專利名稱：對映異構(gòu)體-富集的碳酸亞烷酯的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通式(I)的對映異構(gòu)體-富集的碳酸亞烷酯，特別地，(R)-碳 酸丙烯酯(Ia; R^甲基)的制備方法，
R,
所述方法通過對映選擇性地酶促還原通式(II)的O-取代的羥基丙酮，
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并隨后環(huán)化形成的式(in)的醇
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或由式(III)的化合物的重排而形成的其區(qū)域異構(gòu)體(regioisomers)(IV)而
進(jìn)行<<formula>formula see original document page 5</formula>
背景技術(shù)：
對映異構(gòu)體-富集的碳酸亞垸酯，特別地，(R)-碳酸丙烯酯是具有醫(yī)藥 意義的。因此，(R)-碳酸丙烯酯在制備藥物活性物質(zhì)中用作中間體，如以下 文獻(xiàn)所描述，EP 1243590、 EP 915894和L. M. Schultze， H. H. Chapman, N. J. P. Dubree， R. J. Jones, K. M. Kent, T. T. Lee， M. S. Louie, M. J. Postich, E. J.Prisbe， J. C. Rohloff， R. H. Yu， Tetrahedron Lett. 1998， 39， 1853-1856。
(R)-碳酸丙烯酯通常在兩步過程中"間接地"合成，其中，由手性的， 優(yōu)選已合成的對映異構(gòu)體純的(R)-丙二醇開始，在第一步中分離并純化，在 第二步中進(jìn)行環(huán)化以形成(R)-碳酸丙烯酯。環(huán)化例如通過在堿作為催化劑存 在下在醇作為溶劑中與碳酸二烷基酯反應(yīng)而進(jìn)行(EP 1243590、 EP 915894 和L, M. Schultze, H, H. Chapman, N. J. P. Dubree, R. J. Jones, K. M. Kent, T. T. Lee, M. S. Louie, M. J. Postich, E. J. Prisbe， J. C. Rohloff， R. H. Yu， Tetrahedron Lett. 1998, 39， 1853-1856)。使用碳酸二甲酯作為碳酸二垸基酯組 分，以65。/。的產(chǎn)率獲得(R)-碳酸丙烯酯(EP 943612)。對于制備和分離(R)-1,2-丙二醇，已知有多種方法，例如通過氧化(8)-對映異構(gòu)體而分離外消旋-1，2-丙二醇的外消旋混合物(T. Kometani， H. Yoshii, Y. Takeuchi， R. Matsuno, J. Ferm. Bioeng. 1993， 76， 414-415， T. Kometani， Y Morita， H. Yoshii， Y. Kiyama, R. Matsuno, J. Ferm. Bioeng. 1995, 80, 180-184, JP 2004041076, US 2006019359)，通過環(huán)氧化物開環(huán)而分離外消旋-氧化丙烯的外消旋混合物(Y. Song, X. Yao, H: Chen, C. Bai, X. Hu， Z. Zheng, Tetrahedron Lett; 2002， 43， 6625-6627, D. E. White, E. N. Jacobsen, Tetrahedron: Asymmetiy 2003， 14, 3633-3638， S. S. Thakur， W. Li， S.-J. Kim, G國J. Kim， Tetrahedron Lett. 2005， 46， 2263-2266)或羥基丙酮的非對稱還原(DE 3830253， K. Yamada-Onodera， N. Kawahara, Y Tani, H. Yamamoto, Eng. Life Sci. 2004， 4, 413-417， JP 7059592)。
另外，由已經(jīng)制得的手性化合物(R)-縮水甘油制備(R)-l,2-丙二醇也已 經(jīng)報道(EP 1243590、 EP 915894和L. M. Schultze, H. H. Chapman, N. J. P. Dubree, R. J. Jones, K. M. Kent, T. T. Lee， M. S. Louie, M. J. Postich， E. J. Prisbe， J, C. Rohloff, R. H. Yu， Tetrahedron Lett. 1998， 39, 1853-1856)。該方法 的不利通常在于在與隨后的環(huán)化分離的第一步中-手性化合物的制備-作為 最耗費成本的步驟，并且需要分離(R)-l,2-丙二醇。因此，這導(dǎo)致了總體的 高成本，尤其是當(dāng)考慮在兩個步驟中的產(chǎn)率損失時。
制備(R)-碳酸丙烯酯的另一方法是在手性金屬催化劑存在下用二氧化 碳分離外消旋-環(huán)氧丙垸的外消旋混合物(X. -B. Lu， B. Liang， Y. -J. Zhang, T. —Z. Tian, Y. —M. Wang, C. -X. Bai， H. Wang, R. Zhang, J. Am. Chem. Soc. 2004,
6126， 3732-3733)。使用包含手性沙侖-鈷(III)絡(luò)合物和季銨鹽，優(yōu)選地四-(正 丁基)氯化銨的催化劑體系，進(jìn)行理想的反應(yīng)，形成對映選擇性不高于70% ee的(R)-碳酸丙烯酯，轉(zhuǎn)化率為40%。除了對映選擇性最大為70% ee，這 對于工業(yè)藥物應(yīng)用是太低的之外，這些方法的缺點是對分離外消旋混合物 的總體限制，(R)-碳酸丙烯酯最大可獲得的轉(zhuǎn)化率為50%。
另外，(R)-碳酸丙烯酯可以由其外消旋體通過酶促外消旋體分離制備 (JP 3747640)。在含水反應(yīng)混合物中，使用微生物酵母拮抗菌(Ciyptococcus laurentii)，獲得(R)-碳酸丙烯酯，對映選擇性為98Q/。ee。該過程的缺點也是 在于對外消旋體分離的總體限制，(R)-碳酸丙烯酯最大可獲得的轉(zhuǎn)化率為 50%。
對于經(jīng)濟(jì)上高度誘人的方法，理想地是-成本最集中的-關(guān)鍵步驟總是應(yīng) 該與環(huán)化結(jié)合，而不是分離和特別地對各自的對映異構(gòu)體純的中間體的純 化。因此，原則上，最有效的合成路線無疑是直接非對稱地轉(zhuǎn)化相應(yīng)廉價 的且易于獲得的前手性底物至對映異構(gòu)體純的中間體并隨后環(huán)化未分離的 或純化的中間體至(R)-碳酸丙烯酯。而且，前手性中間體至理想的產(chǎn)物的非 對稱轉(zhuǎn)化提供了定量轉(zhuǎn)化的可能性(理論上100%的轉(zhuǎn)化率)，這尤其是相對 于目前己知的最大轉(zhuǎn)化率僅為50%的外消旋體分離方法來說是明顯有利 的。
然而，對于該提出的由廉價的前手性化合物"直接"合成(R)-碳酸丙烯 酯，沒有已知的方法，除了前述的由羥基丙酮制備(R)-l，2-丙二醇，隨后在 第二步中環(huán)化至(R)-碳酸丙烯酯。鑒于對于(R)-碳酸丙烯酯的制備已發(fā)展的 大量方法，這是極其出人意料的。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種制備對映異構(gòu)體-富集的碳 酸亞烷酯，特別地(R)-碳酸丙烯酯的方法，由此方法可以由廉價的前手性化 合物開始以簡單的方式以高度的轉(zhuǎn)化率和高度的對映異構(gòu)體過量來制備該 化合物。本發(fā)明的另一要解決的技術(shù)問題是提供對于制備對映異構(gòu)體-富集 的碳酸亞垸酯，特別地(R)-碳酸丙烯酯來說新穎的，特別合適的中間體。本 發(fā)明解決的還一技術(shù)問題是設(shè)計對映異構(gòu)體-富集的碳酸亞烷酯，特別地
7(R)-碳酸丙烯酯的制備路線，以使得從工業(yè)角度上，該合成相對于經(jīng)濟(jì)和生 態(tài)的考慮是有利的，并且在這些方面中相對于現(xiàn)有技術(shù)的合成是優(yōu)越的。
這些問題以及由現(xiàn)有技術(shù)來看是明顯的在此未列出的其它問題通過權(quán) 利要求1的方法得以解決。根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)選實施方式列于從屬權(quán) 利要求中。提供對于制備對映異構(gòu)體-富集的碳酸亞垸酯，特別地(R)-碳酸 丙烯酯來說是新穎的，特別合適的中間體的這一問題由權(quán)利要求12的化合 物解決。
在通式(I)的對映異構(gòu)體-富集的碳酸亞垸酯的制備方法中，
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其中，R'代表線性的或任選枝化的(CrQ)-垸基或(C3-C8)-環(huán)烷基，該問 題以簡單但有利的方式解決，其是首先將式(II)的衍生物轉(zhuǎn)化為式(III)的對 映異構(gòu)體-富集的醇，
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其中，R2代表(d-Cs)-烷基、(C2-Q)-烷氧基烷基、(C6-C8)-芳基、(C7-C19)-芳垸基、(Crd8)-雜芳基、(CVd9)-雜芳烷基、(Q-Cs)-烷基-(C6-d8)-芳基、
(C廣C8)-烷基-(C3-d8)-雜芳基、(C3-Cs)-環(huán)烷基、(C廣Q)-烷基-(C3-C8)-環(huán)垸基、
(c3-Cs)-環(huán)烷基-(d-c8)-垸基，或者在ie僅代表負(fù)電荷的情形中，可以代表 它們的鹽，
然后，將式(in)的該化合物或通過重排式(m)的醇而形成的式(iv)的區(qū)
域異構(gòu)體環(huán)化為式(I)的對映異構(gòu)體-富集的碳酸亞烷酯。
<formula>formula see original document page 8</formula>通過上述過程，可以以大于卯％的產(chǎn)率和相應(yīng)好的對映異構(gòu)體純度也
大于90% ee獲得環(huán)狀碳酸酯。預(yù)期必然發(fā)生的由于在水介質(zhì)中不穩(wěn)定的碳 酸酯的斷裂的結(jié)果形成副產(chǎn)物而導(dǎo)致的產(chǎn)率降低，出人意料地，僅以可忽 略的程度被觀察到或幾乎不存在。
特別地，該方法用于由相應(yīng)的衍生物(上述式11中的11=甲基)開始，制 備(R)-碳酸丙烯酯。
本發(fā)明包括對映選擇性的還原存在于分子式(II)中的酮基作為關(guān)鍵步 驟。所述還原原則上可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員會考慮到的方法進(jìn)行。特別
是催化方法是有利的。在這方面，利用化學(xué)催化劑和/或生物催化劑將式(n)
的衍生物轉(zhuǎn)化為式(III)的醇是尤其有利的。使用生物催化劑是特別有利的。 本領(lǐng)域技術(shù)人員為此目的所會考慮到的所有酶均可以被認(rèn)為是生物催化 劑。然而，對于所述還原，醇脫氫酶或甘油脫氫酶已經(jīng)特別地被證實是有 利的。優(yōu)選地，對于所述目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇醇脫氫酶。本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的該類的所有酶原則上都可以用作在根據(jù)本發(fā)明方法中可用作 合適的生物催化劑的醇脫氫酶，前提是它們能夠催化根據(jù)本發(fā)明方法中所 用的轉(zhuǎn)化/反應(yīng)。這可以以常規(guī)實驗確立。這些脫氫酶優(yōu)選地源于細(xì)菌微生 物或酵母。優(yōu)選使用至少一種選自如下生物體的醇脫氫酶高加索酸奶乳 桿菌(Lactobacillus kefir)(LK-ADH)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)(LB-ADH) 或布氏熱厭氧菌(Thermoanaerobium brockii)(TB-ADH) (ADH來自 Lactobacillus kefir: a) EP 456107; b) C. W. Bradshaw, W. Hummel， C. —H. Wong， J. Org. Chem. 1992， 57, 1532-1536; c) PCT/EP2005/06215). (ADH來自 L brevis: a) EP 796914; b) K. Niefmd, B. Riebel, J. Muller, W. Hu腿el， D. Schomburg, Acta Crystallogr" Sect. D: Biol. Crystallogr. 2000, D56, 1696-1698; c) M. Wolberg, W. Hummel, C. Wandrey， M. Muller, Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39， 4306-4308). (ADH來自T. Brockii: a) E. Keinan, E. K, Hafeli， K. K. Seth, R. Lamed， J. Am. Chem. Soc. 1986, 108， 162-169; b) T. R. Rothig， K. D.
9Kulbe， R Buckmann, G. Carrea, Biotechnol, Lett. 1900, 12， 353-356; c) J. Peters: M. R. Kula, Biotechnol. Appl. BioChem. 1991, 13, 363-370)。
原則上在根據(jù)本發(fā)明的方法中可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的形式使用 醇脫氫酶(參見如下)。然而，由于醇脫氫酶是氧化還原酶、基于輔因子的酶， 為了成功進(jìn)行還原，對于所用的酶所需的輔因子必須在反應(yīng)混合物中以足 夠的量存在，以保證酮的完全轉(zhuǎn)化。由于這些輔因子是相對較貴的分子， 基于經(jīng)濟(jì)的原因，使用最小可能量的輔因子是決定性的優(yōu)勢。能夠使用比 化學(xué)計量需要量少的輔因子的一種可能方法是用存在于批料中的第二生物 催化劑再生該輔因子。在所述體系中，(例如，有機(jī))化合物的酶促轉(zhuǎn)化與輔 因子的"消耗" 一起發(fā)生，而該輔因子通過第二酶促體系就地再生。結(jié)果 是這實現(xiàn)了所需的昂貴的輔因子的量的減少。因此，通過偶聯(lián)酶促體系的 反應(yīng)代表了有利的技術(shù)。該類型的偶聯(lián)體系例如在DE-A 10233046或DE-A 10233107中提及。因此，優(yōu)選其中式(II)的衍生物在偶聯(lián)酶促體系協(xié)助下被 還原的該變體，該偶聯(lián)酶促體系包含醇脫氫酶和再生醇脫氫酶的輔因子的 酶。所用的再生輔因子的酶一方面基于所用的輔因子，但是另一方面還基 于待氧化或還原的輔底物。對于再生NAD(P)H的一些酶在Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, Ed.: K. Drauz, H, Waldmann， 1995， Vol I， VCH, p. 721中 提及。所謂的甲酸酯脫氫酶(FDH)(還參見DE-A 10233046)和另外所謂的葡 萄糖脫氫酶(a) M. Kataoka， K. Kita， M. Wada， Y. Yasohara， J. Hasegawa, S. Shimizu, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003, 62, 437-445; b) PCT Pat. Appl. WO 2005121350， 2005)是商業(yè)上有興趣的并且可以大規(guī)模獲得，目前用于合 成氨基酸和醇，并且因此是有利的。因此，它們可以優(yōu)選地用于本發(fā)明的 方法中以再生輔因子。非常優(yōu)選的是，F(xiàn)DH衍生自生物體甲醇酵母。還可 以使用其另外的突變體，例如描述于DE-A 19753350中。而且，可以優(yōu)選 使用來自枯草桿菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脫氫酶(參見W. Hilt, G. Pfleiderer， R Fortnagel， Biochim. Biophys. Acta 1991， 1076， 298誦304)或嗜酸熱 原體菌(Thermoplasma acidophilum)(參見J. R. Bright, D. Byrom， M. J. Danson: D. W. Hough， P. Towner, Eur. J. BioChem. 1993， 211， 549-554)。然而，再生還 可以是底物偶聯(lián)的，例如使用異丙醇(用異丙醇進(jìn)行輔因子再生技術(shù)的實例: a) W. Stampfer, B. Kosjek, C. Moitzi， W. Kroutil, K. Faber， Angew. Chem. 2002，114， 1056-1059; b) M. Wolberg W. Hummel， C. Wandrey, M. Muller, Angew. Chem. 2000, 112, 4476-4478)。
根據(jù)本發(fā)明的方法，立體定向轉(zhuǎn)化/反應(yīng)可以在適合于該反應(yīng)的任何介 質(zhì)中進(jìn)行。催化例如可以在純的水溶液或富集有機(jī)溶劑的含水介質(zhì)中進(jìn)行。 它們可以是單相的或多相體系。對于本發(fā)明的方法，選擇的反應(yīng)介質(zhì)沒有 限制，前提是選擇的酶可以催化其中的理想的立體選擇反應(yīng)。
考慮到高的體積生產(chǎn)率，有利的是在高的初始底物濃度下進(jìn)行該方法。 這些濃度典型地是>50 g/L，優(yōu)選〉100g/L和特別優(yōu)選〉150g/L。而且，通過 在催化轉(zhuǎn)化期間連續(xù)地供應(yīng)新鮮的底物溶液，可以任選地維持底物濃度。
原則上，可以在任何合適的溫度下進(jìn)行該方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員將優(yōu) 選以盡可能高的純度和以盡可能短的時間盡可能高地獲得理想產(chǎn)物的收 率。而且，所用的酶應(yīng)該在所用的溫度下充分穩(wěn)定，并且反應(yīng)應(yīng)該以盡可 能高的對映選擇性進(jìn)行。當(dāng)使用來自嗜熱生物體的酶時，例如可以達(dá)到甚 至IO(TC的溫度。溫度主要基于所用的酶的催化最優(yōu)化。作為含水體系中的 下限，-15。C無疑是合理的。在10-6(TC，特別優(yōu)選20-40。C之間的溫度范圍 對于根據(jù)本發(fā)明的方法是優(yōu)選的，并且主要基于上述的標(biāo)準(zhǔn)。
反應(yīng)期間的pH值也主要基于所用的酶和輔因子的穩(wěn)定性，并且可以通 過測定轉(zhuǎn)化率而確定，以及相應(yīng)地對于根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行調(diào)整。通常， 對于酶的優(yōu)選范圍是pH值為5-11，但是在例外的情形中，如果所用的酶的 一種在較低或較高值處具有其最大的催化活性，可以高于或低于該值。優(yōu) 選地，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，pH范圍5.5-10.0，特別優(yōu)選6.0-9.0可以用 于進(jìn)行該反應(yīng)。
對于應(yīng)用，根據(jù)本發(fā)明的方法所用的酶，尤其是脫氫酶可以作為均勻 純化的化合物以游離的形式使用，或作為通過重組技術(shù)制得的酶使用。另 外，這些多肽還可以用作完整的"宿主生物體"的成分(基因改性的微生物) 或與根據(jù)需要已經(jīng)純化的并且如果需要蒸煮過的宿主生物體的細(xì)胞群結(jié)
合o
當(dāng)單獨使用"游離于(細(xì)胞-)的"酶時，還可以使用這些酶的固定形式
(Sharma B. R; Bailey L. F. and Messing R. A. (1982)， Immobilized Biomaterials -Techniques and Applications, Angew. Chem. 94, 836-852)。固定優(yōu)選地通過冷凍干燥進(jìn)行(Paradkar， V. M.; Dordick， J. S. (1994), Aqueous-Like Activity of a-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhydrous Organic Solvents, J. Am. Chem. Soc. 116， 5009-5010; Mori, T,; Okahata, Y. (1997)， A variety of lipid-coated glycoside hydrolases as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic solvents, Tetrahedron Lett. 38， 1971-1974; Otamiri， M.; Adlercreutz， P.; Matthiasson, B. (1992), Complex formation between chymotrypsin and ethyl cellulose as a means to solubilize the enzyme in active form in toluene, Biocatalysis 6， 291-305)。特別優(yōu)選在表面活性物質(zhì)，例如Aerosol OT,聚乙 烯基吡咯烷酮，聚乙二醇(PEG)或Brij 52(二乙二醇單鯨蠟基醚)存在下的冷 凍干燥(Kamiya， N.; Okazaki， S.畫Y.; Goto, M. (1997)， Surfactant-horseradish peroxidase complex catalytically active in anhydrous benzene, Biotechnol. Tech. ll,375-378)，盡管并不限于此。尤其優(yōu)選在Eupergit⑧，特別地Eupergit C 禾口 Eupergit 250 L (Rohm)上的固定(Eupergit. RTM. C, a carrier for immobilization of enzymes of industrial potential. Katchalski-Katzir， E.; Kraemer， D. M. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic (2000)， 10(1-3)， 157-176)。
還優(yōu)選的是與補(bǔ)加His-Tag(六-組氨酸)的多肽組合在Ni-NTA上的固定 (Purification of proteins using polyhisti.dine affinity tags. Bornhorst， Joshua A.; Falke， Joseph J. Methods in Enzymology (2000)， 326, 245-254)。
還可以想到使用CLEC(St. Clair， N.; Wang， Y. —F.; Margolin, A. L. (2000)， Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals (CLEC) of alcohol dehydrogenase, Angew. Chem. Int. Ed. 39， 380-383)。
這些方法也適用于由被有機(jī)溶劑導(dǎo)致不穩(wěn)定的分離的"游離的"形式 的多肽再生在含水和有機(jī)溶劑的混合物中或者在完全的有機(jī)介質(zhì)中顯示催 化活性的多肽。
在此描述的方法還可以在分離的酶(或由其衍生的固定物)在合適的反 應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行，但是在特別優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法利用用 于反應(yīng)的全細(xì)胞催化劑進(jìn)行，即，包含(至少一個)全細(xì)胞的體系，該細(xì)胞優(yōu) 選地能夠同時表達(dá)理想的醇脫氫酶和再生輔因子的酶。重組全細(xì)胞催化劑 是特別合適的(出于對于對映選擇性還原利用重組全細(xì)胞催化劑的方法的觀
12點，例如參見PCT/EP2005/06215)。因此，該細(xì)胞優(yōu)選地表達(dá)至少一種具有 醇脫氫酶活性的酶(多肽)和至少一種具有再生所用的輔因子的活性的酶。這 些所用的酶和/或細(xì)胞優(yōu)選源自前述的生物體。
或者，當(dāng)使用異丙醇進(jìn)行輔因子再生時，還可以使用優(yōu)選表達(dá)至少一 種具有醇脫氫酶活性的酶(多肽)和僅任選地一種具有再生所用的輔因子的 活性的酶的細(xì)胞。
可以使用的合適的微生物原則上是本領(lǐng)域技術(shù)人員為此目的已知的所 有生物體，例如酵母，如漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、畢赤酵母(Pichia sp.)、酵母多糖A(Saccharomycescerevisiae);原核生物，如大腸桿菌(E. coli)、 枯草桿菌或真核生物，如哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等。優(yōu)選地，大腸桿菌 的菌株可以用于此目的，特別是大腸桿菌XLl Blue, NM 522， JM101, JM 109: JM105， RR1， DH5a， TOP I(T或HBIOI。這些菌株是已知的并且可以商購獲 得。非常優(yōu)選的是使用生物體作為宿主生物體，如DE-A 10155928中所述。
所述生物體的優(yōu)點是同時表達(dá)適合于根據(jù)本發(fā)明方法的兩種多肽體 系，從而僅一種重組的(基因改性的)生物體必須用于本發(fā)明的方法。為了相 對于理想的催化活性，匹配多肽(酶)的表達(dá)，相應(yīng)的編碼核酸序列可以位于 具有不同拷貝數(shù)的不同質(zhì)粒上，和/或具有不同強(qiáng)度的啟動子可以用于不同 強(qiáng)度地表達(dá)核酸序列。對于以此方式匹配的酶體系，有利地是不發(fā)生中間 體的累積，并且反應(yīng)能以最優(yōu)的總體速度進(jìn)行。然而，這對于本領(lǐng)域技術(shù) 人員來說是充分熟知的(Gellissen， G.; Piontek， M.; Dahlems， U.; Jenzelewski， V.; Gavagan， J. W.; DiCosimo， R.; Anton, D. L.; Janowicz, Z. A. (1996)， Recombinant Hansenula polymorpha as a biocatalyst. Coexpression of the spinach glycolate oxidase (GO) and the S. cerevisiae catalase T (CTT1) gene, Appl, Microbiol, Biotechnol. 46， 46-54; Farwick， M.; London, M.; Dohmen， J，； Dahlems， U.; Gellissen， G.; Strasser， A. W.; DE-A 19920712)。任選地，還可以 加入催化劑量的輔因子至全細(xì)胞生物催化劑。
用作"全細(xì)胞催化劑"的微生物的制備，如果需要進(jìn)行基因改性，可 以原則上通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行(Sambrook, J.; Fritsch, E. F. and Maniatis， T. (1989》Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Balbas， R And Bolivar, F. (1990)，
13Design and construction of expression plasmid vectors in E. coli， Methods Enzymol. 185, 14-37; Rodriguez, R. L. And Denhardt, D. T (eds) (1988)， Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 205-225， Butterworth, Stoneham)。關(guān)于常規(guī)過程中所用的技術(shù)(PCR、克隆、表達(dá)等)， 可以參見如下文獻(xiàn)和其中所引用的文獻(xiàn)Universal GenomeWalker Kit User Manual, Clontech， 3/2000和其中所引用的文獻(xiàn)；TrigliaT.; Peterson, M. G. and Kemp, D. J. (1998)， A procedure for in vitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences, Nucleic Acids Res. 16, 8186; Sambrook， J.; Fritsch， E. F. and Maniatis， T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed,, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Rodriguez, R. L. and Denhardt, D. T. (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworth, Stoneham.
優(yōu)選地，例如將反應(yīng)體系用于攪拌反應(yīng)器、攪拌反應(yīng)器的級聯(lián)或膜反 應(yīng)器中，其可以間歇地和連續(xù)地進(jìn)行。然而，其中能進(jìn)行本發(fā)明方法的任
何類型的體系都是合適的。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，"膜反應(yīng)器"是指其中催化 劑包封在反應(yīng)器中的任何反應(yīng)容器，而將低分子量材料供至反應(yīng)器或可以 離開反應(yīng)器。膜可以直接加入反應(yīng)空間中或可以安裝在分離過濾模塊的外 部，反應(yīng)溶液連續(xù)地或間斷地通過過濾模塊流動并且剩余材料返回至反應(yīng) 器。合適的實施方式描述于W098/22415和Wandrey et al， Jahrbuch 1998中， Verfahrenstechnik: und Chemieingenieurwesen, VDI p. 15 Iff.; Wandrey et al, Applied Homogeneous Catalysis with Organometallic Compounds, Vol. 2, VCH 1996， p. 832 ff.; Kragl et al.， Angew. Chem. 1996， 6, 684f中。
除了間歇和半連續(xù)操作，在該裝置中可以進(jìn)行的連續(xù)操作模式可以例 如在錯流過濾模式中進(jìn)行或作為死端過濾進(jìn)行。兩種過程變體原則上描述 于王見有技術(shù)中(Engineering Processes for Bioseparations, Ed.: L. R. "Weatherley， Heinema叫1994， 135-165; Wandrey et al., Tetrahedron Asymmetry 1999， 10， 923-928)。
在非常優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法以單罐反應(yīng)進(jìn)行。 式(III)和式(IV)的對映異構(gòu)體-富集的醇，
14其中，R2代表(d-C8)-烷基、(C2-Q)-烷氧基烷基、(C2-Q)-烯基、(C2-C8)-炔基、(C6-C,8)-芳基、(CrC,9)-芳垸基、(C3-ds)-雜芳基、(C4-C,9)-雜芳烷基、 (C廣C8)-垸基-(C6-d8)-芳基、(C廣C8)-烷基-(C3-C,8)-雜芳基、(CrC8)-環(huán)垸基、 (C廣C8)-垸基-(C3-Cs)-環(huán)烷基、(C3-C8)-環(huán)烷基-(d-Q)-烷基，或者在W僅代
表負(fù)電荷的情形中，可以代表它們的鹽。對映異構(gòu)體-富集優(yōu)選是〉90。/。ee， >95% ee或>96% ee和尤其>97% ee。
對于通過本發(fā)明的方法制備碳酸亞垸酯，特別地(R)-碳酸丙烯酯(I)，優(yōu) 選地，首先將式(II)的相應(yīng)衍生物溶于優(yōu)選含水的溶劑中。任選地，加入對 于生物催化劑及其穩(wěn)定是必需的所有添加劑，如果需要調(diào)節(jié)pH，將生物催 化劑加入至溶液，并進(jìn)行式(II)衍生物的還原，形成式(III)的理想的二醇衍 生物。完成生物轉(zhuǎn)化時，將后者(或任選地部分由其形成的式(IV)的區(qū)域異 構(gòu)體)環(huán)化至理想的碳酸酯(I)。環(huán)化步驟，優(yōu)選地在酸性環(huán)境中，可以直接
地在反應(yīng)溶液中進(jìn)行和/或在處理期間，特別地萃取和/或在完成處理后進(jìn) 行，根據(jù)需要分離。
在特別優(yōu)選的實施方式中，直接將衍生物(II)溶于適合于生物催化劑的 細(xì)胞介質(zhì)中(表達(dá)理想的酶)，加入生物催化劑和對于酶所需的任選的輔因 子，在生物催化劑是穩(wěn)定的且對于其催化的特定反應(yīng)該酶具有高活性的溫 度下進(jìn)行至理想的對映異構(gòu)體的催化轉(zhuǎn)化。
或者，加入各自組分的順序可以根據(jù)需要改變。因此，另一優(yōu)選實施
方式包括在加入式(n)的各自衍生物之前加入生物催化劑。
如下基團(tuán)被視為(CrQ)-烷基殘基甲基、乙基、正丙基、異丙基、正 丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基或辛基，以及所有的 它們的鍵合異構(gòu)體。(CrQ)-烷氧基殘基對應(yīng)于上述(d-C8)-烷基殘基，前提 是通過氧原子將其鍵合至分子。(CrC8)-烷氧基烷基意指其中的垸基鏈被至 少一個氧中斷，并且兩個氧原子不能連接在一起的殘基。碳原子的數(shù)量顯 示了包含于殘基中的碳原子的總數(shù)量。
15(CVC8)-環(huán)烷基是指環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基或環(huán)庚基殘基等。
這些可以被一個或多個鹵原子和/或包含N-、 O-、 P-、 S-、 Si-原子的殘基取 代，和/或可以在環(huán)中具有N-、 O-、 P-、 S-原子，例如l-、 2-、 3-、 4-哌啶 基，l-、 2-、 3-吡咯烷基，2-、 3-四氫呋喃基，2-、 3-、 4-嗎啉基。
(C3-C8)-環(huán)垸基-(d-C8)-烷基殘基是如上所指的環(huán)烷基殘基，其通過如
上所述的烷基殘基連接至分子。
(CrQ)-酰氧基在本發(fā)明的范圍內(nèi)是指如上所定義的最多具有8個碳原 子的烷基殘基，其通過COO鍵合至分子。
(C,-C8)-酰基在本發(fā)明的范圍內(nèi)是指如上所定義的最多具有8個碳原子 的烷基殘基，其通過CO鍵合至分子。
(CVd8)-芳基殘基是指具有6-18個碳原子的芳族殘基。特別地，其包 括化合物如稠和至分子的苯基、萘基、蒽基、菲基、聯(lián)苯殘基或前述類型 的體系，例如，茚基體系，其可以任選地被鹵原子、(C!-C8)-垸基、(d-Q)-垸氧基、NH2、 NH(d-Cs)-垸基、N((C廣C8)-垸基)2、 OH、 CF3、 NH(d-C8)-?；?、N((d-Cs)-?；?2、 (d-C8)-?；?、(CVC8)-酰氧基取代。
(CVd9)-芳垸基殘基是通過(d-C8)-烷基殘基連接至分子的(C6-d8)-芳
基殘基。
鹵素(Hal)包括氟、氯、溴和碘。
術(shù)語"對映異構(gòu)體-富集的"或"對映異構(gòu)體過量"在本發(fā)明的范圍內(nèi)
是指在混合物中的對映異構(gòu)體的比例相對于其光學(xué)對應(yīng)物為>50°/。和
<100%。 ee值如下計算
([對映異構(gòu)體小[對映異構(gòu)體2])/([對映異構(gòu)體d+[對映異構(gòu)體2])=ee值 (R)-碳酸丙烯酯是任何形式的碳酸丙烯酯，其中在混合物中相對于其光
學(xué)對應(yīng)物存在的(R)-對映異構(gòu)體的量》0。/。ee，優(yōu)選〉95。/。ee， W6。/。ee和特
別優(yōu)選〉97Q/。ee。
術(shù)語"非對映異構(gòu)體-富集"是指在混合物中的非對映異構(gòu)體與化合物 的其它可能的非對映異構(gòu)體的比例。
在此所述的化合物的結(jié)構(gòu)包括和公開所有理論上可能的對映異構(gòu)體， 其能在相應(yīng)的碳原子上通過構(gòu)型的改變而產(chǎn)生。
16實施例
實施例1—生物催化還原O-(甲氧基羰基)-羥基丙酮，2a
E. c。l i DSM14459 (包含來自L. kefir的ADH和 來自T. acidophi lum的GDH)
含水緩沖溶液 D —葡萄糖<formula>formula see original document page 17</formula>在Titrino反應(yīng)容器中，將包含來自L. Kefir的(R)-醇脫氫酶和來自T. acidophilum的葡萄糖脫氫酶的E. coli DSM 14459的全細(xì)胞催化劑(對于生 物催化劑的制備，見WO 2005121350)以55 g濕生物質(zhì)/L, D-葡萄糖的細(xì)胞 濃度(相對于所用酮的摩爾量為1.5當(dāng)量)和25 mmol的O-(甲氧基羰基)-羥基 丙酮，2a(相當(dāng)于底物濃度0.5 M)加入至30 mL的含水磷酸鹽緩沖液(0.026 M;調(diào)節(jié)至pH7.0)，用水將該體積增加至50 mL。在室溫下攪拌反應(yīng)混合 物反應(yīng)時間25.5小時，通過加入氫氧化鈉溶液(5 M的NaOH)保持恒定的 pH為約6.5。在反應(yīng)時間25.5小時后，(根據(jù)氫氧化鈉溶液的消耗和GC色 譜法)確定轉(zhuǎn)化率>95%。通過用濃鹽酸降低pH值至〈3進(jìn)行處理，加入3.75 g的過濾助劑Celite Hyflo Supercel至反應(yīng)混合物，隨后施加真空過濾。用 50 ml的MTBE沖洗濾餅4次，相應(yīng)地用獲得的三個有機(jī)MTBE部分萃取 水相。在硫酸鎂上干燥后從所集中的有機(jī)相除去溶劑，以50%的產(chǎn)率得到 粗產(chǎn)品，光學(xué)活性的醇3a(其中12.7摩爾％被重排以得到區(qū)域異構(gòu)體醇4a 和63.6摩爾n/。已經(jīng)被環(huán)化至理想的(R)-碳酸丙烯酯1)。反應(yīng)的對映選擇性為 99.67% ee。
實施例2_生物催化還原O-(乙氧基羰基)-羥基丙酮，2b:(包含來自L. kefir的ADH和 來自T. acidophi lum白勺GDH)
卜Q ~> ，
含水緩沖溶液
D—葡萄糖
在Titrino反應(yīng)容器中，將包含來自L. Kefir的(R)-醇脫氫酶和來自T. acidophilum的葡萄糖脫氫酶的E. coli DSM 14459的全細(xì)胞催化劑(對于生 物催化劑的制備，見WO 2005121350)以51 g濕生物質(zhì)/L, D-葡萄糖的細(xì)胞 濃度(相對于所用酮的摩爾量為1.5當(dāng)量)和25 mmol的O-(乙氧基羰基)-羥基 丙酮，2b(相當(dāng)于底物濃度0.5 M)加入至30 mL的含水磷酸鹽緩沖液(0.026 M;調(diào)節(jié)至pH7.0)，用水將該體積增加至50 mL。在室溫下攪拌反應(yīng)混合 物反應(yīng)時間25.5小時，通過加入氫氧化鈉溶液(5 M的NaOH)保持恒定的 pH為約6.5。在反應(yīng)時間25.5小時后，(根據(jù)氫氧化鈉溶液的消耗和GC色 譜法)確定轉(zhuǎn)化率>95%。通過用濃鹽酸降低pH值至〈3進(jìn)行處理，加入3.75 g的過濾助劑Celite Hyflo Supercel至反應(yīng)混合物，隨后施加真空過濾。用 50 ml的MTBE沖洗濾餅4次，相應(yīng)地用獲得的三個有機(jī)MTBE部分萃取 水相。在硫酸鎂上干燥后從所集中的有機(jī)相除去溶劑，以71%的產(chǎn)率得到 粗產(chǎn)品，光學(xué)活性的醇3b(其中37.3摩爾％被重排以得到區(qū)域異構(gòu)體醇4b 和18.6摩爾。/。已經(jīng)被環(huán)化至理想的(R)-碳酸丙烯酯1)。反應(yīng)的對映選擇性為 99.34% ee。
實施例3一生物催化還原O-(正丙氧基羰基)-羥基丙酮，2c:
在Titrino反應(yīng)容器中，將包含來自L. Kefir的(R)-醇脫氫酶和來自T.
生物催化劑
E. col i DSM14459 p (包含來自L. kefir的ADH和
O O義 來自T. acidophi Ium的GDH)
& 含水緩沖溶液 2c D—葡萄糖
QH
18acidophilum的葡萄糖脫氫酶的E. coli DSM 14459的全細(xì)胞催化劑(對于生 物催化劑的制備，見WO 2005121350)以49 g濕生物質(zhì)/L， D-葡萄糖的細(xì)胞 濃度(相對于所用酮的摩爾量為1.5當(dāng)量)和25 mmol的O-(正丙氧基羰基)-羥基丙酮，2c(相當(dāng)于底物濃度0.5 M)加入至30 mL的含水磷酸鹽緩沖液 (0.026 M;調(diào)節(jié)至pH7.0)，用水將該體積增加至50 mL。在室溫下攪拌反 應(yīng)混合物反應(yīng)時間26小時，通過加入氫氧化鈉溶液(5 M的NaOH)保持恒 定的pH為約6.5。在反應(yīng)時間26小時后，(根據(jù)氫氧化鈉溶液的消耗和GC 色譜法)確定轉(zhuǎn)化率>95%。通過用濃鹽酸降低pH值至<3進(jìn)行處理，加入 3.8 g的過濾助劑Cdite Hyflo Supercel至反應(yīng)混合物，隨后施加真空過濾。 用50 ml的MTBE沖洗濾餅4次，相應(yīng)地用獲得的三個有機(jī)MTBE部分萃 取水相。在硫酸鎂上干燥后從所集中的有機(jī)相除去溶劑，以72%的產(chǎn)率得 到粗產(chǎn)品，光學(xué)活性的醇3c(其中37.3摩爾。/。被重排以得到區(qū)域異構(gòu)體醇4c 和8.9摩爾。/。已經(jīng)被環(huán)化至理想的(R)-碳酸丙烯酯1)。反應(yīng)的對映選擇性為 98.85% ee。
實施例4_通過環(huán)化實施例2的粗產(chǎn)品合成(R)-碳酸丙烯酯1:
o
卜Qo.
CH5
o
日，丫 、CH3 0
對甲苯磺酸 (催化劑量) MTBE, A
O0.
0
3b
人Q HO.
CH3
4b
將根據(jù)實施例2獲得的作為粗產(chǎn)品的0.525 g的光學(xué)活性醇3b(根據(jù)實 施例2中所述的摩爾百分比，其已經(jīng)部分地被重排以得到區(qū)域異構(gòu)醇4b或 已經(jīng)被環(huán)化至理想的(R)-碳酸丙烯酯)吸收在lOmL的乙酸乙酯中，加入對-甲苯磺酸(96 mg)。在反應(yīng)溫度60'C下加熱反應(yīng)混合物6 h。以約80%的比 例獲得理想的(R)-碳酸丙烯酯l(相對于實施例2所用的底物的摩爾量)，對 映選擇性為99.18% ee。
權(quán)利要求
1、通式(I)的對映異構(gòu)體-富集的碳酸亞烷酯的制備方法，其中，R1代表線性的或任選枝化的(C1-C8)-烷基或(C3-C8)-環(huán)烷基，其特征在于首先將式(II)的衍生物轉(zhuǎn)化為式(III)的對映異構(gòu)體-富集的醇，其中，R1具有上述含義，R2代表(C1-C8)-烷基、(C2-C8)-烷氧基烷基、(C6-C18)-芳基、(C7-C19)-芳烷基、(C3-C18)-雜芳基、(C4-C19)-雜芳烷基、(C1-C8)-烷基-(C6-C18)-芳基、(C1-C8)-烷基-(C3-C18)-雜芳基、(C3-C8)-環(huán)烷基、(C1-C8)-烷基-(C3-C8)-環(huán)烷基、(C3-C8)-環(huán)烷基-(C1-C8)-烷基，或者在R2僅代表負(fù)電荷的情形中，可以代表它們的鹽，然后，將式(III)的該化合物環(huán)化為式(I)的對映異構(gòu)體-富集的碳酸亞烷酯，
2、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于該方法用于制備(R)-碳酸丙 烯酯。
3、 如權(quán)利要求1和域2所述的方法，其特征在于式(II)的衍生物至式 (III)的醇的轉(zhuǎn)化利用化學(xué)催化劑和域生物催化劑催化地進(jìn)行。
4、 如前述權(quán)利要求任一項所述的方法，其特征在于將醇脫氫酶或甘油脫氫酶用作生物催化劑。
5、 如前述權(quán)利要求任一項所述的方法，其特征在于在所述方法中所用 的醇脫氫酶衍生于選自如下的生物體高加索酸奶乳桿菌(Lactobacillus kefir)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)禾卩布氏熱厭氧菌(Thermoanaerobium brockii)。
6、 如前述權(quán)利要求任一項所述的方法，其特征在于衍生物(n)的轉(zhuǎn)化利 用偶聯(lián)酶促體系進(jìn)行，所述偶聯(lián)酶促體系包含醇脫氫酶和再生醇脫氫酶的 輔因子的酶。
7、 如前述權(quán)利要求任一項所述的方法，其特征在于衍生物(n)的轉(zhuǎn)化在初始底物濃度為>50 g/L，優(yōu)選>100 g/L和特別地>150 g/L下進(jìn)行。
8、 如前述權(quán)利要求任一項所述的方法，其特征在于衍生物(II)的轉(zhuǎn)化在 -15至10(TC，優(yōu)選10-60。C，特別優(yōu)選20-40。C的溫度下進(jìn)行。
9、 如前述權(quán)利要求任一項所述的方法，其特征在于衍生物(II)的轉(zhuǎn)化在 pH值為5曙11，優(yōu)選5.5-10，特別優(yōu)選6-9下進(jìn)行。
10、 如前述權(quán)利要求任一項所述的方法，其特征在于在所述方法中使 用至少一種微生物，所述微生物能夠同時表達(dá)醇脫氫酶和再生輔因子的酶。
11、 如前述權(quán)利要求一項或多項所述的方法，其特征在于所述合成以 單罐反應(yīng)進(jìn)行。
12、 式(m)或式(iv)的對映異構(gòu)體-富集的醇，其中，rM戈表H、 (C廣C8)-垸基、(C2-Q)-烷氧基烷基、(CVC8)-烯基、 (C2-C8)-炔基、(CVd8)-芳基、(C7-d9)-芳烷基、(C3-C,8)-雜芳基、(C4-C19)_雜芳烷基、(<^-(:8)-垸基-((:6-(:18)-芳基、((^-(:8)-垸基-(<:3-(:18)-雜芳基、((:3-(:8)-環(huán)烷基、(C,-C8)-烷基-(C3-C8)-環(huán)烷基、(C3-C8)-環(huán)烷基-(d-C8)-烷基，或者在rm又代表負(fù)電荷的情形中，可以代表它們的鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備對映異構(gòu)體-富集的碳酸亞烷酯(I)，特別地(R)-碳酸丙烯酯(I)的方法，所述方法通過對映選擇性地酶促還原式(II)的O-取代的羥基丙酮，隨后環(huán)化所形成的式(III)的化合物和它們的區(qū)域異構(gòu)體(IV)形成的醇而進(jìn)行。
文檔編號C07D317/36GK101516866SQ200780035151
公開日2009年8月26日 申請日期2007年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月21日
發(fā)明者C·羅爾曼, D·賴歇特, H·格勒格爾, H·維爾納, W·維南德 申請人:贏創(chuàng)德固賽有限責(zé)任公司