專利名稱：：肽的制作方法肽本發(fā)明涉及一種內(nèi)部受約束的環(huán)形寡肽，包含此寡肽的藥物組合物，此寡肽和藥物組合物在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，和制備此寡肽的方法。
背景技術(shù)：
：已知蛋白質(zhì)受體一般通過(guò)表位與其耙配體結(jié)合，表位是氨基酸的組合，構(gòu)成蛋白大分子中的一小部分。細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)受體常經(jīng)觸發(fā)而在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生信號(hào)，導(dǎo)致與稱為蛋白配體的另一種蛋白結(jié)合。配體中與受體相互作用的部分稱為表位，通常由肽鏈骨架中彼此緊密靠近的少數(shù)氨基酸組合而成。表位的例子是位于蛋白質(zhì)表面能與抗體或T細(xì)胞受體相互作用的那些結(jié)構(gòu)，但事實(shí)上，蛋白表面能被另一種蛋白識(shí)別的任何區(qū)域都屬于表位結(jié)構(gòu)。因?yàn)榈鞍资荏w與表位的結(jié)合可能是疾病病原學(xué)的一個(gè)重要步驟，或相反，是治療疾病的一個(gè)重要步驟，故鑒定出形成表位的功能基團(tuán)對(duì)開(kāi)發(fā)新藥物可能是一種富有成效的途徑，所述新藥是含有結(jié)合該受體的表位的制劑。阻礙用此法開(kāi)發(fā)新藥物有二種挑戰(zhàn)。一種是需鑒定出可用作藥物分子、能結(jié)合相應(yīng)受體以治療疾病的表位。第二種挑戰(zhàn)是需設(shè)計(jì)出能保持和提供形成此表位的氨基酸組合的分子，從而實(shí)現(xiàn)與細(xì)胞受體的強(qiáng)結(jié)合相互作用。能形成表位的氨基酸組合的鑒定方法是已知的。在傳統(tǒng)的組合化學(xué)方法中，必須通過(guò)合成數(shù)百種不同基團(tuán)(如氨基酸)以不同順序組成的可能組合，并檢測(cè)各自的效力，才能鑒定能出結(jié)合某特異性受體的最有希望的序列。此種方法耗時(shí)、費(fèi)用高并且受到用于將不同成分連接在一起的化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)的限制。WO01/01140提供了一種鑒定表位的改進(jìn)方法。提供能與配體相互作用的組合物。該組合物包含由非共價(jià)鍵裝配成的多個(gè)不同偶聯(lián)物，各偶聯(lián)物含有頭基和尾基。偶聯(lián)物的尾基形成疏水性聚集體，各偶聯(lián)物在裝配物中彼此之間能自由運(yùn)動(dòng)，因此在存在配體時(shí)，至少2個(gè)頭基通過(guò)恰當(dāng)定位形成能與配體相互作用的表位，其相互作用強(qiáng)度高于頭基各自單獨(dú)的情況。鑒定具有所需生物學(xué)活性的多種偶聯(lián)物包括選擇一組含頭基陣列、彼此之間形成非共價(jià)連接的偶聯(lián)物，此偶聯(lián)物中尾基疏水性聚集而偶聯(lián)物之間彼此可自由移動(dòng)，并檢測(cè)非共價(jià)連接與配體之間的相互作用是否充分。利用修飾的頭基陣列重復(fù)此過(guò)程以尋找非共價(jià)連接與配體之間的充分相互作用。此方法通過(guò)依賴于頭基彼此靠近結(jié)合所產(chǎn)生的表位來(lái)鑒定能結(jié)合特異性受體的最有希望的序列，而無(wú)需用傳統(tǒng)的組合化學(xué)方法合成數(shù)百種不同基團(tuán)的可能組合。此方法只依賴于頭基彼此靠近結(jié)合所產(chǎn)生的表位。一旦合成了一組偶聯(lián)物就不需要合成其它化學(xué)物，只需將諸偶聯(lián)物簡(jiǎn)單混合通過(guò)非共價(jià)連接而形成不同的探針。雖然這種新的組合物和方法已成功用于鑒定能形成表位而結(jié)合靶配體的功能基團(tuán)，但是仍需要提供能形成所需表位，并且與靶配體相互作用的穩(wěn)定性和特異性提高以產(chǎn)生生物學(xué)應(yīng)答反應(yīng)的改進(jìn)組合物。嘗試過(guò)制備只由氨基酸構(gòu)成的包含結(jié)合位點(diǎn)的表位的類似肽，但常常因?yàn)檫@些肽不具有與蛋白質(zhì)受體相同的生物學(xué)活性而遭遇失敗。蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)是由蛋白質(zhì)鏈的非毗連不同部分的寡肽構(gòu)成，曾嘗試通過(guò)混合分離的游離寡肽溶液重建此種結(jié)合位點(diǎn)，但沒(méi)能產(chǎn)生這種活性結(jié)合位點(diǎn)。因此，本發(fā)明目的是提供能形成所需表位、能以提高的穩(wěn)定性和特異性與耙配體相互作用從而產(chǎn)生生物學(xué)應(yīng)答反應(yīng)的改進(jìn)寡肽。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種環(huán)形寡肽，其包含能特異性結(jié)合靶配體的由至少6個(gè)氨基酸組成的環(huán)，此寡肽中的環(huán)包含多個(gè)氨基酸區(qū)域，每個(gè)區(qū)域含有至少2個(gè)表位形成性氨基酸，以及二個(gè)或多個(gè)結(jié)合性官能團(tuán)，其定位可形成一個(gè)或多個(gè)環(huán)內(nèi)連接；將此環(huán)形寡肽約束成單一構(gòu)象，各區(qū)域中的表位形成性氨基酸形成表位，各表位能特異性結(jié)合耙配體。本領(lǐng)域知曉環(huán)形肽的構(gòu)象比線性寡肽更受約束。環(huán)形肽中肽末端的自由移動(dòng)受限。因?yàn)樗鼈円驯换瘜W(xué)錨著在一起。然而，環(huán)形肽仍具有相當(dāng)程度的柔性，使它們不適合參加與靶配體的穩(wěn)定結(jié)合相互作用。構(gòu)建含有二個(gè)或多個(gè)結(jié)合官能團(tuán)的環(huán)形寡肽，其定位能讓它們形成一個(gè)或多個(gè)環(huán)內(nèi)連接，這種環(huán)形寡肽受被內(nèi)部約束成為單一構(gòu)型。這使得各區(qū)域的表位形成性氨基酸能特異性結(jié)合靶配體，其結(jié)合穩(wěn)定性和特異性比迄今可得到的更高。所述表位形成性氨基酸能形成穩(wěn)定的表位，與配體相互作用而誘導(dǎo)生物學(xué)應(yīng)答反應(yīng)。因?yàn)檫@樣形成的表位穩(wěn)定，因而與靶配體的相互作用得以改善。US2005/0107289公開(kāi)了包含環(huán)形肽的抗微生物制劑和組合物，所述環(huán)形肽含有交替的D-和L-a-氨基酸或P-氨基酸組成的氨基酸序列。該文還公開(kāi)指出，認(rèn)為這種環(huán)形肽可在微生物的膜中自身裝配成超分子結(jié)構(gòu)或與微生物膜結(jié)合。這種超分子結(jié)構(gòu)可以是例如納米管。每個(gè)納米管的管道中心有一個(gè)孔，圍繞著一系列疊加的環(huán)形肽的肽骨架。離子和小分子可透過(guò)此種納米管的孔。US2005/0107289沒(méi)有公開(kāi)其環(huán)形肽是否含有表位形成性氨基酸而形成能特異性結(jié)合靶配體的表位。US2005/0107289也沒(méi)有說(shuō)明其環(huán)形肽是否受環(huán)內(nèi)連接的約束以形成這種表位。G.Abbenante等在"噻唑和噁唑啉環(huán)對(duì)海洋來(lái)源環(huán)形八肽的構(gòu)象控制，新型椅形和船形大環(huán)的構(gòu)象"(Co"/orma"o"a/Co"化o/7Wazo/eam/Oxazo"weC_yc//cOc啤e/"^/ei1o/Mar/weOn'g/w.A^ove/Macroc_yc//cC/mz>a""oWCo"/o謂"—J.Am.Chem.Soc.1996,118,10384-10388—文中披露了氨基酸構(gòu)成部件(蘇氨酸、半胱氨酸)隨構(gòu)象約束環(huán)(噻唑，噁唑啉)的適應(yīng)以調(diào)節(jié)海洋大分子(蛋白)的三維結(jié)構(gòu)和反應(yīng)活性。環(huán)形八肽1,c[Ile-Thr-D-Val-Cys-Ile-Thr-D-Val-Cyc-]有很大的柔性，采取了許多低能結(jié)構(gòu)。這種環(huán)形肽沒(méi)有環(huán)內(nèi)連接，沒(méi)有被約束成單一構(gòu)象而形成多個(gè)表位。G.Abbenante等在"噻唑和噁唑啉環(huán)對(duì)海洋來(lái)源環(huán)形八肽的構(gòu)象控制，新型椅形和船形大環(huán)的構(gòu)象"J.Am.Chem.Soc.1996,118,10384-10388—文中還公開(kāi)了環(huán)形肽2,c[Ile-Thr-D-(Val)Thz-Ile-Thr-D-(Val)Thz-]，此肽在溶液中顯示為單一假椅狀構(gòu)象。合成的環(huán)形肽7,c[(Ile)Oxn-D-(Val)-Thz-(Ile)Oxn-D-(Val)Thz-]產(chǎn)生了受高度約束的假船形或馬鞍形大環(huán)。環(huán)形肽7酸水解產(chǎn)生的環(huán)形八肽8顯示為具有更大柔性的船形構(gòu)象。這些環(huán)形八肽受存在的噻唑和/或噁唑啉一定程度的約束，但它們不能形成多個(gè)表位。R.M.Cusack等在"環(huán)形八肽的構(gòu)象和雜環(huán)約束對(duì)其結(jié)合鈣的影響"wpowca/c/謂6zW/wg)J.Chem.Soc.,PerkinTrans.2,2000,323-331—文中公開(kāi)了雜環(huán)中噻唑和噁唑啉約束環(huán)數(shù)目不同的4種環(huán)形八肽。肽l、2和3在溶液中采取了不同形狀。這些環(huán)形八肽胺受存在的噻唑和/或噁唑啉一定程度的約束，但它們不能形成多個(gè)表位。R.M.Cusack等在"環(huán)形八肽的構(gòu)象和雜環(huán)約束對(duì)其結(jié)合鈣的影響"J.Chem.Soc.,PerkinTrans.2，2000,323-331一文中還公開(kāi)了缺乏噻唑和噁唑啉環(huán)的肽4，分子模型顯示這種環(huán)肽除氫鍵外缺乏約束從而有很大的柔性，在溶液中可能采取無(wú)數(shù)多種構(gòu)象。肽4不具有任何環(huán)內(nèi)連接，不被約束成單一構(gòu)象而形成多個(gè)表位?，F(xiàn)在詳細(xì)描述本發(fā)明的環(huán)形寡肽。所述環(huán)形寡肽含有由至少6個(gè)氨基酸組成的環(huán)，此環(huán)包含多個(gè)氨基酸區(qū)域，每個(gè)區(qū)域含有至少二個(gè)表位形成性氨基酸，以及二個(gè)或多個(gè)結(jié)合性官能團(tuán)。在一種實(shí)施方式中，此環(huán)形寡肽含有6個(gè)氨基酸組成的環(huán)，此環(huán)包含二個(gè)氨基酸區(qū)域，每個(gè)區(qū)域含有二個(gè)表位形成性氨基酸，以及二個(gè)結(jié)合性官能團(tuán)。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，此環(huán)形寡肽含有由8個(gè)氨基酸組成的環(huán)，此環(huán)包含二個(gè)氨基酸區(qū)域，每個(gè)區(qū)域含有三個(gè)表位形成性氨基酸，以及二個(gè)結(jié)合性官能團(tuán)。在另一實(shí)施方式中，此環(huán)形寡肽含有由8個(gè)以上氨基酸組成的環(huán)。在此實(shí)施方式中，所述環(huán)優(yōu)選包含三個(gè)結(jié)合性官能團(tuán)，形成環(huán)內(nèi)連接而產(chǎn)生三個(gè)氨基酸區(qū)域，每個(gè)區(qū)域含三個(gè)表位形成性氨基酸。此環(huán)形寡肽中使用的氨基酸可以是任何天然氨基酸，其取代衍生物、類似物和其D-型氨基酸。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方式中，三個(gè)表位形成性氨基酸具有交替的立體化學(xué)構(gòu)型，即L-D-L或D-L-D。這有特別的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榭墒贡砦恍纬尚园被岬膫?cè)鏈以平面構(gòu)型取向，所有都朝向相同方向。這使得表位形成性氨基酸彼此能緊密靠近形成表位。在另一實(shí)施方式中，此環(huán)形寡肽含有IO個(gè)氨基酸組成的環(huán)，此環(huán)包含二個(gè)氨基酸區(qū)域，每個(gè)區(qū)域含有4個(gè)表位形成性氨基酸，以及二個(gè)結(jié)合性官能團(tuán)。此表位形成性氨基酸具有相同的或交替的立體化學(xué)構(gòu)型，即L丄丄-L、D誦D-D-D、L-D-L"L、L-L-D-L、L-L陽(yáng)L-D、D-L-HHD-D、D-D-L-L、L-D陽(yáng)L-D、D-L-D-L、L-D隱D-L、D-L-L-D、D-L-D-D、D-D-L-D、D-D-D丄或L-D-D-D。所述結(jié)合性官能團(tuán)在此環(huán)形寡肽中的位置使它們能形成一個(gè)或多個(gè)環(huán)內(nèi)連接，因而使此環(huán)形寡肽被約束成單一構(gòu)象，而每個(gè)區(qū)域中的表位形成性氨基酸形成一個(gè)表位?？刹捎迷S多不同的方法檢測(cè)環(huán)形寡肽所形成的單一構(gòu)象，這是本領(lǐng)域已知的?？刹捎脴?biāo)準(zhǔn)的光譜學(xué)方法，如^NMR光譜、園二色譜、旋轉(zhuǎn)光色散或X光晶體圖法測(cè)定此環(huán)形寡肽的構(gòu)象。表位形成性氨基酸在各區(qū)域中形成一個(gè)表位，因?yàn)榇谁h(huán)形寡肽被一個(gè)或多個(gè)環(huán)內(nèi)連接約束成單一構(gòu)象。形成的表位能特異性結(jié)合靶配體。表位和耙配體的特定結(jié)構(gòu)在本發(fā)明中不受限制。本發(fā)明的目的是提供包含由至少二個(gè)表位形成性氨基酸、其類似物或衍生物適當(dāng)組合而成的多個(gè)表位的寡肽支架，其組合方式使這些表位形成性氨基酸能維持在具有足夠的剛性的穩(wěn)定構(gòu)象，以使表位能與特異性靶配體(例如受體)牢固結(jié)合。技術(shù)人員可能知道表位形成性氨基酸的序列，或能采用例如WO01/01140中所述的方法證明與耙配體相互作用的表位。技術(shù)人員不需要(知道)所有可能表位的詳細(xì)化學(xué)結(jié)構(gòu)，因?yàn)檫x擇能形成表位的適合氨基酸并不難。在任何給定的情況中任何表位形成性氨基酸的序列可能都適合，這取決于靶配體。此外，各區(qū)域中的氨基酸的順序可能決定了所形成表位的活性，這也取決于靶配體。不需要知道配體的精確化學(xué)結(jié)構(gòu)，只要知曉靶配體的生物學(xué)活性即可。包含在本發(fā)明環(huán)形寡肽中的表位形成性氨基酸無(wú)須知曉其配體的精確化學(xué)結(jié)構(gòu)，因?yàn)榭蓹z測(cè)其與配體的生物學(xué)結(jié)合功能來(lái)測(cè)定表位與配體是否發(fā)生了相互作用。根據(jù)在相應(yīng)檢測(cè)模型中獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，技術(shù)人員不難選出此環(huán)形寡肽要包含的作為表位形成性氨基酸的氨基酸，并通過(guò)測(cè)定有無(wú)所需活性來(lái)確定各區(qū)域中氨基酸的何種順序能提供最佳生物學(xué)活性。檢測(cè)此環(huán)形寡肽與耙配體之間相互作用的試驗(yàn)例子包括結(jié)合試驗(yàn)，如運(yùn)用ELISA原理來(lái)檢測(cè)抗體與抗原之間結(jié)合的那些試驗(yàn)。其它適合的體外試驗(yàn)包括環(huán)境敏感膜結(jié)合熒光探針的熒光改變，沉淀反應(yīng)，酶活性的增強(qiáng)或抑制等等。也可能適合的試驗(yàn)有依賴于測(cè)試物能否改變體外培養(yǎng)細(xì)胞行為的試驗(yàn)，例如細(xì)胞死亡、細(xì)胞增殖、凋亡、抑制或激發(fā)細(xì)胞間接觸、分泌細(xì)胞因子或其它可溶性產(chǎn)物、合成特異性m-RNA、胞內(nèi)泡囊轉(zhuǎn)運(yùn)、改變細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗(yàn)等等。也可進(jìn)行動(dòng)物或人體的體內(nèi)試驗(yàn)，例如在此環(huán)形寡肽中摻入放射標(biāo)記物，然后經(jīng)各種途徑給藥后調(diào)査其后續(xù)分布。各區(qū)域中形成一個(gè)表位。因此，此環(huán)形寡肽中形成的表位數(shù)目至少為二個(gè)、優(yōu)選二個(gè)或三個(gè)。此環(huán)形寡肽中的表位可相同或不同。當(dāng)此環(huán)形寡肽中的表位不相同時(shí)，各區(qū)域可含有不同的氨基酸，或含有相同但順序不同的氨基酸。這種表位的一個(gè)例子是由絲氨酸(S)、苯丙氨酸(F)和精氨酸(R)組合形成的表位，它能結(jié)合巨噬細(xì)胞的表面受體。表位與細(xì)胞表面受體的結(jié)合可導(dǎo)致TNF分泌的抑制。環(huán)內(nèi)連接一個(gè)或多個(gè)環(huán)內(nèi)連接的作用是將此環(huán)形寡肽約束成具有多個(gè)氨基酸區(qū)域的單一構(gòu)象。各區(qū)域中的表位形成性氨基酸受到緊密約束，運(yùn)動(dòng)自由度十分有限。這樣各區(qū)域中就形成了一個(gè)穩(wěn)定的表位，可以提高的穩(wěn)定性和特異性與靶配體相互作用而產(chǎn)生生物學(xué)應(yīng)答反應(yīng)。各環(huán)形寡肽中結(jié)合性官能團(tuán)及其類型的選擇將取決于表位形成性氨基酸和耙配體。結(jié)合性官能團(tuán)數(shù)目和性質(zhì)可能影響此環(huán)形寡肽的生物學(xué)活性。技術(shù)人員通過(guò)檢測(cè)是否有所需活性，不難選出最有效數(shù)目或類型的結(jié)合性官能團(tuán)。兩個(gè)或更多個(gè)適當(dāng)定位的結(jié)合性官能團(tuán)可形成一個(gè)或多個(gè)環(huán)內(nèi)連接。優(yōu)選至少一個(gè)結(jié)合性官能團(tuán)位于各個(gè)氨基酸區(qū)域之間。所述一個(gè)或多個(gè)環(huán)內(nèi)連接可以是共價(jià)或非共價(jià)連接。此環(huán)形寡肽中結(jié)合性官能團(tuán)可相同或不同。這種結(jié)合性官能團(tuán)可位于結(jié)合性氨基酸上。在一實(shí)施方式中，此結(jié)合性官能團(tuán)是所述結(jié)合性氨基酸的側(cè)鏈或其修飾的側(cè)鏈或是加到該結(jié)合性氨基酸側(cè)鏈上的基團(tuán)。以下結(jié)構(gòu)式I是此實(shí)施方式的一個(gè)例子?；蛘?，結(jié)合性官能團(tuán)通過(guò)取代與氮結(jié)合的氫原子而位于此環(huán)形寡肽環(huán)中肽鍵的氮原子上。以下結(jié)構(gòu)式II是此實(shí)施方式的一個(gè)例子。在另一實(shí)施方式中，結(jié)合性官能團(tuán)可位于寡肽環(huán)中非氨基酸的其它適合的基團(tuán)上。這種基團(tuán)的一個(gè)例子是(X羥基羧酸，其羥基參與脂鍵而非肽鍵。短語(yǔ)"二個(gè)或多個(gè)結(jié)合性官能團(tuán)"包括以下實(shí)施方式當(dāng)環(huán)內(nèi)連接是非共價(jià)鍵時(shí)，。此結(jié)合性官能團(tuán)是位于環(huán)內(nèi)結(jié)合性氨基酸上的寡肽環(huán)的二個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)，它們結(jié)合在一起而形成非共價(jià)連接；。此結(jié)合性官能團(tuán)是位于環(huán)內(nèi)肽鍵氮原子上的寡肽環(huán)的二個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)，它們結(jié)合在一起而形成非共價(jià)連接；。此結(jié)合性官能團(tuán)是位于環(huán)內(nèi)其他合適的基團(tuán)上的寡肽環(huán)的二個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)，它們結(jié)合在一起而形成非共價(jià)連接；或者當(dāng)環(huán)內(nèi)連接是共價(jià)鍵時(shí)，。此結(jié)合性官能團(tuán)是位于環(huán)內(nèi)結(jié)合性氨基酸上的二個(gè)基團(tuán)，它們結(jié)合在一起，直接或通過(guò)接頭如雙功能基團(tuán)形成共價(jià)結(jié)合；。此結(jié)合性官能團(tuán)是位于環(huán)內(nèi)肽鍵氮原子上的二個(gè)基團(tuán)，它們結(jié)合在一起，直接或通過(guò)接頭如雙功能基團(tuán)形成共價(jià)結(jié)合；。此結(jié)合性官能團(tuán)是位于環(huán)內(nèi)其它合適的基團(tuán)上的二個(gè)基團(tuán)，它們結(jié)合在一起，直接或通過(guò)接頭如雙功能基團(tuán)形成共價(jià)結(jié)合。短語(yǔ)"位于……上"指所述結(jié)合基團(tuán)直接結(jié)合，或通過(guò)合適的接頭連接在結(jié)合性氨基酸、氮原子或其它合適的基團(tuán)上。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，結(jié)合性官能團(tuán)之間的一個(gè)或多個(gè)環(huán)內(nèi)連接是非共價(jià)連接。本發(fā)明特別優(yōu)選非共價(jià)的環(huán)內(nèi)連接，因?yàn)檫@樣可使此環(huán)形寡肽的剛性與柔性之間保持正確平衡。此環(huán)形寡肽的剛性足以使肽骨架保持在單一構(gòu)象并確保表位形成性氨基酸的位置足夠緊靠而正確形成能特異性結(jié)合靶配體的表位。此環(huán)形寡肽的柔性也足以讓表位形成性氨基酸的側(cè)鏈充分運(yùn)動(dòng)而適配其要結(jié)合的靶配體的精確結(jié)構(gòu)。因此，包含非共價(jià)環(huán)內(nèi)連接的本發(fā)明環(huán)形寡肽可以提高的穩(wěn)定性和特異性與靶配體相互作用從而產(chǎn)生生物學(xué)應(yīng)答反應(yīng)。所述環(huán)內(nèi)連接優(yōu)選疏水性連接。在一特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，存在二個(gè)氨基酸區(qū)域和二個(gè)親脂性結(jié)合性官能團(tuán)。采用非共價(jià)環(huán)內(nèi)連接，特別是疏水性相互作用具有優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)槿齻€(gè)或更多個(gè)結(jié)合性官能團(tuán)之間的相互作用可形成環(huán)內(nèi)連接。這將允許形成三個(gè)或更多個(gè)氨基酸區(qū)域，這是采用共價(jià)環(huán)內(nèi)連接時(shí)難以實(shí)現(xiàn)的。因此，在本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施方式中，此環(huán)形寡肽可包含三個(gè)或更多個(gè)結(jié)合性官能團(tuán)，它們可形成環(huán)內(nèi)連接而產(chǎn)生三個(gè)或更多個(gè)氨基酸區(qū)域。當(dāng)此環(huán)形寡肽是大分子時(shí)，特別優(yōu)選采用親脂性結(jié)合性官能團(tuán)通過(guò)疏水相互作用而形成非共價(jià)環(huán)內(nèi)連接。定位后能形成一個(gè)或多個(gè)非共價(jià)環(huán)內(nèi)連接的結(jié)合性官能團(tuán)可包括能形成此環(huán)形寡肽環(huán)的一部分的位于適當(dāng)立體化學(xué)結(jié)構(gòu)的任何基團(tuán)上的任何分子。此結(jié)合性官能團(tuán)優(yōu)選位于結(jié)合性氨基酸或其類似物上，例子如下所述，雖然也可采用能插入此環(huán)形寡肽環(huán)的其它基團(tuán)。一般優(yōu)選所述基團(tuán)上結(jié)合性官能團(tuán)通過(guò)肽鍵連接在環(huán)中。在另一實(shí)施方式中，可用其它類型的連接鍵替代一個(gè)或多個(gè)肽鍵。這種連接鍵的例子是脂鍵、醚鍵、硫酯鍵和硫醚鍵。為了在生物液體中限制蛋白酶的攻擊有時(shí)這可能是需要的。所述結(jié)合性氨基酸可包括帶有結(jié)合功能性基團(tuán)的天然氨基酸。所述結(jié)合性氨基酸優(yōu)選脂質(zhì)氨基酸類似物。例如，結(jié)合性氨基酸可包括；半胱氨酸、甘氨酸、賴氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。以半胱氨酸為例，所述結(jié)合性官能團(tuán)可以是通過(guò)巰基功能團(tuán)加到半胱氨酸側(cè)鏈上的脂族基團(tuán)。也可利用該方法將結(jié)合性官能團(tuán)加到賴氨酸、天冬氨酸或谷氨酸側(cè)鏈上。結(jié)合性氨基酸或者可以是其構(gòu)成結(jié)合性官能團(tuán)的側(cè)鏈殘基是單一脂族基團(tuán)的氨基酸。例如，如果結(jié)合性氨基酸以甘氨酸為基礎(chǔ)，則構(gòu)成結(jié)合性官能團(tuán)的此甘氨酸的a氫可被脂族基團(tuán)取代。上述可形成結(jié)合性官能團(tuán)的脂族基團(tuán)優(yōu)選較佳地具有8-20個(gè)碳原子，更優(yōu)選包含10-16個(gè)碳原子，最優(yōu)選10或12個(gè)碳原子的脂族烴鏈，可以是飽和或不飽和直鏈或分支鏈，未取代的、或全部或部分地被取代(例如被鹵原子)。或者，脂族基團(tuán)可由硅烷成分組成。在以下示范性結(jié)構(gòu)I中，所述結(jié)合性氨基酸是甘氨酸，其a氫被C10烴鏈取代。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>在一實(shí)施方式中，所述結(jié)合性官能團(tuán)位于環(huán)內(nèi)肽鍵的氮原子上。通過(guò)用這種結(jié)合性官能團(tuán)，例如上述的脂族基團(tuán)取代肽鍵氮上的氫原子，可產(chǎn)生非共價(jià)環(huán)內(nèi)連接，如疏水性連接?？梢韵扔脦в羞m當(dāng)功能性基團(tuán)，如-SH、-OH或-NH2的亞甲基取代此氫原子，然后用結(jié)合性官能團(tuán)如以上所述的脂族基團(tuán)進(jìn)行衍生化，從而以結(jié)合性官能團(tuán)取代本發(fā)明環(huán)形寡肽肽鍵氮上的氫原子。此實(shí)施方式的一個(gè)方面，肽鍵的氮原子連接了不同氨基酸區(qū)域中的二個(gè)表位形成性氨基酸，本發(fā)明的環(huán)形寡肽具有以下結(jié)構(gòu)式H:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>此式中A、B、C、X、Y和Z代表表位形成性氨基酸；N代表B/Z與C/Y之間肽鍵的氮原子，0)代表與此氮原子連接的結(jié)合性官能團(tuán)如上述脂族基團(tuán)。采用非共價(jià)鍵，特別是疏水性的結(jié)合性官能團(tuán)的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可產(chǎn)生分子內(nèi)相互作用，此時(shí)不同環(huán)形寡肽的疏水性結(jié)合性官能團(tuán)相互連接產(chǎn)生含有沿不同方向取向的多個(gè)重復(fù)表位的二聚體或寡聚體。這種相互作用的程度取決于此環(huán)形寡肽的序列區(qū)域，它決定了氨基酸區(qū)域的相對(duì)親水性。這可通過(guò)對(duì)結(jié)合性官能團(tuán)的明智選擇作進(jìn)一步控制，可改變其手性和體積大小來(lái)精確控制此寡肽暴露的疏水表面面積。其優(yōu)點(diǎn)在于可調(diào)節(jié)與其它內(nèi)部約束環(huán)形寡肽的分子內(nèi)相互作用，或與其它分子如蛋白質(zhì)或環(huán)糊精的相互作用。其優(yōu)點(diǎn)在于能產(chǎn)生包含二個(gè)或多個(gè)本發(fā)明環(huán)形寡肽的小的多聚體結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)能同時(shí)結(jié)合二個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞表面受體，以這種方式使這些受體交聯(lián)從而強(qiáng)烈啟動(dòng)對(duì)細(xì)胞的觸發(fā)效應(yīng)，引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。本發(fā)明環(huán)形寡肽與本發(fā)明其它不相同的環(huán)形寡肽相互作用的優(yōu)點(diǎn)是，由于不同寡肽的不同表位對(duì)該結(jié)構(gòu)的作用可產(chǎn)生具有多種功能的多聚體結(jié)構(gòu)。例如，一種寡肽可包含一個(gè)或多個(gè)表位，結(jié)合受體后引起該多聚體結(jié)構(gòu)內(nèi)化，而內(nèi)化后此多聚體結(jié)構(gòu)中的第二種寡肽可包含與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的組分相互作用的一個(gè)或多個(gè)表位。環(huán)糊精與本發(fā)明環(huán)形寡肽的結(jié)合有助于降低不同寡肽的疏水部分之間相互作用的程度，從而防止形成大的聚集體，因?yàn)檫@些大聚集體中表位的空間位阻導(dǎo)致其活性相對(duì)于單體或寡聚體降低。在蛋白質(zhì)如白蛋白或明膠溶液中，肽中疏水性結(jié)合性官能團(tuán)的親脂部分與具有烷基或?；鶡N鏈親和力的蛋白質(zhì)區(qū)域連接，導(dǎo)致一種或多種本發(fā)明環(huán)形寡肽結(jié)合到蛋白質(zhì)的表面。一種或多種本發(fā)明環(huán)形寡肽與大蛋白質(zhì)表面的這種結(jié)合是重排的一種方式，此環(huán)形寡肽上的多個(gè)表位陣列如此可最大程度地觸發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。在另一實(shí)施方式中，結(jié)合性官能團(tuán)之間的一個(gè)或多個(gè)環(huán)內(nèi)連接是共價(jià)連接。此種實(shí)施方式中，結(jié)合性官能團(tuán)也可位于結(jié)合性氨基酸上。例如，結(jié)合性官能團(tuán)可以是半胱氨酸(結(jié)合性氨基酸)的側(cè)鏈，由于這些側(cè)鏈之間的環(huán)內(nèi)二硫鍵而形成了這種連接。或者，結(jié)合性氨基酸可以是賴氨酸和谷氨酸，它們能通過(guò)其側(cè)鏈末端基團(tuán)(結(jié)合性官能團(tuán))形成肽鍵而共價(jià)連接，或可以是能相互反應(yīng)形成酯鍵的谷氨酸和絲氨酸。也可利用帶有相同官能團(tuán)的這些氨基酸的類似物。在一種實(shí)施方式中，可利用能形成共價(jià)連接的結(jié)合性官能團(tuán)取代環(huán)中肽鍵氮原子上的氫而實(shí)現(xiàn)環(huán)內(nèi)共價(jià)連接。這種基團(tuán)可以是硫醇基，或末端帶有官能團(tuán)可形成共價(jià)連接的其它鏈。用結(jié)合性官能團(tuán)取代本發(fā)明環(huán)形寡肽肽鍵氮原子上的氫包括，先用帶有適當(dāng)官能團(tuán)如-SH、-OH或-NH2的亞甲基取代氫原子，然后再通過(guò)第二步用雙功能試劑連接此官能團(tuán)。這種共價(jià)連接的形成包括，再用帶有適當(dāng)官能團(tuán)的第二個(gè)亞甲基取代(位于此環(huán)形寡肽中適當(dāng)位置處肽鍵氮原子上的)第二個(gè)氫原子，和另外將上述雙功能試劑連接到第二亞甲基的官能團(tuán)而在此環(huán)形寡肽肽鍵的二個(gè)氮原子之間產(chǎn)生共價(jià)連接。根據(jù)摻入此環(huán)形寡肽中的結(jié)合性官能團(tuán)的性質(zhì)，合適的雙功能試劑可以是含有短鏈的那些試劑，所述短鏈的各個(gè)末端具有選自但不限于以下所列的官能團(tuán)羧基、氨基、羥基、巰基、溴、碘、氰基、偶氮基和硼酸基。在本發(fā)明的一特定方面，此環(huán)形寡肽包含二個(gè)氨基酸區(qū)域和二個(gè)結(jié)合性官能團(tuán)，各自位于結(jié)合性氨基酸上，各區(qū)域中三個(gè)表位形成性氨基酸形成一個(gè)表位，此環(huán)形寡肽可以具有以下結(jié)構(gòu)式此式中A、B、C、X、Y和Z代表表位形成性氨基酸；A和X代表D氨基酸，B、C、Y和Z代表L氨基酸；或A和X代表L氨基酸，B、C、Y和Z代表D氨基酸；一個(gè)表位由C-A-B區(qū)形成，一個(gè)表位由Z-X-Y區(qū)形成；每個(gè)S代表一個(gè)帶有結(jié)合性官能團(tuán)的結(jié)合性氨基酸。在本發(fā)明環(huán)形寡肽的一個(gè)實(shí)施例中，Z-X-Y區(qū)和/或C-A-B區(qū)可選自氨基酸序列RFS、RSF、FSR、FRS、SRF、SFR、QLS、QSL、SQL、SLQ、LQS或LSQ，各個(gè)S是含有Cn)直鏈烴側(cè)鏈作為結(jié)合性官能團(tuán)的脂質(zhì)氨基酸。優(yōu)選Z-X-Y區(qū)域是RFS，此區(qū)域中優(yōu)選苯丙氨酸是D-型，絲氨酸是L-型，精氨酸是L-型，各個(gè)脂質(zhì)氨基酸是L-型。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，Z-X-Y區(qū)域和/或C-A-B區(qū)域選自上述各自形成能抑制TNF分泌的表位的序列。因此，這些序列可用于治療TNF是惡化因子的疾病，例如選自癌癥、肥胖、心臟疾病、自身免疫病和炎癥的疾病。可用這些序列來(lái)治療選自類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥和克羅恩病的自身免疫病。在上述結(jié)構(gòu)中，C-A-B區(qū)可與Z-X-Y區(qū)相同或不同。在本發(fā)明的另一方面，此環(huán)形寡肽包含三個(gè)氨基酸區(qū)域，各區(qū)域中由三個(gè)表位形成性氨基酸形成一個(gè)表位，優(yōu)選此寡肽包含三個(gè)結(jié)合性官能團(tuán)。在本發(fā)明的另一方面，此環(huán)形寡肽包含二個(gè)區(qū)域，各區(qū)域中由4個(gè)表位形成性氨基酸形成一個(gè)表位。在本發(fā)明此方面的一種實(shí)施方式中，此環(huán)形寡肽具有以下結(jié)構(gòu)式此式中A、B、C、D、W、X、Y和Z代表表位形成性氨基酸；一個(gè)表位由D-C-A-B區(qū)形成，一個(gè)表位由Z-X-Y-W區(qū)形成；每個(gè)2代表一個(gè)結(jié)合性氨基酸。在本發(fā)明此方面的另一種實(shí)施方式中，此環(huán)形寡肽具有以下結(jié)構(gòu)式此式中A、B、C、D、W、X、Y和Z代表表位形成性氨基酸；一個(gè)表位由D-C-A-B區(qū)形成，一個(gè)表位由Z-X-Y-W區(qū)形成；每個(gè)N代表B-Z與C-Y之間肽鍵的氮原子，每個(gè)0)代表一個(gè)與該氮原子相連的結(jié)合性官能團(tuán)。在本發(fā)明此方面環(huán)形寡肽的一個(gè)實(shí)施例中，Z-X-Y-W區(qū)和/或D-C-A-B區(qū)選自氨基酸序列YEKA、YEAK、YAKE、YAEK、YKAE、YKEA、EYKA、EYAK、EKAY、EKYA、EAKY、EAYK、KAYE、KAEY、KYAE、KYEA、KEAY、KEYA、AKEY、AKYE、AYEK、AYKE、AEYK或AEKY，每個(gè)2是包含長(zhǎng)8-20個(gè)碳原子的烴鏈的直鏈烴側(cè)鏈結(jié)合官能團(tuán)的脂族氨基酸。優(yōu)選的Z-X-Y-W區(qū)是YEKA，D-C-A-B區(qū)是EYAK。在一優(yōu)選實(shí)施方\式中，Z-X-Y-W區(qū)和/或D-C-A-B區(qū)選自上述各自形成能抑制蛋白酶水解活性的表位的序列。因此，這些序列可用于治療蛋白酶活性是惡化因子的疾病，如心血管疾病、循環(huán)血液疾病和HIV。在本發(fā)明此方面的一種實(shí)施方式中，D-C-A-B區(qū)與Z-X-Y-W區(qū)可相同。組合物在另一方面，本發(fā)明提供了包含以上定義的環(huán)形寡肽和藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或輔佐劑的藥物組合物。所述賦形劑選自二乙二醇單乙醚(transcutol)、泊洛沙姆嵌段共聚物、環(huán)糊精、非離子表面活性劑或膽鹽。如果所述賦形劑是非離子表面活性劑，優(yōu)選選自聚乙二醇的酰酯或聚乙二醇的脂族醚。如以上所述，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，可在不同的環(huán)形寡肽之間形成環(huán)內(nèi)連接，此時(shí)不同環(huán)形寡肽的疏水性結(jié)合性官能團(tuán)彼此連接產(chǎn)生含有不同取向的多個(gè)重復(fù)表位的二聚體或寡聚體。可與能幫助疏水分子溶解于水性介質(zhì)的賦形劑共同混合來(lái)調(diào)節(jié)此環(huán)內(nèi)相互反應(yīng)的程度。應(yīng)用在另一方面，本發(fā)明提供以上定義的環(huán)形寡肽或以上定義的組合物用作藥物、預(yù)防或診斷制劑的應(yīng)用。本發(fā)明也提供以上定義的環(huán)形寡肽或以上定義的組合物用于制造治療TNF是惡化因子疾病的藥物的應(yīng)用。這類疾病優(yōu)選選自肥胖、心臟疾病、自身免疫病和炎癥疾病。更優(yōu)選這類疾病是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或克羅恩病?？捎靡陨隙x的環(huán)形寡肽治療TNF是惡化因子的癌癥。這種癌癥可以是良性或惡性的。這種癌癥優(yōu)選是實(shí)體瘤。這種癌癥包括但不限于卵巢癌、乳腺癌、皮膚癌和上皮癌。本發(fā)明也提供以上定義的環(huán)形寡肽或以上定義的組合物用于制造治療蛋白酶活性是惡化因子的疾病，包括心血管疾病、循環(huán)血液疾病和HIV的藥物的應(yīng)用。在本發(fā)明的一特定實(shí)施方式中，此環(huán)形寡肽中的各區(qū)域包含表位形成性氨基酸SRER、SERE、EYKA、YEAK、SFR或RFS，如實(shí)施例7所示，它們能抑制凝血酶的蛋白水解活性。在上述本發(fā)明的一特定實(shí)施方式中，此環(huán)形寡肽在至少一個(gè)區(qū)域中包含絲氨酸、苯丙氨酸和精氨酸作為表位形成性氨基酸。已證明這些寡肽具有抑制巨噬細(xì)胞分泌TNF的活性。在此實(shí)施方式的一優(yōu)選方面，所述結(jié)合性官能團(tuán)是帶有Cu烴側(cè)鏈的脂質(zhì)氨基酸，表位形成性氨基酸選自RFS、FSR或SRF，其中央的氨基酸是D-型，外側(cè)二個(gè)氨基酸為L(zhǎng)-型。此環(huán)形寡肽中的各表位可相同或不同。由于這些寡肽下調(diào)TNF分泌的能力，它們能有效治療諸如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、多發(fā)性硬化癥、肥胖、心臟疾病、自身免疫病和涉及炎癥過(guò)程的其它疾病。由于這些寡肽下調(diào)TNF分泌的能力，它們也能有效治療TNF是惡化因子的癌癥。這種癌癥可以是良性或惡性的。這種癌癥優(yōu)選是實(shí)體瘤。這種癌癥包括但不限于卵巢癌、乳腺癌、皮膚癌和上皮癌。在上述本發(fā)明的一特定實(shí)施方式中，此環(huán)形寡肽在其至少一個(gè)區(qū)域中包含氨基酸A、K、E和Y作為表位形成性氨基酸。己證明這些寡肽具有抑制巨噬細(xì)胞分泌TNF的活性。在此實(shí)施方式的一優(yōu)選方面，所述結(jié)合性官能團(tuán)是帶有C1Q烴側(cè)鏈的脂質(zhì)氨基酸，表位形成性氨基酸選自YEKA或EYAK。此環(huán)形寡肽中的各表位可以相同或不同。一種含有氨基酸A、K、E和Y的無(wú)規(guī)共聚物考派酮(C叩axone)(醋酸格拉替雷(Glatirameracetate)治療多發(fā)性硬化癥的效力通過(guò)該化合物下調(diào)體內(nèi)的TNF分泌的能力而反映出來(lái)(參見(jiàn)WeberMS,StarckM,WagenpfeilS,MeinlE,HohlfeldR和FarinaC."多發(fā)性硬化癥醋酸格拉替雷體內(nèi)外抑制單核細(xì)胞的反應(yīng)性"(^r"/">/eWw)Brain127第1370-8頁(yè)(2004))。就此點(diǎn)而言，也可用實(shí)施例6所檢測(cè)的環(huán)形寡肽環(huán)化(-A-K-S-Y-E-K-A-S-E-Y)來(lái)治療多發(fā)性硬化癥，因?yàn)樗蟹请S機(jī)構(gòu)型的相同氨基酸，對(duì)巨噬細(xì)胞分泌TNF具有相同作用。也可用本發(fā)明環(huán)形寡肽中A、K、E和Y氨基酸的其它排列序列來(lái)治療多發(fā)性硬化癥。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，與常規(guī)生物學(xué)受體相比，用本發(fā)明的環(huán)形寡肽可獲得特異性強(qiáng)結(jié)合相互作用。此環(huán)形寡肽較小，優(yōu)選含有不超過(guò)6個(gè)或8個(gè)氨基酸。因此，制備的本發(fā)明環(huán)形寡肽的免疫原性與其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)相比要小得多。根據(jù)本發(fā)明的一方面內(nèi)容，將本發(fā)明的環(huán)形寡肽配制成不僅在體外能與配體相互作用，而且此組合物也可體內(nèi)應(yīng)用?？赏ㄟ^(guò)與待治療疾病相適應(yīng)的任何途徑，包括但不限于口服、經(jīng)鼻、經(jīng)直腸、經(jīng)口頰、舌下、經(jīng)肺部、陰道、局部、經(jīng)眼睛、經(jīng)耳、皮下、皮內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、鞘內(nèi)、肌內(nèi)、腦內(nèi)、顱內(nèi)和靜脈內(nèi)給藥途徑，給予本發(fā)明的環(huán)形寡肽?？梢杂坞x水溶液形式，或與本發(fā)明組合物中的藥物賦形劑聯(lián)合給予此環(huán)形寡肽。也可將此環(huán)形寡肽或組合物與其它具有協(xié)同作用，或能增強(qiáng)其活性的活性分子共同混合后，用作治療藥物。當(dāng)通過(guò)某種途徑，如口服或經(jīng)直腸給藥時(shí)，可將此寡肽或組合物配制成固體、半固體或液體，充填到膠囊中，或作為固體壓制成片，或壓制成丸。此時(shí)，如果最終的給藥途徑是口服，所述膠囊、藥片或藥丸可以有腸溶包衣。凝膠、糊劑或油劑特別適合局部應(yīng)用，而此寡肽的經(jīng)肺部或鼻給藥則可采用氣溶膠形式。方法另一方面，本發(fā)明提供制備以上定義的環(huán)形寡肽的方法，包括i)選擇表位形成性氨基酸；ii)制備摻入了此表位形成性氨基酸的環(huán)形寡肽。鑒定表位的方法是已知的。在傳統(tǒng)的組合化學(xué)方法中，必須合成數(shù)百種不同基團(tuán)(如氨基酸)以不同順序組成的可能組合并檢測(cè)各自的效率，才能鑒定出結(jié)合某特異性受體的最有希望的序列。此種方法耗時(shí)、費(fèi)用高、受所釆用的將不同成分連接在一起的化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)的限制。如上所述，表位形成性氨基酸可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多不同的方法進(jìn)行選擇。WO01/01140提供了一種方法來(lái)測(cè)定形成能與所需配體相互作用的表位的分子，該方法采用由非共價(jià)鍵裝配成的多個(gè)不同偶聯(lián)物。如WO01/01140第2-5頁(yè)所述，各偶聯(lián)物含有頭基和尾基。偶聯(lián)物的尾基形成疏水性聚集體，各偶聯(lián)物在裝配物中彼此之間能自由運(yùn)動(dòng)，因此在存在配體時(shí)，至少二個(gè)頭基(相同或不同)通過(guò)恰當(dāng)定位形成能與配體相互作用的表位，其相互作用強(qiáng)度高于頭基各自單獨(dú)的情況。頭基通常親水，尾基通常疏水，例如由烴鏈、親鹵素的氟碳鏈結(jié)構(gòu)或硅烷基組成的親脂性基團(tuán)。構(gòu)建含頭基和尾基的偶聯(lián)物，其尾基可結(jié)合形成疏水性聚集體，一般形成超分子裝配物，如膠束、片層結(jié)構(gòu)、脂質(zhì)體或其它脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，在水相中此偶聯(lián)物的取向使得各頭基緊密靠近。因?yàn)樵撆悸?lián)物在裝配物中可運(yùn)動(dòng)，故其頭基在裝配物中能采取許多不同的位置。因此通常不相同的頭基在裝配物中可自由運(yùn)動(dòng)，令人驚奇的是，它們能協(xié)同作用誘導(dǎo)生物學(xué)結(jié)果，而這種結(jié)果原先是各頭基自己不能誘導(dǎo)的。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方式中，采用WO01/01140公開(kāi)的方法來(lái)選擇表位形成性氨基酸，此方法包括(a)選擇一組偶聯(lián)物，各偶聯(lián)物包含頭基和尾基，以及頭基陣列，其中每個(gè)頭基包含氨基酸；(b)在它們形成非共價(jià)連接，其中尾基疏水性聚集而此偶聯(lián)物是可移動(dòng)的；(C)檢測(cè)非共價(jià)連接與耙配體之間充分的相互作用；(d)任選用含有修飾的頭基陣列的一組偶聯(lián)物重復(fù)步驟(a)-(c);和(e)—旦在步驟(c)中發(fā)現(xiàn)充分的相互作用，選擇組成該組偶聯(lián)物頭基的氨基酸作為步驟(a)的表位形成性氨基酸。檢測(cè)"相互作用是否充分"試驗(yàn)的例子包括結(jié)合試驗(yàn)，例如利用ELISA原理檢測(cè)抗體與抗原之間結(jié)合的那些試驗(yàn)。其它適合的體外試驗(yàn)包括環(huán)境敏感膜結(jié)合的熒光探針的熒光變化，沉淀反應(yīng)，酶活性的增強(qiáng)或抑制試驗(yàn)等等。也可能適合的試驗(yàn)有依賴于測(cè)試物能否改變體外培養(yǎng)細(xì)胞行為的試驗(yàn)，例如細(xì)胞死亡、細(xì)胞增殖、凋亡、抑制或激發(fā)細(xì)胞間接觸、分泌細(xì)胞因子或其它可溶性產(chǎn)物、合成特異性m-RNA、胞內(nèi)泡囊轉(zhuǎn)運(yùn)、改變細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗(yàn)等等。也可進(jìn)行動(dòng)物或人體的體內(nèi)試驗(yàn)，例如在此超分子裝配物中摻入放射性標(biāo)記，然后經(jīng)各種途徑給藥后調(diào)査其后續(xù)分布。根據(jù)此法，用組合方法制備一系列不同的超分子裝配質(zhì)(或"探針")，各自含有選自預(yù)先合成的偶聯(lián)物庫(kù)的不同組合?？筛鶕?jù)靶配體的已知性質(zhì)選擇合適的偶聯(lián)物，可簡(jiǎn)單地利用非常廣泛范圍的頭基來(lái)提高二個(gè)或多個(gè)頭基形成此種配體表位的幾率。以此方式，隨后檢測(cè)上述探針與配體之間的相互作用是否充分，可通過(guò)進(jìn)一步增加頭基，去除某些頭基，或這兩種方式進(jìn)行修飾，再次檢測(cè)合成的探針的相互作用是否充分，以發(fā)現(xiàn)最有希望的偶聯(lián)物組合。最后，鑒定和選出最有希望的頭基組合用作表位形成性氨基酸。實(shí)施例實(shí)雄J,翠形微微應(yīng)多薪7撒^"敏鍾系分泌，艦量反座1.用Merrifield樹(shù)脂基技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法合成具有結(jié)構(gòu)式環(huán)形(-DF-S-S-R-DF-S-S-R-)的環(huán)形八肽，然后在溶液相中環(huán)化。用蒸餾水制備此純化肽的溶液，濃度lmg/ml。R、F和S代表表位形成性氨基酸，S代表位于結(jié)合性氨基酸上的結(jié)合性官能團(tuán)，其中結(jié)合性氨基酸是L-a氨基羧酸，結(jié)合性官能團(tuán)是含10個(gè)碳原子的脂族直鏈的側(cè)鏈殘基。所有氨基酸都是L-型，除非另有說(shuō)明。所有氨基酸以肽鍵相連。2.在24孔集落板的所有孔中接種J774A.1細(xì)胞(一種巨噬細(xì)胞系)，接種密度每孔5x1()S個(gè)細(xì)胞/ml(每孔lmlRPMI1640培養(yǎng)液)，在37°C和5%C02/空氣中培養(yǎng)過(guò)夜。3.第二天將步驟1的八肽溶液加入到步驟2含有細(xì)胞的15個(gè)孔中，最終濃度50、25、12.5、6.25或3.125ug/ml各三孔。其余孔留置不作處理。37。C再培養(yǎng)此平板4小時(shí)。4.在接受此八肽溶液的孔及未接受肽溶液的三個(gè)孔加入脂多糖(得自大腸桿菌株0111B4)。脂多糖的終濃度為0.625ug/ml。5.將平板培育過(guò)夜，次日用商品化ELISA試劑盒檢測(cè)上清液的TNF。下表顯示獲得的結(jié)果，表明此環(huán)形寡肽抑制LPS刺激的TNF分泌的活性與劑量相關(guān)。肽濃度(ug/ml)TNF濃度(pg/ml)標(biāo)準(zhǔn)差01780.09136.493.1251494.53127.836.251346.2045.8412.51037.3190.0125.0621.7514.5350.0613.7015.46實(shí),伊/2,'#不廚翁合絲,激舒游萃形寡箭漱激霍遼毒#5(^7^^虔微g敏鍾系分泌，微榮1.制備具有以下結(jié)構(gòu)式的環(huán)形寡肽-環(huán)形(-DF-R-i:KrS-DF-R-SKrS-)環(huán)形(-DF-S-i;K)-R-DF-S-i:KrR-)環(huán)形(-DF-R-S4-S-DF-R-i:4-S-)環(huán)形(-DF-S-S4-R-DF-S-S4-R-)此式中，S、F和R代表表位形成性氨基酸，S代表位于結(jié)合性氨基酸上的結(jié)合性官能團(tuán)，Sn)代表外消旋結(jié)合性氨基酸，它是一種氨基羧酸，結(jié)合性官能團(tuán)是由無(wú)分支的-Cn)H2i構(gòu)成的側(cè)鏈殘基，S4代表正亮氨酸，式中的結(jié)合性官能團(tuán)是4碳側(cè)鏈。用二乙二醇單乙醚(transcutol)將這些環(huán)形寡肽配成濃度5mg/ml的溶液，然后用蒸餾水稀釋至濃度lmg/ml。2.在24孔集落板的所有孔中接種J774A.1細(xì)胞(一種巨噬細(xì)胞系)，接種密度每孔3x105個(gè)細(xì)胞/ml(每孔lmlRPMI1640培養(yǎng)液)，在37。C和5%(:02/空氣下培養(yǎng)過(guò)夜。3.第二天將步驟1的八肽溶液加入到步驟2含有細(xì)胞的12個(gè)孔中，最終濃度12.5ug/ml各三孔。其余孔留置不作處理。37°C再培養(yǎng)此平板4小時(shí)。4.在接受此八肽溶液的孔及未接受肽溶液的三個(gè)孔中加入霍亂毒素B(CTB)片段?；魜y毒素B(CTB)片段的濃度為10ug/ml。5.將平板培育過(guò)夜，次日用商品化ELISA試劑盒檢測(cè)上清液的TNF。下表顯示獲得的結(jié)果，表明存在無(wú)分支-C,oHu組成的長(zhǎng)鏈烴側(cè)鏈作為結(jié)合性官能團(tuán)，可導(dǎo)致此環(huán)形寡肽產(chǎn)生抑制霍亂毒素B(CTB)片段剌激TNF的活性。而含有4個(gè)碳鏈長(zhǎng)的結(jié)合性官能團(tuán)的環(huán)形寡肽不具有任何抑制活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>丄.,不廚表位形成性賓基廢浙翁合性賓基麼立沐眾學(xué)稱麥游柳微鄉(xiāng)應(yīng)多難尸喊衡敏欲贏分泌，微菜1.制備具有以下結(jié)構(gòu)式的環(huán)形八肽壞形(-df-s-i;l-r-df-s-Sl-r-)壞形(-DF-S-2l-R-DF-S-Sd-R-)壞形(-df-s-2d-r-df-s-i:d-r-)壞形(-DF-R-Sl-S-DF-R-Sl-S-)壞形(-df-r-Sl-s-df-r-i:d-s-)壞形(-DF-R-Sd-S-DF-R-Sd-S-)此式中F、S和R是表位形成性氨基酸，SL代表位結(jié)合性氨基酸，它是一種L-ot氨基羧酸，其中結(jié)合性官能團(tuán)是由無(wú)分支-(:1()1121構(gòu)成的側(cè)鏈殘基；sd代表結(jié)合性氨基酸，它是d-(x氨基羧酸，其中結(jié)合性官能團(tuán)是由無(wú)分支-Cu)H2i構(gòu)成的側(cè)鏈殘基。用蒸餾水將這些環(huán)形寡肽配成濃度lmg/ml。2.在24孔集落板的所有孔中接種J774A.1細(xì)胞(一種巨噬細(xì)胞系)，接種密度每孔3x1()S個(gè)細(xì)胞/ml(每孔lmlRPMI1640培養(yǎng)液)，在37。C和5%。02/空氣下培養(yǎng)過(guò)夜。3.第二天將步驟1的八肽溶液加入到步驟2含有細(xì)胞的18個(gè)孔中，最終濃度50ug/ml各三孔。其余孔留置不作處理。37。C再培養(yǎng)此平板4小時(shí)。4.在接受此八肽溶液的孔及未接受肽溶液的三個(gè)孔中加入脂多糖(得自大腸桿菌株0111B4)。脂多糖的終濃度為1.25ug/ml。5.將平板培育過(guò)夜，次日用商品化ELISA試劑盒檢測(cè)上清液的TNF。下表顯示獲得的結(jié)果，表明含有順序R-DF-S氨基酸的環(huán)形寡肽抑制LPS刺激TNF分泌的活性很高，要求至少一個(gè)結(jié)合性氨基酸是L-a氨基羧酸、其結(jié)合性官能團(tuán)是無(wú)分支"CH)H^構(gòu)成的側(cè)鏈殘基，另一個(gè)結(jié)合性氨基酸是L-型或D-型的相同的氨基羧酸。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>環(huán)糊精與本發(fā)明環(huán)形寡肽的結(jié)合有助于降低不同寡肽疏水部分之間相互作用的水平，從而防止形成大的聚集體，由于這些大聚集體中的表位存在空間位阻，導(dǎo)致這種聚集體的活性比單體或寡聚體低。實(shí)娜心微濃度范鵬柳基/國(guó)柳柳含存表泣形成絲粛基廢/-z^-S形成游表位效^效束翠形寡嚴(yán),^劍廢多薪"/^腐激反敏潘蘼系分泌，游艘務(wù)關(guān)效榮1.用二乙二醇單乙醚(transcutol)將具有結(jié)構(gòu)式壞化(-dF-S-I:-R-dF-S-S-R-)的環(huán)形八肽配成濃度5mg/ml的溶液，式中S代表的結(jié)合性氨基酸為L(zhǎng)-a氨基羧酸，位于結(jié)合性氨基酸上的結(jié)合性官能團(tuán)是含10個(gè)碳原子的脂族直鏈構(gòu)成的側(cè)鏈殘基。2.將6個(gè)獨(dú)立等份的200ul步驟1的溶液轉(zhuǎn)移到新的8ml試管中，緩慢振蕩與用蒸餾水配制的濃度分別為50、25、12.5、6.25、3.125或1.5625mg/ml的800ul羥丙基P-環(huán)糊精混合。2.在24孔集落板的所有孔中接種J774A.1細(xì)胞(一種巨噬細(xì)胞系)，接種密度每孔5x105個(gè)細(xì)胞/ml(每孔lmlRPMI1640培養(yǎng)液)，在37。C和5%(:02/空氣下培養(yǎng)過(guò)夜。3.第二天將步驟1的各溶液以適當(dāng)體積加入到步驟2含有細(xì)胞的孔中，最終濃度8、4或2ug/ml各三孔。其余孔留置不作處理。37'C再培養(yǎng)此平板4小時(shí)。4.在接受此八肽溶液的孔及未接受肽溶液的三個(gè)孔中加入脂多糖(得自大腸桿菌株0111B4)。脂多糖的終濃度為0.625ug/ml。5.將平板培育過(guò)夜，次日用商品化ELISA試劑盒檢測(cè)上清液的TNF。下表顯示獲得的結(jié)果，表明此八肽抑制LPS刺激TNF分泌的活性與劑量相關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)差肽濃度(ug/ml)環(huán)糊精與肽的重量比TNF濃度(pg/ml)02222224444448888884020102.51.254020102.51.254020102.51.252519.32450.22223.92278.32177.22314.22161.81646.51488.11474.81477.51538.71599.91276.91298.41218.71140.61105.71130.964.461.237.489.4110.9101.894.798.416.680.633.280.4106.4106.517.320.634.535.971.8結(jié)果顯示，含環(huán)糊精的八肽制劑顯著抑制了TNF分泌，組織培養(yǎng)孔中TNF的濃度下降至2ug/ml，廣泛濃度范圍40:1wt:wt的環(huán)糊精實(shí)現(xiàn)了這種抑制。實(shí)蘑萍5..帝趕尿基/-單撒潸衝激游f,表泣形成絲賓基虔i^i^形成效表泣效/^效jr翠形寡嚴(yán)，,劍蘑多薪fz/^腐撒犬腐分泌2wf效效榮1.如實(shí)施例4所述，用二乙二醇單乙醚和羥丙基(3-環(huán)糊精將具有結(jié)構(gòu)式環(huán)化(-DF-S-S-R-oF-S-i:-R-)的環(huán)形八肽配成溶液，此式中i:代表的結(jié)合性氨基酸為L(zhǎng)-a氨基羧酸，位于此結(jié)合性氨基酸上的結(jié)合性官能團(tuán)為含10個(gè)碳原子的脂族直鏈構(gòu)成的側(cè)鏈殘基。肽溶液濃度為lmg/ml，環(huán)糊精的終濃度為40mg/ml。2.給體重250克的大鼠i.p注射lml肽溶液(每只大鼠lmg肽)。第二組大鼠接受lml不含肽的二乙二醇單乙醚/環(huán)糊精運(yùn)載體。一小時(shí)后，再給大鼠注射lmg脂多糖(馬流產(chǎn)沙門菌)。3.150分鐘后，取血液樣品用ELISA檢測(cè)二組的TNF水平。下表顯示的結(jié)果表明在對(duì)刺激的應(yīng)答反應(yīng)中此肽能抑制TNF產(chǎn)生，使之下降75%以上。運(yùn)載體肽TNF(pg/ml)107172370SD66351831每組動(dòng)物數(shù)目35,應(yīng)銀6:考派膘r朦廢潛^夢(mèng)蜀效界形類欽欽,劍rA^分^1.制備具有以下結(jié)構(gòu)式的環(huán)形寡肽環(huán)形(-A-K-S-Y-E-K-A-2-E-Y國(guó))環(huán)形(-A-K-S-E-Y-K-A-2-Y隱E-)所有氨基酸都是L-型，除非另有說(shuō)明。所有氨基酸以肽鍵相連。A、K、Y和E代表表位形成性氨基酸，S代表位于結(jié)合性氨基酸上的結(jié)合性官能團(tuán)，所述結(jié)合性氨基酸是L-a氨基羧酸，結(jié)合性官能團(tuán)是含10個(gè)碳原子的脂族直鏈構(gòu)成的側(cè)鏈殘基。用六氟-異丙醇(HFIP)將此環(huán)形寡肽配制成濃度10mg/ml的溶液，然后與等體積含濃度50mg/mlP-羥丙基環(huán)糊精的HFIP溶液混合。在氮?dú)庀麓蹈纱擞袡C(jī)溶液，將肽/環(huán)糊精復(fù)合物重溶于蒸餾水，得到最終濃度lmg/ml的環(huán)形寡肽液。2.在24孔集落板的所有孔中接種J774A.1細(xì)胞(一種巨噬細(xì)胞系)，接種密度每孔3x1()5個(gè)細(xì)胞/ml(每孔lmlRPMI1640培養(yǎng)液)，在37。C和5%C02/空氣下培養(yǎng)過(guò)夜。3.第二天將步驟1的八肽溶液加入到步驟2含有細(xì)胞的孔中，最終濃度12.5ug/ml各三孔。也制備了只含62.5ug/ml環(huán)糊精的其它孔。其余孔留置不作處理。37'C再培養(yǎng)此平板4小時(shí)。4.接受此寡肽溶液的孔及未接受肽溶液的三孔中加入脂多糖(得自大腸桿菌株0111B4)。脂多糖的終濃度為0.1ug/ml。5.將平板培育過(guò)夜，次日用商品化ELISA試劑盒檢測(cè)上清液的TNF。肽(12.5ug/ml)LPSTNF濃度(pg/ml)標(biāo)準(zhǔn)差環(huán)形(-A-K-2-Y-E-K-A-S-E-Y)+486.933.5環(huán)形(-A-K國(guó)2-E隱Y-K-A陽(yáng)S陽(yáng)Y-E)+928.872.7只加環(huán)糊精+622.322.9培養(yǎng)液+LPS+637.626.0培養(yǎng)液對(duì)照-50.89.0此表顯示獲得的結(jié)果，表明一種而非二種測(cè)試的環(huán)形寡肽具有抑制LPS刺激TNF分泌的作用。因此各區(qū)域中的氨基酸序列影響了此寡肽的生物學(xué)活性。環(huán)形(-A-K-S-Y-E-K-A-S-E-Y)可用于治療多發(fā)性硬化癥，因?yàn)樗信c考派酮相同的氨基酸(除非隨機(jī)構(gòu)型外)并顯示對(duì)巨噬細(xì)胞分泌TNF有相同作用。,應(yīng)激7;銀激凝^Mt游話絲1.如以上所述合成具有以下結(jié)構(gòu)式的環(huán)形寡肽，用實(shí)施例6的方法以漢格斯(Hanks)平衡鹽溶液制備其與環(huán)糊精的復(fù)合液，濃度lmg/ml。(i)環(huán)形(-R-E-S—S-R-E-R-S-S-E-)(ii)環(huán)形(-A-K-2-E-Y-K-A-S-Y-E-)(iii)環(huán)形(-dF-R-C-S-dF-R隱C-S-)(iv)環(huán)形(-dF-S-C-R-dF-S-C-R-)所有氨基酸都是L-型，除非另有說(shuō)明。所有氨基酸以肽鍵相連。式中R、E、S、Y、K和A代表表位形成性氨基酸，S代表位于結(jié)合性氨30基酸上的結(jié)合性官能團(tuán)，所述結(jié)合性氨基酸是L-a氨基羧酸，結(jié)合性官能團(tuán)是含10個(gè)碳原子的脂族直鏈的側(cè)鏈殘基，C代表半胱氨酸，式中各環(huán)的半胱氨酸被氧化形成內(nèi)連接橋。2.將20ul凝血酶溶液(0.01mg/ml)分配到394-孔微滴板的孔中，與60ul環(huán)形寡肽溶液混合。3.各孔加入20ul底物boc-P-苯甲基-Asp-Pro-Arg-7-酰氨基-4-鹽酸香豆素(0.01mg/ml)，檢測(cè)底物產(chǎn)生的時(shí)間過(guò)程。4.從下表顯示的結(jié)果可以知道，所研究的環(huán)形寡肽抑制凝血酶的蛋白水解活性作用不同，這些活性不同與環(huán)所包括的氨基酸性質(zhì)與組合有關(guān)。可以明白的是，通過(guò)正確選擇氨基酸，根據(jù)受約束的環(huán)形寡肽模板可產(chǎn)生剛性足夠?qū)γ富钚园l(fā)揮顯著作用的結(jié)構(gòu)。因此，可采用本發(fā)明具有抑制凝血酶蛋白水解活性的環(huán)形寡肽來(lái)治療蛋白酶活性是惡化因子的疾病，包括心血管疾病、循環(huán)血液疾病和HIV。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>從此表可見(jiàn)，根據(jù)各區(qū)域中的氨基酸順序，某些環(huán)形寡肽具有比其它寡肽更強(qiáng)的活性。實(shí)應(yīng)伊/"診二個(gè)不廚表泣效萃形寡教滯劍7WF分泌1.制備具有以下結(jié)構(gòu)式的二個(gè)環(huán)形寡肽(i)環(huán)形(-dF誦S誦2-Q-dL-S國(guó)2-R-)(ii)環(huán)形(誦dF-S-i:-L-dQ-S-S-R)所有氨基酸都是L-型，除非另有說(shuō)明。所有氨基酸以肽鍵相連。式中Q、L、S、R和F代表表位形成性氨基酸，2代表位于結(jié)合性氨基酸上的結(jié)合性官能團(tuán)，所述結(jié)合性氨基酸是L-ct氨基羧酸，結(jié)合性官能團(tuán)是含10個(gè)碳原子的脂族直鏈構(gòu)成的側(cè)鏈殘基。如實(shí)施例4所述，制備這些環(huán)形寡肽的二乙二醇單乙醚/環(huán)糊精溶液，肽的最終濃度為lmg/ml，環(huán)糊精為20mg/ml。2.在三塊24孔集落板的所有孔中接種J774A.1細(xì)胞(一種巨噬細(xì)胞系)，接種密度每孔3x105個(gè)細(xì)胞/ml(每孔lmlRPMI1640培養(yǎng)液)，在37'C和5%<:02/空氣下培養(yǎng)過(guò)夜。3.第二天將步驟1的肽溶液加入到步驟2含有細(xì)胞的孔中，環(huán)形寡肽最終濃度為50、25、12.5、6.25或3.125ug/ml各三孔。也制備含環(huán)糊精1、0.5、0.25、0.125和0.0625mg/ml的額外孔。其余孔留置不作處理。37。C再培養(yǎng)此平板4小時(shí)。4.在接受此八肽溶液的孔及未接受肽溶液的三個(gè)孔加入脂多糖(得自大腸桿菌株0111B4)。脂多糖的終濃度為0.1ug/ml。5.將平板培育過(guò)夜，次日用商品化ELISA試劑盒檢測(cè)上清液的TNF。下表顯示獲得的結(jié)果，表明含二個(gè)不同表位，一個(gè)由F、R和S氨基酸組成的環(huán)形寡肽能以劑量依賴形式下調(diào)J774細(xì)胞的TNF分泌。TNF濃度(pg/ml)肽濃度培養(yǎng)液(i)(ii)(ug/ml)環(huán)糊精對(duì)照027+32856*2856*2856*3.1252856*2648±432856*6.252460±832325±672856*12.51595±641748±202856*251341±501437±852376±2150843±421081±1422225±51*讀數(shù)高于檢測(cè)最大限權(quán)利要求1.一種內(nèi)部受約束的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述寡肽包含能特異性結(jié)合靶配體的由至少6個(gè)氨基酸組成的環(huán)，其中所述環(huán)包含多個(gè)氨基酸區(qū)域，每個(gè)區(qū)域含有至少二個(gè)表位形成性氨基酸，以及二個(gè)或多個(gè)結(jié)合性官能團(tuán)，所述結(jié)合性官能團(tuán)的定位使它們形成一個(gè)或多個(gè)環(huán)內(nèi)連接；所述環(huán)形寡肽由此被約束成單一構(gòu)象，使得各區(qū)域中的表位形成性氨基酸形成表位，各表位能特異性結(jié)合靶配體。2.如權(quán)利要求1所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述寡肽中的各個(gè)區(qū)域包含3個(gè)表位形成性氨基酸，此三個(gè)表位形成性氨基酸具有交替的立體化學(xué)構(gòu)型。3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述氨基酸是天然來(lái)源的氨基酸、氨基酸類似物或其D-型氨基酸。4.如以上任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述結(jié)合性官能團(tuán)之間的一個(gè)或多個(gè)環(huán)內(nèi)連接是共價(jià)連接。5.如權(quán)利要求4所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述結(jié)合性官能團(tuán)是通過(guò)二硫橋連接的半胱氨酸提供的。6.如權(quán)利要求1-3所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述結(jié)合性官能團(tuán)之間的一個(gè)或多個(gè)環(huán)內(nèi)連接是非共價(jià)連接。7.如權(quán)利要求6所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述結(jié)合性官能團(tuán)之間的一個(gè)或多個(gè)環(huán)內(nèi)連接是疏水性連接。8.如以上任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，至少一個(gè)結(jié)合性官能團(tuán)位于各區(qū)域之間。9.如權(quán)利要求8所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，毗連結(jié)合性官能團(tuán)的各個(gè)表位形成性氨基酸具有與該毗連的結(jié)合性官能團(tuán)相同的立體化學(xué)構(gòu)型。10.如以上任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述表位相同。11.如以上任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述結(jié)合性官能團(tuán)位于結(jié)合性氨基酸上。12.如權(quán)利要求6-11任何一項(xiàng)所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述結(jié)合性氨基酸是脂質(zhì)氨基酸。13.如權(quán)利要求12所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，位于所述脂質(zhì)氨基酸上的結(jié)合性官能團(tuán)中至少一個(gè)是Cs-C20直鏈烴側(cè)鏈。14.如權(quán)利要求12所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述直鏈烴側(cè)鏈?zhǔn)荂w-d6直鏈烴側(cè)鏈。15.如以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的環(huán)形寡肽，其具有以下結(jié)構(gòu)式式中A、B、C、X、Y和Z代表表位形成性氨基酸；A和X代表D氨基酸而B(niǎo)、C、Y和Z代表L氨基酸，或A和X代表L氨基酸而B(niǎo)、C、Y和Z代表D氨基酸；一個(gè)表位由C-A-B區(qū)形成，一個(gè)表位由Z-X-Y區(qū)形成；各2代表結(jié)合性氨基酸。16.如權(quán)利要求15所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述Z-X-Y區(qū)和/或C-A-B區(qū)選自氨基酸序列RFS、RSF、FSR、FRS、SRF、SFR、QLS、QSL、SQL、SLQ、LQS或LSQ，各個(gè)2是具有含有長(zhǎng)度8-20個(gè)碳原子烴鏈的直鏈烴側(cè)鏈結(jié)合性官能團(tuán)的脂質(zhì)氨基酸。17.如權(quán)利要求16所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述Z-X-Y區(qū)和/或C-A-B區(qū)形成能抑制TNF分泌的表位。18.如權(quán)利要求1-11任何一項(xiàng)所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述結(jié)合性官能團(tuán)位于所述環(huán)形寡肽內(nèi)的肽鍵的氮原子上。19.如權(quán)利要求18所述的環(huán)形寡肽，其具有以下結(jié)構(gòu)式式中A、B、C、X、Y和Z代表表位形成性氨基酸；一個(gè)表位由C-A-B區(qū)形成，一個(gè)表位由Z-X-Y區(qū)形成；各個(gè)N代表B-Z和C-Y之間肽鍵的氮原子，每個(gè)O)代表通過(guò)所述氮原子連接的結(jié)合性官能團(tuán)。20.如權(quán)利要求19所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述Z-X-Y區(qū)和/或C-A-B區(qū)選自氨基酸序列RFS、RSF、FSR、FRS、SRF、SFR、QLS、QSL、SQL、SLQ、LQS或LSQ，每個(gè)O代表長(zhǎng)8-20個(gè)碳原子的脂族烴鏈。21.如權(quán)利要求16或權(quán)利要求20所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述Z-X-Y區(qū)是RFS。22.如權(quán)利要求20或權(quán)利要求21所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述Z-X-Y區(qū)和C-A-B區(qū)各自形成能抑制TNF分泌的表位。23.如權(quán)利要求21或權(quán)利要求22所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，苯丙氨酸是D型，絲氨酸是L型，精氨酸是L構(gòu)型，各脂族氨基酸是L型。24.如權(quán)利要求15-17或19-23任何一項(xiàng)所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述C-A-B區(qū)與Z-X-Y區(qū)相同。25.如以上任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述環(huán)形寡肽包含二個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域中的表位由3個(gè)表位形成性氨基酸形成。26.如權(quán)利要求25所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述寡肽包含二個(gè)結(jié)合性官能團(tuán)。27.如權(quán)利要求l-14或18任何一項(xiàng)所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述環(huán)形寡肽包含三個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域中的表位由3個(gè)表位形成性氨基酸形成。28.如權(quán)利要求27所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述寡肽包含三個(gè)結(jié)合性官能團(tuán)。29.如權(quán)利要求1、3-14或18任何一項(xiàng)所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述寡肽包含二個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域中的表位由4個(gè)表位形成性氨基酸形成。30.如權(quán)利要求29所述的環(huán)形寡肽，其具有以下結(jié)構(gòu)式DW式中A、B、C、D、W、X、Y和Z代表表位形成性氨基酸；一個(gè)表位由D-C-A-B區(qū)形成，一個(gè)表位由Z-X-Y-W區(qū)形成；各個(gè)2代表結(jié)合性氨基酸。31.如權(quán)利要求30所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述Z-X-Y-W區(qū)和/或D-C-A-B區(qū)選自氨基酸序列YEKA、YEAK、YAKE、YAEK、YKAE、YKEA、EYKA、EYAK、EKAY、EKYA、EAKY、EAYK、KAYE、KAEY、KYAE、KYEA、KEAY、KEYA、AKEY、AKYE、AYEK、AYKE、AEYK或AEKY，各個(gè)S是具有包含長(zhǎng)8-20個(gè)碳原子烴鏈的直鏈烴側(cè)鏈的脂質(zhì)氨基酸。32.如權(quán)利要求31所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述Z-X-Y-W區(qū)是YEKA，所述D-C-A-B區(qū)是EYAK。33.如權(quán)利要求31或權(quán)利要求32所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述Z-X-Y-W區(qū)和/或D-C-A-B區(qū)形成能抑制蛋白酶水解活性的表位。34.如權(quán)利要求29所述的環(huán)形寡肽，其具有以下結(jié)構(gòu)式恭DW式中A、B、C、D、W、X、Y和Z代表表位形成性氨基酸；一個(gè)表位由D-C-A-B區(qū)形成，一個(gè)表位由Z-X-Y-W區(qū)形成；每個(gè)N代表B-Z與C-Y之間肽鍵的氮原子，每個(gè)O代表通過(guò)所述氮原子連接的結(jié)合性官能團(tuán)。35.如權(quán)利要求34所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述Z-X-Y-W區(qū)和/或D-C-A-B區(qū)選自氨基酸序列YEKA、YEAK、YAKE、YAEK、YKAE、YKEA、EYKA、EYAK、EKAY、EKYA、EAKY、EAYK、KAYE、KAEY、KYAE、KYEA、KEAY、KEYA、AKEY、AKYE、AYEK、AYKE、AEYK或AEKY，每個(gè)O代表長(zhǎng)8-20個(gè)碳原子的脂族烴鏈。36.如權(quán)利要求35所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述Z-X-Y-W區(qū)是YEKA，所述D-C-A誦B區(qū)是EYAK。37.如權(quán)利要求35或權(quán)利要求36所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述Z-X-Y-W區(qū)和D-C-A-B區(qū)各自形成能抑制蛋白酶水解活性的表位。38.如權(quán)利要求30-37任何一項(xiàng)所述的環(huán)形寡肽，其特征在于，所述D-C-A-B區(qū)與Z-X-Y-W區(qū)相同。39.如以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的環(huán)形寡肽作為藥物、預(yù)防或診斷制劑的應(yīng)用。40.如權(quán)利要求17或權(quán)利要求22所述的環(huán)形寡肽在制造用于治療TNF是惡化因子的疾病的藥物中的應(yīng)用。41.如權(quán)利要求40所述的應(yīng)用，其特征在于，所述疾病選自癌癥、肥胖、心臟疾病、自身免疫病和炎癥疾病。42.如權(quán)利要求41所述的應(yīng)用，其特征在于，所述疾病是選自類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥或克羅恩病的自身免疫病。43.如權(quán)利要求33或權(quán)利要求37所述的環(huán)形寡肽在制造用于治療蛋白酶活性是惡化因子的疾病的藥物中的應(yīng)用。44.如權(quán)利要求43所述的應(yīng)用，其特征在于，所述疾病選自心血管疾病、循環(huán)疾病和HIV。45.—種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-38任何一項(xiàng)所述的環(huán)形寡肽和藥學(xué)上可接受賦形劑和/或輔佐劑。46.如權(quán)利要求45所述的藥物組合物，其特征在于，所述賦形劑選自二乙二醇單乙醚、泊洛沙姆嵌段共聚物、環(huán)糊精、非離子表面活性劑或膽鹽。47.如權(quán)利要求45或權(quán)利要求46所述的藥物組合物，其特征在于，所述非離子表面活性劑選自聚乙二醇的酰酯或聚乙二醇的脂族醚。48.—種制備能特異性結(jié)合靶配體的如權(quán)利要求1-38任何一項(xiàng)所定義環(huán)形寡肽的方法，所述方法包括i)提供表位形成性氨基酸；ii)制備摻入所述表位形成性氨基酸的環(huán)形寡肽。49.如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述提供表位形成性氨基酸的步驟包括(a)選擇一組偶聯(lián)物，各偶聯(lián)物包含頭基和尾基，以及頭基陣列，其中各個(gè)頭基包含氨基酸；(b)使它們形成非共價(jià)連接，其中尾基疏水性聚集而所述偶聯(lián)物是可移動(dòng)的；(c)檢測(cè)所述非共價(jià)連接與靶配體之間充分的相互作用；(d)任選地用具有修飾的頭基陣列的一組偶聯(lián)物重復(fù)步驟(a)至(c);和(e)—旦在步驟(c)發(fā)現(xiàn)充分的相互作用，選出組成該組偶聯(lián)物頭基的氨基酸作為步驟(a)的表位形成性氨基酸。全文摘要一種內(nèi)部受約束的環(huán)形寡肽，此寡肽包含能特異性結(jié)合靶配體的由至少6個(gè)氨基酸組成的環(huán)。此寡肽中的環(huán)包含多個(gè)氨基酸區(qū)域，每個(gè)區(qū)域含有至少2個(gè)表位形成性氨基酸，以及二個(gè)或多個(gè)結(jié)合性官能團(tuán)，它們可定位形成一個(gè)或多個(gè)環(huán)內(nèi)連接；從而將此環(huán)形寡肽約束成單一構(gòu)象，各區(qū)域中的表位形成性氨基酸形成表位，各表位能特異性結(jié)合靶配體。文檔編號(hào)C07K7/52GK101535337SQ200780040243公開(kāi)日2009年9月16日申請(qǐng)日期2007年9月20日優(yōu)先權(quán)日2006年9月20日發(fā)明者R·紐申請(qǐng)人:萊克西康有限公司