專(zhuān)利名稱(chēng)：：禽類(lèi)衍生的紅細(xì)胞生成素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入禽類(lèi)細(xì)胞以及使外源遺傳物質(zhì)在禽類(lèi)細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明特別涉及轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)，包括雞、鵪鶉和火雞，還涉及所產(chǎn)禽蛋中含有外源性蛋白質(zhì)，如藥用蛋白質(zhì)的禽類(lèi)。背景很多天然和合成的蛋白質(zhì)已用于診斷和治療性應(yīng)用；很多其他蛋白質(zhì)正處于開(kāi)發(fā)或臨床試驗(yàn)階段?，F(xiàn)有的蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法包括從天然來(lái)源中分離以及在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中重組生產(chǎn)。然而，因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法的復(fù)雜性和高成本，人們正在開(kāi)發(fā)其他的方法。例如，已報(bào)道了在豬、綿羊、山羊和牛的奶中生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)的方法。這些方法有幾個(gè)局限性，包括創(chuàng)始動(dòng)物和產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物群體之間長(zhǎng)時(shí)間傳代次數(shù)，大量的管理和醫(yī)療成本，以及由于基因組中轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)的位置效應(yīng)所致表達(dá)水平的變化。也正在利用大麥和黑麥的碾磨和麥芽工藝生產(chǎn)蛋白質(zhì)。然而，植物的翻譯后修飾與脊椎動(dòng)物的翻譯后修飾有所不同，這種不同常對(duì)外源蛋白質(zhì)如藥用蛋白質(zhì)的功能產(chǎn)生決定性影響。如組織培養(yǎng)和乳腺生物反應(yīng)器一樣，禽類(lèi)的輸卵管也可能作為生物反應(yīng)器。修飾禽類(lèi)遺傳物質(zhì)使得輸卵管中高水平分泌外源蛋白質(zhì)并包裝于禽蛋中的方法成功使得能便宜地生產(chǎn)大量蛋白質(zhì)。這種方法有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)a)減少了傳代次數(shù)(24周)和通過(guò)人工授精可快速建立轉(zhuǎn)基因群體；b)容易通過(guò)增加群體大小擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模以滿(mǎn)足產(chǎn)品需求；C)所表達(dá)蛋白質(zhì)可經(jīng)歷翻譯后修飾；4)可自動(dòng)喂養(yǎng)和收集蛋；d)卵清天然無(wú)菌；和e)由于卵清中蛋白質(zhì)的濃度高從而降低了工藝成本。禽類(lèi)包括雞的生殖系統(tǒng)已有很好的描述。母雞的蛋由經(jīng)過(guò)輸卵管時(shí)被分泌于卵黃上的幾層組成。蛋的產(chǎn)生開(kāi)始于母雞卵巢中大卵黃的形成。然后未受精的卵母細(xì)胞定位于卵黃囊上部。卵巢排卵或釋放卵黃后，卵母細(xì)胞進(jìn)入輸卵管漏斗，如果出現(xiàn)精子則在此處受精。然后移動(dòng)到有管狀腺細(xì)胞排列的輸卵管蛋白分泌部(magnum)。這些腺體細(xì)胞可向蛋白分泌部腔中分泌卵清蛋白質(zhì)，包括卵白蛋白、溶菌酶、卵類(lèi)粘蛋白、伴白蛋白和卵粘蛋白，在腔中這些蛋白質(zhì)沉積于禽胚胎和卵黃上。卵白蛋白基因編碼一種在輸卵管蛋白分泌部管狀腺細(xì)胞中特異表達(dá)的45kD的蛋白質(zhì)(Beato，Ce〃56:335-344(1989))。卵白蛋白是含量最豐富的卵清蛋白質(zhì)，占管狀腺細(xì)胞產(chǎn)生的總蛋白質(zhì)的50%以上，或每個(gè)大A級(jí)蛋約有4克蛋白質(zhì)(Gilbert，"蛋的白蛋白及其形成"，P/z"/o/ogy朋t/5/oc/zem/^o;o///zeDcweW/cFcnW，Bell禾口Freeman主編，學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress),倫敦，紐約，1291-1329頁(yè))。1291-1329)。已經(jīng)克隆和分析了卵白蛋白基因及其各個(gè)側(cè)翼區(qū)20kb以上的序列(Lai等，/V。c.淑/.爿cW.Sc/.USA75:2205-2209(1978);Gannon等，A^wre278:428-424(1979);Roop等，Ce〃19:63-68(1980);和Royal等，淑訓(xùn)279:125-132(1975))。對(duì)卵白蛋白基因的調(diào)控給予了很大關(guān)注。該基因響應(yīng)甾體激素，例如雌激素、糖皮質(zhì)激素和黃體激素，這些激素可誘導(dǎo)未成熟仔雞每個(gè)管狀腺細(xì)胞累積產(chǎn)生約70,000個(gè)卵白蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄物，和誘導(dǎo)成熟產(chǎn)蛋母雞每個(gè)管狀腺細(xì)胞100,000個(gè)卵清蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄物(Palmiter，乂B/o/.C/zem.248:8260-8270(1973);Palmiter,CW/4:189-197(1975))。轉(zhuǎn)染的管狀腺細(xì)胞中的DNA酶超敏性分析和啟動(dòng)子一報(bào)告基因試驗(yàn)確定，7.4kb的區(qū)域含有卵白蛋白基因表達(dá)所需的序列。此5'側(cè)翼區(qū)含有四個(gè)從中心算起距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-0.25、-0.8、-3.2和-6.0kb的DNA酶I超敏感位點(diǎn)。這些位點(diǎn)分別稱(chēng)為HS-I、-11、-III禾tl-IV。這些區(qū)域反映了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，并且與輸卵管細(xì)胞中卵白蛋白基因的表達(dá)特異性相關(guān)(Kaye等，五7kffiO3:1137-1144(1984))。HS-II和-III的超敏性是雌激素誘導(dǎo)的，支持了這些區(qū)域在卵白蛋白基因表達(dá)的激素誘導(dǎo)中具有作用(的觀點(diǎn))。HS-I和-II是卵白蛋白基因轉(zhuǎn)錄的甾體誘導(dǎo)所必需的，在移植的管狀腺細(xì)胞中，含有這些元件的5'區(qū)的一個(gè)1.4kb部分足以驅(qū)動(dòng)甾體依賴(lài)的卵清蛋白表達(dá)(Sanders和McKnight,27:6550-6557(1988))。6550-6557(1988))。HS-I稱(chēng)為負(fù)響應(yīng)元件("NRE")，因?yàn)樗袔讉€(gè)在缺少激素時(shí)能抑制卵白蛋白表達(dá)的負(fù)調(diào)控元件(Haekers等，^fo/.9:1113-1126(1995))。蛋白因子結(jié)合于這些元件，包括一些只在輸卵管核中發(fā)現(xiàn)的因子，提示這些因子在組織特異性表達(dá)中有作用。HS-II稱(chēng)為甾體依賴(lài)的響應(yīng)元件("SDRE")，因?yàn)樗鼘?duì)啟動(dòng)甾體誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄是必需的。"它可結(jié)合稱(chēng)為Chirp-I的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合體。Chirp-受雌激素誘導(dǎo)并在環(huán)己胺的存在下迅速轉(zhuǎn)換(Dean等，Mo/.Ce〃.腸/.16:2015-2024(1996))。利用移植的管狀腺細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)確定了一套附加的以甾體依賴(lài)方式結(jié)合SDRE的因子，包括NFkB類(lèi)似因子(Nordstrom等，從歷o/.C/ze肌268:13193-13202(1993);Schweers禾BSanders,C/ze肌266:10490-10497(1991))。10490-10497(1991))。關(guān)于HS-III和-IV的功能了解極少。HS-III包括功能性雌激素響應(yīng)元件，當(dāng)它與雌激素受體cDNA共轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞時(shí)使卵清蛋白近端啟動(dòng)子或異源啟動(dòng)子具有雌激素誘導(dǎo)性。這些數(shù)據(jù)提示，HS-III可能在卵白蛋白基因的總體調(diào)控中起功能性作用。關(guān)于HS-IV的功能了解很少，只知道它不含有功能性雌激素響應(yīng)元件(Kato等，C"/68:731-742(1992))。731-742(1992))。通過(guò)導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)和/或打斷特定基因來(lái)修飾真核基因組引起了人們很大的興趣。己證明某些真核細(xì)胞可能是生產(chǎn)外源性真核蛋白質(zhì)的優(yōu)良宿主。導(dǎo)入編碼某些蛋白質(zhì)的基因還可能產(chǎn)生具有更高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的新表型。此外，通過(guò)導(dǎo)入能使遺傳缺陷型細(xì)胞表達(dá)其不能產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的外源基因，可治療一些遺傳疾病。最后，通過(guò)插入或去除遺傳物質(zhì)對(duì)動(dòng)物基因組進(jìn)行修飾，有助于基因功能的基礎(chǔ)研究，并可能最終導(dǎo)入用于治療疾病的基因，或者改進(jìn)動(dòng)物的表型。己用幾種不同的方法實(shí)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因。第一，在哺乳動(dòng)物包括小鼠、豬、山羊、綿羊和牛中，將轉(zhuǎn)基因顯微注射入受精卵的原核，然后將受精卵放于代孕母體的子宮內(nèi)，在其中受精卵發(fā)育成其種系中攜帶有轉(zhuǎn)基因的創(chuàng)始動(dòng)物。用工程方法改造的轉(zhuǎn)基因攜帶有含特定調(diào)控序列指導(dǎo)外源蛋白質(zhì)在特定類(lèi)型細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。因?yàn)檗D(zhuǎn)基因是隨機(jī)插入基因組的，所以轉(zhuǎn)基因插入基因組位點(diǎn)的位置效應(yīng)可能不同程度地引起轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的下降。該方法還要求對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行鑒定，以使指導(dǎo)在所需類(lèi)型細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的必要序列得以確定并包含在轉(zhuǎn)基因載體中(Hogan等，V、Jt^齡潔作IMam》w/a"'"gAeMow"Em6o;o人冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(ColdSpringHarborLaboratory),紐約(1988))。產(chǎn)生動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的第二種方法是靶向基因打斷，該方法中，將含有側(cè)接有選擇標(biāo)記基因的目的基因序列的靶向載體導(dǎo)入胚胎干("ES")細(xì)胞。通過(guò)同源重組，該靶向載體替代了目的基因序列在染色體上的位置或插入序列內(nèi)部阻止目標(biāo)基因產(chǎn)物的表達(dá)。選出含有正確打斷的基因的ES細(xì)胞克隆，然后將其注射入早期胚泡產(chǎn)生嵌合性創(chuàng)始動(dòng)物，其中一些創(chuàng)始動(dòng)物種系中含有該轉(zhuǎn)基因。如果該轉(zhuǎn)基因刪除了目標(biāo)基因座，則該目標(biāo)基因座被轉(zhuǎn)基因載體中的外源DNA所替代，該外源DNA含有編碼用于選擇培養(yǎng)中經(jīng)轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞的選擇性標(biāo)記基因的DNA，還可能含有編碼外源蛋白質(zhì)的插入并替代被刪除基因，以使目標(biāo)基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)該外源基因表達(dá)的DNA序列(美國(guó)專(zhuān)利5,464,764和5,487,992(M.P.Capecchi和K.R.Thomas))。i亥方法的局限性在于，ES細(xì)胞在很多動(dòng)物中是不能獲得的，包括山羊、牛、綿羊和豬。而且，當(dāng)被刪除的基因?qū)τ谠撋锘蚣?xì)胞型的生存或正常發(fā)育是必需時(shí)，此法不可行。最近，禽類(lèi)轉(zhuǎn)基因的發(fā)展已使我們可對(duì)禽類(lèi)基因組進(jìn)行修飾?？蓪?fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒注射入新產(chǎn)蛋的雞胚盤(pán)胚下腔中產(chǎn)生種系轉(zhuǎn)基因雞(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,162,215;Bosselman等，Sc/e臟243:533-534(1989);Thoraval等，Trawgem'cie化arc/z4:369-36(1995))?？蓪⒑型庠椿虻哪孓D(zhuǎn)錄病毒核酸隨機(jī)插入胚胎細(xì)胞的染色體中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中一些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物種系中攜帶有轉(zhuǎn)基因。己有描述利用該插入融合基因構(gòu)建物5，或3'區(qū)的絕緣子元件來(lái)克服插入位點(diǎn)的位置效應(yīng)(Chim等，Ce〃74:504-514(1993))。在另一種方法中，將轉(zhuǎn)基因顯微注射入受精卵胚盤(pán)中產(chǎn)生穩(wěn)定的能將該基因傳遞給Fl代的轉(zhuǎn)基因創(chuàng)始禽(Love等，12:60-63(1994))。然而，該方法有幾點(diǎn)不足。為收集受精卵必須犧牲母雞，轉(zhuǎn)基因創(chuàng)始禽的份數(shù)低，注射的卵需要在代孕殼中花費(fèi)大量勞動(dòng)力體外培養(yǎng)。在另一種方法中，將含有假定的原生殖細(xì)胞("PGC")的胚盤(pán)細(xì)胞從供體卵切下，用轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染并導(dǎo)入受體胚的胚下腔。將該轉(zhuǎn)染的供體細(xì)胞摻入受體胚產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚，預(yù)期其中一些胚的種系中含有該轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因通過(guò)非同源重組隨機(jī)插入染色體位點(diǎn)。然而，用該方法還沒(méi)有產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因創(chuàng)始禽類(lèi)。Lui，戶(hù)oWf.Sc/.68:999-1010(1995)，用含有卵黃原蛋白基因側(cè)接DNA序列的靶向載體刪除培養(yǎng)的雞胚盤(pán)細(xì)胞的部分固有基因。然而，還沒(méi)有證明這些細(xì)胞有助于形成種系并因此產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚。此外，當(dāng)被刪除的基因?qū)τ谠撋锘蚣?xì)胞型的生存或正常發(fā)育是必需的，此法不可行。因此可見(jiàn)，需要一種能將可操作性連接有合適啟動(dòng)子的外源DNA導(dǎo)入禽類(lèi)基因組中以實(shí)現(xiàn)外源基因有效表達(dá)的方法。而且，需要?jiǎng)?chuàng)建能在輸卵管中表達(dá)外源基因并將表達(dá)的外源蛋白質(zhì)分泌到蛋中的種系修飾的轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)。1957年發(fā)現(xiàn)干擾素時(shí)，它作為一種重要的抗病毒制劑受到歡迎。70年代后期，干擾素開(kāi)始與重組基因技術(shù)相結(jié)合。今天，干擾素是癌癥生物過(guò)程的復(fù)雜性以及對(duì)付這種復(fù)雜性的忍耐性和持久性?xún)r(jià)值的象征。引起癌癥的異?；虬ㄖ辽偃N類(lèi)型第一種是癌基因，當(dāng)其改變時(shí)促進(jìn)癌癥特征性的異常生長(zhǎng)和分裂。第二，腫瘤抑制基因，當(dāng)其改變時(shí)不能控制這種異常生長(zhǎng)和分裂。第三，DNA修復(fù)基因，當(dāng)其改變時(shí)不能修復(fù)致癌的突變。研究者推測(cè)體內(nèi)大約有30-40種腫瘤抑制基因，分別編碼產(chǎn)生蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)可能受到"主"腫瘤抑制蛋白質(zhì)例如Rb(成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤，首先與其相關(guān)聯(lián))和p53(與很多不同的腫瘤相關(guān))的控制。實(shí)驗(yàn)室證據(jù)提示，僅使這些腫瘤抑制基因之一回復(fù)到正常功能就可顯著降低惡性腫瘤的侵襲性。發(fā)現(xiàn)干擾素可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，激起了科學(xué)家們對(duì)干擾素的極大興趣。另外，還發(fā)現(xiàn)干擾素對(duì)免疫系統(tǒng)有某些正面作用?，F(xiàn)在認(rèn)為干擾素與腫瘤抑制蛋白質(zhì)類(lèi)似它能抑制細(xì)胞尤其是惡性細(xì)胞的生長(zhǎng)；阻抑許多癌基因和生長(zhǎng)因子的作用；與其他生物制劑不同，它能抑制對(duì)于癌轉(zhuǎn)移過(guò)程很關(guān)鍵的細(xì)胞遷移。細(xì)胞間通信依賴(lài)于組織中所有結(jié)構(gòu)組分發(fā)揮正常功能，信息通過(guò)以下結(jié)構(gòu)組分傳遞基質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞骨架以及細(xì)胞自身。在癌中，細(xì)胞間的通信網(wǎng)絡(luò)受到破壞。如果細(xì)胞骨架被破壞，信息就不能傳輸?shù)胶酥?，核開(kāi)始功能異常。因?yàn)楹耸前┗蚧蚰[瘤抑制基因開(kāi)啟或關(guān)閉的部位，這種功能異?？蓪?dǎo)致惡性腫瘤。當(dāng)發(fā)生這種情況時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始不規(guī)則生長(zhǎng)并且不分化。它們還可能開(kāi)始移動(dòng)并打擾其它細(xì)胞。據(jù)認(rèn)為干擾素可能與其他細(xì)胞外或細(xì)胞物質(zhì)協(xié)同，恢復(fù)平衡和自身穩(wěn)定，確保信息正確傳輸。干擾素抑制生長(zhǎng)、抑制遷移、通過(guò)粘附分子增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)環(huán)境響應(yīng)的能力。它還糾正細(xì)胞骨架的缺陷和損傷。已發(fā)現(xiàn)干擾素可阻抑新血管形成，新血管形成的起始步驟是惡性腫瘤生長(zhǎng)非常所必需的。而且，它能阻抑纖維化，纖維化是對(duì)刺激很多不同類(lèi)型細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)所致傷害的一種反應(yīng)，(KathrynL.Hale，0"co/og，干擾素一種生物治療的演化，對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的新看法)。干擾素是當(dāng)動(dòng)物細(xì)胞受到病毒侵犯時(shí)產(chǎn)生的，被釋放到血流或細(xì)胞間的液體中，誘導(dǎo)健康的細(xì)胞產(chǎn)生抗擊感染的酶。很多年以來(lái)，用于研究的人干擾素的供應(yīng)受到高成本提取技術(shù)的限制。然而1980年，通過(guò)遺傳工程可獲得更大量這種蛋白質(zhì)(即這種蛋白質(zhì)的重組形式)?？茖W(xué)家們還確定體內(nèi)可產(chǎn)生三種不同類(lèi)型的干擾素，分別稱(chēng)為a、(3和Y干擾素。起初認(rèn)為干擾素是高度物種特異性的，但是現(xiàn)在知道，各種干擾素可能在其他物種里具有不同的活性范圍。a干擾素(a-IFN)已被批準(zhǔn)用于毛細(xì)胞白血病和丙型肝炎的治療。還發(fā)現(xiàn)a-IFN對(duì)肝癌和肝硬化主要原因的慢性乙型肝炎和生殖道疣及一些罕見(jiàn)的血和骨髓癌癥有效。含有a-IFN的鼻噴霧劑可提供抗鼻病毒引起的感冒的某些保護(hù)力。人a-IFN屬于一個(gè)細(xì)胞外信號(hào)傳遞蛋白質(zhì)家族，具有抗病毒、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)活性。IFN-a蛋白質(zhì)由人9號(hào)染色體上成簇的13個(gè)基因組成的多基因家族編碼。白細(xì)胞中大多數(shù)IFN-a基因受仙臺(tái)(Sendai)病毒誘導(dǎo)在mRNA水平上表達(dá)。另外，還發(fā)現(xiàn)在蛋白質(zhì)水平至少能產(chǎn)生九種不同亞型的蛋白質(zhì)。表達(dá)幾種類(lèi)似的IFN-a蛋白質(zhì)的生物學(xué)意義還不知道，然而，認(rèn)為它們?cè)诳共《?、生長(zhǎng)抑制和自殺細(xì)胞刺激活性方面具有劑量上不相同的模式?，F(xiàn)在，兩種IFN-a變體，IFN-a2a和IFN-a2b，已通過(guò)重組技術(shù)在大腸桿菌中大量生產(chǎn)并投入市場(chǎng)作為藥物。與天然的IFN-a不同，已發(fā)現(xiàn)這些重組的IFN-a產(chǎn)品在某些患者中具有免疫原性，這可能是因?yàn)镮FN-a蛋白質(zhì)的非天然形式所致。因此，對(duì)于IFN-a藥物的發(fā)展，不但需要鑒定正常人白細(xì)胞中表達(dá)的IFN-a亞型和變體，而且需要特征分析它們可能的翻譯后修飾(Nyman等(1998)五w,J.5/oc/em.253:485-493)。Nyman等(見(jiàn)上)研究了天然人IFN-a的糖基化。他們發(fā)現(xiàn)，仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)后白細(xì)胞產(chǎn)生的九種亞型中有兩個(gè)是糖基化的，稱(chēng)為IFN-al4c和IFN-a2b，與以前的研究一致。IFN-ccl4是唯一一個(gè)有潛在N-糖基化位點(diǎn)的IFN-a亞型，所述潛在糖基化位點(diǎn)為Asn2和Asn72，但實(shí)際上只有Asn72發(fā)生糖基化。IFN-a2在蘇氨酸106(Thrl06)位發(fā)生O-糖基化。令人感興趣的是，其他的IFN-a亞型在這個(gè)位置不含有Thr。在該研究中，Nyman等釋放和分離了這些寡糖鏈并用質(zhì)譜法和特異性糖苷酶消化分析了它們的結(jié)構(gòu)。IFN-a2b禾卩IFN-al4c在反相高效液相色譜(RP-HPLC)中均解析為三個(gè)峰。對(duì)RP-HPLC產(chǎn)生的IFN-a2b諸組分做電噴離子質(zhì)譜(ESI-MS)分析顯示它們的分子量有所不同，提示這些組分代表了不同的糖形。各組分釋放的O—聚糖的質(zhì)譜分析證實(shí)了這一點(diǎn)。據(jù)估計(jì)，IFN-a2b含有約20。/。的核心2型五糖，約50%雙唾酸化和30%單唾酸化的核心1型聚糖。Nyman等的數(shù)據(jù)與以前的IFN-a2b糖基化的部分特征一致(Adolf等，(1991)5/oc/zem.J276:511-518)。IFN-al4c禾BIFN-a2b中糖基化的作用還不是很清楚。根據(jù)Nyman等(見(jiàn)上)，碳?xì)滏湆?duì)于其生物活性不重要，但是糖基化可能會(huì)影響該蛋白質(zhì)的藥物動(dòng)力學(xué)和穩(wěn)定性。人類(lèi)基因組中至少有15種功能基因編碼IFN-a家族的蛋白質(zhì)。氨基酸序列相似性一般在90%的范圍內(nèi)，這些分子在結(jié)構(gòu)上緊密相關(guān)。IFN-a蛋白質(zhì)含有166個(gè)氨基酸(IFN-a2除外，它有165個(gè)氨基酸)，特征是含有四個(gè)保守的可形成兩個(gè)二硫鍵的半胱氨酸殘基。諸IFN-a類(lèi)的特征為弱酸性，缺少天門(mén)冬酰胺相連的糖基化識(shí)別位點(diǎn)(IFN-a14除外，它含有天門(mén)冬酰胺相連的糖基化識(shí)別位點(diǎn))。已知有三種IFN-a2變體，它們?cè)诘?3位和34位上氨基酸不同IFN-a2a(Lys-23,His-34)、IFN-a2b(Arg-23，His-34)和IFN-a2c(Arg-23,Arg-34)。認(rèn)為IFN-a2a和IFN-a2c是IFN-a2b的等位基因變體。參見(jiàn)Gewert等(1993)J.InterferonRes.第13巻，第227-231頁(yè)。預(yù)計(jì)不同種類(lèi)的IFN-a2在氨基酸含量上的微小差異不會(huì)影響該干擾素的糖基化。就是說(shuō)，預(yù)計(jì)IFN-a2a、2b和2c的糖基化模式基本相同。兩種其它人IFN種類(lèi)，即IFN-wl和IFN-p是N-糖基化的，與IFN-a關(guān)系更遠(yuǎn)。IFN-a、-卩、-co總稱(chēng)為I類(lèi)IFN，它們能結(jié)合相同的高親和性細(xì)胞膜受體(Adolf等，(1991)，所oc/zemJ,276:511-518)。Adolf等(見(jiàn)上)利用單克隆抗體的特異性從人白細(xì)胞IFN中分離得到了天然的IFN-a2。他們通過(guò)免疫親和層析得到了具有期望的抗病毒活性純度95%的IFN-a2蛋白質(zhì)。用反相HPLC分析天然的IFN-a2表明，該天然蛋白質(zhì)可以分辨為兩種成分，這兩種成分的親水性均比大腸桿菌產(chǎn)生的IFN-a2高。SDS/PAGE顯示，該蛋白質(zhì)在分子質(zhì)量上也是異質(zhì)性的，可產(chǎn)生三條帶，所有條帶的電泳遷移率都低于相等的大腸桿菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。Adolf等(見(jiàn)上)還推測(cè)天然的IFN-a2攜帶有O-連接的糖殘基。用堿切割假定的多肽-糖鍵斷裂，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是均質(zhì)的并且與重組蛋白質(zhì)的分子量相同，證實(shí)了他們的假說(shuō)。在蛋白水解斷裂后，分離和分析產(chǎn)生的片段，將天然和重組的蛋白質(zhì)作進(jìn)一步比較，使他們確定了一種候選的糖肽。該多肽的序列分析鑒定了Thr-106為O-糖基化位點(diǎn)。所有已發(fā)表的IFN-a2種類(lèi)的氨基酸序列比較顯示，這個(gè)蘇氨酸殘基是IFN-a2獨(dú)有的。在其他所有IFN蛋白質(zhì)中的相應(yīng)位置上(107)為甘氨酸、異亮氨酸或谷氨酸。大腸桿菌產(chǎn)生的IFN-a2制品缺少O-糖基化并且己在很多國(guó)家注冊(cè)為藥物。然而，缺少糖基化可能會(huì)影響治療應(yīng)用的大腸桿菌產(chǎn)生的IFN-a2的免疫原性。研究顯示，16位接受酵母生產(chǎn)的重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的患者中，4位產(chǎn)生了該蛋白質(zhì)的抗體。令人感興趣的是，發(fā)現(xiàn)這些抗體能與在內(nèi)源性粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子中受O-連接的糖基化保護(hù)但在該重組因子中暴露的表位反應(yīng)(Adolf等，見(jiàn)上)。類(lèi)似地，描述了在患者長(zhǎng)期治療之后誘導(dǎo)了針對(duì)重組大腸桿菌IFN-a2的抗體，據(jù)推測(cè)，天然IFN-a2比重組IFN-a2蛋白質(zhì)的免疫原性低(Galton等，(1989)Lancet2:572-573)。需要能產(chǎn)生治療或藥用的蛋白質(zhì)，如抗體和細(xì)胞因子，包括干擾素、G-CSF和紅細(xì)胞生成素的改進(jìn)方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供用于將外源核酸序列穩(wěn)定導(dǎo)入禽類(lèi)基因組以表達(dá)外源序列來(lái)改變禽類(lèi)表型或產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的載體和方法。具體說(shuō)，生產(chǎn)了在輸卵管中表達(dá)外源序列并使外源蛋白質(zhì)如藥用蛋白質(zhì)沉積到蛋中的轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)。本發(fā)明包括含有這類(lèi)外源蛋白質(zhì)的禽蛋。本發(fā)明還提供了治療性蛋白質(zhì)(如人類(lèi)細(xì)胞因子)的新形式，包括在轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)輸卵管中有效表達(dá)并沉積到禽蛋中的干擾素、G-CSF、G-MCSF和紅細(xì)胞生成素。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)(如，人蛋白質(zhì))，如禽類(lèi)產(chǎn)生的細(xì)胞因子。在一個(gè)具體方面，本發(fā)明涉及具有一種糖基化模式的人紅細(xì)胞生成素(如，家禽產(chǎn)生的紅細(xì)胞生成素)，其中所述紅細(xì)胞生成素獲自轉(zhuǎn)基因雞、轉(zhuǎn)基因鵪鶉或轉(zhuǎn)基因火雞的禽細(xì)胞。本發(fā)明也包括人蛋白質(zhì)，包括禽類(lèi)產(chǎn)生的分離或純化形式且出現(xiàn)在藥物組合物中的細(xì)胞因子，如紅細(xì)胞生成素?？赏ㄟ^(guò)蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易了解的方法分離包含紅細(xì)胞生成素的本發(fā)明重組蛋白質(zhì)。用于產(chǎn)生藥物組合物的配方組成是本領(lǐng)域眾所周知的。在一個(gè)實(shí)施方式中，包含紅細(xì)胞生成素的本發(fā)明蛋白質(zhì)具有獲自家禽或禽類(lèi)輸卵管細(xì)胞，例如管狀腺細(xì)胞(如雞的管狀腺細(xì)胞)的糖基化模式。本發(fā)明的一個(gè)方面提供在禽類(lèi)特定組織中產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)的方法。外源蛋白質(zhì)可在禽類(lèi)輸卵管、血液和/或其他細(xì)胞和組織中表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方式中，將轉(zhuǎn)基因?qū)肱咛ヅ弑P(pán)細(xì)胞中，例如接近X期的胚盤(pán)細(xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)，從而在輸卵管蛋白分泌部的管狀腺細(xì)胞中表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)，分泌入腔中，沉積于硬殼蛋的卵清中。如此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)可在其種系中攜帶轉(zhuǎn)基因。因此，可通過(guò)將外源基因人工導(dǎo)入禽類(lèi)胚胎細(xì)胞中和以孟德?tīng)柗绞綄⑼庠椿蚍€(wěn)定傳遞給禽類(lèi)后代這兩種方式將外源基因轉(zhuǎn)入禽類(lèi)。本發(fā)明包括在禽類(lèi)輸卵管中產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)的方法。該方法可包括，第一步，提供含有編碼序列和操作性連接于該編碼序列的啟動(dòng)子以使啟動(dòng)子可影響該核酸在禽類(lèi)輸卵管中表達(dá)的載體。下一步，可產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和/或組織，其中，將所述載體導(dǎo)入新鮮分離的、培養(yǎng)的或胚胎中的禽胚胎胚盤(pán)細(xì)胞，使該載體序列插入(例如隨機(jī)插入)禽基因組。最后，可由轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞和/或組織產(chǎn)生在輸卵管中表達(dá)外源蛋白質(zhì)的成熟轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)。當(dāng)輸卵管中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)也被分泌到輸卵管腔并沉積于硬殼蛋的卵，如卵清中時(shí)，也可用該方法生產(chǎn)含有外源蛋白質(zhì)，如藥用蛋白質(zhì)(如細(xì)胞因子)的禽蛋。一方面，將載體插入禽類(lèi)基因組染色體中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雞的過(guò)程可任選地包括用DNA轉(zhuǎn)染胚胎胚盤(pán)細(xì)胞，然后將這些細(xì)胞注射入受體胚盤(pán)下的胚下腔。該方法所用的載體可含有融合于外源編碼序列并指導(dǎo)該編碼序列在輸卵管管狀腺細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。本發(fā)明的另一方面，通過(guò)用在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的5'和3'LTR之間攜帶有轉(zhuǎn)基因遺傳密碼的復(fù)制缺陷型或可復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)胚胎胚盤(pán)細(xì)胞，插入隨機(jī)染色體并產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)。例如，可利用含有經(jīng)修飾的含有插入到啟動(dòng)子區(qū)段下游的外源基因的pNLB質(zhì)粒的禽白血病病毒(ALV)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或鼠白血病病毒(MLV)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體?？捎冒b在病毒顆粒中的經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的RNA拷貝感染胚胎胚盤(pán)，發(fā)育為轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)?；蛘?，將能產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒的輔助細(xì)胞遞送至胚胎胚盤(pán)。本發(fā)明的另一方面提供一種含有編碼序列和操作及位置上相關(guān)可使該編碼序列在禽類(lèi)輸卵管中表達(dá)的啟動(dòng)子的載體。這類(lèi)載體包括但不限于禽白血病病毒(ALV)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、鼠白血病病毒(MLV)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體。此外，該載體可以是包含禽類(lèi)白血病病毒(ALV)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、鼠白血病病毒(MLV)逆轉(zhuǎn)錄載體或慢病毒載體的LTR的核酸序列。該啟動(dòng)子能充分驅(qū)動(dòng)此編碼序列在禽類(lèi)輸卵管中的有效表達(dá)。此編碼序列編碼可沉積于硬殼蛋卵清中的外源蛋白質(zhì)。同樣，該編碼序列編碼外源性蛋白質(zhì)，例如轉(zhuǎn)基因家禽產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，如干擾素a2b(TPDIFN-a2b)，以及轉(zhuǎn)基因家禽產(chǎn)生的紅細(xì)胞生成素(TPDEPO)和轉(zhuǎn)基因家禽產(chǎn)生的粒細(xì)胞集落刺激因子(TPDG-CSF)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明方法中所用的載體含有尤其適于外源蛋白質(zhì)在禽類(lèi)和禽蛋中表達(dá)的啟動(dòng)子。這樣，可以在轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)的輸卵管和血液中以及禽蛋的卵清中表達(dá)此外源編碼序列。所述啟動(dòng)子包括但不限于，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、MDOT啟動(dòng)子、羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子、(3-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(如雞P-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)、鼠白血病病毒(MLV)啟動(dòng)子、鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子、卵白蛋白啟動(dòng)子、溶菌酶啟動(dòng)子、伴白蛋白啟動(dòng)子、卵類(lèi)粘蛋白啟動(dòng)子、卵粘蛋白啟動(dòng)子和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動(dòng)子。任選地，該啟動(dòng)子可以是至少一種啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)區(qū)段，例如，卵白蛋白啟動(dòng)子、溶菌酶啟動(dòng)子、伴白蛋白啟動(dòng)子、卵類(lèi)粘蛋白啟動(dòng)子、卵粘蛋白啟動(dòng)子和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，該啟動(dòng)子可以是以下一種或多種啟動(dòng)子的組合或融合物，或以下一種或多種啟動(dòng)子的一部分的融合物，這些啟動(dòng)子包括例如卵白蛋白、溶菌酶、伴白蛋白、卵類(lèi)粘蛋白、卵粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的啟動(dòng)子。本發(fā)明的一個(gè)方面包括將卵白蛋白啟動(dòng)子截短和/或?qū)⒙寻椎鞍讍?dòng)子的關(guān)鍵調(diào)控元件壓縮使其保留在輸卵管蛋白分泌部管狀腺細(xì)胞中表達(dá)所需的序列，同時(shí)使其足夠小而易于摻入載體。例如，可利用卵白蛋白啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)區(qū)段。該區(qū)段包含卵清蛋白基因的5'側(cè)翼區(qū)域。卵白蛋白啟動(dòng)子區(qū)段的總長(zhǎng)度為0.88kb-7.4kb，優(yōu)選0.88kb-1.4kb。優(yōu)選該區(qū)段含有卵清蛋白基因的甾類(lèi)依賴(lài)性調(diào)控元件和負(fù)調(diào)控元件。任選地，該區(qū)段也包含卵白蛋白基因的5'非翻譯區(qū)(5'UTR)殘基?；蛘?，該啟動(dòng)子是溶菌酶基因、伴白蛋白基因、卵類(lèi)粘蛋白基因、卵粘蛋白基因和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)區(qū)段。此類(lèi)啟動(dòng)子的一個(gè)例子是合成的含有卵類(lèi)粘蛋白(MD)啟動(dòng)子和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(OT)啟動(dòng)子元件的MDOT啟動(dòng)子。本發(fā)明的另一方面，整合入禽類(lèi)基因組的載體含有操作上連接于外源編碼序列的組成型啟動(dòng)子(例如，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子、鼠白血病病毒(MLV)啟動(dòng)子)?；蛘?，可使用非組成型啟動(dòng)子例如鼠乳腺腫瘤(MMTV)啟動(dòng)子。本發(fā)明的其他方面提供在其種系組織的遺傳物質(zhì)中攜帶有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)。更具體說(shuō)，該轉(zhuǎn)基因包含外源基因和操作及位置上與外源基因相關(guān)的啟動(dòng)子以表達(dá)此外源基因。所述外源基因可以在轉(zhuǎn)基因禽的輸卵管和血液中表達(dá)。該外源基因編碼外源蛋白質(zhì)，如藥用蛋白質(zhì)，包括細(xì)胞因子，如TPDIFN-a(如IFN-a2)、TPDEPO和TPDG-CSF。該外源蛋白質(zhì)可沉積于硬殼蛋的卵清中。本發(fā)明的另外一方面提供含有對(duì)于該禽類(lèi)為外源性的蛋白質(zhì)的禽蛋。利用本發(fā)明可使外源蛋白質(zhì)在輸卵管細(xì)胞中表達(dá)，分泌到輸卵管蛋白分泌部腔并沉積于禽蛋的卵清中。包在禽蛋中的蛋白質(zhì)量可達(dá)到每只蛋1克以上。所述外源蛋白質(zhì)包括但不限于TPDIFN-a2b、TPDEPO和TPDG-CSF。本發(fā)明的另外一方面提供分離的多核苷酸序列，其包含人干擾素-a2b(IFN-a2b)的最佳編碼序列，即編碼轉(zhuǎn)基因家禽產(chǎn)生的干擾素-a2b(TPDIFN-a2b)的重組轉(zhuǎn)基因家禽衍生干擾素-a2b編碼序列。本發(fā)明還包括分離的包含TPDIFN-a2b多肽序列的蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)的Thr-106位被N-乙酰-半乳糖胺、半乳糖、N-乙酰-葡糖胺、唾液酸和其組合O-糖基化。本發(fā)明還設(shè)想一種包含TPDIFN-a2b多肽序列的藥物組合物，其中的蛋白質(zhì)在Thr-106位被N-乙酰-半乳糖胺、半乳糖、N-乙酰-葡糖胺、唾液酸和其組合O-糖基化。本發(fā)明一方面提供如本文所述產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)的編碼序列，其中該編碼序列是根據(jù)在禽類(lèi)，如雞中表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化的?？捎汕蓊?lèi)細(xì)胞(如雞細(xì)胞)中表達(dá)的至少一種，優(yōu)選一種以上蛋白質(zhì)的密碼子使用來(lái)確定密碼子優(yōu)化方案。例如，可由編碼雞的卵白蛋白、溶菌酶、卵粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的核酸序列確定密碼子使用。例如，可通過(guò)WisconsinPackage(威斯康星軟件包)9.1版(威斯康星州麥迪遜的GeneticsComputerGroupInc.(遺傳學(xué)計(jì)算組公司))的BACKTRANSLATE程序，利用由紅原雞(Ga〃Mga〃w力卵白蛋白、溶菌酶、卵類(lèi)粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白編譯的密碼子使用表對(duì)外源蛋白質(zhì)的DNA序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化。本發(fā)明一方面提供一種分離的多核酸序列，其包含人促紅細(xì)胞生成素(EPO)最佳編碼序列，即編碼轉(zhuǎn)基因家禽產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素(TPDEPO)的重組轉(zhuǎn)基因家禽衍生促紅細(xì)胞生成素編碼序列。本發(fā)明另一方面提供一種含有第一和第二編碼序列及操作和位置上與該第一和第二編碼序列相關(guān)的可在禽類(lèi)輸卵管中表達(dá)該第一和第二編碼序列的啟動(dòng)子的載體。在這個(gè)方面，該載體可包含位于該第一和第二編碼序列之間的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)元件，其中，第一編碼序列編碼蛋白X，第二編碼序列編碼蛋白Y，蛋白X和蛋白Y中的一種或兩種沉積于硬殼蛋的卵(如卵清)中。例如，蛋白X可以是單克隆抗體的輕鏈(LC)，蛋白Y可以是單克隆抗體的重鏈(HC)?；蛘撸诙幋a序列編碼的蛋白(例如，酶)能對(duì)第一編碼序列編碼的蛋白進(jìn)行翻譯后修飾。該載體任選地可含有其它編碼序列和其它IRES元件，通過(guò)IRES元件將載體中的各個(gè)編碼序列與其他編碼序列分開(kāi)。使用考慮用于本發(fā)明的IRES的其它例子參見(jiàn)例如2005年1月31日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)11/047,184，將其全部?jī)?nèi)容納入本文作參考。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)含有蛋白質(zhì)如藥用蛋白質(zhì)，包括單克隆抗體、酶和其他蛋白質(zhì)的禽蛋的方法。這種方法可包括提供含有啟動(dòng)子、編碼序列和至少一個(gè)IRES元件的載體；通過(guò)將該載體導(dǎo)入禽類(lèi)胚胎胚盤(pán)細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或組織，其中，該載體序列隨機(jī)插入禽類(lèi)基因組；由轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或組織產(chǎn)生成熟的轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)。如此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)可在其輸卵管中表達(dá)所述編碼序列，將產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分泌入輸卵管腔中，從而沉積于硬殼蛋的卵清中。此外，本發(fā)明包括產(chǎn)出含有該重組蛋白的禽蛋的該轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)的后代。一般地，基本上該后代所有細(xì)胞均含有該轉(zhuǎn)基因，或者該后代的所有細(xì)胞均不含該轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明的一個(gè)重要方面涉及含有外源肽或蛋白質(zhì)，包括但不限于藥用蛋白質(zhì)的禽類(lèi)硬殼蛋(如雞硬殼蛋)。該外源肽或蛋白質(zhì)可由轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)的轉(zhuǎn)基因編碼。在一個(gè)實(shí)施方式中，該外源肽或蛋白質(zhì)(如藥用蛋白質(zhì))是糖基化蛋白質(zhì)。該蛋白可以有用量存在。在一個(gè)實(shí)施方式中，該蛋白的含量為約0.01微克/硬殼蛋-約1克/硬殼蛋。在一個(gè)實(shí)施方式中，該蛋白的含量為約1微克/硬殼蛋-約1克/硬殼蛋。例如，該蛋白的含量為約10微克/硬殼蛋-約1克/硬殼蛋(例如約10微克/硬殼蛋-約400毫克/硬殼蛋)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明外源蛋白質(zhì)，如外源藥用蛋白存在于該蛋的卵清中。在一個(gè)實(shí)施方式中，該蛋白的含量為約1納克/毫升卵清-約0.2克/毫升卵清。例如，該蛋白的含量為約0.1微克/毫升卵清-約0.2克/毫升卵清(例如該蛋白的含量為約1微克/毫升卵清-約100毫克/毫升卵清)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該蛋白的含量為約l微克/毫升卵清-約50毫克/毫升卵清。例如，該蛋白的含量為約1微克/毫升卵清-約10毫克/毫升卵清(例如該蛋白的含量為約1微克/毫升卵清-約1毫克/毫升卵清)。在一個(gè)實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)含量大于O.l)ig/毫升卵清。在一個(gè)實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)含量大于0.5pg/毫升卵清。在一個(gè)實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)含量大于1^g/毫升卵清。在一個(gè)實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)含量大于1.5pg/毫升卵清。本發(fā)明涉及產(chǎn)生含有任何有用蛋白質(zhì)，包括一種或多種藥用蛋白質(zhì)的硬殼蛋。這類(lèi)蛋白質(zhì)包括但不限于激素、免疫球蛋白或免疫球蛋白的一部分、細(xì)胞因子(如GM-CSF、G-CSF、紅細(xì)胞生成素和干擾素)和CTLA4。本發(fā)明也包括產(chǎn)生含有融合蛋白，包括但不限于免疫球蛋白或免疫球蛋白的某部分與某些有用肽序列的融合蛋白的硬殼蛋。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供產(chǎn)生含有抗體Fc片段的硬殼蛋。例如，該蛋可含有本發(fā)明Fc-CTLA4融合蛋白。由引入載體的胚盤(pán)細(xì)胞產(chǎn)生的禽類(lèi)是GO代，可稱(chēng)為"創(chuàng)始者"。創(chuàng)始禽類(lèi)一般是含各插入轉(zhuǎn)基因的嵌合動(dòng)物。就是說(shuō)，GO轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)中只有一些細(xì)胞含有該轉(zhuǎn)基因。GO代一般也是該轉(zhuǎn)基因的半合子。GO代可與非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物配種，產(chǎn)生的G1轉(zhuǎn)基因后代也是該轉(zhuǎn)基因的半合子，基本上所有該禽類(lèi)的細(xì)胞均含有該轉(zhuǎn)基因。G1半合子后代可與非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物配種，產(chǎn)生G2半合子后代，或互相配種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因純合的G2后代?；旧纤醒苌訥l后代的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性禽類(lèi)細(xì)胞均含有該轉(zhuǎn)基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，來(lái)自同一譜系的半合子G2后代可配種產(chǎn)生該轉(zhuǎn)基因純合的G3后代。在一個(gè)實(shí)施方式中，半合子GO動(dòng)物互相配種產(chǎn)生每個(gè)動(dòng)物細(xì)胞含有兩個(gè)轉(zhuǎn)基因拷貝的純合子Gl后代。這些只是某些有用的配種方法的例子，本發(fā)明考慮到采用任何有用的配種方法，如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法。本發(fā)明一方面涉及含有具有家禽產(chǎn)生的糖基化模式，如雞產(chǎn)生的糖基化模式的按本發(fā)明產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的組合物。本發(fā)明一方面涉及含有具有禽類(lèi)產(chǎn)生的糖基化模式，如雞產(chǎn)生的糖基化模式的按本發(fā)明產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的組合物。例如，本發(fā)明包括具有家禽產(chǎn)生的糖基化模式，如本文所述的一種或多種糖基化模式的藥用蛋白質(zhì)。本發(fā)明也包括具有家禽產(chǎn)生的糖基化模式，如本文所述的一種或多種糖基化模式的人蛋白質(zhì)。本發(fā)明一方面包括具有家禽產(chǎn)生的糖基化模式的G-CSF，即轉(zhuǎn)基因家禽產(chǎn)生的G-CSF或TPDG-CSF。本發(fā)明一方面包括具有轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)衍生的糖基化模式的G-CSF，即轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)衍生的G-CSF。在一個(gè)實(shí)施方式中，該糖基化模式不同于人細(xì)胞和/或CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的G-CSF。就是說(shuō)，該組合物含有具有家禽或禽類(lèi)衍生的糖鏈(即糖基化結(jié)構(gòu))且人細(xì)胞和/或CHO細(xì)胞中獲得的G-CSF上沒(méi)有這種糖鏈或糖基化結(jié)構(gòu)的G-CSF分子。然而，該組合物也可含有糖基化結(jié)構(gòu)與CHO細(xì)胞和/或人細(xì)胞中獲得的G-CSF相同的G-CSF分子。CHO細(xì)胞產(chǎn)生的人G-CSF的糖基化參見(jiàn)全部?jī)?nèi)容納入本文作參考的Holloway,C丄，EuropeanJ.ofCancer(1994)，第30A巻，pS2-S6;全部?jī)?nèi)容納入本文作參考的Oheda等(1988)J.Biochem.，第103巻，第544-546頁(yè)以及全部?jī)?nèi)容納入本文作參考的Andersen等(1994)Glycobiology，第4巻，第459-467頁(yè)。似乎實(shí)施例20所示的結(jié)構(gòu)如A和G可能與報(bào)道的CHO細(xì)胞產(chǎn)生的G-CSF的糖基化結(jié)構(gòu)相同或相似。在一個(gè)實(shí)施方式中，按照本發(fā)明產(chǎn)生的G-CSF的糖基化模式不同于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的G-CSF。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供分離的G-CSF。就是說(shuō)，該組合物中所含的G-CSF可以是分離的G-CSF。例如，該G-CSF與卵清分離。分離的G-CSF可以是具有不同糖基化結(jié)構(gòu)的G-CSF分子，或者分離的G-CSF可以是只有一種具體糖基化結(jié)構(gòu)的單獨(dú)分離的G-CSF分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明組合物的G-CSF存在于硬殼蛋中。例如，G-CSF可存在于本發(fā)明轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)所產(chǎn)硬殼蛋的卵清中。就是說(shuō)，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明G-CSF的禽蛋(如雞蛋)卵清。在一個(gè)實(shí)施方式中，卵清中G-CSF的含量超過(guò)約1微克/毫升卵清。例如，G-CSF的含量可以大于約2微克虔升卵清(例如含量約2微克-200微克慮升卵清)。在本發(fā)明的一個(gè)具體方面，在禽類(lèi)，如雞的輸卵管細(xì)胞中G-CSF發(fā)生糖基化。例如，G-CSF可以在輸卵管細(xì)胞中產(chǎn)生并被糖基化。在一個(gè)實(shí)施方式中，G-CSF在管狀腺細(xì)胞中被糖基化(例如G-CSF在管狀腺細(xì)胞中產(chǎn)生并被糖基化)。認(rèn)為G-CSF在蘇氨酸133上糖基化。然而，本發(fā)明不限于在G-CSF分子的任何特定位點(diǎn)上的糖基化。本發(fā)明G-CSF—般是人G-CSF。在一個(gè)實(shí)施方式中，成熟G-CSF含有圖18C所示氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明組合物包含用下述結(jié)構(gòu)糖基化的G-CSF分子SA~Ga!-NAeGa，-,CM-NAcGta-WAcOal、GaI揚(yáng)WAe謂u-NAc.GaKGal幅S森SA-GaJ-織c條機(jī)e咖-,SA-Ga固AeG隨AeG鑫，-，OaWAc.Gah和<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>本發(fā)明還特別涉及包含具有這些特定糖基化結(jié)構(gòu)之一的G-CSF分子的組合物。這類(lèi)組合物還可包含具有一種或多種其它糖基化結(jié)構(gòu)的一種或多種G-CSF分子。就是說(shuō)，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明特別涉及包含具有以下結(jié)構(gòu)的G-CSF分子的組合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>并且涉及包含具有以下結(jié)構(gòu)的G-CSF分子的組合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>I.并且涉及包含具有以下結(jié)構(gòu)的G-CSF分子的組合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>iI并且涉及包含具有以下結(jié)構(gòu)的G-CSF分子的組合物SA-Gal-NAcGal-;并且涉及包含具有以下結(jié)構(gòu)的G-CSF分子的組合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>并且涉及包含具有以下結(jié)構(gòu)的G-CSF分子的組合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>并且涉及包含具有以下結(jié)構(gòu)的G-CSF分子的組合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>其中，Gal二半乳糖，NAcGa一N-乙酰-半乳糖胺，NAcGlu二N-乙酰-葡糖胺，禾口SA二唾液酸本發(fā)明還涉及提高患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法，所述方法包括給予患者治療有效量的按照本發(fā)明產(chǎn)生的G-CSF。治療有效量一般是能將患者的白細(xì)胞計(jì)數(shù)提高所需量的G-CSF用量。本發(fā)明一方面涉及含有EPO，即按照本發(fā)明產(chǎn)生的EPO分子的組合物。在一個(gè)特別有用的實(shí)施方式中，所述EPO是純化或分離的。例如，所述EPO是從轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)所產(chǎn)硬殼蛋內(nèi)容物中取出的。在一個(gè)特別有用的實(shí)施方式中，所述EPO是人EPO。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO具有禽類(lèi)輸卵管細(xì)胞中產(chǎn)生的EPO的糖基化模式。本發(fā)明另一方面涉及含有具有某糖基化模式的EPO的組合物，所述糖基化模式不同于人細(xì)胞或CHO細(xì)胞產(chǎn)生的EPO的糖基化模式，且所述EPO是在雞的輸卵管細(xì)胞中產(chǎn)生的。本發(fā)明一方面提供含有分離EPO(如人EPO)的組合物，所述EPO具有禽類(lèi)或家禽衍生的糖基化模式。例如，該組合物可含有按照本發(fā)明在禽類(lèi)，例如雞中產(chǎn)生，并由卵清分離的EPO分子的混合物。在一個(gè)有用實(shí)施方式中，含有EPO的組合物是藥物制劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO上的寡糖不含巖藻糖。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO上約9(P/?；蚋嗟腘-連接寡糖不含巖藻糖。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO上約80%或更多的N-連接寡糖不含巖藻糖。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO上約70。/。或更多的N-連接寡糖不含巖藻糖。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO上約60。/?；蚋嗟腘-連接寡糖不含巖藻糖。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO上約50%或更多的N-連接寡糖不含巖藻糖。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO上約95%或更多的N-連接寡糖不含唾液酸。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO上約90。/?；蚋嗟腘-連接寡糖不含唾液酸。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO上約80。/。或更多的N-連接寡糖不含唾液酸。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO上大于約70。/。或更多的N-連接寡糖不含唾液酸。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO上約60。/。或更多的N-連接寡糖不含唾液酸。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO上約50。/?；蚋嗟腘-連接寡糖不含唾液酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO上約95%或更多的N-連接寡糖含有末端N-乙酰葡糖胺。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO上約90。/?；蚋嗟腘-連接寡糖含有末端N-乙酰葡糖胺。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO上約80y?；蚋嗟腘-連接寡糖含有末端N-乙酰葡糖胺。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO上約70%或更多的N-連接寡糖含有末端N-乙酰葡糖胺。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO上約60%或更多的N-連接寡糖含有末端N-乙酰葡糖胺。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO上約50%或更多的N-連接寡糖含有末端N-乙酰葡糖胺。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO分子上的N-連接寡糖的結(jié)構(gòu)類(lèi)型基本上都不含巖藻糖。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO分子上約90o/?；蚋嗟腘-連接寡糖的結(jié)構(gòu)類(lèi)型不含巖藻糖。例如，如果有20種寡糖結(jié)構(gòu)類(lèi)型，那么18種或更多種結(jié)構(gòu)類(lèi)型不含巖藻糖。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO分子上約80%或更多的N-連接寡糖的結(jié)構(gòu)類(lèi)型不含巖藻糖。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO分子上約70%或更多的N-連接寡糖的結(jié)構(gòu)類(lèi)型不含巖藻糖。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO分子上約60%或更多的N-連接寡糖的結(jié)構(gòu)類(lèi)型不含巖藻糖。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO分子上約50%或更多的N-連接寡糖的結(jié)構(gòu)類(lèi)型不含巖藻糖。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO分子上的N-連接寡糖的結(jié)構(gòu)類(lèi)型基本上都不含唾液酸。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO分子上約90。/?；蚋嗟腘-連接寡糖的結(jié)構(gòu)類(lèi)型不含唾液酸。例如，如果有20種寡糖結(jié)構(gòu)類(lèi)型，那么18種或更多種結(jié)構(gòu)類(lèi)型不含唾液酸。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO分子上約80%或更多的N-連接寡糖的結(jié)構(gòu)類(lèi)型不含唾液酸。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO分子上約70%或更多的N-連接寡糖的結(jié)構(gòu)類(lèi)型不含唾液酸。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO分子上約60%或更多的N-連接寡糖的結(jié)構(gòu)類(lèi)型不含唾液酸。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO分子上約50%或更多的N-連接寡糖的結(jié)構(gòu)類(lèi)型不含唾液酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO分子上的N-連接寡糖的結(jié)構(gòu)類(lèi)型基本上都含有末端N-乙酰葡糖胺。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO分子上約90。/?；蚋嗟腘-連接寡糖的結(jié)構(gòu)類(lèi)型含有末端N-乙酰葡糖胺。例如，如果有20種寡糖結(jié)構(gòu)類(lèi)型，那么18種或更多種結(jié)構(gòu)類(lèi)型含有末端N-乙酰葡糖胺。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO分子上約80%或更多的N-連接寡糖的結(jié)構(gòu)類(lèi)型含有末端N-乙酰葡糖胺。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO分子上約70%或更多的N-連接寡糖的結(jié)構(gòu)類(lèi)型含有末端N-乙酰葡糖胺。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO分子上約60%或更多的N-連接寡糖的結(jié)構(gòu)類(lèi)型含有末端N-乙酰葡糖胺。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO分子上約50%或更多的N-連接寡糖的結(jié)構(gòu)類(lèi)型含有末端N-乙酰葡糖胺。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及由含有編碼EPO的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)，如轉(zhuǎn)基因雞獲得的EPO。在一個(gè)實(shí)施方式中，EPO是禽類(lèi)輸卵管細(xì)胞，例如，管狀腺細(xì)胞中產(chǎn)生的。在一個(gè)實(shí)施方式中，EPO包含在硬殼蛋，例如，諸如雞等禽類(lèi)所產(chǎn)的硬殼蛋中。例如，EPO可能存在于完整硬殼蛋的內(nèi)容物中。在一個(gè)特別有用的實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO是人EPO。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及含有分離的EPO分子，如人EPO分子的組合物，其中所述EPO是含有編碼該EPO的轉(zhuǎn)基因的禽類(lèi)產(chǎn)生的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述EPO是轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)(如轉(zhuǎn)基因雞)的輸卵管細(xì)胞(如管狀腺細(xì)胞)中產(chǎn)生的，所述EPO是由轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)的卵清分離的。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO具有圖19A所示的氨基酸序列?？紤]到，所述EPO是N-糖基化的和/或0-糖基化的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述EPO是在鳥(niǎo)類(lèi)，如雞的輸卵管細(xì)胞(如管狀腺)中糖基化的。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種組合物，如藥物制劑，其含有具有禽類(lèi)衍生糖基化模式的分離EPO，例如人EPO。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種組合物，如藥物制劑，其含有具有家禽衍生糖基化模式的分離EPO，例如人EPO。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種組合物，如藥物制劑，其含有按照本發(fā)明產(chǎn)生的分離EPO，例如人EPO。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明組合物中的EPO所具有的糖基化模式不同于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的EPO。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明組合物中的EPO所具有的糖基化模式不同于CHO細(xì)胞和人細(xì)胞中產(chǎn)生的EPO。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO連接于本文所述的一個(gè)或多個(gè)N-連接寡糖結(jié)構(gòu)(如圖21所示)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明EPO連接于本文所述的一個(gè)或多個(gè)0-連接寡糖結(jié)構(gòu)(如圖20所示)。本發(fā)明一方面涉及治療患者的方法，所述方法包括給予患者治療有效量的獲自轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)的EPO。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療有效量是將患者的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)提高所需數(shù)值的用量。考慮到，可利用按照本發(fā)明產(chǎn)生的EPO治療慢性腎病，例如，組織無(wú)法維持紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生的狀況。本發(fā)明一方面涉及含有分離的糖基化的人蛋白質(zhì)分子的組合物，所述人蛋白質(zhì)分子是在轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)輸卵管中產(chǎn)生的，所述轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)(如轉(zhuǎn)基因雞)含有編碼該人蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因，所述人蛋白質(zhì)含有通常不會(huì)出現(xiàn)在人蛋白質(zhì)上的雞衍生的寡糖。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人蛋白質(zhì)連接于本文所述的一個(gè)或多個(gè)N-連接寡糖結(jié)構(gòu)(如圖21所示)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人蛋白質(zhì)連接于本文所述的一個(gè)或多個(gè)O-連接寡糖結(jié)構(gòu)(如圖20所示)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在轉(zhuǎn)基因雞輸卵管中產(chǎn)生(如本文所述)的分離的蛋白質(zhì)分子，所述轉(zhuǎn)基因雞含有編碼該蛋白質(zhì)分子的轉(zhuǎn)基因，所述蛋白質(zhì)分子含有雞衍生的寡糖。例如，所述蛋白質(zhì)分子可以是以下蛋白質(zhì)的糖基化形式GM-CSF、干擾素p、融合蛋白、CTLA4-Fc融合蛋白、生長(zhǎng)激素、細(xì)胞因子、結(jié)構(gòu)物(stmctural)、干擾素、溶菌酶、(3-酪蛋白、白蛋白、a-l抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、膠原、因子VIII、因子IX、因子X(jué)(等)、血纖蛋白原、乳鐵蛋白、蛋白C、組織型纖溶酶原激活物(tPA)、生長(zhǎng)激素和糜蛋A酶、免疫球蛋白、抗體、免疫毒素、因子VIII、(3-結(jié)構(gòu)域缺失的閃子VIII、因子VIIa、因子IX，抗凝劑；水蛭素、阿替普酶、tpa、瑞替普,、tpa、tpa-5個(gè)結(jié)構(gòu)域中缺失3個(gè)、胰島素、賴(lài)脯胰島素、阿斯巴特胰島紊(insulinaspart)、甘精胰島素、長(zhǎng)效胰島素類(lèi)似物、高血糖素、tsh、促卵泡素畫(huà)卩、fsh、pdgh、inf-(3lb、ifn-(3la、ifn-ylb、il-2、il-ll、hbsag、ospa、阿法鏈道酶-DNA酶、(3葡糖腦苷脂酶、tnf-a、i1-2-fi喉毒素融合蛋白、tnfr-lgg片段融合蛋白、拉羅尼酵、DNA酶、阿法賽特(alefacept)、托西莫單抗、鼠畢-抗、阿來(lái)組單抗(alemtuzumab)、拉布立酶、阿加糖酶P、特立帕肽、甲狀旁腺激紊衍生物、阿達(dá)木單抗(lggl)、阿那白滯素、生物改性劑、奈西立肽、人卩-型利鈉肽(hbnp)、集落刺激因子、培維索孟、人生長(zhǎng)激素受體拮抗劑、重組激活的蛋白c、奧馬佐單抗(omalizumab)、免疫球蛋Ae(lge)阻斷物、替伊莫單抗、ACTH、高血糖素、生長(zhǎng)抑素、生長(zhǎng)激素、胸腺素、甲狀旁腺激素、色素激素、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素、黃體生成素、絨毛膜促性腺素、下丘腦釋放因子、依那西普、抗利尿激素、促乳素和促甲狀腺激素、免疫球蛋白多肽、免疫球蛋tl多肽D區(qū)、免疫球蛋白多肽J區(qū)、免疫球蛋白多肽C區(qū)、免疫球蛋白輕鏈、免疫球蛋白重鏈、免疫球蛋白重鏈可變區(qū)、免疫球蛋廣」輕鏈可變區(qū)和接頭肽。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解，通常不糖基化的蛋白質(zhì)可經(jīng)工程改造而含有在禽類(lèi)體系中糖基化的糖基化位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離蛋白質(zhì)連接于本文所述的一個(gè)或多個(gè)N-連接寡糖結(jié)構(gòu)(如圖21所示)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離蛋白質(zhì)連接于本文所述的一個(gè)或多個(gè)O-連接寡糖結(jié)構(gòu)(如圖20所示)。本文所述某些蛋白質(zhì)如EPO中特別考慮的特征(如組成、糖基化結(jié)構(gòu))也可用于本文所述的按照本發(fā)明產(chǎn)生的其它具體蛋白。本發(fā)明還包括制備本文所述的糖基化蛋白質(zhì)如紅細(xì)胞生成素的方法，所述方法包括生產(chǎn)含有編碼蛋白質(zhì)(如紅細(xì)胞生成素)的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)，其中所述蛋白質(zhì)包裝到該禽類(lèi)所產(chǎn)的硬殼蛋中。還包括禽類(lèi)所產(chǎn)的含有所述蛋白質(zhì)(如紅細(xì)胞生成素)的蛋。本發(fā)明還提供含有單獨(dú)類(lèi)型的有用蛋白質(zhì)分子，如本文所述的蛋白質(zhì)的分離混合物的組合物，其中所述混合物所含的-種或多種蛋白質(zhì)分子連接有特定的寡糖結(jié)構(gòu)，具體是本文所述的可由轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)產(chǎn)生的寡糖結(jié)構(gòu)。例如，本發(fā)明提供EPO分子，如人EPO分子(如SEQIDNO:50的EPO)的分離混合物，其含有用以下一種或多種結(jié)構(gòu)糖基化的EPO分子和和和<image>imageseeoriginaldocumentpage35</image>和以及圖20和圖21所示其它各寡糖結(jié)構(gòu)。本文所述特征的任何有用組合都包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，只要從上下文、本說(shuō)明書(shū)和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識(shí)中能夠看出這些組合中所含的特征不會(huì)相互矛盾。參照以下說(shuō)明書(shū)詳述，與下面簡(jiǎn)述的附圖結(jié)合考慮時(shí)，可以明顯看出本發(fā)明的其它目的和方面。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1A和1B，顯示卵白蛋白啟動(dòng)子表達(dá)載體，該載體含有卵白蛋白啟動(dòng)子片段和編碼序列即編碼外源蛋白質(zhì)X的基因X。X代表感興趣的任何外源基因或外源蛋白質(zhì)。圖2A、2B、2C和2D，顯示本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，該載體含有卵白蛋白啟動(dòng)子和編碼序列即編碼外源蛋白質(zhì)X的基因Z。X代表感興趣的任何外源基因或外源蛋白質(zhì)。圖2E，顯示擴(kuò)增用于插入2A和2B載體中外源基因的方法。圖2F，顯示逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，該載體含有控制編碼序列，基因；r表達(dá)的卵白蛋白啟動(dòng)子。該載體還包含內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)元件，以使第二編碼序列，基因r能夠表達(dá)。X和Y代表感興趣的任何基因。圖3A和3B，分別顯示ALV衍生的載體pNLB和pNLB-CMV-BL的示意圖。因?yàn)镹LB還沒(méi)有完全測(cè)序，所以bp(堿基對(duì))的測(cè)量是從已發(fā)表的數(shù)據(jù)(Cosset等，1991;Thoraval等，1995)和本文討論的數(shù)據(jù)估計(jì)的。因?yàn)檎先腚u的基因組時(shí)將出現(xiàn)這兩個(gè)載體，所以顯示了它們。圖4A和4B，顯示嵌合和轉(zhuǎn)基因雞的血清中P-內(nèi)酰胺酶(內(nèi)酰胺酶)的量。圖4A中，孵化后8個(gè)月測(cè)定的以NLB-CMV-BL轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的G0雞血清中生物活性?xún)?nèi)酰胺酶濃度。示出了世代、性別和翅圈號(hào)碼。測(cè)定了孵化后6至7個(gè)月Gl轉(zhuǎn)基因雞的內(nèi)酰胺酶血清濃度。箭頭表示從公雞2395繁殖產(chǎn)生的Gl雞。在圖4B中，測(cè)定了Gl和G2轉(zhuǎn)基因雞的內(nèi)酰胺酶血清濃度。箭頭表示從母雞5657或公雞4133繁殖產(chǎn)生的G2雞。雞4133、5308和5657的樣品與圖4A中的相同。收集5657繁殖的G2雞孵化后3至60天的樣品。收集4133繁殖的G2雞孵化后3個(gè)月的樣品。圖5，顯示具有母雞5657(圖5A)或公雞4133(圖5B)所帶轉(zhuǎn)基因基因座的雞的譜系。2395是攜帶有多個(gè)轉(zhuǎn)基因基因座的公雞。將2395與一個(gè)非轉(zhuǎn)基因母雞交配，產(chǎn)生了3個(gè)各在其基因組的唯一位點(diǎn)攜帶有轉(zhuǎn)基因的后代。簡(jiǎn)單起見(jiàn)，將未顯示表達(dá)數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)基因后代和非轉(zhuǎn)基因后代從譜系中略去。以下面的符號(hào)表示翅圈號(hào)碼o母雞；口公雞；參攜帶有NLB-CMV-BL轉(zhuǎn)基因的母雞；B攜帶有NLB-CMV-BL轉(zhuǎn)基因的公雞。圖6，顯示母雞5657及其后代卵清中的|3-內(nèi)酰胺酶(內(nèi)酰胺酶)量。圖6A中，檢測(cè)了5657及其轉(zhuǎn)基因后代卵清中的活性?xún)?nèi)酰胺酶。對(duì)照取自于未處理的母雞，連產(chǎn)雞(clutchmate)是從母雞5657繁殖的非轉(zhuǎn)基因G2雞。2000年三月收集雞蛋。箭頭表示從母雞5657繁殖的G2雞。圖6B中，將攜帶有一拷貝轉(zhuǎn)基因(半合子)的G2轉(zhuǎn)基因母雞的卵清樣品與攜帶有兩拷貝轉(zhuǎn)基因(純合)的G3母雞6978的卵清樣品進(jìn)行了比較。2001年2月收集雞蛋。左邊標(biāo)明了世代和翅圈號(hào)碼。圖7，顯示從公雞4133繁殖的G2和G3母雞蛋中的P-內(nèi)酰胺酶(內(nèi)酰胺酶)。圖7A中，檢測(cè)了從公雞4133繁殖的四個(gè)代表性半合子轉(zhuǎn)基因母雞卵清的活性?xún)?nèi)酰胺酶。收集蛋的時(shí)間分別是1999年IO月、2000年3月和2001年2月，每次收集后一個(gè)月每只母雞至少檢測(cè)4只蛋。對(duì)照代表未處理母雞的卵清。左邊標(biāo)明了翅圈號(hào)碼。計(jì)算每個(gè)時(shí)期四只母雞的平均值。圖7B中，將半合子G2轉(zhuǎn)基因母雞的卵清與半合子和純合子轉(zhuǎn)基因G3母雞的卵清作比較。2001年2月收集雞蛋。每只母雞的世代和轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)列于數(shù)據(jù)欄中。攜帶一個(gè)或兩個(gè)拷貝的母雞的平均濃度見(jiàn)該圖底部。圖8A和8B，分別顯示用于在雞中表達(dá)IFN-a2b的pNLB-CMV-IFN載體和用于在雞中表達(dá)促紅細(xì)胞生成素(EPO)的pNLB-MDOT-EPO載體。圖9，顯示轉(zhuǎn)基因家禽產(chǎn)生的干擾素-a2b(TPDIFN-a2b)的新糖基化模式，包括所有6個(gè)條帶。圖10，顯示人外周血白細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素-a2b(PBLIFN-a2b或天然的WFN)和轉(zhuǎn)基因家禽產(chǎn)生的干擾素-a2b(TPDIFN-a2b或卵清hIFN)的比較。圖IIA，顯示優(yōu)化的人干擾素-a2b(IFN-a2b)的合成核酸序列(cDNA，殘基1—498)，即重組TPDIFN-a2b(SEQIDN0:1)。1).圖11B，顯示轉(zhuǎn)基因家禽產(chǎn)生的干擾素-a2b(TPDIFN-a2b)的合成核酸序列(殘基l-165)(SEQIDNO:2)。圖12A，顯示優(yōu)化的人促紅細(xì)胞生成素(EPO)的合成核酸序列(cDNA，殘基1-579)，即重組TPDEPO(SEQIDNO:3)。圖12B，顯示轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素(TPDEPO)的合成核酸序列(殘基1-193)(SEQIDNO:4)。4).(對(duì)于天然的人EPO，又見(jiàn)NCBI登錄號(hào)NP—000790)。圖13，顯示與IFN-MMCDS相連接的合成MDOT啟動(dòng)子。MDOT啟動(dòng)子包含雞卵類(lèi)粘蛋白基因的-435bp至-166bp(卵類(lèi)粘蛋白啟動(dòng)子)(見(jiàn)NCBI登錄號(hào)J00894)和雞伴白蛋白基因的-251至+29bp(卵轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動(dòng)子)(見(jiàn)NCBI登錄號(hào)Y00497、M11862和X01205)的元件。圖14提供主要卵清蛋白質(zhì)的小結(jié)。圖15A和15D，顯示pCMV-LC-emcvIRES-HC載體，其中，為檢測(cè)單克隆抗體的表達(dá)，通過(guò)放置腦心肌炎病毒(EMCV)的IRES使該載體能表達(dá)人單克隆抗體的輕鏈(LC)和重鏈(HC)。與之相比，圖15B和15C分別顯示獨(dú)立的載體pCMV-HC和pCMV-LC，其中，這些載體也用于檢測(cè)單克隆抗體的表達(dá)。圖16顯示銀染的紐迫基(Neupogen)⑧(泳道A)和TPDG-CSF(泳道B)的SDSPAGE。圖17顯示與細(xì)菌衍生的人G-CSF相比，14天中TPDG-CSF的絕對(duì)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(ANC)增加。圖18A(SEQIDNO:39)顯示編碼圖18B的氨基酸序列的核苷酸序列。對(duì)應(yīng)于NCBI登錄號(hào)NP7577373的圖18B(SEQIDNO:40)顯示包含在細(xì)胞分泌期間被切割而形成成熟G-CSF的天然信號(hào)序列的G-CSF氨基酸序列。圖18C(SEQIDNO:41)顯示按本發(fā)明產(chǎn)生的成熟G-CSF蛋白的氨基酸序列。圖19A顯示用于在轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)中產(chǎn)生人紅細(xì)胞生成素的165個(gè)氨基酸形式的核苷酸編碼序列。圖19B顯示在轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)中產(chǎn)生的人紅細(xì)胞生成素的165個(gè)氨基酸形式的氨基酸序列。圖20顯示測(cè)定的按照本發(fā)明產(chǎn)生的紅細(xì)胞生成素的代表性O(shè)-連接糖基化結(jié)構(gòu)。圖21A和圖21B顯示測(cè)定的按照本發(fā)明產(chǎn)生的紅細(xì)胞生成素的代表性N-連接糖基化結(jié)構(gòu)。一組糖殘基前面的大括號(hào)表示所示糖可連接于大括號(hào)內(nèi)的任何糖。例如，在結(jié)構(gòu)E-n中，所示連接于唾液酸的半乳糖分子可連接于五種末端N-乙酰葡糖胺中的任何一種。也顯示了結(jié)構(gòu)中的假定連接，如本領(lǐng)域所知。考慮到，標(biāo)為C-n、E-n、F-n和H-n的各個(gè)結(jié)構(gòu)中，連接于一個(gè)甘露糖的兩個(gè)末端NAcGlu殘基可以是2，6-連接于甘露糖，而不是2,4連接于甘露糖。圖22顯示純化的轉(zhuǎn)基因雞衍生的EPO的體外活性。ED50=0.44ng/ml。發(fā)明詳述本文提出下面的定義用于闡述和明確描述本發(fā)明所用的各種術(shù)語(yǔ)的含義和范圍。"核酸或多核苷酸序列"包括但不限于，真核生物的mRNA、cDNA、基因組DNA以及合成的DNA和RNA序列，包括天然的核苷堿基腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。該術(shù)語(yǔ)還包括含有一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾堿基的序列。本文所用術(shù)語(yǔ)"禽類(lèi)"指鳥(niǎo)綱分類(lèi)的任何種、亞種或宗，例如但不限于雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、雉、鸚鵡、雀、鷹、烏鴉和平胸鳥(niǎo)，包括鴕鳥(niǎo)、鴯鹋和食火雞。該術(shù)語(yǔ)包括紅原雞(Gfl//^ga〃^)或雞的各種已知品系(例如，白來(lái)杭雞、褐來(lái)杭雞、斑紋石雞(Barred-Rock)、蘇賽克斯雞(Sussex)、新罕布什爾雞、羅德島雞、澳洲黑雞、米諾卡雞、阿木雞(Amrox)、加利福尼亞州灰雞)，以及通常以商業(yè)規(guī)模詞養(yǎng)的火雞、雉、鵪鶉、鴨、鴕鳥(niǎo)和其它家禽的品系。也包括所有發(fā)育階段，包括胚胎和胎兒階段的單獨(dú)禽類(lèi)生物體。"治療性蛋白質(zhì)"或"藥用蛋白質(zhì)"包含全部或部分構(gòu)成藥物的氨基酸序列。"編碼序列"或"開(kāi)放閱讀框"指當(dāng)置于合適的調(diào)控序列控制下可在體外或體內(nèi)被轉(zhuǎn)錄和翻譯(如果是DNA)或翻譯(如果是mRNA)成多肽的多核苷酸或核酸序列。編碼序列的邊界由5'(氨基)末端翻譯起始密碼子和3'(羧基)末端翻譯終止密碼子界定。轉(zhuǎn)錄終止序列一般位于編碼序列的3'端。編碼序列的5'和/或3'末端可側(cè)接有非翻譯區(qū)。"外顯子"指基因的一部分，當(dāng)基因轉(zhuǎn)錄為核轉(zhuǎn)錄物時(shí)，該部分在核剪接除去內(nèi)含子或間插序列后以細(xì)胞質(zhì)mRNA的形式表達(dá)。核酸"控制序列"或"調(diào)控序列"指啟動(dòng)子序列、翻譯起始和終止密碼子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)控區(qū)、增強(qiáng)子等，它們對(duì)于在特定宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯某給定編碼序列是必需的和充分的。適合真核細(xì)胞的控制序列例如有啟動(dòng)子、聚腺苷酸信號(hào)和增強(qiáng)子。重組載體中不一定存在所有的這些控制序列只需存在對(duì)于所需基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯必需和充分的控制序列。"可操作性或操作性連接于"指可發(fā)揮所需功能的編碼和控制序列的配置。因此，操作性連接于編碼序列的控制序列可影響該編碼序列的表達(dá)。在細(xì)胞中，編碼序列可操作性連接于或受控于轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，在此區(qū)DNA聚合酶結(jié)合于啟動(dòng)子序列，將編碼序列轉(zhuǎn)錄為可翻譯成蛋白質(zhì)的mRNA?？刂菩蛄锌刹槐嘏c編碼序列毗連，只要它們可發(fā)揮功能指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。因此，例如，間插非翻譯的轉(zhuǎn)錄序列存在于啟動(dòng)子序列和編碼序列之間時(shí)，仍可認(rèn)為該啟動(dòng)子序列與該編碼序列"操作性連接"。對(duì)于核酸序列例如編碼序列和控制序列，術(shù)語(yǔ)"異源的"和"外源的"指正常情況下不與重組構(gòu)建物的某區(qū)域或特定染色體位點(diǎn)相關(guān)的序列，禾口/或正常情況下不與特定細(xì)胞相關(guān)的序列。因此，核酸構(gòu)建物的"外源"區(qū)域是在自然狀態(tài)下未發(fā)現(xiàn)與其相關(guān)連的其它核酸分子內(nèi)或與該分子相連的核酸的可鑒定區(qū)段。例如，構(gòu)建物的外源區(qū)域可包含與自然狀態(tài)下未與之相關(guān)連的序列相連的編碼序列。外源編碼序列的另一個(gè)例子是編碼序列本身是自然界中未發(fā)現(xiàn)的構(gòu)建物(例如，合成的含有與天然基因不同的密碼子的序列)。類(lèi)似地，用某宿主細(xì)胞正常情況下不存在的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的該宿主細(xì)胞，對(duì)本發(fā)明而言也認(rèn)為是外源的。本文所用術(shù)語(yǔ)"寡糖"、"寡糖結(jié)構(gòu)"、"糖基化模式"和"糖基化結(jié)構(gòu)"的含義基本相同，均指由糖殘基形成并連接于糖基化蛋白質(zhì)的一種或多種結(jié)構(gòu)。本文所用"外源蛋白質(zhì)"指自然狀態(tài)下不存在于特定組織或細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，外源表達(dá)構(gòu)建物或轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物是這種蛋白質(zhì)，或在特定組織或細(xì)胞自然狀態(tài)下不以某確定數(shù)量存在的蛋白質(zhì)。蛋的外源蛋白質(zhì)是通常該蛋中不存在的蛋白質(zhì)。例如，蛋的外源蛋白質(zhì)可以是因?yàn)楫a(chǎn)蛋動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因中編碼序列的表達(dá)而存在于該蛋中的蛋白質(zhì)。"內(nèi)源基因"指自然發(fā)生的正常情況下與特定細(xì)胞相關(guān)的基因或片段。"EPO"指"紅細(xì)胞生成素"，在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)可互換使用。本文所述的表達(dá)產(chǎn)物可包括具有確定化學(xué)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)性物質(zhì)。然而，精確的結(jié)構(gòu)取決于很多因素，尤其是對(duì)于蛋白質(zhì)很普遍的化學(xué)修飾。例如，因?yàn)樗械牡鞍踪|(zhì)都含有可電離的氨基和羧基基團(tuán)，所以可獲得酸性或堿性鹽形式或中性形式的蛋白質(zhì)。例如，可用糖分子(糖基化)或其它化學(xué)方法包括例如與脂、磷酸、乙?；鶊F(tuán)等共價(jià)結(jié)合或離子結(jié)合，經(jīng)常通過(guò)與糖連接的化學(xué)衍生方法來(lái)產(chǎn)生一級(jí)氨基酸序列。這些修飾可發(fā)生在體外或體內(nèi)，后者是宿主細(xì)胞通過(guò)翻譯后加工系統(tǒng)進(jìn)行的。這些修飾可增加或降低分子的生物活性，這些化學(xué)修飾的分子也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？寺　U(kuò)增、表達(dá)和純化的其他方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。代表性方法見(jiàn)Sambrook,Fritsch和Maniatis，實(shí)驗(yàn)室獵^，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(ColdSpringHarborLaboratory)(1989)。"載體"指包括單鏈、雙鏈、環(huán)狀或超螺旋DNA或RNA的多核苷酸。一個(gè)典型載體可包含以下操作性連接于適宜位置以使功能基因表達(dá)的元件復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、5'RNA前導(dǎo)序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、核酸盒(Nucleicacidcassette)、終止位點(diǎn)和聚腺苷酸化位點(diǎn)以及選擇性標(biāo)記序列。在具體應(yīng)用時(shí)可省略一個(gè)或多個(gè)此類(lèi)元件。核酸盒可包含供待表達(dá)核酸序列插入的限制性位點(diǎn)。在功能性載體中，核酸盒包含含有翻譯起始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)的待表達(dá)核酸序列。構(gòu)建物中可任選地包含內(nèi)含子，例如位于編碼序列的5'。構(gòu)建載體時(shí)要使特定的編碼序列和合適的調(diào)控序列位于該載體中，編碼序列相對(duì)于調(diào)控序列的位置和方向應(yīng)使得編碼序列在調(diào)控序列或調(diào)控序列的"控制"下轉(zhuǎn)錄。為實(shí)現(xiàn)這一目的，可能需要對(duì)編碼特定感興趣蛋白質(zhì)的序列進(jìn)行修飾。例如，在有些情況下可能需要修飾該序列使其以正確方向與控制序列相連，或使其保持讀碼框。在插入載體之前將控制序列和其他調(diào)控序列與編碼序列連接?；蛘撸瑢⒕幋a序列直接克隆到已含有控制序列和該控制序列調(diào)控下的合適的讀碼框中的限制性位點(diǎn)的表達(dá)載體中。"啟動(dòng)子"是DNA上可與RNA聚合酶結(jié)合從而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)。在有些實(shí)施方式中，通過(guò)添加或刪除序列來(lái)修飾啟動(dòng)子，或者以其它序列包括天然和合成序列以及這兩種序列的組合物來(lái)替代啟動(dòng)子。許多真核啟動(dòng)子含有兩種類(lèi)型的識(shí)別序列TATA框和上游啟動(dòng)子元件。前者，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游，參與指導(dǎo)RNA聚合酶在正確的位置啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，而后者似乎決定了轉(zhuǎn)錄速率，位于TATA盒上游。增強(qiáng)子也可促進(jìn)相連啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，但很多增強(qiáng)子只在特定細(xì)胞型中發(fā)揮功能。很多增強(qiáng)子/啟動(dòng)子元件來(lái)源于病毒，例如，SV40啟動(dòng)子，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子，羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子和鼠白血病病毒(MLV)啟動(dòng)子均在很多細(xì)胞型中有活性，被稱(chēng)為"遍在型"啟動(dòng)子?；蛘?，本發(fā)明中也可采用非組成型啟動(dòng)子例如小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子。插入克隆位點(diǎn)的核酸序列可含有編碼感興趣多肽的任何開(kāi)放讀碼框，條件是當(dāng)該編碼序列編碼感興趣的多肽時(shí)，它應(yīng)該沒(méi)有可阻礙產(chǎn)生正確mRNA分子和/或產(chǎn)生異常剪接的或異常mRNA分子的隱蔽剪接位點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)"家禽衍生的"指由家禽產(chǎn)生或獲得的組合物或物質(zhì)。"家禽"指可作為家畜飼養(yǎng)的禽類(lèi)，包括但不限于雞、鴨、火雞、鵪鶉和平胸鳥(niǎo)。例如，"家禽衍生的"可指雞衍生的、火雞衍生的和/或鵪鶉衍生的。"標(biāo)記基因"指編碼使正確轉(zhuǎn)染的細(xì)胞得以鑒定和分離的蛋白質(zhì)的基因。適宜的標(biāo)記基因包括，但不限于綠色、黃色和藍(lán)色熒光蛋白基因(分別為OP尸、17^、SF尸)。其他適宜的標(biāo)記基因包括胸苷激酶(A)、二氫葉酸還原酶(￡)///^)和氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶04尸//)基因。后者引入對(duì)氨基甙類(lèi)抗菌素如卡那霉素、新霉素和硫酸慶大霉素的抗性?？蓪⑦@些和其他標(biāo)記基因例如編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、P-內(nèi)酰胺酶、P-半乳糖苷酶(P-gal)的基因，與表達(dá)所需蛋白質(zhì)的基因一起整合入主要核酸盒，或者選擇標(biāo)記可能包含在獨(dú)立的載體上共轉(zhuǎn)染。"報(bào)道基因"是通過(guò)其編碼蛋白的存在來(lái)報(bào)道細(xì)胞活性的標(biāo)記基因。"逆轉(zhuǎn)錄顆粒"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒"指能夠?qū)⒎遣《綝NA或RNA轉(zhuǎn)導(dǎo)如細(xì)胞中的復(fù)制缺陷型或能夠復(fù)制的病毒。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化"、"轉(zhuǎn)導(dǎo)"和"轉(zhuǎn)染"均指將多核苷酸引入禽類(lèi)胚盤(pán)細(xì)胞中。"蛋白分泌部"(Magnum)是含有能合成和分泌禽蛋的卵清蛋白質(zhì)的管狀腺細(xì)胞的輸卵管漏斗和峽之間的部分。本文所用"MDOT啟動(dòng)子"是在輸卵管蛋白分泌部而非其它組織的管狀腺細(xì)胞中有活性的合成啟動(dòng)子。MDOT包含卵類(lèi)粘蛋白(MD)和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(OT)啟動(dòng)子的元件(圖13)。在"優(yōu)化的編碼序列"中用到術(shù)語(yǔ)"優(yōu)化的"，其中，可將在卵清蛋白質(zhì)卵清蛋白、溶菌酶、卵類(lèi)粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的各特定氨基酸最常用的密碼子用于設(shè)計(jì)被插入本發(fā)明載體中的優(yōu)化的人干擾素-(x2b(IFN-a2b)的多核苷酸序列。更具體地，優(yōu)化的人干擾素-(x2b的DNA序列可根據(jù)母雞輸卵管優(yōu)化密碼子的使用率通過(guò)威斯康辛軟件包9.1版(威斯康辛州麥迪遜的遺傳學(xué)計(jì)算組公司)的BACKTRANSLATE程序利用紅原雞卵白蛋白、溶菌酶、卵類(lèi)粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白編譯的密碼子使用率表來(lái)創(chuàng)建。例如，在這四種卵清蛋白質(zhì)中，四種丙氨酸密碼子的使用百分率為GCU34%、GCC31%、GCA26%、GCG8%。因此，可將GCU作為優(yōu)化的人IFN-a2b編碼序列中大多數(shù)丙氨酸的密碼子。用含有編碼優(yōu)化的人IFN-a2b基因的載體來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因禽，其能在組織和卵中表達(dá)轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的IFN-a2b(TPDIFN-a2b)。相似地，用上述方法設(shè)計(jì)按照本發(fā)明產(chǎn)生的其它編碼序列蛋白，如人紅細(xì)胞生成素(EPO)或其它蛋白質(zhì)。通過(guò)本發(fā)明的方法，可將轉(zhuǎn)基因?qū)肭蓊?lèi)胚胎胚盤(pán)細(xì)胞，產(chǎn)生在其種系組織的遺傳物質(zhì)中攜帶有該轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因雞、轉(zhuǎn)基因火雞、轉(zhuǎn)基因鵪鶉和其他禽類(lèi)。胚盤(pán)細(xì)胞是典型的vn-xn期細(xì)胞，或與之相等同的細(xì)胞，在一個(gè)實(shí)施方式中是近X期的細(xì)胞?？捎糜诒景l(fā)明的細(xì)胞包括胚胎生殖細(xì)胞(EG)、胚胎干細(xì)胞(ES)和原生殖細(xì)胞(PGC)。胚胎胚盤(pán)細(xì)胞可以是新分離的、維持在培養(yǎng)物中或胚胎中的。本文描述了可用于實(shí)施本發(fā)明方法的載體。可用這些載體將外源編碼序列穩(wěn)定導(dǎo)入禽類(lèi)基因組?；蛘?，可用這些載體在禽類(lèi)特定組織，例如禽類(lèi)輸卵管組織中生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)。還可將這些載體用于生產(chǎn)含有外源蛋白質(zhì)的禽蛋的方法中。在一個(gè)實(shí)施方式中，引入胚盤(pán)細(xì)胞之前編碼序列和啟動(dòng)子均位于5'和3'LTR之間。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，編碼序列和啟動(dòng)子均位于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的5'和3'LTR之間。在一個(gè)有用的實(shí)施方式中，該LTR或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來(lái)源于禽白血病病毒(ALV)、鼠白血病毒(MLV)或慢病毒。在一個(gè)實(shí)施方式中，該載體包含操作性連接于編碼序列的信號(hào)肽編碼序列，從而在細(xì)胞中翻譯后該信號(hào)肽將指導(dǎo)該載體表達(dá)的外源蛋白質(zhì)分泌入硬殼蛋的卵清中。該載體可包含標(biāo)記基因，其中所述標(biāo)記基因操作性連接于啟動(dòng)子。在有些情況下，將本發(fā)明的載體導(dǎo)入胚胎胚盤(pán)細(xì)胞是用新分離的或培養(yǎng)中的胚胎胚盤(pán)來(lái)進(jìn)行的。然后，一般是將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞注射入蛋的受體胚盤(pán)下的胚下腔內(nèi)。然而在有些情況下，也可將載體直接送入胚盤(pán)胚的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，用于轉(zhuǎn)染胚盤(pán)細(xì)胞并產(chǎn)生穩(wěn)定整合入禽基因組的載體含有某編碼序列和操作及位置上相關(guān)的啟動(dòng)子，以在禽類(lèi)輸卵管蛋白分泌部的管狀腺細(xì)胞中表達(dá)該編碼序列，其中，該編碼序列編碼一種可沉積于硬殼蛋卵清中的外源蛋白質(zhì)。任選地，啟動(dòng)子可以是卵白蛋白啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)足夠大的區(qū)段以指導(dǎo)編碼序列在管狀腺細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明包括將卵白蛋白啟動(dòng)子截短和/或?qū)⒙寻椎鞍讍?dòng)子的關(guān)鍵調(diào)控元件壓縮，使其保留在輸卵管蛋白分泌部管狀腺細(xì)胞中表達(dá)所需的序列，同時(shí)使其足夠小而易于與載體整合。在一個(gè)實(shí)施方式中，可利用卵白蛋白啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)區(qū)段。該區(qū)段包含卵清蛋白基因的5'側(cè)翼區(qū)域。卵白蛋白啟動(dòng)子區(qū)段的總長(zhǎng)度為0.88kb-7.4kb，優(yōu)選0.88kb-1.4kb。優(yōu)選該區(qū)段含有卵清蛋白基因的甾類(lèi)依賴(lài)性調(diào)控元件和負(fù)調(diào)控元件。任選地，該區(qū)段也包含卵白蛋白基因的5'非翻譯區(qū)(5'UTR)殘基。因此，該啟動(dòng)子可來(lái)源于卵白蛋白基因、溶菌酶基因、伴白蛋白基因、卵類(lèi)粘蛋白基因、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白基因或卵粘蛋白基因的啟動(dòng)子區(qū)(圖14)。此類(lèi)啟動(dòng)子的一個(gè)例子是包含卵類(lèi)粘蛋白啟動(dòng)子和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動(dòng)子元件的合成性MDOT啟動(dòng)子(圖13)。該啟動(dòng)子也可以是很大程度上但是不完全是對(duì)輸卵管蛋白分泌部特異性的，例如溶菌酶啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子也可以是鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子?；蛘?，該啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子(例如，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子，羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子，鼠白血病病毒(MLV)啟動(dòng)子等)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該啟動(dòng)子是巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、MDOT啟動(dòng)子、羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子、鼠白血病病毒(MLV)啟動(dòng)子、鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子、卵白蛋白啟動(dòng)子、溶菌酶啟動(dòng)子、伴白蛋白啟動(dòng)子、卵類(lèi)粘蛋白啟動(dòng)子、卵粘蛋白啟動(dòng)子和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動(dòng)子。任選地，該啟動(dòng)子可以是啟動(dòng)子區(qū)的至少一個(gè)區(qū)段，例如卵白蛋白啟動(dòng)子、溶菌酶啟動(dòng)子、伴白蛋白啟動(dòng)子、卵類(lèi)粘蛋白啟動(dòng)子、卵粘蛋白啟動(dòng)子和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，該啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子。圖1A和1B說(shuō)明了卵白蛋白啟動(dòng)子表達(dá)載體的例子?；騔是編碼外源蛋白質(zhì)的編碼序列。彎曲箭頭表示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施例中，此載體含有卵白蛋白基因1.4kb的5，側(cè)翼序列(圖1A)。圖1A中"-1.4kb啟動(dòng)子"序列對(duì)應(yīng)于從卵白蛋白基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約1.4kb開(kāi)始延伸到卵白蛋白基因5'非翻譯區(qū)中約9個(gè)殘基的序列。這個(gè)約1.4kb長(zhǎng)的區(qū)段含有兩個(gè)關(guān)鍵調(diào)控元件，甾類(lèi)依賴(lài)性調(diào)控元件(SDRE)和負(fù)調(diào)控元件(NRE)。之所以稱(chēng)為NRE是因?yàn)樗袔讉€(gè)在缺少激素(例如雌激素)時(shí)可阻斷基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控元件。一個(gè)更短的0.88kb區(qū)段也可含有這兩種元件。在另一個(gè)實(shí)施例中，此載體含有卵白蛋白基因約7.4kb的5'側(cè)翼序列并含有兩個(gè)附加元件(HS-III和HS-IV)，已知其中一個(gè)含有可使該基因被雌激素誘導(dǎo)的功能區(qū)(圖1B)。一個(gè)更短的6kb區(qū)段也含有這四個(gè)元件，可任選地用于本發(fā)明。用于本發(fā)明隨機(jī)整合的每個(gè)載體優(yōu)選包含至少一個(gè)1.2kb的雞|3-珠蛋白基因座元件，該元件可使基因在插入基因組的位點(diǎn)既不活化也不失活。在一個(gè)實(shí)施方式中，將兩個(gè)絕緣子元件加入到卵白蛋白基因構(gòu)建物的一端。在13-珠蛋白基因座中，此絕緣子元件作用是阻止遠(yuǎn)端位點(diǎn)控制區(qū)(LCR)活化珠蛋白基因區(qū)上游的基因，并且已顯示可克服轉(zhuǎn)基因蠅中的位置效應(yīng)，表明它們可防止插入位點(diǎn)的正效應(yīng)和負(fù)效應(yīng)。只有在該基因的5'或3'末端才需要絕緣子元件，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因是以多拷貝串聯(lián)形式整合有效產(chǎn)生了一系列側(cè)翼連接有相鄰轉(zhuǎn)基因的絕緣子的基因。在另一個(gè)實(shí)施方式中，絕緣子元件不連于該載體而是和該載體共轉(zhuǎn)染。這種情況下，所述載體和元件通過(guò)隨機(jī)整合入基因組的過(guò)程在細(xì)胞中串聯(lián)連接。任選地，每個(gè)載體還可包含標(biāo)記基因以鑒定和富集已穩(wěn)定整合表達(dá)載體的細(xì)胞克隆。用能驅(qū)動(dòng)各類(lèi)細(xì)胞型高水平表達(dá)的遍在啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)該標(biāo)記基因的表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，該標(biāo)記基因是受溶菌酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的人干擾素(基因)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，是受蟾蜍延伸因子l-a(e/-/cc)啟動(dòng)子(Johnson禾nKrieg，147:223-26(1994))驅(qū)動(dòng)的綠色熒光蛋白(GFP)報(bào)告基因(Zolotukhin等，</.fW70:4646-4654(1995))。蟾蜍啟動(dòng)子是一種能在各類(lèi)細(xì)胞中都表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子。GFP含有能增強(qiáng)熒光的突變并且已被人源化或修飾以使其密碼子符合人基因的密碼子使用特點(diǎn)。因?yàn)榍蓊?lèi)的密碼子使用和人基本相同，所以該基因的人源化形式也能在禽類(lèi)胚盤(pán)細(xì)胞中高表達(dá)。在其他可選的實(shí)施方式中，該標(biāo)記基因可操作性連接于i/SnCMV、P-肌動(dòng)蛋白或RSV的遍在啟動(dòng)子中的一個(gè)。雖然人和禽類(lèi)的密碼子使用相配很好，但用無(wú)脊椎動(dòng)物的基因作為轉(zhuǎn)基因中的編碼序列時(shí)，可修飾無(wú)脊椎動(dòng)物的基因序列以改變適當(dāng)?shù)拿艽a子從而使密碼子使用與人和禽類(lèi)的相似?？刹捎帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的任何幾種方法轉(zhuǎn)染胚盤(pán)細(xì)胞。首先將核酸與聚賴(lài)氨酸或陽(yáng)離子脂質(zhì)混和以促進(jìn)載體穿過(guò)細(xì)胞膜從而幫助將載體導(dǎo)入細(xì)胞。然而，優(yōu)選通過(guò)采用輸送運(yùn)運(yùn)載體例如脂質(zhì)體或病毒將載體導(dǎo)入細(xì)胞。用于將本發(fā)明載體導(dǎo)入胚盤(pán)細(xì)胞的病毒包括，但不限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒和牛痘病毒。在轉(zhuǎn)染胚盤(pán)細(xì)胞的一種方法中，用包裝的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將該載體運(yùn)送進(jìn)胚胎胚盤(pán)細(xì)胞以使該載體整合入禽類(lèi)基因組。向胚胎中的胚胎胚盤(pán)細(xì)胞運(yùn)送逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒的另一種方法是，可將能產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的輔助細(xì)胞運(yùn)送入胚盤(pán)。用于將轉(zhuǎn)基因隨機(jī)插入禽類(lèi)基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒是復(fù)制缺陷型禽類(lèi)白血病病毒(ALV)、復(fù)制缺陷型鼠白血病病毒(MLV)或慢病毒。為了產(chǎn)生合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將卵白蛋白啟動(dòng)子的一個(gè)區(qū)域和一個(gè)或多個(gè)外源基因插入逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的5'和3'長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)之間以修飾pNLB載體。本發(fā)明考慮到位于管狀腺細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子下游的任何編碼序列將在管狀腺細(xì)胞中表達(dá)。例如，因?yàn)槁寻椎鞍讍?dòng)子驅(qū)動(dòng)卵清蛋白的表達(dá)且在輸卵管管狀腺細(xì)胞中有活性，所以卵白蛋白啟動(dòng)子能在輸卵管蛋白分泌部管狀腺細(xì)胞中表達(dá)。雖然在培養(yǎng)的輸卵管管狀腺細(xì)胞中檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)7.4kb的卵白蛋白啟動(dòng)子產(chǎn)生活性最高的構(gòu)建物，然而用于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)優(yōu)選將卵白蛋白啟動(dòng)子縮短。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體含有卵白蛋白啟動(dòng)子的1.4kb片段；0.88kb區(qū)段也是足夠的。本發(fā)明的任何載體也可任選包含信號(hào)肽的編碼序列，該信號(hào)肽可指導(dǎo)載體中編碼序列表達(dá)的蛋白質(zhì)從輸卵管管狀腺細(xì)胞分泌出來(lái)。本發(fā)明的這一方面有效地?cái)U(kuò)大了利用本發(fā)明方法可沉積于禽蛋的外源蛋白質(zhì)的范圍。當(dāng)一種外源蛋白質(zhì)不能分泌時(shí)，可修飾含有其編碼序列的載體使其含有溶菌酶基因的60bp編碼信號(hào)肽的DNA序列。可將編碼該信號(hào)肽的DNA序列插入載體中并使其位于該DNA編碼蛋白質(zhì)的N端。圖2A-2D說(shuō)明合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建物的例子。此載體構(gòu)建物與5'和3'側(cè)翼LTR—起插入禽類(lèi)基因組中。A^o是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。彎曲箭頭表示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。圖2A和2B顯示含有編碼溶菌酶信號(hào)肽(LSP)的序列的LTR和輸卵管轉(zhuǎn)錄物，而圖2C和2D顯示不含此序列的轉(zhuǎn)錄物。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體策略有兩部分?？蓪⒑姓婧松镄盘?hào)肽的任何蛋白質(zhì)克隆入圖2B和2D所示載體中。可將通常不能分泌的任何蛋白質(zhì)克隆入圖2A和2B所示載體以使其能由管狀腺細(xì)胞分泌。圖2E說(shuō)明將外源蛋白質(zhì)克隆入溶菌酶信號(hào)肽載體的策略。用一對(duì)含有可使擴(kuò)增的基因在雙酶切后插入質(zhì)粒中限制性酶切位點(diǎn)的寡聚核苷酸作為引物，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增編碼序列，基因I的一個(gè)拷貝。5'和3'寡聚核苷酸分別含有5^361和限制性位點(diǎn)。本發(fā)明的另一方面包括在本發(fā)明的任何載體中利用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)以從雙順?lè)醋踊蚨囗樂(lè)醋觤RNA中翻譯兩種或多種蛋白質(zhì)(實(shí)施例15)。將IRES單元融合于一種或多種其它編碼序列的5'末端，然后插入載體中原始編碼序列的末端，從而通過(guò)IRES使這些編碼序列彼此分開(kāi)(圖2F、15A和15D)。按照本發(fā)明的這一方面，有利于產(chǎn)物的翻譯后修飾，因?yàn)橐粋€(gè)編碼序列編碼的酶能夠修飾另一個(gè)編碼序列的產(chǎn)物。例如，第一個(gè)編碼序列編碼的膠原可能被第二個(gè)編碼序列編碼的酶羥基化和活化。在圖2F的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體例子中，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)元件位于兩個(gè)外源編碼序列(基因X和基因F)之間。IRES允許蛋白X和蛋白Y由同一轉(zhuǎn)錄物翻譯，該轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄由啟動(dòng)子如卵清蛋白啟動(dòng)子指導(dǎo)。彎曲箭頭表示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)?；騔編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)預(yù)期在管狀腺細(xì)胞中是最高的，該細(xì)胞特異性表達(dá)但不分泌?；騳編碼的蛋白質(zhì)也在管狀腺細(xì)胞中特異表達(dá)，但因?yàn)樗挥行Х置?，所以蛋白質(zhì)Y被包裝入蛋中。圖15A和15D的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體例子中，由于設(shè)置了腦心肌炎病毒(EMCV)的IRES，一個(gè)載體pCMV-LC-emcvIRES-HC即可表達(dá)人單克隆抗體的輕鏈(LC)和重鏈(HC)。可用CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄。(又見(jiàn)Murakami等(1997)"通過(guò)含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的可復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄病毒載體高水平表達(dá)外源基因"(High-levelexpressionofexogenousgenesbyreplication-competentretrovirusvectorswithaninternalribosomalentrysite)G匿202:23-29;Chen等，(1999)"更有效的禽類(lèi)復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的產(chǎn)生和設(shè)計(jì)"(Productionanddesignofmoreeffectiveavianreplication-incompetentretroviralvectors)Dev.5/o/.214:370-384;Noel等(2000)"通過(guò)遺傳修飾的皮膚成纖維細(xì)胞向全身持續(xù)輸送單克隆抗體"(Sustainedsystemicdeliveryofmonoclonalantibodiesbygeneticallymodifiedskinfibroblasts)J"./"veW.Z)er謹(jǐn)/。/.115:740-745)。本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明任何方法中所用載體的編碼序列都含有一個(gè)3'非翻譯區(qū)(3'UTR)以保證產(chǎn)生的RNA的穩(wěn)定性。當(dāng)將3'UTR添加到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)，該啟動(dòng)子、基因Z和3'UTR在構(gòu)建物中的方向必須反轉(zhuǎn)，以使3'UTR的加入不影響全長(zhǎng)基因組RNA的轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)實(shí)施方式中，該3'UTR可以是卵白蛋白或溶菌酶基因的3'UTR，或是在蛋白分泌部細(xì)胞中有功能的任何3'UTR，如SV40的晚期區(qū)域。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，用組成型啟動(dòng)子(例如CMV)在禽類(lèi)輸卵管蛋白分泌部中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的編碼序列。這種情況下，表達(dá)不局限于蛋白分泌部；在禽類(lèi)的其他組織(例如，血液)中也有表達(dá)。利用這種含有組成型啟動(dòng)子和編碼序列的轉(zhuǎn)基因，尤其適合于實(shí)現(xiàn)或驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)在輸卵管中的表達(dá)以及隨后分泌入卵清中(見(jiàn)圖8A，以CMV驅(qū)動(dòng)的構(gòu)建物為例，如在雞中表達(dá)IFN-a2b的pNLB—CMV-IFN載體)。圖3A顯示基于復(fù)制缺陷型禽白血病病毒(ALV)的載體pNLB，一種適合用于本發(fā)明的載體。在pNLB載體中，用新霉素抗性基因(A^o)和編碼(3-半乳糖苷酶的/acZ基因替代了大部分ALV的基因組。圖3B顯示載體pNLB-CMV-BL，其中，用CMV啟動(dòng)子和(3-內(nèi)酰胺酶編碼序列((3-丄fl或BL)取代/acZ基因。在具體實(shí)施例(實(shí)施例l，見(jiàn)下)中報(bào)道了該載體的構(gòu)建。由CMV啟動(dòng)子表達(dá)P-內(nèi)酰胺酶，并且在其3'長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)中有聚腺苷酸信號(hào)(pA)。p-內(nèi)酰胺酶蛋白質(zhì)含有天然信號(hào)肽；因此，它存在于血液和卵清中。以pNLB-CMV-BL載體轉(zhuǎn)導(dǎo)禽類(lèi)胚胎(實(shí)施例2，見(jiàn)下)。產(chǎn)生的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的母雞每只卵的卵清含有高達(dá)60微克Oig)的分泌的活性)3-內(nèi)酰胺酶(實(shí)施例2和3，見(jiàn)下)。圖8A和8B分別顯示用于表達(dá)干擾素-a2b(IFN-a2b)的pNLB-CMV-IFN載體和用于表達(dá)促紅細(xì)胞生成素(EPO)的pNLB-MDOT-EPO載體。這兩種外源蛋白質(zhì)(EPO，IFN)可在禽類(lèi)中表達(dá)，優(yōu)選的是雞和火雞。pNLB-MDOT-EPO載體是以EPO編碼序列替代BL編碼序列而創(chuàng)建的(實(shí)施例10，見(jiàn)下)。在一個(gè)實(shí)施方式中，采用稱(chēng)為MDOT的合成啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)EPO的表達(dá)。MDOT含有卵類(lèi)粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動(dòng)子元件?？筛鶕?jù)母雞輸卵管優(yōu)化人EPO的DNA序列的密碼子使用，通過(guò)威斯康辛軟件包9.1版(威斯康星州麥迪遜的遺傳學(xué)計(jì)算組公司)的BACKTRANSLATE程序，利用由紅原雞卵白蛋白、溶菌酶、卵類(lèi)粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白編譯的密碼子使用表來(lái)創(chuàng)建。合成EPODNA序列并將其克隆入載體產(chǎn)生質(zhì)粒pNLB-MDOT-EPO(又名pAVIJCRA145.27.2.2)。在一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)生了此載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒，滴定這些轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒以確定可用于注射胚胎的合適濃度。然后將轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒注入蛋，其后孵化蛋21天。可用采集于孵化后一周的仔雞血清樣品做ELISA試驗(yàn)來(lái)測(cè)定外源蛋白質(zhì)例如EPO的水平。選擇雄雞用于交配，其中篩選出精子中含有EPO轉(zhuǎn)基因的G。公雞。優(yōu)選通過(guò)人工授精使精液樣品中轉(zhuǎn)基因水平最高的公雞與非轉(zhuǎn)基因母雞交配。篩選血液DNA樣品中該轉(zhuǎn)基因的存在。常能發(fā)現(xiàn)一些仔雞是轉(zhuǎn)基因的(G，禽)。檢測(cè)仔雞血清中人EPO的存在(例如ELISA試驗(yàn))。也可檢測(cè)G,母雞蛋的卵清中人EPO的存在。本發(fā)明中蛋中的EPO(即，來(lái)源于優(yōu)化的人EPO編碼序列)具有生物活性(實(shí)施例11)。類(lèi)似地，以IFN編碼序列替代BL編碼序列可得到pNLB-CMV-IFN載體(圖8A)(實(shí)施例12，見(jiàn)下)。在一個(gè)實(shí)施方式中，用組成型巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV)驅(qū)動(dòng)IFN表達(dá)。更具體地，用巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和SV40聚A位點(diǎn)控制IFN編碼序列。圖8A說(shuō)明用于在禽類(lèi)，例如雞和火雞中表達(dá)IFN的pNLB-CMV-IFN。創(chuàng)建了人IFN-a2b的優(yōu)化編碼序列，其中，用在卵清蛋白質(zhì)卵白蛋白、溶菌酶、卵類(lèi)粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白中的每個(gè)特定氨基酸最常使用的密碼子來(lái)設(shè)計(jì)插入本發(fā)明載體中的人IFN-a2b序列。更具體地，優(yōu)化的人IFN-a2bDNA序列(圖IIA)的密碼子使用可根據(jù)母雞的輸卵管優(yōu)化，通過(guò)BACKTRANSLATE程序(見(jiàn)上)利用紅原雞卵白蛋白、溶菌酶、卵類(lèi)粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白編譯的密碼子使用表來(lái)創(chuàng)建。例如，在這四種卵清蛋白質(zhì)中，四種丙氨酸密碼子的使用百分率為GCU34%、GCC31%、GCA26%、GCG8%。因此，可將GCU作為優(yōu)化的人IFN-a2b序列中大多數(shù)丙氨酸的密碼子。可用含有優(yōu)化的人IFN-a2b序列的基礎(chǔ)的載體來(lái)產(chǎn)生在其組織和蛋中表達(dá)TPDIFN-a2b的轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)。產(chǎn)生此載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒并滴定這些轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒以確定可用于注射胚胎的合適濃度(實(shí)施例2，見(jiàn)下)。這樣就產(chǎn)生了嵌合的禽類(lèi)(又見(jiàn)實(shí)施例13，見(jiàn)下)。依據(jù)Speksnijder工藝(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，897,998)將禽蛋放于窩中，將轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒注入蛋。注射約21天后蛋孵化。采集孵化后一周的仔雞血清樣品測(cè)定其中hIFN的水平(例如ELISA試驗(yàn))。與EPO類(lèi)似(見(jiàn)上)，選擇雄雞用于交配。為篩選精液中含有IFN轉(zhuǎn)基因的GO公雞，提取公雞精液樣品的DNA。通過(guò)人工授精，使精液樣品中轉(zhuǎn)基因水平最高的G0公雞與非轉(zhuǎn)基因母雞交配。篩選血液DNA樣品中該轉(zhuǎn)基因的存在。檢測(cè)轉(zhuǎn)基因公雞的血清中MFN的存在(例如用ELISA試驗(yàn))。如果證實(shí)有該外源蛋白質(zhì)，用轉(zhuǎn)基因公雞的精液人工授精非轉(zhuǎn)基因母雞。一定比率的后代將含有該轉(zhuǎn)基因(例如，大于50%)。當(dāng)本發(fā)明的蛋中存在IFN(即來(lái)源于優(yōu)化的人IFN編碼序歹U)時(shí)，要檢測(cè)IFN的生物活性。與EPO類(lèi)似，這類(lèi)蛋通常含有具有生物活性的IFN，如TPDIFN-a2b(圖IIB)。本發(fā)明提供在禽類(lèi)輸卵管中生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)和生產(chǎn)含有外源蛋白質(zhì)的蛋的方法，該方法還包括一個(gè)附加后續(xù)步驟，即提供合適的載體及將此載體導(dǎo)入胚胎胚盤(pán)細(xì)胞從而使載體整合入禽類(lèi)基因組。該后續(xù)步驟包括從前面步驟產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因胚盤(pán)細(xì)胞得到成熟的轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)。任選地，從胚盤(pán)細(xì)胞產(chǎn)生成熟的轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)任選包括將轉(zhuǎn)基因胚盤(pán)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到胚胎并使該胚胎充分發(fā)育，從而隨著該胚胎的發(fā)育所述細(xì)胞整合入禽類(lèi)。然后使產(chǎn)生的仔雞生長(zhǎng)成熟。在一個(gè)實(shí)施方式中，直接用胚胎中的載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)胚盤(pán)細(xì)胞(實(shí)施例2)。使產(chǎn)生的胚胎發(fā)育，使仔雞成熟。在這兩種情況下，轉(zhuǎn)基因胚盤(pán)細(xì)胞產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)稱(chēng)為創(chuàng)始禽。有些創(chuàng)始禽在其輸卵管蛋白分泌部管狀腺細(xì)胞中攜帶有轉(zhuǎn)基因，這些禽將在其輸卵管中表達(dá)轉(zhuǎn)基因編碼的外源蛋白質(zhì)。除輸卵管之外，外源蛋白質(zhì)也可能在其他組織中表達(dá)(例如，血液)。如果外源蛋白質(zhì)含有適當(dāng)?shù)男盘?hào)序列，它將會(huì)分泌到輸卵管腔和蛋的卵清中。有些創(chuàng)始禽為種系創(chuàng)始禽(實(shí)施例8和9)。種系創(chuàng)始禽是在其種系組織的遺傳物質(zhì)中攜帶有轉(zhuǎn)基因的創(chuàng)始禽，它們也可在輸卵管蛋白分泌部管狀腺細(xì)胞中攜帶有表達(dá)外源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因。因此，根據(jù)本發(fā)明，轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)將含有表達(dá)外源蛋白質(zhì)的管狀腺細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因禽的后代也將含有表達(dá)外源蛋白質(zhì)的輸卵管蛋白分泌部管狀腺細(xì)胞?；蛘撸蟠菘稍谇莸奶囟ńM織中表達(dá)該外源基因表達(dá)而決定的某種表型(實(shí)施例6，表2)。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)基因禽是雞或火雞?？捎帽景l(fā)明高產(chǎn)量低成本表達(dá)所需蛋白質(zhì)，包括可用作人類(lèi)和動(dòng)物的藥物、診斷劑以及家畜飼料添加劑的蛋白質(zhì)。例如，本發(fā)明包括產(chǎn)生這種蛋白的轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)和卵清中含有該蛋白的轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)產(chǎn)的蛋。本發(fā)明考慮用于生產(chǎn)任何所需蛋白質(zhì)，包括藥用蛋白質(zhì)，其中需要按照本發(fā)明將該蛋白的編碼序列引入輸卵管細(xì)胞中。實(shí)際上，迄今為止檢測(cè)的按照本發(fā)明異源產(chǎn)生的所有蛋白質(zhì)，包括干擾素a2b、GM-CSF、干擾素P、紅細(xì)胞生成素、G-CSF、CTLA4-Fc融合蛋白和P-內(nèi)酰胺酶均已用本文所述方法成功生產(chǎn)。特別感興趣的是如本文所述生產(chǎn)人類(lèi)蛋白質(zhì)?？紤]到按照本發(fā)明生產(chǎn)本文所述各蛋白(有人形式)的人形式?？紤]用本文所述方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)包括但不限于融合蛋白、生長(zhǎng)激素、細(xì)胞因子、結(jié)構(gòu)蛋白和酶，包括人生長(zhǎng)激素、干擾素、溶菌酶和p-酪蛋白、白蛋白、oc-l抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、膠原、因子VIII、IX、X(等)、血纖蛋白原、胰島素、乳鐵蛋白、蛋白C、紅細(xì)胞生成素(EPO)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、組織型血纖蛋白溶酶原活化子(tPA)、促生長(zhǎng)素和胰凝乳蛋白酶。也可按照本文所述產(chǎn)生修飾的免疫球蛋白和抗體，包括結(jié)合于人腫瘤細(xì)胞表面抗原并破壞它們的免疫毒素?？砂凑毡疚乃錾a(chǎn)的治療性蛋白質(zhì)的其它具體例子包括但不限于因子vm、b-結(jié)構(gòu)域缺失的因子vm、因子VIIa、因子IX，抗凝劑；水蛭素、阿替普酶、tpa、瑞替普酶、tpa、tpa-5個(gè)結(jié)構(gòu)域中缺失3個(gè)、胰島素、賴(lài)脯胰島素、阿斯巴特胰島素、甘精胰島素、長(zhǎng)效胰島素類(lèi)似物、hgh、高血糖素、tsh、促卵泡素-p、fsh、gm-csf、pdgh、ifna2、ifna2a、ifna2b、inf-a、inf-卩l(xiāng)b、ifn-(3la、ifn-ylb、il-2、il-ll、hbsag、ospa、抗t-淋巴細(xì)胞抗原的鼠單抗、抗tag-72的鼠單抗、腫瘤相關(guān)糖蛋白、衍生自抗血小板表面受體gpII(b)/III(a)的嵌合單抗的fab片段、抗腫瘤相關(guān)抗原ca125的鼠單抗片段、抗人癌胚抗原cea的鼠單抗片段、抗人心肌球蛋白的鼠單抗片段、抗腫瘤表面抗原psma的鼠單抗片段、抗hmw-maa的鼠單抗片段(fab/fab2混合物)、抗-癌相關(guān)抗原的鼠單抗片段(fab)、抗nca90的單抗片段(fab)、表面粒細(xì)胞非特異性交叉反應(yīng)抗原、抗b淋巴細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)的cd20抗原的嵌合單抗、抗il2受體a鏈的人源化單抗、抗il2受體a鏈的嵌合單抗、抗tnf-a的嵌合單抗、抗呼吸道合胞病毒表面上的表位的人源化爭(zhēng)抗、抗her2的人源化單抗、人表皮生長(zhǎng)因子受體2、抗細(xì)胞角蛋廣i腫瘤相關(guān)抗原的人單抗、抗-ctla4、抗b淋巴細(xì)胞cd20表面抗原的嵌合單抗、阿法鏈道酶-DNA,、p葡糖腦苷脂酶、tnf-a、il-2-G喉毒素融合蛋白、tnfr-lgg片段融合蛋l(fā)'l、拉羅尼酶、DNA酶、阿法賽特(alefacept)、阿法達(dá)貝汀(集落刺激因了.)、托西莫單抗、鼠單抗、阿來(lái)組單抗、拉布立酶、阿加糖酶J3、特立帕肽、甲狀旁腺激素衍生物、阿達(dá)木單抗(lggl)、阿那白滯素、生物改性劑、奈l凡i、、/:肽、人(3型利鈉肽(hbnp)、集落刺激因子、培維索孟、人生長(zhǎng)激素受體拮抗劑、重組激活的蛋白c、奧馬佐單抗、免疫球蛋白e(lge)阻斷劑、替伊莫單抗、ACTH、高血糖素、促生長(zhǎng)素抑制素、生長(zhǎng)激素、胸腺素、甲狀旁腺激素、色素激素、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素、紅細(xì)胞生成素、黃體生成素、絨毛膜促性腺素、下丘腦釋放因子、依那西普、抗利尿激素、促乳素和促甲狀腺激素。本發(fā)明包括產(chǎn)生多聚體蛋白，包括免疫球蛋白，如抗體和其抗原結(jié)合片段的方法。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中'該多聚體蛋白是免疫球蛋Cl，其中第一個(gè)第二個(gè)異源多肽分別是免疫球蛋白重鏈和輕鏈。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)表達(dá)載體的轉(zhuǎn)錄爭(zhēng)位編碼的免疫球蛋A多肽可以是含有可變區(qū)或其變體的免疫球蛋白重鏈多肽，還可包含D區(qū)、J區(qū)、C區(qū)或其組合。表達(dá)載體編碼的免疫球蛋白多肽也可以是含有可變區(qū)或其變體的免疫球蛋白輕鏈多肽，還可包含J區(qū)和C區(qū)。本發(fā)明也涉及由同一動(dòng)物物種或多種物種產(chǎn)生的多重免疫球蛋白區(qū)域，這些物種包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和雞。在某些實(shí)施方式中，抗體是人抗體或人源化抗體。在其它實(shí)施方式中，至少一種表達(dá)載體編碼的免疫球蛋白多肽包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)、免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和接頭肽，從而形成能夠選擇性結(jié)合抗原的單鏈抗體。可用本發(fā)明方法產(chǎn)生的治療性抗體的例子包括但不限于賀賽汀TM(曲妥珠單抗)(加利福尼亞州基因泰克公司(Genetech，CA))，它是用于治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的人源化抗-HER2單克隆抗體；REOPRO(阿昔單抗)(森托克公司(Centocor))，它是血小板上糖蛋白1Ib/IIIa受體的抗體，用于預(yù)防形成血凝塊；ZENAPAX(達(dá)珠單抗)(瑞士的羅氏制藥公司(RochePharmaceuticals,Switzerland)),它是免疫抑制性人源化抗-CD25單克隆抗體，用于預(yù)防急性腎移植排斥反應(yīng)；PANOREXtm，它是鼠抗-17-IA細(xì)胞表面抗原IgG2a抗體(葛蘭素史克/森托克(GlaxoWellcome/Centocor));BEC2，它是抗-獨(dú)特型(GD3表位)IgG抗體(因克隆系統(tǒng)公司(ImCloneSystem));IMC-C225，它是嵌合的抗-EGFRIgG抗體(因克隆系統(tǒng)公司)；維他辛(VITAXINTM)，它是人源化抗-aV(33整聯(lián)蛋白抗體(應(yīng)用分子進(jìn)化/米迪繆尼(AppliedMolecularEvolution/Medlmmune));坎帕斯(Campath);坎帕斯1H/LDP-03,它是人源化抗CD52IgGl抗體(柳克賽特公司(Leukosite));SmartM195，它是人源化抗-CD33IgG抗體(蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室/卡尼伯(ProteinDesignLab/Kanebo));利妥昔tm，它是嵌合抗-CD20IgGl抗體(IDEC制藥/基因泰克(IDECPharm/Genentech)，羅氏/杰題克(Roche/Zettyaku));LYMPHOCIDE，它是人源化抗-CD22IgG抗體(免疫醫(yī)學(xué)公司(Immunomedics));ICM3，它是人源化抗-ICAM3抗體(ICOS制藥公司(ICOSPharm));IDEC-114,它是靈長(zhǎng)動(dòng)物抗-CD80抗體(IDEC制藥公司/三菱公司(IDECPharm/Mitsubishi));ZEVALIN,它是放射性標(biāo)記的鼠抗-CD20抗體(IDEC/ScheringAG);IDEC-131,它是人源化抗CD40L抗體(IDEC/埃塞公司(Eisai));IDEC-151,它是靈長(zhǎng)源化抗-CD4抗體(IDEC);IDEC-152，它是靈長(zhǎng)源化抗-CD23抗體(IDEC/Seikagaku);SMART抗-CD3，它是人源化抗-CD3IgG(蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室)；5G1.1，它是人源化抗-補(bǔ)體因子5(CS)抗體(阿來(lái)興制藥公司(AlexionPharm));D2E7，它是人源化抗-TNF-a抗體(CATIBASF);CDP870,它是人源化抗-TNF-aFab片段(塞爾泰克公司(Celltech));IDEC-151，它是靈長(zhǎng)源化抗-CD4IgGl抗體(IDEC制藥公司/史可必成公司(SmithKlineBeecham));MDX-CD4，它是人抗-CD4IgG抗體(美達(dá)萊克斯公司/埃塞公司/基馬公司(Medarex/Eisai/Genmab));CDP571，它是人源化抗-TNF-aIgG4抗體(塞爾泰克公司)；LDP-02，它是人源化抗-a4卩7抗體(柳克賽特公司/基因泰克公司)；OrthoCloneOKT4A，它是人源化抗-CD4IgG抗體(奧森生物技術(shù)公司(OrthoBiotech));ANTOVATM，它是人源化抗CD40LIgG抗體(百集公司(Biogen));ANTEGREN,它是人源化抗-VLA-4IgG抗體(伊蘭公司(Elan));CAT-152，它是人抗-TGF-卩2抗體(劍橋抗體科技公司(CambridgeAbTech));西妥昔單抗(BMS)，它是單克隆抗-EGF受體(EGFr)抗體；貝伐單抗(基因泰克公司)，它是抗-VEGF人單克隆抗體；英夫利昔單抗(森托克公司(Centocore)，JJ)，它是用于治療自身免疫病的嵌合(小鼠和人)單克隆抗體；吉妥單抗(惠氏公司(Wyeth))，它是用于化療的單克隆抗體；和拉尼組單抗(Ranibizumab)(基因泰克公司)，它是用于治療黃斑變性的嵌合(小鼠和人)單克隆抗體。一方面，本發(fā)明涉及家禽或禽類(lèi)產(chǎn)生的G-CSF。一方面，本發(fā)明涉及具有家禽產(chǎn)生的糖基化模式的G-CSF(TPDG-CSF)，其中該G-CSF獲自禽細(xì)胞，如雞、鵪鶉或火雞的禽細(xì)胞。本發(fā)明也包括人蛋白質(zhì)，包括細(xì)胞因子，如家禽產(chǎn)生的分離或純化形式的G-CSF，還包括人蛋白質(zhì)，包括細(xì)胞因子，如家禽產(chǎn)生的藥物組合物形式的G-CSF?？赏ㄟ^(guò)蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易了解的方法分離包含G-CSF的蛋白質(zhì)。用于產(chǎn)生藥物組合物的配方組成是本領(lǐng)域眾所周知的。本發(fā)明包括轉(zhuǎn)基因家禽產(chǎn)生的治療性蛋白質(zhì)或藥用蛋白質(zhì)，其具有衍生自禽類(lèi)的家禽產(chǎn)生的糖基化模式。例如，本發(fā)明包括由禽類(lèi)產(chǎn)生的干擾素-a2(TPDIFN-a2)。TPDIFN-a2b(如物種類(lèi)型b)顯示正常情況下人外周血白細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素-a2b(PBLIFN-a2b)中不存在的新糖基化模式并含有新糖形(條帶4和5是a-Gal延伸的二糖；見(jiàn)圖9)。TPDIFN-a2b還含有與人PBLIFN-ct2b相似的在雞中比人中更有效產(chǎn)生的O-連接的糖結(jié)構(gòu)。本發(fā)明考慮到含有如本文所述產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的優(yōu)化多核苷酸序列的分離多核苷酸。例如，本發(fā)明包括人IFN-a2b的禽類(lèi)優(yōu)化的編碼序列，即重組轉(zhuǎn)基因家禽產(chǎn)生的干擾素-a2b(TPDIFN-a2b)(SEQIDNO:1)。優(yōu)化的人IFN-a2b編碼序列包含498個(gè)核酸和165個(gè)氨基酸(見(jiàn)SEQIDNO:l和圖IIA)。類(lèi)似地，天然的人IFN-a2b編碼序列包含498個(gè)核苷酸(NCBI登錄號(hào)AF405539和GI:15487989)和165個(gè)氨基酸(NCBI登錄號(hào)AAL01040和GI:15487990)?？衫迷诼亚宓鞍踪|(zhì)卵白蛋白、溶菌酶、卵類(lèi)粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白中各特定氨基酸最常使用的密碼子來(lái)設(shè)計(jì)優(yōu)化的人干擾素-oc2b編碼序列并將其插入本發(fā)明載體。更具體地，優(yōu)化的人干擾素-a2b的DNA序列的密碼子使用可根據(jù)母雞輸卵管優(yōu)化，通過(guò)威斯康辛軟件包9.1版(威斯康辛州麥迪遜的遺傳學(xué)計(jì)算組公司)的BACKTRANSLATE程序，利用紅原雞卵白蛋白、溶菌酶、卵類(lèi)粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白編譯的密碼子使用表來(lái)創(chuàng)建。例如，在這四種卵清蛋白質(zhì)中，四種丙氨酸密碼子的使用百分率為GCU34%、GCC31%、GCA26%、GCG8%。因此，可將GCU作為優(yōu)化的人IFN-a2b編碼序列中大多數(shù)丙氨酸的密碼子?？捎煤袃?yōu)化的人IFN-a2b基因的載體來(lái)產(chǎn)生在其組織和蛋中表達(dá)TPDIFN-a2b的轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)。如實(shí)施例13所述(參見(jiàn)下文)，在雞中產(chǎn)生TPDIFN-a2b。然而，也可在火雞和其它禽類(lèi)物種如鵪鶉中產(chǎn)生TPDIFN-a2b。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，在雞和火雞以及它們的硬殼蛋中表達(dá)TPDIFN-a2b。碳?xì)浠衔锓治?實(shí)施例14，參見(jiàn)下文)包括單糖分析和FACE分析揭示了該蛋白質(zhì)的糖組成或新糖基化模式。這樣，TPDIFN-a2b顯示含有以下單糖殘基N-乙酰-半乳糖胺(NAcGal)、半乳糖(Gal)、N-乙酰-葡糖胺(NAcGlu)和唾液酸(SA)。然而，TPDIFN-a2b中沒(méi)有N連接的糖基化。相反，TPDIFN-a2b是在Thr-106處O-糖基化的。這種糖基化類(lèi)型類(lèi)似于人IFN-a2，其中106位的Thr殘基是IFN-a2的獨(dú)特殘基。與天然IFN-a相似，TPDIFN-a2b不含甘露糖殘基。FACE分析顯示了代表各種糖殘基的6條帶(圖9)，其中條帶1、2、3分別是未唾酸化、單唾酸化和雙唾酸化的(圖10)。唾液酸(SA)連接是a2-3-半乳糖(Gal)和a2-6-N-乙酰-半乳糖胺(NAcGal)。條帶6代表未唾酸化的四糖。條帶4和5是在人PBLIFN-a2b或天然人IFN(天然hIFN)中未發(fā)現(xiàn)的a-半乳糖(a-Gal)延伸的雙糖。圖10顯示TPDIFN-a2b(卵清hIFN)和人PBLIFN-a2b(天然hIFN)的比較。TPDIFN-a2b中條帶3和4，條帶4和帶5之間有次帶(見(jiàn)下)。本發(fā)明設(shè)想TPDIFN-a2b的一種分離的多肽序列(SEQIDNO:2)(又見(jiàn)圖IIB)及其藥物組合物，其中該蛋白質(zhì)在Thr-106位被本文所述的一個(gè)或多個(gè)如下所示的糖結(jié)構(gòu)O-糖基化(i)Gal-NAcGal-(ii)SA陽(yáng)Gal-NAcGal-(iii)SA-Gal-NAcGal-1SA(iv)Gal-NAcGlu-NAcGal-Gal(v)Gal-Ga患-NAcGal-(vi)Gal-Gal-NAcGal-其中，Gal二半乳糖，NAcGa^N-乙酰-半乳糖胺，NAcGlu二N-乙酰-葡糖胺，禾口SA二唾液酸在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，百分比如下(i)Gal-NAcGal陽(yáng)約20%(ii)SA-Gal-NAcGal-約29%(Hi)SA-Ga!-NAcGai-約9%《iv)Gal'-NAcGhi-NMOal-約6%IG效，《v〗Oal-咖i-WAcCW-約丁％輔Gal掘-嵐e編衡約12%SA其中，Gal二半乳糖，NAcGal=N-乙酰-半乳糖胺，NAcGlu:N-乙酰-葡糖胺，和SA二唾液酸條帶3和4，條帶4和帶5之間有次帶，在TPDIFN-a2b中約占17%。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及具有家禽衍生的糖基化模式的人蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述家禽衍生的糖基化模式獲自禽類(lèi)輸卵管細(xì)胞，例如管狀腺細(xì)胞。例如，本文公開(kāi)的糖基化模式呈現(xiàn)在按照本發(fā)明在雞輸卵管細(xì)胞中產(chǎn)生的人蛋白質(zhì)上。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及禽類(lèi)，例如雞、火雞和鵪鶉(如禽類(lèi)輸卵管細(xì)胞)中產(chǎn)生的具有家禽衍生的糖基化模式的人G-CSF。圖18C中顯示成熟的hG-CSF氨基酸序列。圖18A和NCBI登錄號(hào)NM172219中顯示本文所述用于產(chǎn)生G-CSF的核苷酸序列。也考慮使用根據(jù)禽類(lèi)(如雞)密碼子使用優(yōu)化的核苷酸序列來(lái)產(chǎn)生按照本發(fā)明產(chǎn)生的G-CSF和其它蛋白質(zhì)，如人蛋白質(zhì)。本發(fā)明包括含本發(fā)明G-CSF分子的蛋和產(chǎn)該種蛋的禽類(lèi)(如雞、火雞和鵪鶉)，所述G-CSF分子包含一種或多種下示糖基化結(jié)構(gòu)4&￡SA剩-NAcCJa達(dá)-;Ga副AeGlu-NAeOahGaI-織cG，u-跳eGal-;GalGaiSA-G關(guān)AcG關(guān)AcGal-;SA-Gal-NAcG，u-NAedal-;5al-NAcGai-;GalGalSASA-Gal-NAcGal-SA，其中，Gal二半乳糖，NAcGal=N-乙酰-半乳糖胺，NAcGlu二N-乙酰-葡糖胺，和SA二唾液酸在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括G-CSF分子的混合物，其中該混合物包含具有選自結(jié)構(gòu)A、結(jié)構(gòu)B、結(jié)構(gòu)C、結(jié)構(gòu)D、結(jié)構(gòu)E、結(jié)構(gòu)F和結(jié)構(gòu)G中一種或多種的糖基化結(jié)構(gòu)的G-CSF分子。本發(fā)明也包括G-CSF分子的混合物，其中該混合物包含具有選自結(jié)構(gòu)A、結(jié)構(gòu)B、結(jié)構(gòu)C、結(jié)構(gòu)D、結(jié)構(gòu)E、結(jié)構(gòu)F和結(jié)構(gòu)G中一種或多種的糖基化結(jié)構(gòu)的G-CSF分子，所述混合物是分離或純化的，例如由本發(fā)明產(chǎn)生的蛋或卵清純化的。本發(fā)明也包括G-CSF分子的混合物，其中該混合物包含具有兩種、三種、四種、五種或六種以下結(jié)構(gòu)的G-CSF分子結(jié)構(gòu)A、結(jié)構(gòu)B、結(jié)構(gòu)C、結(jié)構(gòu)D、結(jié)構(gòu)E、結(jié)構(gòu)F和結(jié)構(gòu)G。本發(fā)明也包括G-CSF分子的混合物，其中該混合物包含具有兩種、三種、四種、五種或六種以下結(jié)構(gòu)的G-CSF分子結(jié)構(gòu)A、結(jié)構(gòu)B、結(jié)構(gòu)C、結(jié)構(gòu)D、結(jié)構(gòu)E、結(jié)構(gòu)F和結(jié)構(gòu)G，該分子是分離或純化的，例如由本發(fā)明產(chǎn)生的蛋或卵清純化的。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)A的一種G-CSF分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)B的一種G-CSF分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)C的一種G-CSF分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)D的一種G-CSF分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)E的一種G-CSF分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)F的一種G-CSF分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)G的一種G-CSF分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述一種G-CSF分子出現(xiàn)在G-CSF分子混合物中，該混合物可能是分離或純化的G-CSF分子混合物，例如，由本發(fā)明產(chǎn)生的蛋或卵清純化得到該混合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，各種G-CSF分子是分離或純化的，例如按照本文所述純化的(例如通過(guò)實(shí)施例20所述的HPLC)。本文具體描述的有關(guān)G-CSF，如G-CSF分子混合物和一種G-CSF分子(前兩自然段)的本發(fā)明實(shí)施方式一般也可應(yīng)用于按照本發(fā)明產(chǎn)生的各種其它蛋白質(zhì)和其相應(yīng)的家禽衍生糖基化結(jié)構(gòu)。如實(shí)施例22和23所述，生產(chǎn)所產(chǎn)雞蛋含EPO的轉(zhuǎn)基因雞。此外，第二種品系的生產(chǎn)EPO的雞的生產(chǎn)方法與實(shí)施例22和23所述基本相同，不同之處在于使用不同的生產(chǎn)細(xì)胞系，如2007年5月5日公開(kāi)的美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2007/0077650所述(通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容納入本文)。此種第二種品系的生產(chǎn)EPO的雞的CMV啟動(dòng)子和LTR中似乎有缺失，因?yàn)樗棉D(zhuǎn)基因雞的卵清中產(chǎn)生EPO的水平提高，如通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容納入本文的2007年7月14日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?1/880,838所述。利用這種EPO高產(chǎn)品系獲得用于進(jìn)行寡糖分析的EPO?？赏ㄟ^(guò)任何有用的方法，例如蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的方法由卵清純化本發(fā)明轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。例如，可通過(guò)蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的方法由卵清純化本發(fā)明轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的EPO。實(shí)施例24描述了純化卵清中的EPO的方法的例子。已證明，雞中產(chǎn)生的人紅細(xì)胞生成素(hEPO)含有一個(gè)O-連接的糖鏈和三個(gè)N-連接的糖鏈。已證明，0-連接糖基化出現(xiàn)在EPO的Ser-126上，N-連接糖基化出現(xiàn)在Asn-24、Asn-38和Asn-83上。按照本發(fā)明產(chǎn)生的成熟的紅細(xì)胞生成素的氨基酸序列見(jiàn)圖19B。編碼EPO的人核苷酸序列見(jiàn)圖19A。也考慮使用根據(jù)禽類(lèi)(如雞)密碼子使用優(yōu)化的核苷酸序列來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的EPO和其它蛋白質(zhì)。已測(cè)定本發(fā)明紅細(xì)胞生成素的代表性糖基化結(jié)構(gòu)，見(jiàn)實(shí)施例25以及圖20和21。具體說(shuō)，經(jīng)鑒定，禽類(lèi)衍生的EPO上存在B-n、D-n、F-n、H-n、J-n、L-n、N-n、O-n、P-n和Q-n。另外，有證據(jù)顯示EPO上也可能出現(xiàn)一種或多種寡糖結(jié)構(gòu)A-n、C-n、E-n、G-n、I-n、K-n和M-n。此外，數(shù)據(jù)表明，可能有Q-n的第二種形式，其中五個(gè)末端NAcGlu殘基中只出現(xiàn)四個(gè)。Q-n的第二種形式可以是Q-n的前體形式。本發(fā)明包括含本發(fā)明紅細(xì)胞生成素分子的蛋和卵清以及產(chǎn)該種蛋和產(chǎn)生該種卵清的禽類(lèi)(如雞、火雞和鵪鶉)，所述紅細(xì)胞生成素分子包含一種或多種本文所述的糖基化結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括紅細(xì)胞生成素分子的混合物，其中所述混合物包含具有O-連接糖基化結(jié)構(gòu)的紅細(xì)胞生成素分子(如，一種或多種紅細(xì)胞生成素分子)，所述O-連接糖基化結(jié)構(gòu)選自結(jié)構(gòu)A-o、結(jié)構(gòu)B-o或結(jié)構(gòu)C-o。雖然迄今為止O-連接糖基化分析已經(jīng)證實(shí)A-o、B-o和C-o的存在；但也考慮家禽衍生的人EPO上可能存在結(jié)構(gòu)D-o、結(jié)構(gòu)E-o、結(jié)構(gòu)F-o和結(jié)構(gòu)G-o。已缺點(diǎn)，禽類(lèi)衍生的EPO上的主要O-連接寡糖似乎是C-o。本發(fā)明也包括在三個(gè)位點(diǎn)上具有N-連接糖基化結(jié)構(gòu)的EPO，其中在三個(gè)位點(diǎn)上的結(jié)構(gòu)分別選自A-n、B-n、C扁n、D-n、E-n、F-n、G-n、H-n、I-n、J-n、K-n、L-n、M-n、N-n、O-n、P-n或Q扁n。本發(fā)明也包括紅細(xì)胞生成素分子(如，一種以上紅細(xì)胞生成素分子)的混合物，其中一些或所有紅細(xì)胞生成素分子具有一個(gè)或多個(gè)選自下組的糖基化結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)A-o、結(jié)構(gòu)B-o、結(jié)構(gòu)C-o、結(jié)構(gòu)A-n、結(jié)構(gòu)B-n、結(jié)構(gòu)C-n、結(jié)構(gòu)D-n、結(jié)構(gòu)E-n、結(jié)構(gòu)F-n、結(jié)構(gòu)G-n、結(jié)構(gòu)H-n、結(jié)構(gòu)I-n、結(jié)構(gòu)J-n、結(jié)構(gòu)K-n、結(jié)構(gòu)L-n、結(jié)構(gòu)M-n、結(jié)構(gòu)N-n、結(jié)構(gòu)O-n、結(jié)構(gòu)P-n、結(jié)構(gòu)Q-n。在一個(gè)實(shí)施方式中，紅細(xì)胞生成素分子的混合物是純化或分離的，例如由蛋分離，或者由轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的卵清純化或分離。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)A-o的單獨(dú)的紅細(xì)胞生成素分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)B-o的單獨(dú)的紅細(xì)胞生成素分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)C-o的單獨(dú)的紅細(xì)胞生成素分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)A-n的單獨(dú)的紅細(xì)胞生成素分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)B-n的單獨(dú)的紅細(xì)胞生成素分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)C-n的單獨(dú)的紅細(xì)胞生成素分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)D-n的單獨(dú)的紅細(xì)胞生成素分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)E-n的單獨(dú)的紅細(xì)胞生成素分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)F-n的單獨(dú)的紅細(xì)胞生成素分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)G-n的單獨(dú)的紅細(xì)胞生成素分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)H-n的單獨(dú)的紅細(xì)胞生成素分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)I-n的單獨(dú)的紅細(xì)胞生成素分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)J-n的單獨(dú)的紅細(xì)胞生成素分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)K-n的單獨(dú)的紅細(xì)胞生成素分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)L-n的單獨(dú)的紅細(xì)胞生成素分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)M-n的單獨(dú)的紅細(xì)胞生成素分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)N-n的單獨(dú)的紅細(xì)胞生成素分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)0-n的單獨(dú)的紅細(xì)胞生成素分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)P-n的單獨(dú)的紅細(xì)胞生成素分子。本發(fā)明也包括包含結(jié)構(gòu)Q-n的單獨(dú)的紅細(xì)胞生成素分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，在轉(zhuǎn)基因禽，如轉(zhuǎn)基因雞中產(chǎn)生的紅細(xì)胞生成素分子混合物中存在所述單獨(dú)的紅細(xì)胞生成素分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，分離或純化的紅細(xì)胞生成素分子混合物中存在所述單獨(dú)的紅細(xì)胞生成素分子，例如，該混合物是由轉(zhuǎn)基因禽生產(chǎn)的蛋或卵清分離或純化的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單獨(dú)的紅細(xì)胞生成素分子是分離或純化的。本發(fā)明包括Asn-24、Asn-38和Asn-83糖基化位點(diǎn)各自用A-n、B-n、C-n、D-n、E-n、F-n、G-n、H-n、I-n、J-n、K-n、L陽(yáng)n、M-n、N-n、O-n、P-n和Q-n結(jié)構(gòu)之一糖基化，Ser-126用A-o、B-o或C-o糖基化的示范性EPO分子。對(duì)本發(fā)明禽類(lèi)衍生EPO經(jīng)蛋白質(zhì)水解消化獲得的肽產(chǎn)物進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析顯示，三個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)上出現(xiàn)的寡糖結(jié)構(gòu)基本相同。即，似乎EPO分子上三個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)上存在的各個(gè)N-連接寡糖的比例大致相等。這表明，按照本發(fā)明產(chǎn)生的其它N-糖基化的外源蛋白可能具有相似的N-連接糖基化模式。此外，數(shù)據(jù)顯示，三個(gè)N-連接位點(diǎn)分別是廣泛糖基化的，各位點(diǎn)在超過(guò)95%，可能超過(guò)98%，例如超過(guò)99。/。的時(shí)間上是糖基化的。所分析的紅細(xì)胞生成素是轉(zhuǎn)基因雞產(chǎn)生的，所述轉(zhuǎn)基因雞包含編碼切割掉信號(hào)肽后含有165個(gè)氨基酸的人蛋白質(zhì)的氨基酸序列的轉(zhuǎn)基因。然而，預(yù)計(jì)就編碼166個(gè)氨基酸形式的EPO的核苷酸序列在轉(zhuǎn)基因雞中產(chǎn)生的EPO而言，所述166個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)上的寡糖補(bǔ)充物(complement)與165個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)相同。轉(zhuǎn)基因雞產(chǎn)生的連接于人EPO的N-連接寡糖含有少量末端唾液酸部分。即，只有少量N-連接寡糖結(jié)構(gòu)被末端唾酸化。這與人細(xì)胞中產(chǎn)生的EPO和CHO中產(chǎn)生的人EPO相反，這些EPO中N-連接寡糖結(jié)構(gòu)被廣泛地末端唾酸化。此外，轉(zhuǎn)基因雞產(chǎn)生的EPO的N-連接寡糖結(jié)構(gòu)上廣泛存在末端N-乙酰葡糖胺(NAcGlu)，但在人細(xì)胞產(chǎn)生的EPO和CHO細(xì)胞產(chǎn)生的人EPO中則并非如此。另外，轉(zhuǎn)基因雞產(chǎn)生的EPO的N-連接寡糖結(jié)構(gòu)上不存在巖藻糖。然而，在人細(xì)胞產(chǎn)生的EPO和CHO細(xì)胞產(chǎn)生的人EPO的所有或大部分N-連接寡糖結(jié)構(gòu)上存在巖藻糖。考慮到，紅細(xì)胞生成素上可連接糖基化結(jié)構(gòu)組合。例如，可用A-o、A-n、B-n和C-n，或A-o、B-n、C-n和D-n，或A-o、D-n、E-n和F-n，或A-o、E-n、F-n禾BG隱n，或B-o、A-n、D-n和H-n，或B-o、E-n、F-n禾QG-n，或B-o、A-n、A國(guó)n和A-n，或C-o、D-n、D-n和C-n，或C-o、F-n、G-n和H-n，或C-o、A-n、B-n和C-n，或C-o、A-n、B-n和H-n，或C-o、A-n、B-n和E-n，或C-o、A-n、B-n和H-n，或其它這類(lèi)組合糖基化人紅細(xì)胞生成素分子。應(yīng)理解，雖然所報(bào)道的制備本發(fā)明組合物的方法是在禽類(lèi)中進(jìn)行的，但本發(fā)明組合物不限于此。例如，本發(fā)明的某些糖基化蛋白質(zhì)分子可在其它生物體，如轉(zhuǎn)基因魚(yú)類(lèi)，轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物如轉(zhuǎn)基因山羊，或轉(zhuǎn)基因植物如煙草和浮萍(Lemnaminor)中產(chǎn)生。也考慮到，在本發(fā)明一種蛋白質(zhì)上呈現(xiàn)的糖基化結(jié)構(gòu)可以在本發(fā)明另一種蛋白質(zhì)上呈現(xiàn)。例如，呈現(xiàn)在TPDG-CSF上的糖基化結(jié)構(gòu)也可能呈現(xiàn)在TPDGM-CSF、TPDIFN和/或其它TPD蛋白質(zhì)上。在另一個(gè)實(shí)施例中，考慮呈現(xiàn)在TPDIFNa2上的糖基化結(jié)構(gòu)可呈現(xiàn)在TPDG-CSF、TPDGM-CSF和/或其它轉(zhuǎn)基因家禽衍生的(TPD)蛋白質(zhì)上。本發(fā)明也特別考慮到通常具有一種或多種本文所述TPD糖基化結(jié)構(gòu)的人蛋白質(zhì)。本發(fā)明也考慮，將按照本文所述產(chǎn)生的蛋白質(zhì)PEG化可能是有利的，如2006年10月23日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)11/584,832(通過(guò)參考將其全部?jī)?nèi)容納入本文)所述。雖然用于治療時(shí)，本發(fā)明產(chǎn)生的治療性蛋白質(zhì)可以原型給藥，但優(yōu)選作為藥物制劑的一部分給予該治療性蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明還提供了含有家禽衍生的糖基化治療性蛋白質(zhì)或其藥學(xué)上可接受的衍生物及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和任選的其它治療性和/或預(yù)防性成分的藥物制劑，以及給予這種藥物制劑的方法。所述載體必須是"可接受的"，這意味著它與該制劑的其它成分相容，并且對(duì)接受者無(wú)害?？衫镁哂斜绢I(lǐng)域技術(shù)的醫(yī)生知道的標(biāo)準(zhǔn)方法確定用本發(fā)明藥物組合物治療患者的方法(如藥物蛋白質(zhì)的給藥量、給藥頻率和治療持續(xù)時(shí)間)，藥物制劑包括適合口服、直腸、經(jīng)鼻、局部(包括粘膜和舌下)、陰道或胃腸道外給予的制劑。藥物制劑包括適合注射給藥，包括肌肉內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi)給藥的制劑。藥物制劑也包括通過(guò)吸入或吹入給藥的制劑。適當(dāng)時(shí)，該制劑可方便地制備成獨(dú)立的劑量單位，可通過(guò)藥學(xué)領(lǐng)域熟知的任何方法來(lái)制備。生產(chǎn)藥物制劑的方法一般包括以下步驟將治療性蛋白質(zhì)與液體載體或細(xì)碎的固體載體或二者放在一起，然后(如果必要)使該產(chǎn)品成型制成所需制劑。適用于口服給藥的藥物制劑可方便地制成各自含有預(yù)定量的活性成分的粉末劑或顆粒劑、溶液劑、混懸劑或乳劑形式的獨(dú)立單位，如膠囊劑、扁囊劑或片劑。該活性成分也可制成大丸劑、藥糖劑或貼劑?？诜o藥的片劑和膠囊可含有常規(guī)賦形劑，如粘合劑、填充劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑或濕潤(rùn)劑?？砂凑毡绢I(lǐng)域熟知方法對(duì)片劑進(jìn)行包衣。口服液體制劑可以是(例如)水性或油性混懸劑、溶液劑、乳劑、糖漿劑或酏劑的形式，或者可制成臨用前用水或其它合適的載體進(jìn)行重建的干燥產(chǎn)品。這類(lèi)液體制劑可含有常規(guī)的添加劑，如助懸劑、乳化劑、非水性載體(可含食用油)或防腐劑。本發(fā)明治療性蛋白質(zhì)也可配制成胃腸道外給藥(例如注射，如推注或連續(xù)輸注)的形式，并可制成單位劑型裝在安瓿、預(yù)填充注射器、小體積輸液瓶或加入防腐劑的多劑量容器中。可通過(guò)(例如)皮下注射、肌肉內(nèi)注射和靜脈內(nèi)輸液或注射來(lái)注射該治療性蛋白質(zhì)。該治療性蛋白質(zhì)可以是諸如油性或水性載體中的懸浮劑、溶液劑或乳劑的形式，可含有配方試劑，如助懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。也考慮該治療性蛋白質(zhì)可以是無(wú)菌固體經(jīng)無(wú)菌分離或溶液經(jīng)凍干獲得的臨用前用合適的載體如無(wú)菌無(wú)熱原水進(jìn)行重建的粉末形式。外用于表皮時(shí)，本發(fā)明產(chǎn)生的治療性蛋白質(zhì)可配制成軟膏劑、乳膏劑或洗劑，或透皮貼劑?？捎盟曰蛴托曰希尤牒线m的增稠劑和/或凝膠劑來(lái)配制軟膏劑和乳膏劑。可用水性或油性基料配制洗劑，通常還含有一種或多種乳化劑、穩(wěn)定劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑或著色劑。適合局部給予口腔的制劑包括含有活性成分和調(diào)味基料，通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠的錠劑；含有活性成分和惰性基料如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠的軟錠劑；以及含有活性成分和合適液體載體的漱口水。載體是固體的適合直腸給藥的藥物制劑最優(yōu)選為單位劑量栓劑。合適載體包括可可油和本領(lǐng)域常用的其它材料，通過(guò)將活性化合物與軟化或融化的載體混合，然后在模具中冷卻成型，可方便地形成栓劑。適合陰道給藥的制劑可制成陰道栓劑、棉塞劑，乳膏劑、凝膠劑、貼劑、泡沫劑或噴霧劑。就鼻內(nèi)給藥而言，本發(fā)明治療性蛋白質(zhì)可用作液體噴霧劑或可分散粉末劑，或者是滴劑形式?？墒褂眠€含有一種或多種分散劑、增溶劑或助懸劑的水性或非水性基料來(lái)配制滴劑。通過(guò)加壓罐可方便地遞送液體噴霧劑。吸入給藥時(shí)，可由吹藥器、噴霧器或加壓罐或其它方便的遞送氣溶膠噴霧的方式來(lái)方便地遞送本發(fā)明治療性蛋白質(zhì)。加壓罐可包含合適的推進(jìn)劑，如二氯二氟甲垸、三氯氟甲烷、二氯四氟乙垸、二氧化碳或其它合適氣體。在加壓氣溶膠的情況下，可通過(guò)閥門(mén)遞送計(jì)量用量，以確定劑量單位。吸入或吹入給藥時(shí)，本發(fā)明治療性蛋白質(zhì)可以是干燥粉末組合物的形式，例如該化合物與合適的粉末基料如乳糖或淀粉的粉末混合物?？蓪⒎勰┙M合物制成單位劑型，裝在(例如)膠囊或藥筒中，或者(如)明膠或泡罩包裝中，可通過(guò)吸入器或吹藥器的輔助來(lái)給予該粉末。需要時(shí)，上述制劑被配置成能實(shí)現(xiàn)活性成分的緩釋。本發(fā)明藥物組合物也可含有其它活性成分，如抗微生物劑或防腐劑。在一個(gè)具體例子中，將按照本文所述產(chǎn)生的人EPO(可能被PEG化)用于藥物制劑，其中每lmL含有0.05mg聚山梨酯80，并用2.12mg—水合磷酸二氫鈉、0.66mg無(wú)水磷酸氫二鈉和8.18mg氯化鈉和注射用水配制到pH6.2±0.2。在另一具體例子中，將按照本文所述產(chǎn)生的人干擾素a用于藥物制劑，所述藥物制劑含有7.5mg/ml氯化鈉、1.8mg/ml磷酸氫二鈉、1.3mg/ml磷酸二氫鈉、0.1mg/ml二水合乙二胺四乙酸二鈉、0.7mg/ml吐溫⑧80和1.5mg/ml間甲酚。在另一具體例子中，將按照本文所述產(chǎn)生的人G-CSF用于藥物制劑，所述藥物制劑含有0.82mg/ml醋酸鈉、2.8pl/ml冰醋酸、50mg/ml甘露糖醇和0.04mg/ml吐溫⑧80。此外，還考慮到本發(fā)明治療性蛋白質(zhì)可與其它治療劑聯(lián)合使用。本發(fā)明組合物或化合物可用于治療各種疾病。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于治療許多疾病的治療方案，這些方案利用獲自細(xì)胞培養(yǎng)物(如CHO細(xì)胞)的治療性蛋白質(zhì)。本發(fā)明考慮利用在具有家禽衍生糖基化模式的禽類(lèi)系統(tǒng)中產(chǎn)生的治療性蛋白質(zhì)來(lái)治療這類(lèi)疾病。就是說(shuō)，本發(fā)明考慮利用本發(fā)明產(chǎn)生的治療性蛋白質(zhì)來(lái)治療已知可方便地用常規(guī)治療性蛋白質(zhì)進(jìn)行治療的疾病。例如，可利用本發(fā)明產(chǎn)生的紅細(xì)胞生成素治療人類(lèi)疾病，如貧血癥和腎臟疾病(如慢性腎衰竭或可通過(guò)給予本發(fā)明EPO治療的其它病癥)，可使用本發(fā)明產(chǎn)生的G-CSF來(lái)治療癌癥患者，如本領(lǐng)域所了解的那樣。通常，給藥劑量取決于已知因素，如接受者的年齡、健康狀況和體重、并行治療的類(lèi)型、治療頻率等。通常，活性成分的劑量可約為0.0001-10毫克/千克體重?？捎墒熘髦委熜缘鞍踪|(zhì)的給藥知識(shí)的醫(yī)生確定準(zhǔn)確的劑量、給藥頻率和治療時(shí)間間隔。以下具體實(shí)施例是為闡述本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例1載體構(gòu)建用由巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子和報(bào)告基因p-內(nèi)酰胺酶組成的表達(dá)盒替代復(fù)制缺陷型禽白血病病毒(ALV)的載體pNLB(Cosset等，1991)的/acZ基因。圖3A和3B分別圖示了pNLB和pNLB-CMV-BL載體構(gòu)建物。為了用轉(zhuǎn)基因有效替代pNLB的/mZ基因，首先創(chuàng)建了一個(gè)中間銜接子質(zhì)粒，pNLB-銜接子。將鈍化的pNLB^7fllMpal片段(Cosset等，J.K>o/.65:3388-94(1991))(pNLB中5Mpal殘基位于/"cZ上游289bp，3M/al殘基位于3'LTR和Gag區(qū)段的3'端)插入到鈍化的pBluescriptK(-)《戶(hù)IA^cI位點(diǎn)得到pNLB-銜接子。將填平的pCMV-BAf/wI/JGal區(qū)段(Moore等，247:203-9(1997))插入鈍化的pNLB-銜接子的位點(diǎn)，以CMV啟動(dòng)子和基因替代/acZ(在pNLB中，尺;"I殘基位于/acZ上游67bp，7V&I殘基位于/acZ終止密碼子上游100bp)，這樣，得到了pNLB-銜接子-CMV-BL。為了創(chuàng)建pNLB-CMV-BL，用pNLB-銜接子-CMV-BL的歷w/IIIAB/pI插入片段替換pNLB的插入片段(含有/acZ)。因?yàn)槲粗脑蛑苯訉⑩g端片段連接入pNLB的///^/111/5&I位點(diǎn)大多數(shù)可產(chǎn)生重排的亞克隆，因此這個(gè)兩步克隆是必要的。實(shí)施例2pNLB-CMV-BL創(chuàng)始禽群的創(chuàng)建將Sentas和Isoldes在含有5。/。新生牛血清(吉布科公司(Gibco))、1%雞血清(吉布科公司)、50嗎/ml腐草霉素(凱拉實(shí)驗(yàn)室公司(CaylaLaboratories))和50嗎/ml潮霉素(西格瑪公司(Sigma))的F10(吉布科公司)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。如引入本文作為參考的Cosset等(1993)所述產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒，但以下例外。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pNLB-CMV-BL(得自實(shí)施例1，如上)轉(zhuǎn)染9X105Sentas兩天后，將病毒收集到新鮮培養(yǎng)基中持續(xù)6-16小時(shí)并過(guò)濾。用所有的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)導(dǎo)添加了終濃度為4叫/ml聚凝胺的3個(gè)100mm平板中的3106Isoldes。接下來(lái)一天中，將此培養(yǎng)基更換為含有50嗎/ml腐草霉素、50嗎/ml潮霉素和200嗎/mlG418(西格瑪公司)的培養(yǎng)基。10-12天后，分離單個(gè)的G418抗性集落并轉(zhuǎn)移到24孔板中。7-10天后，通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)Sentas然后進(jìn)行G418篩選來(lái)測(cè)定每個(gè)克隆的效價(jià)。一般，60個(gè)克隆中有2個(gè)效價(jià)為l-3xl05。如納入本文作參考的Allioli等，Dev.歷o/.165:30-7(1994)所述，擴(kuò)增這些集落，并將病毒濃縮至2-7xl06。檢測(cè)NLB-CMV-BL轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒所轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)基中的P-內(nèi)酰胺酶確證了CMV-BL表達(dá)盒的完整性。將轉(zhuǎn)導(dǎo)載體pNLB-CMV-BL注射入546個(gè)未孵育的SPF白來(lái)杭雞(WhiteLeghom)胚胎的胚下腔中，其中孵出了126只小雞，檢測(cè)這些小雞是否向血液中分泌(3-內(nèi)酰胺酶(內(nèi)酰胺酶)。為測(cè)定未知樣品中活性?xún)?nèi)酰胺酶的濃度，采用了動(dòng)態(tài)比色測(cè)定法，在該方法中，一種紫色底物PADAC被內(nèi)酰胺酶特異性轉(zhuǎn)化為黃色化合物。通過(guò)監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)時(shí)間內(nèi)OD57Qnm的降低定量測(cè)定內(nèi)酰胺酶的活性，與不同水平純化內(nèi)酰胺酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較(稱(chēng)為"內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)")。也可通過(guò)觀察測(cè)試樣品過(guò)夜后或幾天后紫色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的評(píng)分來(lái)確定樣品中是否存在內(nèi)酰胺酶("過(guò)夜內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)")。后一方法適用于檢測(cè)很低水平的內(nèi)酰胺酶或篩選大量樣品。在一至四周齡時(shí)，檢測(cè)小雞血清樣品中內(nèi)酰胺酶的存在。27只小雞血清中有很低水平的只能在過(guò)夜內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)中檢測(cè)到的內(nèi)酰胺酶，這些小雞成熟后，不再檢測(cè)到內(nèi)酰胺酶。如下表1和圖4A所示，在孵化后六到七個(gè)月還有另外9只雞(3雄，6雌)的血清內(nèi)酰胺酶水平在11.9—173.4ng/ml。_表1:在NLB-CMV-BL-轉(zhuǎn)導(dǎo)雞中表達(dá)p-內(nèi)酰胺酶_P-內(nèi)酰胺酶的平均ng/ml#^翅圈號(hào)血清8月齡~~卵清8月齡卵清14月齡禽母雞3母雞3'NA:無(wú)2對(duì)照獲自未處理母雞。3代表5至20個(gè)蛋的平均值實(shí)施例3B-內(nèi)酰胺酶在GO母雞卵清中的表達(dá)57只以pNLB-CMV-BL逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的小母雞發(fā)育到性成熟，在8月齡時(shí)檢測(cè)每只母雞卵清的活性P-內(nèi)酰胺酶(內(nèi)酰胺酶)。57只雞中，有6只內(nèi)酰胺酶水平顯著，范圍為56.3至250.0ng/ml(表1，見(jiàn)上)。即使在PADAC與樣品培育幾天之后，該組中仍沒(méi)有其他母雞的卵清中可檢測(cè)到內(nèi)酰胺酶。在24只注射模擬物的母雞和用不攜帶有內(nèi)酰胺酶轉(zhuǎn)基因的NLB載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的42只母雞的卵清中未檢測(cè)到內(nèi)酰胺酶。在初始試驗(yàn)6個(gè)月后，0.0±7.436.7±1611.9±1331.5±4833.9±1431.0±05122.8±3.616.0±2.3165.5±5.0173.4±5.90.0±13.656.3±17.81870±3242438±3572226±2771366±202250.0±370NANANA0.0±8.047.9±14.3157.0±32.2321.7±68.8291.0±27.0136.3±11.0232.5±28.6NANANA239524212428I-111Li」i.1二-二-一二.二1-1二.三一7.ii二、EJ-一一二-一二一.一1-11.-一二一、ut11二、tEN雌雌雌雌雌雌雄雄雄，、291703招；248899日二，55577對(duì)有表達(dá)的6只雞的卵清中仍能檢測(cè)到穩(wěn)定的內(nèi)酰胺酶表達(dá)(表1，見(jiàn)上)。用抗P-內(nèi)酰胺酶抗體進(jìn)行Western印跡試驗(yàn)在所有這6只母雞的卵清中都檢測(cè)到了|3-內(nèi)酰胺酶。該卵清內(nèi)酰胺酶與用作標(biāo)準(zhǔn)品的純化的細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)酰胺酶大小相同。以Western分析卵清中檢測(cè)到的量與酶學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)到的相一致，表明卵清內(nèi)酰胺酶的很大一部分是有生物活性的。即使在4'C儲(chǔ)存幾個(gè)月后，母雞卵清中產(chǎn)生的內(nèi)酰胺酶也不會(huì)喪失活性，分子量也沒(méi)有改變。這一發(fā)現(xiàn)使得含有內(nèi)酰胺酶的蛋可儲(chǔ)存更長(zhǎng)的時(shí)間直到分析。實(shí)施例4Gl和G2轉(zhuǎn)基因雞中B-內(nèi)酰胺酶轉(zhuǎn)基因的種系傳遞及血清表達(dá)抽提收集自56只G0公雞的精子DNA，選擇其中定量PCR檢測(cè)到的精子DNA中轉(zhuǎn)基因含量水平顯著的三只雞來(lái)交配。這些公雞是同樣的在其血液中p-內(nèi)酰胺酶(內(nèi)酰胺酶)水平最高的三只(公雞2395、2421和2428)。公雞2395產(chǎn)生了3只Gl轉(zhuǎn)基因后代(在422只后代中)，而其他兩只在總共630只后代中未產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代。對(duì)三只Gl轉(zhuǎn)基因雞各自的血DNA作Southern分析證實(shí)了轉(zhuǎn)基因是完整的并且整合在獨(dú)特的隨機(jī)位點(diǎn)。孵化后6.0-11周時(shí)，Gl轉(zhuǎn)基因雞5308、5657和4133的血清分別含有0.03、2.0和6.(Hig/ml的內(nèi)酰胺酶。在6-7月齡再對(duì)這些雞進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，內(nèi)酰胺酶的水平降到了0.03、1.1和5.0jug/ml(圖4A)。將母雞5657和公雞4133與非轉(zhuǎn)基因雞交配得到轉(zhuǎn)基因半純合后代。圖5顯示從公雞4133或母雞5657繁育的轉(zhuǎn)基因雞及其后代的譜系。也繁殖轉(zhuǎn)基因公雞5308，但其后代血清和卵清中的內(nèi)酰胺酶濃度很低或檢測(cè)不到。在孵化后3-90天測(cè)定隨機(jī)選擇的G2轉(zhuǎn)基因雞血清中活性?xún)?nèi)酰胺酶濃度。從母雞5657繁育的五只G2轉(zhuǎn)基因雞中，活性?xún)?nèi)酰胺酶濃度都在1.9-2.3(ig/ml(相較于親代1.1pg/ml的表達(dá)，圖4B)。所有的樣品都在相同的時(shí)期收集，因此，由于母雞5657的內(nèi)酰胺酶濃度在其成熟后相應(yīng)地下降了，預(yù)期其后代血清中內(nèi)酰胺酶濃度比親代高。類(lèi)似地，從公雞4133繁育的五只隨機(jī)挑選的轉(zhuǎn)基因雞血清內(nèi)酰胺酶濃度都與其親代的相似但高于親代(圖4B)。實(shí)施例5B-內(nèi)酰胺酶在轉(zhuǎn)基因母雞卵清中的表達(dá)Gl母雞5657的蛋的每毫升卵清中含有130ng活性p-內(nèi)酰胺酶(內(nèi)酰胺酶)(圖6A)。內(nèi)酰胺酶濃度在最初產(chǎn)的一些蛋中較高，然后達(dá)到至少可穩(wěn)定九個(gè)月的平臺(tái)期。母雞5657和非轉(zhuǎn)基因公雞繁育的轉(zhuǎn)基因母雞蛋的內(nèi)酰胺酶濃度與親代相似(圖6A)。經(jīng)定量PCR和Southern分析檢測(cè)，G2母雞8617和同科G2公雞8839繁育的母雞6978是轉(zhuǎn)基因純合子。正如預(yù)期的那樣，在雞6978的蛋中內(nèi)酰胺酶濃度高于其半合子親代將近兩倍(圖6B)。沒(méi)有分析其他的由母雞5657繁育的G3母雞，因?yàn)槟鸽u6978是其連產(chǎn)雞中唯一的雌性。重要的是，應(yīng)注意母雞8867、8868和8869的蛋是相隔11個(gè)月收集的并且具有相似的內(nèi)酰胺酶濃度(圖6A和6B)，又一次表明，卵清中的表達(dá)水平在產(chǎn)卵期中是一致的。將公雞4133與非轉(zhuǎn)基因母雞交配得到半合子G2母雞。分析了15只轉(zhuǎn)基因母雞，卵清中都含有濃度范圍在0.47-1.34嗎/ml的內(nèi)酰胺酶。圖7A顯示四只代表性的母雞。6個(gè)月后檢測(cè)時(shí)，平均表達(dá)水平已經(jīng)從大約1.0|ig/ml降到0.8叱/ml(圖7A)。在最初的蛋中表達(dá)水平高，其后幾個(gè)月中水平降低。然后，蛋中內(nèi)酰胺酶濃度保持恒定。G2母雞8150和同科G2公雞8191雜交產(chǎn)生半合子和純合子G3母雞。所有G3母雞卵清中表達(dá)了濃度范圍在0.52-1.65|ig/ml的內(nèi)酰胺酶(圖7B)。G3純合母雞的平均表達(dá)水平比半合子G2和G3母雞高47%。公雞4133及其后代繁育的G2和G3母雞蛋中內(nèi)酰胺酶的量差別很大(圖7A和7B)，雖然此組中任何給定母雞蛋中的內(nèi)酰胺酶水平相對(duì)恒定。預(yù)期對(duì)于純合基因型，內(nèi)酰胺酶的平均表達(dá)加倍。Western印跡分析證實(shí)轉(zhuǎn)基因在G2轉(zhuǎn)基因雞的蛋中正確地產(chǎn)生完整的內(nèi)酰胺酶。Western印跡檢測(cè)到的內(nèi)酰胺酶水平與酶活試驗(yàn)檢測(cè)到的內(nèi)酰胺酶水平密切相關(guān)，表明卵清內(nèi)酰胺酶的大部分具有生物活性。因此，成功地利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在雞中進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定和可靠的表達(dá)?？蓹z測(cè)到卵黃中內(nèi)酰胺酶的沉積但比卵清中低。分析了公雞4133系的七只G2或G3母雞，卵黃中內(nèi)酰胺酶的濃度范圍在107-375ng/ml或約為卵清中濃度的20%。某給定母雞的卵黃和卵清內(nèi)酰胺酶水平無(wú)相關(guān)性(Harvey等，"外源蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)基因雞卵清中的表達(dá)"(Expressionofexogenousproteinineggwhiteoftransgenicchickens)(2000年4月)A^f.5/o&c/mo/.20:396-399)。實(shí)施例6創(chuàng)始雄禽的產(chǎn)生用新產(chǎn)的白來(lái)杭雞受精卵進(jìn)行pNLB-CMV-BL轉(zhuǎn)導(dǎo)。將7-10微升濃縮顆粒注射入開(kāi)窗蛋的胚下腔中，封閉窗口后孵化出仔雞。注射了546只蛋。提取血DNA并通過(guò)Taqman試驗(yàn)采用檢測(cè)新霉素抗性基因的探針-引物對(duì)，分析該轉(zhuǎn)基因的存在。如下表2所示，在所有仔雞中，約25。/。的血DNA中可檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因。表2:用NLB-CMV-BL載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因小結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>實(shí)施例7轉(zhuǎn)基因的種系傳遞用Taqman檢測(cè)精子DNA中的"eo抗性基因來(lái)鑒定用于交配的候選GO雄性。鑒定到三只GO雄性，其中每只雞的精子DNA中NLB-CMV-BL轉(zhuǎn)基因均高于背景水平。將精子中轉(zhuǎn)基因?yàn)殛?yáng)性的所有GO雄雞與非轉(zhuǎn)基因母雞交配以鑒定完全轉(zhuǎn)基因的Gl后代。對(duì)于NLB-CMV-BL，分別繁育了1026只仔雞，每種轉(zhuǎn)基因獲得了三只G1仔雞(表2，見(jiàn)上)。所有G1后代都來(lái)自精子DNA中轉(zhuǎn)基因水平最高的雄性，而且每只雄性繁育出相等數(shù)目的仔雞。實(shí)施例8Gl禾QG2的Southern分析為證實(shí)插入的載體序列的整合和完整性，對(duì)Gl和G2轉(zhuǎn)基因的DNA進(jìn)行Southern印跡分析。以州mffll消化血DNA，將其與wo抗性探抗性針雜交以檢測(cè)pNLB-CMV-BL載體內(nèi)部///^/11I位點(diǎn)形成的接頭片段(圖3B)和整合位點(diǎn)側(cè)翼的基因組位點(diǎn)。攜帶有NLB-CMV-BL的3只Gl雞中的每只都含有獨(dú)特長(zhǎng)度的接頭片段，表明轉(zhuǎn)基因已整合到三個(gè)不同的基因組位點(diǎn)。將G1與非轉(zhuǎn)基因母雞交配得到半合子G2。如表2(見(jiàn)上)所示，如單個(gè)轉(zhuǎn)基因整合的孟德?tīng)柗蛛x所預(yù)期的那樣，攜帶有NLB-CMV-BL的Gl公雞的后代50.8%是轉(zhuǎn)基因的。G2后代歷m/m消化的DNA的Southern分析，檢測(cè)到與它們的轉(zhuǎn)基因親代大小相似的接頭片段，表明轉(zhuǎn)基因被完整傳遞。實(shí)施例9篩選轉(zhuǎn)基因純合子G3后代為獲得轉(zhuǎn)基因純合子轉(zhuǎn)基因雞，將相同位點(diǎn)整合有NLB-CMV-BL的G2半合子雞(例如，同一只Gl雄性的后代)雜交。繁育了兩組雞第一組是來(lái)源于Gl4133雄性的母雞和公雞，第二組來(lái)源于Gl5657母雞。用Taqman試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測(cè)定G3后代中的"eo抗性轉(zhuǎn)抗性基因。用已知量的經(jīng)Southern分析確定為轉(zhuǎn)基因半合子的Gl轉(zhuǎn)基因4133雄雞的基因組DNA來(lái)構(gòu)建此標(biāo)準(zhǔn)曲線。此標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)基因總拷貝的范圍是103—1.6xl(^或每個(gè)二倍體基因組0.2-3.1轉(zhuǎn)基因拷貝。因?yàn)樵谥笖?shù)期反應(yīng)組分是無(wú)限制的，所以擴(kuò)增效率很高并對(duì)給定的拷貝數(shù)給出了可重復(fù)的值。在拷貝數(shù)相差2倍的每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線之間有可重復(fù)的一個(gè)循環(huán)的差異。為確定G3后代中轉(zhuǎn)基因等位基因的數(shù)目，擴(kuò)增DNA并與標(biāo)準(zhǔn)品比較。非轉(zhuǎn)基因雞的DNA不擴(kuò)增。根據(jù)轉(zhuǎn)基因等位基因純合子雞繪制的圖，擴(kuò)增起始比等位基因半合子雞早一個(gè)循環(huán)。此序列檢測(cè)程序能依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和閾值循環(huán)數(shù)(Ct)來(lái)計(jì)算出未知DNA樣品中等位基因的數(shù)目，在閾值循環(huán)數(shù)處樣品的擴(kuò)增圖顯示顯著增高。數(shù)據(jù)示于下面表3。為驗(yàn)證Taqman拷貝數(shù)分析，用尸Wl消化的DNA和與抗性基抗性因互補(bǔ)的探針檢測(cè)0.9kb片段通過(guò)Southern印跡分析所選雞的DNA。選擇檢測(cè)小片段是因?yàn)閷⑤^小DNA從凝膠轉(zhuǎn)移到膜更易量化。該0.9kb條帶的信號(hào)強(qiáng)度與Taqman試驗(yàn)檢測(cè)到的G3轉(zhuǎn)基因雞的拷貝數(shù)良好對(duì)應(yīng)。用Southern印跡分析的其它18只G3轉(zhuǎn)基因雞的拷貝數(shù)與Taqman測(cè)定的一致。共分析了4133譜系33只后代，其中9只(27.3%)是非轉(zhuǎn)基因的，16只(48.5%)是半合子，8只(24.2%)是純合子。5657譜系共分析了10只后代，其中5只(50.0%)是非轉(zhuǎn)基因的，1只(10.0。/。)是半合子，4(40.0%)只是純合子。4133譜系G3后代所觀察到的非轉(zhuǎn)基因、半合子和純合子的比率統(tǒng)計(jì)上與預(yù)期的用x"則驗(yàn)(P吼05)測(cè)定的1:2:1比率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5657譜系的后代不具有預(yù)期的分離，但這可能是所檢測(cè)后代的數(shù)目少的原因(Harvey等，"用復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和高通量篩選程序進(jìn)行轉(zhuǎn)基因雞的連續(xù)生產(chǎn)"(Consistentproductionoftransgenicchickensusingreplicationdeficientretroviralvectorsandhigh-throughputscreeningprocedures)—(2002年2月)尸ow"rj;sc/e"ce81:202-212)。表3:測(cè)定G2轉(zhuǎn)基因雞繁育的G3后代中轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)Gl親代翅圈號(hào)(Std號(hào)或_NTC1)Ct2平均總拷標(biāo)準(zhǔn)差每二倍體貝數(shù)基因組的拷貝341335657565741334133413341334133565756575657413341334133413357AAAAAA41336792697769787020702170227023702471107111711271427143714473387407(stdl)(std2)(std3)(std4)(std5)(NTC)27.340.025.925.826.726.826.126.826.926.430.433.226.525.925.727.237.729.128.127.126.225.339.83,975010,51010,4016,0645,2399,0965,4244,8208,092403606,0239,47412,4204,24611,0002,0004,0008,00016,000-1145.70.0587.0505.1443.1133.8352.355.7110.11037.546.36.1367.6569.8807.7201.71.00.00.00.00.00.00.0102211211200122100.20.40.81.63.10.0^td號(hào)標(biāo)準(zhǔn)號(hào)；NTC:無(wú)模板對(duì)照。2Ct:閾值循環(huán)數(shù)；樣品熒光顯著高于背景的循環(huán)數(shù)。s平均數(shù)除以5100然后四舍五入到一位小數(shù)所確定的每二倍體基因組的拷貝數(shù)。4NA:無(wú)。實(shí)施例10pNLB-MDOT-EPO載體的載體構(gòu)建依照本說(shuō)明書(shū)實(shí)施例l(載體構(gòu)建)所述，將BL編碼序列替換為EPO編碼序列(圖8B)，創(chuàng)建了pNLB-MDOT-EPO載體。用MDOT代替CMV啟動(dòng)wNNNNNN子(圖13)。MDOT是含有卵類(lèi)粘蛋白(MD)和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(TO)啟動(dòng)子元件的合成啟動(dòng)子。(pNLB-MDOT-EPO載體，亦稱(chēng)pAVIJCR-A145.27.2.2)?？筛鶕?jù)母雞輸卵管優(yōu)化的密碼子使用，通過(guò)威斯康辛軟件包9.1版(威斯康星州麥迪遜的遺傳學(xué)計(jì)算組公司)的BACKTRANSLATE程序，利用由紅原雞卵白蛋白、溶菌酶、卵類(lèi)粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白編譯的密碼子使用表來(lái)創(chuàng)建人EPO的DNA序列。合成該DNA序列并由愛(ài)荷華州克拉威爾的整合DNA技術(shù)公司(IntegratedDNATechnologies,Coralville，IA)以規(guī)定的形式將此序列克隆入pCRII-TOPO(英杰公司)3'突端T中。然后用州m/m和FmI將EPO編碼序列從pEpoMM切下，用0.8。/。瓊脂糖-TAE凝膠純化，連接于歷wJin和F"I消化的堿性磷酸酶處理的pCMV-IFNMM。產(chǎn)生的質(zhì)粒是含有受巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和SV40聚A位點(diǎn)控制的EPO編碼序列的pAVIJCR-A137.43.2.2。用7VcoI禾卩i^eI酶切質(zhì)粒pAVIJCR-A137.43.2.2，將正確的片段與用A^。I和/^I酶切的pMDOTIFN片段連接，得到含有受MDOT啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的EPO的pAVIJCR-A137.87.2丄為將MDOT啟動(dòng)子控制的EPO編碼序列克隆入NLB逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，用《p"I禾QI酶切質(zhì)粒pALVMDOTIFN和pAVIJCR-A137.87.2.1。在0.8%瓊脂糖-TAE凝膠上純化正確的DNA片段，然后將這些片段連接并轉(zhuǎn)化入DH5a細(xì)胞。得到的質(zhì)粒是pNLB-MDOT-EPO(亦稱(chēng)pAVIJCR-A145.27.2.2)。實(shí)施例11表達(dá)EPO的轉(zhuǎn)基因雞和完全轉(zhuǎn)基因Gl雞的產(chǎn)生如NLB-CMV-BL(見(jiàn)實(shí)施例2)那樣制備N(xiāo)LB-MDOT-EPO轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。根據(jù)Speksnijder工藝(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,897,998)將300只白來(lái)杭雞蛋開(kāi)窗，然后每只蛋注射約7^104個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。注射后孵化蛋21天，用EPOELISA測(cè)定孵化后一周采集的仔雞血清樣品中的人EPO水平。為篩選精子中含有EPO轉(zhuǎn)基因的GO公雞，用Chdex-100抽提法(Walsh等，1991)提取公雞精液樣品的DNA。然后用"neo正向引物-1"(5，-TGGATTGCACGCAGGTTCT-3，)禾Q"neo反相弓|物-1"(5'-GTGCCCAGTCATAGCCGAAT-3，)引物以及FAM標(biāo)記的NEO-探針1(5，-CCTCTCCACCCAAGCGGCCG-3，)在7700測(cè)序儀(帕金埃爾瑪公司(PerkinElmer))上對(duì)DNA樣品進(jìn)行Taqmar^分析以檢測(cè)轉(zhuǎn)基因。將精液樣品中轉(zhuǎn)基因水平最高的8只G0公雞通過(guò)人工授精與非轉(zhuǎn)基因SPAFAS(白來(lái)杭雞)母雞交配。如上所述用Taqmai^分析篩檢血DNA樣品中轉(zhuǎn)基因的存在。在1，054只后代中，發(fā)現(xiàn)16只仔雞是轉(zhuǎn)基因的(G1禽)。用EPOELISA檢測(cè)雞血清中人EPO的存在，EPO為約70納克/毫升(ng/ml)。用EPOELISA檢測(cè)Gl母雞蛋的卵清中人EPO的存在，發(fā)現(xiàn)含有人EPO約70ng/ml。當(dāng)以細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)在人EPO響應(yīng)細(xì)胞系(HCD57鼠紅細(xì)胞樣細(xì)胞)上檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)蛋中存在的EPO(即衍生自人EPO的優(yōu)化編碼序列)有生物活性。實(shí)施例12pNLB-CMV-IFN的載體構(gòu)建依照實(shí)施例1所述，以IFN編碼序列替代實(shí)施例1中的BL編碼序列創(chuàng)建了pNLB-CMV-IFN載體(圖8A)。創(chuàng)建了優(yōu)化的編碼序列，其中，用卵清蛋白質(zhì)卵白蛋白、溶菌酶、卵類(lèi)粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白中各特定氨基酸使用率最高的密碼子設(shè)計(jì)了優(yōu)選的人干擾素-(x2b(IFN-a2b)編碼序列，并將其插入本發(fā)明的載體。更具體地，優(yōu)化的人干擾素-a2b的DNA序列可根據(jù)母雞輸卵管優(yōu)化的密碼子使用，通過(guò)威斯康辛軟件包9.1版(威斯康辛州麥迪遜的遺傳學(xué)計(jì)算組公司)的BACKTRANSLATE程序利用紅原雞卵白蛋白、溶菌酶、卵類(lèi)粘蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白編譯的密碼子使用率表來(lái)創(chuàng)建。例如，在這四種卵清蛋白質(zhì)中，四種丙氨酸密碼子的使用百分率為GCU34%、GCC31%、GCA26%、GCG8%。因此，可將GCU作為優(yōu)化的人IFN-a2b編碼序列中大多數(shù)丙氨酸的密碼子。用含有編碼優(yōu)化的人IFN-a2b基因的載體來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因禽，其能在組織和卵中表達(dá)轉(zhuǎn)基因禽產(chǎn)生的干擾素-a2b(TPDIFN-a2b)。通過(guò)PCR以p/"聚合酶(加州拉霍亞的司查塔基公司(Stratagene，LaJolla，CA))用20個(gè)下述循環(huán)94°C1分鐘；50°C30秒；和72°C1分鐘10秒擴(kuò)增下表4中列出的模板和引物寡核苷酸。以"擠壓和浸透"方法(Maniatis等，1982)從12。/。的聚丙烯酰胺-TBE凝膠純化PCR產(chǎn)物，然后將該P(yáng)CR產(chǎn)物混合，在只用IFN-1和IFN-8作引物的擴(kuò)增反應(yīng)中作為模板(見(jiàn)表4)。將產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物用/f/"c/in和W"I酶切，從2。/a瓊脂糖-TAE凝膠純化，然后連入用///"^III和I酶切堿性磷酸酶處理的pBluescriptKS(司査塔基公司)，產(chǎn)生質(zhì)粒pBluKSP-IFNMagMax。在ABIPRISM377DNA測(cè)序儀(加州福斯特城的帕金埃爾瑪公司(Perkin-Elmer，F(xiàn)osterCity,Calif))上用通用T7或T3引物，通過(guò)循環(huán)測(cè)序測(cè)定兩條鏈的序列。用轉(zhuǎn)化基因定位誘變?cè)噭┖?TransformerSite-DirectedMutagenesisKit)(加州帕洛阿爾托的克隆泰克公司(Clotech,PaloAlto，Calif))，通過(guò)定點(diǎn)突變修正衍生自原始寡聚核苷酸模板的pBluKSP-IFN中的突變。然后用/f/wc/III和Z6"I從修正的pBluKSP-IFN上切下IFN編碼序列，從0.8。/。瓊脂糖-TAE凝膠純化并連入///"JIII和Z6aI酶切堿性磷酸酶處理的pCMV-BetaLa-3B-dH。產(chǎn)生的質(zhì)粒是含有受巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和SV40聚A位點(diǎn)控制的IFN編碼序列的pCMV-IFN。為將CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子控制的IFN編碼序列克隆入NLB逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，先用C/aI和I酶切pCMV-IFN，然后兩末端用DNA多聚酶的克列諾片段(馬薩諸塞州貝弗利的新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司(NewEnglandBioLabs,Beverly,Mass))填平。將pNLB-銜接子用I和《;7"I酶切，用T4DNA聚合酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司)使兩末端為鈍性。在0.8。/。瓊脂糖-TAE凝膠上純化正確的DNA片段，然后將這些片段連接并轉(zhuǎn)化入DH5a細(xì)胞。產(chǎn)生的質(zhì)粒是pNLB-銜接子-CMV-IFN。然后將該質(zhì)粒用7WwI酶切fi/pl部分酶切，正確的片段用凝膠純化。將pNLB-CMV-EGFP用M/wI和別pI酶切，然后用堿性磷酸酶處理和凝膠純化。將pNLB-銜接子-CMV-IFN的MmIAB/pI部分片段與衍生自pNLB-CMV-EGFPM/wIAS/pI酶切的大片段連接，產(chǎn)生pNLB-CMV-IFN。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>實(shí)施例13表達(dá)IFN的轉(zhuǎn)基因雞和完全轉(zhuǎn)基因Gl雞的產(chǎn)生依照實(shí)施例2的程序制備pNLB-CMV-IFN轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。根據(jù)Speksnijder工藝(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,897,998)將300只白來(lái)杭(品系O)雞蛋開(kāi)窗，然后每只蛋注射約7\104個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。注射后孵化蛋21天，通過(guò)IFNELISA試驗(yàn)測(cè)定孵化后一周采集的仔雞血清樣品中的人IFN水平。為篩選精子中含有IFN轉(zhuǎn)基因的G0公雞，用Chelex-100抽提法(Walsh等，1991)提取公雞精液樣品的DNA。然后用"neo正向引物-l"(5，-TGGATTGCACGCAGGTTCT-3，；SEQIDNO:5)和"neo反向引物誦l"(5，-GTGCCCAGTCATAGCCGAAT-3，)引物以及FAM標(biāo)記的NEO-探針1(5，-CCTCTCCACCCAAGCGGCCG-3，)在7700測(cè)序儀(帕金埃爾瑪公司(PerkinElmer))上對(duì)DNA樣品進(jìn)行l(wèi)^qman分析以檢測(cè)轉(zhuǎn)基因。將精液樣品中轉(zhuǎn)基因水平最高的3只GO公雞通過(guò)人工授精與非轉(zhuǎn)基因SPAFAS(白來(lái)杭雞)母雞交配。如上所述用Taqmar^分析篩檢血DNA樣品轉(zhuǎn)基因的存在。在1,597只后代中，發(fā)現(xiàn)1只公雞是轉(zhuǎn)基因雞(又名"奧菲"(Alphie))。用hIFNELISA檢測(cè)奧菲血清中hIFN的存在，hIFN為200ng/ml。用奧菲的精液對(duì)非轉(zhuǎn)基因SPAFAS(白來(lái)杭雞)母雞人工授精。用Taqmai^分析檢測(cè)到202只中有106只(約52%)后代含有轉(zhuǎn)基因。這些繁育結(jié)果遵循孟德?tīng)栠z傳模式，表明奧菲是轉(zhuǎn)基因的。實(shí)施例14轉(zhuǎn)基因家禽產(chǎn)生的干擾素a2b(TPDIFN-a2b)的糖分析實(shí)驗(yàn)證據(jù)揭示出家禽產(chǎn)生的干擾素-a2b(g口TPDIFNa-2b)中有一種新糖基化模式。發(fā)現(xiàn)TPDIFNa-2b含有正常情況下人外周血白細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素-a2b(PBLIFNa-2b)或天然人干擾素-a2b(天然hIFN)中不存在的兩種新糖形(條帶4和5是a-Gal延伸的二糖；見(jiàn)圖9)。還發(fā)現(xiàn)TPDIFNa-2b含有與人PBLIFNa-2b相似但在雞中比在人中更有效產(chǎn)生的O-連接糖結(jié)構(gòu)。對(duì)人IFN-a2b編碼序歹ij(實(shí)施例12，見(jiàn)上)進(jìn)行優(yōu)化，產(chǎn)生重組IFN-a2b編碼序列。然后在雞中生產(chǎn)TPDIFN-a2b(實(shí)施例13，見(jiàn)上)。糖分析包括單糖分析和FACE分析揭示了該蛋白質(zhì)的糖組成或新糖基化模式。這樣，TPDIFN-a2b顯示含有以下單糖殘基N-乙酰-半乳糖胺(NAcGal)、半乳糖(Gal)、N-乙酰-葡糖胺(NAcGlu)和唾液酸(SA)。在TPDIFN-a2b中沒(méi)發(fā)現(xiàn)N-連接的糖基化，而是在Thr-106位O-糖基化。這種類(lèi)型的糖基化與人IFN-a2的相似，其中，106位的Thr殘基是IFN-a2獨(dú)有的。相反，發(fā)現(xiàn)TPDIFN-a2b是在Thr-106處O-糖基化的。這種糖基化類(lèi)型類(lèi)似于人IFN-a2，其中106位的Thr殘基是IFN-a2的獨(dú)特殘基。此外，發(fā)現(xiàn)TPDIFN-a2b沒(méi)有甘露糖殘基。FACE分析顯示了代表各種糖殘基的6條帶(圖9)，其中條帶1、2、3分別是未唾酸化、單唾酸化和雙唾酸化的(圖10)。唾液酸(SA)連接是a2-3-半乳糖(Gal)和a2-6-N-乙酰-半乳糖胺(NAcGal)。條帶6代表未唾酸化的四糖。條帶4和5是在人PBLIFN-a2b中未發(fā)現(xiàn)的a-半乳糖(a-Gal)延伸的雙糖。圖10顯示TPDIFN-a2b(卵清hIFN)和人PBLIFN-a2b(天然hIFN)的比較。TPDIFN-a2b中條帶3和4，條帶4和帶5之間有次帶(見(jiàn)下)。發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)在Thr-106位點(diǎn)被如下所述的特定殘基O-糖基化:(i)Gal-NAcGal-(ii)SA隱Gal-NAcGal-腳SA-Ga,AGGal-I(W)Ga!-NAeGlu-NAcGal-C3aiSA其中，Gal二半乳糖，NAcGal二N-乙酰-半乳糖胺，NAcGlu^N-乙酰-葡糖胺，禾口SA二唾液酸。百分比如下(i)Gal-NAcGal-約20%(ii)SA-Gal-NAcGal-約29%(iii)SA-Gal-NAcGai-f物.SA(iv)Gai-NAcGlu^NAcGal-約6%1G:ai《v惑)Clal-Gal-NAeGa，暢約12%ISA條帶3和4，條帶4和帶5之間有次帶，在TPDIFN-a2b中約占17%。實(shí)施例15在禽類(lèi)細(xì)胞中用EMCVIRES由質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行MAb的表達(dá)通過(guò)在輕鏈(LC)和重鏈(HC)編碼序列間設(shè)置腦心肌炎病毒(EMCV)的IRES(又見(jiàn)Jang等，(1988)腦心肌炎病毒RNA5'非翻譯區(qū)的一個(gè)區(qū)段在體外翻譯過(guò)程中指導(dǎo)內(nèi)部進(jìn)入核糖體(Asegmentofthe5'nontranslatedregionofencephalomyocarditisvirusRNAdirectsinternalentryofriboxomesduringinvitrotranslation)J^;Vo/.62:2636-2643)從單個(gè)載體pCMV-LC-emcvIRES-HC表達(dá)人單克隆抗體的輕鏈和重鏈。用CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄。為測(cè)定兩個(gè)獨(dú)立載體的單克隆抗體的表達(dá)，將與CMV啟動(dòng)子相連的LC或HC共轉(zhuǎn)染入LMH/2d細(xì)胞，該細(xì)胞是雌激素響應(yīng)性雞肝細(xì)胞系(又見(jiàn)Binder等(1990)"內(nèi)源和轉(zhuǎn)染的載脂蛋白II和卵黃原蛋白II基因在雌激素響應(yīng)性雞月干細(xì)胞系中的表達(dá)"(ExpressionofendogenousandtransfectedapolipoproteinIIandvitellogeninIIgenesinanestrogenresponsivechickenlivercellline)Afo/.五"c/och"o/.4:201—208)。pCMV-LC禾卩pCMV-HC的共轉(zhuǎn)染產(chǎn)生了經(jīng)MAbELISA測(cè)定為392ng/ml的單抗，而pCMV-LC-emcvIRES-HC轉(zhuǎn)染產(chǎn)生了185ng/ml的單抗。將CMV-LC-emcv-HC盒插入基于莫羅尼(Moloney)鼠白血病病毒(MLV)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，產(chǎn)生pL-CMV-LC-emcvIRES-HC-RN-BG。用LMH/2d的親代系LMH細(xì)胞(又見(jiàn)Kawaguchi等(1987)，一種雞肝癌細(xì)胞系LMH的建立禾口鑒定(Establishmentandcharacterizationofachickenhepatocellularcarcinomacellline,LMH),C朋ce廠47:4460-4464)作為耙細(xì)胞，因?yàn)樗鼈儾痪哂行旅顾乜剐?。以pL-CMV-LC-emcvIRES-HC-RN-BG逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)LMH細(xì)胞，以新霉素篩選并傳代幾周。獨(dú)立地以親代MLV載體LXRN轉(zhuǎn)導(dǎo)LMH細(xì)胞并用新霉素篩選。LXRN細(xì)胞的培養(yǎng)基為單抗陰性，而L-CMV-LC-emcvIRES-HC-RN-BG-轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的培養(yǎng)基含有22ng/ml單抗。實(shí)施例16表達(dá)單克隆抗體的轉(zhuǎn)基因雞和完全轉(zhuǎn)基因Gl雞的產(chǎn)生用實(shí)施例15的CMV-LC-emcv-HC盒代替實(shí)施例1的pNLB-CMV-BL的CMV-BL盒得到pNLB-CMV-LC-emcv-HC載體。依照實(shí)施例2的程序制備pNLB-CMV-LC-emcv-HC轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。根據(jù)Speksnijder工藝(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，897，998)將300只白來(lái)杭(品系O)雞蛋開(kāi)窗，然后每只蛋注射約7\104個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。注射后孵化蛋21天，用ELISA測(cè)定孵化后一周采集的仔雞血清樣品中的人單克隆抗體水平。用Taqman⑧分析鑒定精子中含有該轉(zhuǎn)基因的GO公雞。將精液樣品中轉(zhuǎn)基因水平最高的3只GO公雞通過(guò)人工授精與非轉(zhuǎn)基因SPAFAS(白來(lái)杭雞)母雞交配。篩選超過(guò)1000個(gè)后代，發(fā)現(xiàn)IO只以上仔雞含有該轉(zhuǎn)基因(GI禽類(lèi))。用ELISA檢測(cè)仔雞血清中該單克隆抗體的存在。發(fā)現(xiàn)該單克隆抗體在每毫升血清中的含量大于10pg。也用ELISA檢測(cè)Gl母雞所生雞蛋的卵清中該單克隆抗體的存在，發(fā)現(xiàn)每毫升卵清中的含量大于10貼。實(shí)施例17。NLB-CMV-hG-CSF的構(gòu)建此載體構(gòu)建過(guò)程能用G-CSF的編碼序列有效替代實(shí)施例12的pNLB-CMV-IFN載體的IFN編碼區(qū)。用弓l物5'GCSF(ggggggaagctttcaccatggctggacctgcca;SEQIDNO:32)禾口3'GCSF(actagacttttcagggctgggcaaggtggcg;SEQIDNO:33)由pORF9-hG-CSFb(目錄號(hào)porf-hgcsfb,加州圣地亞哥的英杰公司(Invivogen,SanDiego,CA))擴(kuò)增hG-CSFORF(人粒細(xì)胞集落刺激因子開(kāi)放閱讀框)，得到642個(gè)堿基(bp)的PCR產(chǎn)物。為了提供含有與pNLB-CMV-IFNa-2b中3'序列相同的G-CSF編碼序列3，序列的pNLB-CMV-hG-CSF構(gòu)建物，用引物5'GCSF-NLB(ccagccctgaaaagtctagtatggggattggtg;SEQIDNO:34)禾卩3，GCSF-NLB(gggggggctcagctggaattccgcc;SEQIDNO:35)PCR擴(kuò)增與INF編碼序列3，端相鄰的pNLB-CMV-IFNa-2b的86bp片段?；旌线@兩種PCR產(chǎn)物(642bp和86bp),利用引物5'GCSF和3，GCSF-NLB通過(guò)PCR擴(kuò)增將它們?nèi)诤?。按照生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆到pCR4Blunt-TOPO質(zhì)粒載體(英杰公司(Invitrogen))中，電穿孑L至DH5a-E細(xì)胞中，產(chǎn)生pFusion-hG-CSF-NLB。用州"dIII和5/;I消化pFusion-hG-CSF-NLB,凝膠純化該6卯bpG-CSF片段。通過(guò)5/;I的消化去除pNLB-CMV-IFNa-2b中的IFNa-2b編碼序列。然后重新連接該載體，選擇缺少I(mǎi)FN編碼插入片段的克隆，產(chǎn)生pNLB-CMV-ShIFNa-2b。用5//I消化pNLB-CMV-ShIFNa-2b，用歷'"dIII部分消化，凝膠純化該8732&5//1-///"(1111載體片段。將該8732bp片段連接到690bp///"dIG-CSF片段中，產(chǎn)生pNLB-CMV-G-CSF。通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證G-CSFORF。實(shí)施例18表達(dá)人粒細(xì)胞集落刺激因子(hG-CSF)的轉(zhuǎn)基因雞的產(chǎn)生如實(shí)施例2中關(guān)于NLB-CMV-BL所述的那樣制備N(xiāo)LB-CMV-hG-CSF轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。用7^NLB-CMV-hG-CSF轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒注射277個(gè)X期蛋的胚胎(效價(jià)為2.1xl07-6.9xl07)。孵化86只仔雞，飼養(yǎng)至性成熟。將60只經(jīng)測(cè)試為G-CSF陽(yáng)性的仔雞按照性別平均分開(kāi)；三十只母雞，三十只公雞。用ELISA檢測(cè)21只母雞卵清中hG-CSF的存在。發(fā)現(xiàn)5只母雞的卵清中含有顯著性水平的hG-CSF蛋白，其濃度為0.05-0.5嗎/ml。用Chelex-100抽提法(Walsh等，1991)提取公雞精液樣品中的DNA。然后用正向引物SJ-G-CSF(cagagcttcctgctcaagtgctta;SEQIDNO:36)和反向引物SJ陽(yáng)G-CSF(ttgtaggtggcacacagcttct;SEQIDNO:37)以及SJ陽(yáng)G-CSF探針(agcaagtgaggaagatccagggcg;SEQIDNO:38)在7700測(cè)序儀(帕金埃爾瑪公司)上對(duì)DNA樣品進(jìn)行T叫manTM分析，以檢測(cè)該轉(zhuǎn)基因。將精液樣品中轉(zhuǎn)基因水平最高的公雞通過(guò)人工授精與非轉(zhuǎn)基因SPAFAS(白來(lái)杭雞)母雞交配。如上所述用TaqmanTM分析篩檢血DNA樣品轉(zhuǎn)基因的存在。在2264只后代中，發(fā)現(xiàn)13只Gl是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，各自血清為G-CSF陽(yáng)性血清，經(jīng)ELISA測(cè)定其中一只母雞(XGF498)血清中含有約136.5ng/mlG-CSF、卵清中含有5.6|ig/mlG-CSF。兩只與XGF498品系相同(從而有相同的轉(zhuǎn)基因插入基因組中的相同位置)的Gl公雞(QGF910和DD9027)與非轉(zhuǎn)基因母雞雜交，產(chǎn)生的雌性后代所產(chǎn)雞蛋含有家禽衍生的G-CSF。由QGF910和DD9027后代的雞蛋卵清純化毫克量級(jí)的G-CSF。由如實(shí)施例20所述獲得的G-CSF測(cè)定家禽衍生的G-CSF的代表性糖基化結(jié)構(gòu)模式。實(shí)施例19表達(dá)人細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞抗原4-Fc融合蛋白(CTLA4-Fc〗的轉(zhuǎn)基因雞的產(chǎn)生如納入本文作參考的2005年1月31日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?1/047,184所述構(gòu)建pNLB-1.80M-CTLA4Fc和pNLB-3.90M-CTLA4Fc。如實(shí)施例2有關(guān)pNLB-CMV-BL所述產(chǎn)生pNLB-1.80M-CTLA4Fc禾卩pNLB-3.90M-CTLA4Fc轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。用7pipNLB-1.80M-CTLA4Fc轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒(效價(jià)約為4xl()6)注射193只白來(lái)杭雞蛋，孵化了72只仔雞。用7pipNLB-3.90M-CTLA4Fc轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒(效價(jià)約為4xl0"注射199只白來(lái)杭雞蛋，孵化了20只仔雞。利用ELISA測(cè)定用pNLB-1.80M-CTLA4Fc顆粒產(chǎn)生的30只母雞卵清中CTLA4-Fc的存在。發(fā)現(xiàn)一只母雞的卵清中含有顯著水平的CTLA4-Fc，其平均水平為0.132|ig/ml(檢測(cè)了5只雞蛋)。利用ELISA測(cè)定用pNLB-3.90M-CTLA4Fc顆粒產(chǎn)生的7只母雞卵清中CTLA4-Fc的存在。發(fā)現(xiàn)兩只母雞的卵清中含有顯著水平的CTLA4-Fc蛋白，一只母雞的平均水平為0.164pg/ml(檢測(cè)了5只雞蛋)，第二只陽(yáng)性母雞的平均水平為0.123)ig/ml(檢測(cè)了5只雞蛋)。實(shí)施例20轉(zhuǎn)基因家禽衍生的G-CSF的糖分析采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的以下分析技術(shù)確定TPDG-CSF寡糖結(jié)構(gòu)。由肽主鏈釋放后，對(duì)寡糖進(jìn)行MALDI-TOF-MS(襯質(zhì)輔助激光解吸與電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜學(xué))分析和ESIMS/MS(電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜)分析。通過(guò)化學(xué)方法釋放蛋白質(zhì)上的O連接寡糖，用NaOH法全甲基化，該方法包括在無(wú)水DMSO存在下與甲基碘反應(yīng)，用氯仿萃取，然后進(jìn)行分析。對(duì)完整的糖基化G-CSF進(jìn)行直接質(zhì)譜分析。也用HPLC對(duì)多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。簡(jiǎn)要說(shuō)，由蛋白質(zhì)主鏈釋放后，用HPLC分離該結(jié)構(gòu)。用某些酶消化各種多糖物質(zhì)的樣品，然后如本領(lǐng)域所知的那樣用HPLC分析該消化產(chǎn)物，以確定其結(jié)構(gòu)。下面顯示測(cè)定的結(jié)構(gòu)。有趣的是，結(jié)構(gòu)C和結(jié)構(gòu)D可能是下示結(jié)構(gòu)E的前體形式。據(jù)估計(jì)(但本發(fā)明不限于此)，結(jié)構(gòu)A在家禽衍生的糖基化G-CSF上的存在時(shí)間約為20%-40%，結(jié)構(gòu)B在家禽衍生的糖基化G-CSF上的存在時(shí)間約為5%-25%，結(jié)構(gòu)C在家禽衍生的糖基化G-CSF上的存在時(shí)間約為10%-20%，結(jié)構(gòu)D在家禽衍生的糖基化G-CSF上的存在時(shí)間約為5%-15%，結(jié)構(gòu)E在家禽衍生的糖基化G-CSF上的存在時(shí)間約為1%-5%，結(jié)構(gòu)F在家禽衍生的糖基化G-CSF上的存在時(shí)間約為10%-25%，結(jié)構(gòu)G在家禽衍生的糖基化G-CSF上的存在時(shí)間約為20%-30%。Afi￡Ga，Ga蕭SAfig￡SA-Gal-NAeGIu誦NAeGri-;SA-Oa，-NAcGk-WAeGal-;Gal-NAcGaI-；G魏，CMSA-Gd-NAeGal-SA用GC/MS(氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用)對(duì)摻有阿拉伯糖醇(內(nèi)標(biāo))，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法進(jìn)行水解、N乙?；蚑MS衍生化的家禽衍生的G-CSF進(jìn)行單糖分析。將衍生化樣品與類(lèi)似衍生的糖的標(biāo)準(zhǔn)混合物作比較。摻入酮脫氧壬酮糖酸、凍干、水解、脫鹽和再凍干后，對(duì)家禽衍生的G-CSF進(jìn)行唾液酸分析。利用合適的標(biāo)準(zhǔn)品在DionexBioLC系統(tǒng)上分析樣品。這些分析證明存在半乳糖、葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺和唾液酸(N-乙酰神經(jīng)氨酸)，如表5所示。表5中的數(shù)據(jù)取代了HPAEC-PAD分析產(chǎn)生的初步數(shù)據(jù)，HPAEC-PAD分析測(cè)定存在更高百分?jǐn)?shù)的N-乙酰葡糖胺。表5TPDG-CSF單糖檢測(cè)到的摩檢測(cè)到的摩爾數(shù)爾數(shù)/毫克半乳糖4.534.5N-乙酰半乳糖胺2.922.2N-乙酰葡糖胺0.957.3唾液酸6.046.0對(duì)TFA中水解并在硼気化鈉中還原的家禽衍生的G-CSF的預(yù)先甲基化聚糖樣品進(jìn)行連接分析。加入三次甲醇:冰醋酸(9:1)，然后凍干并用醋酸酐乙?；?，從而去除硼酸。氯仿提取純化后，用GC/MS檢測(cè)該樣品。也在相同條件下檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品混合物。測(cè)定的連接如下i.唾液酸連接是2-3連接于半乳糖，并且2-6連接于N-乙酰半乳糖胺ii.半乳糖連接是2-3連接于N-乙酰半乳糖胺，2-4連接于N-乙酰葡糖胺iii.N-乙酰葡糖胺連接是2-6連接于N-乙酰半乳糖胺實(shí)施例21家禽衍生的G-CSF(TPDG-CSF)的體外細(xì)胞增殖活性用NFS-60細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證明TPDG-CSF的體外生物活性。簡(jiǎn)要說(shuō)，用含有GM-CSF的生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)NFS-60細(xì)胞。收獲匯合的培養(yǎng)物，洗滌，并單用生長(zhǎng)培養(yǎng)基以細(xì)胞密度105個(gè)細(xì)胞/孔進(jìn)行接種。用生長(zhǎng)培養(yǎng)基連續(xù)稀釋TPDG-CSF和細(xì)菌衍生的人G-CSF(即紐迫基(Neupogen)⑧)，一式三份地加入各個(gè)孔中。通過(guò)3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)的代謝還原反應(yīng)測(cè)定細(xì)胞增殖，并用分光光度法定量。通過(guò)比較紐迫基⑧與純化的禽類(lèi)衍生G-CSF的ED5Q，確定禽類(lèi)衍生的G-CSF的比活。經(jīng)測(cè)定，在14天中TPDG-CSF的比活遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)菌衍生的G-CSF紐迫基⑧(未糖基化的G-CSF)。參見(jiàn)圖17。實(shí)施例22pNLB畫(huà)CMV-Des畫(huà)Argl66-EPO的構(gòu)建用HindIII和EcoRI消化實(shí)施例12所述的pNLB-CMV-IFN，以便用下示EPO編碼序列和信號(hào)肽(SEQIDNO:42)替代hlFNa2編碼序列和信號(hào)肽編碼序列。因?yàn)檩d體中存在多個(gè)EcoRI和HindIII位點(diǎn)，所以采用RecA-輔助的限制性核酸內(nèi)切酶(RARE)切割方法來(lái)切割所需的位點(diǎn)。將以下寡核苷酸用于RARE步驟pnlbEcoRI3805罕見(jiàn)(5'-GACTCCTGGAGCCCGTCAGTATCGGCGGAATTCCAGCTGAGCGCCGGTCGCTACCATTAC隱3')(SEQIDNO:43)和pnlbHinDIII3172罕見(jiàn)(5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGACCGGAAGCTTTCACCATGGCTTTGACCTTTGCCTTAC陽(yáng)3')(SEQIDNO:44)。獲得并凝膠純化8740bp的線性化載體。如下所述，通過(guò)重疊PCR制備EPO插入物。利用Pfu聚合酶和以下引物擴(kuò)增克隆到標(biāo)準(zhǔn)克隆載體中的合成EPO序列，以產(chǎn)生第一PCR產(chǎn)物5，pNLB/Epo(5，-GGGGGGAAGCTTTCACCATGGGCGTGCACGAG-3，)(SEQIDNO:45)禾口pNLB/3'Epo(5，-TCCCCATACTAGACTTTTTACCTATCGCCGGTC-3，)(SEQIDNO:46)。利用Pfu聚合酶和以下引物擴(kuò)增pNLB-CMV-hIFNa-2b的區(qū)域，以產(chǎn)生第二PCR產(chǎn)物3，Epo/pNLB(5，-ACCGGCGATAGGTAAAAAGTCTAGTATGGG-3，)(SEQIDNO:47)和pNLB/SapIC5，-GGGGGGGCTCTTCTCAGCTGGAATTCCGCCGATAC-3，)(SEQIDNO:48)?；旌线@兩種PCR產(chǎn)物，用以下引物再次擴(kuò)增5，pNLB/Epo(5，-GGGGGGAAGCTTTCACCATGGGCGTGCACGAG-3，)(SEQIDNO:45)禾卩pNLB/SapI(5，-GGGGGGGCTCTTCTCAGCTGGAATTCCGCCGATAC-3，)(SEQIDNO:48)。用HindIII和EcoRI消化融合的PCR產(chǎn)物，凝膠純化633bp片段。連接8740bp和633bp片段以產(chǎn)生pNLB-CMV-EPO。EPOl-合成的EPO序列(610nt)IDNO:42)產(chǎn)生編碼末端密碼子(編碼166位的精氨酸)被去除的165個(gè)氨基酸形式的EPO的EPO編碼序列。合成pNLB-CMV-EPO的179bp區(qū)域，該區(qū)域?qū)?yīng)于pNLB-CMV-EPO中從位于EPO編碼序列內(nèi)的Eco47III位點(diǎn)延伸到位于EPO終止密碼子下游的EcoRI位點(diǎn)；消除末端精氨酸密碼子(166位)以使天冬氨酸(氨基酸165)成為末端氨基酸密碼子，產(chǎn)生176bpEco47111/EcoRI片段。由愛(ài)荷華州克拉威爾的集成DNA技術(shù)公司(IntegratedDNATechnologies,Coralville,Iowa52241)合成該片段，并克隆到pDRIVE載體(凱杰公司(Qiagen，Inc))中，產(chǎn)生pDRIVE-des-Argl66-EPO。將176bpEco47111/EcoRI片段亞克隆到pNLB-CMV-EPO的Eco47III/EcoRI位點(diǎn)中，產(chǎn)生pNLB-CMV-Des-Argl66-EPO?；救鐚?shí)施例2所述，由pNLB-CMV-Des-Arg166-EPO制備轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。實(shí)施例23表達(dá)人紅細(xì)胞生成素的轉(zhuǎn)基因雞的產(chǎn)生將1234只白來(lái)杭雞蛋開(kāi)窗，注入轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒(基本如實(shí)施例2所述)。334只蛋孵化。用Chelex-100抽提法(Walsh等，1991)提取公雞精液樣品中的DNA。然后，在7700序列檢測(cè)儀(帕金埃爾默公司(PerkinElmer))上對(duì)DNA樣品進(jìn)行TaqmanTM分析，以檢測(cè)轉(zhuǎn)基因。7只孵化的G0公雞經(jīng)檢測(cè)為NLB-CMV-EPO轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性。通過(guò)人工授精使三只經(jīng)檢測(cè)為NLB-CMV-EPO轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性的嵌合種系轉(zhuǎn)基因公雞與非轉(zhuǎn)基因雌性交配，產(chǎn)生1190個(gè)后代，其中14個(gè)是轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性種系轉(zhuǎn)基因Gl。經(jīng)ELISA測(cè)定，Gl種系轉(zhuǎn)基因雌性或其后代所產(chǎn)雞蛋的卵清中含有約0.4-1.9pg/mlEPO。實(shí)施例24轉(zhuǎn)基因家禽衍生的EPO的純化用三倍體積的50mM醋酸鈉，pH4.6稀釋輸卵管中產(chǎn)生EPO的轉(zhuǎn)基因雞所產(chǎn)蛋的卵清，混合并過(guò)濾，然后加載到瓊脂糖陽(yáng)離子交換柱上。用含100mMNaCl的50mM醋酸鈉，pH5.0洗柱后，用含500mMNaCl和0.05%吐溫20的相同醋酸鹽緩沖液洗脫EPO。將瓊脂糖柱上洗脫下來(lái)的EPO加載到苯基瓊脂糖疏水作用層析柱上。用2MNaCl，50mMTris-HCl，pH7.2，0.05%吐溫20平衡該柱。加載上述制備物后，利用相同緩沖液洗柱。然后用水洗滌。隨后用30。/。IPA洗脫EPO。然后將EPO制備物施加于反相HPLC柱，用濃度遞增的0.1。/。三氯醋酸配制的乙醇溶液洗脫EPO。在乙醇濃度約為53%時(shí)達(dá)到EPO的洗脫峰值。利用滲濾濃縮最終EPO制備物，并用0.1M磷酸鈉緩沖液，pH7.0替代溶劑。實(shí)施例25轉(zhuǎn)基因家禽衍生的紅細(xì)胞生成素的糖分析采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的以下分析技術(shù)測(cè)定禽類(lèi)衍生的人EPO的寡糖結(jié)構(gòu)。通過(guò)化學(xué)方法釋放蛋白質(zhì)上的O-連接寡糖，通過(guò)酶促方法釋放蛋白質(zhì)上的N-連接寡糖。釋放后，用NaOH方法使O-連接和N-連接的寡糖全甲基化，所述方法包括在無(wú)水DMSO中與甲基碘反應(yīng)，然后用氯仿萃取，并進(jìn)行分析。用HPLC分離結(jié)構(gòu)。由肽主鏈釋放和純化后，如本領(lǐng)域所知的那樣對(duì)寡糖進(jìn)行MALDI-TOF-MS(襯質(zhì)輔助激光解吸與電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜學(xué))分析和ESIMS/MS(電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜)分析。還用某些酶消化各種多糖物質(zhì)的樣品，然后如本領(lǐng)域所知的那樣用HPLC分析該消化產(chǎn)物。鑒定如下所示的O-連接和N-連接的寡糖結(jié)構(gòu)。對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行的連接分析揭示出圖20和21所示的連接。N-連接的EPO結(jié)構(gòu)如下所示。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage90</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage91</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage92</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage93</formula>NAcGal=N-乙酰-半乳糖胺，NAcGh^N-乙酰-葡糖胺，和SA二唾液酸。實(shí)施例26轉(zhuǎn)基因家禽衍生的EPO的糖分析通過(guò)GC/MS(氣相色譜-質(zhì)譜法)對(duì)獲自轉(zhuǎn)基因雞的EPO進(jìn)行單糖分析。向樣品中摻入阿拉伯糖醇(內(nèi)標(biāo))，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法水解、N-乙?；蚑MS衍生化。將衍生化樣品與類(lèi)似衍生的糖的標(biāo)準(zhǔn)混合物作比較。摻入酮脫氧壬酮糖酸、凍干、水解、脫鹽和再凍干后，對(duì)EPO進(jìn)行唾液酸分析。利用合適的標(biāo)準(zhǔn)品在DionexBioLC系統(tǒng)上分析樣品。表6顯示了EPO的單糖定量檢測(cè)結(jié)果。在單糖分析中還檢測(cè)到痕量污染的木糖、巖藻糖和葡萄糖。用表6所示數(shù)據(jù)代替HPAEC-PAD分析產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)。表6檢測(cè)到的檢測(cè)到的納摩爾單糖納摩爾數(shù)數(shù)/毫克樣品甘露糖49245半乳糖1680N-乙酰半乳糖胺6.030N-乙酰葡糖胺91455唾液酸4.724實(shí)施例2TPD人EPO的體外細(xì)胞增殖活性利用TF-1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)家禽衍生的人EPO的體外生物學(xué)活性。檢測(cè)代表由最初離子交換純化步驟回收的兩種組分的兩個(gè)不同樣品(SP1柱130mMNaCl和250mMNaCl)。這兩種組分的細(xì)胞增殖活性基本相同，隨后證明這兩種組分中所含的糖基化的紅細(xì)胞生成素也基本相同。簡(jiǎn)要說(shuō)，用含有GM-CSF(2ng/ml)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)TF-l細(xì)胞。收獲鋪滿(mǎn)的培養(yǎng)物，洗滌，用不含GM-CSF的生長(zhǎng)培養(yǎng)基接種于標(biāo)準(zhǔn)96孔板的各孔中(各孔為0.32cm2)，細(xì)胞密度為104個(gè)細(xì)胞/孔。用生長(zhǎng)培養(yǎng)基連續(xù)稀釋禽類(lèi)衍生的EPO，一式三份地加入不同孔中。5天后，通過(guò)3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)的代謝還原反應(yīng)測(cè)定細(xì)胞增殖，并用分光光度法定量。純化EPO的體外活性見(jiàn)圖22。以上說(shuō)明書(shū)引用的所有文獻(xiàn)(例如，美國(guó)專(zhuān)利、美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)、出版物)都以參考文獻(xiàn)的形式引入本文。對(duì)本發(fā)明的各種改進(jìn)和變動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的，不超出本發(fā)明的范圍和構(gòu)思。雖然已結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了描述，但應(yīng)了解，如權(quán)利要求所述，本發(fā)明不過(guò)分限于這些具體實(shí)施方案。實(shí)際上，對(duì)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的用于實(shí)施本發(fā)明的方式的各種改進(jìn)都落在以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種包含分離的人EPO的組合物，所述人EPO含有禽類(lèi)衍生的寡糖結(jié)構(gòu)。2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述EPO上大于約50%的N-連接寡糖不含唾液酸。3.如權(quán)利要求l所述的組合物，其特征在于，所述EPO上大于約60%的N-連接寡糖不含唾液酸。4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述EPO上大于約70%的N-連接寡糖不含唾液酸。5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述EPO上大于約80%的N-連接寡糖不含唾液酸。6.如權(quán)利要求l所述的組合物，其特征在于，所述EPO上大于約卯°/。的N-連接寡糖不含唾液酸。7.如權(quán)利要求l所述的組合物，其特征在于，所述N連接寡糖結(jié)構(gòu)類(lèi)型中;t于約50%不含唾液酸。8.如權(quán)利要求l所述的組合物，其特征在于，所述EPO上大于約5(P/。或更多的N-連接寡糖含有末端N-乙酰葡糖胺。9.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述EPO上大于約60%的N-連接寡糖含有末端N-乙酰葡糖胺。10.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述EPO上大于約70Q/O的N-連接寡糖含有末端N-乙酰葡糖胺。11.如權(quán)利耍求1所述的組合物，其特征在于，所述EPO上大于約80n/c的N-連接寡糖含有末端N-乙酰葡糖胺。12.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述EPO上大于約90。/0的N-連接寡糖含有末端N-乙酰葡糖胺。13.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述EPO上約50。/?；蚋嗟腘-連接寡糖結(jié)構(gòu)類(lèi)型含有末端N-乙酰葡糖胺。14.—種包含糖基化EPO的組合物，其中所述EPO上大于約80。/。的N-連接寡糖不含巖藻糖。15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述EPO上大于約900/0的N-連接寡糖不含巖藻糖。16.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述EPO獲自含有編碼所述EPO的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)。17.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述EPO獲自含有編碼所述EPO的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因雞。18.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述EPO是在禽類(lèi)輸卵管細(xì)胞中產(chǎn)生的。19.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述EPO出現(xiàn)在硬殼蛋中。20.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述EPO是人EPO。21.—種包含分離的EPO分子的組合物，其中所述EPO是在轉(zhuǎn)基因雞輸卵管細(xì)胞中產(chǎn)生，并由轉(zhuǎn)基因雞的卵清分離，所述轉(zhuǎn)基因雞含有編碼所述EPO的轉(zhuǎn)基因。22.如權(quán)利要求21所述的組合物，其特征在于，所述EPO是人EPO。23.如權(quán)利要求21所述的組合物，其特征在于，所述輸卵管細(xì)胞是管狀腺細(xì)胞。24.如權(quán)利要求21所述的組合物，其特征在于，所述EPO包含在硬殼蛋中。25.如權(quán)利要求21所述的組合物，其特征在于，所述EPO是N-糖基化的。26.如權(quán)利要求21所述的組合物，其特征在于，所述EPO是O-糖基化的。27.如權(quán)利耍求21所述的組合物，其特征在于，所述組合物是藥物制劑。28.如權(quán)利要求21所述的組合物，其特征在于，所述EPO具有氨基酸序列SEQIDNO:50。29.—種包含分離的EPO的組合物，所述EPO具有雞衍生的糖基化模式。30.如權(quán)利要求29所述的組合物，其特征在于，所述EPO是人EPO。31.如權(quán)利要求29所述的組合物，其特征在于，所述EPO是在輸卵管細(xì)胞中產(chǎn)生的。32.如權(quán)利要求29所述的組合物，其特征在于，所述EPO包含在硬殼蛋中。33.如權(quán)利要求29所述的組合物，其特征在于，所述EPO是在雞輸卵管細(xì)胞中糖基化的。34.如權(quán)利要求29所述的組合物，其特征在于，所述輸卵管細(xì)胞是管狀腺細(xì)胞。35.如權(quán)利要求29所述的組合物，其特征在于，所述組合物是藥物制劑。36.如權(quán)利要求29所述的組合物，其特征在于，所述糖基化模式不同于CHO細(xì)胞和人細(xì)胞中產(chǎn)生的EPO的糖基化模式。37.—種EPO分子的分離混合物，其包含用以下結(jié)構(gòu)糖基化的EPO分子38.如權(quán)利要求37所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO獲自硬殼蛋。39.如權(quán)利要求37所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO是N-糖基化的。40.如權(quán)利要求37所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO具有氨基酸序列SEQIDNO:50。41.如權(quán)利要求37所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO在藥物制劑中。42.—種EPO分子的分離混合物，其包含用以下結(jié)構(gòu)糖基化的EPO分子EX/^GalI-1NacGlu唾液酸o甘露糖。43.如權(quán)利要求42所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO存在于硬殼蛋中。44.如權(quán)利要求42所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO是N-糖基化的。45.如權(quán)利要求42所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO具有氮基酸序列SEQIDNO:50。46.如權(quán)利要求42所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO在藥物制劑中。47.—種EPO分子的分離混合物，其包含用以下結(jié)構(gòu)糖基化的EPO分子睡液酸o甘霸WGall_INacGlu^唾液酸^甘露糖。48.如權(quán)利要求47所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO存在于硬殼蛋中。49.如權(quán)利要求47所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO是N-糖基化的。50.如權(quán)利要求47所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO具有氨基酸序列SEQIDNO:50。51.如權(quán)利要求47所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO在藥物制劑中。52.—種EPO分子的分離混合物，其包含用以下結(jié)構(gòu)糖基化的EPO分子Gal(-1NacGlu唾液酸O甘露糖。53.如權(quán)利要求52所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO存在于硬殼蛋中。54.如權(quán)利要求52所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO是N-糖基化的。55.如權(quán)利耍求52所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO具有鋱基酸序列SEQIDNO:50。56.如權(quán)利要求52所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO在藥物制劑中。57.—種EPO分子的分離混合物，其包含用以下結(jié)構(gòu)糖基化的EPO分f:Gal匸]NacGlu唾液酸O甘露糖。58.如權(quán)利要求57所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO存在亍硬殼蛋中。59.如權(quán)利要求57所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO是N-糖基化的。60.如權(quán)利要求57所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO具有氨基酸序列SEQIDNO:50。61.如權(quán)利要求57所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO在藥62.—種EPO分子的分離混合物，其包含用以下結(jié)構(gòu)糖基化的EPO分子:<image>imageseeoriginaldocumentpage7</image>63.如權(quán)利要求62所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO存在亍硬克蛋中。64.如權(quán)利要求62所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO是N-糖基化的。65.如權(quán)利要求62所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO具有氨基酸序列SEQIDNO:50。66.如權(quán)利要求62所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO在藥物制劑中。67.-種EPO分子的分離混合物，其包含用以下結(jié)構(gòu)糖基化的EPO分丫-<image>imageseeoriginaldocumentpage7</image>68.如權(quán)利要求67所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO存在于硬殼蛋中。69.如權(quán)利要求67所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO是N-糖基化的。70.如權(quán)利要求67所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO具有氨基酸序列SEQIDNO:50。71.如權(quán)利要求67所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO在藥物制劑中。72.—種EPO分子的分離混合物，其包含用以下結(jié)構(gòu)糖基化的EPO分子73.如權(quán)利要求72所述的分離混合物，其特征在y、所述EPO存在于硬殼蛋中。74.如權(quán)利要求72所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO是N-糖基化的。75.如權(quán)利要求72所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO具有氨基酸序列SEQIDNO:50。76.如權(quán)利要求72所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO在藥物制劑中。77.--種EPO分子的分離混合物，其包含用以下結(jié)構(gòu)糖基化的EPO78.如權(quán)利要求77所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO存在于硬殼蛋中。79.如權(quán)利要求77所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO是N-糖基化的。80.如權(quán)利要求77所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO具有氨基酸序列SEQIDNO:50。81.如權(quán)利耍求77所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO在藥物制劑中。82.-種EPO分子的分離混合物，其包含用以下結(jié)構(gòu)糖基化的EPO分于83.如權(quán)利要求82所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO存在于硬殼蛋中。84.如權(quán)利要求82所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO是N-糖基化的。85.如權(quán)利要求82所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO具有氨基酸序列SEQIDNO:50。86.如權(quán)利要求82所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO在藥物制劑中。87.—種EPO分子的分離混合物，其包含用以下結(jié)構(gòu)糖基化的EPO分子NacGal。88.如權(quán)利要求87所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO存在于硬殼蛋中。89.如權(quán)利要求87所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO是O-糖基化的。90.如權(quán)利要求87所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO具有敏難酸序列SEQIDNO:50。91.如權(quán)利要求87所述的分離混合物，其特征在于，所述EPO在藥物制劑中。92.—種包含具有糖基化模式的EPO的組合物，其中所述EPO是在禽類(lèi)輸卵宵細(xì)胞中產(chǎn)生的。93.-種包含具有糖基化模式的EPO的組合物，其中所述糖基化模式不同于人細(xì)胞或CHO細(xì)胞產(chǎn)生的EPO的糖基化模式，且所述EPO是在雞的輸卵符細(xì)胞中產(chǎn)生的。94.如權(quán)利要求93所述的組合物，其特征在于，所述EPO是分離的。95.如權(quán)利要求93所述的組合物，其特征在于，所述輸卵管細(xì)胞是管狀腺細(xì)胞。96.—種治療患者的方法，所述方法包括給予患者治療有效量的獲自轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)的EPO。97.如權(quán)利要求96所述的方法，其特征在于，所述治療有效量是將患者的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)提髙所需數(shù)值的用量。98.—種含有分離的糖基化的人蛋白質(zhì)分子的組合物，所述人蛋白質(zhì)分子是在轉(zhuǎn)基因雞輸卵管中產(chǎn)生的，所述轉(zhuǎn)基因雞含有編碼該人蛋白質(zhì)分子的轉(zhuǎn)基因，所述蛋白質(zhì)分子含有通常不會(huì)出現(xiàn)在該人蛋白質(zhì)上的雞衍生的寡糖。99.一種含有分離的蛋白質(zhì)分子的組合物，所述蛋白質(zhì)分子是在轉(zhuǎn)基因雞輸卵管中產(chǎn)生的，所述轉(zhuǎn)基因雞含有編碼該蛋白質(zhì)分子的轉(zhuǎn)基因，所述蛋白質(zhì)分子含有雞衍生的寡糖且選自下組EPO、G-CSF、GM-CSF、干擾素P、融合蛋白、CTLA4-Fc融合蛋白、生長(zhǎng)激素、細(xì)胞因子、結(jié)構(gòu)物、干擾素、溶菌酶、P-酪蛋白、白蛋白、a-l抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、膠原、因子VIII、因子IX、因子X(jué)(等)、血纖蛋白原、乳鐵蛋白、蛋白C、組織型纖溶酶原激活物(tPA)、生長(zhǎng)激素和糜蛋白酶、免疫球蛋白、抗體、免疫毒素、因子VIII、b-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII、因子VIIa、因子IX，抗凝劑；水蛭素、阿替普酶、tpa、瑞替普酶、tpa、tpa-5個(gè)結(jié)構(gòu)域中缺失3個(gè)、胰島素、賴(lài)脯胰島素、阿斯巴特胰島素、甘精胰島素、長(zhǎng)效胰島素類(lèi)似物、"血糖素、tsh、促卵泡素-P、fsh、pdgh、inf-卩l(xiāng)b、ifn-al、ifn-a、ifn-ala、ifn-alb、ifn-a2、ifn-a2a、ifn-a2b、ifn-卩l(xiāng)a、ifn-ylb、il-2、il-ll、hbsag、ospa、阿法鏈道酶-DNA酶、P葡糖腦苷脂酶、tnf-a、il-2-rt喉毒素融合蛋白、tnfr-lgg片段融合蛋白、拉羅尼酶、DNA酶、阿法賽特、托西莫單抗、鼠單抗、阿來(lái)組單抗、拉布立酶、阿加糖酶P、特立帕肽、甲狀旁腺激素衍生物、阿達(dá)木單抗(lggl)、阿那白滯素、生物改性劑、奈西立肽、人P-型利鈉肽(hbnp)、集落刺激因子、培維索孟、人生長(zhǎng)激素受體拮抗劑、重組激活的蛋白c、奧馬佐單抗、免疫球蛋白e(lge)阻斷物、替伊莫單抗、ACTH、高血糖素、生長(zhǎng)抑素、生長(zhǎng)激素、胸腺素、甲狀旁腺激素、色素激素、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素、黃體生成素、絨毛膜促性腺素、下丘腦釋放因子、依那西普、抗利尿激素、促乳素和促甲狀腺激素、免疫球蛋白多肽、免疫球蛋白多肽D區(qū)、免疫球蛋白多肽J區(qū)、免疫球蛋白多肽C區(qū)、免疫球蛋fi輕鏈、免疫球蛋白重鏈、免疫球蛋白重鏈可變區(qū)、免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和接頭肽。100.如權(quán)利要求99所述的組合物，其特征在于，所述組合物在藥物制劑中。101.如權(quán)利要求99所述的組合物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是N-糖基化的。102.如權(quán)利要求99所述的組合物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是O-糖基化的。103.—種制備糖基化的紅細(xì)胞生成素的方法，所述方法包括產(chǎn)生含有編碼紅細(xì)胞生成素的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)，其中所述紅細(xì)胞生成素包裝到所述禽類(lèi)所產(chǎn)的硬殼蛋中。104.—種禽類(lèi)所產(chǎn)的蛋，其含有EPO或G-CSF。105.—種禽類(lèi)所產(chǎn)的蛋，其含有權(quán)利要求99所述的蛋白廣。106.-種卵清，每毫升含有大于0.5微克的外源性蛋白質(zhì)。全文摘要獲自轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)所產(chǎn)蛋的具有禽類(lèi)N-連接和O-連接的糖基化模式的紅細(xì)胞生成素。文檔編號(hào)C07K14/405GK101595125SQ200780039130公開(kāi)日2009年12月2日申請(qǐng)日期2007年10月10日優(yōu)先權(quán)日2006年11月9日發(fā)明者A·J·哈維,G·劉,J·A·莫里斯,J·C·拉普,R·D·伊瓦瑞申請(qǐng)人:辛那杰瓦生物制藥股份有限公司;佐治亞大學(xué)研究基金會(huì)股份有限公司