專利名稱：抗胞外基質(zhì)蛋白的rgd氨基酸序列的抗體及其制法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗胞外基質(zhì)蛋白的RGD氨基酸序列的抗體及 采用該抗體的癌、炎癥性疾病、自身免疫疾病、傳染病、骨疾 病的預(yù)防、治療方法及i貪斷方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞翁附在多細(xì)胞生物的生命維持中發(fā)揮著重要的作用。 多細(xì)胞生物的細(xì)胞黏附可分為細(xì)胞-胞外基質(zhì)間黏附與細(xì)胞-細(xì) 胞間翁附，已知細(xì)胞-胞外基質(zhì)間黏附中，整聯(lián)蛋白參與細(xì)胞黏 附；細(xì)胞-細(xì)胞間黏附中，鈣黏著蛋白、密蛋白(claudin)、柄 蛋白等參與細(xì)胞縣附。此外，這些黏附分子不僅有細(xì)胞黏附的
功能，還逐漸發(fā)現(xiàn)其與信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)的傳導(dǎo)直接相關(guān)。
連結(jié)細(xì)胞與胞外基質(zhì)的黏附由以整聯(lián)蛋白為代表的跨膜細(xì) 胞黏附蛋白構(gòu)成。整聯(lián)蛋白由a鏈與(3鏈的異二聚體構(gòu)成，通過(guò) 不同的a鏈與卩鏈的組合，至少存在24種整聯(lián)蛋白分子，分別與 特異的胞外基質(zhì)分子結(jié)合。由此，包括整聯(lián)蛋白在內(nèi)的跨膜細(xì) 胞黏附蛋白不僅參與細(xì)胞與胞外基質(zhì)的黏附，還以信號(hào)的方式 向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)胞外基質(zhì)來(lái)源的信息，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)、 細(xì)月包死亡、分4匕等(F. G. Giancotti, et al., Science, 285, 1028-1032, 1999 )。
已知胞外基質(zhì)分子的種類可分為膠原類(1 XIX型等)、 非膠原糖蛋白類(骨橋蛋白、玻連蛋白、纖連蛋白、血管性血 友病(von Willebrand )因子、層粘連蛋白、腱生蛋白、纖維蛋 白原、血小板反應(yīng)蛋白等)，彈性蛋白類及蛋白聚糖類(硫酸乙 酰肝素聚糖等)，有多種蛋白質(zhì)；這些胞外基質(zhì)分子(配體)與對(duì)應(yīng)的整聯(lián)蛋白結(jié)合，活化細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié) 細(xì)胞骨架形成、移動(dòng)、增殖、分化等。即，與配體結(jié)合的整聯(lián) 蛋白與細(xì)胞表面的受體型酪氨酸激酶協(xié)同調(diào)控這些信號(hào)活性通 路，依據(jù)配體種類的不同，其對(duì)應(yīng)的整聯(lián)蛋白傳導(dǎo)各種不同的
信號(hào)。多種胞外基質(zhì)蛋白共同存在的細(xì)胞黏附區(qū)域有RGD (精 氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列。從而，胞外基質(zhì)蛋白的RGD序 列通過(guò)與整聯(lián)蛋白勒附而發(fā)揮多種功能，其作為藥物靶標(biāo)受到 關(guān)注，被制成多種低分子化合物及合成肽。
與RGD序列結(jié)合的整聯(lián)蛋白中，存在a3(31、 a5pi、 a8pl、 av卩l(xiāng)、 av卩3、 av卩5、 av卩6、 av卩8。至今為止，整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的 信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的研究以闡明a5(31與作為其特異性配體的纖連 蛋白的相互作用為中心而進(jìn)行。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)a5pi不僅調(diào)控細(xì)胞 黏附與細(xì)胞移動(dòng)，也調(diào)控細(xì)胞的分化及細(xì)胞死亡(S.M. Frisch et al. : Curr. Opin. Cell Biol., 9， 701-706, 1997 )。然而，整 聯(lián)蛋白介導(dǎo)的信號(hào)因配體而不同，纖連蛋白所黏附的內(nèi)皮細(xì) 胞受增殖因子的刺激而顯示出增殖活性，-f旦同樣的細(xì)胞與層 粘連蛋白-l黏附后，增殖活性喪失，反而表現(xiàn)為增殖抑制。 此外，與來(lái)自纖連蛋白的由a5pi介導(dǎo)的信號(hào)不同，來(lái)自層粘連 蛋白-10/11的由a3pi介導(dǎo)的信號(hào)強(qiáng)烈促進(jìn)癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)(J. Gu et al., J . Biol. Chem.， 276, 27090-27097, 2001 )，強(qiáng)烈回避由 血液饑-賊而導(dǎo)致的細(xì)月包凋亡(J. Gu et al., J. Biol. Chem., 277， 19922-19928， 2002 )。與I(GD序歹ll結(jié)A的整耳關(guān)*白中，av整耳關(guān) 蛋白在破骨細(xì)胞及新生血管中高表達(dá)，av整聯(lián)蛋白成為骨質(zhì)疏 松癥及癌治療藥的靶標(biāo)分子。此外，a5pl整if關(guān)蛋白在肺瘤細(xì)胞 中高表達(dá)，顯示出與癌的惡性化相關(guān)。據(jù)此，開(kāi)發(fā)出作為抑制 胞外基質(zhì)蛋白與整聯(lián)蛋白結(jié)合的拮抗物，即作為抗整聯(lián)蛋白抗 體的藥品的抗a5(31整聯(lián)蛋白抗體(Volocimab)、抗a4整耳關(guān)蛋白抗體(Natalizumab )、抗avp3整聯(lián)蛋白抗體(Vitaxin )。
另一方面，含有RGD序列的胞外基質(zhì)蛋白已知有膠原、骨 橋蛋白(OPN )、玻連蛋白、纖連蛋白、血管性血友病(von Willebrand)因子、層粘連蛋白、腱生蛋白、纖維蛋白原、血 小板反應(yīng)蛋白等。此外，病毒及細(xì)菌也有RGD序列，和其與細(xì) 胞的教附有關(guān)。含有RGD序列的OPN為骨中大量含有的鈣結(jié)合 性的酸性糖蛋白，擔(dān)負(fù)著細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、肺瘤形成、免 疫應(yīng)答以及補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解等多種重要功能。此外，采用 OPN的缺陷小鼠及使用中和抗體的分析中顯示，其與肝炎、風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病及癌轉(zhuǎn)移相關(guān)。從而，通過(guò)抑制 RGD介導(dǎo)的細(xì)胞與胞外基質(zhì)蛋白的黏附，可期待骨質(zhì)疏松癥及 癌的治療，因此與整聯(lián)蛋白相反，也可從胞外基質(zhì)蛋白的角度 開(kāi)發(fā)拮抗物藥 品O

發(fā)明內(nèi)容
至今為止，雖制作有抑制RGD序列介導(dǎo)的與整聯(lián)蛋白的相 互作用的低分子化合物及合成肽、抗OPN及整聯(lián)蛋白的抗體， 但不存在抗RGD序列的特異性抗體。此外，抗OPN及整聯(lián)蛋白 的抗體由于抑制RGD序列之外的胞外基質(zhì)蛋白與整聯(lián)蛋白的 結(jié)合，會(huì)在生物體內(nèi)產(chǎn)生非目的的作用，有發(fā)生副作用的可能。
因此，期待通過(guò)特異性抑制RGD序列介導(dǎo)的黏附，從而對(duì) 炎癥、癌、傳染病、自身免疫、骨質(zhì)疏松癥等疾病有顯著效果， 同時(shí)減輕副作用，迫切希望提供這些疾病的更好的治療法。此 外，用病理模型動(dòng)物評(píng)價(jià)抗人OPN抗體及抗人整聯(lián)蛋白抗體的 效果時(shí)，因該抗體與該動(dòng)物的靶標(biāo)蛋白或肽不發(fā)生交叉反應(yīng)， 通常采用抗該動(dòng)物的靶標(biāo)蛋白或肽的異種動(dòng)物的抗體來(lái)進(jìn)行藥 效評(píng)價(jià)，給予人的嵌合抗體、人源化抗體或人抗體與采用病理模型動(dòng)物評(píng)價(jià)的抗體完全不同。這在藥品的開(kāi)發(fā)上是重大的問(wèn) 題點(diǎn)，因此期望可采用治療人時(shí)使用的抗體通過(guò)病理模型動(dòng)物 來(lái)評(píng)價(jià)其治療效果。
本發(fā)明人等以抑制RGD序列介導(dǎo)的胞外基質(zhì)蛋白與整聯(lián) 蛋白的結(jié)合為目的，就抗RGD序列的抗體的制作進(jìn)行了各種研 究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用含有RGD序列的小鼠OPN的部分肽能制作小鼠 的單克隆抗體，該抗RGD序列的抗體與人胞外基質(zhì)蛋白的RGD 序列也發(fā)生交叉反應(yīng)，具有抗炎癥效果、抗癌效果等，從而完 成了本發(fā)明。
即，具體來(lái)"i兌，本發(fā)明提供以下所述的抗RGD抗體、該抗 RGD抗體的制造方法、含有該抗RGD抗體作為有效成分的癌、 炎癥性疾病、傳染病、自身免疫性疾病以及骨病的診斷劑及治 療劑，以及該抗RGD抗體的嵌合抗體、人源化抗體或人抗體的
制造方法等。
(1 ) 一種抗RGD抗體，其含有序列號(hào)l 12中任意一種氨
基酸序列。
(2) —種抗RGD抗體，其含有序列號(hào)l、 3、 5、 7、 9或11 的氨基酸序列。
(3) —種抗RGD抗體，其含有序列號(hào)l、 3、 5、 7、 9及11 的氨基酸序列。
(4) 一種抗RGD抗體，其含有序列號(hào)2、 4、 6、 8、 10或 12的氨基酸序列。
(5) —種抗RGD抗體，其含有序列號(hào)2、 4、 6、 8、 10及 12的氨基酸序列。
(6 )根據(jù)上述(1 ) ~ ( 5 )中任意 一 項(xiàng)所述的抗RGD抗 體，其中，重鏈的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDRH)中的氨基酸序列 含有序列號(hào)l ~ 6中任意一種氨基酸序列，輕鏈的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDRL)中的氨基酸序列含有序列號(hào)7 12中任意一種氨基
酸序列。
(7 )根據(jù)上述(1 ) ~ ( 6 )中任意 一 項(xiàng)所述的抗RGD抗 體，其特異性識(shí)別人、小鼠、或這兩者的胞外基質(zhì)蛋白的RGD序列。
(8) 根據(jù)上述(1) ~ ( 7 )中任意一項(xiàng)所述的抗RGD抗 體，其為單克隆抗體。
(9) 一種單克隆抗體，其特異性識(shí)別人及小鼠的胞外基質(zhì) 蛋白的RGD序列。
(10) 根據(jù)上述(I) ~ ( 9)中任意一項(xiàng)所述的抗RGD抗 體，其抑制人、小鼠、或這兩者的胞外基質(zhì)蛋白與RGD受體的 結(jié)合。
(11 )根據(jù)上述(1 ) ~ ( 10 )中任意一項(xiàng)所述的抗RGD
抗體，其為嵌合抗體。
(12)根據(jù)上述(1 ) ~ (10)中任意一項(xiàng)所述的抗RGD 抗體，其為人源化抗體。
(13 )根據(jù)上述(1 ) ~ (10)中任意一項(xiàng)所述的抗RGD 抗體，其為人抗體。
(14 ) 一種抗RGD單克隆抗體，其由保藏號(hào)FERM BP-10440、 FERM BP-10441標(biāo)示的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。
(15) —種癌、炎癥性疾病、傳染病、自身免疫疾病或骨 疾病的治療劑，其含有上述(1 ) ~ (14)中任意一項(xiàng)所述的抗 RGD抗體作為有效成分。
(16) —種癌、炎癥性疾病、傳染病、自身免疫性疾病或 骨病的診斷劑，其含有上述(1 ) ~ (14)中任意一項(xiàng)所述的抗 R G D抗體作為有效成分。
(17) 上述(1) ~ (14)中任意一項(xiàng)所述的抗RGD抗體的制造方法，其特征在于，其采用CVDVPNGRGDSLAYGLR(序 列號(hào)13)作為抗原。
(18 ) —種嵌合抗體的制造方法，其通過(guò)基因工程學(xué)方法 在人抗體中插入上述(l) ~ ( 14 )中任意一項(xiàng)所述的抗RGD 抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)；或。
(19) 一種人源化抗體的制造方法，其通過(guò)基因工程學(xué)方 法在人抗體中插入上述(1 ) ~ (14)中任意一項(xiàng)所述的單克隆 抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)域。
(20 ) —種人抗體的制造方法，其特征在于，其采用 CVDVPNGRGDSLAYGLR (序列號(hào)13 ) 4乍為4元原。
本發(fā)明的單克隆抗體與小鼠和人的胞外基質(zhì)蛋白中存在的 RGD氨基酸序列特異性反應(yīng)，部分抗體與屬于具有RGD結(jié)構(gòu)的 胞外基質(zhì)蛋白的骨橋蛋白(OPN)、纖連蛋白(FN)、玻連蛋白 (VN)、層粘連蛋白顯示交叉反應(yīng)性。此外，因本發(fā)明的單克 隆抗體與人和小鼠的胞外基質(zhì)蛋白反應(yīng)，可采用病理模型小鼠 進(jìn)行藥效的評(píng)價(jià)。另外，本發(fā)明的單克隆抗體可用于胞外基質(zhì) 蛋白相關(guān)的肝炎等炎癥性疾病、癌的增殖/轉(zhuǎn)移、風(fēng)濕等自身免 疫性疾病等的治療。


圖1為表示采用人及小鼠的OPN的部分肽得到的抗體 (4P11、 I1M6、 25H15、 35B6 )所識(shí)別的表位分析結(jié)果的圖。
圖2為表示采用人及小鼠的OPN的部分肽得到的抗體 (29R5、 30C17、 33E10、 3818)所識(shí)別的表位分析結(jié)果的圖。
圖3為表示采用含有小鼠的OPN的RGD的部分肽得到的抗 體(33E10、 35B6)所識(shí)別的表位分析結(jié)果的圖。
圖4為表示采用小鼠的OPN的部分肽得到的抗體(33E10、35B6)所識(shí)別的表位分析結(jié)果的圖。
圖5為表示采用小鼠的OPN的部分肽(CGDSLAYGLR (序 列號(hào)19))得到的抗體(33E10、 35B6)所識(shí)別的表位分析結(jié)果的圖。
圖6為表示分析抗RGD抗體的重《連中的互補(bǔ)性決定區(qū)域 (CDR)的結(jié)果的圖。予以說(shuō)明，33E10及35B6兩者的重鏈的 序列中，第l位的氨基酸未表示(從第2位的氨基酸殘基開(kāi)始表 示)。此外，33E10的序列中的第99位的殘基(F )及35B6的序 列中的第98位的殘基(F)可為K或R。
圖7為表示分析抗RGD抗體的輕《連中的互補(bǔ)性決定區(qū)域 (CDR )的結(jié)果的圖。
質(zhì)蛋白的結(jié)合的結(jié)果的圖。
圖9為表示研究抗RGD抗體對(duì)mOPN N-half與癌細(xì)胞 (NIH3T3細(xì)胞)的細(xì)胞黏附抑制效果結(jié)果的圖。
圖10為表示研究抗RGD抗體對(duì)各種胞外基質(zhì)蛋白與癌細(xì) 胞(NIH3T3細(xì)胞)的細(xì)胞黏附抑制效果結(jié)果的圖。
圖ll為表示研究抗RGD抗體抑制肝炎發(fā)病效果結(jié)果的圖。
圖12為表示通過(guò)實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型研究抗RGD抗體的肺 轉(zhuǎn)移抑制效果結(jié)果的圖(A:轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)、B:體重的變化)。
圖13為表示用自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移模型研究抗RGD抗體的肺轉(zhuǎn) 移抑制效果結(jié)果的圖(A:腫瘤尺寸、B:轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)、C:體 重的變化)。
圖14為表示抗RGD抗體在風(fēng)濕病理才莫型中的風(fēng)濕治療效
果的圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明人等通過(guò)對(duì)以下幾點(diǎn)進(jìn)行認(rèn)真研究，成功得到了與
小鼠和人的胞外基質(zhì)蛋白中存在的RGD氨基酸序列特異性反 應(yīng)的小鼠單克隆抗體。
首先，也出于采用小鼠的病理模型進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)的目的而 制作RGD序列的單克隆抗體時(shí)，不采用人OPN的氨基酸序列， 而嘗試了采用小鼠OPN設(shè)計(jì)含有RGD序列的部分肽而用小鼠制 備單克隆抗體。其結(jié)果，采用小鼠OPN的部分肽成功制作了 8 種通常認(rèn)為是不可能的小鼠單克隆抗體。確認(rèn)了得到的單克隆 抗體為識(shí)別RGD序列的抗體。此外，發(fā)現(xiàn)得到的單克隆抗體雖 根據(jù)抗體不同反應(yīng)性有差異，但與含有RGD序列的人的胞外基 質(zhì)蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。另外，還確認(rèn)了這些單克隆抗體抑制 RGD序列與整聯(lián)蛋白的結(jié)合。
隨后，釆用病理模型小鼠來(lái)評(píng)價(jià)得到的單克隆抗體的推測(cè) 藥效。對(duì)給予ConA導(dǎo)致發(fā)病的暴發(fā)型肝炎模型，給予得到的單 克隆抗體，觀察到作為肝炎的指標(biāo)的AST與ALT明顯下降。此 外，通過(guò)作為癌轉(zhuǎn)移模型的實(shí)驗(yàn)性癌轉(zhuǎn)移模型與自發(fā)性癌轉(zhuǎn)移 模型，對(duì)得到的單克隆抗體的癌轉(zhuǎn)移抑制效果進(jìn)行了研究。即， 實(shí)驗(yàn)性癌轉(zhuǎn)移模型中，在小鼠的靜脈內(nèi)給予小鼠的癌細(xì)胞 B16-Luc,測(cè)算小鼠的肺中癌轉(zhuǎn)移的數(shù)目；自發(fā)性癌轉(zhuǎn)移模型 中，在小鼠的腳掌給予B16-BL6細(xì)胞后，測(cè)算其向肺的轉(zhuǎn)移數(shù) 目，由此研究了得到的單克隆抗體的癌轉(zhuǎn)移抑制效果。其結(jié)果， 得到的單克隆抗體在兩模型中都顯示了癌轉(zhuǎn)移的抑制效果。另 外，通過(guò)給予II型膠原抗體混合物與LPS導(dǎo)致風(fēng)濕發(fā)病的模型小 鼠，確認(rèn)了得到的單克隆抗體也顯示明顯的風(fēng)濕治療效果。
1.本發(fā)明的抗RGD抗體
本發(fā)明提供抗RGD序列的單克隆抗體。更具體來(lái)說(shuō)，本發(fā) 明提供特異性識(shí)別人及小鼠的胞外基質(zhì)蛋白的RGD氨基酸序列的單克隆抗體。
本說(shuō)明書中"胞外基質(zhì)蛋白"指構(gòu)成胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)，其 含有例如骨橋蛋白、玻連蛋白、纖連蛋白、血管性血友病因子、 膠原、層粘連蛋白、腱生蛋白、纖維蛋白原、血小板反應(yīng)蛋白、
制管張素(angiostatin)、纖溶酶(plasmin )、 VCAM-1等，但不 受限于此。予以說(shuō)明，本說(shuō)明書中"胞外基質(zhì)"遵循該領(lǐng)域常用 的意義，定義為充滿組織中的胞外空間的生物高分子的復(fù)雜集 合體(例如參考《分子細(xì)胞生物學(xué)詞典》，323頁(yè)，東京化學(xué)同 人(1997 ))。此外，本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)"胞外基質(zhì)蛋白"可與"胞
外基質(zhì)分子"互換使用。
本說(shuō)明書中"抗體"指抗體分子整體或其片段(例如Fab、 Fab，、 F (ab，) 2等片段)，可為多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā) 明中優(yōu)選指單克隆抗體。此外，本發(fā)明中"抗體"包括嵌合抗體、 人源化抗體、人抗體。
本說(shuō)明書中抗體"特異性識(shí)別"某蛋白或其片段是指與該 抗體對(duì)其他氨基酸序列的親和性相比，該抗體與該蛋白或其片
段的特定的氨基酸序列以實(shí)質(zhì)上的高親和性結(jié)合。在此，"實(shí)質(zhì) 上的高親和性"指根據(jù)期望的測(cè)定裝置，能與其他氨基酸序列 區(qū)分并檢測(cè)出該特定的氨基酸序列的高親和性，典型地指結(jié)合 常數(shù)(Ka)至少為107m",優(yōu)選至少為1()sm"，更優(yōu)選為109m-1, 更加優(yōu)選為101gm"、 10Hm"、 10"m"或更高，例如最高為1013m-1 或更高的結(jié)合親和性。
本說(shuō)明書中，"抗RGD抗體"指特異性識(shí)別蛋白質(zhì)、多肽或 多肽中的RGD序列的抗體。
本說(shuō)明書中"單克隆抗體"指基本上為均質(zhì)的抗體集團(tuán)，即 構(gòu)成集團(tuán)的每個(gè)抗體都來(lái)自除了天然情況下可能發(fā)生的少量存 在的突變體外的均質(zhì)的抗體集團(tuán)。單克隆抗體為高度特異性地、與單一的抗原部位作用的抗體。另外，與含有對(duì)應(yīng)不同表位的 不同抗體的多克隆抗體相比，各單克隆抗體可針對(duì)抗原上的單 一表位。除了其特異性之外，單克隆抗體不僅具有上述特異性， 而且通過(guò)不混有其他免疫球蛋白的雜交瘤的培養(yǎng)，穩(wěn)定地合成 均質(zhì)的抗體，具有可更簡(jiǎn)便地純化的優(yōu)點(diǎn)。修飾語(yǔ)"單克隆"為 示意來(lái)自基本上均質(zhì)的抗體集團(tuán)的抗體的特性的詞，并非限定 抗體為通過(guò)特定的方法來(lái)制造。
本說(shuō)明書中"抗體片段"指全長(zhǎng)抗體的一部分，為抗原結(jié)合
區(qū)域或可變區(qū)域。例如抗體片段包括Fab、 Fab，、 F ( ab， ) 2、 和Fv片段。這些抗體片段可通過(guò)抗體的木瓜蛋白酶消化，胃蛋 白酶消化等一般公知的方法制作。
上述"嵌合抗體"指通過(guò)基因工程學(xué)方法將本發(fā)明中得到的 抗RGD抗體的恒定區(qū)域改變?yōu)榫哂信c人的抗體相同恒定區(qū)域 的人/小鼠嵌合抗體(參照歐洲專利公開(kāi)公報(bào)EP0125023 )。"人 源化抗體，，指通過(guò)基因工程學(xué)方法將本發(fā)明中得到的抗RGD抗 體的H鏈與L鏈的互補(bǔ)性決定區(qū)域以外的 一 級(jí)結(jié)構(gòu)改變?yōu)榕c人 的抗體相應(yīng)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的抗體。"人抗體"指采用導(dǎo)入了與人的 抗體產(chǎn)生相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物而制作的單克隆抗體(參照 歐洲專利7^開(kāi)/^寺艮EP0546073 )。
本發(fā)明中特別優(yōu)選的抗體為由本說(shuō)明書的實(shí)施例中示出的 保藏號(hào)FERM BP-10440、 FERM BP-10441標(biāo)示的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn) 生的抗RGD抗體。
以下，對(duì)抗RGD單克隆抗體的制作進(jìn)^f亍詳細(xì)闡述，^E抗體 的制作方法不受限于此。
2.含RGD序歹'j的月太(抗原)
本發(fā)明中作為抗原使用的含RGD序列的肽，包括例如 像本實(shí)施例中釆用的含有作為小鼠的胞外基質(zhì)蛋白的細(xì)胞翁附序列的 RGD序列的氨基酸序列 CVDVPNGRGDSLAYGLR (序列號(hào)13 )那樣的、由至少含有作 為細(xì)胞黏附序列的"RGD"序列且通過(guò)免疫可產(chǎn)生抗RGD序列抗
體的氨基酸序列構(gòu)成的肽。
這種"含RGD序列的肽"、"含有RGD序列的肽"或"由含有 RGD序列的氨基酸序列構(gòu)成的肽"例如包括已知含有RGD序列 的作為胞外基質(zhì)蛋白的骨橋蛋白(OPN)、玻連蛋白、纖連蛋白、 血管性血友病因子、膠原、層粘連蛋白、腱生蛋白、纖維蛋白 原、血小板反應(yīng)蛋白等含RGD序列的肽。此外，本發(fā)明中的"含 RGD序列的肽"、"含有RGD序列的肽"或"由含有RGD序列的氨 基酸序列構(gòu)成的肽"為由至少約5個(gè)氨基酸、優(yōu)選約5至約50個(gè)氨 基酸，更優(yōu)選約10至約20個(gè)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列。予以說(shuō) 明，本說(shuō)明書中術(shù)語(yǔ)"含RGD序列的肽"與"含有RGD序列的肽" 或"由含有RGD序列的氨基酸序列構(gòu)成的肽"可互換使用。
在此，只要實(shí)質(zhì)上有同等的抗原性，本發(fā)明中使用的"含 RGD序列的肽"或"由含有RGD序列的氨基酸序列構(gòu)成的肽"還 包括含有該氨基酸序列中的多個(gè)氨基酸優(yōu)選1至10個(gè)的氨基酸 特別優(yōu)選l至數(shù)個(gè)(例如1至5個(gè))氨基酸被置換、缺失及/或被 修飾的氨基酸序列的突變多肽；或者含有該氨基酸序列中添加 或插入多個(gè)氨基酸優(yōu)選1至10個(gè)氨基酸特別優(yōu)選1至數(shù)個(gè)(例如l 至5個(gè))氨基酸的氨基酸序列的突變多肽。另外，"含RGD序列 的肽"或"由含有RGD序列的氨基酸序列構(gòu)成的肽"也可為有多 個(gè)上述那樣的置換、缺失、修飾、添加及插入的突變多肽。
本發(fā)明中使用的、由含有RGD序列的氨基酸序列構(gòu)成的肽 可適當(dāng)釆用化學(xué)合成法，還可適當(dāng)采用基因重組技術(shù)、細(xì)胞培 養(yǎng)方法等該技術(shù)領(lǐng)域中公知的方法或其修飾方法來(lái)制造?？蓪?分離的胞外基質(zhì)蛋白用蛋白分解酶等適當(dāng)?shù)厍袛鄟?lái)制造。此外，由含有RGD序列的氨基酸序列構(gòu)成的肽可為小鼠、大鼠、人、 豬、猴、牛、兔等哺乳動(dòng)物來(lái)源的肽，只要為可產(chǎn)生抗RGD序 列的抗體的含RGD序列的肽即可，其制法不受特別限制。
為進(jìn)一步提高其抗原性，也可將上述含有RGD序列的肽與 其他生物高分子結(jié)合。這種提高抗原性的生物高分子例如有甲 ^j大ll^求蛋白、4月孑L血藍(lán)蛋白(KLH， keyhole limpet hemocyanin), 牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白(OVA)、牛球蛋白等，但更 優(yōu)選甲狀腺球蛋白。此外，含有RGD序列的肽與生物高分子的 結(jié)合可用偶聯(lián)劑法(具有活性酯與馬來(lái)酰亞胺官能團(tuán)的結(jié)合試 劑用活性酯與蛋白質(zhì)或肽的氨基結(jié)合，用馬來(lái)酰亞胺與蛋白 質(zhì)或月太的SH基結(jié)合。)(S. Yoshitake et al., Eur . J. Biochem., 101 ， 395-399, 1979.)、混合酸酐法(B. F. Edanger et al., J. Biol. Chem., 234, 1090-1094， 1954.)、活性酉旨法(A. E. Karu et al.， J. Agric. Food Chem.， 42, 301-309， 1994.)等，但優(yōu)選的方法 為偶聯(lián)試劑法。
3. 抗體產(chǎn)生細(xì)胞的制備
對(duì)于被免疫的動(dòng)物給予抗原，是在可產(chǎn)生抗體的部位將抗 原自身或與載體、稀釋劑共同進(jìn)行給予。給予時(shí)為提高抗體產(chǎn)
周給予1次，共進(jìn)行2 10次左右。采用的溫血?jiǎng)游锢缈膳e出 小鼠、猴、兔、狗、豚鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、綿羊、山羊、雞等，
但本發(fā)明中優(yōu)選采用小鼠。
治療的對(duì)象為人，抗RGD抗體產(chǎn)生動(dòng)物為小鼠的情況下， 優(yōu)選采用人/鼠嵌合抗體或人源化抗體，另外，優(yōu)選采用用導(dǎo)入 了與抗體產(chǎn)生相關(guān)的人基因的小鼠等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來(lái)制作的人單 克隆抗體。
4. 抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合骨髓瘤細(xì)胞采用小鼠、大鼠、人等來(lái)源的細(xì)胞。例如可舉
i±i d、 f、f ft^tP3Ul、 P3X63畫Ag8、 P3X63-Ag8國(guó)Ul 、 P3NSl國(guó)Ag4、 SP2/0-Ag14、 P3X63-Ag8國(guó)653等，優(yōu)選抗體產(chǎn)生細(xì)月包與骨髓瘤 細(xì)胞來(lái)源于同種動(dòng)物，特別是同種系的動(dòng)物。骨髓瘤細(xì)胞可冷 凍保存，也可用添加了胎牛血清的普通培養(yǎng)基傳代維持。細(xì)胞 融合優(yōu)選采用對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞。本發(fā)明中優(yōu)選采用 P3X63-Ag8-653。
使抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤的方法可 舉出采用聚乙二醇(PEG)的方法、采用仙臺(tái)病毒的方法、 采用電融合裝置的方法等。例如采用PEG法的情況下，在含 有約30 ~ 60。/o的PEG (平均分子量1000 ~ 6000 )的適當(dāng)?shù)?；?養(yǎng)基或緩沖液中將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以1 ~ 10: 1、優(yōu)選5 ~ 10: l的混合比懸浮，在溫度約25 37。C、 pH6 8的條件下 反應(yīng)約30秒~ 5分鐘左右即可。反應(yīng)結(jié)束后，除去PEG溶液后 再懸浮于培養(yǎng)基中，接種至多孔細(xì)胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。
5.雜交瘤細(xì)^^的分選
產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的分選可按照公知方法或基 于公知方法的方法進(jìn)行。通常可使用添加了 HAT (次黃。票呤、 氨基蝶呤、胸腺嘧啶脫氧核苷)的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)基進(jìn)行。分 選及育種用培養(yǎng)基只要雜交瘤細(xì)胞能繁殖則可釆用任何培養(yǎng) 基。例如可采用含有1 ~ 20%、優(yōu)選IO ~ 20。/。的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基、含有1 ~ 10。/。的胎牛血清的GIT培養(yǎng)基(和光純藥 工業(yè)(林))或雜交瘤培養(yǎng)用無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM-101,日水制 藥(抹))等。培養(yǎng)溫度通常為20 40°C,優(yōu)選為約37。C。培養(yǎng) 時(shí)間通常為5天 3周，優(yōu)選為1周 2周。培養(yǎng)通常可在5%(:02 下進(jìn)行。
本發(fā)明的單克隆抗體的產(chǎn)生可采用淋巴功能探索法(卩7 球機(jī)能探索法)(矢田純一、藤原道夫編著，中外醫(yī)學(xué)社，
588-592頁(yè)，1994 )中記載的ELISA法進(jìn)行確認(rèn)及篩選?？赏ㄟ^(guò) 對(duì)ELISA中得到陽(yáng)性反應(yīng)的克隆重復(fù)有限稀釋法1至5回、優(yōu)選2 至4回來(lái)制備單克隆抗體。為從通過(guò)細(xì)胞融合得到的各種雜交瘤 中得到與RGD序列反應(yīng)的克隆，可如下篩選產(chǎn)生識(shí)別RGD序列 的抗體的雜交瘤將含有作為抗原的RGD序列的肽例如 CVDVPNGRGDSLAYGLR (序列號(hào)13 )固定在96孔板上，與雜 交瘤的培養(yǎng)上清反應(yīng)后，用酶標(biāo)記抗小鼠IgG抗體檢測(cè)的ELIS A 法來(lái)篩選。
6. 抗體的分離純化
得到的抗體可純化至均質(zhì)?？贵w的分離、純化可采用蛋白 質(zhì)通常使用的分離純化方法。例如適當(dāng)選擇凝膠過(guò)濾、離子交 換色譜、親和色譜等色譜柱、過(guò)濾、超濾、鹽析、透析、SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點(diǎn)電泳等并組合，可分離純化抗體 (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 ),葉旦不受限于此。親和色 譜中使用的載體可舉出抗原結(jié)合樹(shù)脂、蛋白A結(jié)合樹(shù)脂、蛋白G 結(jié)合樹(shù)脂?？乖Y(jié)合樹(shù)脂有巰基瓊脂糖珠(Amersham Biosciences)等，優(yōu)選采用其上結(jié)合有含有作為抗原的RGD序 列的肽、例如CVDVPNGRGDSLAYGLR (序歹。號(hào)13 )的載體的 親和色語(yǔ)。
7. 抗體的制劑
如上所述得到的單克隆抗體可按照常規(guī)方法制劑化，可用 為癌、炎癥性疾病、傳染病、自身免疫性疾病及骨病等的預(yù)防 及/或治療劑。這些預(yù)防及/或治療劑的劑型可為注射劑、點(diǎn)滴 用劑等非經(jīng)口制劑，也可通過(guò)創(chuàng)新研究而作為經(jīng)口制劑使用。 此外，進(jìn)行制劑化時(shí)，在藥事上及藥學(xué)上容許的范圍內(nèi)，可使用與劑型相應(yīng)的載體、稀釋劑或添加劑等。
以本發(fā)明的單克隆抗體作為有效成分的制劑可作為癌、例 如癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，炎癥性疾病(例如變形性關(guān)節(jié)炎、肝 炎、支氣管哮喘、纖維癥、糖尿病、動(dòng)脈硬化、多發(fā)性硬化癥、
炎癥性腸疾病(潰瘍性大腸炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)))、 傳染病(例如肝炎)、自身免疫性疾病(例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系 統(tǒng)性紅斑狼瘙、多發(fā)性肌炎、自身免疫性曱狀腺疾病、小管間 質(zhì)性腎炎、重癥肌無(wú)力癥)及骨病(例如骨質(zhì)疏松癥)等的預(yù) 防及/或治療劑-使用。
給予量根據(jù)給予對(duì)象、對(duì)象疾病、癥狀、給予方式等而異， 例如，使用目的為癌患者的預(yù)防及/或治療的情況下，優(yōu)選通過(guò) 靜脈注射給予本發(fā)明的抗體，每次用量通常為0.01 ~ 20mg/kg 體重左右，優(yōu)選O.l ~ 10mg/kg體重左右，更加優(yōu)選O.l ~ 5mg/kg 體重左右，l月1 ~ IO次左右，優(yōu)選l月1 ~ 5次左右。其他非經(jīng)口 給予及經(jīng)口給予的情況也可按照此量給予。癥狀特別嚴(yán)重的情 況下，也可根據(jù)其癥狀增加給予量或給予次數(shù)。
本發(fā)明的抗體可以將其自身或作為適當(dāng)?shù)乃幬锝M合物給 予。上述給予中采用的藥物組合物為含有上述抗體或其鹽與藥 理學(xué)上容許的載體、稀釋劑或賦形劑的組合物。如上所述的組 合物以適應(yīng)于非經(jīng)口給予或經(jīng)口的劑型提供。
即，用于非經(jīng)口給予的組合物采用例如注射劑、滴鼻劑、 栓劑等，注射劑包含l爭(zhēng)脈注射劑、皮下注射劑、皮內(nèi)注射劑、 肌肉注射劑、點(diǎn)滴注射劑等劑型。如上所述的注射劑按照公知 的方法、例如將上述抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化于通常用于 注射劑的無(wú)菌的水性或油性液體中來(lái)制備。注射用的水性液例 如采用生理食鹽水以及含有葡萄糖、蔗糖、甘露醇等其他佐劑 的等張溶液等，也可與適當(dāng)?shù)脑鋈軇?、例如?例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子型表面活性劑(例如聚
山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、 HCO-50 (氫化蓖麻油聚氧乙烯 (5Ommo1 )加成物)等并用。油性液體例如采用芝麻油、大豆 油等，增溶劑可并用苯曱酸千酯、苯甲醇等。制備的注射液通 常充填于適當(dāng)?shù)陌碴称?、小玻璃瓶、注射器中。滴鼻劑及栓?通過(guò)將上述抗體混合于通常的滴鼻藥用基劑、栓劑用基劑中來(lái) 制備。予以說(shuō)明，通常經(jīng)口給予抗體等蛋白質(zhì)因會(huì)被消化器官 分解而較為困難，但通過(guò)抗體片段及修飾過(guò)的抗體片段與劑型 的創(chuàng)新研究，也存在經(jīng)口給予的可能性。
上述的非經(jīng)口用藥物組合物優(yōu)選制備為適應(yīng)于活性成分的 給予量的給藥單位的劑型。如上所述的給藥單位的劑型例如可 列舉注射劑(安瓿瓶、小玻璃瓶、預(yù)充式注射器)、滴鼻劑、栓 劑等，每投藥單位劑型分別優(yōu)選含有通常5 ~ 500mg上述抗體， 尤其是注射劑優(yōu)選含有5 100mg上述抗體、其他劑型優(yōu)選含有 150 ~ 250mg上述抗體。
予以說(shuō)明，上述各組合物中，只要與上述抗體的調(diào)配不產(chǎn) 生不良相互作用，也可含有其他的活性成分。
8.含有本發(fā)明的單克隆抗體的診斷劑
本發(fā)明的單克隆抗體可作為炎癥性疾病例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎、肝炎、支氣管哮喘、纖維癥、糖尿病、癌轉(zhuǎn)移、動(dòng)脈硬化、 多發(fā)性硬化癥、肉芽肺等的診斷劑，或器官移植后的慢性排斥 反應(yīng)抑制、系統(tǒng)性自身免疫性疾病/紅斑狼瘡/葡萄膜炎/白塞病 (Behcet's Disease) /多發(fā)性肌炎/系膜增殖性腎炎/結(jié)節(jié)病等自 身免疫性疾病的診斷劑使用。本發(fā)明的單克隆抗體因可特異性 識(shí)別RGD序列，可通過(guò)夾層免疫測(cè)定法、竟?fàn)幟庖邷y(cè)定法、免 疫觀'J量(immunometric ) 或散色t匕；蟲(chóng)、;去(nephrometry )等進(jìn) 行待測(cè)液中的胞外基質(zhì)蛋白的定量。在上述各個(gè)免疫學(xué)測(cè)定法應(yīng)用于本發(fā)明的測(cè)定方法時(shí)，無(wú)需設(shè)定特別的條件、操作等。 可在各方法通常的條件、操作方法的基礎(chǔ)上，再加上本領(lǐng)域技 術(shù)人員的通常的技術(shù)考慮建立測(cè)定體系。其一般技術(shù)手段的具
體內(nèi)容可參照總論、書籍等。
如上所述，通過(guò)釆用本發(fā)明的抗體，可高靈敏度地定量胞 外基質(zhì)蛋白。另外，通過(guò)利用采用本發(fā)明的抗體的生物體內(nèi)胞 外基質(zhì)蛋白的定量法，可診斷與胞外基質(zhì)蛋白相關(guān)的各種疾病。 例如，檢測(cè)出胞外基質(zhì)蛋白的濃度的增減的情況下，可診斷為 患有胞外基質(zhì)蛋白相關(guān)疾病、例如炎癥性疾病的可能性較高或 將來(lái)患病的可能性較高。此外，本發(fā)明的單克隆抗體，可在特 異性檢測(cè)體液及組織等待測(cè)樣本中存在的胞外基質(zhì)蛋白的
RGD序列時(shí)使用。此外，可用于制作純化胞外基質(zhì)蛋白時(shí)使用 的抗體柱，檢測(cè)純化時(shí)各組分中含有的胞外基質(zhì)蛋白、分析待
測(cè)細(xì)胞內(nèi)胞外基質(zhì)蛋白的行為等。
以下示出實(shí)施例以更具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍 不受限于此。
實(shí)施例
實(shí)施例l:抗體制作方法
合成含有作為胞外基質(zhì)蛋白的細(xì)胞黏附序列的RGD序列 與SLAYGLR序列(序歹'J號(hào)25 )的CVDVPNGRGDSLAYGLR序 列(序歹'J號(hào)13 )，通過(guò)EMCS( Dojir^^司)與甲狀腺5求蛋白(Sigma 公司)結(jié)合，以此為免疫原與佐劑一起對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。4次免 疫后收集脾細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞X63-Ag8-653進(jìn)行細(xì)胞融合。 采用HAT培養(yǎng)基進(jìn)行選擇后，用固定有抗原肽的ELISA法篩選 培養(yǎng)上清，選擇了產(chǎn)生識(shí)別RGD序列的抗體的雜交瘤(8個(gè)克 隆4P11、 11M6、 25H15、 29R5、 30C17、 33E10、 35B6、 3818)。 采用巰基瓊脂糖珠(Amersham Biosciences^^司)制作抗原肽柱，從雜交瘤的培養(yǎng)上清純化抗體。
予以說(shuō)明，此處得到的雜交瘤細(xì)胞33E10及35B6分別以保 藏號(hào)FERM BP-10440及FERM BP-10441于2005年IO月27日保藏 于茨城縣筑波市東l丁目1番地1中央第6 (郵政編碼305-8566 )、 獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心。
實(shí)施例2:表位的分析
將合成的含有小鼠OPN來(lái)源的部分肽的mOPNl (CLPVKTDSGSSEEKLY ( 序歹'J號(hào)14 ) ) 、 mOPN5 (CVDVPNGRGDSLAYGLR (序列號(hào)13 ) )、 CVDVPNGRGDS (序列號(hào)15 )、 CPNGRGD (序列號(hào)16 )、 CGRGDSLAYGLR (序 列號(hào)17)、 CGDSLAYG (序列號(hào)18)、 CGDSLAYGLR (序列號(hào) 19)及CSLAYGLR (序列號(hào)20)、人OPN來(lái)源的部分肽hOPN5 (CVDTYDGRGDSVVYGLRS (序歹'J號(hào)21 ))及CSVVYGLR(序 列號(hào)22)、含有小鼠與人共同的部分肽的CGRGDS (序列號(hào)23) 通過(guò)EMCS ( Dojin公司)與BSA ( Sigma公司)結(jié)合，作為ELISA 分析用肽使用。 [T丄ISA法]
4夸月太(lOpg/ml)或蛋白質(zhì)(5pg/ml)在96孑14反中于37。C》丈 置1小時(shí)進(jìn)行固定，用0.1。/。BSA/PBS/0.05。/。NaN3溶液封閉后， 在各種濃度下使抗體于37。C反應(yīng)l小時(shí)。隨后以HRP標(biāo)記的抗小 鼠IgG抗體(Jackson公司)作為二抗，于37 °C反應(yīng)30分鐘后， 用OPD顯色15分鐘，以1N H2S04終止反應(yīng)，觀'J定490nm處的吸 光度。
采用固定了各種合成的肽的甲狀腺球蛋白結(jié)合體的96孔板 進(jìn)行ELISA。其結(jié)果如圖l、 2、 3、 4及5中所示，因4P11、 11M6、 25H15、 35B6及33E10與mOPN5及hOPN5結(jié)合，故其為識(shí)別小鼠與人雙 方的部分肽的抗體。其中，33E10不與含有RGD序列下游的序 列的CSLAYGLR (序歹'j號(hào)20 )、 CSVVYGLR (序歹'J號(hào)22 )反應(yīng)， 與CGRGDS (序列號(hào)23 )、 CVDVPNGRGDS (序列號(hào)15 )及 CPNGRGD (序列號(hào)16)反應(yīng)，因此為識(shí)別這些肽的共同序列 RGD的抗體，為對(duì)小鼠與人雙方顯示反應(yīng)性的抗體。此外，35B6 不與CGRGDS (序列號(hào)23 )、 CVDVPNGRGDS (序列號(hào)15 )及 CPNGRGD(序列號(hào)16 )反應(yīng)，與CGRGDSLAYGLR(序列號(hào)17 )、 CGDSLAYG (序列號(hào)18)、 CGDSLAYGLR (序列號(hào)19)反應(yīng)， 因此說(shuō)明其為識(shí)別包括RGD序列中GD的RGD序列下游的序列 的抗體。29R5、 30C17及38I8雖顯示與GRGDS (序列號(hào)24)、 SLAYGLR (序歹'J號(hào)25 )或SVVYGLR (序列號(hào)26 )有少許反應(yīng) 性，但其僅與mOPN5反應(yīng)，因此為識(shí)另'j小鼠的OPN的 VDVPNGRGDSLAYGLR (序列號(hào)27)的抗體。
實(shí)施例3:抗體的氨基酸序列分析
采用RNeasy Mini試劑盒(Qiagen公司)提取雜交瘤細(xì)胞R NA, 采用第一4連cDNA合成試劑盒(Amersham Biosciences公 司)制作cDNA。采用Heavy primer擴(kuò)增試劑盒(Amersham Bi osciences乂^司)進(jìn)4亍PCR, 擴(kuò)增4元體的重！連(Heavy chain) c DNA,插入到pCRII-TOPO載體(invitrogen7^司)中，確定cD NA序列、氨基酸序列。CDR區(qū)域利用ABG(抗體三維結(jié)構(gòu)目錄， Directory of 3D structures of antibodies ) ( http:〃www.ibt.una m.mx/vir/structure/structures.html ) 與Igblast序歹寸(blast for I g sequence ) ( http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast)石角定。
其結(jié)果，重鏈及輕鏈的可變區(qū)域與CDR區(qū)域?yàn)閳D6及圖7中 所示的氨基酸序列。具體如下。(重鏈)
3 3 E 1 0 3 5 B 6 :
3 3 E 1 0 : 3 5 B 6 :
3 3 E 1 0
3 5 B 6 :
(輕鏈)
3 3 E 1 0
3 5 B 6 :
3 3 E 1 0
3 5 B 6 : [CDRX3]
3 3 E 1 0 3 5 B 6 :
予以說(shuō)明
GFTFTDYYMI (序歹ij號(hào)l) GYTFTNYWMH (序歹ij號(hào)2 )
WLGF IRNKANGYTTEYSASVKG (序歹,J號(hào)3) WIGNINPRNGDSNYNEKFRS (序歹ij號(hào)4)
GAY(序列號(hào)5) GYFDV (序列號(hào)6)
RSSQSIVHSNGNTYLE (序歹ij號(hào)7) KASQDINSYLS (序歹'J號(hào)8)
RVSNRFS (序歹ij號(hào)9) R A N R L V D (序歹ij號(hào)1 0 )
GSFVPW (序列號(hào)H) YDEFPF (序列號(hào)12)
本實(shí)驗(yàn)采用ABG確定了 CDR區(qū)域，但根據(jù)使用 的軟件不同，得到的結(jié)果也可能存在少許差異，本領(lǐng)域技術(shù)人 員均可理解這一點(diǎn)。
實(shí)施例4:與具有RGD的胞外基質(zhì)蛋白的結(jié)合 [分析中采用的蛋白質(zhì)]
人骨橋蛋白(hOPN)、小鼠骨橋蛋白(mOPN)釆用抗OPN 抗體柱從分別導(dǎo)入了各基因的CHO-Kl細(xì)胞的培養(yǎng)上清中純化。人玻連蛋白(VN)從旭，夕乂夕'，久公司獲得，人纖連蛋 白(FN)、人血小板反應(yīng)蛋白、小鼠層粘連蛋白從Sigma公司獲
3曰付。
將肽(10pg/ml)或蛋白質(zhì)(5)ig/ml)在96孔板中于37。C放 置1小時(shí)進(jìn)行固定，用0.P/oBSA/PBS/0.05。/。NaN3溶液封閉后， 使抗體在各種濃度下于37。C反應(yīng)l小時(shí)。隨后以HRP標(biāo)記的抗小 鼠IgG抗體(Jackson公司)作為二抗于37°C反應(yīng)30分鐘后，用 OPD顯色15分鐘，以1N H2S04終止反應(yīng)，測(cè)定490nm處的吸光 度。
采用分別固定了hOPN、 mOPN、 FN、 VN或?qū)诱尺B蛋白的 96孔板進(jìn)行ELISA。
其結(jié)果如圖8所示?？梢钥闯?，33E10雖與層粘連蛋白的反 應(yīng)性低，但顯示與研究的所有胞外基質(zhì)蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。 35B6與hOPN及mOPN反應(yīng)，但不與FN、 VN及層粘連蛋白反應(yīng)。
實(shí)施例5:細(xì)力包黏附試-驗(yàn)
人骨橋蛋白(hOPN)、小鼠骨橋蛋白(mOPN)釆用抗OPN 抗體柱從分別導(dǎo)入了各基因的CH0-K1細(xì)胞的培養(yǎng)上清中純 化。mOPN N-half通過(guò)將小鼠OPN的凝血酶(thrombin)的酶切
位點(diǎn)的N端以GST融合蛋白的形式從大腸桿菌中純化得到。人 纖連蛋白(FN)、人玻連蛋白(VN)從Sigma公司獲得。 [細(xì)胞翁附試一驗(yàn)方法]
按50pl/孔向96孔板中添加蛋白質(zhì)，于37度靜置1小時(shí)進(jìn)行 固定。用封閉液(0.5%BSA/PBS )封閉后，用PBS清洗1次，將 用添加了 0.25。/oBSA的D-MEM懸浮的NIH3T3細(xì)胞與單克隆抗體混合，按200pl/孑L添力口 ，使?jié)舛葹?.0xl()5個(gè)/ml。于37。C、 5%C02T反應(yīng)1小時(shí)后，按50|11/孑匕向孔中添加0.5%結(jié)晶紫 (WAKO, Osaka, Japan ) /20%曱醇溶液，室溫下放置30分鐘 進(jìn)行細(xì)胞的固定與染色。將板用蒸餾水清洗后，用20%醋酸溶 液轉(zhuǎn)溶，測(cè)定590nm處的吸光度。 [細(xì)胞黏附抑制力]
在固定了 mOPN N-half的96孔板中加入混合有NIH3T3細(xì)胞 與33E10或35B6的溶液，研究了抗體對(duì)NIH3T3細(xì)胞與mOPN N-half的黏附的影響(圖9)。此外，在分別固定了mOPNN-half、 FN或VN的96孔板中加入混合有NIH3T3細(xì)胞與33E10的溶液， 研究了抗體對(duì)細(xì)胞與各蛋白質(zhì)的黏附的影響(圖IO)。
其結(jié)果如圖9及10中所示，NIH3T3細(xì)胞與mOPN N-half縣附， 該細(xì)胞翁附被抗RGD抗體抑制，與3 5B6相比3 3 E10的RGD依賴 性凌占附抑制能力較高。此外，確認(rèn)了NIH3T3細(xì)胞與研究的所有 胞外基質(zhì)蛋白翁附，33E10抑制其與mOPN N-half的細(xì)胞黏附， 但不抑制其與FN及VN的細(xì)胞黏附，說(shuō)明其特異性抑制OPN與 細(xì)胞的黏附。
實(shí)施例6:肝炎抑制試驗(yàn)
向尾靜脈以400)ag/只給予單克隆抗體，3小時(shí)后給予ConA 后，于12小時(shí)后測(cè)定ALT、 AST。予以-說(shuō)明，小鼠以每組5只進(jìn) 行，對(duì)照抗體采用小鼠IgG。
其結(jié)果如圖ll所示，25H15完全不抑制肝炎發(fā)病，4P11、11M6、 29R5、 30C17及38I8顯示少許的抑制效果，但33E10及 35B6完全未觀察到ALT、 AST活性的上升，說(shuō)明抑制了肝炎發(fā)病。
實(shí)施例7:癌轉(zhuǎn)移抑制試驗(yàn) [癌轉(zhuǎn)移模型動(dòng)物]
實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型采用如下模型向C57BL/6小鼠尾靜脈 給予小鼠黑色素瘤細(xì)胞抹B16-Luc細(xì)胞(lxl()S個(gè)/只)，14日后
研究肺轉(zhuǎn)移數(shù)。
自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移模型中，將B16-BL6細(xì)胞(4xl05)皮下接種 于C57BL/6小鼠的右后腳掌。接種19日后外科切除原發(fā)腫瘤。 于原發(fā)腫瘤切除14日后(B16-BL6細(xì)胞給予后33日后)處死， 測(cè)算肺中的肺瘤集落數(shù)。
實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移才莫型中，將單克隆抗體400pg/只與B16-Luc 細(xì)胞混合后同時(shí)給予，14日后研究肺轉(zhuǎn)移數(shù)。予以說(shuō)明，對(duì)照 抗體采用同亞類(mlgGl)抗體。
其結(jié)果如圖12所示，與對(duì)照相比，33E10與35B6的平均的 肺轉(zhuǎn)移數(shù)都降低，35B6顯著地抑制了肺轉(zhuǎn)移。
另一方面，自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移模型中，將200pg單克隆抗體于 腫瘤移植后第3、 5、 7、 9、 11、 13、 15及17日共計(jì)8次腹腔內(nèi)給 予，測(cè)定至肺瘤移植后第19日外科切除原發(fā)腫瘤為止的原發(fā)腫 瘤的尺寸。另外，于原發(fā)腫瘤切除后第14日測(cè)算肺中的腫瘤集 落數(shù)。予以說(shuō)明，對(duì)照抗體采用同亞類(mlgGl)的抗體。
原發(fā)腫瘤尺寸隨天數(shù)的變化及肺轉(zhuǎn)移的腫瘤數(shù)如圖13所 示。通過(guò)33E10與35B6的給予，原發(fā)肺瘤尺寸與對(duì)照相比顯著 減小，確認(rèn)了 33E10與35B6都有抑制肺瘤增殖的效果。此外， 因?qū)φ?只中2只的轉(zhuǎn)移腫瘤數(shù)較多，35B6未能得出統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，但在轉(zhuǎn)移腫瘤數(shù)的平均值上，33E10與35B6與對(duì) 照相比較少，因此說(shuō)明33E10與35B6均抑制癌的肺轉(zhuǎn)移。
實(shí)施例8:風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎抑制試驗(yàn)
釆用給予抗II型膠原的抗體的關(guān)節(jié)炎用混合物(IBL),按 照說(shuō)明書使風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病。即，對(duì)BALB/c小鼠給予抗II型 膠原抗體混合物，3天后給予LPS使之發(fā)病。予以說(shuō)明，分別對(duì) 四肢按如下所示的關(guān)節(jié)炎分值(score) ( 0:無(wú)癥狀。1:四肢 的指等小關(guān)節(jié)僅l根紅腫。2:小關(guān)節(jié)2根以上、或手腕及腳踝等 較大的關(guān)節(jié)紅腫。3: l只手或腳整體紅腫。4: 一只手或腳的整 體腫脹進(jìn)一步達(dá)到最大限度。四肢的合計(jì)最大為16分。)來(lái)進(jìn)行 關(guān)節(jié)炎的評(píng)價(jià)。
關(guān)節(jié)炎用混合物給予的前一天起至關(guān)節(jié)炎用混合物給予的 6天后每日腹腔內(nèi)給予200iig單克隆抗體共8次，關(guān)節(jié)炎用混合 物給予后每日進(jìn)行觀察算出關(guān)節(jié)炎分值。
其結(jié)果如圖14中所示，33E10和35B6與對(duì)照相比關(guān)節(jié)炎分 值都較小，可以說(shuō)33E10與35B6都具有抑制風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病 的效果。
產(chǎn)業(yè)上的利用可能性
本發(fā)明的單克隆抗體通過(guò)抑制胞外基質(zhì)蛋白的功能，對(duì)癌 (例如癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移)、炎癥性疾病(例如變形性關(guān)節(jié)炎、 肝炎、支氣管哮喘、纖維癥、糖尿病、動(dòng)脈硬化、多發(fā)性硬化 癥、炎癥性腸疾病(潰瘍性大腸炎、克羅恩氏病))、傳染病(例 如肝炎)、自身免疫性疾病(例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼 瘡、多發(fā)性肌炎、自身免疫性曱狀腺疾病、小管間質(zhì)性腎炎、 重癥肌無(wú)力癥)及骨病(例如骨質(zhì)疏松癥)等有治療效果。此夕卜，本發(fā)明的單克隆抗體因可檢測(cè)出體液、細(xì)胞或組織中的胞 外基質(zhì)蛋白，也可作為診斷藥使用。
權(quán)利要求
1.一種抗RGD抗體，其含有序列號(hào)1～12中任意一種氨基酸序列。
2. —種抗RGD抗體，其含有序列號(hào)l、 3、 5、 7、 9或11的氨基酸序列。
3. —種抗RGD抗體，其含有序列號(hào)l、 3、 5、 7、 9及11的氨基酸序列。
4. 一種抗RGD抗體，其含有序列號(hào)2、 4、 6、 8、 10或12的氨基酸序列。
5. —種抗RGD抗體，其含有序列號(hào)2、 4、 6、 8、 10及12的氨基酸序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l ~ 5中任意一項(xiàng)所述的抗RGD抗體，其 中，重鏈的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDRH)中的氨基酸序列含有序 列號(hào)1 ~ 6中任意 一 種氨基酸序列，輕鏈的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDRL)中的氨基酸序列含有序列號(hào)7 12中任意一種氨基酸 序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l ~ 6中任意一項(xiàng)所述的抗RGD抗體，其特 異性識(shí)別人、小鼠、或這兩者的胞外基質(zhì)蛋白的RGD序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l ~ 7中任意一項(xiàng)所述的抗RGD抗體，其為單克隆抗體。
9. 一種單克隆抗體，其特異性識(shí)別人及小鼠的胞外基質(zhì)蛋 白的RGD序列。
10. 根據(jù)權(quán)利要求l ~ 9中任意一項(xiàng)所述的抗RGI)抗體，其 抑制人、小鼠、或這兩者的胞外基質(zhì)蛋白與RGD受體的結(jié)合。
11. 根據(jù)權(quán)利要求l ~ IO中任意一項(xiàng)所述的抗RGD抗體，其為嵌合抗體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求l ~ IO中任意一項(xiàng)所述的抗RGD抗體，其為人源化抗體。
13. 根據(jù)權(quán)利要求l ~ IO中任意一項(xiàng)所述的抗RGD抗體，其為人抗體。
14. 一種抗RGD單克隆抗體，其由保藏號(hào)FERMBP-10440、 FERM BP-10441標(biāo)示的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。
15. —種癌、炎癥性疾病、傳染病、自身免疫性疾病或骨 病的治療劑，其含有斥又利要求l ~ 14中任意一項(xiàng)所述的抗RGD 抗體作為有效成分。
16. —種癌、炎癥性疾病、傳染病、自身免疫性疾病或骨 病的診斷劑，其含有權(quán)利要求l ~ 14中任意一項(xiàng)所述的抗RGD 抗體作為有效成分。
17. 權(quán)利要求l ~ 14中任意一項(xiàng)所述的抗RGD抗體的制造 方法，其特征在于，其采用CVDVPNGRGDSLAYGLR (序列號(hào)13 )作為抗原。
18. —種嵌合抗體的制造方法，其通過(guò)基因工程學(xué)方法在 人抗體中插入權(quán)利要求l ~ 14中任意一項(xiàng)所述的抗RGD抗體的 互補(bǔ)性決定區(qū)i或。
19. 一種人源化抗體的制造方法，其通過(guò)基因工程學(xué)方法 在人抗體中插入權(quán)利要求l ~ 14中任意一項(xiàng)所述的單克隆抗體 的互補(bǔ)性決定區(qū)i^。
20. —種人抗體的制造方法，其特征在于，其采用 CVDVPNGRGDSLAYGLR (序歹d號(hào)13 )作為抗原。
全文摘要
本發(fā)明提供特異性識(shí)別人及小鼠的胞外基質(zhì)蛋白的RGD氨基酸序列的單克隆抗體。通過(guò)特異性抑制RGD序列介導(dǎo)的黏附，可期待對(duì)炎癥、癌、傳染病、自身免疫、骨質(zhì)疏松癥等疾病有顯著效果，同時(shí)可期待減輕副作用，對(duì)于這些疾病可提供更好的治療法。
文檔編號(hào)C07K16/18GK101528777SQ200780039768
公開(kāi)日2009年9月9日 申請(qǐng)日期2007年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月26日
發(fā)明者上出利光, 今重之, 木村千惠美 申請(qǐng)人:株式會(huì)社遺傳科技