是包含一個(gè)或多個(gè)三鍵的直鏈或支鏈的CrC6烴或環(huán)狀CVQ烴。ab)本文使用的術(shù)語(yǔ)"亞炔基"指包含連接至少兩個(gè)部分的兩個(gè)連接點(diǎn)的炔基。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"亞炔基"指可以被取代或未取代的基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"亞炔基"還旨在表示亞炔基的烷基鏈中一個(gè)或多個(gè)亞曱基(如果有的話)被雜原子(如-O-、-Si-或-S-)替換的化合物。ac)本文使用的術(shù)語(yǔ)"脂肪族"指如上文定義的任何直鏈、支鏈或環(huán)狀的烷基、烯基和炔基部分。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"脂肪族"指可以被取代或未取代的基團(tuán)。ad)本文使用的術(shù)語(yǔ)"芳基"(單獨(dú)的或作為其它部分的一部分(例如芳基烷基等))指碳環(huán)芳族基團(tuán)，例如苯基。芳基還包括稠環(huán)多環(huán)芳環(huán)系，其中碳環(huán)芳環(huán)與另一碳環(huán)芳環(huán)稠合(例如l-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基等)，或者碳環(huán)芳環(huán)與一個(gè)或多個(gè)碳環(huán)非芳環(huán)稠合(例如四氫亞萘基、茚滿基等)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"芳基"指可以被取代或未取代的基團(tuán)。ae)本文使用的術(shù)語(yǔ)"雜芳基"指包含l、2、3或4個(gè)雜原子的芳族雜環(huán)，所述雜原子各自獨(dú)立地選自氮、硫和氧。本文使用的術(shù)語(yǔ)"雜芳基"指可以被取代或未取代的基團(tuán)。雜芳基可以與一個(gè)或兩個(gè)環(huán)(如環(huán)烷基、芳基或雜芳基環(huán))稠合。雜芳基與分子連接的點(diǎn)可以在雜芳基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基或芳基環(huán)上，所述雜芳基可通過(guò)碳或雜原子連接。雜芳基的實(shí)例包括咪唑基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、異喁唑基、異噻唑基、噻二唑基(thiadiazolyl)、^二唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、喹啉基、異喹啉基、吲唑基、苯并喁唑基、苯并異喁唑基、苯并呋喃基、苯并噢唑基、中氮茚基(indolizinyl)、咪唑并吡咬基、吡唑基、三唑基、嚅唑基、四唑基、苯并咪唑基、苯丙異噻唑基、苯并噻二唑基、苯丙嚅二唑基、吲哚基、四氫吲咮基、氮雜吲哚基、咪唑并吡咬基、查唑啉基、嘌呤基、吡咯并[2,3嘧咬基、吡唑并[3，4嘧啶基或苯并(b)噻吩基，它們均任選地可被取代。af)本文使用的術(shù)語(yǔ)"亞芳基"指包含連接至少兩個(gè)部分的至少兩個(gè)連接點(diǎn)的芳基或雜芳基(例如亞苯基等)。亞芳基與碳環(huán)非芳環(huán)稠合的連接點(diǎn)可以在芳環(huán)或非芳環(huán)上。本文使用的術(shù)語(yǔ)"亞芳基，，指可以被取代或未取代的基團(tuán)。ag)本文使用的術(shù)語(yǔ)"芳基烷基"指通過(guò)亞烷基連接物連接至另一部分的芳基或雜芳基。本文使用的術(shù)語(yǔ)"芳基烷基"指可以被取代或未取代的基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"芳基烷基"還旨在表示芳基烷基的烷基鏈中一個(gè)或多個(gè)亞甲基(如果有的話)被雜原子(如-O-、-Si-或-S-)替換的化合物。ah)本文使用的術(shù)語(yǔ)"芳基亞烷基，，指具有連接至少兩個(gè)部分的至少兩個(gè)連接點(diǎn)的芳烷基。第二個(gè)連接點(diǎn)可以在芳環(huán)或亞烷基上。本文使用的術(shù)語(yǔ)"芳基亞烷基"指可以被取代或未取代的基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"芳基亞烷基"還旨在表示芳基亞烷基的烷基鏈中一個(gè)或多個(gè)亞甲基(如果有的話)被雜原子(如-O-、-Si-或-S-)替換的化合物。當(dāng)芳基亞烷基發(fā)生取代時(shí)，取代基可以在該芳基亞烷基的芳環(huán)或亞烷基部分中的一個(gè)或兩個(gè)上。ai)本文使用的術(shù)語(yǔ)"任選取代的"以及"取代或未取代的"是等同的并可互換。任何烷基、亞烷基、烯基、亞烯基、炔基、亞炔基、芳基、芳基烷基、亞芳基、雜芳基或芳基亞烷基的合適取代基包括在本發(fā)明實(shí)施方案所用反應(yīng)條件下穩(wěn)定的任何取代基。合適取代基的非限制性實(shí)例可包括烷基(如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、環(huán)己基等)、g代烷基(如三氟甲基、2，2，2-三氟乙基等)、烷氧基(如曱氧基、乙氧基等)、芳基(如苯基)、芳基烷基(如節(jié)基)、硝基(-NOj、氰基(-CN)、季銨氮原子或鹵素基(如氟、氯、溴和/或碘)。此外，烷基、亞烷基、烯基、亞烯基、炔基、亞炔基、芳基、芳基烷基、亞芳基、雜芳基或芳基亞烷基的一部分可任選地被=0或-S取代。aj)本文使用的術(shù)語(yǔ)"活性酯"指在堿性條件下易于與胺、醇和某些硫醇反應(yīng)以分別提供酰胺、酯和硫酯的化合物。還可參考LeoAPaquette,^EVicj;c/o/7ei/,Vi</及eflgewto6^"w/ciS^fi^s/s1,岸2巻JohnWileyandSons,NewYork,1995作為活性酯是有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域的公認(rèn)術(shù)語(yǔ)的證據(jù)。ak)本文使用的術(shù)語(yǔ)"雜環(huán)"指在環(huán)中包含至少兩種不同元素的任何環(huán)狀分子結(jié)構(gòu)。還可參考Ox/on/D/"/o麗fj^BiVc/re附/欲j;楊/ecw/"r所o/收y，OxfordUniversityPress,Oxford,1997作為雜環(huán)是有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域的公認(rèn)術(shù)語(yǔ)的證據(jù)。al)本文使用的術(shù)語(yǔ)"離去基團(tuán)"指在取代或置換反應(yīng)中從被認(rèn)為是反應(yīng)底物的殘基或主要部分上離去的任何帶電或不帶電的原子或基團(tuán)。還可參考Ox/on/Z)/c"Vw"ij5iVc/re挑f's^vMo/ec"/flr必/(/o^j，OxfordUniversityPress,Oxford,1997作為離去基團(tuán)是有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域的公認(rèn)術(shù)語(yǔ)的證據(jù)。am)本文使用的術(shù)語(yǔ)"保護(hù)基團(tuán)"指與分子中的官能團(tuán)反應(yīng)并結(jié)合從而防止該官能團(tuán)參與該分子的后續(xù)反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)，所述基團(tuán)隨后可被除去，從而重新產(chǎn)生非保護(hù)的官能團(tuán)。還可參考OK/iw^Z)/",V麗o;o/5Zoc/rewi&^jfl/irfMo/ecw/flf5iV/o^y，OxfordUniversityPress,Oxford,1997作為保護(hù)基團(tuán)是有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域的公認(rèn)術(shù)語(yǔ)的證據(jù)。多個(gè)實(shí)施方案描述^該理席，r"jt"凝迷"章^—辨:^論^r，及本^:^時(shí)/神泉遂才隸f辨一些^全卑。/森迷標(biāo)記試劑如上文所述，使用質(zhì)鐠法對(duì)分析物進(jìn)行分析時(shí)可使用的標(biāo)記試劑可包括報(bào)告物部分、平衡物部分(或連接物部分)和反應(yīng)基團(tuán)。本文所述的新標(biāo)記試劑還可包含至少一個(gè)非編碼可檢測(cè)標(biāo)記，例如生色團(tuán)、熒光團(tuán)、自旋標(biāo)記(spinlabel)、酶或化學(xué)發(fā)光化合物，在一些實(shí)施方案中可由式I表示，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>包括其鹽形式和/或水合物形式。RG是下文更詳細(xì)描述的反應(yīng)基團(tuán)。RP是下文更詳細(xì)描述的報(bào)告物部分。DL是非編碼可檢測(cè)標(biāo)記。LK是下文更詳細(xì)描述的連接物部分。X是下文更詳細(xì)描述的共價(jià)鍵。Y和W各自獨(dú)立地是下文更詳細(xì)描述的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，m和n各為0或1，條件是m+n=l。在一些實(shí)施方案中，所述標(biāo)記試劑可以是與支持物結(jié)合的。因此，在一些實(shí)施方案中，所述標(biāo)記試劑可由通式rs表示，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>包括其鹽形式和/或水合物形式。RG是下文更詳細(xì)描述的反應(yīng)基團(tuán)。RP是下文更詳細(xì)描述的報(bào)告物部分。DL是非編碼可檢測(cè)標(biāo)記。LK是下文更詳細(xì)描述的連接物部分。SS是通過(guò)下文更詳細(xì)描述的可切割連接物與該標(biāo)記試劑的報(bào)告物部分"RP"共價(jià)連接的固相支持物。X是下文更詳細(xì)描述的共價(jià)鍵。Y和W各自獨(dú)立地是下文更詳細(xì)描述的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，m和n各為0或l，條件是m+n-l。反應(yīng)基團(tuán)多個(gè)實(shí)施方案中所使用標(biāo)記試劑的反應(yīng)基團(tuán)(有時(shí)以縮寫(xiě)"RG，，代表)可包含能與樣品中一種或多種反應(yīng)性分析物的一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)反應(yīng)的任何親電或親核基團(tuán)。反應(yīng)基團(tuán)與分析物的官能團(tuán)反應(yīng)，從而將該分析物與標(biāo)記試劑共價(jià)連接。因此，每種標(biāo)記試劑能與樣品中一種或多種反應(yīng)性分析物反應(yīng)，從而形成一種或多種來(lái)自該樣品的被標(biāo)記分析物。應(yīng)該理解，在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)基團(tuán)應(yīng)認(rèn)為是包括與連接物部分(即平衡物部分)相連的原子或基團(tuán)。例如，如果反應(yīng)基團(tuán)是活性酯或羧酰卣化物基團(tuán)(carboxylicacidhalide)，則在一些實(shí)施方案中，該活性酯或羧酰卣化物的羰基也可以考慮與所述連接物部分相連，這是為了在標(biāo)記試劑和被標(biāo)記分析物中均存在羰基碳的一組同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記試劑中平衡報(bào)告物部分的質(zhì)量。這在一組同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記試劑中一些或全部標(biāo)記試劑中所包含的羰基中含有重原子同位素時(shí)通常是顯而易見(jiàn)的。因此，在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)基團(tuán)可理解成僅代表反應(yīng)基團(tuán)的離去基團(tuán)；而在另一些實(shí)施方案中，反應(yīng)基團(tuán)可包含與連接物部分相連的其它原子或部分。因此，應(yīng)該理解，當(dāng)反應(yīng)基團(tuán)表示為一些下文所述具體部分時(shí)，分析物可以通過(guò)一個(gè)或多個(gè)其它原子或基團(tuán)與連接物部分(即平衡物部分)連接，所述其它原子或基團(tuán)可被認(rèn)為或不可被認(rèn)為是該連接物部分的一部分均可。反應(yīng)基團(tuán)可以是預(yù)先存在的，或者可以原位制備?？稍诓淮嬖诜磻?yīng)性分析物的情況下進(jìn)行或者可以在反應(yīng)性分析物存在下進(jìn)行反應(yīng)基團(tuán)的原位制備。例如，可以用水溶性碳二亞胺(如1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；EDC)原位修飾羧酸基，由此制備可與親核體(如分析物的烷基或芳基氨基)反應(yīng)的親電基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，可在存在含有胺(或其它親核體)的分析物的情況下用EDC對(duì)標(biāo)記試劑中羧酸基進(jìn)行活化。在一些實(shí)施方案中，還可以在用EDC進(jìn)行起始反應(yīng)后加入含有胺(或其它親核體)的分析物。在另一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)原位除去保護(hù)基團(tuán)在原位產(chǎn)生反應(yīng)基團(tuán)。因此，可通過(guò)親核和/或親電反應(yīng)實(shí)現(xiàn)分析物衍生化的任何現(xiàn)有或新產(chǎn)生的試劑均在本發(fā)明方法、混合物、試劑盒和/或組合物實(shí)施方案的范圍之內(nèi)。當(dāng)標(biāo)記試劑的反應(yīng)基團(tuán)包含親電體時(shí)，它可與分析物中合適的親核基團(tuán)反應(yīng)。當(dāng)標(biāo)記試劑的反應(yīng)基團(tuán)包含親核體時(shí)，它可以與分析物中合適的親電基團(tuán)反應(yīng)。大量合適的親核基團(tuán)與親電基團(tuán)對(duì)是已知的，并常在化學(xué)及生物化學(xué)領(lǐng)域中使用。包含可與分析物(例如蛋白質(zhì)、肽、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、類(lèi)固醇、維生素、前列腺素或質(zhì)量小于1500道爾頓的其它小分子)偶聯(lián)以實(shí)現(xiàn)其衍生化的適當(dāng)親核基團(tuán)或親電基團(tuán)的試劑的非限制性實(shí)例描述于PierceLifeScience&AnalyticalResearchProductsCatalog&Handbook(aPerstorpBiotecCompany),Rockford,IL61105,USA。其它合適的試劑為本領(lǐng)域所熟知，并以商品形式由其它供應(yīng)商(例如Sigma-Aldrich)提供。標(biāo)記試劑的反應(yīng)基團(tuán)可包含胺反應(yīng)基團(tuán)。例如，所述胺反應(yīng)基團(tuán)可以是活性酯?；钚怎ピ陔暮铣芍惺鞘熘?，指在肽合成中常用條件下易于與氨基酸的N-a-氨基反應(yīng)的某些酯(參閱LeoAPaquette，￡>io;c/o/;//及eflge她>6^""/ci5jy"幼e喊,2巻JohnWileyandSons,NewYork,1995)。所述胺反應(yīng)活性酯基團(tuán)可以是N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)、N-羥M代琥珀酰亞胺酯(NHSS)、五氟苯基酯(Pfp)、2-硝基苯基酯(2-NP)、3-硝基苯基酯(3-NP)、4-硝基苯基酯(4-NP)、2，4-二硝基苯基酯(2，4-NP)、五氟苯基酯(Pfp)、五氯苯基酯(Pcp)、3-羥基-l，2，3-苯并三唑-4(3H)—酯(Dhbt)、羥基吡咯烷酮(NHP)、2,4-二卣苯基酯、2,2,2-三氟乙烷基酯(2,2,2-trifluoroethanylester)或1,1,1，3,3,3-六氟-2-丙基酯。例如，活性酯(本文的一些實(shí)施方案中""^1稱為Z，，使得可變的RG僅與M基團(tuán)的離去基團(tuán)部分同義)可由下式表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage35</formula>其中X，是-O-或-S-,各個(gè)X"彼此獨(dú)立地是-F、-Cl、-Br-或-I(N-甲基哌喚化合物活性酯的合成參閱美國(guó)已公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)No.US2005-0148771Al，所述活性酯的多種合成途徑參閱圖7)。前述均為活性酯的醇或硫醇離去基團(tuán)，其中所述醇或硫醇基團(tuán)可通過(guò)氨基酸N-a-氨基與該活性酯基團(tuán)羰基碳的反應(yīng)進(jìn)行置換。因此，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是，本文所述任何合適的標(biāo)記/標(biāo)簽試劑的活性酯(例如N-羥基琥珀酰亞胺酯)均可使用熟知的方法與本文公開(kāi)內(nèi)容結(jié)合來(lái)制備(還可參閱如GregT.Hermanson(1996).'TAeC7^附/^o;<>/及efl",'ve(7nm/s"/""5iVco/iyiig她recAw/《nW，第2章，137-165頁(yè)，AcademicPress,(NewYork);還參閱"/"Aiov她Vw尸ers/;e"/ves/"5WiV/i^"m^^aiAmis'',RogerEpton編輯，SPCC(UK)Ltd,Birmingham,1990)。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記試劑的反應(yīng)基團(tuán)可包含混合酸酐，因?yàn)橐阎旌纤狒c氨基高效反應(yīng)，從而產(chǎn)生酰胺鍵?；旌纤狒鞘熘?，并可使用有機(jī)化學(xué)和/或肽化學(xué)領(lǐng)域經(jīng)常應(yīng)用的熟知方法來(lái)制備。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記試劑的反應(yīng)基團(tuán)可以是羧酰卣化物基團(tuán)，例如醜氟基團(tuán)(參閱Carpino等，/爿柳.C7^附.Soc，112:9651(1990))或酰氯基團(tuán)。酸fi化物基團(tuán)與分析物中胺的反應(yīng)會(huì)形成酰胺。酸卣化物基團(tuán)與分析物中羥基或硫醇基(thiolgroup)的反應(yīng)會(huì)分別產(chǎn)生酯或硫酯。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)基團(tuán)可以是磺酰卣或磺酸基。如果是磺酸，則可被活化而與分析物反應(yīng)。如果是磺酰卣，則可直接與分析物反應(yīng)，因?yàn)檫@就是活化形式。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)基團(tuán)可以是異氰酸鹽/酯(isocyanate)或異硫氰酸鹽/酯(isothiocyanate)基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記試劑的反應(yīng)基團(tuán)可包含硫醇反應(yīng)基團(tuán)。例如，所述硫醇反應(yīng)基團(tuán)可以是馬來(lái)酰亞胺(malemide)基、烷基卣化物基、a-卣代-酰基、a-卣代國(guó)硫酮基(a國(guó)halothionegroup)或a曙卣代亞胺基。我們用"卣化物基團(tuán)"或"卣代"或"卣素基團(tuán)"來(lái)表示氟、氯、溴或碘。所述硫醇反應(yīng)基團(tuán)是熟知的，并可使用肽化學(xué)領(lǐng)域常用的方法來(lái)制備。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記試劑的反應(yīng)基團(tuán)可包含羥基反應(yīng)基團(tuán)。例如，所述羥基反應(yīng)基團(tuán)可以是三苯曱基卣化物或甲硅烷基卣化物反應(yīng)基團(tuán)。三苯甲基卣化物反應(yīng)部分可以被取代(例如X"，-甲氧基三苯甲基、X，，，-二甲氧基三苯甲基、X，，，-三甲氧基三苯曱基等)，或者是未取代的，其中X"，是將反應(yīng)基團(tuán)與連接物(即平衡物)連接的鍵。所述甲硅烷基反應(yīng)部分可以是烷基取代的甲硅烷基卣化物，例如X"，-二甲基甲硅烷基、X"，-二三乙基甲硅烷基、X，"-二丙基甲硅烷基、X，"-二異丙基甲硅烷基等)，其中X"，是將該反應(yīng)基團(tuán)與連接物(即平衡物)連接的鍵。所述反應(yīng)基團(tuán)是熟知的，并可使用核酸化學(xué)領(lǐng)域常用的方法來(lái)制備。36在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記試劑的反應(yīng)基團(tuán)可包含親核體，例如氨基、羥基、硫醇基或酰肼基。在一些實(shí)施方案中，所述親核反應(yīng)基團(tuán)可以是氨基烷基、羥基烷基或硫代烷基。所述反應(yīng)基團(tuán)是熟知的，并可使用有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域經(jīng)常應(yīng)用的方法來(lái)制備。報(bào)告物部分本發(fā)明實(shí)施方案中所用標(biāo)記試劑的報(bào)告物部分(有時(shí)以縮寫(xiě)"RP"代表)是具有可測(cè)量的獨(dú)特質(zhì)量(或者質(zhì)鐠儀中的質(zhì)荷比)的基團(tuán)。因此，在一些實(shí)施方案中，一組同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記試劑中的每種報(bào)告物部分及其相應(yīng)的特征離子均具有獨(dú)特的粗略質(zhì)量，并且對(duì)組中每種標(biāo)記試劑而言彼此不同。不同的報(bào)告物部分可包含一個(gè)或多個(gè)重原子同位素，以實(shí)現(xiàn)其獨(dú)特的粗略質(zhì)量。例如，碳(12C、13C和"C)、氮("N和15N)、氧(160和180)、硫(32S和34S)和/或氫(氫、氘和氚)的現(xiàn)有重原子同位素可用于制備報(bào)告物部分的不同基團(tuán)。它們不是限制性的，因?yàn)樵趫?bào)告物部分中還可使用其它輕原子和重原子。包含輕原子和重原子同位素的適于制備報(bào)告物部分的基本起始材料可得自多個(gè)商業(yè)來(lái)源，例如CambridgeIsotopeLaboratories,Andover,MA(參閱www.isotope.com的"基本起始材料"列表)和Isotec(Sigma-Aldrich的分支機(jī)構(gòu))。CambridgeIsotopeLaboratories和Isotec還根據(jù)定制合成協(xié)議制備需要的化合物。報(bào)告物部分可以包含固定的電荷，或者可以在分析過(guò)程中離子化。由于報(bào)告物部分可以包含固定電荷或者可被離子化，因此所述標(biāo)記試劑可以鹽(或鹽的混合物)或兩性離子的形式分離或用于標(biāo)記反應(yīng)性分析物。報(bào)告物部分(或報(bào)告物離子)的離子化有助于在質(zhì)譜儀中對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。因此，被標(biāo)記分析物中報(bào)告物部分的存在狀況可作為片段離子(有時(shí)稱為特征離子(或報(bào)告物離子))而被測(cè)定。N-甲基哌喚報(bào)告物部分的多種報(bào)告物離子示于圖5。所述離子的分子式為13CCsH13N2+、13CC5H1315NN+、13C2C4H1315NN+和13C3C3H1315NN+。離子化后，特征離子(即報(bào)告物離子)可包含一個(gè)或多個(gè)正或負(fù)的凈電荷。因此，報(bào)告物離子可包含一個(gè)或多個(gè)酸性基團(tuán)和/或堿性基團(tuán)，因?yàn)檫@些基團(tuán)易于在質(zhì)i普儀中離子化。例如，報(bào)告物部分可包含一個(gè)或多個(gè)堿性氮原子(帶正電)和/或一個(gè)或多個(gè)離子化的酸性基團(tuán)，例如羧酸基、磺酸基或磷酸基(帶負(fù)電)，條件是在平衡時(shí)酸性基團(tuán)或堿性基團(tuán)之一較多以使該報(bào)告物部分產(chǎn)生包含正或負(fù)的凈電荷的報(bào)告物離子。包含至少一個(gè)堿性氮的報(bào)告物部分的非限制性實(shí)例包括含有取代或未取代的嗎啉、哌啶或哌溱的化合物。獨(dú)特的報(bào)告物部分可以與目的樣品相關(guān)聯(lián)，從而用所述獨(dú)特的報(bào)告物部分標(biāo)記該樣品中的一種或多種分析物。這樣，可將關(guān)于獨(dú)特才艮告物部分的信息(一般在質(zhì)鐠儀中通過(guò)特征離子(即報(bào)告物離子)來(lái)檢測(cè))與關(guān)于所述樣品中一種或全部分析物的信息相關(guān)聯(lián)。然而，在測(cè)定特征離子時(shí)，獨(dú)特的報(bào)告物部分不需要與分析物物理連接。相反，可在斷裂被標(biāo)記分析物以產(chǎn)生子片段離子和特征離子之后在串聯(lián)分析儀中的第二質(zhì)量分析中測(cè)定特征離子的獨(dú)特粗略質(zhì)量。測(cè)定的特征離子可用于鑒定所測(cè)定分析物所來(lái)源的樣品。此外，獨(dú)特特征離子相對(duì)于其它特征離子或相對(duì)于校正標(biāo)準(zhǔn)品(例如預(yù)期存在于所述樣品中且用特異性報(bào)告物部分標(biāo)記的分析物)的該特征離子的量(經(jīng)常表達(dá)為濃度和/或量)可用于測(cè)定樣品(例如用于形成樣品混合物的樣品)中分析物的相對(duì)量和/或絕對(duì)量(經(jīng)常表達(dá)為濃度和/或量)。在一些實(shí)施方案中，不使用內(nèi)校正標(biāo)準(zhǔn)品，而是可基于將多種特征離子的峰強(qiáng)度與校正曲線進(jìn)行比較而進(jìn)行絕對(duì)定量。因此，可將信息(例如特定樣品中一種或多種分析物的量)與用于標(biāo)記每種特定樣品的報(bào)告物部分相關(guān)聯(lián)。當(dāng)也確定分析物的身份時(shí)，該信息可與關(guān)于不同特征離子的信息相關(guān)聯(lián)，從而輔助確定一種或多種樣品中每種被標(biāo)記分析物的身份和量。在一些實(shí)施方案中，報(bào)告物部分可包含與取代或未取代的N-烷基化乙酸部分中亞甲基碳共價(jià)連接的氮原子，其中所述取代或未取代的亞曱基碳(而不是該乙酸部分中羧酸(或硫代羧酸)基團(tuán)的羰基)是該報(bào)告物的一部分。因此，在一些實(shí)施方案中，羧酸(或硫代羧酸)基可用于連接報(bào)告物與連接物，但不認(rèn)為是報(bào)告物的一部分。所述氮原子可以被一、二或三個(gè)基團(tuán)烷基化。例如，包含氮原子的部分可以是取代的伯胺，例如甲基、乙基或丙基基團(tuán)，或者是取代的仲胺，例如二甲基胺、二乙基胺、二正丙基胺或二異丙基胺。因此，例如，報(bào)告物部分"RP"可由以下的式X1、X2、X3、X4、Xs、X6、X7、X8或X9來(lái)表示，其中"RP"以括號(hào)為界<formula>formulaseeoriginaldocumentpage39</formula>報(bào)告物部分可以是5元、6元或7元雜環(huán)，其包含與取代或未取代的N-烷基化乙酸部分的亞曱基碳共價(jià)連接的環(huán)氮原子，所述取代或未取代的N-烷基化乙酸部分通過(guò)其羰基碳與分析物(直接或間接)相連，其中所述取代或未取代的亞甲基碳(而不是羧酸基的羰基碳)是該報(bào)告物的一部分。所述雜環(huán)可以是芳香的或非芳香的。因此，所述報(bào)告物部分可由式Y(jié)-J表示，其中Y基團(tuán)可代表5元、6元或7元雜環(huán)，J基團(tuán)可代表所述取代或未取代的乙酸部分中取代或未取代的亞曱基。所述雜環(huán)可以是取代或未取代的。例如，該雜環(huán)部分的取代基可包括烷基、烷氧基和/或芳基。取代基可包含適于將分析物與支持物連接的保護(hù)或未保護(hù)的基團(tuán)，例如氨基、羥基或硫醇基(見(jiàn)圖6)。所述雜環(huán)可包含額外的雜原子，例如一個(gè)或多個(gè)硅、氮、氧和/或硫原子。因此，例如，報(bào)告物部分"RP，，可以以下式X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25或X"來(lái)代表，其中報(bào)告物部分"RP"以括號(hào)為界可對(duì)報(bào)告物部分進(jìn)行選擇，以使其在對(duì)分析物進(jìn)行分析的典型條件下不發(fā)生亞斷裂(sub-fragment)。為了消除任何疑義，這是任選(而非必需)的特征。例如，可對(duì)報(bào)告物進(jìn)行選擇，以使其在質(zhì)鐠儀中使被標(biāo)記分析物斷裂的解離能條件下不發(fā)生顯著的亞斷裂。我們用"不發(fā)生顯著的亞斷裂，，來(lái)表示在成功測(cè)定被標(biāo)記分析物時(shí)，難于或不可能檢測(cè)到高于背景噪聲的報(bào)告物片段。物離子的粗略質(zhì)量選擇成與不同于意圖測(cè)定的分析物或該分析物的任何預(yù)計(jì)片段的質(zhì)量(即"靜區(qū)(quietzone)")。例如，當(dāng)分析物為蛋白質(zhì)或肽時(shí)，報(bào)告物離子的粗略質(zhì)量可選擇成不同于與任何天然存在的氨基酸或肽或其預(yù)計(jì)斷裂離子。這可有助于分析物測(cè)定，因?yàn)槿Q于分析物，不存在任何樣品中具有相同質(zhì)量的組分可提高任何分析結(jié)果的置信度。對(duì)于肽而言可預(yù)計(jì)背景極低的質(zhì)量范圍實(shí)例可見(jiàn)于表l。表l:選擇與肽分析相關(guān)的標(biāo)記片段離子m/z的可能的"靜區(qū)"<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>156-156160-174177-182184-184188-189191-191202-20721.0-210216-222224-226所述報(bào)告物部分可以是非聚合的。可將報(bào)告物部分選擇成產(chǎn)生具有表明其質(zhì)量小于250原子質(zhì)量單位(amu)的m/z的報(bào)告物部分?？蓪?bào)告物部分選擇成產(chǎn)生m/z小于200原子質(zhì)量單位(amu)的報(bào)告物部分?？蓪?bào)告物部分選擇成產(chǎn)生m/z小于150原子質(zhì)量單位(amu)的報(bào)告物部分。這些小分子可輕易地在第二質(zhì)量分析中測(cè)定，所述第二質(zhì)量分析中不含樣品中與第一質(zhì)量mass)的其它組分。在這種情況下，可以對(duì)第一質(zhì)量分析中測(cè)定的選定離子進(jìn)行第二質(zhì)量分析，一般在串聯(lián)質(zhì)鐠儀中(或者，例如在單階段儀器中通過(guò)源后衰變)來(lái)進(jìn)行。由于可以從第一質(zhì)量分析中具體選出具有特定質(zhì)荷比的離子用于可能的斷裂和進(jìn)一步質(zhì)量分析，因此第一質(zhì)量分析中未選擇的離子不進(jìn)行第二質(zhì)量分析，從而不污染第二質(zhì)量分析的鐠。而且，質(zhì)鐠儀的靈敏度和檢測(cè)器(用于定量)的線性程度在這一低質(zhì)量范圍內(nèi)可以相當(dāng)高。此外，質(zhì)鐠儀技術(shù)的當(dāng)前水平可允許在這一質(zhì)量范圍內(nèi)獲得小于l道爾頓的極限質(zhì)量分辨率。由于以上的所有原因，使用本文所述方法，具有上述特征的報(bào)告物可為復(fù)雜混合物中所測(cè)定的分析物提供相當(dāng)準(zhǔn)確的定量。連接物(或平衡物)部分標(biāo)記試劑的連接物(或平衡物)部分(有時(shí)用縮寫(xiě)"LK，，表示)可用于本發(fā)明的實(shí)施方案，以將報(bào)告物部分(RP)和非編碼可檢測(cè)標(biāo)記(DL)與分析物或反應(yīng)基團(tuán)連接，這取決于是否與分析物發(fā)生反應(yīng)。連接物部分可以是分支的或者是無(wú)分支的。例如，如果報(bào)告物和非編碼可檢測(cè)標(biāo)記各自獨(dú)立地與該連接物連接，連接物可以是分支的；但如果非編碼可檢測(cè)標(biāo)記和報(bào)告物部分依次與該連接物部分連接，則連接物也可以是線性的(參見(jiàn)圖la和lb)。所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記可與連接物直接或間接連接?？蓪⑦B接物選擇成產(chǎn)生中性物質(zhì)(即在質(zhì)鐠儀中發(fā)生中性丟失)，其中連接連接物與報(bào)告物部分的鍵(即鍵X)以及連接連接物與分析物的鍵(在一些實(shí)施方案中為Y)在質(zhì)鐠儀中都斷裂。在一些實(shí)施方案中，連接物部分可設(shè)計(jì)成在經(jīng)受解離能時(shí)亞斷裂，包括僅產(chǎn)生連接物的中性片段的亞斷裂。在一些實(shí)施方案中，可將連接物設(shè)計(jì)成產(chǎn)生一種或多種可檢測(cè)片段。在包含一組同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記試劑的組和/或試劑盒中使用時(shí)，所述連接物部分可包含一種或多種重原子同位素，使得該組中每種不同試劑的連接物部分的質(zhì)量補(bǔ)償針對(duì)該組中不同標(biāo)記試劑在報(bào)告物部分之間的粗略質(zhì)量差異，使得報(bào)告物部分與連接物部分的組合的合計(jì)粗略質(zhì)量對(duì)于該組的每種標(biāo)記試劑均相同。因此，報(bào)告物/連接物組合(即報(bào)告物/連接物部分)的合計(jì)粗略質(zhì)量(即作為整體的粗略質(zhì)量)對(duì)于混合物中每種被標(biāo)記分析物都是相同的(大致相同)，或者對(duì)于組和/或試劑盒中的標(biāo)記試劑是相同的。更具體地，所述連接物部分可補(bǔ)償來(lái)自不同樣品的被標(biāo)記分析物的報(bào)告物部分之間的粗略質(zhì)量差異，其中報(bào)告物部分的獨(dú)特粗略質(zhì)量與被標(biāo)記分析物所來(lái)源的樣品相關(guān)，報(bào)告物/連接物組合的合計(jì)粗略質(zhì)量對(duì)于樣品混合物中的每種被標(biāo)記分析物都是相同的，無(wú)論樣品的來(lái)源如何。這樣，兩種或更多種不同樣品中相同分析物在標(biāo)記及隨之混合之后可具有相同的粗略質(zhì)量，以產(chǎn)生樣品混合物。例如，被標(biāo)記分析物或者用于標(biāo)記該分析物的組和/或試劑盒中的標(biāo)記試劑可以是同分異構(gòu)體和/或同量異位物。因此，如果在質(zhì)鐠儀中從樣品混合物的第一質(zhì)量分析中選擇具有特定質(zhì)荷比(取自樣品混合物)的離子(即選定的離子)，來(lái)自組成樣品混合物的不同樣品中的相同分析物可由所述選定離子來(lái)按比例地代表其在樣品混合物中的相應(yīng)濃度和/或量，因?yàn)闊o(wú)論與分析物連接的標(biāo)記為何，它們都具有相同的粗略質(zhì)量。因此，連接物不僅將報(bào)告物與非編碼可檢測(cè)標(biāo)記和分析物連接，它還用于補(bǔ)償獨(dú)特報(bào)告物部分的質(zhì)量差異，從而使多種樣品中被標(biāo)記分析物的報(bào)告物/連接物部分的粗略質(zhì)量一致。由于連接物可作為標(biāo)記試劑中報(bào)告物部分的質(zhì)量平衡物，因此連接物中的原子數(shù)越多，組和/或試劑盒中不同同分異構(gòu)/同量異位標(biāo)記試劑的可能數(shù)目就越多。換言之，連接物所包含的原子數(shù)越多，一般來(lái)說(shuō)可能的報(bào)告物/連接物組合的數(shù)目就越多，因?yàn)橥凰刈疃嗫稍谶B接物中的任何位置被替換而產(chǎn)生同分異構(gòu)體和/或同量異位物，其中連接物部分用于補(bǔ)償報(bào)告物部分的質(zhì)量差異，從而產(chǎn)生一組獨(dú)特的同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記試劑。這些不同組的標(biāo)記試劑特別適用于相同和/或不同樣品中分析物的多重分析。組和/或試劑盒中標(biāo)記試劑的總數(shù)可以為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多?；谫|(zhì)量平衡的考慮，組或試劑盒中標(biāo)記試劑的多樣性僅受限于報(bào)告物和連接物部分中的原子數(shù)、可用于取代輕同位素的重原子同位素以及可以合成方式安置同位素的多種合成設(shè)置。然而，如上文所指出，多種同位素富集的基本起始材料可便利地從制造商獲得，例如CambridgeIsotopeLaboratories和Isotec。普通技術(shù)人員可將這些同位素富集的基本起始材料用于生產(chǎn)同量異位和/或同分異構(gòu)標(biāo)記試劑組的方法中，或者用于生產(chǎn)同位素富集的起始材料(即以合成方式富集的化合物)的方法中，所述同位素富集的起始材料可用于生產(chǎn)同量異位和/或同分異構(gòu)標(biāo)記試劑組的合成方法中。報(bào)告物/連接物的組合(即報(bào)告物/連接物部分)標(biāo)記試劑可包含報(bào)告物部分和連接物部分，它們通過(guò)鍵x彼此直接連接。如上文所述，報(bào)告物/連接物部分對(duì)于標(biāo)記試劑組和/或試劑盒中的每個(gè)成員而言可以是相同的，或者對(duì)于被標(biāo)記分析物的化合物中每種被標(biāo)記分析物而言都是相同的。而且，(直接或間接地)連接報(bào)告物部分與連接物部分的鍵(即鍵X)可設(shè)計(jì)成在經(jīng)受解離能時(shí)至少在一部分選定的離子中斷裂，從而從連接物部分、連接物/分析物和/或連接物/分析物/非編碼可檢測(cè)標(biāo)記部分中釋放特征離子(即報(bào)告物離子)。因此，可以在MS/MS分析中直接觀察該特征離子(通過(guò)質(zhì)鐠儀中的質(zhì)荷比(m/z)來(lái)觀察)及其強(qiáng)度(即其峰強(qiáng)度)。報(bào)告物/連接物部分可包含一組或試劑盒中的多種標(biāo)記試劑中相同或不同的重原子同位素的多種組合。在科技文獻(xiàn)中，這有時(shí)稱為"編碼"、"同位素編碼"或"代碼"。例如Abersold等公開(kāi)了同位素編碼的親和標(biāo)簽(ICAT;參閱WO00/11208)。在一個(gè)方面中，Abersold等的試劑與本文所述標(biāo)記試劑不同，Abersold未教導(dǎo)兩種或更多種相同質(zhì)量的標(biāo)記試劑，例如同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記試劑。相反，Abersold等教導(dǎo)了其標(biāo)記試劑的"輕"形式和"重"形式。包含非編碼可檢測(cè)標(biāo)記的ICAT試劑形式(有時(shí)稱為VICAT)描述于WO2004/01卯00;Lu等，爿w"/.C7^附.，76:4104-4111(2004)以及Bottari等，5,V"w/"gflteC7^附/對(duì)o;,15(2):380-388(2004)。在一些實(shí)施方案中，報(bào)告物和/或連接物部分可包含可用于將標(biāo)記試劑或被標(biāo)記分析物固定在支持物上的原子或基團(tuán)。固定可以是直接的或間接的。例如，如果與報(bào)告物相關(guān)聯(lián)的原子或基團(tuán)(例如報(bào)告物的烷基氨基取代基)與支持物的反應(yīng)基團(tuán)(例如可切割連接物的反應(yīng)基團(tuán))直接相互作用以實(shí)現(xiàn)固定，則可發(fā)生直接固定。相比之下，間接固定在以下情況下發(fā)生，例如報(bào)告物的取代基(例如報(bào)告物和/或連接物的烷基氨基取代基)被修飾(例如生物素化)，且該修飾基團(tuán)與支持物的反應(yīng)基團(tuán)(例如親和素或鏈霉親和素)相互作用以實(shí)現(xiàn)固定。因此，本發(fā)明涵蓋這樣的實(shí)施方案分析物能與結(jié)合在支持物上的標(biāo)記試劑反應(yīng)，其中每種支持物包含獨(dú)特的標(biāo)記試劑，從而不同的樣品與不同的支持物反應(yīng)；還涵蓋這樣的實(shí)施方案每種不同樣品與不同的標(biāo)記試劑反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物其后固定在相同或不同的支持物上。在任何一種情況下，一般地通過(guò)從支持物上切下被標(biāo)記分析物來(lái)獲得用于質(zhì)i普分析的樣品混合物(參見(jiàn)圖6)。所釋放的每種樣品的被標(biāo)記分析物可任選地分開(kāi)收集，或者可以在切割過(guò)程中混合以形成樣品混合物。如果進(jìn)行收集，則所釋放的被標(biāo)記分析物可在其后混合以形成樣品混合物。非編碼可檢測(cè)標(biāo)記本文所述標(biāo)記試劑包含非編碼的可檢測(cè)標(biāo)記(有時(shí)使用縮寫(xiě)"DL"來(lái)表示)?？膳c本文所述標(biāo)記試劑一起使用的非編碼可檢測(cè)標(biāo)記(部分)的非限制性實(shí)例包括但不僅限于生色團(tuán)、熒光團(tuán)、自旋標(biāo)記、酶或化學(xué)發(fā)光化合物。我們使用"非編碼"來(lái)表示該可檢測(cè)標(biāo)記沒(méi)有以合成方式富集一種或多種重原子同位素。因此，所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記不產(chǎn)生報(bào)告物離子(特征離子)，并且不代表連接物(平衡物)部分的一部分。熒光團(tuán)的非限制性實(shí)例包括5(6)-羧基熒光素(Flu)、6-((7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙?；?氨基)己酸(Cou)、5(和6)-羧基-X-羅丹明(Rox)、花青2(Cyanine2，Cy2)染料、花青3(Cy3)染料、花青3.5(Cy3.5)染料、花青5(Cy5)染料、花青5.5(Cy5.5)染料、花青7(Cy7)染料、花青9(Cy9)染料、(花青染料2、3、3.5、5和5.5作為NHS酯可得自Amersham，ArlingtonHeights,IL)或者Alexa染料系歹'J(MolecularProbes,Eugene,OR)。酶的非限制性實(shí)例包括聚合酶(例如Taq聚合酶、KlenowDNA聚合酶、T7DNA聚合酶、測(cè)序酶、DNA聚合酶1和d>29聚合酶)、堿性磷酸酶(AP)、辣#>過(guò)氧化物酶(HRP)、大豆過(guò)氧化物酶(SBP)、對(duì)于成組的同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記試劑而言，每種非編碼可檢測(cè)標(biāo)記在相似條件下均與該標(biāo)記試劑組中的其它非編碼可檢測(cè)標(biāo)記具有相同的粗略質(zhì)量和相同的凈電荷。每種不同的非編碼可檢測(cè)標(biāo)記均可獨(dú)立于該組中其它標(biāo)記而進(jìn)行檢測(cè)。例如，相信圖8a和8b所述標(biāo)記試劑的熒光團(tuán)(即非編碼可檢測(cè)標(biāo)記)具有可區(qū)分的熒光鐠、在生理pH下具有相同的凈電荷并具有相同的名義粗略質(zhì)量。由于每種非編碼可檢測(cè)標(biāo)記均可在組中獨(dú)立檢測(cè)，因此在一些實(shí)施方案中，所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記可用于在下文所述的電泳分離中在特定的被標(biāo)記分析物顯出相對(duì)濃度差異時(shí)(或其它目的條件)進(jìn)行測(cè)定。因此，在一些實(shí)施方案中，可以基于MS分析及定量之前的(電泳分離和)分析來(lái)審慎地選擇用于MS分析(以及在一定程度上進(jìn)行定量)的目的分析物。這樣，可以跳過(guò)相對(duì)于預(yù)期量來(lái)說(shuō)好像沒(méi)有量改變或者好像沒(méi)有相對(duì)定量差異的分析物進(jìn)行的MSn分析，從而可以更有效地利用時(shí)間和資源。鍵XX是報(bào)告物原子與連接物部分或非編碼可檢測(cè)標(biāo)記的原子之間的鍵。本文所述多種標(biāo)記試劑的鍵X在經(jīng)受解離能時(shí)可在至少一部分選定的離子中斷裂。因此，可在質(zhì)鐠儀中調(diào)整解離能的水平，以4吏鍵x可在被標(biāo)記分析物的至少一部分選定離子中斷裂。鍵x的斷裂從分析物中釋放報(bào)告物，使得報(bào)告物(即特征離子)可獨(dú)立于分析物離子而進(jìn)行測(cè)定。鍵或連接基團(tuán)YY是連接所述連接物部分("LK")與反應(yīng)基團(tuán)("RG")的鍵或連接基團(tuán)。無(wú)論是鍵還是連接基團(tuán)，Y均任選地是可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂的。如果Y是連接基團(tuán)，則它可以是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或芳基亞烷基。如果Y是連接基團(tuán)，它可任選地包含一個(gè)或多個(gè)重原子同位素。如果Y是連接基團(tuán)，并且在同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記試劑組中使用該標(biāo)記試劑，則其粗略質(zhì)量對(duì)于該組中每種標(biāo)記試劑而言都相同。如果Y可斷裂，則Y的斷裂從分析物或其片段中釋放報(bào)告物/連接物/非編碼可檢測(cè)標(biāo)記部分，這取決于鍵X是否已斷裂。如果是鍵，則鍵Y可能比鍵X更不穩(wěn)定。鍵X可以比鍵Y更不穩(wěn)定。鍵X和Y可具有相同的相對(duì)不穩(wěn)定性。如果目的分析物是蛋白質(zhì)或肽，則可根據(jù)酰胺(肽)鍵來(lái)調(diào)整鍵X和Y的相對(duì)不穩(wěn)定性。鍵X、鍵Y或其二者可以比典型酰胺(肽)鍵的不穩(wěn)定性更高、相同或更低。例如，在解離能條件下，鍵X和/或鍵Y與Z，，，-pro二聚體或者Z，"-asp二聚體中的肽鍵相比可以更不易于斷裂，其中Z"，是任何天然氨基酸，pro是脯氨酸，asp是天冬氨酸。在一些實(shí)施方案中，鍵X和Y將與典型酰胺鍵在大致相同的解離能水平下斷裂。在一些實(shí)施方案中，鍵X和Y將在比典型酰胺鍵更高的解離46能水平下斷裂。還可存在這樣的鍵X和Y,使得鍵Y的斷裂引起鍵X的斷裂，反之亦然。這樣，鍵X和Y可基本同時(shí)斷裂，使得沒(méi)有顯著量的分析物(或其子片段)在第二質(zhì)量分析中具有部分標(biāo)記。我們用"顯著量的分析物"來(lái)表示在MS/MS諉中可檢測(cè)到小于25%、優(yōu)選小于10o/n的部分標(biāo)記分析物。由于在一些實(shí)施方案中分析物的標(biāo)記片段與未標(biāo)記片段在第二質(zhì)量分析(MS/MS)中存在明確的界限，因此這一特征可使從子片段離子譜的計(jì)算機(jī)輔助分析中鑒定分析物得以簡(jiǎn)化。而且，由于在一些實(shí)施方案中分析物的片段離子可以用報(bào)告物/連接物/可檢測(cè)部分完全標(biāo)記或者不標(biāo)記(但不是部分標(biāo)記)，因此在子片段離子的質(zhì)量中可能不存在或幾乎不存在由于斷裂鍵之間的同位素分布所導(dǎo)致的離散，例如第二質(zhì)量分析中常規(guī)測(cè)定的部分標(biāo)記分析物中單個(gè)不穩(wěn)定鍵的每一側(cè)都存在同位素的情況。鍵或連接基團(tuán)W:W是連接所述連接物部分("LK")與非編碼可檢測(cè)標(biāo)記("DL")的鍵或連接基團(tuán)。W任選地可通過(guò)施加光、熱或化學(xué)試劑而切割和/或可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂(即可切割)。如果W是連接基團(tuán)，則它可以是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或芳基亞烷基。如果W是連接基團(tuán)，它可任選地包含一個(gè)或多個(gè)重原子同位素。如果W是連接基團(tuán)，并且在同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記試劑組中使用該標(biāo)記試劑，則其粗略質(zhì)量對(duì)于該組中每種標(biāo)記試劑而言都相同。在W是連接基團(tuán)的一些實(shí)施方案中，W可包括例如可切割部分，如XAL、PAL或HMPB，更詳細(xì)地描述于Kates等，5W/rfi^flse5^"幼esisv爿戶m"/cfl/GwiV/e，MarcelDekker，Inc.,NewYork,2000。與支持物結(jié)合的包含可切割連接物的標(biāo)記試劑根據(jù)一些實(shí)施方案，來(lái)自樣品的分析物可與包含標(biāo)記試劑的固相支持物反應(yīng)(每種樣品與不同的固相支持物反應(yīng)，以使每種樣品的每種被標(biāo)記分析物包含不同的報(bào)告物部分)，并可任選地洗去樣品中不與該反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)的組分。接著可以通過(guò)在切割可切割連接物并由此從支持物上釋放報(bào)告物-連接物-非編碼可檢測(cè)標(biāo)記/分析物復(fù)合體的條件下處理支持物，以從每個(gè)固相支持物上除去被標(biāo)記分析物。每個(gè)支持物均可在切割可切割連接物的條件下相似地進(jìn)行處理由此獲得兩種或更多種不同樣品，每種樣品包含一種或多種被標(biāo)記分析物，其中與特定樣品相關(guān)的被標(biāo)記分析物可通過(guò)與其連接的獨(dú)特報(bào)告物部分來(lái)鑒定和/或定量。接著可混合所收集的樣品以形成樣品混合物，如下文所述。有多種市售的支持物可用于通過(guò)可切割連接物將標(biāo)記試劑連接到支持物上。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記試劑可通過(guò)報(bào)告物部分連接到支持物上。一般而言，標(biāo)記試劑會(huì)包含親核或親電基團(tuán)，它們能與可切割連接物的官能團(tuán)反應(yīng)，從而將所述標(biāo)記試劑與所述支持物可切割地連接在一起。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記試劑可在帶有所述可切割連接物的支持物上合成。在另一些實(shí)施方案中，所述標(biāo)記試劑包含可切割連接物，所述可切割連接物可與支持物反應(yīng)，并由此形成包含該可切割連接物的與支持物結(jié)合的標(biāo)記試劑。例如，標(biāo)記試劑的報(bào)告物部分中的氨基、幾基或硫醇基可與適當(dāng)支持物的可切割連接物反應(yīng)。所述可切割連接物可以是"空間受阻的(stericallyhindered)可切割連接物"。切割所述可切割連接物會(huì)從支持物上釋放標(biāo)記或被標(biāo)記分析物?？臻g受阻的固相支持物的非限制性實(shí)例包括三苯甲基氯樹(shù)脂(trityl-Cl,Novabiochem,P/N01-64-0074)、2-氯三苯曱基氯樹(shù)脂(Novabiochem，P/N01-64-0021)、DHPP(Bachem,P/NQ國(guó)1755)、MBHA(AppliedBiosystemsP/N400377)、4-甲基三苯甲基氯樹(shù)脂(Novabiochem,P/N01-64-0075)、4-甲氧基三苯甲基氯樹(shù)脂(Novabiochem,P/N01-64-0076)、羥基誦(2-氯苯基)曱基畫(huà)PS(Novabiochem,P/N01-64-0345)、Rink酸樹(shù)脂(NovabiochemP/N01-64-0380，01-64-0202)、NovaSynTGT醇樹(shù)月旨(Novabiochem，P/N01-64-0074)。多種其它可切割連接物為本領(lǐng)域已知的，并可用于僅使用市售材料、常規(guī)實(shí)驗(yàn)和本文的教導(dǎo)來(lái)制備合適的支持物。例如，所述報(bào)告物部分可以是5元、6元或7元雜環(huán)，其包含有助于將其與適當(dāng)支持物可切割連接的原子或基團(tuán)。例如，所述基團(tuán)可以是包含氨基、羥基或硫醇基的亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或烷基亞芳基，在一些實(shí)施方案中，所述雜環(huán)不需要其它的官能團(tuán)。例如，與該可切割連接物結(jié)合的原子可以是哌嚷環(huán)的仲氮。關(guān)于示例性哌嚷化合物及其制備方法的討論可見(jiàn)于已公開(kāi)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)US2004-0219685Al。報(bào)告物部分中氨基、羥基或硫醇基與包含該連接物部分的支持物之間的反應(yīng)可形成包含該標(biāo)記試劑的支持物。支持物與支持物上所結(jié)合的標(biāo)記試劑的反應(yīng)可產(chǎn)生與支持物結(jié)合的被標(biāo)記分析物。由于所述可切割連接物可選擇成通過(guò)光、熱或化學(xué)試劑進(jìn)行切割，因此適當(dāng)?shù)奶幚頃?huì)釋放可用于產(chǎn)生下文所述樣品混合物的被標(biāo)記分析物。參考圖6,展示了與支持物可切割地連接的示例性標(biāo)記試劑。如圖所示，與珠狀支持物連接的三苯甲基是可切割連接物(例如三苯甲基氯樹(shù)脂(trityl-Cl,Novabiochem,P/N01-64-0074)。如圖所示，標(biāo)記試劑中烷基化哌溱報(bào)告物部分的相連官能團(tuán)Q與支持物上結(jié)合的三苯曱基可切割地連接，反應(yīng)基團(tuán)的離去基團(tuán)Z，可被分析物的官能團(tuán)置換，從而形成與支持物結(jié)合的被標(biāo)記分析物。例如，標(biāo)記試劑的反應(yīng)基團(tuán)可以是羧酸，它可原位活化以與分析物(例如肽)的氨基官能團(tuán)反應(yīng)，從而形成與支持物結(jié)合的被標(biāo)記分析物。如圖所示，用酸處理該支持物通過(guò)再生標(biāo)記試劑報(bào)告物部分的官能團(tuán)Q，而從支持物上釋放被標(biāo)記分析物。質(zhì)諉儀/質(zhì)譜法(MS):可使用能選擇和斷裂分子離子的串聯(lián)質(zhì)語(yǔ)儀和其它質(zhì)i普儀實(shí)施本發(fā)明的方法。串聯(lián)質(zhì)譜儀能根據(jù)其質(zhì)荷比(m/z)來(lái)選擇和斷裂分子離子(單級(jí)質(zhì)譜儀也有此能力，但程度較低)，其后記錄所得到的片段(子片段)離子鐠。更特別地，可通過(guò)對(duì)選定的離子施加解離能(例如碰撞誘導(dǎo)解離，CID))產(chǎn)生子片段離子譜。例如，可以在第一質(zhì)量分析中選擇對(duì)應(yīng)于具有特定m/z比的被標(biāo)記肽的離子，使其斷裂并在第二質(zhì)量分析中進(jìn)行再分析?？蛇M(jìn)行這樣的串聯(lián)質(zhì)量分析的代表性儀器包括但不僅限于磁性四扇區(qū)(magneticfour-sector)、串聯(lián)飛行時(shí)間、三重四極桿、離子阱和串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間(Q-TOF)質(zhì)鐠儀。這些類(lèi)型的質(zhì)鐠儀可以與多種離子源聯(lián)用，所述離子源包括但不僅限于電噴霧電離(ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)。離子源可用于產(chǎn)生離子化物質(zhì)，其用于在分析物還不具有固定電荷時(shí)進(jìn)行第一質(zhì)量分析。其它質(zhì)譜儀器和斷裂方法包括MALDI-MS儀器中的源后衰變和4吏用MALDI-TOF(飛行時(shí)間)-TOFMS進(jìn)行的高能CID。關(guān)于串聯(lián)質(zhì)鐠最近的綜述可參閱R.Aebersold和D.Goodlett，Af"^5^ec^Y附e^j/"iVo&0附/cs.C^e/if.及ev.101:269-295(2001)。通過(guò)解離能進(jìn)行斷裂:公認(rèn)的是，鍵可因質(zhì)鐠儀中發(fā)生的過(guò)程而發(fā)生斷裂。此外，可以在質(zhì)譜儀中通過(guò)對(duì)離子施加解離能來(lái)誘發(fā)斷裂。例如，可以通過(guò)碰撞誘導(dǎo)解離(CID)在質(zhì)譜儀中產(chǎn)生解離能?？捎糜谠谫|(zhì)鐠儀中斷裂離子的解離能的其它非限制性實(shí)例包括碰撞激活解離(CAD)、光誘導(dǎo)解離(PID)、表面誘導(dǎo)解離(SID)、電子誘導(dǎo)解離(EID)、電子俘獲解離(ECD)、熱/黑體紅外輻射解離(BIRD)、源后衰變或其組合。質(zhì)譜領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解，施加引起斷裂的解離能的其它示例性技術(shù)包括但不僅限于光解離、電子俘獲和表面誘導(dǎo)解離。通過(guò)碰撞誘導(dǎo)解離斷裂鍵的方法包括通過(guò)與惰性氣體碰撞而將選定離子的動(dòng)能狀態(tài)提高到發(fā)生鍵斷裂的點(diǎn)。例如，可以通過(guò)在碰撞室中與惰性氣體(例如氮、氦或氬)碰撞來(lái)傳遞動(dòng)能?？梢詡鬟f至該離子的動(dòng)能的量與允許進(jìn)入碰撞室的氣體分子數(shù)成比例。當(dāng)存在較多的氣體分子時(shí)，可以對(duì)選定的離子傳遞較大量的動(dòng)能，當(dāng)存在的氣體分子較少時(shí)，可以傳遞較少的動(dòng)能。因此，很明顯，可以控制質(zhì)鐠儀中所施加的解離能。還公認(rèn)的是，某些鍵比其它鍵更不穩(wěn)定。分析物或報(bào)告物/連接物/非編碼可檢測(cè)標(biāo)記物部分中鍵的不穩(wěn)定性取決于該分析物的性質(zhì)和該報(bào)告物/連接物/非編碼可檢測(cè)標(biāo)記物部分的性質(zhì)。因此，可以調(diào)節(jié)解離能，從而以可測(cè)定的方式使分析物和/或標(biāo)記試劑(例如報(bào)告物/連接物的組合)斷裂。本領(lǐng)得適當(dāng)?shù)慕怆x能水平，從而使被標(biāo)記分析物的至少一部分離子斷裂成特征離子(即報(bào)告物離子)和子片段離子。例如，可以對(duì)在第一質(zhì)量分析中選擇/分離的離子施加解離能。在串聯(lián)質(zhì)鐠儀中，可使提取的離子經(jīng)受解離能，從而導(dǎo)致斷裂，接著轉(zhuǎn)移至第二質(zhì)量分析器中。所選定的離子可具有選定的質(zhì)荷比。所述質(zhì)荷比可以在一定的質(zhì)荷比范圍內(nèi)，這取決于質(zhì)鐠儀的特性。當(dāng)使用碰撞誘導(dǎo)解離時(shí)，可通過(guò)使離子穿過(guò)碰撞室而將其從第一質(zhì)量分析器轉(zhuǎn)移至第二質(zhì)量分析器，在所述碰撞室中可以施加解離能以產(chǎn)生片段離子。例如，送至第二質(zhì)量分析器進(jìn)行分析的離子可包括一些或一部分殘留的(未斷裂的)選定離子(如果有的話)以及被標(biāo)記分析物的才艮告物離子(特征離子)和子片段離子。通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助數(shù)據(jù)庫(kù)分析來(lái)確定分析物在一些實(shí)施方案中，可以基于子離子斷裂模式來(lái)確定分析物，所述模式通過(guò)與已知或"理論"分析物的譜圖進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助的比較來(lái)分析。例如，在低能CID條件下斷裂的肽離子的子片段離子鐠可以認(rèn)為是許多離散斷裂事件的總和。常用的命名原則根據(jù)所斷裂的酰胺鍵和鍵斷裂后保持帶電的肽片段來(lái)區(qū)分子片段離子(Reopstorff等，5"挑W.Mfl^5^"n附.，11:601(1988))。電荷保留在斷裂酰胺鍵的N端側(cè)導(dǎo)致形成b-型離子。如果電荷保留在斷裂酰胺鍵的C端側(cè)，則片段離子稱為y-型離子。除了b-和y-型離子以外，CID質(zhì)鐠還可含有其它診斷性片段離子(它們包括由于谷氨酰胺、賴氨酸和精氨酸發(fā)生氨中性丟失(-17amu)或者含有羥基的氨基酸(如絲氨酸和蘇氨酸)發(fā)生水丟失(-18amu)而產(chǎn)生的離子)；所述診斷性片段離子以及b-和y-型離子都是子片段離子。已經(jīng)觀察到某些氨基酸在低能CID條件下比其它氨基酸更易于斷裂。這對(duì)于含有脯氨酸或天冬氨酸殘基的肽而言特別明顯，在天冬氨酰-脯氨酸鍵處更為明顯(Mak，M.等，及"/;!V/O附www.Mass5^"/w"12:837-842(1998))。因此，Z，，，-pro二聚體或Z，，，畫(huà)asp二聚體(其中Z"，是任何天然氨基酸，pro是脯氨酸，asp是天冬氨酸)的肽鍵與其它氨基酸二聚體組合中的肽鍵相比通常更不穩(wěn)定。因此，就肽和蛋白質(zhì)樣品而言，低能CID鐠含有冗余的b-和y-系列離子、來(lái)自同一肽的內(nèi)部片段離子以及銨和其它中性丟失離子方面的冗余的序列特異性信息。解釋這些CID鐠來(lái)從頭組裝親本肽氨基酸序列是很艱巨且費(fèi)時(shí)的，但仍可行。用于測(cè)序的計(jì)算機(jī)輔助的從頭方法的最新^H描述于Huang，Y.，Ross，P，Smirnov，I，Martin，S.和Pappin，D.2003,Proceedingsof6thInternationalSymposiumonMSinHealthandLifeSciences,2003年8月24日-28日，SanFranciscoCA。肽序列鑒定中最重要的進(jìn)步是開(kāi)發(fā)了將肽CID鐠與現(xiàn)存于蛋白質(zhì)和DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的肽序列相關(guān)聯(lián)的計(jì)算機(jī)算法。這樣的方法例如以下程序SEQUEST(Eng,J.等/J附.Soc.Mam5^"n附.，5:976-989(1994))和MASCOT(Perkins,D.等五/e"n^Ao"s/s，20:3551-3567(1999))。簡(jiǎn)言之，將實(shí)驗(yàn)性肽CID鐠(MS/MS譜)與從得自蛋白質(zhì)或基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)的肽序列中通過(guò)計(jì)算機(jī)產(chǎn)生的"理論"子片段離子譜進(jìn)行匹配或關(guān)聯(lián)。這種匹配或關(guān)聯(lián)是基于預(yù)計(jì)質(zhì)量與MS/MS模式中子片段離子的觀測(cè)質(zhì)量之間的相似性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)與"理論"片段鐠之間的一致程度來(lái)對(duì)可能的匹配或關(guān)聯(lián)評(píng)分。對(duì)給定肽氨基酸序列進(jìn)行檢索的參數(shù)非常具有區(qū)分力，以至于單個(gè)肽CID譜就足以鑒定全基因組或表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫(kù)中的任何給定蛋白質(zhì)。其它綜述可參閱Yates，J.R.Trends,Gew"/cs，J6:5-8(2000)和Yates，J.R.，五/e"n/;/^/^^sJ9:893-卯0(1998)。因此，MS/MS鐠的子片段離子分析不僅可用于確定被標(biāo)記分析物的分析物，它還可用于確定作為所測(cè)定分析物之來(lái)源的分析物。例如，在MS/MS分析中鑒定肽可用于確定該肽從哪種蛋白質(zhì)中由于蛋白質(zhì)的酶消化而切下。我們認(rèn)為這樣的分析可應(yīng)用于其它分析物，例如核酸、脂質(zhì)、類(lèi)固醇和/或前列腺素。X鍵和Y鍵報(bào)告物部分的原子與連接物部分的原子之間的鍵是X鍵。如果是被標(biāo)記分析物中的鍵，則連接物部分的原子與該分析物的原子之間的鍵是Y鍵。在一些實(shí)施方案中，至少在一部分選定離子中的X鍵和Y鍵在經(jīng)受解離能時(shí)可斷裂。因此，在一些實(shí)施方案中，可以調(diào)整質(zhì)鐠儀中的解離能，以使被標(biāo)記分析物的至少一部分選定離子中的X鍵和Y鍵都斷裂。X鍵的斷裂從分析物中釋放報(bào)告物部分，使得報(bào)告物離子可以獨(dú)立于分析物而進(jìn)行測(cè)定。Y鍵的斷裂從分析物中釋放報(bào)告物/連接物/非編碼可檢測(cè)標(biāo)記，或者從分析物中釋放連接物，這取決于Y鍵是否已經(jīng)斷裂。在一些實(shí)施方案中，X鍵可比Y鍵更不穩(wěn)定。在一些實(shí)施方案中，Y鍵可比X鍵更不穩(wěn)定。在一些實(shí)施方案中，X鍵和Y鍵具有相同的相對(duì)不穩(wěn)定性。簡(jiǎn)言之，在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，將X鍵設(shè)計(jì)成斷裂以釋放報(bào)告物離子，而Y鍵可以斷裂或不斷裂。如果標(biāo)記試劑不包含可斷裂的Y鍵，則可調(diào)整子離子分析，使得標(biāo)記試劑對(duì)分析物的任何修飾的質(zhì)量可以在相關(guān)分析中得到補(bǔ)償。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)目的分析物是蛋白質(zhì)或肽時(shí)，可以相對(duì)于酰胺(肽)鍵來(lái)調(diào)整X鍵和Y鍵的相對(duì)不穩(wěn)定性。鍵X、鍵Y或其二者可以比典型酰胺(肽)鍵的不穩(wěn)定性更高、相同或更低。例如，在解離能條件下，與Z"，-pro二聚體或Z"，-asp二聚體中的肽鍵相比鍵X和/或鍵Y可以更不易于斷裂，其中Z，"是任何天然氨基酸，pro是脯氨酸，asp是天冬氨酸。在一些實(shí)施方案中，鍵X和Y將在與典型酰胺鍵大致相同的解離能水平下斷裂。在一些實(shí)施方案中，鍵X和Y將在比典型酰胺鍵更高的解離能水平下斷裂。在一些實(shí)施方案中，還可存在這樣的鍵X和Y,使得鍵X的斷裂引起鍵Y的斷裂，反之亦然。這樣，鍵X和Y可基本同時(shí)斷裂，使得沒(méi)有顯著量的分析物(或其子片段)包含部分標(biāo)記。我們用"顯著量的分析物"來(lái)表示在質(zhì)鐠儀(例如MS/MS或MSn'分析，其中n，是大于1的整數(shù))可檢測(cè)到小于25%、優(yōu)選小于10%的部分標(biāo)記分析物。由于在一些實(shí)施方案中分析物的標(biāo)記片段與未標(biāo)記片段在質(zhì)鐠(例如MS/MS分析)中存在明確的界限，因此這一特征可使通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助分析從子片段離子鐠中鑒定分析物得以筒化，因?yàn)樵谟糜趯?duì)分析物子片段離子進(jìn)行分析的質(zhì)量計(jì)算中不需要對(duì)殘留的標(biāo)記進(jìn)行補(bǔ)償。而且，由于在一些實(shí)施方案中分析物的片段離子可以用報(bào)告物/連接物/可檢測(cè)部分完全標(biāo)記或者不標(biāo)記(并且不是部分標(biāo)記)，因此可以很少有或者沒(méi)有由于跨過(guò)斷裂鍵之間的同位素分布所導(dǎo)致的子片段離子在質(zhì)量上的散布，就像由施加解離能水平所引起的被標(biāo)記分析物的斷裂所導(dǎo)致的部分標(biāo)記分析物中單個(gè)不穩(wěn)定鍵的每一側(cè)都存在同位素的情況那樣。對(duì)分析物進(jìn)行標(biāo)記如上文所述，可通過(guò)使分析物的官能團(tuán)與標(biāo)記試劑的反應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)來(lái)標(biāo)記分析物。分析物上的官能團(tuán)可以是親電基團(tuán)或親核基團(tuán)之一，而標(biāo)記試劑的官能團(tuán)可以是親電基團(tuán)或親核基團(tuán)中的另一種。親電體與親核體可發(fā)生反應(yīng)，以在分析物與標(biāo)記試劑之間形成共價(jià)連接。標(biāo)記反應(yīng)可在溶液中發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，分析物或標(biāo)記試劑之一可與支持物結(jié)合。有時(shí)標(biāo)記反應(yīng)可在水性條件下進(jìn)行。對(duì)于生物分子例如蛋白質(zhì)、肽和/或核酸的標(biāo)記可以選擇水性條件。有時(shí)標(biāo)記反應(yīng)可在有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑的混合物中進(jìn)行。對(duì)于小分子分析物可以選擇有機(jī)溶劑。水與有機(jī)溶劑的混合物可廣泛使用。例如，可以制備水與約5%至約95%有機(jī)溶劑(體積/體積)的溶液，并用于標(biāo)記分析物。在一些實(shí)施方案中，可以制備水與約50%至約95%有機(jī)溶劑(體積/體積)，并用于標(biāo)記分析物。在一些實(shí)施方案中，可以制備水與約65%至約80%有機(jī)溶劑(體積/體積)，并用于標(biāo)記分析物。有機(jī)溶劑的非限制性實(shí)例包括N，N'-二甲基曱酰胺(DMF)、乙腈(ACN)、N-甲基吡咯烷(NMP)和醇類(lèi)，例如甲醇、乙醇、丙醇和/或丁醇。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠利用本領(lǐng)域的知識(shí)和本文的公開(kāi)內(nèi)容并結(jié)合常規(guī)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)標(biāo)記試劑的性質(zhì)和分析物的性質(zhì)來(lái)確定合適的溶劑條件，以便于對(duì)分析物進(jìn)行標(biāo)記。進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)時(shí)，可調(diào)節(jié)pH。pH可以為4-10。pH也可在此范圍之外。通常，可以通過(guò)加入非親核有機(jī)堿來(lái)調(diào)節(jié)非水反應(yīng)的堿度。合適的堿的非限制性實(shí)例包括N-甲基嗎啉、三乙胺和N,N-二異丙基乙胺?；蛘撸梢允褂蒙锞彌_劑(例如N-[2-羥乙基哌溱-N'-[2-乙磺酸)(HEPES)或4-嗎啉乙磺酸(MES))或無(wú)機(jī)緩沖劑(例如碳酸鈉和/或碳酸氫鈉)來(lái)調(diào)節(jié)含水溶劑的pH。因?yàn)榉磻?yīng)基團(tuán)至少之一可以是親電的，所以需要選擇不含有任何親核基團(tuán)的緩沖劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)應(yīng)用常規(guī)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虼_定可用于調(diào)節(jié)標(biāo)記反應(yīng)pH的其它緩沖劑，以有助于用標(biāo)記試劑對(duì)分析物進(jìn)行標(biāo)記。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)標(biāo)記試劑的性質(zhì)和分析物的性質(zhì)，使用本文的公開(kāi)內(nèi)容結(jié)合常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定有助于分析物標(biāo)記的合適的溶劑條件和pH。樣品處理:在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可以在標(biāo)記分析物之前和之后處理樣品。處理可有助于分析物的標(biāo)記。處理可有助于分析樣品組分。處理可簡(jiǎn)化對(duì)樣品的操作。處理可有助于上述的兩項(xiàng)或更多。例如，可以用酶或化學(xué)品處理樣品。所述酶可以是蛋白酶(以降解蛋白質(zhì)和肽)、核酸酶(以降解核酸)或其它一些酶?？梢赃x擇具有高度可預(yù)測(cè)的降解模式的酶。還可以將兩種或更多種蛋白酶和/或兩種或更多種核酸酶一起使用或與其它酶一起使用，以降解樣品組分。例如，蛋白水解酶胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶，其切割賴氨酸或精氨酸與非特定氨基酸之間的肽鍵，從而產(chǎn)生包含氨基端(N端)以產(chǎn)生的肽是可以預(yù)測(cè)的，其在胰蛋白酶消化產(chǎn)物樣品中的存在情況和/或量可指示其來(lái)源蛋白的存在情況和/或量。此外，肽的游離胺末端可以是有助于其標(biāo)記的優(yōu)良親核體。其它示例性蛋白水解酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、ArgC、LysC、V8蛋白酶、AspN、鏈霉蛋白酶、糜蛋例如，理論上講蛋白G在用諸如胰蛋白酶的蛋白酶進(jìn)行消化時(shí)可產(chǎn)生三種肽(例如肽B、C和D)。因此，用蛋白水解酶(如胰蛋白酶)消化過(guò)并在分析中證實(shí)含有肽B、C和D的樣品可以說(shuō)最初包含蛋白G。(C端)的肽。這樣，蛋白質(zhì)切割所肽B、C和D的量也會(huì)與所消化樣品中蛋白G的量相關(guān)。這樣，對(duì)鑒定和/或定量樣品(或其片段)中肽B、C和D中一種或多種的任何測(cè)定均可用于對(duì)原始樣品(或其級(jí)分)中蛋白G進(jìn)行鑒定和/或定量。由于酶的活性是可預(yù)測(cè)的，因此從序列已知的蛋白質(zhì)的降解中產(chǎn)生的肽序列是可以預(yù)測(cè)的(參閱上文在"通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助數(shù)據(jù)庫(kù)分析來(lái)確定分析物"標(biāo)題下的討論)。使用這一信息可以產(chǎn)生"理論"肽信息。因此，在對(duì)實(shí)際樣品質(zhì)鐠分析的子片段離子進(jìn)行的計(jì)算機(jī)輔助分析(如上所述)中確定"理論，，肽片段可用于確定一種或多種未知樣品中的一種或多種肽或蛋白質(zhì)(同上)。在一些實(shí)施方案中，樣品處理可包括處理待標(biāo)記分析物的前體。例如，如果待標(biāo)記分析物是來(lái)自經(jīng)消化蛋白質(zhì)的肽，且標(biāo)記試劑(在這個(gè)例子中)選擇成與該肽或肽分析物的氨基(如賴氨酸的N-a-氨基和N-s-氨基)反應(yīng)，則可以以有助于標(biāo)記反應(yīng)的方式加工樣品中的蛋白質(zhì)(分析物前體分子)。在這個(gè)例子中，可以用還原劑(例如三[2-羧乙基磷(TCEP))還原蛋白質(zhì)，接著通過(guò)與封閉試劑(例如甲基硫代磺酸甲酯(methylmethanethiosulfonate，MMTS))反應(yīng)以封閉硫醇基團(tuán)。這樣，蛋白質(zhì)的硫醇基被封閉，從而不干擾分析物的氨基與標(biāo)記試劑之間的標(biāo)記反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，對(duì)某些其它前體分子的處理可使用易于獲得的試劑和可借助常規(guī)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行修改的方案來(lái)進(jìn)行。試劑和條件的確切選擇可根據(jù)待標(biāo)記的分析物和標(biāo)記試劑的性質(zhì)來(lái)選擇。在一些實(shí)施方案中，樣品加工可包括將分析物或分析物前體固定到固相支持物上，該固相支持物用或未用標(biāo)記試劑進(jìn)行了標(biāo)記。固定可包括共價(jià)固定以及吸附和其它非共價(jià)固定手段(例如靜電固定)。在一些實(shí)施方案中，固定可促進(jìn)降低樣品復(fù)雜度。在一些實(shí)施方案中，固定可有助于分析物的標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，固定可有助于分析物前體的標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，固定可有助于對(duì)樣品組分中包含某些特性(例如包含或缺少半胱氨酸部分)的級(jí)分進(jìn)行選擇性標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，固定可有助于純化。固定可有助于以上兩項(xiàng)或更多。分離，包括分離樣品混合物在一些實(shí)施方案中，對(duì)被標(biāo)記分析物的樣品或樣品混合物的加工可包括分離?？蓪?duì)標(biāo)記和/或未標(biāo)記的分析物、標(biāo)記和/或未標(biāo)記的分析物前體或者其級(jí)分進(jìn)行一次或多次分離?？蓪?duì)得自固相俘獲的一種或多種級(jí)分和/或分離過(guò)程的其它產(chǎn)物進(jìn)行一次或多次分離。可以對(duì)兩種或更多種前述樣品類(lèi)型進(jìn)行分離，并可在質(zhì)量分析之前進(jìn)行不同類(lèi)型的分離。例如，可以制備包含來(lái)自不同樣品的差異性標(biāo)記分析物的樣品混合物。我們用"差異性標(biāo)記"來(lái)表示每種標(biāo)記包含可鑒定的獨(dú)特特性。本文所述標(biāo)記可包含兩種獨(dú)立的可檢測(cè)特性。特別地，它們可包含非編碼可檢測(cè)標(biāo)記以及在MS/MS(或MSn'分析)中產(chǎn)生獨(dú)特"特征離子"的獨(dú)特報(bào)告物部分。例如，為了分析樣品混合物，可以分離該樣品混合物的組分，并僅對(duì)該樣品混合物的一種級(jí)分進(jìn)行質(zhì)量分析。這樣，可以顯著降低分析的復(fù)雜度，因?yàn)榭梢苑謩e分析分離的分析物的質(zhì)量，從而提高了分析方法的靈敏度。當(dāng)然，可以對(duì)樣品混合物的一種或多種其它級(jí)分重復(fù)進(jìn)行一次或多次分析，從而允許對(duì)樣品混合物的所有級(jí)分進(jìn)行分析，因此允許對(duì)樣品混合物的組分進(jìn)行更完整的分析。如果加入樣品混合物中每種樣品的量已知，則可以使用一定的分離條件來(lái)測(cè)定樣品混合物所包含每種樣品中的每種被標(biāo)記分析物的量，其中在所述條件下經(jīng)差異性標(biāo)記的相同分析物以與其在樣品混合物中的豐度成比例的濃度或量共洗脫。因此，在一些實(shí)施方案中，對(duì)樣品混合物的分離可簡(jiǎn)化分析，同時(shí)仍保持質(zhì)量分析(如MS/MS分析)中所測(cè)定信號(hào)與樣品混合物中差異性標(biāo)記分析物之間的相關(guān)性。在一些實(shí)施方案中，分離可通過(guò)色鐠進(jìn)行。例如，可使用液相色鐠/質(zhì)鐠法(LC/MS)來(lái)實(shí)現(xiàn)樣品分離和質(zhì)量分析。此外，任何適于分離目的分析物的色鐠分離方法均可使用。例如，所述色鐠分離可以是正相色鐠、反相色鐠、離子交換色鐠(即陰離子交換色語(yǔ)或陽(yáng)離子交換色鐠)、體積排阻色鐠或親和色鐠。在分析包含用本文所述同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記試劑標(biāo)記的分析物的樣品混合物時(shí)，電泳分離可能特別有用?？梢允褂玫碾娪痉蛛x技術(shù)的非限制性實(shí)例包括但不僅限于1D電泳分離、2D電泳分離和/或毛細(xì)管電泳分離(參閱Westermeier,R"五/e"n^/^res/s/"iVfl"/ce;爿Wiley-VCHVerlanGmbH,Weinheim,Germany,2005以及M.Khaledi，JohnWileyandSons,Inc.NewYork,1998)。在分離時(shí)或分離后，可以使用非編碼可檢測(cè)標(biāo)記來(lái)定位共洗脫的被標(biāo)記分析物混合物，其中該混合物可包含用不同的同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記的目的分析物，其中每種不同的標(biāo)記表示該分析物來(lái)自哪種樣品。此外，由于可獨(dú)立進(jìn)行檢測(cè)非編碼可檢測(cè)標(biāo)記，因此在一些實(shí)施方案中，可以測(cè)定被標(biāo)記分析物的相對(duì)量，并將此信息用于慎重選擇某些共遷移的被標(biāo)記分析物(基于某些標(biāo)準(zhǔn))用于進(jìn)一步的質(zhì)鐠分析，從而不需要分析電泳分離中所存在的所有可能的被標(biāo)記分析物。例如，就某些分析物而言，電泳過(guò)程可產(chǎn)生包含一定量的各種同量異位標(biāo)記分析物的混合物，其中所述同量異位標(biāo)記的分析物與該被標(biāo)記分析物在樣品混合物中的量成比例。此外，從對(duì)該樣品混合物如何制備的了解(樣品的部分與其它任選組分(例如加入樣品混合物中的校正標(biāo)準(zhǔn)品))中有可能反過(guò)來(lái)將樣品混合物中被標(biāo)記分析物的量與該被標(biāo)記分析物在其來(lái)源樣品中的量相關(guān)聯(lián)。基于觀察到的相對(duì)量，有可能僅選擇符合某些所關(guān)注標(biāo)準(zhǔn)(例如相對(duì)強(qiáng)度的差異大于10o/。)的被標(biāo)記分析物用于進(jìn)一步分析。例如，還可在質(zhì)鐠儀中對(duì)某些分離的共遷移分析物進(jìn)行分析，包括提供定量信息的分析。分析物的相對(duì)和絕對(duì)定量:在一些實(shí)施方案中，有可能對(duì)樣品混合物中被差異性標(biāo)記的相同分析物進(jìn)行相對(duì)定量。例如，有可能通過(guò)比較質(zhì)量分析(例如對(duì)第一質(zhì)量分析中觀察到的選定被標(biāo)記分析物進(jìn)行的第二質(zhì)量分析)中測(cè)定的報(bào)告物離子(即特征離子)的相對(duì)量(例如所報(bào)告的峰面積和/或高度)來(lái)對(duì)被差異性標(biāo)記的相同分析物進(jìn)行相對(duì)定量。換言之，當(dāng)每種報(bào)告物離子能與用于產(chǎn)生樣品混合物的每種特定樣品的信息相關(guān)聯(lián)時(shí)，則該報(bào)告物離子相對(duì)于質(zhì)量分析中所觀察到的其它報(bào)告物離子的相對(duì)量就是該分析物在樣品混合物中的相對(duì)量。當(dāng)組成樣品混合物的組分已知(例如組成樣品混合物的每種樣品的量已知)時(shí)，則可以基于對(duì)具有選定質(zhì)荷比的被標(biāo)記分析物觀察到的報(bào)告物離子的相對(duì)量反過(guò)來(lái)計(jì)算該分析物在用于制備該樣品混合物的每種樣品中的相對(duì)量。可以對(duì)第一質(zhì)量分析中觀察到的所有不同的被標(biāo)記分析物重復(fù)這一過(guò)程。這樣，可以測(cè)定用于產(chǎn)生樣品混合物的每種不同樣品中每種反應(yīng)性分析物的相對(duì)量(常以濃度和/或量表示)。在另一些實(shí)施方案中，可以確定分析物的絕對(duì)量。就這些實(shí)施方案而言，可以向樣品混合物中加入已知量的一種或多種差異性標(biāo)記分析物(校正標(biāo)準(zhǔn)品)，或者可將才艮告物離子的強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)聯(lián)。校正標(biāo)準(zhǔn)品可以是由用于標(biāo)記樣品混合物中分析物的所述標(biāo)記組中的同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記進(jìn)行了標(biāo)記的預(yù)期分析物，M是該校正標(biāo)準(zhǔn)品的報(bào)告物部分與形成該樣品混合物任何樣品相比都是獨(dú)特的。一旦確定了校正標(biāo)準(zhǔn)品的報(bào)告物離子相對(duì)于樣品混合物中差異性標(biāo)記分析物的報(bào)告物離子的相對(duì)量，就有可能參考加入該樣品混合物中的校正標(biāo)準(zhǔn)品的量來(lái)計(jì)算該樣品混合物中所有差異性標(biāo)記分析物的絕對(duì)量(常以濃度和/或量表示)。這樣，還可以基于對(duì)該樣品混合物如何制得的了解來(lái)確定每種差異性標(biāo)記分析物(在該分析物來(lái)源的樣品中存在校正標(biāo)準(zhǔn)品)的絕對(duì)量?；蛘撸梢酝ㄟ^(guò)分析被標(biāo)記分析物的代表性樣品來(lái)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中每種樣品包含不同已知量的所述被標(biāo)記分析物。可以將所分析被標(biāo)記分析物的報(bào)告物離子的峰強(qiáng)度對(duì)已知量的每種被標(biāo)記分析物作圖，從而產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線以后，就可以將未知樣品中報(bào)告物離子的強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而確定測(cè)試樣品中該分析物的量。除上述以外，適當(dāng)時(shí)可以就報(bào)告物部分中任何天然存在或人工產(chǎn)生的同位素豐度對(duì)報(bào)告物離子(特征離子)的強(qiáng)度進(jìn)行校正。有多種方式來(lái)校正報(bào)告物部分的特征離子中雜質(zhì)的同位素豐度。這種校正的一個(gè)實(shí)例可見(jiàn)于已公開(kāi)的共同未決共有美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)No.US2005誦0114042A1，其名稱為"MethodandApparatusForDe國(guó)ConvolutingAConvolutedSpectrum",2004年8月12日提交。基本說(shuō)來(lái)，可以使用數(shù)學(xué)公式和計(jì)算，通過(guò)對(duì)標(biāo)記試劑的重疊同位素簇之巻積鐠進(jìn)行去巻積來(lái)測(cè)定與單個(gè)標(biāo)記試劑中同位素簇相關(guān)的上P艮質(zhì)量(upmass)和下限質(zhì)量(downmass)峰的強(qiáng)度。無(wú)論值是如何測(cè)得的，越準(zhǔn)確地定量每種報(bào)告物離子(即特征離子)的強(qiáng)度，原始樣品中分析物的相對(duì)和絕對(duì)定量就會(huì)越準(zhǔn)確。蛋白質(zhì)組分析本發(fā)明的實(shí)施方案可用于復(fù)雜分析，因?yàn)榭梢允褂觅|(zhì)量分析技術(shù)以快速和重復(fù)的方式將樣品復(fù)合、分析和再分析。例如，可以分析一種或多種樣品中一種或多種分析物的量?？梢苑治鼋M成樣品混合物的樣品和質(zhì)量分析可以快速進(jìn)行，因此這些方法可以重復(fù)多次，使得樣品混合物中許多差異性標(biāo)記分析物的量都可以就其在該分析物的來(lái)源樣品中的相對(duì)和/或絕對(duì)量進(jìn)行測(cè)定。可以使用這種快速多重分析的一項(xiàng)應(yīng)用是蛋白質(zhì)組分析領(lǐng)域。蛋白質(zhì)組學(xué)可以看成是在結(jié)構(gòu)、功能和生物過(guò)程調(diào)節(jié)方面描述基因組序列所編碼信息的實(shí)驗(yàn)性方法。這可通過(guò)對(duì)細(xì)胞或組織所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)組分進(jìn)行系統(tǒng)性分析來(lái)實(shí)現(xiàn)。與本發(fā)明的方法、混合物、試劑盒和/或組合物實(shí)施方案聯(lián)用的質(zhì)鐠法是這種全局蛋白質(zhì)分析的一種可能的工具。因此，可以使用這些標(biāo)記試劑的實(shí)驗(yàn)性分析包括但不僅限于時(shí)程實(shí)驗(yàn)、生物標(biāo)記分析、多重蛋白質(zhì)組分析、多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)實(shí)驗(yàn)(mudpitexperiment)、親和捕獲測(cè)定、翻譯后修飾(PTM)和多重對(duì)照實(shí)驗(yàn)。//.逸合#在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由式I表示的化合物，包括其鹽形式和/或水合物形式其中m和n各為0或1，條件是111+11=1，其中該化合物可在報(bào)告物部分和/或連接物部分中用一種或多種重原子同位素進(jìn)行同位素編碼。如上文的詳細(xì)描述，反應(yīng)基團(tuán)"RG"可包含親核體或親電體，其中所述反應(yīng)基團(tuán)能與樣品中一種或多種反應(yīng)性分析物反應(yīng)，從而形成一種或多種被標(biāo)記分析物。如上文的詳細(xì)描述，報(bào)告物部分"RP"可包含固定電荷或者可在質(zhì)譜儀中離子化，其中所述報(bào)告物部分能在鍵X斷裂后在質(zhì)鐠儀中產(chǎn)生特征離子。如上文的詳細(xì)描述，"DL"可以是非編碼可檢測(cè)標(biāo)記。如上文的詳細(xì)描述，連接物部分"LK"可以是線性或分支的,其中LK將所述反應(yīng)基團(tuán)與所述報(bào)告物部分及所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記連接在一起。如上文的詳細(xì)描述，共價(jià)鍵x將報(bào)告物部分與連接物部分或非編碼可檢測(cè)標(biāo)記連接在一起，其中鍵X可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂。如上文的詳細(xì)描述，Y可以是連接所述反應(yīng)基團(tuán)與所述連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中Y任選地可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂。如上文的詳細(xì)描述，W可以是連接所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記與所述連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中W任選地可通過(guò)施加光、熱和/或化學(xué)試劑而切割和/或可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂。在一些實(shí)施方案中，該化合物任選地通過(guò)可切割連接物與固相支持物連接。在一些實(shí)施方案中，該化合物通過(guò)報(bào)告物部分與固相支持物連接。式I的標(biāo)記試劑的某些斷裂特性示于圖2a。例如，該組合物可以是式II或III所表示的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage60</formula>其中RG是反應(yīng)基團(tuán)，其中該化合物可經(jīng)同位素編碼(參見(jiàn)圖8a)。式I、II或III的組成物可用于標(biāo)記分析物，以在本文詳細(xì)討論的利用電泳分離技術(shù)與質(zhì)鐠法(如串聯(lián)質(zhì)鐠法)聯(lián)用的方法中對(duì)其進(jìn)行分析。式II和III的標(biāo)記試劑的要素和某些斷裂特性示于圖2b。該組合物可包含同位素富集(即編碼)的報(bào)告物部分和/或同位素富集的連接物部分。例如，報(bào)告物部分和/或連接物部分可以各自經(jīng)過(guò)同位素富集以包含一種或多種重原子同位素。在一些實(shí)施方案中，報(bào)告物部分和/或連接物部分可以各自經(jīng)過(guò)同位素富集以包含兩種或更多種重原子同位素。在一些實(shí)施方案中，報(bào)告物部分和/或連接物部分可以各自經(jīng)過(guò)同位素富集以包含三種或更多種重原子同位素。在一些實(shí)施方案中，報(bào)告物部分和/或連接物部分可以各自經(jīng)過(guò)同位素富集以包含四種或更多種重原子同位素。在一些實(shí)施方案中，報(bào)告物部分可以與支持物可切割連接。我們用"可切割連接"來(lái)表示可以基于所選擇可切割連接物的性質(zhì)，通過(guò)用適當(dāng)?shù)囊蛩?例如光、熱和/或化學(xué)試劑)進(jìn)行處理來(lái)從支持物上釋放該報(bào)告物部分以及與其共價(jià)連接的任何部分。多種包含可切割連接物的支持物為本領(lǐng)域所熟知。例如，包含三苯曱基部分的多種支持物是市售的，或者也可以制得(例如三苯甲基氯支持物(Trityl-Cl)或2-氯三苯曱基氯支持物)。參考圖6，展示了與支持物結(jié)合的標(biāo)記試劑的實(shí)施方案，其中該標(biāo)記試劑的報(bào)告物部分包含雙-N-烷基化哌溱環(huán)，其中該N-烷基化膝漆環(huán)的取代基之一是以官能團(tuán)Q結(jié)尾的烷基，其中Q是可以在用酸處理該支持物后釋放以產(chǎn)生被標(biāo)記分析物的官能團(tuán)。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含由式r表示的標(biāo)記試劑組合物，包括其鹽形式和/或水合物形式其中m和n各為0或1，條件是111+11=1，其中該化合物可在報(bào)告物部分和/或連接物部分中用一種或多種重原子同位素進(jìn)行同位素編碼。如上文的詳細(xì)描述，反應(yīng)基團(tuán)"RG"可包含親核體或親電體，其中所述反應(yīng)基團(tuán)能與樣品中一種或多種反應(yīng)性分析物反應(yīng)，從而形成一種或多種<formula>formulaseeoriginaldocumentpage62</formula>被標(biāo)記分析物。如上文的詳細(xì)描述，報(bào)告物部分"RP"可包含固定電荷或者可在質(zhì)鐠儀中離子化，其中所述報(bào)告物部分能在鍵X斷裂后在質(zhì)鐠儀中產(chǎn)生特征離子。如上文的詳細(xì)描述，"DL"可以是非編碼可檢測(cè)標(biāo)記。如上文的詳細(xì)描述，連接物部分"LK"可以是線性或分支的，其中LK將所述反應(yīng)基團(tuán)與所述報(bào)告物部分及所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記連接在一起(參見(jiàn)圖la和lb)。如上文的詳細(xì)描述，共價(jià)鍵X將報(bào)告物部分與連接物部分或與非編碼可檢測(cè)標(biāo)記連接在一起，其中鍵X可通過(guò)在質(zhì)譜儀中施加解離能而斷裂。如上文的詳細(xì)描述，Y可以是連接所述反應(yīng)基團(tuán)與連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中Y任選地可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂。如上文的詳細(xì)描述，W可以是連接所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記與所述連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中W任選地可通過(guò)施加光、熱和/或化學(xué)試劑而切割和/或可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂。如上文的詳細(xì)描述，SS是通過(guò)可切割連接物與該組合物的報(bào)告物部分共價(jià)連接的固相支持物。式r的標(biāo)記試劑的某些斷裂特'性示于圖2a。例如，該組合物可以是由式ir或nr表示的化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage63</formula>其中RG是反應(yīng)基團(tuán)，SS是固相支持物，CL是可切割連接物，其中該化合物可在報(bào)告物部分和/或連接物部分中用一種或多種重原子同位素進(jìn)行同位素編碼。式ir和nrs的標(biāo)記試劑的要素和某些斷裂特性示于圖2c。在一些實(shí)施方案中，上述式i、n、in、r、ir或nrs的化合物的基團(tuán)RG可以是羧酸、磺酸、羧酰卣化物、磺酰卣化物、活性酯、混合酸酐、異氰酸鹽/酯或異硫氰酸鹽/酯基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，基團(tuán)RG可以是馬來(lái)酰亞胺基、烷基卣化物基團(tuán)、a-卣代酰基、a-卣代硫酮基或a-卣代亞胺基。在一些實(shí)施方案中，基團(tuán)RG可以是三苯曱基卣化物或甲硅烷基卣化物。在一些實(shí)施方案中，基團(tuán)RG可以是氨基、羥基或硫醇基。如上述，上文所述組合物可以鹽形式和/或水合物形式存在。該組合物是否以鹽形式存在通常取決于取代基的性質(zhì)和數(shù)目以及其存在和/或進(jìn)行分離的條件。人們熟知，可以通過(guò)用酸處理使堿性基團(tuán)(如胺)質(zhì)子化，從而形成該胺的鹽。例如，含有標(biāo)記試劑的哌溱可作為單TFA鹽、單HC1鹽、二TFA鹽或二HC1鹽得到(參閱如美國(guó)專(zhuān)利公布號(hào)US2005-0148771Al)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員十分了解如何使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)和本文的公開(kāi)內(nèi)容對(duì)本文所述組合物鹽形式的任何平衡離子的電荷態(tài)和性質(zhì)進(jìn)行操作。組合物是否以水合物形式存在還將取決于其存在或進(jìn)行分離的條件。水合物只是包含一個(gè)或多個(gè)絡(luò)合的水分子。本發(fā)明涵蓋任何可能的水合物形式。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及用本文公開(kāi)的標(biāo)記試劑組合物進(jìn)行標(biāo)記的分析物。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由式lA表示的被標(biāo)記分析物組合物，包括其鹽形式和/或水合物形式其中m和n各為O或l,^ff是m+n-l，其中RP、X、W和DL如上文式I的組合物所述，其中該化合物可在報(bào)告物部分和/或連接物部分中用一種或多種重原子同位素進(jìn)行同位素編碼。如上文的詳細(xì)描述，連接物部分"LK"可以是線性或分支的，其中LK將所述分析物與所述報(bào)告物部分和所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記兩者(直接或間接)連接在一起。如上文的詳細(xì)描述，Y可以是連接所述分析物與所述連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中Y任選地可在質(zhì)鐠儀中通過(guò)施加解離能而斷裂。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及由式rA表示的與支持物結(jié)合的被標(biāo)記分析物組合物，包括其鹽形式和/或水合物形式其中m和n各為0或l，^ff是m+n-l，其中SS、RP、X、W和DL如上文式r的組合物所述，其中該化合物可在報(bào)告物部分和/或連接物部分中用一種或多種重原子同位素進(jìn)行同位素編碼。如上文的詳細(xì)描述，連接物部分"LK"可以是線性或分支的，其中LK將所述分析物與所述報(bào)告物部分和所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記兩者(直接或間接)連接在分析物一起。如上文的詳細(xì)描述，Y可以是連接所述分析物與所述連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中Y任選地可在質(zhì)語(yǔ)儀中通過(guò)施加解離能而斷裂。與支持物結(jié)合的分析物rA的某些斷裂特性示于圖3a。例如，與支持物結(jié)合的被標(biāo)記分析物可由式ir"或nrA表示，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage65</formula>其中ss是固相支持物，cl是可切割連接物。被標(biāo)記分析物irA和nrA的要素和某些斷裂特性示于圖3c。分析物已在本文中有所描述。在一些實(shí)施方案中，被標(biāo)記分析物可以是經(jīng)標(biāo)記的校正標(biāo)準(zhǔn)品。如本文所述，可以以已知量向混合物中加入校正標(biāo)準(zhǔn)品，有助于對(duì)目的分析物進(jìn)行絕對(duì)定量分析。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及為作為校正標(biāo)準(zhǔn)品而用上述標(biāo)記試劑組合物進(jìn)行了標(biāo)記的目的分析物，例如肽、蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、類(lèi)固醇、脂質(zhì)、氨基酸、維生素或前列腺素。因此，所述經(jīng)標(biāo)記的校正標(biāo)準(zhǔn)品可以是用本文所述標(biāo)記試劑標(biāo)記的任何分析物。通常，標(biāo)記試劑選自一組同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記試劑，使其與用于標(biāo)記一種或多種目的測(cè)試樣品的標(biāo)記試劑相比包含獨(dú)特的報(bào)告物部分，其中以對(duì)所述測(cè)試樣品中所述分析物的定量為目的。///.標(biāo)記々為、浙辨才法根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，可以用上文所述標(biāo)記試劑來(lái)標(biāo)記分析物，隨后進(jìn)行測(cè)定。可以通過(guò)質(zhì)量分析測(cè)定被標(biāo)記分析物、分析物本身、分析物的一個(gè)或多個(gè)片段和/或標(biāo)記的片段。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用于分析同一樣品中的不同分析物，以及用于對(duì)兩種或更多種不同樣品中相同和/或不同的分析物進(jìn)行多重分析?？梢曰旌蟽煞N或更多種不同樣品以形成樣品混合物。在多重分析中，可以使用標(biāo)記試劑來(lái)確定分析物來(lái)源于樣品混合物中的哪種樣品?？梢詼y(cè)定該分析物在合并形成樣品混合物的所述兩種或更多種樣品的每種中的絕對(duì)和/或相對(duì)(相對(duì)于不同樣品中的同一分析物)量(常以濃度或量表示)。此外，可以使用分析物片段(例如子片段離子)的質(zhì)量分析來(lái)鑒定該分析物和/或該分析物的前體，例如在該分析物由前體分子降解而成的情況下。該分析中使用的樣品可以是包含可用標(biāo)記試劑的多種同位素編碼形式進(jìn)行標(biāo)記的分析物的任何樣品。例如，樣品可以是粗制或經(jīng)處理的細(xì)胞裂解物、體液、組織提取物或細(xì)胞提取物。在一些實(shí)施方案中，可以在標(biāo)記之前處理樣品，以制備用于標(biāo)記反應(yīng)的分析物或其它樣品組分。樣品可以是分離過(guò)程的一個(gè)級(jí)分。樣品中的分析物可以是可用標(biāo)記試劑進(jìn)行標(biāo)記的任何分析物。例如，分析物可以是肽、蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、類(lèi)固醇、氨基酸、維生素、前列腺素或分子量小于1500道爾頓(Da)的其它小分子。其它可能的分析物類(lèi)型已在本文中公開(kāi)。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及包括以下步驟的方法使兩種或更多種樣品(每種樣品包含一種或更多種反應(yīng)性分析物)與標(biāo)記試劑組中的不同標(biāo)記試劑反應(yīng)，從而產(chǎn)生兩種或更多種差異性標(biāo)記樣品，所述樣品每個(gè)包含一種或多種被標(biāo)記分析物。所述標(biāo)記試劑可選自一組同位素編碼的同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記試劑，其中不同的標(biāo)記試劑各包含具有獨(dú)特質(zhì)量的報(bào)告物部分。所述報(bào)告物部分可以是具有本文所述特性的任何報(bào)告物部分。例如，所述報(bào)告物部分可包含取代或未取代的哌啶、哌溱或嗎啉基團(tuán)。其它報(bào)告物部分的實(shí)例也已在上文描述。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使兩種或更多種樣品(每種樣品包含一種或多種反應(yīng)性分析物)與一組同位素富集的同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記試劑的不同標(biāo)記試劑反應(yīng)，從而形成兩種或更多種差異性標(biāo)記樣品，所述樣品各包含一種或多種被標(biāo)記分析物，其中該組中的不同標(biāo)記試劑由式I表示，包括其鹽形式和/或水合物形式其中m和n各為0或l，^ff是m+n-l。才艮據(jù)該方法，RG(如上文的詳細(xì)描述)是包含親核體或親電體的反應(yīng)基團(tuán)，所述反應(yīng)基團(tuán)能與樣品中一種或多種反應(yīng)性分析物反應(yīng)，從而形成一種或多種被標(biāo)記分析物。報(bào)告物部分RP(如上文的詳細(xì)描述)包含固定電荷或者可在質(zhì)鐠儀中離子化，其中所述報(bào)告物部分能在鍵X斷裂后在質(zhì)鐠儀中產(chǎn)生特征離子，并且其中每種報(bào)告物部分及其相應(yīng)特征離子的粗略質(zhì)量對(duì)于該組中的每種標(biāo)記試劑而言是不同的。對(duì)于該組中的每種試劑而言，非編碼可檢測(cè)標(biāo)記"DL"(如上文的詳細(xì)描述)是不同的可獨(dú)立檢測(cè)的非編碼可檢測(cè)標(biāo)記，其中每種非編碼可檢測(cè)標(biāo)記與該組中其它標(biāo)記試劑的非編碼可檢測(cè)標(biāo)記具有相同的粗略質(zhì)量和凈電荷。連接物部分"LK，，(如上文的詳細(xì)描述)可以是線性或分支的，其中LK將所述反應(yīng)基團(tuán)與所述報(bào)告物部分和所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記都(直接或間接)連接在一起，其中該組中每種不同試劑的連接物部分的質(zhì)量補(bǔ)償針對(duì)該組中不同標(biāo)記試劑在報(bào)告物部分之間的粗略質(zhì)量差異，從而對(duì)于該組中的每種標(biāo)記試劑而言，所述報(bào)告物部分與所述連接物部分的合計(jì)粗略質(zhì)量都是相同的。所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記連接在一起，其中鍵X可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂。Y(如上文的詳細(xì)描述)是連接所述反應(yīng)基團(tuán)與所述連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中Y任選地可通過(guò)在質(zhì)譜儀中施加解離能而斷裂，M是如果Y是連接基團(tuán)則其粗略質(zhì)量對(duì)于該組中的每種標(biāo)記試劑而言都相同。W(如上文的詳細(xì)描述)是連接所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記與所述連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中w任選地可通過(guò)施加光、熱和/或化學(xué)試劑而切割和/或可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂，a是如果w是連接基團(tuán)則其粗略質(zhì)量對(duì)于該組中的每種標(biāo)記試劑而言都相同。在一些實(shí)施方案中，用式II或III的標(biāo)記試劑標(biāo)記每種差異性標(biāo)記樣品，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage68</formula>其中RG是反應(yīng)基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，化合物II和III可以如圖8a所示進(jìn)行同位素編碼。所述標(biāo)記方法可產(chǎn)生兩種或更多種差異性標(biāo)記樣品，每種樣品包含一種或多種被標(biāo)記分析物。一旦利用對(duì)于該樣品而言獨(dú)特的標(biāo)記試劑將每種樣品中的分析物進(jìn)行標(biāo)記，則可將兩種或更多種差異性標(biāo)記樣品或其部分混合而形成樣品混合物。所述樣品混合物可任選地包含一種或多種上述的校正標(biāo)準(zhǔn)品。可記錄組合以形成樣品混合物的被標(biāo)記分析物的每種樣品的體積和/或量。相對(duì)于樣品混合物的總樣品體積和/或量而言，每種樣品的體積和/或量可用來(lái)測(cè)定來(lái)自樣品混合物分析的每種樣品中所鑒定分析物的量(常以濃度和/或量來(lái)表示)。因此，樣品混合物可包含復(fù)雜的混合物，其中通過(guò)對(duì)兩種或更多種樣品中的每種中的分析物的量進(jìn)行相對(duì)定量，或者通過(guò)絕對(duì)定量(其中還將校正標(biāo)準(zhǔn)品加入樣品混合物中)或在可獲得特征離子的校正曲線的情況下的絕對(duì)定量，可將相同和/或不同分析物的相對(duì)量進(jìn)行鑒定和/或定量。在一些實(shí)施方案中，該方法還可包括通過(guò)電泳分離所述樣品混合物或其部分。例如，所述電泳分離可以是1D電泳分離、2D電泳分離和/或毛細(xì)管電泳分離。所述兩種或更多種可檢測(cè)標(biāo)記可以是可獨(dú)立檢測(cè)的。由于標(biāo)記可獨(dú)立檢測(cè)，因此有可能在電泳分離中定位、檢測(cè)和/或定量被標(biāo)記分析物。例如，所述可獨(dú)立檢測(cè)的非編碼可檢測(cè)標(biāo)記可用于在分離中和/或分離后定位1D或2D凝膠中的被標(biāo)記分析物。在一些實(shí)施方案中，所述標(biāo)記可用于在分離后定位凝膠中的被標(biāo)記分析物，從而可將其從凝膠上切下并進(jìn)一步分析，例如通過(guò)下文所述的質(zhì)鐠法進(jìn)行分析。例如，所述方法還可包括從電泳分離中收集共遷移的差異性標(biāo)記分析物的一種或多種子樣品，并在m為0，n為l，W是可通過(guò)施加光、熱或化學(xué)試劑而切割的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)時(shí)，任選地在適當(dāng)條件下處理所述一種或多種子樣品，以從所述子樣品的差異性標(biāo)記分析物上切下非編碼的可檢測(cè)標(biāo)記。一旦從分析物上切下了非編碼的可檢測(cè)標(biāo)記，就可對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分析，例如通過(guò)質(zhì)鐠法進(jìn)行分析，其中如下文所述可以使用報(bào)告物部分的分析來(lái)測(cè)定和/或確認(rèn)與用于形成該樣品混合物的每種樣品相關(guān)的分析物的相對(duì)和/或絕對(duì)量。在一些實(shí)施方案中，可在毛細(xì)管電泳中使用所述非編碼的可檢測(cè)標(biāo)記來(lái)檢測(cè)和/或定量被標(biāo)記分析物，因?yàn)樗鼈兇嬖谟诿?xì)管中。可以基于分析適當(dāng)?shù)臋z測(cè)器中由該非編碼可檢測(cè)標(biāo)記產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行定量。優(yōu)選地(但不必須)，將組中的非編碼可檢測(cè)標(biāo)記選擇成在電泳分離中具有相似的遷移特性(即，它們共遷移)。在一些實(shí)施方案中，可以基于非編碼可檢測(cè)標(biāo)記的可獨(dú)立檢測(cè)的特性，任選地根據(jù)目的條件來(lái)分析共遷移的差異性標(biāo)記分析物，并慎重地選擇滿足條件的用于進(jìn)一步分析，不滿足條件的則棄去。例如，如果共遷移的差異性標(biāo)記分析物滿足目的條件(例如兩種可獨(dú)立檢測(cè)的標(biāo)記的相對(duì)量差異不超過(guò)10%)，則所述共遷移的差異性標(biāo)記分析物可通過(guò)質(zhì)鐠法進(jìn)行后續(xù)的分析和定量，如果不滿足，則將其棄去。這樣，有可能實(shí)現(xiàn)更高效和經(jīng)濟(jì)地使用質(zhì)鐠設(shè)備。在一些實(shí)施方案中，所述方法還可包括使用第一質(zhì)量分析儀對(duì)子樣品之一或其級(jí)分進(jìn)行第一質(zhì)鐠分析。接著可以選擇在第一質(zhì)量分析中具有特定質(zhì)荷比的離子?？蓪?duì)選定的離子施加一定水平的解離能(例如碰撞誘發(fā)解離(CID))，以誘發(fā)斷裂。例如，鍵X的斷裂可從被標(biāo)記分析物上釋放離子化的報(bào)告物部分(即報(bào)告物離子或特征離子)。通過(guò)解離能斷裂選定的離子還可產(chǎn)生該分析物的子片段離子，接著可以分析所述子片段離子，以測(cè)定該分析物和/或該分析物的一種或多種前體。因此，可在第二質(zhì)量分析器中對(duì)所述離子(剩余的選定離子、子片段離子和離子化的報(bào)告物部分(即特征離子))或其級(jí)分進(jìn)行分析。在第二質(zhì)量分析中，可對(duì)選定的離子、特征離子以及子片段離子或其級(jí)分進(jìn)行第二質(zhì)量分析。所述第二質(zhì)量分析可測(cè)定以選定的質(zhì)荷比存在的每種獨(dú)特報(bào)告物離子的粗略質(zhì)量(或m/z)和相對(duì)量，以及該樣品混合物中至少一種被標(biāo)記分析物的子片段離子中一些或全部的質(zhì)量(粗略質(zhì)量和/或絕對(duì)質(zhì)量)。就每種以選定的質(zhì)荷比存在的分析物而言，可以使用子片段離子來(lái)鑒定以選定的質(zhì)荷比存在的分析物。例如，這種分析可以如上文標(biāo)題為"通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助的數(shù)據(jù)庫(kù)分析來(lái)確定分析物，，的章節(jié)中所述進(jìn)行。因此，在一些實(shí)施方案中，該方法還包括在第二質(zhì)量分析中測(cè)定每種特征離子的粗略質(zhì)量和相對(duì)量，以及在第二質(zhì)量分析中測(cè)定一些或全部子片段離子的粗略質(zhì)量和/或絕對(duì)質(zhì)量。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括通過(guò)對(duì)子片段離子的分析來(lái)測(cè)定與選定的質(zhì)荷比相關(guān)的被標(biāo)記分析物(和/或其前體)。在一些實(shí)施方案中，該方法的一個(gè)或多個(gè)步驟可以重復(fù)一次或多次。例如，在一些實(shí)施方案中，可以如前述對(duì)在第一質(zhì)鐠分析中具有選定質(zhì)荷比的離子(不同于任何之前選定的質(zhì)荷比)進(jìn)行解離能處理，從而形成離子化的報(bào)告物部分(即特征離子)和選定離子中至少一些的子片段離子?？梢詫?duì)選定的離子、報(bào)告物離子和/或子片段離子或其級(jí)分進(jìn)行第二質(zhì)量分析。還可以測(cè)定第二質(zhì)量分析中每種獨(dú)特的特征離子的粗略質(zhì)量和相對(duì)量以及子片段離子的質(zhì)量(粗略質(zhì)量或絕對(duì)質(zhì)量)。任選地，可以通過(guò)對(duì)子片段離子的分析來(lái)確定與選定的質(zhì)荷比相關(guān)的被標(biāo)記分析物(或前體分子)。這樣，所述信息可用于鑒定和/或定量來(lái)自第一質(zhì)量分析的一種或多種其它分析物。在一些實(shí)施方案中，在樣品混合物已分級(jí)(例如通過(guò)電泳分離)時(shí)，對(duì)不同的所收集子樣品重復(fù)該方法(或該方法的某些步驟)一次或多次可能是有用的。通過(guò)對(duì)該樣品的一種或多種其它級(jí)分重復(fù)該方法，有可能更完整地分析該樣品混合物。因此，該方法可包括選擇不同的子樣品并對(duì)該子樣品進(jìn)行第一質(zhì)量分析，接著重復(fù)一次或多次前述的后續(xù)步驟。在一些實(shí)施方案中，在樣品混合物已分級(jí)時(shí)，通過(guò)收集來(lái)自電泳分離的共遷移差異性標(biāo)記分析物的一種或多種不同子樣品將該方法重復(fù)一次或多次可能是有用的。通過(guò)重復(fù)該方法以收集一種或多種其它子樣品，有可能更完整地分析該樣品混合物。因此，該方法可包括從電泳分離中收集共遷移的差異性標(biāo)記分析物的一種或多種不同的子樣品，接著將前述后續(xù)步驟重復(fù)一次或多次還考慮到在一些實(shí)施方案中，將整個(gè)方法重復(fù)一次或多次，在每次重復(fù)時(shí)，某些步驟也可以如上述重復(fù)一次或多次。這樣，可以在可能的最大程度上分析和確定樣品混合物的內(nèi)容。在一些實(shí)施方案中，還可以對(duì)一組新的兩種或更多種樣品重復(fù)整個(gè)方法。如前述，在一些實(shí)施方案中，同分異構(gòu)和/或同量異位物標(biāo)記試劑組中的標(biāo)記試劑可與支持物結(jié)合。因此，除了從支持物上重俘獲被標(biāo)記分析物以外，上述方法還可以使用與支持物結(jié)合的試劑來(lái)進(jìn)行。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及實(shí)施任何上述方法，其中該組中每種不同的標(biāo)記試劑都是與支持物結(jié)合的，并通過(guò)可切割連接物與支持物連接，使得每種不同樣品與帶有該組中不同標(biāo)記試劑的支持物反應(yīng)，并且其中該方法在進(jìn)行樣品標(biāo)記的步驟之后和進(jìn)行混合經(jīng)標(biāo)記樣品以制備樣品混合物之前還包括i)任選地清洗每種支持物，以除去每種樣品中不與支持物上所結(jié)合標(biāo)記試劑的反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)的組分；ii)切割所述可切割連接物，以從每種支持物上釋放被標(biāo)記分析物，每種不同標(biāo)記的樣品包含一種或多種被標(biāo)記分析物，其中與特定樣品相關(guān)的被標(biāo)記分析物可通過(guò)與其相連的獨(dú)特質(zhì)量的報(bào)告物部分來(lái)鑒定和/或定量；和m)任選地收集每種樣品的被標(biāo)記分析物，之后根據(jù)步驟(b)將其混合。例如，可以4吏用一組同位素標(biāo)記試劑來(lái)實(shí)施該方法，其中該組中每種不同的標(biāo)記試劑以式r表示，包括其鹽形式和/或水合物形式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage72</formula>其中m和n各為O或l,^ff是m+i^1。根據(jù)該方法RG(如上文的詳細(xì)描述)為包含親核體或親電體的反應(yīng)基團(tuán)，其中所述反應(yīng)基團(tuán)能與樣品中一種或多種反應(yīng)性分析物反應(yīng)，從而形成一種或多種被標(biāo)記分析物。報(bào)告物部分"RP"(如上文的詳細(xì)描述)包含固定電荷或者可在質(zhì)i普儀中離子化，其中所述報(bào)告物部分在質(zhì)脊R中能在鍵X斷裂后產(chǎn)生特征離子，并且其中每種報(bào)告物部分及其相應(yīng)特征離子的粗略質(zhì)量對(duì)于該組中的每種標(biāo)記試劑而言是不同的。非編碼的可檢測(cè)標(biāo)記"DL"(如上文的詳細(xì)描述)是對(duì)該組中的每種標(biāo)記試劑而言不同的可獨(dú)立檢測(cè)的非編碼可檢測(cè)標(biāo)記，其中每種非編碼可檢測(cè)標(biāo)記與該組中其它標(biāo)記試劑的非編碼可檢測(cè)標(biāo)記具有相同的粗略質(zhì)量和相同的凈電荷。連接物部分"LK"(如上文的詳細(xì)描述)可以是線性或分支的，其中LK將所述反應(yīng)基團(tuán)與所述報(bào)告物部分和所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記二者(直接或間接地)連接在一起，其中該組中每種不同試劑的連接物部分的質(zhì)量補(bǔ)償針對(duì)該組中所述不同標(biāo)記試劑在報(bào)告物部分之間的粗略質(zhì)量差異，使得報(bào)告物部分與連接物部分的合計(jì)粗略質(zhì)量對(duì)于該組中的每種標(biāo)記試劑而言都是相同的。共價(jià)鍵X(如上標(biāo)記連接在一起，其中鍵X可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂。Y(如基團(tuán)，其中Y任選地可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂，M是如果Y是連接基團(tuán)則其粗略質(zhì)量對(duì)于該組中每種標(biāo)記試劑而言都是相同的。W(如鍵或連接基團(tuán)，其中W任選地可通過(guò)施加光、熱和/或化學(xué)試劑而切割和/或可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂;M是如果W是連接基團(tuán)則其粗略質(zhì)量對(duì)于該組中每種標(biāo)記試劑而言都是相同的。SS(如上文的詳細(xì)描述)是通過(guò)可切割連接物與標(biāo)記試劑的報(bào)告物部分共價(jià)連接的固相支持物,在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記試劑之一可由式ir或nr表示，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage73</formula>其中RGM應(yīng)基團(tuán)，SS是固相支持物，CL是可切割連接物。在一些實(shí)施方案中，化合物ir或nr可以如圖8b所示進(jìn)行同位素編碼。質(zhì)鐠領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會(huì)理解，上述方法中的第一和第二質(zhì)量分析可在串聯(lián)質(zhì)語(yǔ)儀中進(jìn)行。適于進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)量分析的儀器已在上文描述。盡管串聯(lián)質(zhì)鐠儀是優(yōu)選的，但單級(jí)質(zhì)譜儀也可以使用。例如，可以通過(guò)錐電壓斷裂來(lái)誘發(fā)分析物斷裂，接著使用單級(jí)四極桿或飛行時(shí)間質(zhì)鐠儀對(duì)得到的片段進(jìn)行質(zhì)量分析。在另一個(gè)例子中，可以使用激光源對(duì)分析物施加解離能，接著使用飛行時(shí)間的源后衰變或串聯(lián)飛行時(shí)間(TOF-TOF)質(zhì)譜儀來(lái)記錄得到的片段。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還可包括在對(duì)樣品中的分析物進(jìn)行標(biāo)記之前用至少一種酶消化每種樣品和/或樣品混合物，以部分或全部降解該樣品和/或樣品混合物的組分(還可參見(jiàn)上文標(biāo)題為"樣品處理"的章節(jié))。例如，所述酶可以是蛋白酶(以降解蛋白質(zhì)和/或肽)或核酸酶(以降解核酸)。還可以一起使用兩種或更多種酶，以進(jìn)一步降解樣品組分。例如，所述酶可以是蛋白水解酶例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、ArgC、LysC、V8蛋白酶、AspN、鏈霉蛋白酶、糜蛋白酶或羧肽酶(例如A、B、C等)。在一些實(shí)施方案中，該方法還可包括在進(jìn)行第一質(zhì)量分析之前通過(guò)應(yīng)用除電泳以外的其它分離方法來(lái)分離樣品混合物(還可參閱上文標(biāo)題為"分離，包括分離樣品混合物，，的章節(jié))。例如，可以使用液相色鐠/質(zhì)鐠(LC/MS)在質(zhì)量分析之前實(shí)現(xiàn)這樣的樣品分離。在一些實(shí)施方案中，所述方法可以與消化和額外的分離步驟一起實(shí)施。雖然這些步驟是任選的，但可將它們一起實(shí)施，例如，當(dāng)進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析從而測(cè)定細(xì)胞中蛋白質(zhì)的上調(diào)和下調(diào)時(shí)。在一些實(shí)施方案中，可將方法的各步驟(無(wú)論有或沒(méi)有消化和/或額外的分離步驟)重復(fù)一次或多次，從而鑒定和/或定量樣品中的一種或多種其它的分析物或者兩種或更多種樣品(包括利用與支持物結(jié)合的標(biāo)記試劑標(biāo)記的樣品)中的每種樣品中的一種或多種分析物。根據(jù)樣品混合物中是否存在校正標(biāo)準(zhǔn)品或者是否可獲得特征離子的校正曲線，特定分析物的定量可以相對(duì)于其它的被標(biāo)記分析物，或者特定分析物的定量可以是絕對(duì)的。如前所述，可通it^"子片段離子的質(zhì)量(粗略質(zhì)量或絕對(duì)質(zhì)量)的分析而測(cè)定與所選離子相關(guān)的分析物。一種這樣的方法描述于標(biāo)題為"通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助數(shù)據(jù)庫(kù)分析進(jìn)行的分析物測(cè)定，，的部分中。一旦已對(duì)分析物進(jìn)行了測(cè)定，則關(guān)于第二質(zhì)量分析中每種獨(dú)特報(bào)告物離子的粗略質(zhì)量和相對(duì)量的信息以及子片段離子質(zhì)量的信息可為確定有關(guān)樣品混合物的其它信息提供^。特征離子(報(bào)告物離子)的相對(duì)量可通過(guò)質(zhì)鐠中的峰強(qiáng)度來(lái)測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)分析使用質(zhì)鐠儀得到的報(bào)告物離子(特征離子)峰高或峰寬(或峰面積)來(lái)測(cè)定每種獨(dú)特特征離子的量。由于每種樣品可以使用不同的標(biāo)記試劑來(lái)標(biāo)記，并且每種標(biāo)記試劑可包含產(chǎn)生獨(dú)特的特征離子的獨(dú)特的報(bào)告物部分，所述獨(dú)特的特征離子可與用于制備該樣品混合物的特定的差異性標(biāo)記樣品相關(guān)聯(lián)，因此在第二質(zhì)量分析中對(duì)不同報(bào)告物離子的測(cè)定可用于鑒定所選分析物的特征離子所來(lái)源的差異性標(biāo)記樣品。當(dāng)發(fā)現(xiàn)多種特征離子時(shí)(例如根據(jù)本發(fā)明的多重方法)，可以相對(duì)于其它特征離子來(lái)測(cè)定每種獨(dú)特特征離子的相對(duì)量。由于第二質(zhì)量分析中測(cè)定的每種獨(dú)特特征離子的相對(duì)量可與樣品混合物中分析物的相對(duì)量相關(guān)，因此可以測(cè)定合并成該樣品混合物的每種差異性標(biāo)記樣品中分析物的相對(duì)量(常以濃度和/或量表示)。此外，當(dāng)所測(cè)定的分析物是來(lái)自另一種目的化合物的副產(chǎn)物時(shí)(例如，分析物是降解反應(yīng)的副產(chǎn)物，例如分析物是蛋白質(zhì)消化產(chǎn)生的肽)，有可能將分析物的定量信息與原始的差異性標(biāo)記樣品相關(guān)聯(lián)。如上所述，可針對(duì)具有不同質(zhì)荷比的所選離子重復(fù)該分析一次或多次，從而獲得組合而形成樣品混合物的每種樣品中的一種或多種其它被測(cè)分析物的相對(duì)量。此外，根據(jù)需要，可對(duì)與每種獨(dú)特特征離子相關(guān)的峰強(qiáng)度進(jìn)行天然或人工產(chǎn)生的同位素豐度的校正，如前面在標(biāo)題為"分析物的相對(duì)和絕對(duì)定量"的部分中所述的。例如，分析物可以是樣品或樣品混合物中的肽。對(duì)樣品或樣品混合物中肽的分析可用來(lái)測(cè)定樣品或樣品混合物中可鑒定蛋白質(zhì)的量(常表示為濃度和/或量)，其中一種或多種樣品中的蛋白質(zhì)可在第一質(zhì)量分析之前被降解，并且其中樣品中蛋白質(zhì)的量是基于兩種或更多種差異性標(biāo)記樣品(其混合而形成所述樣品混合物)之每種中的一種或多種肽的身份和相對(duì)量而測(cè)定的。此夕卜，可為了測(cè)定的目的而將來(lái)自不同樣品的信息進(jìn)行比較，比如為比較與不同濃度的基質(zhì)(其可影響細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和/或死亡)一起孵育對(duì)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的量的作用。其它非限定性的實(shí)例可包括對(duì)患病或健康組織或細(xì)胞培養(yǎng)物中所表達(dá)的蛋白質(zhì)成分的比較。這可涵蓋在傳染性物質(zhì)(比如細(xì)菌或病毒或其它疾病狀態(tài)比如癌癥)感染后對(duì)細(xì)胞、組織或生物流體中所表達(dá)的蛋白質(zhì)水平的比較。在另一些實(shí)例中，可進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度隨時(shí)間變化(時(shí)間-過(guò)程)的研究以檢驗(yàn)藥物治療對(duì)細(xì)胞或組織中所表達(dá)蛋白質(zhì)成分的作用。在另一些實(shí)例中，來(lái)自隨時(shí)間不同所取的不同樣品的信息可用于檢查或監(jiān)測(cè)作為疾病(例如癌癥)或感染之結(jié)果的特定蛋白質(zhì)在組織、器官或生物流體中的濃度。這些實(shí)驗(yàn)可包括一個(gè)或多個(gè)對(duì)照樣品。在一些實(shí)施方案中，所述實(shí)驗(yàn)可用于測(cè)定兩個(gè)或更多個(gè)上述所關(guān)注的性質(zhì)。在已向樣品混合物中加入已知量(常表示為濃度和/或量)的校正標(biāo)準(zhǔn)品(包含與具有所選質(zhì)荷比的分析物相連的獨(dú)特報(bào)告物部分)用于所測(cè)分析物的情況下，可利用所述與校正標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)的獨(dú)特特征離子的量來(lái)測(cè)定每種樣品(其組合而形成樣品混合物)中分析物的絕對(duì)量(常表示為濃度和/或量)。這是可能的，因?yàn)榕c樣品混合物中校正標(biāo)準(zhǔn)品的獨(dú)特特征離子相關(guān)的分析物的量是已知的，并且對(duì)于與所選離子相關(guān)的被標(biāo)記分析物而言，相對(duì)于所述校正標(biāo)準(zhǔn)品的特征離子的強(qiáng)度，可以測(cè)定所有獨(dú)特特征離子的相對(duì)量。因?yàn)閷?duì)于每種獨(dú)特的才艮告物部分(包括所述校正標(biāo)準(zhǔn)品的報(bào)告物部分)而言，所測(cè)的每種獨(dú)特特征離子的相對(duì)量與和每種差異性標(biāo)記樣品(其組合而形成樣品混合物)相關(guān)的分析物的量成比例，參考基于一定比例(參考用于制備產(chǎn)品混合物的配方而計(jì)算的)的獨(dú)特質(zhì)量的每種不同的特征離子的量，可確定每種樣品中分析物的絕對(duì)量(常表示為濃度和/或量)。根據(jù)需要，可對(duì)與每種獨(dú)特的特征離子相關(guān)的峰強(qiáng)度針對(duì)天然或人工產(chǎn)生的同位素豐度進(jìn)行校正。這樣的分析方法尤其可用于具有復(fù)雜性質(zhì)的多重樣品的蛋白質(zhì)組分析，特別是在第一質(zhì)量分析之前進(jìn)M標(biāo)記分析物預(yù)分離(例如液相色鐠分離或電泳分離)的情況下。例如，如果樣品混合物包含100fmol/mL的校正標(biāo)準(zhǔn)品，并且與所述校正標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)的獨(dú)特的特征離子的相對(duì)強(qiáng)度是1，而與第一樣品相關(guān)的第一其它獨(dú)特特征離子的相對(duì)強(qiáng)度是二分之一并且與第二樣品相關(guān)的第二其它獨(dú)特特征離子的相對(duì)強(qiáng)JLA2，則所述第一差異性標(biāo)記樣品(其混合而形成樣品混合物)中分析物的量(假定等量的樣品1和樣品2混合而形成所述樣品混合物)是50fmol/mL(0.5x100fmol/mL)，所述第二差異性標(biāo)記樣品(其混合而形成樣品混合物)中分析物的量是200fmol/mL(2x100fmol/mL)。另夕卜，如果例如所述分析物是與特定蛋白質(zhì)相關(guān)的肽，那么可推出樣品l中蛋白質(zhì)的量是50fmol/ml，樣品2中蛋白質(zhì)的量是200fmol/ml。因此，校正標(biāo)準(zhǔn)品的存在使得可進(jìn)行每種差異性標(biāo)記樣品(其混合而形成樣品混合物)中被標(biāo)記分析物(以及在某些情況下其前體)的絕對(duì)定量。由于所述分析物可以是前體分子，因此在一些實(shí)施方案中，所述分析物可以是肽，可以基于混合形成該樣品混合物的兩種或更多種差異性標(biāo)記樣品之每種中一種或多種肽的身份和絕對(duì)量來(lái)測(cè)定混合形成該樣品混合物的兩種或更多種差異性標(biāo)記樣品之每種中一種或多種蛋白質(zhì)的身份和絕對(duì)量。如前所述，可針對(duì)具有不同質(zhì)荷比的所選離子重復(fù)該分析一次或多次，從而獲得每種樣品(其組合而形成樣品混合物)中一種或多種其它被測(cè)分析物的絕對(duì)量。此外，需要時(shí)，可如前述對(duì)與每種獨(dú)特報(bào)告物離子相關(guān)的峰強(qiáng)度針對(duì)天然或人工產(chǎn)生的同位素豐度進(jìn)行校正。在一些實(shí)施方案中，可以使用與支持物結(jié)合的標(biāo)記試劑來(lái)實(shí)施本文所述的方法，其中該組中每種不同的標(biāo)記試劑都是與支持物結(jié)合的，并通過(guò)可切割連接物與支持物連接，使得每種不同樣品與帶有該組中不同標(biāo)記試劑的支持物反應(yīng)。示例性支持物已在上文標(biāo)題為"組合物"的章節(jié)中討論(還可參見(jiàn)圖6)。根據(jù)該方法，可以任選地在使分析物與支持物上結(jié)合的標(biāo)記試劑反應(yīng)之后而在混合樣品之前清洗所述支持物，以除去不與經(jīng)標(biāo)記試劑的反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)的組分。一旦使分析物與標(biāo)記試劑反應(yīng)以形成被標(biāo)記分析物并任選地進(jìn)行了清洗步驟之后，可以通過(guò)在切割可切割連接物的條件下處理支持物i(U^支持物上釋放被標(biāo)記分析物。切割后，可以任選地收集兩種或更多種差異性標(biāo)記樣品，每種樣品包含一種或多種被標(biāo)記分析物，其中與特定樣品相關(guān)的被標(biāo)記分析物可通過(guò)與其相連的獨(dú)特報(bào)告物部分來(lái)鑒定和/或定量。無(wú)論是否單獨(dú)收集，都可以混合切割產(chǎn)物以形成樣品混合物。IV.混合物在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及混合物(即樣品混合物)。例如，所述混合物可包含含有同位素編碼的同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記物的被標(biāo)記分析物。被標(biāo)記分析物的示例性混合物及其制備方法和/或分析方法已經(jīng)在上述標(biāo)題為"用于標(biāo)記和分析的方法"的部分中進(jìn)行了描述。可通過(guò)將兩種或更多種標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物的全部或部分混合而形成混合物，其中利用標(biāo)記試劑組中的不同標(biāo)記試劑#^種樣品進(jìn)行標(biāo)記，其中每種標(biāo)記試劑包含具有獨(dú)特(大致)質(zhì)量的l艮告物部分以及非編碼的可檢測(cè)標(biāo)記物。可以由兩種或更多種被標(biāo)記分析物中的每種所得自(即來(lái)源)的標(biāo)記Jl應(yīng)鑒定所述每種不同標(biāo)記試劑的獨(dú)特的報(bào)告物部分。非編碼的可檢測(cè)標(biāo)記物可用來(lái)在電泳分離期間定位被標(biāo)記分析物。與這些方法相關(guān)的標(biāo)記試劑和被標(biāo)記分析物的性質(zhì)已在前面論述過(guò)?；旌衔锏囊环N或多種分析物可以是肽?；旌衔锏囊环N或多種分析物可以是蛋白質(zhì)?；旌衔锏囊环N或多種分析物可以是肽和蛋白質(zhì)?；旌衔锏囊环N或多種分析物可以;l核酸分子?；旌衔锏囊环N或多種分析物可以;l碳水化合物。混合物的一種或多種分析物可以AJI旨質(zhì)?；旌衔锏囊环N或多種分析物可以^ja固醇。混合物的一種或多種分析物可以是維生素?；旌衔锏囊环N或多種分析物可以是前列腺素?；旌衔锏囊环N或多種分析物可以是氨基酸?；旌衔锏囊环N或多種分析物可以是質(zhì)量小于1500道爾頓的小分子。在一些情況下，分析物可以是多種分析物類(lèi)型的混合物。例如，混合物中的分析物包括脂質(zhì)和膽固醇；或者2)蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、脂質(zhì)、膽固醇和碳7JC化合物。混合物可包含利用本文中所公開(kāi)的新型標(biāo)記試劑標(biāo)記的任何類(lèi)型的差異性標(biāo)記分析物，包括含有兩種或更多種不同分析物類(lèi)型的混合物。例如，所述混合物可包含至少兩種差異性標(biāo)記分析物，其中所述混合物通過(guò)將至少兩種不同樣品的標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物混合在一起而形成，每種樣品使用來(lái)自一組同位素編碼的同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記試劑的不同標(biāo)記試劑進(jìn)行標(biāo)記，其中該混合物中每種差異性標(biāo)記分析物由式iA表示，包括其鹽形式和/或水合物形式其中m和n各為0或l，條件是111+11=1。報(bào)告物部分"RP"(如上文的詳細(xì)描述)包含固定電荷或者可在質(zhì)鐠儀中離子化，其中所述凈艮告物部分能在質(zhì)鐠儀中在鍵X斷裂后產(chǎn)生特征離子，并且其中每種報(bào)告物部分及其相應(yīng)特征離子的粗略質(zhì)量對(duì)于每種不同樣品而言是不同的，這取決于使用該組中哪種標(biāo)記試劑來(lái)標(biāo)記^f羊品。非編碼的可檢測(cè)標(biāo)記"DL"(如上文的詳細(xì)描述)對(duì)該組中的每種不同標(biāo)記試劑而言是不同的，其中每種不同非編碼可檢測(cè)標(biāo)記與該組中其它標(biāo)記試劑的其它非編碼可檢測(cè)標(biāo)記具有相同的粗略質(zhì)量和相同的凈電荷。連接物部分"LK"(如上文的詳細(xì)描述)可以是線性或分支的，其中LK將所述分析物與所述才艮告物部分和所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記二者(直接或間接地)連接在一起，其中該組中每種不同標(biāo)記試劑的連接物部分的質(zhì)量補(bǔ)償針對(duì)該組中所述不同標(biāo)記試劑在報(bào)告物部分之間的粗略質(zhì)量差異，4吏得才艮告物部分與連接物部分的合計(jì)粗略質(zhì)量對(duì)于該組中的每種標(biāo)記試劑而言都是相同的。X(如上文的詳細(xì)描述)一起的共價(jià)鍵，其中鍵X可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂。Y(如上文的詳細(xì)描述)是連接所述分析物與所述連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中Y任選地可通過(guò)在質(zhì)譜儀中施加解離能而斷裂，條件是如果Y是分析物連接基團(tuán)則其粗略質(zhì)量對(duì)于該組中每種標(biāo)記試劑而言都是相同的。w(如鍵或連接基團(tuán)，其中w任選地可通過(guò)施加光、熱和/或化學(xué)試劑而切割和/或可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂;4Hf是如果W是連接基團(tuán)則其粗略質(zhì)量對(duì)于該組中每種標(biāo)記試劑而言都是相同的。被標(biāo)記分析物lA的某些斷裂特征示于圖3a。例如，該混合物可包含至少一種由式IlA或IIlA表示的被標(biāo)記分析物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage79</formula>分析物I卩和IIlA的要素和某些斷裂特征示于圖3b。在一些實(shí)施方案中，所述混合物通過(guò)使用與支持物結(jié)合的標(biāo)記試劑來(lái)制備，并從支持物上切下被標(biāo)記分析物以形成混合物。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有至少兩種差異性標(biāo)記分析物的混合物，其中通過(guò)混合至少兩種不同樣品的標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物形成所述混合物，每種樣品使用選自一組同位素編碼的同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記試劑的不同標(biāo)記試劑進(jìn)行標(biāo)記，其中該混合物中每種差異性標(biāo)記分析物由式rAx表示，包括其鹽形式和/或水合物形式其中m和n各為0或l，條件是m+i^1。報(bào)告物部分"RP"(如上文的詳細(xì)描述)包含固定電荷或者可在質(zhì)鐠儀中離子化，其中所述報(bào)告物部分能在質(zhì)譜儀中在鍵X斷裂后產(chǎn)生特征離子，并且其中每種報(bào)告物部分及其相應(yīng)特征離子的粗略質(zhì)量對(duì)于每種不同樣品而言是不同的，這取決于使用該組中哪種標(biāo)記試劑來(lái)標(biāo)記樣品。非編碼的可檢測(cè)標(biāo)記"DL"(如上文的詳細(xì)描述)對(duì)該組中的每種不同標(biāo)記試劑而言是不同的，其中每種不同的非編碼可檢測(cè)標(biāo)記與該組中其它標(biāo)記試劑的其它非編碼可檢測(cè)標(biāo)記具有相同的粗略質(zhì)量和相同的凈電荷。連接物部分"LK"(如上文的詳細(xì)描述)可以是線性或分支的，其中LK將所述分析物與所述報(bào)告物部分和所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記二者(直接或間接地)連接在一起，其中該組中每種不同試劑的連接物部分的質(zhì)量補(bǔ)償針對(duì)該組中所述不同標(biāo)記試劑在報(bào)告物部分之間的質(zhì)量差異，使得所述報(bào)告物部分與所述連接物部分的合計(jì)粗略質(zhì)量對(duì)于該組中的每種標(biāo)記試劑而言是相同的。X(如上文的詳細(xì)描述)是將所述報(bào)告物部分與所述連接物部分或所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記連接在一起的共價(jià)鍵，其中鍵X可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂。Y(如上文的詳細(xì)描述)是連接所述分析物與所述連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中Y任選地可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂，M是如果Y是連接基團(tuán)則其粗略質(zhì)量對(duì)于該組中每種標(biāo)記試劑而言都是相同的。W(如上文的詳細(xì)描述)是連接所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記與所述連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中W任選地可通過(guò)施加光、熱、化學(xué)試劑而切割和/或可通過(guò)在質(zhì)i普儀中施加解離能而斷裂，M是如果W是連接基團(tuán)則其粗略質(zhì)量對(duì)于該組中每種標(biāo)記試劑而言都是相同的。Q，是同從固相支持物上切割所述差異性標(biāo)記分析物而形成的官能團(tuán)。例如，Q，可以是烷基氨基、烷基羥基或烷基硫醇基。例如，所述混合物可包含至少一種由式ir^或nrsAx表示的被標(biāo)記分析物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage81</formula>其中Q，是通過(guò)從固相支持物上切割所述差異性標(biāo)記分析物而形成的官能團(tuán)。被標(biāo)記分析物irsAx和nrAx的要素和某些斷裂特征示于圖3d。k試浙盒在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及試劑盒。所述試劑盒可包含一種或多種如上所述的標(biāo)記試劑以及一種或多種其它試劑、容器、酶、緩沖液和/或說(shuō)明書(shū)。例如，該試劑盒的試劑可選擇成用于測(cè)定或定量?jī)煞N或更多種樣品中的一種或多種分析物。該試劑盒可包含一組兩種或更多種標(biāo)記試劑以及一種或多種其它試劑、容器、酶、緩沖液和/或說(shuō)明書(shū)。試劑盒中標(biāo)記試劑的兩種或更多種可以是同分異構(gòu)和/或同量異位的。所述標(biāo)記試劑可以是經(jīng)同位素編碼的。該試劑盒的標(biāo)記試劑可以是本文所述的任何標(biāo)記試劑。例如，該試劑盒的一種或多種標(biāo)記試劑可以是上文所述式i、ii、iii、r、ir和/或nr的化合物(包括化合物組)，包括其同位素編碼的形式。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒可包含前述式iA、nA、niA、rAx、irAx和/或nrsAx的被標(biāo)記分析物，包括其同位素編碼的形式。該試劑盒中標(biāo)記試劑的其它特性已經(jīng)公開(kāi)。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒中的至少一種其它試劑是包含報(bào)告物部分的經(jīng)標(biāo)記校正標(biāo)準(zhǔn)品。在一些實(shí)施方案中，所述報(bào)告物可與該試劑盒中任何化合物(即標(biāo)記試劑)相比具有獨(dú)特的質(zhì)量。例如，該試劑盒可用于對(duì)同一樣品或者兩種或更多種不同樣品中的一種或多種分析物進(jìn)行多重分析。實(shí)施例甲"參孝以7",滋辨迷一步理庠本|銀我,^才面，摩迷豸滋辨不^理岸力"任命才式'艱斧/本發(fā)銀教爭(zhēng)^態(tài)渾。實(shí)施例l:標(biāo)記試劑的建議合成途徑參考圖9a和9b，展示了示例性標(biāo)記試劑III的建議合成途徑。應(yīng)該理解，可以通過(guò)簡(jiǎn)單替換適當(dāng)?shù)臒晒馊玖隙褂孟嗤姆椒▉?lái)制備示例性標(biāo)記試劑II。還應(yīng)該理解，可以用適當(dāng)編碼的起始材料制備具有同位素富集位點(diǎn)的組合物。參考圖9a，在氫化鈉(NaH)存在下使化合物10與化合物11反應(yīng)，以生成產(chǎn)物化合物12。用乙酸酐(Ac20)處理化合物12，形成化合物13。用化合物14(包括其同位素編碼的形式，例如參見(jiàn)下文實(shí)施例2)處理化合物13，生成化合物15。參考圖9b，接著用甲醇(MeOH)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)處理化合物15，生成化合物16。接著在二嚅烷中用鹽酸(HC1)處理化合物16，生成化合物17。接著在堿性條件下用非親核堿(例如三乙胺(Et3N)和活化(例如作為N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS酯)活化)的非編碼可檢測(cè)標(biāo)記(例如化合物18)處理化合物17，生成化合物19?；衔?8是一種可能的非編碼可檢測(cè)標(biāo)記，該標(biāo)記由本文所述式III表示。還可以使用非編碼可檢測(cè)標(biāo)記的活化形式(例如由式II化合物表示的形式)來(lái)形成同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記試劑組的伴侶標(biāo)記。接著用強(qiáng)堿(例如氫氧化鈉(NaOH))處理化合物19，以使該甲基酯皂化，并通過(guò)用N-羥基琥珀酰亞胺-三氟乙酸(NHS-TFA)處理轉(zhuǎn)化成N-羥基琥珀醜亞胺酯，生成標(biāo)記試劑20,NHS-TFA是公知適于將羧酸基轉(zhuǎn)化成N-琥珀酰亞胺酯的試劑(見(jiàn)圖7)。實(shí)施例2:編碼的報(bào)告物分子的建議合成路線(i)合成BocNH13CH213CH2OH(31)參考圖10a,將BocNH13CH213COOH(30，P/N:Aldrich604992;10g，56.44mmol)轉(zhuǎn)移至裝有隔板、磁力攪拌棒和氬氣輸入線的500mL雙頸圓底瓶中。用氬氣沖洗該系統(tǒng)后，使用壓力差通過(guò)插管轉(zhuǎn)移干燥的四氫呋喃(THF，P/N:Aldrich,186562;100mL),并在室溫下攪拌直至獲得澄清溶液。接著將反應(yīng)混合物冷卻至ot:，經(jīng)歷io分鐘通過(guò)插管將曱硼烷畫(huà)THF復(fù)合物(BH3THF，P/N:Aldrich176192,1M,197mL)溶液加入到反應(yīng)混合物中。接著在0x:下使反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行90分鐘。用曱醇(MeOH)猝滅反應(yīng)混合物的小等分試樣，并通過(guò)薄層色鐠(TLC)進(jìn)行分析，該分析顯示完全消耗了起始材料30并形成了產(chǎn)物31(&30=0.00,Rf31=0.20;1:1己烷畫(huà)乙酸乙酯(EtOAc);通過(guò)用乙醇(EtOH)中3%(重量/體積)的水合茚三酮溶液加熱來(lái)使TLC顯色)。通過(guò)緩慢加入甲醇(100mL，經(jīng)歷20分鐘)來(lái)猝滅(在0X:下)反應(yīng)。減壓除去揮發(fā)物。將這樣獲得的油從額外的甲醇(50mL)中共蒸發(fā)，并通過(guò)柱色譜純化(進(jìn)行兩次，120gSiO2柱Isco.;85mL/分鐘，0-10分鐘己烷中的40%EtOAc，10-25分鐘己烷中的卯％EtOAc。收集18mL級(jí)分，39-55級(jí)分含有純產(chǎn)物)，得到BocNH13CH213CH2OH(31)的無(wú)色油(7.40g，81。/。)。(ii)合成BocNHCH2CH2OMs(32)參考圖10b,歷經(jīng)1分鐘一邊攪拌一邊向31(1.15g,7.13mmol)、Et3N(2.5mL，17.82mmol)的二氯曱烷(DCM，100mL)水冷溶液中加入甲磺酰氯(MsCI，P/N:Fluka64260,0.664mL,8.55mmol)。在0X^再經(jīng)過(guò)15分鐘后，通過(guò)TLC分析反應(yīng)混合物，其顯示形成了新產(chǎn)物(Rf31=0.20,Rf32=0.42;1:1己烷畫(huà)EtOAc;通過(guò)用乙醇(EtOH)中3%(重量/體積)的水合茚三酮溶液加熱來(lái)使TLC顯色)。使DCM蒸發(fā)，將黃色固體溶于乙醇(300mL)中。用HC1(1M，100mL)洗滌乙醇層，其后用鹽水洗滌(50mLx2)，用Na2S(Xi干燥并濃縮得到黃色油，無(wú)需純化即可用于下一步反應(yīng)。(iii)合成BocNHCH2CH2NHMe(33)參考圖10c，使用最低量的THF將BocNHCH2CH2OMs(32)(1.42g,5.94mmol)轉(zhuǎn)移至Chem-Glass壓力管，并加入60mL甲胺(MeNH2，P/N:Aldrich395056，THF中2.0M，120mmol)溶液，加蓋并在40畫(huà)45t:加熱(同時(shí)攪拌)3小時(shí)，接著在RT下過(guò)夜(使用防護(hù)罩)。TLC分析(l:lEtOAc-己烷)顯示，完全消耗了32并形成了新產(chǎn)物(Rf33=0.38;1:1DCM-MeOH+1%(體積/體積)Et3N;TLC板首先加熱5分鐘以除去Et3N，接著通過(guò)用EtOH中3%(重量/體積)的水合茚三酮溶液加熱來(lái)顯色。接著將反應(yīng)混合物濃縮成油，并通過(guò)柱色譜純化(40gSi()2柱Isco.;40mL/分鐘，柱用EtOAc平衡，用1:1的MeOH-DCM+1%Et3N(體積/體積)洗脫。收集18mL級(jí)分，級(jí)分13-19中含有純產(chǎn)物)，得到BocNH13CH213CH2NHMe33的無(wú)色油(0.79g，76%)。ES-MS(在MeOH中直接浸出)計(jì)算值MH+13C2C6H18N202+H+=177.14，觀察值MH+=177.14。(iv)合成NH2CH2CH2NH(Me)Fmoc(34)參考圖10d，向充分?jǐn)嚢璧腂ocNH13CH213CH2NHMe(33,1.78g，10.2mmol)的丙酮溶液(125mL)中加入Fmoc-OSu(P/N:AdvanceChemTechRC8015,3.46g，125mL丙酮中10.2mmol)溶液。在室溫下將該混合物攪拌10分鐘。在此時(shí)向反應(yīng)混合物中加入NaHC03(飽和的，25mL)溶液，以將pH調(diào)節(jié)至8-9，再劇烈攪拌30分鐘(兩相反應(yīng))。丙酮蒸發(fā)后，使產(chǎn)物在乙醇(500mL)與稀(水)鹽酸(HCI,30mL,1M)+30mL鹽水之間分層。接著用HC1(30mL，1M)+30mL鹽水洗滌乙醇層，其后用NaHC03(10mL)+鹽水(60mL)以及鹽水(50mLx2)洗滌，用Na2S04干燥并濃縮得到粘稠的無(wú)色油。接著將該油溶于DCM(50mL)中，加入HC1的二喵烷溶液(4M，50mL)并在室溫下將反應(yīng)混合物攪拌30分鐘。減壓除去揮發(fā)物，得到白色干燥固體，用7:3的EtOAc-己烷清洗，得到NH213CH213CH2N(Fmoc)Me34的固體。(v)合成部分編碼的報(bào)告物/連接物部分(35)參考圖11，向34(3份)和N，N，-二異丙基乙胺(DIEA,6份)的DCM溶液中加入固體三苯甲基氯樹(shù)脂(AdvanceChemTech,P/NSC5028,1份)并混合30分鐘。接著過(guò)濾樹(shù)脂并用DMF清洗。接著用20。/。哌啶的N，N'-二曱基曱酰胺(DMF)溶液處理該樹(shù)脂5分鐘，并用DMF清洗。向N-曱基派漆乙酸(ChessGmbH,P/N2022，3份)和0-(7-偶氮苯并三唑國(guó)1誦基)國(guó)N，N,N',N，-四甲基脲六氟磷酸酯HATU(3份)的N-甲基國(guó)2畫(huà)吡咯烷酮(NMP)溶液中加入DIEA(9份)。將其混合l分鐘然后加入到樹(shù)脂中。偶聯(lián)30分鐘后，用NMP清洗樹(shù)脂，其后用乙腈清洗。使用DCM中的15。/。TFA從樹(shù)脂上切下產(chǎn)物(35)，得到TFA鹽的化合物。應(yīng)該理解，編碼的N-曱基哌漆乙酸(編碼的N-甲基哌溱乙酸的示例性合成可參閱如美國(guó)公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)US2005-0148774Al和US2005-01448773Al)和非編碼的NH2CH2CH2N(Fmoc)Me34，(圖12)可在合成反應(yīng)中被取代，由此生成相應(yīng)形式的化合物35(在圖12中標(biāo)為35，)，其中該報(bào)告物包含同位素富集的位點(diǎn)(參閱如圖12所示的替代性合成)。通過(guò)仔細(xì)選擇起始材料，可以使用所示方法制備基本上所有預(yù)期的化合物35的編碼形式。在一些實(shí)施方案中，所述編碼的N-甲基哌嗪乙酸部分可選自由下式表示的化合物36或37，3637其中*表示用"c替代"c。實(shí)施例3:標(biāo)記試劑的替代性建議合成途徑參考圖13和14，展示了標(biāo)記試劑的替代性合成途徑，其中將非編碼可檢測(cè)標(biāo)記與標(biāo)記試劑其余部分可切割地連接的連接物與上文實(shí)施例1的描述相比是倒置的。參考圖13a，將熒光染料40(應(yīng)該理解，可選擇產(chǎn)生本文所述式II化合物的焚光染料)與化合物41在二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)存在下反應(yīng)，生成化合物42。接著通過(guò)用三氟乙酸(TFA)處理來(lái)除去化合物42中的叔丁基羰基(t-boc或Boc)，生成以其TFA鹽形式存在的化合物43。參考圖13a，同圖14中使用的化合物43，一樣，化合物43還以簡(jiǎn)略方式顯示。參考圖13b，將化合物44(可根據(jù)Fadeev，EvgenyA.;Luo，Minkui;Groves,JohnT.5ywAes/sflwd欲w""ni/wocfe//wg</幼efl附/7/ri》/r,7/c5iV/m//^e由'zo6fl",7i-702Jfl/irffl/ifl/ogs:Bioorganic&MedicinalChemistryLetters(2005),15(16)，3771-3774來(lái)制備)與化合物35(應(yīng)該理解，根據(jù)所期望的試劑，可以使用化合物35的多種編碼或非編碼的形式)在非親核有機(jī)堿(例如三乙胺(Et3N)或N,N，-二異丙基乙胺(DIEA))存在下反應(yīng)，生成化合物45。將化合物45與千基溴(BnBr)在無(wú)機(jī)堿(碳酸銫(CsC03))存在下反應(yīng)，形成化合物46。接著通過(guò)用TFA處理來(lái)除去化合物46的M)oc基團(tuán)，生成化合物47。接著將化合物47與HATU在非親核有機(jī)堿(例如DIEA)存在下反應(yīng)，接著與化合物43'反應(yīng)生成化合物48。接著用氫(112)和鈀(Pd)催化劑處理化合物48,從而將該千基酯轉(zhuǎn)化成羧酸基，再將所述羧酸基與N-羥基琥珀酰亞胺-三氟乙酸(NHS-TFA，化合物50)反應(yīng)，形成標(biāo)記試劑49的NHS酯。實(shí)施例4:非編碼可檢測(cè)標(biāo)記的建i義合成途徑作為非編碼可檢測(cè)標(biāo)記的熒光染料可以是可用的染料和/或市售染料的修飾形式。例如，參考圖14，具有通式III的本文所述化合物包含TAMRA部分，其中TAMRA是來(lái)自多種來(lái)源的市售染料。為了制備包含與TAMRA相同的質(zhì)量和電荷的熒光染料，圖14也展示了對(duì)于通式II的化合物所使用染料的建議合成途徑。該建議合成遵循熟知的合成途徑，其中用酚類(lèi)化合物的N-甲基衍生物60取代其N(xiāo)-乙基形式，生成以其二TFA鹽形式存在的預(yù)期染料65。參考圖14，可通過(guò)在高溫下用聚磷酸長(zhǎng)時(shí)間處理化合物60與化合物61的混合物來(lái)制備染料65。熒光染料生產(chǎn)領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)了解如何進(jìn)行這種混合。該反應(yīng)生成化合物62和63，其中分離化合物63并轉(zhuǎn)化成鹽形式64。接著可用三氟乙酸/三乙胺處理化合物64,生成雙三氟乙酸酯65。盡管結(jié)合多個(gè)實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但本發(fā)明并不旨在受限于這些實(shí)施方案。相反，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，本發(fā)明涵蓋多種替代方案、改變和等同方案。權(quán)利要求1.由式I表示的化合物，包括其鹽形式和/或水合物形式其中i)RG為包含親核體或親電體的反應(yīng)基團(tuán)，其中所述反應(yīng)基團(tuán)能與樣品中一種或多種反應(yīng)性分析物反應(yīng)，從而形成一種或多種被標(biāo)記分析物；ii)RP是報(bào)告物部分，其包含固定電荷或者可在質(zhì)譜儀中離子化，其中所述報(bào)告物部分能在質(zhì)譜儀中在鍵X斷裂后產(chǎn)生特征離子；iii)DL是非編碼的可檢測(cè)標(biāo)記；iv)LK是連接物部分，其可以是線性或分支的，其中LK將所述反應(yīng)基團(tuán)與所述報(bào)告物部分和所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記二者連接在一起；v)X是將所述報(bào)告物部分與所述連接物部分或所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記連接在一起的共價(jià)鍵，其中X可通過(guò)在質(zhì)譜儀中施加解離能而斷裂；vi)Y是連接所述反應(yīng)基團(tuán)與所述連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中Y任選地可通過(guò)在質(zhì)譜儀中施加解離能而斷裂；vii)W是連接所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記與所述連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中W任選地可通過(guò)施加光、熱和/或化學(xué)試劑而切割和/或可通過(guò)在質(zhì)譜儀中施加解離能而斷裂；和viii)m和n各為0或1，條件是m+n＝1；其中所述化合物任選地通過(guò)可切割連接物與固相支持物連接。2.權(quán)利要求l的化合物，由式II表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中RG是所述反應(yīng)基團(tuán)。3.權(quán)利要求l的化合物，由式III表示:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中RG是所述反應(yīng)基團(tuán)。4.權(quán)利要求i的化合物，由式rs表示，包括其鹽形式和/或水合物形式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中:i)RG為包含親核體或親電體的反應(yīng)基團(tuán)，其中所述反應(yīng)基團(tuán)能與樣品中一種或多種反應(yīng)性分析物反應(yīng)，從而形成一種或多種被標(biāo)記分析物；ii)RP是報(bào)告物部分，其包含固定電荷或者可在質(zhì)譜儀中離子化，其中所述報(bào)告物部分能在質(zhì)讒儀中在鍵X斷裂后產(chǎn)生特征離子；iii)DL是非編碼的可檢測(cè)標(biāo)記；iv)LK是連接物部分，它可以是線性或分支的，其中LK將所述反應(yīng)基團(tuán)與所述報(bào)告物部分和所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記二者連接在一起；v)X是將所述報(bào)告物部分與所述連接物部分或所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記連接在一起的共價(jià)鍵，其中X可通過(guò)在質(zhì)譜儀中施加解離能而斷裂；vi)Y是連接所述反應(yīng)基團(tuán)與所述連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中Y任選地可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂；vii)W是連接所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記與所述連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中W任選地可通過(guò)施加光、熱和/或化學(xué)試劑而切割和/或可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂；viii)m和n各為0或1，條件是m+n=l;和xi)SS是通過(guò)可切割連接物與所述標(biāo)記試劑的所述報(bào)告物部分共價(jià)連接的固相支持物。5.權(quán)利要求4的化合物，由式ir表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中RG是所迷反應(yīng)基團(tuán)，SS是所述固相支持物，CL是所述可切割連接物。6.權(quán)利要求4的化合物，由式Iir表示:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中RG是所述^^應(yīng)基團(tuán)，SS是所述固相支持物，CL是所述可切割連接物。7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的化合物，其中RG為羧酸、磺酸、羧跣卣化物、磺?；栈铩⒒钚怎?、混合酸酐、異氰酸酯或異硫氰酸酯基團(tuán)。8.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的化合物，其中RG為馬來(lái)酰亞胺基、烷基鹵化物基、a-鹵代it^、a-卣代硫酮基或a-鹵代亞胺基。9.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的化合物，其中RG為三苯曱基卣化物或曱^基卣化物基團(tuán)。10.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的化合物，其中RG為胺基、羥基或硫醇基。11.一種方法，其包括以下步驟a)使各包含一種或多種反應(yīng)性分析物的兩個(gè)或更多個(gè)樣品與一組同位素編碼的同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記試劑中的不同標(biāo)記試劑反應(yīng)，從而形成各包含一種或多種被標(biāo)記分析物的兩個(gè)或更多個(gè)差異性標(biāo)記樣品，其中該組中的不同標(biāo)記試劑由式I表示，包括其鹽形式和/或水合物形式W一LK-其中i)RG為包含親核體或親電體的反應(yīng)基團(tuán)，其中所述反應(yīng)基團(tuán)能與樣品中所述一種或多種反應(yīng)性分析物反應(yīng)，從而在每個(gè)樣品中形成所述一種或多種被標(biāo)記分析物；ii)RP是報(bào)告物部分，其包含固定電荷或者可在質(zhì)i普儀中離子化，其中所述才艮告物部分能在質(zhì)脊仗中在鍵X斷裂后產(chǎn)生特征離子，并且其中每種報(bào)告物部分及其相應(yīng)特征離子的粗略質(zhì)量對(duì)于該組中的每種標(biāo)記試劑而言是不同的；iii)DL是非編碼的可檢測(cè)標(biāo)記，其中該組中的每種標(biāo)記試劑包含不同的可獨(dú)立檢測(cè)的非編碼可檢測(cè)標(biāo)記，其中每種所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記與該組中標(biāo)記試劑的其它非編碼可檢測(cè)標(biāo)記具有相同的粗略質(zhì)量和相同的凈電荷；W)LK是連接物部分，它可以是線性或分支的，其中LK將所述反應(yīng)基團(tuán)與所述報(bào)告物部分和所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記二者連接在一起，其中該組中每種不同試劑的連接物部分的質(zhì)量補(bǔ)償該組中所述不同標(biāo)記試劑的凈艮告物部分之間的粗略質(zhì)量差異，使得所述才艮告物部分與所述連接物部分的合計(jì)粗略質(zhì)量對(duì)于該組中的每種標(biāo)記試劑而言都濕一相同的；v)X是將所述報(bào)告物部分與所述連接物部分或所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記連接在一起的共價(jià)鍵，其中X可通過(guò)在質(zhì)譜儀中施加解離能而斷裂；vi)Y是連接所述反應(yīng)基團(tuán)與所述連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中Y任選地可通過(guò)在質(zhì)語(yǔ)儀中施加解離能而斷裂，^Hf是如果Y是連接基團(tuán)則其粗略質(zhì)量對(duì)于該組中每種標(biāo)記試劑而言都是相同的；vii)W是連接所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記與所述連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中W任選地可通過(guò)施加光、熱和/或化學(xué)試劑而切割和/或可通過(guò)在質(zhì)譜儀中施加解離能而斷裂；M是如果W是連接基團(tuán)則其粗略質(zhì)量對(duì)于該組中每種標(biāo)記試劑而言都是相同的；和viii)m和n各為0或1，條件是m+n=l;以及b)將所述兩種或更多種差異性標(biāo)記樣品或其部分以及任選地一種或多種校正標(biāo)準(zhǔn)品混合在一起，以產(chǎn)生樣品混合物。12.權(quán)利要求ll的方法，其還包括c)電泳分離該樣品混合物或其級(jí)分。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述電泳分離是1D電泳分離、2D電泳分離和/或毛細(xì)管電泳分離。14.權(quán)利要求12的方法，其還包括d)從電泳分離物中收集共遷移的差異性標(biāo)記分析物的一種或多種子樣品；和e)當(dāng)m為0、n為1、W是可通過(guò)施加光、熱或化學(xué)試劑而切割的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)時(shí)，任選地在適當(dāng)條件下處理所述一種或多種子樣品，由此從所述一種或多種子樣品的差異性標(biāo)記分析物中切下所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記。15.權(quán)利要求14的方法，其還包括f)對(duì)所述子樣品之一或其級(jí)分進(jìn)行第一質(zhì)鐠分析；g)對(duì)從第一質(zhì)鐠分析得到的具有選定質(zhì)荷比的差異性標(biāo)記分析物的離子施加解離能，由此形成至少一些所述選定離子的特征離子和子片段離子；和h)對(duì)所述選定離子、所述特征離子和/或所述子片段離子或其級(jí)分進(jìn)行第二質(zhì)量分析。16.權(quán)利要求15的方法，其還包括i)測(cè)定第二質(zhì)量分析中每種特征離子的粗略質(zhì)量和相對(duì)量以及一些或全部所述子片段離子的粗略質(zhì)量和/或絕對(duì)質(zhì)量。17.權(quán)利要求16的方法，其還包括j)通過(guò)分析所述子片段離子來(lái)確定與所選質(zhì)荷比相關(guān)的被標(biāo)記分析物。18.權(quán)利要求17的方法，其還包括k)在不同的選定質(zhì)荷比下對(duì)所述差異性標(biāo)記分析物的所選離子重復(fù)步驟(g)到(i)或(g)到(j)一次或多次。19.權(quán)利要求18的方法，其還包括1)重復(fù)步驟(i)到(i)、(f)到G)或(f)到(k)一次或多次，每次4吏用不同的子樣品。20.權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的方法，其還包括重復(fù)步驟(d)到(i)一次或多次。21.權(quán)利要求11至20中任一項(xiàng)的方法，其中該組中每種不同標(biāo)記試劑是與支持物結(jié)合的，并通過(guò)可切割連接物與所述支持物連接，使得每種不同樣品與帶有該組中不同標(biāo)記試劑的支持物反應(yīng)，其中該方法還包括，在進(jìn)行步驟(a)之后和進(jìn)行步驟(b)之前i)任選地清洗每種支持物，以除去每種樣品中不與支持物上所結(jié)合標(biāo)記試劑的反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)的組分；ii)切割所述可切割連接物，以從每種支持物上釋放被標(biāo)記分析物，每種差異性標(biāo)記樣品包含一種或多種被標(biāo)記分析物，其中與特定樣品相關(guān)的被標(biāo)記分析物可通過(guò)與其相連的具有獨(dú)特質(zhì)量的才艮告物部分來(lái)鑒定和/或定量；和iii)任選地收集每個(gè)樣品的被標(biāo)記分析物，之后根據(jù)步驟(b)將其混合。22.權(quán)利要求21的方法，其中該組中每種與支持物結(jié)合的不同的同位素編碼標(biāo)記試劑由式T表示，包括其鹽形式和/或水合物形式DL——W——LK-Y-RG其中i)RG為包含親核體或親電體的反應(yīng)基團(tuán)，其中所述M基團(tuán)能與樣品中所述一種或多種>^應(yīng)性分析物反應(yīng)，從而形成所述一種或多種被標(biāo)記分析物；ii)RP是報(bào)告物部分，其包含固定電荷或者可在質(zhì)譜儀中離子化，其中所述報(bào)告物部分能在質(zhì)譜儀中在鍵X斷裂后產(chǎn)生特征離子，并且其中每種報(bào)告物部分及其相應(yīng)特征離子的粗略質(zhì)量對(duì)于該組中的每種標(biāo)記試劑而言是不同的；iii)DL是非編碼的可檢測(cè)標(biāo)記，其中該組中的每種標(biāo)記試劑包含不同的可獨(dú)立檢測(cè)的非編碼可檢測(cè)標(biāo)記，其中每種非編碼可檢測(cè)標(biāo)記與該組中標(biāo)記試劑的其它非編碼可檢測(cè)標(biāo)記具有相同的粗略質(zhì)量和相同的凈電荷；iv)LK是連接物部分，它可以是線性或分支的，其中LK將所述反應(yīng)基團(tuán)與所述報(bào)告物部分和所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記二者連接在一起，其中該組中每種不同試劑的連接物部分的質(zhì)量補(bǔ)償該組中所述不同標(biāo)記試劑的報(bào)告物部分之間的粗略質(zhì)量差異，使得所述報(bào)告物部分與所述連接物部分的合計(jì)粗略質(zhì)量對(duì)于該組中的每種標(biāo)記試劑而言都是相同的；v)X是將所述報(bào)告物部分與所述連接物部分或所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記連接在一起的共價(jià)鍵，其中X可通過(guò)在質(zhì)脊K中施加解離能而斷裂；vi)Y是連接所述反應(yīng)基團(tuán)與所述連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中Y任選地可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂，^是如果Y是連接基團(tuán)則其粗略質(zhì)量對(duì)于該組中每種標(biāo)記試劑而言都是相同的；vii)W是連接非編碼可檢測(cè)標(biāo)記與連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中W任選地可通過(guò)施加光、熱和/或化學(xué)試劑而切割和/或可通過(guò)在質(zhì)#^中施加解離能而斷裂；M是如果W是連接基團(tuán)則其粗略質(zhì)量對(duì)于該組中每種標(biāo)記試劑而言都是相同的；和viii)m和n各為0或1,#^ff是m+n=l;以及ix)SS是通過(guò)可切割連接物與所述標(biāo)記試劑的所述才艮告物部分共價(jià)連接的固相支持物。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述標(biāo)記試劑之一由式ir表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中RG是所述反應(yīng)基團(tuán)，SS是所述固相支持物，CL是所述可切割連接物。24.權(quán)利要求22的方法，其中所述標(biāo)記試劑之一由式Iir表示H3CO其中RG是所述M基團(tuán)，SS是所述固相支持物，CL是所述可切割連接物。25.權(quán)利要求11至24中任一項(xiàng)的方法，其還包括用至少一種酶消化每種樣品和/或樣品混合物，以部分或完全降解該樣品和/或樣品混合物中的組分。26.權(quán)利要求17至20中任一項(xiàng)的方法，其中測(cè)定第二質(zhì)量分析中具有獨(dú)特質(zhì)量的每種特征離子相對(duì)于其它特征離子的相對(duì)量。27.權(quán)利要求26的方法，其中將與所測(cè)定分析物相關(guān)的具有獨(dú)特質(zhì)量的每種特征離子的相對(duì)量與混合形成該樣品混合物的每種差異性標(biāo)記樣品的量相關(guān)聯(lián)，從而確定所測(cè)定分析物在所述兩種或更多種差異性標(biāo)記樣品每種中的相對(duì)量。28.權(quán)利要求27的方法，其中i)所述樣品混合物包含已知量的用于所測(cè)定分析物的校正標(biāo)準(zhǔn)品，其中所述校正標(biāo)準(zhǔn)品包含用于所測(cè)定分析物的具有獨(dú)特質(zhì)量的才艮告物部分，并參考與該校正標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)的獨(dú)特特征離子的量來(lái)測(cè)定與每種獨(dú)特報(bào)告物部分對(duì)應(yīng)的每種獨(dú)特特征離子的絕對(duì)量；ii)參考具有獨(dú)特質(zhì)量的每種不同特征離子的絕對(duì)量來(lái)測(cè)定所述樣品混合物的每種不同樣品中所測(cè)定分析物的絕對(duì)量。29.權(quán)利要求27的方法，其中i)參考校正曲線來(lái)測(cè)定與每種獨(dú)特報(bào)告物部分對(duì)應(yīng)的每種獨(dú)特特征離子的絕對(duì)量；ii)參考具有獨(dú)特質(zhì)量的每種不同特征離子的絕對(duì)量來(lái)測(cè)定所述樣品混合物的每種不同樣品中所測(cè)定分析物的絕對(duì)量。30.權(quán)利要求27的方法，其還包括以不同的選定質(zhì)荷比對(duì)被標(biāo)記分析物的選定離子重復(fù)步驟(g)至(j)一次或多次，從而鑒定和/或測(cè)定混合形成所述樣品混合物的所述兩種或更多種差異性標(biāo)記樣品每種中一種或多種其它所測(cè)定分沖斤物的相對(duì)量。31.權(quán)利要求28或29的方法，其還包括以不同的選定質(zhì)荷比對(duì)被標(biāo)記分析物的選定離子重復(fù)步驟(g)至(j)一次或多次，從而鑒定和/或測(cè)定混合形成所述樣品混合物的所述兩種或更多種差異性標(biāo)記樣品每種中一種或多種其它所測(cè)定分析物的絕對(duì)量。32.權(quán)利要求30的方法，其中所述分析物是肽，并且基于混合形成所述樣品混合物的所述兩種或更多種差異性標(biāo)記樣品每種中一種或多種肽的身份和相對(duì)量來(lái)確定混合形成所述樣品混合物的所述兩種或更多種差異性標(biāo)記樣品每種中一種或多種蛋白質(zhì)的身份和相對(duì)量。33.權(quán)利要求31的方法，其中所述分析物是肽，并且基于混合形成所述樣品混合物的所述兩種或更多種差異性標(biāo)記樣品每種中一種或多種肽的身份和絕對(duì)量來(lái)確定混合形成所述樣品混合物的所述兩種或更多種差異性標(biāo)記樣品每種中一種或多種蛋白質(zhì)的身份和絕對(duì)量。34.權(quán)利要求11至31中任一項(xiàng)的方法，其中所述分析物是肽、蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、類(lèi)固醇、維生素、前列腺素或分子量小于1500道爾頓(Da)的其它小分子。35.權(quán)利要求11至34中任一項(xiàng)的方法，其中至少一種差異性標(biāo)記樣品用式II或式III的同位素編碼標(biāo)記試劑進(jìn)行標(biāo)記<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中RG是所述反應(yīng)基團(tuán)。36.包含至少兩種差異性標(biāo)記分析物的混合物，其中所述混合物通過(guò)將至少兩種不同樣品的標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物混合在一起而形成，其中每種樣品使用一組同位素編碼的同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記試劑中的不同標(biāo)記試劑進(jìn)行標(biāo)記，其中該混合物中每種差異性標(biāo)記分析物由式lA表示，包括其鹽形式和/或7JC合物形式分析物其中i)RP是報(bào)告物部分，其包含固定電荷或者可在質(zhì)鐠儀中離子化，其中所述報(bào)告物部分能在質(zhì)鐠儀中在鍵X斷裂后產(chǎn)生特征離子，并且其中每種報(bào)告物部分及其相應(yīng)特征離子的粗略質(zhì)量對(duì)于每種不同樣品而言是不同的，這取決于使用該組中的哪種標(biāo)記試劑來(lái)標(biāo)記該樣品；ii)DL是非編碼的可檢測(cè)標(biāo)記，其對(duì)于該組中的每種不同標(biāo)記試劑而言是不同的，其中每種不同的非編碼可檢測(cè)標(biāo)記可獨(dú)立于該組中其它可檢測(cè)標(biāo)記而進(jìn)行檢測(cè)，并且其中每種不同的非編碼可檢測(cè)標(biāo)記與該組中其它標(biāo)記試劑的其它非編碼可檢測(cè)標(biāo)記具有相同的粗略質(zhì)量和相同的凈電荷；iii)LK是連接物部分，它可以是線性或分支的，其中LK將所述分析物與所述報(bào)告物部分和所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記二者連接在一起，其中該組中每種不同標(biāo)記試劑的連接物部分的質(zhì)量補(bǔ)償該組中所述不同標(biāo)記試劑的才艮告物部分之間的粗略質(zhì)量差異，使得所述才艮告物部分與所述連接物部分的合計(jì)粗略質(zhì)量對(duì)于該組中的每種標(biāo)記試劑而言都是相同的；iv)X是將所述^L告物部分與所述連接物部分或所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記連接在一起的共價(jià)鍵，其中鍵X可通過(guò)在質(zhì)，中施加解離能而斷裂；v)Y是連接所述分析物與所述連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中Y任選地可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂，^ff是如果Y是連接基團(tuán)則其粗略質(zhì)量對(duì)于該組中每種標(biāo)記試劑而言都是相同的；vi)W是連接非編碼可檢測(cè)標(biāo)記與連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中W任選地可通逸沲加光、熱和/或化學(xué)試劑而切割和/或可通過(guò)在質(zhì)#^中施加解離能而斷裂，IHf是如果w是連接基團(tuán)則其粗略質(zhì)量對(duì)于該組中每種標(biāo)記試劑而言都是相同的；和vii)m和n各為0或1，條件是m+n=l。37.權(quán)利要求36的混合物，其中所述分析物中的一種或多種是肽和/或蛋白質(zhì)。38.權(quán)利要求36的混合物，其中所述分析物中的一種或多種是核酸。39.權(quán)利要求36的混合物，其中所述分析物中的一種或多種是碳7jC化合物、氨基酸、脂質(zhì)、類(lèi)固醇、維生素和/或前列腺素。40.權(quán)利要求36的混合物，其中所述分析物中的一種或多種是質(zhì)量小于1500道爾頓的小分子。41.權(quán)利要求36的混合物，其中所述分析物中的兩種或更多種是不同的分析物類(lèi)型。42.權(quán)利要求36至41中任一項(xiàng)的混合物，其中至少一種被標(biāo)記分析物由式IlA表示A43.權(quán)利要求36至41中任一項(xiàng)的混合物，其中至少一種被標(biāo)記分析物由式IIlA表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>III44.包含至少兩種差異性標(biāo)記分析物的混合物，其中所述混合物通過(guò)將至少兩種不同樣品的標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物混合在一起而形成，其中每種樣品使用來(lái)自一組同位素編碼的同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記試劑的不同標(biāo)記試劑進(jìn)行標(biāo)記，其中該混合物中每種差異性標(biāo)記分析物由式r^表示，包括其鹽形式和/或7jc合物形式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>分析物其中i)RP是報(bào)告物部分，其包含固定電荷或者可在質(zhì)鐠儀中離子化，其中所述報(bào)告物部分能在質(zhì)鐠儀中在鍵X斷裂后產(chǎn)生特征離子，并且其中每種報(bào)告物部分及其相應(yīng)特征離子的粗略質(zhì)量對(duì)于每種不同樣品而言是不同的，這取決于使用該組中的哪種標(biāo)記試劑來(lái)標(biāo)記該樣品；ii)DL是非編碼的可檢測(cè)標(biāo)記，其對(duì)于該組中的每種不同標(biāo)記試劑而言是不同的，其中每種不同的非編碼可檢測(cè)標(biāo)記可獨(dú)立于該組中其它可檢測(cè)標(biāo)記而進(jìn)行檢測(cè)，并且其中每種不同的非編碼可檢測(cè)標(biāo)記與該組中其它標(biāo)記試劑的其它非編碼可檢測(cè)標(biāo)記具有相同的粗略質(zhì)量和相同的凈電荷；iii)LK是連接物部分，它可以是線性或分支的，其中LK將所述分析物與所述報(bào)告物部分和所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記二者連接在一起，其中該組中每種不同標(biāo)記試劑的連接物部分的質(zhì)量補(bǔ)償該組中所述不同標(biāo)記試劑的寺艮告物部分之間的粗略質(zhì)量差異，使得所述才艮告物部分與所述連接物部分的合計(jì)粗略質(zhì)量對(duì)于該組中的每種標(biāo)記試劑而言都^!相同的；iv)X是將所述^L告物部分與所述連接物部分或所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記連接在一起的共價(jià)鍵，其中鍵X可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂；v)Y是連接所述分析物與所述連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中Y任選地可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂，4Ht是如果Y是連接基團(tuán)則其粗略質(zhì)量對(duì)于該組中每種標(biāo)記試劑而言都是相同的；vi)W是連接所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記與所述連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中W任選地可通過(guò)施加光、熱和/或化學(xué)試劑而切割和/或可通過(guò)在質(zhì)i普儀中施加解離能而斷裂，M是如果W是連接基團(tuán)則其粗略質(zhì)量對(duì)于該組中每種標(biāo)記試劑而言都是相同的；vii)m和n各為0或1，條件是m+n=l;和viii)Q，是通it^固相支持物上切割所述差異性標(biāo)記分析物而形成的官能團(tuán)。45.權(quán)利要求44的混合物，其中至少一種被標(biāo)記分析物由式ir^表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>其中Q，是通過(guò)從固相支持物上切割所述差異性標(biāo)記分析物而形成的官能團(tuán)。46.權(quán)利要求44的混合物，其中至少一種被標(biāo)記分析物由式IirAx表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>其中Q，是通過(guò)從固相支持物上切割所述差異性標(biāo)記分析物而形成的官能47.包含至少一種權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述化合物的試劑盒。48.權(quán)利要求47的試劑盒，其還包含至少一種其它試劑，所述其它試劑被選擇用于實(shí)施對(duì)兩種或更多種不同樣品中的一種或多種分析物的定量測(cè)定。49.權(quán)利要求48的試劑盒，其中所述至少一種其它試劑是經(jīng)標(biāo)記的校正標(biāo)準(zhǔn)品。50.由式IA表示的化合物，包括其鹽形式和/或水合物形式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>i)RP是報(bào)告物部分，其包含固定電荷或者可在質(zhì)鐠儀中離子化，其中所述報(bào)告物部分能在質(zhì)譜儀中在鍵X斷裂后產(chǎn)生特征離子；ii)DL是非編碼的可檢測(cè)標(biāo)記；iii)LK是連接物部分，它可以是線性或分支的，其中LK將所述分析物與所述報(bào)告物部分和所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記二者連接在一iv)X是將所述報(bào)告物部分與所述連接物部分或所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記連接在一起的共價(jià)鍵，其中X可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能v)Y是連接所述分析物與所述連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中Y任選地可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂；vii)W是連接所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記與所述連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中W任選地可通過(guò)施加光、熱和/或化學(xué)試劑而切割和/或可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂；和分析物其中:而斷裂;viii)m和n各為0或1，^ff是m+n=l;其中所述化合物任選地與支持物相結(jié)合。51.由式rA表示的化合物，包括其鹽形式和/或水合物形式:DL~~W——LK-Y-^析物i)RP是報(bào)告物部分，其包含固定電荷或者可在質(zhì)鐠儀中離子化，其中所述報(bào)告物部分能在質(zhì)鐠儀中在鍵X斷裂后產(chǎn)生特征離子；ii)DL是非編碼的可檢測(cè)標(biāo)記；iii)LK是連接物部分，它可以是線性或分支的，其中LK將所述分析物與所述報(bào)告物部分和所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記二者連接在一iv)X是將所述報(bào)告物部分與所述連接物部分或所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記連接在一起的共價(jià)鍵，其中X可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能v)Y是連接所述分析物與所述連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中Y任選地可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂；vii)W是連接所述非編碼可檢測(cè)標(biāo)記與所述連接物部分的共價(jià)鍵或連接基團(tuán)，其中W任選地可通過(guò)施加光、熱和/或化學(xué)試劑而切割和/或可通過(guò)在質(zhì)鐠儀中施加解離能而斷裂；和viii)m和n各為0或1，條件是m+n=l;ix)SS是通過(guò)可切割連接物與所述標(biāo)記試劑的所述報(bào)告物部分共價(jià)連接的固相支持物。52.權(quán)利要求1至10、50或51中任一項(xiàng)的化合物，其中所述化合其中:而斷裂;物是被同位素編碼的。全文摘要本發(fā)明涉及與使用包含報(bào)告物部分和非編碼可檢測(cè)標(biāo)記的化合物通過(guò)質(zhì)譜法進(jìn)行分析物測(cè)定和/或定量有關(guān)的方法、混合物、試劑盒和組合物。所述化合物可成組用于分析被標(biāo)記分析物的混合物。文檔編號(hào)C07D493/10GK101511844SQ200780032436公開(kāi)日2009年8月19日申請(qǐng)日期2007年6月29日優(yōu)先權(quán)日2006年6月30日發(fā)明者蘇巴卡爾·戴伊,蘇巴西什·普爾卡亞斯塔申請(qǐng)人:阿普里拉股份有限公司