專利名稱：：制備抗耐藥性抗原的活性抗體的方法、所述方法獲得的抗體及其用途的制作方法制備抗耐藥性抗原的活性抗體的方法、所述方法獲得的抗體及其用途本發(fā)明涉及制備用于治療和/或診斷目的的特別的單克隆抗體的新型方法。更特別的是，本發(fā)明的目的在于制備針對在原發(fā)腫瘤的腫瘤細胞表面缺失而在這些原發(fā)腫瘤的抗腫瘤治療之后將出現(xiàn)的腫瘤抗原，以及也可能參與形成腫瘤對于抗腫瘤治療的耐藥性的抗原的抗體。本發(fā)明還包含這些抗體以及這些抗體用作耐藥腫瘤的預防性和/或治療性治療的藥物的用途。本發(fā)明最后包含含有這種可與抗癌制劑聯(lián)合使用的抗體的組合物及其預防和/或治療某些癌癥的用途。抗體的發(fā)現(xiàn)和更特別的制備抗體的方法的發(fā)展構(gòu)成在治療性治療或診斷和更特別的在癌癥范圍內(nèi)的變革。的確，首次，這種新的工具因其抗體本身的識別特性提供靶向治療的可能性。這最后十年的主要挑戰(zhàn)由開發(fā)制備抗體的方法構(gòu)成，在第一階段是多克隆抗體，單克隆抗體或甚至是抗體片段或類似結(jié)構(gòu)。直到今天，為了能夠制備用于治療性和/或診斷性目的的抗體，本領(lǐng)域技術(shù)人員已開發(fā)出一些技術(shù)。最早的抗體為多克隆抗體，即免疫的動物血清中包含不同來源的抗體群體。為了做到這一點，幾種動物(小鼠、大鼠、家兔、山羊等)通過注射給定天然或合成抗原，與一種或多種佐劑，如Freund佐劑和氫氧化鋁而免疫接種，佐劑的目的在于促進和增強免疫反應。然后采集這些動物的血，并回收既含有能或多或少有效識別抗原的幾種表位的抗體(多克隆抗體)也含有動物的其它抗體的血清或抗血清。例如通過親和層析純化法將獲得的抗體進行純化。第一個發(fā)展存在于根據(jù)KOHLER和MIELSTEIN(1975)所述的技術(shù)從雜交瘤中制備單克隆抗體。該技術(shù)使預定抗原的特異性單克隆抗體得以產(chǎn)生，并由B淋巴細胞克隆與骨髓瘤細胞融合以獲得稱為雜交瘤的細胞。這種雜交瘤不僅具有永生化的特征而且還可以永久性產(chǎn)生單克隆的并因此是單一特異性的抗體。也描述過其它基于同一原理的技術(shù)，如三源雜交瘤技術(shù)或甚至依舊是KOZBOR等人(1983)描述的雜交瘤技術(shù)。這些一開始用于制備鼠抗體的技術(shù)已進展到可以制備人源化或人的嵌合抗體。今天所有這些技術(shù)已被本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。通過使用基因修飾的小鼠，所謂"異種小鼠"(專利US5,814，318和US5,939,598所述)的技術(shù)可獲得人抗體。還開發(fā)出其它新方法用于制備人單克隆抗體和更特別地制備抗體片段，如使用RIDDER等人(1995)所述的噬菌體庫或文庫的技術(shù)或所謂的"噬菌體顯示"技術(shù)，其基于抽提來自外周血的人類細胞的mRNA，構(gòu)建包含各種區(qū)的序列的cDNA庫或文庫，并將cDNA插入噬菌體中以產(chǎn)生各種如片段、優(yōu)選Fab片段的抗體區(qū)。盡管這些方法不同，但都有相同的特征，即，用已知抗原免疫接種或在文庫或庫的范圍內(nèi)用該同一已知和限定的抗原篩選這些庫。本發(fā)明區(qū)別于上述方法的是，不再用已知和限定抗原而是直接用全部或部分腫瘤抗原。更特別的是，本發(fā)明指向直接使用腫瘤的裂解物和/或懸浮物和/或磨碎細胞勻漿。在治療癌癥中，數(shù)年來己觀察到一些數(shù)量的患者在首次接受治療性治療之后已經(jīng)發(fā)展出完全的和良好的反應之后，易于復發(fā)。更加特別的是，已知腫瘤能夠修飾其基因型和/或其表型以抵抗作用于它們的不同治療。這種現(xiàn)象存在于放射治療、化學治療和用單克隆抗體的治療。歷史上，治療癌癥的第一個化學治療化合物是20世紀40年代進行的臨床試驗。這些化合物主要是半衰期短的制劑，如皮質(zhì)激素、抗葉酸素或者甚至是長春花生物堿。然而，甚至達到完全緩解時，后者一般不能持續(xù)一年以上而出現(xiàn)系統(tǒng)性復發(fā)，復發(fā)與腫瘤對用于治療的化學治療化合物的耐藥有關(guān)(LehnertM.，Eur.J.Cancer,1996,32A:912-920)。對該這種現(xiàn)象的反應，通過使用各種抗腫瘤化合物進行所謂的"聯(lián)合"治療受到關(guān)注。通過同時或先后使用不同化合物，實際上獲得了較好的結(jié)果。事實上，說到使用不同的抗腫瘤化合物，每種具有細胞毒活性但作用機制不同，對于化合物耐藥的腫瘤細胞可依舊對至少一種所用的其它化合物敏感。14然而，盡管使用不同抗腫瘤化合物或制劑，腫瘤的耐藥在化學療法治療領(lǐng)域內(nèi)仍然是主要問題。聯(lián)合使用有延遲耐藥現(xiàn)象出現(xiàn)的效果，但不能使其消失。對化學療法藥物的耐藥，與最初治療有關(guān)的耐藥或出現(xiàn)在良好的最初反應之后的復發(fā)之時的耐藥，實際上出現(xiàn)在所有所謂的"可治療的"癌癥上。作為例子，要提及專利申請WO2005/077385,WO2004/026293或者甚至是WO2004/110497，這些專利申請很好地解釋了尋找控制耐藥現(xiàn)象的新方法，所有這些申請基于額外注射新型一般化學分子的原理。已證明其它在最初對治療敏感的腫瘤獲得耐藥性的機制。最廣泛認可的假設提示這種耐藥現(xiàn)象可能是腫瘤細胞的基因型發(fā)生了自發(fā)的和隨機進行的體細胞突變的積聚的結(jié)果(CancerChemotherapyandBiotherapy:Principlesandpractice,Chabner&Langoeditors,1996,chapter1)。另一已知的和描述過的耐藥現(xiàn)象，稱為"MDR"(多重藥物耐藥)，基于腫瘤細胞在使用致死量濃度的大量的藥理上、化學上、或甚至是結(jié)構(gòu)上不同的細胞毒性化合物而依舊存活的能力。這些顯示出"MDR"的細胞其胞內(nèi)細胞毒性化合物的積聚因為通過轉(zhuǎn)運蛋白將所述化合物排出而減少。這些蛋白質(zhì)，稱為"多重藥物轉(zhuǎn)運蛋白"，是能夠?qū)⒍喾N毒性分子從細胞排出的膜蛋白。這些"多重藥物轉(zhuǎn)運蛋白"屬于其活性利用ATP水解釋放的能量的轉(zhuǎn)運蛋白的"ATP結(jié)合盒(ABC)超家族"。已揭示幾種解釋這種"MDR"的幾種機制。參與如與依賴于ATP的排出機制相關(guān)的耐藥的最已知和證明最多的基因是MDRl基因。與化學療法治療誘導的這些耐藥現(xiàn)象同時發(fā)生的，用單克隆抗體治療后出現(xiàn)誘導性耐藥也被描述。這種耐藥可與宿主的本性，與藥理學原因或別的原因相關(guān)。它對于實際所患腫瘤是本質(zhì)性的。首先，第一次使用鼠抗體相關(guān)抗體，結(jié)果是抗體抗所述鼠抗體的應答，所謂的HAMA(人抗小鼠抗體)應答。這種與宿主相關(guān)的耐藥形式通過不再使用鼠類而是使用人或人源化抗體而得到部分解決。使用這種人或人源化抗體的不同試驗證明了腫瘤可對免疫治療耐藥的新現(xiàn)象。這些新機制主要基于腫瘤上誘導性突變，在靶抗原的剪切(或脫落)或甚至是喪失表達之后受體的組成型激活。由于在此后的實施例1中這是明顯的，例如申請人進行的研究表明，用抗-IGF-IR、EGFR和Her/2neu三聯(lián)療法，可能顯著地抑制裸鼠體內(nèi)A549細胞腫瘤的生長直至腫瘤完全消失，這種現(xiàn)象出現(xiàn)在90%受治動物身上。盡管多重療法比單一療法或雙重療法明顯有效，但是似乎是那些被完全抑制的腫瘤盡管繼續(xù)治療，仍然逐漸再度出現(xiàn)這些腫瘤形成對多重治療的耐藥。根據(jù)以上觀察，申請人首次考慮直接使用這種耐藥腫瘤制備抗體，優(yōu)先是能夠識別抗原的治療性和/或診斷性單克隆抗體，這些抗原在對抗腫瘤治療耐藥的腫瘤的腫瘤細胞表面的表達可被誘導，并且這些抗原在原發(fā)(未經(jīng)治療)腫瘤的腫瘤細胞表面不表達，這些抗原也可參與腫瘤對抗腫瘤治療的耐藥。根據(jù)第一方面，所以本發(fā)明的目標是將對至少一種抗腫瘤化合物耐藥的腫瘤的粉碎的組織勻漿和/或懸浮液和/或細胞裂解液用于免疫接種并制備在體外直接抗在所述耐藥腫瘤的腫瘤細胞表面表達的腫瘤抗原的抗體或其功能片段之一，該腫瘤抗原優(yōu)選在耐藥腫瘤的原發(fā)腫瘤的腫瘤細胞表面不表達，該腫瘤抗原可能參與所述腫瘤對抗腫瘤化合物的耐藥。術(shù)語"粉碎的組織勻漿"或"細胞勻漿"是指來自腫瘤(接受治療的出現(xiàn)腫瘤復發(fā)的患者的異種移植物、正位移植物(orthotopicgraft)、同系移植物、手術(shù)標本或細胞培養(yǎng)物)的通過機械分離獲得的，如通過例如"Potter"型超聲粉碎機，Ultraturax型粉碎機等分離獲得的細胞和/或細胞碎片的混合物。術(shù)語"懸浮液"或"細胞懸浮液"是指在治療存在或缺失的情況下體外培養(yǎng)后獲得的和通過酶溶液或非酶分離溶液將細胞從支持物上分離下來的細胞的懸浮液。術(shù)語"裂解液"或"細胞裂解液"是指通過酶分離而獲得的細胞和/或細胞碎片的混合物，該細胞和/或細胞碎片來自腫瘤(接受治療的出現(xiàn)腫瘤復發(fā)的患者的異種移植物、正位移植物(orthotopicgraft)、同系移植物、手術(shù)標本或細胞培養(yǎng)物)。術(shù)語"耐藥腫瘤"是指對應用的治療沒有反應或不再發(fā)生反應的腫瘤。如上所述，在化學療法、放射療法、激素療法治療之后還是甚至特別是使用抗體之后，可觀察到這種耐藥性，這些治療方法可單獨應用或者聯(lián)合應用。至今為止，關(guān)于這種耐藥能力的根本原因的各種機制是已知或未知的。最終，這種耐藥性通過初始應用的治療的有效性的下降或喪失而表現(xiàn)出來。當然，已知的和所述的"逃逸"現(xiàn)象是本發(fā)明尋求控制的耐藥現(xiàn)象的一部分。術(shù)語原發(fā)腫瘤(或原生腫瘤)是指指定的來自耐藥腫瘤的腫瘤，不對原發(fā)腫瘤進行任何與耐藥腫瘤相反的治療。腫瘤抗原是指特別是那些在腫瘤細胞表面表達的抗原，無論它們是來自于原發(fā)腫瘤還是來自于耐藥腫瘤，該腫瘤抗原在健康細胞表面不表達。這些腫瘤抗原一般而言是抗體可特異性結(jié)合的天然大分子(可合成)。特別地，腫瘤抗原可是多肽、多糖、碳水化合物、核酸、脂類、半抗原或任何其它在腫瘤細胞表面天然存在的化合物。最終，本文中術(shù)語"抗體"或"免疫球蛋白"在最廣義范圍內(nèi)可互換使用并包含單克隆抗體(例如整個或完整單克隆抗體)，多克隆抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如表現(xiàn)出目的生物學活性的雙特異性抗體)。嵌合抗體或人源化抗體也包含在這個指定中。更加特別的是，這種分子為包含通過二硫鍵連接在一起的兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(或結(jié)構(gòu)域)(HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)構(gòu)成。重鏈的恒定區(qū)包含三個結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(或結(jié)構(gòu)域)(LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)構(gòu)成。重鏈恒定區(qū)包含LC結(jié)構(gòu)域。VH和VL區(qū)可細分成稱為CDR(互補性決定區(qū))的高變區(qū)，稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的多個保守區(qū)插入其中。每個VH和VL由三個CDR和四個FR構(gòu)成，從氨基末端至羧基末端以下列順序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w恒定區(qū)可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，包括免疫系統(tǒng)的不同細胞(例如效應細胞)和首次成分(Clq)或標準補體系統(tǒng)。它們還可能包含某些就免疫球蛋白(IgG、IgE、gM、IgA等)的類型或來源而言表現(xiàn)出所期望的親合力和特異性的抗體片段(更加詳細描述的術(shù)語)。17作為規(guī)則，制備特別是鼠源的單克隆抗體或其功能片段可參照特別是"抗體，，手冊所述的技術(shù)(Harlow禾卩Lane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborNY,pp.726，1988)或參照KohleretMilstein(Nature,256:495-497，1975)所述的雜交瘤的制備技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明，在尋求制備的抗體之中，優(yōu)選上述限定的抗體和所謂的"活性"抗體，即具有針對抵抗治療的腫瘤細胞的抗腫瘤活性的抗體。根據(jù)本發(fā)明和發(fā)明的特定方面，在尋求制備的抗體之中，優(yōu)選上述限定的抗體和那些還能夠表現(xiàn)出針對具有攻擊表型的腫瘤抗原的抗腫瘤活性，具有攻擊表型的腫瘤天然(治療前)表達這些抗體針對的抗原。在第一具體實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的用途的特征在于所述耐藥腫瘤通過對即將或已經(jīng)接受治療性處置的患者進行活檢和/或手術(shù)的方式直接獲得，該治療性處置采用所述至少能夠誘導耐藥的或者對于該化合物腫瘤對其的耐藥性確定的抗腫瘤化合物。在該具體實施方式中，對每個患者的治療可這樣來考慮抗體是根據(jù)本發(fā)明用來自實際患者的全部或部分耐藥腫瘤進行免疫接種所誘導的免疫應答產(chǎn)生的。可因此而考慮對患者的體外訂制性治療。在第二具體實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的用途的特征在于所述耐藥腫瘤是通過將腫瘤細胞系和/或全部或部分人體腫瘤移植到動物體內(nèi)而后通過給藥尤其是通過注射至少一種抗腫瘤化合物(期望該化合物誘導或確定耐藥性)對動物進行治療而誘導產(chǎn)生。更特別的是，所述至少一種抗腫瘤化合物選自化學療法制劑如化學分子或甚至是治療性抗體或甚至是放射療法制劑。一般地，在本說明書的全部內(nèi)容中，"抗腫瘤制劑"或"抗癌治療劑"是指單獨用于對患者的給藥時，能夠治療或預防患者癌癥進展的物質(zhì)。作為這種制劑的非限制性的例子，可提及所謂的"細胞毒"制劑，如"烷化"劑、抗代謝劑、抗腫瘤的抗生素、有絲分裂抑制劑、染色質(zhì)功能抑制劑、抗血管生成劑、抗雌激素劑、抗雄激素劑或免疫調(diào)節(jié)劑。這些制劑作為例子在2006版VIDAL中，專指癌癥學和血液病學相關(guān)化合物中"細胞毒制劑"欄提及，這些在這份資料中作為參考提及的細胞毒化合物在本文中提及作為優(yōu)選的細胞毒制劑。"垸化劑"是指任何在細胞內(nèi)可與任何分子共價偶聯(lián)或使任何分子烷基化的物質(zhì)，其中任何分子優(yōu)選核苷酸(如DNA)。作為這種烷化劑的例子，可提及氮芥類，如雙氯乙基甲胺、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、鹽酸鹽、溴丙哌嗪、松龍苯芥、磷酸氫二鈉或磷雌氮芥；oxazaphosphorine類，如環(huán)磷酰胺、六甲密胺、氯乙環(huán)磷酰胺、磺基磷酰胺(sulfofosfamide)或異磷酰胺；氮丙啶或氮雜環(huán)丙垸類，如三胺硫磷、三亞乙基二胺或六甲密胺；亞硝基脲類如氯乙亞硝脲、鏈脲霉素、福替目丁(fotemustine)或環(huán)己亞硝脲；烷基磺酸鹽類如二甲磺酸丁酯(busulfan)、丁四醇磺酯(treosulfan)或英丙舒凡(improsulfan);三氮烯類如二甲三氮咪唑酰胺;或甚至鉑合成物如順鉑、奧克賽鉑或碳鉑。"抗代謝劑"是指通過干預某些活性，尤其是通過干預DNA合成活性而阻斷生長和/或細胞代謝的物質(zhì)。作為抗代謝劑的例子，甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶脫氧核苷、5-氟脫氧尿嘧啶、卡培他濱(capecitabine)、阿糖胞苷、氟達拉濱(fludarabine)、胞嘧啶阿糖胞苷(cytosinearabinoside)、6-巰基嘌呤(6-MP)、6-硫代鳥嘌呤(6-TG)、2-氯脫氧腺苷、5-氮雜胞苷、2,2-二氟脫氧胞嘧啶核苷、2-氯脫氧腺苷、脫氧助間型霉素(deoxycoformycine)禾卩噴司他丁(pentostatin)。"抗腫瘤抗生素"是指可阻止或抑制DNA、RNA和/或蛋白質(zhì)合成的化合物。這種抗腫瘤抗生素的例子包含阿霉素、柔紅霉素、去甲氧柔紅霉素、戊柔比星(valmbicin)、米托蒽醌、更生霉素、光輝霉素、絲裂霉素C、博萊霉素和甲基節(jié)肼。"有絲分裂抑制劑"阻止細胞周期和有絲分裂的正常推進。一般的微管抑制劑或"taxoids"，如紫杉醇和紫杉萜，能夠抑制有絲分裂。長春藥屬類生物堿類如長春堿、長春新堿、長春花堿酰胺和長春瑞濱，也能抑制有絲分裂。"染色質(zhì)功能抑制齊U"或"拓撲異構(gòu)酶抑制劑"是指抑制染色質(zhì)建模蛋白(thechromatin-modelingprotein)，如拓撲異構(gòu)酶I禾BII的正常功能的物質(zhì)。這種抑制劑的例子包含，拓撲異構(gòu)酶I的抑制劑有喜樹堿及19其衍生物如依立替康(irinotecan)或托泊替康(topotecan)，拓撲異構(gòu)酶I的抑制劑有鬼臼乙叉甙(etoposide)、磷酸鬼臼乙叉甙和鬼臼噻吩甙。"抗血管生成劑"是指任何抑制血管生長的藥物、化合物、物質(zhì)或制劑。抗血管生成劑的例子包含，無任何限制，丙亞胺、馬馬司他、巴馬司他、普啉司他、坦諾司他、伊洛馬司他、CGS-27023A、溴氯哌喹酮、COL-3、新伐司他、BMS-275291、沙立度胺、CDC501、DMXAA、L-651582、角鯊胺、內(nèi)皮他丁、SU5416、SU6668、a-干擾素、EMD121974、白細胞介素-12、IM862、血管抑素、vitaxin。"抗雌激素"或"抗雌激素制劑"是指任何減少、拮抗或抑制雌激素的活性的物質(zhì)。這類制劑的例子有他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬，屈洛昔芬、愛多昔芬(iodoxyfene)、阿那托唑、來曲唑和依西美坦。"抗雄激素"或"抗雄激素制劑"是指任何減少、拮抗或抑制雄激素活性的物質(zhì)。抗雄激素劑的例子有緩退瘤、尼魯米特、比卡魯胺、螺內(nèi)酯、醋酸環(huán)丙氯地孕酮、非那司提和甲氰咪胍。免疫調(diào)節(jié)劑是剌激免疫系統(tǒng)的物質(zhì)。這種免疫調(diào)節(jié)劑的例子包含下列與5-氟尿嘧啶聯(lián)合應用的和其它類型免疫調(diào)節(jié)劑干擾素、白細胞介素類如阿地白介素、OCT-43、地尼白介素毒素連接物(denileukindiflitox)或白介素-2、腫瘤壞死因子如他索納明(tasonermin)或如蘑菇多糖、西佐喃(sizofiran)、羅喹美克(roquinimex)、匹多莫德(pidotimod)、甲氧聚乙二醇琥珀酰胺腺甙脫氨酶(pegademase)胸腺噴丁、多聚肌苷酸:多聚胞苷酸(polyl:C)或左旋咪唑。對于更多細節(jié)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可參考AssociationFra叫aisedesEnseignantsdeChimieTMrapeutique編輯的名為"trait6dechimieth6rapeutique,Vol.6，M6dicamentsantitumorauxetperspectivesdansletraitementdescancers,6ditionTEC&DOC,2003"的手冊。作為抗腫瘤制劑，還可提及放射療法制劑、激素療法制劑或以小分子為靶的治療劑如酪氨酸激酶抑制劑。最后，根據(jù)優(yōu)選具體實施方式，抗體屬于根據(jù)本發(fā)明可使用的抗腫瘤制劑的一部分。更特別地，可提及下列抗體作為非限制性實施例抗EGFR抗體如西妥昔單抗(cetuximab)(C225或愛必妥(erbitux))、matuzumab、huR3、HuMax-EGFR或panitumab;抗VEGF抗體如貝伐單抗(bevacizumab)(Avastin)或2C3;抗IGF-IR抗體，如7C10、h7C10、hEM164、ABX-IGF-IR、Mab39、1H7或4G11;抗HER2抗體，如曲妥單抗(trastuzumab)(Herceptin)或pertuzumab;抗CD20抗體，如commerituximab、ibritumomab或托西莫單f亢(tositumomab);抗CD33抗體如吉姆單抗(gemtuzumab)或林妥珠單抗(lintuzumab);抗CD22抗體例如依帕珠單抗(epratuzumab);抗CD52抗體例如alemtuzumab;抗EpCAM抗體，如依決可單抗(edrecolomab)、Ch17-1A或IGN-101;抗-CTP21或16抗體，如Xactin;抗DNA抗原抗體，如13II-CotamTNT-1;抗MUC1抗體，如pemtumomab或R1150;抗MUC18抗體，如ABX-MA1;抗GD3抗體，如米妥莫單抗(mitumomab);抗CEA抗體，如CeaVac或labetuzumab;抗CA125抗體，如OvaRex;抗HLA-DR抗體，如apolizumab;抗-CTLA4抗體，如MDX-010;抗PSMA抗體，如MDX-070、川ln&卯Y-J591、177LuJ591、J591-DM1;抗LewisY抗體，如IGN311;抗血管生成抗體，如AS1405和9GYmuBCl;抗-Trail-Rl抗體，如TRAILRl單抗或TRAILR2單抗；或者甚至除上述抗體外任何針對酪氨酸激酶受體的抗體，或針對RON、cMET、CXCR2、CXCR4，Ephrin類型的受體等，對于使用如酪氨酸激酶抑制劑的小化學分子的靶向治療是同樣的。當然，該列表絕不限制僅是提及迄今為止在用的或研究中的抗體的目的。根據(jù)本發(fā)明的特定具體實施方式，應注意所述耐藥腫瘤是對幾種治療方法或抗腫瘤制劑抵抗，其中后者可具有各種特性。更加特別的是，根據(jù)本發(fā)明的用途的特征在于所述至少一種抗腫瘤化合物由至少兩種，優(yōu)選至少三種具有不同特性和/或不同作用機制和/或耙蛋白不同的化合物構(gòu)成。作用機制不同是指例如抗腫瘤制劑能改變細胞的不同生物學功能，如改變血管生成、DNA合成或甚至是有絲分裂的功能。靶蛋白不同更加特別是指當抗腫瘤制劑是能夠結(jié)合具有不同特性的蛋白或受體時的情況。相當明顯地，可注意僅抗體彼此聯(lián)合應用，或者僅化學療法制劑彼此聯(lián)合應用或這兩種家族的化合物彼此聯(lián)合應用或與放射療法、激素療法治療或使用如上所述的小化學分子的靶向治療聯(lián)合應用。盡管優(yōu)選，全部抗腫瘤化合物都具有不同的作用機制或靶點也還是不需要的。根據(jù)第二方面，本發(fā)明的目標是體外制備抗體或其中一個功能片段的方法，該抗體或其中一個功能片段針對在對至少一種抗腫瘤化合物耐藥的腫瘤細胞表面表達的腫瘤抗原，所述腫瘤抗原優(yōu)選在相應原發(fā)腫瘤(未經(jīng)治療)的腫瘤細胞表面不表達，并且所述腫瘤抗原可能參與所述對抗腫瘤治療耐藥的腫瘤的耐藥性的形成，該方法包含由直接用耐藥腫瘤的磨碎的組織勻漿和/或懸浮液和/或細胞裂解液免疫接種動物構(gòu)成的步驟和由選擇識別耐藥腫瘤而不識別形成耐藥腫瘤的原發(fā)腫瘤的抗體構(gòu)成的步驟。根據(jù)本發(fā)明所述方法的特定方面，描述了體外制備抗體或其中一個功能片段的方法，該抗體或其中一個功能片段針對在腫瘤細胞表面表達的可能參與所述腫瘤的耐藥性的形成的腫瘤抗原，該方法構(gòu)成如下用來自原發(fā)腫瘤(尚未接受任何治療的腫瘤)的磨碎的組織勻漿和/或懸浮液和/或細胞裂解液為動物進行免疫接種之后，無論動物耐受或不耐受，均用來自耐藥腫瘤的磨碎的組織勻漿和/或懸浮液和/或細胞裂解液為動物進行免疫接種，其中所述耐藥腫瘤對所述至少一種抗腫瘤化合物(腫瘤對其的耐藥是確定的或期望誘導耐藥性的抗腫瘤化合物)耐藥。這種用環(huán)磷酰胺類型的免疫抑制劑進行的耐受的目的是在以誘導耐藥性為目的的抗腫瘤治療應用于動物或人之前或在與人類有關(guān)的治療范圍內(nèi)去除針對所有出現(xiàn)的表面抗原的免疫應答。因此，給藥后的免疫應答，特別是注射耐藥腫瘤的制劑之后的免疫應答，將集中在治療誘導的表面結(jié)構(gòu)上并潛在地參與腫瘤耐藥性的形成。通過隨后用來自原發(fā)腫瘤的腫瘤細胞接種動物后形成的血清滴度的消失評價耐受的效率。然后，對根據(jù)上述方法接種的小鼠的脾臟取樣并根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準方法將脾細胞與骨髓瘤細胞融合。細胞融合之后，在預先制備好的帶有(未治療的)"原發(fā)腫瘤"切片和耐藥腫瘤(用抗腫瘤制劑單處理或多處理)切片的載玻片上通過"鑒別性免疫組織化學"篩選獲得的雜交瘤。僅將產(chǎn)生識別耐藥腫瘤而不識別原發(fā)腫瘤的抗體的雜交瘤選擇出來，克隆并冷凍以產(chǎn)生抗體并測試其抗腫瘤活性。該方法的全部內(nèi)容如下文的圖2和3所示。應注意這種方法也可用于尋找和鑒定細胞內(nèi)耐藥分子。根據(jù)本發(fā)明，上文限定的抗體優(yōu)選是可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的標準方法獲得的特異性，特別是鼠的，嵌合或人源化單克隆抗體。一般地，制備單克隆抗體或其功能片段，尤其是鼠源抗體可參考特別是手冊"抗體，，(Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborNY,pp.726,1988)中所描述的技術(shù)或參考Kohler和Milstein(Nature,256:495-497,1975)描述的由雜交瘤制備抗體的技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明的抗體也包括嵌合抗體或人源化抗體。嵌合抗體是指包含來自特定物種抗體的天然變異(輕鏈和重鏈)區(qū)聯(lián)合所述特定物種(小鼠、馬、家兔、犬、牛、雌鳥等)異源的物種的抗體的恒定輕鏈和重鏈區(qū)的抗體。根據(jù)本發(fā)明的抗體或其嵌合型片段可用基因重組技術(shù)制備。例如，嵌合抗體可通過克隆化包括根據(jù)本發(fā)明的非人的，尤其是鼠的單克隆抗體的啟動子和可變區(qū)的編碼序列和人抗體恒定區(qū)序列的重組DNA而制備。例如，這種重組基因編碼的本發(fā)明的嵌合抗體是小鼠-人構(gòu)建體，這種抗體的特異性由來自鼠DNA的可變區(qū)決定；其同種型由來自人DNA的恒定區(qū)所決定。嵌合抗體的制備方法可參考例如Verhoeyn等人的文獻(BioEssays,8:74,1988)，Morrison等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:6851-6855,1984)或美國專利4,816,567。人源化抗體是指包含源自非人起源的CDR區(qū)和源自一種或多種人的抗體的抗體分子的其它部分。此外，構(gòu)架區(qū)(FR)的一些殘基可被置換以保留結(jié)合親合力(Jones等人，Nature,321:522-525,1986;Verhoeyen等人，Science,239:1534-1536,1988;Riechmann等人，Nature,332:323-327,1988)。根據(jù)本發(fā)明的人源化抗體或其片段可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的技術(shù)制備(如例如文獻Singer等人，J.Immun.150:2844-2857,1992;Mountain等人，Biotechnol.Genet.Eng.Rev"10:1-142,1992;或23Bebbington等人，Bio/Technology,10:169-175，1992中所述的技術(shù))。其它人源化技術(shù)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，如例如PDL所述的"CDR移植"技術(shù)，是專禾UEP0451261、EP0682040、EP0939127、EP0566647或者US5,530,101、US6,180,370、US5,585,089和US5,693,761的主題。專利US5,639,641或者US6,054,297、US5,886,152和US5,877,293也提及了該技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明的抗體的功能片段，如Fv、scFv(對于單一鏈是sc)、Fab、F(ab')2、Fab'、scFv-Fc片段或雙體，或任何半衰期經(jīng)過化學修飾延長的抗體片段，這些化學修飾如增加多(烷基)乙二醇如聚乙烯乙二醇"PEG化"或通過使其進入溶酶體中。一般地，所述片段至少有一個來源抗體的特征性CDR，并一般能表現(xiàn)出甚至來源抗體的部分活性。優(yōu)選地，所述功能片段構(gòu)成自或包含其來源抗體的重鏈或輕鏈可變鏈的部分序列，所述部分序列足以保留與其來源抗體相同的結(jié)合特異性和足夠的親合力，其長度優(yōu)選至少等于其來源抗體序列長度的1/100，更優(yōu)選至少1/10。這種功能片段最少包括其來源抗體序列的5個氨基酸，優(yōu)選10、15、25、50和IOO個連續(xù)氨基酸。優(yōu)選地，這些抗體片段是Fv、scFv、Fab、F(ab')2、F(ab')、scFv-Fc型或雙體一般具有與其來源抗體相同的結(jié)合特異性。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明所述的抗體片段可獲自如前所述的抗體通過如酶切消化(如胃蛋白酶或番木瓜蛋白酶)和/或通過化學還原打開二硫鍵的方法獲得的片段。另一種方式，本發(fā)明包含的抗體片段可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的基因重組技術(shù)獲得或這通過多肽合成技術(shù)，即通過如AppliedBiosystems等提供的自動化多肽合成儀的方式獲得。更優(yōu)選的是，本發(fā)明包含抗體，或其根據(jù)本發(fā)明的功能片段，尤其是通過基因重組或化學合成獲得的嵌合或人源化抗體及其片段。根據(jù)本發(fā)明所述的方法的優(yōu)選具體實施方式，所述免疫接種通過腹腔和/或皮下和/或靜脈和/或脾下注射進行。每種免疫接種的方式可互換，選擇一種方式而不是另一種方式是根據(jù)所用的動物和本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識和實踐。更特別的是，根據(jù)第一具體實施方式，產(chǎn)生的腫瘤是直接通過對正在接受或已接受用至少一種能誘導耐藥性的或?qū)ζ涞哪退幮砸汛_定的抗腫瘤化合物的治療性處置的患者區(qū)活檢和/或手術(shù)而獲得。根據(jù)第二具體實施方式，耐藥腫瘤通過將腫瘤細胞系和/或全部或部分人的腫瘤移植到動物身上，并為該動物注射至少一種期望其誘導耐藥性或確定對其的耐藥性明確的抗腫瘤化合物而誘導產(chǎn)生。無論上述優(yōu)選的具體實施方式，本發(fā)明所述的方法的特征在于所述活性抗體或其中一個功能片段是單克隆抗體。更特別的是，所述單克隆抗體或其中一個功能片段是選自IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的免疫球蛋白。甚至更優(yōu)選的是，所述單克隆抗體或其中一個功能片段是Yl、y2或y4同種型IgG。然而，應理解根據(jù)本發(fā)明，IgGl和IgG2型免疫球蛋白因其誘導效應細胞功能的特性而是優(yōu)選的。一般地，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到效應子功能包含，結(jié)合Clq、CDC(補體依賴的細胞毒活性)，結(jié)合Fc受體、ADCC(抗體依賴的細胞的細胞毒活性)和吞噬作用作為非窮舉性例子。更加特別的是，本發(fā)明所述的優(yōu)選的效應子功能是ADCC和CDC。一般地，本發(fā)明所指的功能片段選自片段Fv、Fab、(Fab')2、Fab'、scFv、scFv-Fc和雙體，或任何半衰期延長的片段，如PEG化的片段。以更加特異性但絕不限制性的方式，本發(fā)明所述的方法至少包含下列步驟i)用來自耐藥腫瘤的磨碎的組織勻漿和/或懸浮液和/或細胞裂解液直接免疫動物；ii)將步驟i)中免疫過的動物的脾細胞與骨髓瘤細胞融合以獲得雜交瘤；和iii)通過鑒別選擇方法選出分泌特異性識別耐藥腫瘤的腫瘤細胞表面表達的通過抗腫瘤治療誘導產(chǎn)生的抗原的抗體的雜交瘤。"鑒別選擇法"是指任何基于可鑒定誘導型抗原的方法的選擇方法，誘導型抗原相對于那些在耐藥性產(chǎn)生之前就己存在于細胞上的抗原而言，是對治療產(chǎn)生耐藥性的抗原。能夠進行這種"鑒別選擇法"的技術(shù)的非限制性的例子有在冰凍切25片或石蠟包埋切片上進行免疫組織化學的方法或"蛋白質(zhì)芯片"或"基因芯片"的方法。更特別的是，優(yōu)選使用所謂的"組織芯片"技術(shù)。包含"組織芯片"技術(shù)，將冰凍或石蠟包埋的的組織塊，新的組織塊包含數(shù)十至數(shù)百這些組織的核心，以致能在將這些用于"組織芯片"的組織塊切片后固定包含數(shù)十至數(shù)百組織切片的顯微鏡玻片。根據(jù)優(yōu)選具體實施方式，本發(fā)明所述的方法在上述步驟O之前進一歩包含下列歩驟a)選擇腫瘤細胞系和/或全部或部分所謂"原發(fā)"腫瘤，并將其移植到動物體內(nèi)；b)用至少一種抗腫瘤化合物治療部分接受移植的動物；c)使步驟a)中接受移植的未經(jīng)治療的動物的全部或部分"原發(fā)"腫瘤恢復；d)使步驟b)中接受移植的接受治療的動物的全部或部分耐藥腫瘤恢復；e)制備來自分別在步驟c)和d)中完全或部分恢復的腫瘤的抗體的鑒別選擇法的手段；和f)制備來自步驟d)中完全或部分恢復的耐藥腫瘤的磨碎的組織勻漿和/或細胞裂解液。在本發(fā)明說明書中，應理解術(shù)語"原發(fā)腫瘤"禾口"原生腫瘤"是等同的，并不區(qū)別使用。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，所述腫瘤細胞系和/或所謂的"原發(fā)"腫瘤選自來自肺部的，而且以非限制性方式，選自結(jié)腸、前列腺、乳腺、卵巢的腫瘤細胞(A549)，或任何治療的耐藥性明確的腫瘤。此外，根據(jù)本發(fā)明所用的抗腫瘤化合物選自化學療法試劑、放射療法試劑、化學分子或抗體，這些不同化合物的全部在本說明說中上述部分定義。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，所述至少一種抗腫瘤化合物為單克隆抗體，所述單克隆抗體更優(yōu)選選自針對生長因子受體、血管生成相關(guān)分子，或細胞遷移現(xiàn)象相關(guān)趨化因子和整合素的抗體或其功能片段。"生長因子受體"是指任何與配基結(jié)合或配基構(gòu)象發(fā)生獨立性變化，或與其它膜蛋白發(fā)生同源或異源二聚作用后介導增殖反應的跨膜蛋白。"血管生成相關(guān)分子"是指任何與配基結(jié)合或配基構(gòu)象發(fā)生獨立性變化，或與其它膜蛋白發(fā)生同源或異源二聚作用后導致血管形成的膜蛋白受體。"細胞遷移現(xiàn)象相關(guān)趨化因子和整合素"是指任何能夠具有分解細胞外基質(zhì)的活性和/或化學-趨化活性的可溶性分子。根據(jù)本發(fā)明的另一具體實施方式，該方法的特征在于所述至少一種抗腫瘤化合物為至少兩種優(yōu)選至少三種特性不同和/或具有不同的作用機制和/或耙點蛋白質(zhì)不同的抗腫瘤化合物的聯(lián)合使用。優(yōu)選地，所述抗腫瘤化合物的聯(lián)合使用是單克隆抗體或其功能片段的聯(lián)合。更優(yōu)選地，所述單克隆抗體或其功能片段的聯(lián)合是選自抗-IGF-IR、抗腸EGFR、抗-Her/2neu、抗-VEGF、抗-VEGFR、抗-CXCR、抗-cMET、抗-RON、Ephrin、抗體等的抗體的聯(lián)合。根據(jù)具體實施方式，作為非限制性舉例，本發(fā)明所述的方法的特征在于所述聯(lián)合是抗-IGF-IR抗體、抗-EGFR抗體和抗-Her/2neu抗體的聯(lián)合，所述提及的抗體優(yōu)選分別構(gòu)成自單克隆抗體7C10、225和h4D5。單克隆抗體7C10為專利申請WO03/059951(于2003年1月20日提交)中所述的抗體，將這些內(nèi)容在此引入以供參考。單克隆抗體225為ATCC保藏的編號為(HB-8508)的雜交瘤產(chǎn)生的抗體。單克隆抗體h4D5為可購得的herceptin，例如從ICR(InstitutClaudiusRegaud)購得。根據(jù)更優(yōu)選具體實施方式，本發(fā)明所述的方法的特征在于通過在未治療的所謂"原發(fā)"腫瘤組織和耐藥腫瘤組織和域誘導形成耐藥的腫瘤組織之間進行鑒別篩選來進行iii)的選擇分泌不識別所謂"原發(fā)"腫瘤細胞抗原的抗體的雜交瘤的步驟。"鑒別篩選"是指通過相對于在形成治療耐受之前出現(xiàn)在細胞上的抗原而言對治療產(chǎn)生耐受可篩選出誘導抗原。優(yōu)選地，鑒別篩選通過實施上述步驟e)的方法而進行。27最后，本發(fā)明所述的最后一個具體實施方式包含在步驟i)之前額外的耐受步驟。"耐受"是指通過使用如環(huán)磷酰胺的免疫抑制性化合物誘導免疫反應的出現(xiàn)。實際上，所述耐受歩驟可構(gòu)成自-用來源于步驟c)的所謂原發(fā)腫瘤獲得的磨碎的組織勻漿和/或懸浮液和/或細胞裂解液給藥，尤其是通過為動物注射的方式給藥；和-用免疫抑制劑處置這些動物以消除通過上述注射歩驟激活的B細胞并因此抑制任何潛在抗所述所謂原發(fā)腫瘤的應答。當然，任何相似的方法或操作，或可獲得相同結(jié)果的手段，應視為與本發(fā)明等同或包含在本發(fā)明中。"免疫抑制劑"是指任何能夠減少免疫系統(tǒng)細胞數(shù)目的物質(zhì)。作為非限制性實施例，可提及環(huán)磷酰胺。在另一方面，本發(fā)明涉及體外制備和選擇能夠抑制腫瘤對抗腫瘤化合物產(chǎn)生耐藥的抗體或其其中一個功能片段的方法或體外制備和選擇針對在對至少一種抗腫瘤化合物耐藥的腫瘤表面表達的腫瘤抗原的抗體或其其中一個功能片段的方法，所述腫瘤抗原參與所述腫瘤對抗腫瘤化合物耐藥性的形成，該方法的特征包含a)體外制備本發(fā)明所述的抗體或其其中一個功能片段的方法，所述抗體針對在耐藥腫瘤表面特異性表達的所述腫瘤抗原，所述腫瘤抗原在形成耐藥腫瘤的原發(fā)腫瘤表面不表達；b)將在步驟a)中獲得的抗體在體外或體內(nèi)與對抗腫瘤化合物耐藥的腫瘤接觸；和c)如果證明了所述抗體對腫瘤對抗腫瘤化合物的耐藥性的抑制性效應，選擇該抗體。根據(jù)另一具體實施方式，為了明確抗腫瘤治療誘導抗原的表達是否參與耐藥現(xiàn)象的形成，可進行體外或體內(nèi)試驗。根據(jù)優(yōu)選具體實施方式，這個步驟可構(gòu)成自體外或體內(nèi)試驗根據(jù)本發(fā)明的抗體對耐藥性腫瘤并觀察耐藥腫瘤的耐藥抑制活性是否形成。在另一方面，本發(fā)明涉及體外制備或選擇能夠表現(xiàn)出抗腫瘤活性，尤其是抑制表達抗體針對的抗原的腫瘤細胞的增殖的抗體或其其中一個功能片段的方法，其特征在于該方法包含a)體外制備抗體或其其中一個功能片段的方法，根據(jù)本發(fā)明，所述抗體針對所述在耐藥腫瘤表面特異性表達的腫瘤抗原，所述腫瘤抗原在產(chǎn)生耐藥腫瘤的原發(fā)腫瘤表面不表達；b)使步驟a)中獲得的抗體在體外或體內(nèi)與其細胞表達所述腫瘤抗原的腫瘤接觸，優(yōu)選與歩驟a)中使用的所述耐藥腫瘤接觸或與具有浸潤表型的腫瘤接觸；禾口c)如果證實所述抗體在該腫瘤上的抗腫瘤效應，尤其是抑制該腫瘤細胞增殖增殖的效應，選擇該抗體。在上文中的方法的歩驟b)中，應理解其細胞表面表達所述腫瘤抗原的腫瘤不必是對已用作制備所述抗體的抗腫瘤化合物耐藥的腫瘤。任何腫瘤，尤其是浸潤表型的腫瘤，其腫瘤細胞表達所述抗體識別的腫瘤抗原可用于步驟b)中。本發(fā)明還明顯地涉及使用上述方法制備治療性和/或診斷性單克隆抗體。本發(fā)明還包括本領(lǐng)域技術(shù)人員為了符合特定標準或而開發(fā)該方法的部分應用或本發(fā)明說明書進行別的相當簡單的改動。根據(jù)本發(fā)明的第三方面關(guān)注通過實施上述本發(fā)明所述的方法而獲得的單克隆抗體或其其中一個功能片段。本發(fā)明在至今沒有描述過具有這種特性的抗體的意義上是革新性的，通過這種方法獲得的這種抗體更加具有革新性。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的所述功能片段選自Fv、scFv、Fab、(Fab')2、Fab'、scFv-Fc片段或雙體，或任何半衰期通過化學修飾，尤其是通PEG化，或通過使其進入溶酶體內(nèi)而延長的功能片段。當然，絕不限于該列表，或應將本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何其它類型的片段視為本發(fā)明的一部分。作為本發(fā)明的示例性例子，下文將描述通過實施本發(fā)明所述的方法獲得的5種抗體。這些命名為1A6、1A9、2E11、3C11禾卩3G7的抗體可以是鼠抗體、嵌合抗體或人源化抗體。根據(jù)第一具體實施方式，本發(fā)明涉及單克隆抗體或其其中一個功能片段，其特征在于包含-包含序列SEQIDNo.1、2禾n3，或優(yōu)化比對后與序列SEQIDNo.1、2和3至少80。/。相同的序列的CDR區(qū)的輕鏈；禾口-包含序列SEQIDNo.4、5禾卩6，或優(yōu)化比對后與序列SEQIDNo.4、5和6至少80M相同的序列的CDR區(qū)的重鏈。本說明書中，術(shù)語"多肽""多肽序列"跟隨抗體化合物或其序列的肽和蛋白質(zhì)可互換。此處應理解本發(fā)明與天然形式的抗體無關(guān)，即不是從天然環(huán)境中提取這些抗體，但是可能從天然來源通過純化分離或獲得，或其它通過基因重組獲得的抗體，或通過化學合成，并且這些抗體可包括下文將描述的非天然氨基酸。CDR區(qū)或CDR是指Kabat等人(Kabat等人，Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thEd"U.S.DepartmentofHealth禾卩HumanServices,NIH,1991，和后來的版本)定義的免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的高度可變區(qū)。該抗體有3個重鏈CDR和3個輕鏈CDR。本文所用的術(shù)語"CDR"的目的是指取決于具體情況，這些區(qū)域中一個或數(shù)個，或全部CDR區(qū)包含形成抗體結(jié)合其識別的抗原或表型的親合力的多數(shù)氨基兩個核酸序列或氨基酸序列之間的"同一性百分數(shù)"在本發(fā)明的意義上講是指兩個在最佳排列(優(yōu)化比對)后獲得的比較序列之間核酸或相同的氨基酸的百分數(shù)，該百分數(shù)純粹通過統(tǒng)計學計算得出，并且兩個序列間的區(qū)別是隨機分布并且遍布其全長。兩條核苷酸序列或蛋白質(zhì)序列之間的序列比較一般通過比較以優(yōu)化方式將其排列后的這些序列而進行，所述比較可通過比較片段或通過"比較窗口"進行。進行比較的序列的優(yōu)化比對可通過Smith和Waterman(1981)[Ad.App.Math.2:482]的局部同源性算法，通過NeddlemanetWunsch(1970)[J.Mol.Biol.48:443]的局部同源性算法，通過Pearson禾PLipman(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444]的相似性査找法，通過使用這些算法的計算機軟件包(GAP,BESTFIT,FASTA和TFASTAintheWisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI,或用比較軟件包BLASTN或BLASTP)進行和人工進行。確定兩條核苷酸或蛋白質(zhì)序列之間的同一性百分數(shù)是通過比較這兩條以比較的核苷酸或蛋白質(zhì)序列可包含相對于兩條序列之間進行優(yōu)化比對的參照序列添加或刪除了核苷酸或氨基酸的優(yōu)化方式排列的序列。通過確定兩個序列之間核苷酸或氨基酸殘基相同的位置的數(shù)目，酸殘基。將這個數(shù)目除以比較窗口中的位置總數(shù)目，然后將所得結(jié)果乘以ioo來獲得同一性百分數(shù)。例如，可以使用BLAST程序"BLAST2序列"((Tatusova等人，"Blast2sequences-anewtoolforcomparingprotein禾口nucleotidesequences",FEMSMicrobiol.Lett.174:247-250)，該程序在http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html站點可以找到，使用設定好的缺省參數(shù)(尤其是參數(shù)"開放空位罰分(opengappenalty)":5，和延伸空位罰分(extensiongappenalty):2，選擇矩陣，例如程序設置的"BLOSUM62"矩陣)兩條進行比較的序列之間的同一性百分數(shù)可直接通過程序計算出來。還可能使用另一種程序如"ALIGN"或"Megalign"(DNASTAR)軟件包。每一條至少與參照氨基酸序列有80%，優(yōu)選有85%、90%、95%和98%的同一性的氨基酸序列，相對于參照序列而言，這些序列中優(yōu)選具有某種修飾的序列，尤其是刪除、添加或取代至少一個氨基酸，平末端或粘末端。就一個或多個連續(xù)或不連續(xù)氨基酸的取代而言，優(yōu)選那些以等價氨基酸替換被取代氨基酸的取代。術(shù)語"等價氨基酸"本文是指能夠被其中一個具有基本機構(gòu)的氨基酸取代而沒有使其相應的抗體的生物學活性發(fā)生實質(zhì)上的變化的任何氨基酸。下面將限定"等價氨基酸"，尤其是在實施例中限定"等價氨基酸"。這些等價氨基酸可通過根據(jù)其與它們被取代的氨基酸的結(jié)構(gòu)同源性，或者根據(jù)被管理的不同抗體之間生物學活性的比較測試的結(jié)果而確定。作為非限制性實施例，表1重復了能夠進行取代而未導致其相應修飾抗體的生物學活性發(fā)生多余變化的可能性，同一條件下可天然地關(guān)注倒轉(zhuǎn)取代。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>Asp(D)GluCys(C)SerGln(Q)AsnGlu(G)AspGly(G)AlaHis(H)ArgUe(I)LeuLeu(L)Ile，Val，MetLys(K)ArgMet(M)LeuPhe(F)TyrPro(P)AlaSer(S)Thr，CysThr(T)SerTrp(W)TyrTyr(Y)Phe，TrpVal(V)Ixu>Ala優(yōu)選地，上述抗體被命名為是1A6抗體，并包含重鏈序列和輕鏈序列，其中重鏈序列包含SEQIDNo.7，輕鏈序列包含序列SEQIDNo.8。更特別的是，本發(fā)明還涉及能夠分泌上述抗體1A6的鼠雜交瘤(1A6)。在本說明書中，無論是指鼠雜交瘤還是這一雜交瘤產(chǎn)生的其它抗體都無區(qū)別地使用同一編號。這種鼠雜交瘤由2006年5月31日保藏在CNCM(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes)，InstitutPasteur,Paris(France)，保藏號為No.1-3612的雜交瘤構(gòu)成。在六個短CDR序列中，重鏈(CDRH3)的第三個CDR的大小變異較大(變異較大主要由于排列基因的機制造成的)。它可短至2個氨基酸，也可長至26個氨基酸。功能上，CDRH3在決定抗體的特異性上發(fā)揮不同的作用(Segal等人,PNAS,71:4298-4302,1974;Amit等人，Science,233:747-753,1986;Chothia等人，J.Mol.Biol,196:901-917,1987;Chothia等人，Nature,32342:877-883,1989;Caton等人，J.Immunol,144:1965-1968,1990;Sharon等人，PNAS,87:4814-4817，1990;Sharon等人，J.Immunol,144:4863-4869,1990;Kabat等人，J.Immunol,147:1709-1719,1991)。已知CDR中僅有小百分數(shù)的氨基酸促進抗體結(jié)合位點的構(gòu)建，然而這些殘基應保持非常特異地三維立體構(gòu)型。根據(jù)第二具體實施方式，本發(fā)明針對單克隆抗體或其其中一個功能片段，該單克隆抗體或其其中一個功能片段的特征在于它包含-輕鏈，其包含的CDR區(qū)序列是SEQIDNo.9、10和11序列或是優(yōu)化比對后與序列SEQIDNo.9、10和11具有至少80%同一性的序列；禾口-重鏈，其包含的CDR區(qū)序列是SEQIDNo.12、13和14序列或是優(yōu)化比對后與序列SEQIDNo.12、13和14具有至少80%同一性的序列。根據(jù)更一具體實施方式，本發(fā)明所述的抗體被命名為1A9，包含重鏈序列(該重鏈序列包含序列SEQIDNo.15)和輕鏈(該輕鏈序列包含序列SEQIDNo.16)。根據(jù)另一方面，要求保護能夠分泌上文限定的抗體鼠雜交瘤(1A9)。最后，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選具體實施方式，涵蓋鼠雜交瘤1A9，其于2006年5月31日保藏在CNCM(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes)，InstitutPasteur,Paris(France),保藏號為No.1-3613。根據(jù)第三具體實施方式，本發(fā)明針對根據(jù)本發(fā)明的方法客體獲得的單克隆抗體或其一個功能片段，該單克隆抗體或其一個功能片段包含-包含CDR區(qū)的輕鏈，其具有序列SEQIDNo.17、18和19或優(yōu)化比對后與序列SEQIDNo.17、18和19具有至少80%同一性的序列；和-包含CDR區(qū)的重鏈，其中包含的CDR區(qū)序列是SEQIDNo.20、21和22序列或是優(yōu)化比對后與序列SEQIDNo.20、21和22具有至少80%同一性的序列。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的抗體，命名為2E11，包含序列SEQIDNo.23的重鏈和包含序列SEQIDNo.24的輕鏈。根據(jù)另一方面，本發(fā)明還包含能夠分泌上述抗體的鼠雜交瘤2E11。更加特別的是，所述鼠雜交瘤是于2006年5月31日保藏在CNCM(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes),InstitutPasteur,Paris(France)保藏號為No.1-3615的雜交瘤。根據(jù)第四具體實施方式，本發(fā)明針對通過上述方法獲得的單克隆抗體或其一個功能片段，其包含-輕鏈，其包含的CDR區(qū)的序列是SEQIDNo.25、26和27的CDR區(qū)或優(yōu)化比對后與序列SEQIDNo.25、26和27具有至少80%同一性的序列；和-重鏈，其包含的CDR區(qū)序列是SEQIDNo.28、29和30序列或是優(yōu)化比對后與序列SEQIDNo.28、29和30具有至少80%同一性的序列。更加特別的是，根據(jù)本發(fā)明所述的抗體，命名為3C11，包含包含序列SEQIDNo.31的重鏈序列和包含序列SEQIDNo.32的輕鏈。根據(jù)另一方面，本發(fā)明還涉及能夠分泌上述抗體的鼠雜交瘤3C11。所述雜交瘤優(yōu)選是于2006年5月31日保藏在CNCM(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes),InstitutPasteur,Paris(France)保藏號為No.1-3614的雜交瘤。最后，根據(jù)本發(fā)明的第五具體實施方式，后者涉及通過實施本發(fā)明所述的方法客體獲得的單克隆抗體或其一個功能片段，其包含-輕鏈，其包含的CDR區(qū)的序列是SEQIDNo.33、34或35的CDR區(qū)或優(yōu)化比對后與序列SEQIDNo.33、34或35具有至少80%同一性的序列；和-重鏈，其包含的CDR區(qū)序列是SEQIDNo.36、37和38序列或是優(yōu)化比對后與序列SEQIDNo.36、37和38具有至少80%同一性的序列。優(yōu)選地，所述抗體(命名為3G7)包含包含SEQIDNo.39的重鏈和包含序列SEQIDNo.40的輕鏈。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，要求保護能夠分泌如上抗體的鼠雜交瘤343G7。所述雜交瘤優(yōu)選是于2006年5月31日保藏在CNCM(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes),InstitutPasteur,Paris(France)保藏號為No.1-3616的鼠雜交瘤。為使其清楚，將其列于下表2中，本發(fā)明所述抗體與所述抗體CDR的各個氨基酸序列之間的對應關(guān)系。2抗體重鏈輕鏈序列號CDR11CDR221A6CDR33CDR14CDR2CDR36CDR19CDR210CDR3111A9CDR112CDR213CDR314CDR117CDR218CDR3192E11CDR120CDR221CDR322CDR125CDR226CDR3273C11CDR128CDR229CDR330CDR133CDR23435<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>當然，將1A6抗體的上述全部修飾特性應用于本發(fā)明所述的其它抗體，并且更特別是應用于1A9、2E11、3C11和3G7抗體。與上述相似的方式也可應用于根據(jù)本發(fā)明所述的方法獲得的任何抗體，同樣尤其是全部所述特征、特性或修飾應被視為也可應用于本發(fā)明鑒定的抗體。更特別的是，特異的是，任何功能片段選自Fv、Fab、(Fab')2、Fab'、scFv、scFv-Fc片段或雙體，或任何半衰期延長的的片段，如PEG化片段。優(yōu)選的是，本發(fā)明所述的抗體優(yōu)選為上述雜交瘤之一，即1-3612、1-3613、1-3614、1-3615或1-3616雜交瘤分泌的抗體或其一個功能片段。根據(jù)本發(fā)明的進一歩具體實施方式，所述抗體是嵌合抗體并進一步包含源自不同于小鼠的其它物種的抗體的恒定輕鏈和重鏈區(qū)。優(yōu)選的是，所述異種物種是人類。更有優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明，所述嵌合抗體或其一個功能片段的特征在于源于人的抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)分別是k和、或y4。最后，甚至更優(yōu)選的是，所述抗體由人源化抗體組成并包含輕鏈和/或重鏈，其中所述輕鏈和/或重鏈的骨架片段FR1-FR4分別來源于人抗體的輕鏈和/或重鏈的骨架片段FR1-FR4。在特定方面，本發(fā)明涉及嵌合抗體或其一個功能片段，根據(jù)本發(fā)明，該嵌合抗體或其一個功能片段的特征在于所述抗體進一步包含源于非小鼠的異種抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)，非小鼠的異種抗體尤其是人的抗體，優(yōu)選源于人的抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)分別是K和Yl、Y2或y4。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述分離的核苷酸的特征在于其選自下列核苷酸a)DNA或RNA核酸，編碼本發(fā)明所述的抗體或其一個功能片段；b)與上述a)的核酸互補的核酸；c)能夠在強烈嚴格條件下與至少一個序列是SEQIDNo.41-46、49-54、57-62、65-70、73-78或是優(yōu)化比對后與序列SEQIDNo.41-46、49-54、57-62、65-70、73-78具有至少80%同一性的序列的CDR雜交的具有至少18個核苷酸的核酸；和d)能夠在強烈嚴格條件下與至少一個序列是SEQIDNo.48、56、64、72或80的輕鏈和/或一個序列是SEQIDNo.47、55、63、71或79的重鏈，或與優(yōu)化比對后與序列SEQIDNo.47、48、55、56、63、64、71、72、79或80具有至少80%同一性的序列雜交的具有至少18個核苷酸的核酸。術(shù)語"核酸"、核序列、核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸序列、核苷酸序列，這些在本發(fā)明說明書中不加區(qū)別地使用的術(shù)語，其目的是指修飾的或未修飾的核苷酸與可限定的核酸片段或核酸區(qū)(包括非天然核苷酸或者不包括非天然核苷酸)、雙鏈DNA、單鏈DNA和所述DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的特異性連接。此處還應理解為本發(fā)明不涉及天然環(huán)境即天然條件下的核酸序列。本發(fā)明涉及的核酸序列是已被分離和/或純化的序列，即直接或間接取樣的序列，例如通過拷貝取樣的序列，這些序列周圍的核苷酸己至少部分修飾過。本發(fā)明還指例如通過宿主細胞方式的基因重組獲得的或通過化學合成獲得的分離的核酸。優(yōu)化比對后，與優(yōu)選序列具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%的同一性百分數(shù)的核序列是指相對于參照核序列而言，具有某些修飾的核序列，這些修飾如特別是缺失、平端、粘端、嵌合融合和/或尤其是點式取代(point-likesubstitution)。優(yōu)選那些編碼與參照序列編碼的氨基酸相同的氨基酸的序列，這些序列涉及能夠與優(yōu)選參照序列在強烈嚴格條件(尤其是下文限定的條件)下發(fā)生特異性雜交的基因密碼或互補序列的降解。強烈嚴格條件下的雜交是指選定的能使雜交在兩條互補性DNA片段間進行的溫度和離子強度條件。作為解釋，為了限定上述多核苷酸片段的目的的雜交步驟的強烈嚴格性條件，優(yōu)選是下列條件。DNA-DNA或DNA-RNA雜交以下列兩步進行(1)于42。C，在含有5xSSC(1xSSC相當于0.15MNaCl+0.015M檸檬酸鹽溶液)的磷酸鹽緩沖液(20mM,pH7.5)、50%甲酰胺、7%十二垸基磺酸鈉(SDS)、10xDenhardt's、5%硫酸葡聚糖和1。/。鮭精DNA中預雜交3小時；(2)實際雜交進行20小時，其雜交溫度條件取決于探針大小(即，對于>100個核苷酸的探針是42°0，接著用2xSSC+2"/。SDS，在20"C洗滌20分鐘共洗滌兩次，再用0.1xSSC+0.1%SDS于2(TC洗滌20分鐘。最后，用0.1xSSC+0.ie/。SDS于6(TC洗滌一次30分鐘，洗除>100個核苷酸的探針。根據(jù)Sambrook等人(1989,Molecularcloning:alaboratorymanual.2ndEd.ColdSpringHarbor)的教程，上述大小確定的38多核苷酸的強烈嚴格雜交條件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來講也適用于大或小的寡核甘酸。為更清楚起見，本發(fā)明所述的抗體之間的對應關(guān)系，更特別是，抗體的CDR序列以及可變鏈與其核苷酸序列之間的對應關(guān)系還詳見下表5<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>CDR375CDR176CDR277CDR3781A6完整47完整481A9完整55完整562E11完整63完整643C11完整71完整723G7完整79完整80本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明所述的核酸的載體。本發(fā)明尤其針對包含本發(fā)明所述的核酸序列的克隆和/或表達載體。根據(jù)本發(fā)明所述的載體優(yōu)選包括能核酸序列在確定的宿主細胞內(nèi)表達和/或分泌的元件。載體應包括啟動子(起始和終止翻譯的信號)和適合的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)。它應能以穩(wěn)定的方式在宿主細胞內(nèi)保留，并可可能含有負責翻譯后蛋白質(zhì)的分泌的特定信號。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)所用的宿主細胞選擇和優(yōu)化不同元件。為了實現(xiàn)這一目的，可將本發(fā)明所述的核酸序列插入選定宿主體內(nèi)的自我復制載體中或是選定宿主的整合載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用當前方法制備這種載體，而且所得克隆可通過標準方法，如通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、熱休克法或化學方法引入合適的宿主體內(nèi)。本發(fā)明所述的載體，例如是質(zhì)?；虿《緛碓吹妮d體?？蓪⑦@些載體轉(zhuǎn)化宿主細胞以克隆和表達本發(fā)明所述的核酸序列。本發(fā)明還包含以本發(fā)明所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞或包含本發(fā)明所述的載體的宿主細胞。40宿主細胞可選自真核或原核系統(tǒng)，例如細菌細胞、酵母細胞或動物細胞，尤其是哺乳動物細胞。也可使用昆蟲細胞或植物細胞。本發(fā)明還涉及除人以外的包含本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化細胞的動物。另一方面，本發(fā)明的目標是制備本發(fā)明所述的抗體或其一個功能片段的方法，該方法的特征在于包含下列步驟a)在合適的培養(yǎng)條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明所述的宿主細胞；和b)回收所述抗體或其一個功能片段，因此從培養(yǎng)基或所述培養(yǎng)細胞中制備得到。可在制備本發(fā)明所述的重組多肽的方法中使用轉(zhuǎn)化細胞。制備本發(fā)明所述的重組形式的多肽的方法(其特征在于使用的本發(fā)明所述的載體和/或轉(zhuǎn)化了載體的細胞)本身包含在本發(fā)明內(nèi)。優(yōu)選地，在可允許表達所述多肽和回收所述重組肽的條件下培養(yǎng)本發(fā)明所述的經(jīng)載體轉(zhuǎn)化的細胞。如上所述，宿主細胞可選自原核或真核系統(tǒng)。尤其是那些有可能使本發(fā)明所述的核酸易于分泌和鑒定的原核或真核系統(tǒng)。因此?？蓪⒈景l(fā)明所述的帶有這種序列的載體優(yōu)選用于制備分泌型重組蛋白。的確，這些目的重組蛋白由于其存在于細胞培養(yǎng)上清液中而不是存在于宿主細胞內(nèi)的事實而使其純化過程更加容易。也可通過化學合成制備本發(fā)明所述的多肽。這種制備方法也是本發(fā)明的目標，本領(lǐng)域技術(shù)人員了解化學合成方法，例如使用固相合成技術(shù)的化學合成方法(尤其見于Steward等人，Solidphasepeptidessynthesis,PierceChem.Company,Rockford,111,2nded.，(1984))或使用在標準溶液中濃縮片段或合成的部分固相合成技術(shù)的化學合成方法?；瘜W合成獲得的多肽和可包括相應的非天然氨基酸的多肽也包含在本發(fā)明中。能夠通過本發(fā)明所述的方法獲得的抗體或其一個功能片段也包含在本發(fā)明中。雙特異性或雙功能抗體形成第二代單克隆抗體，其中在同一個分子中組合了兩個不同的可變區(qū)(Hollinger和Bohlen，1999，Cancerandmetastasisrev.18:411-419)。既在診斷又在治療領(lǐng)域驗證了它們的應用，因為它們募集新效應子功能的能力或靶向腫瘤細胞表面幾個分子的能力。這些抗體可通過化學方法獲得(GlennieMJ等人，1987，J.Immunol.139,2367-2375;ReppR,等人，1995，J.Hemat.377-382)或體細胞(StaerzU.D.禾口BevanM丄,1986,PNAS83,1453-1457;SureshM.R.等人，1986,MethodEnzymol.,121:210-228)也可優(yōu)選通過遺傳工程技術(shù)獲得，遺傳工程中可強制進行異二聚體化，其促進目標抗體的純化方法(Merchand等人，1998，NatureBiotech"16:677-681)。這些雙特異性抗體可構(gòu)建為完整IgG，作為雙特異性Fab'2，作為Fab'PEG或作為二體或甚至是作為雙特異性scFv，但也可作為四價雙特異性抗體或者是存在針對每個靶抗原的結(jié)合位點(Park等人，2000,Mol.Immunol"37(18):1123-30)或其片段(如上所述)除了由生產(chǎn)和使用雙特異性抗體比制備兩條特異性抗體更加低廉這一事實產(chǎn)生的經(jīng)濟效益外，使用這種雙特異性抗體還具有治療毒性減輕的益處。的確，使用雙特異性抗體，有可能使全球循環(huán)抗體用量和可能因此引起的毒性反應下降。在本發(fā)明優(yōu)選具體實施方式中，雙特異性抗體是二價或四價抗體。實際中，使用四價雙特異性抗體的好處是與二價抗體相比由于針對每個靶蛋白具有兩個結(jié)合位點而具有更強的親合力。與選擇上述抗體的功能片段相似，所述第二種模式選自Fv、Fab、(Fab')2、Fab'、Fab'PEG、scFv、scFv-Fc片段和雙體或任何半衰期可能延長的形式。另一方面，本發(fā)明的目標是用作藥物的本發(fā)明所述的抗體或其功能片段(優(yōu)選上文限定的人源化抗體)。"抗體"在本說明書中的下文中，既指應用本發(fā)明上述方法獲得的抗體也指選自已鑒定并命名的抗體1A6、1A9、2E11、3C11或3G7。本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含由本發(fā)明所述的抗體或其一個功能片段的化合物作為活性成分和優(yōu)選加入藥學上可接受的賦形劑和/或載體。更加特別的是，本發(fā)明涵蓋組合物，其包含如上所述的或雜交瘤1-3612、1-3613、1-3614、1-3615或1-3616產(chǎn)生的抗體或其一個功能片段的化合物作為活性成分。根據(jù)另一具體實施方式，本發(fā)明還涉及上述藥物組合物，該藥物組合物進一步包含聯(lián)合使用化學療法制劑、放射療法制劑或抗體的產(chǎn)42物，該產(chǎn)物可使化學療法制劑、放射療法制劑或抗體同時使用、分開使用、或隨時間延伸。"同時使用"是指使用兩種包含在一個或相同藥物劑型中的本發(fā)明所述的組合物的化合物。"分開使用"是指在同一時間使用兩種包含在不同藥物劑型中的本發(fā)明所述的組合物的化合物。"隨時間延伸"是指連續(xù)使用兩種每種包含在不同藥物劑型中的本發(fā)明所述的組合物的化合物。化學療法制劑是指任何出現(xiàn)在本發(fā)明說明書的上文中的定義或列表中列出的化合物。尤其是在優(yōu)選的具體實施方式中，所述作為本發(fā)明所述的聯(lián)合產(chǎn)物的組合物的特征在于所述細胞毒性制劑與所述抗體形成化學偶聯(lián)以用于同時給藥。尤其在是優(yōu)選的具體實施方式中，所述根據(jù)本發(fā)明的組合物的特征在于所述細胞毒性/細胞生長抑制性制劑選自抑制或穩(wěn)定紡錘體的制劑，優(yōu)選長春瑞濱(vinorelbine)和/或長春氟寧(vinflunine)。為了易化所述細胞毒性制劑與所述本發(fā)明所述抗體之間的偶聯(lián)，尤其可在兩個偶聯(lián)的化合物之間引入間隔分子，如多烯基乙二醇如聚乙烯乙二醇或甚至是氨基酸，或者在另一具體實施方式中，可使用所述細胞毒性制劑的活性衍生物，其中可引入能夠與根據(jù)本發(fā)明所述的抗體反應的功能。這些偶聯(lián)技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的，而且本發(fā)明說明書并未將其發(fā)展。本發(fā)明的另一方面還涉及特征在于至少一種所述抗體或其一個功能片段與細胞毒性和/或放射性元素結(jié)合的組合物。優(yōu)選地，所述毒性是來自腸道細菌的毒素，尤其是來自假單胞菌屬(/^eMt/o附o"as)的夕卜毒素A。與本發(fā)明所述的至少一種抗體或其一種功能片段結(jié)合的毒素或放射性元素是指任何手段所述毒素或所述放射性元素可結(jié)合至所述至少一種抗體，尤其通過化合物與共價偶聯(lián)，引入或沒有引入結(jié)合分子。另一種偶聯(lián)形式可以是使用離子螯合劑以產(chǎn)生非共價性絡合作用，如例如EDTA、DOTA或者甚至是"mTc型化合物。同樣優(yōu)選的是，所述至少一種形成根據(jù)本發(fā)明所述的結(jié)合的抗體選自其功能片段，尤其是從其元件Fc如scFv片段上分離下來的片段。本發(fā)明進一步包含本發(fā)明所述的組合物用于制備藥物的用途。本發(fā)明的目標還是上述抗體或甚至是通過本發(fā)明所述的和上述方法獲得的抗體在用于制備旨在預防或治療癌癥的藥物中的用途。本發(fā)明的目標還是上述抗體或甚至是通過本發(fā)明所述的和上述方法獲得的抗體在用于制備旨在抑制腫瘤對患有在本專利預防和治療的癌癥范圍內(nèi)的癌癥的患者接受抗腫瘤治療后產(chǎn)生的耐藥性的藥物中的用途。優(yōu)選地，所述癌癥是耐藥類型的癌癥，其選自結(jié)腸、前列腺、乳腺、肺、卵巢或胰腺癌。根據(jù)本發(fā)明的另一具體實施方式，本發(fā)明還要求保護本發(fā)明所述的抗體或其一個功能片段在制備旨在將生物學活性化合物對耐藥腫瘤和/或晚期腫瘤進行特異性靶向治療的藥物中的用途。例如，標定的本發(fā)明所述的抗體或其一個功能片段包括所謂的免疫交聯(lián)抗體，后者可例如與如過氧化物酶、堿性磷酸酶、(X-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰膽堿酯酶、溶菌酶、蘋果酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶交聯(lián)，或與如生物素、異羥洋地黃毒苷配基(digoxigenin)或5-溴脫氧尿嘧啶核苷的分子交聯(lián)。熒光標記物也可與本發(fā)明所述的抗體或其一個功能片段偶聯(lián)，而且這些熒光標記物尤其包括熒光素及其衍生物、熒光鉻(fluorochromium)、若丹明(rhodamine)及其衍生物、GFP(綠色熒光蛋白)、丹酰、傘形酮(umbelliferone)等。在這種結(jié)合物內(nèi)，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知方法制備本發(fā)明所述的抗體或其一個功能片段。后者可直接或經(jīng)間隔基團或結(jié)合基團如多聚醛如戊二醛、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DPTA)或者在如高碘酸(periodate)等偶聯(lián)劑存在條件下與酶或熒光標記物偶聯(lián)。包括熒光素型標記物的結(jié)合分子可通過與異硫氰酸鹽(isothiocyanate)反應而制備。其它結(jié)合分子還包括化學發(fā)光標記物，如魯米諾(luminol)和二環(huán)氧丙垸(dioxetane)，生物發(fā)光標記物，如熒光素酶、熒光素或甚至放射活性標記物。生物活性化合物本文是指任何能夠調(diào)節(jié)，尤其是能夠抑制細胞活性，特別是抑制細胞的生長、增殖、基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的化合物。在本說明書中，藥學上可接受的載體是指進入組合物的化合物或化合物的組合，其不引起二級反應而且使用它可使活性化合物的給藥例如更容易、在機體中的半衰期更長和/或更有效，在溶液中的溶解性增加或者甚至更易于保存。這些藥學上可接受的載體是熟知的且可根據(jù)所選化合物的本性和施用方法由本領(lǐng)域技術(shù)人員來進行改變。優(yōu)選地，這些化合物可系統(tǒng)給藥，特別是經(jīng)靜脈途徑、經(jīng)肌肉、真皮、腹膜內(nèi)或皮下途徑、或口服系統(tǒng)給藥。更加優(yōu)選的是，包含本發(fā)明所述的抗體的組合物將重復給藥，使藥物長期逐步分布。它們的給藥、劑型和優(yōu)化的蓋侖學派形式(galenicform)可根據(jù)制定適合患者的治療方案時通?？紤]的條件而確定，這些條件如例如適合患者年齡或體重、她/他的疾病的嚴重程度、對治療的耐受性和報導的二級反應。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢將出現(xiàn)在
發(fā)明內(nèi)容后的實施例和包括標題的附圖和中。最后，根據(jù)本發(fā)明的最后一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明所述的方法的用于鑒定新的參與形成耐藥現(xiàn)象的治療性和/或診斷性的細胞內(nèi)或細胞外耙點的用途。最后，所述鑒定新的參與形成耐藥現(xiàn)象的治療性和/或診斷性的細胞內(nèi)或細胞外靶點的方法的特征在于其由應用根據(jù)本發(fā)明的上述方法以獲得單克隆抗體，和然后鑒定化合物，尤其是所述單克隆抗體識別的蛋白質(zhì)組成。這種化合物，尤其是鑒定蛋白質(zhì)的鑒定可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何技術(shù)進行，如例如通過細胞裂解液的免疫沉淀作用和/或免疫純化作用，和通過與標準蛋白質(zhì)組技術(shù)偶聯(lián)的Western-blot技術(shù)的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)。附圖標題和其后的實施例旨在解釋本發(fā)明而絕不限制其范圍。圖1:圖1說明了了h4D5、225和7C10三聯(lián)療法之后的腫瘤體積的時程，并表明對該治療的耐藥性的出現(xiàn)。圖2:圖2以第一示例性形式說明了了本發(fā)明的具體實施方式的解45釋性線圖。1:取樣對照腫瘤、分成兩部分。2:小鼠耐受性。制備免疫接種細胞裂解、細胞懸浮液等。通過腹腔注射(i.p.)環(huán)磷酰胺或其它至耐受劑產(chǎn)生免疫耐受。3:篩選IHC玻片將腫瘤冰凍或包埋。制備標記為"陰性對照玻片"的玻片。4:耐藥腫瘤取樣并分成兩部分。5:制備免疫接種細胞裂解、細胞懸浮液等。6:將腫瘤冰凍或包埋制備標記為"試驗玻片"的玻片。7:對照腫瘤取樣。8:免疫接種小鼠細胞的制備來自對照腫瘤。9:對照IHC玻片。10:通過注射免疫抑制劑產(chǎn)生免疫耐受。11:血清取樣以核實缺乏抗原發(fā)細胞的免疫應答。12:取樣耐藥腫瘤。13:免疫接種耐受小鼠細胞的制備來自耐藥腫瘤。14:試驗IHC玻片。15:取樣標記為IHC腫瘤對耐藥腫瘤的血清。16:雜交瘤的分泌在對照腫瘤的玻片上不標記、在耐藥腫瘤上陽性標記(在間質(zhì)細胞玻片上不標記，在腫瘤細胞上標記)。圖3:圖3也說明了但以簡圖形式解釋本發(fā)明所述方法的具體實施方式。圖4:圖4說明了以用于耐受和免疫接種的腫瘤制備的"組織芯片"類型的載玻片上本發(fā)明所述抗體的表達圖譜。圖5:圖5說明了在結(jié)腸異種移植物模型HT29中抗體1A6和2E11的抗腫瘤活性的數(shù)值。圖6:圖6分別表明抗體1A6、1A9、2E11、3C11和3G7的重鏈和輕鏈序列。各個CDR有下劃線，并字體加粗。圖7:圖7說明了在胰腺異種移植物模型BxPC3中抗體2E11的抗腫瘤活性的數(shù)值。實施例1:證明腫瘤細胞A549對抗-IGF-IR、抗EGFR和抗46Her/2neu三聯(lián)療法產(chǎn)生耐藥將A549細胞移植至小鼠體內(nèi)。腫瘤植入后，一周兩次，以含有每種下列抗體，即h4D5(赫塞汀(herceptin)由ICR(InstitutClaudeRegaud、servicepharmacie、20-24、rueduPontSaint-Pierre、31052Toulouse提供)、225(ATCCNo.HB-8508)和7C10，各300昭的混合物處理小鼠。處理一星期后，在某些小鼠體內(nèi)可觀察到腫瘤生長減慢直至腫瘤完全消失。盡管全部腫瘤或部分腫瘤生長減慢，仍持續(xù)處理。接著，盡管持續(xù)進行治療，仍觀察到腫瘤復發(fā)，這表明腫瘤對三聯(lián)療法已經(jīng)產(chǎn)生耐藥。圖1中顯示了一個例子，其表明腫瘤在第15天前生長減慢，但從第15天起腫瘤復發(fā)，這提示了耐藥性的產(chǎn)生。實施例2:制備針對參與對抗-IGF-IR、EGFR和Her/2neu聯(lián)合療法耐藥的耐藥性形成的抗原的活性單克隆抗體將A549細胞移植入兩批10只小鼠體內(nèi)。第一批兩周一次接受PBS注射。第二批分別聯(lián)合使用直接抗IGF-IR、EGFR和Her/2neu受體的抗體(7C10、225和h4D5)處理。這種抗體的聯(lián)合使用使腫瘤退化，導致60%的被處理動物的腫瘤消失。盡管效果明顯，但所有動物均出現(xiàn)腫瘤復發(fā)。當以PBS處理的動物體內(nèi)的A549腫瘤長至100-200mm3時，將其切除。將這些腫瘤，每個分成兩部分一部分冰凍以制備"組織芯片"類型的免疫組織化學玻片，另一部分用于使BALB/c小鼠產(chǎn)生耐受。耐受通過腹腔注射磨碎的腫瘤細胞勻漿，接著使用環(huán)磷酰胺而進行，并為了完全消除直接抗未處理的"原生"A549腫瘤的免疫應答。在腫瘤復發(fā)過程中，也在腫瘤達到100至200mr^的體積時取樣，然后將其分成兩等份。一份冰凍用于制備PBS對照腫瘤的上述"組織芯片"類型的免疫組織化學玻片。將第二份制成磨碎的勻漿并將用于為之前以未處理的A549腫瘤使其耐受的小鼠進行免疫接種。所有這些小鼠均接受3次腹腔注射三聯(lián)療法耐藥腫瘤的磨碎的勻漿，佐劑注射首次使用以完全弗氏(Freund's)佐劑注射，接著用不完全弗氏佐劑注射。然后進行細胞融合并用用免疫組織化學的方法在之前制備的"組織芯片"型玻片上篩選從此融合產(chǎn)生的雜交瘤。將分泌識別耐藥組織的，既不識別來自對照批PBS組織中的腫瘤組織，也不識別用于體內(nèi)形成腫瘤組織的原發(fā)A549細胞的抗體的雜交瘤克隆和冰凍。抗體于是在腹水中產(chǎn)生，經(jīng)純化、并在體內(nèi)在表達抗體識別的表面結(jié)構(gòu)或抗原的細胞(這些細胞在經(jīng)FACSCAN進行非排除性的分泌每種抗體的腫瘤細胞系組的分析之前進行選擇)上進行檢測之前進行免疫組織學再檢測。圖4表明固定抗體的圖譜。下表6將這些抗體(以FACSCAN儀器進行組織學選擇的抗體識別不同細胞系)識別的細胞分組。表6雜交瘤克隆同種型體內(nèi)模型1A6C7IgMkMCF/Colo205D10LnCap/HT291A9EllIgGlkHepG2/H69/LnCapFl2E11A2IgGlkHT29/BxPC3/H69Bll2E11A8IgGlkHT29/BxPC3/H69B93C11E8IgMkColo205E93G7A7IgMDU145B2實施例3:以結(jié)腸異種移植物模型制備的本分泌所述抗體(更特別是1A6和2E11)抗腫瘤活性的評價將5.106HT29細胞移植入"瑞士裸鼠"體內(nèi)。移植5天后，測定腫瘤并根據(jù)同質(zhì)腫瘤大小將鼠分成3批，每批6只。以PBS(陰性對照)或0.5mglA6或2E11抗體一周3次處理小鼠(初次注射劑量1mg/只)。兩周一次跟蹤腫瘤體積，已知腫瘤體積根據(jù)下列公式(兀/6)48x(l)x(L)x(e)進行常規(guī)計算,其中1=測定寬度，L4則定長度，e^則定厚結(jié)果如圖5所示。可將HT29細胞視為易于轉(zhuǎn)移的表型的細胞。獲得的結(jié)果證明，可能將直接抗腫瘤細胞抗原的抗體(該腫瘤細胞抗原來自以抗腫瘤組合物(見實施例2)處理并對其產(chǎn)生耐藥的腫瘤)用作治療具有易于轉(zhuǎn)移表型的腫瘤的抗腫瘤化合物。該實驗獲得的結(jié)果證實制備抗體的原始方法和自耐藥誘導小鼠制備治療用途的抗體的概念。該方法可與任何其它藥物聯(lián)合使用，后者包括化學療法藥物，單獨或聯(lián)合使用或與抗體或與酪氨酸激酶抑制劑或與蛋白水解酶抑制劑，以同樣的方式接續(xù)使用。實施例4:抗體2E11自胰腺異種移植物模型BxPC3制備的本發(fā)明所述的抗體2E11的抗治療活性的評價。將10.106BxPC3細胞移植入無胸腺"裸"鼠體內(nèi)。移植5天后，測定腫瘤，并將小鼠根據(jù)同質(zhì)腫瘤的大小分成兩批，每批6只。分別以PBS(陰性對照)或抗體2E11(1mg/次)一周兩次處理小鼠。一周兩次跟蹤腫瘤體積。結(jié)果如圖7所示。該實驗獲得的結(jié)果證實抗體2E11的功能活性，還證實了自耐藥誘導小鼠制備治療用途的抗體的概念。49權(quán)利要求1、來自對至少一種抗腫瘤化合物耐藥的腫瘤的磨碎的組織勻漿和/或懸浮液和/或細胞裂解液在免疫接種和體外制備針對腫瘤抗原的抗體或該抗體的一個功能片段中的用途，其中腫瘤抗原為所述耐藥腫瘤的腫瘤細胞表面表達的腫瘤抗原，該腫瘤抗原在產(chǎn)生耐藥腫瘤的原發(fā)腫瘤的腫瘤細胞表面不表達，并且該腫瘤抗原可能參與所述耐藥腫瘤對抗腫瘤化合物耐藥的耐藥性的形成。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述耐藥腫瘤是通過對正在接受或已經(jīng)接受以至少一種已誘導耐藥性的抗腫瘤化合物進行的治療性處置的患者進行活檢和/或手術(shù)時直接獲得的。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述耐藥腫瘤是通過下述方法誘導產(chǎn)生的將腫瘤細胞系和/或全部或部分的人的腫瘤移植到動物體內(nèi)，然后注射至少一種期望其誘導產(chǎn)生耐藥性的抗腫瘤化合物而處理動物。4、根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的用途，其特征在于所述至少一種抗腫瘤化合物選自化學療法制劑、放射療法制劑、激素療法制劑、如酪氨酸激酶抑制劑的化學分子或抗體。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所述至少一種抗腫瘤化合物由至少兩種，優(yōu)選至少三種，不同特性和/或具有不同作用機制和/或具有不同靶蛋白的化合物構(gòu)成。6、一種體外制備針對對至少一種抗腫瘤化合物耐藥的腫瘤表面表達的腫瘤抗原的抗體或抗體的一個功能片段的方法，該方法包含直接用來自所述耐藥腫瘤的磨碎的組織勻槳懸浮液和/或細胞裂解液免疫動物的步驟，和選擇識別耐藥腫瘤而不識別產(chǎn)生耐藥腫瘤的原發(fā)腫瘤的抗體的步驟。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述免疫接種通過腹腔注射和/或皮下注射和/或靜脈注射和/或脾內(nèi)注射進行。8、根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述耐藥腫瘤是直接通過對即將或己經(jīng)接受至少一種誘導腫瘤產(chǎn)生耐藥性的所述抗腫瘤化合物的治療性處置的患者進行的活檢和/或手術(shù)而獲得。9、根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述耐藥腫瘤通過將腫瘤細胞系和/或全部或部分的人的腫瘤移植到動物體內(nèi)，然后對動物使用期望其誘導原發(fā)腫瘤產(chǎn)生耐藥性的抗腫瘤化合物而誘導產(chǎn)生。10、根據(jù)權(quán)利要求6至9任一項所述的方法，其特征在于所述針對所述耐藥腫瘤表面表達的腫瘤抗原的抗體或該抗體的一個功能片段是單克隆抗體。11、根據(jù)權(quán)利要求6至10任一項所述的方法，其特征在于所述抗體或該抗體的一個功能片段是選自IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的免疫球蛋白。12、根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于所述抗體或該抗體的一個功能片段是Yl、或Y4同種型IgG。13、根據(jù)權(quán)利要求6至12任一項所述的方法，其特征在于所述功能片段選自Fv、Fab、(Fab')2、Fab'、scFv、scFv-Fc片段或雙體，或任何半衰期延長的片段，如PEG化片段。14、根據(jù)權(quán)利要求6至13任一項所述的方法，其特征在于其包含下列步驟i)以來自耐藥腫瘤的磨碎的組織勻漿和/或懸浮液和/或細胞裂解液直接免疫動物；ii)將步驟i)的免疫動物的脾細胞與骨髓瘤細胞融合以獲得雜交瘤；和iii)通過鑒別選擇法選擇分泌特異性識別在耐藥腫瘤的腫瘤細胞表面表達并且其表達被抗腫瘤治療誘導的抗原的抗體的雜交瘤。15、根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于在步驟i)之前，該方法進一步包含下列步驟a)選擇腫瘤細胞系和/或全部或部分的原生腫瘤，并將其移植入動物體內(nèi)；b)以至少一種抗腫瘤化合物處理部分該移植動物；c)自步驟a)中接受移植但未接受處理的動物體內(nèi)取出全部或部分的原生腫瘤；d)自歩驟b)中接受處理的動物體內(nèi)取出全部或部分耐藥腫瘤；e)制備鑒別選擇分別來自步驟c)和d)中取出的全部或部分腫瘤的抗體的手段；和f)制備步驟d)中取出的全部或部分耐藥腫瘤的磨碎的組織勻漿和/或細胞裂解液。16、根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于所述細胞系和/或原生腫瘤選自肺、結(jié)腸、前列腺、乳腺、卵巢腫瘤細胞或任何明確對治療耐藥的腫瘤。17、根據(jù)權(quán)利要求6至16中任一項所述的方法，其特征在于所述至少一種抗腫瘤化合物選自化學療法制劑、放射療法制劑、激素療法制劑、如酪氨酸激酶抑制劑的化學分子或抗體。18、根據(jù)權(quán)利要求6至17中任一項所述的方法，其特征在于所述至少一種抗腫瘤化合物優(yōu)選為單克隆抗體。19、根據(jù)權(quán)利要求6至18中任一項所述的方法，其特征在于所述抗體是單克隆抗體，并且該抗體選自針對生長因子受體、血管生成相關(guān)分子、或甚至是細胞遷移現(xiàn)象相關(guān)的趨化因子和整合素的抗體或該抗體的功能片段。20、根據(jù)權(quán)利要求6至19中任一項所述的方法，其特征在于所述至少一種抗腫瘤化合物為聯(lián)合使用至少兩種，優(yōu)選至少三種，不同特性和/或具有不同作用機制和/或耙蛋白不同的抗腫瘤化合物的化合物。21、根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其特征在于所述聯(lián)合使用抗腫瘤化合物為聯(lián)合使用單克隆抗體或其功能片段。22、根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其特征在于所述聯(lián)合使用單克隆抗體或其功能片段為聯(lián)合使用選自抗-IGF-IR、抗-EGFR、抗-Her/2neu、抗-VEGF、抗-VEGFR、抗-CXCR、抗-cMET或抗-RON抗體的抗體。23、根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其特征在于所述聯(lián)合用藥為聯(lián)合使用抗-IGF-IR抗體、抗-EGFR抗體和抗-Her/2neu抗體。24、根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其特征在于所述聯(lián)合用藥為聯(lián)合使用單克隆抗體7C10、225和h4D5。25、根據(jù)權(quán)利要求14至24中任一項所述的方法，其特征在于所述選擇分泌不識別原發(fā)腫瘤細胞抗體的雜交瘤的步驟iii)是通過在分泌識別原發(fā)腫瘤的抗原的抗體的雜交瘤和分泌識別耐藥腫瘤的抗原的抗體的雜交瘤之間進行鑒別篩選而完成。26、根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于所述鑒別篩選通過實施權(quán)利要求15所述的方法的步驟e)獲得的手段而完成。27、根據(jù)權(quán)利要求15至26中任一項所述的方法，其特征在于其在步驟O之前包含額外的耐受步驟。28、根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于所述耐受步驟構(gòu)成如下-對動物使用獲自來自步驟C)的所謂"原發(fā)"腫瘤的磨碎的組織勻漿和/或懸浮液和/或細胞裂解液；和-以免疫抑制劑處理這些動物，以去除在先給藥步驟激活的B細胞并借此抑制任何潛在抗所謂"原發(fā)"腫瘤的免疫應答。29、一種體外制備和選擇能夠抑制腫瘤對于抗腫瘤化合物產(chǎn)生耐藥性的抗體或該抗體的一個功能片段的方法，或一種體外制備和選擇針對對至少一種抗腫瘤化合物耐藥的腫瘤表面表達的參與所述腫瘤對抗腫瘤化合物產(chǎn)生耐藥性的腫瘤抗原的抗體或該抗體的一個功能片段的方法，其特征在于該方法包含a)—種體外制備抗體或該抗體的一個功能片段的方法，根據(jù)權(quán)利要求6至26中任一項，所述抗體針對所述在耐藥腫瘤表面特異性表達的腫瘤抗原，所述腫瘤抗原在形成耐藥腫瘤的原發(fā)腫瘤的細胞表面不表達；b)使步驟a)中獲得的抗體于體外或體內(nèi)與對抗腫瘤化合物耐藥的腫瘤相接觸；和c)如果證實了所述抗體對于腫瘤對抗腫瘤化合物的耐藥性的抑制性效應，選擇該抗體。30、如權(quán)利要求6至29中任一項所述的方法在用于制備治療性和/或診斷性單克隆抗體中的用途。31、一種通過實施根據(jù)權(quán)利要求14至29中任一項所述的方法而獲得的單克隆抗體或該抗體的一個功能片段。32、根據(jù)權(quán)利要求31所述的單克隆抗體，其特征在于所述功能片段選自Fv、Fab、(Fab')2、Fab'、scFv、scFv-Fc片段、雙體，或任何半衰期延長的片段，如PEG化片段。33、根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的單克隆抗體或該抗體的一個功能片段，其特征在于包含-輕鏈，其包含序列為SEQIDNo.1、2禾n3的CDR區(qū)，或包含經(jīng)優(yōu)化比對后與序列SEQIDNo.1、2和3具有至少80%同一性的序列的CDR區(qū)；和-重鏈，其包含序列為SEQIDNo.4、5和6的CDR區(qū)，或包含經(jīng)優(yōu)化比對后與序列SEQIDNo.4、5和6具有至少80%同一性的序列的CDR區(qū)。34、如權(quán)利要求33所述的命名為1A6的抗體，其特征在于其包含包含序列SEQIDNo.7的重鏈序列，和包含序列SEQIDNo.8的輕鏈。35、一種能夠分泌如權(quán)利要求33或34所述的抗體的鼠雜交瘤。36、根據(jù)權(quán)利要求35所述的鼠雜交瘤，其保藏在CNCM(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes),InstitutPasteur,Paris(France),保藏日期為2006年5月31日，保藏號為No.I-3612.37、根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的單克隆抗體或該抗體的一個功能片段，其特征在于包含一輕鏈，其包含序列為SEQIDNo.9、10和11的CDR區(qū)，或包含經(jīng)優(yōu)化比對后與序列SEQIDNo.9、10和11具有至少80%同一性的序列的CDR區(qū)；禾口-重鏈，其包含序列為SEQIDNo.12、13和14的CDR區(qū)，或包含經(jīng)優(yōu)化比對后與序列SEQIDNo.12、13和14具有至少80%同一性的序列的CDR區(qū)。38、如權(quán)利要求37所述的命名為1A9的抗體，其特征在于包含包含序列SEQIDNo.15的重鏈序列，和包含序列SEQIDNo.16的輕鏈。39、一種能夠分泌如權(quán)利要求37或38任一項所述的抗體的鼠雜交瘤。40、根據(jù)權(quán)利要求39所述的鼠雜交瘤，其保藏在CNCM(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes),InstitutPasteur,Paris(France)，保藏日期為2006年5月31日，保藏號為No.I-3613。41、根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的單克隆抗體或該抗體的一個功能片段，其特征在于包含-輕鏈，其包含序列為SEQIDNo.17、18和19的CDR區(qū)，或包含經(jīng)優(yōu)化比對后與序列SEQIDNo.17、18和19具有至少80%同一性的序列的CDR區(qū)；和-重鏈，其包含序列為SEQIDNo.20、21和22的CDR區(qū)，或包含經(jīng)優(yōu)化比對后與序列SEQIDNo.20、21和22具有至少80%同一性的序列的CDR區(qū)。42、如權(quán)利要求41所述的命名為2E11的抗體，其特征在于包含包含序列SEQIDNo.23的重鏈序列，和包含序列SEQIDNo.24的輕鏈。43、一種能夠分泌如權(quán)利要求41或42所述的抗體的鼠雜交瘤。44、根據(jù)權(quán)利要求43所述的鼠雜交瘤，其保藏在CNCM(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes),InstitutPasteur,Paris(France),保藏日期為2006年5月31日，保藏號為No.1-3615。45、根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的單克隆抗體或該抗體的一個功能片段，其特征在于包含-輕鏈，其包含序列為SEQIDNo.25、26和27的CDR區(qū)，或包含經(jīng)優(yōu)化比對后與序列SEQIDNo.25、26和27具有至少80%同一性的序列的CDR區(qū)；禾口-重鏈，其包含序列為SEQIDNo.28、29和30的CDR區(qū)，或包含經(jīng)優(yōu)化比對后與序列SEQIDNo.28、29和30具有至少80%同一性的序列的CDR區(qū)。46、如權(quán)利要求45所述的命名為3C11的抗體，其特征在于包含包含序列SEQIDNo.31的重鏈序列，和包含序列SEQIDNo.32的輕鏈。47、一種能夠分泌如權(quán)利要求45或46所述抗體的鼠雜交瘤。48、根據(jù)權(quán)利要求47所述的鼠雜交瘤，其保藏在CNCM(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes),InstitutPasteur,Paris(France),保藏日期為2006年5月31日，保藏號為No.1-3614。49、根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的單克隆抗體或該抗體的一個功能片段，其特征在于包含-輕鏈，其包含序列為SEQIDNo.33、34和35的CDR區(qū)，或包含經(jīng)優(yōu)化比對后與序列SEQIDNo.33、34和35具有至少80%同一性的序列的CDR區(qū)；禾口-重鏈，其包含序列為SEQIDNo.36、37和38的CDR區(qū)，或包含經(jīng)優(yōu)化比對后與序列SEQIDNo.36、37和38具有至少80%同一性的序列的CDR區(qū)。50、如權(quán)利要求49所述的命名為3G7的抗體，其特征在于包含包含序列SEQIDNo.39的重鏈序列，和包含序列SEQIDNo.40的輕鏈。51、一種能夠分泌如權(quán)利要求49或50所述抗體的鼠雜交瘤。52、根據(jù)權(quán)利要求51所述的鼠雜交瘤，其保藏在CNCM(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes),InstitutPasteur,Paris(France),保藏日期為2006年5月31日，保藏號為No.I-3616。53、如權(quán)利要求31-34、37、38、41、42、45、46、49或50所述的抗體，其特征在于所述功能片段選自Fv、Fab、(Fab')2、Fab'、scFv、scFv-Fc片段、雙體，或任何半衰期延長的片段，如PEG化片段。54、一種抗體或該抗體一個功能片段，其特征在于所述抗體選自如權(quán)利要求36、40、44、48或52所述的雜交瘤。55、根據(jù)權(quán)利要求31-34、37、38、41、42、45、46、49或50任一項所述的抗體或該抗體的一個功能片段，其特征在于所述抗體是嵌合抗體并進一步包含源自不同于小鼠的異種物種抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)。56、根據(jù)權(quán)利要求55所述的抗體或該抗體的一個功能片段，其特征在于所述抗體是嵌合抗體并且所述異種物種是人類。57、根據(jù)權(quán)利要求56所述的抗體或該抗體的功能片段，其特征在于源于人類抗體的輕鏈和重鏈的恒定區(qū)分別是K和y1、W或y4區(qū)。58、根據(jù)權(quán)利要求55至57中任一項所述的嵌合抗體或該抗體的功能片段，其特征在于所述抗體是人源化抗體并包含，其中所述輕鏈和/或重鏈的骨架片段FR1-FR4源于人抗體的輕鏈和/或重鏈的骨架片段FR1-FR4。59、一種分離的核酸，其特征在于選自下列核酸a)編碼如權(quán)利要求33、34、37、38、41、42、45、46、49或50所述的抗體或該抗體的功能片段的核酸、DNA或RNA;b)與a)限定的核酸互補的核酸；c)含有能夠在強烈嚴格條件下與序列SEQIDNo.41-46、49-54、57-62、65-70、73-78或經(jīng)優(yōu)化比對后與序列SEQIDNo.41-46、49-54、57-62、65-70、73-78具有至少80%同一性的序列的至少一個CDR區(qū)雜交的至少18個核苷酸的核酸；和d)含有能夠在強烈嚴格條件下與具有序列SEQIDNo.48、56、64、72或80的至少一個輕鏈雜交，和/或與一個具有序列SEQIDNo.47、55、63、71或79的重鏈雜交，或與經(jīng)優(yōu)化比對后與序列SEQIDNo.47、48、55、56、63、64、71、72、79或80具有至少80%同一性的序列雜交的至少18個核苷酸的核酸。60、一種包含如權(quán)利要求59所述的核酸的載體。61、一種包含如權(quán)利要求60所述的載體的宿主細胞。62、一種除外人類的包含以權(quán)利要求61所述的載體轉(zhuǎn)化的細胞的轉(zhuǎn)基因動物。63、一種制備如權(quán)利要求33、34、37、38、41、42、45、46、49或50所述的抗體或該抗體的一個功能片段的方法，其特征在于該方法包含下列步驟a)在培養(yǎng)基中在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求61所述的細胞；和b)通過該方法自培養(yǎng)基中或所述培養(yǎng)細胞中提取產(chǎn)生的所述抗體或該抗體的一個功能片段。64、一種用作藥物的如權(quán)利要求31-34、37、38、41、42、45、46、49、50或53-58中任一項所述的抗體或該抗體的一個功能片段。65、一種包含以由如權(quán)利要求31-34、37、38、41、42、45、46、49、50、53-58或64任一項所述的或如權(quán)利要求35、36、39、40、43、44、47、48、51或52任一項所述的雜交瘤產(chǎn)生的抗體或該抗體的一個功能片段構(gòu)成的化合物作為活性成分的組合物。66、根據(jù)權(quán)利要求65所述的組合物，其特征在于該組合物進一步包含聯(lián)合使用化學療法制劑、放射療法制劑或抗體的用于同時、分開使用或使其長期逐步分布的產(chǎn)品。67、一種作為藥物的如權(quán)利要求65或66所述的組合物。68、如權(quán)利要求64所述的抗體和/或如權(quán)利要求67所述的組合物在制備旨在預防或治療癌癥的藥物中的用途。69、根據(jù)權(quán)利要求68所述的用途，其特征在于所述癌癥是選自結(jié)腸、前列腺、乳腺、肺、卵巢或胰腺癌癥的耐藥類型的癌癥。70、如權(quán)利要求31-34、37、38、41、42、45、46、49、50、53-58或64任一項所述的抗體或該抗體的一個功能片段或如權(quán)利要求35、36、39、40、43、44、47、48、51或52任一項所述的雜交瘤產(chǎn)生的抗體，在制備旨在特異性以形成腫瘤耐藥的和/或在晚期階段發(fā)現(xiàn)的生物學活性化合物為靶點的藥物中用途。71、一種方法鑒定參與耐藥現(xiàn)象形成的新的細胞內(nèi)或細胞外的治療性和/或診斷性耙點的方法，其特征在于該方法由實施如權(quán)利要求1至29中任一項所述的方法以獲得單克隆抗體，然后通過所述單克隆抗體鑒定其識別的蛋白質(zhì)構(gòu)成。全文摘要本發(fā)明涉及來自對至少一種抗腫瘤化合物耐藥的腫瘤的磨碎組織勻漿和/或懸浮液和/或細胞裂解液在免疫接種和體外制備針對腫瘤抗原的抗體或其功能片段之一中的用途，該腫瘤抗原在所述耐藥腫瘤表面特異性表達并可能參與形成所述耐藥腫瘤的耐藥性。更特別地，本發(fā)明涉及通過方法所獲得的這樣的抗體，例如抗體1A6、1A9、2E11、3C11和3G7，以及其用于治療癌癥的用途。文檔編號C07K16/00GK101516394SQ200780035523公開日2009年8月26日申請日期2007年9月27日優(yōu)先權(quán)日2006年9月28日發(fā)明者A·茹阿諾,L·哥徹申請人:皮埃爾法布雷醫(yī)藥公司