專(zhuān)利名稱(chēng)：：骨髓白血病來(lái)源的細(xì)胞在抗體表達(dá)中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了生物技術(shù)上有利的生成蛋白分子組合物、尤其具有增加的活性和/或增加的產(chǎn)量和/或提高的同質(zhì)性和人糖基化的抗體分子組合物的方法。另外提供了新穎的宿主細(xì)胞、核酸和蛋白分子組合物。簡(jiǎn)介工業(yè)上的一個(gè)關(guān)鍵特征和挑戰(zhàn)是重組蛋白的生產(chǎn)，生產(chǎn)力、成本、同質(zhì)性和蛋白活性是有待優(yōu)化的關(guān)鍵問(wèn)題。糖基化也是同質(zhì)重組糖蛋白的高產(chǎn)量生產(chǎn)中的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，所述同質(zhì)重組糖蛋白在它們的生產(chǎn)中產(chǎn)生一系列的關(guān)鍵問(wèn)題。每種現(xiàn)有的生產(chǎn)細(xì)胞系具有一系列不同的挑戰(zhàn)和問(wèn)題，它們主要是由于糖基化的復(fù)雜性和物種、組織和位點(diǎn)特異性。因此，在糖基化方面優(yōu)化生產(chǎn)系統(tǒng)，仍然是優(yōu)化的關(guān)鍵方面之一。這特別是由于糖基化模式的差異經(jīng)常對(duì)蛋白分子的活性、免疫原性、生物利用度和半衰期有顯著影響。在Jenkins等人(Gettingtheglycosylationright:implicationsforthebiotechnologyindustry,NatBiotechnology,1996，14:975-981)中，給出了源自不同物種和非哺乳動(dòng)物生產(chǎn)系統(tǒng)的不同細(xì)胞系的糖基化性質(zhì)的詳細(xì)綜述?？贵w是用于診斷和研究的主要工具，可能變成最大的治療劑家族。有超過(guò)十種重組抗體治療劑面市，數(shù)百種處于臨床開(kāi)發(fā)中。工業(yè)上的一個(gè)關(guān)鍵特征和挑戰(zhàn)是重組抗體("rMAbs")的生產(chǎn)，生產(chǎn)力、成本、同質(zhì)性和抗體活性是有待優(yōu)化的關(guān)鍵問(wèn)題。幾乎所有面市的治療性rMAbs已經(jīng)在來(lái)自侖鼠(CHO)和小鼠(NS0或Sp2/0)的嚙齒動(dòng)物細(xì)胞系中生產(chǎn)。在開(kāi)發(fā)中的絕大多數(shù)rMABs是在嚙齒動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)，其它處于開(kāi)發(fā)中，但是，都沒(méi)有充分優(yōu)化生產(chǎn)力、成本、同質(zhì)性和抗體活性。糖基化也是同質(zhì)的和有效的rMAbs的高產(chǎn)量生產(chǎn)中的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，這在rMAbs的生產(chǎn)中導(dǎo)致一系列關(guān)鍵問(wèn)題。每種現(xiàn)有的生產(chǎn)細(xì)胞系具有一系列不同的挑戰(zhàn)和問(wèn)題，它們主要是由于糖基化的復(fù)雜性和物種、組織和位點(diǎn)特異性[綜述RoystonJefferis,CCEIX:GlycosylationofRecombinantAntibodyTherapeutics;Biotechnol.Prog.2005，21,11-16〗。因此，在糖基化方面優(yōu)化蛋白、尤其是抗體生產(chǎn)系統(tǒng)，仍然是優(yōu)化的關(guān)鍵方面之一。本發(fā)明提供了基于永生化人血細(xì)胞、尤其基于骨髓白血病起源的細(xì)胞的新的表達(dá)系統(tǒng)。這些細(xì)胞令人驚奇地在活性、產(chǎn)量和/或同質(zhì)性方面提高了糖基化蛋白、尤其是抗體的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
：蛋白是一個(gè)彼此的功能和產(chǎn)生大不相同的集合。在具有治療潛能的蛋白中，大多數(shù)蛋白為糖基化蛋白，例如許多激素(例如生長(zhǎng)激素，胰高血糖素，F(xiàn)SH和LH)、生長(zhǎng)因子(例如GM-CSF，G-CSF，VEGF和促紅細(xì)胞生成素)、細(xì)胞因子(例如IL-2，IL-7，干擾素-a和-P，TNF-a)、抗凝血?jiǎng)?例如重組水蛭素，地西盧定)、血液凝固因子(例如因子VII、VIII及IX)、疫苗(例如乙型肝炎抗原)及抗體。已建立的細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)不能夠生產(chǎn)具有原始的人糖基化的蛋白。原核細(xì)胞(如細(xì)菌)和大多數(shù)真核細(xì)胞系統(tǒng)(如酵母、昆蟲(chóng)和植物細(xì)胞)會(huì)合成缺少糖基化或攜帶與人糖鏈大不相同的聚糖的蛋白。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CH0)細(xì)胞是一種常用的生產(chǎn)系統(tǒng)，它能夠以與人細(xì)胞相似的方式對(duì)蛋白糖基化。但是，仍然存在重要差異，例如，在半乳糖基化、巖藻糖基化、使用N-乙酰葡糖胺的特殊糖基化中，以及尤其在唾液酸化的各個(gè)方面。這些差異會(huì)影響活性、生物利用度、免疫原性和半衰期。在建立這些生產(chǎn)系統(tǒng)的時(shí)候，生產(chǎn)至少在某種程度上具有活性的治療蛋白是足夠的。但是，目前很大努力集中提高治療蛋白的活性，其目的是(i)減少治療蛋白的使用劑量的數(shù)目和濃度，(ii)減少治療費(fèi)用，和(iii)減輕副作用。提高蛋白的生物活性的主要策略是，延長(zhǎng)它們的血清半衰期，并因此提高它們的生物利用度。這可通過(guò)稱(chēng)為聚乙二醇化(PEG化)的方法完成，其中某些形式的聚乙二醇被化學(xué)添加/連接至所生產(chǎn)的蛋白中。PEG會(huì)增加分子量，并因此增加血清半衰期。然而，有幾個(gè)問(wèn)題與此方法有關(guān)。例如，在幾乎所有情況下，PEG化通過(guò)其細(xì)胞效應(yīng)子功能減小蛋白的活性，作為中和抗體在人體中重復(fù)使用常導(dǎo)致不良免疫應(yīng)答，和/或生產(chǎn)過(guò)程需要其它化學(xué)修飾，從而導(dǎo)致需要附加成本、損失及時(shí)間的多步驟過(guò)程。存在具有相當(dāng)缺點(diǎn)的類(lèi)似的系統(tǒng)(例如HES化或白蛋白的結(jié)合)。另外，為提高重組表達(dá)的蛋白的血清半衰期，糖鏈的修飾和蛋白的糖基化是焦點(diǎn)。因此，技術(shù)集中在使重組糖蛋白的唾液酸化程度最大化。唾液酸是真核細(xì)胞表面分布最廣的末端單糖，通常認(rèn)為糖蛋白被唾液酸化程度越大，它在循環(huán)中的血清半衰期就越長(zhǎng)。這是基于某些受體作為去唾液酸蛋白-受體在肝臟中的存在，該受體結(jié)合循環(huán)的非唾液酸化的蛋白，并指導(dǎo)它們進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行降解。在人和大多數(shù)哺乳動(dòng)物中存在多種類(lèi)型的抗體，即IgG，IgM，IgE:IgA，IgD。盡管所有抗體類(lèi)型的分子用于診斷或用作研究工具，面市的和處于開(kāi)發(fā)中的大部分基于抗體的治療劑是IgG，少數(shù)是IgM。人IgG類(lèi)別進(jìn)一步分成4個(gè)亞類(lèi)，IgGl，IgG2，IgG3和IgG4。IgG分子的基本結(jié)構(gòu)由2個(gè)輕鏈和2個(gè)重鏈組成，它包含2個(gè)Fab區(qū)域(每個(gè)Fab區(qū)域具有一個(gè)包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變域和一個(gè)恒定域)、一個(gè)Fc區(qū)域(它包含另外的恒定域和配體相互作用位點(diǎn))和連接Fab和Fc區(qū)域的柔性鉸鏈區(qū)。抗體可以作為完整分子或作為抗體片段(例如Fab片段)或單鏈Fv(它包含通過(guò)連接物相連的重鏈和輕鏈的2個(gè)可變區(qū))存在。圖18.顯示了IgG抗體。為了降低它們的免疫原性，用于治療用途的重組抗體經(jīng)常是嵌合的、人源化的、或所謂的全人蛋白序列。但是，不能容易地得到真正的全人分子，因?yàn)榉g后修飾(例如特別是糖基化)不是人的，這是由于在嚙齒動(dòng)物或CHO細(xì)胞中生產(chǎn)，因而不同于在人血清中人抗體上發(fā)現(xiàn)的那些修飾。修飾(尤其是糖基化模式)的差異，可以分別對(duì)生成的抗體的活性和免疫原性具有嚴(yán)重影響?？贵w的活性可以是由于多種因素或受多種因素的影響。一方面，抗體具有某些特異性，其由位于Fab區(qū)域的抗體可變區(qū)("V區(qū)域")介導(dǎo)，其中V區(qū)域的某些序列(CDR區(qū)域)在抗體的特定特異性和親和力測(cè)定中起關(guān)鍵作用。V區(qū)域因而對(duì)于表位結(jié)合特征是決定性的，且隨抗體而不同?？贵w的親和力描述了抗體的單個(gè)結(jié)合區(qū)結(jié)合它的表位的強(qiáng)度和動(dòng)力學(xué)。由于不同類(lèi)別和亞類(lèi)的抗體攜帶一個(gè)抗體分子中的2至IO個(gè)相同的可變區(qū)，抗體結(jié)合的強(qiáng)度和動(dòng)力學(xué)受到可用于結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目和靶抗原或細(xì)胞上表位的可達(dá)性影響，表達(dá)為它的魚(yú)合力。—就它用于診斷和尤其是治療的用途而言，抗體質(zhì)量的另一個(gè)重要因素是它的靶物結(jié)構(gòu)或細(xì)胞上抗體的結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目以及它的內(nèi)化速率。這些質(zhì)量會(huì)影響抗體用于尤其是治療的效果和適用性。另一方面，與抗體的治療用途有關(guān)的效應(yīng)機(jī)理是多種,由此有些抗體僅通過(guò)一種機(jī)理起作用，其它抗體通過(guò)多種效應(yīng)機(jī)理的組合起作用。一種策略是偶聯(lián)抗體或抗體片段到介導(dǎo)治療效應(yīng)的效應(yīng)分子上，例如偶聯(lián)到免疫效應(yīng)分子(例如白細(xì)胞介素-2)以征集免疫系統(tǒng)，或偶聯(lián)到毒素或放射性同位素以殺死靶細(xì)胞，例如用于抗腫瘤治療。放射標(biāo)記的抗體或抗體片段對(duì)于體內(nèi)診斷也是有價(jià)值的。另一種策略是使用未標(biāo)記的、所謂的"棵"抗體，其可以具有重要的優(yōu)點(diǎn)，例如更低的毒性、更少的并發(fā)癥(complicatedlogistics)，使用天然免疫效應(yīng)子臂或在不需要其它效應(yīng)分子的情況下觸發(fā)治療效應(yīng)。已經(jīng)進(jìn)行了大量研究來(lái)解釋抗體的活性機(jī)理和作用模式，以及使用這些活性來(lái)開(kāi)發(fā)抗體。最重要的活性和效應(yīng)是依賴(lài)于抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性活性(本文中稱(chēng)作"ADCC活性")，依賴(lài)于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性活性(本文中稱(chēng)作"CDC活性")，吞噬作用介導(dǎo)的細(xì)胞毒性活性(本文中稱(chēng)作"吞噬活性")，包含一整組不同效應(yīng)和活性的受體介導(dǎo)的活性(本文中稱(chēng)作"受體介導(dǎo)的活性")。受體介導(dǎo)的活性主要是基于抗體對(duì)靶細(xì)胞上的分子或受體的結(jié)合，或通過(guò)阻止某些分子對(duì)靶細(xì)胞的結(jié)合，從而誘導(dǎo)或抑制這些細(xì)胞上的某些效應(yīng)，例如拮抗或激動(dòng)活性或抗體對(duì)受體的阻斷，導(dǎo)致例如細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)或抑制、或靼細(xì)胞的增殖、或靶細(xì)胞中某些分子的分泌或分泌抑制，或阻斷或觸發(fā)某些其它受體介導(dǎo)的分子和細(xì)胞之間或細(xì)胞之間的事件例如相互作用。ADCC活性、CDC活性和吞噬活性是由抗體的Fc區(qū)域介導(dǎo)的細(xì)胞毒性活性(本文中稱(chēng)作"Fc部分介導(dǎo)的活迭")，而受體介導(dǎo)的抗體的活性、親和力、親合力和特異性主要是通過(guò)Fab區(qū)域中包含的抗體的結(jié)合區(qū)來(lái)介導(dǎo)。通過(guò)結(jié)合效應(yīng)酉己體侈'J^(口Fc-yRI，F(xiàn)c—yRII，F(xiàn)c—yRIII，^卜體的Clq組分，新生的Fc受體(FcRn)，等，通過(guò)免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如殺傷細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞和激活的巨噬細(xì)胞或各種補(bǔ)體組分)來(lái)介導(dǎo)Fc部分介導(dǎo)的活性。據(jù)報(bào)道，在人IgG類(lèi)分子中，人IgGl亞類(lèi)具有最高的ADCC和CDC活性。就IgM而言，CDC活性是優(yōu)勢(shì)的效應(yīng)機(jī)理。ADCC活性和CDC活性包含F(xiàn)c區(qū)域(抗體的恒定區(qū))對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的Fc-受體(例如Fc-yRI，F(xiàn)c-yRII，F(xiàn)c-yRIII)或補(bǔ)體組分(例如Clq)的結(jié)合。重要的氨基酸殘基是在鉸鏈區(qū)、尤其是恒定區(qū)的笫二域("Cy2域，，)。結(jié)合CY2域的糖鏈對(duì)活性而言是重要的。糖鏈結(jié)合在Cy2的氨基酸天冬酰胺297(Asn-297)(N-糖苷連接的糖鏈)。結(jié)合天冬酰胺的糖鏈末端稱(chēng)作還原端，相對(duì)端稱(chēng)作非還原端。IgG抗體的Fc區(qū)域具有2個(gè)糖結(jié)合位點(diǎn)。圖18顯示了IgG分子的結(jié)構(gòu)，指出了可以發(fā)現(xiàn)典型的糖結(jié)構(gòu)的位置。此外，解釋了這些糖結(jié)構(gòu)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成。從Fc部分介導(dǎo)的活性，假定2種受到抗體糖基化的影響:已經(jīng)證實(shí)，抗體Fc部分中糖鏈的去除會(huì)導(dǎo)致CDC和ADCC活性的消失，這些N-聚糖中半乳糖的減少也會(huì)造成CDC活性的降低[Boyd等人，MolecularImmunol.，32，1311，(1995);US6946292]。此外，描述了與在倉(cāng)鼠和大鼠細(xì)胞中表達(dá)的相同抗體相比，大鼠細(xì)胞中抗體的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致其中表達(dá)的某些抗體的ADCC活性的增加[Lifely等人，Glycobiology，1995Dec;5(8):813-22;W000/61739]。兩篇報(bào)道都假定，糖基化的變化造成抗體ADCC活性的這些差異，但是，這是不清楚的。Lifely等人1995假定，二等分N-乙酰葡糖胺("bisecGlcNAc，，)引起抗體的ADCC活性增加，而WO00/61739假定，連接到在N-聚糖還原端的N-乙酰葡糖胺上的巖藻糖ocl-6("核心-巖藻糖")的急劇降低，是增加的ADCC活性的原因。此外，描述了與在未用GnTIII重組轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中表達(dá)的相同抗體相比，當(dāng)在這些細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，CHO細(xì)胞中負(fù)責(zé)將糖bisecGlcNAc結(jié)合到N-聚糖上的酶GnTIII的重組表達(dá)導(dǎo)致某些抗體的ADCC活性的增加[US6602684，Umana等人，NatureBiotechn17:176-180(1999)]。另外，描述了當(dāng)在這樣的FUT8K0CHO細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，CHO細(xì)胞中導(dǎo)致核心-巖藻糖缺失的基因FUT8敲除可以增加某些抗體的ADCC活性[US6946292]。這些結(jié)果也證實(shí)了糖基化模式對(duì)抗體活性的重要性和復(fù)雜性。但是，"外源的"和因而未優(yōu)化的糖基化模式不僅有害于活性，也可能是免疫原性的?，F(xiàn)有的蛋白、尤其是抗體的表達(dá)和生產(chǎn)系統(tǒng)主要是源自嚙齒動(dòng)物的細(xì)胞系，基于來(lái)自倉(cāng)鼠、小鼠或大鼠的細(xì)胞系，例如CHO，BHK，NSO，Sp2/0和YB2/0。已知嚙齒動(dòng)物細(xì)胞可以在非最佳條件下生成許多異常糖基化的蛋白產(chǎn)物，它們?nèi)鄙傩r(jià)或是免疫原性的。另外，已知嚙齒動(dòng)物細(xì)胞會(huì)表達(dá)與人細(xì)胞中表達(dá)的那些顯著不同的、存在非人糖且缺少某些人糖部分的糖結(jié)構(gòu)，這可以使在這些細(xì)胞中表達(dá)的蛋白具有例如免疫原性、更低的有效性、更低的產(chǎn)量或亞適結(jié)構(gòu)需求或折疊。大多數(shù)嚙齒動(dòng)物細(xì)胞會(huì)表達(dá)例如N-乙醇?；窠?jīng)氨酸("NeuGc，，)，這是不存在于人中的N-乙?；窠?jīng)氨酸("NeuMc，，)的一種替代物，它在人中是免疫原性的，和/或免疫原性的半乳糖ct(l-3)半乳糖修飾("Galotl-3Gal")，和/或它們?nèi)鄙僦匾奶抢缰匾膐c2-6連接的NeuNAc，或它們?nèi)鄙賐isecGlcNAc。還存在其它已知的和未知的差異。另外，從嚙齒動(dòng)物生產(chǎn)已知，糖形大部分是異質(zhì)的，并且在CHO、NS0或Sp2/0細(xì)胞的克隆之間不同的克隆特異性的糖形也依賴(lài)于生產(chǎn)方式和培養(yǎng)條件。此外，存在用于生產(chǎn)蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，它們包括人細(xì)胞，例如Hek293細(xì)胞，它們?cè)醋匀伺吣I細(xì)胞或源自單個(gè)人視網(wǎng)膜衍生細(xì)胞(使用重組DM技術(shù)使它成為永生化的)的細(xì)胞系統(tǒng)PerC6。但是，這些細(xì)胞系盡管經(jīng)常優(yōu)于非人細(xì)胞系統(tǒng)，仍然具有一些缺點(diǎn)。它們具有獨(dú)特的糖基化模式，這可以歸因于各個(gè)細(xì)胞的糖基化機(jī)理。但是，根據(jù)要生產(chǎn)的蛋白，它們可能不遞送優(yōu)化的糖基化模式，例如關(guān)于蛋白的活性和/或血清半衰期。具體地，用這些細(xì)胞難以實(shí)現(xiàn)唾液酸化的某些程度和模式。例如，本領(lǐng)域已知的細(xì)胞系統(tǒng)經(jīng)常不能提供可檢測(cè)的oc2-6連接的唾液酸化，但是，后者對(duì)于血清半衰期是重要的。從這些事實(shí)可以看出，仍然需要可以進(jìn)一步優(yōu)化生產(chǎn)力、同質(zhì)性和/或抗體活性的表達(dá)和生產(chǎn)系統(tǒng)，這通過(guò)提供替代系統(tǒng)和/或改進(jìn)的表達(dá)系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外，從這些事實(shí)也可以看出，不能指出哪些糖結(jié)構(gòu)、尤其哪些人糖結(jié)構(gòu)對(duì)于提高蛋白、尤其是抗體的活性或同質(zhì)性是最佳的，以及細(xì)胞系、尤其是人細(xì)胞系必須提供哪類(lèi)糖基化模式，以便優(yōu)化蛋白、尤其是抗體的活性。因此，需要與用本領(lǐng)域已知的表達(dá)系統(tǒng)得到的產(chǎn)物相比，會(huì)提供具有差異化的糖基化模式的產(chǎn)物的表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明通過(guò)提供基于人永生化血細(xì)胞系、尤其是骨髓白血病起源的細(xì)胞的新表達(dá)系統(tǒng)，提供了這些問(wèn)題的解決方案。與現(xiàn)有技術(shù)已知的系統(tǒng)相比，使用永生化人血細(xì)胞是有利的，因?yàn)檫@些細(xì)胞會(huì)提供不同于源自不同組織(例如腎或視網(wǎng)膜)的其它已知人細(xì)胞系統(tǒng)的糖基化模式。這些差異在活性、同質(zhì)性和產(chǎn)物產(chǎn)量方面可能是有利的。此外，可以轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞，并在無(wú)血清條件下懸浮生長(zhǎng)。因此，根據(jù)第一個(gè)實(shí)施方案，提供了生產(chǎn)蛋白組合物的方法，其包含下述步驟(a)向宿主細(xì)胞(它是永生化人血細(xì)胞)中引入至少一種核酸，其編碼所述蛋白的至少一部分；和(b)在允許生成所述蛋白組合物的條件下，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；和(c)分離所述蛋白組合物。使用永生化人血細(xì)胞的該方法會(huì)在活性、產(chǎn)量和/或同質(zhì)性方面提高蛋白、尤其是抗體的生產(chǎn)。這是令人驚奇的，因?yàn)槠駷橹箾](méi)有證實(shí)永生化人血細(xì)胞、尤其是骨髓白血病細(xì)胞適用于生產(chǎn)蛋白，尤其導(dǎo)致抗體具有各種提高的性質(zhì)。盡管某些大鼠白血病細(xì)胞被用于表達(dá)抗體，人和大鼠之間的糖基化機(jī)理決定性的不同，由此后者可以表達(dá)在人中是免疫原性的糖部分，例如NeuGc和Galcc1-3Gal。據(jù)稱(chēng)大鼠YB2/0白血病細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生具有更高ADCC活性的抗體，這是由于更高的bisecGlcNAc存在或由于核心-巖藻糖的急劇下調(diào)。甚至更令人驚奇地，本發(fā)明使用永生化人血細(xì)胞、尤其是髓樣細(xì)胞解決了問(wèn)題，因?yàn)橐郧皥?bào)道，細(xì)胞系K562(—種骨髓白血病細(xì)胞)不會(huì)表達(dá)bisecGlcNAc的酶，通過(guò)GnTIII的基因雜交描述和證實(shí)了該發(fā)現(xiàn)[YoshimuraM等人，CancerRes.56(2):412-8(1996)]，且確實(shí)表達(dá)基因FUT8，它會(huì)表達(dá)造成核心-巖藻糖的添加的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，如RT-PCR所證實(shí)的[實(shí)施例1]。這是令人驚奇的，因?yàn)镵562不能耐受凝集素處理，因?yàn)樗鼤?huì)被凝集素LCA強(qiáng)烈結(jié)合，這是核心-巖藻糖基化陰性的或強(qiáng)烈下調(diào)的細(xì)胞的基礎(chǔ)。由于關(guān)于K562細(xì)胞的糖基化的該信息，不能預(yù)見(jiàn)到這些細(xì)胞可以提高在其中表達(dá)的抗體的活性，因?yàn)榧俣ú淮嬖谟欣幕钚阅Ｊ剿匦璧奶腔瘷C(jī)理。還令人驚奇地，與現(xiàn)有的表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞相比，使用本發(fā)明的生產(chǎn)方法可以產(chǎn)生和得到具有增加的結(jié)合活性、提高的同質(zhì)性和/或更高的產(chǎn)量的蛋白、尤其是抗體o本發(fā)明的策略是，建立合適的人細(xì)胞系，以便得到系統(tǒng)，其可以提供具有與人系統(tǒng)盡可能接近的一整組翻譯后修飾、因此在人系統(tǒng)中不具有或具有更少的免疫原性性質(zhì)和/或具有提高的活性的蛋白產(chǎn)物。其目的是為要表達(dá)的每種蛋白/抗體提供定制的糖基化模式。由于下式事實(shí)，糖結(jié)構(gòu)是非常復(fù)雜的、細(xì)胞的糖基化機(jī)理包含數(shù)百種參與它們的合成的酶、和這些酶主要物種特異性地和組織特異性地表達(dá)，發(fā)明人的實(shí)現(xiàn)人糖基化的主要策略是，提供合適的生物技術(shù)上的人表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)具有優(yōu)化的糖基化模式的蛋白、尤其是抗體。由于優(yōu)化的糖基化模式可以在蛋白之間不同和在抗體之間不同，本發(fā)明提供了生產(chǎn)不同糖基化模式的細(xì)胞系，從而允許選擇生產(chǎn)細(xì)胞系，其生產(chǎn)為各種蛋白/抗體產(chǎn)物優(yōu)化的糖基化模式。因此，本發(fā)明提供了生物技術(shù)上有利的生產(chǎn)蛋白組合物、尤其是抗體分子組合物的方法，所述組合物具有增加的活性和/或增加的產(chǎn)量和/或提高的同質(zhì)性和全人糖基化。另外提供了新穎的宿主細(xì)胞、核酸和分子組合物。因此，提供了生產(chǎn)具有確定的糖基化模式的蛋白組合物、優(yōu)選抗體分子組合物的方法，其包含下述步驟(a)向作為宿主細(xì)胞的永生化人血細(xì)胞中引入至少一種核酸，其編碼蛋白或其至少一部分；(b)在允許生成所述蛋白組合物的條件下，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；和(c)分離具有預(yù)期的糖基化特征的所述蛋白組合物。為了得到根據(jù)本發(fā)明具有提高的性質(zhì)的蛋白組合物、尤其是抗體組合物，選擇宿主細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)具有至少一種下述糖基化特征的蛋白/抗體組合物(i)它不含有可檢測(cè)的NeuGc。如上所述，NeuGc糖基化在人中可以具有免疫原性性質(zhì)。因此，希望盡可能避免各個(gè)糖基化。通過(guò)使用永生化人血細(xì)胞、尤其是人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞，避免各個(gè)糖基化。(ii)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中的相同量的蛋白分子相比，它在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白分子組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上具有增加的半乳糖基化程度。發(fā)現(xiàn)半乳糖殘基主要P1-4連接至抗體的復(fù)雜型N-聚糖的觸角上的GlcNAc殘基，但是也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了P-1，3鍵。但是，它們通常以三觸角結(jié)構(gòu)存在。半乳糖基化程度對(duì)活性(尤其是關(guān)于抗體)的影響是顯著的。已經(jīng)證實(shí)，半乳糖的剝奪會(huì)導(dǎo)致降低的CDC活性。因此，可以?xún)?yōu)選地具有高度的半乳糖基化。就其它蛋白而言，半乳糖基化也可能起重要作用。當(dāng)提及蛋白分子的總糖結(jié)構(gòu)時(shí)，考慮蛋白分子的所有糖基化。在分析蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)時(shí)，焦點(diǎn)在于特定的糖結(jié)構(gòu)，例如結(jié)合到抗體分子Fc部分的Asn297上的糖結(jié)構(gòu)(也請(qǐng)參考圖18)。在評(píng)價(jià)各個(gè)特定結(jié)構(gòu)的情況下，測(cè)定特定結(jié)構(gòu)的含量/組成。也可以稱(chēng)作總糖單元和決定所述特征的特定糖鏈(它們是同義詞)。(iii)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中的相同量的蛋白分子相比，它具有高至少5%的量的G2結(jié)構(gòu)，該G2結(jié)構(gòu)是在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白分子組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上。更具體地，在根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)抗體的情況下，大量G2結(jié)構(gòu)是有益的。"G2結(jié)構(gòu)"定義了一種糖基化模式，其中半乳糖存在于結(jié)合到Fc區(qū)域的雙觸角結(jié)構(gòu)的兩端(在抗體的情況下)(也請(qǐng)參考圖18)。如果發(fā)現(xiàn)了一個(gè)半乳糖分子，它稱(chēng)作G1結(jié)構(gòu)，如果沒(méi)有半乳糖，稱(chēng)作G0結(jié)構(gòu)。經(jīng)常發(fā)現(xiàn)G2糖基化模式會(huì)提高抗體的CDC。因此，優(yōu)選地，至少10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、85%、95°/?；蛏踔脸^(guò)100%的更高量的G2結(jié)構(gòu)存在于生成的蛋白/抗體組合物中。本文描述了實(shí)現(xiàn)各個(gè)高G2糖基化模式的合適的細(xì)胞系。由于高總體半乳糖基化程度經(jīng)常有益于抗體的CDC,經(jīng)常有益地在總糖結(jié)構(gòu)上或在蛋白、尤其抗體分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上得到60%、65%、70%、75%、亂85%、90%、95%或甚至超過(guò)95%的G2和/或Gl結(jié)構(gòu)。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，超過(guò)35°/。(40%、45%、50%、55%、60%、65%或超過(guò)70%)的G2結(jié)構(gòu)存在于總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上。(iv)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí),與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上具有低至少5%的量的GO結(jié)構(gòu)。如上所述，高半乳糖基化程度經(jīng)常是有利的。因此，優(yōu)選地選擇細(xì)胞系，使得避免GO結(jié)構(gòu)。GO結(jié)構(gòu)的量?jī)?yōu)選地低于10%、15°/。、20%、25%、30%、35%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、亂85%、90%,或該量甚至更低。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上存在小于22%(20°/。、18%、15%、12%、10%、9%、8%、7%、6%、小于5。/。)的G0結(jié)構(gòu)。(v)它不含有可檢測(cè)的末端Galoc1-3Gal。如上所述，Galal-3Gal糖基化在人中可以是免疫原性的。該糖基化表征了一種模式，其中第二個(gè)半乳糖殘基在oc1，3位置連接至第一個(gè)半乳糖殘基，產(chǎn)生高免疫原性的Galal-3Gal二糖。通過(guò)使用永生化人血細(xì)胞、尤其是人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞，避免了各個(gè)不利的糖基化。(vi)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從C腿hfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上包含少至少5%的量的巖藻糖。在N-聚糖樹(shù)內(nèi)的不同位點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)了巖藻糖殘基，所以具體地-cx1，6連接至在氨基酸strain附近的GlcNAc殘基；-a1，3和ot1,4連接至觸角位置的GlcNAc殘基；-a1，2連接至觸角位置的Gal殘基。在抗體結(jié)合的N-聚糖上，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)巖藻糖殘基1，6連接至鄰近的GlcMc殘基(所謂的"核心巖藻糖")。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在結(jié)合到抗體上的N-聚糖的還原端缺少核心巖藻糖，會(huì)使抗體的ADCC活性提高因子(factor)25至100。由于對(duì)ADCC的該有益作用，優(yōu)選地當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，巖藻糖的量少至少10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、250%、300%、400%、500%、1000%、1500%或超過(guò)2000%。本發(fā)明也提供了特別構(gòu)建的細(xì)胞系，其實(shí)現(xiàn)各個(gè)低總巖藻糖基化。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，選擇所述宿主細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)糖蛋白，其包含總糖結(jié)構(gòu)或在所述蛋白分子組合物的蛋白分子的特定糖基化位點(diǎn)處的至少一個(gè)特定糖結(jié)構(gòu)的糖的至少10%(15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75°/?；虺^(guò)80%),其缺少巖藻糖。關(guān)于抗體，特別優(yōu)選地，結(jié)合到Fc區(qū)域上的N-糖苷連接的糖鏈包含具有GlcNAc的還原端，其中所述糖鏈不含有結(jié)合到糖鏈還原端的GlcNAc的6位置上的巖藻糖。(vii)它包含至少一個(gè)含有二等分GlcNAc的糖結(jié)構(gòu)。經(jīng)常發(fā)現(xiàn)二等分N-乙酰葡糖胺(bisGlcMc)p1，4結(jié)合到抗體中存在的N-聚糖的三甘露糖基核心結(jié)構(gòu)的中央甘露糖殘基。二等分GlcNAc在抗體Fc-N-聚糖的中央甘露糖殘基處的存在，會(huì)增加抗體的ADCC活性。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，選擇所述宿主細(xì)胞，使得與含有二等分GlcNAc且不含有巖藻糖的各個(gè)糖結(jié)構(gòu)相比，生成的所述蛋白包含更多的不含有巖藻糖且不含有二等分GlcNAc的所述蛋白分子組合物中的蛋白分子的總糖單元(或在蛋白分子的特定糖基化位點(diǎn)處的至少一個(gè)特定糖鏈)的糖結(jié)構(gòu)。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，選擇所述宿主細(xì)胞，使得與含有二等分GlcMc且不含有巖藻糖的各個(gè)糖結(jié)構(gòu)相比，生成的所述蛋白包含更多的含有更多二等分GlcNAc和巖藻糖的所述蛋白分子組合物中的蛋白分子的總糖單元(或在蛋白分子的特定糖基化位點(diǎn)處的至少一個(gè)特定糖鏈)的糖結(jié)構(gòu)。(viii)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，具有與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物的唾液酸化模式相比改變的唾液酸化模式。唾液酸化程度/模式對(duì)活性、半衰期和生物利用度的影響隨不同蛋白/抗體而不同。因此，有益地通過(guò)使用根據(jù)本發(fā)明的篩選方法，提前確定各個(gè)蛋白/抗體分子的優(yōu)化的唾液酸化模式，然后用最合適的宿主細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)，提供希望的糖基化模式。例如，幾篇出版物報(bào)道了抗體Fc聚糖上存在的唾液酸殘基對(duì)下游效應(yīng)(即CDC和ADCC)的負(fù)面影響。但是，發(fā)現(xiàn)高唾液酸化會(huì)延長(zhǎng)唾液酸化的分子的半衰期。因此，根據(jù)生產(chǎn)的蛋白/抗體，不同的唾液酸化模式是有利的，本發(fā)明提供了具有不同唾液酸化活性的永生化人血細(xì)胞系，從而允許得到具有優(yōu)化的糖基化模式的蛋白/抗體。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，選擇宿主細(xì)胞，使得它生成具有降低的唾液酸化程度的蛋白，當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上的唾液酸的量低至少10%(優(yōu)選15%、20%、25%、30%、35°/。、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、>95%)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，該產(chǎn)物甚至包含不可檢測(cè)的NeuNAc。根據(jù)生產(chǎn)的蛋白/抗體，唾液酸和具體地NeuMc的存在可能不促成蛋白/抗體的活性。在這些情況下，可以有利地避免唾液酸糖基化，以便使產(chǎn)物更同質(zhì)。NeuNAc糖基化模式也可以在得到的蛋白組合物中變化。這可以造成管理當(dāng)局難以批準(zhǔn)產(chǎn)品，因?yàn)楫a(chǎn)品是由于改變NeuNAc含量更不同質(zhì)。對(duì)于它們的活性不依賴(lài)于NeuNAc糖基化的蛋白/抗體，為了增加同質(zhì)性，可以有益地避免NeuNAc糖基化。但是，"沒(méi)有可檢測(cè)的NeuNAc"不一定是指絕對(duì)不存在NeuNAc。相反，也包括具有相當(dāng)?shù)统潭鹊腘euNAc(例如1-10%)的實(shí)施方案。各種蛋白的一個(gè)示例是FSH。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，產(chǎn)物具有降低的唾液酸化程度，當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物的相同量的蛋白分子相比，在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上具有低至少15%(20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、〉500%)的量的NeuMc。在假定表達(dá)蛋白/抗體的情況下，其中所述唾液酸化對(duì)蛋白/抗體的活性具有負(fù)面影響，該實(shí)施方案是有益的。通過(guò)在無(wú)血清培養(yǎng)基中使用唾液酸化缺陷型細(xì)胞例如NM-F9和NM-D4,可以實(shí)現(xiàn)各個(gè)糖基化(不存在或非常低程度的唾液酸或具體地NeuNAc)。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，產(chǎn)物具有增加的唾液酸化程度，當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上的NeuNAc的量高至少15%(20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%或超過(guò)500%)。如上所述，各自增加的唾液酸化程度可以提供對(duì)蛋白的血清半衰期的正面影響，這通過(guò)延長(zhǎng)它來(lái)實(shí)現(xiàn)。在這些情況下，優(yōu)選地使用這樣的細(xì)胞系，它會(huì)提供比CHOdhfr-細(xì)胞[ATCCNo.CRL-9096]更高的唾液酸化程度，且也提供比唾液酸化缺陷型細(xì)胞(例如NM-F9和NM-D4)更高的唾液酸化程度，其中需要加入前體，以便發(fā)生唾液酸化。但是，當(dāng)培養(yǎng)這些唾液酸化缺陷型細(xì)胞時(shí)，即使加入各個(gè)前體，這些細(xì)胞通常僅達(dá)到不具有唾液酸化必需的糖基化機(jī)理中的遺傳突變/缺陷的永生化人血細(xì)胞的約50-60%的唾液酸化程度。因此，對(duì)于其中需要更高的唾液酸化程度的實(shí)施方案，優(yōu)選地使用能提供各個(gè)高唾液酸化程度的細(xì)胞系而不使用NM-F9和NM-D4。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，產(chǎn)物包含oc2-6連接的NeuNAc。另外，oc2-3連接的NeuMc可以在一定程度上存在。關(guān)于有些蛋白/抗體，NeuNAc糖基化的存在是有益的，尤其關(guān)于蛋白/抗體的半衰期。提供a2-6連接的NeuNAc是有益的，因?yàn)樵撎腔Ｊ筋?lèi)似于人糖基化模式。嚙齒動(dòng)物細(xì)胞通常提供oc2-3連接的NeuNAc。另外，其它現(xiàn)有的人細(xì)胞系不能提供足夠的oc2-6連接的NeuNAc糖基化。適用于提供各個(gè)糖基化模式的細(xì)胞系是例如NM-H9D8和NM-H9D8-E6。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，使用這樣的宿主細(xì)胞，當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，其生產(chǎn)的蛋白包含多至少20%負(fù)載的總糖單元或在所述蛋白分子組合物的所述蛋白分子的特定糖基化位點(diǎn)處的至少一個(gè)特定糖鏈的N-糖苷連接的糖鏈。糖鏈的負(fù)載也可能影響性質(zhì)，因而應(yīng)當(dāng)考慮。負(fù)載糖鏈的化學(xué)基團(tuán)是，例如，硫基或唾液酸。根據(jù)一個(gè)替代實(shí)施方案，當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，所述產(chǎn)物包含少至少20%負(fù)載的總糖單元或在所述蛋白分子組合物的蛋白分子的特定糖基化位點(diǎn)處的至少一個(gè)特定糖鏈的N-糖苷連接的糖鏈。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，選擇所述宿主細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)糖蛋白，其包含總糖單元或含有二等分GlcNAc的所述蛋白分子組合物中的蛋白分子的蛋白分子的特定糖基化位點(diǎn)處的至少一個(gè)特定糖鏈的糖結(jié)構(gòu)的至少2%(5%、10°/。、15°/。、20%、25%、30°/。、35%、40%,或超過(guò)45%)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，將宿主細(xì)胞用于生產(chǎn)蛋白，其描述了下述性質(zhì)-當(dāng)在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，與相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物相比，它具有增加的活性、增加的產(chǎn)量和/或提高的同質(zhì)性；和/或-當(dāng)在細(xì)胞系CH0dhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，它具有增加的平均或最大產(chǎn)量，這比來(lái)自相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物的產(chǎn)量高至少10%;和/或-它具有提高的同質(zhì)性，這是提高的糖基化同質(zhì)性，其中當(dāng)在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，所述抗體分子組合物具有比來(lái)自相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物的唾液酸化程度更低的唾液酸化程度；和/或-在所述蛋白分子是抗體分子的情況下，它具有增加的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，當(dāng)在細(xì)胞系CH0dhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，這比來(lái)自相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性高至少2倍；和/或-在所述蛋白分子是抗體分子的情況下，它具有增加的抗原介導(dǎo)的或Fc-介導(dǎo)的結(jié)合，當(dāng)在細(xì)胞系CH0dhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，這比來(lái)自相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物的結(jié)合高至少50%。如上所述，通過(guò)優(yōu)化本文所述的蛋白的糖基化，可以得到各個(gè)性質(zhì)。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，使用一些基于糖基化的抗體，也可以改變和提高結(jié)合性質(zhì)。本文也描述了合適的宿主細(xì)胞。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述蛋白分子組合物的提高的同質(zhì)性是具有至少一種下述特征的所述蛋白分子組合物的提高的糖基化同質(zhì)性-沒(méi)有可檢測(cè)的NeuGc;-沒(méi)有可檢測(cè)的NeuNAc;-當(dāng)在細(xì)胞系CH0dhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，比來(lái)自相同蛋白分子的蛋白分子組合物更多的NeuNAc;-可檢測(cè)的a2-6連接的NeuNAc。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，選擇所述宿主細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)蛋白組合物，其包含具有下述特征糖基化模式之一的蛋白分子(a)-它不含有可檢測(cè)的NeuGc-它不含有可檢測(cè)的Galoc1-3Gal-它包含在權(quán)利要求2中定義的半乳糖基化模式-它具有在權(quán)利要求2中定義的巖藻糖含量-它包含MsecGlcNAc國(guó)當(dāng)在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，與相同蛋白分子的蛋白組合物相比，或與唾液酸化缺陷型細(xì)胞系例如NM-F9和NM-D4相比，它包含增加量的唾液酸。(b)國(guó)它不含有可檢測(cè)的NeuGc-它不含有可檢測(cè)的Galotl-3Gal-它包含在權(quán)利要求2中定義的半乳糖基化模式-它具有在權(quán)利要求2中定義的巖藻糖含量-它包含bisecGlcNAc-當(dāng)在細(xì)胞系CH0dhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，與相同蛋白分子的蛋白組合物相比，它包含減少量的唾液酸。(c)-它不含有可檢測(cè)的NeuGc-它不含有可檢測(cè)的Galocl-3Gal-它包含在權(quán)利要求2中定義的半乳糖基化模式-它具有在權(quán)利要求2中定義的巖藻糖含量-它包含bisecGlcMc-它包含2-6NeuNAc。在表9中描述了導(dǎo)致提高的特征的其它合適的特征組合。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"蛋白分子"是指目標(biāo)蛋白或其活性片段和/或突變體，由此可以使用任意的蛋白，優(yōu)選人起源的任意糖蛋白。術(shù)語(yǔ)"蛋白分子"是指任意的多肽分子或其部分。它可以由一個(gè)或多個(gè)核酸編碼。它可以以分泌形式或其部分或含有融合伴侶的融合蛋白來(lái)生產(chǎn)。優(yōu)選地，將蛋白分泌進(jìn)上清液。在總生產(chǎn)過(guò)程方面，該實(shí)施方案是特別有益的，因?yàn)槔缈梢员苊饷撀洳襟E(例如使用佛波酯)。哺乳動(dòng)物糖蛋白的實(shí)例包括以下分子，例如細(xì)胞因子及其受體，例如TNF-ct和TNF-P;腎素；人生長(zhǎng)激素及牛生長(zhǎng)激素；生長(zhǎng)激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；oc-l-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈及B鏈；促性腺激素，例如促卵胞生成激素(FSH)，促黃體生成激素(LH)，促甲狀腺激素及人絨毛膜促性腺激素(hCG);降血鈣素；胰高血糖素；凝血因子，例如因子VIIIC、因子IX、因子VII、組織因子及血管假性血友病因子；抗凝血因子，例如蛋白C;心房利鈉因子；肺表面活性物質(zhì)；纖溶酶原活化因子，例如尿激酶、人尿和組織型纖溶酶原激活劑；鈴蟾素；凝血酶；造血生長(zhǎng)因子；腦啡肽酶；人巨噬細(xì)胞炎癥蛋白；血清白蛋白，如人血清白蛋白；苗勒氏抑制物質(zhì)；松弛素A鏈及B鏈；松弛素原；小鼠促性腺素相關(guān)肽；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；激素或生長(zhǎng)因子受體；整聯(lián)蛋白；蛋白A及蛋白D;類(lèi)風(fēng)濕因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，例如骨源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-4、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-5，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-6及神經(jīng)生長(zhǎng)因子-P;血小板源生長(zhǎng)因子；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；表皮生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，例如TGF-oc和TGF-P;胰島素樣生長(zhǎng)因子-I及胰島素樣生長(zhǎng)因子-n;胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白；CD蛋白，例如CD-3、CD-4、CD-8及CD-19;促紅細(xì)胞生成素(EPO);骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白；千擾素，例如干擾素-ot，-P，和-y;集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF及G-CSF;白細(xì)胞介素(IL)，如IL-1至IL-12;過(guò)氧化物歧化酶；T-細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；抗體及免疫粘合素、血型糖蛋白A、MUC1。前述許多糖蛋白屬于"細(xì)胞因子"，在本文中是指在免疫系統(tǒng)細(xì)胞中存在的一般種類(lèi)的激素，淋巴因子和單核因子，以及其它細(xì)胞因子。該定義旨在包括但不限于那些在局部起作用而不在血液中循環(huán)的激素，當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，會(huì)導(dǎo)致個(gè)體免疫應(yīng)答的改變。其它合適免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的實(shí)例包括但不限于干擾素(例如IFN-a，IFN-P和IFN-y)、白細(xì)胞介素(例如IL-1，IL-2，IL-3,IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10和IL-12)、胂瘤壞死因子(例如TNF-ot和TNF-P)，促紅細(xì)胞生成素(EP0)、FLT-3配體、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、CD2及ICAM。對(duì)于促紅細(xì)胞生成素，認(rèn)為該分子促進(jìn)祖細(xì)胞成熟為紅細(xì)胞，而血小板生成素被認(rèn)為促進(jìn)祖細(xì)胞經(jīng)歷血小板途徑。CSF是指誘導(dǎo)骨髓中發(fā)現(xiàn)的祖細(xì)胞分化為特定類(lèi)型成熟血細(xì)胞的淋巴因子家族。祖細(xì)胞產(chǎn)生的成熟血細(xì)胞的具體類(lèi)型依賴(lài)于存在的CSF的類(lèi)型。相似地，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落形成依賴(lài)于GM-CSF的存在。另外，當(dāng)被證明對(duì)免疫系統(tǒng)顯示相似活性時(shí)，與IL-2、GM-CSF、TNF-ct等的人源形式基本同源的其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞因子可用于本發(fā)明。類(lèi)似地，與特定蛋白基本類(lèi)似但蛋白序列具有相對(duì)較小變化的蛋白也用于本發(fā)明。眾所周知，蛋白序列的某些小的改變是可能的，不會(huì)影響蛋白分子的功能性能力，因此可以制備在本發(fā)明中作為與其父本蛋白起作用但與現(xiàn)有已知序列稍有不同的蛋白。因而也包含維持生物學(xué)功能的各個(gè)變體。優(yōu)選的糖蛋白選自血型糖蛋白A，EPO，G-CSF，GM-CSF，F(xiàn)SH，hCGLH，干擾素，白細(xì)胞介素，抗體和/或其片段。上述的所有蛋白分子可以與其它肽或多肽序列融合，例如、但不限于，連接物、激活分子或毒素。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸編碼分泌形式的蛋白或其片段。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述分泌形式缺少跨膜域。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"蛋白分子組合物"是指根據(jù)本發(fā)明的方法、尤其是在可以分離的本發(fā)明的宿主細(xì)胞中表達(dá)的任意蛋白分子的分子。所述蛋白分子組合物包含至少一種蛋白分子。所述蛋白組合物包含蛋白分子的至少一種糖形。所述蛋白分子的糖形是指攜帶在至少一個(gè)糖構(gòu)造塊方面不同的特定糖基化的糖鏈的蛋白分子，例如、但不限于，額外的半軋?zhí)牵僖核?，bisecGlcNAc，巖藻糖，或另一種糖修飾，例如、但不限于，來(lái)自相同蛋白分子的另一種糖形的乙酰化或sulfatation的分子。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白分子組合物可以包含在宿主細(xì)胞中表達(dá)的超過(guò)一種蛋白分子的分子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白分子組合物包含更多百分比的這種糖形的蛋白分子，當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，它們介導(dǎo)比從細(xì)胞系CHO、或CHOdhfr-、或BHK、或NSO、或SP2/0、或PerC.6或小鼠雜交瘤中的至少一種、優(yōu)選CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]得到的相同蛋白分子的蛋白分子組合物更高的活性。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白分子組當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，它們介導(dǎo)比從細(xì)胞系CHO、或CH0dhfr-、或BHK、或NSO、或SP2/0、或PerC.6或小鼠雜交瘤中的至少一種、優(yōu)選CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]得到的相同蛋白分子的蛋白分子組合物更高的活性。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"抗體分子"是指任意完整抗體或抗體片段或包含抗體片段的分子。所述完整抗體可以是任意抗體或任意類(lèi)別或子類(lèi)的免疫球蛋白分子或包含本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的至少一個(gè)免疫球蛋白域的任意分子，包括但不限于，動(dòng)物起源的IgG、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD，例如、但不限于，人，猿猴，嚙齒動(dòng)物，小鼠，大鼠，倉(cāng)鼠，兔子，駱駝，鳥(niǎo)，雞，或鯊魚(yú)起源，且也可以是包含來(lái)自源自不同動(dòng)物的抗體(例如嵌合的或人源化的抗體)的蛋白序列的分子，其中將不同百分比的例如鼠和人序列組合成完整抗體，和/或突變，以例如降低免疫原性或增加親和力，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述完整抗體也可以是具有至少一個(gè)額外的氨基酸或多肽序列的前述完整抗體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述完整抗體是人、人源化的或嵌合的包含人Fc區(qū)域的IgG、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4或IgM。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述完整抗體是人、人源化的或嵌合的具有人Fc區(qū)域的IgGl、IgG4或IgM。所述人Fc區(qū)域包含至少一個(gè)20氨基酸序列、更優(yōu)選至少I(mǎi)OO個(gè)氨基酸的人抗體Fc區(qū)域的恒定域，優(yōu)選地它包含人抗體的至少一個(gè)Fc域，更優(yōu)選它包含人Cy2域，更優(yōu)選它包含某些類(lèi)別或子類(lèi)的人抗體的Fc區(qū)域的所有恒定域。所述人Fc區(qū)域也可以包含突變了至少一個(gè)氨基酸的人序列。在本發(fā)明的最優(yōu)選實(shí)施方案中，完整抗體分子是(i)例如從生產(chǎn)人抗體的血細(xì)胞或細(xì)胞或從轉(zhuǎn)基因小鼠制備的全人抗體，在所述轉(zhuǎn)基因小鼠中，小鼠抗體基因座至少部分地被替換為人抗體序列，或(ii)人源化的完整抗體，其中鼠或大鼠抗體的可變區(qū)的至少一部分(例如框架區(qū)或框架的至少一個(gè)氨基酸)被替換為人序列或被突變以在人中的免疫原性更低，其包含人恒定域，或(iii)嵌合的完整抗體，其中可變區(qū)是鼠或大鼠且包含人恒定域。所述全人抗體、人源化的完整抗體和嵌合的完整抗體或其部分，以及構(gòu)建、鑒別、測(cè)試、優(yōu)化和選擇這些具有或沒(méi)有合適的其它序列的抗體分子的方法，以及構(gòu)建、鑒別、測(cè)試和選擇最合適的編碼這些抗體分子的核酸的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。所述抗體片段是包含來(lái)自所述完整抗體的至少20個(gè)氨基酸、優(yōu)選至少I(mǎi)OO個(gè)氨基酸的抗體的任意片段。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體片段包含抗體的結(jié)合區(qū)，例如Fab,F(ab)2，包含多個(gè)結(jié)合域的多體(multibodies)，例如雙體、三體或四體，單域抗體或affibodies。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體片段包含具有全部或一部分恒定域的Fc區(qū)域，優(yōu)選包含第二域(Cy2域)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段是截短的完整抗體，其中至少一個(gè)氨基酸、多肽區(qū)段或整個(gè)域被刪除。那些分子可以與其它序列相組合，用于穩(wěn)定化或提高連接物等分子的結(jié)合。所述包含抗體片段的分子是包含任意所述抗體片段或至少20個(gè)氨基酸的其它免疫球蛋白域的任意分子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述包含抗體片段的分子是融合分子，其中抗體片段與其它蛋白序列相融合，例如效應(yīng)子序列，例如細(xì)胞因子，輔助刺激因子，毒素，或來(lái)自其它抗體的抗體片段，以便建立具有多種結(jié)合特異性的分子，例如雙或三特異性的抗體，或用于導(dǎo)致結(jié)合域的多聚化的多聚化序列例如MBP(甘露聚糖結(jié)合蛋白)域，或用于檢測(cè)、純化、分泌或穩(wěn)定化的序列，例如標(biāo)記、定位信號(hào)或連接物等。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述包含抗體片段的分子是包含完整抗體的Fc區(qū)域或其部分的融合分子，優(yōu)選包含第二個(gè)恒定域(Cy2域)。所述融合分子通過(guò)基因方式融合，其中該分子由一種核酸編碼，或通過(guò)至少2種核酸的共表達(dá)來(lái)融合，由此通過(guò)非共價(jià)或共價(jià)蛋白相互作用來(lái)造成融合，或通過(guò)二者的組合來(lái)融合。通過(guò)基因工程，可以實(shí)現(xiàn)抗體片段和另一個(gè)多肽序列或蛋白分子之間的基因融合，其中兩個(gè)部分由單個(gè)核酸編碼，二者之間有或沒(méi)有其它氨基酸。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述融合分子包含至少一個(gè)來(lái)自抗體片段的結(jié)合區(qū)，例如單域抗體或Fab或非源自抗體的結(jié)合序列，例如凝集素域和Fc區(qū)域或其包含第二域(Cy域)的部分。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，融合分子包含IL-2，IL-12,IL-15GM-CSF，肽毒素，或其部分。它們例如通過(guò)基因方式來(lái)融合，其中分子由一種核酸編碼，或通過(guò)至少2種核酸的共表達(dá)來(lái)融合，由此通過(guò)非共價(jià)或共價(jià)蛋白相互作用來(lái)造成融合，或通過(guò)來(lái)自抗體片段的comion來(lái)融合，例如單域抗體，F(xiàn)ab或連接至MBP的多聚化序列的Fab。所有這些抗體分子或其部分，以及構(gòu)建、鑒別、測(cè)試和選擇這些有或沒(méi)有合適的其它序列的抗體分子的方法，以及構(gòu)建、鑒別、測(cè)試和選擇最合適的編碼這些抗體分子的核酸的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"抗體分子組合物"是指在可以分離的本發(fā)明的宿主細(xì)胞中表達(dá)的任意抗體分子的分子組合。所述抗體分子組合物包含至少一種抗體分子。所述抗體分子組合物包含抗體分子的至少一種糖形。所述抗體分子的糖形是指攜帶特定糖基化或相差至少一個(gè)糖構(gòu)造塊的糖鏈的抗體分子，例如、但不限于，另一半乳糖，唾液酸，bisecGlcNAc，巖藻糖，或另一種糖修飾，例如、但不限于，來(lái)自相同蛋白分子的另一種糖形的乙?；騭ulfatation。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體分子組合物可以包含在宿主細(xì)胞中表達(dá)的超過(guò)一種抗體分子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體分子組合物包含更多百分比的這種糖形的抗體分子，當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，它們介導(dǎo)比從細(xì)胞系CHO、或C陽(yáng)hfr-、或BHK、或NSO、或SP2/0、或PerC.6或小鼠雜交瘤中的至少一種、優(yōu)選CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]得到的相同抗體分子的抗體分子組合物更高的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和/或提高的結(jié)合。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體分子組合物包含更多百分比的這種糖形的抗體分子，當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，它們介導(dǎo)比從細(xì)胞系CHO、或CHOdhfr-、或BHK、或NSO、或SP2/0、或PerC.6或小鼠雜交瘤中的至少一種、優(yōu)選CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]得到的相同抗體分子的抗體分子組合物更高的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和/或提高的結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞，，或等價(jià)描述是指人骨髓白血病起源的任意細(xì)胞或細(xì)胞系，或可以從白血病患者得到的任意人骨髓細(xì)胞或骨髓前體細(xì)胞或細(xì)胞系，或可以從人供體得到的任意骨髓細(xì)胞或骨髓前體細(xì)胞或細(xì)胞系，或從任一種所述宿主細(xì)胞衍生的細(xì)胞或細(xì)胞系，或包含前述這些細(xì)胞中的至少一種的細(xì)胞或細(xì)胞系的混合物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的所述人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞或所述永生化人血細(xì)胞也包含通過(guò)融合至少一種前述宿主細(xì)胞、尤其骨髓白血病起源的那些宿主細(xì)胞與人或動(dòng)物起源的另一種細(xì)胞(例如、但不限于，B細(xì)胞，CHO細(xì)胞)得到的這樣的細(xì)胞或細(xì)胞系。本領(lǐng)域技術(shù)人員能鑒別和使用合適的來(lái)源和方法得到、建立來(lái)自人的合適的細(xì)胞和細(xì)胞系和/或使其永生化，用作人骨髓白血病起源的合適的宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)源自所述宿主細(xì)胞的細(xì)胞或細(xì)胞系是指，經(jīng)過(guò)或不經(jīng)過(guò)所述骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞的預(yù)先突變或基因工程，通過(guò)任意培養(yǎng)和克隆方式可以得到的任意細(xì)胞或細(xì)胞系，且包含選擇具有希望的性質(zhì)的那些源自所述宿主細(xì)胞的細(xì)胞或細(xì)胞系。所述培養(yǎng)和克隆是基于下述事實(shí)，即通過(guò)多輪細(xì)胞的傳代和克隆，優(yōu)選使用單細(xì)胞克隆方法，例如有限稀釋或基于細(xì)胞分類(lèi)的流式細(xì)胞術(shù)，可以從原代細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞培養(yǎng)物和甚至細(xì)胞克隆培養(yǎng)物得到具有不同性質(zhì)的細(xì)胞克隆。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)結(jié)合凝集素或結(jié)合糖的抗體，選擇所述源自所述宿主細(xì)胞的細(xì)胞或細(xì)胞系。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的處理，使用物理的、化學(xué)的或生物的誘變劑，例如、但不限于，輻射、烷化劑或EMS(甲磺酸乙酯)、蛋白例如凝集素或病毒顆粒，可以進(jìn)行所述突變。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如通過(guò)位點(diǎn)特異性的同源重組敲除基因，使用轉(zhuǎn)座子，位點(diǎn)特異性的誘變，某些核酸的轉(zhuǎn)染，或基因沉默，或基因產(chǎn)物，可以進(jìn)行所述基因工程。所述培養(yǎng)和克隆的方法、所述突變和誘變?cè)退龌蚬こ淌潜绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的，一些實(shí)例詳細(xì)描述在WO2005/017130A2，US2003/0115614Al，或如本文所述。本領(lǐng)域技術(shù)人員能選擇和/或采取和/或修改合適的方法或建立從所述本發(fā)明的宿主細(xì)胞衍生的合適細(xì)胞或細(xì)胞系的方法的組合。根據(jù)與它們的母細(xì)胞或細(xì)胞系相比有利的下述細(xì)胞性質(zhì)，選擇所述源自所述宿主細(xì)胞的細(xì)胞或細(xì)胞系例如、但不限于，更短的倍增時(shí)間，更快的生長(zhǎng)，在更高密度下生長(zhǎng)的可能性，產(chǎn)量更高，能在無(wú)血清條件下和/或在無(wú)蛋白培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，更高的克隆效率，更高的DNA轉(zhuǎn)染效率，更高的抗體分子組合物表達(dá)速率，在其中表達(dá)的抗體分子組合物的更高的活性，在其中表達(dá)的抗體分子組合物的更高的同質(zhì)性，和/或更高的放大穩(wěn)健性。選擇具有有利性質(zhì)的那些細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或如本文所述。本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的宿主細(xì)胞的方法，其包含(a)與凝集素或抗體一起溫育人骨髓白血病細(xì)胞，所述凝集素或抗體識(shí)別去唾液酸化的表位或缺少唾液酸的表位，但是結(jié)合無(wú)唾液酸化形式的或顯著更少的唾液酸化形式的表位，和(b)分離結(jié)合到所述凝集素或抗體上的細(xì)胞，和(c)培養(yǎng)分離的細(xì)胞合適時(shí)間，和(d)選擇強(qiáng)烈結(jié)合凝集素或抗體的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞克隆，所述凝集素或抗體結(jié)合具有唾液酸的表位。更優(yōu)選的是如上所述的方法，其中凝集素或所述識(shí)別去唾液酸化的表位或缺少唾液酸的表位的抗體是Nemod-TFl，Nemod-TF2，A78-G/A7,或PNA，且其中所述人骨髓白血病細(xì)胞是細(xì)胞系K562,KG-1，MUTZ-3，NM-F9[,ACC2606]、NM-D4[羅ACC2605]、醒-H9，H9，NM-HIO。制備具有高唾液酸化和有利的生物技術(shù)性質(zhì)(例如快速的細(xì)胞生長(zhǎng))的本發(fā)明的宿主細(xì)胞的方法包含，(i)與凝集素或優(yōu)選的抗體一起溫育作為起始細(xì)胞的本發(fā)明的人骨髓白血病細(xì)胞，優(yōu)選K562，所述凝集素或優(yōu)選的抗體識(shí)別去唾液酸化的表位或缺少唾液酸的表位，但是結(jié)合非唾液酸化形式的或顯著更少的唾液酸化形式的表位，例如、但不限于，Nemod-TF1，Nemod-TF2，A78-G/A7，或PNA(來(lái)自落花生的凝集素，花生凝集素)，優(yōu)選是結(jié)合到磁珠上的，和(ii)分離結(jié)合到所述凝集素或抗體上的細(xì)胞，和(iii)培養(yǎng)分離的細(xì)胞合適時(shí)間，和(iv)選擇強(qiáng)烈結(jié)合凝集素或抗體的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞克隆，優(yōu)選在單細(xì)胞克隆后，所述凝集素或抗體結(jié)合具有唾液酸的表位，例如SNA(紫云接骨木凝集素)或MAL(檫槐凝集素)，MALI(懷槐凝集素1)，優(yōu)選SNA。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備具有高唾液酸化和有利的生物技術(shù)性質(zhì)(例如快速的細(xì)胞生長(zhǎng))的本發(fā)明的宿主細(xì)胞的方法，其包含(i)與結(jié)合到磁珠上的Nemod-TFl、Nemod-TF2、A78-G/A7或PNA—起溫育K562，和(ii)分離結(jié)合到所述凝集素或抗體上的細(xì)胞，和(iii)培養(yǎng)分離的細(xì)胞合適時(shí)間約1-6周，和(iv)在單細(xì)胞克隆后，選擇強(qiáng)烈結(jié)合SNA的細(xì)胞克隆。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，那些細(xì)胞結(jié)合SNA比起始細(xì)胞更強(qiáng)烈，在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，它們比起始細(xì)胞生長(zhǎng)得更快。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在步驟U)之前，用曱磺酸乙酯處理起始細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員能選擇合適的條件和方法，并優(yōu)化它們，以便制備本發(fā)明的這些宿主細(xì)胞。在W02005/017130A2和W02005/080585Al中，可以發(fā)現(xiàn)一些步驟的更多細(xì)節(jié)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，將永生化的人血細(xì)胞用作宿主細(xì)胞，它們選自下述組1-4:(a)組l，其包含具有高唾液酸化活性的宿主細(xì)胞，例如K562;(b)組2，其包含因?yàn)檫z傳缺陷或表達(dá)抑制措施(例如RNAi)而具有低或無(wú)唾液酸化活性的宿主細(xì)胞，包括NM-F9[DSMACC2606],NM-D4[DSMACC2605]和GTX-2;(c)組3，其包含具有比K562更高唾液酸化程度的宿主細(xì)胞，例如NM-H9和NM-H9D8;(d)組4，其包含具有低或甚至無(wú)巖藻糖基化活性的宿主細(xì)胞，例如NM-H9D8-E6和NMH9D8-E6Q12。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述制備的細(xì)胞系是NM-H9D8。選擇NM-H9D8作為通過(guò)上述方法制備的最優(yōu)選的細(xì)胞克隆，由GlycotopeGmbH，Robert-R6ssle-Str.10，13125Berlin(Germany)于2006年9月15曰在讓ACC2806下保藏在Braunschweig(Germany)的"DSMZ-DeutscheSammlungvonMikroorganUmenundZellkulturenGmbH"。如下選擇其它細(xì)胞克隆例如NM-E-2F9,NM-C-2F5，或NM-H9D8-E6(DSMACC2807):在使用流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞分類(lèi)單個(gè)細(xì)胞克隆后，用一種或多種凝集素溫育母細(xì)胞，由此進(jìn)行陽(yáng)性選擇操作或陰性和陽(yáng)性選擇的組合。為了得到具有穩(wěn)定特征的細(xì)胞克隆，通過(guò)如上所述的有限稀釋?zhuān)瑢⒌玫降募?xì)胞克隆重新克隆至少一次。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述永生化人血細(xì)胞(它優(yōu)選是骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞)在無(wú)血清條件下生長(zhǎng)和生成本發(fā)明的蛋白/抗體分子組合物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述永生化人血細(xì)胞(它優(yōu)選是骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞)在無(wú)血清條件下生長(zhǎng)。此外，也可以將編碼蛋白/抗體分子的核酸引入這些細(xì)胞，也可以在無(wú)血清條件下分離蛋白/抗體分子組合物。當(dāng)制備治療性蛋白時(shí)，能在無(wú)血清條件下工作是特別重要的，因?yàn)檠逦廴驹谶^(guò)程控制中是不可接受的。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞是細(xì)胞或細(xì)胞系K562,KG1，MUTZ-3，NM-F9[DSMACC2606]，NM-D4[DSMACC2605]，或從任一種所述宿主細(xì)胞衍生的細(xì)胞或細(xì)胞系，或包含前述這些細(xì)胞中的至少一種的細(xì)胞或細(xì)胞系的混合物。宿主細(xì)胞優(yōu)選地選自:NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、NM-E-2F9NM-C-2F5，賜-H9D8[DSMACC2806]，或服-H9D8-E6DSMACC2807，45或NMH9D8-E6Q12(DSMACC2856)，GT-2X(保藏號(hào)DSMACC____________，由GlycotopeGmbH，Robert-R(issle-Str.10，13125Berlin(Germany)于2007年9月7日保藏在"DSMZ-DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH"inBraunschweig(Germany))或從這些細(xì)胞系中的任一種衍生的細(xì)胞或細(xì)胞系。細(xì)胞NM-F9[DSMACC2606]和NM-D4[DSMACC2605]由NemodBiotherapeuticsGmbH&Co.KG，Robert-FUissle-Str.10，13125Berlin,Germany保藏，其授斥又申請(qǐng)人提及本文所述的保藏的生物材料。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞是細(xì)胞或細(xì)胞系K562，NM-F9[DSMACC2606]，NM-D4[DSMACC2605]，或從任一種所述宿主細(xì)胞衍生的細(xì)胞或細(xì)胞系。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞是細(xì)胞或細(xì)胞系K562,例如K562[ATCCCCL-243]，或源自所述宿主細(xì)胞的細(xì)胞或細(xì)胞系。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞是細(xì)胞或細(xì)胞系K562，NM-F9[DSMACC2606]，NM-D4[DSMACC2605]，NM-B-2F9，NM-C-2F5，NM-H9D8，或醒-H9D8-E6，或GT-2X，或NMH9D8-E6Q12或從任一種所述宿主細(xì)胞衍生的細(xì)胞或細(xì)胞系。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞是一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞系K562,NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、NM-E-2F9，NM-C-2F5,NM-H9D8，或NM-H9D8-E6，或GT-2X，或醒H9D8-E6Q12，其在無(wú)血清條件下生長(zhǎng)和生成本發(fā)明的抗體分子組合物，更優(yōu)選地在下文中，一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞系在無(wú)血清條件下生長(zhǎng)，可以將編碼抗體分子的核酸引入這些細(xì)胞，并在無(wú)血清條件下分離抗體分子組合物。在本發(fā)明的最優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞是一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞系NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、NM-E-2F9，NM-C-2F5，NM-H9D8，GT-2X,或NM-H9D8-E6，或NMM9D8-E6Q12，其在無(wú)血清條件下生長(zhǎng)和生成本發(fā)明的抗體分子組合物，最優(yōu)選地在下文中，一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞系在無(wú)血清條件下生長(zhǎng)，可以將編碼抗體分子的核酸引入這些細(xì)胞，并在無(wú)血清條件下分離抗體分子組合物。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，永生化人血細(xì)胞和人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞不是下述之一唾液酸化缺陷型細(xì)胞系NM-F9和NM-D4，或從具有相同性質(zhì)的任一種所述宿主細(xì)胞衍生的細(xì)胞或細(xì)胞系。在以高唾液酸化程度為目的的情況下，該實(shí)施方案是有益的。對(duì)于這些實(shí)施方案，宿主細(xì)JI包優(yōu)選地選自K562，NMH9D8，NMH9D8-E6，NMH9D8-E6Q12和從任一種這些宿主細(xì)胞衍生的宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系，與本發(fā)明一起相關(guān)的細(xì)胞系具有14-24小時(shí)的倍增時(shí)間，這與其它哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)相比非常快。此外，不知道用于在人細(xì)胞系中高產(chǎn)量抗體表達(dá)的普遍合適的高表達(dá)載體系統(tǒng)，因?yàn)槿思?xì)胞通常不會(huì)缺少DHFR基因，因此不允許使用dhfr/曱氨蝶呤擴(kuò)增系統(tǒng)。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，提供了一個(gè)實(shí)施方案，它允許增加產(chǎn)物產(chǎn)量。根據(jù)該實(shí)施方案，另外將編碼抗葉酸劑抗性的DHFR-變體的核酸引入宿主細(xì)胞。二氫葉酸還原酶或DHFR會(huì)將二氫葉酸還原成四氫葉鹽，使用NADPH作為電子供體，其可以轉(zhuǎn)化成在1-碳轉(zhuǎn)移化學(xué)中使用的四氫葉酸輔因子類(lèi)型?？谷~酸劑會(huì)抑制DHFR酶，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。為了提供編碼抗葉酸劑抗性的DHFR變體的核酸，提供了一種工具來(lái)選擇被核酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，此外，允許核酸的擴(kuò)增在宿主細(xì)胞中表達(dá)。例如通過(guò)單獨(dú)的載體，而不是編碼要表達(dá)的蛋白/抗體的核酸，可以在宿主細(xì)胞中引入編碼所述抗葉酸劑抗性的DHFR-變體的核酸。優(yōu)選地，與包含編碼蛋白/抗體的核酸的載體基本上同時(shí)，用編碼抗葉酸劑抗性的DHFR-變體的載體轉(zhuǎn)染。該實(shí)施方案支持將編碼要表達(dá)的所述蛋白/抗體的核酸整合入宿主細(xì)胞的基因組中，其在與編碼抗葉酸劑抗性的DHFR-變體的核酸處于相同的遺傳位點(diǎn)，在希望擴(kuò)增編碼所述蛋白/抗體的核酸的情況下，這是有益的?；蛘?，可以使用載體系統(tǒng)，其包含編碼要表達(dá)的所述蛋白的至少一部分的核酸，以及編碼抗葉酸劑抗性的DHFR-變體的核酸。然后用所述抗葉酸劑培養(yǎng)宿主細(xì)胞。其效果是，盡管存在抗葉酸劑，用編碼所述抗葉酸劑抗性的DHFR-變體的核酸成功轉(zhuǎn)染的那些宿主細(xì)胞可以生長(zhǎng)。由此可以選擇成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，通過(guò)逐步增加培養(yǎng)物中的抗葉酸劑濃度，擴(kuò)增編碼所述蛋白/抗體的至少一部分的核酸序列。培養(yǎng)基中抗葉酸劑濃度的增加，會(huì)導(dǎo)致基因組中抗葉酸劑抗性的DHFR-變體的拷貝數(shù)的增加。假定這通過(guò)細(xì)胞中的重組事件來(lái)實(shí)現(xiàn)。由此，如果編碼所述蛋白的核酸位于基因組中抗葉酸劑抗性的DHFR變體附近，也可以增加編碼要表達(dá)的蛋白的至少一部分的核酸的拷貝數(shù)，這可以通過(guò)同時(shí)轉(zhuǎn)染單獨(dú)分開(kāi)的載體或通過(guò)使用包含兩個(gè)核酸序列的單個(gè)載體來(lái)促成。通過(guò)該機(jī)理，得到以更高產(chǎn)量表達(dá)蛋白/抗體的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，所述抗葉酸劑是甲氨蝶呤。優(yōu)選地通過(guò)用至少2個(gè)連續(xù)輪回的抗葉酸劑、優(yōu)選甲氨蝶呤(其中所述抗葉酸劑、優(yōu)選甲氨蝶呤的濃度在每個(gè)連續(xù)輪回中增加至少100%)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，擴(kuò)增編碼所述蛋白、優(yōu)選抗體分子或其一部分的核酸序列。適用于提供所述抗葉酸劑抗性的DHFR-變體的核酸會(huì)編碼序列IDNo.1至9的多肽，優(yōu)選序列IDNo1。在下面也進(jìn)一步詳細(xì)描述了該擴(kuò)增系統(tǒng)的其它細(xì)節(jié)和實(shí)施方案。本發(fā)明也提供了生產(chǎn)蛋白、優(yōu)選抗體分子組合物的方法，其包含:(a)在人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞中引入編碼蛋白、優(yōu)選抗體分子或其至少一部分的至少一種核酸，和包含編碼序列#1至序列#9、優(yōu)選序列#1的至少一種多肽的至少一種核酸序列的至少一種核酸；和(b)通過(guò)用甲氨蝶呤培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，優(yōu)選通過(guò)用至少2個(gè)連續(xù)輪回的甲氨蝶呤培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，從而使甲氨蝶呤的濃度在每個(gè)連續(xù)輪回中優(yōu)選增加至少約50°/。、更優(yōu)選至少約100%,擴(kuò)增編碼所述蛋白、優(yōu)選抗體分子或其至少一部分的核酸序列；和(c)在允許生產(chǎn)所述蛋白組合物、優(yōu)選抗體分子組合物的條件下，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，和(d)分離所述蛋白，它優(yōu)選是抗體分子組合物。本發(fā)明也提供了生產(chǎn)具有增加的活性和/或增加的產(chǎn)量和/或提高的同質(zhì)性的蛋白組合物、優(yōu)選抗體分子組合物的方法，其包含(a)在人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞中引入編碼蛋白、優(yōu)選抗體分子或其至少一部分的至少一種核酸；和(b)在允許生成所述蛋白組合物、優(yōu)選抗體分子組合物的條件下，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；和(c)分離所述蛋白組合物，其優(yōu)選地是具有增加的活性和/或增加的產(chǎn)量和/或提高的同質(zhì)性的抗體分子組合物。此外，本發(fā)明提供了生產(chǎn)具有增加的活性和/或增加的產(chǎn)量和/或提高的同質(zhì)性的蛋白組合物、優(yōu)選抗體分子組合物的方法，其包含(a)在人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞中引入編碼蛋白、優(yōu)選抗體分子或其至少一部分的至少一種核酸，和包含編碼序列#1至序列#9、優(yōu)選序列#1的至少一種多肽的至少一種核酸序列的至少一種核酸；和(b)通過(guò)用甲氨蝶呤培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，優(yōu)選通過(guò)用至少2個(gè)連續(xù)輪回的甲氨蝶呤培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，從而使甲氨蝶呤的濃度在每個(gè)連續(xù)輪回中優(yōu)選增加至少約50%、更優(yōu)選至少約100%，擴(kuò)增編碼所述抗體分子或其至少一部分的核酸序列；和(c)在允許生產(chǎn)所述蛋白組合物、優(yōu)選抗體分子組合物的條件下，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；和(d)分離所述蛋白組合物，它優(yōu)選是具有增加的活性和/或增加的產(chǎn)量和/或提高的同質(zhì)性的抗體分子組合物。所述編碼抗體分子或其至少一部分的核酸和所述包含編碼序列#1至序列#9、優(yōu)選序列#1的至少一種多肽的至少一種核酸序列的核酸可以是一個(gè)核酸或2個(gè)分開(kāi)的核酸。為了選擇適用于得到具有優(yōu)化的糖基化特征的蛋白的宿主細(xì)胞，49有利地進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的篩選/選擇方法。通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的選擇方法確定合適的宿主細(xì)胞后，然后將所述宿主細(xì)胞用于生產(chǎn)權(quán)利要求1-20中定義的蛋白。因此，本發(fā)明也提供了選擇宿主細(xì)胞的方法，所述宿主細(xì)胞用于生產(chǎn)具有至少一種下述糖基化特征的蛋白(i)它不含有可檢測(cè)的NeuGc;和/或(ii)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，它在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上具有增加的半乳糖基化程度；和/或(iii)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，它在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白分子組合物中所述蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上具有增加至少5%的量的G2結(jié)構(gòu)；和/或(iv)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，它在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白分子組合物中所述蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上具有降低至少5%的量的GO結(jié)構(gòu)；和/或(v)它不含有可檢測(cè)的末端Galal-3Gal;和/或(vi)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，它在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白分子組合物中所述蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上包含降低至少5%的量的巖藻糖；(vii)它包含至少一個(gè)含有二等分GlcNAc的糖結(jié)構(gòu)；和/或(viii)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，它具有與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物的唾液酸化模式相比改變的唾液酸化模式；所述方法包含下述步驟(a)在作為宿主細(xì)胞的至少2種不同的永生化人血細(xì)胞中引入至少一種核酸，其編碼蛋白或其至少一部分；和(b)培養(yǎng)所述至少2種不同的宿主細(xì)胞，其中每種不同的宿主細(xì)胞生成具有與其它宿主細(xì)胞生成的糖基化模式不同的糖基化模式的蛋白組合物；(c)從所述至少2種不同的宿主細(xì)胞分離所述表達(dá)的具有不同糖基化模式的蛋白組合物；和(d)選擇生產(chǎn)蛋白組合物的所述宿主細(xì)胞，所述蛋白組合物具有在(i)至(viii)中定義的至少一種糖基化特征。關(guān)于糖基化模式和適用于得到所述模式的細(xì)胞系的細(xì)節(jié)如上所述，該細(xì)節(jié)也可應(yīng)用于或適用于選擇根據(jù)本發(fā)明的合適宿主細(xì)胞的篩選方法。在建立權(quán)利要求1-20所述的生產(chǎn)方法之前執(zhí)行各個(gè)篩選步驟是有利的，因?yàn)樵搶?shí)施方案允許選擇最適用于生產(chǎn)具有優(yōu)化的糖基化模式的蛋白/抗體分子組合物的宿主細(xì)胞。根據(jù)該篩選系統(tǒng)的基本構(gòu)思，在具有不同糖基化模式的至少2種不同的細(xì)胞系中表達(dá)目標(biāo)蛋白。例如，一種細(xì)胞系可以具有高唾液酸化程度，另一種可以具有低唾液酸化(或巖藻糖基化和/或半乳糖基化)程度或甚至未知的糖基化特征。從然后可以測(cè)定在不同細(xì)胞系中生產(chǎn)的蛋白的特征，例如關(guān)于它們的活性(例如抗體的ADCC和CDC),親和力，血清半衰期和其它重要特征。結(jié)果允許選擇具有最好糖基化機(jī)理的細(xì)胞系，以便得到在它的糖基化^=莫式方面優(yōu)化的蛋白。隨著明確特征(例如親和力，血清半衰期等)的變化，該方法是特別有利的。優(yōu)選地，要生產(chǎn)的所述蛋白具有至少一種下述特征(a)在它是抗體分子組合物的情況下，當(dāng)細(xì)胞系CH0dhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，它具有比來(lái)自相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性高至少2倍的增加的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性；和/或(b)在它是抗體分子組合物的情況下，當(dāng)在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，它具有比來(lái)自相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物的結(jié)合高至少50%的增加的抗原介導(dǎo)的或Fc-介導(dǎo)的結(jié)合；和/或(c)當(dāng)在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，它具有比來(lái)自相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物的產(chǎn)量高至少10%的增加的所述蛋白分子組合物的平均或最大產(chǎn)量。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，至少一種所述宿主細(xì)胞是永生化的人血細(xì)胞，優(yōu)選人骨髓白血病起源的細(xì)胞，例如K562，NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、NM-E-2F9，NM-C-2F5，NM-H9D8，NM-H9D8-E6，NM-H9D8-E6Q12，GT-2X或源自它們的細(xì)胞或細(xì)胞系。所述至少一種人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞可以選自下述組1-4之一(a)組1，其包含具有高唾液酸化活性的宿主細(xì)胞例如K562或從其4汙生的細(xì)胞或細(xì)l包系，(b)組2，其包含由于遺傳缺陷或表達(dá)抑制措施(例如RNAi)而具有低或無(wú)唾液酸化的宿主細(xì)胞，例如NM-F9[DSMACC2606],NM-D4[DSMACC2605]和GTX-2或從其衍生的細(xì)胞或細(xì)胞系，(c)組3，其包含具有比K562更高唾液酸化程度的宿主細(xì)胞例如NM-H9和NM-H9D8或從其4汙生的細(xì)月包或細(xì)胞系，(d)組4，其包含具有低或無(wú)巖藻糖基化活性的宿主細(xì)胞，例如NM-H9D8-E6或從其衍生的細(xì)胞或細(xì)月包系。優(yōu)選地，在篩選過(guò)程中使用的至少2種或3種宿主細(xì)胞選自上述組。但是，在根據(jù)本發(fā)明的篩選系統(tǒng)中也可以包含源自另一種起源的其它宿主細(xì)胞(例如Hek293細(xì)胞)，以便進(jìn)一步拓寬分析的不同糖基化模式。得到的宿主細(xì)胞優(yōu)選地生產(chǎn)具有至少一種表9所示的糖基化模式的蛋白、尤其抗體。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)引入核酸是指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的將一種核酸、或兩種或多種核酸引入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的任意方法，例如、但不限于，電穿孔，使用陽(yáng)離子脂質(zhì)的轉(zhuǎn)染，磷酸鉤，DEAE-葡聚糖，或通過(guò)病毒粒子(例如腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒)或其組合的感染。本領(lǐng)域技術(shù)人員能選擇和優(yōu)化用于引入本發(fā)明的一種或多種核酸的合適的方法。根據(jù)本發(fā)明，編碼抗體分子的核酸是編碼抗體分子或其至少一部分的任意核酸。本發(fā)明的抗體分子因此可以由單個(gè)或多個(gè)核酸分子編碼。所述由所述核酸編碼的抗體分子部分包含抗體分子或該抗體分子的恒定和/或可變域的至少一個(gè)20氨基酸序列、更優(yōu)選至少100個(gè)氨基酸。包含的編碼抗體分子或其至少一部分的序列可以被至少一個(gè)其它序列(例如內(nèi)含子)隔開(kāi)。域的序列可以包含至少一個(gè)氨基酸突變。根據(jù)本發(fā)明，編碼蛋白分子的核酸是編碼蛋白分子或其至少一部分的任意核酸。本發(fā)明的蛋白分子因此可以由單個(gè)或多個(gè)核酸分子編碼。編碼蛋白分子或其至少一部分的序列可以被至少一個(gè)其它序列(例如內(nèi)含子)隔開(kāi)。蛋白分子的序列可以包含至少一個(gè)氨基酸突變。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼抗體分子或其至少一部分的核酸包舍抗體分子的至少一個(gè)可變域和/或至少一個(gè)恒定域、更優(yōu)選二者，更優(yōu)選至少在恒定域部分或多個(gè)域中包含人序列的那些，更優(yōu)選包含人CY2域的那些，最優(yōu)選包含某些類(lèi)別或子類(lèi)的人抗體的Fc區(qū)域的所有恒定域和可變域。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，蛋白、尤其抗體分子是由單個(gè)核酸編碼。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，蛋白、尤其抗體分子由2個(gè)核酸或3個(gè)核酸編碼。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，一個(gè)核酸編碼抗體分子的一個(gè)部分，其編碼輕鏈的可變域和/或恒定域，另一個(gè)核酸編碼抗體分子的另一個(gè)部分，其編碼重鏈的可變域和/或至少一個(gè)恒定域。根據(jù)本發(fā)明，包含編碼序列#1至序列#9的至少一種多肽的至少一種核酸序列的核酸是指,所述核酸編碼序列#1至序列#9、優(yōu)選序列并1的至少一種多肽。這些序列的任意數(shù)目是合適的，只要它可以成功地引入本發(fā)明的宿主細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸編碼序列#1至序列#9的一種、兩種或三種多肽，更優(yōu)選編碼一種多肽，和最優(yōu)選編碼序列#1的多肽。在本發(fā)明中，所述核酸也可以編碼序列#1至序列#9、優(yōu)選序列#1的多肽，其具有至少一個(gè)氨基酸突變，只要該突變?cè)试S通過(guò)如本文別處所述的甲氨蝶呤擴(kuò)增編碼抗體分子或其至少一部分的核酸。編碼序列#1至序列#9、優(yōu)選序列#1的至少一種多肽的核酸序列，可以是與編碼本文別處所述的抗體分子或其至少一部分的核酸相同的核酸分子的部分，或在分開(kāi)的核酸分子上。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，包含編碼選自序列#1至序列#9的序列、最優(yōu)選序列#1的核酸序列的分開(kāi)的核酸，可以與編碼本發(fā)明的抗體分子或其部分的核酸分開(kāi)地引入本發(fā)明的宿主細(xì)胞中。這可以如下實(shí)現(xiàn)在引入編碼本發(fā)明的抗體分子或其部分的核酸之前、之后或同時(shí)，引入所述包含編碼選自序列#1至序列#9的序列的核酸序列的分開(kāi)的核酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這平行地進(jìn)行，在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞已經(jīng)包含含有所述編碼選自序列#1至序列#9的序列、最優(yōu)選序列#1的核酸序列的分開(kāi)的核酸。其它優(yōu)選的實(shí)施方案如實(shí)施例所述。可以如本文別處和實(shí)施例所述，使用甲氨蝶呤擴(kuò)增穩(wěn)定引入的所述核酸或編碼所述蛋白(優(yōu)選地是抗體分子或其一部分)的所述核酸的幾個(gè)拷貝。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼蛋白(優(yōu)選地是抗體分子或其至少一部分)的核酸包含至少一個(gè)其它的遺傳元件,其允許選擇其中已經(jīng)成功引入核酸的那些細(xì)胞，例如、但不限于，抗生素抗性基因，例如、但不限于，編碼嘌呤霉素或新霉素抗性的遺傳元件。此外，這些核酸包含一個(gè)或多個(gè)用于在本發(fā)明的宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體分子的遺傳元件，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、多腺苷酸化位點(diǎn)和/或內(nèi)含子，和其它遺傳元件，例如細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子和用于選擇轉(zhuǎn)染的細(xì)菌的元件，例如用于在細(xì)菌中倍增核酸的抗生素抗性基因。54合適的啟動(dòng)子包括巨細(xì)胞病毒(CMV)的IE(立即早期)基因的啟動(dòng)子，SV40早期啟動(dòng)子，逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動(dòng)子，金屬硫蛋白啟動(dòng)子，熱休克啟動(dòng)子，SRct啟動(dòng)子，EF-la啟動(dòng)子，等。人CMV的IE基因的增強(qiáng)子可以與啟動(dòng)子組合使用。這些和其它遺傳元件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇、組合、優(yōu)化和引入所述編碼蛋白(它優(yōu)選是抗體分子或其至少一部分)的核酸中。在本文和實(shí)施例中描述了所述編碼蛋白(它優(yōu)選是抗體分子或其至少一部分)的核酸或所述核酸的組合的優(yōu)選實(shí)施方案以及使用和組合的優(yōu)選遺傳元件，但是，本發(fā)明不限于這些應(yīng)用，且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員組合或進(jìn)一步優(yōu)化。本領(lǐng)域技術(shù)人員能選擇和/或組合合適的遺傳元件、構(gòu)建的相應(yīng)的核酸載體或元件，以將本發(fā)明的一種或多種核酸引入根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系中。所述核酸或編碼蛋白(它優(yōu)選是抗體分子或其至少一部分)的核酸組合，以及所述其它遺傳元件，以及引入它們的方法，例如將它們轉(zhuǎn)染進(jìn)本發(fā)明的宿主細(xì)胞中來(lái)表達(dá)抗體分子組合物，或轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)菌來(lái)倍增，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，而且構(gòu)建、鑒別、測(cè)試、優(yōu)化、選擇和組合這些核酸的方法，將它們與用于選擇成功轉(zhuǎn)染的那些細(xì)胞的其它合適序列組合的方法，以及構(gòu)建、鑒別、測(cè)試和選擇最合適的編碼這些抗體分子的核酸的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在實(shí)施例中詳述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼蛋白(它優(yōu)選是抗體分子或其至少一部分)的核酸包含用于選擇其中成功引入核酸的本發(fā)明的那些宿主細(xì)胞的遺傳元件，例如、但不限于，新霉素或嘌呤霉素，更優(yōu)選它另外包含啟動(dòng)子例如EF-lot或CMV啟動(dòng)子、更優(yōu)選它另外包含CMV增強(qiáng)子、更優(yōu)選它另外包含允許選擇用核酸轉(zhuǎn)染的細(xì)菌的遺傳元件和用于復(fù)制的遺傳元件，例如所述核酸在細(xì)菌中倍增的ColEl復(fù)制起點(diǎn)，和更優(yōu)選地它另外包含所述核酸在COS細(xì)胞中倍增的遺傳元件，例如SV40起點(diǎn)。這些元件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇、組合、優(yōu)化和使用。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，上述的編碼蛋白分子或其至少一部分的核酸包含一個(gè)核酸序列。優(yōu)選地，所述編碼蛋白分子或其至少一部分的核酸另外編碼賦予噤呤霉素抗性或新霉素抗性的遺傳元件，或編碼至少一個(gè)選自序列#1至序列#9的序列、最優(yōu)選序列#1的核酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，上述編碼抗體分子或其至少一部分的核酸包含至少一個(gè)編碼抗體分子的重鏈和/或輕鏈的可變域和至少一個(gè)恒定域的序列。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，上述編碼抗體分子或其至少一部分的核酸包含至少一個(gè)編碼抗體分子輕鏈的可變域和恒定域的序列或編碼完整抗體分子重鏈的可變域和所有恒定域的序列。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，上述核酸之一編碼抗體分子的至少一個(gè)部分，其包含至少一個(gè)編碼抗體分子輕鏈的可變域和恒定域的序列，且上述核酸中的第二個(gè)編碼抗體分子的至少一個(gè)其它部分，其包含至少一個(gè)編碼抗體分子重鏈的可變域和和至少一個(gè)恒定域、優(yōu)選所有恒定域的序列，且兩個(gè)核酸引入同一個(gè)本發(fā)明的宿主細(xì)胞中。優(yōu)選地，所述核酸之一另外編碼賦予噪呤霉素抗性的遺傳元件，且另一個(gè)所述核酸另外編碼賦予新霉素抗性的遺傳元件。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，上述編碼蛋白分子或其至少一部分的核酸包含至少2個(gè)核酸序列，它們編碼蛋白分子或其至少一部分的2個(gè)氨基酸序列。優(yōu)選地，所述核酸之一另外編碼賦予嘌呤霉素抗性的遺傳元件，且另一個(gè)所述核酸另外編碼賦予新霉素抗性的遺傳元件。更優(yōu)選地，所述核酸之一另外編碼賦予嘌呤霉素或新霉素抗性、優(yōu)選嘌呤霉素抗性的遺傳元件，且另一個(gè)所述核酸另外包含編碼至少一個(gè)選自序列#1至序列#9、最優(yōu)選序列#1的序列的核酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，上述編碼蛋白分子或其至少一部分的包含3個(gè)核酸序列，它們編碼蛋白分子或其至少一部分的3個(gè)氨基酸序列。優(yōu)選地，所述核酸之一另外編碼賦予嘌呤霉素抗性的遺傳元件，另一個(gè)所述核酸另外編碼賦予新霉素抗性的遺傳元件，另一個(gè)所述核酸另外包含編碼至少一個(gè)選自序列#1至序列#9、最優(yōu)選序列#1的序列的核酸序列。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸之一另外編碼賦予嘌呤霉素或新霉素抗性的遺傳元件，另一個(gè)所述核酸另外包含編碼至少一個(gè)選自序列#1至序列#9、最優(yōu)選序列#1的序列的核酸序列。在一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸之一包含編碼輕鏈的可變域和恒定域的序列，且另外包含編碼至少一個(gè)選自序列#1至序列#9、最優(yōu)選序列#1的序列的核酸序列，另一個(gè)所述核酸包含編碼抗體分子重鏈的可變域和至少一個(gè)恒定域、優(yōu)選所有恒定域的序列，且另外包含編碼嘌呤霉素或新霉素抗性、優(yōu)選嘌呤霉素抗性的核酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述編碼抗體分子或其至少一部分的核酸包含至少一個(gè)編碼抗體分子輕鏈的可變域和恒定域的序列，和至少一個(gè)編碼抗體分子重鏈的可變域和至少一個(gè)恒定域、優(yōu)選所有恒定域的序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，由上面或別處所述的本發(fā)明的核酸編碼的恒定域是IgG或IgM(優(yōu)選人IgGl、IgG4或IgM)的人恒定域，或一個(gè)域或域組合，由此優(yōu)選地使用包含至少一個(gè)內(nèi)含子的基因組序列或源自基因組序列的序列，其可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇、構(gòu)建和優(yōu)化。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述編碼本發(fā)明的蛋白(它優(yōu)選是抗體分子或其至少一部分)的核酸另外包含EF-la啟動(dòng)子/CMV增強(qiáng)子或CMV啟動(dòng)子衍生的啟動(dòng)子，優(yōu)選CMV-E。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述編碼本發(fā)明的蛋白(它優(yōu)選是抗體分子或其至少一部分)的核酸另外包含分泌信號(hào)肽，優(yōu)選T細(xì)胞受體分泌信號(hào)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述編碼本發(fā)明的蛋白(它優(yōu)57選是抗體分子或其至少一部分)的核酸另外包含分泌信號(hào)肽，優(yōu)選序列#10。所述編碼蛋白(它優(yōu)選是抗體分子或其至少一部分)的核酸或核酸組合，以及所述其它遺傳元件，以及引入它們的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，而且構(gòu)建、鑒別、測(cè)試、優(yōu)化、選擇這些核酸和將它們與適用于選擇成功轉(zhuǎn)染的那些細(xì)胞的其它序列相組合的方法，以及構(gòu)建、鑒別、測(cè)試和選擇最合適的編碼這些抗體分子的核酸的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在實(shí)施例中詳述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。核酸的引入可以是暫時(shí)的或穩(wěn)定的。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"通過(guò)用抗葉酸劑、尤其甲氨蝶呤培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞來(lái)擴(kuò)增編碼蛋白或抗體分子或其至少一部分的核酸序列"是指，用至少一種抗葉酸劑、優(yōu)選曱氨蝶呤濃度引入和培養(yǎng)本文別處所述的本發(fā)明的宿主細(xì)胞，其中存在至少一種編碼要表達(dá)的蛋白、例如抗體分子或其至少一部分的核酸，和至少一種核酸，其包含至少一種編碼抗葉酸劑抗性的DHFR變體(優(yōu)選編碼序列#1至序列#9、優(yōu)選序列井1的至少一種多肽)的核酸序列。典型的培養(yǎng)時(shí)間是每輪l-2周，典型濃度是約20nM至3000nM，優(yōu)選約50nM至2000nM、更優(yōu)選約100nM至2000nM。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以?xún)?yōu)化抗葉酸劑/甲氨蝶呤擴(kuò)增處理的持續(xù)時(shí)間以及濃度和本發(fā)明的核酸的相應(yīng)載體，且也描述在實(shí)施例的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中。最佳擴(kuò)增條件可以隨編碼的不同的蛋白/抗體分子和前述不同的核酸或核酸構(gòu)建體或其組合的使用而異。本領(lǐng)域技術(shù)人員能選擇和優(yōu)化最合適的條件和本發(fā)明的核酸。所述擴(kuò)增導(dǎo)致與沒(méi)有抗葉酸劑/曱氨蝶呤培養(yǎng)相比和與沒(méi)有引入編碼至少一種抗葉酸劑抗性的DHFR變體(尤其序列#1至序列#9的多肽)的核酸序列相比更多的編碼蛋白/抗體分子或其至少一部分的核酸拷貝摻入宿主細(xì)胞基因組中，和/或?qū)е略黾拥牡鞍?抗體分子組合物生產(chǎn)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述用于擴(kuò)增編碼蛋白/抗體分子或其至少一部分的核酸(它們引入所述宿主細(xì)胞中，在所述宿主細(xì)胞中引入了至少一種核酸，后者包含至少一種編碼序列#1至序列#9、優(yōu)選序列#1的至少一種多肽的核酸序列，如本文別處所述，包括它的優(yōu)選實(shí)施方案)的宿主細(xì)胞是人骨髓白血病起源,優(yōu)選細(xì)胞或細(xì)胞系KG1，MUTZ-3，K562,NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、NM-E-2F9，NM-C-2F5，NM-H9D8，或NM-H9D8-E6，NM-H9D8-E6Q12，GT-2X或從任一種所述宿主細(xì)胞衍生的細(xì)胞或細(xì)胞系、更優(yōu)選細(xì)胞或細(xì)胞系K562，NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、NM-E-2F9，NM-C-2F5，NM-H9D8，或NM-H9D8-E6，NM-H9D8-E6Q12，GT-2X或從任一種所述宿主細(xì)胞衍生的細(xì)胞或細(xì)胞系、更優(yōu)選細(xì)胞或細(xì)胞系NM-F9[薩ACC2606]、NM-D4[廳ACC2605]、NM-E-2F9,NM-C-2F5,NM-H9D8，或NM-H9D8-E6，NM-H9D8-E6Q12，GT-2X或從任一種所述宿主細(xì)胞衍生的細(xì)月包或細(xì)J包系。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用至少2個(gè)連續(xù)輪回的抗葉酸劑/甲氨蝶呤培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，其中在每個(gè)連續(xù)輪回中抗葉酸劑/曱氨蝶呤的濃度優(yōu)選地增加了至少約50%、更優(yōu)選至少約100%。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用至少3個(gè)、更優(yōu)選4個(gè)、更優(yōu)選5個(gè)、更優(yōu)選6個(gè)連續(xù)輪回的抗葉酸劑/甲氨蝶呤培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，其中在每個(gè)連續(xù)輪回中抗葉酸劑/甲氨蝶呤的濃度優(yōu)選地增加了至少約50%、更優(yōu)選至少約100%。更優(yōu)選地，抗葉酸劑/甲氨蝶呤的濃度是約20nM至3000nM，更優(yōu)選約50nM至2000nM、更優(yōu)選約100nM至2000nM，更優(yōu)選約100nM，200nM，500nM，1000nM，2000nM，它們?cè)趦?yōu)選實(shí)施方案中從100nM開(kāi)始用于連續(xù)輪回中。令人驚奇地，編碼抗葉酸劑抗性的DHFR-變體和優(yōu)選序列#1至序列#9的至少一種多肽的核酸序列的引入，允許通過(guò)用抗葉酸劑/曱氨蝶呤培養(yǎng)，在本發(fā)明的人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞中、尤其在K562，NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605〗、NM-E-2F9，NM-C-2F5，NM-H9D8，或NM-H9D8-E6，NM-H9D8-E6Q12，GT-2X或從任一種所述宿一部分的核酸序列。5特別令人驚奇地，編碼至少一種序列#1的多肽的核酸序列的引入，允許通過(guò)用甲氨蝶呤培養(yǎng)，在本發(fā)明的宿主細(xì)胞中、尤其在K562，NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、NM-E-2F9，NM-C-2F5,NM-H9D8，或NM-H9D8-E6，NM-H9D8-E6Q12,GT-2X或從任一種所述宿主細(xì)胞衍生的細(xì)胞或細(xì)胞系中擴(kuò)增編碼所述抗體分子或其至少一部分的核酸序列。更令人驚奇地，編碼序列#1至序列#9的至少一種多肽的核酸序列的引入，允許通過(guò)用至少2個(gè)連續(xù)輪回的甲氨蝶呤(其中在每個(gè)連續(xù)輪回中，甲氨蝶呤的濃度增加至少約50%、更優(yōu)選至少約100%)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，在本發(fā)明的宿主細(xì)胞中、尤其在K562,NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、NM-E-2F9，NM-C-2F5，NM-H9D8，或NM-H9D8-E6，NM-H9D8-E6Q12，GT-2X或從任一種所述宿主細(xì)胞4汙生的細(xì)胞或細(xì)胞系中進(jìn)一步擴(kuò)增編碼所述抗體分子或其至少一部分的核酸序列。更令人驚奇地，編碼至少一種序列#1的多肽的核酸序列的引入，允許通過(guò)用至少2個(gè)連續(xù)輪回的甲氨蝶呤(其中在每個(gè)連續(xù)輪回中，曱氨蝶呤的濃度增加至少約50%、更優(yōu)選至少約100%)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，在本發(fā)明的宿主細(xì)胞中、尤其在K562,NM-F9[DSMACC2606〗、NM-D4[DSMACC2605]、NM-E-2F9,NM-C-2F5，NM-H9D8，或NM-H9D8-E6，NM-H9D8-E6Q12，GT-2X或從任一種所述宿主細(xì)胞衍生的細(xì)胞或細(xì)胞系中進(jìn)一步擴(kuò)增編碼所述抗體分子或其至少一部分的核酸序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增是穩(wěn)定的，，是指，經(jīng)過(guò)至少35代的宿主細(xì)胞分裂周期，導(dǎo)致抗體分子組合物的高產(chǎn)量生產(chǎn)。使用甲氨蝶呤，可以如上面和實(shí)施例所述擴(kuò)增編碼蛋白/抗體分子或其一部分的穩(wěn)定引入的所述核酸。其它優(yōu)選實(shí)施方案如實(shí)施例所述。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，優(yōu)選地在至少一輪單細(xì)胞克隆使用含有引入的本發(fā)明核酸的本發(fā)明的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，在至少一輪本文別處所述的曱氨蝶呤擴(kuò)增后，進(jìn)行所述單細(xì)胞克隆和用所述蛋白/抗體組合物的適當(dāng)表達(dá)和分泌選擇那些細(xì)胞克隆。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)至少一個(gè)額外的甲氨蝶呤擴(kuò)增輪回，優(yōu)選用遞增濃度的曱氨蝶呤，優(yōu)選至少約兩個(gè)濃度的甲氨蝶呤，進(jìn)一步擴(kuò)增所述細(xì)胞克隆，更優(yōu)選地隨后進(jìn)行另一輪單細(xì)胞克隆和用所述蛋白/抗體組合物的適當(dāng)表達(dá)和分泌選擇那些細(xì)胞克隆。使用這些優(yōu)選實(shí)施方案，可以選擇具有特別高表達(dá)產(chǎn)量的細(xì)胞克隆。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"在允許生成所述抗體分子組合物或各種蛋白制劑的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，，通常是指，在允許以蛋白/抗體分子組合物形式表達(dá)蛋白/抗體分子、優(yōu)選分泌進(jìn)培養(yǎng)基中、優(yōu)選以本文別處所述的高產(chǎn)量和/或高活性和/或高同質(zhì)性的條件下，培養(yǎng)包含至少一種編碼蛋白/抗體分子的核酸的本發(fā)明的宿主細(xì)胞，優(yōu)選本文別處所述的本發(fā)明核酸的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員能選擇最合適的培養(yǎng)條件，其中使用合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，例如、但不限于，合適的時(shí)間、溫度、pH、供氣、補(bǔ)料、培養(yǎng)基、培養(yǎng)基添加劑、罐或反應(yīng)器大小和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的原理。本領(lǐng)域技術(shù)人員能選擇和優(yōu)化最合適的條件。優(yōu)選實(shí)施方案如實(shí)施例所述，但是不限于它們。通過(guò)能有效生產(chǎn)目標(biāo)抗體分子組合物的一般動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法，例如，批式培養(yǎng)、重復(fù)批式培養(yǎng)、補(bǔ)料-批式培養(yǎng)和灌注培養(yǎng)，可以培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)胞。優(yōu)選地，采用補(bǔ)料-批式培養(yǎng)或灌注培養(yǎng)，以便提高目標(biāo)多肽的生產(chǎn)力。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在無(wú)血清條件下進(jìn)行所述培養(yǎng)，更優(yōu)選地，用無(wú)蛋白的培養(yǎng)基或無(wú)動(dòng)物組分的培養(yǎng)基。本發(fā)明的宿主細(xì)胞對(duì)根據(jù)本發(fā)明的無(wú)血清培養(yǎng)基的適應(yīng)，令人驚奇地迅速和有力。適應(yīng)可以如下進(jìn)行，例如，將在含有血清的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)的細(xì)胞直接放入可商業(yè)得到的無(wú)血清培養(yǎng)基中，或通過(guò)連續(xù)適應(yīng)，其中直接適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基是優(yōu)選的和有利的。在適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基的過(guò)程中，細(xì)胞的生存力暫時(shí)降低，這有時(shí)會(huì)造成細(xì)胞消滅。因此，優(yōu)選地以1x105-5x105細(xì)胞/ml、優(yōu)選2x105細(xì)胞/ml61的細(xì)胞密度，將細(xì)胞接種至培養(yǎng)基中以適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基，以便恢復(fù)和保持較高的細(xì)胞生存力。培養(yǎng)4-7天后，選擇密度達(dá)到5x105至10x105細(xì)胞/ml的細(xì)胞作為適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞。通過(guò)用無(wú)血清培養(yǎng)基組合物連續(xù)稀釋添加了FCS的培養(yǎng)基(連續(xù)適應(yīng))，也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基的適應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能選擇和優(yōu)化最合適的條件。優(yōu)選實(shí)施方案如實(shí)施例所述，但是不限于它們。本發(fā)明的細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基后，可以使用有限稀釋方法(使用96孔板)、菌落形成方法等，制備克隆的細(xì)胞系，并根據(jù)與它們的母細(xì)胞或細(xì)胞系相比有利的這些細(xì)胞的性質(zhì)，選擇細(xì)胞或細(xì)胞系，所述性質(zhì)例如、但不限于，更短的倍增時(shí)間，更快的生長(zhǎng)，在更高密度下生長(zhǎng)的可能性，產(chǎn)量更高，更高的克隆效率，更高的DNA轉(zhuǎn)染效率，更高的抗體分子組合物表達(dá)速率，在其中表達(dá)的抗體分子組合物的更高的活性，在其中表達(dá)的抗體分子組合物的更高的同質(zhì)性，和/或更高的放大穩(wěn)健性。選擇具有有利性質(zhì)的細(xì)胞的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或如本文所述。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"分離所述抗體分子組合物或蛋白的相應(yīng)制劑"通常是指，使用培養(yǎng)基培養(yǎng)，或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)一步富集或純化蛋白/抗體分子組合物或所述蛋白/抗體分子組合物的一部分后，得到由包含編碼本文別處所述的蛋白/抗體分子或其一部分的至少一種所述核酸的所述宿主細(xì)胞表達(dá)的蛋白/抗體分子組合物。在本發(fā)明的意義上，所述蛋白/抗體分子組合物也指富集了本文別處所述的某些蛋白/抗體分子的所述蛋白/抗體分子組合物的一部分。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)在培養(yǎng)后從細(xì)胞和/或細(xì)胞碎片(例如通過(guò)離心技術(shù))分離培養(yǎng)基，分離蛋白/抗體分子組合物。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，分離本發(fā)明的蛋白/抗體分子組合物，或通過(guò)超濾、沉淀方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它濃縮方法，進(jìn)一步富集。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，如下分離本發(fā)明的蛋白/抗體分子組合物通過(guò)色鐠方法純化蛋白/抗體分子組合物，例如、但不限于，使用相應(yīng)親和材料的親和色譜，例如、但不限于，蛋白A，蛋白G，抗-抗體同種型抗體，凝集素色語(yǔ)，抗某些引入抗體分子的標(biāo)記(例如HIS-標(biāo)記或myc-標(biāo)記)或抗原的抗體，或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的離子交換色譜。純化或富集蛋白或蛋白的某些糖形的其它方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇、改進(jìn)、優(yōu)化和單獨(dú)地或與前述方法組合地使用，以分離或進(jìn)一步純化、分級(jí)或富集本發(fā)明的蛋白分子組合物或其級(jí)分。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，經(jīng)或不經(jīng)預(yù)先超速離心，通過(guò)蛋白A色謙分離主要是IgG的本發(fā)明的抗體分子組合物。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，經(jīng)或不經(jīng)預(yù)先超速離心，通過(guò)抗-IgM抗體色謙分離主要是IgM的本發(fā)明的抗體分子組合物。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，經(jīng)或不經(jīng)預(yù)先超速離心，通過(guò)凝集素親和色i瞽分離在抗體分子的某些糖形中富集的本發(fā)明的抗體分子組合物。純化或富集蛋白或蛋白的某些糖形的其它方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇、改進(jìn)、優(yōu)化和單獨(dú)地或與前述方法組合地使用，以分離或進(jìn)一步純化、分級(jí)或富集本發(fā)明的抗體分子組合物或其級(jí)分。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用蛋白A柱分離抗體分子組合物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用抗-IgM柱分離抗體分子組合物。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"增加的活性，，是指，在人骨髓白血病起源的細(xì)胞系CHO或CH0dhfr-或BHK或NSO或SP2/0或PerC.6或小鼠雜交瘤中的至少一種中表達(dá)的相同蛋白/抗體分子的至少一種蛋白/抗體分子組合物的活性。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，它是指在人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞中表達(dá)的本發(fā)明的蛋白和/或抗體分子組合物的活性高于在CH0dhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)的相同蛋白/抗體分子的蛋白/抗體分子組合物的活性。就抗體而言，所述增加的活性是增加的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性或增加的結(jié)合活性。63在本發(fā)明的含義中，"活性"也是生物學(xué)背景下蛋白分子實(shí)現(xiàn)的功能或功能集合。在本發(fā)明的含義中，術(shù)語(yǔ)"增加的活性"、其內(nèi)容的等價(jià)描述和語(yǔ)法等價(jià)描述應(yīng)當(dāng)理解為在選定的應(yīng)用方面提高的或最佳的活性，其中活性可以接近極限值，例如最小化或最大化，或設(shè)定在代表比現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)的對(duì)應(yīng)蛋白分子更高或更低活性的中間值。在本發(fā)明的含義中，提高的或增加的活性也是指在它的生物學(xué)和/或藥學(xué)含義上有利的活性，如提高的血清半衰期，藥代動(dòng)力學(xué)，穩(wěn)定性，生物活性，結(jié)合，抗原性和/或免疫原性。例如，通過(guò)降低不利生物效應(yīng)，例如通過(guò)減少不利免疫效應(yīng)的刺激或減少免疫原性，可以在一定程度上增加蛋白分子組合物的生物活性。在能測(cè)定蛋白活性的合適生物測(cè)定中，可以測(cè)定根據(jù)本發(fā)明的蛋白分子組合物的活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員能鑒別合適的生物測(cè)定或建立合適的生物測(cè)定。根據(jù)本發(fā)明，這樣的生物測(cè)定包括例如體外生物測(cè)定，包括細(xì)胞的或分子的或混合的測(cè)定，例如增殖測(cè)定，細(xì)胞凋亡測(cè)定，細(xì)胞粘連測(cè)定，信號(hào)傳遞測(cè)定，遷移測(cè)定，細(xì)胞毒性測(cè)定，吞噬作用測(cè)定，裂解測(cè)定，和結(jié)合測(cè)定。這樣的生物測(cè)定也包括使用動(dòng)物模型或人的體內(nèi)測(cè)定，例如生物分配，藥代動(dòng)力學(xué)，藥效學(xué)的實(shí)驗(yàn)，血清半衰期實(shí)驗(yàn)，生物利用度實(shí)驗(yàn)，功效實(shí)驗(yàn)，定位實(shí)驗(yàn)，包括臨床研究在內(nèi)的疾病治療和預(yù)防實(shí)驗(yàn)。這樣的生物測(cè)定也包括化學(xué)的、物理的、生理化學(xué)的、生物物理的、和生化的實(shí)驗(yàn)，例如對(duì)溫度、剪應(yīng)力、壓力、pH、綴合和其它因素的穩(wěn)定性。這樣的生物測(cè)定也包括免疫原性和/或抗原性的實(shí)驗(yàn)，以便在它的臨床應(yīng)用方面提高蛋白分子組合物的性質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能測(cè)定蛋白分子組合物的活性或所述活性的組合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，蛋白分子組合物的更高活性的特征在于，在至少一個(gè)體外模型中更高的活性和/或在至少一個(gè)體內(nèi)模型中更高的活性和/或更高的穩(wěn)定性和/或更長(zhǎng)的血清半衰期和/或更長(zhǎng)的生物利用度和/或提高的免疫原性和/或提高的抗原性，這通過(guò)至少一個(gè)生物測(cè)定來(lái)測(cè)得。總活性的提高(在本文中也稱(chēng)作更高的活性)可以導(dǎo)致例如下述提高，如降低的劑量，更長(zhǎng)的給藥時(shí)間間隔，更少的副作用，和當(dāng)用于人或相應(yīng)生物時(shí)沒(méi)有或更低的產(chǎn)物毒性，產(chǎn)生大幅提高的藥物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞中表達(dá)的本發(fā)明的蛋白分子組合物的活性高于來(lái)自現(xiàn)有^a術(shù)生產(chǎn)的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物的活性。所述增加的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性是增加的依賴(lài)于抗體的細(xì)胞毒性(ADCC活性)，依賴(lài)于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC活性)，和/或由吞噬作用(吞噬活性)造成的細(xì)胞毒性。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同方法，可以測(cè)定增加的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，包括ADCC活性、CDC活性或吞噬活性，一些方法在實(shí)施例中詳細(xì)描述，但是不限于那些方法，所以在實(shí)施例中描述的方法是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。所述增加的結(jié)合活性是增加的對(duì)抗體分子表位(例如表位、抗原、另一種包含表位的多肽或包含抗體分子表位的細(xì)胞)的結(jié)合，或增加的對(duì)至少一種Fc受體或另一種效應(yīng)配體(例如Fc-yRI，F(xiàn)c-yRII，F(xiàn)c-yRIII，和來(lái)自它們的子類(lèi)，例如Fc-yRIIa，F(xiàn)c-yRIIIa，F(xiàn)c-yRIIIb或補(bǔ)體的Clq組分或FcRn或包含任一種這樣的Fc受體或效應(yīng)配體的分子或細(xì)胞)的結(jié)合。增加的結(jié)合活性可以是更高的親和力，更高的親合力，和/或更高的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)或其組合。增加的結(jié)合活性可以導(dǎo)致不同的效應(yīng)和活性，例如、但不限于，在
背景技術(shù)：
中所述的受體介導(dǎo)的活性的形式。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法中的至少一種，可以測(cè)定增加的結(jié)合親和力、親合力和受體介導(dǎo)的活性，例如、但不限于，Biacore測(cè)量，Scatchard分析，基于ELISA或RIA的測(cè)量，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量，在合適的靶細(xì)胞中測(cè)定細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)，測(cè)定合適的靶細(xì)胞的增殖的實(shí)驗(yàn)，抗體分子組合物的拮抗、激動(dòng)和/或受體阻斷實(shí)驗(yàn)，例如、但不限于，細(xì)胞-細(xì)胞介導(dǎo)的結(jié)合的抑制，細(xì)胞內(nèi)部分子事件的觸發(fā)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能選擇和/或改造和/或修飾適用于測(cè)定結(jié)合親和力、親合力、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和/或受體介導(dǎo)的活性的方法或方法組合。本發(fā)明的方法可以用于測(cè)試抗體的能力以得到增加的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，優(yōu)選ADCC活性、CDC活性和/或由吞噬作用造成的細(xì)胞毒性和/或增加的對(duì)抗體分子表位或優(yōu)選至少一種Fc受體或另一種效應(yīng)配體的結(jié)合活性，通常和/或具體使用本發(fā)明的宿主細(xì)胞和本文別處所述的它的優(yōu)選實(shí)施方案。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞中表達(dá)的本發(fā)明的蛋白/抗體分子組合物的活性高于當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)來(lái)自細(xì)胞系CHO或CHOdhfr-或BHK或NSO或SP2/0或PerC.6或小鼠雜交瘤、優(yōu)選CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中的至少一種的相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物的活性。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞中表達(dá)的本發(fā)明的蛋白/抗體分子組合物的活性比來(lái)自細(xì)胞系CH0dhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)的相同抗體分子的抗體分子組合物的活性高至少50%、更優(yōu)選至少2倍、更優(yōu)選至少3倍、更優(yōu)選至少4倍、更優(yōu)選至少5倍、更優(yōu)選至少7倍、更優(yōu)選至少10倍、更優(yōu)選至少15倍、更優(yōu)選至少23倍、更優(yōu)選至少30倍、更優(yōu)選至少50倍、更優(yōu)選至少75倍、更優(yōu)選至少100倍、更優(yōu)選至少150倍、更優(yōu)選至少150倍、更優(yōu)選至少230倍、更優(yōu)選至少300倍、更優(yōu)選至少500倍、更優(yōu)選至少750倍、最優(yōu)選超過(guò)IOOO倍。因此并非每個(gè)生物測(cè)定必須顯示出更高的活性，但是依賴(lài)于特定蛋白分子組合物的應(yīng)用和特征，有些有利的生物效應(yīng)可以補(bǔ)償更少有利的那些，且仍然在本發(fā)明意義上導(dǎo)致蛋白分子組合物的總體更高的活性。例如，通過(guò)結(jié)合它的細(xì)胞受體、從而觸發(fā)第二效應(yīng)，例如增殖的誘導(dǎo)，某些蛋白分子組合物可以產(chǎn)生高得多的活性，但是顯示出稍微降低的血清半衰期?？傊|發(fā)更多受體的更高的活性然后補(bǔ)償總生物活性中更短的生物利用度。在另一個(gè)實(shí)例中，更短的半衰期和更高的受體觸發(fā)活性都是有利的。在另一個(gè)實(shí)例中，沒(méi)有提高體內(nèi)活性，但是體外穩(wěn)定性會(huì)提高蛋白分子組合物的生產(chǎn)和儲(chǔ)存。在另一個(gè)實(shí)例中，需要長(zhǎng)半衰期、但是更低的活性。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，增加的抗體分子組合物的活性是增加的ADCC活性。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，增加的抗體分子組合物的活性是增加的CDC。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，增加的抗體分子組合物的活性是吞噬作用造成的增加的細(xì)胞毒性。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，增加的抗體分子組合物的活性是增加的對(duì)表位的結(jié)合活性。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，增加的抗體分子組合物的活性是增加的對(duì)至少一種Fc受體、優(yōu)選FcyRIIIA的結(jié)合活性。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，增加的抗體分子組合物的活性是增加的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和增加的對(duì)表位的結(jié)合活性。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，增加的抗體分子組合物的活性是增加的ADCC活性和增加的對(duì)表位的結(jié)合活性。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，增加的抗體分子組合物的活性是增加的ADCC活性、增加的CDC活性、增加的對(duì)表位的結(jié)合活性和增加的對(duì)至少一種Fc受體的結(jié)合活性。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，增加的抗體分子組合物的活性是增加的ADCC活性、由吞噬作用造成的增加的細(xì)胞毒性、增加的對(duì)表位的結(jié)合活性和增加的對(duì)至少一種Fc受體的結(jié)合活性。在最優(yōu)選實(shí)施方案中，增加的抗體分子組合物的活性是增加的ADCC、由吞噬作用造成的增加的細(xì)胞毒性、增加的CDC活性和增加的對(duì)表位的結(jié)合活性和增加的對(duì)至少一種Fc受體的結(jié)合活性。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"提高的同質(zhì)性"是指,與當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)從細(xì)胞系CHO或CHOdhfr-或BHK或NSO或SP2/0或PerC.6或小鼠雜交瘤中的至少一種分離的相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物相比，在本發(fā)明的人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞中表達(dá)的本發(fā)明的蛋白/少一種抗體分子糖形(優(yōu)選它自5己代^至少1%的總抗體^^組合物的那些糖形)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，它是指，與當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)從細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同抗體分子的抗體分子組合物相比，在本發(fā)明的人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞中表曰月"始/太乂》芩鈕A拙6厶齏，1/或更少的至少一種抗體分子糖形在生產(chǎn)和人用中特別成為問(wèn)題的異質(zhì)性是唾液酸化。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白/抗體分子組合物具有提高的同質(zhì)性，其不包含具有唾液酸N-乙醇?；窠?jīng)氨酸(NeuGc)的糖形，因此在該情況下，沒(méi)有糖形是指沒(méi)有糖形含有可從純化的抗體分子組合物得到的所有糖鏈的超過(guò)1%，更優(yōu)選地，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法根本沒(méi)有檢測(cè)到糖鏈。因?yàn)橐阎狽euGc在人中是免疫原性的，本發(fā)明的宿主細(xì)胞具有勝過(guò)其它生產(chǎn)系統(tǒng)(例如CHO，NSO，SP2/0)的巨大優(yōu)點(diǎn)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白/抗體分子組合物在唾液酸化方面具有提高的同質(zhì)性，其包含小于5%、更優(yōu)選小于3%、更優(yōu)選小于1%和最優(yōu)選沒(méi)有含有如實(shí)施例所述可檢測(cè)的唾液酸的蛋白/抗體分子組合物的糖形。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞，得到在唾液酸化方面具有提高的同質(zhì)性的蛋白/抗體分子組合物，所述宿主細(xì)胞具有糖核苷酸前體途徑缺陷，因此是CMP-唾液酸缺陷型或具有減少的CMP-唾液酸，當(dāng)所述細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，這導(dǎo)致蛋白/抗體分子的糖鏈沒(méi)有唾液酸化或具有大幅減少的唾液酸化。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用NM-F9[DSMACC2606]或NM-D4[DSMACC2605]作為在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的本發(fā)明的宿主細(xì)胞，可以得到這樣的在唾液酸化方面具有提高的同質(zhì)性的蛋白/抗體分子組合物，如實(shí)施例中更詳細(xì)描述的。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞，得到在唾液酸化方面具有提高的同質(zhì)性的蛋白/抗體分子組合物，所述宿主細(xì)胞具有GMP-唾液酸的糖核苷酸運(yùn)栽體缺陷或至少一種唾液酸轉(zhuǎn)移酶缺陷，當(dāng)所述細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，這導(dǎo)致蛋白/抗體分子的糖鏈沒(méi)有唾液酸化或具有減少的唾液酸化。實(shí)例是NM-F9，NM-D4和GT-2X。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用具有增加的唾液酸化程度的本發(fā)明的人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞，制備在唾液酸化方面具有提高的同質(zhì)性的蛋白/抗體分子組合物。所述唾液酸化程度是指，所述抗體分子組合物中蛋白/抗體分子上的唾液酸N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuNc或NeuNAc)的量與相同量的當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)從細(xì)胞系CHO或CHOdhfr-或BHK或NSO或SP2/0或PerC.6或小鼠雜交瘤中的至少一種、優(yōu)選CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白/抗體分子的蛋白/抗體分子組合物的蛋白/抗體分子相比，比其蛋白/抗體分子的總糖單元或特定糖基化位點(diǎn)處的特定糖鏈的唾液酸N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuNc或NeuNAc)的量高至少5%、更優(yōu)選至少15%、更優(yōu)選至少20%、更優(yōu)選至少25%、更優(yōu)選至少30%、更優(yōu)選至少35°/。、更優(yōu)選至少40%、更優(yōu)選至少50°/、更優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少70°/、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少100%、更優(yōu)選至少3倍、更優(yōu)選至少5倍、更優(yōu)選至少10倍、更優(yōu)選至少25倍、更優(yōu)選至少50倍，和最優(yōu)選超過(guò)100倍。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，可以檢測(cè)唾液酸化程度，例如、但不限于，使用凝集素的免疫印跡分析或ELISA，其結(jié)合依賴(lài)于糖結(jié)構(gòu)的唾液酸化，例如SNA,MAL，MALI或PNA，通過(guò)化學(xué)檢測(cè)方法例如硫代巴比妥酸方法，通過(guò)HPLC或質(zhì)諳法或其組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇最合適的方法，并針對(duì)目的進(jìn)行改造和優(yōu)化，在實(shí)施例中描述了更多細(xì)節(jié)。優(yōu)選使用SNA的免疫印跡分析。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的人骨髓白血病起源的宿主細(xì)月包，優(yōu)選K562、NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X和源自它們的細(xì)胞或細(xì)胞系，最優(yōu)選具有高唾液酸化程度的K562，NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X，得到在唾液酸化方面具有提高的同質(zhì)性的蛋白/抗體分子組合物，并產(chǎn)生包含可通過(guò)例如SM結(jié)合檢測(cè)到的a2-6連接的唾液酸的蛋白/抗體分子組合物，在一種更優(yōu)選方式中，蛋白/抗體分子組合物包含cc2-6和oc2-3連接的唾液酸。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞，得到得到在唾液酸化方面具有提高的同質(zhì)性的蛋白/抗體分子組合物，所述宿主細(xì)胞包含至少一種使NeuNAc以a2-3鍵結(jié)合糖基的唾液酸轉(zhuǎn)移酶和至少一種使NeuMc以a2-6鍵結(jié)合糖基的唾液酸轉(zhuǎn)移酶，例如、但不限于，K562、NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X和源自它們的細(xì)胞或細(xì)胞系，由此產(chǎn)生蛋白/抗體分子組合物的蛋白/抗體分子的更優(yōu)選糖形組合物。在本發(fā)明的另一個(gè)(優(yōu)選的)實(shí)施方案中，所述在唾液酸化方面具t提高的同質(zhì)性的本發(fā)明的抗體分子組合物包含具有至少一個(gè)糖鏈的抗體分子的至少一種糖形，所述糖鏈結(jié)合到抗體分子的除了Fc區(qū)域的第二域(Cy2域)中的氨基酸Asn-297以外的另一個(gè)糖基化位點(diǎn)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述在人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞中表達(dá)在唾液酸化方面具有提高的同質(zhì)性的抗體分子組合物，所述宿主細(xì)胞具有增加的唾液酸化程度，且/或包含至少一種使唾液酸以a2-3鍵結(jié)合糖基的唾液酸轉(zhuǎn)移酶和至少一種使唾液酸以a2-6鍵結(jié)合糖基的唾液酸轉(zhuǎn)移酶，例如K562，NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X和源自它們的細(xì)胞或細(xì)胞系。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體分子在Fab區(qū)域的序列中具有至少一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(Asn-X-Ser/Thr，其中X可以是Pro以外的任意氨基酸)和/或至少一個(gè)0-糖基化位點(diǎn)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)在至少一種哺乳動(dòng)物(例如小鼠、大鼠)或優(yōu)選在人中測(cè)量時(shí)，與當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)從細(xì)胞系CHO或CHOdhfr-或BHK或NSO或SP2/0,NM-F9，NM-D4或PerC.6或小鼠雜交瘤中的至少一種、優(yōu)選細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同抗體分子的抗體分子組合物相比，在唾液酸化方面具有提高的同質(zhì)性的本發(fā)明的抗體分子組合物(其包含具有至少一個(gè)結(jié)合到除了Fc部分的第二域(Cy2域)中的氨基酸Asn-297以外的抗體分子的另一個(gè)糖基化位點(diǎn)的糖鏈的抗體分子)具有延長(zhǎng)的血清半衰期和/或生物利用度。使用本發(fā)明可以?xún)?yōu)化抗體的生物利用度?？贵w分子具體地在具有高或甚至非常高唾液酸化(上面討論的組1和3)的細(xì)胞中的表達(dá)，可以產(chǎn)生具有延長(zhǎng)的生物利用度的抗體組合物，同時(shí)抗體分子在組2細(xì)胞中的表達(dá)可以產(chǎn)生具有相對(duì)縮短的生物利用度的抗體組合物。使用動(dòng)物或優(yōu)選人，可以如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和在實(shí)施例中所述測(cè)定生物利用度。動(dòng)物包括小鼠、大鼠、豚鼠、狗或猴子，但是不限于這些物種。由于人性，具有最接近人的糖基化和最重要的唾液酸化的那些動(dòng)物是優(yōu)選的，最優(yōu)選的是人。在一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，在本發(fā)明的人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞中表達(dá)在唾液酸化方面具有提高的同質(zhì)性的抗體分子組合物，所述宿主細(xì)胞具有增加的唾液酸化程度，且/或包含至少一種使唾液酸以oc2-3鍵結(jié)合糖基的唾液酸轉(zhuǎn)移酶和至少一種使唾液酸以a2-6鍵結(jié)合糖基的唾液酸轉(zhuǎn)移酶，例如K562，NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、NM-E-2F9，NM-C-2F5，NM-H9D8或NM-H9D8-E6，和源自它們的細(xì)胞或細(xì)胞系，且在抗體分子的Fab區(qū)域序列中包含結(jié)合到至少一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和/或至少一個(gè)O-糖基化位點(diǎn)上的至少一個(gè)糖鏈，且當(dāng)在至少一種哺乳動(dòng)物(例如小鼠、大鼠)或優(yōu)選在人中測(cè)量時(shí)，與當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)從細(xì)胞系CHO或CH0dhfr-或BHK或NSO或SP2/0或PerC.6或小鼠雜交瘤中的至少一種、優(yōu)選細(xì)胞系CH0dhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同抗體分子的抗體分子組合物相比，具有延長(zhǎng)的血清半衰期和/或生物利用度。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)的抗體分子是Erbitux(西妥昔單抗)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"增加的產(chǎn)量"是指，在人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞中生產(chǎn)的本發(fā)明的蛋白/抗體分子組合物的平均或最大產(chǎn)量高于當(dāng)在細(xì)胞系CHO或CH0dhfr-或BHK或NSO或SP2/0或PerC.6或小鼠雜交瘤中的至少一種中表達(dá)時(shí)來(lái)自相同蛋白/抗體分子的至少一種蛋白/抗體分子組合物的各個(gè)平均或最大產(chǎn)量。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，它是指，在人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞中表達(dá)的本發(fā)明的蛋白/抗體分子組合物的平均或最大產(chǎn)量高于當(dāng)在CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)(使用鼠dhfr基因和甲氨蝶呤在CH0dhfr-中擴(kuò)增)量。在SPR中測(cè)量平均和最大產(chǎn)量，其反映了細(xì)胞、細(xì)胞混合物或細(xì)胞系的生產(chǎn)力，這可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)測(cè)定，且在實(shí)施例的優(yōu)選實(shí)施方案中予以描述。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞(優(yōu)選K562、NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X或源自它們的細(xì)胞或細(xì)胞系)中表達(dá)的本發(fā)明的蛋白/抗體分子組合物的至少平均或最大產(chǎn)量比在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096](使用鼠dhfr基因和甲氨蝶呤在CHOdhfr-中擴(kuò)增)中表達(dá)的相同蛋白/抗體分子的相應(yīng)蛋白/抗體分子組合物高至少10%、更優(yōu)選至少15%、更優(yōu)選至少20°/。、更優(yōu)選至少25%、更優(yōu)選至少30%、更優(yōu)選至少35°/"更優(yōu)選至少45%、更優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少55%、更優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少100%、更優(yōu)選至少3倍、更優(yōu)選至少4倍、最優(yōu)選超過(guò)5倍。本發(fā)明另外提供了核酸，其包含(a)編碼如本文別處所述的蛋白、優(yōu)選抗體分子或其至少一部分的序列，和(b)編碼來(lái)自序列#1至序列#9的序列的至少一個(gè)序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸包含(a)編碼如本文別處所述的蛋白、優(yōu)選抗體分子或其至少一部分的序列，和(b)編碼序列#1的序列。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，上述本發(fā)明的核酸另外包含編碼選擇標(biāo)記的序列，優(yōu)選編碼誘導(dǎo)宿主細(xì)胞(其中引入了所述核酸)的抗生素(例如、但不限于，新霉素或嘌呤霉素)抗性的多肽的序列。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，上述本發(fā)明的上述核酸另外包含至少一個(gè)本文別處所述的遺傳元件的至少一個(gè)序列。本發(fā)明另外提供了人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞，或可以從白血病患者得到的任意人骨髓細(xì)胞或骨髓前體細(xì)胞或細(xì)胞系，或可以從人供體得到的任意骨髓細(xì)胞或骨髓前體細(xì)胞或細(xì)胞系，或包含至少一種人骨髓白血病起源細(xì)胞的細(xì)胞或細(xì)胞系的混合物，或通過(guò)將至少一種人骨髓白血病起源細(xì)胞或細(xì)胞系、或可以從白血病患者得到的任意人骨髓細(xì)胞或骨髓前體細(xì)胞或細(xì)胞系、或可以從人供體得到的任意骨髓細(xì)胞或骨髓前體細(xì)胞或細(xì)胞系與另一種人或動(dòng)物起源的細(xì)胞(例如、但不限于，B細(xì)胞，CHO細(xì)胞)融合得到的細(xì)胞或細(xì)胞系，其包含引入所述細(xì)胞中的至少一種編碼蛋白/抗體分子或其部分的核酸。本發(fā)明提供了如上所述本發(fā)明的宿主細(xì)胞，其包含至少一種編碼蛋白/抗體分子或其至少一部分的核酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了宿主細(xì)胞K562、NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[湖ACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X或從任一種所述宿主細(xì)胞衍生的細(xì)胞或細(xì)胞系，優(yōu)選在無(wú)血清條件下生長(zhǎng)的那些，且在無(wú)血清條件下從它們分離蛋白/抗體分子組合物，更優(yōu)選無(wú)血清條件下向其中引入編碼抗體分子的核酸的那些，其包含至少一種編碼蛋白/抗體分子或其部分的核酸，優(yōu)選包含編碼本文別處所述的蛋白/抗體分子或其至少一部分的序列的核酸。本發(fā)明提供了如上所述的本發(fā)明的宿主細(xì)胞，其包含至少一種編碼序列#1至序列#9、優(yōu)選序列#1的至少一種多肽的核酸。本發(fā)明提供了如上所述的本發(fā)明的宿主細(xì)胞，其包含至少一種編碼抗體分子或其部分的核酸和至少一種編碼序列#1至序列#9、優(yōu)選序列#1的至少一種多肽的核酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了宿主細(xì)胞K562、NM-F9[DSMACC2606]、賜-D4[DSMACC2605]、NM-E-2F9、醒-C-2F5、賜-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X或從任一種所述宿主細(xì)胞衍生的細(xì)胞或細(xì)胞系，優(yōu)選在無(wú)血清條件下生長(zhǎng)的那些，且在無(wú)血清條件下從它們分離蛋白/抗體分子組合物，更優(yōu)選無(wú)血清條件下向其中引入編碼蛋白/抗體分子的核酸的那些，其包含至少一種編碼蛋白/抗體分子或其部分的核酸，優(yōu)選包含編碼本文別處所述的蛋白/抗體分子或其至少一部分的序列的核酸，和至少一種編碼選自序列#1至序列#9的序73列、優(yōu)選序列#1的序列。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述的宿主細(xì)胞，其中編碼的抗體分子是W02004/065423的抗體。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述的宿主細(xì)胞，其中編石馬的抗體分子是抗體PankoMab[CancerImmunolIm隱other.2006Nov;55(11):1337-47.Epub2006Feb.PankoMab:apotentnewgenerationanU-tumourMUC1antibody.Danielczyk等人]，優(yōu)選PankoMab與所有人恒定域的嵌合形式，更優(yōu)選人源化的PankoMab。本發(fā)明另外提供了通過(guò)本文別處所述的本發(fā)明的任意方法生產(chǎn)的具有增加的活性和/或增加的產(chǎn)量和/或提高的同質(zhì)性和全人糖基化的蛋白/抗體分子組合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過(guò)本發(fā)明的任意方法生產(chǎn)的蛋白/抗體分子組合物，當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從細(xì)胞系CH0或CH0dhfr-或BHK或NSO或SP2/0或PerC.6或小鼠雜交瘤中的至少一種、優(yōu)選CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白/抗體分子的蛋白/抗體分子組合物相比，其具有增加的活性和/或增加的產(chǎn)量和/或提高的同質(zhì)性和全人糖基化。表達(dá)的蛋白分子或其部分可以是任意蛋白或蛋白部分或蛋白片段。表達(dá)的抗體分子或其部分可以是任意抗體或抗體部分或抗體片段。本發(fā)明的蛋白分子組合物可用于疾病的預(yù)防性和/或治療性處理，例如白血病、中性粒細(xì)胞減少癥、血細(xì)胞減少癥、癌癥、骨髓移植、造血系統(tǒng)疾病、不育癥及自身免疫性疾病。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的蛋白分子組合物的治療用途范圍非常廣泛。例如，G-CSF是治療中性粒細(xì)胞減少癥的重要治療劑，中性粒細(xì)胞減少癥是白血病癌癥患者化療導(dǎo)致的威脅生命的中性粒細(xì)胞減少。GM-CSF尤其用于治療化學(xué)治療后高齡AML患者，以從中性粒細(xì)胞減少癥的快速恢復(fù)。另外，GM-CSF被批準(zhǔn)作為治療劑用于骨髓移植的一些用途及用于動(dòng)員外周血干細(xì)胞。另外，GM-CSF具有一些臨床用途，它們目前處于研究中，例如用于治療HIV和癌癥。某些造血系統(tǒng)疾病用EP0治療，IFN-P是目前用于治療多發(fā)性硬化(一種自身免疫性疾病)的重要治療劑。另一個(gè)實(shí)例是廣泛用于治療男性和女性不育癥的FSH。hCG也用于治療不育癥，但集中于女性不排卵。hGH具有臨床證實(shí)的效果，如體脂肪減少和肌肉組織增加。治療性處理的藥劑，所述疾病選自白血病、中性粒細(xì)胞減少癥、血細(xì)胞減少癥、癌癥、骨髓移植、造血系統(tǒng)疾病、不育癥及自身免疫性疾病。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)的抗體分子是識(shí)別下述疾病的抗體分子銀屑病，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，克羅恩病，潰瘍性結(jié)腸炎，自身免疫性疾病，SLE，多發(fā)性硬化，自身免疫性血液病，哮喘，變態(tài)反應(yīng)，移植物抗宿主病，同種異體移植物排斥，青光眼手術(shù)，心肌梗死，病毒如RSV，HIV，HepB或CMV，癌癥，肉瘤，CLL，AML或NHL。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)的抗體分子是識(shí)別下述疾病的抗體分子在至少一個(gè)人中的癌癥、胂瘤或轉(zhuǎn)移灶，至少一種癌癥細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，優(yōu)選地選自耳鼻喉區(qū)域、肺、縱隔、胃腸道、泌尿系統(tǒng)、婦科系統(tǒng)、乳房、內(nèi)分泌系統(tǒng)、皮膚的癌性疾病或腫瘤疾病、骨和軟組織肉瘤、間皮瘤、黑素瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的贅生物、嬰兒期內(nèi)的癌性疾病或腫瘤疾病、淋巴瘤、白血病、瘤外綜合征、具有未知的原發(fā)性腫瘤的轉(zhuǎn)移灶(CUP綜合征)、腹膜癌擴(kuò)散、免疫抑制有關(guān)的惡性腫瘤和/或腫瘤轉(zhuǎn)移灶。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)的抗體或其部分是抗MUC1抗體。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸編碼的抗體分子是抗體利妥昔單抗，赫賽汀，Erbitux，Campath1H或源自它們的抗體。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸編碼的抗體分子是W02004/050707的抗體，更優(yōu)選WO2004/065423的抗體，更優(yōu)選PankoMab[CancerImmunolI,nother.2006Nov;55(11):1337-47.Epub2006Feb.PankoMab:apotentnewgenerationanti-tumourMUC1antibody.Danielczyk等人]，更優(yōu)選包含所有人恒定域的嵌合形式，更優(yōu)選人源化的抗體。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸編碼的抗體分子是本發(fā)明的任意完整抗體，優(yōu)選利妥昔單抗，赫賽汀，ErbUux，更優(yōu)選WO2004/065423的抗體，最優(yōu)選PankoMab，其中從本發(fā)明的任意宿主細(xì)胞、優(yōu)選K562、NM-F9[應(yīng)ACC2606]、NM-D4[應(yīng)ACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X或從任一種所述宿主細(xì)胞衍生的細(xì)胞或細(xì)胞系分離的抗體分子組合物不包含可檢測(cè)的NeuGc。這也適用于一般蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸編碼的抗體分子是任意完整抗體分子或包含本發(fā)明的CY2域的抗體分子，優(yōu)選利妥昔單抗，赫賽汀，Erbitux，更優(yōu)選W02004/065423的抗體，最優(yōu)選PankoMab，其中從本發(fā)明的宿主細(xì)胞、優(yōu)選K562、NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X或從任一種所述宿主細(xì)胞衍生的細(xì)胞或細(xì)胞系分離的抗體分子組合物包含至少一種具有cc2-6唾液酸的糖形。這也適用于一般蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸編碼的抗體分子是任意完整抗體分子或包含本發(fā)明的Cy2域的抗體分子，優(yōu)選利妥昔單抗，赫賽汀，Erbitux，Campath1H，更優(yōu)選WO2004/065423的抗體，最優(yōu)選PankoMab，其中從宿主細(xì)胞NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X或從^f壬一種所述宿主細(xì)胞衍生的細(xì)胞或細(xì)胞系分離的抗體分子組合物包含a2-6唾液酸，其可以通過(guò)使用凝集素SNA的免疫印跡分析檢測(cè)到，如實(shí)施例所述。這也適用于一般蛋白。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸編碼的抗體分子是任意抗體分子，優(yōu)選利妥昔單抗，赫賽汀，Erbitux，Campath1H，更優(yōu)選WO2004/065423的抗體，最優(yōu)選PankoMab，在無(wú)血清的、更優(yōu)選無(wú)蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后從本發(fā)明的宿主細(xì)胞NM-F9或NM-D4分離的抗體分子組合物具有提高的同質(zhì)性，沒(méi)有可檢測(cè)的唾液酸。這也適用于一般蛋白。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸編碼的抗體分子是抗體利妥昔單抗，赫賽汀，Campath1H或源自它們的抗體，從本發(fā)明的宿主細(xì)胞分離的抗體分子組合物具有比在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)的相同抗體分子的抗體分子組合物的活性高至少4倍的增加的ADCC活性。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸編碼的抗體分子是W02004/065423的抗體，更優(yōu)選PankoMab，當(dāng)在細(xì)胞K562、NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X中的至少一種或從任一種所述宿主細(xì)胞衍生的細(xì)胞或細(xì)胞系中生產(chǎn)時(shí)，從本發(fā)明的宿主細(xì)胞分離的抗體分子組合物具有比在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)的相同抗體分子的抗體分子組合物的活性高至少4倍的增加的ADCC活性。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸編碼的抗體分子是WO2004/065423的抗體，更優(yōu)選PankoMab,從本發(fā)明的宿主細(xì)胞K562、NM-F9[應(yīng)ACC2606〗、NM-D4[應(yīng)ACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X或從任一種所述宿主細(xì)胞衍生的細(xì)胞或細(xì)胞系分離的抗體分子組合物具有比在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)的相同抗體分子的抗體分子組合物的活性高至少50%、優(yōu)選2倍的增加的結(jié)合其表位的活性。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸編碼的抗體分子是W02004/065423的抗體，更優(yōu)選PankoMab,在無(wú)血清的、更優(yōu)選無(wú)蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后從本發(fā)明的宿主細(xì)胞NM-F9或NM-D4分離的抗體分子組合物具有提高的同質(zhì)性，沒(méi)有可檢測(cè)的唾液酸。這也適用于一般蛋白。77在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸編碼的抗體分子是WO2004/065423的抗體，更優(yōu)選PankoMab，從宿主細(xì)胞K562、NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X或從任一種所述宿主細(xì)胞衍生的細(xì)胞或細(xì)胞系分離的抗體分子組合物具有比在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)的相同抗體分子的抗體分子組合物提高的同質(zhì)性，具有多至少10%的唾液酸。這也適用于一般蛋白。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸編碼的抗體分子是WO2004/065423的抗體，更優(yōu)選PankoMab，當(dāng)在NM-F9或NM-D4中表達(dá)時(shí)，從本發(fā)明的宿主細(xì)胞分離的抗體分子組合物具有比在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)的相同抗體分子的抗體分子組合物提高的同質(zhì)性，沒(méi)有可檢測(cè)的唾液酸的程度更高。這也適用于一般蛋白。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸編碼的抗體分子是WO2004/065423的抗體，更優(yōu)選PankoMab，從本發(fā)明的宿主細(xì)胞分離的抗體分子組合物具有如上所述提高的同質(zhì)性和增加的ADCC活性，其比在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)的相同抗體分子的抗體分子組合物的活性高至少4倍。在本發(fā)明的最優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸編碼的抗體分子是W02004/065423的抗體，更優(yōu)選PankoMab。本發(fā)明另外提供了用于生產(chǎn)如本文別處所述本發(fā)明意義上的具有增加的活性和/或增加的產(chǎn)量和/或提高的同質(zhì)性和全人糖基化的蛋白/抗體分子組合物的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是任意細(xì)胞、人骨髓白血病起源的細(xì)胞或細(xì)胞系、或可以從白血病患者得到的任意人骨髓細(xì)胞或骨髓前體細(xì)胞或細(xì)胞系、或可以從人供體得到的任意骨髓細(xì)胞或骨髓前體細(xì)胞或細(xì)胞系、或如本文別處所迷包含至少一種人骨髓白或包含前述這些細(xì)胞中的至少一種的細(xì)胞或細(xì)胞系的混合物。本發(fā)明也提供了用于生產(chǎn)如本文別處所述本發(fā)明意義上的具有增加的活性和/或增加的產(chǎn)量和/或提高的同質(zhì)性和全人糖基化的蛋白/抗體分子組合物的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是任意細(xì)胞，通過(guò)將至少一種人骨髓白血病起源細(xì)胞或細(xì)胞系、或可以從白血病患者得到的任意人骨髓細(xì)胞或骨髓前體細(xì)胞或細(xì)胞系、或可以從人供體得到的任意骨髓細(xì)胞或骨髓前體細(xì)胞或細(xì)胞系與另一種人或動(dòng)物起源的細(xì)胞(例如、但不限于，B細(xì)胞，CHO細(xì)胞)融合得到的細(xì)胞或細(xì)胞系。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的用于生產(chǎn)如本文別處所述本發(fā)明意義上的具有增加的活性和/或增加的產(chǎn)量和/或提高的同質(zhì)性的蛋白/抗體分子組合物的所述宿主細(xì)胞是細(xì)胞或細(xì)胞系KG1、MUTZ-3、K562、NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X或、源自它們的細(xì)胞或細(xì)胞系、或包含前述這些細(xì)胞中的至少一種的細(xì)胞或細(xì)胞系的混合物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的用于生產(chǎn)如本文別處所述本發(fā)明意義上的具有增加的活性和/或增加的產(chǎn)量和/或提高的同質(zhì)性的蛋白/抗體分子組合物的所述宿主細(xì)胞是細(xì)胞或細(xì)胞系K562、NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X或源自它們的細(xì)胞或細(xì)胞系。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的用于生產(chǎn)如本文別處所述本發(fā)明意義上的具有增加的活性和/或增加的產(chǎn)量和/或提高的同質(zhì)性的蛋白/抗體分子組合物的所述宿主細(xì)胞是細(xì)胞或細(xì)胞系賜-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、麗-H9D8-E6Q12、GT-2X或源自它們的細(xì)胞或細(xì)胞系或如本文別處所述源自它們的細(xì)胞或細(xì)胞系。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的用于生產(chǎn)如本文別處所述本發(fā)明意義上的具有增加的活性和/或增加的產(chǎn)量和/或提高的同質(zhì)性的蛋白/抗體分子組合物的所述宿主細(xì)胞是源自KG1、MUTZ-3、K562、NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X的細(xì)胞或細(xì)胞系，或如本文別處所述源自它們的細(xì)胞或細(xì)胞系，它們生長(zhǎng)在無(wú)血清條件下，件下分離抗體分子組合物的那些。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的用于生產(chǎn)如本文別處所述本發(fā)明意義上的具有增加的活性和/或增加的產(chǎn)量和/或提高的同質(zhì)性的蛋白/抗體分子組合物的所述宿主細(xì)胞是源自K562、NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X的細(xì)胞或細(xì)胞系，或如本文別處所述源自它們的細(xì)胞或細(xì)胞系，它們生長(zhǎng)在無(wú)血清條件下。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的用于生產(chǎn)如本文別處所述本發(fā)明意義上的具有增加的活性和/或增加的產(chǎn)量和/或提高的同質(zhì)性的蛋白/抗體分子組合物的所述宿主細(xì)胞是源自K562、NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X的細(xì)胞或細(xì)胞系，或如本文別處所述源自它們的細(xì)胞或細(xì)胞系，它們生長(zhǎng)在無(wú)血清條件下，可以在這分子組合物。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的用于生產(chǎn)如本文別處所述本發(fā)明意義上的具有增加的活性和/或增加的產(chǎn)量和/或提高的同質(zhì)性的蛋白/抗體分子組合物的所述宿主細(xì)胞是細(xì)胞或細(xì)胞系NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[讓ACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X或如本文別處所述源自它們的細(xì)胞或細(xì)胞系，它們生長(zhǎng)在無(wú)血清條件下，優(yōu)選可以在這些細(xì)胞中引入編碼蛋白/抗體分子的核酸且在無(wú)血清條件下分離蛋白/抗體分子組合物的那些。本發(fā)明另外提供了通過(guò)本文別處所述的本發(fā)明的任意方法分離的蛋白/蛋白組合物。本發(fā)明另外提供了通過(guò)本文別處所述的本發(fā)明的任意方法分離的蛋白/蛋白組合物，其具有本發(fā)明意義上的和本文別處所述的增加的活性和/或增加的產(chǎn)量和/或提高的同質(zhì)性和全人糖基化。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述蛋白分子或其部分的大小是至少10kDa，優(yōu)選大小是至少15kDa、更優(yōu)選大小是至少20kDa、更優(yōu)選大小是至少25kDa、更優(yōu)選大小是至少30kDa、更優(yōu)選大小是至少35kDa、更優(yōu)選大小是至少40kDa、更優(yōu)選大小是至少45kDa、更優(yōu)選大小是至少50kDa、更優(yōu)選大小是至少55kDa、更優(yōu)選大小是至少60kDa、更優(yōu)選大小是至少65kDa、更優(yōu)選大小是至少70kDa、更優(yōu)選大小是至少75kDa、更優(yōu)選大小是至少80kDa、更優(yōu)選大小是至少85kDa、更優(yōu)選大小是至少90kDa、更優(yōu)選大小是至少95kDa、更優(yōu)選大小是至少100kDa、更優(yōu)選大小是至少105kDa、更優(yōu)選大小是至少110kDa、更優(yōu)選大小是至少115kDa、更優(yōu)選大小是至少120kDa、更優(yōu)選大小是至少125kDa、更優(yōu)選大小是至少130kDa、更優(yōu)選大小是至少135kDa、更優(yōu)選大小是至少140kDa、更優(yōu)選大小是至少145kDa、更優(yōu)選大小是至少150kDa、更優(yōu)選大小是至少155kDa、更優(yōu)選大小是至少160kDa、更優(yōu)選大小是至少165kDa、更優(yōu)選大小是至少170kDa、更優(yōu)選大小是至少175kDa、更優(yōu)選大小是至少180kDa、更優(yōu)選大小是至少185kDa、更優(yōu)選大小是至少190kDa、更優(yōu)選大小是至少195kDa、最優(yōu)選大小是至少200kDa。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述蛋白分子組合物源自細(xì)胞因子和它們的受體中的任意蛋白分子，例如，腫瘤壞死因子TNF-a和TNF-P;腎素；人生長(zhǎng)激素及牛生長(zhǎng)激素；生長(zhǎng)激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；ct-l-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈及B鏈；促性腺激素，例如促卵胞生成激素(FSH)，促黃體生成激素(LH),促曱狀腺激素及人絨毛膜促性腺激素(hCG);降血鈣素；胰高血糖素；凝血因子，例如因子VIIIC、因子IX、因子VII、組織因子及血管假性血友病因子；抗凝血因子，例如蛋白C;心房利鈉因子；肺表面活性物質(zhì)；纖溶酶原活化因子，例如尿激酶、人尿和組織型纖溶酶原激活劑；鈴蟾素；凝血酶；造血生長(zhǎng)因子；腦啡肽酶；人巨噬細(xì)胞炎癥81蛋白；血清白蛋白，如人血清白蛋白；苗勒氏抑制物質(zhì)；松弛素A鏈及b鏈；松弛素原；小鼠促性腺素相關(guān)肽；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；激素或生長(zhǎng)因子受體；整聯(lián)蛋白；蛋白A及蛋白D;類(lèi)風(fēng)濕因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，例如骨源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-4、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-5，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-6及神經(jīng)生長(zhǎng)因子-P;血小板源生長(zhǎng)因子；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；表皮生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，例如TGF-ot和TGF-p;胰島素樣生長(zhǎng)因子-I及胰島素樣生長(zhǎng)因子-n;胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白；CD蛋白，例如CD-3、CD-4、CD-8及CD-19;促紅細(xì)胞生成素(EPO);骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白；干擾素，例如干擾素-cc，-P，和-y;集落刺激因子(csf)，如m-csf、GM-CSF及G-CSF;白細(xì)胞介素(IL)，如IL-1至IL-12;過(guò)氧化物歧化酶；T-細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；抗體及免疫粘合素、血型糖蛋白A、MUC1。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述蛋白分子組合物源自下述的任意蛋白分子血型糖蛋白A,EPO，G-CSF，GM-CSF，F(xiàn)SH，hCG，LH，干擾素，白細(xì)胞介素，抗體和/或其片段。物。所述蛋白優(yōu)選具有在權(quán)利要求27中定義的糖基化特征。優(yōu)選地，所述蛋白組合物是抗體分子組合物。本發(fā)明另外提供了通過(guò)本文別處所述的本發(fā)明的任意方法分離的抗體分子組合物，其具有本發(fā)明意義上的和本文別處所述的增加的活性和/或增加的產(chǎn)量和/或提高的同質(zhì)性。這樣的抗體的實(shí)例包括抗神經(jīng)節(jié)苷脂GD3的抗體，人白介素-5受體cc-鏈，HER2，CC趨化因子受體4，CD20，CD22，神經(jīng)母細(xì)胞瘤，MUC1，表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體分子組合物源自下述的任意抗體分子Muromomab，達(dá)珠單抗，巴利昔單抗，阿昔單抗，利妥昔單抗，赫賽汀，吉姆單抗，阿侖單抗，Ibritumomab，西妥昔單抗(Erbitux)，貝伐單抗，托西莫單抗，Pavlizumab,英夫利昔單抗，Eculizumab，依中白珠單抗，Omalizumab，Efalizumab,阿達(dá)木單抗,Campath-lH，C2B8，Panorex，BrevaRex，Simulect，Antova，0KT3賽尼旅,ReoPro，Synagis，Ostavir，Protovir,OvaRex，Vitaxin。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體分子組合物源自下述的任意抗體分子利妥昔單抗，赫賽汀，抗-CC趨化因子受體4抗體KM2160，Campath-1H，C2B8，Erbitux，抗-神經(jīng)母細(xì)胞瘤抗體chCE7。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體分子組合物源自下述的抗體分子WO2004/065423的抗體、更優(yōu)選PankoMab、更優(yōu)選它的嵌合形式、更優(yōu)選它的人源化形式。也提供了通過(guò)本發(fā)明的生產(chǎn)方法可得到的蛋白或蛋白組合物，其中所述蛋白是結(jié)合MUC1表位的抗體，其包含氨基酸序列DTR。MUC-1是一種確定的在多種上皮腫瘤上表達(dá)的腫瘤標(biāo)志物，且是潛在的腫瘤靶物。MUC-1是一種大的、高度O-糖基化的跨膜糖蛋白。胞外部分由不同數(shù)目(20至120)的串聯(lián)重復(fù)序列(TR)組成，其中的每個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列由20個(gè)氨基酸組成，具有5個(gè)潛在的0-糖基化位點(diǎn)。MUC1不僅在上皮組織上表達(dá)，而且在造血細(xì)胞上表達(dá)。已知結(jié)合MUC1的DTR基序的幾種抗體，它們也是在本發(fā)明背景下的合適的蛋白/抗體(綜述參見(jiàn)Karsten等人，1998)。Karsten也描述了MUC1上的一種新的糖誘導(dǎo)的構(gòu)象表位(TAMUC)，其具有結(jié)構(gòu)…PDT'RP…，其中T'被0糖基化。在該位點(diǎn)存在的聚糖本身是胂瘤特異性的糖結(jié)構(gòu)。因此，希望使用可以區(qū)分TAMUC腫瘤表位和未糖基化的表位的MUC抗體。一種能特異性地識(shí)別糖基化的TAMUC表位的合適的抗體是PankoMab抗體。這里通過(guò)參考整體引入的Danielczyk等人2006詳細(xì)描述了它的生產(chǎn)(PankoMab:apotentnewgenerationanti-tumorMUC-1antibody)。優(yōu)選使用竟?fàn)幮缘亟Y(jié)合同母PankoMab抗體相同的TA-MUC1表位的抗體PankoMab或其變體。這樣的抗體變體具有至少一種下述特征-它結(jié)合至少包含氨基酸序列PDTRP的表位；-當(dāng)在PDTRP序列處被Gal-NAca糖基化時(shí)，它結(jié)合包含l，5TRs的30個(gè)氨基酸的短MUC肽，但是如果該肽未被糖基化，則不結(jié)合；-它顯示出超過(guò)25、優(yōu)選28(最優(yōu)選29，5的比例)的額外長(zhǎng)度效應(yīng)；-它對(duì)造血系統(tǒng)細(xì)胞的結(jié)合較低或甚至不結(jié)合(關(guān)于檢測(cè)方法，參見(jiàn)Danielczyk等人2006，通過(guò)參考引入)；-它對(duì)腫瘤細(xì)胞具有高親和力，通過(guò)斯卡恰特作圖分析是大約至少Km=0，2-lx109M_1。在實(shí)施例中給出了各個(gè)變體的合適實(shí)例。抗體可以是鼠源的、嵌合的或人源化的。本文所述的結(jié)合TA-MUCl表位的抗體、優(yōu)選PankoMab抗體或抗體Pankol和Panko2具有至少一種下述糖基化特征(i)它具有增加的唾液酸化程度，當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物中相同量的抗體分子相比，在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述抗體分子組合物的抗體分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上的N-乙?；窠?jīng)氨酸的量高至少15%;(ii)它具有更高的半乳糖基化程度，當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物中相同量的抗體分子相比，在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述抗體分子組合物的抗體分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上的G2結(jié)構(gòu)的量高至少5%;(iii)它包含可檢測(cè)量的bisecGlcNAc;(iv)它不具有或具有小于2%的雜種或高甘露糖結(jié)構(gòu)。各個(gè)糖基化模式導(dǎo)致下述令人驚奇的、且有益的活性模式(i)比在CH0細(xì)胞中表達(dá)的相同抗體的活性高超過(guò)15%的CDC活性；(ii)與不具有可檢測(cè)的唾液酸化的抗體相比延長(zhǎng)了因子2(超過(guò)L5)的血清半衰期;(iii)它具有增加的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，當(dāng)在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，比來(lái)自相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性高至少2倍。通過(guò)在根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系中生產(chǎn)，可以得到各個(gè)抗體，所述細(xì)胞系提供高唾液酸化和半乳糖基化程度，但是優(yōu)選更低的巖藻糖基化。合適的實(shí)例是NM-H9D8和NM-H9D8-E6。下面的表和附圖解釋了本發(fā)明。下面的表1和8和附圖1至17解釋了本發(fā)明。表l:在添加了FCS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的CHOdhfr-和NM-F9表達(dá)的嵌合PankoMab的產(chǎn)量。表2:在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的NM-H9D8[DSMACC2806]表達(dá)的嵌合PankoMab的產(chǎn)量。表3:PankoMab和西妥昔單抗中唾液酸含量的定量用指定的細(xì)胞系生產(chǎn)抗體，并累積通過(guò)DMB標(biāo)記的唾液酸變體的反相色譜得到的峰面積進(jìn)行定量。使用唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品區(qū)分NeuGc和NeuAc。表4:Panko1和PankoMab中帶不同電荷的結(jié)構(gòu)的定量對(duì)2-AB標(biāo)記的N-聚糖進(jìn)行陰離子交換色鐠(Asahi-PAK-column),通過(guò)積分定量與帶不同電荷的結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的峰。表5:通過(guò)2-AB標(biāo)記的聚糖的aminophaseHPLC(Luna-NH2-柱)，測(cè)定抗體Pankol和PankoMab的半乳糖基化程度。通過(guò)積分定量峰，通過(guò)質(zhì)譜法分析潛在的聚糖結(jié)構(gòu)。表6:Pankol和PankoMab中三觸角和雙觸角+平分結(jié)構(gòu)的定量。收集來(lái)自aminophase-HPLC的含有潛在二等分GlcNAc的級(jí)分，并進(jìn)行反相色鐠(RP18-column)。由此可以區(qū)分開(kāi)三觸角和雙觸角+平分結(jié)構(gòu)。通過(guò)2-AB標(biāo)記的聚糖的aminophaseHPLC(L腿-顧-柱)，測(cè)定抗體的巖藻糖基化程度。通過(guò)積分定量峰，通過(guò)質(zhì)譜法分析潛在的聚糖結(jié)構(gòu)。測(cè)定巖藻糖基化的和未巖藻糖基化的結(jié)構(gòu)，并定量累積的峰面積。表7:在添加了FCS(CHOdhfr-)的培養(yǎng)基中或在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的CHOdhfr-和GT-2x表達(dá)的hFSH的產(chǎn)量。表8:在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的NM-H9D8[DSMACC2806]表達(dá)的hFSH的產(chǎn)量。表9:用根據(jù)本發(fā)明的方法可得到的合適的糖基化和活性組合。表IO:在不同細(xì)胞系中得到的bisecGlcNAc和巖藻糖的值。圖1:NM-F9，NM-D4，和NM-H9D8[DSMACC2806]細(xì)胞的fut8mRNA表達(dá)。HepG2細(xì)胞用作對(duì)照。圖2:使用從NM-H9D8-E6細(xì)胞、CHOdhfr-細(xì)胞或SP2/0細(xì)胞分離的西妥昔單抗進(jìn)行的銪釋放測(cè)定，LS174T細(xì)胞用作靶細(xì)胞。以效應(yīng)物靶細(xì)胞-50:1的比例，進(jìn)行溫育測(cè)定4h,抗體濃度為0至100ng/ml。圖3:從NM-F9分離的嵌合PankoMab的ADCC活性比從CHOdhfr-細(xì)胞分離的嵌合PankoMab高約5倍。圖4:4吏用從NM-H9D8-E6細(xì)胞、CHOdhfr-細(xì)胞和NM-H9D8細(xì)胞分離的嵌合Pankol進(jìn)行的銪釋放測(cè)定，ZR-75-1細(xì)胞用作靶細(xì)胞。以效應(yīng)物靼細(xì)胞=80:1的比例，進(jìn)行溫育測(cè)定4h，抗體濃度為0至lpg/ml。圖5:以效應(yīng)物耙細(xì)胞-50:1的比例，每孔5000個(gè)靼細(xì)胞，溫育過(guò)夜(o.n.)后，在銪釋放測(cè)定中嵌合Panko2抗ZR-75-l細(xì)胞的ADCC活性。一式三份地溫育樣品。圖6:以效應(yīng)物耙細(xì)胞-50:1的比例，每孔10，000個(gè)耙細(xì)胞，溫育過(guò)夜(o.n.)后，在銪釋放測(cè)定中嵌合Panko2抗ZR-75-l細(xì)胞的ADCC活性。一式三份地溫育樣品。圖7:嵌合PankoMab抗ZR-75-1的CDC測(cè)定。圖8:從NM-F9分離的嵌合PankoMab對(duì)合成的糖基化的MUC130-聚體肽的結(jié)合活性比從CHOdhfr-細(xì)胞分離的嵌合PankoMab的結(jié)合活性高約50%。圖9:從GT-2x和NM-H9D8分離的嵌合Panko2對(duì)合成的糖基化的MUC130-聚體肽的結(jié)合活性比從CH0dhfr-細(xì)胞分離的嵌合Panko2的結(jié)合活性高約50%。圖IO:進(jìn)行蛋白印跡分析來(lái)鑒別在CHOdhfr-、NM-F9或NM-H9D8[DSMACC2806]中表達(dá)的抗體分子組合物的有差別地唾液酸化的重鏈。將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素，用第二抗-人IgG抗體(圖10A)或檢測(cè)2-6唾液酸化的SNA(圖IOB)顯影。圖11:進(jìn)行蛋白印跡分析來(lái)鑒別在CHOdhfr-或NM-H9D8中表達(dá)的抗體分子組合物的有差別地唾液酸化的重鏈。將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素，用檢測(cè)2-6唾液酸化的SNA顯影。圖12:進(jìn)行ELISA分析來(lái)鑒別在C,hfr-、GT-2x、NM-H9D8或NM-H9D8-E6中表達(dá)的有差別地唾液酸化的抗體分子組合物。圖13:進(jìn)行ELISA分析來(lái)鑒別在CHOdhfr-、NM-F9或NM-H9D8中表達(dá)的西妥昔單抗的有差別地唾液酸化的抗體分子組合物。如下分析唾液酸化(A)經(jīng)或不經(jīng)神經(jīng)氨酸酶處理，用檢測(cè)ot2-6唾液酸化的SNA,和(B)用檢測(cè)ot2-3唾液酸化的MALI。圖14:從CH0dhfr-、NM-F9、NM-H9D8或NM-H9D8-E6細(xì)胞分離的嵌合抗體Pankol和Panko2的SNA染色的斑點(diǎn)印跡。圖15:從NM-H9D8細(xì)胞分離的嵌合PankoMab比從NM-F9分離的嵌合PankoMab在棵鼠血清中的可利用時(shí)間更久。圖16:在NM-H9D8(泳道1)和GT-2x(泳道2)中生產(chǎn)的hFSH的SDS-PAGE分析。在還原條件下，每個(gè)泳道通過(guò)SDS-PAGE分離5jiig純化的hFSH，并通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色。標(biāo)志物指示21-108kD的范圍。圖17:進(jìn)行蛋白印跡分析來(lái)鑒別有差別地唾液酸化的hFSH分子組合物。在還原條件下，通過(guò)10°/。丙烯酰胺凝膠中的SDS-PAGE，分離來(lái)自CH0(泳道l)、NM-H9D8(泳道2)和GT-2x(泳道3)的lpghFSH分子組合物。將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素，用檢測(cè)2-6唾液酸化的SNA顯影。圖18:顯示了IgG抗體，其中N-聚糖共價(jià)結(jié)合在Fc的Ch2域的保守Asn297殘基。如指出的，在Fab域中可以存在其它的N-連接的寡糖，其甚至可以影響抗體的結(jié)合活性。僅顯示了在一半抗體上的聚糖87結(jié)構(gòu)。Fc糖是分支的鏈結(jié)構(gòu)，其主要存在于2個(gè)Ch2域內(nèi)，每個(gè)寡糖具有一個(gè)與CH2域的疏水區(qū)相互作用的臂/觸角。多克隆和骨髓瘤人IgG的結(jié)構(gòu)分析已經(jīng)證實(shí)，F(xiàn)c含有不同量的基礎(chǔ)雙觸角核心結(jié)構(gòu)，如圖18所示。標(biāo)識(shí)的含義顯示在對(duì)應(yīng)的表中。所述核心結(jié)構(gòu)可以含有0個(gè)(GQ)、1個(gè)(Gl)或2個(gè)(G2)末端半乳糖殘基和/或二等分GlcNAc和/或在鄰近GlcNAc的巖藻糖殘基。其它巖藻糖分子也可以存在于其它GlcNAc殘基或半乳糖殘基。多樣性甚至增加，因?yàn)榭梢源嬖诨虿淮嬖谀┒送僖核幔@取決于抗體的性質(zhì)，據(jù)報(bào)道唾液酸對(duì)ADCC具有負(fù)面影響。實(shí)施例1細(xì)胞中fut8表達(dá)的分析根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作(RNeasy-Mini-Kit,Qiagen)，從NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[羅ACC2605]、NM-H9、K562、NM-H9D8[謂ACC2806]、GT-2x[DSMACC_______]和HepG2(對(duì)照)細(xì)胞提取RNA。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)(HDynabeads01igo(dT)25H，Invitrogen)，使用磁珠技術(shù)分離mRNA。對(duì)于第一鏈PPcDNA合成，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)，使用每種樣品和Omniscript反轉(zhuǎn)錄酶(Qiagen)的50pl珠懸浮液。對(duì)于隨后的PPRT-PCR反應(yīng)，使用5^1cDNA產(chǎn)物pP和特異性的尸""引物，產(chǎn)生212bp片段。使用肌動(dòng)蛋白特異性的引物作為對(duì)照，產(chǎn)生240bp片段。在1.5%凝膠上分析得到的PCR-產(chǎn)物Pp。NM-F9，NM-D4，NM-H9,K562,NM-H9D8和GT-2x都表達(dá)尸"M的mRM。圖1顯示了NM-F9、NM-D4和NM-H9D8的fut8mRNA表達(dá)作為一個(gè)實(shí)例實(shí)施例2K562細(xì)胞的糖工程化在EP1654353中描述了K562細(xì)胞的糖工程化和NM-D4和NM-F988細(xì)胞系的建立。如下制備N(xiāo)M-H9細(xì)胞，和從它衍生的具有高唾液酸化潛力的細(xì)胞或細(xì)胞系。通過(guò)使用烷化劑曱磺酸乙酯處理K562細(xì)胞，進(jìn)行隨機(jī)誘變。使用PBS洗滌每樣品K562細(xì)胞，并以10P6P細(xì)胞/ml細(xì)胞培養(yǎng)基接種于添加EMS(O.1mg/ml，曱磺酸乙酯，Sigma-Aldrich)的培養(yǎng)基，在37。C及5。/。COB2B培養(yǎng)過(guò)夜。洗滌細(xì)胞并添加新鮮培養(yǎng)基。每隔一天通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞活力，并通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色分析細(xì)胞。隨后，使用TF特異性的抗體篩選暴露高TF表達(dá)的新表型的細(xì)胞。在B-PBS(O.5%BSA,在PBS中)中洗滌K562細(xì)胞，使用50pl單克隆抗體A78-G/A7或PankoMab的雜交瘤培養(yǎng)物上清液和950plB-PBS于4。C培養(yǎng)30分鐘。洗滌后，使用50^1MicroBeads(MiltenyiBiotec，K6ln，Germany)綴合的大鼠-抗-小鼠-IgM-抗體或大鼠-抗-小鼠-IgG-抗體重復(fù)上迷操作。洗滌后，按操作手冊(cè)所迷，通過(guò)MiltenyiBiotec0Uiln，Germany)提供的兩個(gè)連續(xù)柱分離磁標(biāo)記的TF陽(yáng)性的K562細(xì)胞。培養(yǎng)9天后，重復(fù)分離操作共3次。以抗體染色開(kāi)始FACS分析(流式細(xì)胞術(shù))使用第一單克隆抗體(A78-G/A7(IgM)的雜交瘤培養(yǎng)上清液，PankoMab(IgGl)，均在細(xì)胞培養(yǎng)基中1:2稀釋)于4。C培養(yǎng)約3xl(T細(xì)胞1.5小時(shí)，然后使用第二Cy3綴合的山羊抗小鼠IgM或IgG抗體(在PBS中l(wèi):200稀釋)于4'C培養(yǎng)30分鐘，并再次洗滌。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(流式細(xì)胞器CoulterEpics,BeckmanCoulter,Krefeld,Ger)檢測(cè)重懸細(xì)胞(200piPBS)。使用Expo32軟件(BectonCoulter)進(jìn)行定量分析，對(duì)于抗體標(biāo)記的細(xì)胞使用下列參數(shù)前向散射(FS):26V，gainl(放大l)，側(cè)向散射(SS):807V，放大5,FL2:740V，放大l，對(duì)于凝集素標(biāo)記的細(xì)胞使用下列參數(shù)FS:26V，放大l，SS:807V，放大5，F(xiàn)L1:740V，放大1)。分離三輪后，得到含有93%TF陽(yáng)性細(xì)胞的K562細(xì)胞群。然而，TF陽(yáng)性的K562細(xì)胞的百分比隨時(shí)間而減少，在分離程序之后14天期間達(dá)到約20%TF陽(yáng)性細(xì)胞的基礎(chǔ)水平。為了穩(wěn)定表達(dá)TF陽(yáng)性表型，第四次分離K562細(xì)胞，最后通過(guò)在96孔培養(yǎng)板中有限稀釋(l個(gè)細(xì)胞/100nl)，克隆所分離的TF陽(yáng)性的K562細(xì)胞。在所獲得的30個(gè)K562細(xì)胞克隆中，17個(gè)細(xì)胞克隆表達(dá)少量的TF抗原，或不表達(dá)TF抗原。在流式細(xì)胞術(shù)中分析這些細(xì)胞克隆的SNA結(jié)合和增殖速率(倍增時(shí)間的分析參見(jiàn)下面)。選擇表現(xiàn)出高SM結(jié)合和高增殖速率的細(xì)胞克隆。選擇穩(wěn)定的NM-H9克隆，用于通過(guò)單細(xì)胞克隆進(jìn)行進(jìn)一步克隆開(kāi)發(fā)，并在無(wú)血清條件下優(yōu)化生長(zhǎng)。選擇NM-H9D8[DSMACC2806]作為最優(yōu)選的細(xì)胞克隆，由GlycotopeGmbH,Robert-R6ssle-Str.10，13125Berlin(Germany)于2006年9月15日保保藏在Braunschweig(德國(guó))的"DSMZ-DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH",保藏號(hào)為DSMACC2806。實(shí)施例3K562、NM-F9、NM-D4、NM-H9、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8、NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12和GT-2x細(xì)胞系和CHOdhfr-細(xì)胞的培養(yǎng)和無(wú)血清細(xì)胞系的建立在添加了10%FCS和2mM谷氨酰胺的RPMI1640中或在無(wú)血清的X-Vivo20培養(yǎng)基中，培養(yǎng)K562、NM-F9、NM-D4、NM-H9、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8[DSMACC2806]、NM-H9D8-E6[DSMACC2807]、NM-歸8-E6Q12[讓ACC2856](由GlycotopeGmbH，Robert-Riissle-Str.10，13125Berlin(Germany)于2007年8月8曰保保藏在Braunschweig(德國(guó))的"DSMZ-DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH")或GT-2x[應(yīng)ACC____],在8%控濕氣氛下在37t:生長(zhǎng)。在添加了10%FCS、2mM谷氨酰胺和2%HT添加劑的DMEM中或在無(wú)血清的CHO-S-SFMII培養(yǎng)基中，培養(yǎng)CHOdhfr-細(xì)胞(ATCCNo.CRL-9096)，在8%控濕氣氛下在37。C生長(zhǎng)。通過(guò)徹底更換細(xì)胞培養(yǎng)基，可以使K562、NM-F9、NM-D4、NM-H9、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8[DSMACC2806〗、NM-H9D8-E6[顧ACC2807]、NM-H9D8-E6Q12[DSMACC2856]或GT-2x[DSMACC____]和源自所述宿主細(xì)胞的細(xì)胞或細(xì)胞系容易地適應(yīng)無(wú)血清條件。以1x105至5x105細(xì)胞/ml、優(yōu)選2x105細(xì)胞/ml的密度，將根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞和細(xì)胞系接種進(jìn)無(wú)血清培養(yǎng)基X-Vivo20，并通過(guò)普通的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)4至7天后，選擇密度達(dá)到5x105至10x105細(xì)胞/ml的細(xì)胞作為適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞。通過(guò)用添加了FCS的培養(yǎng)基連續(xù)稀釋無(wú)血清培養(yǎng)基組合物，也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基的適應(yīng)(連續(xù)適應(yīng))。極大保留了本發(fā)明的生產(chǎn)抗體組合物的宿主細(xì)胞的改造的FCS生產(chǎn)克隆在無(wú)血清條件下的生產(chǎn)力。必須逐步進(jìn)行CH0dhfr-(ATCCNo.CRL-9096)對(duì)無(wú)血清條件的適應(yīng)，這需要幾周，所以損失至少一半生產(chǎn)力是常見(jiàn)的。實(shí)施例4用于在真核細(xì)胞中表達(dá)嵌合抗體PankoMab、Pankol、Panko2或西妥昔單抗的載體的克隆使用來(lái)自生產(chǎn)PankoMab的鼠雜交瘤細(xì)胞的特異性引物，PCR擴(kuò)增PankoMab的可變序歹'j[HCancerImmunolImmunother.H2006Nov;55(11):1337-47.Epub2006Feb.PankoMab:apotentnewgenerationant卜tumourMUC1antibody.Danielczyk等人〗。Pankol和Panko2的可變序列VH和VL如WO2004/065423所述，其通過(guò)參考引入。Pankol的可變重鏈TVSPankol的可變輕鏈:Panko2的可變重鏈:Panko2的可變輕鏈:從http://redpoll,pharmacy,ualberta.ca/drugbank/cgi-bin/getCard.cgiCARD=BTD00071.txt得到西妥昔單抗VH和VL的可變氨基酸序列，并使用VectorNTI逆向翻譯成cDM編碼序列。西妥昔單抗的可變重鏈TVS西妥昔單抗的可變輕鏈:在VL的情況下，用Ncol/Nhel延伸cDNA序列，在VH的情況下用NcoI/SalI，產(chǎn)生cMA。將NcoI/XhoI-切割的可變重鏈片段VH克隆進(jìn)NcoI/SalI-切割的如WO2004/065423所述的BS-Leader載體。BS-Leader載體包括一個(gè)克隆盒，用于將T細(xì)胞受體信號(hào)肽序列引入5'末端，將拼接供體序列引入可變域的3'末端。用另外編碼拼接供體位點(diǎn)的3，末端特異性引物擴(kuò)增對(duì)應(yīng)抗體的可變輕鏈VL，通過(guò)NcoI/Nhel克隆進(jìn)類(lèi)似消化的BS-Leader載體。此后，將來(lái)自BS-Leader載體的每個(gè)HindlII/BamHI片段克隆進(jìn)對(duì)應(yīng)的真核表達(dá)載體。這些載體(pEFpuroCY1VBHB，pEFdhfrCkVBlb，pEFdhfrBrautBCkVBlb)包含EF-1a-啟動(dòng)子和HCMV增強(qiáng)子，SV40起點(diǎn)，多腺苷酸化信號(hào)，在載體中的嘌呤霉素抗性基因(對(duì)于重鏈)和鼠二氳葉酸酶基因(dhfr)(用于CHO細(xì)胞表達(dá))或用于載體的選擇和基因擴(kuò)增的SEQID1(序列1#)(用于K562、NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、NM-H9、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8[DSMACC2806]、NM-H9D8-E6[DSMACC2807]、NM-H9D8-E6Q12[DSMACC2856]或GT-2x[DSMACC____]表達(dá))(對(duì)于輕鏈)，以及人重鏈恒定yl區(qū)域或人輕鏈恒定K區(qū)域的基因組序列(擴(kuò)增引物來(lái)自基因組人DNA,載體圖譜參見(jiàn)W02004/065423)。實(shí)施例5用于表達(dá)嵌合抗體PankoMab、Pankol、Panko2或西妥昔單抗的真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，和在有血清存在下制備高產(chǎn)細(xì)胞克隆的基因擴(kuò)增操作為了表達(dá)嵌合抗體，通過(guò)使用DMRIE-C的脂轉(zhuǎn)染，或電穿孔(對(duì)于懸浮細(xì)胞NM-F9)和lipofectamin或電穿孔(對(duì)于貼壁細(xì)胞系CHOdhfr-)，用上述重鏈和輕鏈的載體的混合物(l:1至l:3)共轉(zhuǎn)染NM-F9[DSMACC2606]或CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后2天，將生長(zhǎng)培養(yǎng)基更換成選擇培養(yǎng)基(NM-F9:RPMI1640+10%FCS+2mML-谷氨酰胺+0.75pg/ml噪呤霉素+50nM曱氨蝶呤；CH0dhfr-:DMEM+10°/。透析的FCS+2mML-谷氨酰胺+5^g/ml嘌呤霉素+50mM甲氨蝶呤)l周。通過(guò)將甲氨蝶呤濃度升高至100nM另外2周，進(jìn)行第一次擴(kuò)增。擴(kuò)增的細(xì)胞群體的一部分是在沒(méi)有添加嘌呤霉素和甲氨蝶呤的培養(yǎng)基中克隆的單個(gè)細(xì)胞，通過(guò)升高甲氨蝶呤濃度，對(duì)其它細(xì)胞進(jìn)行新一輪的基因擴(kuò)增。以此方式，進(jìn)行4-6輪基因擴(kuò)增(100，200,500，1000，2000，3000nM曱氨蝶呤)。另外，類(lèi)似地進(jìn)一步擴(kuò)增通過(guò)克隆篩選和分析鑒別出的最好的生產(chǎn)克隆。在96-孔培養(yǎng)板中有限稀釋(0.5細(xì)胞/孔)單個(gè)細(xì)胞克隆后，培養(yǎng)平板2-3周，顯微鏡分析生長(zhǎng)中的細(xì)胞克隆，測(cè)定克隆效率％(含有生長(zhǎng)中的細(xì)胞克隆的孔的數(shù)目x100/接種細(xì)胞的理論數(shù)目)。對(duì)于貼壁CHOdhfr-細(xì)胞或NM-F9懸浮細(xì)胞，使用不同方法篩選生長(zhǎng)中的克隆的生產(chǎn)力。CHOdhfr-:用PBS洗滌生長(zhǎng)中的克隆的細(xì)胞，通過(guò)Accutase處理來(lái)收獲。將一半重新懸浮的細(xì)胞接種進(jìn)96-孔實(shí)驗(yàn)板，將另一半接種進(jìn)24-孔平板，用于進(jìn)一步培養(yǎng)。將實(shí)驗(yàn)平板培養(yǎng)20-24h。如比生產(chǎn)率(specificproductivityrate，SPR)和倍增時(shí)間(g)的測(cè)定所述(參見(jiàn)下面)，分析每個(gè)孔的上清液的抗體滴度。使用MTT測(cè)定，測(cè)量相對(duì)細(xì)胞密度。詳細(xì)地，用MTT溶液溫育細(xì)胞2h，拋棄溶液，用在2-丙醇中的0.04MHC1溶液裂解細(xì)胞。2小時(shí)后，適度混合平板，使用微量滴定板光度計(jì)測(cè)量，其中使用570nm雙模式過(guò)濾器和630mn參照過(guò)濾器。NM-F9:離心96-孔培養(yǎng)板，拋棄上清液。將細(xì)胞重新懸浮于200新鮮培養(yǎng)基中。將一半重新懸浮的細(xì)胞接種進(jìn)96-孔實(shí)驗(yàn)板，用100pl培養(yǎng)基稀釋?zhuān)瑢⒘硪话氡Ａ粼诳寺∑桨逯?，用于進(jìn)一步培養(yǎng)。培養(yǎng)2天后，離心實(shí)驗(yàn)平板，如比生產(chǎn)率(SPR)和倍增時(shí)間(g)的測(cè)定所述(參見(jiàn)下面)，分析20pl上清液的抗體滴度。通過(guò)在每個(gè)孔中加入IOplWST-l溶液(Roche)，使用WST-1測(cè)定，測(cè)量相對(duì)細(xì)胞密度。溫育l-3小時(shí)后，使用微量滴定板光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量，其中使用450nm雙模式過(guò)濾器和63Gnm參照過(guò)濾器。選擇具有高抗體滴度細(xì)胞密度比率的細(xì)胞克隆，培養(yǎng)，并進(jìn)一步分析。K562、NM-D4和賜-H9的條件都相同。比生產(chǎn)率(SPR)和倍增時(shí)間(g)的測(cè)定對(duì)于每個(gè)克隆，在24-孔組織培養(yǎng)板的每個(gè)孔中的500pl生長(zhǎng)培養(yǎng)基中接種2xlOP"細(xì)胞。使細(xì)胞生長(zhǎng)3天，收獲條件培養(yǎng)基用于分析，如果必要，用Accutase取出細(xì)胞，并計(jì)數(shù)。通過(guò)ELISA，從培養(yǎng)基樣品定量測(cè)定比抗體滴度。給測(cè)定平板覆蓋人K鏈特異性的抗體(BD)。用抗-人IgG(H+L)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)綴合物(JacksonImmunoresearchLaboratories)檢測(cè)結(jié)合的重組抗體。對(duì)于定量，使用純化的重組嵌合抗體作為標(biāo)準(zhǔn)品。94以皮克特定蛋白/細(xì)胞/天(pcd)為單位測(cè)量的SPR是生長(zhǎng)速率和生產(chǎn)力的函數(shù)，用下面的方程來(lái)計(jì)算總蛋白質(zhì)量SPR-----------------------------------累積細(xì)胞面積(ICA)(最終細(xì)胞數(shù)-起始細(xì)胞數(shù))x培養(yǎng)天數(shù)ICA=---------------------------------------------10gBeB(最終細(xì)胞數(shù)/起始細(xì)胞數(shù))用下面的方程來(lái)計(jì)算倍增時(shí)間g-log2x(培養(yǎng)小時(shí)數(shù))/log(最終細(xì)胞數(shù)/起始細(xì)胞數(shù))細(xì)胞系的平均產(chǎn)量和最大產(chǎn)量的測(cè)定如上所迷有限稀釋(O.5細(xì)胞/孔)96-孔培養(yǎng)板中的來(lái)自200個(gè)理論涂布的單個(gè)克隆的單個(gè)細(xì)胞后，為生長(zhǎng)中的細(xì)胞克隆測(cè)定SPR，并測(cè)定平均值和偏差，以及不同細(xì)胞系和不同條件的最大產(chǎn)量。表l對(duì)比了在含有血清條件下開(kāi)發(fā)的生產(chǎn)嵌合PankoMab的CH0dhfr-和NM-F9細(xì)胞克隆的數(shù)據(jù)。實(shí)施例6生產(chǎn)抗體分子組合物的無(wú)血清高產(chǎn)細(xì)胞克隆的建立使用DMRIE-C或電穿孔(Nucleofector，Amaxa)，轉(zhuǎn)染適應(yīng)了無(wú)血清培養(yǎng)基X-Vivo20的NM-H9D8、NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12或GT-2x。轉(zhuǎn)染后2天，將生長(zhǎng)培養(yǎng)基換成選擇培養(yǎng)基(X-Vivo20+0.75jig/ml嘌呤霉素+50nM曱氨蝶呤)l周。通過(guò)將曱氨蝶呤濃度升高至100nM另外2周，進(jìn)行第一次擴(kuò)增。擴(kuò)增的細(xì)胞群體的一部分是在沒(méi)有添加噤呤霉素和甲氨蝶呤的X-Vivo中克隆的單個(gè)細(xì)胞，通過(guò)升高甲氨蝶呤濃度，對(duì)其它細(xì)胞進(jìn)行新一輪的基因擴(kuò)增。以此方式，進(jìn)行4-6輪基因擴(kuò)增(100，200，500,1000,2000，3000nM曱氨蝶呤)。另外，類(lèi)似地進(jìn)一步擴(kuò)增通過(guò)克隆篩選和分析鑒別出的最好的生產(chǎn)克隆。在96-孔培養(yǎng)板中有限稀釋(0.5細(xì)胞/孔)單個(gè)細(xì)胞克隆后，培養(yǎng)平板2-3周，顯微鏡分析生長(zhǎng)中的細(xì)胞克隆，測(cè)定克隆效率％(含有生長(zhǎng)中的細(xì)胞克隆的孔的數(shù)目x100/接種細(xì)胞的理論數(shù)目)。在有血清存在下，使用與NM-F9懸浮細(xì)胞相同的操作(參見(jiàn)上面)，篩選生長(zhǎng)中的克隆的生產(chǎn)力。細(xì)胞克隆的平均產(chǎn)量和最大產(chǎn)量的測(cè)定如上所述有限稀釋(O.5細(xì)胞/孔)96-孔培養(yǎng)板中的來(lái)自200個(gè)理論涂布的單個(gè)克隆的單個(gè)細(xì)胞后，為生長(zhǎng)中的細(xì)胞克隆測(cè)定SPR，并測(cè)定平均值和偏差，以及不同條件的最大產(chǎn)量。表2顯示了完全在無(wú)血清條件下開(kāi)發(fā)的生產(chǎn)嵌合PankoMab的NM-H9D8[DSMACC2806]細(xì)胞克隆的數(shù)據(jù)。本發(fā)明的細(xì)胞系中擴(kuò)增后的比生產(chǎn)速率(SPR)高于CH0dhfr-，在無(wú)血清條件下開(kāi)發(fā)的生產(chǎn)嵌合PankoMab的NM-H9D8[DSMACC2806]細(xì)胞中最高。在沒(méi)有選擇壓力下，大多數(shù)克隆的生產(chǎn)速率在至少6周中是非常穩(wěn)定的。最好的克隆穩(wěn)定超過(guò)6周(SPR為30pcd)，倍增速率是24h。數(shù)據(jù)反映了小實(shí)驗(yàn)室規(guī)模克隆的生產(chǎn)力，具有通過(guò)過(guò)程開(kāi)發(fā)、培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵來(lái)進(jìn)一步提高生產(chǎn)力的潛力。在無(wú)血清條件下開(kāi)發(fā)的生產(chǎn)克隆的更高的生產(chǎn)力和產(chǎn)量是有利的，所有其它抗體和所有細(xì)胞系(如適應(yīng)了無(wú)血清條件的K562、NM-F9、NM-D4、NM-H9、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8-E6[DSMACC2807〗、NM-H9D8-E6Q12[DSMACC2856]或GT-2x[DSMACC____])的條件都相同。實(shí)施例7抗體分子組合物的分離為了生產(chǎn)和分離根據(jù)本發(fā)明的抗體分子組合物，在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)分泌嵌合抗體PankoMab、Pankol、Panko2或西妥昔單抗的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，直到達(dá)到約1-2x10P6P細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度。通過(guò)離心(400xg,15min)從細(xì)胞培養(yǎng)上清液去除細(xì)胞后，^使用蛋白A柱(HiTrapr-蛋白AFF，AmershamPharmaciaBiotech)純化嵌合抗體。將通過(guò)突然pH變化洗脫的純化的抗體級(jí)分重新懸浮于PBS，使用Centriprep離心試管(截止值50kDa,Mi11ipore)濃縮。實(shí)施例8根據(jù)本發(fā)明的抗體分子組合物的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的測(cè)定從供血者分離的PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞通過(guò)Ficol卜Hypaque(Biochrom)密度離心，從健康供血者的血液分離PBMC。用添加了5%FCS的RPMI1640洗涂細(xì)胞3次，將分批的5xl07細(xì)胞冷凍保藏。融化PBMC，直接使用，或在添加了10%FCS(RPMI/FCS)的RPMI1640中保藏過(guò)夜，直到用于流式細(xì)胞術(shù)或用作細(xì)胞毒性測(cè)定中的效應(yīng)細(xì)胞。在體外模型中檢測(cè)依賴(lài)于抗體的細(xì)胞毒性在銪釋放測(cè)定中，研究了根據(jù)本發(fā)明的重組抗體的依賴(lài)于抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)。在800jil銪緩沖液(5GmMHEPES，pH7.4，93mMNaCl，5mMKC1，2mMMgCl2，10mM二乙烯三胺五乙酸，2mM醋酸銪(III))中，在水上溫育靶細(xì)胞(ZR-75-l，5x106)6分鐘，在Multiporator(eppendorf)中電穿孔(710V，1脈沖，30jis)，隨后在水上溫育另外6min。此后，在RPMI1640/5%FCS中洗滌細(xì)胞5次，接種至96-孔圓底板(Nunc;每孔100pl，lxl(T細(xì)胞)。加入不同濃度(0.5-25pg/ml終濃度，200pl溫育體積)的20pl重組抗體或?qū)?yīng)對(duì)照(培養(yǎng)基，同種型對(duì)照人IgG)后，加入人外周血細(xì)胞(80Jul/孔)作為效應(yīng)細(xì)胞，使用50:1的效應(yīng)/靼細(xì)胞比。加入不含有效應(yīng)細(xì)胞的80jilRPMI/FCS，以測(cè)定自發(fā)釋放。用乙醇完全裂解靶細(xì)胞后，測(cè)定最大釋放。在37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)后，在500xg離心平板5分鐘，將25jil每種樣品吸量進(jìn)200pl/孔的增強(qiáng)溶液(Perkin-ElmerWallac)。在室溫溫育15min后，測(cè)定熒光(VictorP2P熒光計(jì)，Perkin-ElmerWallac)。從方程(實(shí)驗(yàn)裂解-自發(fā)裂解)/(最大裂解-自發(fā)裂解)*100得到比細(xì)胞毒性?；蛘撸?00銪緩沖液(50mMHEPES，pH7.4，93mMNaCl，5mMKCl，2mMMgCl2，10mM二乙烯三胺五乙酸，2mM醋酸銪(111))中，在冰上溫育耙細(xì)胞(LS174T或ZR-75-l，3x106細(xì)胞)6分鐘，在使用programA-Oll的NucleofectorII(Amaxa)中電穿孑L，隨后在冰上溫育另外6min。此后，在RPMI1640/5%FCS中洗滌細(xì)胞4次，接種進(jìn)96-孔圓底板(Nunc;每孔100pl，5-10x103細(xì)胞)。加入不同濃度(對(duì)于西妥昔單抗，0.001-100ng/ml終濃度，200pi溫育體積；對(duì)于嵌合PankoMab、Pankol或Panko2,0,16-5pg/ml)的20pl重組抗體或?qū)?yīng)對(duì)照(培養(yǎng)基，同種型對(duì)照人IgG)后，加入人外周血細(xì)胞(80nl/孔)作為效應(yīng)細(xì)胞，使用100:1至50:1的效應(yīng)/耙細(xì)胞比。加入不含有效應(yīng)細(xì)胞的80jnlRPMI/FCS，以測(cè)定自發(fā)釋放。用1°/。TritonX-100完全裂解靶細(xì)胞后，測(cè)定最大釋放。在37'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)或過(guò)夜后，在500xg離心平板5分鐘，將25jil每種樣品吸量進(jìn)200jal/孔的增強(qiáng)溶液(Perkin-ElmerWallac)。在室溫溫育10min后，測(cè)定熒光(Victorp2P熒光計(jì)，Perkin-ElmerWallac)。從方程(實(shí)驗(yàn)裂解-自發(fā)裂解)/(最大裂解-自發(fā)裂解)*100得到比細(xì)胞毒性。從fut8—細(xì)胞系NM-H9D8-E6分離的西妥昔單抗的ADCC活性顯著高于從CHOdhfr-細(xì)胞或SP2/Q細(xì)胞分離的西妥昔單抗的ADCC活性。如圖2所示，在比從CH0dhfr-或SP2/0細(xì)胞分離的西妥昔單抗(Erbitux，從Merck得到)低約30倍的抗體濃度，從NM-H9D8-E6分98離的西妥昔單抗誘導(dǎo)相同的LS174T細(xì)胞特異性裂解(specificlysis)。這指示比可商業(yè)得到的產(chǎn)品高30倍的ADCC活性。使用本發(fā)明的生產(chǎn)方法得到該結(jié)果，產(chǎn)生優(yōu)化的糖基化模式。從NM-F9[DSMACC2606]、K562、NM-H9、NM-D4[DSMACC2605]、NM-H9D8-E6[DSMACC2807]、NM-H9D8-E6Q12[DSMACC2856]，GT-X2或NM-H9D8[DSMACC2806]分離的嵌合PankoMab的ADCC活性也比從CHOdhfr-細(xì)胞分離的嵌合PankoMab的ADCC活性高約5倍。約1/5的嵌合PankoMab濃度產(chǎn)生與在CHOdhfr-細(xì)胞中表達(dá)的嵌合PankoMab相同的ADCC活性。圖3顯示了用于對(duì)比目的的使用NM-F9細(xì)胞系得到的各個(gè)結(jié)果。從NM-H9D8-E6或NM-H9D8-E6Q12分離的嵌合Pankol的ADCC活性比從CHOdhfr-細(xì)胞分離的嵌合Pankol的ADCC活性高約8倍。約1/8的嵌合Pankol濃度產(chǎn)生與在CH0dhfr-細(xì)胞中表達(dá)的嵌合Pankol相同的ADCC活性。圖4顯示了各個(gè)結(jié)果。從NM-H9D8或GT-2x分離的嵌合Panko2的ADCC活性比從CH0dhfr-細(xì)胞分離的嵌合Panko2的ADCC活性高約6倍。約1/6的嵌合Panko2濃度產(chǎn)生與在CHOdhfr-細(xì)胞中表達(dá)的嵌合Panko2相同的ADCC活性。圖5顯示了各個(gè)結(jié)果。從NM-H9D8-E6分離的嵌合Panko2的ADCC活性比從NM-H9D8細(xì)胞分離的嵌合Panko2的ADCC活性低。圖6顯示了各個(gè)結(jié)果。在體外模型中檢測(cè)依賴(lài)于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性在銪釋放測(cè)定中研究抗體的依賴(lài)于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)。如上所述制備E^-裝載的粑細(xì)胞(ZR-75-1，3x106)。此后，將細(xì)胞接種進(jìn)96-孔圓底板(Nunc;每孑L1QOpl，5x103細(xì)胞)。加入不同濃度(0.5至50jtg/ml終濃度，200pl溫育體積)的20pl抗體或?qū)?yīng)對(duì)照(培養(yǎng)基，同種型對(duì)照人IgG)后，在室溫溫育細(xì)胞半小時(shí)。此后，加入10nl/孔幼兔補(bǔ)體(Cedarline，1:5至1:10稀釋)。加入不含有補(bǔ)體的1QRPMI/FCS，以測(cè)定自發(fā)釋放。用乙醇或1%TritonX-100完全裂解靶細(xì)胞后，測(cè)定最大釋放。在37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-3.5小時(shí)后，在500xg離心平板5分鐘，將25pl每種樣品吸量進(jìn)200jul/孔的增強(qiáng)溶液(Perkin-ElmerWallac)。在室溫溫育10min后，測(cè)定熒光(Victorp2P熒光計(jì)，Perkin-ElmerWaliac)。從方程(實(shí)驗(yàn)裂解-自發(fā)裂解)/(最大裂解-自發(fā)裂解)*100得到比細(xì)胞毒性。從NM-F9細(xì)胞分離的嵌合PankoMab的CDC活性比從CHOdhfr-細(xì)胞分離的嵌合PankoMab的CDC活性高約8倍。從NM-F9分離的嵌合PankoMab在比從CHOdhfr-細(xì)胞分離的嵌合PankoMab低8倍的濃度誘導(dǎo)相同的特異性裂解(specificlysis)。圖7顯示了各個(gè)結(jié)果。分析抗體分子組合物的吞噬活性的綴合物形成測(cè)定(CFA)尸A^M細(xì)應(yīng)染^.-在PBS中洗滌lxlOP"-2xlOP711腫瘤細(xì)胞2次，重新懸浮于lml稀釋劑C，對(duì)于ZR-74-l，ZR-74-1TF，MCF-7和MT-3，加入濃度為12x,6PM的lmlPKH26。在室溫溫育3min后，通過(guò)在室溫加入2mlFCSlmin，停止染色。加入培養(yǎng)基(4ml，添加了1%L-谷氨酰胺、10%FCS的RPMI)，旋轉(zhuǎn)，用培養(yǎng)基洗滌4次。在37°C，5%C0B2B溫育腫瘤細(xì)胞過(guò)夜，以允許釋放多余的PKH-26。用半數(shù)細(xì)胞和體積，進(jìn)行PKH-26染色的優(yōu)化。，用胰蛋白酶/EDTA收獲PKH-26標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞，用PBS洗滌一次，在有或沒(méi)有重組抗體分子組合物存在下，以0.8x10P6P細(xì)胞/ml重新懸浮于MAK細(xì)胞培養(yǎng)基(Invitrogen)。將胂瘤細(xì)胞(250^1，0.2x10P6P細(xì)胞)接種進(jìn)非粘性的聚丙烯試管。根據(jù)Boyer等人，Exp.Hematol.27，751-761(1999)，制備MAK細(xì)胞，洗滌，以1.6xl0p6P細(xì)胞/ml重新懸浮。將250julMAK細(xì)胞(0.2x10P6P細(xì)胞)加入PKH-26標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞(E:T比2:1)。在4'C和37。C/5%C0B2B—式兩份地溫育單個(gè)樣品3h或過(guò)夜(18-20h)。溫育3h或過(guò)夜后，用PBS洗滌細(xì)胞，用在PBS/10%FCS中的CDllc-FITC(1:18,5)+7-AAD(l:500)染色，用PBS洗滌細(xì)胞，重新懸浮于400^1PBS。在EpicsXL(BeckmanCoulter)中采集10.000細(xì)胞。將colocalizedMAK細(xì)胞的百分比測(cè)定為PKH-26陽(yáng)性細(xì)胞在所有存活的CDllc-FITC陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞群體中的百分比。實(shí)施例9在ELISA中分析抗體分子組合物結(jié)合活性為了分析在不同細(xì)胞系中表達(dá)的抗體分子組合物的抗原結(jié)合，在具有序列APPAHGVTSAPDT[GalNAcoc]RPAPGSTAPPAHGVTSA的合成的糖基化的MUC130-聚體肽上，在ELISA中測(cè)量嵌合PankoMab和Panko2的純化的抗體分子組合物。未糖基化的MUC1肽用作對(duì)照。使用在-20。C分份儲(chǔ)存的母液(1mg，在lmlbidest.HB2B0)，制備在PBS中的1ing/ml稀釋液。將50nl/孔吸量進(jìn)NUNCImniunoplateF96MaxiSorp，在4'C溫育實(shí)驗(yàn)平板過(guò)夜。次日，用PBS/0.2%Tween-20洗滌實(shí)驗(yàn)平板3次。隨后，用在PBS中的2。/。BSA封閉非特異性的結(jié)合位點(diǎn)，在室溫溫育至少1h，應(yīng)用50pl重組PankoMab(1-400ng/mlPBS/1%BSA)。用PBS/0.2%Tween-20洗滌3步后，采用過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的第二抗-人Fcyl抗體來(lái)檢測(cè)特異性地結(jié)合的抗體。為了檢測(cè)結(jié)合的第二抗體，用TMB(3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺)進(jìn)行顏色反應(yīng)。15分鐘后，通過(guò)加入2.5NHB2BSOB4B，猝滅反應(yīng)。使用微量滴定板光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量，使用450nm雙模式過(guò)濾器和630nm參照過(guò)濾器。從NM-F9分離的嵌合PankoMab的結(jié)合活性比從CHOdhfr-細(xì)胞分離的嵌合PankoMab的結(jié)合活性高約50%(圖8)。在ELISA中從高唾液酸化克隆NM-H9D8表達(dá)和克隆的嵌合Panko2的結(jié)合活性與GT-2x相當(dāng)，比CHOdhfr-細(xì)胞更高(圖9)。實(shí)施例10在NM-F9、NM-和CHOdhfr-細(xì)胞中表達(dá)的抗體分子組合物的聚糖分析通過(guò)酸水解，切割至少10(Vg純化的抗體的聚糖。通過(guò)綴合焚光染料DMB，特異性地標(biāo)記唾液酸。通過(guò)HPLC進(jìn)行分析，例如在Asahipak-NH2柱上，以分離糖。通過(guò)適當(dāng)?shù)耐僖核針?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，進(jìn)行唾液酸的鑒別和計(jì)算。在CH0dhfr-或NM-F9細(xì)胞中表達(dá)的嵌合PankoMab抗體分子組合物的分析揭示了CHOdhfr-產(chǎn)物的〈10。/。單唾液酸化和NM-F9或GT-2x產(chǎn)物的幾乎沒(méi)有唾液酸化。后者僅含有不帶電荷的聚糖。更詳細(xì)地，通過(guò)酸水解，切割至少100jag純化的抗體的聚糖。通過(guò)綴合熒光染料如DMB，特異性地標(biāo)記唾液酸。通過(guò)HPLC進(jìn)行分析，例如通過(guò)RP-18柱上的反相色i普。通過(guò)適當(dāng)?shù)耐僖核針?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，進(jìn)行唾液酸的鑒別和計(jì)算。對(duì)于帶電荷的聚糖結(jié)構(gòu)和半乳糖基化狀態(tài)的測(cè)定，用胰蛋白酶消化lO(Vg抗體，通過(guò)PNGaseF處理得到N-聚糖。用2-氨基苯酰胺(2-AB)標(biāo)記純化的聚糖，進(jìn)行陰離子交換色鐠HPLC(Asahi-PAK-柱)，用于測(cè)定帶電荷的N-聚糖結(jié)構(gòu)。對(duì)于半乳糖基化狀態(tài)的測(cè)定，用神經(jīng)氨酸酶處理N-聚糖，以消除唾液酸含量，并通過(guò)AminophaseHPLC(Luna-NH2-柱)進(jìn)行分離，通過(guò)質(zhì)譜法分析峰。通過(guò)反相色譜(RP18-柱)，在第二步中分離含有攜帶聚糖的潛在二等分GlcNAc的峰。由此，可以區(qū)分開(kāi)三觸角和雙觸角+平分結(jié)構(gòu)。通過(guò)2-AB標(biāo)記的聚糖的aminophaseHPLC(Luna-NH2-柱)，測(cè)定抗體的巖藻糖基化程度。通過(guò)積分來(lái)定量峰，通過(guò)質(zhì)謙法來(lái)分析潛在的聚糖結(jié)構(gòu)。測(cè)定巖藻糖基化的和未巖藻糖基化的結(jié)構(gòu)，并定量累積的峰面積。分析了在NM-F9、GT-2x、NM-H9D8、NM-H9D8-E6或CHOdhfr-細(xì)胞中表達(dá)的西妥昔單抗、PankoMab和Pankol的不同抗體分子組合物，結(jié)果總結(jié)在表3-4中。102通過(guò)ELISA或蛋白印跡分析，使用優(yōu)先結(jié)合ct2-6(SNA)或ct2-3(MAL-I)連接的唾液酸的凝集素來(lái)表征抗體唾液酸化。進(jìn)行蛋白印跡分析來(lái)鑒別在CHOdhfr-、NM-F9或NM-H9D8[DSMACC2806]中表達(dá)的抗體分子組合物的有差別地唾液酸化的重鏈。在還原條件下，通過(guò)10°/。丙烯酰胺凝膠中的SDS-PAGE，分離5jag每種抗體分子組合物。將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素，通過(guò)凝集素和/或通過(guò)第二抗-人IgG抗體顯影。圖10顯示了通過(guò)檢測(cè)2-6唾液酸化的第二抗-人IgG抗體(圖IOA)或SNA(圖10B)，在CH0dhfr-、NM-F9或NM-H9D8[DSMACC2806]中表達(dá)的嵌合PankoMab的抗體分子組合物的有差別地唾液酸化的重鏈。圖11顯示了通過(guò)SNA結(jié)合觀(guān)察到的在CHOdhfr-或NM-H9D8中表達(dá)的西妥昔單抗的抗體分子組合物的有差別地唾液酸化的重鏈。使用ELISA實(shí)驗(yàn)來(lái)分析從NM-F9、NM-H9D8或NM-H9D8-E6細(xì)胞的上清液分離的抗體的唾液酸化。將在PBS中的2ng/ml純化的抗體以5(Vl/孔覆蓋到96孔微量滴定板(Maxisorp)上在4'C過(guò)夜，封閉(PBS/BSA)，洗滌，用生物素化的SNA(2pg/ml，PBS/1%BSA)溫育1小時(shí)，再次洗滌。然后用POD-抗生蛋白鏈菌素溫育細(xì)胞，洗滌，用TMB顯影。通過(guò)加入2.5NH2S04來(lái)終止反應(yīng)，在450nm測(cè)量光密度，630nm作為參照。圖12顯示了在NM-H9D8或NM-H9D8-E6細(xì)胞中表達(dá)的抗體發(fā)生的SNA結(jié)合，但是在CHOdhfr-或GT-2x細(xì)胞中表達(dá)的抗體不結(jié)合。各個(gè)抗體的結(jié)合強(qiáng)度是不同的，這指示由各個(gè)抗體的精細(xì)結(jié)構(gòu)或在使用的條件下糖的可用性造成的不同唾液酸化程度。如下進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)將純化的在不同細(xì)胞系中表達(dá)的抗體包被到微量滴定板的孔中(2pg/ml，50pl/孔)，通過(guò)適當(dāng)?shù)纳锼鼗哪豐NA和MALI進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)神經(jīng)氨酸酶處理(O.1U/ml，在室溫溫育1小時(shí))，檢查唾液酸化對(duì)凝集素結(jié)合的依賴(lài)性。在圖13A和13B中解釋了西妥昔單抗的結(jié)果。進(jìn)行斑點(diǎn)印跡分析來(lái)鑒別在CHOdhfr-、NM-F9、NM-H9D8和NM-H9D8-E6細(xì)胞中表達(dá)的抗體的唾液酸化差異。將3]tig純化的抗體分別點(diǎn)到硝酸纖維素上，用PBS/BSA封閉，洗滌，通過(guò)檢測(cè)2，6-唾液酸化的SNA顯影。圖14顯示了從CHOdhfr-、NM-F9、NM-H9D8或NM-H9D8-E6細(xì)胞分離的嵌合抗體Pankol和Panko2的印跡。僅在從NM-H9D8或NM-H9D8-E6細(xì)胞分離的抗體上可檢測(cè)到2，6-唾液酸化。實(shí)施例11在NM-F9、NM-H9D8和CHOdhfr-細(xì)胞中表達(dá)的抗體分子組合物的生物利用度的檢測(cè)與在NM-F9細(xì)胞中表達(dá)的未唾液酸化的抗體PankoMab相比，在棵鼠中測(cè)得在NM-H9D8中表達(dá)的唾液酸化的抗體PankoMab具有更長(zhǎng)的生物利用度。給每只小鼠靜脈內(nèi)注射5pg純化的抗體，每組至少3只小鼠。在注射后的不同時(shí)間點(diǎn)(注射后5分鐘，2，5，8，24，48，72，和144小時(shí))，收集血樣。分離血清，在分析之前在-8(TC保存樣品。通過(guò)ELISA，測(cè)定這些樣品中的抗體滴度。圖15表明，從NM-H9D8細(xì)胞分離的嵌合PankoMab比從醒-F9細(xì)胞分離的嵌合PankoMab的可利用時(shí)間更長(zhǎng)，這可能是由于抗體的不同唾液酸化。實(shí)施例12在真核細(xì)胞中克隆表達(dá)hFSH的載體使用從德國(guó)RZPD得到的BAC克隆RZPDB737B122053D(FSHot基因組)、IRAUp969E0752D(FSHacDNA)和RZPDB737H0619D6(FSHP基因組)，用特異性引物PCR擴(kuò)增FSHcc和FSH0鏈的編碼序列。FSHct鏈的引物FSHa-wt-f-Kpnl:AAAGGTACCATGGATTACTACAGAAAATATG/FSHa-b-BamHI:AAAGGATCCTTAAGATTTGTGATAATAAC;FSHp鏈的引物FSHb-wt-f-HindIII:TTTAAGCTTATGAAGACACTCCAGTTTTTC/FSHb-b-BamHI:TTTGGATCCTTATTCTTTCATTTCACC擴(kuò)增后，通過(guò)HindlII/BamHI(FSH基因組P)和Kpnl/BamHI(FSH基因組a或FSHcDNAoc)，將產(chǎn)物克隆進(jìn)對(duì)應(yīng)的真核表達(dá)載體。通過(guò)編碼與TCR-先導(dǎo)序列融合的FSH0鏈的Genesynthesis，生產(chǎn)cDNA序列，并克隆進(jìn)真核表達(dá)載體(FSHcDNAP)。序列FSHcDNA0(TCR-先導(dǎo)序列標(biāo)有下劃線(xiàn))atggcctgccccggcttcctgtgggccctggtgatcagcacctgcctggaattctcggttctgcatcagcatcaacaccacctggtgcgccggctactgctacacccgggacctgaggggcctgggccccagcUctgcagcttcggcgagatgaaagagtga表達(dá)載體(pEFpuro和pEFdhfrButB)包含EF-1ct-啟動(dòng)子和HCMV增強(qiáng)子，SV40起點(diǎn)，多腺苷酸化信號(hào)，在栽體中的嘌呤霉素抗性基因(對(duì)于oc鏈)和用于CHO細(xì)胞表達(dá)的鼠二氫葉酸酶基因(dhfr)或用于載體的選擇和基因擴(kuò)增的SEQID1(序列1#)(用于NM-F9，GT-2x，K562、NM-H9、NM-D4或NM-H9D8表達(dá))(對(duì)于P鏈)。實(shí)施例13轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞以表達(dá)人重組hFSH，和在無(wú)血清條件下(GT-2x和NM-H9D8)或含有血清條件下(CHOdhfr-)制備高產(chǎn)細(xì)胞克隆的基因擴(kuò)增為了表達(dá)hFSH，通過(guò)使用DMRIE-C的脂轉(zhuǎn)染，或電穿孔(Nucleofector;Amaxa)(對(duì)于懸浮細(xì)胞GT-2x(FSHcDNAa/FSH基因組p)和NM-H9D8(FSHc腿ct/FSHcDNAP))和1ipofectamin或電穿孔(對(duì)于貼壁細(xì)胞系CHOdhfr-(FSH基因組ot/FSH基因組p)),用上述ct和P鏈的載體的混合物(1:1至l:3)共轉(zhuǎn)染GT-2x[DSMACC____]、NM-H9D8(應(yīng)ACC2806)和CHOdhfr-(ATCCNo.CRL-9096)。這些是在該方案中使用的示例性組合。hFSHa和hFSH0鏈表達(dá)質(zhì)粒的每種其它組合，產(chǎn)生相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。轉(zhuǎn)染后2天，將生長(zhǎng)培養(yǎng)基更換成選擇培養(yǎng)基(GT-2x和NM-H9D8:X-Vivo20培養(yǎng)基+0.75pg/ffll嘌呤霉素+50nM甲氨蝶呤；CHOdhfr-:DMEM+10%透析的FCS+2mML-谷氨酰胺+5ng/ml嘌呤霉素+50mM曱氨蝶呤)1周。通過(guò)將曱氨蝶呤濃度升高至100nM另外2周，進(jìn)行第一次擴(kuò)增。200nM甲氨蝶呤用于另外2周。擴(kuò)增的細(xì)胞群體的一部分是在沒(méi)有添加嘌呤霉素和甲氨蝶呤的培養(yǎng)基中克隆的單個(gè)細(xì)胞。通過(guò)升高甲氨蝶呤濃度，對(duì)其它細(xì)胞進(jìn)行新一輪的基因擴(kuò)增。以此方式，進(jìn)行2-3輪基因擴(kuò)增(100，200，500nM甲氨蝶呤)。另外，類(lèi)似地進(jìn)一步擴(kuò)增通過(guò)克隆篩選和分析鑒別出的最好的生產(chǎn)克隆。CHOdhfr-:用PBS洗滌生長(zhǎng)中的克隆的細(xì)胞，通過(guò)Accutase處理來(lái)收獲。將一半重新懸浮的細(xì)胞接種進(jìn)96-孔實(shí)驗(yàn)板，將另一半接種進(jìn)24-孔平板，用于進(jìn)一步培養(yǎng)。將實(shí)驗(yàn)平板培養(yǎng)20-24h。如比生產(chǎn)率(SPR)和倍增時(shí)間(g)的測(cè)定所述(參見(jiàn)下面)，分析每個(gè)孔的上清液的抗體滴度。使用MTT測(cè)定，測(cè)量相對(duì)細(xì)胞密度。詳細(xì)地，用MTT溶液溫育細(xì)胞2h，拋棄溶液，用在2-丙醇中的0.04MHC1溶液裂解細(xì)胞。2小時(shí)后，適度混合平板，使用微量滴定板光度計(jì)測(cè)量，使用570nra雙模式過(guò)濾器和630nm參照過(guò)濾器。GT-2x和醒-H9D8:離心96-孔培養(yǎng)板，拋棄上清液。將細(xì)胞重新懸浮于200jlU新鮮培養(yǎng)基中。將一半重新懸浮的細(xì)胞接種進(jìn)96-孔實(shí)驗(yàn)板，用100培養(yǎng)基稀釋?zhuān)瑢⒘硪话氡Ａ粼诳寺∑桨逯?，用于進(jìn)一步培養(yǎng)。培養(yǎng)2天后，離心實(shí)驗(yàn)平板，如比生產(chǎn)率(SPR)和倍增時(shí)間(g)的測(cè)定所述(參見(jiàn)下面)，分析20jil上清液的抗體滴度。通過(guò)在每個(gè)孔中加入10piWST-1溶液(Roche),使用WST-1測(cè)定，測(cè)量相對(duì)細(xì)胞密度。溫育1-3小時(shí)后，使用微量滴定板光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量，使用450nm雙模式過(guò)濾器和630nm參照過(guò)濾器。比生產(chǎn)率(SPR)和倍增時(shí)間(g)的測(cè)定對(duì)于每個(gè)克隆，在24-孔組織培養(yǎng)板的每個(gè)孔中的500pl生長(zhǎng)培養(yǎng)基中接種2xlOP"細(xì)胞。使細(xì)胞生長(zhǎng)3天，收獲條件培養(yǎng)基用于分析，如果必要，用Accutase取出細(xì)胞，并計(jì)數(shù)。通過(guò)ELISA,從培養(yǎng)基樣品定量測(cè)定比抗體滴度。給測(cè)定平板覆蓋對(duì)hFSHP(ab22473)特異性的小鼠mAB。用對(duì)hCGa(ab20712)特異性的山羊多克隆抗體溫育結(jié)合的重組hFSH，并用驢抗山羊IgGH+L-POD(JacksonlmmunoCat.No305-035-003)檢測(cè)。對(duì)于定量，使用純化的重組hFSH作為標(biāo)準(zhǔn)品。以皮克特定蛋白/細(xì)胞/天(pcd)為單位測(cè)量的SPR是生長(zhǎng)速率和生產(chǎn)力的函數(shù)，用下面的方程來(lái)計(jì)算總蛋白質(zhì)量SPR-----------------------------------累積細(xì)胞面積(ICA)(最終細(xì)胞數(shù)-起始細(xì)胞數(shù))x培養(yǎng)天數(shù)ICA=----------------------------------------------10gBeB(最終細(xì)胞數(shù)/起始細(xì)胞數(shù))用下面的方程來(lái)計(jì)算倍增時(shí)間g=log2x(培養(yǎng)小時(shí)數(shù))/log(最終細(xì)胞數(shù)/起始細(xì)胞數(shù))細(xì)胞系的平均產(chǎn)量和最大產(chǎn)量的測(cè)定如上所述有限稀釋(0，5細(xì)胞/孔)96-孔培養(yǎng)板中的來(lái)自200個(gè)理論涂布的單個(gè)克隆的單個(gè)細(xì)胞后，為生長(zhǎng)中的細(xì)胞克隆測(cè)定SPR,并測(cè)定平均值和偏差，以及不同細(xì)胞系和不同條件的最大產(chǎn)量。表7和表8對(duì)比了在含有血清條件下(CHOdhfr-)和無(wú)血清條件下(GT-2x和NM-H9D8)開(kāi)發(fā)的生產(chǎn)hFSH的CH0dhfr-、GT-2x和NM-H9D8細(xì)胞克隆的數(shù)據(jù)。實(shí)施例14hFSH分子組合物的分離為了生產(chǎn)和分離根據(jù)本發(fā)明的hFSH分子組合物，在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)分泌hFSH的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，直到達(dá)到約l-2x10P6P細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度。通過(guò)離心(400xg，15min)從細(xì)胞培養(yǎng)上清液去除細(xì)胞后，使用親和色傳純化嵌合抗體，其中使用偶聯(lián)到NHS活化柱(HiTrapNHS-活化的HP;GEHealthcare)上的抗hCGoc的多克隆抗體。將通過(guò)突然pH變化洗脫的純化的FSH級(jí)分重新懸浮于PBS,使用Centriprep離心試管(截止值10kDa，Millipore)濃縮，并通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分析(參見(jiàn)圖16)。實(shí)施例15根據(jù)本發(fā)明的FSH分子組合物的活性的測(cè)定根據(jù)后面所述的方法，可以測(cè)定攜帶不同糖基化模式的FSH分子的活性。為了用根據(jù)本發(fā)明的篩選方法選擇合適的細(xì)胞系(其提供優(yōu)化的糖基化)，在不同細(xì)胞系中表達(dá)FSH分子，從而從在例如唾液酸化程度、半乳糖基化和/或巖藻糖基化程度方面具有不同糖基化模式的單個(gè)細(xì)胞系得到FSH組合物。通過(guò)至少一種下述方法，可以測(cè)定具有最有利的活性和糖基化模式的FSH分子/組合物大鼠粒層細(xì)胞測(cè)定從DES處理過(guò)的切除垂體的大鼠得到粒層細(xì)胞。制備細(xì)胞的方法在Jia和Hsueh1985中詳細(xì)描述。在含有l(wèi)OOnMDES、0.125Ml-甲基-3-異丁基黃嘌呤、2mM谷氨酰胺、lpM雄烯二酮、100U/ml青霉素和100pg/ml鏈霉素、lng/ml牛胰島素和源自GT-2x和NM-H9D8細(xì)胞的遞增濃度的rFSH制品(0-1pg/ml)的McCoy's5A培養(yǎng)基中，以~160000細(xì)胞/孔，在24孔板中培養(yǎng)得到的細(xì)胞高達(dá)72小時(shí)。溫育后72h，收集培養(yǎng)基，在通過(guò)ELISA(Calbiotech#ES071S)定量雌二醇之前保存在-20°C。在37°C，在有0.125mM1-甲基-3-異丁基黃噤呤存在下，將用hFSH-受體轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞(2xl05細(xì)胞/35mm培養(yǎng)皿)暴露于遞增劑量的從GT-2x和NM-H9D8細(xì)胞得到的每種FSH蛋白分子組合物(其范圍是0-l^ig/mlFSH)24h，最高達(dá)72小時(shí)。溫育后，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)，通過(guò)cAMPDirectBiotrakEIA(GEHealthcare,Cat.no.:RPN225)測(cè)定總(細(xì)胞內(nèi)的和細(xì)胞外的)cAMP濃度。GFSHR-17細(xì)胞測(cè)定用含有5%月臺(tái)牛血、清(BiochromKG,Berlin,Germany)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基HamF12(1:1v:v;BiochromKG，Berlin,Germany),培養(yǎng)細(xì)胞。以2xl05細(xì)胞/24孔板涂布細(xì)胞，用從GT-2x和NM-H9D8細(xì)胞得到的FSH蛋白分子組合物溫育24h，范圍是0-ljag/ml1-24小時(shí)。溫育后，收集培養(yǎng)基，在根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)4吏用孕酉同ELISA觀(guān)寸定(BiochemImmuno系纟克，F(xiàn)reiburg,Germany)定量孕酮之前，保存在-20。C。人粒層細(xì)胞測(cè)定如Khan等人，1990所述，富集從參與Miinster大學(xué)的體外受精方案的婦女得到的來(lái)自卵泡抽吸物的粒層-葉黃質(zhì)細(xì)胞，接種進(jìn)6-孔培養(yǎng)板(1-1.5x105活細(xì)胞/孔)。在37°C,在5%C02氣氛下，在添加了10%熱滅活的胎牛血清(FCS;Gibco，Eggenstein，Germany)、青霉素(50units/ml)、鏈霉素(50pg/ml)、慶大霉素(100pg/rnl)和兩性霉素(0.6pg/ml)的HAM，sF12/Dulbecco氏改良的基本培養(yǎng)基(DMEM)(1:1;ICNBiomedicals,Meckenheim，Germany)中培養(yǎng)細(xì)胞。在37。C，在有0.125raMl-曱基-3-異丁基黃嘌呤存在下，將細(xì)胞暴露于遞增劑量的從GT-2x和NM-H9D8細(xì)胞得到的每種FSH蛋白分子組合物(其范圍是O-ljug/mlFSH)24h，最高達(dá)72小時(shí)。溫育后，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)，通過(guò)cAMPDirectBiotrakEIA(GEHealthcare,Cat.no.:RPN225)測(cè)定總(細(xì)胞內(nèi)的和細(xì)胞外的)cAMP濃度。實(shí)施例16在GF-2X和CH0細(xì)胞中表達(dá)的FSH組合物的聚糖分析進(jìn)行蛋白印跡分析來(lái)鑒別在CHOdhfr-、GT-2x[DSMACC____]或NM-H9D8[DSMACC2806]中表達(dá)的有差別地唾液酸化的FSH分子組合物。在還原條件下，通過(guò)10%丙烯酰胺凝膠中的SDS-PAGE，分離5pg每種抗體分子組合物。將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素，通過(guò)檢測(cè)2-6唾液酸化的SNA顯影(圖17)。根據(jù)實(shí)施例IO進(jìn)行詳細(xì)的聚糖分析，以測(cè)定唾液酸含量、電荷分布、巖藻糖含量、半乳糖基化狀態(tài)和二等分GlcNAc含量。結(jié)果顯示在GT-2X中可高產(chǎn)量地生產(chǎn)FSH(見(jiàn)圖17)。其中，產(chǎn)物沒(méi)有顯示任何可檢測(cè)的2-6連接的NeuNAc(見(jiàn)圖17的泳道1)。相反，在NM-H9D8中產(chǎn)生的FSH顯示量相當(dāng)高的可檢測(cè)的2-6連接的NeuNAc。活性可用通過(guò)實(shí)施例15所述的方法檢測(cè)。才艮據(jù)IUPAC-IUBMB推薦(1996)的定義Neu5Gc:5-A^羥乙?；?a-神經(jīng)氨酸Neu5Ac和NeuNAc:5-^乙酰基-a-神經(jīng)氨酸Galal,3Gal和Galocl，3Gal:a-D-吡喃型半乳糖基-(1—3)-吡喃型半乳糖基-鄰近的糖2,3連接的神經(jīng)氨酸5-^-乙?；?ct-神經(jīng)氨?；?(2—3)-鄰近的糖2，6連接的神經(jīng)氨酸5-^乙?；?a-神經(jīng)氨酰基-(2—6)-鄰近的糖應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于本文所述的特定方法、方案和/或試劑，它們可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解，本文使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描迷特定實(shí)施方案的目的，無(wú)意限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅由所附權(quán)利要求書(shū)來(lái)限定。SEQID:序列#1SEQID1KGIKYKFEVYEKKD序列#2SEQID2KGIKYKFEVYEKND序列#3SEQID3KGIKYKFEVYEKND序列#4SEQIDKGIKYKFEVYEKND序列#5SEQID4KGIKYKFEVYEKND序列#6SEQID6KGIKYKFEVYEKND序列#7SEQID7KGIKYKFEVYEKND序列#8SEQID8KGIKYKFEVYEKKD序列#9SEQID9KGIKYKFEVYEKKD序列#10SEQID10MWLGSLLLLGTVACSISA表1<table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table>表10Panko1Fucneg+BisGlcNAcneg.H9D8=54%H9D8-E6=79%Fucpos+BisGlcNAcposH9D8=5%H9D8-E6-2%Fucneg+BisGlcNAcposH9D8=0°/。H9D8-E6-0%Panko2Fucneg+BisGlcNAcneg.H9D8=Fucpos+BisGlcMcposH9D8=Fucneg+BisGlcNAcposH9D8=~0°/。F9和GT-2X=_5-6%36%F9和GT-2X=29%0%F9和GT-2X=0%權(quán)利要求1.生產(chǎn)蛋白分子組合物的方法，其包含(a)在永生化人血細(xì)胞宿主細(xì)胞中引入至少一種核酸，其編碼所述蛋白的至少一部分；和(b)在允許生產(chǎn)所述蛋白分子組合物的條件下，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；和(c)分離所述蛋白分子組合物。2.根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)蛋白分子組合物、優(yōu)選抗體分子組合物的方法，其包含下述步驟(a)在永生化人血細(xì)胞宿主細(xì)胞中引入至少一種核酸，其編碼蛋白或其至少一部分；其中選擇生產(chǎn)具有至少一種下述糖基化特征的蛋白組合物的所述宿主細(xì)胞(i)它不含有可檢測(cè)的NeuGc;和/或(ii)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從C畫(huà)hfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中的相同量的蛋白分子相比，它在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白分子組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上具有增加的半乳糖基化程度；和/或(iii)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中的相同量的蛋白分子相比，它具有高至少5%的量的G2結(jié)構(gòu)，該G2結(jié)構(gòu)是在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白分子組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上；和/或(iv)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從C畫(huà)hfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上具有低至少5%的量的GO結(jié)構(gòu)；和/或(v)它不含有可檢測(cè)的末端Galal-3Gal;和/或(vi)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9Q96]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上包含少至少5%的量的巖藻糖；和/或(vii)它包含至少一個(gè)含有二等分GlcNAc的糖結(jié)構(gòu)；和/或(viii)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，具有與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物的唾液酸化模式相比改變的唾液酸化模式；(b)在允許生產(chǎn)所述蛋白分子組合物的條件下，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；和(c)分離所述蛋白分子組合物，其中所述蛋白分子具有(i)至(viii)的至少一種糖基化特征。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述唾液酸化模式的特征在于至少一種下述特征-它包含a2-6連接的NeuNAc;和/或—它具有增加的唾液酸化程度，當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CH0dhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，它在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上具有高至少15%量的NeuNAC，和/或-它具有降低的唾液酸化程度，當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物的相同量的蛋白分子相比，它在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上，具有低至少15%量的NeuMc，和/或-當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，它在總糖單元上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的特定糖基化位點(diǎn)處的至少一個(gè)特定糖鏈上包含多至少20%的帶電荷的N-糖苷連接的糖鏈，-當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，它在總糖單元上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的特定糖基化位點(diǎn)處的至少一個(gè)特定糖鏈上包含少至少20%的帶電荷的N-糖苷連接的糖鏈。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中至少一項(xiàng)的方法，其中選擇所述宿主細(xì)胞以生產(chǎn)糖蛋白，其包含總糖單元或在所述蛋白組合物的蛋白分子的特定糖基化位點(diǎn)處的至少一個(gè)特定糖鏈的至少10%糖結(jié)構(gòu)，且缺少巖藻糖。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中至少一項(xiàng)的方法，其中選擇所述宿主細(xì)胞以生產(chǎn)糖蛋白，其包含總糖單元或在所述蛋白組合物的蛋白分子的特定糖基化位點(diǎn)處的至少一個(gè)特定糖鏈的至少2%糖結(jié)構(gòu)，其含有二等分GlcMc。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中至少一項(xiàng)的方法，其中選擇所述宿主細(xì)胞以生產(chǎn)糖蛋白，其包含-在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上的超過(guò)35%G2結(jié)構(gòu)；和/或-在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上的小于22%GO結(jié)構(gòu)。7.根據(jù)權(quán)利要求l-6中至少一項(xiàng)的方法，其中生產(chǎn)的所述蛋白分子組合物具有至少一種下述特征-當(dāng)在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，與相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物相比，它具有增加的活性和/或尤其增加的產(chǎn)量；-當(dāng)在細(xì)胞系CHOdhfr-〖ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，與相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物相比，它尤其具有提高的同質(zhì)性；-當(dāng)在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，它具有增加的平均或最大產(chǎn)量，這比來(lái)自相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物的產(chǎn)量高至少10%;和/或-當(dāng)在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，與相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物相比，它具有提高的同質(zhì)性，這是提高的糖基化同質(zhì)性；-當(dāng)在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，與相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物相比，它具有增加的活性；-在所述蛋白分子是抗體分子的情況下，當(dāng)在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，它具有增加的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，這比來(lái)自相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性高至少2倍；和/或-在所述蛋白分子是抗體分子的情況下，當(dāng)在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，它具有增加的抗原介導(dǎo)的或Fc-介導(dǎo)的結(jié)合，這比來(lái)自相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物的結(jié)合高至少15°/n、優(yōu)選20%、25%、30%、35°/。、40°/。、45%和優(yōu)選50%。8.權(quán)利要求1-7中至少一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞在無(wú)血清條件下生長(zhǎng)和生產(chǎn)蛋白分子組合物。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中至少一項(xiàng)的方法，其中選擇所述宿主細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)蛋白組合物，后者包含具有下述特征糖基化組合的蛋白分子(a)-它不含有可檢測(cè)的NeuGc-它不含有可檢測(cè)的Galal-3Gal-它包含在權(quán)利要求2中定義的半乳糖基化模式-它具有在權(quán)利要求2中定義的巖藻糖含量-它包含bisecGlcNAc-當(dāng)在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)與相同蛋白分子的蛋白組合物相比，或與唾液酸化缺陷型細(xì)胞系例如NM-F9和NM-D4相比，它包含增加量的唾液酸；(b)-它不含有可檢測(cè)的NeuGc-它不含有可檢測(cè)的Galal-3Gal-它包含在權(quán)利要求2中定義的半乳糖基化模式-它具有在權(quán)利要求2中定義的巖藻糖含量-它包含bisecGlcMc-當(dāng)在細(xì)胞系CH0dhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí),與相同蛋白分子的蛋白組合物相比，它包含減少量的唾液酸；(c)-它不含有可檢測(cè)的NeuGc-它不含有可檢測(cè)的Galal-3Gal-它包含在權(quán)利要求2中定義的半乳糖基化模式-它具有在權(quán)利要求2中定義的巖藻糖含量-它包含bisecGlcNAc-它包含2-6NeuNAc。10.權(quán)利要求1-9中至少一項(xiàng)的方法，其中使用選自下述組1-4的宿主細(xì)胞(a)組1，其包含具有高唾液酸化活性的宿主細(xì)胞，例如K562或源自它們的細(xì)胞系；(b)組2，其包含因?yàn)檫z傳缺陷或表達(dá)抑制系統(tǒng)而具有低或無(wú)唾液酸化活性的宿主細(xì)胞，包括NM-F9[DSMACC2606],服-D4[DSMACC2605]和GT-2X;(c)組3，其包含具有比K562更高唾液酸化程度的宿主細(xì)胞，例如NM-H9和NM-H9D8或源自它們的細(xì)胞系；(d)組4，其包含具有低或甚至無(wú)巖藻糖基化活性的宿主細(xì)胞，例如NM-H9D8-E6和NMH9D8-E6Q12或源自它們的細(xì)胞系。11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中至少一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞是人骨髓白血病起源，優(yōu)選地選自K562、NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、GT-2X[應(yīng)ACC___________]、NM-H9、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8[DSMACC2806]、NM-H9D8-E6、NM-H9D8-B6Q12或源自它們的細(xì)胞或細(xì)胞系。12.根據(jù)權(quán)利要求l-ll中至少一項(xiàng)的方法，其中在宿主細(xì)胞中引入編碼抗葉酸劑抗性的DHFR-變體的核酸。13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中除了包含編碼要表達(dá)的所述蛋白的至少一部分的核酸的載體以外，通過(guò)單獨(dú)的載體，引入編碼所述抗葉酸劑抗性的DHFR變體的核酸，或其中使用載體，其至少包含編碼要表達(dá)的所述蛋白的至少一部分的核酸和編碼抗葉酸劑抗性的DHFR變體的核酸。14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的方法，其中用所述抗葉酸劑培養(yǎng)所述宿主細(xì)月包。15.根據(jù)權(quán)利要求12-14中至少一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)逐步增加培養(yǎng)物中的抗葉酸劑濃度，擴(kuò)增編碼要表達(dá)的所述蛋白分子的至少一部分的所述核酸序列。16.根據(jù)權(quán)利要求12-15中至少一項(xiàng)的方法，其中滿(mǎn)足至少一種下述特征(a)所述抗葉酸劑是曱氨蝶呤(b)編碼所述抗葉酸劑抗性的DHFR變體的核酸會(huì)編碼序列IDNo.1-9、優(yōu)選ID.No1的多肽。17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中至少一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白是抗體。18.根據(jù)權(quán)利要求1-17中至少一項(xiàng)的生產(chǎn)抗體分子組合物的方法，其包含(a)在人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞中引入至少一種編碼抗體分子或其至少一部分的核酸、和包含編碼序列#1至序列#9的至少一種多肽的至少一種核酸序列的至少一種核酸，和(b)通過(guò)用曱氨蝶呤培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，擴(kuò)增編碼所述抗體分子或其至少一部分的核酸序列；和(c)在允許生產(chǎn)所述抗體分子組合物的條件下，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，和(d)分離所述抗體分子組合物。19.根據(jù)權(quán)利要求1-18中至少一項(xiàng)的生產(chǎn)具有增加的活性和/或增加的產(chǎn)量和/或提高的同質(zhì)性的抗體分子組合物的方法，其包含(a)在人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞中引入編碼抗體分子或其至少一部分的至少一種核酸；和(b)在允許生產(chǎn)所述抗體分子組合物的條件下，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；和(c)分離具有增加的活性和/或增加的產(chǎn)量和/或提高的同質(zhì)性的所述抗體分子組合物。20.根據(jù)權(quán)利要求1-19中至少一項(xiàng)的生產(chǎn)具有增加的活性和/或增加的產(chǎn)量和/或提高的同質(zhì)性的抗體分子組合物的方法，其包含(a)在人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞中引入至少一種編碼抗體分子或其至少一部分的核酸、和包含編碼序列#1至序列#9的至少一種多肽的至少一種核酸序列的至少一種核酸，和(b)通過(guò)用甲氨蝶呤培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，擴(kuò)增編碼所述抗體分子或其至少一部分的核酸序列；和(c)在允許生產(chǎn)所述抗體分子組合物的條件下，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，和(d)分離具有增加的活性和/或增加的產(chǎn)量和/或提高的同質(zhì)性的所述抗體分子組合物。21.選擇用于生產(chǎn)具有至少一種下述糖基化特征的蛋白組合物的宿主細(xì)胞的方法(i)它不含有可檢測(cè)的NeuGc;和/或(ii)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí),與從C腿hfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，它在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上具有增加的與GlcMc相連的半乳糖的半乳糖基化程度；和/或(iii)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，它在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上具有高至少5%的量的G2結(jié)構(gòu)；和/或(iv)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，它在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上具有低至少5M的量的G0結(jié)構(gòu)；和/或(v)它不含有可檢測(cè)的末端Gal"l-3Gal;和/或(vi)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí),與從C,hfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，它在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上具有低至少5°/的量的巖藻糖；和/或(vii)它包含至少一個(gè)含有二等分GlcNAc的糖結(jié)構(gòu)；和/或(viii)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，具有與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物的唾液酸化模式相比改變的唾液酸化模式；其包含下述步驟(a)在至少2種提供不同糖基化模式的不同宿主細(xì)胞中引入至少一種編碼蛋白或其至少一部分的核酸；其中至少一種所述宿主細(xì)胞是永生化人血細(xì)胞，和(b)培養(yǎng)所述至少2種不同的宿主細(xì)胞，其中每種不同宿主細(xì)胞生成的蛋白組合物的糖基化模式不同于另一種宿主細(xì)胞生成的糖基化模式；(c)從至少2種不同的宿主細(xì)胞分離具有不同糖基化模式的所述表達(dá)的蛋白組合物；和(d)選擇所述生產(chǎn)蛋白組合物的宿主細(xì)胞，所述蛋白組合物具有在(i)至(viii)中定義的至少一種糖基化特征。22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述蛋白組合物具有至少一種下述特征-在它是抗體分子組合物的情況下，當(dāng)在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，它具有比來(lái)自相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性高至少2倍的增加的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性；和/或-在它是抗體分子組合物的情況下，當(dāng)在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，它具有比來(lái)自相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物的結(jié)合高至少50%的增加的抗原介導(dǎo)的或Fc-介導(dǎo)的結(jié)合；和/或-當(dāng)在細(xì)胞系CH0dhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，它具有比來(lái)自相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物的產(chǎn)量高至少10°/。的增加的所述蛋白分子組合物的平均或最大產(chǎn)量。23.權(quán)利要求21或22的方法，其中所述人骨髓白血病起源的至少2種不同的宿主細(xì)胞中的至少一種是K562、NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[讓ACC2605]、GT-2X[讓ACC___________]、NM-H9、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8[羅ACC2806〗、NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12或源自它們的細(xì)胞或細(xì)胞系。24.權(quán)利要求21或22的方法，其中所述至少2種不同的宿主細(xì)胞選自下述組1至4:(a)組1，其包含具有高唾液酸化活性的宿主細(xì)胞，例如K562或源自它們的細(xì)胞系；(b)組2,其包含因?yàn)檫z傳缺陷而具有低或無(wú)唾液酸化的宿主細(xì)胞，例如NM-F9[DSMACC2606〗、NM-D4[DSMACC2605]和GT-2X或源自它們的細(xì)l包系；(c)組3，其包含具有比K562更高唾液酸化程度的宿主細(xì)胞，例如NM-H9和NM-H9D8或源自它們的細(xì)胞系；(d)組4，其包含具有低或甚至無(wú)巖藻糖基化活性的宿主細(xì)胞，例如NM-H9D8-E6或NM-H9D8-E6Q12或源自它們的細(xì)胞系。25.根據(jù)權(quán)利要求21-24中至少一項(xiàng)的方法，其中選擇至少一種宿主細(xì)胞，其生產(chǎn)具有權(quán)利要求2-9中定義的糖基化模式的蛋白組合物、優(yōu)選抗體組合物。26.通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1-20中的至少一項(xiàng)的生產(chǎn)方法可得到的蛋白或蛋白分子組合物。27.根據(jù)權(quán)利要求26的蛋白或蛋白分子組合物，其中所述組合物具有至少一種下述特征(i)它不含有可檢測(cè)的NeuGc;和/或(ii)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，它在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上具有增加的半乳糖的半乳糖基化程度；和/或(iii)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí),與從CH0dhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，它在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白分子組合物中蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上具有增加至少5%的量的G2結(jié)構(gòu)；和/或(iv)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，它在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白分子組合物中蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上具有降低至少5%的量的GO結(jié)構(gòu)；和/或(v)它不含有可檢測(cè)的末端Galocl-3Gal;和/或(vi)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，它在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白分子組合物中蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上包含降低至少5%的量的巖藻糖；和/或(vii)它包含至少一個(gè)含有二等分GlcNAc的糖結(jié)構(gòu)；和/或(viii)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，它具有與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物的唾液酸化模式相比改變的唾液酸化模式。28.根據(jù)權(quán)利要求27的蛋白或蛋白分子組合物，其中所述蛋白分子組合物具有至少一種下述特征-它包含ct2-6連接的NeuNAc,和/或-它具有增加的唾液酸化程度，當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CH0dhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，它在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上具有高至少15%的量的NeuNAcj和/或-它具有降低的唾液酸化程度，當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，它在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上具有低至少15%的量的NeuNAc.，和/或-當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，它在總糖單元上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的特定糖基化位點(diǎn)處的至少一個(gè)特定糖鏈上包含多至少20%的帶電荷的N-糖苷連接的糖鏈，和/或-當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物中相同量的蛋白分子相比，它在總糖單元上或在所述蛋白組合物的蛋白分子的特定糖基化位點(diǎn)處的至少一個(gè)特定糖鏈上包含少至少20%的帶電荷的N-糖苷連接的糖鏈，和/或-它在總糖單元上或在所述蛋白分子組合物的蛋白分子的特定糖基化位點(diǎn)處的至少一個(gè)特定糖鏈上包含至少10%糖結(jié)構(gòu)，且缺少巖藻糖；和/或-它在總糖單元上或在所述蛋白分子組合物的蛋白分子的特定糖基化位點(diǎn)處的至少一個(gè)特定糖鏈上包含至少2%糖結(jié)構(gòu)，其含有二等分GlcNAc;和/或-它在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白分子組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上包含超過(guò)35%的G2結(jié)構(gòu)；和/或-它在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述蛋白分子組合物的蛋白分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上包含小于22%的GO結(jié)構(gòu)；和/或-當(dāng)在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，與相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物相比，它具有增加的活性和/或增加的產(chǎn)量；和/或-當(dāng)在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí),與相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物相比，它具有提高的同質(zhì)性；和/或-當(dāng)在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，它具有增加的平均或最大產(chǎn)量，這比來(lái)自相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物的產(chǎn)量高至少10%;和/或-當(dāng)在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，它具有增加的活性，這比來(lái)自相同蛋白分子的至少一種蛋白分子組合物的活性高至少10%;和/或-當(dāng)在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，它具有提高的同質(zhì)性，這是提高的糖基化同質(zhì)性，其中所迷抗體分子組合物具有比來(lái)自相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物的唾液酸化程度更低的唾液酸化程度；和/或在所述蛋白分子是抗體分子的情況下，它具有增加的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，當(dāng)在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，這比來(lái)自相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性高至少2倍；和/或-在所述蛋白分子是抗體分子的情況下，它具有增加的抗原介導(dǎo)的或Fc-介導(dǎo)的結(jié)合，當(dāng)在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，這比來(lái)自相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物的結(jié)合高至少50%。29.根據(jù)權(quán)利要求26-28中的至少一項(xiàng)的蛋白或蛋白分子組合物，其中所述組合物包含至少一種結(jié)合MUC1表位的抗體分子，其包含胞外串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的氨基酸序列DTR。30.根據(jù)權(quán)利要求29的蛋白或蛋白分子組合物，其中所述抗體結(jié)合TA-MUC1表位，其包含氨基酸序列DTR,其中所述T被糖基化。31.根據(jù)權(quán)利要求30的抗體或抗體分子組合物，其中所述抗體以比未糖基化的表位更高的親和力結(jié)合糖基化的表位。32.根據(jù)權(quán)利要求30或31的抗體或抗體分子組合物，其中所述抗體選自-抗體PankoMab或其變體，它們竟?fàn)幮缘亟Y(jié)合與PankoMab相同的TA-MUC1表位；-抗體Panko1或其變體，它們竟?fàn)幮缘亟Y(jié)合與Panko1相同的TA-MUC1表位；-抗體Panko2或其變體，它們竟?fàn)幮缘亟Y(jié)合與Panko2相同的TA-MUC1表位；33.根據(jù)權(quán)利要求26至32中的一項(xiàng)、尤其權(quán)利要求32的抗體或抗體分子組合物，其中所述抗體具有至少一種下述糖基化特征(a)它具有增加的唾液酸化程度，當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物中相同量的抗體分子相比，在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述抗體分子組合物的抗體分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上的N-乙?；窠?jīng)氨酸的量高至少15%;(b)它具有更高的半乳糖基化程度，當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物中相同量的抗體分子相比，在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述抗體分子組合物的抗體分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上的G2結(jié)構(gòu)的量高至少5%;(c)它包含bisecGlcNAc。34.根據(jù)權(quán)利要求26至33中的一項(xiàng)、尤其權(quán)利要求33的抗體或抗體分子組合物，其中所述糖基化模式導(dǎo)致下述活性模式(a)比在CHO細(xì)胞中表達(dá)的相同抗體的活性高超過(guò)15%的CDC活性；(b)與不具有或具有低程度的可檢測(cè)的唾液酸化的抗體相比延長(zhǎng)了因子2的血清半衰期；(c)它具有增加的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，當(dāng)在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)時(shí)，比來(lái)自相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性高至少2倍。35.根據(jù)權(quán)利要求29-34中的至少一項(xiàng)的抗體或抗體分子組合物，其中所述抗體選自(a)PankoMab抗體或其變體，其具有(i)比來(lái)自在細(xì)胞系CH0dhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)的相同抗體分子的抗體分子組合物的活性高至少2倍或至少4倍的增加的ADCC活性；和/或(ii)比來(lái)自在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)的相同抗體分子的抗體分子組合物的活性高至少2倍的增加的CDC活性；和/或(iii)比來(lái)自在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)的相同抗體分子的抗體分子組合物的活性高至少20%、優(yōu)選30%或40%的更高的抗原結(jié)合活性；和/或(iv)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物中相同量的抗體分子相比，在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述抗體分子組合物的抗體分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上的G2結(jié)構(gòu)的量高至少50%;和/或(v)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物中相同量的抗體分子相比，在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述抗體分子組合物的抗體分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上的二等分GlcNAc結(jié)構(gòu)的量高至少20%，其中通過(guò)在宿主細(xì)胞NM-F9中生產(chǎn)，與當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的PankoMab分子組合物相比，以更高的產(chǎn)量得到所述PankoMab分子組合物；(b)PankoMab抗體或其變體，其具有(i)比來(lái)自在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)的相同抗體分子的抗體分子組合物的活性高至少3倍的增加的ADCC活性；和/或(ii)比來(lái)自在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)的相同抗體分子的抗體分子組合物的活性高至少20°/。、優(yōu)選30%或40%的增加的CDC活性；和/或(iii)可檢測(cè)的2-6NeuNAc;和/或(iv)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從NM-F分離的相同抗體分子的抗體分子組合物相比延長(zhǎng)的血清半衰期；和/或(v)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí),與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物中相同量的抗體分子相比，在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述抗體分子組合物的抗體分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上的G2結(jié)構(gòu)的量高至少20°/。；和/或(vi)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從C廳hfr-[ATCCNo.CRL-9096〗分離的相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物中相同量的抗體分子相比，在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述抗體分子組合物的抗體分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上的二等分GlcNAc結(jié)構(gòu)的量高至少20%;其中通過(guò)在宿主細(xì)胞NM-H9D8中生產(chǎn)，與當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的PankoMab分子組合物相比，以更高的產(chǎn)量得到所述PankoMab分子組合物；(c)Panko2抗體或其變體，其具有(i)比來(lái)自在細(xì)胞系CH0dhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)的相同抗體分子的抗體分子組合物的活性高至少4倍的增加的ADCC活性；和/或(ii)可檢測(cè)的2-6NeuNAc;和/或(iii)與來(lái)自在細(xì)胞系CH0dhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)的相同抗體分子的抗體分子組合物的活性相比高至少30°/、優(yōu)選40%或50%的更高的抗原結(jié)合活性；和/或其中通過(guò)在宿主細(xì)JJ包NM-H9D8中生產(chǎn)，得到所述Panko2分子組合物；(d)Panko2抗體或其變體，其具有(i)比來(lái)自在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)的相同抗體分子的抗體分子組合物的活性高至少4倍的增加的ADCC活性；和/或(ii)比來(lái)自在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)的相同抗體分子的抗體分子組合物的活性高至少30%、優(yōu)選40%或50%的更高的抗原結(jié)合活性；和/或其中通過(guò)在宿主細(xì)胞GT-2x中生產(chǎn)，得到所述Panko2分子組合物；(e)Panko1抗體或其變體，其具有(i)比來(lái)自在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)的相同抗體分子的抗體分子組合物的活性高至少8倍的增加的ADCC活性；和/或(ii)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物中相同量的抗體分子相比，在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述抗體分子組合物的抗體分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上的G2結(jié)構(gòu)的量高至少50%;和/或(iii)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物中相同量的抗體分子相比，在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述抗體分子組合物的抗體分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上的未巖藻糖基化的結(jié)構(gòu)的量高至少70%;其中通過(guò)在宿主細(xì)胞NM-H9D8-E6中生產(chǎn)，得到所述Panko1分子組合物；(f)Pankol抗體或其變體，其具有(i)比來(lái)自在細(xì)胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表達(dá)的相同抗體分子的抗體分子組合物的活性高至少50%的增加的ADCC活性；和/或(ii)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物中相同量的抗體分子相比，在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述抗體分子組合物的抗體分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上的G2結(jié)構(gòu)的量高至少50%;和/或(iii)當(dāng)在其中表達(dá)時(shí)，與從CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分離的相同抗體分子的至少一種抗體分子組合物中相同量的抗體分子相比，在總糖結(jié)構(gòu)上或在所述抗體分子組合物的抗體分子的一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)處的糖結(jié)構(gòu)上的未巖藻糖基化的結(jié)構(gòu)的量高至少50%;其中通過(guò)在宿主細(xì)胞NM-H9D8中生產(chǎn)，得到所述Panko1分子組合物。36.根據(jù)權(quán)利要求26-34中的至少一項(xiàng)的抗體，它是抗體西妥昔單抗或其變體，結(jié)合與西妥昔單抗相同的表位。37.根據(jù)權(quán)利要求26-30中的至少一項(xiàng)的蛋白，其中所述蛋白是FSH。38.根據(jù)權(quán)利要求37的蛋白，其中所述FSH包含可檢測(cè)的2-6連接的NeuMc。39.用于生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求26-38中的至少一項(xiàng)的蛋白、尤其抗體組合物的永生化人血細(xì)胞，它優(yōu)選是人骨髓白血病起源的宿主細(xì)胞，其包含在適當(dāng)表達(dá)載體中的至少一種編碼蛋白分子或其至少一部分的核酸。40.根據(jù)權(quán)利要求39的宿主細(xì)胞，其包含編碼蛋白分子或其至少一部分的至少一種核酸，和含有編碼序列#1至序列#9的至少一種多肽的至少一種核酸序列的至少一種核酸。41.根據(jù)權(quán)利要求39或36的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是K562、NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、NM-H9，H9、醒-HIO、NM-E-2F9、NM-C-2F5、腿-H9D8或畫(huà)-H9D8-E6或從任一種所述宿主細(xì)胞衍生的細(xì)胞或細(xì)胞系，其包含編碼蛋白分子或其至少一部分的至少一種核酸，和含有編碼序列#1至序列#9的至少一種多肽的至少一種核酸序列的至少一種核酸。42.根據(jù)權(quán)利要求39-41中的至少一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求41或42的至少一種核酸。43.根據(jù)權(quán)利要求39-42中的任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述編碼的抗體分子是在權(quán)利要求31至36中定義的抗體。44.根據(jù)權(quán)利要求39-43中的任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述編碼的抗體分子是嵌合的或人源化的抗體，尤其PankoMab、Panko1、Panko2或西妥昔單抗或其變體，它們結(jié)合相同的表位。45.根據(jù)權(quán)利要求39-44中的任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其在無(wú)血清條件下生長(zhǎng)和生產(chǎn)抗體分子組合物。46.—種核酸，其包含(a)編碼蛋白分子或其至少一部分的序列，和(b)編碼序列#1至序列#9的序列的至少一個(gè)序列。47.—種核酸，其包含(a)編碼蛋白分子或其至少一部分的序列，和(b)編碼序列#1的至少一個(gè)序列。全文摘要本發(fā)明涉及生產(chǎn)具有確定的糖基化模式的蛋白分子組合物的方法，其包含(a)在永生化人血細(xì)胞宿主細(xì)胞中引入至少一種核酸，其編碼所述蛋白的至少一部分；和(b)在允許生產(chǎn)所述蛋白分子組合物的條件下，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；和(c)分離所述蛋白分子組合物。文檔編號(hào)C07K14/59GK101588817SQ200780041241公開(kāi)日2009年11月25日申請(qǐng)日期2007年9月10日優(yōu)先權(quán)日2006年9月10日發(fā)明者A·丹尼爾奇克,A·勒夫勒,H·鮑邁斯特,L·施特克爾,R·施塔恩,S·戈勒茨申請(qǐng)人:葛萊高托普有限公司