專(zhuān)利名稱(chēng)：經(jīng)修飾的人類(lèi)血漿多肽或Fc骨架和其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及經(jīng)修飾以包含至少一個(gè)非天然編碼氨基酸的人類(lèi)血漿多肽或Fc分子。

背景技術(shù)：
人類(lèi)血漿包含多種執(zhí)行多種功能的蛋白質(zhì)。血漿的蛋白質(zhì)組分是密集研究的焦點(diǎn)。關(guān)于人類(lèi)血漿的已知蛋白質(zhì)組分的描述，例如參見(jiàn)Anderson等人，Molecular &Cellular Proteomics，3.4311-326(2004)；和Ping等人，Proteomics，53506-3519(2005)。人類(lèi)血漿中可見(jiàn)的最常見(jiàn)蛋白質(zhì)是白蛋白。
人類(lèi)白蛋白(也稱(chēng)為血清白蛋白)是血漿中可見(jiàn)的多功能蛋白質(zhì)。其由于有助于形成血漿的膠體滲透壓而成為血漿容量和組織液平衡調(diào)控中的重要因素。白蛋白也充當(dāng)血流中可見(jiàn)的其它分子的運(yùn)載體。白蛋白通常占血漿蛋白的50-60％，且因相對(duì)較低的分子量(66,500道爾頓)而施加80-85％的血液的膠體滲透壓。白蛋白調(diào)控跨血管流體通量且因此調(diào)控血管內(nèi)和血管外流體容量，且轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)和脂溶性物質(zhì)。白蛋白溶液在某些類(lèi)型的休克或?yàn)l臨休克的治療中通常用于擴(kuò)大血漿容量和維持心輸出量，所述休克包括由灼傷、手術(shù)、出血或其它外傷或存在循環(huán)容量不足的病狀引起的休克。
白蛋白具有約兩周的血液循環(huán)半衰期且天生經(jīng)設(shè)計(jì)為運(yùn)載諸如脂質(zhì)、肽以及其它蛋白質(zhì)等其它分子。疏水性結(jié)合口袋和游離硫醇半胱氨酸殘基(Cys34)是賦予這一功能的特征。Cys34因其低pKa(約7)而成為出現(xiàn)在人類(lèi)血漿中的一個(gè)更具反應(yīng)性的硫醇基。白蛋白的Cys34也占血漿中硫醇濃度的主要部分(超過(guò)80％)(Kratz等人，J.Med.Chem.，45(25)5523-33(2002))。白蛋白通過(guò)其反應(yīng)性硫醇充當(dāng)運(yùn)載體的能力已用于治療用途。舉例來(lái)說(shuō)，描述了使藥物與白蛋白連接，從而改進(jìn)藥物的藥理學(xué)性質(zhì)(Kremer等人，Anticancer Drugs，13(6)615-23(2002)；Kratz等人，J.DrugTarget，8(5)305-18(2000)；Kratz等人，J.Med.Chem.，45(25)5523-33(2002)；Tanaka等人，Bioconjug.Chem.，2(4)261-9(1991)；Dosio等人，J.Control.Release，76(1-2)107-17(2001)；Dings等人，Cancer Lett.，194(1)55-66(2003)；Wunder等人，J.Immunol.，170(9)4793-801(2003)；Christie等人，Biochem.Pharmacol.，36(20)3379-85(1987))。也描述了使肽和蛋白質(zhì)治療劑與白蛋白連接(Holmes等人，Bioconjug.Chem.，11(4)439-44(2000)；Leger等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，13(20)3571-5(2003)；Paige等人，Pharm.Res.，12(12)1883-8(1995))。也進(jìn)行了白蛋白與干擾素α(AlbuferonTM)和白蛋白與人類(lèi)生長(zhǎng)激素(AlbutropinTM)以及白蛋白與白細(xì)胞介素-2(AlbuleukinTM)的結(jié)合。所屬領(lǐng)域也描述使用標(biāo)準(zhǔn)重組分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)產(chǎn)生白蛋白-蛋白質(zhì)融合物(美國(guó)專(zhuān)利第6,548,653號(hào)，其以引用的方式并入本文中)。所有結(jié)合物(與白蛋白形成的最后一種結(jié)合物除外)都涉及使用外源白蛋白的離體結(jié)合物形成。使用外源白蛋白的潛在缺點(diǎn)是污染或免疫原性反應(yīng)。
也描述了治療劑與白蛋白的活體內(nèi)連接，例如其中選定肽在給予之前經(jīng)修飾以允許白蛋白與肽結(jié)合。這種方法是使用二肽基肽酶IV抗性胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類(lèi)似物來(lái)描述(Kim等人，Diabetes，52(3)751-9(2003))。使特異性連接子([2-[2-[2-馬來(lái)酰亞胺基-丙酰胺基-(乙氧基)-乙氧基]-乙酰胺)連接到肽上所添加的羧基末端賴氨酸以使得白蛋白的半胱氨酸殘基能夠與肽結(jié)合。其它人已研究使特異性標(biāo)簽連接到肽或蛋白質(zhì)以增加其活體內(nèi)與白蛋白的結(jié)合(Koehler等人，Bioorg Med.Chem.Lett.，12(20)2883-6(2002)；Dennis等人，J.Biol.Chem.，277(38)35035-35043(2002)；Smith等人，Bioconjug.Chem.，12750-756(2001))。已使用一種利用小分子藥物的類(lèi)似方法，其中藥物的衍生物經(jīng)特定設(shè)計(jì)以具有與白蛋白的半胱氨酸殘基結(jié)合的能力。舉例來(lái)說(shuō)，這種前藥策略已用于阿霉素(doxorubicin)衍生物，其中阿霉素衍生物在位置34的半胱氨酸殘基處與內(nèi)源白蛋白結(jié)合(Cys34；Kratz等人，J Med.Chem.，45(25)5523-33(2002))。治療劑與白蛋白的活體內(nèi)連接相對(duì)于上述離體方法具有優(yōu)勢(shì)，這是因?yàn)槭褂脙?nèi)源白蛋白，從而避免與外源白蛋白的污染或免疫原性反應(yīng)相關(guān)的問(wèn)題。然而，藥物與內(nèi)源白蛋白的結(jié)合物的活體內(nèi)形成的現(xiàn)有技術(shù)方法涉及藥物與白蛋白之間的永久性共價(jià)鍵。為達(dá)到可使所述鍵可裂解或可逆的程度，從結(jié)合物釋放的藥物或肽應(yīng)呈最初化合物的修飾形式。
人類(lèi)血清白蛋白已在包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Etcheverry等人，(1986)BioTechnology 8726和EPA 123 544)、畢赤酵母(Pichia pastoris)(EPA 344459)以及克魯維酵母(Kluyveromyces)(Fleer等人，(1991)BioTechnology 9968-975)的酵母宿主細(xì)胞和大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)(Latta等人，(1987)BioTechnology51309-1314)，所述參考文獻(xiàn)以引用的方式并入本文中。
天然產(chǎn)生的抗體(Ab)是由兩個(gè)相同免疫球蛋白(Ig)重鏈和兩個(gè)相同輕鏈組成的四聚物結(jié)構(gòu)。免疫球蛋白是含有通過(guò)雙硫鍵結(jié)合在一起的多肽鏈的分子，所述多肽鏈通常具有兩個(gè)輕鏈和兩個(gè)重鏈。在各鏈中，一個(gè)域(V)具有視分子的抗體特異性而定的可變氨基酸序列。其它域(C)具有相同種類(lèi)的分子所共有的相當(dāng)恒定的序列。
Ab的重鏈和輕鏈由不同域組成。各輕鏈具有一個(gè)可變域(VL)和一個(gè)恒定域(CL)，而各重鏈具有一個(gè)可變域(VH)和三個(gè)或四個(gè)恒定域(CH)。由約110個(gè)氨基酸殘基組成的各域是折疊成由兩個(gè)彼此堆疊的β-折疊形成的特征性β-夾層結(jié)構(gòu)，即免疫球蛋白折疊。VL域各自具有三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1-3)且VH域各自具有多達(dá)四個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1-4)，所述互補(bǔ)決定區(qū)為在域的一端連接β鏈的環(huán)或轉(zhuǎn)角。輕鏈和重鏈的可變區(qū)通常對(duì)抗原特異性有貢獻(xiàn)，但個(gè)別鏈對(duì)特異性的貢獻(xiàn)不必相同?？贵w分子已發(fā)展到通過(guò)使用隨機(jī)CDR環(huán)與大量分子結(jié)合。
Ab的功能子結(jié)構(gòu)可通過(guò)蛋白水解和通過(guò)重組方法制備。所述子結(jié)構(gòu)包括包含通過(guò)單一鏈間雙硫鍵連接的重鏈的VH-CH1域和輕鏈的VL-CL1域的Fab片段和僅包含VH和VL域的Fv片段以及包含分子的非抗原結(jié)合區(qū)的Fc部分。在一些情況下，單一VH域保留顯著的對(duì)抗原的親和力(Ward等人，1989，Nature 341，554-546)。也已顯示某種單體κ輕鏈將特異性結(jié)合其抗原(L.Masat等人，1994，PNAS 91893-896)。發(fā)現(xiàn)分離的輕鏈或重鏈有時(shí)也保留某種抗原結(jié)合活性(Ward等人，1989，Nature 341，554-546)。
另一功能子結(jié)構(gòu)是包含經(jīng)由肽連接子共價(jià)連接的免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可變區(qū)的單鏈Fv(scFv)(S-z Hu等人，1996，Cancer Research，56，3055-3061)。這些小(Mr25,000)蛋白質(zhì)通常保留對(duì)單一多肽中的抗原的特異性和親和力且可對(duì)較大的抗原特異性分子提供便利的結(jié)構(gòu)單元。在多種情況下，scFv在循環(huán)中的短半衰期限制其治療效用。
使用Ig VH域的一部分作為模板，設(shè)計(jì)出稱(chēng)為“微抗體”的小蛋白質(zhì)骨架(Pessi等人，1993，Nature 362，367-369)。通過(guò)使對(duì)應(yīng)于VH的CDR1和CDR2的環(huán)隨機(jī)化，且然后使用噬菌體呈現(xiàn)方法選擇突變體而鑒別出對(duì)白細(xì)胞介素-6具有高親和力(解離常數(shù)(Kd)為約10-7M)的微抗體(Martin等人，1994，EMBO J.13，5303-5309)。
當(dāng)分析來(lái)自駱駝血清的IgG樣物質(zhì)時(shí)，駱駝通常缺乏可變輕鏈域，這提示足夠的抗體特異性和親和力可能僅源自VH域(三個(gè)或四個(gè)CDR環(huán))。已制備出具有高親和力的“駱駝化”VH域，且通過(guò)僅隨機(jī)化CDR3可產(chǎn)生高特異性。
“微抗體”的替代物為“雙功能抗體”。雙功能抗體是具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小型二價(jià)且具雙特異性的抗體片段。所述片段包含連接到同一多肽鏈上的輕鏈可變域(VL)的重鏈可變域(VH)(VH-VL)。雙功能抗體的大小與Fab片段類(lèi)似。通過(guò)使用太短而不允許在同一鏈上的兩個(gè)域之間配對(duì)的連接子，迫使所述域與另一鏈的互補(bǔ)域配對(duì)并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。這些二聚抗體片段或“雙功能抗體”是二價(jià)的且具雙特異性。參見(jiàn)P.Holliger等人，PNAS 906444-6448(1993)。
抗體片段包括除全長(zhǎng)形式以外的抗體的任何形式。本文中的抗體片段包括為存在于全長(zhǎng)抗體內(nèi)的較小組分的抗體和已經(jīng)工程化的抗體?？贵w片段包括(但不限于)Fv、Fc、Fab以及(Fab′)2、單鏈Fv(scFv)、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、雙功能雜交抗體、CDR1、CDR2、CDR3、CDR的組合、可變區(qū)、構(gòu)架區(qū)、恒定區(qū)等(Maynard和Georgiou，2000，Annu.Rev.Biomed.Eng.2339-76；Hudson，1998，Curr.Opin.Biotechnol.9395-402)。
已制備出CDR肽和有機(jī)CDR模擬物(Dougall等人，1994，Trends Biotechnol.12，372-379)。CDR肽是對(duì)應(yīng)于抗體的CDR環(huán)的氨基酸序列的通常為環(huán)狀的短肽。CDR環(huán)會(huì)引起抗體-抗原相互作用。已顯示CDR肽和有機(jī)CDR模擬物保留某種結(jié)合親和力(Smyth和von Itzstein，1994，J.Am.Chem.Soc.116，2725-2733)。已在不損失親和力的情況下將小鼠CDR移植到人類(lèi)Ig構(gòu)架上(Jones等人，1986，Nature 321，522-525；Riechmann等人，1988)。
在體內(nèi)，從大型文庫(kù)選擇特異性Ab并使其擴(kuò)增(親和力成熟)。這些過(guò)程可在活體外使用組合文庫(kù)技術(shù)重現(xiàn)。Ab片段在噬菌體表面上的成功呈現(xiàn)使得有可能產(chǎn)生和篩選大量CDR突變(McCafferty等人，1990，Nature 348，552-554；Barbas等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，7978-7982；Winter等人，1994，Annu.Rev.Immunol.12，433-455)。通過(guò)這種技術(shù)產(chǎn)生數(shù)目增加的Fab和Fv(和其衍生物)。這種組合技術(shù)可與Ab模擬技術(shù)組合。
多個(gè)可潛在充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)骨架的蛋白質(zhì)域已表達(dá)為與噬菌體衣殼蛋白的融合物。綜述見(jiàn)于Clackson和Wells，Trends Biotechnol.12173-184(1994)中。已使用這些蛋白質(zhì)域中的數(shù)種作為呈現(xiàn)隨機(jī)肽序列的骨架，所述蛋白質(zhì)域包括牛胰腺胰蛋白酶抑制劑(Roberts等人，PNAS 892429-2433(1992))、人類(lèi)生長(zhǎng)激素(Lowman等人，Biochemistry 3010832-10838(1991)；Venturini等人，Protein Peptide Letters 170-75(1994))以及鏈球菌的IgG結(jié)合域(O′N(xiāo)eil等人，Techniques in Protein Chemistry V(Crabb，L編)，第517-524頁(yè)，Academic Press，San Diego(1994))。這些骨架已呈現(xiàn)單一隨機(jī)化環(huán)或區(qū)。已使用淀粉酶抑肽(tendamistat)作為絲狀噬菌體M13上的提呈骨架(presentation scaffold)(McConnell和Hoess，1995，J.Mol.Biol.250460-470)。
免疫球蛋白的Fc部分包括(但不限于)通過(guò)從抗體中去除兩個(gè)抗原結(jié)合區(qū)(Fab片段)獲得的抗體片段。一種去除Fab片段的方法是用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白。因此，F(xiàn)c部分是由來(lái)自兩個(gè)重鏈的恒定區(qū)的大小近似相等的片段形成，所述片段通過(guò)非共價(jià)相互作用和雙硫鍵締合。Fc部分可包括鉸鏈區(qū)且延伸穿過(guò)抗體的CH2和CH3域到達(dá)C-末端。人類(lèi)和小鼠免疫球蛋白的代表性鉸鏈區(qū)可見(jiàn)于AntibodyEngineering，A Practical Guide，Borrebaeck，C.A.K.編，W.H.Freeman and Co.，1992中，其教示以引用的方式并入本文中。Fc部分可進(jìn)一步包括一個(gè)或一個(gè)以上糖基化位點(diǎn)。所屬領(lǐng)域中熟知多種含有鉸鏈區(qū)、CH2和CH3域以及一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)的代表性Fc蛋白的氨基酸序列。
存在五種類(lèi)型的具有不同效應(yīng)功能和藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的人類(lèi)免疫球蛋白Fc區(qū)IgG、IgA、IgM、IgD以及IgE。IgG是血清中最豐富的免疫球蛋白。IgG還具有任何免疫球蛋白中最長(zhǎng)的血清半衰期(23天)。不同于其它免疫球蛋白，IgG在與Fc受體結(jié)合后可有效地再循環(huán)。存在四個(gè)IgG亞類(lèi)G1、G2、G3以及G4，其各自具有不同的效應(yīng)功能。G1、G2以及G3能結(jié)合C1q和固定補(bǔ)體，而G4則不能。雖然G3能夠比G1有效地結(jié)合C1q，但G1在介導(dǎo)補(bǔ)體導(dǎo)向的細(xì)胞溶解中更有效。G2以極低效率固定補(bǔ)體。IgG中的C1q結(jié)合位點(diǎn)位于CH2域的羧基末端區(qū)。
所有IgG亞類(lèi)都能夠結(jié)合Fc受體(CD16、CD32、CD64)，其中G1和G3比G2和G4有效。IgG的Fc受體結(jié)合區(qū)是由位于CH2域的鉸鏈區(qū)和羧基末端區(qū)中的殘基形成。
IgA可以單體形式和通過(guò)J-鏈結(jié)合在一起的二聚物形式存在。IgA是血清中第二豐富的Ig，但其半衰期僅為6天。IgA具有三種效應(yīng)功能。其結(jié)合巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞上的IgA特異性受體，所述受體分別驅(qū)動(dòng)吞噬作用和脫粒作用。其也可經(jīng)由未知的替代途徑固定補(bǔ)體。
IgM是表達(dá)為通過(guò)J-鏈結(jié)合在一起的五聚物或六聚物。IgM具有5天的血清半衰期。其經(jīng)由位于CH3域中的結(jié)合位點(diǎn)微弱地結(jié)合C1q。IgD具有3天的血清半衰期。尚不清楚哪些效應(yīng)功能是歸因于這種Ig。IgE是單體Ig且具有2.5天的血清半衰期。IgE結(jié)合驅(qū)動(dòng)脫粒作用且引起促發(fā)炎劑釋放的兩種Fc受體。
本發(fā)明的多肽可含有上述同種型中的任一種，或可含有補(bǔ)體和/或Fc受體結(jié)合功能已改變、變化或消除的突變Fc區(qū)。本發(fā)明的多肽可含有上述同種型中的任一種，或可含有效應(yīng)功能已改變、變化或消除的突變Fc區(qū)。因此，本發(fā)明的多肽可含有免疫球蛋白的整個(gè)Fc部分、免疫球蛋白的Fc部分的片段或其類(lèi)似物。
本發(fā)明的多肽可由單鏈蛋白質(zhì)組成或呈多鏈多肽形式?？僧a(chǎn)生兩個(gè)或兩個(gè)以上Fc蛋白，以致其通過(guò)天然形成于Fc區(qū)之間的雙硫鍵相互作用。這些多聚物就共軛分子來(lái)說(shuō)可為同源的，或其可在融合蛋白的Fc部分的N-末端含有不同的共軛分子。
Fc或Fc樣區(qū)可用于延長(zhǎng)與其融合的化合物的活體內(nèi)血漿半衰期。因?yàn)橛傻鞍姿馑a(chǎn)生的IgG的Fc區(qū)具有與完整IgG分子相同的活體內(nèi)半衰期且Fab片段快速降解，所以認(rèn)為用于延長(zhǎng)半衰期的相關(guān)序列駐留在CH2和/或CH3域中。另外，文獻(xiàn)中已顯示不結(jié)合高親和力Fc受體或C1q的IgG變異體的分解代謝率與親本野生型抗體的清除速率很難區(qū)分，表明分解代謝位點(diǎn)不同于參與Fc受體或C1q結(jié)合的位點(diǎn)。[Wawrzynczak等人，(1992)Molecular Immunology 29221]。使用鼠類(lèi)IgG1 Fc區(qū)的定點(diǎn)誘變研究提示，控制分解代謝率的IgG1 Fc區(qū)的位點(diǎn)位于CH2-CH3域的界面處。Fc區(qū)可在分解代謝位點(diǎn)處經(jīng)修飾以優(yōu)化融合蛋白的半衰期。用于本發(fā)明的融合蛋白的Fc區(qū)可源自IgG1或IgG4 Fc區(qū)，且可含有CH2和CH3區(qū)(包括鉸鏈區(qū))。
可產(chǎn)生包含F(xiàn)c和一個(gè)或一個(gè)以上其它分子(包括(但不限于)多肽)的嵌合分子。嵌合分子可含有Fc的特異性區(qū)或片段和其它分子。任何所述片段都可由蛋白質(zhì)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)生物化學(xué)方法來(lái)制備，或通過(guò)表達(dá)編碼所述片段的多核苷酸來(lái)制備。多肽或其片段可以包含人類(lèi)血清白蛋白(HSA)、Fc或其部分的融合蛋白形式產(chǎn)生?？赏ㄟ^(guò)融合多肽與a)免疫球蛋白的Fc部分、b)免疫球蛋白的Fc部分的類(lèi)似物以及c)免疫球蛋白的Fc部分的片段來(lái)產(chǎn)生融合物。
最近，已報(bào)導(dǎo)蛋白質(zhì)科學(xué)中的一種全新技術(shù)，其有希望克服與蛋白質(zhì)的位點(diǎn)特異性修飾相關(guān)的許多限制。具體來(lái)說(shuō)，已向原核生物大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)(例如L. Wang等人，(2001)，Science 292498-500)和真核生物釀酒酵母(Sacchromyces cerevisiae，S.cerevisiae)(例如J.Chin等人，Science 301964-7(2003)；Drabkin等人，(1996)Mol.Cell.Biol.，16907)以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Sakamoto等人，(2002)Nucleic Acids Res.304692)的蛋白質(zhì)生物合成機(jī)構(gòu)中添加新穎組件，所述組件使得能夠?qū)⒎沁z傳編碼氨基酸在活體內(nèi)并入蛋白質(zhì)中。已使用這種方法響應(yīng)琥珀密碼子TAG將多種具有新穎化學(xué)、物理或生物性質(zhì)的新穎氨基酸有效且高保真地并入大腸桿菌和酵母中的蛋白質(zhì)中，所述氨基酸包括光親和標(biāo)記(photoaffinity label)和光致異構(gòu)化氨基酸、光交聯(lián)氨基酸(例如參見(jiàn)Chin，J.W.等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9911020-11024；和Chin，J.W.等人，(2002)J.Am.Chem.Soc.1249026-9027)、酮基氨基酸、含重原子的氨基酸以及糖基化氨基酸。例如參見(jiàn)J.W.Chin等人，(2002)，Journal of the American Chemical Society 1249026-9027；J.W.Chin和P.G.Schultz，(2002)，ChemBioChem 3(11)1135-1137；J.W.Chin等人，(2002)，PNASUnited States of America 9911020-11024；以及L.Wang和P.G.Schultz，(2002)，Chem.Comm.，11-11。所有參考文獻(xiàn)都以全文引用的方式并入本文中。這些研究已證明有可能選擇性和常規(guī)地引入諸如酮基、炔基以及疊氮部分等化學(xué)官能團(tuán)，其在蛋白質(zhì)中未見(jiàn)，對(duì)20種常見(jiàn)的遺傳編碼氨基酸中可見(jiàn)的所有官能團(tuán)來(lái)說(shuō)都具有化學(xué)惰性且可用于有效地且選擇性反應(yīng)以形成穩(wěn)定共價(jià)鍵。
在蛋白質(zhì)中并入非遺傳編碼氨基酸的能力允許引入可提供天然存在的官能團(tuán)的有價(jià)值替代物的化學(xué)官能團(tuán)，諸如賴氨酸的ε-NH2、半胱氨酸的巰基-SH、組氨酸的亞氨基等。已知本文中所述的某些化學(xué)官能團(tuán)(諸如羰基、炔以及疊氮部分)對(duì)20種常見(jiàn)的遺傳編碼氨基酸中可見(jiàn)的官能團(tuán)來(lái)說(shuō)都具有惰性，但其干凈且有效地反應(yīng)以形成穩(wěn)定鍵。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供人類(lèi)血漿蛋白(human plasma protein，hPP)家族成員，包括(但不限于)充當(dāng)其它分子的運(yùn)載體的血漿蛋白。可適用于本發(fā)明的hPP包括(但不限于)下列公開(kāi)文獻(xiàn)中所列的那些蛋白質(zhì)，這些公開(kāi)文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中Anderson等人，Molecular & Cellular Proteomics，3.4311-326(2004)；和Ping等人，Proteomics，53506-3519(2005)。一些已知的hPP包括(但不限于)α1-抗胰凝乳蛋白酶、抗胰蛋白酶、α1-抗胰蛋白酶、前白蛋白、人類(lèi)白蛋白(人類(lèi)血清白蛋白)、α1-脂蛋白、A-γ球蛋白、α2-巨球蛋白、α1-微球蛋白、α2-微球蛋白、β2-微球蛋白、本-周蛋白(Bence Jones protein)、膽汁分泌組分、補(bǔ)體蛋白3、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白、脂肪酸結(jié)合蛋白、鐵蛋白、鐵蛋白H鏈、纖維蛋白原、抑胃肽(gastricinhibitory peptide)、球蛋白、結(jié)合球蛋白、血紅蛋白、血紅蛋白A、血紅蛋白A1C、血紅蛋白F、糖化血紅蛋白、盤(pán)狀血紅蛋白(pan hemoglobin)、乳鐵蛋白、脂肪酶、溶菌酶、mutY、肌紅蛋白、心臟肌紅蛋白、血清類(lèi)粘蛋白(orosmucoid)、類(lèi)風(fēng)濕因子、胰泌素(secretin)、血清素(serotonin)、甲狀腺球蛋白、甲狀腺素、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine)、轉(zhuǎn)移蛋白(transferring)、維生素D結(jié)合蛋白以及其包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的變異體形式。本發(fā)明還提供包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的人類(lèi)Fc(hFc)。
在一些實(shí)施例中，hPP或hFc包含一個(gè)或一個(gè)以上翻譯后修飾。在一些實(shí)施例中，hPP或hFc與連接子、聚合物或生物活性分子連接。在一些實(shí)施例中，hPP或hFc與雙功能或多功能聚合物、雙功能或多功能連接子或至少一個(gè)其它生物活性分子連接。
在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。在一些實(shí)施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸經(jīng)由連接子與水溶性聚合物連接，或直接與水溶性聚合物鍵結(jié)。在一些實(shí)施例中，聚(乙二醇)分子是雙功能或多功能聚合物。在一些實(shí)施例中，雙功能或多功能聚合物與第二多肽連接。在一些實(shí)施例中，第二多肽是生物活性分子。
在一些實(shí)施例中，hPP或hFc包含至少兩個(gè)與水溶性聚合物、連接子或生物活性分子連接的氨基酸。在一些實(shí)施例中，至少一個(gè)氨基酸是非天然編碼氨基酸。
在一些實(shí)施例中，包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的hPP是人類(lèi)白蛋白(hA)，其在所屬領(lǐng)域中也稱(chēng)為人類(lèi)血清白蛋白。hA可在多肽序列的582個(gè)位置中的一個(gè)或一個(gè)以上位置處經(jīng)一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸取代，包括(但不限于)下列位置中的一個(gè)或一個(gè)以上位置位置1(即，在N-末端)之前、17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、574、581以及位置582(即，在蛋白質(zhì)的羧基末端)之后(SEQ ID NO1)。
hFc可在多肽序列的一個(gè)或一個(gè)以上位置處經(jīng)一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸取代，包括(但不限于)位置1(即，在N-末端)之前和N-末端(SEQ ID NO22)。
在一些實(shí)施例中，hPP或hFc包含調(diào)節(jié)hPP或hFc對(duì)hPP或hFc受體或結(jié)合搭配物的親和力的取代、添加或缺失，所述搭配物包括(但不限于)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類(lèi)、多肽、小分子或核酸。在一些實(shí)施例中，hPP或hFc包含當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)hPP或hFc的穩(wěn)定性相比時(shí)增加hPP或hFc的穩(wěn)定性的取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，hPP或hFc包含當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)hPP或hFc的免疫原性相比時(shí)調(diào)節(jié)hPP或hFc的免疫原性的取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，hPP或hFc包含當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)hPP或hFc的血清半衰期或循環(huán)時(shí)間相比時(shí)調(diào)節(jié)hPP或hFc的血清半衰期或循環(huán)時(shí)間的取代、添加或缺失。
在一些實(shí)施例中，hPP或hFc包含當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)hPP或hFc的水溶性相比時(shí)增加hPP或hFc的水溶性的取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，hPP或hFc包含當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)hPP或hFc的溶解性相比時(shí)增加宿主細(xì)胞中所產(chǎn)生的hPP或hFc的溶解性的取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，hPP或hFc包含當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)hPP或hFc的表達(dá)或合成相比時(shí)增加hPP或hFc在宿主細(xì)胞中的表達(dá)或增加hPP或hFc的活體外合成的取代、添加或缺失。包含這種取代的hPP或hFc保留激動(dòng)活性且保留或提高宿主細(xì)胞中的表達(dá)水平。在一些實(shí)施例中，hPP或hFc包含當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)hPP或hFc的蛋白酶抗性相比時(shí)增加hPP或hFc的蛋白酶抗性的取代、添加或缺失。
在一些實(shí)施例中，hPP或hFc中的氨基酸取代可為經(jīng)天然存在或非天然存在的氨基酸取代，只要至少一個(gè)取代是經(jīng)非天然編碼氨基酸取代即可。
在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包含羰基、乙?；毖趸?、肼基、酰肼基、氨基脲基(semicarbazide group)、疊氮基、炔基、苯胺氨基或糖部分。
在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包含羰基。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸具有如下結(jié)構(gòu)
其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基或經(jīng)取代芳基；R2為H、烷基、芳基、經(jīng)取代烷基以及經(jīng)取代芳基；且R3為H、氨基酸、多肽或氨基末端修飾基團(tuán)；且R4為H、氨基酸、多肽或羧基末端修飾基團(tuán)。
在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包含氨氧基。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包含酰肼基。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包含肼基。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸殘基包含氨基脲基。
在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸殘基包含疊氮基。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸具有如下結(jié)構(gòu)
其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基、經(jīng)取代芳基或不存在；X為O、N、S或不存在；m為0-10；R2為H、氨基酸、多肽或氨基末端修飾基團(tuán)；且R3為H、氨基酸、多肽或羧基末端修飾基團(tuán)。
在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包含炔基。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸具有如下結(jié)構(gòu)
其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基或經(jīng)取代芳基；X為O、N、S或不存在；m為0-10；R2為H、氨基酸、多肽或氨基末端修飾基團(tuán)；且R3為H、氨基酸、多肽或羧基末端修飾基團(tuán)。
本發(fā)明還提供包含在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO2、20或23雜交的多核苷酸的分離核酸，其中多核苷酸包含至少一個(gè)選擇密碼子。在一些實(shí)施例中，選擇密碼子是選自由琥珀密碼子、赭石密碼子、蛋白石密碼子(opal codon)、獨(dú)特密碼子、稀有密碼子、五個(gè)堿基的密碼子以及四個(gè)堿基的密碼子組成的群組。
本發(fā)明還提供制備與水溶性聚合物連接的hPP或hFc的方法。在一些實(shí)施例中，所述方法包含使包含非天然編碼氨基酸的分離hPP與包含與所述非天然編碼氨基酸反應(yīng)的部分的水溶性聚合物接觸。在一些實(shí)施例中，并入hPP或hFc中的非天然編碼氨基酸反而可與不與20種常見(jiàn)氨基酸中的任一種反應(yīng)的水溶性聚合物反應(yīng)。在一些實(shí)施例中，并入hPP或hFc中的非天然編碼氨基酸反而可與不與20種常見(jiàn)氨基酸中的任一種反應(yīng)的連接子、聚合物或生物活性分子反應(yīng)。
在一些實(shí)施例中，通過(guò)使包含含羰基的氨基酸的hPP或hFc與包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的聚(乙二醇)分子反應(yīng)來(lái)制備與水溶性聚合物連接的hPP或hFc。在一些實(shí)施例中，氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基通過(guò)酰胺鍵與聚(乙二醇)分子連接。
在一些實(shí)施例中，通過(guò)使包含羰基的聚(乙二醇)分子與包含包括氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的非天然編碼氨基酸的多肽反應(yīng)來(lái)制備與水溶性聚合物連接的hPP或hFc。
在一些實(shí)施例中，通過(guò)使包含含炔基的氨基酸的hPP或hFc與包含疊氮部分的聚(乙二醇)分子反應(yīng)來(lái)制備與水溶性聚合物連接的hPP或hFc。在一些實(shí)施例中，疊氮基或炔基通過(guò)酰胺鍵與聚(乙二醇)分子連接。
在一些實(shí)施例中，通過(guò)使包含含疊氮基的氨基酸的hPP或hFc與包含炔部分的聚(乙二醇)分子反應(yīng)來(lái)制備與水溶性聚合物連接的hPP或hFc。在一些實(shí)施例中，疊氮基或炔基通過(guò)酰胺鍵與聚(乙二醇)分子連接。
在一些實(shí)施例中，聚(乙二醇)分子具有約0.1kDa與約100kDa之間的分子量。在一些實(shí)施例中，聚(乙二醇)分子具有0.1kDa與50kDa之間的分子量。
在一些實(shí)施例中，聚(乙二醇)分子為支化聚合物。在一些實(shí)施例中，聚(乙二醇)支化聚合物的各分支具有1kDa與100kDa之間或1kDa與50kDa之間的分子量。
在一些實(shí)施例中，與hPP連接的水溶性聚合物包含聚烷二醇部分。在一些實(shí)施例中，并入hPP或hFc中的非天然編碼氨基酸殘基包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、疊氮基或炔基。在一些實(shí)施例中，并入hPP或hFc中的非天然編碼氨基酸殘基包含羰基部分，且水溶性聚合物包含氨氧基、酰肼、肼或氨基脲部分。在一些實(shí)施例中，并入hPP或hFc中的非天然編碼氨基酸殘基包含炔部分，且水溶性聚合物包含疊氮部分。在一些實(shí)施例中，并入hPP或hFc中的非天然編碼氨基酸殘基包含疊氮部分，且水溶性聚合物包含炔部分。
本發(fā)明還提供包含包括非天然編碼氨基酸的hPP或hFc和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑的組合物。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。
本發(fā)明還提供包含包括選擇密碼子的編碼hPP或hFc的多核苷酸的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞包含用于將非天然編碼氨基酸取代到hPP或hFc中的正交RNA合成酶和/或正交tRNA。
本發(fā)明還提供制備包含非天然編碼氨基酸的hPP或hFc的方法。在一些實(shí)施例中，所述方法包含在允許表達(dá)hPP或hFc的條件下培養(yǎng)包含編碼hPP或hFc的一種或一種以上多核苷酸、正交RNA合成酶和/或正交tRNA的細(xì)胞；和從細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中純化hPP或hFc。
本發(fā)明還提供增加hPP或hFc的治療半衰期、血清半衰期或循環(huán)時(shí)間的方法。本發(fā)明還提供調(diào)節(jié)hPP或hFc的免疫原性的方法。在一些實(shí)施例中，所述方法包含用非天然編碼氨基酸取代天然存在的hPP或hFc中的任何一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸和/或使hPP或hFc與連接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子連接。
本發(fā)明還提供用有效量的本發(fā)明的hPP或hFc分子治療需要所述治療的患者的方法。在一些實(shí)施例中，所述方法包含向患者給予治療有效量的包含包括非天然編碼氨基酸的hPP或hFc和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑的醫(yī)藥組合物。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。
本發(fā)明還提供包含SEQ ID NO1中所示的氨基酸序列或其中至少一個(gè)氨基酸經(jīng)非天然編碼氨基酸取代的任何其它hPP多肽序列的hPP。本發(fā)明還提供包含SEQ IDNO22中所示的氨基酸序列或其中至少一個(gè)氨基酸經(jīng)非天然編碼氨基酸取代的任何其它hFc多肽序列的hFc。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。在一些實(shí)施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、疊氮基或炔基。
本發(fā)明還提供包含醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑和包含SEQ ID NO1中所示的序列或其中至少一個(gè)氨基酸經(jīng)非天然編碼氨基酸取代的任何其它hPP多肽序列的hPP的醫(yī)藥組合物。本發(fā)明還提供包含醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑和包含SEQ ID NO22中所示的序列或其中至少一個(gè)氨基酸經(jīng)非天然編碼氨基酸取代的任何其它hFc多肽序列的hPP的醫(yī)藥組合物。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包含糖部分。在一些實(shí)施例中，水溶性聚合物經(jīng)由糖部分與多肽連接。在一些實(shí)施例中，連接子、聚合物或生物活性分子經(jīng)由糖部分與hPP或hFc連接。
本發(fā)明還提供包含在單個(gè)氨基酸處經(jīng)由共價(jià)鍵與hPP或hFc連接的水溶性聚合物的hPP或hFc。在一些實(shí)施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些實(shí)施例中，與水溶性聚合物共價(jià)連接的氨基酸是多肽中存在的非天然編碼氨基酸。
本發(fā)明提供包含至少一個(gè)連接子、聚合物或生物活性分子的hPP或hFc，其中所述連接子、聚合物或生物活性分子通過(guò)經(jīng)由核糖體并入多肽中的非天然編碼氨基酸的官能團(tuán)與多肽連接。在一些實(shí)施例中，多肽是經(jīng)單聚乙二醇化。本發(fā)明還提供包含與一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸連接的連接子、聚合物或生物活性分子的hPP或hFc，其中所述非天然編碼氨基酸在預(yù)選定位點(diǎn)處經(jīng)由核糖體并入多肽中。
在另一實(shí)施例中，包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然存在的氨基酸的hPP或hFc與包括(但不限于)PEG的另一分子的結(jié)合歸因于與非天然氨基酸的結(jié)合所利用的獨(dú)特化學(xué)反應(yīng)而提供實(shí)質(zhì)上純的hPP或hFc。在另一實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入hPP或hFc的氨基酸序列中提供以下優(yōu)勢(shì)利用非天然編碼氨基酸的官能團(tuán)來(lái)純化hPP或hFc。包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的hPP或hFc與諸如PEG等另一分子的結(jié)合可與在結(jié)合步驟之前或之后執(zhí)行以提供實(shí)質(zhì)上純的hPP或hFc的其它純化技術(shù)一起執(zhí)行。在另一實(shí)施例中，將非天然編碼氨基酸取代到hPP或hFc的氨基酸序列中可調(diào)節(jié)多肽的pKa，多肽的pKa又調(diào)節(jié)hPP或hFc與其它分子結(jié)合時(shí)的結(jié)合反應(yīng)條件、速率或效率。在一些實(shí)施例中，包含非天然編碼氨基酸的hPP或hFc在與結(jié)合搭配物接觸時(shí)展現(xiàn)經(jīng)調(diào)節(jié)的結(jié)合特征，諸如增加或減小的結(jié)合強(qiáng)度。在一些實(shí)施例中，包含非天然編碼氨基酸的hPP或hFc在與缺乏所述非天然編碼氨基酸的相同hPP或hFc相比時(shí)展現(xiàn)經(jīng)調(diào)節(jié)的組織結(jié)合或組織分布特征。在一些實(shí)施例中，包含非天然編碼氨基酸的hPP或hFc在經(jīng)調(diào)配以用于醫(yī)藥用途時(shí)具有經(jīng)調(diào)節(jié)的穩(wěn)定性質(zhì)。



圖1A和1B1A中表示成熟人類(lèi)白蛋白的氨基酸序列，且1B中表示編碼人類(lèi)白蛋白的核苷酸序列。
圖2表示hA氨基酸的平均Cx值。
圖3表示hA的模型和某些氨基酸位置。
圖4表示hA中用于經(jīng)非天然編碼氨基酸取代的選定氨基酸位置的表。
圖5由考馬斯藍(lán)(coomassie)染色的聚丙烯酰胺凝膠電泳表示酵母宿主細(xì)胞中重組人類(lèi)白蛋白的表達(dá)。
圖6由考馬斯藍(lán)染色的聚丙烯酰胺凝膠電泳表示多肽序列中含有非天然編碼氨基酸的hA的表達(dá)。
圖7的A圖通過(guò)SDS-PAGE分析在存在(+)或不存在(-)5K氨氧基聚(乙二醇)(PEG)的情況下培育的純Fc(WT)和D1pAF取代的Fc(D1pAF)的還原樣品。
圖7的B圖通過(guò)SDS-PAGE分析在存在(+)或不存在(-)5K氨氧基聚(乙二醇)(PEG)的情況下培育的純Fc(WT)和D1pAF取代的Fc(D1pAF)的非還原樣品。
圖8A表示野生型Fc的多核苷酸序列。
圖8B表示野生型Fc的多肽序列。
圖8C表示成熟Fc的多肽序列。
圖8D表示編碼成熟Fc的多核苷酸序列。
圖9A表示tRNA的多核苷酸序列。
圖9B表示編碼氨?；鵷RNA合成酶的多核苷酸序列。
圖10A表示考馬斯藍(lán)染色的聚丙烯酰膠凝膠中將非天然氨基酸并入hA中。
圖10B表示W(wǎng)estern印跡法中將非天然氨基酸并入hA中。
圖10C表示W(wǎng)estern印跡法中將非天然氨基酸并入hA中。
圖10C表示W(wǎng)estern印跡法中將非天然氨基酸并入hA中。
圖11由Western印跡法表示聚乙二醇化hA的產(chǎn)生。
圖12的A圖和圖12的B圖分別表示包含非天然氨基酸的hA和野生型hA的肽圖結(jié)果。
圖13A表示包含非天然氨基酸(pAF或?qū)σ阴；奖彼?的hA的質(zhì)譜結(jié)果。
圖13B表示包含非天然氨基酸pAF(對(duì)乙?；奖彼?的hA的氨基酸的預(yù)測(cè)離子質(zhì)量。

具體實(shí)施例方式 定義 應(yīng)了解本發(fā)明不受本文中所述的特定方法、方案、細(xì)胞系、構(gòu)筑體和試劑限制，且因此可變化。還應(yīng)了解，本文中所使用的術(shù)語(yǔ)只是出于描述特定實(shí)施例的目的，并且不打算限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍將僅受隨附權(quán)利要求書(shū)限制。
除非上下文另作明確指示，否則如本文和隨附權(quán)利要求中所使用，單數(shù)形式“一”和“所述”包括多個(gè)指示物。因此，例如提及一“hPP”或“hA”或“hFc”是提及一個(gè)或一個(gè)以上所述蛋白質(zhì)且包括所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的其等效物，等等。
除非另作定義，否則本文中所使用的所有科技術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員通常所理解的含義相同的含義。雖然可將與本文中所述的方法、裝置和材料類(lèi)似或等價(jià)的任何方法、裝置和材料用于本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中，但現(xiàn)僅對(duì)優(yōu)選方法、裝置和材料加以描述。
本文中所提及的所有公開(kāi)文獻(xiàn)和專(zhuān)利都是以引用的方式并入本文中，以達(dá)到描述和公開(kāi)例如所述公開(kāi)文獻(xiàn)中所述的可能與當(dāng)前所述的發(fā)明結(jié)合使用的構(gòu)筑體和方法的目的。本文中所討論的公開(kāi)文獻(xiàn)僅提供本申請(qǐng)文件的申請(qǐng)日期之前的公開(kāi)內(nèi)容。本文決不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明的發(fā)明者無(wú)權(quán)由于現(xiàn)有發(fā)明或任何其它原因使所述公開(kāi)案的日期提前。
術(shù)語(yǔ)“實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化”在重組產(chǎn)生的“hPP”或“hA”或“hFc”多肽的情況下是指可實(shí)質(zhì)上或基本上不含通常伴隨天然存在的環(huán)境(即，天然細(xì)胞或宿主細(xì)胞)中可見(jiàn)的蛋白質(zhì)或與所述蛋白質(zhì)相互作用的組分的“hPP”或“hA”或hFc多肽?？蓪?shí)質(zhì)上不含細(xì)胞材料的“hPP”或“hA”或“hFc”多肽包括具有小于約30％、小于約25％、小于約20％、小于約15％、小于約10％、小于約5％、小于約4％、小于約3％、小于約2％或小于約1％(以干重計(jì))的污染蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)制劑。當(dāng)“hPP”或“hA”或“hFc”多肽或其變異體是通過(guò)宿主細(xì)胞重組產(chǎn)生時(shí)，蛋白質(zhì)可以細(xì)胞干重的約30％、約25％、約20％、約15％、約10％、約5％、約4％、約3％、約2％或約1％或不足1％存在。當(dāng)“hPP”或“hA”或“hFc”多肽或其變異體是通過(guò)宿主細(xì)胞重組產(chǎn)生時(shí)，蛋白質(zhì)可以細(xì)胞干重的約5g/L、約4g/L、約3g/L、約2g/L、約1g/L、約750mg/L、約500mg/L、約250mg/L、約100mg/L、約50mg/L、約10mg/L或約1mg/L或不足1mg/L存在于培養(yǎng)基中。因此，如通過(guò)諸如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛細(xì)管電泳等適當(dāng)方法所測(cè)定，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的“實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化”的“hPP”或“hA”或“hFc”多肽可具有至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％的純度水平，具體來(lái)說(shuō)，至少約75％、80％、85％的純度水平，且更具體來(lái)說(shuō)，至少約90％的純度水平、至少約95％的純度水平、至少約99％的純度水平或更高純度水平。
“重組宿主細(xì)胞”或“宿主細(xì)胞”是指包括外源多核苷酸的細(xì)胞，而不考慮用于插入(例如直接攝取、轉(zhuǎn)導(dǎo)、f配對(duì))的方法或所屬領(lǐng)域中已知的產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞的其它方法。所述外源多核苷酸可維持非整合載體形式(例如質(zhì)粒)，或可整合到宿主基因組中。
如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)基”包括任何培養(yǎng)基、溶液、固體、半固體或剛性支撐物，其可支撐或含有任何宿主細(xì)胞，包括細(xì)菌宿主細(xì)胞、酵母宿主細(xì)胞、昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞、植物宿主細(xì)胞、真核生物宿主細(xì)胞、哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞、CHO細(xì)胞、原核生物宿主細(xì)胞、大腸桿菌或假單胞菌(Pseudomonas)宿主細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)容物。因此，所述術(shù)語(yǔ)可涵蓋已生長(zhǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基，例如已分泌有“hPP”或“hA”或“hFc”多肽的培養(yǎng)基，包括增殖步驟之前或之后的培養(yǎng)基。諸如在“hPP”或“hA”或“hFc”多肽在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生且宿主細(xì)胞已溶解或受到破壞以釋放“hPP”或“hA”或“hFc”多肽的情況下，所述術(shù)語(yǔ)還可涵蓋含有宿主細(xì)胞溶解產(chǎn)物的緩沖劑或試劑。
如本文中所使用，“還原劑”就蛋白質(zhì)再折疊來(lái)說(shuō)是定義為維持巰基處于還原狀態(tài)且還原分子內(nèi)或分子間雙硫鍵的任何化合物或物質(zhì)。合適的還原劑包括(但不限于)二硫蘇糖醇(DTT)、2-巰基乙醇、二硫赤蘚醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和還原型谷胱甘肽。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)，多種還原劑適用于本發(fā)明的方法和組合物中。
如本文中所使用，“氧化劑”就蛋白質(zhì)再折疊來(lái)說(shuō)是定義為能夠從正在經(jīng)氧化的化合物中移除電子的任何化合物或物質(zhì)。合適的氧化劑包括(但不限于)氧化型谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化型二硫蘇糖醇、氧化型赤蘚醇和氧。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)，多種氧化劑適用于本發(fā)明的方法中。
如本文中所使用，“變性劑”是定義為將引起蛋白質(zhì)可逆展開(kāi)的任何化合物或物質(zhì)。變性劑的強(qiáng)度將由特定變性劑的性質(zhì)和濃度來(lái)決定。合適的變性劑可為離液劑、清潔劑、有機(jī)溶劑、水溶性溶劑、磷脂或兩種或兩種以上所述試劑的組合。合適的離液劑包括(但不限于)脲、胍和硫氰酸鈉。適用的清潔劑可包括(但不限于)強(qiáng)清潔劑(諸如十二烷基硫酸鈉)或聚氧乙烯醚(例如，Tween或Triton清潔劑)、月桂酰肌氨酸鈉(Sarkosyl)、溫和的非離子清潔劑(例如，毛地黃皂苷(digitonin))、溫和的陽(yáng)離子清潔劑(諸如，N->2，3-(二油基氧基)-丙基-N，N，N-三甲基銨)、溫和的離子清潔劑(例如，膽酸鈉或去氧膽酸鈉)或兩性離子清潔劑(包括(但不限于)硫代甜菜堿(兩性離子清潔劑(Zwittergent))、3-(3-膽酰胺基丙基)二甲氨基-1-丙烷硫酸鹽(CHAPS)和3-(3-膽酰胺基丙基)二甲氨基-2-羥基-1-丙烷磺酸鹽(CHAPSO))。諸如乙腈、低碳烷醇(尤其諸如乙醇或異丙醇等C2-C4烷醇)或低碳烷二醇(尤其諸如乙二醇等C2-C4烷二醇)等水溶性有機(jī)溶劑可用作變性劑。適用于本發(fā)明的磷脂可為天然存在的磷脂，諸如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰肌醇；或合成磷脂衍生物或變異體，諸如二己酰基磷脂酰膽堿或二庚?；字Ｄ憠A。
如本文中所使用，“再折疊”就二硫鍵來(lái)說(shuō)描述將含有二硫鍵的多肽從不適當(dāng)折疊或展開(kāi)狀態(tài)轉(zhuǎn)化成天然或適當(dāng)折疊的構(gòu)象的任何過(guò)程、反應(yīng)或方法。
如本文中所使用，“共折疊”尤其是指使用至少兩個(gè)多肽的再折疊過(guò)程、反應(yīng)或方法，所述多肽彼此相互作用且導(dǎo)致展開(kāi)或不適當(dāng)折疊的多肽轉(zhuǎn)化為天然、適當(dāng)折疊的多肽。
如本文中所使用，“人類(lèi)血漿蛋白或多肽”或“hPP”包括正常人類(lèi)血漿中可見(jiàn)的那些多肽和蛋白質(zhì)，包括hPP類(lèi)似物、hPP同種型、hPP模擬物、hPP片段、雜交hPP蛋白、其融合蛋白、寡聚物和多聚物、同源物、糖基化模式變異體、變異體、剪接變異體以及突變蛋白，而不考慮以上各物的生物活性且更不考慮其合成或制造方法，所述方法包括(但不限于)重組(由cDNA、基因組DNA、合成DNA或核酸的其它形式制備)、活體外、活體內(nèi)、微注射核酸分子、合成、轉(zhuǎn)基因?qū)W以及基因激活方法。所屬領(lǐng)域中已知多種hPP且其可見(jiàn)于Anderson等人，Molecular&CellularProteomics，3.4311-326(2004)和Ping等人，Proteomics，53506-3519(2005)中，所述參考文獻(xiàn)以引用的方式并入本文中。適用于本發(fā)明的hPP可包括(但不限于)α1-抗胰凝乳蛋白酶、抗胰蛋白酶、α1-抗胰蛋白酶、前白蛋白、人類(lèi)白蛋白(人類(lèi)血清白蛋白)、α1-脂蛋白、A-γ球蛋白、α2-巨球蛋白、α1-微球蛋白、α2-微球蛋白、β2-微球蛋白、本-周蛋白、膽汁分泌組分、補(bǔ)體蛋白3、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白、脂肪酸結(jié)合蛋白、鐵蛋白、鐵蛋白H鏈、纖維蛋白原、抑胃肽、球蛋白、結(jié)合球蛋白、血紅蛋白、血紅蛋白A、血紅蛋白A1C、血紅蛋白F、糖化血紅蛋白、盤(pán)狀血紅蛋白、乳鐵蛋白、脂肪酶、溶菌酶、mutY、肌紅蛋白、心臟肌紅蛋白、血清類(lèi)粘蛋白、類(lèi)風(fēng)濕因子、胰泌素、血清素、甲狀腺球蛋白、甲狀腺素、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、三碘甲狀腺原氨酸、轉(zhuǎn)移蛋白、維生素D結(jié)合蛋白以及其變異體形式。
如本文中所使用，“白蛋白”總起來(lái)說(shuō)是指白蛋白蛋白質(zhì)或氨基酸序列，或具有白蛋白的一種或一種以上功能活性(例如生物活性)的白蛋白片段或變異體。具體來(lái)說(shuō)，“白蛋白”是指人類(lèi)白蛋白(“hA”)或其片段，尤其如SEQ ID NO1中所示的人類(lèi)白蛋白的成熟形式或來(lái)自諸如牛、豬、馬、犬、貓或鳥(niǎo)類(lèi)等其它脊椎動(dòng)物的白蛋白或其片段，或這些分子或其片段的類(lèi)似物或變異體。hA的氨基酸序列和核苷酸序列在所屬領(lǐng)域中為已知的且公開(kāi)于例如美國(guó)專(zhuān)利第5,879,907號(hào)、第5,756,313號(hào)、第5,707,828號(hào)、第5,986,062號(hào)、第5,521,287號(hào)、第5,612,197號(hào)、第5,440,-18號(hào)、第5,759,819號(hào)以及第5,648,243號(hào)中，所述專(zhuān)利以引用的方式并入本文中。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明中所使用的人類(lèi)血清白蛋白蛋白質(zhì)含有下列各組參考SEQ ID NO1的點(diǎn)突變中的一組或兩組Leu-407突變?yōu)锳la、Leu-408突變?yōu)閂al、Val-409突變?yōu)锳la以及Arg-410突變?yōu)锳la；或Arg-410突變?yōu)锳la、Lys-413突變?yōu)镚1n以及Lys-414突變?yōu)镚1n(例如參見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)文獻(xiàn)第WO95/23857號(hào)，其以全文引用的方式并入本文中)。在其它實(shí)施例中，含有上述各組點(diǎn)突變中的一組或兩組的本發(fā)明的白蛋白融合蛋白具有改進(jìn)的針對(duì)酵母Yap3p蛋白水解裂解的穩(wěn)定性/抗性，從而使得在酵母宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組白蛋白融合蛋白的產(chǎn)生增加。
如本文中所使用，足以延長(zhǎng)治療產(chǎn)品的治療活性、循環(huán)時(shí)間或保存期的hA的部分是指長(zhǎng)度或結(jié)構(gòu)方面足以使蛋白質(zhì)的治療活性穩(wěn)定或延長(zhǎng)的hA的部分。蛋白質(zhì)的白蛋白部分可包含如本文中所述的hA序列的全長(zhǎng)，或可包括其一個(gè)或一個(gè)以上能夠提供所需活性的片段。所述hA片段可為10個(gè)或10個(gè)以上氨基酸長(zhǎng)，或可包括約15、20、25、30、50、100或100個(gè)以上來(lái)自hA序列的相鄰氨基酸，或可包括hA的部分或所有特異性域。舉例來(lái)說(shuō)，可使用一個(gè)或一個(gè)以上橫跨頭兩個(gè)免疫球蛋白樣域的hA的片段。hA的截短形式的實(shí)例可見(jiàn)于美國(guó)專(zhuān)利第5,380,712號(hào)，其以引用的方式并入本文中。
本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可為正常hA的變異體。本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療蛋白部分也可為如本文中所述的治療蛋白的變異體。術(shù)語(yǔ)“變異體”包括保守性或非保守性插入、缺失和取代，其中所述變化并不會(huì)實(shí)質(zhì)上改變白蛋白的腫脹、有效配位體結(jié)合和非免疫原性質(zhì)或活性位點(diǎn)或賦予治療蛋白的治療活性的有效域中的一個(gè)或一個(gè)以上。
具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的hA蛋白可包括hA的天然存在的多晶型變異體和hA的片段，例如EP 322 094中所公開(kāi)的那些片段。白蛋白可源自任何脊椎動(dòng)物，尤其任何哺乳動(dòng)物，例如人類(lèi)、母牛、綿羊或豬。非哺乳動(dòng)物白蛋白包括(但不限于)母雞和鮭魚(yú)。白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可來(lái)自與可與hA偶合的分子不同的動(dòng)物。hA片段或變異體也可用于本發(fā)明中。hA變異體可由hA的至少一個(gè)完全結(jié)構(gòu)域組成或包含hA的至少一個(gè)完全結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域例如域1(SEQ ID NO1的氨基酸1-194)、2(SEQ ID NO1的氨基酸195-387)、3(SEQ ID NO1的氨基酸388-585)、1/2(SEQ ID NO1的氨基酸1-387)、2/3(SEQ ID NO1的氨基酸195-585)或1/3(SEQ ID NO1的氨基酸1-194和SEQ ID NO1的氨基酸388-585)。各域自身是由兩個(gè)同源子域(即1-105、120-194、195-291、316-387、388-491和512-585)和包含殘基Lysl06到Glu 119、Glu292到Val315和Glu492到Ala511的柔性子域間連接區(qū)構(gòu)成。本發(fā)明的hA蛋白的hA部分優(yōu)選包含hA的至少一個(gè)子域或域，或其保守性修飾。如果hA是基于子域，那么優(yōu)選將部分或所有相鄰連接子用于連接諸如連接子、聚合物或生物活性分子等另一分子。
關(guān)于完全全長(zhǎng)的天然存在的hA氨基酸序列，參見(jiàn)本文中的SEQ ID NO1。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的hA多肽與SEQ ID NO1實(shí)質(zhì)上一致。關(guān)于編碼hA的完全核酸序列，參見(jiàn)本文中的SEQ ID NO2。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的hA多肽是由與SEQ ID NO2實(shí)質(zhì)上一致的核酸序列編碼。
術(shù)語(yǔ)“hA”還包括天然存在的hA的醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽和前藥和所述鹽的前藥、多晶型物、水合物、溶劑合物、生物活性片段、生物活性變異體和立體異構(gòu)體，以及天然存在的hA的激動(dòng)劑、模擬物和拮抗劑變異體，以及其多肽融合物。術(shù)語(yǔ)“hA多肽”涵蓋在氨基末端、羧基末端或兩者處包含其它氨基酸的融合物。
抗體是對(duì)特定抗原展現(xiàn)結(jié)合特異性的蛋白質(zhì)?！疤烊豢贵w”通常為包括兩個(gè)相同輕(L)鏈及兩個(gè)相同重(H)鏈的約150,000道爾頓的異源四聚糖蛋白。各輕鏈經(jīng)由一個(gè)共價(jià)雙硫鍵與重鏈連接，而雙硫鍵的數(shù)目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間有所不同。各重鏈和輕鏈也具有規(guī)則間隔開(kāi)的鏈內(nèi)雙硫橋鍵。各重鏈在一端具有可變域(VH)，后面是若干恒定域。各輕鏈在一端具有可變域(VL)且在另一端具有恒定域；輕鏈的恒定域與重鏈的第一恒定域?qū)?zhǔn)，且輕鏈可變域與重鏈的可變域?qū)?zhǔn)。認(rèn)為特定氨基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面。
術(shù)語(yǔ)“可變”是指可變域的某些部分的序列在抗體間廣泛不同且產(chǎn)生各特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合特異性的事實(shí)。然而，可變性在整個(gè)抗體的可變域中并未均勻分布。其集中在輕鏈與重鏈可變域中的三個(gè)稱(chēng)為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的區(qū)段中。可變域的更高保守部分稱(chēng)為構(gòu)架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個(gè)經(jīng)由三個(gè)或四個(gè)CDR連接的主要采用β-折疊構(gòu)象的FR區(qū)，所述CDR形成環(huán)連接，且在一些情況下形成β-折疊結(jié)構(gòu)的部分。各鏈中的CDR通過(guò)FR區(qū)緊密地結(jié)合在一起，且與來(lái)自另一鏈的CDR一起促使形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見(jiàn)Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。
雖然恒定域并未直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)各種效應(yīng)功能。視重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列而定，可將抗體或免疫球蛋白指定為不同種類(lèi)。存在五個(gè)主要種類(lèi)的免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM且這些種類(lèi)中的多者可進(jìn)一步分為亞類(lèi)(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；IgA1和IgA2。對(duì)應(yīng)于免疫球蛋白的不同種類(lèi)的重鏈恒定區(qū)分別稱(chēng)為α、δ、ε、γ以及μ。在各人類(lèi)免疫球蛋白種類(lèi)中，僅已知人類(lèi)IgG1、IgG2、IgG3和IgM激活補(bǔ)體。
抗體的親和力成熟在活體內(nèi)是由主要通過(guò)體細(xì)胞超誘變(hypermutagenesis)制得的更高親和力的抗體變異體的抗原選擇來(lái)驅(qū)動(dòng)。通常也發(fā)生“譜系轉(zhuǎn)換(repertoireshift)”，其中可見(jiàn)二次或三次反應(yīng)的主要生殖系基因與初次或二次反應(yīng)的所述基因不同。
可通過(guò)活體外在抗體基因中引入突變且使用親和力選擇來(lái)分離具有改進(jìn)親和力的突變體來(lái)復(fù)制免疫系統(tǒng)的親和力成熟過(guò)程。所述突變抗體可呈現(xiàn)于絲狀噬菌體或諸如酵母等微生物的表面上，且可通過(guò)對(duì)抗原的親和力或通過(guò)從抗原解離的動(dòng)力學(xué)(解離速率(off-rate))選擇抗體。Hawkins等人，J.Mol.Biol.226889-896(1992)。已使用CDR模糊誘變(walking mutagenesis)來(lái)使結(jié)合1型人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV-1)的人類(lèi)包膜糖蛋白gpl20的人類(lèi)抗體(Barbas III等人，PNAS(USA)913809-3813(1994)；和Yang等人，J.Mol.Biol.254392-403(1995))和抗-c-erbB-2單鏈Fv片段(Schier等人，J.Mol.Biol.263551567(1996))親和力成熟。已使用抗體鏈改組和CDR誘變來(lái)使針對(duì)HIV的第三高變環(huán)的高親和力人類(lèi)抗體(Thompson等人，J.Mol.Biol.25677-88(1996))親和力成熟。Balint和Larrick Gene 137109-118(1993)描述計(jì)算機(jī)輔助的寡脫氧核糖核苷酸導(dǎo)向的掃描誘變，由此同時(shí)且全面地搜索可變區(qū)基因的所有CDR的改進(jìn)變異體。使用最初的受限制的誘變策略使αvβ3特異性人類(lèi)化抗體親和力成熟，在所述策略中使所有六個(gè)CDR的每個(gè)位置都突變，接著表達(dá)和篩選包括最高親和力突變體的組合文庫(kù)(Wu等人，PNAS(USA)956037-6-42(1998))。噬菌體呈現(xiàn)抗體是綜述于Chiswell和McCafferty TIBTECH 1080-84(1992)以及Rader和Barbas III Current Opinion in Biotech.8503-508(1997)中。上述參考文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)，在具有提高的親和力的突變抗體與親本抗體相比的各情況下，突變抗體在CDR中具有氨基酸取代。
“親和力成熟”在本文中意思是增加抗體對(duì)其抗原的親和力的方法。親和力成熟的方法包括(但不限于)計(jì)算機(jī)篩選法和實(shí)驗(yàn)法。
“抗體”在本文中意思是由一個(gè)或一個(gè)以上實(shí)質(zhì)上由所有或部分抗體基因編碼的多肽組成的蛋白質(zhì)。免疫球蛋白基因包括(但不限于)κ、λ、α、γ(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、δ、ε和μ恒定區(qū)基因以及多個(gè)免疫球蛋白可變區(qū)基因。本文中的抗體打算包括全長(zhǎng)抗體和抗體片段，且包括天然存在于任何生物體中或經(jīng)工程化(例如，為變異體)的抗體。
“抗體片段”意思是除全長(zhǎng)形式以外的抗體的任何形式。本文中的抗體片段包括為存在于全長(zhǎng)抗體內(nèi)的較小組分的抗體和已經(jīng)工程化的抗體。抗體片段包括(但不限于)Fv、Fc、Fab和(Fab′)2、單鏈Fv(scFv)、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、雙功能雜交抗體、CDR1、CDR2、CDR3、CDR的組合、可變區(qū)、框架區(qū)、恒定區(qū)等(Maynard和Georgiou，2000，Annu.Rev.Biomed.Eng.2339-76；Hudson，1998，Curr.Opin.Biotechnol.9395-402)。
“Fc”在本文中意思是包含免疫球蛋白域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)的抗體的部分。Fc也可包括存在于Cγ2與Cγ1(Cγ1)之間的N-末端鉸鏈中的任何殘基。Fc可指獨(dú)立的這種區(qū)或抗體或抗體片段情況下的這種區(qū)。Fc還包括Fc的任何修飾形式，包括(但不限于)天然單體、天然二聚物(雙硫鍵連接)、經(jīng)修飾二聚物(二硫鍵和/或非共價(jià)連接)以及經(jīng)修飾單體(即，衍生物)。“hFc”是指人類(lèi)Fc。
“全長(zhǎng)抗體”在本文中意思是構(gòu)成抗體H和/或L鏈的天然生物形式的結(jié)構(gòu)。在包括人類(lèi)和小鼠的大多數(shù)哺乳動(dòng)物中，這種形式是四聚物且由兩個(gè)相同的兩個(gè)免疫球蛋白鏈的對(duì)組成，各對(duì)具有一個(gè)輕鏈和一個(gè)重鏈，各輕鏈包含免疫球蛋白域VL和CL，且各重鏈包含免疫球蛋白域VH、Cγ1、Cγ2和Cγ3。在各對(duì)中，輕鏈和重鏈可變區(qū)(VL和VH)一起導(dǎo)致與抗原的結(jié)合，且恒定區(qū)(CL、Cγ1、Cγ2和Cγ3，尤其Cγ2和Cγ3)產(chǎn)生抗體效應(yīng)功能。在一些哺乳動(dòng)物中，例如在駱駝和美洲駝中，全長(zhǎng)抗體可由僅兩個(gè)重鏈組成，各重鏈包含免疫球蛋白域Vn、Cγ2和Cγ3。
“免疫球蛋白(Ig)”在本文中意思是由一個(gè)或一個(gè)以上實(shí)質(zhì)上由免疫球蛋白基因編碼的多肽組成的蛋白質(zhì)。免疫球蛋白包括(但不限于)抗體。免疫球蛋白可具有多種結(jié)構(gòu)形式，包括(但不限于)全長(zhǎng)抗體、抗體片段和個(gè)別免疫球蛋白域(包括(但不限于)VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL和CL)。
“免疫球蛋白(Ig)域”在本文中意思是由實(shí)質(zhì)上由免疫球蛋白基因編碼的多肽組成的蛋白質(zhì)域。Ig域包括(但不限于)VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL和CL。
如本文中所使用，“變異蛋白質(zhì)序列”意思是具有氨基酸一致性與另一類(lèi)似的蛋白質(zhì)序列有所不同的一個(gè)或一個(gè)以上殘基的蛋白質(zhì)序列。所述類(lèi)似的蛋白質(zhì)序列可為天然野生型蛋白質(zhì)序列或野生型序列的另一變異體。起始序列通常稱(chēng)為“親本”序列且可為野生型或變異序列。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例可利用已進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析的人類(lèi)化親本序列來(lái)制備變異體。
本文中，抗體的“可變區(qū)”意思是包含VH免疫球蛋白域、VL免疫球蛋白域或VH和VL免疫球蛋白域的一種或一種以上多肽(包括變異體)。可變區(qū)可指獨(dú)立的、呈Fv片段、呈scFv片段、呈較大抗體片段情況下的這種區(qū)或呈全長(zhǎng)抗體或替代的非抗體骨架分子情況下的這種區(qū)的這種多肽。
本發(fā)明可用于從大量來(lái)源獲得的抗體?？贵w可實(shí)質(zhì)上由來(lái)自任何生物體的一種或一種以上抗體基因編碼，所述生物體包括(但不限于)人類(lèi)、小鼠、大鼠、兔子、駱駝、美洲駝、單峰駱駝、猴，尤其哺乳動(dòng)物且尤其人類(lèi)且尤其小鼠和大鼠。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體可為通過(guò)使用轉(zhuǎn)基因小鼠或其它動(dòng)物例如從患者或個(gè)體獲得的完全人類(lèi)抗體(Bruggemann和Taussig，1997，Curr.Opin.Biotechnol.8455-458)，或從與選擇方法聯(lián)合的人類(lèi)抗體文庫(kù)獲得的完全人類(lèi)抗體(Griffiths和Duncan，1998，Curr.Opin.Biotechnol.9102-108)。抗體可來(lái)自任何來(lái)源，包括人工來(lái)源或天然存在的來(lái)源。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可利用工程化抗體，所述抗體包括(但不限于)嵌合抗體和人類(lèi)化抗體(Clark，2000，Immunol.Today 21397-402)或源自組合文庫(kù)。另外，所優(yōu)化的抗體可為實(shí)質(zhì)上由一個(gè)或一個(gè)以上天然抗體基因編碼的抗體的工程化變異體。舉例來(lái)說(shuō)，在一個(gè)實(shí)施例中，所優(yōu)化的抗體是已通過(guò)親和力成熟鑒別的抗體。
如本文中所使用，“hFc”或“人類(lèi)Fc”或“hFc多肽”包括hFc類(lèi)似物、hFc同種型、hFc模擬物、hFc片段、雜交hFc蛋白、融合蛋白、寡聚物和多聚物、同源物、糖基化模式變異體、變異體、剪接變異體以及其突變蛋白，而不考慮以上各物的生物活性且更不考慮其合成或制造方法，所述方法包括(但不限于)重組(由cDNA、基因組DNA、合成DNA或核酸的其它形式制備)、活體外、活體內(nèi)、微注射核酸分子、合成、轉(zhuǎn)基因?qū)W以及基因激活方法。所屬領(lǐng)域中已知多種hFc。
術(shù)語(yǔ)“hFc”還包括hFc的醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽和前藥和所述鹽的前藥、多晶型物、水合物、溶劑合物、生物活性片段、生物活性變異體和立體異構(gòu)體，以及hFc的激動(dòng)劑、模擬物和拮抗劑變異體，以及其多肽融合物。術(shù)語(yǔ)“hFc多肽”涵蓋在氨基末端、羧基末端或兩者處包含其它氨基酸的融合物。
各種參考文獻(xiàn)公開(kāi)通過(guò)聚合物結(jié)合或糖基化進(jìn)行的多肽修飾。術(shù)語(yǔ)“hPP多肽”或“hA多肽”或“hFc多肽”包括與諸如PEG等聚合物結(jié)合的多肽且可包含半胱氨酸、賴氨酸或其它殘基的一種或一種以上其它衍生。另外，hPP多肽或hA或hFc多肽可包含連接子或聚合物，其中所述連接子或聚合物所結(jié)合的氨基酸可為根據(jù)本發(fā)明的非天然氨基酸，或所述多肽可利用所屬領(lǐng)域中已知的技術(shù)(諸如與賴氨酸或半胱氨酸偶合)與天然編碼氨基酸結(jié)合。
術(shù)語(yǔ)“hPP多肽”或“hA多肽”或“hFc多肽”還包括糖基化形式，諸如(但不限于)在任何氨基酸位置處糖基化的多肽、多肽的N-連接或O-連接糖基化形式。含有單個(gè)核苷酸變化的變異體也被視為hPP多肽或hA多肽或hFc多肽的生物活性變異體。另外，還包括剪接變異體。術(shù)語(yǔ)hPP多肽或hA多肽或hFc多肽還包括任何一個(gè)或一個(gè)以上hPP或hA或hFc多肽或任何其它多肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物、聚合物、小分子、連接子、配位體或任何類(lèi)型的其它生物活性分子的通過(guò)化學(xué)方法連接或表達(dá)為融合蛋白的hPP或hA或hFc多肽異源二聚物、同源二聚物、異源多聚物或同源多聚物，以及例如含有仍維持生物活性的特異性缺失或其它修飾的多肽類(lèi)似物。
除非另作說(shuō)明，否則本文中所述的hA的所有所提及的氨基酸位置都是基于SEQID NO1中的位置。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1或任何其它hA序列中的位置的氨基酸位置都可在諸如hA融合物、變異體、片段等任何其它hA分子中容易地鑒別。舉例來(lái)說(shuō)，可使用諸如BLAST等序列比對(duì)程式來(lái)比對(duì)和鑒別蛋白質(zhì)中的與SEQ ID NO1、2或其它hA序列中的位置對(duì)應(yīng)的特定位置。本文中參考SEQID NO1或其它hA序列所述的氨基酸的取代、缺失或添加也打算指本文中所述或所屬領(lǐng)域中已知的hA融合物、變異體、片段等中的相應(yīng)位置的取代、缺失或添加，且明確涵蓋在本發(fā)明中。
除非另作說(shuō)明，否則本文中所述的hFc的所有所提及的氨基酸位置都是基于SEQID NO22中的位置。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO22或任何其它hFc序列中的位置的氨基酸位置都可在諸如hFc融合物、變異體、片段等任何其它hFc分子中容易地鑒別。舉例來(lái)說(shuō)，可使用諸如BLAST等序列比對(duì)程式來(lái)比對(duì)和鑒別蛋白質(zhì)中的與SEQ ID NO20、21、22、23或其它hFc序列中的位置對(duì)應(yīng)的特定位置。本文中參考SEQ ID NO22或其它hFc序列所述的氨基酸的取代、缺失或添加也打算指本文中所述或所屬領(lǐng)域中已知的hFc融合物、變異體、片段等中的相應(yīng)位置的取代、缺失或添加，且明確涵蓋在本發(fā)明中。
“非天然編碼氨基酸”是指不為20種常見(jiàn)氨基酸或吡咯賴氨酸或硒代半胱氨酸中的一種的氨基酸?？膳c術(shù)語(yǔ)“非天然編碼氨基酸”同義使用的其它術(shù)語(yǔ)為“非天然氨基酸(non-natural amino acid)”、“非天然存在的氨基酸”。術(shù)語(yǔ)“非天然編碼氨基酸”還包括(但不限于)通過(guò)修飾(例如翻譯后修飾)天然編碼氨基酸(包括(但不限于)20種常見(jiàn)氨基酸或吡咯賴氨酸和硒代半胱氨酸)而存在、但本身無(wú)法通過(guò)翻譯復(fù)合物天然地并入正在生長(zhǎng)的多肽鏈中的氨基酸。所述非天然存在的氨基酸的實(shí)例包括(但不限于)N-乙酰氨基葡萄糖基-L-絲氨酸、N-乙酰氨基葡萄糖基-L-蘇氨酸以及O-磷酸酪氨酸。
“氨基末端修飾基團(tuán)”是指可連接到多肽的氨基末端的任何分子。類(lèi)似地，“羧基末端修飾基團(tuán)”是指可連接到多肽的羧基末端的任何分子。末端修飾基團(tuán)包括(但不限于)各種水溶性聚合物、諸如血清白蛋白等肽或蛋白質(zhì)或增加肽的血清半衰期的其它部分。
術(shù)語(yǔ)“官能團(tuán)”、“活性部分”、“活化基團(tuán)”、“離去基團(tuán)”、“反應(yīng)位點(diǎn)”、“化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)”和“化學(xué)反應(yīng)性部分”在所屬領(lǐng)域和本文中是用于指分子的不同的可界定的部分或單元。所述術(shù)語(yǔ)在化學(xué)領(lǐng)域中在一定程度上同義且在本文中用于指示執(zhí)行某種功能或活性且可與其它分子反應(yīng)的分子的部分。
術(shù)語(yǔ)“鍵”或“連接子”在本文中用于指通常由化學(xué)反應(yīng)所形成且通常為共價(jià)鍵的基團(tuán)或鍵結(jié)。水解穩(wěn)定鍵意思是所述鍵在水中實(shí)質(zhì)上穩(wěn)定且在適用的pH值下(包括(但不限于)在生理?xiàng)l件下)在延長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)(可能甚至無(wú)限期)不與水反應(yīng)。水解不穩(wěn)定或可降解的鍵意思是所述鍵可在水或水溶液(例如包括血液)中降解。酶促不穩(wěn)定或可降解的鍵意思是所述鍵可通過(guò)一種或一種以上酶降解。所屬領(lǐng)域中應(yīng)了解，PEG和相關(guān)聚合物可在聚合物主鏈內(nèi)或在聚合物主鏈與聚合物分子的一個(gè)或一個(gè)以上末端官能團(tuán)之間的連接子基團(tuán)內(nèi)包括可降解鍵。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)PEG羧酸或經(jīng)活化的PEG羧酸與生物活性劑上的醇基反應(yīng)所形成的酯鍵通常在生理?xiàng)l件下水解以釋放所述生物活性劑。其它水解可降解鍵包括(但不限于)碳酸酯鍵；由胺與醛反應(yīng)所產(chǎn)生的亞胺鍵；通過(guò)使醇與磷酸酯基反應(yīng)形成的磷酸酯鍵；作為酰肼與醛的反應(yīng)產(chǎn)物的腙鍵；作為醛與醇的反應(yīng)產(chǎn)物的縮醛鍵；作為甲酸鹽與醇的反應(yīng)產(chǎn)物的原酸酯鍵；由包括(但不限于)諸如PEG等聚合物的末端的胺基與肽的羧基形成的肽鍵；以及由包括(但不限于)聚合物末端的亞磷酰胺(phosphoramidite)基與寡核苷酸的5′羥基形成的寡核苷酸鍵。
術(shù)語(yǔ)“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性劑”在本文中使用時(shí)意思是可影響涉及生物體(包括(但不限于)病毒、細(xì)菌、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、朊病毒、昆蟲(chóng)、真菌、植物、動(dòng)物以及人類(lèi))的生物系統(tǒng)、途徑、分子或相互作用的任何物理或化學(xué)性質(zhì)的任何物質(zhì)。具體來(lái)說(shuō)，如本文中所使用，生物活性分子包括(但不限于)預(yù)期用于診斷、治愈、緩解、治療或預(yù)防人類(lèi)或其它動(dòng)物的疾病或者以其它方式增強(qiáng)人類(lèi)或動(dòng)物的身體或精神健康狀況的任何物質(zhì)。生物活性分子的實(shí)例包括(但不限于)肽、蛋白質(zhì)、酶、小分子藥物、硬藥、軟藥、碳水化合物、無(wú)機(jī)原子或分子、染料、脂質(zhì)、核苷、放射性核素、寡核苷酸、毒素、細(xì)胞、病毒、脂質(zhì)體、微粒以及膠束。適用于本發(fā)明的生物活性劑的種類(lèi)包括(但不限于)藥物、前藥、放射性核素、顯影劑、聚合物、抗生素、殺真菌劑、抗病毒劑、消炎劑、抗腫瘤劑、心血管劑、抗焦慮劑、激素、生長(zhǎng)因子、類(lèi)固醇劑、微生物來(lái)源的毒素等。P32生物活性分子涵蓋多種多肽，包括(但不限于)。適用于本發(fā)明的多肽的代表性非限制性種類(lèi)包括屬于下列治療劑類(lèi)別的種類(lèi)促腎上腺皮質(zhì)激素肽、腎上腺髓質(zhì)素肽(adrenomedullin peptide)、咽側(cè)體抑制素肽、胰淀素肽(amylin peptide)、淀粉樣β-蛋白質(zhì)片段肽、血管緊張素肽、抗菌肽、抗原多肽、抗微生物肽、細(xì)胞凋亡相關(guān)肽、心房利尿鈉肽、袋細(xì)胞肽(bag cell peptide)、鈴蟾肽、骨GLA肽、緩激肽(bradykininpeptide)、腦利尿鈉肽、C-肽、C型利尿鈉肽、降鈣素肽、降鈣素基因相關(guān)肽、CART肽、酪啡肽、趨化性肽、膽囊收縮素肽、菌落刺激因子肽、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子肽、皮質(zhì)抑素肽、細(xì)胞因子肽、皮啡肽、強(qiáng)啡肽、內(nèi)啡肽、內(nèi)皮素肽、ETa受體拮抗劑肽、ETb受體拮抗劑肽、腦啡肽、纖維粘連蛋白肽、甘丙肽、胃泌素肽、胰高血糖素肽、Gn-RH相關(guān)肽、生長(zhǎng)因子肽、生長(zhǎng)激素肽、GTP結(jié)合蛋白片段肽、鳥(niǎo)苷素肽、抑制素肽、胰島素肽、白細(xì)胞介素肽、層粘連蛋白肽、瘦素肽、白細(xì)胞激肽(leucokinin peptide)、黃體生成素釋放激素肽、肥大細(xì)胞脫粒肽(mastoparan)、肥大細(xì)胞脫粒肽(mast cell degranulating peptide)、促黑素細(xì)胞激素肽、嗎啡肽(morphiceptin peptide)、胃動(dòng)素肽、神經(jīng)肽、神經(jīng)肽Y肽、嗜神經(jīng)性因子肽、食欲素肽、阿片樣肽(opioid peptide)、催產(chǎn)素肽、PACAP肽、胰抑制素肽、胰多肽、甲狀旁腺激素肽、甲狀旁腺激素相關(guān)肽、肽T肽、促乳激素釋放肽、肽YY肽、腎素底物肽、胰泌素肽、生長(zhǎng)抑素肽、P物質(zhì)肽、速激肽(tachykinin peptide)、促甲狀腺激素釋放激素肽、毒素肽、血管活性腸肽、加壓素肽以及病毒相關(guān)肽(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第6,858,580號(hào))。
作為多肽的生物活性分子的實(shí)例包括(但不限于)垂體激素，諸如加壓素、催產(chǎn)素、促黑素細(xì)胞激素、促腎上腺皮質(zhì)激素、生長(zhǎng)激素；下丘腦激素，諸如生長(zhǎng)激素釋放因子、促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子、促乳激素釋放肽、促性腺激素釋放激素和其相關(guān)肽、黃體激素釋放激素、促甲狀腺素釋放激素、食欲素肽以及生長(zhǎng)抑素；甲狀腺激素，諸如降鈣素、降鈣素前體以及降鈣素基因相關(guān)肽；甲狀旁腺激素和其相關(guān)蛋白質(zhì)；胰激素，諸如胰島素和胰島素樣肽、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素、胰多肽、胰淀素(amylin)、肽YY以及神經(jīng)肽Y；消化性激素，諸如胃泌素、胃泌素釋放肽、胃泌素抑制肽、膽囊收縮素、胰泌素、胃動(dòng)素以及血管活性腸肽；利尿鈉肽，諸如心房利尿鈉肽、腦利尿鈉肽以及C型利尿鈉肽；神經(jīng)激肽，諸如神經(jīng)激肽A、神經(jīng)激肽B以及P物質(zhì)；腎素相關(guān)肽，諸如腎素底物和抑制劑以及血管緊張素；內(nèi)皮素，包括大內(nèi)皮素、內(nèi)皮素A受體拮抗劑以及角蝰毒素(sarafotoxin)肽；以及其它肽，諸如腎上腺髓質(zhì)素肽、咽側(cè)體抑制素肽、淀粉樣β蛋白質(zhì)片段、抗生素以及抗生物肽、細(xì)胞凋亡相關(guān)肽、袋細(xì)胞肽、鈴蟾肽、骨Gla蛋白肽、CART肽、趨化性肽、皮質(zhì)抑素肽、纖維粘連蛋白片段和血纖蛋白原相關(guān)肽、FMRF和類(lèi)似肽、甘丙肽和相關(guān)肽、生長(zhǎng)因子和相關(guān)肽、G治療肽結(jié)合蛋白片段、鳥(niǎo)苷素和尿鳥(niǎo)苷素、抑制素肽、白細(xì)胞介素和白細(xì)胞介素受體蛋白、層粘連蛋白片段、瘦素片段肽、白細(xì)胞激肽、肥大細(xì)胞脫粒肽、垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽、胰抑制素、肽T、多肽、病毒相關(guān)肽、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑、毒素以及雜肽(miscellaneous peptide)，諸如佐劑肽類(lèi)似物、α交配因子、抗心律不齊肽、防凍多肽、減食欲肽、牛松果抗生育肽、三肽囊素(bursin)、C3肽P16、腫瘤壞死因子、鈣粘連蛋白肽、嗜鉻粒蛋白A片段、避孕四肽、芋螺毒素(conantokin)G、芋螺毒素T、甲殼動(dòng)物心臟活性肽、C-端肽、細(xì)胞色素b588肽、抗栓肽(decorsin)、美味肽(delicious peptide)、δ-睡眠肽、安定(diazempam)結(jié)合抑制劑片段、氧化氮合成酶嵌段肽、OVA肽、血小板鈣蛋白酶抑制劑(P1)、纖溶酶原激活物抑制劑1、rigin、精神分裂癥相關(guān)肽、血清胸腺因子、鈉鉀A治療劑肽酶抑制劑-1、精子激活肽(speract)、精液激活肽、系統(tǒng)素、凝血酶受體激動(dòng)劑、胸腺體液γ2因子、胸腺五肽(thymopentin)、胸腺素α1、胸腺因子、促吞噬肽(tuftsin)、脂肪酸釋放激素、尿毒癥五肽、葡萄糖依賴性促胰島素多肽(GIP)、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、胰高血糖素樣肽-2(GLP-1)、艾生丁-3(exendin-3)、艾生丁-4以及其它治療肽或其片段。肽的其它實(shí)例包括胃內(nèi)激素(ghrelin)、阿片樣肽(酪啡肽、皮啡肽、內(nèi)啡肽、腦啡肽、δ啡肽、強(qiáng)啡肽以及這些肽的類(lèi)似物和衍生物)、胸腺肽(胸腺生成素、胸腺九肽、胸腺五肽、胸腺素、胸腺體液因子(Thymic Humoral Factor，THF))、細(xì)胞粘著肽、補(bǔ)體抑制劑、凝血酶抑制劑、胰蛋白酶抑制劑、α-1抗胰蛋白酶、海膽精液激活肽、SHU-9119 MC3-R和MC4-R拮抗劑、格拉莫德(glaspimod)(適用于細(xì)菌感染、真菌感染、免疫缺陷免疫病癥、白血球減少癥的免疫刺激劑)、HP-228(適用于化學(xué)療法誘發(fā)的嘔γ、毒性、疼痛、糖尿病、炎癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肥胖的黑色素皮質(zhì)素)、α2-纖溶酶抑制劑(纖溶酶抑制劑)、APC腫瘤抑制因子(適用于贅瘤的腫瘤抑制因子)、早孕因子(免疫抑制劑)、內(nèi)源性類(lèi)苯甲二氮肽(endozepine)安定結(jié)合抑制劑(受體肽)、γ干擾素(適用于白血病)、腺性激肽釋放酶-1(免疫刺激劑)、胎盤(pán)核糖核酸酶抑制劑、sarcolecin結(jié)合蛋白、表面活性劑蛋白質(zhì)D、韋爾姆斯氏腫瘤抑制因子(Wilms′tumor suppressor)、GABAB 1b受體肽、朊病毒相關(guān)肽(iPrP13)、膽堿結(jié)合蛋白片段(細(xì)菌相關(guān)肽)、端粒酶抑制劑、cardiostatin肽、內(nèi)皮抑制素衍生肽(血管生成抑制劑)、朊病毒抑制肽、D-天冬氨酸N-甲基酯受體拮抗劑、C-肽類(lèi)似物(適用于糖尿病并發(fā)癥)、RANTES、NTY受體、NPY2-R(神經(jīng)肽Y型2-受體)配位體、NC4R肽或其片段。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利6,849,714，其以引用的方式并入本文中。還包括α-1抗胰蛋白酶、血管抑制素、抗溶血因子、抗體、載脂蛋白(Apolipoprotein)、載脂蛋白(Apoprotein)、心房利尿鈉因子、心房利尿鈉多肽、心房肽、C-X-C趨化因子(例如T39765、NAP-2、ENA-78、Gro-a、Gro-b、Gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG)、降鈣素、CC趨化因子(例如單核細(xì)胞趨化蛋白-1、單核細(xì)胞趨化蛋白-2、單核細(xì)胞趨化蛋白-3、單核細(xì)胞發(fā)炎性蛋白-1α、單核細(xì)胞發(fā)炎性蛋白-1β、RANTES、I309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262)、CD40配位體、C-kit配位體、膠原蛋白、菌落刺激因子(Colony stimulatingfactor，CSF)、補(bǔ)體因子5a、補(bǔ)體抑制劑、補(bǔ)體受體1、細(xì)胞因子(例如上皮中性粒細(xì)胞激活肽-78、GRO α/MGSA、GRO、GRO、MIP-1、MIP-1、MCP-1)、表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal Growth Factor，EGF)、促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，“EPO”)、剝脫性毒素A及和B、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X(jué)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fibroblast Growth Factor，F(xiàn)GF)、纖維蛋白原、纖維粘連蛋白、G-CSF、GM-CSF、葡糖腦苷脂酶、促性腺激素、生長(zhǎng)因子、刺猬蛋白(Hedgehog protein)(例如音速(Sonic)、印度(Indian)、沙漠(Desert))、血紅蛋白、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HepatocyteGrowth Factor，HGF)、水蛭素、人類(lèi)血清白蛋白、胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子(Insulin-like Growth Factor，IGF)、干擾素(例如IFN-t、IFN-β、IFN-γ)、白細(xì)胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12等)、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Keratinocyte Growth Factor，KGF)、乳鐵蛋白(Lactoferrin)、白血病抑制因子、熒光素酶、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、中性粒細(xì)胞抑制因子(Neutrophilinhibitory factor，NIF)、抑瘤素M、成骨蛋白、甲狀旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素(例如人類(lèi)生長(zhǎng)激素)、多效營(yíng)養(yǎng)因子(Pleiotropin)、蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G、致熱外毒素A、B或C、松弛素、腎素、SCF、可溶性補(bǔ)體受體I、可溶性I-CAM 1、可溶性白細(xì)胞介素受體(IL-1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15)、可溶性TNF受體、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素、生長(zhǎng)抑素、生長(zhǎng)激素、鏈激酶、超抗原(即，葡萄球菌腸毒素(SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE))、超氧化物歧化酶、中毒性休克綜合癥毒素(TSST-1)、胸腺素α1、組織型纖溶酶原激活劑、腫瘤壞死因子β(TNFβ)、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、腫瘤壞死因子-α(TNFα)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGEF)、尿激酶、T-20、SS-14、LHRH、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、G-CSF、TPO、阿索開(kāi)(axokine)、瘦素等。與生物活性分子結(jié)合、連接或融合的hA的實(shí)例可見(jiàn)于美國(guó)專(zhuān)利第7,056,701號(hào)、第7,041,478號(hào)、第7,045,318號(hào)、第6,994,857號(hào)、第6,987,006號(hào)、第6,972,322號(hào)、第6,946,134號(hào)、第6,926,898號(hào)、第6,905,688號(hào)、第6,686,179號(hào)、第6,548,653號(hào)、第6,423,512號(hào)、第5,773,417號(hào)以及第5,594,110號(hào)中，其以引用的方式并入本文中。
“雙官能聚合物”或“雙官能連接子”是指包含兩個(gè)能夠與其它部分(包括(但不限于)氨基酸側(cè)基)特異性反應(yīng)以形成共價(jià)或非共價(jià)鍵的離散官能團(tuán)的分子。具有一個(gè)與特定生物活性組分上的基團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)和另一與第二生物活性組分上的基團(tuán)反應(yīng)的基團(tuán)的雙官能連接子可用于形成包括第一生物活性組分、雙官能連接子和第二生物活性組分的結(jié)合物。已知使各種化合物與肽連接的多種程序和連接分子。例如參見(jiàn)歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)文件第188,256號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利第4,671,958號(hào)、第4,659,839號(hào)、第4,414,148號(hào)、第4,699,784號(hào)、第4,680,338號(hào)以及第4,569,789號(hào)，所述專(zhuān)利以引用的方式并入本文中?！岸喙倌芫酆衔铩被颉岸喙倌苓B接子”是指包含兩個(gè)或兩個(gè)以上能夠與其它部分(包括(但不限于)氨基酸側(cè)基)特異性反應(yīng)以形成共價(jià)或非共價(jià)鍵的離散官能團(tuán)的分子。雙官能聚合物或連接子或多官能聚合物或連接子可具有任何所需長(zhǎng)度或分子量，且可經(jīng)選擇以在連接到hPP或hFc的一個(gè)或一個(gè)以上分子與其結(jié)合搭配物或hPP或hFc之間提供特定的所需間隔或構(gòu)象。
當(dāng)通過(guò)從左向右書(shū)寫(xiě)的常規(guī)化學(xué)式來(lái)說(shuō)明取代基時(shí)，同樣涵蓋由從右向左書(shū)寫(xiě)的結(jié)構(gòu)所得到的在化學(xué)上相同的取代基，例如，結(jié)構(gòu)-CH2O-與結(jié)構(gòu)-OCH2-等價(jià)。
術(shù)語(yǔ)“取代基”包括(但不限于)“無(wú)干擾取代基”?！盁o(wú)干擾取代基”是那些產(chǎn)生穩(wěn)定化合物的基團(tuán)。合適的無(wú)干擾取代基或基團(tuán)包括(但不限于)鹵基、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C1-C10烷氧基、C1-C12芳烷基、C1-C12烷芳基、C3-C12環(huán)烷基、C3-C12環(huán)烯基、苯基、經(jīng)取代苯基、甲苯基、二甲苯基、聯(lián)苯基、C2-C12烷氧基烷基、C2-C12烷氧基芳基、C7-C12芳氧基烷基、C7-C12氧基芳基、C1-C6烷基亞磺酰基、C1-C10烷基磺?；?(CH2)m-O-(C1-C10烷基)(其中m為1至8)、芳基、經(jīng)取代芳基、經(jīng)取代烷氧基、氟烷基、雜環(huán)基、經(jīng)取代雜環(huán)基、硝基烷基、-NO2、-CN、-NRC(O)-(C1-C10烷基)、-C(O)-(C1-C10烷基)、C2-C10烷硫基烷基、-C(O)O-(C1-C10烷基)、-OH、-SO2、＝S、-COOH、-NR2、羰基、-C(O)-(C1-C10烷基)-CF3、-C(O)-CF3、-C(O)NR2、-(C1-C10芳基)-S-(C6-C10芳基)、-C(O)-(C1-C10芳基)、-(CH2)m-O-(CH2)m-O-(C1-C10烷基)(其中m各自為1至8)、-C(O)NR2、-C(S)NR2、-SO2NR2、-NRC(O)NR2、-NRC(S)NR2、其鹽等。如本文中所使用，各R為H、烷基或經(jīng)取代烷基、芳基或經(jīng)取代芳基、芳烷基或烷芳基。
術(shù)語(yǔ)“鹵素”包括氟、氯、碘以及溴。
除非另作說(shuō)明，否則術(shù)語(yǔ)“烷基”本身或作為另一取代基的部分時(shí)意思是具有指定碳原子數(shù)目(即，C1-C10意思是1到10個(gè)碳)的直鏈或支鏈或環(huán)狀烴基或其組合，其可為完全飽和、單不飽和或多不飽和的且可包括二價(jià)和多價(jià)基團(tuán)。飽和烴基的實(shí)例包括(但不限于)以下基團(tuán)，諸如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、環(huán)己基、(環(huán)己基)甲基、環(huán)丙基甲基；(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和異構(gòu)物等。不飽和烷基是具有一個(gè)或一個(gè)以上雙鍵或三鍵的烷基。不飽和烷基的實(shí)例包括(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-異戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及高級(jí)同系物和異構(gòu)物。除非另作說(shuō)明，否則術(shù)語(yǔ)“烷基”還打算包括下文更為詳細(xì)地定義的烷基衍生物，諸如“雜烷基”。只限于烴基的烷基被稱(chēng)為“同系烷基(homoalkyl)”。
術(shù)語(yǔ)“亞烷基”本身或作為另一取代基的部分時(shí)意思是衍生自烷烴的二價(jià)基團(tuán)，例如(但不限于)結(jié)構(gòu)-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-且進(jìn)一步包括下文中描述為“雜亞烷基”的那些基團(tuán)。烷基(或亞烷基)通常將具有1到24個(gè)碳原子，其中具有10個(gè)或10個(gè)以下碳原子的那些基團(tuán)是本文中所述的方法和組合物的特定實(shí)施例?！暗吞纪榛被颉暗吞紒喭榛笔峭ǔ＞哂?個(gè)或8個(gè)以下碳原子的較短鏈烷基或亞烷基。
術(shù)語(yǔ)“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷基硫基”(或硫代烷氧基)是以其常規(guī)含義使用，且分別是指通過(guò)氧原子、氨基或硫原子與分子的其余部分連接的那些烷基。
除非另作說(shuō)明，否則術(shù)語(yǔ)“雜烷基”本身或與另一術(shù)語(yǔ)組合時(shí)意思是穩(wěn)定的直鏈或支鏈或環(huán)狀烴基或其組合，其由規(guī)定數(shù)目的碳原子和至少一個(gè)選自由O、N、Si和S組成的群組的雜原子組成，且其中氮原子和硫原子可視情況經(jīng)氧化且氮雜原子可視情況經(jīng)季銨化。雜原子O、N和S以及Si可位于雜烷基的任何內(nèi)部位置或位于烷基與分子的其余部分連接的位置處。實(shí)例包括(但不限于)-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3以及-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多兩個(gè)雜原子可相鄰，諸如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。類(lèi)似地，術(shù)語(yǔ)“雜亞烷基”本身或作為另一取代基的部分時(shí)意思是衍生自雜烷基的二價(jià)基團(tuán)，例如(但不限于)-CH2-CH2-S-CH2CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。對(duì)于雜亞烷基來(lái)說(shuō)，相同或不同的雜原子也可占據(jù)鏈的一端或兩端(包括(但不限于)亞烷基氧基、亞烷基二氧基、亞烷基氨基、亞烷基二氨基、氨基氧基亞烷基等)。另外，對(duì)于亞烷基和雜亞烷基連接基團(tuán)來(lái)說(shuō)，連接基團(tuán)的化學(xué)式所書(shū)寫(xiě)的方向并不表示連接基團(tuán)的定向。舉例來(lái)說(shuō)，式-C(O)2R′-表示-C(O)2R′-和-R′C(O)2- 除非另外說(shuō)明，否則術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”和“雜環(huán)烷基”本身或與其它術(shù)語(yǔ)組合時(shí)分別表示“烷基”和“雜烷基”的環(huán)狀形式。因此，環(huán)烷基或雜環(huán)烷基包括飽和、部分不飽和以及完全不飽和環(huán)鍵。另外，對(duì)于雜環(huán)烷基來(lái)說(shuō)，雜原子可占據(jù)雜環(huán)與分子的其余部分連接的位置。環(huán)烷基的實(shí)例包括(但不限于)環(huán)戊基、環(huán)己基、1-環(huán)己烯基、3-環(huán)己烯基、環(huán)庚基等。雜環(huán)烷基的實(shí)例包括(但不限于)1-(1，2，5，6-四氫吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。另外，所述術(shù)語(yǔ)還涵蓋雙環(huán)和三環(huán)結(jié)構(gòu)。類(lèi)似地，術(shù)語(yǔ)“雜亞環(huán)烷基”本身或作為另一取代基的部分時(shí)意思是衍生自雜環(huán)烷基的二價(jià)基團(tuán)，且術(shù)語(yǔ)“亞環(huán)烷基”本身或作為另一取代基的部分時(shí)意思是衍生自環(huán)烷基的二價(jià)基團(tuán)。
如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“水溶性聚合物”是指可溶于水性溶劑中的任何聚合物。水溶性聚合物與hPP或hA或hFc多肽的連接可產(chǎn)生改變，包括(但不限于)相對(duì)于未經(jīng)修飾的形式增加或經(jīng)調(diào)節(jié)的血清半衰期或增加或經(jīng)調(diào)節(jié)的治療半衰期、經(jīng)調(diào)節(jié)的免疫原性、經(jīng)調(diào)節(jié)的物理締合特征(諸如聚集和多聚物形成)、改變的受體結(jié)合、改變的與一種或一種以上結(jié)合搭配物的結(jié)合以及改變的受體二聚化或多聚化作用。水溶性聚合物可具有或可不具有其本身的生物活性且可用作使hPP或hA或hFc與其它物質(zhì)(包括(但不限于)一種或一種以上hPP或hA或hFc多肽，或一種或一種以上生物活性分子)連接的連接子。合適的聚合物包括(但不限于)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其單C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(描述于美國(guó)專(zhuān)利第5,252,714號(hào)中，其以引用的方式并入本文中)、單甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚馬來(lái)酸酐、N-(2-羥丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖類(lèi)衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纖維素和纖維素衍生物(包括(但不限于)甲基纖維素和羧甲基纖維素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚烷二醇和其衍生物、聚烷二醇的共聚物和其衍生物、聚乙烯基乙基醚以及α-β-聚[(2-羥乙基)-DL-天冬酰胺等或其混合物。所述水溶性聚合物的實(shí)例包括(但不限于)聚乙二醇和血清白蛋白。
如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“聚烷二醇”或“聚(烷二醇)”是指聚乙二醇(聚(乙二醇))、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。術(shù)語(yǔ)“聚烷二醇”涵蓋線性與支化聚合物且平均分子量介于0.1kDa與100kDa之間。其它例示性實(shí)施例是列于(例如)供應(yīng)商目錄中，諸如Shearwater Corporation的目錄“用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的聚乙二醇和衍生物(Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications)”(2001)。
除非另作說(shuō)明，否則術(shù)語(yǔ)“芳基”意思是可為單環(huán)或稠合在一起或共價(jià)連接的多環(huán)(包括(但不限于)1到3個(gè)環(huán))的多不飽和芳香族烴取代基。術(shù)語(yǔ)“雜芳基”是指含有1到4個(gè)選自N、O以及S的雜原子的芳基(或環(huán))，其中氮原子和硫原子視情況經(jīng)氧化且氮原子視情況經(jīng)季銨化。雜芳基可通過(guò)雜原子與分子的其余部分連接。芳基和雜芳基的非限定性實(shí)例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯(lián)苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基以及6-喹啉基。上述芳基和雜芳基環(huán)系統(tǒng)中的每一個(gè)的取代基都選自下文中所述的可接受的取代基的群組。
為了簡(jiǎn)便起見(jiàn)，當(dāng)與其它術(shù)語(yǔ)組合使用時(shí)(包括(但不限于)芳氧基、芳基硫氧基、芳烷基)，術(shù)語(yǔ)“芳基”包括如上文所定義的芳基環(huán)與雜芳基環(huán)。因此，術(shù)語(yǔ)“芳烷基”打算包括芳基與烷基連接的那些基團(tuán)(包括(但不限于)苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等)，所述烷基包括碳原子(包括(但不限于)亞甲基)已經(jīng)(例如)氧原子置換的那些烷基(包括(但不限于)苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘基氧基)丙基等)。
上述術(shù)語(yǔ)(包括(但不限于)“烷基”、“雜烷基”、“芳基”和“雜芳基”)各自打算包括所指示的基團(tuán)的經(jīng)取代和未經(jīng)取代形式。各類(lèi)型基團(tuán)的例示性取代基提供如下。
烷基和雜烷基(包括通常稱(chēng)為亞烷基、烯基、雜亞烷基、雜烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基以及雜環(huán)烯基的那些基團(tuán))的取代基可為多種選自(但不限于)以下各基團(tuán)的基團(tuán)中的一個(gè)或一個(gè)以上基團(tuán)-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-鹵素、-SiR′R″R″′、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、 -NR′C(O)NR″R″′、-NR″(O)2R′、-NR-C(NR′R″R″′)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR″′、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN以及-NO2，其數(shù)目在0到(2m′+1)(其中m′為所述基團(tuán)中的碳原子的總數(shù))的范圍內(nèi)。R′、R″、R″′和R″″各自獨(dú)立地是指氫、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的雜烷基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的芳基(包括(但不限于)經(jīng)1-3個(gè)鹵素取代的芳基)、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)本發(fā)明的化合物包括一個(gè)以上R基團(tuán)時(shí)，各R基團(tuán)是獨(dú)立地經(jīng)選擇，而當(dāng)存在R′、R″、R″′和R″″基團(tuán)中的一個(gè)以上時(shí)，這些基團(tuán)同樣是各自獨(dú)立地經(jīng)選擇。當(dāng)R′和R″與同一氮原子連接時(shí)，其可與氮原子組合以形成5元環(huán)、6元環(huán)或7元環(huán)。舉例來(lái)說(shuō)，-NR′R″打算包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-嗎啉基。根據(jù)取代基的上述討論，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，術(shù)語(yǔ)“烷基”打算包括包含與除氫基以外的基團(tuán)結(jié)合的碳原子的基團(tuán)，諸如鹵烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和?；?包括(但不限于)-C(O)CH3，、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
類(lèi)似于關(guān)于烷基所述的取代基，芳基和雜芳基的取代基可變化且是選自(但不限于)鹵素、-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-鹵素、-SiR′R″R″′、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′C(O)NR′R″′、-NR″(O)2R′、-NR-C(NR′R″R″′)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR″′、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN以及-NO2、-R′、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基以及氟(C1-C4)烷基，數(shù)目在零到芳環(huán)系統(tǒng)上的開(kāi)放價(jià)態(tài)的總數(shù)的范圍內(nèi)；且其中R′、R″、R″′和R″″是獨(dú)立地選自氫、烷基、雜烷基、芳基和雜芳基。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)本發(fā)明的化合物包括一個(gè)以上R基團(tuán)時(shí)，各R基團(tuán)是獨(dú)立地經(jīng)選擇，而當(dāng)存在R′、R″、R″′和R″″基團(tuán)中的一個(gè)以上時(shí)，這些基團(tuán)同樣是各自獨(dú)立地經(jīng)選擇。
如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“經(jīng)調(diào)節(jié)的血清半衰期”意思是經(jīng)修飾hPP或hA或hFc的循環(huán)半衰期相對(duì)于其未經(jīng)修飾的形式存在正或負(fù)改變。血清半衰期是通過(guò)在給予hPP或hA或hFc后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲取血液樣本且測(cè)定各樣本中所述分子的濃度來(lái)進(jìn)行測(cè)量。血清濃度與時(shí)間的相關(guān)性允許計(jì)算血清半衰期。血清半衰期的增加理想地為至少約兩倍，但例如當(dāng)較小增加能夠促成令人滿意的給藥方案或避免毒性作用時(shí)，較小增加也可適用。在一些實(shí)施例中，所述增加為至少約3倍、至少約5倍或至少約10倍。
如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“經(jīng)調(diào)節(jié)的治療半衰期”意思是治療有效量的hPP或hA或hFc的半衰期相對(duì)于其未經(jīng)修飾的形式存在正或負(fù)改變。治療半衰期是通過(guò)測(cè)量給藥后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的藥物動(dòng)力學(xué)和/或藥效性質(zhì)來(lái)進(jìn)行測(cè)量。增加的治療半衰期理想地能夠促成特別有益的給藥方案、特別有益的總劑量或避免不合需要的作用。在一些實(shí)施例中，增加的治療半衰期是由增加的功效、增加或降低的經(jīng)修飾分子與其標(biāo)靶的結(jié)合、增加或降低的酶(諸如蛋白酶)對(duì)分子的降解或未經(jīng)修飾分子的另一參數(shù)或作用機(jī)理的增加或降低引起。
當(dāng)術(shù)語(yǔ)“經(jīng)分離”應(yīng)用于核酸或蛋白質(zhì)時(shí)，其表示所述核酸或蛋白質(zhì)不含其在天然狀態(tài)下締合的細(xì)胞組分中的至少一些組分，或所述核酸或蛋白質(zhì)已濃縮到高于其活體內(nèi)或活體外產(chǎn)生濃度的程度。其可呈均質(zhì)狀態(tài)。經(jīng)分離物質(zhì)可處于干燥或半干燥狀態(tài)或?yàn)槿芤?包括(但不限于)水溶液)。其可為包含其它醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑和/或賦形劑的醫(yī)藥組合物的組分。通常使用分析化學(xué)技術(shù)來(lái)測(cè)定純度和均質(zhì)性，所述技術(shù)諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜。作為制劑中所存在的主要物質(zhì)的蛋白質(zhì)實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化。具體來(lái)說(shuō)，經(jīng)分離基因是從側(cè)接所述基因且編碼除所關(guān)注的基因以外的蛋白質(zhì)的開(kāi)放閱讀框分離。術(shù)語(yǔ)“經(jīng)純化”表示核酸或蛋白質(zhì)在電泳凝膠中產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上一個(gè)條帶。具體來(lái)說(shuō)，其意思可能是核酸或蛋白質(zhì)為至少85％純、至少90％純、至少95％純、至少99％或99％以上純。
術(shù)語(yǔ)“核酸”是指脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸以及其單鏈或雙鏈形式的聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語(yǔ)還涵蓋含有具有與參考核酸類(lèi)似的結(jié)合性質(zhì)且以類(lèi)似于天然存在核苷酸的方式代謝的天然核苷酸的已知類(lèi)似物的核酸。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語(yǔ)也是指包括PNA(肽基核酸)、反義技術(shù)中使用的DNA的類(lèi)似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)的寡核苷酸類(lèi)似物。除非另外指出，否則特定核酸序列也暗示性涵蓋其保守性修飾變異體(包括(但不限于)簡(jiǎn)并密碼子取代)和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。具體來(lái)說(shuō)，可通過(guò)產(chǎn)生一個(gè)或一個(gè)以上所選(或全部)密碼子的第三位置經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來(lái)實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)并密碼子取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.195081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.2602605-2608(1985)；以及Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 891-98(1994))。
術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”以及“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，是指氨基酸殘基的聚合物。即，針對(duì)多肽的描述同樣適用于對(duì)肽的描述和對(duì)蛋白質(zhì)的描述，且反之亦然。所述術(shù)語(yǔ)適用于天然存在氨基酸聚合物以及一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸殘基為非天然編碼氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述術(shù)語(yǔ)涵蓋具有任何長(zhǎng)度的氨基酸鏈，包括全長(zhǎng)蛋白質(zhì)，其中氨基酸殘基通過(guò)共價(jià)肽鍵連接。
術(shù)語(yǔ)“氨基酸”是指天然存在和非天然存在的氨基酸，以及以類(lèi)似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸類(lèi)似物和氨基酸模擬物。天然編碼氨基酸為20種常見(jiàn)氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸以及纈氨酸)以及吡咯賴氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸類(lèi)似物是指具有與天然存在氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)(即，與氫、羧基、氨基以及R基團(tuán)結(jié)合的α-碳)的化合物，諸如高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。所述類(lèi)似物具有經(jīng)修飾R基團(tuán)(諸如，正亮氨酸)或經(jīng)修飾肽主鏈，但仍保留與天然存在氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。
氨基酸在本文中可由其通常已知的三字母符號(hào)或由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推薦的單字母符號(hào)來(lái)指代。同樣地，核苷酸可由其通常接受的單字母代碼來(lái)指代。
“保守性修飾變異體”適用于氨基酸與核酸序列。對(duì)于特定核酸序列來(lái)說(shuō)，“保守性修飾變異體”是指編碼一致或基本上一致的氨基酸序列的核酸，或當(dāng)核酸不編碼氨基酸序列時(shí)是指基本上一致的序列。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，大量功能相同的核酸編碼任何給定蛋白質(zhì)。舉例來(lái)說(shuō)，密碼子GCA、GCC、GCG以及GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密碼子指定的每一位置處，密碼子可改變?yōu)樗鱿鄳?yīng)密碼子中的任一個(gè)而不改變經(jīng)編碼的多肽。所述核酸變異為“沉默變異(silentvariation)”，其為保守性修飾變異中的一種。編碼多肽的本文中的每一核酸序列也描述核酸的每一種可能的沉默變異。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，核酸中的各密碼子(除通常為蛋氨酸的唯一密碼子的AUG和通常為色氨酸的唯一密碼子的TGG外)可經(jīng)修飾以產(chǎn)生功能相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的各沉默變異隱含在各所述序列中。
關(guān)于氨基酸序列，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，改變、添加或缺失編碼序列中的單個(gè)氨基酸或少量氨基酸的對(duì)核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列的個(gè)別取代、缺失或添加為“保守性修飾變異體”，其中所述改變將導(dǎo)致氨基酸的缺失、氨基酸的添加或化學(xué)上類(lèi)似的氨基酸對(duì)氨基酸的取代。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知提供功能類(lèi)似的氨基酸的保守性取代表。所述保守性修飾變異體是在本發(fā)明的多晶型變異體、種間同源物以及等位基因的范圍之外且不將其排除在外。
所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知提供功能類(lèi)似的氨基酸的保守性取代表。下列八組各自含有彼此互為保守性取代的氨基酸 1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)； 2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)； 3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)； 4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)； 5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、纈氨酸(V)； 6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)； 7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；以及 8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M) (例如參見(jiàn)Creighton，Proteins.Structures and Molecular Properties(W H Freeman& Co.；第2版(1993年12月))。
在兩個(gè)或兩個(gè)以上核酸或多肽序列的情形中，術(shù)語(yǔ)“一致”或“一致性”百分比是指相同的兩個(gè)或兩個(gè)以上序列或子序列。當(dāng)通過(guò)比較窗比較和比對(duì)最大對(duì)應(yīng)性時(shí)，或如使用下列序列比較算法(或所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員可用的其它算法)中的一種或通過(guò)手工比對(duì)和目測(cè)檢查來(lái)測(cè)量指定區(qū)域時(shí)，如果序列具有相同(即，在指定區(qū)域上具有約60％的一致性，約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％或約95％的一致性)的氨基酸殘基或核苷酸百分比，那么所述序列為“實(shí)質(zhì)上一致”的。這一定義也是指測(cè)試序列的互補(bǔ)序列。一致性可存在于長(zhǎng)度為至少約50個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域中，或長(zhǎng)度為75-100個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域中，或(在未指定時(shí))在多核苷酸或多肽的整個(gè)序列中。
對(duì)于序列比較來(lái)說(shuō)，通常使一個(gè)序列充當(dāng)與測(cè)試序列相比較的參考序列。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試序列與參考序列輸入計(jì)算機(jī)中，必要時(shí)指定子序列坐標(biāo)，且指定序列算法程序參數(shù)。可使用默認(rèn)程序參數(shù)，或可指定替代參數(shù)。然后，序列比較算法基于程序參數(shù)計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參考序列的序列一致性百分比。
如本文中所使用，“比較窗”包括提及選自由20到600、通常約50到約200、更通常約100到約150組成的群組的連續(xù)位置數(shù)目中的任一個(gè)的區(qū)段，其中可在將序列與具有相同數(shù)目的連續(xù)位置的參考序列最佳比對(duì)后對(duì)兩個(gè)序列進(jìn)行比較。所屬領(lǐng)域中的一般技術(shù)人員已知用于比較的序列比對(duì)方法。可如下進(jìn)行用于比較的序列的最佳比對(duì)，包括(但不限于)通過(guò)Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2482c的局部同源性算法；通過(guò)Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443的同源性比對(duì)算法；通過(guò)搜索Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 852444的相似方法；通過(guò)這些算法的計(jì)算機(jī)實(shí)施(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA)；或通過(guò)手動(dòng)比對(duì)和目測(cè)檢查(例如參見(jiàn)Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology(1995增刊))。
適于測(cè)定序列一致性百分比和序列相似性的算法的一個(gè)實(shí)例為BLAST和BLAST 2.0算法，其分別描述于Altschul等人，(1997)Nuc.Acids Res.253389-3402和Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215403-410中。執(zhí)行BLAST分析的軟件可通過(guò)在萬(wàn)維網(wǎng)的ncbi.nlm.nih.gov上獲得的美國(guó)生物技術(shù)信息中心(National Center forBiotechnology Information)公開(kāi)獲得。BLAST算法參數(shù)W、T及X將決定比對(duì)的靈敏性和速度。BLASTN程序(對(duì)于核苷酸序列)使用字長(zhǎng)(W)為11、期望值(E)為10、M＝5、N＝-4和兩條鏈的比較作為默認(rèn)值。對(duì)于氨基酸序列來(lái)說(shuō)，BLASTP程序使用字長(zhǎng)為3且期望值(E)為10和BLOSUM62計(jì)分矩陣(參見(jiàn)Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl，Acad.Sci.USA 8910915)、比對(duì)值(B)為50、期望值(E)為10、M＝5、N＝-4以及兩條鏈的比較作為默認(rèn)值。BLAST算法通常在“低復(fù)雜度”過(guò)濾關(guān)閉下執(zhí)行。
BLAST算法也執(zhí)行兩個(gè)序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)分析(例如參見(jiàn)Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5787)。由BLAST算法提供的一種相似性量度是最小和概率(P(N))，其提供兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間偶然會(huì)發(fā)生匹配的概率的指示。舉例來(lái)說(shuō)，如果在測(cè)試核酸與參考核酸的比較中，最小和概率小于約0.2，或小于約0.01，或小于約0.001，那么就認(rèn)為所述核酸與參考序列相似。
短語(yǔ)“與…選擇性(或特異性)雜交”是指當(dāng)特定核苷酸序列存在于復(fù)雜混合物(包括(但不限于)總細(xì)胞或文庫(kù)DNA或RNA)中時(shí)，在嚴(yán)格雜交條件下分子僅與所述序列結(jié)合、雙聯(lián)或雜交。
短語(yǔ)“嚴(yán)格雜交條件”是指DNA、RNA、PNA或其它核酸模擬物或其組合的序列在如所屬領(lǐng)域中已知的低離子強(qiáng)度和高溫條件下的雜交。在嚴(yán)格條件下，探針通常將會(huì)與核酸的復(fù)雜混合物(包括(但不限于)總細(xì)胞或文庫(kù)DNA或RNA)中的其標(biāo)靶子序列雜交，但不與復(fù)雜混合物中的其它序列雜交。嚴(yán)格條件具有序列依賴性且在不同環(huán)境下會(huì)有所不同。較長(zhǎng)序列在較高溫度下特異性雜交。核酸雜交的詳細(xì)指南可見(jiàn)于Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Probes，″Overview of principles of hybridization andthe strategy of nucleic acid assays″(1993)中。嚴(yán)格條件通常經(jīng)選擇為在規(guī)定離子濃度、pH值下比特異性序列的熱力學(xué)熔點(diǎn)(Tm)低約5℃-10℃。Tm是與標(biāo)靶互補(bǔ)的探針的50％在平衡狀態(tài)下與標(biāo)靶序列雜交(當(dāng)標(biāo)靶序列過(guò)量存在時(shí)，在Tm下，平衡時(shí)50％的探針被占據(jù))的溫度(在規(guī)定離子強(qiáng)度、pH值以及核酸濃度下)。嚴(yán)格條件可為在pH值為7.0到8.3下鹽濃度小于約1.0M鈉離子、通常約0.01M到1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)且溫度對(duì)于短探針(包括(但不限于)10到50個(gè)核苷酸)來(lái)說(shuō)為至少約30℃且對(duì)于長(zhǎng)探針(包括(但不限于)大于50個(gè)核苷酸)來(lái)說(shuō)為至少約60℃的那些條件。嚴(yán)格條件也可通過(guò)添加去穩(wěn)定劑(諸如，甲酰胺)來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)選擇性或特異性雜交來(lái)說(shuō)，陽(yáng)性信號(hào)可為至少兩倍背景、視情況10倍背景雜交。例示性嚴(yán)格雜交條件可如下50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培育，或5×SSC，1％SDS，在65℃下培育，其中在65℃下以0.2×SSC和0.1％SDS洗滌。所述洗滌可進(jìn)行5分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘或120分鐘以上。
如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“真核細(xì)胞”是指屬于系統(tǒng)發(fā)育域(phylogenetic domain)真核域(Eucarya)的生物體，諸如動(dòng)物(包括(但不限于)哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、爬行動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)等)、纖毛蟲(chóng)、植物(包括(但不限于)單子葉植物、雙子葉植物、藻類(lèi)等)、真菌、酵母、鞭毛蟲(chóng)、微孢子蟲(chóng)、原生生物等。
如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“非真核生物”是指非真核生物體。舉例來(lái)說(shuō)，非真核生物體可屬于真細(xì)菌(Eubacteria)(其包括(但不限于)大腸桿菌(Escherichia coli)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)等)系統(tǒng)發(fā)育域，或古細(xì)菌(Archaea)(其包括(但不限于)詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、產(chǎn)甲烷桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、諸如沃氏嗜鹽富饒菌(Haloferrax volcanii)和嗜鹽菌屬NRC-1(Halobacterium NRC-1)等嗜鹽菌、超嗜熱古菌(Archaeoglobusus)、強(qiáng)烈熾熱球菌(pyrococcus furiosus)、極端嗜熱古菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜熱泉生古細(xì)菌(Aeuropyrum pernix)等)系統(tǒng)發(fā)育域。
如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”是指動(dòng)物，在一些實(shí)施例中是指哺乳動(dòng)物，且在其它實(shí)施例中是指人類(lèi)，其是治療、觀察或?qū)嶒?yàn)的對(duì)象。
如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“有效量”是指會(huì)在一定程度上減輕所治療的疾病、病狀或病癥的一種或一種以上癥狀的所給予的經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽的量?？山o予含有本文中所述的經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽的組合物來(lái)進(jìn)行預(yù)防性、增強(qiáng)性和/或治療性治療。
術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)”意思是增加或延長(zhǎng)所需作用的效力或持續(xù)時(shí)間。因此，對(duì)于增強(qiáng)治療劑的作用來(lái)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)”是指在效力或持續(xù)時(shí)間方面增加或延長(zhǎng)其它治療劑對(duì)系統(tǒng)的作用的能力。如本文中所使用，“增強(qiáng)有效量”是指足以增強(qiáng)另一治療劑在所需系統(tǒng)中的作用的量。當(dāng)用于患者中時(shí)，對(duì)于此用途有效的量將視以下因素而定疾病、病癥或病狀的嚴(yán)重性和病程、先前療法、患者的健康狀況和對(duì)藥物的反應(yīng)以及主治醫(yī)師的判斷。
如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“經(jīng)修飾”是指對(duì)給定多肽所進(jìn)行的任何改變，諸如多肽的長(zhǎng)度、多肽的氨基酸序列、化學(xué)結(jié)構(gòu)、共翻譯修飾或翻譯后修飾的改變。形式“(經(jīng)修飾)”術(shù)語(yǔ)意思是所討論的多肽視情況經(jīng)修飾，即，所討論的多肽可經(jīng)修飾或不經(jīng)修飾。
術(shù)語(yǔ)“翻譯后修飾”是指在將天然或非天然氨基酸并入多肽鏈中以后發(fā)生的對(duì)所述氨基酸的任何修飾。僅舉例來(lái)說(shuō)，所述術(shù)語(yǔ)涵蓋共翻譯活體內(nèi)修飾、共翻譯活體外修飾(諸如，在無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中)、翻譯后活體內(nèi)修飾和翻譯后活體外修飾。
在預(yù)防性應(yīng)用中，將含有經(jīng)修飾的非天然氨基酸多肽的組合物給予易患特定疾病、病癥或病狀或處于患特定疾病、病癥或病狀的風(fēng)險(xiǎn)中的患者。所述量是定義為“預(yù)防有效量”。在這一用途中，精確量還視患者的健康狀況、體重等而定。認(rèn)為通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)(例如，劑量遞增臨床試驗(yàn))來(lái)確定所述預(yù)防有效量完全在所屬領(lǐng)域的技能范圍內(nèi)。
術(shù)語(yǔ)“經(jīng)保護(hù)”是指存在防止化學(xué)反應(yīng)性官能團(tuán)在某些反應(yīng)條件下反應(yīng)的“保護(hù)基”或部分。保護(hù)基將視所保護(hù)的化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)的類(lèi)型而改變。舉例來(lái)說(shuō)，如果化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)為胺或酰肼，那么保護(hù)基可選自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群組。如果化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)為硫醇，那么保護(hù)基可為鄰吡啶基二硫化物。如果化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)為諸如丁酸或丙酸等羧酸或羥基，那么保護(hù)基可為苯甲基或諸如甲基、乙基或叔丁基等烷基。本文中所述的方法和組合物中也可使用所屬領(lǐng)域中已知的其它保護(hù)基，包括對(duì)光不穩(wěn)定的基團(tuán)，諸如Nvoc和MeNvoc。本文中所述的方法和組合物中也可使用所屬領(lǐng)域中已知的其它保護(hù)基。
僅舉例來(lái)說(shuō)，封端/保護(hù)基可選自
其它保護(hù)基是描述于Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，John Wiley & Sons，New York，NY，1999中，其是以全文引用的方式并入本文中。
在治療性應(yīng)用中，將含有經(jīng)修飾的非天然氨基酸多肽的組合物以足以治愈或至少部分阻滯疾病、病癥或病狀的癥狀的量給予已患所述疾病、病狀或病癥的患者。所述量是定義為“治療有效量”且將視疾病、病癥或病狀的嚴(yán)重性和病程、先前療法、患者的健康狀況和對(duì)藥物的反應(yīng)以及主治醫(yī)師的判斷而定。認(rèn)為通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)(例如，劑量遞增臨床試驗(yàn))來(lái)確定所述治療有效量完全在所屬領(lǐng)域的技能范圍內(nèi)。
術(shù)語(yǔ)“治療”是用于指預(yù)防性和/或治療性治療。
本文中提出的非天然編碼氨基酸多肽可包括一個(gè)或一個(gè)以上原子經(jīng)具有與自然界中通常可見(jiàn)的原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)不同的原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)的原子置換的經(jīng)同位素標(biāo)記的化合物。可并入本發(fā)明化合物中的同位素的實(shí)例包括氫、碳、氮、氧、氟以及氯的同位素，分別諸如2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、35S、15F、36Cl。本文中所述的某些經(jīng)同位素標(biāo)記的化合物(例如合并有諸如3H和14C等放射性同位素的那些化合物)可適用于藥物和/或底物組織分布檢定。此外，用諸如氘(即2H)等同位素取代可提供某些由較高代謝穩(wěn)定性產(chǎn)生的治療優(yōu)勢(shì)，例如增加的活體內(nèi)半衰期或降低的劑量需求。
所有異構(gòu)體都被視作本文中所述的組合物的部分，包括(但不限于)非對(duì)映異構(gòu)體、對(duì)映異構(gòu)體以及其混合物。在另外或其它實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸多肽在給予需要產(chǎn)生代謝物的生物體之后代謝，所述代謝物然后用于產(chǎn)生所需效應(yīng)，包括所需治療效應(yīng)。在其它或另外實(shí)施例中，其為非天然編碼氨基酸多肽的活性代謝物。
在一些情形中，非天然編碼氨基酸多肽可以互變異構(gòu)體形式存在。另外，本文中所述的非天然編碼氨基酸多肽可以非溶劑化形式以及由諸如水、乙醇等醫(yī)藥學(xué)上可接受的溶劑形成的溶劑化形式存在。也認(rèn)為本文中公開(kāi)所述溶劑化形式。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，本文中的一些化合物可以多種互變異構(gòu)形式存在。所有這種互變異構(gòu)形式都被視作本文中所述的組合物的部分。
除非另作指示，否則使用所屬領(lǐng)域中的質(zhì)譜、NMR、HPLC、蛋白質(zhì)化學(xué)、生物化學(xué)、重組DNA技術(shù)以及藥理學(xué)的常規(guī)方法。

具體實(shí)施例方式 I.引言 本發(fā)明提供包含至少一個(gè)非天然氨基酸的hPP或hFc分子。在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，具有至少一個(gè)非天然氨基酸的hPP或hFc多肽包括至少一個(gè)翻譯后修飾。在一些實(shí)施例中，hPP是hA。在一個(gè)實(shí)施例中，hPP或hA或hFc的至少一個(gè)翻譯后修飾包含利用所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的適于特定反應(yīng)性基團(tuán)的化學(xué)方法學(xué)使包含第二反應(yīng)性基團(tuán)的分子與包含第一反應(yīng)性基團(tuán)的至少一個(gè)非天然氨基酸連接，所述分子包括(但不限于)標(biāo)記；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交聯(lián)劑；放射性核素、細(xì)胞毒性化合物；藥物；親和標(biāo)記；光親和標(biāo)記；反應(yīng)性化合物；樹(shù)脂；第二蛋白質(zhì)或多肽或多肽類(lèi)似物；抗體或抗體片段；金屬螯合劑；輔因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反義多核苷酸；糖類(lèi)、水溶性樹(shù)枝狀聚合物、環(huán)糊精、抑制性核糖核酸；生物材料；納米粒子；自旋標(biāo)記；熒光團(tuán)；含金屬的部分；放射性部分；新穎官能團(tuán)；與其它分子共價(jià)或非共價(jià)相互作用的基團(tuán)；光籠化部分；光化輻射可激發(fā)的部分；可光致異構(gòu)化部分；生物素；生物素衍生物；生物素類(lèi)似物；合并有重原子的部分；可化學(xué)裂解的基團(tuán)；可光裂解的基團(tuán)；延長(zhǎng)的側(cè)鏈；碳連接的糖；氧化還原活性劑；氨基硫代酸；毒性部分；經(jīng)同位素標(biāo)記的部分；生物物理探針；磷光基團(tuán)；化學(xué)發(fā)光基團(tuán)；電子致密基團(tuán)；磁性基團(tuán)；插入基團(tuán)；發(fā)色團(tuán)；能量轉(zhuǎn)移劑；生物活性劑；可檢測(cè)標(biāo)記；小分子；量子點(diǎn)；納米傳遞素；放射性核苷酸；放射性傳遞素；中子捕獲劑；或上述物質(zhì)的任何組合或任何其它所需的化合物或物質(zhì)。舉例來(lái)說(shuō)，第一反應(yīng)性基團(tuán)為炔基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸對(duì)炔丙氧基苯基丙氨酸中，其中炔丙基有時(shí)也稱(chēng)為乙炔部分)，且第二反應(yīng)性基團(tuán)為疊氮基部分，且利用[3+2]環(huán)加成化學(xué)方法學(xué)。在另一實(shí)例中，第一反應(yīng)性基團(tuán)為疊氮基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸對(duì)疊氮基-L-苯丙氨酸中)，且第二反應(yīng)性基團(tuán)為炔基部分。在本發(fā)明的經(jīng)修飾hPP或hA或hFc多肽的某些實(shí)施例中，使用至少一個(gè)包含至少一個(gè)翻譯后修飾的非天然氨基酸(包括(但不限于)含有酮基官能團(tuán)的非天然氨基酸)，其中至少一個(gè)翻譯后修飾包含糖部分。在某些實(shí)施例中，翻譯后修飾是在真核細(xì)胞或非真核細(xì)胞中活體內(nèi)進(jìn)行。連接子、聚合物、水溶性聚合物或其它分子可使分子與多肽連接。分子可直接連接到多肽。
在某些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)包括至少一個(gè)由一種宿主細(xì)胞在活體內(nèi)進(jìn)行的翻譯后修飾，其中翻譯后修飾通常無(wú)法通過(guò)另一種宿主細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行。在某些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)包括至少一個(gè)由真核細(xì)胞在活體內(nèi)進(jìn)行的翻譯后修飾，其中翻譯后修飾通常無(wú)法通過(guò)非真核細(xì)胞進(jìn)行。翻譯后修飾的實(shí)例包括(但不限于)糖基化、乙酰化、?；⒅|(zhì)修飾、棕櫚?；⒆貦八猁}加成、磷酸化、糖脂鍵修飾等。在一個(gè)實(shí)施例中，翻譯后修飾包含通過(guò)GlcNAc-天冬酰胺鍵使寡糖與天冬酰胺連接(包括(但不限于)其中寡糖包含(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc等)。在另一實(shí)施例中，翻譯后修飾包含通過(guò)GalNAc-絲氨酸、GalNAc-蘇氨酸、GlcNAc-絲氨酸或GlcNAc-蘇氨酸鍵使寡糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)與絲氨酸或蘇氨酸連接。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可包含分泌或定位序列、抗原決定基標(biāo)記、FLAG標(biāo)簽、聚組氨酸標(biāo)簽、GST融合物等。分泌信號(hào)序列的實(shí)例包括(但不限于)原核生物分泌信號(hào)序列、真核生物分泌信號(hào)序列、為進(jìn)行細(xì)菌表達(dá)而優(yōu)化5′的真核生物分泌信號(hào)序列、新穎的分泌信號(hào)序列、果膠裂解酶分泌信號(hào)序列、OmpA分泌信號(hào)序列以及噬菌體分泌信號(hào)序列。分泌信號(hào)序列的實(shí)例包括(但不限于)STII(原核生物)、Fd GUI和M13(噬菌體)、Bgl2(酵母)以及源自轉(zhuǎn)座子的信號(hào)序列bla。
所關(guān)注的蛋白質(zhì)或多肽可含有至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)、至少七個(gè)、至少八個(gè)、至少九個(gè)或十個(gè)或十個(gè)以上非天然氨基酸。所述非天然氨基酸可相同或不同，例如蛋白質(zhì)中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10個(gè)以上不同位點(diǎn)，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10個(gè)以上不同的非天然氨基酸。在某些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)的天然存在形式中所存在的至少一個(gè)(但少于全部)特定氨基酸是經(jīng)非天然氨基酸取代。
本發(fā)明提供基于hPP家族的成員(尤其hA或hFc)的包含至少一個(gè)非天然編碼氨基酸的方法和組合物。在hPP或hA或hFc家族成員中引入至少一個(gè)非天然編碼氨基酸可允許應(yīng)用涉及特異性化學(xué)反應(yīng)的結(jié)合化學(xué)，所述特異性化學(xué)反應(yīng)包括(但不限于)與一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸反應(yīng)而不與通常存在的20種氨基酸反應(yīng)。在一些實(shí)施例中，包含非天然編碼氨基酸的hPP或hA或hFc家族成員經(jīng)由非天然編碼氨基酸的側(cè)鏈與諸如聚乙二醇(PEG)等水溶性聚合物連接。本發(fā)明提供通過(guò)使蛋白質(zhì)與包括(但不限于)聚合物、連接子或生物活性分子的其它分子偶合來(lái)選擇性修飾蛋白質(zhì)的高效方法，所述方法涉及響應(yīng)選擇密碼子在蛋白質(zhì)中選擇性并入非遺傳編碼氨基酸，所述氨基酸包括(但不限于)含有20種天然合并的氨基酸中未見(jiàn)的官能團(tuán)或取代基(包括(但不限于)酮基、疊氮或乙炔部分)的那些氨基酸，以及隨后用合適反應(yīng)性分子修飾所述氨基酸。一旦并入氨基酸側(cè)鏈，就可通過(guò)利用所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的適于非天然編碼氨基酸中所存在的特定官能團(tuán)或取代基的化學(xué)方法學(xué)來(lái)修飾這些氨基酸側(cè)鏈。多種已知的化學(xué)方法學(xué)適用于在本發(fā)明中使分子與蛋白質(zhì)偶合。這些方法學(xué)包括(但不限于)分別利用包括(但不限于)乙炔或疊氮化物衍生物的休斯根[3+2]環(huán)加成反應(yīng)(Huisgen[3+2]cycloaddition reaction)(例如參見(jiàn)Padwa，A.in Comprehensive Organic Synthesis，第4卷，(1991)Trost，B.M編，Pergamon，Oxford，第1069-1109頁(yè)；和Huisgen，R.，1，3-Dipolar CycloadditionChemistry，(1984)Padwa，A.編，Wiley，New York，第1-176頁(yè))。
本發(fā)明提供具有多種官能團(tuán)、取代基或部分的物質(zhì)與其它物質(zhì)的結(jié)合物，所述其它物質(zhì)包括(但不限于)標(biāo)記；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交聯(lián)劑；放射性核素；細(xì)胞毒性化合物；藥物；親和標(biāo)記；光親和標(biāo)記；反應(yīng)性化合物；樹(shù)脂；第二蛋白質(zhì)或多肽或多肽類(lèi)似物；抗體或抗體片段；金屬螯合劑；輔因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反義多核苷酸；糖類(lèi)；水溶性樹(shù)枝狀聚合物；環(huán)糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；納米粒子；自旋標(biāo)記；熒光團(tuán)；含金屬的部分；放射性部分；新穎官能團(tuán)；與其它分子共價(jià)或非共價(jià)相互作用的基團(tuán)；光籠化部分；光化輻射可激發(fā)的部分；可光致異構(gòu)化部分；生物素；生物素衍生物；生物素類(lèi)似物；合并有重原子的部分；可化學(xué)裂解的基團(tuán)；可光裂解的基團(tuán)；延長(zhǎng)的側(cè)鏈；碳連接的糖；氧化還原活性劑；氨基硫代酸；毒性部分；經(jīng)同位素標(biāo)記的部分；生物物理探針；磷光基團(tuán)；化學(xué)發(fā)光基團(tuán)；電子致密基團(tuán)；磁性基團(tuán)；插入基團(tuán)；發(fā)色團(tuán)；能量轉(zhuǎn)移劑；生物活性劑；可檢測(cè)標(biāo)記；小分子；量子點(diǎn)；納米傳遞素；放射性核苷酸；放射性傳遞素；中子捕獲劑；或上述物質(zhì)的任何組合或任何其它所需的化合物或物質(zhì)。本發(fā)明還包括具有疊氮或乙炔部分的物質(zhì)與具有相應(yīng)乙炔或疊氮部分的PEG聚合物衍生物的結(jié)合物。舉例來(lái)說(shuō)，含有疊氮部分的PEG聚合物可在蛋白質(zhì)的含有具有乙炔官能團(tuán)的非遺傳編碼氨基酸的位置處與生物活性分子偶合。使PEG與生物活性分子偶合的鍵聯(lián)包括(但不限于)休斯根[3+2]環(huán)加成產(chǎn)物。
II.人類(lèi)血漿蛋白家族 如本文中所使用，“人類(lèi)血漿蛋白或多肽”或“hPP”包括正常人類(lèi)血漿中可見(jiàn)的那些多肽和蛋白質(zhì)，包括hPP類(lèi)似物、hPP同種型、hPP模擬物、hPP片段、雜交hPP蛋白、其融合蛋白、寡聚物和多聚物、同源物、糖基化模式變異體、變異體、剪接變異體以及突變蛋白，而不考慮以上各物的生物活性且更不考慮其合成或制造方法，所述方法包括(但不限于)重組(由cDNA、基因組DNA、合成DNA或核酸的其它形式制備)、活體外、活體內(nèi)、微注射核酸分子、合成、轉(zhuǎn)基因?qū)W以及基因激活方法。所屬領(lǐng)域中已知多種hPP且其可見(jiàn)于Anderson等人，Molecular & CellularProteomics，3.4311-326(2004)和Ping等人，Proteomics，53506-3519(2005)中，所述參考文獻(xiàn)以引用的方式并入本文中。
將來(lái)很可能發(fā)現(xiàn)hPP家族的其它成員。hPP家族的新成員可通過(guò)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)序列的計(jì)算機(jī)輔助的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析且通過(guò)設(shè)計(jì)用于鑒別結(jié)合特定標(biāo)靶的分子的選擇技術(shù)來(lái)鑒別。hPP超基因家族的成員通常具有通過(guò)非螺旋氨基酸連接的四個(gè)或五個(gè)兩親螺旋(環(huán)區(qū))。所述蛋白質(zhì)可在其N(xiāo)-末端含有疏水性信號(hào)序列來(lái)促進(jìn)從細(xì)胞分泌。這些后來(lái)發(fā)現(xiàn)的hPP超基因家族的成員也包括在本發(fā)明內(nèi)。
因此，hPP家族或hA的描述僅是出于說(shuō)明性目的且以舉例的方式提供且不限制本文中所述的方法、組合物、策略以及技術(shù)的范圍。另外，本申請(qǐng)文件中提及hPP或hA多肽是打算將此通稱(chēng)用作hPP家族的任何成員的實(shí)例。因此，應(yīng)了解本文中參考hPP或hA多肽或蛋白質(zhì)所述的修飾和化學(xué)反應(yīng)同樣可應(yīng)用于hPP家族的任何成員，包括本文中特別列出的那些成員。
III. 本發(fā)明中使用的一般重組核酸方法 在本發(fā)明的許多實(shí)施例中，將使用重組方法來(lái)分離、克隆和通常改變編碼所關(guān)注的hPP多肽的核酸。所述實(shí)施例是用于包括(但不限于)蛋白質(zhì)表達(dá)或產(chǎn)生源自hPP或hFc多肽的變異體、衍生物、表達(dá)盒或其它序列的過(guò)程中。在一些實(shí)施例中，編碼本發(fā)明的多肽的序列可操作性連接到異源啟動(dòng)子。hPP的分離和hPP在宿主細(xì)胞中的產(chǎn)生例如描述于美國(guó)專(zhuān)利第5,648,243號(hào)、第5,707,828號(hào)和第5,521,287號(hào)中，所述參考文獻(xiàn)以引用的方式并入本文中。
可以母體多肽的氨基酸序列(包括(但不限于)具有SEQ ID NO1中所示的氨基酸序列)為基礎(chǔ)來(lái)合成編碼包含非天然編碼氨基酸的hPP多肽的核苷酸序列，且然后改變所述核苷酸序列以實(shí)現(xiàn)相關(guān)氨基酸殘基的引入(即，并入或取代)或移除(即，缺失或取代)。可以母體多肽的氨基酸序列(包括(但不限于)具有SEQ ID NO22中所示的氨基酸序列)為基礎(chǔ)來(lái)合成編碼包含非天然編碼氨基酸的hFc多肽的核苷酸序列，且然后改變所述核苷酸序列以實(shí)現(xiàn)相關(guān)氨基酸殘基的引入(即，并入或取代)或移除(即，缺失或取代)?？筛鶕?jù)常規(guī)方法通過(guò)定點(diǎn)誘變來(lái)方便地修飾核苷酸序列?；蛘?，可通過(guò)化學(xué)合成(包括(但不限于)通過(guò)使用寡核苷酸合成器，其中寡核苷酸是基于所需多肽的氨基酸序列來(lái)設(shè)計(jì))來(lái)制備核苷酸序列，且優(yōu)先選擇將產(chǎn)生重組多肽的宿主細(xì)胞中所偏好的那些密碼子。舉例來(lái)說(shuō)，可通過(guò)PCR、連接或連接鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)合成和組裝編碼所需多肽的部分的若干小寡核苷酸。例如參見(jiàn)Barany等人，Proc.Natl.Acad.Sci.88189-193(1991)；美國(guó)專(zhuān)利6,521,427，其以引用的方式并入本文中。
本發(fā)明利用重組遺傳學(xué)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。公開(kāi)本發(fā)明中使用的一般方法的基礎(chǔ)文章包括Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版，2001)；Kriegler，Gene Transfer and ExpressionA Laboratory Manual(1990)；和CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel等人編，1994)。
描述分子生物技術(shù)的一般文章包括Berger和Kimmel，Guide to Molecular CloningTechniques，Methods in Enzymology第152卷Academic Press，Inc.，San Diego，CA(Berger)；Sambrook等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第2版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989(″Sambrook″)和Current Protocols in Molecular Biology，F(xiàn).M.Ausubel等人編，Current Protocols，GreenePublishing Associates，Inc.與John Wiley & Sons，Inc.合資(1999增刊)(″Ausubel″)。這些文章描述誘變、載體的使用、啟動(dòng)子和許多其它相關(guān)主題，所述相關(guān)主題涉及包括(但不限于)包括用于產(chǎn)生包括非天然氨基酸、正交tRNA、正交合成酶和其對(duì)的蛋白質(zhì)的選擇密碼子的基因或多核苷酸的產(chǎn)生。
本發(fā)明出于多種目的使用各種類(lèi)型的誘變，所述目的包括(但不限于)產(chǎn)生新穎合成酶或tRNA、使tRNA分子突變、使編碼合成酶的多核苷酸突變、產(chǎn)生tRNA文庫(kù)、產(chǎn)生合成酶文庫(kù)、產(chǎn)生選擇密碼子、在所關(guān)注的蛋白質(zhì)或多肽中插入編碼非天然氨基酸的選擇密碼子。所述誘變包括(但不限于)定點(diǎn)誘變、隨機(jī)點(diǎn)誘變、同源重組、DNA改組或其它遞歸誘變方法、嵌合構(gòu)筑、使用含尿嘧啶的模板的誘變、寡核苷酸定向誘變、硫代磷酸酯修飾的DNA誘變、使用缺口雙螺旋DNA的誘變等，或其任何組合。其它合適的方法包括點(diǎn)錯(cuò)配修復(fù)、使用修復(fù)缺陷型宿主品系的誘變、限制性選擇和限制性純化、缺失誘變、通過(guò)總基因合成進(jìn)行的誘變、雙鏈斷裂修復(fù)等。包括(但不限于)涉及嵌合構(gòu)筑體的誘變也包括在本發(fā)明內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施例中，可通過(guò)天然存在的分子或已改變或突變的天然存在的分子的己知信息(包括(但不限于)序列、序列比較、物理性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)或四級(jí)結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)等)來(lái)指導(dǎo)誘變。
本文中可見(jiàn)的文章和實(shí)例描述這些程序。其它信息可見(jiàn)于下列公開(kāi)文獻(xiàn)和其中所引用的參考文獻(xiàn)中Ling等人，Approaches to DNA mutagenesis an overvew，AnalBiochem.254(2)157-178(1997)；Dale等人，Oligonucleotide-directed randommutagenesis using the phosphorothioate method，Methods Mol.Biol.57369-374(1996)；Smith，In vitro mutagenesis，Ann.Rev.Genet.19423-462(1985)；Botstein和Shortle，Strategies and applications of in vitro mutagenesis，Science 2291193-1201(1985)；Carter，Site-directed mutagenesis.Biochem.J.2371-7(1986)；Kunkel，The efficiency ofoligonucleotide directed mutagenesis，Nucleic Acids & Molecular Biology(Eckstein，F(xiàn).和Lilley，D.M.J編，Springer Verlag，Berlin)(1987)；Kunkel，Rapid and efficientsite-specific mutagenesis without phenotytpic selection，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82488-492(1985)；Kunkel等人，Rapid and efficient site-specific mutagenesis withoutphenotyrpic selection，Methods in Enzymol.154，367-382(1987)；Bass等人，Mutant Trprepressors with new DNA-binding specificities，Science 242240-245(1988)；Zoller和Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectorsanefficient andμeneral procedure for the production of point mutations inany DNA fragment，NucleicAcids Res.106487-6500(1982)；Zoller和Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesisof DNA fragments cloned into MB vectors，Methods in Enzymol.100468-500(1983)；Zoller和Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesisa simple method using twooligonucleotide primers and a single-stranded DNA template，Methods in Enzymol.154329-350(1987)；Taylor等人，The use of phosphor othioate-modified DNA inrestriction enzyme reactions to prepare nicked DNA，Nucl.Acids Res.138749-8764(1985)；Taylor等人，The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at highfrequency using phosphorothiate-modified DNA.Nucl.Acids Res.138765-8785(1985)；Nakamaye和Eckstein，Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage byphosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis，Nucl.Acids Res.149679-9698(1986)；Sayers等人，5′-3′Exonu cleases inphosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis，Nucl.Acids Res.16791-802(1988)；Sayers等人，Strand specific cleavage of phosphorothioate-containingDNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide，(1988)Nucl.Acids Res.16803-814；Kramer等人，The gapped duplex DNA approach tooligonucleotide-directed mutation construction，Nucl.Acids Res.129441-9456(1984)；Kramer和Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplexDNA，Methods in Enzymol.154350-367(1987)；Kramer等人，Improved enzymatic invitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directedconstruction of mutations，Nucl.Acids Res.167207(1988)；Fritz等人，Oligonucleotide-directed construction of mutationsa gapped duplex DNA procedurewithout enzymatic reactions in vitro，Nucl.Acids Res.166987-6999(1988)；Kramer等入，Different base/base mismatches are corrected with different efficiencies by themethyl-directed DNA mismatch-repair system of E.coli，Cell 38879-887(1984)；Carter等人，Improyed oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors，Nucl.AcidsRes.134431-4443(1985)；Carter，Improved oligonucleotide-directed mutagenesis usingM13 vectors，Methods in Enzymol.154382-403(1987)；Eghtedarzadeh和Henikoff，Useof oligonucleotides to generate large deletions，Nucl.Acids Res.145115(1986)；Wells等人，Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition statg ofsubtilisin，Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317415-423(1986)；Nambiar等人，Totalsynthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein，Science 2231299-1301(1984)；Sakmar和Khorana，Total synthesis and expression of a gene for thealpha-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleoyide-binding protein(transducin)，Nucl.Acids Res.146361-6372(1988)；Wells等人，Cassette mutagenesisan efficient method for generation of multiple mutations at defined sites，Gene34315-323(1985)；

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例如用于本發(fā)明的誘變(例如使合成酶文庫(kù)突變或改變tRNA)的寡核苷酸通常是根據(jù)Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Letts.22(20)1859-1862，(1981)所描述的固相亞磷酰胺三酯方法例如使用如Needham-VanDevanter等人，Nucleic Acids Res.，126159-6168(1984)中所述的自動(dòng)合成儀以化學(xué)方式合成。
本發(fā)明也涉及經(jīng)由正交tRNA/RS對(duì)在活體內(nèi)并入非天然氨基酸的真核宿主細(xì)胞、非真核宿主細(xì)胞和生物體。利用本發(fā)明的多核苷酸或包括本發(fā)明的多核苷酸的構(gòu)筑體(包括(但不限于)本發(fā)明載體，其可例如為克隆載體或表達(dá)載體)使宿主細(xì)胞遺傳工程化(包括(但不限于)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)。舉例來(lái)說(shuō)，使正交tRNA、正交tRNA合成酶和欲衍生化的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)與在所需宿主細(xì)胞中起作用的基因表達(dá)控制元件可操作地連接。例如，載體可呈質(zhì)粒、科斯質(zhì)粒(cosmid)、噬菌體、細(xì)菌、病毒、裸多核苷酸或結(jié)合多核苷酸的形式。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法將載體引入細(xì)胞和/或微生物中，所述方法包括電穿孔(Fromm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，5824(1985))、通過(guò)病毒載體感染、由具有核酸的小粒子在小珠粒或粒子的基質(zhì)內(nèi)或表面上高速?gòu)椀罎B透(Klein等人，Nature 327，70-73(1987))等。
可在經(jīng)改良適用于諸如篩選步驟、激活啟動(dòng)子或選擇轉(zhuǎn)化株等活動(dòng)的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)工程化的宿主細(xì)胞。視情況，可將這些細(xì)胞培養(yǎng)到轉(zhuǎn)基因生物體中。關(guān)于包括(但不限于)細(xì)胞分離和培養(yǎng)(例如用于后續(xù)的核酸分離)的其它有用參考文獻(xiàn)包括Freshney(1994)Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique，第3版，Wiley-Liss，NewYork和其中所引用的參考文獻(xiàn)；Payne等人，(1992)Plant Cell andTissue Culture in Liquid SystemsJohn Wiley & Sons，Inc.New York，NY；Gamborg和Phillips(編)(1995)Plant Cell，Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods SpringerLab Manual，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)以及Atlas和Parks(編)TheHandbook of Microbiological Media(1993)CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L。
可使用將標(biāo)靶核酸引入細(xì)胞中的數(shù)種熟知的方法，其中任一種都可用于本發(fā)明中。這些方法包括接受者細(xì)胞與含有DNA的細(xì)菌原生質(zhì)體融合、電穿孔、基因槍法(proiectile bombardment)和經(jīng)病毒載體(在下文中進(jìn)一步論述)感染等。細(xì)菌細(xì)胞可用于擴(kuò)增含有本發(fā)明的DNA構(gòu)筑體的質(zhì)粒的數(shù)目。使細(xì)菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且可通過(guò)所屬領(lǐng)域中已知的多種方法分離細(xì)菌中的質(zhì)粒(例如參見(jiàn)Sambrook)。另外，可購(gòu)得試劑盒以從細(xì)菌中純化質(zhì)粒(例如參見(jiàn)都來(lái)自Pharmacia Biotech的EasyPrepTM、FlexiPrepTM； 來(lái)自Stratagene的StrataCleanTM；以及來(lái)自Qiagen的QIAprepTM)。然后，進(jìn)一步操縱經(jīng)分離和純化的質(zhì)粒以產(chǎn)生其它質(zhì)粒，將其用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞或并入相關(guān)載體中以感染生物體。典型載體含有轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、轉(zhuǎn)錄和翻譯起始序列以及可用于調(diào)控特定標(biāo)靶核酸的表達(dá)的啟動(dòng)子。載體視情況包含通用表達(dá)盒，其含有至少一個(gè)獨(dú)立終止子序列、允許表達(dá)盒在真核細(xì)胞或原核細(xì)胞或兩者中復(fù)制的序列(包括(但不限于)穿梭載體(shuttle vector))以及用于原核生物系統(tǒng)與真核生物系統(tǒng)的選擇標(biāo)記。載體適用于在原核細(xì)胞、真核細(xì)胞或兩者中復(fù)制和整合。參見(jiàn)Gillam和Smith Gene 881(1979)；Roberts等人，Nature.328731(1987)；Schneider，E.等人，Protein Expr.Purif.6(1)10-14(1995)；Ausubel，Sambrook，Berger(所有都同上文)。舉例來(lái)說(shuō)，ATCC(例如，由ATCC出版的The ATCC Catalogue ofBacteria and Bacteriophage(1992)Gherna等人(編))提供適用于克隆的細(xì)菌和噬菌體的目錄。用于測(cè)序、克隆和分子生物學(xué)的其它方面的其它基本程序以及基礎(chǔ)理論考慮也見(jiàn)于Watson等人，(1992)Recombinant DNA第2版Scientific American Books，NY。另外，基本上任何核酸(和幾乎任何標(biāo)記核酸，無(wú)論標(biāo)準(zhǔn)或非標(biāo)準(zhǔn))都可從多種商業(yè)來(lái)源中的任一種定制或標(biāo)準(zhǔn)定購(gòu)，這些商業(yè)來(lái)源諸如Midland Certified ReagentCompany(Midland，TX，在萬(wàn)維網(wǎng)的mcrc.com上獲得)、The Great American GeneCompany(Ramona，CA，在萬(wàn)維網(wǎng)的genco.com上獲得)、ExrpressGen Inc.(Chicago，IL，在萬(wàn)維網(wǎng)的expressgen.com上獲得)、Operon Technologies Inc.(Alameda，CA)和許多其它來(lái)源。
選擇密碼子 本發(fā)明的選擇密碼子將擴(kuò)充蛋白質(zhì)生物合成機(jī)構(gòu)的遺傳密碼子框架。舉例來(lái)說(shuō)，選擇密碼子包括(但不限于)獨(dú)特三堿基密碼子、無(wú)義密碼子(諸如終止密碼子，包括(但不限于)琥珀密碼子(UAG)、赭石密碼子或蛋白石密碼子(UGA))、非天然密碼子、四個(gè)或四個(gè)以上堿基的密碼子、稀有密碼子等。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員顯而易見(jiàn)，可引入所需基因或多核苷酸中的選擇密碼子的數(shù)目范圍很廣，其包括(但不限于)在編碼hPP多肽的至少一部分的單一多核苷酸中存在一個(gè)或一個(gè)以上、兩個(gè)或兩個(gè)以上、三個(gè)或三個(gè)以上、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)或10個(gè)以上選擇密碼子。
在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法涉及使用作為終止密碼子的選擇密碼子，以在活體內(nèi)并入一個(gè)或一個(gè)以上非天然氨基酸。舉例來(lái)說(shuō)，產(chǎn)生識(shí)別包括(但不限于)UAG的終止密碼子的O-tRNA且通過(guò)O-RS利用所需非天然氨基酸使O-tRNA氨?；?。天然存在的宿主氨?；鵷RNA合成酶無(wú)法識(shí)別所述O-tRNA?？墒褂贸Ｒ?guī)定點(diǎn)突變?cè)谒P(guān)注的多肽的所關(guān)注位點(diǎn)處引入包括(但不限于)TAG的終止密碼子。例如參見(jiàn)Sayers，J.R.等人，(1988)，5′-3′Exonucleases inphosphorothioate-based oligonucleotide-directedmutagenesis.Nucleic Acids Res.16791-802。當(dāng)在活體內(nèi)組合O-RS、O-tRNA和編碼所關(guān)注的多肽的核酸時(shí)，響應(yīng)UAG密碼子并入非天然氨基酸以產(chǎn)生在特定位置處含有非天然氨基酸的多肽。
活體內(nèi)并入非天然氨基酸可在不顯著干擾真核宿主細(xì)胞的情況下進(jìn)行。舉例來(lái)說(shuō)，因?yàn)閁AG密碼子的抑制效率取決于O-tRNA(包括(但不限于)琥珀抑制因子tRNA)與真核生物釋放因子(包括(但不限于)eRF)(其結(jié)合終止密碼子且起始正在生長(zhǎng)的肽從核糖體中的釋放)之間的競(jìng)爭(zhēng)，所以抑制效率可通過(guò)包括(但不限于)增加O-tRNA和/或抑制因子tRNA的表達(dá)水平來(lái)調(diào)節(jié)。
也可利用稀有密碼子來(lái)編碼非天然氨基酸。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)降低活體外蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中的精氨酸濃度時(shí)，已證明稀有精氨酸密碼子AGG有效用于通過(guò)經(jīng)丙氨酸?；暮铣蓆RNA插入Ala。例如參見(jiàn)Ma等人，Biochemistry.327939(1993)。在這種情況下，合成tRNA與作為大腸桿菌中的次要物質(zhì)存在的天然存在tRNAArg競(jìng)爭(zhēng)。一些生物體并不使用所有三聯(lián)體密碼子。已利用藤黃微球菌(Micrococcus luteus)中的未指定密碼子AGA在活體外轉(zhuǎn)錄/翻譯提取物中插入氨基酸。例如參見(jiàn)Kowal和Oliver，Nucl.Acid.Res.，254685(1997)?？僧a(chǎn)生本發(fā)明的組件以在活體內(nèi)使用這些稀有密碼子。
選擇密碼子還包含延長(zhǎng)密碼子，包括(但不限于)四個(gè)或四個(gè)以上堿基的密碼子，諸如四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)或六個(gè)以上堿基的密碼子。四個(gè)堿基的密碼子的實(shí)例包括(但不限于)AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五個(gè)堿基的密碼子的實(shí)例包括(但不限于)AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等。本發(fā)明的特征包括使用基于移碼抑制(frameshift suppression)的延長(zhǎng)密碼子。四個(gè)或四個(gè)以上堿基的密碼子可將包括(但不限于)一個(gè)或一個(gè)以上非天然氨基酸插入同一蛋白質(zhì)中。舉例來(lái)說(shuō)，在存在具有反密碼子環(huán)(例如，具有至少8-10nt的反密碼子環(huán))的突變O-tRNA(包括(但不限于)特定移碼抑制因子tRNA)的情況下，將四個(gè)或四個(gè)以上堿基的密碼子讀作單一氨基酸。在其它實(shí)施例中，反密碼子環(huán)可解碼包括(但不限于)至少一個(gè)四個(gè)堿基的密碼子、至少一個(gè)五個(gè)堿基的密碼子或至少一個(gè)六個(gè)堿基的密碼子或更多堿基的密碼子。因?yàn)榇嬖?56種可能的四個(gè)堿基的密碼子，所以可使用四個(gè)或四個(gè)以上堿基的密碼子在同一細(xì)胞中編碼多個(gè)非天然氨基酸。參見(jiàn)Anderson等人，(2002)Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size，Chemistryand Biology，9237-244；Magliery，(2001)Expanding the Genetic Code.Selection ofEfficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of″Shiffy″Four-baseCodons with a Library Approach in Escherichia coli.J.Mol.Biol.307755-769。
舉例來(lái)說(shuō)，已經(jīng)使用活體外生物合成方法利用四個(gè)堿基的密碼子將非天然氨基酸并入蛋白質(zhì)中。例如參見(jiàn)Ma等人，(1993)Biochemistry，327939；和Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc，12134。使用CGGG和AGGU，從而在活體外利用兩個(gè)化學(xué)?；囊拼a抑制因子tRNA同時(shí)將2-萘基丙氨酸和賴氨酸的NBD衍生物并入抗生蛋白鏈菌素中。例如參見(jiàn)Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc，12112194。在活體內(nèi)研究中，Moore等人檢查具有NCUA反密碼子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密碼子(N可為U、A、G或C)的能力且發(fā)現(xiàn)四聯(lián)體UAGA可通過(guò)具有UCUA反密碼子的tRNALeu以13％到26％的效率解碼，其中在0或-1框架中極少解碼。參見(jiàn)Moore等人，(2000)J.Mol.Biol.，298195。在一個(gè)實(shí)施例中，可在本發(fā)明中使用基于稀有密碼子或無(wú)義密碼子的延長(zhǎng)密碼子，其可減少其它不合需要的位點(diǎn)處的錯(cuò)義通讀和移碼抑制。
對(duì)于給定系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，選擇密碼子也可包括一個(gè)天然的三個(gè)堿基的密碼子，其中內(nèi)源性系統(tǒng)不使用(或很少使用)天然堿基密碼子。舉例來(lái)說(shuō)，這包括缺乏識(shí)別天然的三個(gè)堿基的密碼子的tRNA的系統(tǒng)和/或三個(gè)堿基的密碼子為稀有密碼子的系統(tǒng)。
選擇密碼子視情況包括非天然堿基對(duì)。這些非天然堿基對(duì)進(jìn)一步擴(kuò)充現(xiàn)有的遺傳代碼。一個(gè)額外的堿基對(duì)使三聯(lián)體密碼子的數(shù)目從64增加到125。第三堿基對(duì)的性質(zhì)包括穩(wěn)定且具選擇性的堿基配對(duì)、通過(guò)聚合酶以高保真性有效地酶促并入DNA中以及在合成新的非天然堿基對(duì)之后有效的持續(xù)引物延伸。可適于方法和組合物的非天然堿基對(duì)的描述例如包括Hirao等人，(2002)An unnatural base pair forincorporating amino acid analogues into protein，Nature Biotechnology，20177-182。
也參見(jiàn)Wu，Y.等人，(2002)J.Am.Chem.Soc.12414626-14630。其它相關(guān)公開(kāi)文獻(xiàn)列于下文中。
對(duì)于活體內(nèi)使用來(lái)說(shuō)，非天然核苷是膜可滲透的且磷酸化以形成相應(yīng)的三磷酸鹽。另外，增加的遺傳信息為穩(wěn)定的且不受細(xì)胞酶破壞。Benner和其它人先前的工作利用不同于典型Watson-Crick配對(duì)的氫鍵模式，其中最值得注意的實(shí)例為iso-Ciso-G配對(duì)。例如參見(jiàn)Switzer等人，(1989)J.Am.Chem.Soc，1118322；和Piccirilli等人，(1990)Nature，34333；Kool，(2000)Curr.Opin.Chem.Biol，4602。這些堿基通常在一定程度上與天然堿基錯(cuò)配且不能酶促?gòu)?fù)制。Kool和同事證實(shí)堿基之間的疏水性堆積相互作用可代替氫鍵來(lái)驅(qū)動(dòng)堿基對(duì)的形成。參見(jiàn)Kool，(2000)Curr.Opin.Chem.Biol，4602；和Guckian和Kool，(1998)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，36，2825。在研發(fā)滿足所有上述要求的非天然堿基對(duì)的工作中，Schultz、Romesberg和同事已系統(tǒng)地合成和研究了一系列非天然疏水性堿基。發(fā)現(xiàn)PICSPICS自身配對(duì)比天然堿基對(duì)穩(wěn)定，且可通過(guò)大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段(Klenow fragment)(KF)有效地并入DNA中。例如參見(jiàn)McMinn等人，(1999)J.Am.Chem.Soc，12111585-6；以及Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，1223274?？赏ㄟ^(guò)KF以足以用于生物功能的效率和選擇性合成3MN3MN自身配對(duì)。例如參見(jiàn)Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，1228803。然而，這兩種堿基都充當(dāng)用于進(jìn)一步復(fù)制的鏈終止子。突變DNA聚合酶近來(lái)已得到發(fā)展，其可用于復(fù)制PICS自身配對(duì)。此外，也可復(fù)制7AI自身配對(duì)。例如參見(jiàn)Tae等人，(2001)J.Am.Chem.Soc，1237439。也已研發(fā)新穎的金屬堿基對(duì)DipicPy，其在結(jié)合Cu(II)后形成穩(wěn)定配對(duì)。參見(jiàn)Meggers等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，12210714。因?yàn)檠娱L(zhǎng)密碼子和非天然密碼子固有地與天然密碼子正交，所以本發(fā)明的方法可利用這一性質(zhì)產(chǎn)生正交tRNA供其使用。
也可使用翻譯旁路系統(tǒng)(translational bypassing system)將非天然氨基酸并入所需多肽中。在翻譯旁路系統(tǒng)中，將大序列并入基因中，但并未將其翻譯成蛋白質(zhì)。所述序列含有充當(dāng)誘導(dǎo)核糖體跳過(guò)所述序列且在插入下游重新開(kāi)始翻譯的提示的結(jié)構(gòu)。
在某些實(shí)施例中，在本發(fā)明的方法和/或組合物中的所關(guān)注的蛋白質(zhì)或多肽(或其部分)是由核酸編碼。通常，核酸包含至少一個(gè)選擇密碼子、至少兩個(gè)選擇密碼子、至少三個(gè)選擇密碼子、至少四個(gè)選擇密碼子、至少五個(gè)選擇密碼子、至少六個(gè)選擇密碼子、至少七個(gè)選擇密碼子、至少八個(gè)選擇密碼子、至少九個(gè)選擇密碼子、十個(gè)或十個(gè)以上選擇密碼子。
可使用所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知且在本文中描述的方法來(lái)誘變編碼所關(guān)注的蛋白質(zhì)或多肽的基因，從而使其包括例如一個(gè)或一個(gè)以上選擇密碼子以并入非天然氨基酸。舉例來(lái)說(shuō)，使所關(guān)注的蛋白質(zhì)的核酸誘變以使其包括一個(gè)或一個(gè)以上選擇密碼子，從而提供一個(gè)或一個(gè)以上非天然氨基酸的并入。本發(fā)明包括例如包括至少一個(gè)非天然氨基酸的任何蛋白質(zhì)的任何這種變異體(包括(但不限于)突變體)形式。類(lèi)似地，本發(fā)明還包括相應(yīng)核酸，即，具有一個(gè)或一個(gè)以上編碼一個(gè)或一個(gè)以上非天然氨基酸的選擇密碼子的任何核酸。
可容易地使編碼諸如hPP多肽等所關(guān)注的蛋白質(zhì)的核酸分子突變以在多肽的任何所需位置處引入半胱氨酸。半胱氨酸廣泛用于將反應(yīng)性分子、水溶性聚合物、蛋白質(zhì)或多種其它分子引入所關(guān)注的蛋白質(zhì)上。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知適于將半胱氨酸并入多肽的所需位置中的方法，所述方法諸如美國(guó)專(zhuān)利第6,608,183號(hào)(以引用的方式并入本文中)中所述的那些方法以及標(biāo)準(zhǔn)誘變技術(shù)。
IV.非天然編碼氨基酸 多種非天然編碼氨基酸適用于本發(fā)明中?？蓪⑷魏螖?shù)目的非天然編碼氨基酸引入hPP多肽中。所引入的非天然編碼氨基酸對(duì)20種常見(jiàn)的遺傳編碼氨基酸(即，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸)來(lái)說(shuō)通常實(shí)質(zhì)上都具有化學(xué)惰性。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包括與20種常見(jiàn)氨基酸中未見(jiàn)的官能團(tuán)(包括(但不限于)疊氮基、酮基、醛基和氨氧基)有效且選擇性反應(yīng)以形成穩(wěn)定結(jié)合物的側(cè)鏈官能團(tuán)。舉例來(lái)說(shuō)，包括含有疊氮基官能團(tuán)的非天然編碼氨基酸的hPP多肽可與聚合物(包括(但不限于)聚(乙二醇))或者含有炔部分的第二多肽反應(yīng)，以形成由于疊氮官能團(tuán)與炔官能團(tuán)選擇性反應(yīng)形成休斯根[3+2]環(huán)加成產(chǎn)物而引起的穩(wěn)定結(jié)合物。
α-氨基酸的一般結(jié)構(gòu)說(shuō)明如下(式I)
非天然編碼氨基酸通常為具有以上所列結(jié)構(gòu)式的任何結(jié)構(gòu)，其中R基團(tuán)是除20種天然氨基酸中所用的取代基以外的任何取代基且可適用于本發(fā)明中。因?yàn)楸景l(fā)明的非天然編碼氨基酸不同于天然氨基酸之處通常僅在于側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)，所以非天然編碼氨基酸以與天然存在多肽中形成酰胺鍵相同的方式與包括(但不限于)天然或非天然編碼氨基酸的其它氨基酸形成酰胺鍵。然而，非天然編碼氨基酸具有使其區(qū)別于天然氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)。舉例來(lái)說(shuō)，R視情況包含烷基-、芳基-、?；?、酮基-、疊氮基-、羥基-、肼、氰基-、鹵基-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒基-、磺?；⑴鹚狨?borate)、硼酸酯(boronate)、磷酸基、膦酸基、膦、雜環(huán)、烯酮、亞胺、醛、酯、硫代酸、羥胺、氨基等或其任何組合。所關(guān)注的可適用于本發(fā)明中的其它非天然存在氨基酸包括(但不限于)包含光活化交聯(lián)劑的氨基酸、經(jīng)自旋標(biāo)記的氨基酸、熒光氨基酸、金屬結(jié)合氨基酸、含金屬氨基酸、放射性氨基酸、具有新穎官能團(tuán)的氨基酸、與其它分子共價(jià)或非共價(jià)相互作用的氨基酸、光籠化和/或光致異構(gòu)化氨基酸、包含生物素或生物素類(lèi)似物的氨基酸、糖基化氨基酸(諸如糖取代絲氨酸)、經(jīng)其它碳水化合物改性的氨基酸、含酮基的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、化學(xué)可裂解和/或光可裂解氨基酸、與天然氨基酸相比具有延長(zhǎng)側(cè)鏈(包括(但不限于)聚醚或長(zhǎng)鏈烴，包括(但不限于)約5個(gè)以上或約10個(gè)以上碳)的氨基酸、含碳連接的糖的氨基酸、氧化還原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸以及包含一個(gè)或一個(gè)以上毒性部分的氨基酸。
可適用于本發(fā)明中且適用于與水溶性聚合物反應(yīng)的例示性非天然編碼氨基酸包括(但不限于)那些具有羰基、氨氧基、肼、酰肼、氨基脲、疊氮和炔反應(yīng)性基團(tuán)的氨基酸。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包含糖部分。所述氨基酸的實(shí)例包括N-乙?；?L-氨基葡萄糖基-L-絲氨酸、N-乙?；?L-氨基半乳糖基-L-絲氨酸、N-乙?；?L-氨基葡萄糖基-L-蘇氨酸、N-乙?；?L-氨基葡萄糖基-L-天冬酰胺和O-氨基甘露糖基-L-絲氨酸。所述氨基酸的實(shí)例還包括氨基酸與糖之間的天然存在N-或O-鍵聯(lián)是由自然界中通常不可見(jiàn)的共價(jià)鍵(包括(但不限于)烯、肟、硫醚、酰胺等)置換的實(shí)例。所述氨基酸的實(shí)例還包括諸如2-脫氧-葡萄糖、2-脫氧半乳糖等天然存在蛋白質(zhì)中通常不可見(jiàn)的糖類(lèi)。
本文中提供的多種非天然編碼氨基酸可例如從Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)、Novabiochem(EMD Biosciences的分公司，Darmstadt，Germany)或Peptech(Burlington，MA，USA)購(gòu)得。無(wú)法購(gòu)得的非天然編碼氨基酸視情況如本文中所提供或使用所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法合成。關(guān)于有機(jī)合成技術(shù)，例如參見(jiàn)Fessendon和Fessendon，Organic Chemistry(1982，第2版，Willard Grant Press，Boston Mass.)；March，Advanced Organic Chemistry(第3版，1985，Wiley and Sons，NewYork)；以及Carey和Sundberg，Advanced Organic Chemistry(第3版，A部分和B部分，1990，Plenum Press，New York)。也參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)文獻(xiàn)2003/0082575和2003/0108885，其以引用的方式并入本文中。除含有新穎側(cè)鏈的非天然氨基酸外，可適用于本發(fā)明的非天然氨基酸還視情況包含經(jīng)修飾的主鏈結(jié)構(gòu)，包括(但不限于)如式II和式III的結(jié)構(gòu)所說(shuō)明的結(jié)構(gòu)
其中Z通常包含OH、NH2、SH、NH-R′或S-R′；X和Y可相同或不同，通常包含S或O；且R和R′視情況相同或不同，通常是選自上文關(guān)于具有式I的非天然氨基酸所述的R基團(tuán)的組成部分的相同清單以及氫。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的非天然氨基酸視情況包含如式II和III所說(shuō)明的氨基或羧基的取代。這種類(lèi)型的非天然氨基酸包括(但不限于)α-羥基酸、α-硫代酸、α-氨基硫代羧酸鹽，其具有包括(但不限于)對(duì)應(yīng)于常見(jiàn)的20種天然氨基酸的側(cè)鏈或非天然側(cè)鏈。另外，α-碳處的取代視情況包括(但不限于)L、D或α-α-二取代氨基酸，諸如D-谷氨酸鹽、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等。其它結(jié)構(gòu)替代物包括環(huán)狀氨基酸，諸如脯氨酸類(lèi)似物以及3、4、6、7、8和9元環(huán)脯氨酸類(lèi)似物；β和γ氨基酸，諸如經(jīng)取代β-丙氨酸和γ-氨基丁酸。
多種非天然氨基酸是基于諸如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等天然氨基酸，且適用于本發(fā)明中。酪氨酸類(lèi)似物包括(但不限于)對(duì)位取代的酪氨酸、鄰位取代的酪氨酸以及間位取代的酪氨酸，其中經(jīng)取代酪氨酸包含包括(但不限于)酮基(包括(但不限于)乙?；?、苯甲?；被?、肼、羥胺、硫醇基、羧基、異丙基、甲基、C6-C20直鏈或支鏈烴、飽和或不飽和烴、O-甲基、聚醚基、硝基、炔基等。另外，也涵蓋多取代芳基環(huán)?？蛇m用于本發(fā)明的谷氨酰胺類(lèi)似物包括(但不限于)α-羥基衍生物、γ取代衍生物、環(huán)狀衍生物以及酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。可適用于本發(fā)明的例示性苯丙氨酸類(lèi)似物包括(但不限于)對(duì)位取代的苯丙氨酸、鄰位取代的苯丙氨酸以及間位取代的苯丙氨酸，其中取代基包含包括(但不限于)羥基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛、疊氮基、碘基、溴基、酮基(包括(但不限于)乙?；?、苯甲?；?、炔基等。可適用于本發(fā)明的非天然氨基酸的特定實(shí)例包括(但不限于)對(duì)乙?；?L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙?；?GlcNAcβ-絲氨酸、L-多巴(L-Dopa)、氟化苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、對(duì)疊氮基-L-苯丙氨酸、對(duì)?；?L-苯丙氨酸、對(duì)苯甲?；?L-苯丙氨酸、L-磷酸絲氨酸、膦?；z氨酸、膦?；野彼帷?duì)碘苯丙氨酸、對(duì)溴苯丙氨酸、對(duì)氨基-L-苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸以及對(duì)炔丙氧基-苯丙氨酸等。例如，可適用于本發(fā)明的多種非天然氨基酸的結(jié)構(gòu)的實(shí)例是提供于標(biāo)題為“Invivo incorporation of unnatural amino acids”的WO 2002/085923中。關(guān)于其它蛋氨酸類(lèi)似物，也參見(jiàn)Kiick等人，(2002)Incorporation ofazides into recombinant proteins forchemoselective modification by the Staudinger ligation，PNAS 9919-24，其以引用的方式并入本文中。
在一個(gè)實(shí)施例中，提供包括非天然氨基酸(諸如對(duì)(炔丙氧基)-苯丙氨酸)的hPP多肽的組合物。還提供各種包含對(duì)(炔丙氧基)-苯丙氨酸和包括(但不限于)蛋白質(zhì)和/或細(xì)胞的組合物。一方面，包括對(duì)(炔丙氧基)-苯丙氨酸非天然氨基酸的組合物進(jìn)一步包括正交tRNA。非天然氨基酸可與正交tRNA鍵結(jié)(包括(但不限于)共價(jià))，包括(但不限于)通過(guò)氨酰基鍵與正交tRNA共價(jià)鍵結(jié)，與正交tRNA的末端核糖的3′OH或2′OH共價(jià)鍵結(jié)等。
可借助于非天然氨基酸并入蛋白質(zhì)中的化學(xué)部分提供蛋白質(zhì)的多種優(yōu)勢(shì)和操縱性。舉例來(lái)說(shuō)，酮基官能團(tuán)的獨(dú)特反應(yīng)性允許利用多種含肼或羥胺試劑中的任一個(gè)在活體外和活體內(nèi)選擇性修飾蛋白質(zhì)。舉例來(lái)說(shuō)，重原子非天然氨基酸可適用于定相X射線結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。使用非天然氨基酸位點(diǎn)特異性引入重原子還為選擇重原子的位置提供選擇性和靈活性。舉例來(lái)說(shuō)，光反應(yīng)性非天然氨基酸(包括(但不限于)具有二苯甲酮和疊氮芳基(包括(但不限于)疊氮苯)側(cè)鏈的氨基酸)允許蛋白質(zhì)的活體內(nèi)和活體外有效光交聯(lián)。光反應(yīng)性非天然氨基酸的實(shí)例包括(但不限于)對(duì)疊氮基-苯丙氨酸和對(duì)苯甲?；?苯丙氨酸。然后，可通過(guò)激發(fā)光反應(yīng)性基團(tuán)(提供時(shí)間控制)使具有光反應(yīng)性非天然氨基酸的蛋白質(zhì)隨意交聯(lián)。在一個(gè)實(shí)例中，非天然氨基酸的甲基可經(jīng)作為局部結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)的探針(包括(但不限于)使用核磁共振和振動(dòng)光譜學(xué))的同位素標(biāo)記的(包括(但不限于))甲基取代。舉例來(lái)說(shuō)，炔基或疊氮基官能團(tuán)允許利用分子通過(guò)[3+2]環(huán)加成反應(yīng)選擇性修飾蛋白質(zhì)。
并入多肽的氨基末端的非天然氨基酸可包含R基團(tuán)，其為除20種天然氨基酸中所用的取代基以外的任何取代基；和不同于α-氨基酸(參見(jiàn)式I)中通常存在的NH2基團(tuán)的第二反應(yīng)性基團(tuán)。類(lèi)似的非天然氨基酸可在羧基末端處并入不同于α-氨基酸(參見(jiàn)式I)中通常存在的COOH基團(tuán)的第二反應(yīng)性基團(tuán)。
可選擇或設(shè)計(jì)本發(fā)明的非天然氨基酸以提供20種天然氨基酸中不可獲得的其它特征。舉例來(lái)說(shuō)，可視情況設(shè)計(jì)或選擇非天然氨基酸以改良例如并入所述氨基酸的蛋白質(zhì)的生物性質(zhì)。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)在蛋白質(zhì)中包括非天然氨基酸可視情況改良下列性質(zhì)毒性、生物分布(biodistribution)、溶解性、穩(wěn)定性(例如熱穩(wěn)定性、水解穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性、酶促降解抗性等)、純化和加工便利性、結(jié)構(gòu)性質(zhì)、光譜性質(zhì)、化學(xué)和/或光化學(xué)性質(zhì)、催化活性、氧化還原電勢(shì)、半衰期、與其它分子例如共價(jià)或非共價(jià)反應(yīng)的能力等。
非天然氨基酸的結(jié)構(gòu)和合成羰基、羰基樣基團(tuán)、經(jīng)掩蔽羰基、經(jīng)保護(hù)羰基和羥胺基 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供通過(guò)肟鍵與水溶性聚合物(例如PEG)連接的hPP或hA或hFc。
多種類(lèi)型的非天然編碼氨基酸適用于形成肟鍵。這些氨基酸包括(但不限于)含有羰基、二羰基或羥胺基的非天然編碼氨基酸。所述氨基酸是描述于美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)文獻(xiàn)第2006/0194256號(hào)、第2006/0217532號(hào)和第2006/0217289號(hào)以及標(biāo)題為“Compositions containing，methods involving，and uses of non-natural amino acids andpolypeptides”的WO 2006/069246中，所述公開(kāi)文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中。非天然編碼氨基酸也描述于美國(guó)專(zhuān)利第7,083,970號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利第7,045,337號(hào)中，所述專(zhuān)利以全文引用的方式并入本文中。
本發(fā)明的一些實(shí)施例利用在一個(gè)或一個(gè)以上位置經(jīng)對(duì)乙酰基苯丙氨酸氨基酸取代的hPP或hA或hFc多肽。對(duì)乙?；?(+/-)-苯丙氨酸和間乙?；?(+/-)-苯丙氨酸的合成是描述于Zhang，Z.等人，Biochemistry 426735-6746(2003)中，其以引用的方式并入本文中。其它含羰基或含二羰基的氨基酸可由所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員類(lèi)似地制備。另外，本文中所包括的非天然氨基酸的非限制性例示性合成是呈示于美國(guó)專(zhuān)利第7,083,970號(hào)的圖4、24-34和36-39中，所述專(zhuān)利以全文引用的方式并入本文中。
具有親電子反應(yīng)性基團(tuán)的氨基酸允許多種通過(guò)親核加成反應(yīng)連接分子的反應(yīng)。所述親電子反應(yīng)性基團(tuán)包括羰基(包括酮基和二羰基)、羰基樣基團(tuán)(其具有與羰基(包括酮基和二羰基)相似的反應(yīng)性且在結(jié)構(gòu)上與羰基相似)、經(jīng)掩蔽羰基(其可容易地轉(zhuǎn)化為羰基(包括酮基和二羰基))或經(jīng)保護(hù)羰基(其在去保護(hù)后具有與羰基(包括酮基和二羰基)相似的反應(yīng)性)。所述氨基酸包括具有式(IV)的結(jié)構(gòu)的氨基酸
其中 A是可選的且當(dāng)存在時(shí)為低碳亞烷基、經(jīng)取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經(jīng)取代低碳亞烯基、亞炔基、低碳雜亞烷基、經(jīng)取代雜亞烷基、低碳雜亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳雜亞環(huán)烷基、亞芳基、經(jīng)取代亞芳基、雜亞芳基、經(jīng)取代雜亞芳基、亞烷芳基、經(jīng)取代亞烷芳基、亞芳烷基或經(jīng)取代亞芳烷基； B是可選的且當(dāng)存在時(shí)為選自由以下各基組成的群組的連接子低碳亞烷基、經(jīng)取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經(jīng)取代低碳亞烯基、低碳雜亞烷基、經(jīng)取代低碳雜亞烷基、-O-、-O-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨(dú)立地為H、烷基或經(jīng)取代烷基； J為

或
R為H、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基； R″各自獨(dú)立地為H、烷基、經(jīng)取代烷基或保護(hù)基，或當(dāng)存在一個(gè)以上R″基團(tuán)時(shí)，兩個(gè)R″視情況形成雜環(huán)烷基； R1是可選的且當(dāng)存在時(shí)為H、氨基保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且 R2是可選的且當(dāng)存在時(shí)為OH、酯保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸； R3和R4各自獨(dú)立地為H、鹵素、低碳烷基或經(jīng)取代低碳烷基，或R3和R4或兩個(gè)R3基團(tuán)視情況形成環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； 或-A-B-J-R基團(tuán)一起形成包含至少一個(gè)羰基(包括二羰基)、經(jīng)保護(hù)羰基(包括經(jīng)保護(hù)二羰基)或經(jīng)掩蔽羰基(包括經(jīng)掩蔽二羰基)的雙環(huán)或三環(huán)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； 或-J-R基團(tuán)一起形成包含至少一個(gè)羰基(包括二羰基)、經(jīng)保護(hù)羰基(包括經(jīng)保護(hù)二羰基)或經(jīng)掩蔽羰基(包括經(jīng)掩蔽二羰基)的單環(huán)或雙環(huán)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； 其中限制條件為當(dāng)A為亞苯基且R3各自為H時(shí)，B存在；且當(dāng)A為-(CH2)4-且R3各自為H時(shí)，B不為-NHC(O)(CH2CH2)-；且當(dāng)A和B不存在且R3各自為H時(shí)，R不為甲基。
另外，包括具有式(V)的結(jié)構(gòu)的氨基酸
其中 A是可選的且當(dāng)存在時(shí)為低碳亞烷基、經(jīng)取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經(jīng)取代低碳亞烯基、亞炔基、低碳雜亞烷基、經(jīng)取代雜亞烷基、低碳雜亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳雜亞環(huán)烷基、亞芳基、經(jīng)取代亞芳基、雜亞芳基、經(jīng)取代雜亞芳基、亞烷芳基、經(jīng)取代亞烷芳基、亞芳烷基或經(jīng)取代亞芳烷基； B是可選的且當(dāng)存在時(shí)為選自由以下各基組成的群組的連接子低碳亞烷基、經(jīng)取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經(jīng)取代低碳亞烯基、低碳雜亞烷基、經(jīng)取代低碳雜亞烷基、-O-、-O-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨(dú)立地為H、烷基或經(jīng)取代烷基； R為H、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基； R1是可選的且當(dāng)存在時(shí)為H、氨基保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且 R2是可選的且當(dāng)存在時(shí)為OH、酯保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸； 其中限制條件為當(dāng)A為亞苯基時(shí)，B存在；且當(dāng)A為-(CH2)4-時(shí)，B不為-NHC(O)(CH2CH2)-；且當(dāng)A和B不存在時(shí)，R不為甲基。
另外，包括具有式(VI)的結(jié)構(gòu)的氨基酸
其中 B是選自由以下各基組成的群組的連接子低碳亞烷基、經(jīng)取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經(jīng)取代低碳亞烯基、低碳雜亞烷基、經(jīng)取代低碳雜亞烷基、-O-、-O-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨(dú)立地為H、烷基或經(jīng)取代烷基； R為H、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基； R1是可選的且當(dāng)存在時(shí)為H、氨基保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且 R2是可選的且當(dāng)存在時(shí)為OH、酯保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸； Ra是各自獨(dú)立地選自由以下各基組成的群組H、鹵素、烷基、經(jīng)取代烷基、-N(R′)2、-C(O)kR′(其中k為1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各自獨(dú)立地為H、烷基或經(jīng)取代烷基。
另外，包括下列氨基酸


和

其中所述化合物視情況氨基經(jīng)保護(hù)、羧基經(jīng)保護(hù)，或其鹽。另外，下列非天然氨基酸中的任一個(gè)都可并入非天然氨基酸多肽中。
另外，包括下列具有式(VII)的結(jié)構(gòu)的氨基酸
其中 B是可選的且當(dāng)存在時(shí)為選自由以下各基組成的群組的連接子低碳亞烷基、經(jīng)取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經(jīng)取代低碳亞烯基、低碳雜亞烷基、經(jīng)取代低碳雜亞烷基、-O-、-O-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)--N(R′)-N＝-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨(dú)立地為H、烷基或經(jīng)取代烷基； R為H、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基； R1是可選的且當(dāng)存在時(shí)為H、氨基保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且 R2是可選的且當(dāng)存在時(shí)為OH、酯保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸； Ra是各自獨(dú)立地選自由以下各基組成的群組H、鹵素、烷基、經(jīng)取代烷基、-N(R′)2、-C(O)kR′(其中k為1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各自獨(dú)立地為H、烷基或經(jīng)取代烷基；且n為0到8； 其中限制條件為當(dāng)A為-(CH2)4-時(shí)，B不為-NHC(O)(CH2CH2)-。
另外，包括下列氨基酸



和

其中所述化合物視情況氨基經(jīng)保護(hù)、視情況羧基經(jīng)保護(hù)、視情況氨基經(jīng)保護(hù)且羧基也經(jīng)保護(hù)，或其鹽。另外，這些非天然氨基酸以及下列非天然氨基酸中的任一個(gè)都可并入非天然氨基酸多肽中。
另外，包括下列具有式(VIII)的結(jié)構(gòu)的氨基酸
其中A是可選的且當(dāng)存在時(shí)為低碳亞烷基、經(jīng)取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經(jīng)取代低碳亞烯基、亞炔基、低碳雜亞烷基、經(jīng)取代雜亞烷基、低碳雜亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳雜亞環(huán)烷基、亞芳基、經(jīng)取代亞芳基、雜亞芳基、經(jīng)取代雜亞芳基、亞烷芳基、經(jīng)取代亞烷芳基、亞芳烷基或經(jīng)取代亞芳烷基； B是可選的且當(dāng)存在時(shí)為選自由以下各基組成的群組的連接子低碳亞烷基、經(jīng)取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經(jīng)取代低碳亞烯基、低碳雜亞烷基、經(jīng)取代低碳雜亞烷基、-O-、-O-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-S-，-S-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨(dú)立地為H、烷基或經(jīng)取代烷基； R1是可選的且當(dāng)存在時(shí)為H、氨基保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且 R2是可選的且當(dāng)存在時(shí)為OH、酯保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸。
另外，包括下列具有式(IX)的結(jié)構(gòu)的氨基酸
B是可選的且當(dāng)存在時(shí)為選自由以下各基組成的群組的連接子低碳亞烷基、經(jīng)取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經(jīng)取代低碳亞烯基、低碳雜亞烷基、經(jīng)取代低碳雜亞烷基、-O-、-O-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨(dú)立地為H、烷基或經(jīng)取代烷基； R為H、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基； R1是可選的且當(dāng)存在時(shí)為H、氨基保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且 R2是可選的且當(dāng)存在時(shí)為OH、酯保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸； 其中Ra是各自獨(dú)立地選自由以下各基組成的群組H、鹵素、烷基、經(jīng)取代烷基、-N(R′)2、-C(O)kR′(其中k為1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各自獨(dú)立地為H、烷基或經(jīng)取代烷基。
另外，包括下列氨基酸


和

其中所述化合物視情況氨基經(jīng)保護(hù)、視情況羧基經(jīng)保護(hù)、視情況氨基經(jīng)保護(hù)且羧基也經(jīng)保護(hù)，或其鹽。另外，這些非天然氨基酸以及下列非天然氨基酸中的任一個(gè)都可并入非天然氨基酸多肽中。
另外，包括下列具有式(X)的結(jié)構(gòu)的氨基酸
其中 B是可選的且當(dāng)存在時(shí)為選自由以下各基組成的群組的連接子低碳亞烷基、經(jīng)取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經(jīng)取代低碳亞烯基、低碳雜亞烷基、經(jīng)取代低碳雜亞烷基、-O-、-O-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-S-，-S-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨(dú)立地為H、烷基或經(jīng)取代烷基； R為H、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基； R1是可選的且當(dāng)存在時(shí)為H、氨基保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且 R2是可選的且當(dāng)存在時(shí)為OH、酯保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸； Ra是各自獨(dú)立地選自由以下各基組成的群組H、鹵素、烷基、經(jīng)取代烷基、-N(R′)2、-C(O)kR′(其中k為1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各自獨(dú)立地為H、烷基或經(jīng)取代烷基；且n為0到8。
另外，包括下列氨基酸

和

其中所述化合物視情況氨基經(jīng)保護(hù)、視情況羧基經(jīng)保護(hù)、視情況氨基經(jīng)保護(hù)且羧基也經(jīng)保護(hù)，或其鹽。另外，這些非天然氨基酸以及下列非天然氨基酸中的任一個(gè)都可并入非天然氨基酸多肽中。
除單羰基結(jié)構(gòu)外，本文中所述的非天然氨基酸也可包括諸如二羰基、二羰基樣基團(tuán)、經(jīng)掩蔽二羰基以及經(jīng)保護(hù)二羰基等基團(tuán)。
舉例來(lái)說(shuō)，包括下列具有式(XI)的結(jié)構(gòu)的氨基酸
其中A是可選的且當(dāng)存在時(shí)為低碳亞烷基、經(jīng)取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經(jīng)取代低碳亞烯基、亞炔基、低碳雜亞烷基、經(jīng)取代雜亞烷基、低碳雜亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳雜亞環(huán)烷基、亞芳基、經(jīng)取代亞芳基、雜亞芳基、經(jīng)取代雜亞芳基、亞烷芳基、經(jīng)取代亞烷芳基、亞芳烷基或經(jīng)取代亞芳烷基； B是可選的且當(dāng)存在時(shí)為選自由以下各基組成的群組的連接子低碳亞烷基、經(jīng)取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經(jīng)取代低碳亞烯基、低碳雜亞烷基、經(jīng)取代低碳雜亞烷基、-O-、-O-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨(dú)立地為H、烷基或經(jīng)取代烷基； R為H、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基； R1是可選的且當(dāng)存在時(shí)為H、氨基保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且 R2是可選的且當(dāng)存在時(shí)為OH、酯保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸。
另外，包括下列具有式(XII)的結(jié)構(gòu)的氨基酸
B是可選的且當(dāng)存在時(shí)為選自由以下各基組成的群組的連接子低碳亞烷基、經(jīng)取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經(jīng)取代低碳亞烯基、低碳雜亞烷基、經(jīng)取代低碳雜亞烷基、-O-、-O-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨(dú)立地為H、烷基或經(jīng)取代烷基； R為H、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基； R1是可選的且當(dāng)存在時(shí)為H、氨基保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且 R2是可選的且當(dāng)存在時(shí)為OH、酯保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸； 其中Ra是各自獨(dú)立地選自由以下各基組成的群組H、鹵素、烷基、經(jīng)取代烷基、-N(R′)2、-C(O)kR′(其中k為1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各自獨(dú)立地為H、烷基或經(jīng)取代烷基。
另外，包括下列氨基酸

和

其中所述化合物視情況氨基經(jīng)保護(hù)、視情況羧基經(jīng)保護(hù)、視情況氨基經(jīng)保護(hù)且羧基也經(jīng)保護(hù)，或其鹽。另外，這些非天然氨基酸以及下列非天然氨基酸中的任一個(gè)都可并入非天然氨基酸多肽中。
另外，包括下列具有式(XIII)的結(jié)構(gòu)的氨基酸
其中B是可選的且當(dāng)存在時(shí)為選自由以下各基組成的群組的連接子低碳亞烷基、經(jīng)取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經(jīng)取代低碳亞烯基、低碳雜亞烷基、經(jīng)取代低碳雜亞烷基、-O-、-O-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經(jīng)取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨(dú)立地為H、烷基或經(jīng)取代烷基； R為H、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基； R1是可選的且當(dāng)存在時(shí)為H、氨基保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且 R2是可選的且當(dāng)存在時(shí)為OH、酯保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸； Ra是各自獨(dú)立地選自由以下各基組成的群組H、鹵素、烷基、經(jīng)取代烷基、-N(R′)2、-C(O)kR′(其中k為1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各自獨(dú)立地為H、烷基或經(jīng)取代烷基；且n為0到8。
另外，包括下列氨基酸


和

其中所述化合物視情況氨基經(jīng)保護(hù)、視情況羧基經(jīng)保護(hù)、視情況氨基經(jīng)保護(hù)且羧基也經(jīng)保護(hù)，或其鹽。另外，這些非天然氨基酸以及下列非天然氨基酸中的任一個(gè)都可并入非天然氨基酸多肽中。
另外，包括下列具有式(XIV)的結(jié)構(gòu)的氨基酸
其中 A是可選的且當(dāng)存在時(shí)為低碳亞烷基、經(jīng)取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經(jīng)取代低碳亞烯基、亞炔基、低碳雜亞烷基、經(jīng)取代雜亞烷基、低碳雜亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳雜亞環(huán)烷基、亞芳基、經(jīng)取代亞芳基、雜亞芳基、經(jīng)取代雜亞芳基、亞烷芳基、經(jīng)取代亞烷芳基、亞芳烷基或經(jīng)取代亞芳烷基； R為H、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基； R1是可選的且當(dāng)存在時(shí)為H、氨基保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且 R2是可選的且當(dāng)存在時(shí)為OH、酯保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸； X1為C、S或S(O)；且L為亞烷基、經(jīng)取代亞烷基、N(R′)(亞烷基)或N(R′)(經(jīng)取代亞烷基)，其中R′為H、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基。
另外，包括下列具有式(XIV-A)的結(jié)構(gòu)的氨基酸
其中 A是可選的且當(dāng)存在時(shí)為低碳亞烷基、經(jīng)取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經(jīng)取代低碳亞烯基、亞炔基、低碳雜亞烷基、經(jīng)取代雜亞烷基、低碳雜亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳雜亞環(huán)烷基、亞芳基、經(jīng)取代亞芳基、雜亞芳基、經(jīng)取代雜亞芳基、亞烷芳基、經(jīng)取代亞烷芳基、亞芳烷基或經(jīng)取代亞芳烷基； R為H、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基； R1是可選的且當(dāng)存在時(shí)為H、氨基保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且 R2是可選的且當(dāng)存在時(shí)為OH、酯保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸； L為亞烷基、經(jīng)取代亞烷基、N(R′)(亞烷基)或N(R′)(經(jīng)取代亞烷基)，其中R′為H、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基。
另外，包括下列具有式(XIV-B)的結(jié)構(gòu)的氨基酸
其中 A是可選的且當(dāng)存在時(shí)為低碳亞烷基、經(jīng)取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經(jīng)取代低碳亞烯基、亞炔基、低碳雜亞烷基、經(jīng)取代雜亞烷基、低碳雜亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳雜亞環(huán)烷基、亞芳基、經(jīng)取代亞芳基、雜亞芳基、經(jīng)取代雜亞芳基、亞烷芳基、經(jīng)取代亞烷芳基、亞芳烷基或經(jīng)取代亞芳烷基； R為H、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基； R1是可選的且當(dāng)存在時(shí)為H、氨基保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且 R2是可選的且當(dāng)存在時(shí)為OH、酯保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸； L為亞烷基、經(jīng)取代亞烷基、N(R′)(亞烷基)或N(R′)(經(jīng)取代亞烷基)，其中R′為H、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基。
另外，包括下列具有式(XV)的結(jié)構(gòu)的氨基酸
其中 A是可選的且當(dāng)存在時(shí)為低碳亞烷基、經(jīng)取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經(jīng)取代低碳亞烯基、亞炔基、低碳雜亞烷基、經(jīng)取代雜亞烷基、低碳雜亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳雜亞環(huán)烷基、亞芳基、經(jīng)取代亞芳基、雜亞芳基、經(jīng)取代雜亞芳基、亞烷芳基、經(jīng)取代亞烷芳基、亞芳烷基或經(jīng)取代亞芳烷基； R為H、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基； R1是可選的且當(dāng)存在時(shí)為H、氨基保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且 R2是可選的且當(dāng)存在時(shí)為OH、酯保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸； X1為C、S或S(O)；且n為0、1、2、3、4或5；且各CR8R9基團(tuán)上的R8和R9是各自獨(dú)立地選自由H、烷氧基、烷基胺、鹵素、烷基、芳基組成的群組，或任何R8和R9可一起形成＝O或環(huán)烷基，或任何鄰接R8基團(tuán)的基團(tuán)可一起形成環(huán)烷基。
另外，包括下列具有式(XV-A)的結(jié)構(gòu)的氨基酸
其中 A是可選的且當(dāng)存在時(shí)為低碳亞烷基、經(jīng)取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經(jīng)取代低碳亞烯基、亞炔基、低碳雜亞烷基、經(jīng)取代雜亞烷基、低碳雜亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳雜亞環(huán)烷基、亞芳基、經(jīng)取代亞芳基、雜亞芳基、經(jīng)取代雜亞芳基、亞烷芳基、經(jīng)取代亞烷芳基、亞芳烷基或經(jīng)取代亞芳烷基； R為H、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基； R1是可選的且當(dāng)存在時(shí)為H、氨基保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且 R2是可選的且當(dāng)存在時(shí)為OH、酯保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸； n為0、1、2、3、4或5；且各CR8R9基團(tuán)上的R8和R9是各自獨(dú)立地選自由H、烷氧基、烷基胺、鹵素、烷基、芳基組成的群組，或任何R8和R9可一起形成＝O或環(huán)烷基，或任何鄰接R8基團(tuán)的基團(tuán)可一起形成環(huán)烷基。
另外，包括下列具有式(XV-B)的結(jié)構(gòu)的氨基酸
其中 A是可選的且當(dāng)存在時(shí)為低碳亞烷基、經(jīng)取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經(jīng)取代低碳亞烯基、亞炔基、低碳雜亞烷基、經(jīng)取代雜亞烷基、低碳雜亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳雜亞環(huán)烷基、亞芳基、經(jīng)取代亞芳基、雜亞芳基、經(jīng)取代雜亞芳基、亞烷芳基、經(jīng)取代亞烷芳基、亞芳烷基或經(jīng)取代亞芳烷基； R為H、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基； R1是可選的且當(dāng)存在時(shí)為H、氨基保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且 R2是可選的且當(dāng)存在時(shí)為OH、酯保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸； n為0、1、2、3、4或5；且各CR8R9基團(tuán)上的R8和R9各自獨(dú)立地選自由H、烷氧基、烷基胺、鹵素、烷基、芳基組成的群組，或任何R8和R9可一起形成＝O或環(huán)烷基，或任何鄰接R8基團(tuán)的基團(tuán)可一起形成環(huán)烷基。
另外，包括下列具有式(XVI)的結(jié)構(gòu)的氨基酸
其中 A是可選的且當(dāng)存在時(shí)為低碳亞烷基、經(jīng)取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經(jīng)取代低碳亞烯基、亞炔基、低碳雜亞烷基、經(jīng)取代雜亞烷基、低碳雜亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳雜亞環(huán)烷基、亞芳基、經(jīng)取代亞芳基、雜亞芳基、經(jīng)取代雜亞芳基、亞烷芳基、經(jīng)取代亞烷芳基、亞芳烷基或經(jīng)取代亞芳烷基； R為H、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基； R1是可選的且當(dāng)存在時(shí)為H、氨基保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且 R2是可選的且當(dāng)存在時(shí)為OH、酯保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸； X1為C、S或S(O)；且L為亞烷基、經(jīng)取代亞烷基、N(R′)(亞烷基)或N(R′)(經(jīng)取代亞烷基)，其中R′為H、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基。
另外，包括下列具有式(XVI-A)的結(jié)構(gòu)的氨基酸
其中 A是可選的且當(dāng)存在時(shí)為低碳亞烷基、經(jīng)取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經(jīng)取代低碳亞烯基、亞炔基、低碳雜亞烷基、經(jīng)取代雜亞烷基、低碳雜亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳雜亞環(huán)烷基、亞芳基、經(jīng)取代亞芳基、雜亞芳基、經(jīng)取代雜亞芳基、亞烷芳基、經(jīng)取代亞烷芳基、亞芳烷基或經(jīng)取代亞芳烷基； R為H、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基； R1是可選的且當(dāng)存在時(shí)為H、氨基保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且 R2是可選的且當(dāng)存在時(shí)為OH、酯保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸； L為亞烷基、經(jīng)取代亞烷基、N(R′)(亞烷基)或N(R′)(經(jīng)取代亞烷基)，其中R′為H、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基。
另外，包括下列具有式(XVI-B)的結(jié)構(gòu)的氨基酸
其中 A是可選的且當(dāng)存在時(shí)為低碳亞烷基、經(jīng)取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經(jīng)取代低碳亞烯基、亞炔基、低碳雜亞烷基、經(jīng)取代雜亞烷基、低碳雜亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳雜亞環(huán)烷基、亞芳基、經(jīng)取代亞芳基、雜亞芳基、經(jīng)取代雜亞芳基、亞烷芳基、經(jīng)取代亞烷芳基、亞芳烷基或經(jīng)取代亞芳烷基； R為H、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基； R1是可選的且當(dāng)存在時(shí)為H、氨基保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且 R2是可選的且當(dāng)存在時(shí)為OH、酯保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸； L為亞烷基、經(jīng)取代亞烷基、N(R′)(亞烷基)或N(R′)(經(jīng)取代亞烷基)，其中R′為H、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基。
另外，包括具有式(XVII)的結(jié)構(gòu)的氨基酸
其中 A是可選的且當(dāng)存在時(shí)為低碳亞烷基、經(jīng)取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經(jīng)取代低碳亞烯基、亞炔基、低碳雜亞烷基、經(jīng)取代雜亞烷基、低碳雜亞環(huán)烷基、經(jīng)取代低碳雜亞環(huán)烷基、亞芳基、經(jīng)取代亞芳基、雜亞芳基、經(jīng)取代雜亞芳基、亞烷芳基、經(jīng)取代亞烷芳基、亞芳烷基或經(jīng)取代亞芳烷基； M為-C(R3)-、


或

其中(a)指示與A基團(tuán)鍵結(jié)且(b)指示與各自的羰基結(jié)合，R3和R4是獨(dú)立地選自H、鹵素、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基，或R3和R4或兩個(gè)R3基團(tuán)或兩個(gè)R4基團(tuán)視情況形成環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； R為H、鹵素、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基； T3為鍵、C(R)(R)、O或S；且R為H、鹵素、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基； R1是可選的且當(dāng)存在時(shí)為H、氨基保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且 R2是可選的且當(dāng)存在時(shí)為OH、酯保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸。
另外，包括具有式(XVIII)的結(jié)構(gòu)的氨基酸
其中 M為-C(R3)-、


或

其中(a)指示與A基團(tuán)鍵結(jié)且(b)指示與各自的羰基結(jié)合，R3和R4是獨(dú)立地選自H、鹵素、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基，或R3和R4或兩個(gè)R3基團(tuán)或兩個(gè)R4基團(tuán)視情況形成環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； R為H、鹵素、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基； T3為鍵、C(R)(R)、O或S，且R為H、鹵素、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基； R1是可選的且當(dāng)存在時(shí)為H、氨基保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且 R2是可選的且當(dāng)存在時(shí)為OH、酯保護(hù)基、樹(shù)脂、氨基酸、多肽或多核苷酸； Ra是各自獨(dú)立地選自由以下各基組成的群組H、鹵素、烷基、經(jīng)取代烷基、-N(R′)2、-C(O)kR′(其中k為1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各自獨(dú)立地為H、烷基或經(jīng)取代烷基。
另外，包括具有式(XIX)的結(jié)構(gòu)的氨基酸
其中 R為H、鹵素、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基；且 T3為O或S。
另外，包括具有式(XX)的結(jié)構(gòu)的氨基酸
其中 R為H、鹵素、烷基、經(jīng)取代烷基、環(huán)烷基或經(jīng)取代環(huán)烷基。
另外，包括下列具有式(XXI)的結(jié)構(gòu)的氨基酸

和
在一些實(shí)施例中，以化學(xué)方式修飾包含非天然氨基酸的多肽以產(chǎn)生反應(yīng)性羰基或二羰基官能團(tuán)。舉例來(lái)說(shuō)，可由具有鄰接氨基和羥基的官能團(tuán)產(chǎn)生適用于結(jié)合反應(yīng)的醛官能團(tuán)。當(dāng)生物活性分子為多肽時(shí)，例如，可使用N-末端絲氨酸或蘇氨酸(其通常可存在，或可經(jīng)由化學(xué)或酶促消化而暴露)在溫和的氧化裂解條件下使用高碘酸鹽產(chǎn)生醛官能團(tuán)。例如參見(jiàn)Gaertner等人，Bioconjug.Chem.3262-268(1992)；Geoghegan，K.和Stroh，J.，Bioconjug.Chem.3138-146(1992)；Gaertner等人，J.Biol.Chem.2697224-7230(1994)。然而，所屬領(lǐng)域中已知的方法局限于肽或蛋白質(zhì)的N-末端的氨基酸。
在本發(fā)明中，可將具有相鄰羥基和氨基的非天然氨基酸并入多肽中，作為“經(jīng)掩蔽”的醛官能團(tuán)。舉例來(lái)說(shuō)，5-羥基賴氨酸具有鄰接ε胺的羥基。產(chǎn)生醛的反應(yīng)條件通常涉及在溫和條件下添加摩爾過(guò)量的偏高碘酸鈉，以避免在多肽中的其它位點(diǎn)發(fā)生氧化。氧化反應(yīng)的pH值通常為約7.0。典型反應(yīng)涉及向多肽的緩沖溶液中添加約1.5摩爾過(guò)量的偏高碘酸鈉，接著在黑暗環(huán)境中培育約10分鐘。例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第6,423,685號(hào)。
羰基或二羰基官能團(tuán)可在溫和條件下在水溶液中與含羥胺試劑選擇性反應(yīng)，從而形成在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定的相應(yīng)肟鍵。例如參見(jiàn)Jencks，W.P.，J.Am.Chem.Soc.81，475-481(1959)；Shao，J.和Tarn，J.P.，J.Am.Chem.Soc.1173893-3899(1995)。此外，羰基或二羰基的獨(dú)特反應(yīng)性允許在存在其它氨基酸側(cè)鏈的情況下進(jìn)行選擇性修飾。例如參見(jiàn)Cornish，V.W.等人，J.Am.Chem.Soc.1188150-8151(1996)；Geoghegan，K.F.和Stroh，J.G.，Bioconjug.Chem.3138-146(1992)；Mahal，L.K.等人，Science2761125-1128(1997)。
非天然氨基酸的結(jié)構(gòu)和合成含羥胺的氨基酸 美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)文件第60/638,418號(hào)是以全文引用的方式并入本文中。因此，美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)文件第60/638,418號(hào)中的第V章(標(biāo)題為“Non-natural AminoAcids”B部分(標(biāo)題為“Structure and Synthesis of Non-Natural Amino AcidsHydroxylamine-Containing Amino Acids”)中所提供的公開(kāi)內(nèi)容完全適用于制備、純化、表征和使用本文中所述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經(jīng)修飾的非天然氨基酸多肽的方法、組合物(包括式I-XXXV)、技術(shù)和策略，其應(yīng)用程度就如同所述公開(kāi)內(nèi)容完全呈現(xiàn)于本文中。美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)文獻(xiàn)第2006/0194256號(hào)、第2006/0217532號(hào)和第2006/0217289號(hào)以及標(biāo)題為“Compositions containing，methodsinvolving，and uses of non-natural amino acids and polypeptides”的WO 2006/069246也是以全文引用的方式并入本文中。
非天然氨基酸的化學(xué)合成 適用于本發(fā)明的多種非天然氨基酸可例如從Sigma(USA)或Aldrich(Milwaukee，WI，USA)購(gòu)得。無(wú)法購(gòu)得的非天然氨基酸是視情況如本文中所提供或如各種公開(kāi)文獻(xiàn)中所提供或使用所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法合成。關(guān)于有機(jī)合成技術(shù)，例如參見(jiàn)Fessendon和Fessendon，Organic Chemistry，(1982，第2版，Willard GrantPress，Boston Mass.)；March，Advanced Organic Chemistry(第3版，1985，Wiley andSons，New York)；以及Carey和Sundberg，Advanced Organic Chemistry(第3版，A部分和B部分，1990，Plenum Press，New York)。例如，描述非天然氨基酸的合成的其它公開(kāi)文獻(xiàn)包括標(biāo)題為″In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids″的WO2002/085923；Matsoukas等人，(1995)J.Med.Chem.，38，4660-4669；King，F(xiàn).E.和Kidd，D.A.A.(1949)A New Synthesis of Glutamine and of y-Dipeptides of Glutamic Acid fromPhthylated Intermediates.J.Chem.Soc，3315-3319；Friedman，O.M.和Chatterrji，R.(1959)Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents.J.Am.Chem.Soc.81，3750-3752；Craig，J.C.等人，(1988)Absolute Configuration of theEnantiomers of 7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-l-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine).J.Org.Chem.53，1167-1170；Azoulay，M。Vilmont，M.和Frappier，F(xiàn).(1991)Glutamine analogues as Potential Antimalarials，Eur.J.Med.Chem.26，201-5；Koskinen，A.M.P.和Rapoport，H.(1989)Synthesis of 4-Substituted Prolines asConformationally Constrained Amino Acid Analogues.J.Org.Chem.54，1859-1866；Christie，B.D.和Rapoport，H.(1985)Synthesis of Optically Pure Pipecolates fromL-Asparagine.Application to the Total Synthesis of(+)-Apovincamine through AminoAcid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization.J.Org.Chem.501239-1246；Barton等人，(1987)Synthesis of Novel alpha-Amino-Acids and Derivatives Using RadicalChemistrySynthesis of L-and D-alpha-Amino-Adipic Acids，L-alpha-aminopimelic Acidand Appropriate Unsaturated Derivatives.Tetrahedron 434297-4308；以及Subasinghe等人，(1992)Quisqualic acid analoguessynthesis of beta-heterocyclic2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitizedsite.J.Med.Chem.354602-7。也參見(jiàn)標(biāo)題為″Protein Arrays″的美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)文獻(xiàn)第US 2004/0198637號(hào)，其以引用的方式并入本文。
A.羰基反應(yīng)性基團(tuán) 具有羰基反應(yīng)性基團(tuán)的氨基酸允許多種通過(guò)親核加成或醛醇縮合反應(yīng)連接分子(包括(但不限于)PEG或其它水溶性分子)的反應(yīng)。
例示性含羰基的氨基酸可如下表示
其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基或經(jīng)取代芳基；R2為H、烷基、芳基、經(jīng)取代烷基以及經(jīng)取代芳基；且R3為H、氨基酸、多肽或氨基末端修飾基團(tuán)；且R4為H、氨基酸、多肽或羧基末端修飾基團(tuán)。在一些實(shí)施例中，n為1，R1為苯基且R2為簡(jiǎn)單烷基(即，甲基、乙基或丙基)且酮部分是位于相對(duì)于烷基側(cè)鏈的對(duì)位。在一些實(shí)施例中，n為1，R1為苯基且R2為簡(jiǎn)單烷基(即，甲基、乙基或丙基)且酮部分是位于相對(duì)于烷基側(cè)鏈的間位。
對(duì)乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和間乙?；?(+/-)-苯丙氨酸的合成是描述于Zhang，Z.等人，Biochemistry 426735-6746(2003)中，其以引用的方式并入本文中。其它含羰基的氨基酸可由所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員類(lèi)似地制備。
在一些實(shí)施例中，以化學(xué)方式修飾包含非天然編碼氨基酸的多肽以產(chǎn)生反應(yīng)性羰基官能團(tuán)。舉例來(lái)說(shuō)，可由具有鄰接氨基和羥基的官能團(tuán)產(chǎn)生適用于結(jié)合反應(yīng)的醛官能團(tuán)。當(dāng)生物活性分子為多肽時(shí)，例如，可使用N-末端絲氨酸或蘇氨酸(其通?？纱嬖冢蚩山?jīng)由化學(xué)或酶促消化而暴露)在溫和的氧化裂解條件下使用高碘酸鹽產(chǎn)生醛官能團(tuán)。例如參見(jiàn)Gaertner等人，Bioconjug.Chem.3262-268(1992)；Geoghegan，K.和Stroh，J.，Bioconjug.Chem.3138-146(1992)；Gaertner等人，J.Biol.Chem.2697224-7230(1994)。然而，所屬領(lǐng)域中已知的方法局限于肽或蛋白質(zhì)的N-末端的氨基酸。
在本發(fā)明中，可將具有相鄰羥基和氨基的非天然編碼氨基酸并入多肽中，作為“經(jīng)掩蔽”的醛官能團(tuán)。舉例來(lái)說(shuō)，5-羥基賴氨酸具有鄰接ε胺的羥基。產(chǎn)生醛的反應(yīng)條件通常涉及在溫和條件下添加摩爾過(guò)量的偏高碘酸鈉，以避免在多肽中的其它位點(diǎn)發(fā)生氧化。氧化反應(yīng)的pH值通常為約7.0。典型反應(yīng)涉及向多肽的緩沖溶液中添加約1.5摩爾過(guò)量的偏高碘酸鈉，接著在黑暗環(huán)境中培育約10分鐘。例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第6,423,685號(hào)，其以引用的方式并入本文中。
羰基官能團(tuán)可在溫和條件下在水溶液中與含肼、含酰肼、含羥胺或含氨基脲的試劑選擇性反應(yīng)，以分別形成在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定的相應(yīng)腙、肟或半卡巴腙(semicarbazone)鍵。例如參見(jiàn)Jencks，W.P.，J.Am.Chem.Soc.81，475-481(1959)；Shao，J.和Tarn，J.P.，J.Am.Chem.Soc.1173893-3899(1995)。此外，羰基的獨(dú)特反應(yīng)性允許在存在其它氨基酸側(cè)鏈的情況下進(jìn)行選擇性修飾。例如參見(jiàn)Cornish，V.W.等人，J.Am.Chem.Soc.1188150-8151(1996)；Geoghegan，K.F.和Stroh，J.G.，Bioconjug.Chem.3138-146(1992)；Mahal，L.K.等人，Science 2761125-1128(1997)。
B.肼、酰肼或氨基脲反應(yīng)性基團(tuán) 含有諸如肼、酰肼或氨基脲等親核基團(tuán)的非天然編碼氨基酸允許與多種親電子基團(tuán)反應(yīng)以形成結(jié)合物(包括(但不限于)與PEG或其它水溶性聚合物反應(yīng))。
例示性含肼、含酰肼或含氨基脲的氨基酸可如下表示
其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基或經(jīng)取代芳基或不存在；X為O、N或S或不存在；R2為H、氨基酸、多肽或氨基末端修飾基團(tuán)；且R3為H、氨基酸、多肽或羧基末端修飾基團(tuán)。
在一些實(shí)施例中，n為4，R1不存在且X為N。在一些實(shí)施例中，n為2，R1不存在且X不存在。在一些實(shí)施例中，n為1，R1為苯基，X為O，且氧原子是位于芳基環(huán)上脂肪族基團(tuán)的對(duì)位。
含酰肼、含肼和含氨基脲的氨基酸可購(gòu)自商業(yè)來(lái)源。舉例來(lái)說(shuō)，L-谷氨酸-γ-酰肼可購(gòu)自Sigma Chemical(St.Louis，MO)。無(wú)法購(gòu)得的其它氨基酸可由所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員制備。例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第6,281,211號(hào)，其以引用的方式并入本文中。
含有具有酰肼、肼或氨基脲官能團(tuán)的非天然編碼氨基酸的多肽可與多種含有醛或其它具有類(lèi)似化學(xué)反應(yīng)性的官能團(tuán)的分子有效且選擇性反應(yīng)。例如參見(jiàn)Shao，J.和Tarn，J.，J.Am.Chem.Soc.1173893-3899(1995)。酰肼、肼和氨基脲官能團(tuán)的獨(dú)特反應(yīng)性使其對(duì)醛、酮和其它親電子基團(tuán)相比對(duì)20種常見(jiàn)氨基酸中存在的親核基團(tuán)(包括(但不限于)絲氨酸或蘇氨酸的羥基或賴氨酸的氨基和N-末端)顯著更具反應(yīng)性。
C.含氨氧基的氨基酸 含有氨氧基(也稱(chēng)為羥胺)的非天然編碼氨基酸允許與多種親電子基團(tuán)反應(yīng)以形成結(jié)合物(包括(但不限于)與PEG或其它水溶性聚合物反應(yīng))。如同肼、酰肼和氨基脲，氨氧基的增加的親核性使其與多種含有醛或其它具有類(lèi)似化學(xué)反應(yīng)性的官能團(tuán)的分子有效且選擇性反應(yīng)。例如參見(jiàn)Shao，J.和Tarn，J.，J.Am.Chem.Soc.1173893-3899(1995)；H.Hang和C.Bertozzi，Ace.Chem.Res.34727-736(2001)。盡管與肼基團(tuán)的反應(yīng)結(jié)果是相應(yīng)的腙，但氨氧基與含羰基的基團(tuán)(諸如酮)的反應(yīng)通常產(chǎn)生肟。
例示性含氨氧基的氨基酸可如下表示
其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基或經(jīng)取代芳基或不存在；X為O、N、S或不存在；m為0-10；Y＝C(O)或不存在；R2為H、氨基酸、多肽或氨基末端修飾基團(tuán)；且R3為H、氨基酸、多肽或羧基末端修飾基團(tuán)。在一些實(shí)施例中，n為1，R1為苯基，X為O，m為1且Y存在。在一些實(shí)施例中，n為2，R1和X不存在，m為0且Y不存在。
含氨氧基的氨基酸可由可容易地獲得的氨基酸前體(高絲氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)制備。例如參見(jiàn)M.Carrasco和R.Brown，J.Org.Chem.688853-8858(2003)。某些含氨氧基的氨基酸(諸如L-2-氨基-4-(氨氧基)丁酸)已從天然來(lái)源分離(Rosenthal，G.，Life Sci.601635-1641(1997))。其它含氨氧基的氨基酸可由所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員制備。
D.疊氮和炔反應(yīng)性基團(tuán) 疊氮和炔官能團(tuán)的獨(dú)特反應(yīng)性使其極適用于多肽和其它生物分子的選擇性修飾。有機(jī)疊氮化物(尤其脂肪族疊氮化物)和炔對(duì)常見(jiàn)的反應(yīng)性化學(xué)條件來(lái)說(shuō)通常是穩(wěn)定的。具體來(lái)說(shuō)，疊氮和炔官能團(tuán)對(duì)天然存在多肽中可見(jiàn)的20種常見(jiàn)氨基酸的側(cè)鏈(即，R基團(tuán))來(lái)說(shuō)都是惰性的。然而，當(dāng)疊氮和炔基團(tuán)靠近時(shí)，其“彈簧加壓(spring-loaded)”生質(zhì)顯露且其經(jīng)由休斯根[3+2]環(huán)加成反應(yīng)選擇性且有效地反應(yīng)，從而產(chǎn)生相應(yīng)三唑。例如參見(jiàn)Chin J.等人，Science 301964-7(2003)；Wang，Q.等人，J.Am.Chem.Soc.125，3192-3193(2003)；Chin，J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.1249026-9027(2002)。
因?yàn)樾菟垢h(huán)加成反應(yīng)涉及選擇性環(huán)加成反應(yīng)(例如參見(jiàn)Padwa，A.，Comprehensive Organic Synthesis，第4卷，(Trost，B.M.編，1991)，第1069-1109頁(yè)；Huisgen，R.1，3-Dipolar Cycloaddition Chemistry，(Padwa，A.編，1984)，第1-176頁(yè))而不是親核取代，所以并入具有含疊氮和含炔的側(cè)鏈的非天然編碼氨基酸使得所得多肽在非天然編碼氨基酸的位置處經(jīng)選擇性修飾。涉及含疊氮或含炔的hPP多肽的環(huán)加成反應(yīng)可在室溫下在水性條件下通過(guò)在存在催化量的當(dāng)場(chǎng)將Cu(II)還原成Cu(I)的還原劑的情況下添加Cu(II)(包括(但不限于)呈催化量CUSO4的形式)進(jìn)行。例如參見(jiàn)Wang，Q等人，J.Am.Chem.Soc.125，3192-3193(2003)；Tornoe，C.W.等人，J.Org.Chem.673057-3064(2002)；Rostovtsev等人，Angew.Chem.Int.Ed.412596-2599(2002)。例示性還原劑包括(包括(但不限于))抗壞血酸鹽、金屬銅、奎寧(quinine)、氫醌、維生素K、谷胱甘肽、半胱氨酸、Fe2+、Co2+和外加電勢(shì)。
在一些情況下，當(dāng)需要疊氮化物與炔之間的休斯根[3+2]環(huán)加成反應(yīng)時(shí)，hPP多肽包含包括炔部分的非天然編碼氨基酸，且欲與氨基酸連接的水溶性聚合物包含疊氮部分?；蛘?，也可進(jìn)行倒轉(zhuǎn)反應(yīng)(即，疊氮部分在氨基酸上且炔部分存在于可溶性聚合物上) 也可使疊氮官能團(tuán)與含有芳基酯且經(jīng)芳基膦部分適當(dāng)官能化的水溶性聚合物選擇性反應(yīng)以產(chǎn)生酰胺鍵。芳基膦基團(tuán)當(dāng)場(chǎng)還原疊氮化物，且所得胺接著與鄰近酯鍵有效反應(yīng)以產(chǎn)生相應(yīng)酰胺。例如參見(jiàn)E.Saxon和C.Bertozzi，Science 287，2007-2010(2000)。含疊氮基的氨基酸可為烷基疊氮化物(包括(但不限于)2-氨基-6-疊氮基-1-己酸)或芳基疊氮化物(對(duì)疊氮基-苯丙氨酸)。
含芳基酯和膦部分的例示性水溶性聚合物可如下表示
其中X可為O、N、S或不存在，Ph為苯基，W為水溶性聚合物，且R可為H、烷基、芳基、經(jīng)取代烷基和經(jīng)取代芳基。例示性R基團(tuán)包括(但不限于)-CH2、-C(CH3)3、-OR′、-NR′R″、-SR′、-鹵素、-C(O)R′、-CONR′R″、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-CN和-NO2。R′、R″、R″′和R″″各自獨(dú)立地是指氫、經(jīng)取代或未經(jīng)取代雜烷基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代芳基(包括(但不限于)經(jīng)1-3個(gè)鹵素取代的芳基)、經(jīng)取代或未經(jīng)取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。例如，當(dāng)本發(fā)明的化合物包括一個(gè)以上R基團(tuán)時(shí)，R基團(tuán)是各自獨(dú)立地經(jīng)選擇，而當(dāng)存在R′、R″、R″′和R″″基團(tuán)中的一個(gè)以上時(shí)，這些基團(tuán)同樣是各自獨(dú)立地經(jīng)選擇。當(dāng)R′和R″連接到同一氮原子時(shí)，其可與氮原子組合形成5、6或7元環(huán)。舉例來(lái)說(shuō)，-NR′R″打算包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-嗎啉基。根據(jù)取代基的以上討論，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解術(shù)語(yǔ)“烷基”打算包括包括結(jié)合除氫基以外的基團(tuán)的碳原子的基團(tuán)，諸如鹵代烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和?；?包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
也可使疊氮官能團(tuán)與含有硫酯且經(jīng)芳基膦部分適當(dāng)官能化的水溶性聚合物選擇性反應(yīng)以產(chǎn)生酰胺鍵。芳基膦基團(tuán)當(dāng)場(chǎng)還原疊氮化物，且所得胺接著與硫酯鍵有效反應(yīng)以產(chǎn)生相應(yīng)酰胺。含硫酯和膦部分的例示性水溶性聚合物可如下表示
其中n為1-10；X可為O、N、S或不存在，Ph為苯基，且W為水溶性聚合物。
例示性含炔的氨基酸可如下表示
其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基或經(jīng)取代芳基或不存在；X為O、N、S或不存在；m為0-10；R2為H、氨基酸、多肽或氨基末端修飾基團(tuán)；且R3為H、氨基酸、多肽或羧基末端修飾基團(tuán)。在一些實(shí)施例中，n為1，R1為苯基，X不存在，m為0且乙炔部分是位于相對(duì)于烷基側(cè)鏈的對(duì)位。在一些實(shí)施例中，n為1，R1為苯基，X為O，m為1且炔丙氧基是位于相對(duì)于烷基側(cè)鏈的對(duì)位(即，O-炔丙基-酪氨酸)。在一些實(shí)施例中，n為1，R1和X不存在且m為0(即，炔丙基甘氨酸)。
含炔的氨基酸可購(gòu)得。舉例來(lái)說(shuō)，炔丙基甘氨酸可購(gòu)自Peptech(Burlington，MA)?；蛘撸驳陌被峥筛鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)方法制備。舉例來(lái)說(shuō)，可(例如)如Deiters，A.等人，J.Am.Chem.Soc.12511782-11783(2003)中所述來(lái)合成對(duì)炔丙氧基苯丙氨酸，且可如Kayser，B.等人，Tetrahedron 53(7)2475-2484(1997)中所述來(lái)合成4-炔基-L-苯丙氨酸。其它含炔的氨基酸可由所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員制備。
例示性含疊氮基的氨基酸可如下表示
其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基、經(jīng)取代芳基或不存在；X為O、N、S或不存在；m為0-10；R2為H、氨基酸、多肽或氨基末端修飾基團(tuán)；且R3為H、氨基酸、多肽或羧基末端修飾基團(tuán)。在一些實(shí)施例中，n為1，R1為苯基，X不存在，m為0且疊氮部分是位于烷基側(cè)鏈的對(duì)位。在一些實(shí)施例中，n為0-4且R1和X不存在且m＝0。在一些實(shí)施例中，n為1，R1為苯基，X為O，m為2且β疊氮基乙氧基部分是位于相對(duì)于烷基側(cè)鏈的對(duì)位。
含疊氮基的氨基酸可購(gòu)自商業(yè)來(lái)源。舉例來(lái)說(shuō)，可從Chem-Impex International，Inc.(Wood Dale，IL)獲得4-疊氮基苯丙氨酸。關(guān)于那些無(wú)法購(gòu)得的含疊氮基的氨基酸，可使用所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法相對(duì)容易地制備疊氮基，所述方法包括(但不限于)經(jīng)由置換合適的離去基(包括(但不限于)鹵基、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基)或經(jīng)由打開(kāi)經(jīng)合適保護(hù)的內(nèi)酯。例如參見(jiàn)March，Advanced OrganicChemistry(第3版，1985，Wiley and Sons，New York)。
E.氨基硫醇反應(yīng)性基團(tuán) β取代的氨基硫醇官能團(tuán)的獨(dú)特反應(yīng)性使其極適用于經(jīng)由形成噻唑烷來(lái)選擇性修飾含有醛基的多肽和其它生物分子。例如參見(jiàn)J.Shao和J.Tarn，J. Am.Chem.Soc.1995，117(14)3893-3899。在一些實(shí)施例中，可將β-取代的氨基硫醇氨基酸并入hPP多肽中，且然后使其與包含醛官能團(tuán)的水溶性聚合物反應(yīng)。在一些實(shí)施例中，可經(jīng)由形成噻唑烷使水溶性聚合物、藥物結(jié)合物或其它有效載荷與包含β-取代的氨基硫醇氨基酸的hPP多肽偶合。
F.其它反應(yīng)性基團(tuán) 可并入本發(fā)明的hPP或hA或hFc中的其它反應(yīng)性基團(tuán)和非天然編碼氨基酸(包括(但不限于)對(duì)氨基-苯丙氨酸)是描述于下列專(zhuān)利申請(qǐng)文件中美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)文獻(xiàn)第2006/0194256號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)文獻(xiàn)第2006/0217532號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)文獻(xiàn)第2006/0217289號(hào)、美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利第60/755,338號(hào)、美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利第60/755,711號(hào)、美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利第60/755,018號(hào)、國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)文件第PCT/US06/49397號(hào)、WO2006/069246、美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利第60/743,041號(hào)、美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利第60/743,040號(hào)、國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)文件第PCT/US06/47822號(hào)、美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利第60/882,819號(hào)、美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利第60/882,500號(hào)和美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利第60/870,594號(hào)，所述專(zhuān)利申請(qǐng)文件都以全文引用的方式并入本文中。這些申請(qǐng)文件還論述可存在于PEG或其它聚合物上的反應(yīng)性基團(tuán)，包括(但不限于)用于結(jié)合的羥胺基(氨氧基)。
非天然氨基酸的細(xì)胞攝取 細(xì)胞對(duì)非天然氨基酸的攝取是在設(shè)計(jì)和選擇包括(但不限于)用于并入蛋白質(zhì)中的非天然氨基酸時(shí)通?？紤]的一個(gè)問(wèn)題。舉例來(lái)說(shuō)，α-氨基酸的高電荷密度提示這些化合物不可能為細(xì)胞可滲透的。經(jīng)由一系列基于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將天然氨基酸吸收到真核細(xì)胞中。可進(jìn)行快速篩選以分析哪些非天然氨基酸(如果存在)被細(xì)胞吸收。例如參看，例如標(biāo)題為“Protein Arrays”的美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)文獻(xiàn)第2004/198637號(hào)(其以引用的方式并入本文中)以及Liu，D.R.和Schultz，P.G.(1999)Progress towardthe evolution of an organism with an expanded genetic code.PNAS United States964780-4785中的毒性檢定。盡管易于利用各種檢定來(lái)分析攝取，但設(shè)計(jì)適用于細(xì)胞攝取途徑的非天然氨基酸的替代方法是提供生物合成途徑以在活體內(nèi)產(chǎn)生氨基酸。
非天然氨基酸的生物合成 許多生物合成途徑已存在于細(xì)胞中以供產(chǎn)生氨基酸和其它化合物。自然界(包括(但不限于)細(xì)胞)中可能不存在特定非天然氨基酸的生物合成方法，但本發(fā)明提供所述方法。舉例來(lái)說(shuō)，視情況通過(guò)加入新穎酶或改變現(xiàn)有宿主細(xì)胞途徑而在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生非天然氨基酸的生物合成途徑。其它新穎酶視情況為天然存在的酶或人工開(kāi)發(fā)的酶。舉例來(lái)說(shuō)，對(duì)氨基苯丙氨酸的生物合成(如標(biāo)題為“In vivoincorporation of unnatural amino acids”的WO 2002/085923中的實(shí)例中所提供)依賴來(lái)自其它生物體的已知酶的組合的加入。可通過(guò)利用包含這些酶的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞來(lái)將所述基因引入真核細(xì)胞中。當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，這些基因提供合成所需化合物的酶促途徑。視情況加入的酶類(lèi)型的實(shí)例是提供于下文實(shí)例中。其它酶序列可見(jiàn)于例如Genbank中。也視情況以相同方式將人工開(kāi)發(fā)的酶加入細(xì)胞中。以此方式操縱細(xì)胞的細(xì)胞機(jī)構(gòu)和資源，從而產(chǎn)生非天然氨基酸。
多種方法可用于產(chǎn)生用于生物合成途徑或發(fā)展現(xiàn)有途徑的新穎酶。舉例來(lái)說(shuō)，視情況使用包括(但不限于)如Maxygen，Inc.所開(kāi)發(fā)的遞歸重組(recursiverecombination)(可在萬(wàn)維網(wǎng)的maxygen.com上獲得)來(lái)開(kāi)發(fā)新穎酶和途徑。例如參見(jiàn)Stemmer(1994)，Rapid evolution of a protein invitro by DNA shuffling，Nature370(4)389-391；和Stemmer，(1994)，DNA shuffling by random fragmentation andreassemblyIn vitro recombination for molecular evolution.Proc.Natl.Acad.Sci.USA..9110747-10751。類(lèi)似地，視情況將Genencor所開(kāi)發(fā)的DesignPathTM(可在萬(wàn)維網(wǎng)的genencor.com上獲得)用于代謝途徑工程化，包括(但不限于)工程化在細(xì)胞中產(chǎn)生O-甲基-L-酪氨酸的途徑。這項(xiàng)技術(shù)使用新基因(包括(但不限于)通過(guò)功能性基因組學(xué)以及分子進(jìn)化和設(shè)計(jì)所鑒別的基因)的組合在宿主生物體中重建現(xiàn)有途徑。Diversa公司(可在萬(wàn)維網(wǎng)的diversa.com上獲得)也提供迅速篩選基因文庫(kù)和基因途徑的技術(shù)，從而包括(但不限于)建立新途徑。
通常，利用本發(fā)明的經(jīng)工程化的生物合成途徑產(chǎn)生的非天然氨基酸是以足以進(jìn)行有效蛋白質(zhì)生物合成(包括(但不限于)天然細(xì)胞量)但未達(dá)到影響其它氨基酸的濃度或耗盡細(xì)胞資源的程度的濃度來(lái)產(chǎn)生。在活體內(nèi)以此方式產(chǎn)生的典型濃度為約10mM到約0.05mM。在利用包含用于產(chǎn)生特定途徑所需的酶的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞并且產(chǎn)生非天然氨基酸后，視情況使用活體內(nèi)選擇以針對(duì)核糖體蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)一步優(yōu)化非天然氨基酸的產(chǎn)生。
具有非天然氨基酸的多肽 非天然氨基酸的并入可出于多種目的來(lái)進(jìn)行，包括(但不限于)調(diào)整蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和/或功能的改變；改變尺寸、酸度、親核性、氫鍵結(jié)、疏水性、蛋白酶標(biāo)靶位點(diǎn)的可及性；靶向部分(包括(但不限于)用于蛋白質(zhì)陣列)；添加生物活性分子；連接聚合物；連接放射性核素；調(diào)節(jié)血清半衰期；調(diào)節(jié)組織滲透(例如腫瘤)；調(diào)節(jié)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)；調(diào)節(jié)組織、細(xì)胞或器官特異性或分布；調(diào)節(jié)免疫原性；調(diào)節(jié)蛋白酶抗性等。包括非天然氨基酸的蛋白質(zhì)可具有增強(qiáng)的或甚至完全新穎的催化或生物物理性質(zhì)。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)在蛋白質(zhì)中包括非天然氨基酸來(lái)視情況改良下列性質(zhì)毒性、生物分布、結(jié)構(gòu)性質(zhì)、光譜性質(zhì)、化學(xué)和/或光化學(xué)性質(zhì)、催化能力、半衰期(包括(但不限于)血清半衰期)、與其它分子包括(但不限于)共價(jià)或非共價(jià)反應(yīng)的能力等。包括包含至少一個(gè)非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的組合物適用于包括(但不限于)新穎治療劑、診斷劑、催化酶、工業(yè)酶、結(jié)合蛋白(包括(但不限于)抗體)以及包括(但不限于)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究。例如參見(jiàn)Dougherty，(2000)Unnatural Amino Acidsas Probes of Protein Structure and Function，Current Opinion in Chemical Biology4645-652。
在本發(fā)明的一方面，組合物包括至少一種具有至少一個(gè)，包括(但不限于)至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)、至少七個(gè)、至少八個(gè)、至少九個(gè)或至少十個(gè)或十個(gè)以上非天然氨基酸的蛋白質(zhì)。非天然氨基酸可相同或不同，包括(但不限于)在蛋白質(zhì)中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10個(gè)以上不同位點(diǎn)，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10個(gè)以上不同的非天然氨基酸。另一方面，組合物包括蛋白質(zhì)中所存在的至少一個(gè)(但少于全部)特定氨基酸經(jīng)非天然氨基酸取代的蛋白質(zhì)。對(duì)于具有一個(gè)以上非天然氨基酸的給定蛋白質(zhì)，非天然氨基酸可相同或不同(包括(但不限于)蛋白質(zhì)可包括兩個(gè)或兩個(gè)以上不同類(lèi)型的非天然氨基酸，或可包括兩個(gè)相同的非天然氨基酸)。對(duì)于具有兩個(gè)以上非天然氨基酸的給定蛋白質(zhì)，非天然氨基酸可相同、不同或?yàn)槎鄠€(gè)相同種類(lèi)的非天然氨基酸與至少一個(gè)不同非天然氨基酸的組合。
所關(guān)注的具有至少一個(gè)非天然氨基酸的蛋白質(zhì)或多肽是本發(fā)明的特征。本發(fā)明還包括使用本發(fā)明的組合物和方法產(chǎn)生的具有至少一個(gè)非天然氨基酸的多肽或蛋白質(zhì)。賦形劑(包括(但不限于)醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑)也可與蛋白質(zhì)一起存在。
通過(guò)在真核細(xì)胞中產(chǎn)生所關(guān)注的具有至少一個(gè)非天然氨基酸的蛋白質(zhì)或多肽，蛋白質(zhì)或多肽通常將包括真核生物翻譯后修飾。在某些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)包括至少一個(gè)非天然氨基酸和至少一個(gè)由真核細(xì)胞在活體內(nèi)進(jìn)行的翻譯后修飾，其中所述翻譯后修飾并非由原核細(xì)胞進(jìn)行。舉例來(lái)說(shuō)，翻譯后修飾包括包括(但不限于)乙?；?、?；?、脂質(zhì)修飾、棕櫚酰化、棕櫚酸鹽加成、磷酸化、糖脂鍵修飾、糖基化等。一方面，翻譯后修飾包括通過(guò)GlcNAc-天冬酰胺鍵使寡糖(包括(但不限于)(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc)與天冬酰胺連接。也參見(jiàn)表1，表1列出真核生物蛋白質(zhì)的N-連接寡糖的一些實(shí)例(也可存在其它未表示的殘基)。另一方面，翻譯后修飾包括通過(guò)GalNAc-絲氨酸或GalNAc-蘇氨酸鍵或GlcNAc-絲氨酸或GlcNAc-蘇氨酸鍵使寡糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)與絲氨酸或蘇氨酸連接。
表1通過(guò)GlcNAc鍵連接的寡糖的實(shí)例
另一方面，翻譯后修飾包括前體(包括(但不限于)降鈣素前體、降鈣素基因相關(guān)肽前體、前甲狀旁腺激素原(preproparathyroid hormone)、前胰島素原、胰島素原、前阿黑皮素原(prepro-opiomelanocortin)、阿黑皮素原等)的蛋白水解加工，組裝成多亞單元蛋白質(zhì)或大分子組裝物中，翻譯到細(xì)胞中的另一位點(diǎn)(包括(但不限于)細(xì)胞器，諸如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體(Golgi apparatus)、核、溶酶體、過(guò)氧化物酶體、線粒體、葉綠體、空泡等，或通過(guò)分泌途徑)。在某些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)包含分泌或定位序列、抗原決定基標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、聚組氨酸標(biāo)簽、GST融合物等。美國(guó)專(zhuān)利第4,963,495號(hào)和第6,436,674號(hào)(其以引用的方式并入本文中)詳述可改進(jìn)hPP多肽的分泌的構(gòu)筑體。
非天然氨基酸的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于，其提供可用于添加其它分子的其它化學(xué)部分。這些修飾可在真核細(xì)胞或非真核細(xì)胞中活體內(nèi)進(jìn)行或在活體外進(jìn)行。因此，在某些實(shí)施例中，翻譯后修飾是通過(guò)非天然氨基酸進(jìn)行。舉例來(lái)說(shuō)，翻譯后修飾可通過(guò)親核-親電子反應(yīng)進(jìn)行。目前用于選擇性修飾蛋白質(zhì)的大多數(shù)反應(yīng)包括親核與親電子反應(yīng)搭配物之間的共價(jià)鍵形成，包括(但不限于)α-鹵基酮與組氨酸或半胱氨酸側(cè)鏈的反應(yīng)。這些情況下的選擇性是由蛋白質(zhì)中親核殘基的數(shù)目和可及性決定。在本發(fā)明的蛋白質(zhì)中，可在活體外和活體內(nèi)使用其它更具選擇性的反應(yīng)，諸如非天然酮基氨基酸與酰肼或氨氧基化合物的反應(yīng)。例如參見(jiàn)Cornish等人，(1996)Am.Chem.Soc，1188150-8151；Mahal等人，(1997)Science，2761125-1128；Wang等人，(2001)Science292498-500；Chin等人，(2002)Am.Chem.Soc.1249026-9027；Chin等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.9911020-11024；Wang等人，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.，10056-61；Zhang等人，(2003)Biochemistry，426735-6746；以及Chin等人，(2003)Science，301964-7，所有這些文獻(xiàn)都是以引用的方式并入本文中。這允許用許多試劑選擇性標(biāo)記幾乎任何蛋白質(zhì)，所述試劑包括熒光團(tuán)、交聯(lián)劑、糖類(lèi)衍生物以及細(xì)胞毒性分子。也參見(jiàn)標(biāo)題為“Glycoprotein synthesis”的美國(guó)專(zhuān)利第6,927,042號(hào)，其以引用的方式并入本文中。包括(但不限于)通過(guò)疊氮基氨基酸進(jìn)行的翻譯后修飾也可通過(guò)斯達(dá)汀格連接反應(yīng)(Staudinger ligation)(包括(但不限于)用三芳基膦試劑)進(jìn)行。例如參見(jiàn)Kiick等人，(2002)Incorporation of azides into recombinant proteins forchemoselective modification by the Staudinger ligtation PNAS 9919-24。
本發(fā)明提供選擇性修飾蛋白質(zhì)的另一種極為有效的方法，其包括響應(yīng)選擇密碼子將包括(但不限于)含有疊氮部分或炔基部分的非天然氨基酸遺傳并入蛋白質(zhì)中。然后，可包括(但不限于)通過(guò)休斯根[3+2]環(huán)加成反應(yīng)(例如參見(jiàn)Padwa，A.，Comprehensive Organic Synthesis，第4卷，(1991)Trost，B.M.編，Pergamon，Oxford，第1069-1109頁(yè)；和Huisgen，R.，1，3-Dipolar Cycloaddition Chemistry，(1984)Padwa，A.編，Wiley，New York，第1-176頁(yè))分別用包括(但不限于)炔基或疊氮衍生物來(lái)修飾這些氨基酸側(cè)鏈。因?yàn)檫@一方法包括環(huán)加成而不是親核取代，所以可以極高選擇性修飾蛋白質(zhì)?？稍谑覝叵略谒詶l件下通過(guò)向反應(yīng)混合物中添加催化量的Cu(I)鹽而以極佳區(qū)域選擇性(1，4>1，5)進(jìn)行這一反應(yīng)。例如參見(jiàn)Tornoe等人，(2002)Org.Chem.673057-3064；和Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.412596-2599。可使用的另一方法為用四半胱氨酸(tetracysteine)基元對(duì)雙砷化合物進(jìn)行配位體交換，例如參見(jiàn)Griffin等人，(1998)Science 281269-272。
可通過(guò)[3+2]環(huán)加成添加到本發(fā)明的蛋白質(zhì)中的分子包括幾乎任何具有疊氮化物或炔基衍生物的分子。這些分子包括(但不限于)染料、熒光團(tuán)、交聯(lián)劑、糖類(lèi)衍生物、聚合物(包括(但不限于)聚乙二醇的衍生物)、光交聯(lián)劑、細(xì)胞毒性化合物、親和標(biāo)記、生物素衍生物、樹(shù)脂、珠粒、第二蛋白質(zhì)或多肽(或更多)、多核苷酸(包括(但不限于)DNA、RNA等)、金屬螯合劑、輔因子、脂肪酸、碳水化合物等。分別可將這些分子添加到具有炔基的非天然氨基酸(包括(但不限于)對(duì)炔丙氧基苯丙氨酸)或具有疊氮基的非天然氨基酸(包括(但不限于)對(duì)疊氮基-苯丙氨酸)中。
V.活體內(nèi)產(chǎn)生包含非遺傳編碼氨基酸的hPP或hA或hFc 可使用經(jīng)修飾的tRNA和tRNA合成酶在活體內(nèi)產(chǎn)生本發(fā)明的hPP或hFc多肽，以將其添加到天然存在的系統(tǒng)中無(wú)法編碼的氨基酸中或取代所述氨基酸。
例如，使用天然存在的系統(tǒng)中無(wú)法編碼的氨基酸產(chǎn)生tRNA和tRNA合成酶的方法是描述于美國(guó)專(zhuān)利第7,045,337號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)文獻(xiàn)2003/0108885(第10/126,931號(hào))中，所述專(zhuān)利以引用的方式并入本文中。這些方法涉及產(chǎn)生獨(dú)立于翻譯系統(tǒng)的內(nèi)源性合成酶和tRNA起作用(且因此有時(shí)稱(chēng)為“正交”)的翻譯機(jī)構(gòu)。翻譯系統(tǒng)通常包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS)。通常，O-RS在翻譯系統(tǒng)中優(yōu)先利用至少一種非天然存在氨基酸使O-tRNA氨?；襉-tRNA識(shí)別至少一個(gè)不被系統(tǒng)中的其它tRNA識(shí)別的選擇密碼子。因此，翻譯系統(tǒng)響應(yīng)經(jīng)編碼的選擇密碼子將非天然編碼氨基酸插入系統(tǒng)中所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)中，從而“取代”氨基酸使其進(jìn)入編碼多肽的某一位置中。
所屬領(lǐng)域中已描述用于將特定合成氨基酸插入多肽中的多種正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶，且其通常適用于本發(fā)明。舉例來(lái)說(shuō)，酮基特異性O(shè)-tRNA/氨酰基tRNA合成酶是描述于Wang，L等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 10056-61(2003)和Zhang，Z.等人，Biochem.42(22)6735-6746(2003)中。例示性O(shè)-RS或其部分是由多核苷酸序列編碼并且包括美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)文獻(xiàn)2003/0082575和2003/0108885(各自以引用的方式并入本文)中所公開(kāi)的氨基酸序列。與O-RS一起使用的相應(yīng)O-tRNA分子也描述于美國(guó)專(zhuān)利第7,045,337號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)文獻(xiàn)2003/0108885(第10/126,931號(hào))中，所述專(zhuān)利以引用的方式并入本文中。
疊氮化物特異性O(shè)-tRNA/氨?；鵷RNA合成酶系統(tǒng)的實(shí)例是描述于Chin，J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.1249026-9027(2002)中。對(duì)疊氮基-L-苯丙氨酸的例示性O(shè)-RS序列包括(但不限于)如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)文獻(xiàn)2003/0108885(第10/126,931號(hào))中所公開(kāi)的核苷酸序列SEQ ID NOs14-16和29-32以及氨基酸序列SEQ ID NO46-48和61-64，所述專(zhuān)利以引用的方式并入本文中。適用于本發(fā)明的例示性O(shè)-tRNA序列包括(但不限于)如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)文獻(xiàn)2003/0108885(第10/126,931號(hào))(其以引用的方式并入本文中)中所公開(kāi)的核苷酸序列SEQ ID NOs1-3。對(duì)特定非天然氨基酸具特異性的O-tRNA/氨?；鵷RNA合成酶對(duì)的其它實(shí)例是描述于美國(guó)專(zhuān)利第7，045,337號(hào)中，其以引用的方式并入本文中。在釀酒酵母中并入含酮基的氨基酸與含疊氮基的氨基酸的O-RS和O-tRNA是描述于Chin，J.W.等人，Science 301964-967(2003)中。
已報(bào)導(dǎo)若干其它正交對(duì)。已描述用于將非天然氨基酸潛在地并入大腸桿菌中的源自釀酒酵母tRNA和合成酶的谷氨酰胺?；?例如參見(jiàn)Liu，D.R.和Schultz，P.G.，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.964780-4785)、天冬氨?；?例如參見(jiàn)Pastrnak，M等人，(2000)Helv.Chim.Acta 832277-2286)以及酪氨酰基(例如參見(jiàn)Ohno，S.等人，(1998)J.Biochem.(Tokyo，Jpn.)1241065-1068；和Kowal，A.K.等人，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.982268-2273)系統(tǒng)。已描述用于釀酒酵母的源自大腸桿菌谷氨酰胺?；?例如參見(jiàn)Kowal.A.K.等人，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.982268-2273)和酪氨?；?例如參見(jiàn)Edwards，H.和Schimmel，P.(1990)Mol.Cell.Biol.101633-1641)合成酶的系統(tǒng)。大腸桿菌酪氨?；到y(tǒng)已用于將3-碘-L-酪氨酸在活體內(nèi)并入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。參見(jiàn)Sakamoto，K.等人，(2002)Nucleic Acids Res.304692-4699。
O-tRNA/氨酰基tRNA合成酶的使用涉及選擇編碼非天然編碼氨基酸的特定密碼子。盡管可使用任何密碼子，但一般需要選擇很少或從未用于表達(dá)O-tRNA/氨?；鵷RNA合成酶的細(xì)胞中的密碼子。舉例來(lái)說(shuō)，例示性密碼子包括無(wú)義密碼子，諸如終止密碼子(琥珀、赭石和蛋白石)；四個(gè)或四個(gè)以上堿基的密碼子；和很少使用或未經(jīng)使用的其它天然的三個(gè)堿基的密碼子。
可使用所屬領(lǐng)域中已知的誘變方法(包括(但不限于)位點(diǎn)特異性誘變、盒式誘變、限制選擇誘變等)將特定的選擇性密碼子引入hPP多核苷酸編碼序列的適當(dāng)位置中。
用于產(chǎn)生可用于并入非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)合成機(jī)構(gòu)的組件(諸如O-RS、O-tRNA和正交O-tRNA/O-RS對(duì))的方法是描述于Wang，L.等人，Science 292498-500(2001)；Chin，J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.1249026-9027(2002)；Zhang，Z等人，Biochemistry 426735-6746(2003)中。用于活體內(nèi)并入非天然編碼氨基酸的方法和組合物是描述于美國(guó)專(zhuān)利第7,045,337號(hào)中，其以引用的方式并入本文中。用于選擇生物體的活體內(nèi)翻譯系統(tǒng)中所使用的正交tRNA-tRNA合成酶對(duì)的方法也描述于美國(guó)專(zhuān)利第7,045,337號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)文獻(xiàn)2003/0108885(第10/126，931號(hào))中，其以引用的方式并入本文中。標(biāo)題為“Site Specific Incorporation of Keto Amino Acidsinto Proteins”的PCT公開(kāi)文獻(xiàn)第WO 04/035743號(hào)(其以全文引用的方式并入本文中)描述用于并入酮基氨基酸的正交RS和tRNA對(duì)。標(biāo)題為“Expanding the EukaryoticGenetic Code”的PCT公開(kāi)文獻(xiàn)第WO 04/094593號(hào)(其以全文引用的方式并入本文中)描述用于將非天然編碼的氨基酸并入真核宿主細(xì)胞中的正交RS和tRNA對(duì)。
用于產(chǎn)生至少一種重組正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS)的方法包含(a)由第一生物體產(chǎn)生源自至少一種氨酰基tRNA合成酶(RS)的(視情況突變)RS文庫(kù)，所述第一生物體包括(但不限于)原核生物體(諸如詹氏甲烷球菌、產(chǎn)甲烷桿菌、嗜鹽菌、大腸桿菌、超嗜熱古菌、強(qiáng)烈熾熱球菌、極端嗜熱古菌、嗜熱泉生古細(xì)菌、嗜熱棲熱菌等)或真核生物體；(b)在RS(視情況突變RS)文庫(kù)中選擇(和/或篩選)在存在非天然編碼氨基酸和天然氨基酸的情況下使正交tRNA(O-tRNA)氨?；某蓡T，從而提供活性(視情況突變)RS池；和/或(c)在所述池中選擇(視情況通過(guò)陰性選擇)在不存在非天然編碼氨基酸的情況下優(yōu)先使O-tRNA氨酰化的活性RS(包括(但不限于)突變RS)，從而提供所述至少一種重組O-RS；其中所述至少一種重組O-RS利用非天然編碼氨基酸優(yōu)先使O-tRNA氨酰化。
在一個(gè)實(shí)施例中，RS為無(wú)活性RS?？赏ㄟ^(guò)使活性RS突變來(lái)產(chǎn)生無(wú)活性RS。舉例來(lái)說(shuō)，可通過(guò)使至少約1個(gè)、至少約2個(gè)、至少約3個(gè)、至少約4個(gè)、至少約5個(gè)、至少約6個(gè)或至少約10個(gè)或10個(gè)以上氨基酸突變成不同氨基酸(包括(但不限于)丙氨酸)來(lái)產(chǎn)生無(wú)活性RS。
可使用所屬領(lǐng)域已知的各種技術(shù)產(chǎn)生突變RS文庫(kù)，所述技術(shù)包括(但不限于)基于蛋白質(zhì)三維RS結(jié)構(gòu)的合理設(shè)計(jì)或在隨機(jī)或合理設(shè)計(jì)技術(shù)中RS核苷酸的誘變。舉例來(lái)說(shuō)，可通過(guò)位點(diǎn)特異性突變、隨機(jī)突變、產(chǎn)生多樣性的重組突變、嵌合構(gòu)筑體、合理設(shè)計(jì)和本文中所述或所屬領(lǐng)域已知的其它方法產(chǎn)生突變RS。
在一個(gè)實(shí)施例中，在RS(視情況突變RS)文庫(kù)中選擇(和/或篩選)(包括(但不限于))在存在非天然編碼氨基酸和天然氨基酸的情況下使正交tRNA(O-tRNA)氨?；幕钚猿蓡T包括將陽(yáng)性選擇或篩選標(biāo)記(包括(但不限于)抗生素抗性基因等)和(視情況突變)RS文庫(kù)引入多個(gè)細(xì)胞中，其中陽(yáng)性選擇和/或篩選標(biāo)記包含至少一個(gè)選擇密碼子(包括(但不限于)琥珀密碼子、赭石密碼子或蛋白石密碼子)；使所述多個(gè)細(xì)胞在存在選擇劑的情況下生長(zhǎng)；通過(guò)抑制陽(yáng)性選擇或篩選標(biāo)記中的所述至少一個(gè)選擇密碼子來(lái)鑒別在存在選擇劑和/或篩選劑的情況下存活(或顯示特異性反應(yīng))的細(xì)胞，從而提供含有活性(視情況突變)RS池的經(jīng)陽(yáng)性選擇細(xì)胞的子集。視情況可改變選擇劑和/或篩選劑濃度。
一方面，陽(yáng)性選擇標(biāo)記為氯霉素(chloramphenicol)乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)基因且選擇密碼子為CAT基因中的琥珀終止密碼子。視情況，陽(yáng)性選擇標(biāo)記為β-內(nèi)酰胺酶基因且選擇密碼子為β-內(nèi)酰胺酶基因中的琥珀終止密碼子。另一方面，陽(yáng)性篩選標(biāo)記包含熒光或發(fā)光篩選標(biāo)記或基于親和性的篩選標(biāo)記(包括(但不限于)細(xì)胞表面標(biāo)記)。
在一個(gè)實(shí)施例中，在池中陰性選擇或篩選在不存在非天然編碼氨基酸的情況下優(yōu)先使O-tRNA氨?；幕钚訰S(視情況突變體)包括將陰性選擇或篩選標(biāo)記與來(lái)自陽(yáng)性選擇或篩選的活性(視情況突變)RS池引入第二生物體的多個(gè)細(xì)胞中，其中陰性選擇或篩選標(biāo)記包含至少一個(gè)選擇密碼子(包括(但不限于)抗生素抗性基因，其包括(但不限于)氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)基因)；以及鑒別在補(bǔ)充有非天然編碼氨基酸和篩選劑或選擇劑的第一培養(yǎng)基中存活或顯示特異性篩選反應(yīng)，但在未補(bǔ)充非天然編碼氨基酸和選擇劑或篩選劑的第二培養(yǎng)基中不能存活或顯示特異性反應(yīng)的細(xì)胞，從而提供具有至少一種重組O-RS的存活細(xì)胞或篩選細(xì)胞。舉例來(lái)說(shuō)，CAT鑒別方案在適當(dāng)O-RS重組體的確定中視情況充當(dāng)陽(yáng)性選擇和/或陰性篩選。舉例來(lái)說(shuō)，視情況在存在或不存在一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的情況下在含有CAT(其包含至少一個(gè)選擇密碼子)的生長(zhǎng)板上復(fù)制克隆池。因此，認(rèn)為僅在含有非天然編碼氨基酸的平板上生長(zhǎng)的菌落含有重組O-RS。一方面，改變選擇(和/或篩選)劑的濃度。在一些方面中，第一與第二生物體是不同的。因此，第一和/或第二生物體視情況包含原核生物、真核生物、哺乳動(dòng)物、大腸桿菌、真菌、酵母、古細(xì)菌、真細(xì)菌、植物、昆蟲(chóng)、原生生物等。在其它實(shí)施例中，篩選標(biāo)記包含熒光或發(fā)光篩選標(biāo)記或基于親和性的篩選標(biāo)記。
在另一實(shí)施例中，在池中篩選或選擇(包括(但不限于)陰性選擇)活性(視情況突變)RS包括自陽(yáng)性選擇步驟(b)分離活性突變RS池；將陰性選擇或篩選標(biāo)記和活性(視情況突變)RS池引入第二生物體的多個(gè)細(xì)胞中，其中陰性選擇或篩選標(biāo)記包含至少一個(gè)選擇密碼子(包括(但不限于)包含至少一個(gè)選擇密碼子的毒性標(biāo)記基因，其包括(但不限于)核糖核酸酶barnase基因)；以及鑒別在未補(bǔ)充非天然編碼氨基酸的第一培養(yǎng)基中存活或顯示特異性篩選反應(yīng)，但在補(bǔ)充有非天然編碼氨基酸的第二培養(yǎng)基中不能存活或顯示特異性篩選反應(yīng)的細(xì)胞，從而提供具有至少一種重組O-RS的存活細(xì)胞或篩選細(xì)胞，其中所述至少一種重組O-RS對(duì)非天然編碼氨基酸具特異性。一方面，所述至少一個(gè)選擇密碼子包含約兩個(gè)或兩個(gè)以上選擇密碼子。這些實(shí)施例視情況可包括所述至少一個(gè)選擇密碼子包含兩個(gè)或兩個(gè)以上選擇密碼子的情形，以及第一與第二生物體不同(包括(但不限于)各生物體視情況為(包括(但不限于))原核生物、真核生物、哺乳動(dòng)物、大腸桿菌、真菌、酵母、古細(xì)菌、真細(xì)菌、植物、昆蟲(chóng)、原生生物等)的情形。另外，一些方面包括陰性選擇標(biāo)記包含核糖核酸酶barnase基因(其包含至少一個(gè)選擇密碼子)的情形。其它方面包括篩選標(biāo)記視情況包含熒光或發(fā)光篩選標(biāo)記或基于親和力的篩選標(biāo)記的情形。在本文中的實(shí)施例中，篩選和/或選擇視情況包括篩選和/或選擇嚴(yán)格度的變化。
在一個(gè)實(shí)施例中，用于產(chǎn)生至少一種重組正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS)的方法可進(jìn)一步包含(d)分離所述至少一種重組O-RS；(e)產(chǎn)生源自所述至少一種重組O-RS的第二組O-RS(視情況突變)；以及(f)重復(fù)步驟(b)和(c)，直到獲得包含優(yōu)先使O-tRNA氨?；哪芰Φ耐蛔僌-RS。視情況，將步驟(d)-(f)重復(fù)(包括(但不限于))至少約兩次。一方面，可通過(guò)誘變(包括(但不限于)隨機(jī)誘變、位點(diǎn)特異性誘變、重組或其組合)產(chǎn)生源自至少一種重組O-RS的第二組突變O-RS。
在上述方法中，選擇/篩選步驟(包括(但不限于)陽(yáng)性選擇/篩選步驟(b)、陰性選擇/篩選步驟(c)或陽(yáng)性與陰性選擇/篩選步驟(b)與(c))的嚴(yán)格度視情況包括改變選擇/篩選嚴(yán)格度。在另一實(shí)施例中，陽(yáng)性選擇/篩選步驟(b)、陰性選擇/篩選步驟(c)或陽(yáng)性與陰性選擇/篩選步驟(b)與(c)包含使用報(bào)告基因，其中報(bào)告基因是通過(guò)熒光激活細(xì)胞分類(lèi)(FACS)檢測(cè)或其中報(bào)告基因是通過(guò)發(fā)光檢測(cè)。報(bào)告基因是視情況呈現(xiàn)于細(xì)胞表面、噬菌體呈現(xiàn)上等且根據(jù)涉及非天然編碼氨基酸或類(lèi)似物的親和性或催化活性進(jìn)行選擇。在一個(gè)實(shí)施例中，突變合成酶是呈現(xiàn)于細(xì)胞表面、噬菌體呈現(xiàn)上等。
用于產(chǎn)生重組正交tRNA(O-tRNA)的方法包括(a)由第一生物體產(chǎn)生源自至少一種tRNA(包括(但不限于)抑制因子tRNA)的突變tRNA文庫(kù)；(b)在所述文庫(kù)中選擇(包括(但不限于)陰性選擇)或篩選在不存在來(lái)自第一生物體的RS的情況下通過(guò)來(lái)自第二生物體的氨?；鵷RNA合成酶(RS)氨酰化的(視情況突變)tRNA，從而提供tRNA(視情況突變體)池；以及(c)在所述tRNA(視情況突變體)池中選擇或篩選通過(guò)引入的正交RS(O-RS)氨酰化的成員，從而提供至少一種重組O-tRNA；其中所述至少一種重組O-tRNA識(shí)別選擇密碼子且無(wú)法由來(lái)自第二生物體的RS有效識(shí)別且通過(guò)O-RS優(yōu)先氨?；?。在一些實(shí)施例中，所述至少一種tRNA為抑制因子tRNA和/或包含具有天然和/或非天然堿基的獨(dú)特的三個(gè)堿基的密碼子，或?yàn)闊o(wú)義密碼子、稀有密碼子、非天然密碼子、包含至少4個(gè)堿基的密碼子、琥珀密碼子、赭石密碼子或蛋白石終止密碼子。在一個(gè)實(shí)施例中，重組O-tRNA具有正交性的改良。應(yīng)了解在一些實(shí)施例中，O-tRNA無(wú)需修飾而視情況從第二生物體引入第一生物體中。在各種實(shí)施例中，第一與第二生物體是相同或不同的且視情況選自(包括(但不限于))原核生物(包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、產(chǎn)甲烷桿菌、大腸桿菌、嗜鹽菌等)、真核生物、哺乳動(dòng)物、真菌、酵母、古細(xì)菌、真細(xì)菌、植物、昆蟲(chóng)、原生生物等。另外，重組tRNA是由非天然編碼氨基酸視情況氨?；?，其中非天然編碼氨基酸是在活體內(nèi)天然生物合成或通過(guò)基因操縱生物合成。視情況將非天然編碼氨基酸添加到至少第一或第二生物體的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。
一方面，在所述文庫(kù)中選擇(包括(但不限于)陰性選擇)或篩選通過(guò)氨酰基tRNA合成酶氨?；?視情況突變)tRNA(步驟(b))包括將毒性標(biāo)記基因和(視情況突變)tRNA文庫(kù)引入來(lái)自第二生物體的多個(gè)細(xì)胞中，其中毒性標(biāo)記基因包含至少一個(gè)選擇密碼子(或?qū)е庐a(chǎn)生毒性劑或抑制劑(static agent)的基因或生物體必需的基因，其中所述標(biāo)記基因包含至少一個(gè)選擇密碼子)；和選擇存活細(xì)胞，其中存活細(xì)胞含有包含至少一個(gè)正交tRNA或非功能性tRNA的(視情況突變)tRNA池。舉例來(lái)說(shuō)，可通過(guò)使用比較比率細(xì)胞密度檢定來(lái)選擇存活細(xì)胞。
另一方面，毒性標(biāo)記基因可包括兩個(gè)或兩個(gè)以上選擇密碼子。在所述方法的另一實(shí)施例中，毒性標(biāo)記基因?yàn)楹颂呛怂崦竍arnase基因，其中核糖核酸酶barnase基因包含至少一個(gè)琥珀密碼子。核糖核酸酶barnase基因視情況可包括兩個(gè)或兩個(gè)以上琥珀密碼子。
在一個(gè)實(shí)施例中，在(視情況突變)tRNA池中選擇或篩選通過(guò)引入的正交RS(O-RS)氨酰化的成員可包括將陽(yáng)性選擇或篩選標(biāo)記基因以及O-RS和(視情況突變)tRNA池引入來(lái)自第二生物體的多個(gè)細(xì)胞中，其中陽(yáng)性標(biāo)記基因包含藥物抗性基因(其包括(但不限于)β-內(nèi)酰胺酶基因，其包含至少一個(gè)選擇密碼子，諸如至少一個(gè)琥珀終止密碼子)或生物體必需的基因或使得毒性劑解毒的基因；以及鑒別在存在選擇劑或篩選劑(包括(但不限于)抗生素)的情況下生長(zhǎng)的存活細(xì)胞或篩選細(xì)胞，從而提供具有至少一種重組tRNA的細(xì)胞池，其中所述至少一種重組tRNA是通過(guò)O-RS氨?；翼憫?yīng)所述至少一個(gè)選擇密碼子將氨基酸插入由陽(yáng)性標(biāo)記基因編碼的翻譯產(chǎn)物中。在另一實(shí)施例中，改變選擇劑和/或篩選劑的濃度。
提供用于產(chǎn)生特異性O(shè)-tRNA/O-RS對(duì)的方法。所述方法包括(a)由第一生物體產(chǎn)生源自至少一種tRNA的突變tRNA的文庫(kù)；(b)在所述文庫(kù)中陰性選擇或篩選在不存在來(lái)自第一生物體的RS的情況下通過(guò)來(lái)自第二生物體的氨?；鵷RNA合成酶(RS)氨酰化的(視情況突變)tRNA，從而提供(視情況突變)tRNA池；(c)在(視情況突變)tRNA池中選擇或篩選通過(guò)引入的正交RS(O-RS)氨?；某蓡T，從而提供至少一種重組O-tRNA。所述至少一種重組O-tRNA識(shí)別選擇密碼子且無(wú)法由來(lái)自第二生物體的RS有效識(shí)別且通過(guò)O-RS優(yōu)先氨酰化。所述方法還包括(d)由第三生物體產(chǎn)生源自至少一種氨?；鵷RNA合成酶(RS)的(視情況突變)RS的文庫(kù)；(e)在所述突變RS文庫(kù)中選擇或篩選在存在非天然編碼氨基酸和天然氨基酸的情況下優(yōu)先使所述至少一種重組O-tRNA氨?；某蓡T，從而提供活性(視情況突變)RS池；和(f)在所述池中陰性選擇或篩選在不存在非天然編碼氨基酸的情況下優(yōu)先使所述至少一種重組O-tRNA氨?；幕钚?視情況突變)RS，從而提供至少一個(gè)特異性O(shè)-tRNA/O-RS對(duì)，其中所述至少一個(gè)特異性O(shè)-tRNA/O-RS對(duì)包含至少一種對(duì)非天然編碼氨基酸具特異性的重組O-RS和所述至少一種重組O-tRNA。包括由所述方法產(chǎn)生的特異性O(shè)-tRNA/O-RS對(duì)。舉例來(lái)說(shuō)，特異性O(shè)-tRNA/O-RS對(duì)可包括(包括(但不限于))mutRNATyr-mutTyrRS對(duì)，諸如mutRNATyr-SS12TyrRS對(duì)、mutRNALeu-mutLeuRS對(duì)、mutRNAThr-mutThrRS對(duì)、mutRNAGlu-mutGluRS對(duì)等。另外，所述方法包括第一與第三生物體相同(其包括(但不限于)詹氏甲烷球菌)的情形。
本發(fā)明中也包括選擇用于第二生物體的活體內(nèi)翻譯系統(tǒng)中的正交tRNA-tRNA合成酶對(duì)的方法。所述方法包括將標(biāo)記基因、tRNA和從第一生物體分離或獲得的氨?；鵷RNA合成酶(RS)引入來(lái)自第二生物體的第一組細(xì)胞中；將標(biāo)記基因和tRNA引入來(lái)自第二生物體的復(fù)制細(xì)胞組中；和選擇在復(fù)制細(xì)胞組中不能存活的第一組中的存活細(xì)胞或篩選顯示特異性篩選反應(yīng)但在復(fù)制細(xì)胞組中不能提供這種反應(yīng)的細(xì)胞，其中第一組與復(fù)制細(xì)胞組是在存在選擇劑或篩選劑的情況下生長(zhǎng)，其中存活或篩選細(xì)胞包含用于第二生物體的活體內(nèi)翻譯系統(tǒng)中的正交tRNA-tRNA合成酶對(duì)。在一個(gè)實(shí)施例中，比較和選擇或篩選包括活體內(nèi)互補(bǔ)檢定?？筛淖冞x擇劑或篩選劑的濃度。
本發(fā)明的生物體包含多種生物體和多種組合。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明方法的第一種生物體和第二種生物體可相同或不同。在一個(gè)實(shí)施例中，生物體視情況為原核生物體，其包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、產(chǎn)甲烷桿菌、嗜鹽菌、大腸桿菌、超嗜熱古菌、強(qiáng)烈熾熱球菌、極端嗜熱古菌、嗜熱泉生古細(xì)菌、嗜熱棲熱菌等?；蛘撸矬w視情況包含真核生物體，其包括(但不限于)植物(包括(但不限于)復(fù)雜植物，諸如單子葉植物或雙子葉植物)、藻類(lèi)、原生生物、真菌(包括(但不限于)酵母等)、動(dòng)物(包括(但不限于)哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、節(jié)肢動(dòng)物等)等。在另一實(shí)施例中，第二種生物體為原核生物體，其包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、產(chǎn)甲烷桿菌、嗜鹽菌、大腸桿菌、超嗜熱古菌、嗜鹽菌、強(qiáng)烈熾熱球菌、極端嗜熱古菌、嗜熱泉生古細(xì)菌、嗜熱棲熱菌等?；蛘?，第二種生物體可為真核生物體，其包括(但不限于)酵母、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。在各個(gè)實(shí)施例中，第一種生物體和第二種生物體可不同。
VI.hPP或hA或hFc中非天然存在氨基酸的位置 本發(fā)明涵蓋將一個(gè)或一個(gè)以上非天然存在氨基酸并入hPP或hFc多肽中。可將一個(gè)或一個(gè)以上非天然存在氨基酸并入特定位置處而不破壞多肽活性。這可以通過(guò)進(jìn)行“保守”取代實(shí)現(xiàn)，包括(但不限于)用疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸；用龐大氨基酸取代龐大氨基酸；用親水性氨基酸取代親水性氨基酸；和/或?qū)⒎翘烊淮嬖诎被岵迦牖钚圆恍枰奈恢弥小?br> 可使用多種生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)方法來(lái)選擇hPP或hFc多肽內(nèi)供非天然編碼氨基酸取代的所需位點(diǎn)。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員顯而易見(jiàn)，多肽鏈的任何位置都適用于選擇以并入非天然編碼氨基酸，并且選擇可建立在合理設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上或者通過(guò)隨機(jī)選擇來(lái)進(jìn)行以實(shí)現(xiàn)任何目的或無(wú)特定需要的目的。所需位點(diǎn)的選擇可用于產(chǎn)生具有任何所需性質(zhì)或活性的hPP或hFc分子，包括(但不限于)激動(dòng)劑、超激動(dòng)劑、反向激動(dòng)劑、拮抗劑、受體結(jié)合調(diào)節(jié)劑、受體活性調(diào)節(jié)劑、與結(jié)合搭配物結(jié)合的調(diào)節(jié)劑、結(jié)合搭配物活性調(diào)節(jié)劑、結(jié)合搭配物構(gòu)象調(diào)節(jié)劑；二聚物或多聚物形成；與天然分子相比活性或性質(zhì)無(wú)改變；或者操縱多肽的任何物理或化學(xué)性質(zhì)(諸如，溶解性、聚集或穩(wěn)定性)。舉例來(lái)說(shuō)，可使用所屬領(lǐng)域已知的點(diǎn)突變分析、丙氨酸掃描或同系物掃描方法來(lái)鑒別hPP或hFc多肽中為多肽生物活性所需的位置。美國(guó)專(zhuān)利第5,580,723號(hào)、第5,834,250號(hào)、第6,013,478號(hào)、第6,428,954號(hào)和第6,451,561號(hào)(其以引用的方式并入本文中)描述通過(guò)用標(biāo)靶物質(zhì)鑒別影響多肽活性的活性域來(lái)系統(tǒng)分析諸如hGH等多肽的結(jié)構(gòu)和功能的方法。除通過(guò)丙氨酸或同系物掃描誘變鑒別為對(duì)生物活性至關(guān)重要的殘基外的殘基可視對(duì)于多肽所尋求的所需活性而為供非天然編碼氨基酸取代的良好候選物。或者，經(jīng)鑒別為對(duì)生物活性至關(guān)重要的位點(diǎn)也可視對(duì)于多肽所尋求的所需活性而為供非天然編碼氨基酸取代的良好候選物。另一替代方法將為在多肽鏈上的各個(gè)位置中利用非天然編碼氨基酸簡(jiǎn)單地進(jìn)行連續(xù)取代并且觀察對(duì)多肽活性的影響。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員顯而易見(jiàn)，在任何多肽中選擇供非天然氨基酸取代的位置的任何方式、技術(shù)或方法都適用于本發(fā)明中。
也可檢查hPP多肽的含有缺失的天然存在突變體的結(jié)構(gòu)和活性以確定有可能耐受非天然編碼氨基酸進(jìn)行的取代的蛋白質(zhì)區(qū)域。在已去除可能無(wú)法耐受非天然編碼氨基酸進(jìn)行的取代的殘基后，可自hPP或hFc和其結(jié)合蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)檢查所推薦的取代在各剩余位置處的影響。如果無(wú)法得到三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，那么可建立模型來(lái)研究多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員可容易地鑒別可經(jīng)非天然編碼氨基酸取代的氨基酸位置。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的hPP或hFc多肽包含一個(gè)或一個(gè)以上位于不破壞多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的區(qū)中的非天然存在氨基酸。
在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入對(duì)應(yīng)于hA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的下列各區(qū)中的一個(gè)或一個(gè)以上區(qū)中的任何位置處，所述位置如下位置1(即，在N-末端)之前、17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、574、581以及位置582(即，在蛋白質(zhì)的羧基末端)之后(SEQ ID NO1)。
可用多種非天然編碼氨基酸取代hPP或hFc多肽中的給定位置，或可將所述氨基酸并入所述位置中。一般來(lái)說(shuō)，根據(jù)hPP或hFc多肽與其受體或結(jié)合搭配物的三維晶體結(jié)構(gòu)的檢查來(lái)選擇供并入的特定非天然編碼氨基酸，其中優(yōu)選保守取代(即，基于芳基的非天然編碼氨基酸，諸如取代Phe、Tyr或Trp的對(duì)乙酰基苯丙氨酸或O-炔丙基酪氨酸)以及需要引入hPP或hFc多肽蛋白的特定結(jié)合化學(xué)(例如，如果需要利用具有炔部分的水溶性聚合物來(lái)實(shí)現(xiàn)休根斯[3+2]環(huán)加成，或需要利用具有芳基酯的水溶性聚合物來(lái)形成酰胺鍵，那么引入4-疊氮基苯丙氨酸，反之，并入膦部分)。
在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包括將非天然氨基酸并入蛋白質(zhì)中，其中所述非天然氨基酸包含第一反應(yīng)性基團(tuán)；和使所述蛋白質(zhì)與包含第二反應(yīng)性基團(tuán)的分子(包括(但不限于)標(biāo)記；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交聯(lián)劑；放射性核素、細(xì)胞毒性化合物；藥物；親和標(biāo)記；光親和標(biāo)記；反應(yīng)性化合物；樹(shù)脂；第二蛋白質(zhì)或多肽或多肽類(lèi)似物；抗體或抗體片段；金屬螯合劑；輔因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反義多核苷酸；糖類(lèi)；水溶性樹(shù)枝狀聚合物；環(huán)糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；納米粒子；自旋標(biāo)記；熒光團(tuán)；含金屬的部分；放射性部分；新穎官能團(tuán)；與其它分子共價(jià)或非共價(jià)相互作用的基團(tuán)；光籠化部分；光化輻射可激發(fā)的部分；可光致異構(gòu)化部分；生物素；生物素衍生物；生物素類(lèi)似物；合并有重原子的部分；可化學(xué)裂解的基團(tuán)；可光裂解的基團(tuán)；延長(zhǎng)的側(cè)鏈；碳連接的糖；氧化還原活性劑；氨基硫代酸；毒性部分；經(jīng)同位素標(biāo)記的部分；生物物理探針；磷光基團(tuán)；化學(xué)發(fā)光基團(tuán)；電子致密基團(tuán)；磁性基團(tuán)；插入基團(tuán)；發(fā)色團(tuán)；能量轉(zhuǎn)移劑；生物活性劑；可檢測(cè)標(biāo)記；小分子；量子點(diǎn)；納米傳遞素；放射性核苷酸；放射性傳遞素；中子捕獲劑；或上述物質(zhì)的任何組合或任何其它所需的化合物或物質(zhì))接觸。第一反應(yīng)性基團(tuán)與第二反應(yīng)性基團(tuán)反應(yīng)以使分子通過(guò)[3+2]環(huán)加成與非天然氨基酸連接。在一個(gè)實(shí)施例中，第一反應(yīng)性基團(tuán)為炔基或疊氮基部分，且第二反應(yīng)性基團(tuán)為疊氮基或炔基部分。舉例來(lái)說(shuō)，第一反應(yīng)性基團(tuán)為炔基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸對(duì)炔丙氧基苯丙氨酸中)且第二反應(yīng)性基團(tuán)為疊氮基部分。在另一實(shí)例中，第一反應(yīng)性基團(tuán)為疊氮基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸對(duì)疊氮基-L-苯丙氨酸中)，且第二反應(yīng)性基團(tuán)為炔基部分。
在一些情況下，將非天然編碼氨基酸取代與hPP多肽內(nèi)的其它添加、取代或缺失組合以影響hPP或hFc多肽的其它生物性質(zhì)。在一些情況下，所述其它添加、取代或缺失可增加hPP或hFc多肽的穩(wěn)定性(包括(但不限于)對(duì)蛋白水解降解的抗性)或增加hPP或hFc多肽對(duì)其受體或結(jié)合搭配物的親和力。在一些情況下，所述其它添加、取代或缺失可增加hPP或hFc多肽的溶解性(包括(但不限于)當(dāng)在大腸桿菌或其它宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí))。在一些實(shí)施例中，添加、取代或缺失在表達(dá)于大腸桿菌或其它重組宿主細(xì)胞中之后可增加多肽溶解性。在一些實(shí)施例中，除并入非天然氨基酸的位點(diǎn)外還選擇另一位點(diǎn)以供天然編碼或非天然氨基酸取代，此使得在大腸桿菌或其它重組宿主細(xì)胞中表達(dá)后增加多肽溶解性。在一些實(shí)施例中，hPP或hFc多肽包含另一添加、取代或缺失，其調(diào)節(jié)對(duì)hPP或hFc多肽受體、結(jié)合蛋白或締合配位體的親和力；調(diào)節(jié)(包括(但不限于)增加或降低)受體二聚化；使受體二聚物穩(wěn)定；調(diào)節(jié)循環(huán)半衰期；調(diào)節(jié)釋放或生物可用性；有利于純化；或者改進(jìn)或改變特定給藥途徑。類(lèi)似地，hPP或hFc多肽可包含化學(xué)或酶裂解序列、蛋白酶裂解序列、反應(yīng)性基團(tuán)、抗體結(jié)合域(包括(但不限于)FLAG或聚組氨酸)或其它基于親和性的序列(包括(但不限于)FLAG、聚組氨酸、GST等)或連接分子(包括(但不限于)生物素)，其改進(jìn)檢測(cè)(包括(但不限于)GFP)、純化、通過(guò)組織或細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)、前藥釋放或活化、hPP或hFc尺寸減小或多肽的其它性質(zhì)。
在一些情況下，用一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10個(gè)以上氨基酸。在一些情況下，hPP或hFc多肽進(jìn)一步包括一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸對(duì)天然存在氨基酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10個(gè)以上取代。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施例中，hA的下列區(qū)中的一個(gè)或一個(gè)以上殘基是經(jīng)一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸取代位置1(即，在N-末端)之前、17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、574、581以及位置582(即，在蛋白質(zhì)的羧基末端)之后(SEQ ID NO1)。
在一些情況下，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼殘基與一個(gè)或一個(gè)以上較低分子量的線性或分支PEG(質(zhì)量為約5-20kDa或更低)連接，從而增加結(jié)合親和力且使血清半衰期與連接到單一較高分子量PEG的物質(zhì)可相當(dāng)。
hA中用于并入兩個(gè)或兩個(gè)以上非天然編碼氨基酸的優(yōu)選位置包括下列殘基的組合位置1(即，在N-末端)之前、17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、574、581以及位置582(即，在蛋白質(zhì)的羧基末端)之后(SEQ ID NO1)。
VII. 非真核生物和真核生物中的表達(dá) 為獲得克隆hPP或hA或hFc多核苷酸的高水平表達(dá)，通常將編碼本發(fā)明的hPP或hA或hFc多肽的多核苷酸亞克隆到含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子以及(如果就編碼蛋白質(zhì)的核酸來(lái)說(shuō))供翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的表達(dá)載體中。合適的細(xì)菌啟動(dòng)子為所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知且描述于例如Sambrook等人和Ausubel等人中。
用于表達(dá)本發(fā)明的hPP或hA或hFc多肽的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)可在(包括(但不限于))大腸桿菌、芽孢桿菌(Bacillus sp.)、熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌和沙門(mén)氏菌(Salmonella)中獲得(Palva等人，Gene 22229-235(1983)；Mosbach等人，Nature 302543-545(1983))。用于這些表達(dá)系統(tǒng)的試劑盒可購(gòu)得。哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母和昆蟲(chóng)細(xì)胞的真核表達(dá)系統(tǒng)為所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知且也可購(gòu)得。在將正交tRNA和氨?；鵷RNA合成酶(如上所述)用于表達(dá)本發(fā)明的hPP或hA多肽的情況中，用于表達(dá)的宿主細(xì)胞是根據(jù)其使用正交組件的能力加以選擇。例示性宿主細(xì)胞包括革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(Gram-positive bacteria)(包括(但不限于)短小芽孢桿菌(B.brevis)、枯草桿菌(B.subtilis)或鏈霉菌(Streptomyces))和革蘭氏陰性細(xì)菌(Gram-negative bacteria)(大腸桿菌、熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌)，以及酵母和其它真核細(xì)胞。如本文中所述，可使用包含O-tRNA/O-RS對(duì)的細(xì)胞。
本發(fā)明的真核宿主細(xì)胞或非真核宿主細(xì)胞提供合成包含大量有用的非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的能力。一方面，組合物視情況包括(包括(但不限于))至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克或1克以上的包含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)，或可通過(guò)活體內(nèi)蛋白質(zhì)制備方法所實(shí)現(xiàn)的量的所述蛋白質(zhì)(關(guān)于重組蛋白質(zhì)制備和純化的細(xì)節(jié)是提供于本文中)。另一方面，所述蛋白質(zhì)視情況以在(包括(但不限于))細(xì)胞溶解產(chǎn)物、緩沖劑、醫(yī)藥緩沖劑或其它液體懸浮液(包括(但不限于)體積約為包括(但不限于)約1nl到約100L或100L以上)中(包括(但不限于))每升至少10微克蛋白質(zhì)、每升至少50微克蛋白質(zhì)、每升至少75微克蛋白質(zhì)、每升至少100微克蛋白質(zhì)、每升至少200微克蛋白質(zhì)、每升至少250微克蛋白質(zhì)、每升至少500微克蛋白質(zhì)、每升至少1毫克蛋白質(zhì)或每升至少10毫克或10毫克以上蛋白質(zhì)的濃度存在于組合物中。在真核細(xì)胞中產(chǎn)生大量(包括(但不限于)大于通常用其它方法(包括(但不限于)活體外翻譯)可能獲得的量)蛋白質(zhì)(包括至少一個(gè)非天然氨基酸)是本發(fā)明的特征。
本發(fā)明的真核宿主細(xì)胞或非真核宿主細(xì)胞提供生物合成包含大量有用的非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的能力。舉例來(lái)說(shuō)，可在細(xì)胞提取物、細(xì)胞溶解產(chǎn)物、培養(yǎng)基、緩沖劑等中產(chǎn)生蛋白質(zhì)濃度為(包括(但不限于))至少10微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克/升或至少500微克/升、至少1毫克/升、至少2毫克/升、至少3毫克/升、至少4毫克/升、至少5毫克/升、至少6毫克/升、至少7毫克/升、至少8毫克/升、至少9毫克/升、至少10毫克/升、至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900毫克/升、1克/升、5克/升、10克/升或10克/升以上的包含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)。
多種適于表達(dá)hPP或hFc的載體都可購(gòu)得。有效用于真核生物宿主的表達(dá)載體包括(但不限于)包含來(lái)自SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒以及細(xì)胞肥大病毒的表達(dá)控制序列的載體。這些載體包括pCDNA3.1(+)\Hyg(Invitrogen，Carlsbad，Cali坑USA)和pCI-neo(Stratagene，La Jolla，Calif.，USA)?？墒褂眉?xì)菌質(zhì)粒，諸如來(lái)自大腸桿菌的質(zhì)粒(包括pBR322、pET3a和pET12a)、較寬宿主范圍質(zhì)粒(諸如RP4)；噬菌體DNA，例如噬菌體λ(例如NM989)和其它DNA噬菌體(諸如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體)的多種衍生物。2μ質(zhì)粒和其衍生物、POT1載體(美國(guó)專(zhuān)利第4,931,373號(hào)，其以引用的方式并入本文中)、(Okkels，Ann.New York Aced.Sci.782，202207，1996)中述描的pJS037載體以及pPICZA、B或C(Invitrogen)可與酵母宿主細(xì)胞一起使用。對(duì)于昆蟲(chóng)細(xì)胞，載體包括(但不限于)pVL941、pBG311(Cate等人，″Isolationof the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression ofthe Human Gene In Animal Cells″，Cell，45，第68598頁(yè)(1986))、pBluebac 4.5以及pMelbac(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
編碼hPP或hFc多肽的核苷酸序列還可包括或可不包括編碼信號(hào)肽的序列。當(dāng)多肽是由表達(dá)所述多肽的細(xì)胞分泌時(shí)，存在信號(hào)肽。這種信號(hào)肽可為任何序列。信號(hào)肽可為原核生物信號(hào)肽或真核生物信號(hào)肽。Coloma，M(1992)J.Imm.Methods15289104描述用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的信號(hào)肽(鼠類(lèi)Igκ輕鏈信號(hào)肽)。其它信號(hào)肽包括(但不限于)來(lái)自釀酒酵母的α-因子信號(hào)肽(美國(guó)專(zhuān)利第4,870,008號(hào)，其以引用的方式并入本文中)、小鼠唾液淀粉酶的信號(hào)肽(O.Hagenbuchle等人，Nature 289，1981，第643-646頁(yè))、經(jīng)修飾的羧基肽酶信號(hào)肽(L.A.Vails等人，Cell 48，1987，第887-897頁(yè))、酵母BAR1信號(hào)肽(WO 87/02670，其以引用的方式并入本文中)以及酵母天冬氨酸蛋白酶3(yeast aspartic protease 3，YAP3)信號(hào)肽(參見(jiàn)M.Egel-Mitani等人，Yeast 6，1990，第127-137頁(yè))。
所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知合適哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的實(shí)例。這些宿主細(xì)胞可為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細(xì)胞(例如CHO-K1；ATCC-CCL-61)、綠猴細(xì)胞(Green Monkey cell，COS)(例如COS 1(ATCC CRL-1650)、COS(ATCCCRL-1651))、小鼠細(xì)胞(例如NS/O)、幼倉(cāng)鼠腎(Baby Hamster Kidney，BHK)細(xì)胞系(例如(ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)和人類(lèi)細(xì)胞(例如HEK 293(ATCCCRL-1573))以及組織培養(yǎng)中的植物細(xì)胞。這些細(xì)胞系和其它細(xì)胞系可自諸如美國(guó)典型微生物菌種保藏中心(American Type Culture Collection，Rockville，Md)等公共寄存場(chǎng)所獲得。為提供hPP多肽的改進(jìn)的糖基化，可修飾哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞以表達(dá)唾液酸轉(zhuǎn)移酶，舉例來(lái)說(shuō)，如(例如)美國(guó)專(zhuān)利第5,047,335號(hào)中所述的1，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，所述專(zhuān)利以引用的方式并入本文中。
將外源DNA引入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的方法包括(但不限于)磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、病毒載體以及LifeTechnologies Ltd，Paisley，UK中所述的使用Lipofectamine 2000的轉(zhuǎn)染方法和RocheDiagnostics Corporation，Indianapolis，USA中所述的使用FuGENE 6的轉(zhuǎn)染方法。這些方法在所屬領(lǐng)域中為眾所周知的且由Ausbel等人(編)，1996，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，New York，USA描述。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)可根據(jù)(例如)如(Animal Cell Biotechnology，Methods and Protocols，Nigel Jenkins編，1999，Human Press Inc.Totowa，N.J.，USA；以及Harrison Mass.和Rae IF，GeneralTechniques of Cell Culture，Cambridge University Press 1997)中所公開(kāi)的確定方法來(lái)進(jìn)行。
I.表達(dá)系統(tǒng)、培養(yǎng)和分離 hPP或hA或hFc多肽可在任何數(shù)目的合適表達(dá)系統(tǒng)(例如包括酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌)中表達(dá)。例示性表達(dá)系統(tǒng)的描述是提供于下文中。
酵母如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“酵母”包括能夠表達(dá)編碼hPP或hA或hFc多肽的基因的各種酵母中的任一種。這些酵母包括(但不限于)產(chǎn)子囊酵母(ascosporogenous yeast)(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、擔(dān)孢子酵母(basidiosporogenous yeast)和屬于半知菌(Fungi imperfecti)(芽孢綱(Blastomycetes))類(lèi)的酵母。產(chǎn)子囊酵母分為兩個(gè)科蝕精霉科(Spermophthoraceae)和酵母菌科(Saccharomycetaceae)。
后者包含四個(gè)亞科， 即裂殖酵母亞科(Schizosaccharomycoideae)(例如，裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces))、拿遜酵母亞科(Nadsonioideae)、油脂酵母亞科(Lipomycoideae)和釀酒酵母亞科(Saccharomycoideae)(例如，畢赤酵母屬(Pichia)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)和酵母屬(Saccharomyces))。擔(dān)孢子酵母包括白冬孢酵母屬(Leucosporidium)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)、線黑粉酵母屬(Filobasidium)和香灰擬鎖擔(dān)菌屬(Filobasidiella)。屬于半知菌(芽孢綱)類(lèi)的酵母分為兩個(gè)科擲孢酵母科(Sporobolomycelaceae)(例如，擲孢酵母屬(Sporoholomyces)和布勒擲孢酵母屬(Bullera))和隱球酵母科(Cryptococcaceae)(例如，假絲酵母屬(Candida))。
尤其受關(guān)注的供本發(fā)明使用的物種是畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、酵母菌屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、球擬酵母屬(Torulopsis)和假絲酵母屬內(nèi)的物種，所述物種包括(但不限于)巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)、谷勒氏酵母(P.guillerimondii)、釀酒酵母、卡爾斯伯酵母(S.carlsbergensis)、糖化酵母(S.diastaticus)、道格拉斯酵母(S.douglasii)、克魯維酵母(S,kluyveri)、諾本酵母(S.norbensis)、卵形酵母(S.oviformis)、乳酸克魯維酵母(K.lactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)、白色念珠菌(C.albicans)、麥芽糖假絲酵母(C.maltosa)和漢森酵母(H.polymorpha)。
適用于表達(dá)hPP或hA或hFc多肽的酵母的選擇是在所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。在選擇用于表達(dá)的酵母宿主時(shí)，合適宿主可包括顯示具有例如良好分泌能力、低蛋白水解活性、良好分泌能力、良好可溶性蛋白質(zhì)產(chǎn)生和總體穩(wěn)固性的酵母宿主。酵母通?？勺远喾N來(lái)源獲得，包括(但不限于)加利福尼亞大學(xué)生物物理和醫(yī)學(xué)物理系酵母基因保藏中心(Berkeley，CA)以及美國(guó)典型菌種保藏中心(“ATCC”)(Manassas，VA)。
術(shù)語(yǔ)“酵母宿主”或“酵母宿主細(xì)胞”包括可用作或已用作重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA的接受體的酵母。所述術(shù)語(yǔ)包括已接收重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA的原始酵母宿主細(xì)胞的后代。應(yīng)了解，由于偶發(fā)突變或故意突變，單一母體細(xì)胞的后代在形態(tài)上或在與原始母體互補(bǔ)的基因組DNA或總DNA方面可能未必完全相同。由這一定義所指代的后代中包括與將要以相關(guān)性質(zhì)(諸如存在編碼hPP或hA多肽的核苷酸序列)表征的母體足夠類(lèi)似的母體細(xì)胞的后代。
已研發(fā)包括染色體外復(fù)制子或整合載體的表達(dá)和轉(zhuǎn)化載體，以將其轉(zhuǎn)化到多種酵母宿主中。舉例來(lái)說(shuō)，已研發(fā)用于以下各酵母的表達(dá)載體釀酒酵母(Sikorski等人，Genetics(1989)12219；Ito等人，J.Bacteriol.(1983)153163；Hinnen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)751929)；白色念珠菌(Kurtz等人，Mol.Cell.Biol.(1986)6142)；麥芽糖假絲酵母(Kunze等人，J.Basic Microbiol.(1985)25141)；漢森酵母(Gleeson等人，J.Gen.Microbiol.(1986)1323459；Roggenkamp等人，Mol.Geneticsand Genomics(1986)202302)；脆壁克魯維酵母(Das等人，J.Bacteriol.(1984)1581165)；乳酸克魯維酵母(De Louvencourt等人，J.Bacteriol.(1983)154737；Vanden Berg等人，Bio/Technology(NY)(1990)8135)；谷勒氏酵母(Kunze等人，J.BasicMicrobiol.(1985)25141)；巴斯德畢赤酵母(美國(guó)專(zhuān)利第5,324,639號(hào)；第4,929,555號(hào)；和第4,837,148號(hào)；Cregg等人，Mol.Cell.Biol.(1985)53376)；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach等人，Nature(1982)300706)；以及耶氏酵母(Y.lipolytica)；構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)(Ballance等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.(1983)112284-89；Tilburn等人，Gene(1983)26205-221；和Yelton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)811470-74)；黑曲霉(A.niger)(Kelly和Hynes，EMBO J.(1985)4475-479)；里氏木霉(T.reesia)(EP 0 244 234)；和絲狀真菌，諸如脈孢菌(Neurospora)、青霉菌(Penicillium)、彎頸霉(Tolypocladium)(WO 91/00357)，其中各文獻(xiàn)以引用的方式并入本文中。
用于酵母載體的控制序列為所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知且包括(但不限于)來(lái)自以下基因的啟動(dòng)子區(qū)域例如，醇脫氫酶(ADH)(EP 0284044)；烯醇酶；葡萄糖激酶；葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶；甘油醛-3-磷酸-脫氫酶(GAP或GAPDH)；己糖激酶；磷酸果糖激酶；3-磷酸甘油酸變位酶；和丙酮酸激酶(PyK)(EP 0 329 203)。編碼酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也可提供適用的啟動(dòng)子序列(Miyanohara等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)801)。用于酵母宿主的其它合適啟動(dòng)子序列可包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人，J.Biol.Chem.(1980)25512073)和其它糖解酶(諸如丙酮酸脫羧酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(Holland等人，Biochemistry(1978)174900；Hess等人，J.Adv.Enzyme Reg.(1969)7149))的啟動(dòng)子。具有由生長(zhǎng)條件控制的轉(zhuǎn)錄的其它優(yōu)勢(shì)的可誘導(dǎo)酵母啟動(dòng)子可包括醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶以及導(dǎo)致麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動(dòng)子區(qū)域。適用于酵母表達(dá)的載體和啟動(dòng)子進(jìn)一步描述于EP 0 073 657中。
酵母增強(qiáng)子也可與酵母啟動(dòng)子一起使用。另外，合成啟動(dòng)子也可充當(dāng)酵母啟動(dòng)子。舉例來(lái)說(shuō)，酵母啟動(dòng)子的上游活化序列(UAS)可與另一酵母啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)連接，從而產(chǎn)生合成雜合啟動(dòng)子。所述雜合啟動(dòng)子的實(shí)例包括與GAP轉(zhuǎn)錄活化區(qū)連接的ADH調(diào)控序列。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第4,880,734號(hào)和第4,876,197號(hào)，其以引用的方式并入本文中。雜合啟動(dòng)子的其它實(shí)例包括由ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的調(diào)控序列與糖解酶基因(諸如GAP或PyK)的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)組成的啟動(dòng)子。參見(jiàn)EP 0 164 556。此外，酵母啟動(dòng)子可包括具有與酵母RNA聚合酶結(jié)合且起始轉(zhuǎn)錄的能力的非酵母來(lái)源的天然存在的啟動(dòng)子。
可構(gòu)成酵母表達(dá)載體的部分的其它控制元件包括例如來(lái)自GAPDH或烯醇酶基因的終止子(Holland等人，J.BIOL.CHEM.(1981)2561385)。另外，來(lái)自2μ質(zhì)粒來(lái)源的復(fù)制起點(diǎn)適用于酵母。適用于酵母的選擇基因?yàn)榻湍纲|(zhì)粒中所存在的trp1基因。參見(jiàn)Tschumper等人，Gene(1980)10157；Kingsman等人，Gene(1979)7141。trp1基因?qū)θ狈υ谏彼嶂猩L(zhǎng)的能力的酵母的突變菌株提供選擇標(biāo)記。類(lèi)似地，由帶有Leu2基因的已知質(zhì)粒補(bǔ)充Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20，622或38，626)。
將外源DNA引入酵母宿主中的方法為所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知且通常包括(但不限于)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)球狀體或轉(zhuǎn)化經(jīng)堿性陽(yáng)離子處理的完整酵母宿主細(xì)胞。舉例來(lái)說(shuō)，可根據(jù)Hsiao等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)763829以及Van Solingen等人，J.BACT.(1977)130946中所述的方法來(lái)進(jìn)行酵母的轉(zhuǎn)化。然而，也可如Sambrook等人，Molecular CloningA Lab.Manual(2001)中通常所述來(lái)使用將DNA引入細(xì)胞中的其它方法，諸如通過(guò)核注射、電穿孔或原生質(zhì)體融合。然后，可使用所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)培養(yǎng)酵母宿主細(xì)胞。
所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知在酵母宿主細(xì)胞中表達(dá)異源蛋白的其它方法。通常參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)文獻(xiàn)第20020055169號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,361,969號(hào)；第6,312,923號(hào)；第6,183,985號(hào)；第6,083,723號(hào)；第6,017,731號(hào)；第5,674,706號(hào)；第5,629,203號(hào)；第5,602,034號(hào)；和第5,089,398號(hào)；美國(guó)復(fù)審專(zhuān)利第RE37,343號(hào)和第RE35,749號(hào)；PCT公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)文件WO 99/07862；WO 98/37208；和WO 98/26080；歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)文件EP 0 946 736；EP 0 732 403；EP 0 480 480；WO 90/10277；EP 0 340 986；EP 0 329 203；EP 0 324 274；和EP 0 164 556。也參見(jiàn)Gellissen等人，ANTONIE VanLEEUWENHOEK(1992)62(1-2)79-93；Romanos等人，YEAST(1992)8(6)423-488；Goeddel，METHODS IN ENZYMOLOOY(1990)1853-7，其各自以引用的方式并入本文中。
在使用所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)料分批發(fā)酵方法進(jìn)行的擴(kuò)增階段期間，可使酵母宿主菌株在發(fā)酵罐中生長(zhǎng)。所述發(fā)酵方法可適用于解釋特定酵母宿主的碳利用途徑或表達(dá)控制模式的差異。舉例來(lái)說(shuō)，酵母菌酵母宿主的發(fā)酵可能需要單一葡萄糖進(jìn)料、復(fù)合氮源(例如，酪蛋白水解產(chǎn)物)和多種維生素補(bǔ)充。相反，甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母巴斯德畢赤酵母可能需要甘油、甲醇和痕量礦物進(jìn)料，但僅需要簡(jiǎn)單銨(氮)鹽以進(jìn)行最佳生長(zhǎng)和表達(dá)。例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第5,324,639號(hào)；Elliott等人，J.PROTEIN CHEM.(1990)995；和Fieschko等人，BIOTECH.BIOENG.(1987)291113，其各自以引用的方式并入本文中。
然而，這些發(fā)酵方法可具有與所用的酵母宿主菌株無(wú)關(guān)的某些常見(jiàn)特征。舉例來(lái)說(shuō)，在擴(kuò)增階段期間，可將限制生長(zhǎng)的養(yǎng)分(通常為碳)添加到發(fā)酵罐中以允許最大生長(zhǎng)。另外，發(fā)酵方法通常使用經(jīng)設(shè)計(jì)成含有適量碳、氮、基礎(chǔ)鹽、磷和其它微量養(yǎng)分(維生素、痕量礦物和鹽等)的發(fā)酵培養(yǎng)基。適用于畢赤酵母的發(fā)酵培養(yǎng)基的實(shí)例是描述于美國(guó)專(zhuān)利第5,324,639號(hào)和第5,231,178號(hào)中，其各自以引用的方式并入本文中。
感染桿狀病毒的昆蟲(chóng)細(xì)胞術(shù)語(yǔ)“昆蟲(chóng)宿主”或“昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞”是指可用作或已用作重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA的接受體的昆蟲(chóng)。所述術(shù)語(yǔ)包括已經(jīng)轉(zhuǎn)染的原始昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞的后代。應(yīng)了解，由于偶發(fā)突變或故意突變，單一母體細(xì)胞的后代在形態(tài)上或在與原始母體互補(bǔ)的基因組DNA或總DNA方面可能未必完全相同。由這一定義所指代的后代中包括與將要以相關(guān)性質(zhì)(諸如存在編碼hPP或hA或hFc多肽的核苷酸序列)表征的母體充分類(lèi)似的母體細(xì)胞的后代。
所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知適用于表達(dá)hPP或hA或hFc多肽的昆蟲(chóng)細(xì)胞的選擇。多種昆蟲(chóng)物種在所屬領(lǐng)域中得到充分描述且可購(gòu)得，其包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、桑蠶(Bombyx mori)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)。在選擇用于表達(dá)的昆蟲(chóng)宿主時(shí)，合適宿主可包括顯示具有良好分泌能力、低蛋白水解活性和總體穩(wěn)固性的那些宿主。昆蟲(chóng)通?？勺远喾N來(lái)源獲得，包括(但不限于)加利福尼亞大學(xué)生物物理和醫(yī)學(xué)物理系昆蟲(chóng)基因保藏中心(Berkeley，CA)；以及美國(guó)典型菌種保藏中心(“ATCC”)(Manassas，VA)。
通常，感染桿狀病毒的昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)的組件包括轉(zhuǎn)移載體(通常為細(xì)菌質(zhì)粒)，其含有桿狀病毒基因組的片段和用于插入欲表達(dá)的異源基因的便利限制位點(diǎn)；野生型桿狀病毒，其具有與轉(zhuǎn)移載體中的桿狀病毒特異性片段同源的序列(這允許將異源基因同源重組到桿狀病毒基因組中)；以及合適的昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞和生長(zhǎng)培養(yǎng)基。所屬領(lǐng)域中已知用于構(gòu)筑載體、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、挑選斑塊、使細(xì)胞在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)等的材料、方法和技術(shù)且可使用描述這些技術(shù)的手冊(cè)。
在將異源基因插入轉(zhuǎn)移載體中后，將載體和野生型病毒基因組轉(zhuǎn)染到昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞中，其中載體與病毒基因組重組。表達(dá)經(jīng)包裝的重組病毒，并且鑒別和純化重組體斑塊。用于桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的材料和方法可以試劑盒形式購(gòu)自例如Invitrogen Corp.(Carlsbad，CA)。這些技術(shù)通常為所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知且全面描述于Summers and Smith，Texas Agricultural Experiment Station Bulletin，第1555期，(1987)中，其以引用的方式并入本文中。還參見(jiàn)Richardson，39 Methods inMolecular BiologyBaculovirus Expression Protocols(1995)；Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology 16.9-16.11(1994)；King和Possee，The BaculovirusSystemA Laboratory Guide(1992)；以及O′Reilly等人，Baculovirus Expression VectorsA Laboratory Manual(1992)。
實(shí)際上，使用桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的各種異源蛋白質(zhì)的制備為所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知。例如參見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利第6,368,825號(hào)；第6,342,216號(hào)；第6,338,846號(hào)；第6,261,805號(hào)；第6,245,528號(hào)；第6,225,060號(hào)；第6,183,987號(hào)；第6,168,932號(hào)；第6,126,944號(hào)；第6,096,304號(hào)；第6,013,433號(hào)；第5,965,393號(hào)；第5,939,285號(hào)；第5,891,676號(hào)；第5,871,986號(hào)；第5,861,279號(hào)；第5,858,368號(hào)；第5,843,733號(hào)；第5,762,939號(hào)；第5,753,220號(hào)；第5,605,827號(hào)；第5,583,023號(hào)；第5,571,709號(hào)；第5,516,657號(hào)；第5,290,686號(hào)；WO 02/06305；WO 01/90390；WO 01/27301；WO 01/05956；WO 00/55345；WO 00/20032；WO 99/51721；WO99/45130；WO 99/31257；WO 99/10515；WO 99/09193；WO 97/26332；WO 96/29400；WO 96/25496；WO 96/06161；WO 95/20672；WO 93/03173；WO 92/16619；WO92/02628；WO 92/01801；WO 90/14428；WO 90/10078；WO 90/02566；WO 90/02186；WO 90/01556；WO 89/01038；WO 89/01037；WO 88/07082，其各自以引用的方式并入本文中。
適用于桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的載體在所屬領(lǐng)域中為已知的且例如包括從桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒(AcNPV)獲得的昆蟲(chóng)表達(dá)和轉(zhuǎn)移載體，其為不依賴于輔助細(xì)胞的病毒表達(dá)載體。從此系統(tǒng)得到的病毒表達(dá)載體通常使用強(qiáng)病毒多角體蛋白基因啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)異源基因的表達(dá)。通常參見(jiàn)O′Reilly等人，BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORSA LABORATORYMANUAL(1992)。
在將外來(lái)基因插入桿狀病毒基因組中之前，通常將包含啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列(必要時(shí))、所關(guān)注的編碼序列和轉(zhuǎn)錄終止序列的上述組件組裝到中間錯(cuò)位構(gòu)筑體(intermediate transplacement construct)(轉(zhuǎn)移載體)中。中間錯(cuò)位構(gòu)筑體通常保持在能夠穩(wěn)定保持在宿主(諸如細(xì)菌)中的復(fù)制子(諸如染色體外元件(例如，質(zhì)粒))中。復(fù)制子將具有復(fù)制系統(tǒng)，因此使其保持在適用于克隆和擴(kuò)增的宿主中。更具體來(lái)說(shuō)，質(zhì)?？珊卸嘟求w蛋白聚腺苷酸化信號(hào)(Miller，Ann.Rev.Microbiol.(1988)42177)和用于在大腸桿菌中選擇和繁殖的原核氨比西林(ampicillin)抗性(amp)基因和復(fù)制起點(diǎn)。
一種將外來(lái)基因引入AcNPV中的常用轉(zhuǎn)移載體為pAc373。也已經(jīng)對(duì)所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的許多其它載體進(jìn)行設(shè)計(jì)，所述載體包括例如pVL985，其將多角體蛋白起始密碼子由ATG變?yōu)锳TT，且其將BamHI克隆位點(diǎn)引入ATT下游32個(gè)堿基對(duì)處。參見(jiàn)Luckow和Summers，VIROLOGY 17031(1989)。其它可購(gòu)得的載體包括例如PBlueBac4.5/V5-His、pBlueBacHis2、pMelBac、pBlueBac4.5(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)。
在插入異源基因之后，將轉(zhuǎn)移載體和野生型桿狀病毒基因組共轉(zhuǎn)染到昆蟲(chóng)細(xì)胞宿主中。將異源DNA引入桿狀病毒的所需位點(diǎn)中的方法在所屬領(lǐng)域中為已知的。參見(jiàn)SUMMERS和SMITH，TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATIONBULLETIN，第1555期，(1987)；Smith等人，Mol.Cell.BIOL.(1983)32156；Luckow和Summers，VIROLOGY(1989)17031中。舉例來(lái)說(shuō)，可通過(guò)同源雙交叉重組插入諸如多角體蛋白基因等基因中；也可插入所需桿狀病毒基因中經(jīng)工程化的限制酶位點(diǎn)中。參見(jiàn)Miller等人，BIOESSAYS(1989)11(4)91。
可通過(guò)電穿孔來(lái)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染。參見(jiàn)TROTTER和WOOD，39 METHODS INMOLECULAR BIOLOGY(1995)；Mann和King，J.Gen.Virol.(1989)703501?；蛘?，可使用脂質(zhì)體以重組表達(dá)載體和桿狀病毒轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞。例如參見(jiàn)Liebman等人，BIOTECHNIQUES(1999)26(1)36；Graves等人，BIOCHEMISTRY(1998)376050；Nomura等人，J.BIOL.CHEM.(1998)273(22)13570；Schmidt等人，PROTEINEXPRESSION AND PURIFICATION(1998)12323；Siffert等人，Nature Genetics(1998)1845；Tilkins等人，Cell BiologyA Laboratory Handbook 145-154(1998)；Cai等人，Protein Expression and Purification(1997)10263；Dolphin等人，Nature Genetics(1997)17491；Kost等人，GENE(1997)190139；Jakobsson等人，J.BIOL.CHEM.(1996)27122203；Rowles等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271(37)22376；Reverey等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271(39)23607-10；Stanley等人，J.BIOL.CHEM.(1995)2704121；Sisk等人，J.Virol.(1994)68(2)766；以及Peng等人，BIOTECHNIQUES(1993)14(2)274?？少?gòu)得的脂質(zhì)體包括例如Cellfectin

和Lipofectin

(Invitrogen，Corp.，Carlsbad，CA)。另外，也可使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染。參見(jiàn)Trotter和Wood，39 METHODS IN Molecular Biology(1995)；Kitts，NAR(1990)18(19)5667；以及Mann和King，J.Gen.Virol.(1989)703501。
桿狀病毒表達(dá)載體通常含有桿狀病毒啟動(dòng)子。桿狀病毒啟動(dòng)子是能夠與桿狀病毒RNA聚合酶結(jié)合且起始編碼序列(例如，結(jié)構(gòu)基因)下游(3′)轉(zhuǎn)錄成mRNA的任何DNA序列。啟動(dòng)子將具有通常與編碼序列的5′端最接近放置的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。此轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包括RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。桿狀病毒啟動(dòng)子也可具有稱(chēng)作增強(qiáng)子的第二區(qū)域，當(dāng)存在所述區(qū)域時(shí)，其通常在結(jié)構(gòu)基因的末梢。此外，表達(dá)可經(jīng)調(diào)控或具有組成性。
在感染周期的末期大量轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)基因提供特別適用的啟動(dòng)子序列。實(shí)例包括源自編碼病毒多面體蛋白的基因(Friesen等人，The Regulation of Baculovirus GeneExpression，THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES(1986)；EP 0 127839和0155476)和編碼p10蛋白的基因(Vlak等人，J.GEN.VIROL.(1988)69765)的序列。
將新近形成的桿狀病毒表達(dá)載體包裝到感染性重組桿狀病毒中，且隨后可通過(guò)所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的技術(shù)來(lái)純化所生長(zhǎng)的斑塊。參見(jiàn)Miller等人，BIOESSAYS(1989)11(4)91；SUMMERS和SMITH，TEXAS AGRICULTURALEXPERIMENT STATION BULLETIN，第1555期，(1987)。
已開(kāi)發(fā)用于感染到多種昆蟲(chóng)細(xì)胞中的重組桿狀病毒表達(dá)載體。舉例來(lái)說(shuō)，已開(kāi)發(fā)用于埃及伊蚊(ATCC第CCL-125號(hào))、桑蠶(ATCC第CRL-8910號(hào))、黑腹果蠅(ATCC第1963號(hào))、草地貪夜蛾和粉紋夜蛾的重組桿狀病毒。參見(jiàn)Wright，NATURE(1986)321718；Carbonell等人，J.VIROL.(1985)56153；Smith等人，MOL.CELL.BIOL.(1983)32156。通常參見(jiàn)Fraser等人，In Vitro CELL.Dev.BIOL(1989)25225。更具體來(lái)說(shuō)，用于桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的細(xì)胞系通常包括(但不限于)Sf9(草地貪夜蛾)(ATCC第CRL-1711號(hào))、Sf21(草地貪夜蛾)(Invitrogen Corp.，目錄號(hào)11497-013(Carlsbad，CA)、Tri-368(粉紋夜蛾)和High-FiveTM BTI-TN-5B1-4(粉紋夜蛾)。
用于桿狀病毒/表達(dá)中的異源多肽的直接表達(dá)和融合表達(dá)的細(xì)胞和培養(yǎng)基可購(gòu)得，且細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)通常為所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人所知。
大腸桿菌、假單胞菌物種和其它原核生物所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知細(xì)菌表達(dá)技術(shù)。多種載體可用于細(xì)菌宿主中。載體可為單拷貝或者低或高的多拷貝載體。載體可用于克隆和/或表達(dá)。鑒于關(guān)于載體的豐富文獻(xiàn)、許多載體的商業(yè)可用性以及甚至描述載體和其限制酶圖譜和特征的手冊(cè)，無(wú)需在本文中廣泛討論。熟知載體通常涉及允許選擇的標(biāo)記，這些標(biāo)記可提供細(xì)胞毒性劑抗性、原營(yíng)養(yǎng)或免疫性。通常存在多個(gè)標(biāo)記，其提供不同特征。
細(xì)菌啟動(dòng)子為能夠結(jié)合細(xì)菌RNA聚合酶且起始編碼序列(例如結(jié)構(gòu)基因)下游(3″)轉(zhuǎn)錄成mRNA的任何DNA序列。啟動(dòng)子將具有通常與編碼序列的5′端最接近放置的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。此轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包括RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。細(xì)菌啟動(dòng)子也可具有稱(chēng)作操縱基因的第二區(qū)域，其可與開(kāi)始RNA合成的相鄰RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)重疊。操縱基因允許負(fù)調(diào)控(可誘導(dǎo))轉(zhuǎn)錄，這是因?yàn)榛蛞种频鞍卓山Y(jié)合操縱基因且由此抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄。在不存在負(fù)調(diào)控元件(諸如操縱基因)的情況下可發(fā)生組成性表達(dá)。另外，可通過(guò)基因活化蛋白結(jié)合序列實(shí)現(xiàn)正調(diào)控，當(dāng)存在所述結(jié)合序列時(shí)，所述序列通常最接近RNA聚合酶結(jié)合序列的(5′)?；蚧罨鞍椎膶?shí)例為代謝物活化蛋白(CAP)，其有助于起始大腸桿菌(E.coli)中l(wèi)ac操縱子的轉(zhuǎn)錄[Raibaud等人，Annu.Rev.Genet.(1984)18173]。因此，經(jīng)調(diào)控的表達(dá)可為正調(diào)控或負(fù)調(diào)控，由此增強(qiáng)或減弱轉(zhuǎn)錄。
編碼代謝途徑酶的序列提供特別適用的啟動(dòng)子序列。實(shí)例包括源自糖代謝酶(諸如半乳糖、乳糖(lac)[Chang等人，Nature(1977)1981056]和麥芽糖)的啟動(dòng)子序列。其它實(shí)例包括源自生物合成酶(諸如色氨酸(trp))的啟動(dòng)子序列[Goeddel等人，NUC.Acids Res.(1980)84057；Yelverton等人，Nucl.Acids Res.(1981)9731；美國(guó)專(zhuān)利第4,738,921號(hào)；歐洲公開(kāi)文獻(xiàn)第036776號(hào)和第121775號(hào)，其各自以引用的方式并入本文中]。β-半乳糖苷酶(bla)啟動(dòng)子系統(tǒng)[Weissmann(1981)″The cloningof interferon and other mistakes.″Interferon 3(I.Gresser編)]、噬菌體λPL[Shimatake等人，Nature(1981)292128]和T5[美國(guó)專(zhuān)利第4,689,406號(hào)](所述文獻(xiàn)各自以引用的方式并入本文中)啟動(dòng)子系統(tǒng)還提供適用的啟動(dòng)子序列。本發(fā)明的優(yōu)選方法利用強(qiáng)啟動(dòng)子(諸如T7啟動(dòng)子)來(lái)誘導(dǎo)高含量的hPP或hA多肽。這些載體的實(shí)例為所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知且包括來(lái)自Novagen的pET29系列和WO99/05297(其以引用的方式并入本文中)中所述的pPOP載體。這些表達(dá)系統(tǒng)在宿主中產(chǎn)生高含量的hPP或hA或hFc多肽，而不損害宿主細(xì)胞生存能力或生長(zhǎng)參數(shù)。pET19(Novagen)是所屬領(lǐng)域中已知的另一種載體。
另外，在自然界中不存在的合成啟動(dòng)子也充當(dāng)細(xì)菌啟動(dòng)子。舉例來(lái)說(shuō)，可將一個(gè)細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活化序列與另一細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子的操縱子序列連接，從而產(chǎn)生合成雜合啟動(dòng)子[美國(guó)專(zhuān)利第4,551,433號(hào)，其以引用的方式并入本文中]。舉例來(lái)說(shuō)，tac啟動(dòng)子是包含trp啟動(dòng)子與lac操縱子序列的雜合trp-lac啟動(dòng)子，其是由lac阻遏物調(diào)控[Amann等人，Gene(1983)25167；de Boer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1983)8021]。此外，細(xì)菌啟動(dòng)子可包括非細(xì)菌來(lái)源的天然存在啟動(dòng)子，其具有與細(xì)菌RNA聚合酶結(jié)合且起始轉(zhuǎn)錄的能力。也可將非細(xì)菌來(lái)源的天然存在啟動(dòng)子與可相容的RNA聚合酶偶合以產(chǎn)生一些基因在原核生物中的高水平表達(dá)。噬菌體T7 RNA聚合酶/啟動(dòng)子系統(tǒng)為偶合啟動(dòng)子系統(tǒng)的實(shí)例[Studier等人，J.Mol.BIOL.(1986)189113；Tabor等人，Proc Natl.Acad.Sci.(1985)821074]。另外，雜合啟動(dòng)子也可包含噬菌體啟動(dòng)子和大腸桿菌操縱基因區(qū)域(歐洲公開(kāi)文獻(xiàn)第267 851號(hào))。
除功能性啟動(dòng)子序列之外，有效核糖體結(jié)合位點(diǎn)也適用于在原核生物中表達(dá)外來(lái)基因。在大腸桿菌中，核糖體結(jié)合位點(diǎn)是稱(chēng)作Shine-Dalgarno(SD)序列且包括起始密碼子(ATG)和位于起始密碼子上游3-11個(gè)核苷酸處的長(zhǎng)度為3-9個(gè)核苷酸的序列[Shine等人，Nature(1975)25434]。認(rèn)為SD序列通過(guò)SD序列與大腸桿菌16SrRNA的3′端之間的堿基配對(duì)來(lái)促進(jìn)mRNA與核糖體的結(jié)合[Steitz等人，″Geneticsignals and nucleotide sequences in messenger RNA″，Biological Regulation andDevelopmentGene Expression(Ed.R.F.Goldberger，1979)]。為表達(dá)具有弱核糖體結(jié)合位點(diǎn)的真核基因和原核基因[Sambrook等人，″Expression of cloned genes inEscherichia coli″，Molecular CloningA Laboratory Manual，1989]。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)菌宿主”或“細(xì)菌宿主細(xì)胞”是指可用作或已用作重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA的接受體的細(xì)菌。所述術(shù)語(yǔ)包括已經(jīng)轉(zhuǎn)染的原始細(xì)菌宿主細(xì)胞的后代。應(yīng)了解，由于偶發(fā)突變或故意突變，單一母體細(xì)胞的后代在形態(tài)上或在與原始母體互補(bǔ)的基因組DNA或總DNA方面可能未必完全相同。由這一定義所指代的后代中包括與將要以相關(guān)性質(zhì)(諸如存在編碼hPP或hA多肽的核苷酸序列)表征的母體充分類(lèi)似的母體細(xì)胞的后代。
所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知適用于表達(dá)hPP或hA多肽的宿主細(xì)菌的選擇。在選擇供表達(dá)的細(xì)菌宿主時(shí)，合適宿主可包括顯示具有良好包涵體形成能力、低蛋白水解活性和總體穩(wěn)固性的那些宿主。細(xì)菌宿主通?？勺远喾N來(lái)源獲得，包括(但不限于)加利福尼亞大學(xué)生物物理和醫(yī)學(xué)物理系細(xì)菌基因保藏中心(Berkeley，CA)以及美國(guó)典型菌種保藏中心(“ATCC”)(Manassas，VA)。工業(yè)/醫(yī)藥發(fā)酵通常使用源自K菌株的細(xì)菌(例如W3110)或源自B菌株的細(xì)菌(例如BL21)。這些菌株因其生長(zhǎng)參數(shù)為人熟知且穩(wěn)定而特別適用。另外，這些菌株為非病原性的，出于安全性和環(huán)境原因，其在商業(yè)上相當(dāng)重要。合適的大腸桿菌宿主的其它實(shí)例包括(但不限于)菌株BL21、DH10B或其衍生物。在本發(fā)明方法的另一實(shí)施例中，大腸桿菌宿主為蛋白酶缺乏菌株，其包括(但不限于)OMP-和LON-。宿主細(xì)胞菌株可為假單胞菌屬，包括(但不限于)熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌。已知指定為菌株MB101的熒光假單胞菌生物變種1適用于重組產(chǎn)生且可用于治療蛋白產(chǎn)生方法中。假單胞菌屬表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例包括可以宿主菌株形式自Dow Chemical Company(Midland，MI，在萬(wàn)維網(wǎng)的dow.com上獲得)獲得的系統(tǒng)。
在形成重組宿主細(xì)胞株(即，已將表達(dá)構(gòu)筑體引入宿主細(xì)胞中且分離具有合適表達(dá)構(gòu)筑體的宿主細(xì)胞)后，在適于產(chǎn)生hPP或hA或hFc多肽的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞株。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)，培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞株的方法將取決于所利用的表達(dá)構(gòu)筑體的性質(zhì)和宿主細(xì)胞的身份。通常使用所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知的方法來(lái)培養(yǎng)重組宿主菌株。重組宿主細(xì)胞通常是在含有可吸收的碳、氮和無(wú)機(jī)鹽來(lái)源且視情況含有維生素、氨基酸、生長(zhǎng)因子和所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知的其它蛋白質(zhì)培養(yǎng)補(bǔ)充物的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞的液體培養(yǎng)基可視情況含有抗生素或抗真菌劑以防止不合需要的微生物和/或化合物(包括(但不限于)用于選擇含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞的抗生素)的生長(zhǎng)。
重組宿主細(xì)胞可以分批或連續(xù)形式培養(yǎng)，其中細(xì)胞采集(在hPP或hA或hFc多肽在細(xì)胞內(nèi)積聚的情況下)或培養(yǎng)物上清液的采集為分批或連續(xù)形式。對(duì)于原核宿主細(xì)胞中的制備來(lái)說(shuō)，優(yōu)選分批培養(yǎng)和細(xì)胞采集。
本發(fā)明的hPP或hA或hFc多肽通常是在重組系統(tǒng)中表達(dá)之后純化?？赏ㄟ^(guò)所屬領(lǐng)域已知的多種方法從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中純化hPP或hA或hFc多肽。細(xì)菌宿主細(xì)胞中所產(chǎn)生的許多hPP或hA或hFc多肽可具有弱溶解性或不可溶(呈包涵體形式)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，利用本文中所公開(kāi)的方法以及所屬領(lǐng)域已知的方法，可容易地在hPP或hA或hFc多肽中進(jìn)行為增加重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的溶解性而選擇的氨基酸取代。在不溶性蛋白質(zhì)的情況下，可通過(guò)離心從宿主細(xì)胞溶解產(chǎn)物收集蛋白質(zhì)，且接著可進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞的均質(zhì)化。在具有弱溶解性的蛋白質(zhì)的情況下，可加入包括(但不限于)聚乙烯亞胺(PEI)的化合物以誘導(dǎo)部分可溶性蛋白質(zhì)的沉淀。然后，可通過(guò)離心便利地收集沉淀的蛋白質(zhì)。可使用所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知的多種方法使重組宿主細(xì)胞破裂或均質(zhì)化以自細(xì)胞內(nèi)部釋放包涵體。可使用熟知的技術(shù)來(lái)進(jìn)行宿主細(xì)胞的破裂或均質(zhì)化，這些技術(shù)包括(但不限于)酶促細(xì)胞破裂、超聲波降解法、杜恩斯均質(zhì)化(dounce homogenization)或高壓釋放破裂。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施例中，使用高壓釋放技術(shù)來(lái)使大腸桿菌宿主細(xì)胞破裂以釋放hPP或hA或hFc多肽的包涵體。在處理hPP或hA或hFc多肽的包涵體時(shí)，最好使重復(fù)過(guò)程的均質(zhì)化時(shí)間減到最小以使包涵體產(chǎn)率增到最高且不會(huì)由于諸如溶解、機(jī)械剪切或蛋白質(zhì)水解等因素造成損失。
然后，可使用所屬領(lǐng)域已知的多種合適增溶劑中的任一種來(lái)溶解不溶性或沉淀的hPP或hA或hFc多肽?？捎秒寤螓}酸胍來(lái)溶解hPP或hA或hFc多肽。應(yīng)使溶解的hPP或hA或hFc多肽的體積減到最小，從而可使用可方便操作的批量大小來(lái)制備大批量。在重組宿主可以體積為數(shù)千升的批量生長(zhǎng)的大規(guī)模商業(yè)裝置中，這個(gè)因素可為重要的。另外，當(dāng)在大規(guī)模商業(yè)裝置中制造hPP或hA或hFc多肽時(shí)，特別是對(duì)于人類(lèi)醫(yī)藥用途來(lái)說(shuō)，如果可能的話，應(yīng)避免可損害機(jī)器和容器的苛性化學(xué)品(harshchemicals)或其蛋白質(zhì)產(chǎn)物。本發(fā)明的方法中已顯示，可使用較溫和的變性劑脲代替較苛刻的變性劑鹽酸胍來(lái)溶解hPP或hA或hFc多肽包涵體。脲的使用在有效溶解hPP或hA或hFc多肽包涵體的同時(shí)顯著降低對(duì)在hPP或hA或hFc多肽的制造和純化過(guò)程中所利用的不銹鋼設(shè)備造成損害的風(fēng)險(xiǎn)。
在可溶性hPP或hA或hFc蛋白的情況下，可將hPP或hA或hFc分泌到周質(zhì)空間或培養(yǎng)基中。另外，可溶性hPP或hA或hFc可存在于宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。在進(jìn)行純化步驟之前，可能希望濃縮可溶性hPP或hA或hFc?？墒褂盟鶎兕I(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)濃縮例如來(lái)自細(xì)胞溶解產(chǎn)物或培養(yǎng)基的可溶性hPP或hA或hFc。另外，所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)也可用于使宿主細(xì)胞破裂并從宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或周質(zhì)空間釋放可溶性hPP或hA或hFc。
當(dāng)制備呈融合蛋白形式的hPP或hA或hFc多肽時(shí)，可去除融合序列?？赏ㄟ^(guò)酶促裂解或化學(xué)裂解來(lái)實(shí)現(xiàn)融合序列的去除?？墒褂盟鶎兕I(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)融合序列的酶促去除。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)，用于去除融合序列的酶的選擇將由融合體的身份決定，且反應(yīng)條件將根據(jù)酶的選擇來(lái)指定?？墒褂盟鶎兕I(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知的試劑(包括(但不限于)溴化氰、TEV蛋白酶和其它試劑)來(lái)實(shí)現(xiàn)化學(xué)裂解?？赏ㄟ^(guò)所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知的方法從裂解的融合序列中純化裂解的hPP或hA或hFc多肽。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)，這些方法將由融合序列和hPP或hA或hFc多肽的身份和性質(zhì)決定。用于純化的方法可包括(但不限于)尺寸排阻色譜、疏水性相互作用色譜、離子交換色譜或透析或其任何組合。
也可純化hPP或hA或hFc多肽以從蛋白質(zhì)溶液中去除DNA。雖然可通過(guò)所屬領(lǐng)域已知的任何合適方法(諸如沉淀或離子交換色譜)去除DNA，但也可通過(guò)用核酸沉淀劑(諸如(但不限于)硫酸魚(yú)精蛋白)沉淀來(lái)去除DNA?？墒褂冒?但不限于)離心或過(guò)濾的熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法使hPP或hA或hFc多肽與沉淀的DNA分離。在將使用hPP或hA或hFc多肽來(lái)治療人類(lèi)的情況中，宿主核酸分子的去除是重要因素，且本發(fā)明的方法將宿主細(xì)胞DNA降低到醫(yī)藥學(xué)上可接受的水平。
用于小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵的方法也可用于蛋白質(zhì)表達(dá)中，所述方法包括(但不限于)發(fā)酵罐、振蕩燒瓶、流化床生物反應(yīng)器、中空纖維生物反應(yīng)器、滾瓶培養(yǎng)系統(tǒng)和攪拌槽生物反應(yīng)器系統(tǒng)。這些方法中的每一種都可以分批、分批饋料或連續(xù)模式方法進(jìn)行。
通常，可使用所屬領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)回收本發(fā)明的人類(lèi)hPP或hA或hFc多肽。舉例來(lái)說(shuō)，可將培養(yǎng)基或細(xì)胞溶解產(chǎn)物離心或過(guò)濾以去除細(xì)胞碎片?？蓪⑸锨逡簼饪s或稀釋到所需體積，或者透濾到合適緩沖劑中以調(diào)節(jié)制劑以供進(jìn)一步純化。本發(fā)明的hPP或hA或hFc多肽的進(jìn)一步純化包括從完整形式分離脫酰胺化和剪短形式的hPP或hA或hFc多肽變異體。
以下例示性程序中的任一種都可用于純化本發(fā)明的hPP或hA多肽親和色譜；陰離子或陽(yáng)離子交換色譜(使用(包括(但不限于)DEAE SEPHAROSE)；二氧化硅色譜；高效液相色譜(HPLC)；反相HPLC；凝膠過(guò)濾(使用(包括(但不限于))SEPHADEX G-75)；疏水性相互作用色譜；尺寸排阻色譜；金屬螯合物色譜；超濾/透濾；乙醇沉淀；硫酸銨沉淀；色譜聚焦；置換色譜；電泳程序(包括(但不限于)制備型等電聚焦)；差示溶解度(包括(但不限于)硫酸銨沉淀)；SDS-PAGE；或萃取。
根據(jù)所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知且使用的標(biāo)準(zhǔn)程序，可將本發(fā)明的蛋白質(zhì)(包括(但不限于)包含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)、包含非天然氨基酸的肽、包含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的抗體、包含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的結(jié)合搭配物等)部分或?qū)嵸|(zhì)上純化成均質(zhì)。因此，可通過(guò)所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知的許多方法中的任一種來(lái)回收和純化本發(fā)明的多肽，這些方法包括(但不限于)硫酸銨或乙醇沉淀、酸或堿萃取、柱色譜、親和柱色譜、陰離子或陽(yáng)離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水性相互作用色譜、羥基磷灰石色譜、凝集素色譜、凝膠電泳等。在制備正確折疊的成熟蛋白質(zhì)時(shí)，必要時(shí)可使用蛋白質(zhì)再折疊步驟。當(dāng)需要高純度時(shí)，在最后純化步驟中可使用高效液相色譜(HPLC)、親和色譜或其它合適方法。在一個(gè)實(shí)施例中，使用針對(duì)非天然氨基酸(或包含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)或多肽)制成的抗體作為純化試劑，從而包括(但不限于)用于包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然氨基酸的蛋白質(zhì)或多肽的以親和力為基礎(chǔ)的純化。必要時(shí)，在部分純化或純化成均質(zhì)后，視情況將所述多肽用于多種應(yīng)用，包括(但不限于)用作檢定組分、治療劑、預(yù)防劑、診斷劑、研究試劑和/或用作抗體產(chǎn)生的免疫原。
除了本文中所提到的其它參考文獻(xiàn)外，所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知多種純化/蛋白質(zhì)折疊方法，包括(但不限于)以下文獻(xiàn)中所述的那些R.Scopes，ProteinPurification，Springer-Verlag，N.Y.(1982)；Deutscher，Methods in Enzymology第182卷Guide to Protein Purification.Academic Press，Inc.N.Y.(1990)；Sandana，(1997)Bioseparation of Proteins.Academic Press，Inc.；Bollag等人，(1996)Protein Methods，第2版，Wiley-Liss，NY；Walker，(1996)The Protein Protocols Handbook Humana Press，NJ，Harris和Angal，(1990)Protein Purification ApplicationsA Practical Approach IRL Pressat Oxford，Oxford，England；Harris和Angal，Protein Purification MethodsA PracticalApproach IRL Press at Oxford，Oxford，England；Scopes，(1993)Protein PurificationPrinciples and Practice，第3版，Springer Verlag，NY；Janson和Ryden，(1998)ProteinPurificationPrinciples.High Resolution Methods and Applications，第2版，Wiley-VCH，NY；和Walker(1998)，Protein Protocols on CD-ROM Humana Press，NJ；以及其中所引用的參考文獻(xiàn)。
在真核宿主細(xì)胞或非真核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生具有非天然氨基酸的所關(guān)注的蛋白質(zhì)或多肽的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于，所述蛋白質(zhì)或多肽通常將以其天然構(gòu)象經(jīng)折疊。然而，在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在合成、表達(dá)和/或純化之后，蛋白質(zhì)或多肽可能具有與相關(guān)多肽所需的構(gòu)象不同的構(gòu)象。在本發(fā)明的一方面，視情況使所表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽變性，且然后使其復(fù)性。這是利用所屬領(lǐng)域中已知的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述方法包括(但不限于)將伴侶蛋白(chaperonin)添加到所關(guān)注的蛋白質(zhì)或多肽中、將蛋白質(zhì)溶解于諸如鹽酸胍等離液劑中、利用蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶等。
一般來(lái)說(shuō)，有時(shí)希望使所表達(dá)的多肽變性和還原，且然后使多肽再折疊成優(yōu)選構(gòu)象。舉例來(lái)說(shuō)，可將胍、脲、DTT、DTE和/或伴侶蛋白添加到所關(guān)注的翻譯產(chǎn)物中。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知使蛋白質(zhì)還原、變性和復(fù)性的方法(參見(jiàn)上述參考文獻(xiàn)，以及Debinski等人，(1993)J.Biol.Chem.，26814065-14070；Kreitman和Pastan(1993)Bioconjug.Chem.，4581-585；以及Buchner等人，(1992)Anal.Biochem.，205263-270)。舉例來(lái)說(shuō)，Debinski等人描述胍-DTE中包涵體蛋白質(zhì)的變性和還原?？稍诤?包括(但不限于))氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化還原緩沖劑中使蛋白質(zhì)再折疊?？墒乖僬郫B試劑流動(dòng)或以其它方式移動(dòng)以與一種或一種以上多肽或其它表達(dá)產(chǎn)物接觸，或者可使一種或一種以上多肽或其它表達(dá)產(chǎn)物流動(dòng)或以其它方式移動(dòng)以與再折疊試劑接觸。
在原核產(chǎn)生hPP或hA或hFc多肽的情況下，由此產(chǎn)生的hPP或hA或hFc多肽可能錯(cuò)誤折疊且因而缺乏生物活性或具有降低的生物活性?？赏ㄟ^(guò)“再折疊”來(lái)恢復(fù)蛋白質(zhì)的生物活性。一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)使用例如一種或一種以上離液劑(例如脲和/或胍)和能夠還原二硫鍵的還原劑(例如二硫蘇糖醇、DTT或2-巰基乙醇(2-ME))溶解(其中hPP或hA或hFc多肽也不可溶)、展開(kāi)和還原多肽鏈而使錯(cuò)誤折疊的hPP或hA多肽再折疊。在中等濃度的離液劑下，接著加入氧化劑(例如，氧、胱氨酸或胱胺)，這允許再形成二硫鍵。可使用所屬領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)方法將hPP或hA或hFc多肽再折疊，諸如美國(guó)專(zhuān)利第4,511,502號(hào)、第4,511,503號(hào)和第4,512,922號(hào)中所述的那些方法，所述專(zhuān)利各自以引用的方式并入本文中。hPP或hA或hFc多肽也可與其它蛋白質(zhì)共折疊以形成異二聚物或異多聚物。
在再折疊之后，可進(jìn)一步純化hPP或hA或hFc多肽。可使用所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的多種技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)hPP或hA或hFc的純化，所述技術(shù)包括疏水性相互作用色譜、尺寸排阻色譜、離子交換色譜、反相高效液相色譜、親和色譜等或其任何組合。其它純化還可包括干燥或沉淀所純化的蛋白質(zhì)的步驟。
在純化后，可將hPP或hA或hFc交換到不同緩沖劑中和/或通過(guò)所屬領(lǐng)域中已知的多種方法中的任一種使其濃縮，所述方法包括(但不限于)透濾和透析。作為單一經(jīng)純化蛋白質(zhì)所提供的hPP或hA或hFc可經(jīng)歷聚集和沉淀。
經(jīng)純化的hPP或hA或hFc可為至少90％純(如通過(guò)反相高效液相色譜RP-HPLC或十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、SDS-PAGE所測(cè)量)或至少95％純，或至少98％純，或至少99％純或更純。無(wú)論hPP或hA或hFc的純度的確切數(shù)值如何，hPP或hA或hFc對(duì)于用作醫(yī)藥產(chǎn)品或用于進(jìn)一步處理(諸如與諸如PEG等水溶性聚合物結(jié)合)來(lái)說(shuō)都足夠純。
可在不存在其它活性成分或蛋白質(zhì)(除賦形劑、載劑和穩(wěn)定劑、血清白蛋白等外)的情況下將某些hPP或hA或hFc分子用作治療劑，或可使其與另一種蛋白質(zhì)或聚合物復(fù)合。
一般純化方法可以任何合適次序?qū)Π琱PP或hA或hFc多肽的細(xì)胞溶解產(chǎn)物、提取物、培養(yǎng)基、包涵體、宿主細(xì)胞的周質(zhì)空間、宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或其它材料或者對(duì)由任何分離步驟產(chǎn)生的任何hPP或hA或hFc多肽混合物進(jìn)行多種分離步驟中的任一種，所述分離步驟包括(但不限于)親和色譜、離子交換色譜、疏水性相互作用色譜、凝膠過(guò)濾色譜、高效液相色譜(“HPLC”)、反相HPLC(“RP-HPLC”)、膨脹床吸附或其任何組合和/或重復(fù)。
用于進(jìn)行本文中所述的技術(shù)的設(shè)備和其它必要材料都可購(gòu)得。泵、餾分收集器、監(jiān)測(cè)器、記錄器和整個(gè)系統(tǒng)可自例如Applied Biosystems(Foster City，CA)、Bio-RadLaboratories，Inc.(Hercules，CA)和Amersham Biosciences，Inc.(Piscataway，NJ)獲得。包括(但不限于)交換基質(zhì)材料、培養(yǎng)基和緩沖劑的色譜材料也可自這些公司獲得。
可使用專(zhuān)用設(shè)備(諸如泵)更迅速地實(shí)現(xiàn)平衡和本文中所述的柱色譜過(guò)程中的其它步驟(諸如洗滌和洗提)。可購(gòu)得的泵包括(但不限于)HILOAD

泵P-50、蠕動(dòng)泵P-1、泵P-901和泵P-903(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。
餾分收集器的實(shí)例包括RediFrac餾分收集器、FRAC-100和FRAC-200餾分收集器以及

餾分收集器(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。也可使用混合器來(lái)形成pH值和線性濃度梯度?？少?gòu)得的混合器包括梯度混合器GM-1和管道混合器(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。
可使用任何可購(gòu)得的監(jiān)測(cè)器來(lái)監(jiān)測(cè)色譜過(guò)程。這些監(jiān)測(cè)器可用于收集如UV、pH值和傳導(dǎo)率的信息。檢測(cè)器的實(shí)例包括監(jiān)測(cè)器UV-1、

S II、監(jiān)測(cè)器UV-MII、監(jiān)測(cè)器UV-900、監(jiān)測(cè)器UPC-900、監(jiān)測(cè)器pH/C-900和傳導(dǎo)率監(jiān)測(cè)器(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)。實(shí)際上，整個(gè)系統(tǒng)都可購(gòu)得，包括來(lái)自AmershamBiosciences(Piscataway，NJ)的各種

系統(tǒng)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，舉例來(lái)說(shuō)，可通過(guò)首先在脲中使所得經(jīng)純化的hPP或hA或hFc多肽變性，接著在合適pH值下在含有還原劑(諸如DTT)的TRIS緩沖劑中稀釋來(lái)還原h(huán)PP或hA或hFc多肽且使其變性。在另一實(shí)施例中，使hPP或hA或hFc多肽以介于約2M到約9M之間的濃度范圍在脲中變性，接著在約5.0到約8.0的范圍內(nèi)的pH值下在TRIS緩沖劑中稀釋。然后，可培育此實(shí)施例的再折疊混合物。在一個(gè)實(shí)施例中，在室溫下將再折疊混合物培育4小時(shí)到24小時(shí)。然后，可進(jìn)一步分離或純化經(jīng)還原且變性的hPP或hA或hFc多肽混合物。
如本文中所述，在進(jìn)行任何后續(xù)分離步驟之前，可調(diào)整第一hPP或hA或hFc多肽混合物的pH值。另外，可使用所屬領(lǐng)域中已知的技術(shù)來(lái)濃縮第一hPP或hA或hFc多肽混合物或其任何后續(xù)混合物。此外，可使用所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知的技術(shù)將包含第一hPP或hA或hFc多肽混合物或其任何后續(xù)混合物的洗提緩沖劑交換成適用于下一分離步驟的緩沖劑。
離子交換色譜在一個(gè)實(shí)施例中且作為可選的其它步驟，可對(duì)第一hPP或hA或hFc多肽混合物進(jìn)行離子交換色譜。通常參見(jiàn)Ion EXCHANGE CHROMATOGRAPHYPRINCIPLES AND METHODS(目錄號(hào)18-1114-21，Amersham Biosciences(Piscataway，NJ))?？少?gòu)得的離子交換柱包括


和

柱(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)。這些柱利用強(qiáng)陰離子交換劑，諸如Q

FastFlow、Q

High Performance和Q

XL；強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑，諸如SP

High Performance、SP

Fast Flow和SP

XL；弱陰離子交換劑，諸如DEAE

Fast Flow；和弱陽(yáng)離子交換劑，諸如CM

Fast Flow(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)?？稍诩兓^(guò)程的任何階段對(duì)hPP或hA或hFc多肽進(jìn)行陰離子或陽(yáng)離子交換柱色譜以分離實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化的hPP或hA或hFc多肽?？墒褂萌魏魏线m的陽(yáng)離子交換基質(zhì)來(lái)進(jìn)行陽(yáng)離子交換色譜步驟。適用的陽(yáng)離子交換基質(zhì)包括(但不限于)纖維狀、多孔、無(wú)孔、微粒、珠粒或交聯(lián)陽(yáng)離子交換基質(zhì)材料。這些陽(yáng)離子交換基質(zhì)材料包括(但不限于)纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅、聚醚或任何上述材料的復(fù)合物。
陽(yáng)離子交換基質(zhì)可為任何合適的陽(yáng)離子交換劑，包括強(qiáng)和弱陽(yáng)離子交換劑。強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑在寬pH值范圍內(nèi)可能仍為電離的，且因此可能能夠在寬pH值范圍內(nèi)結(jié)合hPP或hA或hFc。然而，弱陽(yáng)離子交換劑可隨pH值而喪失電離能力。舉例來(lái)說(shuō)，弱陽(yáng)離子交換劑在pH值降低到約pH4或pH5以下時(shí)可能失去電荷。合適的強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑包括(但不限于)帶電官能團(tuán)，諸如磺丙基(sulfopropyl，SP)、磺酸甲酯基(methyl sulfonate，S)或磺乙基(sulfoethyl，SE)。陽(yáng)離子交換基質(zhì)可為優(yōu)選具有約2.5到約6.0的hPP或hA或hFc結(jié)合pH值范圍的強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑?；蛘?，所述強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑可具有約pH2.5到約pH5.5的hPP或hA或hFc結(jié)合pH值范圍。陽(yáng)離子交換基質(zhì)可為具有約3.0的hPP或hA或hFc結(jié)合pH值的強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑?；蛘撸?yáng)離子交換基質(zhì)可為優(yōu)選具有約6.0到約8.0的hPP或hA或hFc結(jié)合pH值范圍的強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑。陽(yáng)離子交換基質(zhì)可為優(yōu)選具有約8.0到約12.5的hPP或hA或hFc結(jié)合pH值范圍的強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑。或者，所述強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑可具有約pH8.0到約pH12.0的hPP或hA結(jié)合pH值范圍。
在負(fù)荷hPP或hA或hFc之前，可例如使用多個(gè)柱體積的稀弱酸(例如4個(gè)柱體積的20mM乙酸，pH3)來(lái)平衡陽(yáng)離子交換基質(zhì)。平衡后可添加hPP或hA或hFc，且在洗提實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化的hPP或hA或hFc之前，也可使用諸如弱乙酸或磷酸溶液等弱酸溶液將柱洗滌一到數(shù)次。舉例來(lái)說(shuō)，可使用約2-4個(gè)柱體積的20mM乙酸(pH3)來(lái)洗滌所述柱。也可使用其它洗滌，所述洗滌例如使用2-4個(gè)柱體積的0.05M乙酸鈉(pH5.5)或與0.1M氯化鈉混合的0.05M乙酸鈉(pH5.5)?；蛘?，使用所屬領(lǐng)域中已知的方法，可使用多個(gè)柱體積的稀弱堿來(lái)平衡陽(yáng)離子交換基質(zhì)。
或者，可通過(guò)使陽(yáng)離子交換劑基質(zhì)與具有足夠低的pH值或離子強(qiáng)度以從基質(zhì)中置換hPP或hA的緩沖劑接觸來(lái)洗提實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化的hPP或hA或hFc。洗提緩沖劑的pH值可在約pH2.5到約pH6.0的范圍內(nèi)。更具體來(lái)說(shuō)，洗提緩沖劑的pH值可在約pH2.5到約pH5.5、約pH2.5到約pH5.0的范圍內(nèi)。洗提緩沖劑可具有約3.0的pH值。另外，洗提緩沖劑的量可廣泛變化且通常將在約2個(gè)柱體積到約10個(gè)柱體積的范圍內(nèi)。
在使hPP或hA或hFc多肽吸附到陽(yáng)離子交換劑基質(zhì)上之后，可通過(guò)使所述基質(zhì)與具有足夠高的pH值或離子強(qiáng)度以從基質(zhì)中置換hPP或hA或hFc多肽的緩沖劑接觸來(lái)洗提實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化的hPP或hA或hFc多肽。適用于實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化的hPP或hA或hFc多肽的高pH值洗提的緩沖劑可包括(但不限于)濃度在至少約5mM到至少約100mM范圍內(nèi)的檸檬酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、HEPES以及MES緩沖劑。
反相色譜可根據(jù)所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知的合適方案來(lái)進(jìn)行RP-HPLC，從而純化蛋白質(zhì)。例如參見(jiàn)Pearson等人，ANAL BIOCHEM.(1982)124217-230(1982)；Rivier等人，J.Chrom.(1983)268112-119；Kunitani等人，J.CHROM.(1986)359391-402?？蓪?duì)hPP或hA多肽進(jìn)行RP-HPLC以分離實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化的hPP或hA或hFc多肽。關(guān)于這一點(diǎn)，可使用含有具有多種長(zhǎng)度(包括(但不限于)至少約C3到至少約C30、至少約C3到至少約C20或至少約C3到至少約C18)的烷基官能團(tuán)的二氧化硅衍生的樹(shù)脂。或者，可使用聚合樹(shù)脂。舉例來(lái)說(shuō)，可使用TosoHaas AmberchromeCG1000sd樹(shù)脂，其為苯乙烯聚合物樹(shù)脂。也可使用具有多種烷基鏈長(zhǎng)度的氰基或聚合樹(shù)脂。此外，可用諸如乙醇等溶劑洗滌RP-HPLC柱。Source RP柱是RP-HPLC柱的另一個(gè)實(shí)例。
可使用含有離子配對(duì)劑和有機(jī)改性劑(諸如甲醇、異丙醇、四氫呋喃、乙腈或乙醇)的合適洗提緩沖劑從RP-HPLC 柱洗提hPP或hA或hFc多肽。最常用的離子配對(duì)劑包括(但不限于)乙酸、甲酸、高氯酸、磷酸、三氟乙酸、七氟丁酸、三乙胺、四甲基銨、四丁基銨和乙酸三乙銨?？墒褂靡环N或一種以上梯度或等度條件來(lái)進(jìn)行洗提，其中優(yōu)選減少分離時(shí)間且降低峰寬度的梯度條件。另一種方法涉及使用兩種具有不同溶劑濃度范圍的梯度。適用于本文中的洗提緩沖劑的實(shí)例可包括(但不限于)乙酸銨和乙腈溶液。
疏水性相互作用色譜純化技術(shù)可對(duì)hPP或hA多肽進(jìn)行疏水性相互作用色譜(HIC)。
通常參見(jiàn)HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHYHANDBOOKPRINCIPLES AND Methods(目錄號(hào)18-1020-90，Amersham Biosciences(Piscataway，NJ))，其以引用的方式并入本文中。合適的HIC基質(zhì)可包括(但不限于)經(jīng)烷基或芳基取代的基質(zhì)，諸如經(jīng)丁基、己基、辛基或苯基取代的基質(zhì)，包括瓊脂糖、交聯(lián)瓊脂糖、瓊脂糖凝膠(sepharose)、纖維素、二氧化硅、葡聚糖、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸酯)基質(zhì)和混合模式樹(shù)脂(包括(但不限于)聚乙二胺樹(shù)脂或經(jīng)丁基或苯基取代的聚(甲基丙烯酸酯)基質(zhì))。疏水性相互作用柱色譜的可購(gòu)得的來(lái)源包括(但不限于)


和

柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，在裝載之前，可使用所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)緩沖劑(諸如乙酸/氯化鈉溶液或含有硫酸銨的HEPES)來(lái)平衡HIC柱?？蓪⒘蛩徜@用作裝載HIC柱的緩沖劑。在裝載hPP或hA或hFc多肽后，然后可使用標(biāo)準(zhǔn)緩沖劑和條件來(lái)洗滌所述柱以去除不合需要的材料，但將hPP或hA或hFc多肽保留在HIC柱上?？捎眉s3到約10個(gè)柱體積的標(biāo)準(zhǔn)緩沖劑(諸如含有EDTA和濃度低于平衡緩沖劑的硫酸銨的HEPES緩沖劑，或乙酸/氯化鈉緩沖劑)來(lái)洗提hPP或hA或hFc多肽。也可使用例如使用磷酸鉀梯度的不斷降低的線性鹽梯度來(lái)洗提hPP或hA或hFc分子。然后，可例如通過(guò)過(guò)濾(諸如透濾或超濾)來(lái)濃縮洗提液。可利用透濾來(lái)去除用于洗提hPP或hA或hFc多肽的鹽。
其它純化技術(shù)可對(duì)第一hPP或hA或hFc多肽混合物或其任何后續(xù)混合物進(jìn)行使用例如凝膠過(guò)濾(Gel FILTRATIONPRINCIPLES AND Methods(目錄號(hào)18-1022-18，Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)，其以引用的方式并入本文中)、羥基磷灰石色譜(合適基質(zhì)包括(但不限于)HA-Ultrogel、High Resolution(Calbiochem)、CHT陶瓷羥基磷灰石(BioRad)、Bio-Gel HTP-羥基磷灰石(BioRad))、HPLC、膨脹床吸附、超濾、透濾、凍干等的另一分離步驟，以去除任何過(guò)量鹽且用合適緩沖劑來(lái)代替所述緩沖劑以用于下一分離步驟或甚至最終藥物產(chǎn)品的調(diào)配。
hPP或hA或hFc分子中所存在的非天然編碼氨基酸也可用于提供與其它不含非天然編碼氨基酸的細(xì)胞蛋白質(zhì)的分離。因?yàn)榉翘烊痪幋a氨基酸可包含獨(dú)特的化學(xué)官能團(tuán)，所以所述獨(dú)特的官能團(tuán)與另一分子的偶合可提供實(shí)質(zhì)純化步驟。舉例來(lái)說(shuō)，可使非天然編碼氨基酸與另一有利于與其它蛋白質(zhì)分離的分子偶合。這些用于與非天然氨基酸偶合的分子包括(但不限于)PEG和其它聚合物、珠粒以及其它固體底物。
在本文中所述的各步驟中，可使用所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知的技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)hPP或hA或hFc多肽(包括實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化的hPP或hA或hFc多肽)的產(chǎn)率。也可使用這些技術(shù)在最后分離步驟后分析實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化的hPP或hA或hFc多肽的產(chǎn)率。舉例來(lái)說(shuō)，可使用具有多種烷基鏈長(zhǎng)度的若干反相高壓液相色譜柱(諸如氰基RP-HPLC、C18RP-HPLC)以及陽(yáng)離子交換HPLC和凝膠過(guò)濾HPLC中的任一種來(lái)監(jiān)測(cè)hPP或hA或hFc多肽的產(chǎn)率。
在本發(fā)明的特定實(shí)施例中，在各純化步驟后hPP或hA或hFc的產(chǎn)率可為用于各純化步驟的原材料中的hPP或hA或hFc的至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％、至少約99.9％或至少約99.99％。
可使用諸如SDS-PAGE等標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或通過(guò)使用Western印跡法和ELISA檢定測(cè)量hPP或hA或hFc多肽來(lái)測(cè)定純度。舉例來(lái)說(shuō)，可針對(duì)從陰性對(duì)照酵母發(fā)酵和陽(yáng)離子交換回收分離的蛋白質(zhì)來(lái)產(chǎn)生多克隆抗體。所述抗體也可用于探測(cè)污染性宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的存在。
RP-HPLC材料Vydac C4(Vydac)是由硅膠粒子組成，其表面帶有C4-烷基鏈。hPP或hA或hFc多肽與蛋白質(zhì)雜質(zhì)的分離是基于疏水性相互作用強(qiáng)度的差異。用稀三氟乙酸中的乙腈梯度來(lái)進(jìn)行洗提。使用不銹鋼柱(填充有2.8到3.2升Vydac C4硅膠)進(jìn)行制備型HPLC。通過(guò)加入三氟乙酸來(lái)酸化羥基磷灰石Ultrogel洗提液且將其裝載于Vydac C4柱上。為進(jìn)行洗滌和洗提，使用稀三氟乙酸中的乙腈梯度。收集各洗提份且立即用磷酸鹽緩沖劑中和。匯集在IPC限度內(nèi)的hPP或hA或hFc多肽洗提份。
DEAE瓊脂糖凝膠(Pharmacia)材料是由與瓊脂糖凝膠珠粒的表面共價(jià)結(jié)合的二乙基氨基乙基(DEAE)基團(tuán)組成。通過(guò)離子相互作用來(lái)介導(dǎo)hPP或hA或hFc多肽與DEAE基團(tuán)的結(jié)合。乙腈和三氟乙酸無(wú)滯留地通過(guò)柱。在洗掉這些物質(zhì)之后，通過(guò)用低pH值的乙酸鹽緩沖劑洗滌柱來(lái)去除痕量雜質(zhì)。然后，用中性磷酸鹽緩沖劑洗滌柱且用具有增加的離子強(qiáng)度的緩沖劑洗提hPP或hA或hFc多肽。用快流速DEAE瓊脂糖凝膠(DEAE Sepharose fast flow)填充所述柱。調(diào)整柱體積以確保hPP或hA多肽裝載量在每毫升凝膠3-10毫克hPP或hA或hFc多肽的范圍內(nèi)。用水和平衡緩沖劑(磷酸鈉/鉀)洗滌所述柱。裝載HPLC洗提液的匯集的洗提份且用平衡緩沖劑洗滌柱。然后，用洗滌緩沖劑(乙酸鈉緩沖劑)洗滌柱，接著用平衡緩沖劑洗滌。接著，利用洗提緩沖劑(氯化鈉、磷酸鈉/鉀)從柱洗提hPP或hA或hFc多肽且根據(jù)主要洗提曲線將其收集到單一洗提份中。將DEAE瓊脂糖凝膠柱的洗提液調(diào)整到指定傳導(dǎo)率。將所得藥物無(wú)菌過(guò)濾到鐵氟隆(Teflon)瓶中且在-70℃下儲(chǔ)存。
可使用的其它方法包括(但不限于)去除內(nèi)毒素的步驟。內(nèi)毒素為位于革蘭氏陰性宿主細(xì)胞(諸如，大腸桿菌)的外膜上的脂多糖(LPS)。用于降低內(nèi)毒素含量的方法為所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知且包括(但不限于)使用二氧化硅支撐物、玻璃粉或羥基磷灰石的純化技術(shù)；反相色譜、親和色譜、尺寸排阻色譜、陰離子交換色譜；疏水性相互作用色譜；這些方法的組合等?？赡苄枰薷幕蚱渌椒ㄒ詮乃P(guān)注的多肽中去除污染物(諸如共遷移蛋白質(zhì))。用于測(cè)量?jī)?nèi)毒素含量的方法已為所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知且包括(但不限于)鱟變形細(xì)胞溶解產(chǎn)物(LimulusAmebocyte Lysate，LAL)檢定。EndosafeTM-PTS檢定為利用預(yù)負(fù)荷有LAL試劑、發(fā)色底物和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素以及手持式分光光度計(jì)的柱體的比色單管系統(tǒng)。替代方法包括(但不限于)動(dòng)力學(xué)LAL方法，其為比濁法且使用96孔格式。
可使用多種方法和程序來(lái)分析包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的hPP或hA蛋白質(zhì)的產(chǎn)率和純度，所述方法包括(但不限于)Bradford檢定、SDS-PAGE、銀染色SDS-PAGE、考馬斯藍(lán)染色SDS-PAGE、質(zhì)譜(包括(但不限于)MALDI-TOF)和所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的其它表征蛋白質(zhì)的方法。
其它方法包括(但不限于)與蛋白質(zhì)染色方法聯(lián)合的SDS-PAGE、免疫印跡、基質(zhì)輔助激光解吸附/離子化質(zhì)譜(MALDI-MS)、液相色譜/質(zhì)譜、等電聚焦、分析型陰離子交換、色譜聚焦和圓二色譜。
VIII. 替代系統(tǒng)中的表達(dá) 已使用多種策略將非天然氨基酸引入非重組宿主細(xì)胞、誘變宿主細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)中。這些系統(tǒng)也適用于制備本發(fā)明的hPP或hA或hFc多肽。諸如Lys、Cys和Tyr等具有反應(yīng)性側(cè)鏈的氨基酸的衍生會(huì)使得賴氨酸轉(zhuǎn)化為N2-乙?；?賴氨酸?；瘜W(xué)合成也提供并入非天然氨基酸的直接方法。利用肽片段的酶促連接和天然化學(xué)連接的新近發(fā)展，有可能制造較大蛋白質(zhì)。例如參見(jiàn)P.E.Dawson和S.B.H.Kent，Annu.Rev.Biochem.，69923(2000)?；瘜W(xué)肽連接和天然化學(xué)連接是描述于美國(guó)專(zhuān)利第6,184,344號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)文獻(xiàn)第2004/0138412號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)文獻(xiàn)第2003/0208046號(hào)、WO 02/098902和WO 03/042235中，所述專(zhuān)利以引用的方式并入本文中。已使用將利用所需非天然氨基酸以化學(xué)方式酰化的抑制因子tRNA添加到能夠支持蛋白質(zhì)生物合成的活體外提取物中的通用活體外生物合成方法將超過(guò)100個(gè)非天然氨基酸位點(diǎn)特異性地并入幾乎任何尺寸的多種蛋白質(zhì)中。例如參見(jiàn)V.W.Cornish，D.Mendel和P.G.Schultz，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995，34621(1995)；C.J.Noren，S.J.Anthony-Cahill，M.C.Griffith，P.G.Schultz，Ageneral method forsite-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins，Science 244182-188(1989)；和J.D.Bain，C.G.Glabe，T.A.Dix，A.R.Chamberlin，E.S.Diala，Biosyntheticsite-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide，J.Am.Chem.Soc.1118013-8014(1989)。已經(jīng)將多種官能團(tuán)引入蛋白質(zhì)中以供研究蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)折疊、酶機(jī)理和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
已提出稱(chēng)作選擇性壓力并入的活體內(nèi)方法以利用野生型合成酶的雜亂性。例如參見(jiàn)N.Budisa，C.Minks，S.Alefelder，W.Wenger，F(xiàn).M.Dong，L.Moroder和R.Huber，F(xiàn)ASEB J.，1341(1999)。使向細(xì)胞供應(yīng)特定天然氨基酸的相關(guān)代謝路徑關(guān)閉的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株在含有有限濃度的天然氨基酸的基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而靶基因的轉(zhuǎn)錄受到阻遏。在穩(wěn)定生長(zhǎng)期開(kāi)始時(shí)，天然氨基酸被耗盡且由非天然氨基酸類(lèi)似物置換。對(duì)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)的誘導(dǎo)使得含有非天然類(lèi)似物的蛋白質(zhì)積聚。舉例來(lái)說(shuō)，已使用這種策略將鄰氟苯丙氨酸、間氟苯丙氨酸和對(duì)氟苯丙氨酸并入蛋白質(zhì)中，且其在UV光譜中顯示兩個(gè)易于鑒別的特征性肩峰，例如參見(jiàn)C.Minks，R.Huber，L.Moroder和N.Budisa，Anal.Biochem.，28429(2000)；已使用三氟蛋氨酸來(lái)代替噬菌體T4溶菌酶中的蛋氨酸，從而通過(guò)19F NMR來(lái)研究其與殼寡糖配位體的相互作用，例如參見(jiàn)H.Duewel，E.Daub，V.Robinson和J.F.Honek，Biochemistry，363404(1997)；且已并入三氟亮氨酸來(lái)代替亮氨酸，從而使亮氨酸拉鏈蛋白的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性增加。例如參見(jiàn)Y.Tang，G.Ghirlanda，W.A.Petka，T.Nakajima，W.F.DeGrado和D.A.Tirrell，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，401494(2001)。此外，將硒代蛋氨酸和碲代蛋氨酸并入各種重組蛋白質(zhì)中以促進(jìn)X射線結(jié)晶學(xué)中的相溶解。例如參見(jiàn)W.A.Hendrickson，J.R.Horton和D.M.Lemaster，EMBO J.，91665(1990)；J.O.Boles，K.Lewinski，M.Kunkle，J.D.Odom，B.Dunlap，L.Lebioda和M.Hatada，Nat.Struct.Biol..1283(1994)；N.Budisa，B.Steipe，P.Demange，C.Eckerskorn，J.Kellermann和R.Huber，Eur.J.Biochem..230788(1995)；和N.Budisa，W.Karnbrock，S.Steinbacher，A.Humm，L.Prade，T.Neuefeind，L.Moroder和R.Huber，J.Mol.Biol..270616(1997)。也已有效地并入具有烯或炔官能團(tuán)的蛋氨酸類(lèi)似物，從而允許通過(guò)化學(xué)方式對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行其它修飾。例如參見(jiàn)J.C.M.van Hest和D.A.Tirrell，F(xiàn)EBS Lett.，42868(1998)；J.C.M.van Hest，K.L.Kiick和D.A.Tirrell，J.Am.Chem.Soc.1221282(2000)；以及K.L.Kiick和D.A.Tirrell，Tetrahedron，569487(2000)；美國(guó)專(zhuān)利第6,586,207號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)文獻(xiàn)第2002/0042097號(hào)，其以引用的方式并入本文中。
這種方法的成功是取決于氨?；鵷RNA合成酶對(duì)非天然氨基酸類(lèi)似物的識(shí)別，所述合成酶通常需要高選擇性以確保蛋白質(zhì)翻譯的保真度。一種擴(kuò)展這種方法的范圍的方式是放寬氨酰基tRNA合成酶的底物特異性，這已在有限數(shù)目的情況下實(shí)現(xiàn)。舉例來(lái)說(shuō)，在大腸桿菌苯丙氨?；鵷RNA合成酶(PheRS)中用Gly置換Ala294可增加底物結(jié)合口袋的尺寸，且導(dǎo)致對(duì)氯苯丙氨酸(p-Cl-Phe)使tRNAPhe?；⒁?jiàn)M.Ibba，P.Kast和H.Hennecke，Biochemistry，337107(1994)。帶有這種突變PheRS的大腸桿菌菌株允許并入對(duì)氯苯丙氨酸或?qū)︿灞奖彼醽?lái)代替苯丙氨酸。例如參見(jiàn)M.Ibba和H.Hennecke，F(xiàn)EBS Lett..364272(1995)；以及N.Sharma，R.Furter，P.Kast和D.A.Tirrell，F(xiàn)EBS Lett.，46737(2000)。類(lèi)似地，顯示接近大腸桿菌酪氨?；鵷RNA合成酶的氨基酸結(jié)合位點(diǎn)的點(diǎn)突變Phe130Ser允許比酪氨酸有效地并入重氮酪氨酸。參見(jiàn)F.Hamano-Takaku，T.Iwama，S.Saito-Yano，K.Takaku，Y.Monden，M.Kitabatake，D.Soll和S.Nishimura，J.Biol.Chem.，27540324(2000)。
在活體內(nèi)將非天然氨基酸并入蛋白質(zhì)中的另一種策略為修飾具有校對(duì)機(jī)制的合成酶。這些合成酶無(wú)法區(qū)分在結(jié)構(gòu)上與同源天然氨基酸類(lèi)似的氨基酸且因此使其活化。這一錯(cuò)誤在單獨(dú)位點(diǎn)上得到校正，這使來(lái)自tRNA的錯(cuò)配氨基酸去?；员３值鞍踪|(zhì)翻譯的保真度。如果合成酶失去校對(duì)活性，那么錯(cuò)誤活化的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物可避開(kāi)編輯功能且被并入。近來(lái)已用纈氨?；鵷RNA合成酶(ValRS)證實(shí)這種方法。參見(jiàn)V.Doring，H.D.Mootz，L.A.Nangle，T.L.Hendrickson，V.de Crecy-Lagard，P.Schimmel和P.Marliere，Science，292501(2001)。ValRS可利用Cys、Thr或氨基丁酸(Abu)使tRNAVal錯(cuò)誤氨?；浑S后，通過(guò)編輯域來(lái)水解這些非同源氨基酸。在使大腸桿菌染色體隨機(jī)誘變之后，選擇在ValRS的編輯位點(diǎn)中具有突變的突變大腸桿菌菌株。這種編輯缺陷型ValRS錯(cuò)誤地使tRNAVal裝有Cys。由于Abu與Cys在空間上類(lèi)似(Cys的-SH基團(tuán)在Abu中經(jīng)-CH3置換)，因此當(dāng)使這種突變大腸桿菌菌株在存在Abu的情況下生長(zhǎng)時(shí)，突變ValRS也將Abu并入蛋白質(zhì)中。質(zhì)譜分析顯示在天然蛋白質(zhì)的各纈氨酸位置處約24％的纈氨酸經(jīng)Abu置換。
固相合成和半合成方法也已允許合成含有新穎氨基酸的多種蛋白質(zhì)。舉例來(lái)說(shuō)，參見(jiàn)以下公開(kāi)文獻(xiàn)和其中所引用的如下參考文獻(xiàn)Crick，F(xiàn).H.C.，Barrett，L.Brenner，S.Watts-Tobin，R.General nature of the genetic code for proteins. Nature，1921227-1232(1961)；Hofmann，K.，Bohn，H.Studies on polypeptides.XXXVI.The effect ofpyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptidefragment，J.Am Chem，88(24)5914-5919(1966)；Kaiser，E.T.Synthetic approaches tohiologically active peptides and proteins including enyzmes，Acc Chem Res，2247-54(1989)；Nakatsuka，T.，Sasaki，T.，Kaiser，E.T.Peptide segment coupling catalyzed by thesemisynthetic enzyme thiosubtilisin，J Am Chem Soc.1093808-3810(1987)；Schnolzer，M.，Kent，S B H.Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptidesbackbone-engineered HIV protease，Science，256(5054)221-225(1992)；Chaiken，I.M.Semisynthetic peptides and proteins，CRC Crit Rev Biochem.11(3)255-301(1981)；Offord，R.E.Protein engineering by chemical means？Protein Eng.，1(3)151-157(1987)；以及Jackson，D.Y.，Burnier，J.，Quan，C，Stanley，M.，Tom，J.，Wells，J.A.A DesignedPeptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues，Science，266(5183)243(1994)。
已使用化學(xué)修飾在活體外將包括輔因子、自旋標(biāo)記和寡核苷酸的多種非天然側(cè)鏈引入蛋白質(zhì)中。例如參見(jiàn)，Corey，D.R.，Schultz，P.G.Generation of a hybridseauence-specific single-stranded deoxyribonuclease，Science，238(4832)1401-1403(1987)；Kaiser，E.T.，Lawrence D.S.，Rokita，S.E.The chemical modification of enzymaticspecificity，Annu Rev Biochem，54565-595(1985)；Kaiser，E.T.，Lawrence，D.S.Chemical mutation of enyzme active sites，Science，226(4674)505-511(1984)；Neet，K.E.，Nanci A，Koshland，D.E.Properties of thiol-subtilisin，J Biol.Chem.243(24)6392-6401(1968)；Polgar，L.和M.L.Bender.A new enzyme containing a synthetically formed activesite.Thiol-subtilisin.J.Am Chem Soc，883153-3154(1966)；以及Pollack，S.J.，Nakayama，G.Schultz，P.G.Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes intoantibody combining sites，Science，242(4881)1038-1040(1988)。
或者，使用以化學(xué)方式修飾的氨?；鵷RNA的生物合成方法已用于將多種生物物理探針并入在活體外合成的蛋白質(zhì)中。參見(jiàn)以下公開(kāi)文獻(xiàn)和其中所引用的參考文獻(xiàn)Brunner，J.New Photolabeling and crosslinking methods.Annu.Rev Biochem，62483-514(1993)；和Krieg，U.C.，Walter，P.，Hohnson，A.E.Photocrosslinking of thesignal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signalrecognition particle，Proc.Natl.Acad.Sci，83(22)8604-8608(1986)。
先前已證實(shí)，通過(guò)將以化學(xué)方式氨?；囊种埔蜃觮RNA添加到利用含有所需琥珀無(wú)義突變的基因編程的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中，可在活體外將非天然氨基酸位點(diǎn)特異性地并入蛋白質(zhì)中。使用這些方法，可使用特定氨基酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，用密切結(jié)構(gòu)同源物來(lái)取代20種常見(jiàn)氨基酸中的多種氨基酸，例如，用氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸。例如參見(jiàn)Noren，C.J.，Anthony-Cahill，Griffith，M.C.，Schultz，P.G.A generalmethod for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins，Science，244182-188(1989)；M.W.Nowak等人，Science 268439-42(1995)；Bain，J.D.，Glabe，C.G.，Dix，T.A.，Chamberlin，A.R.，Diala，E.S.Biosynthetic site-specific Incorporation ofa non-natural amino acid into a polypeptide，J.Am Chem Soc，1118013-8014(1989)；N.Budisa等人，F(xiàn)ASEB J.1341-51(1999)；Ellman，J.A.，Mendel，D.，Anthony-Cahill，S.，Noren，C.J.，Schultz，P.G.Biosynthetic method for introducing unnatural amino acidssite-specifically into proteins.Methods in Enz.，第202卷，301-336(1992)；和Mendel，D.，Cornish，V.W.& Schultz，P.G.Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code，Annu Rev Biophys.Biomol Struct.24，435-62(1995)。
舉例來(lái)說(shuō)，制備識(shí)別終止密碼子UAG的抑制因子tRNA且用非天然氨基酸以化學(xué)方式使其氨?；?。使用常規(guī)定點(diǎn)誘變?cè)诘鞍踪|(zhì)基因中的所關(guān)注位點(diǎn)處引入終止密碼子TAG。例如參見(jiàn)Sayers，J.R.，Schmidt，W.Eckstein，F(xiàn).5′-3′Exonucleases inphosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis，Nucleic Acids Res，16(3)791-802(1988)。當(dāng)將酰化抑制因子tRNA和突變基因組合到活體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中時(shí)，響應(yīng)UAG密碼子而并入非天然氨基酸，這得到在指定位置處含有所述氨基酸的蛋白質(zhì)。使用[3H]-Phe的實(shí)驗(yàn)和使用α-羥基酸的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在UAG密碼子指定的位置處僅并入所需氨基酸且未在蛋白質(zhì)中的任何其它位點(diǎn)處并入此氨基酸。例如參見(jiàn)，Noren等人，同上文；Kobayashi等人，(2003)Nature Structural Biology10(6)425-432；和Ellman，J.A.，Mendel，D.，Schultz，P.G.Site-specific incorporation ofnovel backbone structures into proteins，Science，255(5041)197-200(1992)。
可通過(guò)任何方法或技術(shù)(包括(但不限于)化學(xué)或酶促氨?；?利用所需氨基酸使tRNA氨酰化。
可通過(guò)氨酰基tRNA合成酶或其它酶分子(包括(但不限于)核糖酶)來(lái)實(shí)現(xiàn)氨?；?。術(shù)語(yǔ)“核糖酶”可與“催化性RNA”互換。Cech和同事(Cech，1987，Science.2361532-1539；McCorkle等人，1987，Concepts Biochem.64221-226)證實(shí)存在可充當(dāng)催化劑的天然存在的RNA(核糖酶)。然而，盡管僅證實(shí)這些天然RNA催化劑對(duì)核糖核酸底物具有裂解和剪接作用，但核糖酶人工開(kāi)發(fā)的近期發(fā)展已將催化譜系擴(kuò)大到各種化學(xué)反應(yīng)。研究已鑒別出可催化自身(2′)3′末端的氨酰基RNA鍵的RNA分子(Illangakekare等人，1995 Science 267643-647)，以及可將氨基酸從一個(gè)RNA分子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)的RNA分子(Lohse等人，1996，Nature 381442-444)。
美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)文獻(xiàn)2003/0228593(其以引用的方式并入本文中)描述構(gòu)筑核糖體的方法和其在利用天然編碼和非天然編碼氨基酸使tRNA氨?；械挠猛尽？墒箃RNA氨酰化的酶分子(包括(但不限于)核糖酶)的底物固定形式使得能夠有效地親和純化氨?；a(chǎn)物。適當(dāng)?shù)孜锏膶?shí)例包括瓊脂糖、瓊脂糖凝膠和磁珠。用于氨?；牡孜锕潭ㄐ问降暮颂敲傅闹苽浜陀猛臼敲枋鲇贑hemistry and Biology 2003，101077-1084和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)文獻(xiàn)2003/0228593中，其以引用的方式并入本文中。
化學(xué)氨?；椒ò?但不限于)避免在氨酰化過(guò)程中使用合成酶的由Hecht和同事(Hecht，S.M.Acc.Chem.Res.1992，25，545；Heckler，T.G.；Roesser，J.R.；Xu，C；Chang，P.；Hecht，S.M.Biochemistry 1988，27，7254；Hecht，S.M.；Alford，B.L.；Kuroda，Y.；Kitano，S.J.Biol.Chem.1978，253，4517)以及Schultz，Chamberlin，Dougherty等人(Cornish，V.W.；Mendel，D.；Schultz，P.G.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995，34，621；Robertson，S.A.；Ellman，J.A.；Schultz，P.G.J.Am.Chem.Soc.1991，113，2722；Noren，C.J.；Anthony-Cahill，S.J.；Griffith，M.C.；Schultz，P.G.Science 1989，244，182；Bain，J.D.；Glabe，C.G.；Dix，T.A.；Chamberlin，A.R.J.Am.Chem.Soc.1989，111，8013；Bain，J.D.等人，Nature 1992，356，537；Gallivan，J.P.；Lester，H.A.；Dougherty，D.AChem.Biol.1997，4，740；Turcatti等人，J.Biol.Chem.1996，271，19991；Nowak，M.W.等人，Science，1995，268，439；Saks，M.E.等人，J.Biol.Chem.19.96，271，23169；Hohsaka，T.等人，J.Am.Chem.Soc.1999，12l，34)介紹的方法。所述方法或其它化學(xué)氨?；椒ǘ伎捎糜谑箃RNA分子氨?；?。
產(chǎn)生催化性RNA的方法可涉及產(chǎn)生單獨(dú)的隨機(jī)核糖酶序列池；對(duì)所述池進(jìn)行定向演化；針對(duì)所需氨?；钚院Y選所述池；和選擇展現(xiàn)所需氨?；钚缘暮颂敲感蛄小?br> 核糖酶可包含促進(jìn)?；钚缘幕?或區(qū)域，諸如GGU基元和富集U的區(qū)域。舉例來(lái)說(shuō)，已報(bào)導(dǎo)富集U的區(qū)域可促進(jìn)氨基酸底物的識(shí)別，且GGU基元可與tRNA的3′末端形成堿基對(duì)。GGU基元與富集U的區(qū)域的組合促進(jìn)同時(shí)識(shí)別氨基酸與tRNA，且因此促進(jìn)tRNA的3′末端的氨?；?。
可通過(guò)使用與tRNAAsnCCCG結(jié)合的部分隨機(jī)化r24mini進(jìn)行活體外選擇，隨后系統(tǒng)工程化活性克隆中所見(jiàn)的一致序列來(lái)產(chǎn)生核糖酶。通過(guò)此方法獲得的例示性核糖酶是稱(chēng)為“Fx3核糖酶”并且描述于美國(guó)公開(kāi)申請(qǐng)文件第2003/0228593號(hào)中，所述申請(qǐng)文件的內(nèi)容以引用的方式并入本文中，所述核糖酶充當(dāng)合成裝載有同源非天然氨基酸的各種氨?；鵷RNA的通用催化劑。
在底物上固定可用于促成氨?；痶RNA的有效親和純化。適當(dāng)?shù)孜锏膶?shí)例包括(但不限于)瓊脂糖、瓊脂糖凝膠和磁珠。可通過(guò)利用RNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)將核糖酶固定在樹(shù)脂上，舉例來(lái)說(shuō)，可用高碘酸鹽氧化RNA核糖上的3′-順-二醇以得到相應(yīng)的二醛，從而促進(jìn)RNA在樹(shù)脂上的固定?？墒褂酶鞣N類(lèi)型的樹(shù)脂，包括廉價(jià)的酰肼樹(shù)脂，其中還原胺化使得樹(shù)脂與核糖酶之間相互作用形成不可逆鍵聯(lián)?？赏ㄟ^(guò)此項(xiàng)柱上氨酰化技術(shù)來(lái)顯著促進(jìn)氨?；鵷RNA的合成。Kourouklis等人，Methods 2005；36239-4中描述一種基于柱的氨酰化系統(tǒng)。
氨?；痶RNA的分離可以多種方式實(shí)現(xiàn)。一種適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ抢镁彌_劑(諸如含有10mM EDTA的乙酸鈉溶液；含有50mM N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-(3-丙烷磺酸)、12.5mM KCl(pH7.0)、10mM EDTA的緩沖劑；或者簡(jiǎn)單地，EDTA緩沖的水(pH7.0))從柱中洗提氨?；痶RNA。
可將氨?；痶RNA添加到翻譯反應(yīng)中以便將使tRNA氨?；陌被岵⑷敕g反應(yīng)所產(chǎn)生的多肽中的所選位置中?？墒褂帽景l(fā)明的氨?；痶RNA的翻譯系統(tǒng)的實(shí)例包括(但不限于)細(xì)胞溶解產(chǎn)物。細(xì)胞溶解產(chǎn)物提供由輸入mRNA活體外翻譯多肽所需的反應(yīng)組件。所述反應(yīng)組件的實(shí)例包括(但不限于)核糖體蛋白、rRNA、氨基酸、tRNA、GTP、ATP、翻譯起始因子和延長(zhǎng)因子以及其它與翻譯有關(guān)的因子。此外，翻譯系統(tǒng)可為批量翻譯或分隔翻譯(compartmentalized translation)。批量翻譯系統(tǒng)將反應(yīng)組件組合到單一隔室中，而分隔翻譯系統(tǒng)使翻譯反應(yīng)組件與可抑制翻譯效率的反應(yīng)產(chǎn)物分離。這些翻譯系統(tǒng)可購(gòu)得。
此外，可使用偶聯(lián)式轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)。偶聯(lián)式轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)允許將輸入DNA轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的mRNA，而所述mRNA又經(jīng)反應(yīng)組件翻譯。市售偶聯(lián)式轉(zhuǎn)錄/翻譯的實(shí)例為Rapid Translation System(RTS，Roche Inc.)。所述系統(tǒng)包括含有大腸桿菌溶解產(chǎn)物的混合物以提供諸如核糖體和翻譯因子等翻譯組件。此外，還包括RNA聚合酶以將輸入DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA模板以用于翻譯。RTS可經(jīng)由插入反應(yīng)隔室(包括供應(yīng)/廢料隔室和轉(zhuǎn)錄/翻譯隔室)之間的膜來(lái)分隔反應(yīng)組件。
可通過(guò)包括(但不限于)轉(zhuǎn)移酶、聚合酶、催化性抗體、多功能蛋白等的其它試劑進(jìn)行tRNA的氨?；?。
Stephan在Scientist，2005年10月10日第30-33頁(yè)中描述將非天然編碼氨基酸并入蛋白質(zhì)中的其它方法。Lu等人在Mol Cell.2001年10月；8(4)759-69中描述一種以化學(xué)方式將蛋白質(zhì)結(jié)合到含有非天然氨基酸的合成肽的方法(經(jīng)表達(dá)的蛋白質(zhì)連接)。
也已使用微注射技術(shù)將非天然氨基酸并入蛋白質(zhì)中。例如參見(jiàn)M.W.Nowak，P.C.Kearney，J.R.Sampson，M.E.Saks，C.G.Labarca，S.K.Silverman，W.G.Zhong，J.Thorson，J.N.Abelson，N.Davidson，P.G.Schultz，D.A.Dougherty和H.A.Lester，Science，268439(1995)；以及D.A.Dougherty，Curr.Opin.Chem.Biol.，4645(2000)。將爪蟾卵母細(xì)胞(Xenopus oocyte)與活體外產(chǎn)生的以下兩種RNA物質(zhì)共注射在所關(guān)注的氨基酸位置處具有UAG終止密碼子的編碼標(biāo)靶蛋白的mRNA，和經(jīng)所需非天然氨基酸氨酰化的琥珀抑制因子tRNA。隨后，卵母細(xì)胞的翻譯機(jī)構(gòu)將非天然氨基酸插入由UAG所指定的位置處。這種方法已允許整合膜蛋白的活體內(nèi)結(jié)構(gòu)-功能研究，所述研究通常不適用于活體外表達(dá)系統(tǒng)。實(shí)例包括將熒光氨基酸并入速激肽神經(jīng)激肽-2受體中以通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移來(lái)測(cè)量距離，例如參見(jiàn)G.Turcatti，K.Nemeth，M.D.Edgerton，U.Meseth，F(xiàn).Talabot，M.Peitsch，J.Knowles，H.Vogel和A.Chollet，J.Biol.Chem.，27119991(1996)；并入生物素化氨基酸以鑒別離子通道中表面暴露的殘基，例如參見(jiàn)J.P.Gallivan，H.A.Lester和D.A.Dougherty，Chem.Biol.，4739(1997)；使用籠化的酪氨酸類(lèi)似物以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)離子通道中的構(gòu)象變化，例如參見(jiàn)J.C.Miller，S.K.Silverman，P.M.England，D.A.Dougherty和H.A.Lester，Neuron，20619(1998)；以及使用α羥基氨基酸以改變用于探查其門(mén)控機(jī)制的離子通道主鏈。例如參見(jiàn)P.M.England，Y.Zhang，D.A.Dougherty和H.A.Lester，Cell，9689(1999)；以及T.Lu，A.Y.Ting，J.Mainland，L.Y.Jan，P.G.Schultz和J.Yang，Nat.Neurosci.，4239(2001)。
在活體內(nèi)直接將非天然氨基酸并入蛋白質(zhì)中的能力提供多種優(yōu)勢(shì)，包括(但不限于)突變蛋白的高產(chǎn)率、技術(shù)簡(jiǎn)易性、在細(xì)胞中或可能在活生物體中研究突變蛋白的可能性以及這些突變蛋白在治療性治療和診斷使用中的用途。將具有各種尺寸、酸度、親核性、疏水性和其它性質(zhì)的非天然氨基酸包括在蛋白質(zhì)中的能力可極大地?cái)U(kuò)展理性且系統(tǒng)地操縱蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的能力，從而探查蛋白質(zhì)功能并且產(chǎn)生具有新穎性質(zhì)的新蛋白質(zhì)或生物體。
在位點(diǎn)特異性并入para-F-Phe的一次嘗試中，將酵母琥珀抑制因子tRNAPheCUA/苯丙氨酰基tRNA合成酶對(duì)用于p-F-Phe抗性、Phe營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸桿菌菌株中。例如參見(jiàn)R.Furter，Protein Sci.，7419(1998)。
使用無(wú)細(xì)胞(活體外)翻譯系統(tǒng)獲得本發(fā)明的hPP或hA或hFc多核苷酸的表達(dá)也是可能的。翻譯系統(tǒng)可為細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，并且可為原核或真核翻譯系統(tǒng)。細(xì)胞翻譯系統(tǒng)包括(但不限于)全細(xì)胞制劑，諸如可將所需核酸序列轉(zhuǎn)錄成mRNA并且翻譯所述mRNA的滲透細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物。無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)可購(gòu)得，并且眾所周知多種不同的類(lèi)型和系統(tǒng)。無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的實(shí)例包括(但不限于)原核細(xì)胞溶解產(chǎn)物，諸如大腸桿菌溶解產(chǎn)物；和真核細(xì)胞溶解產(chǎn)物，諸如麥胚提取物、昆蟲(chóng)細(xì)胞溶解產(chǎn)物、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解產(chǎn)物、兔卵母細(xì)胞溶解產(chǎn)物和人類(lèi)細(xì)胞溶解產(chǎn)物。當(dāng)所得蛋白質(zhì)經(jīng)糖基化、磷酸化或以其它方式經(jīng)修飾時(shí)，由于許多這種修飾只可能在真核系統(tǒng)中發(fā)生，所以真核細(xì)胞提取物或溶解產(chǎn)物可為優(yōu)選的。這些提取物和溶解產(chǎn)物中有一些可購(gòu)得(Promega；Madison，Wis.；Stratagene；La Jolla，Calif.；Amersham；Arlington Heights，Ill.；GIBCO/BRL；Grand Island，N.Y.)。膜提取物(諸如含有微粒體膜的犬胰腺提取物)也可用，其可用于翻譯分泌蛋白質(zhì)。在可包括mRNA作為模板(活體外翻譯)或包括DNA作為模板(組合式活體外轉(zhuǎn)錄與翻譯)的這些系統(tǒng)中，由核糖體指導(dǎo)活體外合成。已進(jìn)行相當(dāng)多的嘗試來(lái)研發(fā)無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。例如參見(jiàn)，Kim，D.M.和J.R.Swartz，Biotechnology and Bioengineering，74309-316(2001)；Kim，D.M.和J.R.Swartz，Biotechnology Letters，22，1537-1542，(2000)；Kim，D.M.和J.R.Swartz，Biotechnology Progress，16，385-390，(2000)；Kim，D.M.和J.R.Swartz，Biotechnology and Bioengineering，66，180-188，(1999)；以及Patnaik，R.和J.R.Swartz，Biotechniques 24，862-868，(1998)；美國(guó)專(zhuān)利第6,337,191號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)文獻(xiàn)第2002/0081660號(hào)；WO 00/55353；WO 90/05785，其以引用的方式并入本文中。另一種可用于表達(dá)包含非天然編碼氨基酸的hPP或hA或hFc多肽的方法包括mRNA-肽融合技術(shù)。例如參見(jiàn)R.Roberts和J.Szostak，Proc.Natl Acad.Sci.(USA)9412297-12302(1997)；A.Frankel等人，Chemistry & Biology 101043-1050(2003)。在本方法中，在核糖體上將與嘌呤霉素(puromycin)連接的mRNA模板翻譯成肽。如果已對(duì)一個(gè)或一個(gè)以上tRNA分子進(jìn)行修飾，那么也可將非天然氨基酸并入肽中。在已讀取最后一個(gè)mRNA密碼子后，嘌呤霉素捕獲肽的C末端。如果發(fā)現(xiàn)所得mRNA-肽結(jié)合物在活體外檢定中具有引人關(guān)注的性質(zhì)，那么可容易地由mRNA序列公開(kāi)其身份。以此方式，可篩選包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的hPP或hA或hFc多肽的文庫(kù)，以鑒別具有所需性質(zhì)的多肽。最近，已報(bào)導(dǎo)利用經(jīng)純化組分的活體外核糖體翻譯，其允許合成經(jīng)非天然編碼氨基酸取代的肽。例如參見(jiàn)A.Forster等人，Proc.Natl Acad.Sci.(USA)1006353(2003)。
還可使用重構(gòu)翻譯系統(tǒng)。已成功地使用經(jīng)純化翻譯因子的混合物以及溶解產(chǎn)物或補(bǔ)充有經(jīng)純化翻譯因子(諸如，起始因子-1(IF-1)、IF-2、IF-3(α或β)、延長(zhǎng)因子T(EF-Tu)或終止因子)的溶解產(chǎn)物的組合將mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)也可為偶聯(lián)式轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)，其中如Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人編輯，Wiley Interscience，1993)(其以引用的方式特別并入本文中)中所述，將DNA引入所述系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄成mRNA并翻譯所述mRNA。在真核轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄的RNA可為異核RNA(hnRNA)或者5′端戴帽(7-甲基鳥(niǎo)苷)且3′端加聚腺苷酸尾的成熟mRNA(其可在某些翻譯系統(tǒng)中具有優(yōu)勢(shì))的形式。舉例來(lái)說(shuō)，在網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解產(chǎn)物系統(tǒng)中，以高效率翻譯戴帽的mRNA。
IX.與hPP或hA或hFc多肽偶合的大分子聚合物 本文中所述的針對(duì)非天然氨基酸多肽的各種修飾可使用本文中所述的組合物、方法、技術(shù)以及策略來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些修飾包括在多肽的非天然氨基酸組分上并入其它官能團(tuán)，所述官能團(tuán)包括(但不限于)標(biāo)記；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交聯(lián)劑；放射性核素；細(xì)胞毒性化合物；藥物；親和標(biāo)記；光親和標(biāo)記；反應(yīng)性化合物；樹(shù)脂；第二蛋白質(zhì)或多肽或多肽類(lèi)似物；抗體或抗體片段；金屬螯合劑；輔因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反義多核苷酸；糖類(lèi)；水溶性樹(shù)枝狀聚合物；環(huán)糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；納米粒子；自旋標(biāo)記；熒光團(tuán)；含金屬的部分；放射性部分；新穎官能團(tuán)；與其它分子共價(jià)或非共價(jià)相互作用的基團(tuán)；光籠化部分；光化輻射可激發(fā)的部分；可光致異構(gòu)化部分；生物素；生物素衍生物；生物素類(lèi)似物；合并有重原子的部分；可化學(xué)裂解的基團(tuán)；可光裂解的基團(tuán)；延長(zhǎng)的側(cè)鏈；碳連接的糖；氧化還原活性劑；氨基硫代酸；毒性部分；經(jīng)同位素標(biāo)記的部分；生物物理探針；磷光基團(tuán)；化學(xué)發(fā)光基團(tuán)；電子致密基團(tuán)；磁性基團(tuán)；插入基團(tuán)；發(fā)色團(tuán)；能量轉(zhuǎn)移劑；生物活性劑；可檢測(cè)標(biāo)記；小分子；量子點(diǎn)；納米傳遞素；放射性核苷酸；放射性傳遞素；中子捕獲劑；或上述物質(zhì)的任何組合，或任何其它所需的化合物或物質(zhì)。作為本文中所述的組合物、方法、技術(shù)以及策略的說(shuō)明性非限制性實(shí)例，以下描述將集中在將大分子聚合物添加到非天然氨基酸多肽中，同時(shí)應(yīng)了解相關(guān)組合物、方法、技術(shù)以及策略也適用于(必要時(shí)利用適當(dāng)修飾，且所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可利用本文中的公開(kāi)內(nèi)容來(lái)進(jìn)行)添加其它官能團(tuán)，包括(但不限于)以上所列的官能團(tuán)。
多種大分子聚合物和其它分子可與本發(fā)明的hPP或hA多肽連接來(lái)調(diào)節(jié)hPP或hA多肽的生物性質(zhì)，和/或?qū)PP或hA或hFc分子提供新穎的生物性質(zhì)。這些大分子聚合物可經(jīng)由天然編碼氨基酸、經(jīng)由非天然編碼氨基酸或天然或非天然氨基酸的任何官能取代基或添加到天然或非天然氨基酸中的任何取代基或官能團(tuán)與hPP或hA或hFc多肽連接。聚合物的分子量可具有寬范圍，包括(但不限于)介于約100Da與約100,000Da或100,000Da以上之間。聚合物的分子量可介于約100Da與約100,000Da之間，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da以及100Da。在一些實(shí)施例中，聚合物的分子量介于約100Da與50,000Da之間。在一些實(shí)施例中，聚合物的分子量介于約100Da與40,000Da之間。在一些實(shí)施例中，聚合物的分子量介于約1,000Da與40,000Da之間。在一些實(shí)施例中，聚合物的分子量介于約5,000Da與40,000Da之間。在一些實(shí)施例中，聚合物的分子量介于約10,000Da與40,000Da之間。
本發(fā)明提供實(shí)質(zhì)上均質(zhì)的聚合物蛋白質(zhì)結(jié)合物制劑。如本文中所使用，“實(shí)質(zhì)上均質(zhì)”意思是據(jù)觀察聚合物蛋白質(zhì)結(jié)合物分子大于總蛋白質(zhì)的一半。聚合物蛋白質(zhì)結(jié)合物具有生物活性且本文中所提供的本發(fā)明的“實(shí)質(zhì)上均質(zhì)”的聚乙二醇化hPP或hA或hFc多肽制劑為足夠均質(zhì)以致展現(xiàn)均質(zhì)制劑的優(yōu)勢(shì)(例如，在臨床應(yīng)用中預(yù)計(jì)各批次之間的藥物動(dòng)力學(xué)的簡(jiǎn)便性)的多肽制劑。
還可選擇制備聚合物蛋白質(zhì)結(jié)合物分子的混合物，且本文中所提供的優(yōu)勢(shì)在于可選擇欲包括在所述混合物中的單一聚合物蛋白質(zhì)結(jié)合物的比例。因此，必要時(shí)，可制備各種蛋白質(zhì)與各種數(shù)目的所連接的聚合物部分(即，二、三、四等)的混合物且將所述結(jié)合物與使用本發(fā)明的方法制備的單一聚合物蛋白質(zhì)結(jié)合物組合，且得到具有預(yù)定的單一聚合物蛋白質(zhì)結(jié)合物比例的混合物。
所選擇的聚合物可為水溶性的，以致其所連接的蛋白質(zhì)在諸如生理環(huán)境等水性環(huán)境中不沉淀。聚合物可為分支的或不分支的。對(duì)于最終產(chǎn)品制劑的治療使用來(lái)說(shuō)，聚合物將為醫(yī)藥學(xué)上可接受的。
聚合物的實(shí)例包括(但不限于)聚烷基醚和其經(jīng)烷氧基封端的類(lèi)似物(例如，聚氧乙二醇、聚氧乙烯/丙二醇和其經(jīng)甲氧基或乙氧基封端的類(lèi)似物，尤其聚氧乙二醇，后者也稱(chēng)為聚乙二醇或PEG)；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯烷基醚；聚噁唑啉、聚烷基噁唑啉和聚羥基烷基噁唑啉；聚丙烯酰胺、聚烷基丙烯酰胺和聚羥基烷基丙烯酰胺(例如，聚羥基丙基甲基丙烯酰胺和其衍生物)；聚羥基烷基丙烯酸酯；聚唾液酸和其類(lèi)似物；親水性肽序列；多糖和其衍生物，包括葡聚糖和葡聚糖衍生物，例如羧甲基葡聚糖、硫酸葡聚糖、氨基葡聚糖、纖維素和其衍生物，例如羧甲基纖維素、羥基烷基纖維素；甲殼質(zhì)和其衍生物，例如殼聚糖、琥珀?；鶜ぞ厶?、羧甲基甲殼質(zhì)、羧甲基殼聚糖；透明質(zhì)酸和其衍生物；淀粉；海藻酸酯；硫酸軟骨素；白蛋白；支鏈淀粉(pullulan)和羧甲基支鏈淀粉；聚氨基酸和其衍生物，例如聚谷氨酸、聚賴氨酸、聚天冬氨酸、聚天冬酰胺；馬來(lái)酸酐共聚物，諸如苯乙烯馬來(lái)酸酐共聚物、二乙烯基乙基醚馬來(lái)酸酐共聚物；聚乙烯醇；其共聚物；其三聚物；其混合物；和上述物質(zhì)的衍生物。
聚乙二醇分子與蛋白質(zhì)分子的比例將變化，其在反應(yīng)混合物中的濃度也將變化。一般來(lái)說(shuō)，最佳比率(就存在最小過(guò)量的未反應(yīng)蛋白質(zhì)或聚合物的反應(yīng)的效率來(lái)說(shuō))可通過(guò)所選擇的聚乙二醇的分子量和可利用的可利用性反應(yīng)性基團(tuán)的數(shù)目來(lái)確定。至于分子量，通常聚合物的分子量越高，可與蛋白質(zhì)連接的聚合物分子的數(shù)目越少。類(lèi)似地，當(dāng)優(yōu)化這些參數(shù)時(shí)，應(yīng)考慮聚合物的分支。通常，分子量越高(或分支越多)，聚合物蛋白質(zhì)比率越高。
如本文中所使用且當(dāng)涵蓋PEGhPP或hA或hFc多肽結(jié)合物時(shí)，術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指產(chǎn)生患者所需益處的量。所述量將隨個(gè)體而變化且將取決于許多因素，包括患者的總體身體狀況和待治療的病狀的潛伏病因。用于療法的hPP或hA或hFc多肽的量產(chǎn)生可接受的變化速率且將所需反應(yīng)維持在有益水平。本發(fā)明組合物的治療有效量可由所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員使用可公開(kāi)獲得的物質(zhì)和程序容易地確定。
水溶性聚合物可為任何結(jié)構(gòu)形式，包括(但不限于)線性、叉狀或分支形式。水溶性聚合物通常為聚(烷二醇)，諸如聚(乙二醇)(PEG)，但也可使用其它水溶性聚合物。舉例來(lái)說(shuō)，使用PEG來(lái)描述本發(fā)明的某些實(shí)施例。
PEG為熟知的水溶性聚合物，其可購(gòu)得或可根據(jù)所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知的方法通過(guò)使乙二醇開(kāi)環(huán)聚合來(lái)制備(Sandler和Karo，Polymer Synthesis，AcademicPress，New York，第3卷，第138-161頁(yè))。術(shù)語(yǔ)“PEG”廣泛用于涵蓋任何聚乙二醇分子(不考慮PEG的尺寸或其末端的修飾)，且可由下式表示為與hPP或hA或hFc多肽連接 XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y， 其中n為2到10,000且X為H或末端修飾，包括(但不限于)C1-4烷基、保護(hù)基或末端官能基。
在一些情況下，本發(fā)明中所使用的PEG在一端以羥基或甲氧基封端，即，X為H或CH3(“甲氧基PEG”)?；蛘撸琍EG可以反應(yīng)性基團(tuán)封端，從而形成雙官能聚合物。典型反應(yīng)性基團(tuán)可包括通常用于與20種常見(jiàn)氨基酸中所見(jiàn)的官能團(tuán)反應(yīng)的反應(yīng)性基團(tuán)(包括(但不限于)馬來(lái)酰亞胺基、活化碳酸酯(包括(但不限于)對(duì)硝基苯酯)、活化酯(包括(但不限于)N-羥基琥珀酰亞胺、對(duì)硝基苯酯)和醛)以及對(duì)20種常見(jiàn)氨基酸呈惰性但與非天然編碼氨基酸中所存在的互補(bǔ)官能團(tuán)特異性反應(yīng)的官能團(tuán)(包括(但不限于)疊氮基、炔基)。應(yīng)注意，上式中由Y顯示的PEG的另一端將直接與hPP或hA或hFc多肽連接或經(jīng)由天然存在或非天然編碼氨基酸間接與hPP或hA或hFc多肽連接。舉例來(lái)說(shuō)，Y可為與多肽的胺基(包括(但不限于)賴氨酸的ε胺或N-末端)連接的酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或脲鍵?；蛘?，Y可為與硫醇基(包括(但不限于)半胱氨酸的硫醇基)連接的馬來(lái)酰亞胺鍵?；蛘?，Y可為與通過(guò)20種常見(jiàn)氨基酸通常不可及的殘基連接的鍵。舉例來(lái)說(shuō)，PEG上的疊氮基可與hPP或hA或hFc多肽上的炔基反應(yīng)以形成休斯根[3+2]環(huán)加成產(chǎn)物。或者，PEG上的炔基可與非天然編碼氨基酸中所存在的疊氮基反應(yīng)以形成類(lèi)似的產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，強(qiáng)親核體(包括(但不限于)肼、酰肼、羥胺、氨基脲)可與非天然編碼氨基酸中所存在的醛或酮基反應(yīng)以形成腙、肟或半卡巴腙，在一些情況下，適當(dāng)時(shí)可通過(guò)用適當(dāng)還原劑處理使腙、肟或半卡巴腙進(jìn)一步還原?；蛘撸瑥?qiáng)親核體可經(jīng)由非天然編碼氨基酸并入hPP或hA或hFc多肽中且可用于優(yōu)先與水溶性聚合物中所存在的酮或醛基反應(yīng)。
按實(shí)際需要，可使用PEG的任何分子質(zhì)量，視需要包括(但不限于)約100道爾頓(Da)到100,000Da或100,000Da以上(有時(shí)包括(但不限于)0.1-50kDa或10-40kDa)。PEG的分子量可具有寬范圍，包括(但不限于)介于約100Da與約100,000Da或100,000Da以上之間。PEG可介于約100Da與約100,000Da之間，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da以及100Da。在一些實(shí)施例中，PEG介于約100Da與50,000Da之間。在一些實(shí)施例中，PEG介于約100Da與40,000Da之間。在一些實(shí)施例中，PEG介于約1,000Da與40,000Da之間。在一些實(shí)施例中，PEG介于約5,000Da與40,000Da之間。在一些實(shí)施例中，PEG介于約10,000Da與40,000Da之間。也可使用分支鏈PEG，包括(但不限于)各鏈具有介于1-100kDa(包括(但不限于1-50kDa或5-20kDa))范圍內(nèi)的MW的PEG分子。分支鏈PEG的各鏈的分子量可介于包括(但不限于)約1,000Da與約100,000Da或100,000Da以上之間。分支鏈PEG的各鏈的分子量可介于約1,000Da與約100,000Da之間，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da以及1,000Da。在一些實(shí)施例中，分支鏈PEG的各鏈的分子量介于約1,000Da與50,000Da之間。在一些實(shí)施例中，分支鏈PEG的各鏈的分子量介于約1,000Da與40,000Da之間。在一些實(shí)施例中，分支鏈PEG的各鏈的分子量介于約5,000Da與40,000Da之間。在一些實(shí)施例中，分支鏈PEG的各鏈的分子量介于約5,000Da與20,000Da之間。多種PEG分子是描述于包括(但不限于)Shearwater Polymers，Inc.目錄、NektarTherapeutics目錄中，所述目錄以引用的方式并入本文中。
通常，PEG分子的至少一個(gè)末端可用于與非天然編碼氨基酸反應(yīng)。舉例來(lái)說(shuō)，可使用具有與氨基酸側(cè)鏈反應(yīng)的炔和疊氮部分的PEG衍生物來(lái)使PEG與如本文中所述的非天然編碼氨基酸連接。如果非天然編碼氨基酸包含疊氮化物，那么PEG通常將含有炔部分以實(shí)現(xiàn)[3+2]環(huán)加成產(chǎn)物的形成，或含有膦基團(tuán)的活化PEG物質(zhì)(即，酯、碳酸酯)以實(shí)現(xiàn)酰胺鍵的形成?；蛘?，如果非天然編碼氨基酸包含炔，那么PEG通常將含有疊氮部分以實(shí)現(xiàn)[3+2]休斯根環(huán)加成產(chǎn)物的形成。如果非天然編碼氨基酸包含羰基，那么PEG通常將包含有效親核體(包括(但不限于)酰肼、肼、羥胺或氨基脲官能團(tuán))以分別實(shí)現(xiàn)相應(yīng)腙、肟以及半卡巴腙鍵的形成。在其它替代方案中，可使用上述反應(yīng)性基團(tuán)的定向的反向定向，即，可使非天然編碼氨基酸中的疊氮部分與含有炔的PEG衍生物反應(yīng)。
在一些實(shí)施例中，具有PEG衍生物的hPP或hA或hFc多肽變異體含有與非天然編碼氨基酸側(cè)鏈上所存在的化學(xué)官能團(tuán)反應(yīng)的化學(xué)官能團(tuán)。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供包含平均分子量為約800Da到約100,000Da的水溶性聚合物主鏈的含疊氮和乙炔的聚合物衍生物。水溶性聚合物的聚合物主鏈可為聚(乙二醇)。然而，應(yīng)理解多種水溶性聚合物也適用于本發(fā)明的實(shí)施，包括(但不限于)聚(乙二醇)和其它相關(guān)聚合物，包括聚(葡聚糖)和聚(丙二醇)，且術(shù)語(yǔ)PEG或聚(乙二醇)的使用打算涵蓋且包括所有這些分子。術(shù)語(yǔ)PEG包括(但不限于)呈任何形式的聚(乙二醇)，包括雙官能PEG、多臂PEG、衍生PEG、叉狀PEG、分支PEG、側(cè)接PEG(即，具有一個(gè)或一個(gè)以上側(cè)接到聚合物主鏈上的官能團(tuán)的PEG或相關(guān)聚合物)或其中具有可降解鍵的PEG。
PEG通常是透明的，無(wú)色，無(wú)味，可溶于水，對(duì)熱穩(wěn)定，對(duì)許多化學(xué)試劑呈惰性，不水解或退化且通常無(wú)毒。認(rèn)為聚(乙二醇)是生物相容的，也就是說(shuō)PEG能夠與生命組織或生物體共存而不引起危害。更具體來(lái)說(shuō)，PEG實(shí)質(zhì)上為非免疫原性的，也就是說(shuō)PEG不傾向于在體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)。當(dāng)與體內(nèi)具有某種所需功能的分子(諸如生物活性劑)連接時(shí)，PEG傾向于遮蔽所述試劑且可減少或消除任何免疫反應(yīng)，從而使有機(jī)體可耐受所述試劑的存在。PEG結(jié)合物不傾向于產(chǎn)生實(shí)質(zhì)免疫反應(yīng)或引起凝固或其它不合需要的作用。具有式-CH2CH2O-(CH2GH2O)n-CH2CH2-(其中n為約3到約4000，通常約20到約2000)的PEG適用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，分子量為約800Da到約100,000Da的PEG尤其適用作聚合物主鏈。PEG的分子量可具有寬范圍，包括(但不限于)介于約100Da與約100,000Da或100,000Da以上之間。PEG的分子量可介于約100Da與約100,000Da之間，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200D以及100Da。在一些實(shí)施例中，PEG的分子量介于約100Da與50,000Da之間。在一些實(shí)施例中，PEG的分子量介于約100Da與40,000Da之間。在一些實(shí)施例中，PEG的分子量介于約1,000Da與40,000Da之間。在一些實(shí)施例中，PEG的分子量介于約5,000Da與40,000Da之間。在一些實(shí)施例中，PEG的分子量介于約10,000Da與40,000Da之間。
聚合物主鏈可為線性或分支的。所屬領(lǐng)域中通常已知分支聚合物主鏈。分支聚合物通常具有一個(gè)中心分支核心部分和與所述中心分支核心連接的多個(gè)線性聚合物鏈。PEG通常以可通過(guò)將氧化乙烯添加到各種多元醇(諸如甘油、甘油寡聚物、季戊四醇以及山梨糖醇)中制備的分支形式使用。中心分支部分也可源自多種氨基酸，諸如賴氨酸。分支聚(乙二醇)可以一般形式R(-PEG-OH)m(其中R源自核心部分，諸如甘油、甘油寡聚物或季戊四醇；且m表示臂的數(shù)目)表示。也可使用多臂PEG分子作為聚合物主鏈，諸如美國(guó)專(zhuān)利第5,932,462號(hào)、第5,643,575號(hào)、第5,229,490號(hào)、第4,289,872號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)文件第2003/0143596號(hào)；WO 96/21469和WO 93/21259中所述的多臂PEG分子，所述專(zhuān)利各自以全文引用的方式并入本文中。
分支PEG也可呈由PEG(-YCHZ2)n(其中Y為連接基團(tuán)且Z為經(jīng)由規(guī)定長(zhǎng)度的原子鏈連接于CH的經(jīng)活化末端基)表示的叉狀PEG形式。
另一種分支形式側(cè)接PEG沿PEG主鏈而不是在PEG鏈的末端處具有諸如羧基等反應(yīng)性基團(tuán)。
除這些PEG形式外，也可制備主鏈中具有弱或可降解鍵的聚合物。舉例來(lái)說(shuō)，可制備聚合物主鏈中具有經(jīng)受水解作用的酯鍵的PEG。如下所示，這一水解作用引起聚合物裂解成較低分子量的片段 -PEG-CO2-PEG-+H2O→PEG-CO2H+HO-PEG-。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員應(yīng)了解，術(shù)語(yǔ)聚(乙二醇)或PEG表示或包括所屬領(lǐng)域中已知的所有形式，包括(但不限于)本文中所公開(kāi)的這些形式。
許多其它聚合物也適用于本發(fā)明。在一些實(shí)施例中，具有2到約300個(gè)末端的水可溶性聚合物主鏈尤其適用于本發(fā)明。合適的聚合物的實(shí)例包括(但不限于)其它聚(烷二醇)(諸如聚(丙二醇)(“PPG”))、其共聚物(包括(但不限于)乙二醇與丙二醇的共聚物)、其三聚物、其混合物等。雖然聚合物主鏈的各鏈的分子量可不同，但其通常在約800Da到約100,000Da、通常約6,000Da到約80,000Da的范圍內(nèi)。聚合物主鏈的各鏈的分子量可介于約100Da與約100,000Da之間，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da,65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da，25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da,300Da、200Da以及100Da。在一些實(shí)施例中，聚合物主鏈的各鏈的分子量介于約100Da與50,000Da之間。在一些實(shí)施例中，聚合物主鏈的各鏈的分子量介于約100Da與40,000Da之間。在一些實(shí)施例中，聚合物主鏈的各鏈的分子量介于約1,000Da與40,000Da之間。在一些實(shí)施例中，聚合物主鏈的各鏈的分子量介于約5,000Da與40,000Da之間。在一些實(shí)施例中，聚合物主鏈的各鏈的分子量介于約10,000Da與40,000Da之間。
所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，實(shí)質(zhì)上水溶性主鏈的上述清單無(wú)論如何不是詳盡的且僅是說(shuō)明性的，且預(yù)期具有上述質(zhì)量的所有聚合材料都適用于本發(fā)明中。
在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，聚合物衍生物為“多官能”的，意思是所述聚合物主鏈具有至少兩個(gè)經(jīng)官能團(tuán)官能化或活化的末端且可能具有多達(dá)約300個(gè)所述末端。多官能聚合物衍生物包括(但不限于)具有兩個(gè)末端的線性聚合物，其中各末端與可相同或不同的官能團(tuán)鍵結(jié)。
在一個(gè)實(shí)施例中，聚合物衍生物具有如下結(jié)構(gòu) X-A-POLY-B-N＝N＝N， 其中 N＝N＝N為疊氮部分； B為可存在或不存在的連接部分； POLY為水可溶性非抗原性聚合物； A為可存在或不存在且可與B相同或不同的連接部分；且 X為第二官能團(tuán)。
A和B的連接部分的實(shí)例包括(但不限于)含有至多18個(gè)且可含有1-10個(gè)碳原子的多官能烷基。烷基鏈中可包括諸如氮、氧或硫等雜原子。烷基鏈也可在雜原子處分支。A和B的連接部分的其它實(shí)例包括(但不限于)含有至多10個(gè)且可含有5-6個(gè)碳原子的多官能芳基。芳基的一個(gè)或一個(gè)以上碳原子可經(jīng)氮、氧或硫原子取代。合適連接基團(tuán)的其它實(shí)例包括美國(guó)專(zhuān)利第5,932,462號(hào)、第5,643,575號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)文獻(xiàn)2003/0143596中所述的連接基團(tuán)，所述專(zhuān)利以引用的方式并入本文中。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，連接部分的上述清單無(wú)論如何不是詳盡的且僅是說(shuō)明性的，且預(yù)期具有上述質(zhì)量的所有連接部分都適用于本發(fā)明中。
適用作X的官能團(tuán)的實(shí)例包括(但不限于)羥基、經(jīng)保護(hù)羥基、烷氧基、諸如N-羥基琥珀酰亞胺酯和1-苯并三唑酯等活性酯、諸如N-羥基琥珀酰亞胺碳酸酯和1-苯并三唑碳酸酯等活性碳酸酯、縮醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、經(jīng)保護(hù)胺、酰肼、經(jīng)保護(hù)酰肼、經(jīng)保護(hù)硫醇、羧酸、經(jīng)保護(hù)羧酸、異氰酸酯、異硫代氰酸酯、馬來(lái)酰亞胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘代乙酰胺、環(huán)氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟甲磺酸酯、烯烴、酮以及疊氮化物。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所了解，所選擇的X部分應(yīng)與疊氮基相容以便不發(fā)生與疊氮基的反應(yīng)。含疊氮基的聚合物衍生物可具有同雙官能性，意思是第二官能團(tuán)(即，X)也是疊氮部分；或具有異雙官能性，意思是第二官能團(tuán)是不同的官能團(tuán)。
術(shù)語(yǔ)“經(jīng)保護(hù)”是指存在防止化學(xué)反應(yīng)性官能團(tuán)在某些反應(yīng)條件下反應(yīng)的保護(hù)基或保護(hù)部分。保護(hù)基將視所保護(hù)的化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)的類(lèi)型而改變。舉例來(lái)說(shuō)，如果化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)是胺或酰肼，那么保護(hù)基可選自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群組。如果化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)是硫醇，那么保護(hù)基可為鄰吡啶基二硫化物。如果化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)是諸如丁酸或丙酸等羧酸或羥基，那么保護(hù)基可為苯甲基或諸如甲基、乙基或叔丁基等烷基。所屬領(lǐng)域中已知的其它保護(hù)基也可用于本發(fā)明中。
文獻(xiàn)中的末端官能團(tuán)的特定實(shí)例包括(但不限于)N-琥珀酰亞胺碳酸酯(例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第5,281,698號(hào)、第5,468,478號(hào))、胺(例如參見(jiàn)Buckmann等人，Makromol.Chem.1821379(1981)；Zalipsky等人，Eur.Polym.J.191177(1983))、酰肼(例如參見(jiàn)Andresz等人，Makromol.Chem.179301(1978))、琥珀酰亞胺丙酸酯和琥珀酰亞胺丁酸酯(例如參見(jiàn)Olson等人，Poly(ethylene glycol)Chemistry&BiologicalApplications，第170-181頁(yè)，Harris和Zalipsky編，ACS，Washington，D.C.，1997；也參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第5,672,662號(hào))、琥珀酰亞胺琥珀酸酯(例如參見(jiàn)Abuchowski等人，CancerBiochem.Biophys.7175(1984)和Joppich等人，Makromol.Chem.1801381(1979))、琥珀酰亞胺酯(例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第4,670,417號(hào))、苯并三唑碳酸酯(例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第5,650,234號(hào))、縮水甘油醚(例如參見(jiàn)Pitha等人，Eur.J Biochem.9411(1979)；Elling等人，Biotech.Appl.Biochem.13354(1991))、氧羰基咪唑(例如參見(jiàn)，Beauchamp等人，Anal.Biochem.13125(1983)；Tondelli等人，J.Controlled Release1251(1985))、對(duì)硝基苯基碳酸酯(例如參見(jiàn)Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech.，11141(1985)和Sartore等人，Appl.Biochem.Biotech.，2745(1991))、醛(例如參見(jiàn)Harris等人，J.Polym.Sci.Chem.Ed.22341(1984)；美國(guó)專(zhuān)利第5,824,784號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利第5,252,714號(hào))、馬來(lái)酰亞胺(例如參見(jiàn)Goodson等人，Biotechnology(NY)8343(1990)；Romani等人，Chemistry of Peptides and Proteins 229(1984)以及Kogan，Synthetic Comm.222417(1992))、鄰吡啶基二硫化物(例如參見(jiàn)Woghiren等人，Bioconj.Chem.4314(1993))、丙烯醇(例如參見(jiàn)，Sawhney等人，Macromolecules，26581(1993))、乙烯砜(例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第5,900,461號(hào))。上述所有參考文獻(xiàn)和專(zhuān)利都以引用的方式并入本文中。
在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，本發(fā)明的聚合物衍生物包含具有如下結(jié)構(gòu)的聚合物主鏈 X-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-N＝N＝N， 其中 X為如上所述的官能團(tuán)；且 n為約20到約4000。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的聚合物衍生物包含具有如下結(jié)構(gòu)的聚合物主鏈 X-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-W-N＝N＝N， 其中 W為包含1-10個(gè)碳原子的脂肪族或芳香族連接部分； n為約20到約4000；且 X為如上所述的官能團(tuán)。m介于1與10之間。
本發(fā)明的含疊氮基的PEG衍生物可通過(guò)所屬領(lǐng)域中已知和/或本文中所公開(kāi)的多種方法制備。在下文所示的一種方法中，使平均分子量為約800Da到約100,000Da的水溶性聚合物主鏈(所述聚合物主鏈具有與第一官能團(tuán)鍵結(jié)的第一末端和與合適離去基鍵結(jié)的第二末端)與疊氮陰離子(其可與許多合適的平衡離子(包括鈉、鉀、叔丁基銨等)中的任一種配對(duì))反應(yīng)。離去基經(jīng)歷親核置換且由所述疊氮部分置換，從而得到所需的含疊氮基的PEG聚合物。
X-PEG-L+N3-→X-PEG-N3。
如上所示，適用于本發(fā)明的聚合物主鏈具有式X-PEG-L，其中PEG為聚(乙二醇)且X為不與疊氮基反應(yīng)的官能團(tuán)且L為合適離去基。合適官能團(tuán)的實(shí)例包括(但不限于)羥基、經(jīng)保護(hù)羥基、縮醛、烯基、胺、氨氧基、經(jīng)保護(hù)胺、經(jīng)保護(hù)酰肼、經(jīng)保護(hù)硫醇、羧酸、經(jīng)保護(hù)羧酸、馬來(lái)酰亞胺、二硫代吡啶和乙烯基吡啶以及酮。合適離去基的實(shí)例包括(但不限于)氯離子、溴離子、碘離子、甲磺酸酯基、三氟乙磺酸酯基以及甲苯磺酸酯基。
在另一種制備本發(fā)明的含疊氮基的聚合物衍生物的方法中，使具有疊氮官能團(tuán)的連接劑與平均分子量為約800Da到約100,000Da的水溶性聚合物主鏈接觸，其中連接劑具有將與PEG聚合物上的化學(xué)官能團(tuán)選擇性反應(yīng)的化學(xué)官能團(tuán)，以形成通過(guò)連接基團(tuán)使疊氮基與聚合物主鏈分隔開(kāi)的含疊氮基的聚合物衍生物產(chǎn)物。
例示性反應(yīng)流程如下所示 X-PEG-M+N-連接子-N＝N＝N→PG-X-PEG-連接子-N＝N＝N， 其中 PEG為聚(乙二醇)且X為諸如烷氧基等封端基團(tuán)或如上所述的官能團(tuán)；且 M為不與疊氮官能團(tuán)反應(yīng)但將與N官能團(tuán)有效且選擇性地反應(yīng)的官能團(tuán)。
合適官能團(tuán)的實(shí)例包括(但不限于)如果N為胺，那么M為羧酸、碳酸酯或活性酯；如果N為酰肼或氨氧基部分，那么M為酮；如果N為親核體，那么M為離去基。
粗產(chǎn)物的純化可通過(guò)已知方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述方法包括(但不限于)使產(chǎn)物沉淀，必要時(shí)接著進(jìn)行色譜法。
以下展示在PEG二胺情況下的更特定實(shí)例，其中一個(gè)胺經(jīng)諸如叔丁基-Boc等保護(hù)基部分保護(hù)且使所得經(jīng)單保護(hù)的PEG二胺與具有疊氮官能團(tuán)的連接部分反應(yīng) BocHN-PEG-NH2+HO2C-(CH2)3-N＝N＝N。
在這種情況下，可使用諸如亞硫酰氯或碳二亞胺試劑和N-羥基琥珀酰亞胺或N-羥基苯并三唑等多種活化劑使胺基與羧酸基團(tuán)偶合以在單胺PEG衍生物與具有疊氮基的連接部分之間產(chǎn)生酰胺鍵。在成功形成酰胺鍵后，所得經(jīng)N-叔丁基-Boc保護(hù)的含疊氮基的衍生物可直接用于修飾生物活性分子，或其可進(jìn)一步經(jīng)精細(xì)修飾以安裝其它適用的官能團(tuán)。舉例來(lái)說(shuō)，可通過(guò)用強(qiáng)酸處理使N-t-Boc基團(tuán)水解以產(chǎn)生Ω-氨基-PEG-疊氮化物。可使用所得胺作為合成手柄(synthetic handle)來(lái)安裝諸如馬來(lái)酰亞胺基、經(jīng)活化二硫化物、活性酯等其它適用的官能團(tuán)以產(chǎn)生有價(jià)值的異雙官能性試劑。
當(dāng)希望使不同分子與聚合物的各末端連接時(shí)，異雙官能性衍生物尤其適用。舉例來(lái)說(shuō)，Ω-N-氨基-N-疊氮基PEG將允許具有諸如醛、酮、活性酯、活性碳酸酯等活性親電子基團(tuán)的分子與PEG的一個(gè)末端連接，且將允許具有乙炔基團(tuán)的分子與PEG的另一末端連接。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，聚合物衍生物具有如下結(jié)構(gòu) X-A-POLY-B-C≡C-R， 其中 R可為H或烷基、烯基、烷氧基或芳基或經(jīng)取代芳基； B為可存在或不存在的連接部分； POLY為水可溶性非抗原性聚合物； A為可存在或不存在且可與B相同或不同的連接部分；且 X為第二官能團(tuán)。
A和B的連接部分的實(shí)例包括(但不限于)含有至多18個(gè)且可含有1-10個(gè)碳原子的多官能烷基。烷基鏈中可包括諸如氮、氧或硫等雜原子。烷基鏈也可在雜原子處分支。A和B的連接部分的其它實(shí)例包括(但不限于)含有至多10個(gè)且可含有5-6個(gè)碳原子的多官能芳基。芳基的一個(gè)或一個(gè)以上個(gè)碳原子原子可經(jīng)氮、氧或硫原子取代。合適連接基團(tuán)的其它實(shí)例包括美國(guó)專(zhuān)利第5,932,462號(hào)和第5,643,575號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)文獻(xiàn)2003/0143596中所述的連接基團(tuán)，所述專(zhuān)利以引用的方式并入本文中。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，連接部分的上述清單無(wú)論如何不是詳盡的且打算僅是說(shuō)明性的，且預(yù)期具有上述質(zhì)量的多種連接部分都適用于本發(fā)明中。
適用作X的官能團(tuán)的實(shí)例包括羥基、經(jīng)保護(hù)羥基、烷氧基、諸如N-羥基琥珀酰亞胺酯和1-苯并三唑酯等活性酯、諸如N-羥基琥珀酰亞胺碳酸酯和1-苯并三唑碳酸酯等活性碳酸酯、縮醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、經(jīng)保護(hù)胺、酰肼、經(jīng)保護(hù)酰肼、經(jīng)保護(hù)硫醇、羧酸、經(jīng)保護(hù)羧酸、異氰酸酯、異硫代氰酸酯、馬來(lái)酰亞胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘代乙酰胺、環(huán)氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟甲磺酸酯、烯烴、酮以及乙炔。應(yīng)了解，所選擇的X部分應(yīng)與乙炔基相容以致不發(fā)生與乙炔基的反應(yīng)。含乙炔的聚合物衍生物可具有同雙官能性，意思是第二官能團(tuán)(即，X)也是乙炔部分；或具有異雙官能性，意思是第二官能團(tuán)是不同的官能團(tuán)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，聚合物衍生物包含具有如下結(jié)構(gòu)的聚合物主鏈 X-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-C≡CH， 其中 X為如上所述的官能團(tuán)； n為約20到約4000；且 m介于1與10之間。
各異雙官能性PEG聚合物的實(shí)例如下所示。
本發(fā)明的含乙炔的PEG衍生物可使用所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所已和/或本文中所公開(kāi)的方法制備。在一種方法中，使平均分子量為約800Da到約100,000Da的水溶性聚合物主鏈(所述聚合物主鏈具有與第一官能團(tuán)鍵結(jié)的第一末端和與合適親核基團(tuán)鍵結(jié)的第二末端)與具有乙炔官能團(tuán)和適于與PEG上的親核基團(tuán)反應(yīng)的離去基的化合物反應(yīng)。當(dāng)使具有親核部分的PEG聚合物和具有離去基的分子組合時(shí)，離去基經(jīng)歷親核置換且由所述親核部分置換，從而產(chǎn)生所需含乙炔的聚合物。
X-PEG-Nu+L-A-C→X-PEG-Nu-A-C≡CR′。
如上所示，用于反應(yīng)中的優(yōu)選聚合物主鏈具有式X-PEG-Nu，其中PEG為聚(乙二醇)，Nu為親核部分且X為不與Nu、L或乙炔官能團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)。
Nu的實(shí)例包括(但不限于)將主要經(jīng)由SN2型機(jī)理反應(yīng)的氨基、烷氧基、芳氧基、巰基、亞氨基、羰酸酯基、酰肼基、氨氧基。Nu基的其它實(shí)例包括將主要經(jīng)由親核加成反應(yīng)來(lái)反應(yīng)的官能團(tuán)。L基團(tuán)的實(shí)例包括氯離子、溴離子、碘離子、甲磺酸酯基、三氟乙磺酸酯基和甲苯磺酸酯基和預(yù)期經(jīng)歷親核置換的其它基團(tuán)以及酮、醛、硫酯、烯烴、a-β不飽和羰基、碳酸酯基和預(yù)期經(jīng)歷親核體加成的其它親電子基團(tuán)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，A為具有1-10個(gè)碳原子的脂肪族連接子或具有6-14個(gè)碳原子的經(jīng)取代芳環(huán)。X為不與疊氮基反應(yīng)的官能團(tuán)；且L為合適離去基。
在另一種制備本發(fā)明的含乙炔的聚合物衍生物的方法中，使平均分子量為約800Da到約100,000Da的在一個(gè)末端具有經(jīng)保護(hù)官能團(tuán)或封端劑且在另一個(gè)末端具有合適離去基的PEG聚合物與乙炔陰離子接觸。
例示性反應(yīng)流程如下所示 X-PEG-L+-OCR′→X-PEG-OCR′， 其中 PEG為聚(乙二醇)且X為諸如烷氧基等封端基或如上所述的官能團(tuán)；且 R′為H、烷基、烷氧基、芳基或芳氧基或經(jīng)取代烷基、烷氧基、芳基或芳氧基。
在上述實(shí)例中，離去基L應(yīng)具有足夠反應(yīng)性以在與足夠濃度的乙炔陰離子接觸時(shí)經(jīng)歷SN2型置換。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知由乙炔陰離子對(duì)離去基進(jìn)行SN2置換所需的反應(yīng)條件。
粗產(chǎn)物的純化通?？赏ㄟ^(guò)所屬領(lǐng)域中已知的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述方法包括(但不限于)使產(chǎn)物沉淀，必要時(shí)接著進(jìn)行色譜法。
水溶性聚合物可與本發(fā)明的hPP或hA或hFc多肽連接。水溶性聚合物可經(jīng)由并入hPP或hA或hFc多肽中的非天然編碼氨基酸或非天然編碼或天然編碼氨基酸的任何官能團(tuán)或取代基或添加到非天然編碼或天然編碼氨基酸中的任何官能團(tuán)或取代基連接?；蛘?，水溶性聚合物經(jīng)由天然存在氨基酸(包括(但不限于)半胱氨酸、賴氨酸或N-末端殘基的氨基)與并入非天然編碼氨基酸中的hPP或hA或hFc多肽連接。在一些情況下，本發(fā)明的hPP或hA或hFc多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)非天然氨基酸，其中一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物(包括(但不限于)PEG和/或寡糖)連接。在一些情況下，本發(fā)明的hPP或hA或hFc多肽進(jìn)一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)或10個(gè)以上與水溶性聚合物連接的天然編碼氨基酸。在一些情況下，本發(fā)明的hPP或hA或hFc多肽包含一個(gè)或一個(gè)以上與水溶性聚合物連接的非天然編碼氨基酸和一個(gè)或一個(gè)以上與水溶性聚合物連接的天然存在氨基酸。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明中所使用的水溶性聚合物相對(duì)于非結(jié)合形式增加hPP或hA或hFc多肽的血清半衰期。
可調(diào)整與本發(fā)明的hPP或hA或hFc多肽連接的水溶性聚合物的數(shù)目(即，聚乙二醇化或糖基化程度)以提供改變的(包括(但不限于)增加或減小的)藥理學(xué)、藥物動(dòng)力學(xué)或藥效特征，諸如活體內(nèi)半衰期。在一些實(shí)施例中，hPP或hA或hFc的半衰期比未經(jīng)修飾的多肽增加至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、50倍或至少約100倍。
含強(qiáng)親核基團(tuán)(即，酰肼、肼、羥胺或氨基脲)的PEG衍生物 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，用含有直接與PEG主鏈連接的末端肼、羥胺、酰肼或氨基脲部分的PEG衍生物修飾包含含羰基的非天然編碼氨基酸的hPP或hA或hFc多肽。
在一些實(shí)施例中，羥胺末端PEG衍生物將具有如下結(jié)構(gòu) RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2， 其中R為簡(jiǎn)單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之間)。
在一些實(shí)施例中，含肼或含酰肼的PEG衍生物將具有如下結(jié)構(gòu) RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X-NH-NH2， 其中R為簡(jiǎn)單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000且X視情況為可存在或不存在的羰基(C＝O)。
在一些實(shí)施例中，含氨基脲的PEG衍生物將具有如下結(jié)構(gòu) RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2， 其中R為簡(jiǎn)單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，用含有借助于酰胺鍵與PEG主鏈連接的末端羥胺、酰肼、肼或氨基脲部分的PEG衍生物修飾包含含羰基的氨基酸的hPP或hA或hFc多肽。
在一些實(shí)施例中，羥胺末端PEG衍生物具有如下結(jié)構(gòu) RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-O-NH2， 其中R為簡(jiǎn)單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之間)。
在一些實(shí)施例中，含肼或含酰肼的PEG衍生物具有如下結(jié)構(gòu) RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-X-NH-NH2， 其中R為簡(jiǎn)單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10，n為100-1,000且X視情況為可存在或不存在的羰基(C＝O)。
在一些實(shí)施例中，含氨基脲的PEG衍生物具有如下結(jié)構(gòu) RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2， 其中R為簡(jiǎn)單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，用含有末端肼、羥胺、酰肼或氨基脲部分的分支PEG衍生物修飾包含含羰基的氨基酸的hPP或hA或hFc多肽，其中分支PEG的各鏈具有介于10-40kDa范圍內(nèi)且可為5-20kDa的MW。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，用具有分支結(jié)構(gòu)的PEG衍生物修飾包含非天然編碼氨基酸的hPP或hA或hFc多肽。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施例中，肼或酰肼末端PEG衍生物將具有如下結(jié)構(gòu) [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-NH-NH2， 其中R為簡(jiǎn)單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000，且X視情況為可存在或不存在的羰基(C＝O)。
在一些實(shí)施例中，含有氨基脲基的PEG衍生物將具有如下結(jié)構(gòu) [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2， 其中R為簡(jiǎn)單烷基(甲基、乙基、丙基等)，X視情況為NH、O、S、C(O)或不存在，m為2-10且n為100-1,000。
在一些實(shí)施例中，含有羥胺基的PEG衍生物將具有如下結(jié)構(gòu) [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2， 其中R為簡(jiǎn)單烷基(甲基、乙基、丙基等)，X視情況為NH、O、S、C(O)或不存在，m為2-10且n為100-1,000。
水溶性聚合物與hPP或hA多肽連接的程度和位點(diǎn)可調(diào)節(jié)hPP或hA或hFc多肽與hPP或hA或hFc多肽受體結(jié)合搭配物的結(jié)合。在一些實(shí)施例中，鍵是經(jīng)安置以使hPP或hA或hFc多肽以如通過(guò)平衡結(jié)合檢定(諸如Spencer等人，J.Biol.Chem.，2637862-7867(1988)中所述的檢定)所測(cè)量約400nM或400nM以下的Kd、以150nM或150nM以下的Kd且在一些情況下以100nM或100nM以下的Kd結(jié)合hPP或hA多肽受體或結(jié)合搭配物。
聚合物激活以及肽結(jié)合的方法和化學(xué)是描述于文獻(xiàn)中且在所屬領(lǐng)域中為已知的。聚合物激活的常用方法包括(但不限于)用溴化氰、高碘酸鹽、戊二醛、二環(huán)氧化物(biepoxide)、氯甲代氧丙環(huán)(epichlorohydrin)、二乙烯基砜(divinylsulfone)、碳二亞胺、磺酰鹵、三氯三嗪等激活官能團(tuán)<參見(jiàn)R.F.Taylor，(1991)，ProteinImmobilisation.Fundamental and Applications，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking，CRC Press，Boca Raton；G.T.Hermanson等人，(1993)，Immobilized Affinity Ligand Techniques，Academic Press，N.Y.；Dunn，R.L.等人編，POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，ACS Symposium Series，第469卷，American Chemical Society，Washington，D.C.1991)。
可利用若干關(guān)于PEG的官能化和結(jié)合的綜述和專(zhuān)題論文。例如參見(jiàn)Harris，Macromol.Chem.Phys.C25325-373(1985)；Scouten，Methods in Enzymology 13530-65(1987)；Wong等人，Enzyme Microb.Technol.14866-874(1992)；Delgado等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6150-165(1995)。
關(guān)于聚合物激活的方法也可見(jiàn)于WO 94/17039、美國(guó)專(zhuān)利第5,324,844號(hào)、WO94/18247、WO 94/04193、美國(guó)專(zhuān)利第5,219,564號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利第5,122,614號(hào)、WO90/13540、美國(guó)專(zhuān)利第5,281,698號(hào)以及WO 93/15189中，且關(guān)于經(jīng)活化聚合物與酶之間的結(jié)合的方法可見(jiàn)于以下對(duì)應(yīng)不同酶的參考文獻(xiàn)中，所述酶包括(但不限于)凝血因子VIII(WO 94/15625)、血紅蛋白(WO 94/09027)、載氧分子(美國(guó)專(zhuān)利第4,412,989號(hào))、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人，App.Biochem.Biotech.11141-52(1985))。所引用的所有參考文獻(xiàn)和專(zhuān)利都以引用的方式并入本文中。
通過(guò)任何便利方法來(lái)進(jìn)行含有諸如對(duì)疊氮基-L-苯丙氨酸等非天然編碼氨基酸的hPP或hA或hFc多肽的聚乙二醇化(即，添加任何水溶性聚合物)。舉例來(lái)說(shuō)，用經(jīng)炔封端的mPEG衍生物使hPP或hA或hFc多肽聚乙二醇化。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，在室溫下在攪拌下向含有對(duì)疊氮基-L-苯丙氨酸的hPP或hA或hFc多肽中添加過(guò)量固體mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH。通常，用具有接近進(jìn)行反應(yīng)的pH值(通常約pH4-10)的pKa的緩沖劑緩沖水溶液。例如，適于在pH7.5下聚乙二醇化的緩沖劑的實(shí)例包括(但不限于)HEPES、磷酸鹽、硼酸鹽、TRIS-HCl、EPPS以及TES。連續(xù)監(jiān)測(cè)pH值且必要時(shí)進(jìn)行調(diào)整。通常使反應(yīng)繼續(xù)約1-48小時(shí)。
隨后，使反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)受疏水性相互作用色譜，以使聚乙二醇化hPP或hA或hFc多肽變異體與游離mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH以及當(dāng)在分子的兩端使未阻斷PEG活化從而使hPP或hA或hFc多肽變異體分子交聯(lián)時(shí)可形成的聚乙二醇化hPP或hA或hFc多肽的任何高分子量復(fù)合物分離。疏水性相互作用色譜期間的條件使得游離mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH流經(jīng)色譜柱，而任何經(jīng)交聯(lián)的聚乙二醇化hPP或hA或hFc多肽變異體復(fù)合物在含有一個(gè)與一個(gè)或一個(gè)以上PEG基團(tuán)結(jié)合的hPP或hA或hFc多肽變異體分子的所需形式之后洗提。合適條件視交聯(lián)復(fù)合物相對(duì)于所需結(jié)合物的相對(duì)大小而改變，且可由所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員容易地確定。通過(guò)超濾來(lái)濃縮含有所需結(jié)合物的洗提液且通過(guò)滲濾使其脫鹽。
必要時(shí)，可通過(guò)所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的一個(gè)或一個(gè)以上程序進(jìn)一步純化由疏水性色譜獲得的聚乙二醇化hPP或hA或hFc多肽，所述程序包括(但不限于)親和色譜；陰離子或陽(yáng)離子交換色譜(使用包括(但不限于)DEAE瓊脂糖凝膠)；二氧化硅色譜；逆相HPLC；凝膠過(guò)濾(使用包括(但不限于)SEPHADEX G-75)；疏水性相互作用色譜；尺寸排阻色譜；金屬螯合物色譜；超濾/滲濾；乙醇沉淀；硫酸銨沉淀；色譜聚焦；置換色譜；電泳程序(包括(但不限于)制備型等電位聚焦)；差異溶解性(包括(但不限于)硫酸銨沉淀)；或萃取。表觀分子量可由GPC通過(guò)與球狀蛋白標(biāo)準(zhǔn)物比較來(lái)估算(Preneta，AZ in Protein purification methods，a practicalapproach(Harris和Angal編)IRL Press 1989，293-306)。hPP或hA-PEG結(jié)合物的純度可通過(guò)蛋白水解降解(包括(但不限于)胰蛋白酶裂解)，接著質(zhì)譜分析來(lái)評(píng)定。Pepinsky RB.等人，J.Pharmcoh&Exp.Ther.297(3)1059-66(2001)。
與本發(fā)明的hPP或hA或hFc多肽的氨基酸連接的水溶性聚合物可進(jìn)一步不受限制地衍生或經(jīng)取代。
含疊氮基的PEG衍生物 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，用含有疊氮部分的PEG衍生物修飾hPP或hA或hFc多肽，所述疊氮部分將與非天然編碼氨基酸側(cè)鏈上所存在的炔部分反應(yīng)。一般來(lái)說(shuō)，PEG衍生物將具有介于1-100kDa范圍內(nèi)且在一些實(shí)施例中介于10-40kDa范圍內(nèi)的平均分子量。
在一些實(shí)施例中，疊氮末端PEG衍生物將具有如下結(jié)構(gòu) RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3， 其中R為簡(jiǎn)單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之間)。
在另一實(shí)施例中，疊氮末端PEG衍生物將具有如下結(jié)構(gòu) RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-N3， 其中R為簡(jiǎn)單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10，p為2-10且n為100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之間)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，用含有末端疊氮部分的分支PEG衍生物修飾包含含炔的氨基酸的hPP或hA或hFc多肽，其中分支PEG的各鏈具有介于10-40kDa范圍內(nèi)且可為5-20kDa的MW。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施例中，疊氮末端PEG衍生物將具有如下結(jié)構(gòu) [RO-(CH2CH2O)n-0-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pN3， 其中R為簡(jiǎn)單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10，p為2-10，且n為100-1.000且X視情況為O、N、S或羰基(C＝O)，在各情況下，X都可存在或不存在。
含炔的PEG衍生物 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，用含有炔部分的PEG衍生物修飾hPP或hA或hFc多肽，所述炔部分將與非天然編碼氨基酸側(cè)鏈上所存在的疊氮部分反應(yīng)。
在一些實(shí)施例中，炔末端PEG衍生物將具有如下結(jié)構(gòu) RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-C≡CH， 其中R為簡(jiǎn)單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之間)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，用含有借助于酰胺鍵與PEG主鏈連接的末端疊氮部分或末端炔部分的PEG衍生物修飾包含含炔的非天然編碼氨基酸的hPP或hA或hFc多肽。
在一些實(shí)施例中，炔末端PEG衍生物將具有如下結(jié)構(gòu) RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-C≡CH， 其中R為簡(jiǎn)單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10，p為2-10且n為100-1,000。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，用含有末端炔部分的分支PEG衍生物修飾包含含疊氮基的氨基酸的hPP或hA或hFc多肽，其中分支PEG的各鏈具有介于10-40 kDa范圍內(nèi)且可為5-20kDa的MW。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施例中，炔末端PEG衍生物將具有如下結(jié)構(gòu) [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pC≡CH， 其中R為簡(jiǎn)單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10，p為2-10，且n為100-1,000且X視情況為O、N、S或羰基(C＝O)或不存在。
含膦的PEG衍生物 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，用含有進(jìn)一步包含將與非天然編碼氨基酸側(cè)鏈上所存在的疊氮部分反應(yīng)的芳基膦基團(tuán)的經(jīng)活化官能團(tuán)(包括(但不限于)酯、碳酸酯)的PEG衍生物修飾hPP或hA或hFc多肽。一般來(lái)說(shuō)，PEG衍生物將具有介于1-100kDa范圍內(nèi)且在一些實(shí)施例中介于10-40kDa范圍內(nèi)的平均分子量。
在一些實(shí)施例中，PEG衍生物將具有如下結(jié)構(gòu)
其中n為1-10；X可為O、N、S或不存在，Ph為苯基，且W為水溶性聚合物。
在一些實(shí)施例中，PEG衍生物將具有如下結(jié)構(gòu)
其中X可為O、N、S或不存在，Ph為苯基，W為水溶性聚合物，且R可為H、烷基、芳基、經(jīng)取代烷基和經(jīng)取代芳基。例示性R基團(tuán)包括(但不限于)-CH2、-C(CH3)3、-OR′、-NR′R″、-SR′、-鹵素、-C(O)R′、-CONR′R″、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-CN以及-NO2。R′、R″、R″′和R″″各自獨(dú)立地是指氫、經(jīng)取代或未經(jīng)取代雜烷基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代芳基(包括(但不限于)經(jīng)1-3個(gè)鹵素取代的芳基)、經(jīng)取代或未經(jīng)取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。例如，當(dāng)本發(fā)明的化合物包括一個(gè)以上R基團(tuán)時(shí)，R基團(tuán)是各自獨(dú)立地經(jīng)選擇，而當(dāng)存在R′、R″、 R″′和R″″基團(tuán)中的一個(gè)以上時(shí)，這些基團(tuán)同樣是各自獨(dú)立地經(jīng)選擇。當(dāng)R′和R″是連接到同一氮原子時(shí)，其可與氮原子組合形成5、6或7元環(huán)。舉例來(lái)說(shuō)，-NR′R″打算包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-嗎啉基。根據(jù)取代基的以上討論，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解術(shù)語(yǔ)“烷基”打算包括包括結(jié)合除氫基以外的基團(tuán)的碳原子的基團(tuán)，諸如鹵代烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和?；?包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
其它PEG衍生物和一般聚乙二醇化技術(shù) 例如，可與hPP或hA或hFc多肽連接的其它例示性PEG分子以及聚乙二醇化方法包括以下文獻(xiàn)中所述的分子和方法美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)文獻(xiàn)第2004/0001838號(hào)、第2002/0052009號(hào)、第2003/0162949號(hào)、第2004/0013637號(hào)、第2003/0228274號(hào)、第2003/0220447號(hào)、第2003/0158333號(hào)、第2003/0143596號(hào)、第2003/0114647號(hào)、第2003/0105275號(hào)、第2003/0105224號(hào)、第2003/0023023號(hào)、第2002/0156047號(hào)、第2002/0099133號(hào)、第2002/0086939號(hào)、第2002/0082345號(hào)、第2002/0072573號(hào)、第2002/0052430號(hào)、第2002/0040076號(hào)、第2002/0037949號(hào)、第2002/0002250號(hào)、第2001/0056171號(hào)、第2001/0044526號(hào)、第2001/0021763號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,646,110號(hào)、第5,824,778號(hào)、第5,476,653號(hào)、第5,219,564號(hào)、第5,629,384號(hào)、第5,736,625號(hào)、第4,902,502號(hào)、第5,281,698號(hào)、第5,122,614號(hào)、第5,473，034號(hào)、第5,516,673號(hào)、第5,382,657號(hào)、第6,552,167號(hào)、第6,610,281號(hào)、第6,515,100號(hào)、第6,461,603號(hào)、第6,436,386號(hào)、第6,214,966號(hào)、第5,990,237號(hào)、第5,900,461號(hào)、第5,739,208號(hào)、第5,672,662號(hào)、第5,446,090號(hào)、第5,808,096號(hào)、第5,612,460號(hào)、第5,324,844號(hào)、第5,252,714號(hào)、第6,420,339號(hào)、第6,201,072號(hào)、第6,451,346號(hào)、第6,306,821號(hào)、第5,559,213號(hào)、第5,747,646號(hào)、第5,834,594號(hào)、第5,849,860號(hào)、第5,980,948號(hào)、第6,004,573號(hào)、第6,129,912號(hào)；WO 97/32607；EP 229,108；EP 402,378；WO92/16555；WO 94/04193；WO 94/14758；WO 94/17039；WO 94/18247；WO 94/28024；WO 95/00162；WO 95/11924；WO 95/13090；WO 95/33490；WO 96/00080；WO97/18832；WO 98/41562；WO 98/48837；WO 99/32134；WO 99/32139；WO 99/32140；WO 96/40791；WO98/32466；WO 95/06058；EP 439 508；WO 97/03106；WO 96/21469；WO 95/13312；EP 921 131；WO 98/05363；EP 809 996；WO 96/41813；WO 96/07670；EP 605 963；EP 510 356；EP 400 472；EP 183 503以及EP 154 316；其以引用的方式并入本文中。本文中所述的任何PEG分子都可以任何形式使用，所述形式包括(但不限于)單鏈、分支鏈、多臂鏈、單官能、雙官能、多官能形式或其任何組合。
增強(qiáng)生物活性分子對(duì)hA的親和力 也可使各種生物活性分子與本發(fā)明的hA多肽融合以調(diào)節(jié)生物活性分子的半衰期或調(diào)節(jié)生物活性分子的另一性質(zhì)。在一些實(shí)施例中，使生物活性分子與本發(fā)明的hA多肽連接或融合以增強(qiáng)對(duì)內(nèi)源性結(jié)合搭配物的親和力。
舉例來(lái)說(shuō)，在一些情況下，制備生物活性分子和hA的重組融合物。例示性白蛋白結(jié)合序列包括(但不限于)來(lái)自鏈球菌蛋白G的白蛋白結(jié)合域(例如參見(jiàn)Makrides等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.277534-542(1996)；和sjolander等人，J.Immunol.Methods 201115-123(1997))或白蛋白結(jié)合肽，諸如在例如Dennis等人，J.Biol Chem.27735035-35043(2002)中所述的白蛋白結(jié)合肽。
在其它實(shí)施例中，用脂肪酸使本發(fā)明的生物活性分子?；?。在一些情況下，脂肪酸促進(jìn)與hA的結(jié)合。例如參見(jiàn)Kurtzhals等人，Biochem.J.312725-731(1995)。
在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的生物活性分子多肽直接與hA融合。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，也可使多種其它生物活性分子與本發(fā)明的其它hPP連接來(lái)調(diào)節(jié)與結(jié)合搭配物的結(jié)合。
X.hPP或hA或hFc多肽的糖基化 本發(fā)明包括并入一個(gè)或一個(gè)以上具有糖殘基的非天然編碼氨基酸的hPP或hA或hFc多肽。糖殘基可為天然殘基(包括(但不限于)N-乙?；咸前?或非天然殘基(包括(但不限于)3-氟半乳糖)。糖可通過(guò)N-或O-連接的糖苷鍵(包括(但不限于)N-乙?；肴樘?L-絲氨酸)或非天然鍵(包括(但不限于)肟或相應(yīng)C-或S-連接的糖苷)與非天然編碼氨基酸連接。
可在活體內(nèi)或活體外向hPP或hA或hFc多肽中添加糖(包括(但不限于)糖基)部分。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，用由氨氧基衍生的糖修飾包含含羰基的非天然編碼氨基酸的hPP或hA或hFc多肽以產(chǎn)生經(jīng)由肟鍵連接的相應(yīng)糖基化多肽。在糖與非天然編碼氨基酸連接后，可通過(guò)用糖基轉(zhuǎn)移酶和其它酶處理來(lái)進(jìn)一步精細(xì)修飾糖以產(chǎn)生與hPP或hA或hFc多肽結(jié)合的寡糖。例如參見(jiàn)H.Liu，等人，J.Am.Chem.Soc.1251702-1703(2003)。
在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，直接用以氨氧基衍生物形式制備的具有預(yù)定結(jié)構(gòu)的聚糖修飾包含含羰基的非天然編碼氨基酸的hPP或hA或hFc多肽。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可使用包括疊氮、炔、酰肼、肼和氨基脲的其它官能團(tuán)使糖與非天然編碼氨基酸連接。
在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，然后可通過(guò)包括(但不限于)休斯根[3+2]環(huán)加成反應(yīng)分別用包括(但不限于)炔基或疊氮衍生物修飾包含含疊氮或炔基的非天然編碼氨基酸的hPP或hA或hFc多肽。這種方法允許以極高選擇性修飾蛋白質(zhì)。
XI.測(cè)量生物活性分子活性 無(wú)論使用什么方法來(lái)產(chǎn)生hPP或hA或hFc，都使hPP或hA或hFc經(jīng)受生物活性檢定。適當(dāng)時(shí)，可進(jìn)行氚化胸腺嘧啶檢定來(lái)確定細(xì)胞分裂的程度。然而，可使用其它生物檢定來(lái)確定所需活性。諸如測(cè)量抑制抗原的生物活性(諸如酶促、增生性或代謝活性)的能力的生物檢定也提供hPP或hFc活性的指示?？墒褂闷渌铙w外檢定來(lái)確定生物活性。一般來(lái)說(shuō)，生物活性的測(cè)試應(yīng)提供對(duì)所需結(jié)果的分析，視抗原的生物活性的情況而定，諸如生物活性的增加或減小(與未改變的hPP或hFc相比)、不同生物活性(乳與未改變的hPP或hFc相比)、受體或結(jié)合搭配物的親和力分析、hPP或hFc本身或結(jié)合搭配物的構(gòu)象或結(jié)構(gòu)變化(與未改變的hPP或hFc相比)或血清半衰期分析。
關(guān)于檢定方法學(xué)的參考文獻(xiàn)的上述匯編并不詳盡，且所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將認(rèn)可適用于測(cè)試所需最終結(jié)果的其它檢定。
XIII.測(cè)量效價(jià)、功能性活體內(nèi)半衰期和藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù) 本發(fā)明的一個(gè)重要方面是通過(guò)在使多肽與水溶性聚合物部分結(jié)合或不結(jié)合的情況下構(gòu)筑hPP或hA或hFc多肽獲得的延長(zhǎng)的生物半衰期。hPP或hA或hFc多肽血清濃度的快速降低使得評(píng)估對(duì)用結(jié)合和未結(jié)合hPP或hA或hFc多肽和其變異體進(jìn)行治療的生物反應(yīng)變得重要。本發(fā)明的結(jié)合和未結(jié)合hPP或hA或hFc多肽和其變異體在皮下或靜脈內(nèi)給藥后也可具有延長(zhǎng)的血清半衰期，從而使例如通過(guò)ELISA方法或通過(guò)初級(jí)篩選檢定進(jìn)行測(cè)量成為可能?？墒褂脕?lái)自BioSource International(Camarillo，CA)或Diagnostic Systems Laboratories(Webster，TX)的ELISA或RIA試劑盒?；铙w內(nèi)生物半衰期的測(cè)量是如本文中所述來(lái)進(jìn)行。
包含非天然編碼氨基酸的hPP或hA或hFc多肽的效價(jià)和功能性活體內(nèi)半衰期可根據(jù)Clark，R.等人，J.Biol.Chem.271(36)21969-21977(1996)中所述的方案來(lái)測(cè)定。
包含非天然編碼氨基酸的hPP或hA或hFc多肽的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)可在正常Sprague-Dawley雄性大鼠(N＝每處理組5只動(dòng)物)中評(píng)估。動(dòng)物將接受靜脈內(nèi)每只大鼠25微克或皮下每只大鼠50微克的單劑量，且將根據(jù)預(yù)定時(shí)程采集約5-7個(gè)血液樣品，對(duì)包含非天然編碼氨基酸的未與水溶性聚合物結(jié)合的hPP或hA或hFc多肽來(lái)說(shuō)通常覆蓋約6小時(shí)，且對(duì)包含非天然編碼氨基酸且與水溶性聚合物結(jié)合的hPP或hA多肽來(lái)說(shuō)通常覆蓋約4天。在若干物種中透徹研究hPP或hA或hFc多肽的藥物動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)且可將其直接與包含非天然編碼氨基酸的hPP或hA或hFc多肽所獲得的數(shù)據(jù)比較。關(guān)于與hPP或hA或hFc相關(guān)的研究，參見(jiàn)Mordenti J.等人，Pharm.Res.8(11)1351-59(1991)。
藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)也可在例如獼猴的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中評(píng)估。通常，皮下或靜脈內(nèi)給予單一注射液，且隨時(shí)間監(jiān)測(cè)血清hPP或hA或hFc含量。
根據(jù)本發(fā)明的hPP或hA或hFc多肽的比活性可由所屬領(lǐng)域中已知的各種檢定來(lái)確定。根據(jù)本發(fā)明獲得和純化的hPP或hA或hFc多肽蛋白變異體或其片段的生物活性可由本文中描述或參考或所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的方法測(cè)試。XIV.給藥和醫(yī)藥組合物 本發(fā)明的多肽或蛋白質(zhì)(包括(但不限于)hPP或hA或hFc、合成酶、包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然氨基酸的蛋白質(zhì)等)視情況可包括(但不限于)與合適的醫(yī)藥載劑組合用于治療用途中。例如，這些組合物包含治療有效量的化合物和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑或賦形劑。所述載劑或賦形劑包括(但不限于)生理食鹽水、緩沖鹽水、葡聚糖、水、甘油、乙醇和/或其組合。進(jìn)行調(diào)配以適合給藥模式。一般來(lái)說(shuō)，所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知給予蛋白質(zhì)的方法，且可將其用于給予本發(fā)明的多肽。
視情況根據(jù)所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的方法在疾病的一種或一種以上適當(dāng)?shù)幕铙w外和/或活體內(nèi)動(dòng)物模型中測(cè)試包含一種或一種以上本發(fā)明的多肽的治療組合物，從而證實(shí)功效、組織代謝和估算劑量。具體來(lái)說(shuō)，最初可通過(guò)本文的非天然氨基酸同源物相對(duì)于天然氨基酸同源物(包括(但不限于)比較經(jīng)修飾包括一個(gè)或一個(gè)以上非天然氨基酸的hPP或hA或hFc多肽與天然氨基酸hPP或hA或hFc多肽)的活性、穩(wěn)定性或其它合適的量度(即，在相關(guān)測(cè)定中)確定劑量。
給予借助于通常用于引導(dǎo)分子與血液或組織細(xì)胞的最終接觸的任何途徑。本發(fā)明的非天然氨基酸多肽視情況與一種或一種以上醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑一起以任何合適的方式給予?？衫迷诒景l(fā)明的情況下向患者給予所述多肽的合適方法，且雖然可使用超過(guò)一種途徑給予特定組合物，但特定途徑通?？商峁┍攘硪煌緩郊磿r(shí)且有效的作用或反應(yīng)。
醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑部分地由所給予的特定組合物以及用于給予組合物的特定方法決定。因此，存在本發(fā)明的醫(yī)藥組合物的多種合適調(diào)配物。
本發(fā)明的hPP或hA或hFc多肽可通過(guò)適于蛋白質(zhì)或肽的任何常規(guī)途徑給予，所述途徑包括(但不限于)腸外，例如注射，包括(但不限于)皮下或靜脈內(nèi)或任何其它形式的注射或輸注。多肽組合物可通過(guò)許多途徑給予，所述途徑包括(但不限于)口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、眼用、眼內(nèi)、顱內(nèi)、硬膜下、投入CSF內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、局部、舌下或直腸方式。包含經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾的非天然氨基酸多肽的組合物也可經(jīng)由脂質(zhì)體給予。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常已知所述給藥途徑和適當(dāng)?shù)恼{(diào)配物。包含非天然編碼氨基酸的hPP或hA或hFc多肽可單獨(dú)使用或與諸如醫(yī)藥載劑等其它合適組分組合使用。包含非天然編碼氨基酸的hPP或hA或hFc多肽也可與調(diào)節(jié)活性劑的釋放或可利用性的生物可降解或生物可溶解的醫(yī)藥載劑組合使用。
單獨(dú)或與其它合適組分組合的包含非天然氨基酸的hPP或hA或hFc多肽也可制成氣霧劑調(diào)配物(即，其可“成霧狀”)以經(jīng)由吸入給予?？蓪忪F劑調(diào)配物放入諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等加壓可接受推進(jìn)劑中。
適于腸外給藥(諸如通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)(在關(guān)節(jié)中)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、眼內(nèi)、顱內(nèi)和皮下途徑)的調(diào)配物包括水性和非水性等張無(wú)菌注射液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使調(diào)配物與預(yù)定受體的血液等張的溶質(zhì)，以及可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑的水性和非水性無(wú)菌懸浮液?？稍趩挝粍┝炕蚨鄤┝棵芊馊萜?諸如安瓿和小瓶)中提供經(jīng)hPP或hA或hFc的調(diào)配物。
腸外給藥和靜脈內(nèi)給藥是優(yōu)選的給藥方法。具體來(lái)說(shuō)，已經(jīng)用于天然氨基酸同源物治療劑的給藥途徑(包括(但不限于)通常用于白蛋白、白蛋白與其它多肽的融合物、EPO、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN、白細(xì)胞介素、抗體、抗體片段和/或任何其它醫(yī)藥學(xué)上傳遞蛋白質(zhì)的途徑)以及當(dāng)前使用的調(diào)配物提供本發(fā)明的多肽的優(yōu)選給藥途徑和調(diào)配物。
在本發(fā)明的情況中，給予患者的劑量足以在患者體內(nèi)視施用而定隨時(shí)間引起有益的治療反應(yīng)。通過(guò)特定載體或調(diào)配物的功效和所使用的非天然氨基酸多肽的活性、穩(wěn)定性或血清半衰期和患者的病狀以及欲治療患者的體重或表面積來(lái)確定劑量。劑量大小也通過(guò)在特定患者體內(nèi)伴隨特定載體、組合物的給藥的任何不利副作用的存在、性質(zhì)和程度等來(lái)確定。
在確定疾病(包括(但不限于)癌癥、遺傳疾病、糖尿病、AIDS等)的治療或預(yù)防中欲給予的載體或調(diào)配物的有效量時(shí)，醫(yī)師評(píng)價(jià)循環(huán)血漿含量、調(diào)配物毒性、疾病進(jìn)展和/或(相關(guān)時(shí))抗非天然氨基酸多肽抗體的產(chǎn)生。
例如給予70公斤患者的劑量通常在等于當(dāng)前使用的治療性蛋白質(zhì)的劑量的范圍內(nèi)，所述范圍可針對(duì)相關(guān)組合物的活性或血清半衰期的改變而進(jìn)行調(diào)整。本發(fā)明的載體或醫(yī)藥調(diào)配物可通過(guò)任何已知的常規(guī)療法來(lái)補(bǔ)充治療條件，包括抗體給予、疫苗給予、給予細(xì)胞毒性劑、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸類(lèi)似物、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑等。
對(duì)于給藥，本發(fā)明的調(diào)配物是以由相關(guān)調(diào)配物的LD-50或ED-50確定的速率給予，和/或包括(但不限于)當(dāng)應(yīng)用于患者的質(zhì)量和總體健康狀況時(shí)，觀察各種濃度的非天然氨基酸多肽的任何副作用。給藥可以單次劑量或分劑量實(shí)現(xiàn)。
如果經(jīng)歷調(diào)配物輸注的患者出現(xiàn)發(fā)燒、寒戰(zhàn)或肌肉疼痛，那么其接收適當(dāng)劑量的阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen)或其它疼痛/發(fā)燒控制藥物。在將進(jìn)行輸注之前30分鐘，對(duì)經(jīng)歷輸注反應(yīng)(諸如發(fā)燒、肌肉疼痛和寒戰(zhàn))的患者預(yù)先給予阿司匹林、布洛芬、對(duì)乙酰氨基酚或(包括(但不限于))苯海拉明(diphenhydramine)。將哌替啶(Meperidine)用于不能對(duì)解熱劑和抗組織胺快速反應(yīng)的更為嚴(yán)重的寒戰(zhàn)和肌肉疼痛。視反應(yīng)的嚴(yán)重程度減緩或中斷細(xì)胞輸注。
本發(fā)明的hPP或hA或hFc多肽可直接給予哺乳動(dòng)物個(gè)體。給藥可通過(guò)通常用于將hPP或hA或hFc多肽引入個(gè)體的任何途徑。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的hPP或hA或hFc多肽組合物包括適于口服、經(jīng)直腸、局部、吸入(包括(但不限于)經(jīng)由氣霧劑)、口腔(包括(但不限于)舌下)、經(jīng)陰道、腸外(包括(但不限于)皮下、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、胸膜內(nèi)、腹膜內(nèi)、大腦內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或靜脈內(nèi))、局部(即，皮膚與粘膜表面，包括氣道表面)和透皮給藥，但在任何指定情況下最適合的途徑將視所治療病狀的性質(zhì)和嚴(yán)重程度而定。給藥可為局部的或全身的?；衔锏恼{(diào)配物可以單位劑量呈遞或在多劑量密封容器(諸如安瓿和小瓶)中呈遞。本發(fā)明的hPP或hA或hFc多肽可與醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑一起制備成單位劑量可注射形式(包括(但不限于)溶液、懸浮液或乳液)的混合物。本發(fā)明的hPP或hA或hFc多肽還可通過(guò)連續(xù)輸注(包括(但不限于)使用微型泵，諸如滲透泵)、單次團(tuán)注或緩釋儲(chǔ)槽式調(diào)配物給予。
適于給藥的調(diào)配物包括水溶液和非水溶液、等張無(wú)菌溶液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使調(diào)配物等張的溶質(zhì)；以及水性和非水性無(wú)菌懸浮液，其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。溶液和懸浮液可由先前所述種類(lèi)的無(wú)菌粉末、顆粒和片劑制備而來(lái)。
冷凍干燥是用于將水從所關(guān)注的蛋白質(zhì)制劑中去除的提供蛋白質(zhì)的常用技術(shù)。冷凍干燥或凍干是首先將欲干燥的材料冷凍且隨后通過(guò)在真空環(huán)境中升華來(lái)去除冰或冷凍溶劑的過(guò)程。預(yù)先凍干的調(diào)配物中可包括賦形劑以在冷凍干燥過(guò)程中增強(qiáng)穩(wěn)定性和/或改進(jìn)儲(chǔ)存時(shí)凍干產(chǎn)物的穩(wěn)定性。Pikal，M.Biopharm.3(9)26-30(1990)和Arakawa等人，Pharm.Res.8(3)285-291(1991)。
所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員也已知藥物的噴霧干燥。舉例來(lái)說(shuō)，參見(jiàn)Drug Dev.Ind.Pharm，18(11和12)，1169-1206(1992)中，Broadhead，J.等人，″The Spray Drying ofPharmaceuticals″。除小分子藥物外，也已將多種生物材料噴霧干燥并且這些材料包括酶、血清、血漿、微生物和酵母。由于噴霧干燥可將液態(tài)醫(yī)藥制劑以單步驟工藝轉(zhuǎn)化成無(wú)粉塵或團(tuán)聚細(xì)粉，所以噴霧干燥為有用技術(shù)。基本技術(shù)包含以下四個(gè)步驟a)使進(jìn)料溶液霧化成噴霧液；b)噴霧液-空氣接觸；c)干燥噴霧液；和d)使干燥產(chǎn)物與干燥空氣分離。美國(guó)專(zhuān)利第6,235,710號(hào)和第6,001,800號(hào)(其以引用的方式并入本文中)中描述通過(guò)噴霧干燥制備重組促紅細(xì)胞生成素。
本發(fā)明的醫(yī)藥組合物和調(diào)配物可包含醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑。醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑是由所給予的特定組合物以及用于給予組合物的特定方法部分地決定。因此，存在本發(fā)明的醫(yī)藥組合物的多種合適調(diào)配物(包括可選的醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑)(例如參見(jiàn)Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，1985)。
合適的載劑包括(但不限于)緩沖劑，其含有琥珀酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、HEPES、檸檬酸鹽、組氨酸、咪唑、乙酸鹽、碳酸氫鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括(但不限于)抗壞血酸；低分子量多肽，包括(但不限于)小于約10個(gè)殘基的多肽；蛋白質(zhì)，包括(但不限于)血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，包括(但不限于)聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，包括(但不限于)甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、組氨酸或組氨酸衍生物、蛋氨酸、谷氨酸鹽或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括(但不限于)海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，包括(但不限于)EDTA和依地酸二鈉(edentate disodium)；二價(jià)金屬離子，包括(但不限于)鋅、鈷或銅；糖醇，包括(但不限于)甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽平衡離子，包括(但不限于)鈉和氯化鈉；和/或非離子表面活性劑，包括(但不限于)TweenTM(包括(但不限于)Tween 80(聚山梨醇酯80)和Tween 20(聚山梨醇酯20))、PluronicsTM和其它普流尼克酸(pluronic acid)(包括(但不限于)普流尼克酸F68(泊洛沙姆188(poloxamer 188))或PEG。例如，合適的表面活性劑包括(但不限于)以聚(環(huán)氧乙烷)-聚(環(huán)氧丙烷)-聚(環(huán)氧乙烷)(即，(PEO-PPO-PEO))或聚(環(huán)氧丙烷)-聚(環(huán)氧乙烷)-聚(環(huán)氧丙烷)(即，(PPO-PEO-PPO))或其組合為基礎(chǔ)的聚醚。PEO-PPO-PEO和PPO-PEO-PPO在市面上以商品名PluronicsTM、R-PluronicsTM、TetronicsTM和R-TetronicsTM(BASF Wyandotte Corp.，Wyandotte，Mich.)銷(xiāo)售并且進(jìn)一步描述于美國(guó)專(zhuān)利第4,820,352號(hào)中，所述專(zhuān)利以全文引用的方式并入本文中。其它乙烯/聚丙烯嵌段聚合物可為合適的表面活性劑。表面活性劑或表面活性劑的組合可用于使聚乙二醇化hPP或hA或hFc對(duì)一種或一種以上應(yīng)力(包括(但不限于)由攪動(dòng)產(chǎn)生的應(yīng)力)穩(wěn)定。上述一些物質(zhì)可稱(chēng)為“增積劑(bulking agent)”。一些也可稱(chēng)為“張力改變劑(tonicity modifier)”。抗菌防腐劑也可應(yīng)用于產(chǎn)物穩(wěn)定性和抗菌效率；合適的防腐劑包括(但不限于)苯甲醇、苯扎氯銨(benzalkonium chloride)、間甲酚、對(duì)羥基苯甲酸甲酯/對(duì)羥基苯甲酸丙酯、甲酚和酚或其組合。
本發(fā)明的hPP或hA或hFc多肽(包括與諸如PEG等水溶性聚合物連接的多肽)還可以通過(guò)持續(xù)釋放系統(tǒng)或作為持續(xù)釋放系統(tǒng)的部分給予。持續(xù)釋放組合物包括(包括但不限于)成形物件形式的半滲透性聚合物基質(zhì)，包括(但不限于)薄膜或微囊。持續(xù)釋放基質(zhì)包括生物可相容材料，諸如聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.，15267-277(1981)；Langer，Chem.Tech.，1298-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上文)或聚D-(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)、聚丙交酯(聚乳酸)(美國(guó)專(zhuān)利第3,773,919號(hào)；EP 58,481)、聚乙交酯(乙醇酸聚合物)、聚丙交酯共聚乙交酯(乳酸與乙醇酸的共聚物)、聚酐、L-谷氨酸與γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人，Biopolymers，22,547-556(1983))、聚(原酸)酯、多肽、透明質(zhì)酸、膠原蛋白、硫酸軟骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(諸如苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸)、多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。持續(xù)釋放組合物還包括脂質(zhì)體包埋的化合物。可通過(guò)以下本身已知的方法來(lái)制備含有化合物的脂質(zhì)體DE 3,218,121；Eppstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，823688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci..U.S.A.，774030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；美國(guó)專(zhuān)利第4,619,794號(hào)；EP 143,949；美國(guó)專(zhuān)利第5,021,234號(hào)；日本專(zhuān)利申請(qǐng)文件83-118008；美國(guó)專(zhuān)利第4,485,045號(hào)和第4,544,545號(hào)；以及EP 102,324。所引用的所有參考文獻(xiàn)和專(zhuān)利是以引用的方式并入本文中。
可通過(guò)例如DE 3,218,121；Eppstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，823688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci..U.S.A.，774030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；美國(guó)專(zhuān)利第4,619,794號(hào)；EP 143,949；；美國(guó)專(zhuān)利第5,021,234號(hào)；日本專(zhuān)利申請(qǐng)文件83-118008；美國(guó)專(zhuān)利第4,485,045號(hào)和第4,544,545號(hào)；以及EP 102,324中所述的方法來(lái)制備脂質(zhì)體包埋的hPP或hA或hFc多肽。脂質(zhì)體的組成和尺寸已為人們所熟知，或者能夠憑所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)容易地確定。脂質(zhì)體的一些實(shí)例是描述于例如Park JW等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA921327-1331(1995)；Lasic D和Papahadjopoulos D(編)Medical Applications OFLiposomes(1998)；Drummond DC等人，Liposomal drug delivery systems for cancertherapy，Teicher B(編)Cancer Drug Discovery and Development(2002)；Park JW等人，Clin.Cancer Res.81172-1181(2002)；Nielsen UB等人，Biochim.Biophys.Acta159l(1-3)109-118(2002)；Mamot C等人，Cancer Res.633154-3161(2003)中。所引用的所有參考文獻(xiàn)和專(zhuān)利是以引用的方式并入本文中。
在本發(fā)明的情況中，給予患者的劑量應(yīng)足以隨時(shí)間在個(gè)體體內(nèi)引起有益的反應(yīng)。一般來(lái)說(shuō)，每劑腸外給予的本發(fā)明的hPP或hA或hFc多肽的總的醫(yī)藥有效量在每天每公斤患者體重約0.01微克到每公斤患者體重約100微克，或者每天每公斤體重約0.05毫克到每公斤患者體重約1毫克的范圍內(nèi)，但這是以治療判斷為依據(jù)。給藥頻率也是以治療判斷為依據(jù)且可以比批準(zhǔn)用于人類(lèi)的可購(gòu)得的hPP或hA或hFc多肽產(chǎn)品的頻率更高或更低。一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的聚乙二醇化hPP或hA或hFc多肽可通過(guò)上述給藥途徑中的任一種給予。
實(shí)例 提供下列實(shí)例以說(shuō)明但不限制所主張的發(fā)明。
實(shí)例1 這一實(shí)例描述選擇將非天然編碼氨基酸并入hA中的優(yōu)選位點(diǎn)的許多組可能的標(biāo)準(zhǔn)中的一組。使用下文所述的標(biāo)準(zhǔn)，用于將對(duì)乙酰基-苯丙氨酸(pAF)位點(diǎn)特異性并入HSA中的氨基酸位置是34、82、172、301、364、505。使用多種HSA晶體結(jié)構(gòu)來(lái)確定可引入一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的優(yōu)選位置這些結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)可經(jīng)由www.rcsb.org中的The Research Collaboratory for Structural Bioinformatics從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Data Bank，PDB)獲得(PDB ID為1A06、1E78和1BMO)。使用X射線晶體結(jié)構(gòu)信息，利用Cx程序(Pintar等人，Bioinformatics，2002，第18卷，第980卷)對(duì)HSA分子進(jìn)行溶劑可及性計(jì)算。計(jì)算所有原子的溶劑可及性且確定各氨基酸殘基的復(fù)合Cx值，且將所述Cx值表示于圖2中。根據(jù)Cx值對(duì)氨基酸排序且使這些氨基酸與其在HSA結(jié)構(gòu)中的三維位置相關(guān)聯(lián)，且將這些位點(diǎn)中的某些表示于圖3中。HSA含有總計(jì)582個(gè)氨基酸檢查用于pAF取代的前51個(gè)Cx值。選擇位點(diǎn)以將pAF放入將最可能發(fā)生共價(jià)結(jié)合的HSA結(jié)構(gòu)的溶劑暴露區(qū)中。使用下列標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)估用于引入非天然編碼氨基酸的HSA的前51個(gè)Cx位置所選擇的殘基(a)應(yīng)具有最大的Cx值，從而證明溶劑可及性和與周?chē)鷼埢淖钚》兜氯A(van derWaals)或氫鍵結(jié)相互作用，b)應(yīng)來(lái)自蛋白質(zhì)的不同表面暴露區(qū)，且c)應(yīng)位于具有剛性和可撓性的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的區(qū)域中。適于將非天然編碼氨基酸并入hA中的氨基酸位置的部分清單是表示于圖4中。
實(shí)例2 這一實(shí)例詳述有和無(wú)非天然編碼氨基酸的hA多肽在酵母中的克隆和表達(dá)。[白蛋白DNA在表達(dá)載體中的克隆，酵母的轉(zhuǎn)化] 使用包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的所引入翻譯系統(tǒng)來(lái)表達(dá)含有非天然編碼氨基酸的hA。O-RS優(yōu)先利用非天然編碼氨基酸使O-tRNA氨酰化。翻譯系統(tǒng)又響應(yīng)經(jīng)編碼的選擇密碼子將非天然編碼氨基酸插入hA中。
表2hA、O-RS和O-tRNA序列

用含有經(jīng)修飾的hA基因和正交氨?；鵷RNA合成酶/tRNA對(duì)(對(duì)所需的非天然編碼氨基酸具有特異性)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母允許將非天然編碼氨基酸位點(diǎn)特異性地并入hA多肽中。在37℃下在含有0.01-100mM特定非天然編碼氨基酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化酵母以高保真性和效率表達(dá)經(jīng)修飾的hA。
在YPD中將攜帶pGADHSA或pGADGAL4(對(duì)照)的釀酒酵母菌株MaV203培養(yǎng)23小時(shí)。通過(guò)在4℃下在4000g下離心5分鐘來(lái)收集細(xì)胞和上清液。通過(guò)溶解約10毫克濕細(xì)胞小球產(chǎn)生細(xì)胞提取物。通過(guò)10kDa MWCO離心柱(spin column)使上清液濃縮約30倍。將16微升還原樣品加載到4-12％Bis-Tris PAGE凝膠的各孔中，在200V下跑膠50分鐘且用考馬斯藍(lán)染色或?qū)⑵滢D(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(25V，70分鐘)。用初級(jí)抗HSA IgY pAb(200ng/ml)和HRP結(jié)合山羊抗IgY IgG(10ng/ml)探查印跡，然后使用Supersignal ECL底物(Sigma)和Biorad Fluor-S成像系統(tǒng)檢測(cè)。結(jié)果表示于圖5中。
純化hA的方法為所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知且由SDS-PAGE、西方印跡(Western Blot)分析或電噴霧-電離離子阱(ion trap)質(zhì)譜等得到證實(shí)。
白蛋白DNA在表達(dá)載體中的克隆，酵母轉(zhuǎn)化 如下將野生型hA編碼序列(CDS)克隆到酵母穿梭/表達(dá)載體pGADGAL4中。獲得可購(gòu)得的hA cDNA，且通過(guò)PCR使用對(duì)hA CDS的5′和3′端具有特異性的引物擴(kuò)增；將HindIII限制位點(diǎn)整合到引物端中。在PCR之后，用HindIII(37℃，60分鐘)消化正確片段，使其純化且與HindIII-切割pGADGAL4連接。使連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到TOP10化學(xué)耐久性大腸桿菌中；使用小量提取試劑盒從所選擇的轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA。通過(guò)所選擇的各質(zhì)粒克隆的獨(dú)立的EcoRV和PstI限制消化來(lái)進(jìn)行所需質(zhì)粒產(chǎn)物的篩選；通過(guò)測(cè)序來(lái)核實(shí)瓊脂糖凝膠電泳(130伏，30分鐘)和EtBr染色之后展現(xiàn)預(yù)期帶型的克隆。如果克隆具有替代pGADGAL4的GAL4區(qū)的hA CDS的拷貝，那么認(rèn)為克隆是‘陽(yáng)性’；用于其它實(shí)驗(yàn)中的特異性質(zhì)粒是稱(chēng)為‘pGADHSA’。
通過(guò)定點(diǎn)誘變Quickchange方法在hA CDS內(nèi)對(duì)指定密碼子進(jìn)行琥珀突變(Stratagene，La Jolla，CA)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，在PCR反應(yīng)中使用對(duì)待突變的區(qū)具有特異性的重疊引物和含有產(chǎn)生突變區(qū)所必需的核苷酸堿基改變以產(chǎn)生半突變的雜交質(zhì)粒DNA分子。在裂解和破壞親本甲基化DNA鏈的DpnI限制分解之后，使產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到TOP10化學(xué)耐久性大腸桿菌中。選擇轉(zhuǎn)化體；分離質(zhì)粒DNA且通過(guò)核苷酸測(cè)序證實(shí)含有所需突變體的質(zhì)粒DNA。
根據(jù)R.D.Geitz(http//www.umanitoba.ca/faculties/medicine/biochem/gietz/Trafo.html)詳述的方案進(jìn)行釀酒酵母轉(zhuǎn)化。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，以約50微升等分試樣從YPD瓊脂板刮取剛生長(zhǎng)的釀酒酵母，用無(wú)菌水洗滌，且使其再懸浮于含有33％聚(乙二醇)-3350、100mM LiOAc、300微克/毫升單鏈鮭魚(yú)精液DNA和5-10微克轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化混合物中。使細(xì)胞在42℃下熱休克40-60分鐘，洗滌并使其再懸浮于1.0毫升無(wú)菌水中，且將其涂鋪到選擇性瓊脂板上的稀釋液中。然后，將轉(zhuǎn)化體用于后續(xù)表達(dá)和抑制實(shí)驗(yàn)中。
具有非天然氨基酸的HSA蛋白的表達(dá)和表征 用以下物質(zhì)轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株InvSc1 1)僅pGADHSA(琥珀)， 2)pGADHSA(琥珀)加含有大腸桿菌酪氨酸t(yī)RNA合成酶基因和tRNACuA基因的質(zhì)粒， 3)pGADHSA(琥珀)加含有大腸桿菌對(duì)乙酰基苯丙氨酸t(yī)RNA合成酶基因和tRNACuA基因的質(zhì)粒。
在50毫升SD培養(yǎng)基(缺乏亮氨酸，缺乏色氨酸)中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體且在上述(3)的情況下，在30℃下在振蕩下在存在1mM對(duì)乙酰基苯丙氨酸的情況下，直到OD600為1.0。此時(shí)，通過(guò)在3000×g下離心5分鐘使各培養(yǎng)物的30OD600等效物變成小球且將其再懸浮于30ml YPD(再次在上述(3)的情況下，也在存在1mM對(duì)乙?；奖彼岬那闆r下)中。再次使培養(yǎng)物在30℃下在250rpm振蕩下再生長(zhǎng)24小時(shí)。然后，如上所述使各培養(yǎng)物的50OD600等效物變成小球；分離培養(yǎng)上清液，且使用10kDa MWCO離心柱使其一部分濃縮約30倍。
通過(guò)免疫印跡法來(lái)檢定hA蛋白質(zhì)的存在，且免疫印跡法描述如下。將16微升各還原樣品加載到4-12％Bis-Tris PAGE凝膠的各孔中，在200V下跑膠50分鐘且用考馬斯藍(lán)染色或?qū)⑵滢D(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(25V，70分鐘)。用初級(jí)抗HSAIgYpAb(200ng/ml)和HRP結(jié)合山羊抗IgY IgG(10ng/ml)探查印跡，然后使用SupersignalECL底物(Sigma)和Biorad Fluor-S成像系統(tǒng)檢測(cè)。結(jié)果表示于圖6中，且證明將非天然編碼氨基酸并入hA多肽中。
HSA-C34的非天然編碼氨基酸抑制 使經(jīng)編碼WT HSA、HSA-C34或HSA-C34的質(zhì)粒加編碼tRNA合成酶(RS)/tRNA對(duì)[酪氨酸(Y)RS、pAFRS、pAzRS、pBzRS、OMeRS]的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的釀酒酵母Y187菌株在HC-Leu培養(yǎng)基或HC-Leu-Trp培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜(30℃,200rpm)。使細(xì)胞在4℃下在5000×g下歷時(shí)5分鐘變成小球，且使其再懸浮于YPAD中直到OD600為0.5。在存在(+)或不存在(-)適當(dāng)?shù)男路f氨基酸(pAF、pAZ-Phe、pBz-Phe、OMe-Tyr，1mM)的情況下培育含有外源tRNA/RS對(duì)的菌株。pAF＝對(duì)乙酰基苯丙氨酸；pAZ-Phe＝對(duì)疊氮基苯丙氨酸；pBz-Phe＝對(duì)苯甲酰基-L-苯丙氨酸；OMe-Tyr＝O-甲基酪氨酸。在培育24小時(shí)(30℃,200rpm)之后，通過(guò)離心收集所有培養(yǎng)物；通過(guò)SDS-PAGE用4-12％ Bis-Tris凝膠來(lái)分解15mL還原上清液且通過(guò)(圖10A)考馬斯藍(lán)以及(圖10B和C)抗HSA Western印跡法來(lái)觀察。HSA標(biāo)準(zhǔn)物為從人類(lèi)血清純化的200ng HSA。
HSA-C34-pAF與5K氨氧基PEG的結(jié)合 將經(jīng)純化的wt HSA或HSA-C34-pAF以緩沖劑交換到反應(yīng)緩沖劑(20mM乙酸鈉、20g/L甘氨酸、5g/L甘露糖醇、1mM EDTA(pH4.0))中，最終濃度為約2mg/ml。通過(guò)添加20摩爾當(dāng)量的5K氨氧基衍生的PEG(+)或通過(guò)添加反應(yīng)緩沖劑(-)來(lái)起始HSA-C34-pAF的反應(yīng)；向所有反應(yīng)中添加乙酸酰肼(催化劑最終濃度為50mM)。使反應(yīng)在28℃下在不受干擾下進(jìn)行48小時(shí)。然后，在4-12％bis-tris聚丙烯酰膠凝膠上分離每個(gè)泳道1微升反應(yīng)混合物且通過(guò)α-HSA Western印跡法加以分析。參見(jiàn)圖11。
HSA分析方法 樣品的胰蛋白酶化 將WT HSA(Sigma-Aldrich，2mg/ml)或經(jīng)純化的pAF抑制的HSA(約2mg/ml)稀釋到6M鹽酸胍和50mM Tris(pH7.5)中(最終濃度)。在37℃下用20mM DTT使樣品還原1小時(shí)，接著在室溫下在黑暗環(huán)境中用40mm碘乙酸(iodoacetic acid，IAA)使其烷基化40分鐘。用40mm DTT中止反應(yīng)，且將樣品透析到50mM Tris、1mM CaC12(pH7.5)中并在37℃下用胰蛋白酶1:20(酶蛋白質(zhì))處理4小時(shí)。通過(guò)添加TFA直到占0.1％使反應(yīng)中止。
TC-MS/MS 將100μL胰蛋白酶化樣品以0.2mL/min加載到Zorbax SB-C18柱(2.1×150mm，3.5μm，40℃)上。經(jīng)60分鐘，用0到100％乙腈的每分鐘1.38％的梯度將肽洗提到0.05％TFA中。將所洗提的肽直接地電噴霧到施加15V毛細(xì)管電壓和4.5kV噴霧電壓的ThermoElectron LCQ Deca上。在整個(gè)肽洗提過(guò)程中，以35％的標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量進(jìn)行一個(gè)全掃描質(zhì)譜(300-2000m/z)、接著數(shù)據(jù)相關(guān)的級(jí)聯(lián)MS譜圖截獲的循環(huán)。
HSA-C34pAF的肽質(zhì)量圖 使經(jīng)純化的wtHSA和HSA-C34pAF(約60μg)經(jīng)受胰蛋白酶的蛋白水解消化，且用LCQ Deca(Thermoelectron)對(duì)樣品進(jìn)行LC-MS/MS以獲得肽質(zhì)量圖。基于序列分析，WT HSA中從N-末端開(kāi)始的第五個(gè)胰蛋白酶肽(T5)含有Cys34；pAF抑制的HSA中的T5應(yīng)展現(xiàn)對(duì)應(yīng)于Cys34pAF氨基酸取代的質(zhì)量差。WT T5肽(M2H+m/z計(jì)算值＝1246.95)在37.3分鐘時(shí)從反相柱洗提，其中m/z觀察值為1246.4；HSA-C34pAF的胰蛋白酶質(zhì)量圖在37。3分鐘時(shí)不產(chǎn)生m/z為1246+/-2的肽。相反地，pAF取代的T5(M2H+m/z計(jì)算值＝1260.63)在39.1分鐘時(shí)洗提，其中m/z觀察值為1260.4(圖12A)。wtHSA的胰蛋白酶質(zhì)量圖在39.1分鐘時(shí)未觀察到m/z為1246+/-2的肽(圖12B)。(A)中的39.1min峰(m/z＝1260.4)具有與預(yù)期的pAF取代的T5肽一致的MS/MS譜圖(參見(jiàn)圖13)。
含pAF的HSA多肽的MS/MS pAF-T5母體離子的MS/MS譜圖(m/z＝1260.4)。通過(guò)碰撞誘導(dǎo)的雙電荷母體離子的解離產(chǎn)生單電荷離子片段。譜圖中指示對(duì)應(yīng)于預(yù)測(cè)的m/z間隔的峰(y″系列)。峰間隔與含有Cys34-pAF取代的HSAT5肽一致。參見(jiàn)圖13。
實(shí)例3 這一實(shí)例詳述含羰基的氨基酸的引入和隨后與含氨氧基的PEG的反應(yīng)。
這一實(shí)例證明產(chǎn)生并入含酮的非天然編碼氨基酸的hA多肽的方法，所述非天然編碼氨基酸隨后與約5,000MW的含氨氧基的PEG反應(yīng)。使根據(jù)實(shí)例1(hA)的標(biāo)準(zhǔn)鑒別的各殘基17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、574、581單獨(dú)經(jīng)具有如下結(jié)構(gòu)的非天然編碼氨基酸取代
用于將對(duì)乙?；?苯丙氨酸位點(diǎn)特異性并入hA中的序列為SEQ ID NO1。
使包含含羰基的氨基酸的hA多肽變異體與具有如下形式的含氨氧基的PEG衍生物反應(yīng) R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2， 其中R為甲基，n為3且N為約5,000MW。另一種與hA結(jié)合的PEG衍生物具有30,000的分子量。使以10mg/mL溶解于25mM MES(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH6.0)、25mM Hepes(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH7.0)或10mM乙酸鈉(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH4.5)中的含有對(duì)乙酰基苯丙氨酸的經(jīng)純化hA與10到100倍過(guò)量的含氨氧基的PEG反應(yīng)，然后在室溫下攪拌10-16小時(shí)(Jencks，W.J.Am.Chem.Soc.1959，81，第475頁(yè))。然后，將PEG-hA稀釋到適當(dāng)緩沖劑中以立即純化和分析。
實(shí)例4 與由經(jīng)由酰胺鍵與PEG連接的羥胺基組成的PEG的結(jié)合 使用實(shí)例3中所描述的程序，使具有如下結(jié)構(gòu)的PEG試劑與含酮的非天然編碼氨基酸偶合 R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-O-NH2， 其中R＝甲基，n＝4且N為約20,000MW。反應(yīng)、純化和分析條件是如實(shí)例3中所述。
實(shí)例5 這一實(shí)例詳述將兩種不同的非天然編碼氨基酸引入hA多肽中。
這一實(shí)例證明產(chǎn)生在下列殘基中的兩個(gè)位置處并入包含酮官能團(tuán)的非天然編碼氨基酸的hA多肽的方法E30、E74、Y103、K38、K41、K140以及K145。如實(shí)例1和2中所述來(lái)制備hA多肽，其中例外為在核酸內(nèi)的兩個(gè)不同位點(diǎn)處引入選擇密碼子。
實(shí)例6 這一實(shí)例詳述hA多肽與含酰肼的PEG的結(jié)合和隨后的當(dāng)場(chǎng)還原。
根據(jù)實(shí)例2和3中所述的程序來(lái)制備并入含羰基的氨基酸的hA多肽。具有如下結(jié)構(gòu)的含酰肼的PEG在修飾后與hA多肽結(jié)合 R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-X-NH-NH2， 其中R＝甲基，n＝2且N＝10,000MW且X為羰基(C＝O)。將含有對(duì)乙?；奖彼岬慕?jīng)純化hA以0.1-10mg/mL溶解于25mM MES(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH6.0)、25mM Hepes(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH7.0)或10mM乙酸鈉(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH4.5)中，使其與1到100倍過(guò)量的含酰肼的PEG反應(yīng)，且通過(guò)添加1M NaCNBH3儲(chǔ)備液(Sigma Chemical，St.Louis，MO)當(dāng)場(chǎng)還原相應(yīng)的腙，將其溶解于H2O中，直到最終濃度為10-50mM。在4℃到室溫下，在黑暗環(huán)境中進(jìn)行反應(yīng)18-24小時(shí)。通過(guò)添加1M Tris(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH值約為7.6)使反應(yīng)中止，直到最終Tris濃度為50mM，或?qū)⒎磻?yīng)稀釋到適當(dāng)緩沖劑中以立即純化。
實(shí)例7 這一實(shí)例詳述將含炔的氨基酸引入hA多肽中以及用mPEG-疊氮化物使其衍生。
使下列殘基17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、574、581經(jīng)以下非天然編碼氨基酸取代(hA；SEQID NO1)
用于將對(duì)炔丙基-酪氨酸位點(diǎn)特異性并入hA中的序列為以上實(shí)例2中所述的SEQ ID NO2(hA)、SEQ ID NO3(muttRNA，詹氏甲烷球菌

)和8、9或10。使含有炔丙基酪氨酸的hA多肽在大腸桿菌中表達(dá)且使用實(shí)例3中所述的條件加以純化。
向反應(yīng)混合物中添加以0.1-10mg/mL溶解于PB緩沖劑(100mM磷酸鈉、0.15MNaCl(pH＝8))和10到1000倍過(guò)量的含疊氮基的PEG中的含有炔丙基-酪氨酸的經(jīng)純化hA。然后，向反應(yīng)混合物中添加催化量的CuSO4和Cu線。在培育混合物(包括(但不限于)在室溫下或在37℃下培育約4小時(shí)或在4℃下培育過(guò)夜)后，添加H2O且經(jīng)由透析膜過(guò)濾混合物。根據(jù)包括(但不限于)實(shí)例3中所述的類(lèi)似程序來(lái)分析樣品的添加。
在這一實(shí)例中，PEG將具有如下結(jié)構(gòu) R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-N3， 其中R為甲基，n為4且N為10,000MW。
實(shí)例8 這一實(shí)例詳述用炔丙基酪氨酸取代hA多肽中的大的疏水性氨基酸。
如實(shí)例7中所述，使hA的下列位置17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、574、581(SEQ ID NO1)中的一個(gè)位置內(nèi)存在的Phe、Trp或Tyr殘基經(jīng)以下非天然編碼氨基酸取代
PEG在修飾后與包含含炔的氨基酸的hA多肽變異體連接。PEG將具有如下結(jié)構(gòu) Me-PEG(N)-O-(CH2)2-N3， 且偶合程序?qū)⒆裱瓕?shí)例7中的程序。這將產(chǎn)生包含與一個(gè)天然存在的大的疏水性氨基酸大致等排的非天然編碼氨基酸且在多肽內(nèi)的不同位點(diǎn)處經(jīng)PEG衍生物修飾的hA多肽變異體。
實(shí)例9 這一實(shí)例詳述由一個(gè)或一個(gè)以上PEG連接子分隔開(kāi)的hA多肽同源二聚物、異源二聚物、同源多聚物或異源多聚物的產(chǎn)生。
使實(shí)例7中所產(chǎn)生的含炔的hA多肽變異體與具有如下形式的雙官能PEG衍生物反應(yīng) N3-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)2-O-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)n-N3， 其中n為4且PEG具有約5,000的平均MW，以產(chǎn)生兩個(gè)hA分子由PEG以物理方式分隔開(kāi)的相應(yīng)hA多肽同源二聚物?？梢灶?lèi)似方式使hA多肽與一個(gè)或一個(gè)以上其它多肽偶合，從而形成異源二聚物、同源多聚物或異源多聚物。偶合、純化和分析將如實(shí)例7和3中進(jìn)行。
實(shí)例10 這一實(shí)例詳述糖部分與hA多肽的偶合。
如實(shí)例3中所述，使下列殘基17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、574、581(hA，SEQ ID NO1)中的一個(gè)殘基經(jīng)以下非天然編碼氨基酸取代。

包含含羰基的氨基酸的hA多肽變異體在修飾后與N-乙?；咸前?GlcNAc)的β-連接氨氧基類(lèi)似物反應(yīng)。將hA多肽變異體(10mg/mL)和氨氧基糖(21mM)混合到100mM乙酸鈉緩沖水溶液(pH5.5)中，且在37℃下培育7到26小時(shí)。通過(guò)在周?chē)鷾囟认略?50mM HEPES緩沖劑(pH7.4)中將糖結(jié)合的hA多肽(5mg/ml)與UDP-半乳糖(16mM)和β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(0.4單位/毫升)一起培育48小時(shí)使第二種糖與第一種糖酶促偶合(Schanbacher等人，J.Biol.Chem.1970，245，5057-5061)。
實(shí)例11 hA分子直接連接的hA多肽同源二聚物、異源二聚物、同源多聚物或異源多聚物的產(chǎn)生 可使包含含炔的氨基酸的hA多肽變異體與包含含疊氮基的氨基酸的另一種hA多肽變異體直接偶合，各hA多肽變異體在(不限于)實(shí)例10中所述的位點(diǎn)處包含非天然編碼氨基酸取代。這將產(chǎn)生兩個(gè)hA多肽變異體在位點(diǎn)II結(jié)合界面處以物理方式連接的相應(yīng)hA多肽同源二聚物?？梢灶?lèi)似方式使hA多肽與一個(gè)或一個(gè)以上其它多肽偶合，從而形成異源二聚物、同源多聚物或異源多聚物。偶合、純化和分析是如實(shí)例3、6和7中進(jìn)行。
實(shí)例12 這一實(shí)例描述包含非天然編碼氨基酸的hA與其它生物活性分子的結(jié)合。使本文實(shí)例2中所產(chǎn)生的hA與具有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或三個(gè)以上官能團(tuán)的所需生物活性分子(諸如合成肽、小有機(jī)分子、聚合物、連接子)反應(yīng)，所述官能團(tuán)可用于與hA或其它生物活性分子、除hA以外的蛋白質(zhì)或多肽、另一種hA分子偶合，或使生物活性分子與非天然氨基酸以及在SEQ ID NO1的位置34處與半胱氨酸連接的另一種生物活性分子結(jié)合。在允許在hA的非天然編碼氨基酸的官能團(tuán)與生物活性分子的互補(bǔ)官能團(tuán)之間形成共價(jià)鍵的條件下，使所需生物活性分子與包含非天然編碼氨基酸的hA反應(yīng)。必要時(shí)，利用所屬領(lǐng)域中已知或本文中所述的方法進(jìn)一步純化共價(jià)鍵結(jié)的hA和所需生物活性分子。
實(shí)例13 這一實(shí)例詳述有和無(wú)非天然編碼氨基酸的Fc在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆和表達(dá)。[Fc DNA在表達(dá)載體中的克隆，哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化]SEQ ID NO20表示野生型Fc多核苷酸序列。這一多核苷酸序列編碼具有經(jīng)純化蛋白質(zhì)中不存在的信號(hào)序列的人類(lèi)IgG1-Fc。使這一序列中加下劃線的密碼子經(jīng)選擇密碼子琥珀密碼子置換，從而獲得突變蛋白質(zhì)。加下劃線的密碼子編碼為成熟蛋白質(zhì)的第一個(gè)氨基酸的天冬氨酸(Asp；D)氨基酸。SEQ ID NO21表示具有信號(hào)序列的Fc的多肽序列。SEQ ID NO22表示成熟Fc蛋白質(zhì)的序列。SEQ ID NO23表示編碼成熟Fc蛋白質(zhì)的多核苷酸序列。參見(jiàn)圖8A-D。
使用包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的所引入的翻譯系統(tǒng)來(lái)表達(dá)含有非天然編碼氨基酸的Fc。O-RS優(yōu)先利用非天然編碼氨基酸使O-tRNA氨酰化。翻譯系統(tǒng)又響應(yīng)經(jīng)編碼的選擇密碼子將非天然編碼氨基酸插入Fc中。
瞬時(shí)產(chǎn)生WT和D1pAF-Fc 在轉(zhuǎn)染之前24小時(shí)，將CHO-S FreestyleTM細(xì)胞(第10代；Invitrogen，Carlsbad，CA)以每毫升5×105個(gè)細(xì)胞接種到300毫升FreestyleTM CHO培養(yǎng)基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將375毫升FreestyleMAXTM試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA)與編碼野生型(WT)Fc(415μg)的質(zhì)?；蚓幋a正交tRNA(SEQ ID NO24)、正交tRNA合成酶(5μg)(以SEQ ID NO25表示的編碼多核苷酸序列)和Fc-D1TAG(140μg)的質(zhì)粒一起培育15分鐘。關(guān)于tRNA和RS序列，參見(jiàn)圖9A和9B。非天然編碼氨基酸將代替Fc序列的位置1中所存在的天冬氨酸(Asp；D)氨基酸。將DNA轉(zhuǎn)染混合物添加到總計(jì)300毫升的3.2×108個(gè)細(xì)胞中。關(guān)于蛋白質(zhì)從Fc-D1TAG的細(xì)胞表達(dá)，添加對(duì)乙酰基苯丙氨酸(pAF)直到最終濃度為1mM。在34℃下在8％CO2中且在100rpm下培育細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，添加選擇植物蛋白胨UF水解產(chǎn)物(Becton，Dickinson and Company，F(xiàn)ranklinLakes，New Jersey)直到最終濃度為0.1％。在轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，通過(guò)離心(10分鐘，4，000rpm)收集培養(yǎng)物，且使用0.22μm過(guò)濾器對(duì)上清液進(jìn)行過(guò)濾殺菌。
從CHO-S培養(yǎng)上清液純化WT和D1pAF-Fc 將澄清的培養(yǎng)上清液加載到5mL HiTrap rProteinA FF預(yù)填充柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ)上。用10個(gè)柱體積的PBS(pH7.4)洗滌柱，接著用0.1M甘氨酸(pH3.0)洗提。用0.03體積的0.5M Tris堿中和含有Fc的洗提份，直到pH值約為7?；赟DS-PAGE分析來(lái)匯集洗提份，且用10,000分子量截?cái)帱c(diǎn)離心裝置(Amicon)濃縮所述池，且在4℃下相對(duì)于PBS(pH7.4)+10％甘油透析過(guò)夜。使用280nm下的吸光度來(lái)確定Fc濃度。用于并入對(duì)乙?；奖彼岬腇c(D1pAF)的消光系數(shù)為1.35。用于WT Fc的消光系數(shù)為1.40。N-末端測(cè)序和質(zhì)譜證明pAF適當(dāng)并入D1TAG的N-末端處。這一蛋白質(zhì)是稱(chēng)為D1pAF(位置1處經(jīng)pAF取代的Fc)。
5K氨氧基PEG與D1pAF-Fc的結(jié)合 將經(jīng)純化的WT-Fc和D1pAF以緩沖劑交換到結(jié)合緩沖劑(20mM乙酸鈉、20g/L甘氨酸、5g/L甘露糖醇、1mM EDTA(pH4.0))中且將其濃縮到約1.5mg/mL。將樣品在僅結(jié)合緩沖劑中或與最終濃度為15g/L(相對(duì)Fc單體50倍摩爾過(guò)量)的5K氨氧基聚(乙二醇)(PEG)一起培育。向所有反應(yīng)中添加最終濃度為50mM的乙酸酰肼來(lái)催化結(jié)合反應(yīng)。使反應(yīng)在28℃下進(jìn)行48小時(shí)。在24小時(shí)時(shí)，移出5μl等分試樣。根據(jù)SDS PAGE分析3微克各樣品。在還原和非還原條件下進(jìn)行4-12％ bis-trisSDS-PAGE且進(jìn)行考馬斯藍(lán)染色。使用MES緩沖系統(tǒng)來(lái)分離還原樣品，且用MOPS緩沖系統(tǒng)來(lái)分離非還原樣品。
圖7表示5K PEG與人類(lèi)IgG1-Fc的氨基末端pAF殘基的結(jié)合。在28℃下將經(jīng)純化的Fc(WT)和D1pAF取代的Fc(D1pAF)在存在(+)或不存在(-)5K氨氧基聚(乙二醇)(PEG)的情況下培育24或48小時(shí)。通過(guò)對(duì)SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行考馬斯藍(lán)染色來(lái)分析還原(圖7A)或非還原(圖7B)樣品。
圖7A表示D1pAF+PEG與無(wú)PEG下培育的D1pAF相比展現(xiàn)質(zhì)量移動(dòng)(相應(yīng)為泳道7對(duì)5)。相反，將WT Fc與5K PEG(泳道3和6)一起培育后未觀察到質(zhì)量移動(dòng)，表明質(zhì)量移動(dòng)與pAF有關(guān)。非還原樣品的SDS-PAGE分析證明完整Fc二聚物與分子的一個(gè)(PEG-D1pAF+D1pAF)或兩個(gè)(PEG-D1pAF+PEG-D1pAF)臂結(jié)合(圖7B)。染色強(qiáng)度指示大部分物質(zhì)為雙聚乙二醇化Fc二聚物(泳道7)。圖(圖7B)中所存在的下部條帶是聚乙二醇化和未聚乙二醇化Fc單體的還原形式。
作為本文中所述的組合物、方法、技術(shù)以及策略的說(shuō)明性非限制性實(shí)例，所述描述論述將大分子聚合物添加到包含非天然編碼氨基酸的Fc中，同時(shí)應(yīng)了解相關(guān)組合物、方法、技術(shù)以及策略也適用于(必要時(shí)利用適當(dāng)修飾，且所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可利用本文中的公開(kāi)內(nèi)容來(lái)進(jìn)行)添加其它官能團(tuán)(包括(但不限于)以上所列的官能團(tuán))和/或其它Fc分子。
應(yīng)了解，本文中所述的實(shí)例和實(shí)施例僅出于說(shuō)明性目的且將提示給所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員根據(jù)其作出的各種修飾和變化且所述修飾和變化包括在本申請(qǐng)文件的精神和權(quán)限和附加權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。本申請(qǐng)文件中所引用的所有公開(kāi)文獻(xiàn)、專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)文件和/或其它文獻(xiàn)出于所有目的以全文引用的方式并入本文中，引用的程度就如同已個(gè)別地將各個(gè)公開(kāi)文獻(xiàn)、專(zhuān)利案、專(zhuān)利申請(qǐng)文件和/或其它文獻(xiàn)出于所有目的以引用的方式并入一般。




P095436CN seq.txt
序列表
<110>約瑟夫·謝菲爾
席雅·諾曼
理查D.·戴馬基
安娜-瑪麗亞·A.·海斯·普特南
田鋒
斯蒂芬妮·周
丹尼斯·克拉維茲
曹豪崇
<120>經(jīng)修飾的人類(lèi)血漿多肽或Fc骨架和其用途
<130>AMBX-0122.00PCT
<150>60/843，215
<151>2006-09-08
<150>60/928，485
<151>2007-05-08
<160>25
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>609
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>1
<210>2
<211>1830
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>2
<210>3
<211>77
<212>DNA
<213>Methanococcus jannaschii
<400>3
<210>4
<211>77
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工tRNA
<400>4
<210>5
<211>89
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工tRNA
<400>5
<210>6
<211>306
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人工合成酶
<400>6
<210>7
<211>305
<212>PRT
<213>人工
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<223>人工合成酶
<400>7
<210>8
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<212>PRT
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<212>PRT
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<223>人工合成酶
<400>9
<210>10
<211>305
<212>PRT
<213>人工
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<223>人工合成酶
<400>10
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<213>人工
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<213>人工
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<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人工合成酶
<400>18
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<211>306
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人工合成酶
<400>19
<210>20
<211>744
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>20
<210>21
<211>247
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>21
<210>22
<211>227
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>22
<210>23
<211>684
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>23
<210>24
<211>82
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>24
<210>25
<211>1299
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>2權(quán)利要求
1.一種hPP或hA多肽，其包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一個(gè)或一個(gè)以上翻譯后修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述多肽與連接子、聚合物或生物活性分子連接。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的hPP或hA多肽，其中所述多肽與水溶性聚合物連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述多肽與雙官能聚合物、多官能聚合物、雙官能連接子、多官能連接子或至少一個(gè)生物活性分子連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的hPP或hA多肽，其中所述連接子或聚合物與第二種多肽連接。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的hPP或hA多肽，其中所述第二種多肽為生物活性分子。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物與所述hPP或hA多肽中存在的非天然編碼氨基酸連接。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸是在選自由以下殘基組成的群組的位置處經(jīng)取代SEQ ID NO1的17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、574、581。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一個(gè)或一個(gè)以上調(diào)節(jié)所述hPP或hA的至少一種生物活性的氨基酸取代、添加或缺失。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一個(gè)或一個(gè)以上增加所述hPP或hA多肽的穩(wěn)定性或溶解性的氨基酸取代、添加或缺失。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一個(gè)或一個(gè)以上增加所述hPP或hA多肽在重組宿主細(xì)胞中的表達(dá)或活體外合成的所述hPP或hA多肽的氨基酸取代、添加或缺失。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一個(gè)或一個(gè)以上增加所述hPP或hA多肽的蛋白酶抗性的氨基酸取代、添加或缺失。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸與不與所述多肽中的20種常見(jiàn)氨基酸中的任一種反應(yīng)的連接子、聚合物或生物活性分子反應(yīng)。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、疊氮基或炔基。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸具有如下結(jié)構(gòu)
其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基或經(jīng)取代芳基；R2為H、烷基、芳基、經(jīng)取代烷基以及經(jīng)取代芳基；且R3為H、氨基酸、多肽或氨基末端修飾基團(tuán)；且R4為H、氨基酸、多肽或羧基末端修飾基團(tuán)。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含氨氧基。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含酰肼基。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含肼基。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸殘基包含氨基脲基。
24.根據(jù)權(quán)利要求18所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸殘基包含疊氮基。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸具有如下結(jié)構(gòu)
其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基、經(jīng)取代芳基或不存在；X為O、N、S或不存在；m為0-10；R2為H、氨基酸、多肽或氨基末端修飾基團(tuán)；且R3為H、氨基酸、多肽或羧基末端修飾基團(tuán)。
26.根據(jù)權(quán)利要求18所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含炔基。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸具有如下結(jié)構(gòu)
其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基或經(jīng)取代芳基；X為O、N、S或不存在；m為0-10；R2為H、氨基酸、多肽或氨基末端修飾基團(tuán)；且R3為H、氨基酸、多肽或羧基末端修飾基團(tuán)。
28.根據(jù)權(quán)利要求4所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物具有約0.1kDa與約100kDa之間的分子量。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物具有約0.1kDa與約50kDa之間的分子量。
30.根據(jù)權(quán)利要求4所述的hPP或hA多肽，其是通過(guò)使包含含羰基的氨基酸的hPP或hA多肽與包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的水溶性聚合物反應(yīng)來(lái)制備。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的hPP或hA多肽，其中所述氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基通過(guò)酰胺鍵與所述水溶性聚合物連接。
32.根據(jù)權(quán)利要求4所述的hPP或hA多肽，其是通過(guò)使包含羰基的水溶性聚合物與包含包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的非天然編碼氨基酸的多肽反應(yīng)來(lái)制備。
33.根據(jù)權(quán)利要求4所述的hPP或hA多肽，其是通過(guò)使包含含炔的氨基酸的hPP或hA多肽與包含疊氮部分的水溶性聚合物反應(yīng)來(lái)制備。
34.根據(jù)權(quán)利要求4所述的hPP或hA多肽，其是通過(guò)使包含含疊氮基的氨基酸的hPP或hA多肽與包含炔部分的水溶性聚合物反應(yīng)來(lái)制備。
35.根據(jù)權(quán)利要求18所述的hPP或hA多肽，其中所述疊氮基或炔基通過(guò)酰胺鍵與水溶性聚合物連接。
36.根據(jù)權(quán)利要求4所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物為分支或多臂聚合物。
37.根據(jù)權(quán)利要求48所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物的各分支具有約1kDa與約100kDa之間的分子量。
38.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含糖部分。
39.根據(jù)權(quán)利要求3所述的hPP或hA多肽，其中所述連接子、聚合物或生物活性分子經(jīng)由糖部分與所述多肽連接。
40.一種編碼SEQ ID NO1中所述的氨基酸序列的經(jīng)分離多核苷酸分子，其包含選擇密碼子，其中所述選擇密碼子是選自由琥珀密碼子、赭石密碼子、蛋白石密碼子(opal codon)、獨(dú)特密碼子、稀有密碼子以及四個(gè)堿基的密碼子組成的群組。
41.一種制備根據(jù)權(quán)利要求3所述的hPP或hA多肽的方法，所述方法包含使包含非天然編碼氨基酸的經(jīng)分離hPP或hA多肽與包含與所述非天然編碼氨基酸反應(yīng)的部分的連接子、聚合物或生物活性分子接觸。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述聚合物包含選自由水溶性聚合物和聚(乙二醇)組成的群組的部分。
43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、疊氮基或炔基。
44.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基部分且所述連接子、聚合物或生物活性分子包含氨氧基、肼、酰肼和氨基脲部分。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分通過(guò)酰胺鍵與所述連接子、聚合物或生物活性分子連接。
46.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含炔部分且所述連接子、聚合物或生物活性分子包含疊氮部分。
47.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含疊氮部分且所述連接子、聚合物或生物活性分子包含炔部分。
48.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述疊氮部分或炔部分通過(guò)酰胺鍵與連接子、聚合物或生物活性分子連接。
49.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述聚(乙二醇)部分具有約0.1kDa與約100kDa之間的平均分子量。
50.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述聚(乙二醇)部分為分支或多臂聚合物。
51.一種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的組合物，其中所述非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。
53.一種治療患有由hPP或hA調(diào)節(jié)的病癥的患者的方法，所述方法包含向所述患者給予治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求51所述的組合物。
54.一種細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求40所述的核酸。
55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含正交tRNA合成酶或正交tRNA。
56.一種制備包含非天然編碼氨基酸的hPP或hA多肽的方法，所述方法包含在允許所述包含非天然編碼氨基酸的hPP或hA多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)包含一種或一種以上編碼hPP或hA多肽的包含選擇密碼子、正交RNA合成酶和正交tRNA的多核苷酸的細(xì)胞；和純化所述hPP或hA多肽。
57.一種調(diào)節(jié)hPP或hA多肽的血清半衰期或循環(huán)時(shí)間的方法，所述方法包含用一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸取代所述hPP或hA多肽中的任何一個(gè)或一個(gè)以上天然存在氨基酸。
58.一種由具有SEQ ID NO1中所示的序列的多核苷酸編碼的hPP或hA多肽，其中所述多核苷酸包含選擇密碼子且其中所述多肽包含至少一種非天然編碼氨基酸。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸與連接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子連接。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
61.根據(jù)權(quán)利要求58所述的hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸是在選自由以下殘基組成的群組的位置處經(jīng)取代SEQ ID NO1的17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、574、581和其任何組合。
62.根據(jù)權(quán)利要求58所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、疊氮基或炔基。
63.根據(jù)權(quán)利要求60所述的hPP或hA多肽，其中所述聚(乙二醇)部分具有約0.1kDa與約100kDa之間的分子量。
64.根據(jù)權(quán)利要求60所述的hPP或hA多肽，其中所述聚(乙二醇)部分為分支或多臂聚合物。
65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的hPP或hA多肽，其中所述聚(乙二醇)部分具有約1kDa與約100kDa之間的分子量。
66.一種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求58所述的hPP或hA多肽和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑。
67.一種hPP或hA多肽，其包含一個(gè)或一個(gè)以上增加所述hPP或hA多肽在重組宿主細(xì)胞中的表達(dá)的氨基酸取代、添加或缺失。
68.一種包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸與選自由小有機(jī)分子、以化學(xué)方式合成的肽、用核糖體合成的多肽、聚合物和連接子組成的群組的分子鍵結(jié)。
69.一種hPP或hA多肽，其包含在單個(gè)氨基酸處通過(guò)共價(jià)鍵與所述hPP或hA多肽連接的水溶性聚合物。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
71.根據(jù)權(quán)利要求69所述的hPP或hA多肽，其中所述與所述水溶性聚合物共價(jià)連接的氨基酸為非天然編碼氨基酸。
72.根據(jù)權(quán)利要求71所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸是在選自如下群組的位置處經(jīng)取代對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、574、581。
73.一種包含至少一個(gè)連接子、聚合物或生物活性分子的hPP或hA多肽，其中所述連接子、聚合物或生物活性分子通過(guò)經(jīng)核糖體并入所述多肽中的非天然編碼氨基酸的官能團(tuán)與所述多肽連接。
74.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一個(gè)或一個(gè)以上調(diào)節(jié)所述hPP或hA多肽的免疫原性的氨基酸取代、添加或缺失。
75.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一個(gè)或一個(gè)以上調(diào)節(jié)生物活性分子的血清半衰期或循環(huán)時(shí)間的氨基酸取代、添加或缺失。
76.一種調(diào)節(jié)生物活性分子的免疫原性的方法，所述方法包含用一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸取代所述hPP或hA多肽中的任何一個(gè)或一個(gè)以上天然存在氨基酸。
全文摘要
本發(fā)明提供經(jīng)修飾的人類(lèi)血漿多肽或Fc和其用途。
文檔編號(hào)C07K14/765GK101511866SQ200780033084
公開(kāi)日2009年8月19日 申請(qǐng)日期2007年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月8日
發(fā)明者約瑟夫·謝菲爾, 席雅·諾曼, 理查D.·戴馬基, 斯蒂芬妮·周, 安娜-瑪麗亞·A.·海斯·普特南, 鋒 田, 丹尼斯·克拉維茲, 曹豪崇 申請(qǐng)人:Ambrx公司