專(zhuān)利名稱(chēng)：：淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的突變蛋白及其獲得方法淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的突變蛋白及其獲得方法本申請(qǐng)要求2006年8月1日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/821,073及2007年4月16日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/912,013的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容就所有目的而言均整體并入本文作為參考。本發(fā)明涉及來(lái)自人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(tearlipocalin)的新型突變蛋白，該突變蛋白以可檢測(cè)的親和力與給定的非天然配體結(jié)合。本發(fā)明還涉及編碼這樣的突變蛋白的相應(yīng)核酸分子及其產(chǎn)生方法。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生這樣的突變蛋白的方法。最后，本發(fā)明涉及包含這樣的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的藥物組合物以及該突變蛋白的多種用途。脂質(zhì)運(yùn)載蛋白蛋白家族(Pervaiz，S.和Brew,K.(1987)FAS^51，209-214)的成員通常是小分泌蛋白，其通過(guò)一系列不同的分子識(shí)別特性來(lái)表征其結(jié)合多種(注意為疏水的)分子(例如類(lèi)視黃醇、脂肪酸、膽固醇、前列腺素、膽綠素、外激素、促味劑和芳香劑)的能力、其結(jié)合特異性細(xì)胞表面受體及其形成大分子復(fù)合體的能力。盡管過(guò)去它們主要?dú)w類(lèi)為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，但現(xiàn)在明白了脂質(zhì)運(yùn)載蛋白實(shí)現(xiàn)多種生理功能。這些生理功能包括在視黃醇轉(zhuǎn)運(yùn)、嗅覺(jué)、外激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和前列腺素合成中的作用。脂質(zhì)運(yùn)載蛋白還涉及免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的介導(dǎo)(綜述于例如Flower,D.R.(1996)B"die附./.318，1-14和Flower,D.R.等(2000)fi/oc/".附.^/c/7^ys1.^c,"1482，9-24)。脂質(zhì)運(yùn)載蛋白通常共有低水平的總體序列保守性，序列同一性常低于20%。與此截然相反的是，它們的總體折疊模式高度保守。脂質(zhì)運(yùn)載蛋白結(jié)構(gòu)的中心部分由一個(gè)8條鏈的反向平行p折疊組成，該卩折疊自身折回形成連續(xù)的氫鍵鍵合的P桶。該桶的一端被跨過(guò)其底部的N端肽區(qū)段以及連接該P(yáng)鏈的三個(gè)肽環(huán)在空間上封閉。該p桶的另一端對(duì)溶劑開(kāi)放，并包含由四個(gè)肽環(huán)形成的靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)。正是由于其他部分為剛性的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白支架中的這種環(huán)多樣性才產(chǎn)生了多種不同的結(jié)合模式，它們各自能夠容納不同大小、形狀和化學(xué)特征的靶標(biāo)(綜述于例如Flower,D.R.(1996)，見(jiàn)上文；Flower,D.R.等(2000)，見(jiàn)上文；或者Skerra，A.(2000)腸c7h'柳.Jc似1482，337-350)。人淚液前清蛋白(現(xiàn)在稱(chēng)為淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白，TLPC或Tlc)最初描述為人淚液的主要蛋白質(zhì)(約為總蛋白質(zhì)含量的三分之一)，但最近也已在若干其他分泌組織(包括前列腺、鼻粘膜和氣管粘膜)中鑒定到。已經(jīng)在大鼠、豬、狗和馬中發(fā)現(xiàn)了同源蛋白。淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白是一種不常見(jiàn)的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白成員，因?yàn)樗谙鄬?duì)不溶性脂質(zhì)及結(jié)合特征方面高度混雜，這區(qū)別于該蛋白家族的其他成員(綜述于Redl，B.(2000)"/oc/i/w.^^/i".1482，241-248)。大量不同化學(xué)類(lèi)別的親脂性化合物例如脂肪酸、脂肪醇、磷脂、糖脂和膽固醇等都是該蛋白的內(nèi)源性配體。有意思的是，與其他脂質(zhì)運(yùn)載蛋白相反，對(duì)烷基酰胺和脂肪酸而言，配體(靶標(biāo))結(jié)合強(qiáng)度都與羥基尾相關(guān)。因此，淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白與溶解性最低的脂質(zhì)結(jié)合最強(qiáng)(Glasgow,B丄等(1995)C"/r.爭(zhēng)紐14，363-372;Gasymov,().K.等(1999)肌o/7/^s.爿"fl1433，307-320)。人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的確切生物功能目前尚未完全闡明，并且仍然存在爭(zhēng)論。在淚液中，它似乎通過(guò)將脂質(zhì)從眼的粘膜表面移動(dòng)到液相而對(duì)淚膜的完整性非常重要(綜述于Gasymov,O.K.等(1999),同上)。然而，它在體外顯示出在脂質(zhì)運(yùn)載蛋白中非常罕見(jiàn)的其他活性，即抑制半胱氨酸蛋白酶以及非特異性的內(nèi)切核酸酶活性(van，tHof，W.等(1997)/.CTie附.272，1837-1841;Yusifov，T.N.等(2000)5"c/ie附./.347，815-819)。最近已經(jīng)證明，淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白能夠在體外結(jié)合多種脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，從而產(chǎn)生了這一假說(shuō)，即它可能作為對(duì)可能有害的親脂性分子的由生理氧化應(yīng)激誘發(fā)的清除劑(Lechner,M.等(2001)肌oc/^附./.356，129-135)。通過(guò)非共價(jià)相互作用結(jié)合其相應(yīng)靶標(biāo)的蛋白質(zhì)總體而言作為試劑在生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)、生物分析學(xué)以及生物及生命科學(xué)中發(fā)揮重要的作用?？贵w(即免疫球蛋白)是這類(lèi)蛋白質(zhì)的一個(gè)突出的例子。盡管在與配體/靶標(biāo)的識(shí)別、結(jié)合和/或分離方面對(duì)這些蛋白質(zhì)存在多方面的需求，但幾乎僅有免疫球蛋白是目前使用的。對(duì)其他具有確定的配體結(jié)合特征的蛋白質(zhì)(例如凝集素)的應(yīng)用仍?xún)H限于特殊的情況。近來(lái)，脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族的成員成為了關(guān)于具有確定配體結(jié)合特性的蛋白質(zhì)的研究的主題。PCT公開(kāi)WO99/168737>開(kāi)了在四個(gè)肽環(huán)的區(qū)域中具有突變氨基酸位置的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族多肽，這四個(gè)肽環(huán)排列在包含結(jié)合口袋的圓桶狀P-桶結(jié)構(gòu)的末端，并對(duì)應(yīng)于包含甘藍(lán)菜粉蝶(尸/w/s6fYwWcfle)后膽色素結(jié)合蛋白中28至45、58至69、86至99和114至129位氨基酸的線(xiàn)性多肽序列中的那些區(qū)段。PCT公開(kāi)WO00/75308公開(kāi)了特異性結(jié)合洋地黃毒苷(digoxigenin)的后膽色素結(jié)合蛋白的突變蛋白，而國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO03/029463和WO03/029471分別涉及人嗜中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(hNGAL)和栽脂蛋白D的突變蛋白。為了進(jìn)一步改善和細(xì)調(diào)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白變體的配體親和力、特異性和折疊穩(wěn)定性，已經(jīng)提出了使用不同脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族成員的多種方法(Skerra，A.(2001)Wcv.Mo/.J5/otec/mo/.74，257-275;Schlehuber，S.以及Skerra，A.(2002)B/op/^s.0^附.96，213-228)，例如替換額外的氨基酸殘基。PCT//HfWO2006/56464^Hf了在低納摩爾范圍內(nèi)對(duì)CTLA-4具有結(jié)合親和力的人嗜中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的突變蛋白。PCT7>開(kāi)WO2005/19256公開(kāi)了具有不同或相同耙配體的至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白，并提供了產(chǎn)生這樣的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的方法。根據(jù)該P(yáng)CT申請(qǐng)，對(duì)淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白一級(jí)序列中的某些氨基酸串(特別是包含成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的氨基酸7-14、24-36、41-49、53-66、69-77、79-84、87-98和103-110的環(huán)區(qū)域)進(jìn)行誘變，以產(chǎn)生具有結(jié)合親和力的突變蛋白。所得突變蛋白對(duì)選定的配體的結(jié)合親和力(K。)在納摩爾范圍內(nèi)，在多數(shù)情況下〉100nM。盡管存在這一進(jìn)步，但即便只是為了進(jìn)一步改善人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白在診斷及治療應(yīng)用中的適用性，也仍期望能有用于產(chǎn)生對(duì)選定靶分子具有改善的結(jié)合特性(例如在皮摩爾范圍內(nèi))的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的方法，因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供對(duì)給定靶標(biāo)具有高結(jié)合親和力的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白。該目的通過(guò)產(chǎn)生具有獨(dú)立權(quán)利要求中所述特征的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)。在第一個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的方法，其中所述突變蛋白以可檢測(cè)的結(jié)合親和力與人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的給定非天然配體結(jié)合，該方法包括(a)將編碼人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的核酸分子在天然成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)栽蛋白線(xiàn)性多肽序列的26-34、56-58、80、83、104-106和108位氨基酸序列中任何位置的至少一個(gè)密碼子進(jìn)行誘變，其中將成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列中61和153位序列位的至少一個(gè)編碼半胱氨酸殘基的密碼子突變成編碼任一其他氨基酸殘基，從而獲得多種編碼人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的核酸，(b)在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)(a)中得到的一種或多種突變蛋白核酸分子，從而獲得一種或多種突變蛋白，和(c)通過(guò)選擇和/或分離富集步驟(b)中獲得的對(duì)人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的給定非天然配體具有可檢測(cè)的結(jié)合親和力的一種或多種突變蛋白。在這種情況下，應(yīng)該注意，本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，(在各個(gè)天然核酸文庫(kù)水平上)除去野生型淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白中由半胱氨酸殘基61與153形成的結(jié)構(gòu)二硫鍵(參閱Breustedt,等(2005),The1.8-Acrystalstructureofhumantearlipocalinrevealsanextendedbranchedcavitywithcapacityformultipleligands./.AW.C7^附.型，484-493)提供了這樣的淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白，其不僅穩(wěn)定折疊，而且以低皮摩爾范圍內(nèi)的親和力與給定的非天然配體結(jié)合。不希望被理論束縛，還認(rèn)為去除結(jié)構(gòu)二硫鍵提供了額外的優(yōu)點(diǎn)，例如在本發(fā)明突變蛋白中(自發(fā))產(chǎn)生或故意引入非天然人工二硫鍵，從而提高突變蛋白穩(wěn)定性(參見(jiàn)實(shí)施例)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"誘變，，指選擇這樣的實(shí)驗(yàn)條件，其使得人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)條目P31025)中給定序列位置的天然氨基酸可被在各自天然多肽序列中不存在于該特定位置的至少一個(gè)氨基酸所替換。術(shù)語(yǔ)"誘變"還包括通過(guò)缺失或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸而對(duì)序列區(qū)段的長(zhǎng)度進(jìn)行(進(jìn)一步)修飾。因此，本發(fā)明范圍內(nèi)包括例如用一段三個(gè)隨機(jī)突變替換選定序列位置的一個(gè)氨基酸，使得與野生型蛋白質(zhì)的各自區(qū)段的長(zhǎng)度相比插入了兩個(gè)氨基酸殘基。這樣的插入或缺失可彼此獨(dú)立地在可進(jìn)行本發(fā)明誘變的任何肽區(qū)段引入。在本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施方案中，可以在選定的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白骨架的環(huán)AB中引入多個(gè)突變的插入(參閱國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO2005/019256，其整體并入本文作為參考)。術(shù)語(yǔ)"隨機(jī)誘變"指在誘變過(guò)程中不存在某序列位置處預(yù)定的單個(gè)氨基酸(突變)，而是在預(yù)定的序列位置處可以一定的概率摻入至少兩個(gè)氨基酸。使用人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的編碼序列(Redl，B.等(1992)/.所o/.C7^附.267,20282-20287)作為本發(fā)明中選定的肽區(qū)段誘變的起點(diǎn)。對(duì)于所引用氨基酸位置的誘變，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)其需求可使用多種用于定點(diǎn)誘變的成熟的標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook，J.等(1989)，同上)。一種普遍使用的技術(shù)是通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))引入突變，其中使用在所需序列位置具有簡(jiǎn)并堿基組成的合成寡核苷酸混合物。例如，使用密碼子NNK或NNS(其中N-腺噤呤、鳥(niǎo)噤呤或者胞嘧啶或胸腺嘧啶；K-鳥(niǎo)噤呤或胸腺嘧啶；S二腺噤呤或胞嘧啶)允許在誘變過(guò)程中摻入所有20種氨基酸和琥珀型終止密碼子，而密碼子VVS將可能摻入的氨基酸限制在12種，因?yàn)椴粚被酑ys、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val摻入多肽序列的選定位置；例如，使用密碼子NMS(其中M-腺嘌呤或胞嘧啶)將選定序列位置處可能摻入的氨基酸數(shù)限制在ll種，因?yàn)樗粚被酇rg、Cys、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Val摻入選定的序列位置。就此而言，應(yīng)該注意，(除20種天然氨基酸以外的)其他氨基酸如硒代半胱氨酸或吡咯賴(lài)氨酸的密碼子也可摻入突變蛋白的核酸中。如Wang，L.，等(2001)292，498-500或Wang，L.和Schultz，P.G.(2002)C7^附.Co附附.1，1-11所述，還有可能使用通常被識(shí)別為終止密碼子的"人工，，密碼子如UAG來(lái)插入其他罕見(jiàn)氨基酸，例如鄰曱基-L-酪氨酸或?qū)Π被奖彼?。使用堿基對(duì)特異性降低的核苷酸構(gòu)件(例如肌苷、8-氧代-2，脫氧尿苷或6(2-脫氧-B-D-咬喃核糖基)-3，4-二氬-8H-嘧啶-l，2-。惡溱-7-酮(Zacco10等(1996)M"5^/.255，589-603)是向選定的序列區(qū)段中引入突變的另一種選擇。另一種可能性是所謂的三聯(lián)體誘變。該方法使用不同核苷酸三聯(lián)體的混合物(各編碼一種氨基酸)摻入到編碼序列中(Virnek3sB，GeL，PliickthunA，SchneiderKC，WellnhoferG,MoroneySE.1994Trinucleotidephosphoramidites:idealreagentsforthesynthesisofmixedoligonucleotidesforrandommutagenesis.7V"c,"'cJ"Vfe22，5600-5607)。在各個(gè)多肽的選定區(qū)域中引入突變的一種可能的策略是基于使用四種寡核苷酸，其中每種均部分來(lái)自相應(yīng)待突變的序列區(qū)段之一。在合成這些寡核苷酸時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用核酸構(gòu)件的混合物來(lái)合成對(duì)應(yīng)于待突變氨基酸位置的那些核苷酸三聯(lián)體，從而隨機(jī)產(chǎn)生編碼所有天然氨基酸的密碼子，最終產(chǎn)生脂質(zhì)運(yùn)載蛋白肽的文庫(kù)。例如，第一種寡核苷酸的序列(除了突變位置以外)與脂質(zhì)運(yùn)載蛋白多肽N末端位置處的待突變肽區(qū)段的編碼鏈對(duì)應(yīng)。相應(yīng)地，第二種寡核苷酸與該多肽序列中之后的第二個(gè)序列區(qū)段的非編碼鏈對(duì)應(yīng)。第三種寡核苷酸繼而與第三個(gè)序列區(qū)段的編碼鏈對(duì)應(yīng)。最后，第四種寡核苷酸與第四個(gè)序列區(qū)段的非編碼鏈對(duì)應(yīng)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可使用各自的第一種及第二種寡核苷酸進(jìn)行，必要時(shí)單獨(dú)地使用各自的第三種和第四種寡核苷酸進(jìn)行。可以使用多種已知方法將這兩個(gè)反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物組合成包含第一個(gè)至第四個(gè)序列區(qū)段的單個(gè)核酸，其中突變已在選定的位置引入。為此，可以使用側(cè)翼寡核苷酸和一種或多種中介體核酸分子(其貢獻(xiàn)第二與第三個(gè)序列區(qū)段之間的序列)將兩種產(chǎn)物進(jìn)行新的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在選擇寡核苷酸序列中用于誘變的數(shù)目和排列時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)其需要有多種備選方案?？梢酝ㄟ^(guò)連接將上述核酸分子與缺少的編碼脂質(zhì)運(yùn)載蛋白多肽的核酸的5'及3，序列和/或載體連接在一起，并可克隆到已知的宿主生物中。有多種成熟的方法可用于連接和克隆(Sambrook，J.等(1989)，同上)。例如，可將也存在于克隆載體中的限制性?xún)?nèi)切核酸酶識(shí)別序列改造到所述合成寡核苷酸序列中。這樣，在擴(kuò)增各個(gè)PCR產(chǎn)物和酶切割后，所得的片段可以容易地使用相應(yīng)的識(shí)別序列進(jìn)行克隆。序列區(qū)段進(jìn)行隨機(jī)誘變，例如通過(guò)在提高錯(cuò)誤率的條件下使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、化學(xué)誘變或使用細(xì)菌增變菌抹。這些方法還可用于進(jìn)一步優(yōu)化脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的靶標(biāo)親和力或特異性。實(shí)驗(yàn)誘變區(qū)段以外可能發(fā)生的突變通常是可以接受的，甚至已證明是有利的，例如在它們有助于改善脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的折疊效率或折疊穩(wěn)定性時(shí)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白"指SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)P31025的成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白。術(shù)語(yǔ)"非天然配體，，指在生理?xiàng)l件下不與天然成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白結(jié)合的化合物。該乾標(biāo)(配體)可以是游離或綴合形式的顯示免疫半抗原特征的任何化合物、激素如甾類(lèi)激素，或其任何生物聚合物或片段，例如蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、肽、寡聚脫氧核糖核苷酸、核酸、寡糖或多糖或其綴合物、脂質(zhì)或另一大分子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的方法包括對(duì)成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列中26-34、56-58、80、83、104-106和108位氨基酸序列中任何位置的至少2、3、4、5、6、8、10、12、14、15、16或17個(gè)密碼子進(jìn)行突變。在另一實(shí)施方案中，對(duì)成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列中26、27、28、29、30、31、32、33、34、56、57、58、80、83、104、105、106和108位氨基絲列的全部18個(gè)密碼子進(jìn)行突變。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明包括用于產(chǎn)生人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的方法，其中所述突變蛋白以可檢測(cè)的結(jié)合親和力結(jié)合人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的給定的非天然配體，該方法包括(a)將編碼人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的核酸分子在天然成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列的30、80和104位氨基酸序列中任何位置的至少一個(gè)密碼子進(jìn)行誘變，從而獲得多種編碼人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的核酸，(b)在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)(a)中得到的一種或多種突變蛋白核酸分子，從而獲得一種或多種突變蛋白，和(c)通過(guò)選擇和/或分離富集步驟(b)中獲得的對(duì)人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的給定非天然配體具有可檢測(cè)的結(jié)合親和力的一種或多種突變蛋白。在上述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，另外還對(duì)天然成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列的26-33、56-58、83、105-106和108位氨基紗列中任何位置的至少2、3、4、5、6、8、10、12、14或15個(gè)密碼子進(jìn)行突變。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括對(duì)天然成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列的61和153位編碼半胱氨酸的兩個(gè)密碼子同時(shí)進(jìn)行突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，將61位突變成編碼丙氨酸、苯丙氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、脯氨酸或色氨酸殘基，這只是其中的幾種可能性。在突變153位的實(shí)施方案中，可以在153位引入諸如絲氨酸或丙氨酸的氨基酸。在本文所述的本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)編碼天然成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列中氨基酸序列位置111和/或114的密碼子進(jìn)行突變，例如突變成111位編碼精氨酸，114位編碼色氨酸。。本發(fā)明方法的另一實(shí)施方案涉及對(duì)編碼成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列中IOI位半胱氨酸的密碼子進(jìn)行誘變，以使該密碼子編碼任何其他氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述突變的IOI位密碼子編碼絲氨酸。因此，在一些實(shí)施方案中，用另一氨基酸的密碼子替換61、101和153位半胱氨酸密碼子中的兩個(gè)或全部三個(gè)。根據(jù)本發(fā)明的方法，從編碼人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的核酸開(kāi)始獲得了突變蛋白。對(duì)這樣的核酸進(jìn)行誘變并通過(guò)重組DNA技術(shù)將其引入合適的細(xì)菌或真核宿主生物中。可以使用任何本領(lǐng)域已知的合適技術(shù)來(lái)產(chǎn)生淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的核酸文庫(kù)，以產(chǎn)生具有抗體樣特性的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白，即對(duì)給定靶標(biāo)具有親和力的突變蛋白。這些組合方法的實(shí)例詳細(xì)描述于例如國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO99/16873、WO00/75308、WO03/029471、WO03/029462、WO03/029463、WO2005/019254、WO2005/019255、WO2005/019256或WO2006/56464。這些專(zhuān)利申請(qǐng)中每篇內(nèi)容均整體并入本文作為參考。在合適的宿主中表達(dá)進(jìn)行了誘變的核酸序列之后，可以從所得文庫(kù)中選擇出帶有與給定靶標(biāo)結(jié)合的各個(gè)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的遺傳信息的克隆?？梢允褂檬熘募夹g(shù)來(lái)選擇這些克隆，例如噬菌體展示(綜述于Kay，B.K.等(1996)同上；Lowman，H.B.(1997)同上，或者Rodi,I)丄和Makowski,L.(1999)同上)、菌落篩選(綜述于Pini，A.等(2002)0附6.C7^附.H/g/i7T^owgA/;",Scree".5，503-510)、核糖體展示(綜述于Amstutz,P.等(2001)CWr.12，400曙405)或如Wilson,D.S.等(2001)7VW/.爿ow/.Sd.(ASJ98，3750-3755報(bào)道的mRNA展示或者具體描述于WO99/16873、WO00/75308、WO03/029471、WO03/029462、WO03/029463、WO2005/019254、WO2005/019255、WO2005/019256或WO2006/56464的方法。根據(jù)本文的公開(kāi)內(nèi)容，在上述方法的另一實(shí)施方案中，步驟(c)還包括(i)提供選自以下的化合物作為給定的配體例如游離或綴合形式的顯示免疫半抗原特征的化合物、肽、蛋白質(zhì)或其他大分子如多糖、核酸分子(例如DNA或RNA)或完整的病毒顆?；蝾?lèi)病毒，(ii)將多種突變蛋白與所述配體接觸，以允許所述配體與對(duì)所述配體具有結(jié)合親和力的突變蛋白之間形成復(fù)合體，和(iii)除去無(wú)結(jié)合親和力或無(wú)實(shí)質(zhì)結(jié)合親和力的突變蛋白。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述配體可以是蛋白質(zhì)或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，排除與T細(xì)胞共同受體CD4結(jié)合的突變蛋白。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(c)中的選擇在竟?fàn)幮詶l件下進(jìn)行。本文使用的"竟?fàn)幮詶l件"指突變蛋白的選擇包括至少一個(gè)將突變蛋白與人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(革巴標(biāo))的給定的非天然配體在其他配體存在下進(jìn)行接觸的步驟，所述其他配體與突變蛋白竟?fàn)幗Y(jié)合靶標(biāo)。這種其他配體可以是靶標(biāo)的生理配體，過(guò)量的靶標(biāo)本身或者靶標(biāo)的任何其他生理配體，其至少與本發(fā)明突變蛋白所識(shí)別表位重疊的表位結(jié)合，因此干擾該突變蛋白的靶標(biāo)結(jié)合?；蛘?，所述其他配體通過(guò)別構(gòu)效應(yīng)將與突變蛋白的結(jié)合位點(diǎn)不同的表位與靶標(biāo)絡(luò)合而竟?fàn)幫蛔兊鞍椎慕Y(jié)合。給出了使用溫和噬菌體M13進(jìn)行的噬菌體展示技術(shù)實(shí)施方案(綜述于Kay,B,K.等(1996)，同上；Lowman，H.B.(1997)同上，或者Rodi，D.J.和Makowski，L.(1999)，同上)作為本發(fā)明可以4吏用的選擇方法的實(shí)例?？捎糜谶x擇本發(fā)明突變蛋白的噬菌體展示技術(shù)的另一實(shí)施方案是如Broders等(Broders等(2003)"Hyperphage.Improvingantibodypresentationinphagedisplay."胸Ws編.說(shuō)o/.205:295-302)所述的超級(jí)謹(jǐn)菌體(hyperphage)技術(shù)。其他溫和噬菌體(如fl)或溶菌性噬菌體(如T7)也可以使用。就示例性選擇方法而言，產(chǎn)生了M13噬菌粒，其允許將突變的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白核酸序列表達(dá)為在N端與信號(hào)序列(優(yōu)選OmpA信號(hào)序列)融合并在C端與噬菌體M13衣殼蛋白pill或其能摻入噬菌體衣殼的片段融合的融合蛋白。優(yōu)選使用包含野生型序列的氨基酸217至406的噬菌體衣殼蛋白的C端片段ApIII來(lái)產(chǎn)生融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，特別優(yōu)選的是其中201位半胱氨酸殘基缺失或被另一氨基酸替換的pillC端片段。因此，本發(fā)明方法的另一實(shí)施方案中包括將編碼多種人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白并由3，末端誘變所導(dǎo)致的核酸分子與編碼M13家族絲狀噬菌體衣殼蛋白pIII或該衣殼蛋白片段的基因有效融合，以選擇至少一種與給定配體結(jié)合的突變蛋白。該融合蛋白可包含額外的組分，例如允許固定、檢測(cè)和/或純化該融合33蛋白或其部分的親和標(biāo)記。此外，可將終止密碼子置于編碼脂質(zhì)運(yùn)載蛋白或其突變蛋白的序列區(qū)與噬菌體衣殼基因或其片段之間，其中該終止密碼子(優(yōu)選為琥珀型終止密碼子)在適當(dāng)?shù)囊种凭ㄖ蟹g時(shí)至少部分翻譯成氨基酸。例如，本文描述的質(zhì)粒載體pTLPC27(現(xiàn)在也稱(chēng)為pTlc27)，可用于制備編碼人淚液脂質(zhì)運(yùn)栽蛋白突變蛋白的噬菌粒文庫(kù)。使用兩個(gè)5WXI限制性位點(diǎn)將本發(fā)明編碼淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的核酸分子插入載體中。連接之后，用所得的核酸混合物轉(zhuǎn)化合適的宿主菌林，例如大腸桿菌XL1-Bhie，以獲得大量獨(dú)立的克隆。需要時(shí)，可產(chǎn)生用于制備超級(jí)噬菌粒文庫(kù)的相應(yīng)載體。接著，使用適當(dāng)?shù)腗13輔助噬菌體或超級(jí)噬菌體，將所得文庫(kù)在液體培養(yǎng)物中進(jìn)行超感染(superinfect)，以產(chǎn)生功能性噬菌粒。重組噬菌粒在其表面上以帶有衣殼蛋白pIII或其片段的融合蛋白形式展示淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白，而該融合蛋白的N端信號(hào)序列通常被切掉。另一方面，它還帶有由輔助噬菌體提供的天然衣殼蛋白pIII的一個(gè)或多個(gè)拷貝，因此它能感染受者，所述受者一般是帶有F或F，質(zhì)粒的細(xì)菌菌林。對(duì)于超級(jí)噬菌體展示的情況，超級(jí)噬菌粒在其表面上以帶有感染性衣殼蛋白pIII而不是天然衣殼蛋白的融合蛋白形式展示脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白。在用輔助噬菌體或超級(jí)噬菌體感染過(guò)程中或感染之后，可以誘導(dǎo)基因表達(dá)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白與衣殼蛋白pHI的融合蛋白，例如通過(guò)加入無(wú)水四環(huán)素來(lái)誘導(dǎo)。將誘導(dǎo)條件選擇成使得所得噬菌粒中的大部分在其表面上展示至少一個(gè)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白。對(duì)于超級(jí)噬菌體展示的情況，誘導(dǎo)條件產(chǎn)生帶有3至5個(gè)融合蛋白的超級(jí)噬菌粒群，所述融合蛋白由脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白和衣殼蛋白pIII組成。已知有多種方法來(lái)分離噬菌粒，例如用聚乙二醇進(jìn)行沉淀。一般在6-8小時(shí)的孵育期后進(jìn)行分離。接著通過(guò)與期望的靶標(biāo)一起孵育來(lái)對(duì)所分離的噬菌粒進(jìn)行選擇，其中所述靶標(biāo)以允許將噬菌粒至少暫時(shí)固定的形式存在，所述噬菌粒在衣殼中帶有具有期望的結(jié)合活性的突變蛋白作為融合蛋白。在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)可以例如與載體蛋白(如血清白蛋白)綴合，并通過(guò)該載體蛋白與蛋白質(zhì)結(jié)合表面(例如聚苯乙烯)結(jié)合。適用于ELISA技術(shù)的微量滴定板或所謂的"免疫棒(immuno-stick)"可優(yōu)選地用于這樣的靶標(biāo)固定?；蛘?，可以使用靶標(biāo)與其他結(jié)合基團(tuán)(如生物素)的綴合物。接著可將靶標(biāo)固定在選擇性結(jié)合該基團(tuán)的表面上，例如包被有鏈霉親和素、中性親和素(neutravidin)或親和素的微量滴定板或順磁性顆粒。如果靶標(biāo)與免疫球蛋白的Fc部分融合，那么也可以固定在表面上，例如包被有A蛋白或G蛋白的微量滴定板或順磁性顆粒。可以像ELISA方法中已知的那樣，用封閉液飽和表面上存在的非特異性噬菌粒結(jié)合位點(diǎn)。接著一般在生理緩沖液存在下使噬菌粒與固定在表面上的革巴標(biāo)接觸。多次洗滌除去未結(jié)合的噬菌粒。接著洗脫表面上剩余的噬菌粒顆粒。例如，可通過(guò)加入蛋白酶或者在酸、堿、洗滌劑或離液鹽存在下或在適度變性的條件下洗脫噬菌粒。一個(gè)優(yōu)選方法是使用pH2.2的緩沖液洗脫，其中接著中和洗脫液。或者，可以加入游離靶標(biāo)的溶液以與固定靶標(biāo)竟?fàn)幗Y(jié)合噬菌粒，或者可通過(guò)與特異性結(jié)合目的靶標(biāo)的免疫球蛋白或中性配體蛋白竟?fàn)巵?lái)洗脫靶標(biāo)特異性噬菌粒。其后，用洗脫的噬菌粒感染大腸桿菌細(xì)胞?；蛘撸梢詮南疵摰氖删Ｖ刑崛『怂岵⒂糜诤罄m(xù)的分析、擴(kuò)增或以其他方式轉(zhuǎn)化細(xì)胞。從這樣獲得的大腸桿菌克隆開(kāi)始，根據(jù)上述方法通過(guò)用M13輔助噬菌體或超級(jí)噬菌體進(jìn)行超感染而再次產(chǎn)生新的噬菌?；虺?jí)噬菌粒，并將這樣擴(kuò)增的噬菌粒再次以固定的耙標(biāo)進(jìn)行選擇。經(jīng)常需要多個(gè)選擇循環(huán)才能以足夠豐富的形式獲得帶有本發(fā)明突變蛋白的噬菌粒。優(yōu)選地，將選擇循環(huán)數(shù)選擇成使得在后續(xù)的功能分析中至少0.1%所研究的克隆產(chǎn)生對(duì)給定靶標(biāo)具有可檢測(cè)親和力的突變蛋白。根據(jù)所使用文庫(kù)的大小(即復(fù)雜性)，一般需要2至8個(gè)循環(huán)來(lái)達(dá)到這一目的。對(duì)于選定突變蛋白的功能分析，用從選擇循環(huán)中獲得的噬菌粒感染大腸桿菌菌林，并分離相應(yīng)的雙鏈?zhǔn)删NA。從該噬菌粒DNA開(kāi)始或者從提取自該噬菌粒的單鏈DNA開(kāi)始，可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定本發(fā)35明選定突變蛋白的核酸序列，并可由此推斷出氨基酸序列?？梢栽诹硪槐磉_(dá)栽體中亞克隆完整淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的突變區(qū)或序列，并在合適的宿主生物中表達(dá)。例如，可以使用載體pTLPC26(現(xiàn)在也稱(chēng)為pTlc26)在大腸桿菌菌林(如大腸桿菌TG1)中表達(dá)?？赏ㄟ^(guò)多種生物化學(xué)方法純化這樣產(chǎn)生的淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白。所產(chǎn)生(例如用pTlc26產(chǎn)生)的淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白在其C端帶有親和肽S&印-tagII(Schmidt等，同上)，因此優(yōu)選地可通過(guò)鏈霉親和素親和層析來(lái)純化。還可以通過(guò)其他方法進(jìn)行選擇。許多相應(yīng)的實(shí)施方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，或者已在文獻(xiàn)中描述。此外，可以使用方法的組合。例如，可以對(duì)通過(guò)"噬菌體展示"選擇或至少富集的克隆再進(jìn)行"菌落篩選"。該方法在產(chǎn)生對(duì)耙標(biāo)具有可檢測(cè)的結(jié)合親和力的淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白這方面具有這樣的優(yōu)點(diǎn)，即可以直接分離各個(gè)克隆。除了使用大腸桿菌在"噬菌體展示"技術(shù)或"菌落篩選"方法中作為宿主生物以外，其他細(xì)菌菌林、酵母或者昆蟲(chóng)細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞也可用于該目的。除了從上述隨機(jī)文庫(kù)中選擇淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白以外，還可以使用進(jìn)化方法(包括限制性誘變)，以在重復(fù)篩選循環(huán)后對(duì)已對(duì)耙標(biāo)具有一定結(jié)合活性的突變蛋白在親和力或特異性方面進(jìn)行優(yōu)化。一旦選擇了對(duì)給定靶標(biāo)具有親和力的突變蛋白，還可以對(duì)這樣的突變蛋白進(jìn)行另一誘變，以隨后選擇具有更高親和力的變體，或者選擇具有改進(jìn)的特性(如更高的熱穩(wěn)定性；提高的血清穩(wěn)定性、熱力學(xué)穩(wěn)定性；提高的溶解度；改進(jìn)的單體行為；對(duì)熱變性、化學(xué)變性、蛋白水解或去污劑提高的抗性等)。這一其他誘變(在目的為更高親和力的情況下可認(rèn)為是體外"親和力成熟")可通過(guò)基于推理性設(shè)計(jì)的位點(diǎn)特異性突變或隨機(jī)突變來(lái)實(shí)現(xiàn)。獲得更高親和力或改進(jìn)特性的另一種可能的方法是使用易錯(cuò)PCR,這導(dǎo)致在脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的選定序列位置范圍中產(chǎn)生點(diǎn)突變。易錯(cuò)PCR可根據(jù)任何已知的方案來(lái)進(jìn)行，例如Zaccolo等(1996)J.Mol.Biol.255，589-603所述的方案。適用于這些目的的其他隨機(jī)誘變方法包括如Murakami,H等(2002)Nat.Biotechnol.20，76-81所述的隨機(jī)插入/缺失(RID)誘變或者如Bittker，J.A等(2002)Nat.Biotechnol.20,1024-1029所述的非同源隨機(jī)重組(NRR)。需要時(shí)，還可以根據(jù)WO00/75308或Schlehuber，S.等，(2000)J.Mol.Biol.297，1105-1120中公開(kāi)的方法進(jìn)行親和力成熟，在該方法中獲得了對(duì)洋地黃毒苷具有高親和力的后膽色素結(jié)合蛋白的突變蛋白。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及對(duì)給定的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白非天然配體具有可檢測(cè)結(jié)合親和力的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白，該突變蛋白可通過(guò)本發(fā)明上述方法獲得，或者通過(guò)本發(fā)明上述方法獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)上述方法獲得的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白包括成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白中序列位置61和153的半胱氨酸殘基中的至少一個(gè)或兩個(gè)被其他氨基酸替換，以及序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108中任何位置的至少一個(gè)氨基酸殘基的突變。在淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白p-桶結(jié)構(gòu)開(kāi)口端的結(jié)合位點(diǎn)中，24-36位包含在AB環(huán)中，53-66位包含在CD環(huán)中，69-77位包含在EF環(huán)中，103-110位包含在GH環(huán)中。本文中這四個(gè)環(huán)的定義與Flower(Flower,D.R.(1996)，同上，以及Flower,D.R.等(2000),同上)一致。通常，這樣的突變蛋白在成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列的序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108中包含至少2、3、4、5、6、8、10、12、14、15、16、17或18個(gè)突變的氨基酸殘基。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，上述突變蛋白包含以下氨基酸替換Cys61—Ala、Phe、Lys、Arg、Thr、Asn、Tyr、Met、Ser、Pro或Trp，以及Cys153—Ser或Ala。這樣的替換已證明可用于防止形成連接Cys61與Cys153的天然二硫鍵，因此有利于操作該突變蛋白。在另一實(shí)施方案中，所述突變蛋白包含選自Arglll—Pro和Lys114—Trp的至少一個(gè)額外的氨基酸替換。本發(fā)明的突變蛋白還可包含用其他氨基酸替換天然成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白序列中101位的半胱氨酸。例如，該替換可以是突變Cys101—Ser或Cys101—Thr。該突變蛋白所結(jié)合的非天然配體可以是蛋白質(zhì)或其片段，前提為在一些實(shí)施方案中可以排除人T細(xì)胞共同受體CD4作為非天然靶標(biāo)。37本發(fā)明的淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白可在突變的氨基酸序列位置以外包含野生型(天然)氨基酸序列。另一方面，本文公開(kāi)的淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白還可在進(jìn)行誘變的序列位置以外也包含氨基酸突變，只要這些突變不干擾該突變蛋白的結(jié)合活性和折疊即可?？梢允褂贸墒斓臉?biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook，J.等(1989)Afo/ecw/"rC7wVtg..JZ^6omto^Af第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)非常容易地在DNA水平實(shí)現(xiàn)這些突變?？赡艿陌被嵝蛄懈淖兪遣迦牖蛉笔б约鞍被崽鎿Q。這樣的替換可以是保守性的，即氨基酸殘基被化學(xué)上相似的氨基酸殘基替換。保守性替換的實(shí)例是以下組中成員之間的替換1)丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和賴(lài)氨酸；5)異亮氨酸、亮氨酸、曱硫氨酸和纈氨酸；以及6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。另一方面，還可以在氨基酸序列中引入非保守性改變。此外，作為替換單個(gè)氨基酸殘基的替代，還可以插入或缺失淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)中的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)氨基酸，只要這些缺失或插入產(chǎn)生穩(wěn)定折疊/功能性的突變蛋白即可(例如，參閱其中產(chǎn)生具有截短的N端和C端的突變蛋白的實(shí)驗(yàn)章節(jié))。這樣的氨基酸序列修飾包括定向誘變單個(gè)氨基酸位置，以通過(guò)引入某些限制性酶的切割位點(diǎn)而簡(jiǎn)化突變的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白基因或其部分的亞克隆。此外，還可摻入這些突變以進(jìn)一步改善脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白對(duì)給定靶標(biāo)的親和力。另外，必要時(shí)可以引入突變以調(diào)節(jié)突變蛋白的某些特征，例如提高折疊穩(wěn)定性、血清穩(wěn)定性、蛋白抗性或水溶性，或者降低聚集傾向。例如，可將天然半胱氨酸殘基突變成其他氨基酸，以防止形成二硫鍵。然而，也可以故意將其他氨基酸序列位置突變成半胱氨酸，以引入新的反應(yīng)基團(tuán)，例如用于綴合到其他化合物(例如聚乙二醇(PEG)、羥乙基淀粉(HES)、生物素、肽或其他蛋白質(zhì))或者形成非天然的二硫鍵。向人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白氨基酸序列中引入半胱氨酸殘基的此類(lèi)突變的示例可能性包才舌以下替換Thr40—Cys、Glu73—Cys、Arg90—Cys、Asp95—Cys和Glu131—Cys。例如，在氨基酸位置40、73、90、95和/或131中任何位置側(cè)面產(chǎn)生的硫羥部分可用于對(duì)突變蛋白進(jìn)行PEG化或HES化，以提高各自淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的血清半衰期。在任一這些序列位置引入半胱氨酸的突變蛋白S236.1-A22(見(jiàn)實(shí)施例46)是這些本發(fā)明突變蛋白的一個(gè)說(shuō)明性實(shí)例。本發(fā)明還涵蓋上述突變蛋白，其中成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白序列的前四個(gè)N端氨基酸殘基(His-His-Leu-Leu;1-4位)和/或成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白序列的C端最后兩個(gè)氨基酸殘基(Ser-Asp;157-158位)被缺失(還參見(jiàn)實(shí)施例及所附序列表)。本發(fā)明的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白能以可檢測(cè)的親和力(即解離常數(shù)至少為200nM)與期望的靶標(biāo)結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選為以對(duì)給定靶標(biāo)至少為100、20、lnM或更低的解離常數(shù)與期望靶標(biāo)結(jié)合的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白。突變蛋白與期望靶標(biāo)的結(jié)合親和力可通過(guò)多種方法測(cè)量，例如熒光滴定、竟?fàn)嶦LISA或表面等離振子共振(BIAcore)。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，復(fù)合體的形成取決于許多因素，例如結(jié)合配偶體的濃度、竟?fàn)巹┑拇嬖?、緩沖體系的離子強(qiáng)度等。選擇和富集通常在允許分離脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的條件下進(jìn)行，所述脂質(zhì)運(yùn)載蛋白在與期望靶標(biāo)復(fù)合時(shí)解離常數(shù)至少為200nM。然而，可以在多種嚴(yán)格度條件下進(jìn)行洗滌和洗脫步驟。還可以在動(dòng)力學(xué)特征方面進(jìn)行選擇。例如，可以在這樣的條件下進(jìn)行選擇，該條件有利于與靶標(biāo)顯示緩慢解離(即低K。ff速率)的突變蛋白與靶標(biāo)形成復(fù)合體?；蛘?，可以在這樣的條件下進(jìn)行選擇，所述條件有利于快速形成突變蛋白與靶標(biāo)的復(fù)合體，換句話(huà)說(shuō)，高K。。速率。作為另一示例性替代方案，篩選可以在選擇突變蛋白提高的熱穩(wěn)定性(與野生型淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白或?qū)︻A(yù)定靶標(biāo)已具有親和力的突變蛋白相比)的條件下進(jìn)行。本發(fā)明的淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白作為單體蛋白存在。然而本發(fā)明的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白有可能能夠自發(fā)二聚化或寡聚化。盡管對(duì)一些應(yīng)用而言可能優(yōu)選使用形成穩(wěn)定單體的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(例如由于更快的擴(kuò)散和更好的組織透過(guò)性)，但在另一些情況下使用自發(fā)形成穩(wěn)定同型二聚體或多聚體的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白可能是有利的，因?yàn)檫@些多聚體可提供對(duì)給定靶標(biāo)(進(jìn)一步)提高的親和力和/或親合力。此外，寡聚體形式的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白可具有更慢的解離速率或延長(zhǎng)的血清半衰期。如果期望使形成穩(wěn)定單體的突變蛋白二聚化或多聚化，這可通過(guò)例如將各自寡聚化結(jié)構(gòu)域(如jun-fos結(jié)構(gòu)域或亮氨酸拉鏈)與本發(fā)明突變蛋白融合或通過(guò)使用"雙運(yùn)載蛋白(Duocalin)"(見(jiàn)下文)來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白可用于與給定靶標(biāo)形成復(fù)合體。所述靶標(biāo)可以是非天然耙標(biāo)/配體。所述耙標(biāo)(配體)可以是任何顯示免疫半抗原特征的游離或綴合形式的化合物、激素例如甾類(lèi)激素或其生物聚合體或片段，例如蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、肽、寡聚脫氧核糖核苷酸、核酸、寡糖或多糖或其綴合物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)是蛋白質(zhì)，其前提為排除人T細(xì)胞共同受體CD4。該蛋白質(zhì)可以是任何球形可溶性蛋白質(zhì)或受體蛋白，例如參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的跨膜蛋白、免疫系統(tǒng)的組分如MHC分子或指示特定疾病的細(xì)胞表面受體。所述突變蛋白還可以?xún)H與蛋白質(zhì)片段結(jié)合。例如，突變蛋白可與細(xì)胞表面受體的結(jié)構(gòu)域結(jié)合(當(dāng)它是錨著在細(xì)胞膜上的受體部分時(shí))以及與溶液中的相同結(jié)構(gòu)域結(jié)合(如果該結(jié)構(gòu)域可產(chǎn)生為可溶性蛋白)。然而，本發(fā)明決不僅限于僅結(jié)合這些大分子靶標(biāo)的突變蛋白。而是也可以通過(guò)誘變獲得淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白，其對(duì)(較)低分子量配體(如生物素、熒光素或洋地黃毒苷)顯示特異性結(jié)合親和力。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，被淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白結(jié)合的配體是蛋白質(zhì)或其片段，其選自血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGF-R2)和白介素4受體a鏈(IL-4受體a)，或其片段。配體還包括VEGF-R2或IL-4受體a的胞外區(qū)域或結(jié)構(gòu)域。這些配體一般為哺乳動(dòng)物來(lái)源。在一些實(shí)施方案中，這些配體為人來(lái)源，但它們也可以為小鼠、大鼠、豬、馬、狗、貓或牛或獼猴來(lái)源，以上僅為少數(shù)示例性實(shí)例。人VEGF可選自VEGF曙A、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D,并可具40有SWISSPROT數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)P15692、P49765、P49767和043915(SEQIDNo.:22-25)所示氨基酸序列或其片段。一個(gè)這樣的示例性片段由VEGF-A的氨基酸8至109組成。人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGF-R2)可具有SWISSPROT數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)P35968(SEQIDNO:21)的氨基酸序列或其片段。這些片段的示例性實(shí)例包括VEGF-R2的胞外Ig樣C2型結(jié)構(gòu)域1至7，分別包含氨基酸46至110、141至207、224至320、328至414、421至548、551至660以及667至753。人白介素4受體a可具有SWISSPROT數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)P24394(SEQIDNO:20)的氨基^列或其片段。人白介素4受體a鏈的片段的示例性實(shí)例包括IL-4受體a的氨基酸26至232。一般而言，就本發(fā)明淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的蛋白質(zhì)配體而言，本文使用的術(shù)語(yǔ)"片段"涉及N端和/或C端縮短的蛋白質(zhì)或肽配體，其保持全長(zhǎng)配體被本發(fā)明突變蛋白識(shí)別和/或結(jié)合的能力。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白，其在成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列的序列位置24-36、53-66、79-84和103-110中兩個(gè)或更多個(gè)位置處包含至少一個(gè)突變氨基酸殘基，并結(jié)合IL-4受體a、VEGF畫(huà)R2或VEGF。結(jié)合IL-4受體a的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白可作為IL-4拮抗劑和/或IL-13拮抗劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白作為人IL-4和/或IL-13的拮抗劑。在另一實(shí)施方案中，所述突變蛋白與獼猴配體如IL-4和/或IL-13交叉反應(yīng)，并因此作為獼猴IL-4受體a的4吉抗劑。相對(duì)于成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白氨基酸序列而言，結(jié)合IL-4受體a的本發(fā)明人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白可包含天然成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的26-34、56-58、80、83、104-106和108中任何位置上用半胱氨酸殘基替換天然氨基酸殘基的至少兩個(gè)氨基酸替換。一般而言，這樣的突變蛋白以200nM或更低、100nM或更低、20nM或更低或者1nM的K。或甚至在皮摩爾范圍內(nèi)的Kd與IL-4受體a的胞外區(qū)或結(jié)構(gòu)域結(jié)合。因此，本發(fā)明還涵蓋以900pM或更低、600pM或更低、500pM或更低、250pM、100pM或更低、60pM或更低或者40pM或更低的K。與IL-4受體結(jié)合的淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白。測(cè)定突變蛋白-配體復(fù)合體的Ko值的合適方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，并且包括熒光滴定、竟?fàn)嶦LISA、量熱法如等溫滴定量熱法(ITC)以及表面等離振子共振。這些方法的實(shí)例在下文中詳細(xì)描述(參見(jiàn)如實(shí)施例6、8、14、16、22、24和27)。在這種情況下，還應(yīng)注意，各個(gè)突變蛋白與其配體之間復(fù)合體的形成受到多種不同因素的影響，例如各結(jié)合配偶體的濃度、竟?fàn)巹┑拇嬖凇⑺镁彌_體系的pH和離子強(qiáng)度，以及用于測(cè)定解離常數(shù)KD的實(shí)驗(yàn)方法(例如熒光滴定、竟?fàn)嶦LISA或表面等離振子共振，以上僅為幾個(gè)實(shí)例)或甚至用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的數(shù)學(xué)算法。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員也十分清楚，本文給出的Ko值(各個(gè)突變蛋白與其配體形成的復(fù)合體的解離常數(shù))可在一定實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)變化，這取決于用于測(cè)定特定脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白對(duì)給定配體的親和力的方法和實(shí)驗(yàn)設(shè)置。這意味著，取決于例如是通過(guò)表面等離振子共振(Biacore)還是通過(guò)竟?fàn)嶦LISA測(cè)定K。值，所測(cè)得的Ko值可能稍有變化或者是可接受的范圍。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，這樣的突變蛋白相對(duì)于成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的氨基酸序列而言包含選自以下的至少6、8、10、12、14或16個(gè)氨基酸替換Arg26—Ser、Pro;Glu27~>Arg;Phe28—Cys;Glu30—Arg;Met31~>Ala;Asn32—Tyr、His;Leu33—Tyr;Glu34—(;ly、Ser、Ala、Asp、Lys、Asn、Thr、Arg;Leu56—Gin;lie57—Arg;Ser58—Ile、Ala、Arg、Val、Thr、Asn、Lys、Tyr、Leu、Met;Asp80—Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;以及Lys108—Gin。此外，這樣的突變蛋白還可包含選自以下的至少一個(gè)氨基酸替換Met39—Val;Thr42—Met、Ala;Thr43—Ile、Pro、Ala;Glu45—Lys、Gly;Asn48—Asp、His、Ser、Thr;Val53—Leu、Phe、Ile、Ala、Gly、Ser;Thr54—Ala、Leu;Met55—Leu、Ala、Ile、Val、Phe、Gly、Thr、Tyr;Glu63—Lys、Gln、Ala、Gly、Arg;Val64—Gly、Tyr、Met、Ser、Ala、Lys、Arg、Leu、Asn、His、Thr、lie;Ala66—Ile、Leu、Val、Thr、Met;Glu69—Lys、Gly;Lys70—Arg、Gln、Glu;Thr78—Ala;Ile89—Val;Asp95—Asn、Ala、Gly;以及Tyr100—His。在一個(gè)實(shí)施方案中，與IL-4受體a結(jié)合的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白包含以下氨基酸替換Arg26—Ser、Glu27—Arg、Phe28~>Cys、Glu30—Arg;Met31—Ala、Leu33—Tyr、Leu56—Gln、lie57—Arg、Asp80—Ser、Lys83—Arg、Glu104—Leu、Leu105—Cys、His106—Pro和Lys108—Gln。在另一實(shí)施方案中，與IL-4受體a結(jié)合的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白包含以下氨基酸替換組之一(1)Arg26—Ser;Glu27—Arg;Phe28—Cys;Glu30—Arg;Met31—Ala;Asn32—Tyr;Leu33—Tyr;Glu34—Gly;Leu56—Gin;Ile57—Arg;Ser58—Ile;Asp80—Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;Lys108—Gin;(2)Arg26—Ser;Glu27—Arg;Phe28—Cys;Glu30—Arg;Met31—Ala;Asn32—Tyr;Leu33—Tyr;Glu34—Lys;Leu56—Gin;Ile57—Arg;Ser58—Asn;Asp80—Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;Lys108—Gin;(3)Arg26—Ser;Glu27—Arg;Phe28—Cys，Glu30—Arg;Met31—Ala;Asn32—Tyr;Leu33—Tyr;Leu56—Gin;Ile57—Arg;Ser58—Arg;Asp80—Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;Lys108—Gin;(4)Arg26—Ser;Glu27—Arg;Phe28—Cys;Glu30—Arg;Met31—Ala;Asn32—Tyr;Leu33—Tyr;Glu34—SenLeu56—Gin;lie57—Arg;Asp80—Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;Lys108—Gin;(5)Arg26—Ser;Glu27—Arg;Phe28—Cys;Glu30—Arg;Met31—Ala;Asn32—His;Leu33—Tyr;Glu34—Ser;Leu56—Gin;lie57—Arg;Ser58—Ala;Asp80—Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;Lys108—(6)Arg26—Ser;Glu27~>Arg;Phe28—Cys;Glu30—Arg;Met31—Ala;Asn32—Tyr;Leu33—Tyr;Glu34—Asp;Leu56—Gin;lie57—Arg;Ser58—Lys;Asp80—Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;Lys108—Gin;and(7)Arg26—Ser;Glu27—Arg;Phe28—Cys;Glu30—Arg;Met31—Ala;Asn32—Tyr;Leu33—Tyr;Glu34—Gly;Leu56—Gin;lie57—Arg;Asp80—Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;Lys108—Gln。與il-4受體a結(jié)合的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白可包含、基本組成為或組成為SEQIDNO:2-8所示氨基酸序列任一個(gè)或其片段或變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變蛋白包含、基本組成為或組成為SEQIDNO:5或6所示氨基^列或其片段或變體。涉及本發(fā)明的突變蛋白時(shí)，本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)"片段"指的來(lái)自全長(zhǎng)成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的N端和/或C端縮短(即缺少至少一個(gè)N端和/或C端氨基酸)的蛋白質(zhì)或肽。這樣的片段優(yōu)選地包含成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白一級(jí)序列的至少10個(gè)、更優(yōu)選20個(gè)、最優(yōu)選30個(gè)或更多連續(xù)氨基酸，并且通常可在成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的免疫測(cè)定中檢測(cè)到。本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)"變體"指蛋白質(zhì)或肽的衍生物，其包含氨基酸序列的修飾，例如替換、缺失、插入或化學(xué)修飾。優(yōu)選地，這樣的修飾不降低該蛋白質(zhì)或肽的功能性。這樣的變體包括蛋白質(zhì)，其中一個(gè)或多個(gè)氨基44酸被其相應(yīng)的D-立體異構(gòu)體取代或20種天然氨基酸以外的氨基酸(例如鳥(niǎo)氨酸、羥脯氨酸、瓜氨酸、高絲氨酸、羥賴(lài)氨酸、正纈氨酸)取代。然而，這樣的替換也可以是保守性的，即氨基酸殘基被化學(xué)性質(zhì)相似的氨基酸殘基取代。保守性替換的實(shí)例是以下組的成員之間的替換l)丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和賴(lài)氨酸；5)異亮氨酸、亮氨酸、甲疏氨酸和纈氨酸；以及6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGF-R2)或其胞外區(qū)或結(jié)構(gòu)域結(jié)合的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白。通常，這樣的突變蛋白作為VEGF拮抗劑，并以200nM或更低、100nM或更低、20nM或更低、15nM或更低、10nM或更低或甚至1nM或更低的KD與VEGF-R2的胞外區(qū)或結(jié)構(gòu)域結(jié)合。相對(duì)于成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白而言，這樣的突變蛋白可包含選自以下的至少6、8、10、12、14或16個(gè)氨基酸替換Arg26—Ser;Glu27—lie;Glu30—Ser;Met31—Gly;Asn32—Arg;Leu33—lie;Glu34—Tyr;Leu56—Lys、Glu、Ala、Met;He57—Phe;Ser58—Arg;Asp80—Ser、Pro;Lys83—GIu、Gly;Glu104—Leu;Leu105—Ala;His106—Val;以及Lys108—Thr,并且還可包含選自以下的至少一個(gè)氨基酸替換Leu41—Phe;Glu63—Lys;Val64~>Met;Asp72—Gly;Lys76—Arg、Glu;lie88—Val、Thr;lie89—Thr;Arg90—Lys;Asp95—Gly;Phe99—Leu;以及Gly107—Arg、Lys、Glu。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，這樣的突變蛋白包含以下氨基酸替換Arg26—Ser，Glu27—Ile，Glu30—Ser，Met31—Gly，Asn32—Arg,Leu33—Ile，Glu34—Tyr，lie57—Phe，Ser58—Arg，Lys83—Glu，Glu104—Leu，Leu105—Ala,His106—Val，和Lys108—Thr。以可檢測(cè)的親和力與VEGF-R2胞外區(qū)或結(jié)構(gòu)域結(jié)合的本發(fā)明人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白可包含以下氨基酸替換組之一(1)Arg26—Ser，Glu27—lie,Glu30—Ser,Met31—Gly，Asn32—Arg，Leu33—lie,Glu34—Tyr，Leu56—Lys,lie57—Phe，Ser58—Arg，Asp80—Ser，Lys83—Glu，Glu104—Leu，Leu105—Ala,His106—Val，Lys108—Thr;(2)Arg26—Ser，Glu27—He,Glu30—Ser，Met31—Gly，Asn32—Arg，Leu33—lie,Glu34—Tyr，Leu56—GIu，lie57—Phe，Ser58—Arg，Asp80—Ser，Lys83—Glu，Glu104—Leu，Leu105—Ala,His106—Val，Lys108—Thr;(3)Arg26—Ser，Glu27—lie,Glu30—Ser，Met31—GIy，Asn32—Arg，Leu33—Ile，Glu34—Tyr,Leu56—Ala，lie57—Phe，Ser58—Arg，Asp80—Ser，Lys83—Ghi，Glu104—Leu，Leu105—Ala，His106—Val，Lys108—Thr;和(4)Arg26—Ser，Glu27—lie,Glu30—Ser,Met31—Gly，Asn32—Arg，Leu33—Ile，Glu34—Tyr，Leu56—Glu，Ile57—Phe，Ser58—Arg，Asp80—Pro,Lys83—Glu，Glu104—Leu，Leu105—Ala,His106—Val，Lys108—Thr。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，與VEGF-R2結(jié)合的突變蛋白包含、基本組成為或組成為SEQIDNo:34-39所示任一氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)結(jié)合的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白。通常，這樣的突變蛋白通過(guò)抑制VEGF與VEGF受體結(jié)合而作為VEGF拮抗劑，并以200nM或更低、100nM或更低、20nM、5nM或更低或甚至1nM或更低的KD與VEGF結(jié)合。相對(duì)于成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白而言，可通過(guò)本發(fā)明方法獲得的這樣的突變蛋白可包含選自以下的至少6、8、10、12、14或16個(gè)氨基酸替換Arg26—Ser、Pro、Val、Leu、Ile;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His、Arg、Tyr、Gin;Ile57—Val、Thr、Leu;Ser58—Lys;Asp80—Ile;Lys83—Ile、Val;Glu104—Cys;His106—Asn、Ser、Asp;以及Lys108—Ala、Val，并且還可包含選自以下的至少一個(gè)氨基酸替換Val36—Met;Thr37—Ala;Met39—Thr;Thr40—Ala、Ser;Asn48—Asp;Ala51—Val;Lys52—Arg;Thr54—Val;Met55—Val;Ser61—Pro;Lys65—Arg;Ala66—Val;Val67—He;Glu69—Gly、Ser、Thr;Lys76—Arg、Ile、Ala、Me"Pro;Tyr87—Arg、His、Lys、Gin;Ile89—Thr、Val、Gly、His、Met、Lys;Arg90—Gly;Ile98—Val和Gly107—Glu。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的與VEGF結(jié)合的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白包含以下氨基酸替換Glu27—Gly，Phe28—Ala,Pro29—Leu,Glu30—Arg，Met31—Cys，Asn32—Leu，Leu33—Ala,Glu34—Gly，Asp80—lie,Lys83—lie,Glu104—Cys，和Lys108—Val。在另一具體的實(shí)施方案中，與VEGF結(jié)合的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白可包含選自以下的氨基酸替換組之一(1)Arg26—Ser;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His;Ser58—Lys;Asp80—Ile;Lys83—Ile;Glu104—Cys;His106—Asn;Lys108—Val;(2)Arg26—Pro;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His;Ser58—Glu;Asp80—Ile;Lys83—Ile;Glu104—Cys;His106—Ser;Lys108—Val;(3)Arg26—Pro;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His;Ser58—Lys;Asp80—He;Lys83—Ile;Glu104—Cys;His106—Asn;Lys108—Val;(4)Arg26—Pro;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—Arg;Ser58—Lys;Asp80—Ile;Lys83—Ile;Glu104—Cys;His106—Ser;Lys108—Val;(5)Arg26—Pro;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His;Ser58—Lys;Asp80—lie;Lys83—IIe;Glu104—Cys;His106—Ser;Lys108—Val;(6)Arg26—Ser;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His;Ser58—Lys;Asp80—lie;Lys83—He;Glu104—Cys;His106—Ser;Lys108—Val;(7)Arg26—Val;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His;Ser58—Lys;Asp80—lie;Lys83—lie;Glu104—Cys;His106—Ser;Lys108—Val;(8)Arg26—Leu;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His;Ser58—Lys;Asp80—He;Lys83—lie;Glu104—Cys;His106—Ser;Lys108—Val;和(9)Arg26—lie;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His;Ser58—Lys;Asp80—lie;Lys83—lie;Glu104—Cys;His106—Ser;Lys108—Val。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，與VEGF結(jié)合的突變蛋白包含、基本組成為或組成為SEQIDNo:26-33或SEQIDNo:44-47中任一氨基酸序列。本發(fā)明范圍內(nèi)還包括在潛在免疫原性方面發(fā)生了改變的上述突變蛋白。細(xì)胞毒性T細(xì)胞識(shí)別與I類(lèi)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子結(jié)合的抗原呈遞細(xì)胞表面上的肽抗原。肽與MHC分子結(jié)合的能力是等位基因特異性的，并與其免疫原性相關(guān)。為了降低給定蛋白質(zhì)的免疫原性，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)中哪些肽具有與給定MHC分子結(jié)合的能力是十分有價(jià)值的。先前已經(jīng)描述了利用計(jì)算機(jī)線(xiàn)程法(computationalthreadingapproach)鑒定潛在T細(xì)胞表位來(lái)預(yù)測(cè)給定肽序列與1類(lèi)MHC分子的結(jié)合的方法(Altuvia等(1995)/.Mo/.249:244-250).這樣的方法還可用于鑒定本發(fā)明突變蛋白中的潛在T細(xì)胞表位，并用于根據(jù)其預(yù)期用途而基于其預(yù)計(jì)免疫原性選擇特定的突變蛋白。它還可以對(duì)預(yù)計(jì)含有T細(xì)胞表位的肽區(qū)域進(jìn)行額外的誘變，以減少或消除這些T細(xì)胞表位，從而使免疫原性最小化。從遺傳改造的抗體中除去兩性表位已有描述(Mateo等(2000)7fy^7Vfe附a19(6):463-471)，并可適用于本發(fā)明的突變蛋白。這樣獲得的突變蛋白可具有盡可能小的免疫原性，這在其治療或診斷應(yīng)用中是期望的，如下文所述。對(duì)于一些應(yīng)用，使用標(biāo)記形式的本發(fā)明突變蛋白也可能是有用的。因此，本發(fā)明涉及與選自以下的標(biāo)記綴合的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白酶標(biāo)記、放射性標(biāo)記、有色標(biāo)記、熒光標(biāo)記、生色標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、半抗原、洋地黃毒苷、生物素、金屬絡(luò)合物、金屬以及膠體金。突變蛋白也可以綴合到有機(jī)分子。本文使用的術(shù)語(yǔ)"有機(jī)分子"優(yōu)選指這樣的有機(jī)分子其包含至少兩個(gè)碳原子，但優(yōu)選不超過(guò)7或12個(gè)可旋轉(zhuǎn)的碳鍵，分子量為100至2000道爾頓，優(yōu)選100至1000道爾頓，并任選地包含一個(gè)或兩個(gè)金屬原子。一般而言，可以以任何合適的化學(xué)物質(zhì)或酶來(lái)標(biāo)記脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白，所述化學(xué)物質(zhì)或酶在化學(xué)、物理、光學(xué)或酶促反應(yīng)中直接或間接產(chǎn)生可檢測(cè)的化合物或信號(hào)。物理反應(yīng)并且同時(shí)是光學(xué)反應(yīng)/標(biāo)記物的實(shí)例是在照射后發(fā)出焚光或在使用放射性標(biāo)記時(shí)發(fā)射X射線(xiàn)。堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶或(5-半乳糖苷酶是催化形成生色反應(yīng)產(chǎn)物的酶標(biāo)記(也是光學(xué)標(biāo)記)實(shí)例。一般而言，通常用于抗體的所有標(biāo)記(除了僅用于免疫球蛋白Fc部分的糖部分的標(biāo)記以外)均可用于與本發(fā)明突變蛋白綴合。本發(fā)明的突變蛋白還可綴合任何合適的治療活性劑，例如用于將這樣的活性劑定向遞送至給定細(xì)胞、組織或器官或者用于選擇性靶定細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)治療活性劑的實(shí)例包括放射性核素、毒素、小有機(jī)分子和治療肽(例如作為細(xì)胞表面受體激動(dòng)劑/拮抗劑的肽或者竟?fàn)幗o定細(xì)胞靶標(biāo)上蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的肽)。然而，本發(fā)明的脂質(zhì)運(yùn)栽蛋白突變蛋白還可綴合治療活性核酸，如反義核酸分子、小干擾RNA、小RNA或核酶。這些綴合物可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變蛋白還可與靶向特定機(jī)體部位的靶向部分偶聯(lián)，以將本發(fā)明突變蛋白遞送至體內(nèi)期望的部位或區(qū)域?？赡芷谕@樣的修飾的一個(gè)實(shí)例是穿過(guò)血腦屏障。為了穿過(guò)血腦屏障，本發(fā)明的突變蛋白可與有利于主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)該屏障的部分偶聯(lián)(參閱GaillardPJ等.Diphtheria-toxinreceptor-targetedbraindrugdelivery,/wfmia^wa/Om^r^ySc/d20051277:185-198或者GaillardPJ等Targeteddeliveryacrosstheblood-brainbarrier.O/;/""ragZ>e//v.20052(2):299-309)。這樣的部分可以例如商品名2B-TransTM(BBBtechnologiesBV，Leiden,NL)購(gòu)得。如上述，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變蛋白可與延長(zhǎng)該突變蛋白的血清半衰期的部分綴合(這方面可參閱PCT公開(kāi)WO2006/56464,其中參考對(duì)CTLA-4具有結(jié)合親和力的人嗜中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的突變蛋白描述了這樣的綴合策略)。延長(zhǎng)血清半衰期的部分可以是聚(亞烷基)二醇分子、羥乙基淀粉、脂肪酸分子如棕櫚酸(Vajo&Duckworth2000，尸Aflr附"o/.iev.52，1-9)、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白的CH4結(jié)構(gòu)域、白蛋白或其片段、白蛋白結(jié)合肽或白蛋白結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白，以上僅為少數(shù)實(shí)例。白蛋白結(jié)合蛋白可以是細(xì)菌白蛋白結(jié)合蛋白、抗體、抗體片段，包括結(jié)構(gòu)域抗體(參閱如美國(guó)專(zhuān)利6,696,245)或者對(duì)白蛋白有結(jié)合親和力的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白。相應(yīng)地，延長(zhǎng)本發(fā)明脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白半衰期的合適的綴合配偶體包括白蛋白(Osborn，B丄.等(2002)Pharmacokineticandpharmacodynamicstudiesofahumanserumalbumin-interferon-alphafusionproteinincynomolgusmonkeys/.尸/i"/7mico/.￡!x:/7.77rer.303，540-548)或者白蛋白結(jié)50合蛋白，例如細(xì)菌白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如鏈球菌G蛋白之一(K6nig，T.和Skerra，A.(1998)'Useofanalbumin-bindingdomainfortheselectiveimmobilisationofrecombinantcaptureantibodyfragmentsonELISAplates.丄/附附"m/.218，73-83)?？捎米骶Y合配偶體的白蛋白結(jié)合肽的其他實(shí)例為例如具有Cys-Xaa廣Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys共有序列的那些，其中Xaa!是Asp,Asn，Ser，Thr或Trp;Xaa;j是Asn，Gin,His,lie,Leu或Lys;Xaa3是Ala,Asp,Phe，Trp或Tyr;Xaa4是Asp,Gly，Leu，Phe，Ser或Thr，如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)2003/0069395或Dennis等(Dennis,M.S"Zhang,M.，Meng，Y.G.，Kadkhodayan,M.，Kirchhofer，D.，Combs,D.&Damico，LA.(2002).，Albuminbindingasageneralstrategyforimprovingthepharmacokineticsofproteins."/^,V/CAe/w277，35035-35043)戶(hù)斤述。在其他實(shí)施方案中，白蛋白本身或白蛋白的生物活性片段可用作本發(fā)明脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的綴合配偶體。術(shù)語(yǔ)"白蛋白"包括所有哺乳動(dòng)物白蛋白，例如人血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠白蛋白。白蛋白或其片段可如美國(guó)專(zhuān)利5,728,553或歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)EP0330451和EP0361991所述重纟且產(chǎn)生。重組人白蛋白(Recombumin)NovozymesDeltaLtd.(Nottingham,UK)可與脂質(zhì)運(yùn)栽蛋白突變蛋白綴合或融合，以延長(zhǎng)該突變蛋白的半衰期。如果所述白蛋白結(jié)合蛋白是抗體片段，則它可以是結(jié)構(gòu)域抗體。結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)被改造成允許精確控制生理特性和體內(nèi)半衰期，以產(chǎn)生最佳的安全性及效力產(chǎn)品特性。結(jié)構(gòu)域抗體例如可購(gòu)自DomantisLtd.(Cambridge,UKandMA，USA)。使用轉(zhuǎn)鐵蛋白作為延長(zhǎng)本發(fā)明突變蛋白血清半衰期的部分，該突變蛋白可遺傳融合至非糖基化轉(zhuǎn)鐵蛋白的N段或C端，或者這兩個(gè)末端。非糖基化的轉(zhuǎn)鐵蛋白具有14-17天的半衰期，轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白將相似地具有延長(zhǎng)的半衰期。轉(zhuǎn)鐵蛋白載體還提供高生物利用率、生物分布和循環(huán)穩(wěn)定性。該技術(shù)可購(gòu)自BioRexis(BioRexisPharmaceuticalCorporation,PA，USA)。用作蛋白穩(wěn)定劑/半衰期延長(zhǎng)配偶體的重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白(DeltaFerrinTM)也可購(gòu)自NovozymesDeltaLtd.(Nottingham,UK)。如果使用免疫球蛋白的Fc部分來(lái)延長(zhǎng)本發(fā)明突變蛋白的血清半衰期，則可<吏用可購(gòu)自SyntonixPharmaceuticals,Inc(MA，USA)的5>"FmwVwtm技術(shù)。使用該Fc融合技術(shù)允許產(chǎn)生作用更長(zhǎng)久的生物藥物，并可由例如兩拷貝的突變蛋白與抗體Fc區(qū)連接組成，以改進(jìn)藥代動(dòng)力學(xué)、溶解度和生產(chǎn)效率。延長(zhǎng)本發(fā)明突變蛋白半衰期的另一替代方案是向本發(fā)明突變蛋白的N端或C端融合富含甘氨酸的長(zhǎng)的非結(jié)構(gòu)化的柔性序列(例如具有約20至80個(gè)連續(xù)甘氨酸殘基的聚甘氨酸)。公開(kāi)于例如WO2007/038619的這種方法也稱(chēng)為"rPEG"(重組PEG)。如果使用聚(亞烷基)二醇作為綴合配偶體，則所述聚(亞烷基)二醇可以是被取代的、未取代的，直鏈的或分支的。還可以是活化的聚亞烷基衍生物。合適的化合物的實(shí)例為聚乙二醇(PEG)分子，如WO99/64016、美國(guó)專(zhuān)利6,177,074或美國(guó)專(zhuān)利6,403,564中涉及干擾素的描述，或者如針對(duì)其他蛋白質(zhì)的描述，如PEG修飾的天冬酰胺酶、PEG-腺苷脫氨酶(PEG-ADA)或PEG-超氧化物歧化酶(參閱如Fuertges等(1990)TheClinicalEfficacyofPoly(EthyleneGlycol)-ModifiedProteins/.CVw加/./^/mm11,139-148)。這樣的聚合物(優(yōu)選聚乙二醇)的分子量為約300至約70000道爾頓，包括如分子量約10000、約20000、約30000或約40000道爾頓的聚乙二醇。此外，如美國(guó)專(zhuān)利6,500,930或6,620,413所述，可將碳水化合物的寡聚物和多聚體(如淀粉或羥乙基淀粉(HES))與本發(fā)明的突變蛋白綴合，以用于延長(zhǎng)血清半衰期的目的。如果將上迷部分之一與本發(fā)明人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白綴合，則綴合至氨基酸側(cè)鏈可能是有利的。合適的氨基酸側(cè)鏈可天然存在于人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的氨基,列中，或者可通過(guò)誘變引入。對(duì)于通過(guò)誘變引入適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合位點(diǎn)的情況，一種可能性是用半胱氨酸殘基替換適當(dāng)位置的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的突變包括Thr40—Cys、Glu73—Cys、Arg90—Cys、Asp95—Cys或Glu131—Cys替換中至少一個(gè)。任何這些位置處新產(chǎn)生的半胱氨酸殘基其后均可用于將該突變蛋白與延長(zhǎng)該突變蛋白血清半衰期的部分(如PEG或其活化衍生物)綴合。在另一實(shí)施方案中，為了提供用于將本發(fā)明突變蛋白與上述部分之一綴合的合適的氨基酸側(cè)鏈，可通過(guò)誘變引入人工氨基酸。一般而言，這樣的人工氨基酸設(shè)計(jì)成更具反應(yīng)性，因此有利于綴合期望的部分。這些可通過(guò)人工tRNA引入的人工氨基酸的一個(gè)實(shí)例是對(duì)乙酰苯丙氨酸。對(duì)于本文公開(kāi)的突變蛋白的一些應(yīng)用而言，以融合蛋白的形式使用它們可能是有利的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白在其N(xiāo)端或其C端與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或肽(如信號(hào)序列和/或親和標(biāo)記)融合。對(duì)于藥物應(yīng)用而言，本發(fā)明突變蛋白可與延長(zhǎng)該突變蛋白體內(nèi)血清半衰期的融合配偶體融合(也參閱PCT公開(kāi)WO2006/56464,其中參考對(duì)CTLA-4具有結(jié)合親和力的人嗜中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的突變蛋白描述了合適的融合配偶體)。與上述綴合相似，融合配偶體可以是免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白的CH4結(jié)構(gòu)域、白蛋白、白蛋白結(jié)合肽或白蛋白結(jié)合蛋白，以上僅為少數(shù)實(shí)例。再次，白蛋白結(jié)合蛋白可以是細(xì)菌白蛋白結(jié)合蛋白或者對(duì)白蛋白具有結(jié)合活性的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白。相應(yīng)地，用于延長(zhǎng)本發(fā)明脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白半衰期的合適的融合配偶體包括白蛋白(Osborn，B丄,等(2t)02)同上/.尸/mrwao/.Ejc/7.7T^r.303，540-548)或白蛋白結(jié)合蛋白，例如細(xì)菌白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，如鏈球菌G蛋白之一(K6nig，T.和Skerra，A.(1998)同上丄/附/ww冊(cè)/.M"/^fo218，73-83)。Dennis等，同上(2002)或美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)2003/0069395中描述的具有Cys-Xaa廠(chǎng)Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys共有序列的白蛋白結(jié)合肽也可用作融合配偶體，其中Xaa,是Asp，Asn，Ser，Thr或Trp;Xaa2是Asn，Gln，His,lie,Leu或Lys;Xaa3是Ala,Asp,Phe，Trp或Tyr;Xaa4是Asp，Gly，Leu，Phe，Ser或Thr。還可以使用白蛋白本身或白蛋白的生物活性片段作為本發(fā)明脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的融合配偶體。術(shù)語(yǔ)"白蛋白"包括所有的哺乳動(dòng)物白蛋白，例如人血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠血清白蛋白。重組產(chǎn)生白蛋白或其片段為本領(lǐng)域所熟知，并描述于例如美國(guó)專(zhuān)利5,728,553、歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)EP0330451或EP0361991。融合配偶體可賦予本發(fā)明脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白新的特征，例如酶活性或?qū)ζ渌肿拥慕Y(jié)合親和力。合適的融合蛋白的實(shí)例為堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、G蛋白的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、A蛋白、抗體片段、寡聚化結(jié)構(gòu)域、具有相同或不同結(jié)合特異性的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(導(dǎo)致形成"雙運(yùn)載蛋白"，參閱Schlehuber，S.和Skerra，A.(2001)，l)uocalins，engineeredligand畫(huà)bindingproteinswithdualspecificityderivedfromthelipocalinfold.AW.C7^/w.382，1335-1342)或毒素。特別地，可以將本發(fā)明的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白與獨(dú)立的酶活性位點(diǎn)融合，使得所得融合蛋白的兩個(gè)"組分"都作用于給定的治療性靶標(biāo)。上述脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域附著至致病靶標(biāo)，使得酶結(jié)構(gòu)域能夠消除靶標(biāo)的生物功能。親和標(biāo)記如Strep-tag⑧或Strep-tagII(Schmidt,T.G.M.等(1996)/Mo/.255,753-766)、附y(tǒng)c-標(biāo)記、FLAG-標(biāo)記、His6-標(biāo)記或HA-標(biāo)記或者蛋白質(zhì)如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶也允許對(duì)重組蛋白容易地進(jìn)行檢測(cè)和/或純化，并且也是優(yōu)選的融合配偶體實(shí)例。最后，具有生色或發(fā)光特性的蛋白質(zhì)如綠色熒光蛋白(GFP)或黃色熒光蛋白(YFP)也是用于本發(fā)明脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的合適的融合配偶體。本文使用的術(shù)語(yǔ)"融合蛋白"還包括含有信號(hào)序列的本發(fā)明脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白。多肽N端的信號(hào)序列將該多肽引導(dǎo)至特定的細(xì)胞區(qū)室，例如大腸桿菌的周質(zhì)或真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。大量的信號(hào)序列為本領(lǐng)域已知。用于將多肽分泌進(jìn)大腸桿菌周質(zhì)的一種優(yōu)選信號(hào)序列是OmpA-信號(hào)序列。本發(fā)明還涉及包含編碼本文所述突變蛋白的核苷酸序列的核酸分子(DNA和RNA)。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性將某些密碼子替換成代表同一氨基酸的其他密碼子，因此本發(fā)明不局限于編碼本發(fā)明突變蛋白的特定核酸分子，而是包括包含編碼功能性突變蛋白的核苷酸序列的所有核酸分子。因此，本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明突變蛋白的核酸序列，其包含天然成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列的氨基酸序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108中任何位置上的至少一個(gè)密碼子突變，其中編碼成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列中序列位置61和153的半胱氨酸殘基中至少一個(gè)的密碼子被突變成編碼任一其他氨基酸殘基。如本文公開(kāi)的本發(fā)明還包括編碼淚液脂質(zhì)運(yùn)栽蛋白突變蛋白的核酸分子，其包含實(shí)驗(yàn)誘變所指出序列位置以外的其他突變。這樣的突變經(jīng)常是可以容忍的，或者甚至證明可提供優(yōu)點(diǎn)，例如如果它們有助于提高該突變蛋白的折疊效率、血清穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性或配體結(jié)合親和力的話(huà)。本申請(qǐng)所述核酸分子可以與調(diào)節(jié)序列"有效連接，，，以允許表達(dá)該核酸分子。如果核酸分子(如DNA)包含含有轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)節(jié)相關(guān)信息的序列元件，并且這些序列與編碼多肽的核苷酸序列"有效連接"，則稱(chēng)其"能夠表達(dá)核酸分子"或能"允許表達(dá)核苷酸序列"。有效連接是其中調(diào)節(jié)性序列元件與待表達(dá)序列以允許基因表達(dá)的方式相連的連接?；虮磉_(dá)所需調(diào)節(jié)區(qū)的確切性質(zhì)在物種之間可能有所不同，但一般而言，這些區(qū)域包含啟動(dòng)子，其在原核生物中包含啟動(dòng)子本身(即指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起始的DNA元件)以及在轉(zhuǎn)錄成RNA后發(fā)出翻譯起始信號(hào)的DNA元件。這樣的啟動(dòng)子區(qū)通常包括參與轉(zhuǎn)錄及翻譯起始的5'非編碼序列(如-35/-10盒)，以及原核生物中的Shine-Dalgarno元件或真核生物中的TATA盒、CAAT序列和5'加帽元件。這些區(qū)域還可包括增強(qiáng)子或阻抑基因元件以及用于將天然多肽革巴向至宿主細(xì)胞特定區(qū)室的翻譯的信號(hào)和前導(dǎo)序列。此外，3，非編碼序列可包含參與轉(zhuǎn)錄終止、多腺苷酸化等的調(diào)節(jié)元件。然而，如果這些終止序列在特定宿主細(xì)胞中的功能不令人滿(mǎn)意，則可將其替換成在該細(xì)胞中有功能的信號(hào)。因此，本發(fā)明的核酸分子可包含調(diào)節(jié)序列，優(yōu)選為啟動(dòng)子序列。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含啟動(dòng)子序列和轉(zhuǎn)錄終止序列。合適的原核啟動(dòng)子為例如W啟動(dòng)子、/acUV5啟動(dòng)子或T7啟動(dòng)子。為SV40啟動(dòng)子或CMV啟動(dòng)子。本發(fā)明的核酸分子還可以是載體或其他類(lèi)型克隆運(yùn)載體(如質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體、桿狀病毒、粘?；蛉斯と旧w)的一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸分子包含在質(zhì)粒中。噬粒載體指編碼與目的cDNA融合的溫和噬菌體(如M13或fl)基因間區(qū)域或其功能部分的栽體。用這樣的噬菌粒和合適的輔助噬菌體(如M13K07、VCS-M13或R408)超感染細(xì)菌宿主細(xì)胞后，產(chǎn)生完整的噬菌體顆粒，從而使得可以將所編碼的異源cDNA與噬菌體表面所展示的其相應(yīng)多肽物理偶聯(lián)(綜述于例如Kay，B.K.等(1996)i°/iageD/s/7/"y<//Vy>/"Vis-j丄fl6or她rj;Maw"fl/，第^，AcademicPress,NewYorkNY;Lowman，H.B.(1997)iev.必/—p.5&歸/.26，401—424，或者Rodi,I)丄和Makowski，L.(1999)O/;/".B,》/ecAwo/.10,87—93)。除了上述調(diào)節(jié)序列和編碼本發(fā)明脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的核酸序列以外，這些克隆載體可包括來(lái)自與表達(dá)所使用的宿主細(xì)胞相容的物種的復(fù)制及控制序列，以及賦予轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞可選擇表型的選擇標(biāo)記。大量合適的克隆載體為本領(lǐng)域已知，并可購(gòu)得。編碼本發(fā)明脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的DNA分子(特別是含有此類(lèi)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的編碼序列的克隆載體)可轉(zhuǎn)化進(jìn)能表達(dá)該基因的宿主細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行(Sambrook，J.等(1989)，同上)，因此，本發(fā)明還涉及含有本文所述核酸分子的宿主細(xì)胞。在適于表達(dá)編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸序列的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如大腸桿菌或枯草芽孢桿菌(Bad〃ns)，或者是真才亥的，例i口酉良酒酵母(Scrcc/iflra附j(luò);c"(wev/s,V^)、巴斯德畢赤酵母(尸/d/"p"s似n、)、SF9或High5昆蟲(chóng)細(xì)胞、永生化哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(如HeLa細(xì)胞或CHO細(xì)胞)或原代哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明突變蛋白的方法，其中通過(guò)遺傳工程方法，從編碼該突變蛋白的核酸開(kāi)始產(chǎn)生該突變蛋白、該突變蛋白的片段或該突變蛋白與另一多肽的融合蛋白。該方法還可在體內(nèi)進(jìn)行，上述突變蛋56白可以在例如細(xì)菌或真核宿主生物中產(chǎn)生，接著從該宿主生物或其培養(yǎng)物中分離。還可以在體外產(chǎn)生蛋白質(zhì)，例如使用體外翻譯系統(tǒng)。在體內(nèi)產(chǎn)生突變蛋白時(shí)，通過(guò)重組DNA技術(shù)(上文已概述)將編碼本發(fā)明突變蛋白的核酸引入合適的細(xì)菌或真核宿主生物中。為此，首先使用成熟的標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook，J.等(1989)，同上)用克隆載體轉(zhuǎn)化該宿主細(xì)胞，所述克隆載體包含編碼本發(fā)明突變蛋白的核酸分子。接著在允許表達(dá)該異源DNA并因此允許合成相應(yīng)多肽的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞。其后，從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收該多肽。在本發(fā)明的一些淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白中，Cys61與Cys153之間天然存在的二石克鍵被除去。因此，這樣的突變蛋白(或不包含分子內(nèi)二硫鍵的任何其他淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白)可在具有還原性氧還環(huán)境的細(xì)胞區(qū)室(例如革蘭氏陰性菌的胞質(zhì))中產(chǎn)生。對(duì)于本發(fā)明脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白包含分子內(nèi)二石克鍵的情況，使用適當(dāng)?shù)男盘?hào)序列將新生多肽引導(dǎo)至具有氧化性氧還環(huán)境的細(xì)胞區(qū)室中可能是優(yōu)選的。這樣的氧化性環(huán)境可由革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌)的周質(zhì)、革蘭氏陽(yáng)性菌的胞外環(huán)境或真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔來(lái)提供，并通常有利于形成結(jié)構(gòu)性二疏鍵。然而，也可以在宿主細(xì)胞(優(yōu)選大腸桿菌)的胞質(zhì)溶膠中產(chǎn)生本發(fā)明的突變蛋白。在這種情況下，該多肽可以可溶并已折疊的狀態(tài)直接獲得，或者以包含體形式回收，其后體外復(fù)性。另一種選擇是使用具有氧化性胞內(nèi)環(huán)境并因此允許在胞質(zhì)溶膠中形成二硫鍵的特定宿主菌林(VenturiM,SeifertC，HunteC，(2002)"HighlevelproductionoffunctionalantibodyFabfragmentsinanoxidizingbacterialcytoplasm."/.Afo/.315,1-8.)。然而，本發(fā)明的突變蛋白不一定僅使用遺傳工程產(chǎn)生或生產(chǎn)。相反，脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白也可通過(guò)化學(xué)合成(如Merrifield固相多肽合成)或者體外轉(zhuǎn)錄和翻譯獲得。例如，可以使用分子建模鑒定有希望的突變，接著在體外合成需要(設(shè)計(jì))的多肽并研究對(duì)給定靶標(biāo)的結(jié)合活性。固相和/或溶液相合成蛋白質(zhì)的方法為本領(lǐng)域所熟知(綜述于例如Lloyd-Williams,P.等(1997)C7re附/oz/々/7/YttcA^to幼e5)^/^is</Pe/7&Vfes1awdiV她,Ti51.CRCPress,BocaRaton,Fields,G.B.，以及Colowick,S.P.(1997)尸e/;ftV/eXj^/r^sis1.AcademicPress,SanDiego,或者Bruckdorfer，T.等(2004)Cmr.尸/^r附.5，29-43)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變蛋白可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的成熟方法通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄/翻譯產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及包含至少一種本發(fā)明人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白或其融合蛋白或綴合物以及可藥用賦形劑的藥物組合物。本發(fā)明的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白可通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)藥物而言有療效的任何腸胃外或非腸胃外(腸內(nèi))途徑給藥。腸胃外施用法包括如皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)或靜脈內(nèi)的注射及輸注技術(shù)，例如注射液、輸注液或酊劑以及氣霧劑裝置和吸入(例如氣霧劑混合物)、噴霧劑或粉劑的形式。肺部藥物遞送(即通過(guò)吸入氣霧劑(也可用于鼻內(nèi)給藥)或氣管內(nèi)滴注)的概述由例如J.S.Patton等Thelungsasaportalofentryforsystemicdrugdelivery.Proc.Amer.ThoracicSoc.2004Vol,1338-344頁(yè)給出。非腸胃外遞送模式為例如經(jīng)口(例如丸劑、片劑、膠嚢劑、溶液劑或混懸劑形式)或直腸(如栓劑形式)。根據(jù)需要，本發(fā)明的突變蛋白可在含有常規(guī)無(wú)毒可藥用賦形劑或載體、添加劑和運(yùn)載體的制劑中全身或局部給藥。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物腸胃外施用至哺乳動(dòng)物(特別是人)。相應(yīng)的給藥方法包括但不僅限于例如皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、氣管內(nèi)或靜脈內(nèi)的注射及輸注技術(shù)，例如注射液、輸注液或酊劑以及氣霧劑裝置和吸入(例如氣霧劑混合物)、噴霧劑或粉劑的形式。靜脈內(nèi)及皮下輸注和/或注射的組合對(duì)于血清半衰期相對(duì)短的化合物可能是最方便的。所述藥物組合物可以是水溶液、水包油乳劑或油包水乳劑。就這一點(diǎn)而言，應(yīng)該注意，如MeidanVM和MichniakBB2004Am.J.Ther.11(4):312-316所述的經(jīng)皮遞送技術(shù)(如離子電滲、超聲促滲或纖維針增強(qiáng)遞送)也可用于經(jīng)皮遞送本文所述突變蛋白。非腸胃外遞送模式為例如經(jīng)口(例如丸劑、片劑、膠嚢劑、溶液劑或混懸劑形式)或直腸施用(如松劑形式)。本發(fā)明的突變蛋白可在含有常規(guī)無(wú)毒可藥用賦形劑或載體、添加劑和運(yùn)載體的制劑中全身或局部給藥。所施用的突變蛋白劑量可在寬范圍內(nèi)變化，以實(shí)現(xiàn)期望的預(yù)防效果或治療應(yīng)答。例如，這將取決于該化合物對(duì)選定配體的親和力以及該突變蛋白與該配體的復(fù)合體在體內(nèi)的半衰期。此外，最佳劑量將取決于該突變蛋白或其融合蛋白或其綴合物的生物分布、給藥模式、受治疾病/病癥的嚴(yán)重程度以及患者的醫(yī)學(xué)狀況。例如，當(dāng)在軟膏劑中用于局部施用時(shí)，可以使用高濃度的淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白。然而，如果需要的話(huà)，也可在持續(xù)釋放制劑中給予該突變蛋白，例如脂質(zhì)體分散體或基于水凝膠的聚合物微球體，如PolyActive或OctoDEXTM(參閱Bos等，BusinessBriefing:Pharmatech2003:1-6)。其他可用的持續(xù)釋放制劑為例如基于PLGA的聚合物(PRpharmaceuticals)、基于PLA-PEG的水凝膠(Medincell)以及基于PEA的聚合物(Medivas)。因此，可使用可藥用成分和成熟的制備法將本發(fā)明的突變蛋白配制成組合物(Gennaro，A丄.和Geimaro,A.R，(2000)/e附iVigtow:!TAeSc/ewceawrfZVfl",Ve尸/rar附"cy，第二十版，LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,PA)。為了制備藥物組合物，可以使用藥學(xué)惰性的無(wú)機(jī)或有機(jī)賦形劑。為了制備如丸劑、粉劑、明膠膠嚢劑或栓劑，可以使用例如乳糖、滑石、硬脂酸及其鹽、脂肪、蠟、固體或液體多元醇、天然及硬化的油。用于產(chǎn)生溶液劑、混懸劑、乳劑、氣霧劑混合物或粉劑(在使用前將粉劑重建成溶液劑或氣霧劑混合物)的合適賦形劑包括水、醇、甘油、多元醇及其合適的混合物以及植物油。所述藥物組合物還可包含添加劑，例如填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、助流劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、乳化劑，以及溶劑或增溶劑或用于實(shí)現(xiàn)貯存效應(yīng)的試劑。后者是融合蛋白可摻入緩慢或持續(xù)釋放或靶向遞送系統(tǒng)(如脂質(zhì)體和微嚢劑)?？赏ㄟ^(guò)多種方法對(duì)制劑進(jìn)行滅菌，包括通過(guò)截留細(xì)菌的濾器過(guò)濾，或通過(guò)以無(wú)菌固體組合物的形式摻入消毒劑，所述消毒劑可在臨用前溶于或分散于無(wú)菌水或其他無(wú)菌介質(zhì)中。本發(fā)明的另一方面涉及治療疾病或病癥的方法，包括對(duì)有此需要的受試者施用包含上述突變蛋白的藥物組合物。需要這些治療的受試者可以是哺乳動(dòng)物，例如人、狗、小鼠、大鼠、豬、猿(如獼猴)，以上僅為幾個(gè)示例性實(shí)例。待根據(jù)本發(fā)明治療的疾病和病癥的確切性質(zhì)取決于所使用突變蛋白預(yù)期結(jié)合的配體。因此，本發(fā)明的突變蛋白可用于治療任何疾病，只要已物或展示為以其他方式獲得的淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白即可。上述以高親和力結(jié)合IL-4受體a的突變蛋白或含有它們的藥物組合物可用于治療與Th2免疫應(yīng)答提高相關(guān)的疾病或病癥的方法。例如，這樣的疾病或病癥可以是變態(tài)反應(yīng)或變應(yīng)性炎癥。上述變應(yīng)性炎癥又可與變應(yīng)性哮喘、鼻炎、結(jié)膜炎或皮炎相關(guān)(參閱Hage等，CrystalStructureoftheInteiieukin-4Receptoralphachaincomplexrevealsamosaicbindinginterface,Cell,Vol.97，271-281，April16，1999或者M(jìn)ueller等，Structure,bindingandantagonistsintheIL-4/IL-13receptorsystem,BiochemicaetBiophysicaActa(2002)，237-250)。在這種情況下，應(yīng)該注意，多種腫瘤細(xì)胞表達(dá)比正常細(xì)胞更多數(shù)量的高親和力IL-4受體。這些細(xì)胞包括例如人實(shí)體瘤如黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、間皮瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、腎細(xì)胞癌、頭頸癌、AIDS相關(guān)的卡波西肉瘤^AIDSKS、激素依賴(lài)性及非依賴(lài)性前列腺癌細(xì)胞以及來(lái)自前列腺瘤的原代培養(yǎng)物(參閱GarlandL，GitlitzB，等,JournalofImmunotherapy.28:376-381，No.4，Jul-Aug2005;RandRW，KreitmanR,J，等ClinicalCancerResearch.6:2157-2165，Jun2000;HusainSR，KreitmanRJ，等NatureMedicine.5:817-822，Jul1999;PuriRK，HoonDS，等CancerResearch.56:5631-5637，15Dec1996，10.DebinskiW，PuriR等，或HusainSR，BehariN，等CancerResearch.58:3649-3653，15Aug1998，KawakamiK,LelandP，等CancerResearch.60:2981-2987，1Jun602000;或者StromeSE，KawakamiK，等ClinicalCancerResearch.8:281-286，Jan2002)。例如，已證實(shí)過(guò)表達(dá)IL-4受體的細(xì)胞的具體實(shí)例包括但不僅限于Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系Jijoye(B細(xì)胞r淋巴瘤)、前列腺癌(LNCaP、DU145)、頭頸癌(SCC、KCCT873)、胰腺癌(PANC-1細(xì)胞系)、SCC-25:13.000(+/-500)h頭頸癌細(xì)胞系(ATCC)。IL4Ra鏈在IL4內(nèi)化中發(fā)揮重要作用。因此，當(dāng)與毒素融合或綴合時(shí)，與IL-4受體a鏈結(jié)合的淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白還可用于治療腫瘤(癌癥)。合適的毒素的實(shí)例包括假單胞菌外毒素、百日咳毒素、白喉毒素、蓖麻毒蛋白、肥皂草毒蛋白、假單胞菌外毒素、刺孢霉素或其衍生物、紫杉烷、maytansinoid、tubulysin和多拉司他汀類(lèi)似物。多拉司他汀類(lèi)似物的實(shí)例包括但不僅限于auristatinE、monomethylauristatinE、auristatinPYE和auristatinPHE。就癌癥治療而言，還可以將結(jié)合IL-4受體a鏈的突變蛋白與細(xì)胞抑制劑綴合。這些細(xì)胞抑制劑的實(shí)例包括順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、5-氟尿嘧淀、泰索帝(多西他賽)、紫杉醇、蒽環(huán)類(lèi)抗生素(多柔比星)、氨曱喋呤、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春地辛、長(zhǎng)春烯堿、達(dá)卡巴噪、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、阿霉素、喜樹(shù)堿、考布他汀A-4相關(guān)化合物、氨磺酰類(lèi)、^悉二唑啉類(lèi)、苯并lbj瘞吩合成螺酮縮醇吡喃、單四氫呋喃化合物、curacin和curacin衍生物、曱氧基雌二醇衍生物和亞葉酸。就這方面而言，還應(yīng)該指出，本發(fā)明淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白與毒素或細(xì)胞抑制劑的融合物或綴合物當(dāng)然不僅限于對(duì)IL-4受體a鏈有親和力的突變蛋白。相反，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，與癌細(xì)胞表面表達(dá)的受體結(jié)合的任何淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白都可以融合蛋白或綴合物的形式用于治療癌癥。以高親和力與VEGF-R2或VEGF結(jié)合的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白或包含它們的藥物組合物可用于治療與血管化作用提高的疾病或病癥，例如癌癥、新血管濕性年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變或黃斑水腫、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變或視網(wǎng)膜靜脈閉塞。這樣的癌癥可選自胃腸道、直腸、結(jié)腸、前列腺、卵巢、胰腺、乳腺、膀胱、腎、子宮內(nèi)膜和肺的癌癥、白血病和黑素瘤，以上僅為少數(shù)實(shí)例。從上文的公開(kāi)內(nèi)容中很明顯的是，本發(fā)明的突變蛋白或其融合蛋白或綴合物可用于許多應(yīng)用中。一般而言，這樣的突變蛋白可用于所有使用抗體的應(yīng)用，除了特別依賴(lài)于Fc部分的糖基化的以外。因此，在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，本發(fā)明的人淚液脂質(zhì)運(yùn)栽蛋白突變蛋白用于檢測(cè)人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的給定的非天然配體。這一用途可包括以下步驟在適當(dāng)條件下使該突變蛋白接觸懷疑含有給定配體的樣品，以允許該突變蛋白與該給定配體形成復(fù)合體，并通過(guò)適當(dāng)?shù)男盘?hào)檢測(cè)復(fù)合的突變蛋白。可檢測(cè)信號(hào)可通過(guò)如上述的標(biāo)記產(chǎn)生，或通過(guò)由于結(jié)合(即復(fù)合物形成)本身而導(dǎo)致的物理特性的變化而產(chǎn)生。一個(gè)實(shí)例是等離振子表面共振，其數(shù)值在結(jié)合配偶體結(jié)合時(shí)發(fā)生改變，所述配偶體之一固定在表面上，例如金箔上。本文所述人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白還可用于分離人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的給定非天然配體。這樣的用途可包括以下步驟在適當(dāng)條件下使該突變蛋白接觸推測(cè)含有給定配體的樣品，以允許該突變蛋白與該給定配體形成復(fù)合體，并從樣品中分離突變蛋白/配體復(fù)合體。在突變蛋白用于檢測(cè)給定非天然配體和分離給定配體的用途中，突變蛋白和/或耙標(biāo)均可固定在合適的固相上。本發(fā)明的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白還可用于將化合物靶向至預(yù)選的部位。就這樣的目的而言，將突變蛋白與目的化合物接觸，以允許形成復(fù)合體。接著將該突變蛋白與目的化合物的復(fù)合體遞送至預(yù)選部位。該用途特別適用于(但不僅限于)將藥物(選擇性)遞送至生物體中的預(yù)選部位，例如旨在用該藥物進(jìn)行治療的受到感染的機(jī)體部分、組織或器官。除了在突變蛋白與目的化合物之間形成復(fù)合體以外，突變蛋白還可以與給定的化合物反應(yīng)，以得到突變蛋白與化合物的綴合物。與上述復(fù)合體相似，這樣的綴合物可適用于將化合物遞送至預(yù)定的靶部位。這樣的突變蛋白與化合物的綴合物還可包括將突變蛋白和化合物彼此共價(jià)連接的接頭。任選地，這樣的接頭在血流中穩(wěn)定，但在細(xì)胞環(huán)境中可被切割。因此，本文所述突變蛋白及其衍生物可以與抗體或其片段相似地用于許多領(lǐng)域。除了與支持物結(jié)合以允許固定或分離給定突變蛋白的靶標(biāo)或該耙標(biāo)的綴合物或融合蛋白以外，該突變蛋白還可用于以酶、抗體、放射性物質(zhì)或任何其他具有生物化學(xué)活性或確定的結(jié)合特征的基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記。這樣，它們各自的靶標(biāo)或其綴合物或融合蛋白可以被檢測(cè)或者與它們接觸。例如，本發(fā)明的突變蛋白可用于通過(guò)成熟的分析法(如ELISA或Western印跡)或通過(guò)顯微術(shù)或免疫傳感器來(lái)檢測(cè)化學(xué)結(jié)構(gòu)。這里，檢測(cè)信號(hào)可使用合適的突變蛋白綴合物或融合蛋白直接產(chǎn)生，或者通過(guò)以抗體對(duì)結(jié)合的突變蛋白進(jìn)行免疫化學(xué)檢測(cè)而間接產(chǎn)生。醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中還存在本發(fā)明突變蛋白的眾多可能的應(yīng)用。除了在診斷和藥物遞送中的用途以外，可以產(chǎn)生與例如組織或腫瘤特異性細(xì)胞表面分子結(jié)合的本發(fā)明突變多肽。這樣的突變蛋白例如可以綴合形式或作為融合蛋白用于"肺瘤成像"或直接用于癌癥治療。因此，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的人淚液脂質(zhì)運(yùn)栽蛋白突變蛋白用于與給定非天然配體形成復(fù)合體的用途。本文所述突變蛋白的另一相關(guān)并優(yōu)選的用途是靶標(biāo)確認(rèn)，即分析推測(cè)參與疾病或病癥的發(fā)生或發(fā)展的多肽是否確實(shí)以某種方式導(dǎo)致該疾病或病癥。這種確i^蛋白質(zhì)作為藥理學(xué)藥物靶標(biāo)的用途利用本發(fā)明突變蛋白特異性識(shí)別天然構(gòu)象蛋白質(zhì)的表面區(qū)(即結(jié)合天然表位)的能力。在這方面，應(yīng)該注意，該能力僅在少數(shù)重組抗體中有過(guò)報(bào)道。然而，本發(fā)明突變蛋白用于確認(rèn)藥物耙標(biāo)的用途不僅限于檢測(cè)蛋白質(zhì)作為耙標(biāo)，而且還包括檢測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、肽、核酸分子、有機(jī)分子或金屬*物。通過(guò)以下非限制性實(shí)例和附圖進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，其中圖1顯示表達(dá)載體pTLPC10(SEQIDNO:l)的圖。圖2顯示S148.3J14的多肽序列，S148.3J14是一種對(duì)IL-4受體a具有結(jié)合親和力的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白。圖3顯示通過(guò)ELISA進(jìn)行的親和力篩選方法，以及對(duì)IL-4受體a具有親和力的突變蛋白得到的結(jié)果。圖4顯示對(duì)IL-4受體a具有最高親和力的突變蛋白的多肽序列(SEQIDNo:3-8)。圖5顯示本發(fā)明人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(S148.3J14;SEQIDNO:2)與IL-4受體a的結(jié)合的BIAcore測(cè)量。圖6顯示本發(fā)明人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(S191.5K12;SEQIDN():3)與IL-4受體a的結(jié)合的BIAcore測(cè)量。圖7顯示本發(fā)明人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(S148.3J14AM2C2;SEQIDNO:4)與IL-4受體a的結(jié)合的BIAcore測(cè)量。圖8顯示本發(fā)明人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(S191.4B24;SEQIDNO:5)與IL-4受體a的結(jié)合的BIAcore測(cè)量。圖9顯示本發(fā)明人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(S191.4K19;SEQIDN():6)與IL-4受體a的結(jié)合的BIAcore測(cè)量。圖10顯示本發(fā)明人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(S191.5H16;SEQIDNO:7)與IL-4受體a的結(jié)合的BIAcore測(cè)量。圖11顯示本發(fā)明人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(S197.8D22;SEQIDNO:8)與IL-4受體a的結(jié)合的BIAcore測(cè)量。圖12顯示本發(fā)明人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(S148.3J14;SEQIDNO:2)與IL-4受體a的結(jié)合的竟?fàn)幮訣LISA測(cè)量。圖13顯示本發(fā)明人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(S191.5K12;SEQIDNO:3)與IL-4受體a的結(jié)合的竟?fàn)幮訣LISA測(cè)量。圖14顯示本發(fā)明人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(S148.3J14AM2C2;SEQIDNO:4)與IL-4受體a的結(jié)合的竟?fàn)幮訣LISA測(cè)量。圖15顯示本發(fā)明人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(S191.4B24;SEQIDNO:5)與IL-4受體a的結(jié)合的竟?fàn)幮訣LISA測(cè)量。圖16顯示本發(fā)明人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(S191.4K19;SEQIDNO:6)與IL-4受體a的結(jié)合的竟?fàn)幮訣LISA測(cè)量。圖17顯示本發(fā)明人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白竟?fàn)幮?S191.5H16;SEQIDNO:7)與IL-4受體a的結(jié)合的竟?fàn)幮訣LISA測(cè)量。圖18顯示本發(fā)明人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(S197.8D22;SEQIDNO:8)與IL-4受體a的結(jié)合的竟?fàn)幮訣LISA測(cè)量。圖19顯示IL-4或IL-13及本發(fā)明人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(S191.5K12、S148.3J14AM2C2、S191.4B24、S191.4K19、S191.5H16和S197.8D22[SEQIDNo:3-8j)存在下的TF-1細(xì)胞增殖測(cè)定。圖20顯示表達(dá)載體pTLPC27(SEQIDNO:9)的圖。圖21顯示在人VEGF165及本發(fā)明人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(S209.2C23、S209.2D16、S209.2N9、S209.6H7、S209.6H10、S209.2M17、S209.2O10SEQIDNOs:27-33)、野生型淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(pTLPC10的基因產(chǎn)物，對(duì)照)或Avastin(Roche;對(duì)照)存在下由人臍靜脈(HUVEC)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖測(cè)定。圖22顯示PEG化的本發(fā)明人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(S148.3J14;SEQIDNO:2)與IL-4受體a的結(jié)合的BIAcore測(cè)量。圖23顯示本發(fā)明人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(S236.1-A22、SEQIDNO:44)與固定的VEGF8-109的結(jié)合的BIAcore測(cè)量。圖24顯示hVEGF8_109、hVEGF121、剪接形式hVEGF,65及相應(yīng)小鼠直向同源物mVEGF^與人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白S236.1-A22(SEQIDNO:44)結(jié)合的BIAcore測(cè)量。圖25顯示人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白S236.1-A22(SEQIDNO:44)在人血漿和玻璃體液中穩(wěn)定性測(cè)試的結(jié)果(圖25A)，以及突變蛋白S236.1-A22與白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ABD)的融合蛋白(SEQIDNO:51)的穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果(圖25B)。圖26顯示表達(dá)載體pTLPC51，其編碼包含以下的融合蛋白OmpA信號(hào)序列(OmpA)、與白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(abd)融合的突變?nèi)藴I液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(Tic)，其后為Strep-tagII。圖27顯示淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白S236.1-A22(SEQIDNO:44)和突變蛋白S236.1-A22與ABD的融合蛋白(SEQIDNO:51)與重組VEGF結(jié)合的BIAcore測(cè)量。圖28顯示在人血清白蛋白(HAS)不存在或存在下用S236.1-A22與ABD的融合蛋白(SEQIDNO:51)抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖。圖29顯示與Avastin⑧和野生型淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白所實(shí)現(xiàn)的抑制相比，脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白S236.1-A22(SEQIDNO:44)對(duì)培養(yǎng)自人臍靜脈(HUVEC)的內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF誘導(dǎo)的增殖的抑制。圖30顯示與Avastin⑧所實(shí)現(xiàn)的抑制相比，脂質(zhì)運(yùn)栽蛋白突變蛋白S236.1-A22(SEQIDNO:44)對(duì)HUVEC中VEGF介導(dǎo)的MAP激酶激活的抑制。圖31顯示與Avastin⑧和野生型淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白相比，局部施用淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白S209.2一O10(SEQIDNO:33)的血管通透性測(cè)定的結(jié)果。圖32顯示比較淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白S209.2—O10(SEQIDN():33)與Avastin⑧和野生型淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的中值血管發(fā)生指數(shù)的CAM測(cè)定結(jié)果。圖33顯示淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白S236.1-A22(SEQIDNO:44)和突變蛋白S236.1-A22與ABD的融合蛋白(SEQIDNO:51)的NMRI小鼠血漿中的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白濃度。圖34顯示與野生型淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、PBS緩沖液和Avastin⑧相比，全身施用淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白S236.1-A22與ABD的融合蛋白(SEQIDNO:51)后血管通透性測(cè)定的結(jié)果。圖35顯示與野生型淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、PBS緩沖液和Avastin⑧相比，腹膜內(nèi)施用淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白S236.1-A22與ABD的融合蛋白(SEQIDNO:51)的腫瘤異種移植物模型(Swiss棵鼠)的結(jié)果。圖36顯示在存在和不存在濃度逐漸提高的IL-4受體a結(jié)合突變蛋白S191.4B24(SEQIDNO:4)的情況下用IL-4或IL-13刺激的A549細(xì)胞進(jìn)行的嗜酸性粒細(xì)胞活化趨化因子(Eotaxin)-3分泌測(cè)定的結(jié)果。圖37顯示在存在和不存在濃度逐漸提高的IL-4受體a結(jié)合突變蛋白S191.4B24(SEQIDNO:4)時(shí)，經(jīng)刺激的外周血單核細(xì)胞(PBMC)中IL-4/IL-13誘導(dǎo)的CD23表達(dá)。圖38顯示IL-4受體a結(jié)合突變蛋白S191.4B24(SEQIDNO:4)的Schild分析結(jié)果。圖39顯示IL-4受體a結(jié)合突變蛋白S191.4B24(SEQIDNO:4)對(duì)人原代B細(xì)胞的親和力評(píng)估的結(jié)果。圖40顯示IL-4受體a結(jié)合突變蛋白S191.4B24在靜脈內(nèi)、皮下或氣管內(nèi)給藥后的生物利用率測(cè)試的結(jié)果。圖41顯示VEGF刺激的HUVEC增殖測(cè)定中以PEG20、PEG30或PEG40PEG化或未PEG化的突變蛋白S236.1-A22(SEQIDNO:44)的體外功效評(píng)估。圖1顯示了表達(dá)載體pTLPC10，其編碼包含OmpA信號(hào)序列(OmpA)、T7親和標(biāo)記和突變?nèi)藴I液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(Tlc)、其后為Strep-tagII的融合蛋白。用于克隆突變基因表達(dá)盒的BWXI限制性位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)基因側(cè)翼的限制性位點(diǎn)均已標(biāo)記?；虮磉_(dá)在四環(huán)素啟動(dòng)子/操縱基因(tetp/°)控制之下。轉(zhuǎn)錄在脂蛋白轉(zhuǎn)錄終止子(t,pp)處終止。該載體還包含復(fù)制起點(diǎn)(ori)、絲狀噬菌體fl的基因間區(qū)域(fl-IG)、氨芐青霉素抗性基因(amp)和四環(huán)素抑制基因(tetR)。將pTLPC10核^列的相關(guān)區(qū)段與序列表中SEQIDNO:1所編碼氨基酸序列一起復(fù)制。該區(qū)段從X6al限制性位點(diǎn)開(kāi)始，以f/ZdIII限制性位點(diǎn)結(jié)束。該區(qū)域以外的載體元件與載體pASK75相同，其完整核苷酸序列在德國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)DE4417598Al中給出。圖2顯示對(duì)IL-4受體a顯示結(jié)合親和力的本發(fā)明人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(S148.3J14)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。前21個(gè)殘基(下劃線(xiàn))構(gòu)成在周質(zhì)表達(dá)后^皮切割的信號(hào)序列。N端T7-標(biāo)記(斜體)和C端Streptag-II(粗體)是所表征蛋白質(zhì)的一部分。圖2還顯示在這一本發(fā)明的示例性突變蛋白中4個(gè)N端氨基酸殘基(H1H2L3A4)和最后兩個(gè)C端氨基酸殘基(S157和1)158)已缺失。圖3顯示親和力篩選實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。將單克隆抗StrepTag抗體(Qiagen)包被至ELISA平板上，以捕獲所表達(dá)的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白，使用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)綴合的抗IL-4受體a-Fc的Fc結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體來(lái)檢測(cè)IL-4受體a-Fc(R&DSystems;3nM和0.75nM)與所捕獲突變蛋白的結(jié)合。親和力提高的克隆給出更高的信號(hào)(左)。將IL-4包被至ELISA平板上，并將IL-4受體a-Fc(3nM)與所表達(dá)的突變蛋白一起孵育。使用針對(duì)IL-4受體a-Fc的Fc結(jié)構(gòu)域的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)綴合多克隆抗體來(lái)檢測(cè)具有未占據(jù)的IL-4結(jié)合位點(diǎn)的IL-4受體a-Fc的結(jié)合。拮抗性親和力提高的克隆給出更低的信號(hào)(右)。用箭頭標(biāo)出了對(duì)應(yīng)于本發(fā)明突變蛋白S148.3J14(SEQIDNO:2)的信號(hào)，并用菱形標(biāo)出了來(lái)自各個(gè)克隆的信號(hào)。圖4顯示通過(guò)SEQIDNO:2(S148.3J14)的親和力成熟獲得的對(duì)IL-4受體a具有最高結(jié)合親和力的六種人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(S191.5K12、S148.3J14AM2C2、S191.4B24、S191.4K19、S191.5H16和S197.8D2SEQIDNo:3-8j)的多肽序列。所示一級(jí)結(jié)構(gòu)的前21個(gè)殘基(下劃線(xiàn))構(gòu)成在周質(zhì)表達(dá)后被切割的信號(hào)序列。C端Streptag-II(粗體)是所表征蛋白質(zhì)的一部分。圖4還顯示在本發(fā)明淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白中，例如可缺失前4個(gè)N端氨基酸殘基(HHLA)以及最后兩個(gè)C端氨基酸殘基(SD)而不影響該蛋白質(zhì)的生物功能。圖5-11顯示顯示對(duì)IL-4受體a具有親和力的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(S148.3J14、S191.5K12、S148.3J14AM2C2、S191.4B24、S191.4K19、S191.5H16和S197.8D22[SEQIDNo:2國(guó)8)的Biacore測(cè)量。約400RU的IL-4受體a-Fc被捕獲在之前以抗人Fc單克隆抗體包被的CM-5芯片上。其后，使不同濃度(圖5:20nM;40nM;80nM;160nM;320nM)或單個(gè)濃度25nM(圖6-ll)的突變蛋白經(jīng)過(guò)流動(dòng)池，記錄共振單位的變化。減去來(lái)自經(jīng)同樣處理但無(wú)任何IL-4受體a-Fc的流動(dòng)池的參比信號(hào)，使用BIAevaluatoin軟件將所得數(shù)據(jù)以1:1Langmuir模型進(jìn)行擬合。由于圖6-11所示實(shí)驗(yàn)中相互作用的慢解離動(dòng)力學(xué)情況，通過(guò)減去來(lái)自同樣處理但無(wú)任68何IL-4受體a-Fc并減去來(lái)自?xún)H注射樣品緩沖液的實(shí)驗(yàn)的信號(hào)來(lái)使用雙參照。使用BIAevaluation軟件用質(zhì)量轉(zhuǎn)運(yùn)限制模式將所得數(shù)據(jù)以1:1Langmuir模型進(jìn)行擬合。在圖6-ll中，顯示了五個(gè)實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)代表的結(jié)果。圖12顯示對(duì)IL-4受體a具有結(jié)合親和力的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(S148.3J14;SEQIDNO:2)的竟?fàn)嶦LISA測(cè)量。將IL-4(20照/ml)包被至ELISA平板上，并將IL-4受體a-Fc(15nM)與多種濃度的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白或IL-4受體特異性單克隆抗體(MAB230，R&DSystems)在室溫下一起孵育1小時(shí)。對(duì)IL-4包被的平板在室溫下給予IL-4受體a-Fc和突變蛋白混合物30分鐘。用山羊抗人Fc-HRP綴合抗體檢測(cè)結(jié)合的IL-4受體a-Fc。將數(shù)據(jù)對(duì)以下表達(dá)式進(jìn)行擬合0.5*(-mO+m2-ml+sqrt((-mO+m2-ml)A2+4*ml*m2))。通過(guò)變量ml給出Ki。顯示了三個(gè)實(shí)驗(yàn)中一個(gè)代表的結(jié)果。圖13-18顯示對(duì)IL-4受體a具有結(jié)合親和力的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白及作為對(duì)照的野生型淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(TLPC10;pTLPC10的基因產(chǎn)物)的竟?fàn)嶦LISA測(cè)量。將針對(duì)IL-4受體的IL-4受體a特異性單克隆抗體MAB230(R&DSystems)包被至ELISA平板上，并將生物素化的IL-4受體a(IL-4Ralpha-bio;0.5nM)與多種濃度的本發(fā)明突變蛋白或TLPC10在室溫下一起孵育1小時(shí)。將IL-4Ralpha-bio和突變蛋白混合物在室溫下在MAB230包被的平板中孵育30分鐘。用Extravidin-HRP檢測(cè)結(jié)合的IL-4Ralpha-bio。將數(shù)據(jù)以以下表達(dá)式進(jìn)行擬合0.5*(-mO+m2-ml+sqrt((-mO+m2-ml)A2+4*ml*m2))。通過(guò)變量ml給出KD。顯示了三個(gè)實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)代表的結(jié)果。圖19顯示了TF-1細(xì)胞增殖測(cè)定的結(jié)果。將TF-1細(xì)胞與連續(xù)稀釋的所示突變蛋白、IL-4受體a特異性單克隆抗體或IgG2a抗體同種型對(duì)照在37。C下孵育1小時(shí)，之后加入0.8ng/mlIL-4(a，b)或12ng/mlIL-13(c，d)72小時(shí)。通過(guò)311-胸苷摻入來(lái)測(cè)量增殖。圖20顯示噬粒載體pTLPC27，其編碼包含OmpA信號(hào)序歹'j(OmpA)、69Tlc、其后為Strep-tagII的融合蛋白以及包含氨基酸217至406的截短形式的M13衣殼蛋白pill(pill)的融合蛋白。在S叩E琥珀抑制基因宿主菌種中部分翻譯成Gln的琥珀型終止密碼子位于Tlc編碼區(qū)(包括Strep-tagII)與截短的噬菌體衣殼蛋白pIII的編碼區(qū)之間，從而允許在4吏用非阻抑基因大腸桿菌菌種時(shí)可以可溶性表達(dá)無(wú)M13衣殼蛋白pIII的Tlc突變蛋白。用于克隆突變基因表達(dá)盒的丑"XI限制性位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)基因側(cè)翼的限制性位點(diǎn)均已標(biāo)記?；虮磉_(dá)在四環(huán)素啟動(dòng)子/操縱基因(tet—)控制之下。轉(zhuǎn)錄在脂蛋白轉(zhuǎn)錄終止子Upp)處終止。該載體還包含復(fù)制起點(diǎn)(ori)、絲狀噬菌體fl的基因間區(qū)域(fl-IG)、編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨千青霉素抗性基因(amp)和四環(huán)素抑制基因(tetR)。將pTLPC27核酸序列的相關(guān)區(qū)段與序列表中SEQIDNO:9所編碼氨基^列一起復(fù)制。圖21顯示利用對(duì)人VEGF具有結(jié)合親和力的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白、野生型淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(TLPC10)或VEGF特異性治療性抗體Avastii^進(jìn)行的增殖測(cè)定的結(jié)果。將約1400個(gè)HUVEC細(xì)胞接種到完全培養(yǎng)基中并以37。C過(guò)夜孵育，洗滌細(xì)胞并加入含有0.5%FCS、氫化可的松和慶大霉素/兩性霉素的基本培養(yǎng)基。以標(biāo)明的濃度一式三份向孔中加入VEGF特異性突變蛋白S209.2-C23,S209.2-D16，S209.2-N9，S209.6-H7，S209.6-H10,S209.2-M17,S209.2-O10(SEQIDNO:27-33)、野生型淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(pTLPC10的基因產(chǎn)物，作為對(duì)照)或治療性VEGF特異性單克隆抗體Avastin(Roche;作為對(duì)照)。30分鐘后，加入人VEGF165或人FGF-2(作為未受VEGF誘導(dǎo)增殖的對(duì)照(未顯示))，6天后以CellTiter96AqueousOne生色觀'J定(chromogenicassay)(Promega)評(píng)估細(xì)胞生存力。圖22顯示對(duì)IL-4受體a具有親和力的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的PEG化突變蛋白S148.3J14(SEQIDNO:2)的Biacore測(cè)量。將約400RUIL-4受體a-Fc捕獲在之前以抗人Fc單克隆抗體包被的CM-5芯片上。其后，使不同濃度(200nM;67nM;22nM)的突變蛋白通過(guò)流動(dòng)池并記錄共振單位的改變。減去來(lái)自同樣處理但無(wú)任何IL-4受體a-Fc的流動(dòng)池的參照信號(hào)，并使用BIAevaluation軟件將所得數(shù)據(jù)以1:1Langmuir模型進(jìn)行擬合。圖23顯示人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白S236.1-A22(SEQIDNO:44)與固定的VEGF8_1()9的結(jié)合的示例性Biacore測(cè)量。使用標(biāo)準(zhǔn)胺化學(xué)反應(yīng)將VEGF8-1()9固定在CM5芯片上。在500nM至16nM的六種不同濃度下以30jnl/分鐘的流速應(yīng)用脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白S236.1-A22。用BIAT100軟件進(jìn)行傳感圖評(píng)估，以測(cè)定該突變蛋白的kon、koff和KD。圖24顯示固定在傳感芯片上的突變蛋白S236.1-A22(SEQIDNO:44)與不同形式VEGF的親和力測(cè)量?；救鏦O2006/56464的實(shí)施例9所述進(jìn)行親和力測(cè)量，改動(dòng)是突變蛋白被固定，并以250nM的濃度注入含有不同VEGF變體的70^1樣品。結(jié)果的定性比較顯示，截短形式hVEGF8—109和hVEGF121顯示基本相同的傳感圖，表明對(duì)淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白S236.1-A22(SEQIDNO:44)相似的親和力。剪接形式hVEGF^也顯示與淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的強(qiáng)烈結(jié)合，而相應(yīng)的小鼠直向同源物mVEGF,64的親和力稍低。圖25顯示VEGF-結(jié)合突變蛋白S236.1-A22在37。C下在PBS和人血清中的穩(wěn)定性測(cè)試，該測(cè)試基本如國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO2006/056464的實(shí)施例15所述進(jìn)行，只是所使用的濃度為lmg/ml。通過(guò)HPLC-SEC判斷，在7天的溫育期間未檢測(cè)到該突變蛋白的改變(數(shù)據(jù)未顯示)。在人血清中孵育該淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白導(dǎo)致親和力在7天后下降至參照的約70%(圖25a)。還如上述在人血清中測(cè)試了S236.1-A22的ABD融合蛋白(SEQIDNO:51)的穩(wěn)定性。在7天的孵育期中未檢測(cè)到活性的損失(圖25b)。圖26顯示表達(dá)載體pTLPC51,其編碼包含OmpA信號(hào)序歹'J(OmpA)、與白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(abd)融合的突變?nèi)藴I液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(Tlc)、其后為Strep-tagII的融合蛋白。用于克隆突變基因表達(dá)盒的5"XI限制性位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)基因側(cè)翼的限制性位點(diǎn)均已標(biāo)記?；虮磉_(dá)在四環(huán)素啟動(dòng)子/操縱基因(tetp/°)控制之下。轉(zhuǎn)錄在脂蛋白轉(zhuǎn)錄終止子(t,pp)處終止。該載體還包含復(fù)制起點(diǎn)(ori)、絲狀噬菌體fl的基因間區(qū)域(fl-IG)、氨節(jié)青霉素抗性基因(amp)和四環(huán)素抑制基因(tetR)。將pTLPC51核酸序列的相關(guān)區(qū)段與序列表中SEQIDNO:48和49所編碼氨基酸序列一起復(fù)制。該區(qū)段從X6al限制性位點(diǎn)開(kāi)始，以7/,VidlII限制性位點(diǎn)結(jié)束。該區(qū)域以外的載體元件與載體pASK75相同，其完整核苷酸序列在德國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)DE4417598Al中給出。圖27顯示使用表面等離振子共振(Biacore)對(duì)淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的ABD融合物S236.1國(guó)A22(A22-ABD)(SEQIDNO:51)(200pM)與重組VEGF^。9的親和力測(cè)量。親和力測(cè)量基本如WO2006/56464的實(shí)施例9所述進(jìn)行，改動(dòng)為使用標(biāo)準(zhǔn)胺化學(xué)反應(yīng)將約250RU的重組VEGF8—冊(cè)與傳感芯片直接偶聯(lián)。以400nM的濃度注入40pl突變蛋白。發(fā)現(xiàn)親和力基本無(wú)改變，測(cè)得為260pM。圖28顯示淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白A22-ABD(ABD-S236.1-A22融合物)在人血清白蛋白存在下的功能性測(cè)試，這通過(guò)評(píng)估其抑制VEGF所誘導(dǎo)的HUVEC增殖來(lái)進(jìn)行。在明膠包被的平皿中培養(yǎng)HUVEC(Promocell)，并在P2至P8代之間使用。在第1天，以1400個(gè)細(xì)胞/孔接種到96孔板的完全培養(yǎng)基中。第2天，洗滌細(xì)胞并加入含有0.5%FCS、氫化可的松和慶大霉素/兩性霉素的100pl基本培養(yǎng)基。用20ng/mlVEGF,65或10ng/mlFGF-2刺激增殖，將它們與脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白S236.1-A22-ABD(SEQIDNO:51)混合，孵育30分鐘并加入孔中。在第6天測(cè)定生存力，將結(jié)果表示為抑制百分比。在標(biāo)明的情況下加入了人血清白蛋白(HSA，5pM)。在5pMHAS下，>99.8%的A22-ABD在任何給定時(shí)間均與HAS相關(guān)聯(lián)。圖29顯示本發(fā)明突變蛋白對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖的抑制。在明膠包被的平亞中增殖HUVEC(Promocell),并在P2到P8代之間使用。在第1天，以1400個(gè)細(xì)胞/孔接種到96孔板的完全培養(yǎng)基中。第2天，洗滌細(xì)胞并加入含有0.5%FCS、氫化可的松和慶大霉素/兩性霉素的100pl基本培養(yǎng)基。用20ng/mlVEGF附或10ng/mlFGF-2刺激增殖，將它們與脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白S236.1-A22(SEQIDNO:44)混合，孵育30分鐘并加入孔中。在第6天測(cè)定生存力，將結(jié)果表示為抑制百分比。圖30顯示本發(fā)明突變蛋白對(duì)HUVEC中VEGF介導(dǎo)的MAP激酶活化的抑制。以1400個(gè)細(xì)胞/孔將HUVEC接種到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(Promocell，Heidelberg)中。第2天，將FCS減少至0.5。/。，并繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)。在基本培養(yǎng)基中的0.5D/。BSA中使細(xì)胞饑餓5小時(shí)。在濃度逐漸提高的淚液脂質(zhì)運(yùn)栽蛋白突變蛋白A22或Avastin(貝伐單抗，Genentech/Roche)存在下用VEGF165(Reliatech，Braunschweig)刺激HUVEC10分鐘，以獲得劑量應(yīng)答曲線(xiàn)。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)(ActiveMotif,Rixensart，Belgium),使用ELISA定量MAP激酶ERK1和ERK2的磷酸化。ICso值測(cè)定為突變蛋白A22(SEQIDNO:44)為4.5nM,Avastin為13nM。圖31顯示局部施用淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的血管通透性測(cè)定。將體重350±50g的Duncan-Hartley豚鼠在肩和背部剃毛。該動(dòng)物通過(guò)耳靜脈接受靜脈注射lml1%Evan's藍(lán)色染料。30分鐘后，將20ngVEGF165(Calbiochem)以10倍摩爾過(guò)量與測(cè)試物質(zhì)或?qū)φ瘴锘旌希⒃?x4的方格中皮內(nèi)注射。30分鐘后，通過(guò)C02窒息對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死。注射VEGF后1小時(shí)，取下含有方格圖案的皮膚并清除結(jié)締組織。使用圖像分析儀(ImageProPlus1.3，MediaCybernetics)對(duì)染料外滲面積進(jìn)行定量。圖32顯示雞尿嚢絨膜(CAM)測(cè)定。將含有FGF-2(500ng)、VEGF(150ng)以及淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(1.35照)或Avastin(10照)的膠原種植體(onplant)置于10日雞胚的CAM上(4個(gè)/動(dòng)物，10只動(dòng)物/組)。在24小時(shí)時(shí)以相同劑量對(duì)該種植體再次應(yīng)用淚液脂質(zhì)運(yùn)栽蛋白突變蛋白或Avastin。72小時(shí)后，收集種植體并捕捉圖像。通過(guò)不知情觀察者確定含有至少一個(gè)血管的陽(yáng)性方格的百分比。對(duì)VEGF拮抗劑S209.2-O10(SEQII)NO:33)和Avastii^以及野生型淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白對(duì)照將中值血管發(fā)生指數(shù)報(bào)告為陽(yáng)性方格的分?jǐn)?shù)。圖33顯示測(cè)定A22和A22-ABD在小鼠中的藥代動(dòng)力學(xué)(PK)參數(shù)。在NMRI小鼠中測(cè)定靜脈內(nèi)注射淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白S236.1A22(SEQIDNO:44)(4mg/kg)后及靜脈或腹膜內(nèi)快速輸注突變蛋白S236.1A22與ABD的融合蛋白(SEQIDNO:51)(5.4mg/kg)后的藥代動(dòng)力學(xué)(PK)參數(shù)(半衰期血漿濃度、生物利用率)。從在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)收集的末端血樣中制備血漿，并通過(guò)ELISA測(cè)定脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的濃度。使用WinNonlin軟件(PharsightCorp.,MountainView,USA)分析結(jié)果。T,/2A22靜脈內(nèi)注射0.42小時(shí)；1>2A22-ABD靜脈內(nèi)注射18.32小時(shí)；T,/2A22-ABD腹膜內(nèi)注射20.82小時(shí)。腹膜內(nèi)注射施用A22-ABD融合蛋白后的生物利用率為82.5%。圖34顯示全身施用淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的血管通透性測(cè)定。實(shí)驗(yàn)前12小時(shí)，將測(cè)試物質(zhì)或?qū)φ侦o脈內(nèi)注射到每組三只動(dòng)物中。第l組PBS載體；第2組Avastin，10mg/kg;第3組突變蛋白S236.1A22國(guó)ABD，6.1mg/kg;第4組TLPC51:6.1mg/kg。在時(shí)間=0時(shí)注射Evan，sBlue。3()分鐘后，在3x4方格中一式三份皮內(nèi)注射4種劑量的VEGF(5、10、20或40ng)。注射VEGF后30分鐘，處死動(dòng)物并使用圖像分析儀(ImageProPlus1.3,MediaCybernetics)對(duì)染料外滲進(jìn)行定量。圖35顯示本發(fā)明突變蛋白在腫瘤異種移植物模型中的作用。將基質(zhì)膠中的lxl0個(gè)A673橫紋肌肉瘤細(xì)胞(ATTC)皮下接種至經(jīng)照射(2.5Gy，Co6°)的Swiss棵鼠的右側(cè)腹(11=12只/組)。腹膜內(nèi)施用處理，在照射開(kāi)始的同一天開(kāi)始并持續(xù)21天。第1組PBS載體，每天一次；第2組Avastin(貝伐單抗，Genentech/Roche)，5mg/kg，每3天一次；第3組月旨質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白A22-ABD(SEQIDNO:51),每天一次，3.1mg/kg;第4組TLPC51,每天一次，3.1mg/kg。將脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白A22-ABD的劑量選擇成實(shí)現(xiàn)恒定存在等摩爾數(shù)的突變蛋白及Avastin的VEGF結(jié)合位點(diǎn)，這是基于A22-ABDPK數(shù)據(jù)和抗體在小鼠中的估計(jì)血清半衰期。用測(cè)徑器每周兩次測(cè)量腫瘤大小，并根據(jù)式(長(zhǎng)度x寬度2)/2來(lái)估計(jì)腫瘤體積。當(dāng)腫瘤體積超過(guò)2，000mm3時(shí)處死小鼠。圖36顯示用A549細(xì)胞進(jìn)行的嗜酸性粒細(xì)胞活化趨化因子分泌測(cè)定的結(jié)果。在存在和不存在濃度逐漸提高的IL-4受體a結(jié)合突變蛋白S191.4B24(SEQIDNO:4)的情況下分別用0.7nMIL-4或0.83nMIL-13刺激A549細(xì)胞。在72小時(shí)后通過(guò)使用市售試劑盒測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的嗜酸性粒細(xì)胞活化趨化因子3濃度來(lái)評(píng)估嗜酸性粒細(xì)胞活化趨化因子3的分泌。圖37顯示在不存在和存在濃度逐漸提高的IL-4受體a結(jié)合突變蛋白S191.4B24(SEQIDNO:4)的情況下經(jīng)刺激的外周血單核細(xì)胞(PBMC)中IL-4/IL-13誘導(dǎo)的CD23表達(dá)。從暗黃覆蓋區(qū)中分離總?cè)薖BMC。加入濃度逐漸提高的IL-4受體a結(jié)合突變蛋白S191.4B24，并分別以終濃度1.0nM或2.5nM的IL-4或IL-13刺激細(xì)胞。48小時(shí)后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)表達(dá)CD23的CD14+單核細(xì)胞進(jìn)行定量。圖38顯示IL-4受體a結(jié)合突變蛋白S191.4B24(SEQIDNO:4)的Schild分析的結(jié)果。在不存在或存在若千固定濃度IL-4受體a結(jié)合突變蛋白S191.4B24的情況下評(píng)估TF-1細(xì)胞的IL-4劑量依賴(lài)性增殖(圖38A)。所得結(jié)果的Schild分析(圖38B)獲得的Kd為192pM(線(xiàn)性回歸)和116pM(非線(xiàn)性回歸)。圖39顯示結(jié)合IL-4受體a的突變蛋白S191.4B24(SEQIDNO:4)對(duì)人原代B細(xì)胞的親和力評(píng)估的結(jié)果。從人血液中分離PBMC,并與不同濃度的結(jié)合IL-4受體a的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白S191.4B24或野生型人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(TLPC26)—起孵育。接著用抗CD20-FITC單克隆抗體和生物素化的抗脂質(zhì)運(yùn)載蛋白抗血清、其后用鏈霉親合素-PE染色細(xì)胞。野生型脂質(zhì)運(yùn)載蛋白和結(jié)合IL-4受體a的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白S191.4B24的結(jié)果分別示于圖39A和B。將所測(cè)定的PE陽(yáng)性B細(xì)胞百分比對(duì)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白濃度進(jìn)行擬合(圖39C),并從所得曲線(xiàn)中計(jì)算ECso。IL-4受體a結(jié)合突變蛋白S191.4B24(SEQIDNO:4)的ECs。計(jì)算為105pM。圖40顯示靜脈內(nèi)、皮下或氣管內(nèi)施用后結(jié)合IL-4受體a的突變蛋白S191.4B24的生物利用率測(cè)試的結(jié)果。通過(guò)所示途徑，以4mg/kg對(duì)Sprague-Dawley大鼠給予單劑量的突變蛋白S191.4B24。使用微型噴霧給藥裝置(PennCentury，USA)進(jìn)行氣管內(nèi)施用。在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)獲得血漿樣品并進(jìn)行夾層ELISA分析，以測(cè)定具有功能活性的突變蛋白的剩余濃度。通過(guò)非房室PK分析來(lái)分析濃度。生物利用率在皮下給藥后為100%,在氣管內(nèi)遞送后為13.8%。圖41顯示與人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白野生型相比，未PEG化或以PEG20、PEG30或PEG40PEG化的突變蛋白S236.1-A22(SEQIDNO:44)的體外效力評(píng)估。通過(guò)在VEGF刺激的HUVEC增殖測(cè)定中滴定各自的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白并測(cè)定增殖抑制來(lái)測(cè)定ICSo。實(shí)施例除非另外指明，否則均使用成熟的重組基因技術(shù)方法，例如Sambrook等(同上)所述。實(shí)施例l:產(chǎn)生具有2xl(^種獨(dú)立的Tlc突變蛋白的文庫(kù)通過(guò)協(xié)同誘變成熟野生型人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白中18個(gè)選定的氨基酸位置26、27、28、29、30、31、32、33、34、56、57、58、80、83、104、105、106和108來(lái)制備高復(fù)雜性的淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(Tic)隨機(jī)文庫(kù)。為此，在根據(jù)前述策略的兩個(gè)步驟中，使用簡(jiǎn)并性引物寡脫氧核苷酸通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)裝配以耙向方式將相應(yīng)密碼子隨機(jī)化的基因盒，(Skerra,A.(2001)"Anticalins":anewclassofengineered-ligand-bindingproteinswithantibody-likeproperties./24,257-275)。在"i亥文庫(kù)設(shè)計(jì)中，淚液脂質(zhì)運(yùn)栽蛋白野生型序列中的前4個(gè)N端氨基酸殘基(HHLA)和最后兩個(gè)C端氨基酸殘基(SD)^皮缺失(為此，所附序列表中所有的淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白均含有野生型序列的Ala5作為N末端殘基，Glyl56作為C末端殘基(后者任選地與例如親和標(biāo)記融合)。在產(chǎn)生隨機(jī)文庫(kù)的第一個(gè)步驟中，使用引物TL46(SEQIDNO:10)和TL47(SEQIDNO:ll)為T(mén)ic第一個(gè)和第二個(gè)暴露環(huán)制備帶有隨機(jī)化密碼子的PCR片段，使用引物TL48(SEQIDNO:12)和TL49(SEQIDNO:13)平行地為T(mén)ic第三個(gè)和第四個(gè)暴露環(huán)制備帶有隨機(jī)化密碼子的另一PCR片段。在第二個(gè)步驟中，使用連接寡脫氧核苷酸將這兩個(gè)PCR片段合并，并在使用引物AN14(SEQIDNO:14)、TL50bio(SEQIDNO:15)和TL51bio(SEQIDNO:16)的PCR反應(yīng)中作為模板，以獲得裝配好的隨機(jī)化基因盒。第一步中的兩個(gè)PCR反應(yīng)(la和lb)各在lOOitil體積中進(jìn)行，每個(gè)反應(yīng)分別使用作為模板的10ngpTLPC10質(zhì)粒DNA(圖1)以及50pmol的每對(duì)引物(分別為T(mén)L46和TL47，或者TL48和TL49)，它們根據(jù)常規(guī)的亞磷酰胺法合成。此外，反應(yīng)混合物含有10pll0xTaq反應(yīng)緩沖液(100mMTris/HClpH9.0，500mMKCl，15mMMgCl2，1%v/vTritonX畫(huà)100)和2pidNTP-Mix(10mMdATP,dCTP，dGTP，dTTP)。用水補(bǔ)足體積后，加入5uT叫DNA聚合酶(5u/l，Promega),在帶熱蓋的可編程熱循環(huán)儀(Eppendorf)中進(jìn)行94°Cl分鐘、58。C1分鐘和72°C1.5分鐘的20個(gè)循環(huán)，其后60。C孵育5分鐘完成反應(yīng)。使用GTQ瓊脂糖(Roth)和WizardDNA提取試劑盒(Promega)，通過(guò)制備型瓊脂糖凝膠電泳分離具有分別為135bp和133bp的期望大小的擴(kuò)增產(chǎn)物。在第二個(gè)PCR步驟中，制備1000pi混合物，其中在500pmol每種側(cè)翼引物TL50bio(SEQIDNO:15)和TL51bio(SEQIDNO:16)以及10pmol中介體引物AN-14(SEQIDNO:14)存在下，使用約500fmol來(lái)自PCR反應(yīng)la和lb的片段作為模板。兩種側(cè)翼引物均在其5，末端帶有生物素基團(tuán)，因此允許在5WXI切割后通過(guò)包被有鏈霉親合素的順磁性珠從不完全消化的產(chǎn)物中分離PCR產(chǎn)物。此外，該反應(yīng)混合物含有100jullOxTaq緩沖液、20pidNTP混合物(IOmMdATP，dCTP，dGTP，dTTP)、50uT叫DNA聚合酶(5u/l，Promega),并用水將終體積補(bǔ)足至1000pi終體積。將混合物分成100pi等分試樣并以94°C1分鐘、57°C1分鐘、72°C1.5分鐘的20個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR，隨后最終以60。C孵育5分鐘。使用E.Z.N.A.Cycle-PureKit(PeqLab)純化PCR產(chǎn)物。就后續(xù)的克隆而言，首先根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，用限制性酶5"XI(Promega)切下代表核酸形式Tic突變蛋白文庫(kù)中心部分的這一片段，接著如上述通過(guò)制備型瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，產(chǎn)生大小為301個(gè)堿基對(duì)的雙鏈DNA片段。使用以鏈霉親合素包被的順磁性珠(Merck)，通過(guò)其5，-生物素標(biāo)簽除去未消化或未完全消化的DNA片段。為此，用100jUTE緩沖液(10mMTris/HClpH8.0，1mMEDTA)將150pl市售的鏈霉親合素包被的順磁性顆粒的懸浮液(10mg/ml的濃度)洗滌三次。接著借助磁體將顆粒排干水分并與100plTE緩沖液中的70pmol經(jīng)消化DNA片段在室溫下混合15分鐘。接著借助磁體收集Eppendor容器壁上的順磁性顆粒，回收完全消化的DNA片段用于后續(xù)的連接反應(yīng)中。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，用限制性酶5WXI(Promega)切割載體pTLPC27(圖20)，如上述通過(guò)制備型瓊脂糖凝膠電泳純化獲得的大載體片段，產(chǎn)生代表載體骨架的大小為3772個(gè)堿基對(duì)的雙鏈DNA片段。就連接反應(yīng)而言，在總體積10.76ml(50mMTris/HClpH7.8，10mMMgCl2，10mMDTT，1mMATP，50pg/mlBSA)中，在1074Weiss單位T4I)NA連接酶(Promega)存在下將40pmolPCR片段和40pmol載體片段(pTLPC27)以16。C孵育48小時(shí)。接著通過(guò)加入267pl酵母tRNA(水中10mg/ml溶液(Roche))、10.76ml5M乙酸銨和42.7ml乙醇將連接混合物中的DNA沉淀1.5小時(shí)。沉淀后，用70%EtOH洗滌DNA沉淀并干燥。最后，將DNA在總體積538pi水中溶解至終濃度200|iig/ml。根據(jù)Tung和Chow(rmwfo11(1995)，128-129)以及Hengen(7>e"^祝oc/^附.Sd.21(1996),75-76)所述方法進(jìn)行細(xì)胞大腸桿菌菌抹XLl-Blue的電感受態(tài)細(xì)菌(Bullock等，同上)的制備。通過(guò)加入XLl-Blue的過(guò)夜培養(yǎng)物并在2升錐形瓶中以140rpm和26。C孵育而將1升LB培養(yǎng)基(IOg/LBactoTryptone，5g/L細(xì)菌用酵母提取物，5g/LNaCl，pH7.5)調(diào)整成600nm處的吸光度OD60。=0.08。達(dá)到OD600=0.6后，將培養(yǎng)物在冰上冷卻30分鐘，其后以4000g和4°C離心15分鐘。將細(xì)胞用500ml冰預(yù)冷的10%w/v甘油洗滌兩次，最后重懸于2ml冰預(yù)冷的GYT培養(yǎng)基(10。/。w/v甘油、0.125%w/v酵母提取物、0.25%w/v胰蛋白胨)中。接著將細(xì)胞分成等分試樣(200在液氮中速凍并保存于-80。C。在4。C下使用MicroPulser系統(tǒng)(BioRad)結(jié)合來(lái)自同一銷(xiāo)售商的穿孔杯(電極距離2mm)進(jìn)行電穿孑L。將10jil等分試樣的連接后的DNA溶液(含有1jugDNA)與100^細(xì)胞懸液混合，首先在水上孵育l分鐘，接著轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的穿孔杯中。使用5ms和12.5kV/cm場(chǎng)強(qiáng)的參數(shù)進(jìn)行電穿孔，其后立即將懸液在2ml水預(yù)冷的SOC培養(yǎng)基(20g/LBactoTryptone，5g/L細(xì)菌用酵母提取物，10mMNaCl,2.5mMKCl，pH7.5,高壓滅菌，在電穿孔前加入10ml/L1MMgCl2和1MMgS04以及20ml/L20%葡萄糖)中稀釋?zhuān)S后以37。C和140rpm孵育60分鐘。其后，將培養(yǎng)物在含有100^tg/ml氯霉素(2YT/Cam)的2L2xYT培養(yǎng)基(16g/LBactoTryptone，10g/L細(xì)菌用酵母提取物，5g/LNaCl，pH7.5)中稀釋?zhuān)玫?.26的OD550。將培養(yǎng)物在37。C下孵育，直至ODsso再提高0.6單位。通過(guò)在54次電穿孔中使用總計(jì)107.6照已連接的DNA，獲得了總計(jì)約2.0xl(f個(gè)轉(zhuǎn)化體。將轉(zhuǎn)化體進(jìn)一步用于制備編碼作為融合蛋白的Tlc突變蛋白文庫(kù)的噬菌粒。就噬菌粒文庫(kù)的制備而言，用1.3xl012pfuVCS-M13輔助噬菌體(Stratagene)感染41上述培養(yǎng)物。37。C攪拌45分鐘后，將孵育溫度降至26°C。溫度平衡10分鐘后，加入25ng/l無(wú)水四環(huán)素，以誘導(dǎo)基因表達(dá)Tlc突變蛋白與噬菌體衣殼蛋白之間的融合蛋白。允許在26。C產(chǎn)生噬菌粒11小時(shí)。通過(guò)離心除去細(xì)菌后，用20%(w/v)聚乙二醇8000(Fluka)、15%(Wv)NaCl從培養(yǎng)物上清液沉淀嗟菌粒兩次，最后溶于PBS(4mMKH2P04,16mMNa2HP04，115mMNaCl)中。實(shí)施例2:噬菌粒呈遞以及選擇對(duì)IL-4受體a具有親和力的Tic突變蛋白利用實(shí)施例1所得的噬菌粒進(jìn)行噬菌粒展示和選擇，基本如WO2006/56464的實(shí)施例2所述的進(jìn)行，有以下纟務(wù)改以200nM的濃度4吏用草巴蛋白(IL-4受體a，Peprotech)，并作為生物素化蛋白呈遞給文庫(kù)，隨后使用鏈霉親合素珠(Dynal)捕獲噬菌體-靶標(biāo)復(fù)合體?；蛘撸?00nM濃度Fc-融合蛋白(IL-4受體a-Fc，R&DSystem)的形式使用靶蛋白，其后根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，使用G蛋白珠(Dynal)并通過(guò)將Fc-融合蛋白固定在以抗人Fc捕獲抗體(JacksonImmunoResearch)包4皮的免疫才奉(Nunc)上來(lái)捕獲噬菌體-靶標(biāo)復(fù)合體。進(jìn)行三輪或四輪選擇。實(shí)施例3:使用高通量ELISA篩選來(lái)鑒定IL-4受體a特異性突變蛋魚(yú)基本如WO2006/56464的實(shí)施例3所述對(duì)根據(jù)實(shí)施例2選擇的突變蛋白進(jìn)行篩選，有以下修改表達(dá)載體為pTLPClO(圖1)。所使用的靶蛋白為IL-4受體a-Fc(R&DSystems)和IL-4受體a(P印rotech)，均為2pg/ml。篩選了如實(shí)施例2所述選擇的5632個(gè)克隆，鑒定了指示從文庫(kù)中成功分離突變蛋白的2294個(gè)原始命中。使用該方法鑒定了克隆S148.3J14(SEQIDNO:2)。S148.3J14的序列也示于圖2。實(shí)施例4:使用易錯(cuò)PCR對(duì)突變蛋白S148.3J14進(jìn)行親和力成熟使用寡核苷酸TL50bio(SEQIDNO:15)和TL51bio(SEQIDNO:16),基本如WO2006/56464實(shí)施例5所述產(chǎn)生基于突變蛋白S148.3J14(SEQIDNO:2)的變體文庫(kù)，得到每個(gè)結(jié)構(gòu)基因平均帶有3個(gè)替換的文庫(kù)。如實(shí)施例2所述進(jìn)行噬菌粒選擇，但使用有限的靶標(biāo)濃度(2nM、0.5nM和O.lnM的IL-4受體a，P印rotechLtd)、延長(zhǎng)的洗滌時(shí)間以及針對(duì)IL-4受體a的拮抗性單克隆抗體(MAB230，R&DSystems;1小時(shí)洗滌時(shí)間和2小時(shí)洗滌時(shí)間)或短孵育時(shí)間(30秒、l分鐘和5分鐘)。進(jìn)行三輪或四輪選擇。實(shí)施例5:使用定點(diǎn)隨機(jī)法對(duì)突變蛋白S148.3J14進(jìn)行親和力成熟通過(guò)將位置34、53、55、58、61、64和66隨^L化成在這些位置上允許全部20種氨基酸來(lái)設(shè)計(jì)基于突變蛋白S148.3J14(SEQIDNO:2)的變體文庫(kù)。基本如實(shí)施例1所述構(gòu)建文庫(kù)，改動(dòng)為分別使用脫氧核苷酸TL70(SEQIDNO:17)、TL71(SEQIDNO:18)和TL72(SEQIDNO:19)代替TL46、TL47和AN-14。分別使用有限的草巴標(biāo)濃度(0.5nM和O.lnMIL-4受體a，Peprotech)與延長(zhǎng)的洗滌時(shí)間及針對(duì)IL-4受體a的竟?fàn)幮詥慰寺】贵w(MAB230，R&DSystems;1小時(shí)洗滌)或短孵育時(shí)間(10分鐘)組合，如實(shí)施例2所述進(jìn)行噬菌粒選擇。進(jìn)行三輪或四輪選擇。實(shí)施例6:使用高通量ELISA篩選對(duì)IL-4受體a結(jié)合突變蛋白進(jìn)行親和力篩選如實(shí)施例3所述進(jìn)行篩選，改動(dòng)為使用3nM濃度的IL-4受體a-Fc(R&DSystems),并加入了i)將單克隆抗-Strep標(biāo)簽抗體(Qiagen)包被在ELISA平板上，以捕獲產(chǎn)生的突變蛋白，并使用針對(duì)IL-4受體a-Fc的Fc結(jié)構(gòu)域的HRP(辣根過(guò)氧化物酶)綴合的多克隆抗體檢測(cè)IL-4受體a-Fc(R&DSystems,3nM和0.75nM)與所捕獲的淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的結(jié)合。另外，在備選的篩選設(shè)置中ii)將IL-4包被在ELISA平板上，將IL-4受體a-Fc(R&DSystems,3nM)與所表達(dá)的突變蛋白一起孵育，使用針對(duì)IL-4受體a-Fc的Fc結(jié)構(gòu)域的HRP(辣根過(guò)氧化物酶)綴合的多克隆抗體檢測(cè)IL-4受體a-Fc與未占據(jù)的IL-4結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。這樣的篩選的結(jié)果示于圖3。與作為親和力成熟基礎(chǔ)的突變蛋白S148.3J14(SEQIDNO:2)相比，如實(shí)施例4和5所述選擇的大量突變蛋白被鑒定為對(duì)IL-4受體a具有提高的親和力。使用該方法鑒定了突變蛋白S191.5K12、S191.4B24、S191.4K19、S191.5H16、S197.8D22和S148.3J14AM2C2(SEQIDNO:3-8)。S191.5K12、S191.4B24、S191.4K19、S191.5H16、S197.8D22和S148，3J14AM2C2的序列也示于圖4。實(shí)施例7:產(chǎn)生IL-4受體a結(jié)合突變蛋白為制備性產(chǎn)生IL-4受體a特異性突變蛋白，根據(jù)Schlehuber，S.等(丄Mo/.肌o/.(2000)，297,1105-1120)所述方案，將帶有表達(dá)載體pTLPC10(圖1)上所編碼各個(gè)突變蛋白的大腸桿菌K12菌抹JM83以2L搖瓶培養(yǎng)在LB-氨千青霉素培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在需要大量蛋白質(zhì)時(shí)，基于Schiweck，W.和Skerra，A.尸她/"s(1995)23，561-565)所述方案，在11或101容器中，使用帶有各自表達(dá)載體的大腸桿菌W3110通過(guò)臺(tái)式發(fā)酵罐培養(yǎng)進(jìn)行周質(zhì)生產(chǎn)。根據(jù)Skerra，A.&Schmidt,T.G.M.(2000)(Useofthe版尸畫(huà)tagandstreptavidinfordetectionandpurificationofrecombinantproteins.MC/^AE/izj附o/.326A，271-304)所述方法，使用適當(dāng)柱床體積的柱通過(guò)鏈霉親合素親和層析在單個(gè)步驟中從周質(zhì)級(jí)分中純化突變蛋白。為了獲得更高的純度以及除去任何聚集的重組蛋白，最后在PBS緩沖液存在下在Superdex75HR10/30柱(24-ml柱床體積，AmershamPharmaciaBiotech)上最后進(jìn)行突變蛋白的凝膠過(guò)濾。合并單體蛋白級(jí)分，通過(guò)SDS-PAGE檢查純度，并用于進(jìn)一步生化表征。實(shí)施例8:使用Biacore進(jìn)行親和力測(cè)量基本如WO2006/56464實(shí)施例9所述進(jìn)4亍親和力測(cè)量，改動(dòng)是固定約400RUIL-4受體a-Fc(R&DSystems)(而不是WO2006/56464中用作革巴標(biāo)的2000RU人CTLA-4或小鼠CTLA-4-Fc)，并注射25mM濃度的100pi突變蛋白(而不是WO2006/56464中使用濃度5-0.3]nM的純化脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的40pl樣品)。使用S148.3J14、S191.5K12、S191.4B24、S191.4K19、S191.5H16、S197.8D22和S148.3J14AM2C2進(jìn)行的親和力測(cè)量的結(jié)果示于圖5-11,并總結(jié)于表I<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>表I.通過(guò)Biacore測(cè)定的本發(fā)明選定的突變蛋白對(duì)IL-4受體a的親和力。顯示了五個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值(標(biāo)準(zhǔn)差)。實(shí)施例9:使用抑制ELISA鑒定IL-4的拮抗劑在抑制ELISA中評(píng)估所選突變蛋白對(duì)IL-4與IL-4受體a之間相互作用的抑制。因此，將恒定濃度的IL-4受體a(0.5nM生物素化的IL-4受體a，Peprotech，或15nMIL-4受體a-Fc，R&DSystems)與淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的連續(xù)稀釋液一起孵育，在ELISA中定量具有未占據(jù)的IL-4結(jié)合位點(diǎn)的IL-4受體a的量，在所述ELISA中用IL-4或拮抗性抗IL-4受體a單克隆抗體包被平板。使用HRP綴合的Extravidin(Sigma)檢測(cè)已結(jié)合的生物素化IL-4受體a，并與確定量生物素化IL-4受體a的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行比較。使用突變蛋白S148,3J14、S191,5K12、S191.4B24、S191.4K19、S191.5H16、S197.8D22和S148.3J14AM2C2測(cè)量的結(jié)果示于圖12-18,并總結(jié)于表II。<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>S197.8D22140(37)表II.通過(guò)竟?fàn)嶦LISA測(cè)定的所選本發(fā)明淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白對(duì)IL-4受體a的拮抗能力和親和力。顯示了三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值(標(biāo)準(zhǔn)差)。實(shí)施例10:使用TF-1增殖測(cè)定鑒定IL-4及IL-13信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗劑基本如Lefort等(LefortS.，VitaN.，ReebR.，CaputD"FerraraP.(1995)F^BSLe汰366(2-3)，122-126)所述進(jìn)行以IL-4和IL-13刺激的TF-1細(xì)胞增殖測(cè)定。來(lái)自TF-1增殖測(cè)定的結(jié)果示于圖19，其顯示高親和力變體S191.5K12、S191.4B24、S191.4K19、S191.5H16、S197.8D22和S148.3J14AM2C2是IL-4和IL-13所誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及增殖的強(qiáng)力拮抗劑。實(shí)施例11:抗IL-4受體a人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白抑制STAT6介導(dǎo)的途徑在含有10%熱滅活胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、100單位/ml青霉素、100g/ml氯霉素的RPMI1640中培養(yǎng)TF-1細(xì)胞，并補(bǔ)充2ng/ml重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子。將細(xì)胞以5xl0"個(gè)細(xì)胞/ml接種至100mm直徑組織培養(yǎng)皿中的總體積20ml培養(yǎng)基中，每2至3天將其分開(kāi)并以此濃度再接種，在5%C02的加濕氣氛中在37°C下培養(yǎng)。通過(guò)1200rpm離心5分鐘來(lái)收獲TF-1細(xì)胞，并通過(guò)在含有1%熱滅活胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、100單位/ml青霉素、100g/ml鏈霉素的RPMI1640(RPMI-1%FCS)中1200rpm離心5分4中來(lái)洗、滌兩次。以lx106個(gè)細(xì)胞/ml將細(xì)胞重懸于RPMI-1%FCS中，以lml接種到24孔板中并培養(yǎng)過(guò)夜。第二天，將TF-1細(xì)胞與20g/mlIL-4受體a特異性突變蛋白或陰性對(duì)照突變蛋白一起培養(yǎng)。將細(xì)胞的其他等分試樣在空氣中5。/。C02的加濕氣氛中在37。C下僅用培養(yǎng)基培養(yǎng)1小時(shí)。其后，分別以終濃度0.8ng/ml或12ng/ml加入人重組IL-4或IL-13，在空氣中5%<:02的加濕氣氛中在37。C下將培養(yǎng)物孵育10分鐘。通過(guò)加入42pl37。/。甲醛(1.5%終濃度)在室溫(RT)下將細(xì)胞固定IO分鐘，并轉(zhuǎn)移至5ml圓底聚苯乙烯管(BDFalcon)中。用含有1。/。FCS的2mlPBS(PBS-FCS)洗滌細(xì)胞，1200rpm離心5分鐘進(jìn)行沉淀，棄去上清液。通過(guò)加入500jil冰預(yù)冷的曱醇并劇烈渦旋來(lái)透化細(xì)胞。4。C孵育10分鐘后，通過(guò)以2mlPBS-FCS以1200rpm離心5分鐘洗滌兩次。將細(xì)胞重懸于100piPBS-FCS中，并用20^1抗磷酸化STAT-6藻紅蛋白(PE)-標(biāo)記的抗體(克隆Y641;BDBiosciences)在室溫下避光染色30分鐘。最后，通過(guò)1200rpm離心5分鐘而用2mlPBS-FCS洗滌細(xì)胞兩次并重懸浮在500filPBS-FCS中。使用FACScalibur流式細(xì)胞儀(BDBiosciences),通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞。從至少10000個(gè)門(mén)控細(xì)胞收集數(shù)據(jù)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量IL-4受體a特異性突變蛋白S191.4B24(SEQIDNO:5)和S191.4K19(SEQIDNO:6)抑制TF-1細(xì)胞中IL-4和IL-13介導(dǎo)的STAT-6躊酸化的能力?；诩?xì)胞大小(前向散射，F(xiàn)SC)和細(xì)胞粒度(側(cè)向散射，SSC)使用對(duì)照TF-1細(xì)胞(未刺激的和未染色的)，對(duì)完整細(xì)胞設(shè)置門(mén)控，以基于FL2值(通道2熒光；PE強(qiáng)度)排除99%的對(duì)照未染色群體。用抗磷酸化STAT-6PE標(biāo)記抗體對(duì)未刺激細(xì)胞的其他等分試樣進(jìn)行染色。STAT-6磷酸化測(cè)定的結(jié)果清楚地顯示，IL-4受體a特異性突變蛋白S191.4B24和S191.4K19顯著抑制TF-1細(xì)胞中IL-4和IL-13誘導(dǎo)的STAT-6磷酸化(數(shù)據(jù)總結(jié)于表III)。<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>表III.通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量S191.4B24和S191.4K19(SEQIDNO:5和6)抑制TF細(xì)胞中IL-4和IL-13誘導(dǎo)的STAT-6磷酸化的能力。顯示了STAT-6磷酸化陽(yáng)性染色的門(mén)控細(xì)胞百分比以及所有門(mén)控細(xì)胞的中值熒光強(qiáng)度(MFI)。實(shí)施例12:抗人IL-4受體a突變蛋白與獼猴外周血淋巴細(xì)胞交叉反座由AstraZeneca(Macclesfield,UK)的臨床藥理學(xué)單位(CPU)將健康人志愿者的全血收集到9ml肝素鋰管中。從HarlanSera-Lab(Bicester,UK)或者BandKUniversalLtd(Hull,UK)獲得來(lái)自獼猴的肝素化全血樣品(合并自至少兩只動(dòng)物)。將人和獼猴全血以紅細(xì)胞裂解緩沖液(0.15MNH4C1，1.0mMKHC03，0.1mMEDTA，pH7.2-7.4)以1:5稀釋?zhuān)又谑覝叵碌怪梅跤?0分鐘。將細(xì)胞以1200rpm離心5分鐘，除去上清液。將細(xì)胞重懸于裂解緩沖液中并重復(fù)操作，直至上清液中不再含有血紅蛋白。將細(xì)胞重懸于與血液原始體積相同體積的冷凍介質(zhì)(1:10，二曱亞砜:胎牛血清)中并轉(zhuǎn)移至凍存管。每管含有來(lái)自1ml血的細(xì)胞。將細(xì)胞在-80。C下冷凍過(guò)夜，并轉(zhuǎn)移至液氮中保存。將冷凍的外周血細(xì)胞在37。C下迅速解凍并用FACS緩沖液(FBS/1%FCS)洗滌。將細(xì)胞沉淀重懸于FACS緩沖液中(1ml緩沖液/管)。將100nl等分試樣置于96孔圓底平板中，每孔加入100jUFACS緩沖液，將平才反在4。C下以1200rpm離心5分鐘，棄去上清液。其后，通過(guò)低速渦旋而重懸細(xì)胞，加入100nl稀釋的第一抗體(抗CD124或IgGl同種型對(duì)照，eBioscience，10^g/ml)或抗IL-受體a突變蛋白(IOjig/ml)，并將細(xì)胞在冰上孵育30分鐘。通過(guò)加入100jalFACS緩沖液并在4。C下1200rpm離心5分鐘而將細(xì)胞洗滌一次，棄去上清液，低速渦旋使細(xì)胞重懸。使用200nlFACS緩沖液重復(fù)兩次以洗滌細(xì)胞。最后一次離心后，將細(xì)胞沉淀重懸于5ng/ml的100nl適當(dāng)?shù)牡诙贵w(生物素化的抗人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白-l抗體(R&DSystems)或生物素化的大鼠抗小鼠IgG(InsightBiotechnologyLtd))中并將細(xì)胞在水上孵育30分鐘。通過(guò)在4。C下1200rpm離心5分鐘而在100piFACS緩沖液中洗滌細(xì)胞，棄去上清液并通過(guò)低速渦旋而重懸細(xì)胞。使用200piFACS緩沖液和4°C1200rpm離心5分鐘再洗滌兩次。最后一次離心后，將細(xì)胞沉淀重懸于100nl檢測(cè)試劑(藻紅蛋白[PE]標(biāo)記的鏈霉親合素(eBioscience);1.25ng/ml)中并在水上避光賻育30分鐘。如前述再進(jìn)行三次洗滌后，將細(xì)胞置于200^1FACS緩沖液中，轉(zhuǎn)移至40x6mm試管中并使用FACScalibur流式細(xì)胞儀通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。對(duì)照細(xì)胞未染色。使用未染色的對(duì)照細(xì)胞，并對(duì)細(xì)胞大小(前向散射，F(xiàn)SC)和細(xì)胞粒度(側(cè)向散射，SSC)設(shè)置完整淋巴細(xì)胞門(mén)控(Chrest，F(xiàn)丄等(1993).Identificationandquantificationofapoptoticcellsfollowinganti-CD3activationofmurineGOTcells.Q;似附"o;14:883-90)。該區(qū)域在同一天分析的樣品之間沒(méi)有改變?；趯?duì)照未染色群體的FL2(通道2熒光，PE強(qiáng)度)值做出標(biāo)記以區(qū)分IL-4受體a+和IL-4受體of的群體，基于排除99%的未染色群體而設(shè)置標(biāo)記1(Ml)IL-4R(x+細(xì)胞。對(duì)每個(gè)樣品，獲得來(lái)自至少lxlO"個(gè)細(xì)l包的數(shù)據(jù)。突變蛋白S191.5K12、S.148.3J14畫(huà)AM2C2、S.191.4B24、S.191.4K19和S.197.8D22(SEQIDNO:3-6和8)對(duì)獼猴'淋巴細(xì)胞顯示高水平結(jié)合，IL-4受體a+細(xì)胞為61%至80%不等，MFI值為6.0至9.2不等(表2)。變體S.191.5H16(SEQIDNO:7)也特異性結(jié)合獼猴淋巴細(xì)胞，但與剩余突變蛋白相比親和力降低(41%IL-4受體a+細(xì)胞；MFI值4.1)。平行地，還通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析了這些IL-4受體a特異性突變蛋白與來(lái)自一名人供體的外周血淋巴細(xì)胞結(jié)合的能力。所有的抗IL-4受體a突變蛋白均顯示出與pTLPC10陰性對(duì)照所觀察到的相比對(duì)人細(xì)胞顯著更高水平的結(jié)合。IL-4受體a+細(xì)胞為60%至76。/。不等，MFI值為7.4至9.7不等。用pTLPC10陰性對(duì)照染色的細(xì)胞顯示低水平的非特異性結(jié)合，9%的細(xì)胞記錄為IL-4受體a+,MFI值為3.2。突變蛋白S191.5K12、S.191.4B24和S.191.4K19(SEQIDNO:3、5和6)對(duì)第二名人供體的外周血淋巴細(xì)胞顯示相似的結(jié)合親和力(數(shù)據(jù)未顯示)。<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>表IV.通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析了IL-4受體a特異性突變蛋白結(jié)合人及獼猴外周血淋巴細(xì)胞的能力。顯示了IL-4受體a陽(yáng)性染色的門(mén)控細(xì)胞百分比以及所有門(mén)控細(xì)胞的中值熒光強(qiáng)度(MFI)。實(shí)施例13:噬菌粒呈遞和以對(duì)人VEGF的親和力選擇Tlc突變蛋白基本如實(shí)施例2所述利用得自實(shí)施例1的噬菌粒進(jìn)行噬菌粒展示和選擇，進(jìn)行了以下改動(dòng)靶蛋白(即重組人VEGF-A片段(VEGF8_109，成熟多肽鏈的氨基酸8-109)以200nM濃度使用，并作為生物素化蛋白呈遞于噬菌粒文庫(kù)，其后根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明使用鏈霉親合素珠(Dynal)捕獲噬菌體-靶標(biāo)復(fù)合體。進(jìn)行四輪選擇。肽鏈的氨基酸8至109的核酸引入表達(dá)載體pETllc(Novagen)中而獲得靶蛋白。因此，5fl附HI和7V&I限制性位點(diǎn)分別引入了人VEGF片段cDNA的3，和5，末端，并用于亞克隆VEGF基因片段。用所得表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，在37。C下在含有氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基中以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)3小時(shí)后實(shí)現(xiàn)VEGF8—1Q9的胞質(zhì)產(chǎn)生。5000g離心20分鐘后，將細(xì)胞沉淀重懸于每21培養(yǎng)液200ml的PBS中，5000g再離心IO分鐘，然后-20。C孵育過(guò)夜。將得自500ml培養(yǎng)液的每^f分細(xì)胞沉淀重懸于20ml20mMTris-HCl(pH7.5)，5mMEDTA中并在水上超聲處理，4次，IO秒鐘。4'C下10000g離心10分鐘后，將包含體溶于15ml預(yù)冷的IB緩沖液(2M尿素、20mMTris-HCl(pH7.5)、0.5MNaCl)中，如上述進(jìn)行超聲處理和離心。其后，將細(xì)胞沉淀溶于20mlIB緩沖液并如上述再次離心，之后溶于25ml溶解緩沖液中(7.5M尿素、20mMTris-HCl(pH7.5)、4mMDTT)。將細(xì)胞懸液在室溫下攪拌2小時(shí)，4°C下40000g離心15分鐘，過(guò)濾含有重組VEGF的上清液(0.45nm)。如下進(jìn)行重折疊室溫下對(duì)51緩沖液1(20mMTris-HCl(pH8.4)，400mMNaCl，1mM半胱氨酸)透析過(guò)夜，其后再對(duì)51緩沖液2(20mMTris-HCl(pH8.4),1mM半胱氨酸)透析，并以5l緩沖液3(20mMTris-HCl(pH8.4))透析兩次。離心(40000g，20min，4。C)和濃縮后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)離子交換層析(Q-Sepharose)和大小排阻層析(Superdex75)純化重組的VEGF片段。實(shí)施例14:使用高通量ELISA篩選來(lái)鑒定VEGF結(jié)合突變蛋白基本如實(shí)施例3所述對(duì)實(shí)施例13所得Tic突變蛋白進(jìn)行篩選，進(jìn)行了以下改動(dòng)得自實(shí)施例11的重組靶蛋白VEGFw的以5ng/ml使用，并直接包被至微量滴定板。篩選了共2124個(gè)克隆，鑒定了972個(gè)指示從文庫(kù)中成功分離了突變蛋白的初步命中。使用該方法鑒定出了Tic突變蛋白S168.4-L01(SEQIDNO:26)。實(shí)施例15:使用易錯(cuò)PCR對(duì)Tic突變蛋白S168.4-L01進(jìn)行親和力成基本如實(shí)施例4所述使用寡核苷酸TL50bio(SEQIDNO:15)和TL51bio(SEQIDNO:16)產(chǎn)生基于突變蛋白S168.4-L01的變體文庫(kù)，得到平均每個(gè)結(jié)構(gòu)基因含有5個(gè)替換的文庫(kù)。如實(shí)施例13所述進(jìn)行噬菌粒選擇，使用有限的靶標(biāo)濃度(IOnM、1nM和0.2nMVEGFw。9)或短孵育時(shí)間(l和5分鐘)并使用或不使用有限的靶標(biāo)濃度(10nM、100nM)。進(jìn)行四輪選擇。實(shí)施例16:使用高通量ELISA篩選對(duì)VEGF結(jié)合突變蛋白的親和力篩選如實(shí)施例14所述對(duì)實(shí)施例15中選擇的突變蛋白進(jìn)行篩選，改動(dòng)為將單克隆抗T7標(biāo)簽抗體(Novagen)包被至ELISA平板上以捕獲產(chǎn)生的突變蛋白，并使用HRP綴合的Extravidin檢測(cè)生物素化VEGF8.1()9(500nM和50nM)與所捕獲Tic突變蛋白的結(jié)合。鑒定了與作為親和力成熟基礎(chǔ)的突變蛋白S168.4-L01相比具有提高的親和力的大量克隆。使用該方法鑒定出了克隆S209.2-C23、S209.2-D16、S209.2-N9、S209.6-H7、S209.6-H10、S209.2畫(huà)M17、S209.2-O10(SEQIDN():27-33)。實(shí)施例17:產(chǎn)生VEGF結(jié)合突變蛋白基本如實(shí)施例7所述進(jìn)行產(chǎn)生。實(shí)施例18:使用Biacore進(jìn)行VEGF特異性突變蛋白的親和力測(cè)定基本如實(shí)施例8所述進(jìn)行親和力測(cè)量，改動(dòng)是使用標(biāo)準(zhǔn)胺化學(xué)反應(yīng)將約250RU的重組VEGF與傳感器芯片直接偶聯(lián)。以400nM濃度注入40pi得自實(shí)施例15的Tic突變蛋白。突變蛋白S209.2-C23、S209.2-D16、S209.2-N9、S209.6-H7、S209.6H10、S209.2-M17和S209.2-O10(SEQIDNO:27-33)的親和力測(cè)定結(jié)果總結(jié)于表<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>表V.在25'C下通過(guò)Biacore測(cè)量測(cè)定了選定的本發(fā)明突變蛋白對(duì)VEGF的親和力。實(shí)施例19:使用抑制ELISA鑒定VEGF的拮抗劑在抑制ELISA中評(píng)估對(duì)VEGF與VEGF受體2(VEGF-R2)之間相互作用的抑制。為此，將恒定濃度的生物素化VEGF8_1()9(1nM)與連續(xù)稀釋的各個(gè)Tlc突變蛋白一起孵育，并在ELISA中測(cè)定帶有未占據(jù)的VEGF-R2結(jié)合位點(diǎn)的VEGF的量，所述ELISA中包被了干擾VEGF/VEGF-R2相互作用的抗VEGF抗體(MAB293，R&DSystems)。使用HRP綴合的Extravidin(Sigma)檢測(cè)結(jié)合的VEGF并與確定量VEGF的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行比較。使用突變蛋白S209.2-C23、S209.2-D16、S209.2-N9、S209.6-H7、S209.6-H10、S209.2-M17和S209.2-O10(SEQIDNO:27-33)的測(cè)定結(jié)果總結(jié)于表VI。<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>S209.2-D163.9S209.2-N92.8S209.6-H72.4S209.6-H101.3S209.2掘72.0S209.2-O100.83表VI.通過(guò)竟?fàn)嶦LISA測(cè)定的選定的本發(fā)明淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的拮抗能力以及對(duì)VEGF的親和力。實(shí)施例20:使用HUVEC增殖測(cè)定來(lái)鑒定VEGF拮抗劑基本如前述(KorherrC.，GilleH，SchaferR.,Koenig-HoffmannK.，I)ixelius丄，EglandK.A.，PastanI.&BrinkmannU.(2006)尸度.7V",/.OAS^)103(11)4240-4245)評(píng)估對(duì)VEGF和FGF-2刺激的HUVEC細(xì)胞增殖的抑制，進(jìn)行了以下改動(dòng)根據(jù)生產(chǎn)商的推薦培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞(Promocell)并在第2代至第6代之間使用。笫1天，將1400個(gè)細(xì)胞接種至完全培養(yǎng)基(Promocell)。第二天，洗涂細(xì)胞并加入含0.5%FCS、氫化可的松和慶大霉素/兩性霉素但無(wú)其他補(bǔ)充劑的基本培養(yǎng)基(Promocell)。向一式三份的孔中加入以標(biāo)明的濃度連續(xù)稀釋的VEGF特異性突變蛋白S209.2-C23、S209.2-D16、S209.2畫(huà)N9、S209.6畫(huà)H7、S209.6-H0、S209.2-M17、S209.2-O10(SEQIDNO:27-33)、野生型淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(pTLPC10的基因產(chǎn)物；作為對(duì)照)或VEGF特異性治療性單克隆抗體Avastin⑧(Roche;作為對(duì)照)，30分鐘后加入人VEGF165(R&DSystems)或人FGF-2(Reliatech)。6天后，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，使用CellTiter96AqueousOne(Promega)評(píng)估細(xì)月包生存力。使用突變蛋白S209.2-C23、S209.2-D16、S209.2-N9、S209.6-H7、S209.6-H10、S209.2-M17和S209.2-O10(SEQIDNO:27-33)的測(cè)量結(jié)果示于圖21。所有本發(fā)明突變蛋白均顯示顯著抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞增殖，與Avastin⑧誘導(dǎo)的抑制相當(dāng)或更好，而野生型淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白不抑制VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。FGF-2誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖不受VEGF特異性突變蛋白、TLPC10或Avastii^中任何一種的影響(未顯示)。實(shí)施例21:針對(duì)VEGF-R2的Tlc突變蛋白的噬菌粒呈遞和選擇基本如實(shí)施例2所述用得自實(shí)施例1的噬菌粒進(jìn)行噬菌粒展示和選擇，進(jìn)行了以下修改靶蛋白VEGF-R2-Fc(R&DSystems)以200nM濃度使用，并作為Fc融合蛋白呈遞至文庫(kù)，其后才艮據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明使用G蛋白珠(Dynal)捕獲噬菌體-靶標(biāo)復(fù)合體。進(jìn)行四輪選擇。實(shí)施例22:使用高通量ELISA篩選來(lái)鑒定VEGF-R2結(jié)合突變蛋白基本如實(shí)施例3所述進(jìn)行篩選，改動(dòng)為乾蛋白VEGF-R2-Fc(R&DSystems)以2.5|ag/ml的濃度4吏用。篩選了得自實(shí)施例21所述方法的1416個(gè)克隆，鑒定出指示從本發(fā)明文庫(kù)中成功分離了突變蛋白的593個(gè)原始命中。使用該方法鑒定出了突變蛋白S175.4Hll(SEQIDNO:34)。實(shí)施例23:使用易錯(cuò)PCR對(duì)VEGF-R2特異性突變蛋白S175.4Hll進(jìn)行親和力成熟基本如實(shí)施例4所述使用寡聚脫氧核苷酸TL50bio(SEQIDNO:15)和TL51bio(SEQIDNO:16)產(chǎn)生基于突變蛋白S175.4Hll的變體文庫(kù)，產(chǎn)生了平均每個(gè)結(jié)構(gòu)基因含有2個(gè)替換的文庫(kù)。如實(shí)施例21所述進(jìn)行噬菌粒選擇，使用有限的靶標(biāo)濃度(5nM、lnM和0.2nM的VEGF-R2-Fc)、在竟?fàn)幹亟MVEGF8_,。9(100nM)存在下延長(zhǎng)的洗滌時(shí)間(l小時(shí))或短孵育時(shí)間(2和5分鐘)并使用或不使用有限的靶標(biāo)濃度(10nM、100nM)。進(jìn)行四輪選擇。實(shí)施例24:使用高通量ELISA篩選對(duì)VEGF-R2結(jié)合突變蛋白進(jìn)行親和力篩選如實(shí)施例3所述進(jìn)行篩選，改動(dòng)為將單克隆抗T7標(biāo)記抗體(Novagen)包被至ELISA平板以捕獲產(chǎn)生的Tlc突變蛋白，并4吏用針對(duì)VEGF-R2-Fc中Fc結(jié)構(gòu)域的HRP綴合抗體檢測(cè)VEGF-R2-Fc(R&DSystems,3nM和1nM)與所捕獲突變蛋白的結(jié)合。鑒定了與作為親和力成熟基礎(chǔ)的突變蛋白S175.4Hll相比具有提高的親和力的大量克隆。使用該方法鑒定出了克隆S197.7-N1、S197.2-I18、S197.2-L22、S197.7-B6和S197.2-N24(SEQIDNO:35-39)。實(shí)施例25:產(chǎn)生VEGF-R2結(jié)合突變蛋白如實(shí)施例7所述進(jìn)行產(chǎn)生。實(shí)施例26:使用Biacore對(duì)VEGF-R2特異性突變蛋白進(jìn)行親和力測(cè)基本如實(shí)施例8所述進(jìn)行親和力測(cè)量，改動(dòng)為捕獲了約500RU的VEGF-R2-Fc(R&DSystems)并以1.5濃度注入80pl突變蛋白。使用S175,4-H11、S197.7-N1、S197.2-I18、S197.2-L22、S197.7-B6和S197.2-N24(SEQIDNOs:35-39)的測(cè)定結(jié)果總結(jié)于表VII。<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>表VII.通過(guò)Biacore測(cè)量測(cè)定了選定的本發(fā)明突變蛋白對(duì)VEGF-R2的親和力。實(shí)施例27:使用抑制ELISA鑒定VEGF拮抗劑在抑制ELISA中評(píng)估VEGF-R2特異性突變蛋白對(duì)VEGF與VEGF受體2(VEGF-R2)之間相互作用的抑制。為此，將恒定濃度的VEGF-R2(4nMVEGF-R2-Fc,R&DSystems)與連續(xù)稀釋的各個(gè)突變蛋白一起孵育，并在ELISA中測(cè)定帶有未占據(jù)的VEGF結(jié)合位點(diǎn)的VEGF-R2的量，所述ELISA中包被了VEGF8-109。使用HRP綴合的抗人Fc抗體(Dianova)檢測(cè)結(jié)合的VEGF-R2并與確定量VEGF-R2-Fc的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行比較。使用突變蛋白S175.4曙H11、S197.7-N1、S197.2-I18、S197.2畫(huà)L22、S197.7-B6和S197.2-N24(SEQIDNO:35-39)的測(cè)定結(jié)果總結(jié)于表VIII。<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>表VIII.通過(guò)竟?fàn)嶦LISA測(cè)定了選定的本發(fā)明淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的拮抗能力和對(duì)VEGF-R2的親和力。實(shí)施例28:用聚乙二醇(PEG)對(duì)IL-4受體a特異性突變蛋白進(jìn)行位點(diǎn)特異性修飾通過(guò)點(diǎn)突變?cè)贗L-4受體a特異性突變蛋白S148.3J14(SEQIDNO:2)中引入未配對(duì)的半胱氨酸殘基來(lái)代替131位氨基酸Glu，以便提供用于與活化PEG的偶聯(lián)的反應(yīng)基。其后如實(shí)施例7所述在大腸桿菌中產(chǎn)生帶有該游離Cys殘基的重組突變蛋白。就突變蛋白S148.3J14與PEG的偶聯(lián)而言，將5.1mg聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺(平均分子量20kDa，線(xiàn)性碳鏈，NOF)與3mg蛋白質(zhì)在PBS中混合，并室溫?cái)嚢?小時(shí)。加入p-巰基乙醇至85nN終濃度以終止反應(yīng)。對(duì)10mMTrisHC1(pH7.4)透析后，將反應(yīng)混合物應(yīng)用至HiTrapQ-XL瓊脂糖柱(Amersham)，棄去流出液。應(yīng)用0mM至100mMNaCl梯度洗脫并從未反應(yīng)的蛋白質(zhì)中分離PEG化的突變蛋白。實(shí)施例29:使用Biacore對(duì)PEG化突變蛋白S148.3J14進(jìn)行親和力測(cè)量基本如實(shí)施例8所述進(jìn)行親和力測(cè)量，改動(dòng)為固定約500RU的IL-4受體a-Fc(R&DSystems),并以200nM、67nM和22nM濃度注入80jal純化的PEG化突變蛋白。該測(cè)定的結(jié)果示于圖22并總結(jié)于表IX。與未PEG化突變蛋白(約37nM,見(jiàn)實(shí)施例8)相比，PEG化形式的突變蛋白S148.3J14的親和力(約30nM)幾乎沒(méi)有變化?？寺∮H和力(SEQIDNO:43)CTC實(shí)施例31:使用高通量ELISA篩選對(duì)VEGF結(jié)合突變蛋白進(jìn)行親和力篩選如實(shí)施例14所述進(jìn)行篩選，改動(dòng)為使用1|iig/ml濃度的VEGF，并且此外i)將單克隆抗T7標(biāo)簽抗體(Novagen)包被到ELISA平板上以捕獲產(chǎn)生的突變蛋白，并使用HRP(辣根過(guò)氧化物酶)綴合的extravidin檢測(cè)生物素化VEGF(3nM和1nM)與所捕獲的淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的結(jié)合。此外，在備選篩選設(shè)置中ii)不使用人VEGF8-1()9，而是將小鼠VEGF164(R&DSystems)直接包被到微量滴定板上(1照/ml)。iii)將含有VEGF結(jié)合突變蛋白的提取物在60。C加熱1小時(shí)。iv)將mAB293(R&DSystems,5照/ml)包被到ELISA平板上，并用生物素化VEGF8-w與所表達(dá)的突變蛋白預(yù)孵育。使用HRP(辣根過(guò)氧化物酶)綴合的extravidin檢測(cè)VEGFs.柳與mAB293的結(jié)合。9鑒定到了與作為親和力成熟基礎(chǔ)的突變蛋白S209.6-H10相比具有提高的親和力的大量克隆。使用該方法鑒定出了克隆S236.1-A22、S236.1-J20、S236.1-M11和S236.1-L03(SEQIDNO:44-47)。在這種情況下，應(yīng)該注意，由于本發(fā)明突變蛋白中缺失了淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的前4個(gè)氨基酸，因此氨基酸序列從所保藏的野生型淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白序列的序列位置5(丙氨酸)開(kāi)始顯示，從而Ala5顯示為N端氨基酸。此外，野生型淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的C端氨基酸Aspl58被丙氨酸殘基取代(SEQIDNO:44-47中的殘基154,還參見(jiàn)本發(fā)明其他突變蛋白如SEQIDNO:26-40)。此外，用于構(gòu)建實(shí)施例1天然文庫(kù)的突變蛋白S236.1-A22、S236.1-J20、S236.1-M11和S236.1-L03以及與淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白C端融合的STREP-TAGII的氨基酸序列示于SEQIDNO:52(S236.1-A22-str印)、SEQIDNO:53(S236.1畫(huà)J20-strep)、SEQIDNO:54(S236.1-Mll-str印)和SEQIDNO:55(S236.1-L03-step)。還顯示了本發(fā)明淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白偏離所標(biāo)明的突變位置/突變的變異性，這些突變位置/突變是為各自突變蛋白提供特異性結(jié)合給定靶標(biāo)(如VEGF或VEGF-R2或白介素4受體a鏈(IL-4受體a))的能力所必需的。實(shí)施例32:產(chǎn)生VEGF結(jié)合突變蛋白基本如實(shí)施例7所述進(jìn)行產(chǎn)生。實(shí)施例33:使用Biacore對(duì)VEGF特異性突變蛋白進(jìn)行親和力測(cè)定基本如實(shí)施例18所述進(jìn)行親和力測(cè)量。(含參閱圖23，其中展示了人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白S236.1-A22(SEQIDNO:44)與固定的VEGF(mq9的Biacore測(cè)量)。簡(jiǎn)言之，使用標(biāo)準(zhǔn)胺化學(xué)反應(yīng)將VEGF8.109固定在CM5芯片上。在500nM至16nM的六種濃度下以30^1/分鐘的流速應(yīng)用脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白。用BIAT100軟件評(píng)估傳感器圖，以測(cè)定各個(gè)突變蛋白的K。n、K。ff和KD。<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table>表X.在25。C下通過(guò)Biacore測(cè)定的選定的本發(fā)明突變蛋白對(duì)VEGF的親和力。實(shí)施例34:使用抑制ELISA鑒定VEGF的拮抗劑基本如實(shí)施例19所述在抑制ELISA中評(píng)估對(duì)VEGF與VEGF受體2(VEGF-R2)之間相互作用的抑制，改動(dòng)為將1小時(shí)的孵育時(shí)間縮短至10分鐘。抑制常數(shù)總結(jié)于下表中<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table>表XI.通過(guò)竟?fàn)嶦LISA測(cè)定的選定的本發(fā)明淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的拮抗能力和對(duì)VEGF的親和力。實(shí)施例35:使用Biacore測(cè)定VEGF特異性突變蛋白S236.1-A22的交叉反應(yīng)性基本如實(shí)施例18所述進(jìn)行親和力測(cè)量，改動(dòng)是將突變蛋白S236.1-A22(SEQIDNO:44)固定在傳感器芯片上。以250nM濃度注入70^1樣品。圖24所示的結(jié)果的定性比較顯示，截短形式的hVEGFs-南和hVEGF121顯示基本相同的傳感器圖，表明與淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白S236.1-A22(SEQIDNO:44)相似的親和力。剪接形式hVEGF，6s也顯示與脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白強(qiáng)結(jié)合，而各自小鼠直向同源物mVEGF164具有稍4氐的親和力。同種型VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D及相關(guān)蛋白P1GF在該實(shí)驗(yàn)中不顯示結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例36:使用CD光譜術(shù)測(cè)定VEGF結(jié)合突變蛋白的熱變性基本如國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO2006/056464的實(shí)施例14所述進(jìn)行圓二色性測(cè)量，改動(dòng)是使用的波長(zhǎng)為228nM。例如，淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白S236.1-A22(SEQIDNO:44)的解鏈溫度Tm測(cè)定為75°C。實(shí)施例37:S236.1-A22的穩(wěn)定性測(cè)試基本如國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO2006/056464的實(shí)施例15所述測(cè)試VEGF結(jié)合突變蛋白在37。C下在PBS和人血清中的穩(wěn)定性，只是使用的濃度為1mg/ml。通過(guò)HPLC-SEC判斷，在PBS中孵育的7天中未檢測(cè)到突變蛋白的改變(數(shù)據(jù)未顯示)。將脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白在人血清中孵育導(dǎo)致親和力與參考相比在7天后下降約70%(還參見(jiàn)圖25a)。實(shí)施例38:將抗VEGF突變蛋白與白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合為了延長(zhǎng)血清半衰期，將抗VEGF突變蛋白在C端與白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ABD)融合。用于表達(dá)的遺傳構(gòu)建體稱(chēng)為pTLPC51—S236.1-A22(SEQIDNO:50)(見(jiàn)圖26)?；救鐚?shí)施例7所述進(jìn)行VEGF特異性突變蛋白-ABD融合物或Tlc-ABD(作為對(duì)照)的制備性產(chǎn)生?；救鐚?shí)施例18所述使用表面等離振子共振(Biacore)進(jìn)行親和力測(cè)量。發(fā)現(xiàn)淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白S236.1-A22的ABD融合物(A22-ABD)(SEQIDNO:51)(200pM)對(duì)重組VEGF的親和力基本未改變，測(cè)定為260pM(見(jiàn)圖27)。此外，通過(guò)如實(shí)施例8所述的相同方法測(cè)試ABD結(jié)構(gòu)域的完整性，100改動(dòng)是使用標(biāo)準(zhǔn)胺化學(xué)反應(yīng)將約850RU的人血清白蛋白直接與傳感器芯片偶聯(lián)。以500nM濃度注入60pl突變蛋白-ABD融合物(A22-ABD(SEQIDNO:51)或野生型Tlc-ABD(SEQIDNO:49))。測(cè)得其親和力為約20nM?；救鐚?shí)施例37所述測(cè)試S236.1-A22的ABD融合物(SEQIDNO:51)在人血清中的穩(wěn)定性。在7天的孵育期中未檢測(cè)到活性喪失(見(jiàn)圖25b)。通過(guò)其抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖的能力測(cè)試脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白A22-ABD(S236.1-A22的ABD融合物)在人血清白蛋白存在下的功能性。該測(cè)定基本如實(shí)施例39所述進(jìn)行，只是在標(biāo)明處加入了人血清白蛋白(HSA，5pM)。在5^iMHAS下，由于A22-ABD對(duì)HAS的納摩爾親和力，>99.8%的A22-ABD在任何給定時(shí)間均與HAS結(jié)合(見(jiàn)圖28)。測(cè)得IC50值如下S236.1陶A22-ABDIC50:760pMS236.1-A22-ABD(+HSA)IC50:470pM。實(shí)施例39:抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖在明膠包被的平皿上增殖HUVEC(Promocdl)，并在P2代到P8代之間使用。第一天，在96孔平板中每孔的完全培養(yǎng)基中接種1400個(gè)細(xì)胞。第二天，洗滌細(xì)胞并加入含有0.5%FCS、氫化可的松和慶大霉素/兩性霉素的100^1基本培養(yǎng)基。用20ng/mlVEGF165或10ng/mlFGF-2刺激增殖，將它們與脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白S236.1-A22(SEQIDNO:44)混合，醉育30分鐘并加入孔中。在第6天測(cè)定生存力，結(jié)果表示為％抑制。測(cè)得ICso值如下(還參見(jiàn)圖29)。S236.1-A22IC50:0.51nMAvastinIC50:0,56nMFGF-2介導(dǎo)的刺激不受VEGF拮抗劑影響(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例40:抑制HUVEC中VEGF介導(dǎo)的MAP激酶活化1以1400個(gè)細(xì)胞/孔將HUVEC細(xì)胞接種至96孔板的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(Promocell，Heidelberg)中。第二天，將FCS減少到0.5%并繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)。接著在基本培養(yǎng)基中的0.5%BSA中使細(xì)胞饑餓5小時(shí)。在濃度逐漸提高的淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白A22或Avastin(貝伐單抗，Genentech/Roche)存在下用VEGF165(Reliatech，Braunschweig)刺激HUVEC10分鐘，以獲得劑量反應(yīng)曲線(xiàn)。根據(jù)生產(chǎn)商的手冊(cè)(ActiveMotif,Rixensart，Belgium)使用ELISA定量MAP激酶ERK1和ERK2的砩酸化。ICs。值測(cè)得為突變蛋白A22(SEQIDNO:44)為4,5nM,Avastin(參見(jiàn)圖30)為13nM。實(shí)施例41:使用局部施用淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的血管通透性測(cè)將體重350±50g的Duncan-Hartley豚鼠在肩和背部剃毛。該動(dòng)物通過(guò)耳靜脈接受靜脈內(nèi)注射1ml1%Evan's藍(lán)染料。30分鐘后，將20ngVEGF165(Calbiochem)與10倍摩爾過(guò)量的測(cè)試物質(zhì)或?qū)φ瘴锘旌希⒃?x4的方格上皮內(nèi)注射。30分鐘后，通過(guò)C02窒息處死動(dòng)物。注射VEGF后1小時(shí)，取下含有方格圖案的皮膚并清除結(jié)締組織。使用圖像分析儀(ImageProPlus1.3，MediaCybernetics)對(duì)染料外滲面積進(jìn)行定量(見(jiàn)圖31)。實(shí)施例42:CAM(雞尿嚢絨膜)測(cè)定如標(biāo)示將含有FGF-2(500ng)、VEGF(150ng)和淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(1.35照)或Avastin(10jag)的膠原種植體置于10日雞胚的CAM上(4個(gè)/動(dòng)物，10只動(dòng)物/組)。在24小時(shí)時(shí)以相同劑量對(duì)該種植體再次局部應(yīng)用淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白或Avastin。72小時(shí)后，收集種植體并捕捉圖像。通過(guò)不知情觀察者確定含有至少一個(gè)血管的陽(yáng)性方格的百分比。對(duì)VEGF拮抗劑S209.2-O10(SEQIDNO:33)和Avastin⑧以及野生型淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白對(duì)照將中值血管發(fā)生指數(shù)報(bào)告為陽(yáng)性方格的分?jǐn)?shù)(見(jiàn)圖10232)。實(shí)施例43:測(cè)定A22和A22-ABD在小鼠中的藥代動(dòng)力學(xué)(PK)參數(shù)在NMRI小鼠中測(cè)定靜脈內(nèi)注射淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白S236.1A22(SEQIDNO:44)(4mg/kg)后及靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)單次快速濃注施用突變蛋白S236.1A22與ABD的融合蛋白(SEQIDNO:51)(5.4mg/kg)后的藥代動(dòng)力學(xué)(PK)參數(shù)(半衰期血漿濃度、生物利用率)。從在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)收集的末端血樣制備血漿，并通過(guò)ELISA測(cè)定脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的濃度。使用WinNonlin軟件(PharsightCorp.,MountainView,USA)分析結(jié)果。T,/2A22靜脈內(nèi)注射0.42小時(shí)；T,/zA22-ABD靜脈內(nèi)注射18.32小時(shí)；T,/2A22-ABD腹膜內(nèi)注射20.82小時(shí)。腹膜內(nèi)注射施用融合蛋白A22-ABD后的生物利用率為82.5%(見(jiàn)圖33)。實(shí)施例44:全身施用淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的血管通透性測(cè)定實(shí)驗(yàn)前12小時(shí)，將測(cè)試物質(zhì)或?qū)φ侦o脈內(nèi)注射到每組三只動(dòng)物中。第1組PBS載體；第2組Avastin，10mg/kg;第3組突變蛋白S236.1A22-ABD，6.1mg/kg;第4組TLPC51:6.1mg/kg。在時(shí)間=0時(shí)注射Evan，sBlue。30分鐘后，在3x4方格中一式三份皮內(nèi)注射4種劑量的VEGF(5、10、20或40ng)。注射VEGF后30分鐘，處死動(dòng)物并如上對(duì)染料外滲進(jìn)行定量(見(jiàn)圖34)。實(shí)施例45:肺瘤異種移植物模型將基質(zhì)膠中的lxl(f個(gè)A673橫紋肌肉瘤細(xì)胞(ATTC)接種至經(jīng)照射(2.5Gy，Co6G)的Swiss棵鼠的右側(cè)腹(n-12只/組)。腹膜內(nèi)施用處理，在照射開(kāi)始的同一天開(kāi)始并持續(xù)21天。第1組PBS載體，每天一次；第2組Avastin(貝伐單抗，Genentech/Roche)，5mg/kg，每3天一次；第3組突變蛋白A22-ABD(SEQIDNO:51)，每天一次，3.1mg/kg;第4組TLPC51，每天一次，3.1mg/kg。將脂質(zhì)運(yùn)載蛋白A22-ABD的劑量選擇成實(shí)現(xiàn)恒定存在等摩爾數(shù)的突變蛋白及Avastin的VEGF結(jié)合位點(diǎn)，這是基于A22-ABDPK數(shù)據(jù)和抗體在小鼠中的估計(jì)的血清半衰期。用測(cè)徑器每周兩次測(cè)量腫瘤大小，并根據(jù)式(長(zhǎng)度x寬度2)/2來(lái)估計(jì)腫瘤體積。當(dāng)腫瘤體積超過(guò)2,000mm3時(shí)處死小鼠(見(jiàn)圖35)。實(shí)施例46:篩選脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白-Cys變體為了提供用于偶聯(lián)例如活化的PEG的反應(yīng)基，通過(guò)定點(diǎn)誘變引入未配對(duì)的半胱氨酸殘基。其后如實(shí)施例7所述在大腸桿菌中產(chǎn)生帶有游離Cys殘基的重組突變蛋白，如實(shí)施例14所述測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物并通過(guò)ELISA測(cè)量親和力。下表中給出了VEGF特異性突變蛋白S236.1-A22(SEQIDNO:44)的Cys篩選的示例性結(jié)果。使用以下寡核苷酸引入半胱氨酸來(lái)代替氨基酸Thr40、Glu73、Asp95、Arg90和Glu131::GAGGTCGCACGTGAAGTGCCACTACATCTTTTACTCTGAGG:CCTCAGAGTAAAAGATGTAGTGGCACTTCACGTGCGACCTC:GGGTCGGTGATACCCACGTGCCTCACGACCCTGGAAGGG(SEQCCCTTCCAGGGTCGTGAGGCACGTGGGTATCACCGACCC，(SE(^:CCGTCCTGAGCAAAACTGATTGCCCGGGGATCTACACGG(SEQCCGTGTAGATCCCCGGGCAATCAGTTTTGCTCAGGACGG(SEQ:GCCTTGGAGGACTTTTGTAAAGCCGCAGGAG(SEQIDNO:62),:CTCCTGCGGCTTTACAAAAGTCCTCCAAGGC(SEQIDNO:63),:CGTGGCAAAGATCGGGTGCTCGCACGTGAAGGACC(SEQID:GGTCCTTCACGTGCGAGCACCCGATCTTTGCCACG(SEQIDNO:A22—D95C正向(SEQIDNO:56)，A22—D95C反向(SEQIDNO:57)，A22—T40C正向IDNO:58)，A22—T40C反向IDNO:59)，A22—E73C正向IDNO:60)，A22—E73C反向IDNO:61),A22一E131C正向A22—E13]C反向A22—R90C正向NO:64)，和A22—R90C反向65).104<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>表XII.通過(guò)ELISA測(cè)定的突變蛋白S236.1-A22及其Thr40—Cys(SEQIDNO:66)、Glu73—Cys(SEQIDNO:67)、Asp95—Cys(SEQIDNO:68)、Arg卯—Cys(SEQIDNO:69)和Glu131—Cys(SEQIDNO:70)突變體對(duì)VEGF的親和力。實(shí)施例47:嗜酸性粒細(xì)胞活化趨化因子3分泌測(cè)定在72小時(shí)中對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行嗜酸性粒細(xì)胞活化趨化因子3分泌測(cè)定。肺上皮細(xì)胞(如A549細(xì)胞)在IL-4/IL-13刺激后分泌嗜酸性粒細(xì)胞活化趨化因子3。因此，用濃度逐漸提高的結(jié)合IL-4受體a的突變蛋白S191.4B24(SEQIDNO:4)處理細(xì)胞，并分別用0.7nMIL-4或0.83nMIL-13進(jìn)行刺激。在72小時(shí)后通過(guò)使用市售的夾層ELISA(R&DSysterms)評(píng)估嗜酸性粒細(xì)胞活化趨化因子3的分泌。結(jié)果(圖36)證明，結(jié)合IL-4受體a的突變蛋白S191.4B24分別以32和5.1nM的ICso值抑制A549細(xì)胞中IL-4和IL-13介導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞活化趨化因子3分泌(表XIII)。<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>表XIII.S191.4B24對(duì)A549細(xì)胞中IL-4和IL-13所介導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞活化趨化因子3分泌的ICso值。實(shí)施例48:IL-4/IL-13介導(dǎo)的外周血單核細(xì)胞上CD23的誘導(dǎo)從暗黃覆蓋區(qū)中分離總?cè)薖BMC。用濃度逐漸提高的IL-4受體a結(jié)合突變蛋白S191.4B24處理PBMC，并分別加入終濃度1.0nM和2.5nM的IL-4或IL-13。將PBMC在含有1(T/qFCS的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)。用抗CD14-FITC和抗CD23-PE抗體染色細(xì)胞并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析。對(duì)于每個(gè)點(diǎn)，測(cè)定雙陽(yáng)性細(xì)胞在全部CD14陽(yáng)性單核細(xì)胞中的百分比，并作為突變蛋白濃度的函數(shù)作圖。從獲得的結(jié)果中計(jì)算突變蛋白S191.4B24抑制IL-4和IL-13介導(dǎo)的單核細(xì)胞上CD23表達(dá)的ICso值(表XIV)。<table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table>表XIV.S191.4B24對(duì)IL-4和IL-13介導(dǎo)的PBMC中CD23表達(dá)的IC50值。實(shí)施例49:IL-4受體a結(jié)合突變蛋白S191.4B24的Schild分析進(jìn)行了Schild分析來(lái)證實(shí)假想的突變蛋白竟?fàn)幮越Y(jié)合機(jī)制并測(cè)定對(duì)細(xì)胞的Kd。用固定濃度的IL-4受體a結(jié)合突變蛋白S191.4B24(0、4.1、12.3、37、111.1、333.3或1000nM)處理TF-l細(xì)胞并用IL-4滴定，在4天后評(píng)估細(xì)胞生存力(圖38A)。通過(guò)非線(xiàn)性回歸測(cè)定ECs。值。所得結(jié)果的常規(guī)Schild分析(圖38B)得到Kd為192pM(線(xiàn)性回歸)，更準(zhǔn)確的非線(xiàn)性回歸得到116pM。1.084的Schild斜率表明竟?fàn)幮砸种?，即突變蛋白與IL-4竟?fàn)嶪L-4受體a結(jié)合。實(shí)施例50:突變蛋白S191.4B24與原代B細(xì)胞的皮摩爾結(jié)合從人血液中分離PBMC，并與不同濃度的IL-4受體a結(jié)合人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白S191.4B24或野生型人淚液脂質(zhì)運(yùn)栽蛋白(TLPC26)一起孵育。接著用抗CD20-FITC單克隆抗體和生物素化的抗脂質(zhì)運(yùn)載蛋白抗血清、其后用鏈霉親合素-PE染色細(xì)胞。野生型脂質(zhì)運(yùn)載蛋白和IL-4受體a結(jié)合突變蛋白S191.4B24的結(jié)果分別示于圖39A和B。將所測(cè)定的PE陽(yáng)性B細(xì)胞百分比對(duì)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白濃度進(jìn)行擬合(圖39C)，并從所得曲線(xiàn)中計(jì)算ECs。。IL-4受體a結(jié)合突變蛋白S191.4B24(SEQIDNO:4)結(jié)合原代B細(xì)胞的ECs。計(jì)算為105pM。實(shí)施例51:突變蛋白在皮下及氣管內(nèi)給藥后的生物利用率測(cè)定了靜脈內(nèi)、皮下或氣管內(nèi)給藥后IL-4受體a結(jié)合突變蛋白S191.4B24的生物利用率，這通過(guò)在大鼠中4mg/kg快速推注突變蛋白S191.4B24后監(jiān)測(cè)血漿濃度4小時(shí)來(lái)進(jìn)行。氣管內(nèi)給藥使用市售的氣管內(nèi)給藥裝置(MicroSprayer,Penn-CenturyInc，Philiadelphia，PA，USA)來(lái)進(jìn)行，該裝置從連接在注射器上的細(xì)長(zhǎng)管的尖端產(chǎn)生氣溶膠。氣溶膠大小約為20pm。非房室藥代動(dòng)力學(xué)(PK)分析的結(jié)果證實(shí)了皮下注射后100%的生物利用率，并且與抗體相反，人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的經(jīng)肺遞送看來(lái)是可行的。所得結(jié)果示于表xv。<table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table>表XV.靜脈內(nèi)、皮下和氣管內(nèi)給藥后S191.4B24的半衰期和生物利用率。實(shí)施例52:使用HUVEC增殖測(cè)定PEG化VEGF拮抗劑的體外效力基本如實(shí)施例20所述評(píng)估對(duì)VEGF刺激的HUVEC細(xì)胞增殖的抑制，進(jìn)行以下修改如實(shí)施例28所述將VEGF特異性突變蛋白S236.1-A22(SEQIDNO:44)在95C位置與PEG20、PEG30或PEG40偶聯(lián)。向VEGF165中加入突變蛋白、其PEG化衍生物和野生型脂質(zhì)運(yùn)栽蛋白(pTLPC26的基因產(chǎn)物，作為對(duì)照)的連續(xù)稀釋液，并在室溫下孵育30分鐘。將混合物加入一式三份孔中的HUVEC細(xì)胞中，獲得20ng/mlVEGF的終濃度以及標(biāo)出的0.003nM至2.000nM的濃度。6天后根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明用CellTiter-Glo(Promega)評(píng)估細(xì)胞生存力。使用上述突變蛋白的測(cè)量結(jié)果示于圖41。S236.1-A22(SEQIDNO:44)及其PEG化衍生物顯示隨著附著的PEG部分分子量的下降而顯著抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞增殖，而野生型淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白不抑制VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖(表XVI)。IC50(nM)S236.1-A220.4S236.1-A22-PEG200.53S236.1-A22-PEG302.13S236.1-A22-PEG403.27表XVI.S236.1-A22(SEQIDNO:44)及其用PEG20、PEG30或PEG40PEG化的衍生物對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖抑制的ICs。值。本文所述發(fā)明適于在缺少本文具體公開(kāi)的任何要素、限制的情況下實(shí)施。因此，例如術(shù)語(yǔ)"包含"、"包括"、"舍有"等應(yīng)理解為開(kāi)放性的并且沒(méi)有限制。此外，本文使用的術(shù)語(yǔ)和表述處于描述和表達(dá)目的使用，這些術(shù)應(yīng)該理解，在要求保護(hù)的發(fā)明范圍內(nèi)可以有多種改變。因此，應(yīng)該理解，108盡管本發(fā)明通過(guò)優(yōu)選實(shí)施方案和任選特征進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可進(jìn)行本文所述發(fā)明的修改和改變，并且這樣的修改和改變被認(rèn)為是在本發(fā)明范圍內(nèi)。本文廣義和一般性地描述了本發(fā)明。落入一般公開(kāi)內(nèi)容之內(nèi)的每種更窄的種類(lèi)和亞類(lèi)也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。這包括本發(fā)明的一般描述，而不限制從類(lèi)中除去任何主題，無(wú)論是否所除去的材料是否在本文中具體指出。此外，當(dāng)本發(fā)明的特征或方面以馬庫(kù)什組方式描述時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，本發(fā)明也就該馬庫(kù)什組的任何個(gè)體成員或成員亞組進(jìn)行了描述。本發(fā)明的其他實(shí)施方案根據(jù)以下權(quán)利要求將是顯而易見(jiàn)的。權(quán)利要求1.產(chǎn)生人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的方法，其中所述突變蛋白以可檢測(cè)的親和力與人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的給定非天然配體結(jié)合，該方法包括(a)將人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的核酸分子在天然成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列中氨基酸序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108中任何位置的至少一個(gè)密碼子處進(jìn)行誘變，其中編碼成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列的序列位置61和153處半胱氨酸殘基的至少一個(gè)密碼子已經(jīng)被突變成編碼任何其他氨基酸殘基，從而獲得編碼人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的多種核酸，(b)在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)(a)中獲得的一種或多種突變蛋白核酸分子，從而獲得一種或多種突變蛋白，和(c)通過(guò)選擇和/分離來(lái)富集對(duì)人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的給定非天然配體具有可檢測(cè)親和力的(b)中所得一種或多種突變蛋白。2.產(chǎn)生人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的方法，其中所述突變蛋白以可檢測(cè)的親和力與人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的給定非天然配體結(jié)合，該方法包括(a)將編碼人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的核酸分子在成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)栽蛋白線(xiàn)性多肽序列的氨基酸位置34、80和104中任一位置的至少一個(gè)密碼子處進(jìn)行誘變，從而獲得編碼人淚液脂質(zhì)運(yùn)栽蛋白突變蛋白的多種核酸，(b)在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)(a)中獲得的一種或多種突變蛋白核酸分子，從而獲得一種或多種突變蛋白，和(c)通過(guò)選擇和/分離來(lái)富集對(duì)人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的給定非天然配體具有可檢測(cè)親和力的(b)中所得一種或多種突變蛋白。3.權(quán)利要求1的方法，其中突變了成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列中氨基酸序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108中任一位置的至少2、3、4、5、6、8、10、12、14或16個(gè)密碼子。4.權(quán)利要求3的方法，其中突變了成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列的氨基酸序列位置26、27、28、29、30、31、32、33、34、56、57、58、80、83、104、105、106和108的所有18個(gè)密碼子。5.權(quán)利要求2的方法，其中還突變了成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列的氨基酸序列位置26-33、56-58、83、105-106和108中任何位置的至少2、3、4、5、6、8、10、12、14或15個(gè)密碼子。6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其中將編碼成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列的氨基酸序列位置61和153的至少一個(gè)密碼子突變成在61位編碼丙氨酸、苯丙氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、曱硫氨酸、絲氨酸、脯氨酸或色氨酸和/或在153位編碼絲氨酸或丙氨酸。7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中將編碼成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列中氨基酸序列位置111和114的密碼子突變成在111位編碼精氨酸和在114位編碼色氨酸。8.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的方法，其中將編碼成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列101位半胱氨酸的密碼子突變成編碼任何其他氨基酸。9.權(quán)利要求8的方法，其中將編碼成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列101位半胱氨酸的密碼子突變成編碼絲氨酸。10.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(c)還包括(a)提供選自游離或綴合形式的顯示免疫半抗原特征的化合物、肽、蛋白質(zhì)或另一大分子的化合物作為給定的配體，(b)將多種突變蛋白與所述配體接觸，以允許所述配體與對(duì)所述配體具有結(jié)合親和力的突變蛋白之間形成復(fù)合體，和(c)除去無(wú)或基本無(wú)結(jié)合親和力的突變蛋白。11.權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方法，其中所述配體是蛋白質(zhì)或其片段。12.權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(c)中的選擇在竟?fàn)幮詶l件下進(jìn)行。13.權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法，其中將誘變產(chǎn)生的編碼人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的多種突變蛋白的核酸在3'末端與編碼M13家族絲狀嗟菌體衣殼蛋白pIII或編碼該衣殼蛋白的片段的基因有效融合，以選擇至少一種突變蛋白與給定配體結(jié)合。14.可通過(guò)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)的方法獲得的對(duì)人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白給定的非天然配體具有可檢測(cè)結(jié)合親和力的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白。15.權(quán)利要求14的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白，其中野生型淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白中序列位置61和153處的半胱氨酸殘基被其他氨基酸替換，并且其中在成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列的序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108中任一位置處存在至少一個(gè)突變的氨基酸殘基。16.權(quán)利要求14或15的突變蛋白，其中所述突變蛋白包含成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列的序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108處的至少2、3、4、5、6、8、10、12、14或16個(gè)突變的氨基酸殘基。17.權(quán)利要求14或15的突變蛋白，其中所述突變蛋白在序列位置26、27、28、29、30、31、32、33、34、56、57、58、80、83、104、105、106和108的所有18個(gè)位置包含突變的氨基酸殘基。18.權(quán)利要求14-17中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白包含以下至少一個(gè)氨基酸替換Cys61—Ala，Phe，Lys，Arg，Thr,Asn，Tyr,Met,Ser，Pro或Trp，以及Cys153—Ser或Ala。19.權(quán)利要求14-18中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白包含以下至少一個(gè)額外的氨基酸替換Arg111—Pro和Lys114—Trp。20.權(quán)利要求14-19中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白還包含成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白序列的101位半胱氨酸殘基的氨基酸替換。21.權(quán)利要求20的突變蛋白，其中所述突變蛋白包含突變Cys101—Ser。22.權(quán)利要求14-21中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白在其N(xiāo)端或c端與酶、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、肽、信號(hào)序列和/或親和標(biāo)記有效融合。23.權(quán)利要求14-22中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白與延長(zhǎng)該突變蛋白的血清半衰期的部分融合。24.權(quán)利要求23的突變蛋白，其中所述延長(zhǎng)血清半衰期的部分選自免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白的CH4結(jié)構(gòu)域、白蛋白或白蛋白片段、白蛋白結(jié)合肽、白蛋白結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白。25.權(quán)利要求24的突變蛋白，其中所述白蛋白結(jié)合蛋白是細(xì)菌的白蛋白結(jié)合蛋白、針對(duì)白蛋白的抗體或抗體片段或者對(duì)白蛋白具有結(jié)合活性的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白。26.權(quán)利要求25的突變蛋白，其中所述細(xì)菌白蛋白結(jié)構(gòu)域?yàn)殒溓蚓鶪蛋白的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。27.權(quán)利要求24的突變蛋白，其中所述白蛋白結(jié)合肽具有式Cys-Xaa廣Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys，其中Xaa，是Asp、Asn、Ser、Thr或Trp;Xaa2是Asn、Gln、His、Ile、Leu或Lys;Xaa3是Ala、Asp、Phe、Trp或Tyr;Xaa4是Asp、Gly、Leu、Phe、Ser或Thr。28.權(quán)利要求14至21中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白與選自以下的標(biāo)記綴合有機(jī)分子、酶標(biāo)記、放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、生色標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、半抗原、洋地黃毒苷、生物素、金屬絡(luò)合物、金屬、膠體金以及延長(zhǎng)該突變蛋白的血清半衰期的部分。29.權(quán)利要求28的突變蛋白，其中所述延長(zhǎng)血清半衰期的部分選自聚(亞烷基)二醇分子、羥乙基淀粉、棕櫚酸或其他脂肪酸分子、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白的CH4結(jié)構(gòu)域、白蛋白或白蛋白片段、白蛋白結(jié)合肽、白蛋白結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白。30.權(quán)利要求29的突變蛋白，其中所述白蛋白結(jié)合蛋白是細(xì)菌的白蛋白結(jié)合蛋白或?qū)Π椎鞍拙哂薪Y(jié)合活性的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白。31.權(quán)利要求30的突變蛋白，其中所述細(xì)菌白蛋白結(jié)構(gòu)域是鏈球菌G蛋白的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。32.權(quán)利要求29的突變蛋白，其中所述聚(亞烷基)二醇是聚乙二醇(PEG)或其活化衍生物。33.權(quán)利要求29的突變蛋白，其中所述白蛋白結(jié)合肽具有式Cys-Xaa廣Xaa2-Xaa;j-Xaa4-Cys，其中Xaa，是Asp、Asn、Ser、Thr或Trp;Xaa2是Asn、Gln、His、Ile、Leu或Lys;Xaa3是Ala、Asp、Phe、Trp或Tyr;Xaa4是Asp、Gly、Leu、Phe、Ser或Thr。34.權(quán)利要求14至33中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述非天然配體為蛋白質(zhì)或其片段。35.權(quán)利要求34的突變蛋白，其中所述蛋白質(zhì)或其片段選自血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGF-R2)和白介素4受體a鏈(IL-4受體a)。36.權(quán)利要求35的突變蛋白，其中所述蛋白質(zhì)是IL-4受體a。37.權(quán)利要求36的突變蛋白，其中所述蛋白質(zhì)是人IL-4受體a。38.權(quán)利要求36或37的突變蛋白，其中所述蛋白質(zhì)是IL-4受體a的胞外區(qū)或結(jié)構(gòu)域。39.權(quán)利要求36至38中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白作為IL-4拮抗劑。40.權(quán)利要求39的突變蛋白，其中所述突變蛋白作為人IL-4的拮抗劑。41.權(quán)利要求36至40中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白作為IL-13的拮抗劑。42.權(quán)利要求41的突變蛋白，其中所述突變蛋白作為人IL-13的拮抗劑。43.權(quán)利要求36至42中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白與獼猴IL-4受體a具有交叉反應(yīng)性。44.權(quán)利要求36至43中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白包含相對(duì)于成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白氨基酸序列而言在26-34、56-58、80、83、104-106和108的任何位置處將天然氨基酸替換為半胱氨酸殘基的至少兩個(gè)氨基酸替換。45.權(quán)利要求36至44中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白以200nM或更小的Kd與IL-4受體a的胞外區(qū)或結(jié)構(gòu)域結(jié)合。46.權(quán)利要求45的突變蛋白，其中所述突變蛋白以100nM或更小的KD與IL-4受體a的胞外區(qū)或結(jié)構(gòu)域結(jié)合。47.權(quán)利要求46的突變蛋白，其中所述突變蛋白以20nM或更小的Kd與IL-4受體a的胞外區(qū)或結(jié)構(gòu)域結(jié)合。48.權(quán)利要求47的突變蛋白，其中所述突變蛋白以1nM或更小的Kd與IL-4受體a的胞外區(qū)或結(jié)構(gòu)域結(jié)合。49.權(quán)利要求36至48中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白包含相對(duì)于成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白氨基酸序列而言的至少6、8、10、12、14或16個(gè)氨基酸替換，所述替換選自Arg26—Ser，Pro;Glu27—Arg;Phe28—Cys;Glu30—Arg;Met31—Ala;Asn32—Tyr，His;Leu33—Tyr;Glu34—Gly，Ser，Ala,Asp,Lys，Asn，Thr，Arg;Leu56~^Gin;Ile57—Arg;Ser584Ile,Ala,Arg，Val,Thr，Asn，Lys，Tyr，Leu，Met;Asp80—Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;以及Lysl08—Gln。50.權(quán)利要求49的突變蛋白，其還包含選自以下的至少一個(gè)氨基酸替換Met39—Val;Thr42—Met,Ala;Thr43—lie,Pro,Ala;Glu45—Lys,Gly;Asn48—Asp,His,Ser，Thr;Val53—Leu，Phe，lie,Ala,Gly，SenThr54—Ala,Leu;Met55—Leu，Ala,lie,Val，Phe,Gly，Thr，Tyr;Glu63—Lys,Gln，Ala,Gly，Arg;Val64—Gly，Tyr，Met,Ser，Ala,Lys，Arg，Leu，Asn，His,Thr，Ile;Ala66—lie,Leu，Val，Thr，Met;Glu69—Lys，Gly;Lys70—Arg，Gln，Glu;Thr78—Ala;Ile89~>Val;Asp95—Asn，Ala，Gly;以及Tyr100—His。51.權(quán)利要求49或50的突變蛋白，其中所述突變蛋白包含氨基酸替換Arg26—Ser;Glu27—Arg;Phe28—Cys;Glu30—Arg;Met31—Ala;Leu33—Tyr;Leu56—Gln;Ile57—Arg;Asp80—Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;以及Lys108—Gln。52.權(quán)利要求49至51中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白包含以下氨基酸替換組之一(1)Arg26—Ser;Glu27—Arg;Phe28—Cys;Glu30—Arg;Met31—Ala;Asn32—Tyr;Leu33—Tyr;Glu34—Gly;Leu56—Gin;He57—Arg;Ser58—He;Asp80—Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;Lys108—Gin;(2)Arg26—Ser;Glu27—Arg;Phe28—Cys;Glu30—Arg;Met31—Ala;Asn32—Tyr;Leu33—Tyr;Glu34—Lys;Leu56—Gin;He57—Arg;Ser58~>Asn;Asp80—Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;Lys108—Gin;(3)Arg26—Ser;Glu27—Arg;Phe28~>Cys，Glu30—Arg;Met31—Ala;Asn32—Tyr;Leu33—Tyr;Leu56—Gin;lie57—Arg;Ser58—Arg;Asp80—SenLys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;Lys108—Gin;(4)Arg26—Ser;Glu27—Arg;Phe28—Cys;Glu30—Arg;Met31—Ala;Asn32—Tyr;Leu33—Tyr;Glu34—Ser;Leu56—Gin;lie57~>Arg;Asp80—Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;Lys108—Gin;(5)Arg26—Ser;Glu27—Arg;Phe28—Cys;Glu30—Arg;Met31~>Ala;Asn32—His;Leu33—Tyr;Glu34—Ser;Leu56—Gin;lie57—Arg;Ser58—Ala;Asp80—Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;Lys108—Gin;(6)Arg26—Ser;Glu27—Arg;Phe28—Cys;Glu30—Arg;Met—Ala;Asn32—Tyr;Leu33—Tyr;Glu34—Asp;Leu56—Gin;lie57—Arg;Ser58—Lys;Asp80—Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;Lys108—Gin;和(7)Arg26—Ser;Glu27—Arg;Phe28—Cys;Glu30—Arg;Met31—Ala;Asn32—Tyr;Leu33—Tyr;Glu34—Gly;Leu56—Gin;lie57—Arg;Asp80—Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;Lys108—Gln。53.權(quán)利要求36至52中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白具有如SEQIDNO:2-8中任一項(xiàng)所示氨基^列或其片段或變體。54.權(quán)利要求53的突變蛋白，其中所述突變蛋白具有SEQIDNO:5的氨基^列或其片段或變體。55.權(quán)利要求53的突變蛋白，其中所述突變蛋白具有SEQIDNO:6的氨基^列或其片段或變體。56.權(quán)利要求35的突變蛋白，其中所述配體是VEGF-R2。57.權(quán)利要求56的突變蛋白，其中所述配體是VEGF-R2的胞外區(qū)或結(jié)構(gòu)域。58.權(quán)利要求56或57的突變蛋白，其中所述突變蛋白作為VEGF拮抗劑。59.權(quán)利要求56至58中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白以200nM或更小的Kd與VEGF-R2結(jié)合。60.權(quán)利要求59的突變蛋白，其中所述突變蛋白以100nM或更小的Kd與VEGF-R2結(jié)合。61.權(quán)利要求60的突變蛋白，其中所述突變蛋白以20nM或更小的K。與VEGF-R2結(jié)合。62.權(quán)利要求61的突變蛋白，其中所述突變蛋白以1nM或更小的K。與VEGF-R2結(jié)合。63.權(quán)利要求56至62中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白相對(duì)于成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白氨基酸序列而言包含至少6、8、10、12、14或16個(gè)氨基酸替換，所述替換選自Arg26—Ser;Ghi27—lie;GIu30—Ser;Met31—Gly;Asn32—Arg;Leu33—lie;Glu34—Tyr;Leu56—Lys，Glu，Ala,Met;lie57—Phe;Ser58~>Arg;Asp80—Ser，Pro;Lys83—GIu，Gly;Glu104—Leu;Leu105—Ala;His106—Val;以及Lys108—Thr。64.權(quán)利要求63的突變蛋白，其還包含選自以下的至少一個(gè)氨基酸替換Leu41—Phe;Glu63—Lys，Val64—Met;Asp72—Gly;Lys76—Arg,Glu;lie88—Val，Thr;He89—Thr;Arg90—Lys;Asp95—Gly;Phe99—Leu;以及Gly107—Arg，Lys，Glu。65.權(quán)利要求63或64的突變蛋白，其中所述突變蛋白包含氨基酸替換Arg26—Ser;Glu27—lie;Glu30—Ser;Met31—Gly;Asn32—Arg;Leu33—lie;Glu34—Tyr;lie57—Phe;Ser58—Arg;Lys83—Glu;Glu104—Leu;Leu105—Ala;His106—Val;以及Lys108—Thr。66.權(quán)利要求63至65中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白包含以下氨基酸替換組之一(1)Arg26—Ser;Glu27—lie;Glu30—Ser;Met31—Gly;Asn32—Arg;Leu33—lie',Glu34—TynLeu56—LysHe57—Phe;Ser58—Arg;Asp80—Ser;Lys83—Glu;Glu104—Leu;Leu105—Ala;His106—Val;Lys108—Thr;(2)Arg26—Ser;Glu27—lie;Glu30—Ser;Met31—Gly;Asn32—Arg;Leu33—lie;Glu34—Tyr;Leu56—Glu;Ik57—Phe;Ser58—Arg;Asp80—Ser;Lys83—Glu;Glu104—Leu;Leu105—Ala;His106—Val;Lys108—Thr;(3)Arg26—Ser;GIu27—lie;Glu30—Ser;Met31~>Gly;Asn32—Arg;Leu33—lie;Glu34—Tyr;Leu56—Ala;lie57—Phe;Ser58—Arg;Asp80—Ser;Lys83—Glu;Glu104—Leu;Leu105—Ala;His106—Val;Lys108—Thr;和(4)Arg26—Ser;GIu27—lie;GIu30—Ser;Met31—Gly;Asn32—Arg;Leu33—lie;Glu34—Tyr;Leu56—Glu;lie57~^Phe;Ser58—Arg;Asp80—Pro;Lys83—Glu;Glu104—Leu;Leu105—Ala;His106—Val;Lys108—Thr。67.權(quán)利要求56至66中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所迷突變蛋白具有SEQIDNo:34-39所示的氨基^f列。68.權(quán)利要求35的突變蛋白，其中所述配體是VEGF或其片段。69.權(quán)利要求68的突變蛋白，其中所述突變蛋白通過(guò)抑制VEGF與其受體的結(jié)合而作為VEGF拮抗劑，其中VEGF的受體選自VEGF-Rl、VEGF-R2和Neuropilin畫(huà)I。70.權(quán)利要求69的突變蛋白，其中VEGF的受體是VEGF-R2。71.權(quán)利要求68到70任一項(xiàng)的突變蛋白，其中突變蛋白以200nM或更小的Kd與VEGF結(jié)合。72.權(quán)利要求71的突變蛋白，其中突變蛋白以100nM或更小的KD與VEGF結(jié)合。73.權(quán)利要求72的突變蛋白，其中突變蛋白以20nM或更小的Kd與VEGF結(jié)合。74.權(quán)利要求73的突變蛋白，其中突變蛋白以1nM或更小的Ko與VEGF結(jié)合。75.權(quán)利要求68至74中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白相對(duì)于成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)栽蛋白的氨基酸序列而言包含至少6、8、10、12、14或16個(gè)氨基酸替換，所述替換選自Arg26—Ser，Pro,Val，Leu，lie;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His,Arg，Tyr，Gin;lie57—Val，Thr，Leu;Ser58—Lys;Asp80—lie;Lys83—lie;Glu104—Cys;His106—Asn,Ser;以及Lys108—Ala,Val。76.權(quán)利要求75的突變蛋白，其還包含選自以下的至少一個(gè)氨基酸替換Val36—Ala;Thr37—Ala,Ile;Met39—Thr;Thr40—Ala,Ser;Asn48—Asp,Ala51—Val;Lys52—Arg;Thr54—Val;Met55—Val;Ser61—Pro;Lys65—Arg;Ala66—Val;Val67—Ile;Glu69—Gly,Ser，Thr;Lys76—Arg，Ile，Ala,Met,Pro;Tyr87—Arg，His,Lys，Gin;Ile89—Thr，Val，Gly，His,Met,Lys;Arg卯—Gly;Ile98—Val;以及Gly107—Glu。77.權(quán)利要求75或76的突變蛋白，其中所述突變蛋白包含氨基酸替換Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Asp80—Ile;Lys83—Ile;Glu104—Cys;以及Lys108—Val。78.權(quán)利要求75至77中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白包含以下氨基酸替換組之一(1)Arg26—Ser;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys5Asn32—Leu5Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His;Ser58—Lys;Asp80—Ile;Lys83—Ile;Glu104—Cys;His106—Asn;Lys108—Val;(2)Arg26—Pro;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu5Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His;Ser58—Glu;Asp80—Ile;Lys83—Ile;Glu104—Cys;His106—Ser;Lys108—Val;(3)Arg26—Pro;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—CysAsn32—LeuLeu33—Ala5Glu34—Gly;Leu56—His;Ser58—Lys;Asp80—Ile;Lys83—Ile;Glu104—Cys;His106—Asn;Lys108—Val;(4)Arg26—Pro;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31~>Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—Arg;Ser58—Lys;Asp80—Ile;Lys83—lie;Glu104—Cys;His106—Ser;Lys108—Val;(5)Arg26—Pro;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His;Ser58—Lys;Asp80—lie;Lys83—Ile;Glu104—Cys;His106—Ser;Lys108—Val;(6)Arg26—Ser;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His;Ser58~>Lys;Asp80—lie;Lys83—lie;Glu104—Cys;His106—Ser;Lys108—Val;(7)Arg26—Val;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30~>Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His;Ser58—Lys;Asp80—lie;Lys83—lie;Glu104—Cys;His106—Ser;Lys108—Val;(8)Arg26—Leu;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His;Ser58—Lys;Asp80—lie;Lys83—lie;Glu104—Cys;His106—Ser;Lys108—Val;和(9)Arg26—lie;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His;Ser58—Lys;Asp80—lie;Lys83—lie;Glu104—Cys;His106—Ser;Lys108—Val。79.權(quán)利要求68至78中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白具有SEQIDNo:26-33或44-47所示的氨基酸序列。80.核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求14至79中任一項(xiàng)的突變蛋白的核苷酸序列。81.權(quán)利要求80的核酸分子，其包含在載體中。82.權(quán)利要求81的核酸分子，其包含在噬菌粒載體中。83.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求80至82中任一項(xiàng)的核酸分子。84.藥物組合物，其包含權(quán)利要求14至35中任一項(xiàng)所定義的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白以及可藥用賦形劑。85.藥物組合物，其包含權(quán)利要求36至55中任一項(xiàng)所定義的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白以及可藥用賦形劑。86.藥物組合物，其包含權(quán)利要求56至79中任一項(xiàng)所定義的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白以及可藥用賦形劑。87.產(chǎn)生權(quán)利要求14至79中任一項(xiàng)所定義的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的方法，其中所述突變蛋白通過(guò)遺傳工程方法在細(xì)菌或真核宿主生物中從編碼該突變蛋白的核酸開(kāi)始產(chǎn)生，并從該宿主生物或其培養(yǎng)物中分離。88.治療疾病或病癥的方法，包括施用含有權(quán)利要求14至79中任一項(xiàng)所定義突變蛋白的藥物組合物。89.治療疾病或病癥的方法，包括對(duì)有此需要的受試者施用權(quán)利要求36至55中任一項(xiàng)所定義的突變蛋白或者權(quán)利要求85的藥物組合物。90.權(quán)利要求89的方法，其中所述疾病或病癥與Th2免疫應(yīng)答的提高相關(guān)，或者所述疾病是癌癥。91.權(quán)利要求89或卯的方法，其中所述疾病或病癥是變態(tài)反應(yīng)或變應(yīng)性炎癥。92.權(quán)利要求91的方法，其中所述變應(yīng)性炎癥與變應(yīng)性哮喘、鼻炎、結(jié)膜炎或皮炎相關(guān)。93.治療疾病或病癥的方法，包括對(duì)有此需要的受試者施用權(quán)利要求56至79中任一項(xiàng)所定義的突變蛋白或者權(quán)利要求86的藥物組合物。94.權(quán)利要求93的方法，其中所述疾病或病癥選自血管化作用的提高導(dǎo)致或促進(jìn)的疾病或病癥。95.權(quán)利要求94的方法，其中所述疾病或病癥選自癌癥、新血管濕性年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、黃斑水腫、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變或視網(wǎng)膜靜脈閉塞。96.權(quán)利要求95的方法，其中所述癌癥選自胃腸道、直腸、結(jié)腸、前列腺、卵巢、胰腺、乳腺、膀胱、腎、子宮內(nèi)膜和肺的癌癥、白血病和黑素瘤。97.權(quán)利要求14至79中任一項(xiàng)的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白用于檢測(cè)人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的給定非天然配體的用途，包括以下步驟(a)將該突變蛋白在適當(dāng)?shù)臈l件下與懷疑含有所述給定配體的樣品接觸，從而允許該突變蛋白與該給定配體之間形成復(fù)合體，和(b)通過(guò)適當(dāng)?shù)男盘?hào)檢測(cè)復(fù)合的突變蛋白。98.權(quán)利要求14至79中任一項(xiàng)的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白用于分離人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的給定非天然配體的用途，包括以下步驟(a)將該突變蛋白在適當(dāng)?shù)臈l件下與懷疑含有所述配體的樣品接觸，從而允許該突變蛋白與該給定配體之間形成復(fù)合體，和(b)從樣品中分離突變蛋白/配體復(fù)合體。99.權(quán)利要求97或98的用途，其中所述突變蛋白/配體復(fù)合體結(jié)合在固相支持體上。100.權(quán)利要求14至79中任一項(xiàng)的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白用于將化合物靶向生物或組織中預(yù)選部位的用途，包括以下步驟(a)將該突變蛋白與所述化合物綴合，和(b)將突變蛋白/化合物復(fù)合體遞送至預(yù)選的部位。101.權(quán)利要求14至79中任一項(xiàng)的人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白用于與人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的給定非天然配體形成復(fù)合體的用途。102.人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白，其中所述突變蛋白在成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列中序列位置24-36，53-66，79-84和103-110中任何兩個(gè)或更多個(gè)位置處包含至少一個(gè)突變氨基酸殘基，并且其中所述突變蛋白與IL4受體a結(jié)合。103.權(quán)利要求102的突變蛋白，其中所述突變蛋白與人IL-4受體a結(jié)合。104.權(quán)利要求102或103的突變蛋白，其中所述突變蛋白與IL-4受體a的胞外區(qū)或結(jié)構(gòu)域結(jié)合。105.權(quán)利要求102至104中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白作為IL-4的拮抗劑。106.權(quán)利要求105的突變蛋白，其中所述突變蛋白作為人IL-4的拮抗劑。107.權(quán)利要求102至106中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白作為IL-13的拮抗劑。108.權(quán)利要求107的突變蛋白，其中所述突變蛋白作為人IL-13的拮抗劑。109.權(quán)利要求102至108中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白與獼猴IL-4受體a具有交叉反應(yīng)性。110.權(quán)利要求102至109中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所迷突變蛋白相對(duì)于成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)栽蛋白氨基酸序列而言包含在26-34、56-58、80、83、104-106和108中任何位置處將天然氨基酸替換為半胱氨酸殘基的至少兩個(gè)氨基酸替換。111.權(quán)利要求102至110中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白以200nM或更小的K。與IL-4受體a的胞外區(qū)或結(jié)構(gòu)域結(jié)合。112.權(quán)利要求111的突變蛋白，其中所述突變蛋白以100nM或更小的Kd與IL-4受體a的胞外區(qū)或結(jié)構(gòu)域結(jié)合。113.權(quán)利要求112的突變蛋白，其中所述突變蛋白以20nM或更小的K，)與IL-4受體a的胞外區(qū)或結(jié)構(gòu)域結(jié)合。114.權(quán)利要求113的突變蛋白，其中所述突變蛋白以1nM或更小的Kd與IL-4受體a的胞外區(qū)或結(jié)構(gòu)域結(jié)合。115.權(quán)利要求102至104中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白相對(duì)于成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)栽蛋白氨基酸序列而言包含至少6、8、10、12、14或16個(gè)氨基酸替換，所述替換選自Arg26—Ser，Pro;Glu27—Arg;Phe28—Cys;Glu30—Arg;Met31—Ala;Asn32—Tyr;Asn32—His;Leu33—Tyr;Glu34—Gly,Ser，Ala,Asp,Lys，Asn，Thr，Arg;Leu56—Gin;lie57—Arg;Ser58~>lie,Ala,Arg，Val，Thr，Asn，Lys，Tyr，Leu，Met;Asp80—Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His116.權(quán)利要求115的突變蛋白，其還包含選自以下的至少一個(gè)氨基酸替換Met39—Val，Thr42—Met,Ala;Thr43—lie,Pro,Ala;Glu45—Lys，Gly;Asn48—Asp，His,Ser，Thr;Val53—Leu，Phe，Ile，Ala，Gly，Ser;Thr54—Ala,Leu;Met55—Leu，Ala,Ile，Val，Phe,Gly,Thr，Tyr;Glu63—Lys，Gln，Ala，Gly，Arg;Val64—Gly，Tyr，Met,Ser，Ala,Lys，Arg,Leu，Asn，His，Thr，IlqAla66—lie,Leu，Val,Thr，Me"Glu69—Lys，Gly;Lys70—Arg，Gin,Glu;Thr78—Ala;Ile89—Val;Asp95—Asn，Ala，Gly;以及Tyr100—His。117.權(quán)利要求115或116的突變蛋白，其中所述突變蛋白包含氨基酸替換Arg26—Ser;Glu27—Arg;Phe28—Cys;Glu30—Arg;Met31—Ala;Leu33—Tyr;Leu56—Gin;Ile57—Arg;Asp80—Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;以及Lys108—Gln。118.權(quán)利要求115至117中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所迷突變蛋白包含以下氨基酸替換組之一(1)Arg26—Ser;Glu27—Arg;Phe28—Cys;Glu30—Arg;Met31—Ala;Asn32—Tyr;Leu33—Tyr;Glu34—Gly;Leu56—Gin;Ile57—Arg;Ser58—Ile;Asp80—Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;Lys108—Gin;(2)Arg26—Ser;Glu27—Arg;Phe28—Cys;Glu30—Arg;Met31—Ala;Asn32—Tyr;Leu33—Tyr;Glu34—Lys;Leu56—Gin;Ile57—Arg;Ser58—Asn;Asp80—Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;Lys108—Gin;(3)Arg26—Ser;Glu27—Arg;Phe28—Cys，Glu30—Arg;Met31—Ala;Asn32—Tyr;Leu33—Tyr;Leu56—Gin;Ile(57—Arg;Ser58—Arg;Asp80—Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;Lys108—Gin;(4)Arg26—Ser;Glu27—Arg;Phe28—Cys;Glu30—Arg;Met31—Ala;Asn32—Tyr;Leu33—Tyr;Glu34—Ser;Leu56—Gin;lie57—Arg;Asp80—Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;Lys108—Gin;(5)Arg26—Ser;Glu27—Arg;Phe28—Cys;Glu30—Arg;Met31—Ala;Asn32—His;Leu33—Tyr;Glu34—Ser;Leu56—Gin;lie57—Arg;Ser58—Ala;Asp80—Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;Lys108—Gin;(6)Arg26—Ser;Glu27—Arg;Phe28—Cys;Glu30—Arg;Met31—Ala;Asn32—Tyr;Leu33—Tyr;Glu34—Asp;Leu56—Gin;lie57—Arg;Ser58—Lys;Asp80~>Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;Lys108—Gin;和(7)Arg26—Ser;Glu27—Arg;Phe28—Cys;Glu30—Arg;Met31—Ala;Asn32—Tyr;Leu33—Tyr;Glu34—Gly;Leu56—Gin;He57—Arg;Asp80—Ser;Lys83—Arg;Glu104—Leu;Leu105—Cys;His106—Pro;Lys108—Gln。119.權(quán)利要求102至118中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白具有SEQIDNo:2-8中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列或其片段或變體。120.權(quán)利要求119的突變蛋白，其中所述突變蛋白具有SEQIDNO:5的氨基酸序列或其片段或變體。121.權(quán)利要求119的突變蛋白，其中所述突變蛋白具有SEQIDNO:6的氨基^列或其片段或變體。122.人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白，其中所述突變蛋白包含成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列的序列位置24-36、53-66、79-84和103-110中任何兩個(gè)或更多個(gè)位置處的至少一個(gè)突變氨基酸殘基，并且所述突變蛋白與VEGF受體2(VEGF-R2)結(jié)合。123.權(quán)利要求122的突變蛋白，其中所述配體是VEGF-R2的胞外區(qū)或結(jié)構(gòu)域。124.權(quán)利要求122或123的突變蛋白，其中所述突變蛋白作為VEGF拮抗劑。125.權(quán)利要求122至124中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白相對(duì)于成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白氨基酸序列而言包含在26-34、56-58、80、83、104-106和108中任何位置處將天然氨基酸替換為半胱氨酸殘基的至少兩個(gè)氨基酸替換。126.權(quán)利要求122至125中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白以200nM或更小的Kd與VEGF-R2結(jié)合。127.權(quán)利要求126的突變蛋白，其中所述突變蛋白以100nM或更小的Kd與VEGF-R2結(jié)合。128.權(quán)利要求127的突變蛋白，其中所述突變蛋白以20nM或更小的KD與VEGF-R2結(jié)合。129.權(quán)利要求128的突變蛋白，其中所述突變蛋白以1nM或更小的Kd與VEGF-R2結(jié)合。130.權(quán)利要求122至129中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白相對(duì)于成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白氨基酸序列而言包含至少6、8、10、12、14或16個(gè)氨基酸替換，所述替換選自Arg26—Ser;Glu27—lie;Glu30—Ser;Met31—Gly;Asn32—Arg;Leu33—lie;Glu34—Tyr;Leu56—Lys，Glu，Ala，Met;lie57—Phe;Ser58—Arg;Asp80—Ser,Pro;Lys83—Glu，Gly;Glu104—Leu;Leu105—Ala;His106—Val;以及Lys108—Thr。131.權(quán)利要求130的突變蛋白，其還包含選自以下的至少一個(gè)氨基酸替換Leu41—Phe;Glu63—Lys,Val64—Met;Asp72—Gly;Lys76—Arg;Lys76—Glu;He88—Val，Thr;lie89—Thr;Arg90—Lys;Asp95—Gly;Phe99—Leu;Gly107—Arg，Gly107—Lys;以及Gly107—Glu。132.權(quán)利要求130或131的突變蛋白，其中所述突變蛋白包含氨基酸替換Arg26—Ser;Glu27—He;Glu30~>Ser;Met31—Gly;Asn32—Arg;Leu33—lie;Glu34—Tyr;lie57—Phe;Ser58—Arg;Lys83—Ghi;Ghi104一Leu;Leu105一Ala;His106—Val;以及Lys108—Thr。133.權(quán)利要求130至132中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白包含以下氨基酸替換組之一(1)Arg26—Ser;Glu27—lie;Glu30—Ser;Met31—Gly;Asn32—Arg;Leu33—lie;Glu34—Tyr;Leu56—Lys;lie57—Phe;Ser58~>Arg;Asp80—Ser;Lys83—Glu;Glu104—Leu;Leu105—Ala;His106—Val;Lys108—Thr;(2)Arg26—Ser;Glu27—lie;Glu30—Ser;Met31—Gly;Asn32—Arg;Leu33—lie;Glu34—Tyr;Leu56—Glu;lie57—Phe;Ser58—Arg;Asp80—Ser;Lys83—Glu;Glu104—Leu;Leu105—Ala;His106—Val;Lys108—Thr;(3)Arg26—Ser;Glu27—lie;Glu30—Ser;Met31—Gly;Asn32—Arg;Leu33—lie;Glu34—Tyr;Leu56—Ala;lie57—Phe;Ser58—Arg;Asp80—Ser;Lys83—Glu;Glu104—Leu;Leu105—Ala;His106—Val;Lys108—Thr;和(4)Arg26—Ser;Glu27—lie;Glu30—Ser;Met31—Gly;Asn32~>Arg;Leu33—lie;Glu34—Tyr;Leu56—Glu;lie57—Phe;Ser58—Arg;Asp80—Pro;Lys83—Glu;Glu104—Leu;Leu105—Ala;His106—Val;Lys108—Thr。134.權(quán)利要求122至133中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白具有SEQIDNo:34-39所示的氨基酸序列。135.人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白，其中所述突變蛋白在成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白線(xiàn)性多肽序列中序列位置24-36、53-66、79-84和103-110中任何兩個(gè)或更多個(gè)位置處包含至少一個(gè)突變的氨基酸殘基，并且所述突變蛋白與VEGF或其片段結(jié)合。136.權(quán)利要求135的突變蛋白，其中所述突變蛋白通過(guò)抑制VEGF與其受體的結(jié)合而作為VEGF拮抗劑，其中VEGF的受體選自VEGF-R1、VEGF-R2和Neuropilin-I。137.權(quán)利要求136的突變蛋白，其中所述VEGF的受體為VEGF-R2。138.權(quán)利要求135至137中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白包含相對(duì)于成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白氨基酸序列而言在26-34、56-58、80、83、104-106和108中任何位置處的將天然氨基酸替換為半胱氨酸殘基的至少兩個(gè)氨基酸替換。139.權(quán)利要求135至138中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白以200nM或更小的Kd與VEGF結(jié)合。140.權(quán)利要求139的突變蛋白，其中所述突變蛋白以100nM或更小的Kd與VEGF結(jié)合。141.權(quán)利要求140的突變蛋白，其中所述突變蛋白以20nM或更小的Kd與VEGF結(jié)合。142.權(quán)利要求141的突變蛋白，其中所述突變蛋白以1nM或更小的Kd與VEGF結(jié)合。143.權(quán)利要求135至142中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白相對(duì)于成熟人淚液脂質(zhì)運(yùn)栽蛋白氨基酸序列而言包含至少6、8、10、12、14、16個(gè)氨基酸替換，所述替換選自Arg26—Ser，Pro，Val，Leu，lie;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His，Arg，Tyr，Gin;lie57—Val，Thr，Leu;Ser58—Lys;Asp80—lie;Lys83—lie;Glu104—Cys;His106—Asn，Ser;以及Lys108~>Ala,Val。144.權(quán)利要求143的突變蛋白，其還包含選自以下的至少一個(gè)氨基酸替換Val36—Ala;Thr37—Ala,lie;Met39—Thr;Thr40—Ala,Ser;Asn48—Asp,Ala51—Val;Lys52—Arg;Thr54—Val;Met55~>Val;Glu58—Lys;Ser61—Pro;Lys65—Arg;Ala66—Val;Val67—lie;Glu69—Gly,Ser，Thr;Lys76—Arg，Ile，Ala,Met,Pro;Tyr87—Arg，His,Lys，Gin;Ile89—Thr，Val，Gly，His,Met,Lys;Arg卯—Gly;Ile98—Val;以及Gly107—Glu。145.權(quán)利要求143或144的突變蛋白，其中所述突變蛋白包含氨基酸替換Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Asp80—Ile;Lys83—lie;Glu104—Cys;以及Lys108—Val。146.權(quán)利要求143至145中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白包含以下氨基酸替換組之一(1)Arg26—Ser;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Lei^Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His;Ser58—Lys;Asp80—lie;Lys83—lie;Glu104—Cys;His106—Asn;Lys108—Val;(2)Arg26—Pro;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His;Ser58—Glu;Asp80—Ile;Lys83—Ile;Glu104—Cys;His106—Ser;Lys108—Val;(3)Arg26—Pro;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His;Ser58—Lys;Asp80—Ile;Lys83—Ile;Glu104—Cys;His106—Asn;Lys108—Val;(4)Arg26—Pro;Ghi27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—Arg;Ser58—Lys;Asp80—Ile;Lys83—Ile;Glu104—Cys;His106—Ser;Lys108—Val;(5)Arg26—Pro;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His;Ser58—Lys;Asp80—lie;Lys83—Ile;Glu104—Cys;His106—Ser;Lys108—Val;(6)Arg26—Ser;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His;Ser58—Lys;Asp80—lie;Lys83—lie;Glu104—Cys;His106—Ser;Lys108—Val;(7)Arg26—Val;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His;Ser58—Lys;Asp80—lie;Lys83—lie;Glu104—Cys;His106—Ser;Lys108—Val;(8)Arg26—Leu;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His;Ser58—Lys;Asp80—lie;Lys83—lie;Ghi104—Cys;His106—Ser;Lys108—Val;(9)Arg26—lie;Glu27—Gly;Phe28—Ala;Pro29—Leu;Glu30—Arg;Met31—Cys;Asn32—Leu;Leu33—Ala;Glu34—Gly;Leu56—His;Ser58—Lys;Asp80—lie;Lys83—He;Glu104—Cys;His106—Ser;Lys108—Val。147.權(quán)利要求135至146中任一項(xiàng)的突變蛋白，其中所述突變蛋白具有SEQIDNo:26-33或44-47的氨基酸序列。全文摘要本發(fā)明涉及來(lái)自人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的新的突變蛋白。本發(fā)明還涉及編碼這樣的突變蛋白的相應(yīng)核酸分子及其產(chǎn)生方法。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生這樣的突變蛋白的方法。最后，本發(fā)明涉及包含這樣的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的藥物組合物以及該突變蛋白的多種用途。文檔編號(hào)C07K14/435GK101516907SQ200780035208公開(kāi)日2009年8月26日申請(qǐng)日期2007年8月1日優(yōu)先權(quán)日2006年8月1日發(fā)明者A·斯克拉,A·霍爾鮑姆,E·布德羅,I·金伯,K·詹森,M·許爾斯邁爾,R·C·瓊斯,R·迪爾曼,S·施勒胡伯爾申請(qǐng)人:皮里斯股份公司