專利名稱：：新的化合物及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及安莎霉素(ansamycin)類似物，其可用于例如癌癥、B細(xì)胞惡性病、癡疾、真菌感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及神經(jīng)變性疾病、有賴于血管生成的疾病、自身免疫疾病的治療或者作為癌癥的預(yù)防性預(yù)處理。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)這些化合物的方法以及它們?cè)卺t(yī)療中的用途。
背景技術(shù)：
：研發(fā)具有低毒性和有利藥代動(dòng)力學(xué)特征的高特異性抗癌藥物構(gòu)成了抗癌治療的主要挑戰(zhàn)。90kDa熱休克蛋白(Hsp卯)是一種參與蛋白質(zhì)折疊和裝配的豐富的分子伴倡，在這些蛋白質(zhì)中有許多參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(綜述參見(jiàn)Neckers，2002;Sreedhar等，2004a;Wegele等，2004及其中的參考文獻(xiàn))。迄今已有近50種這些所謂的客戶蛋白(clientprotein)得以鑒定，包括類固醇受體、非受體酪氨酸激酶如S/T家族、細(xì)胞周期素依賴性激酶如cdk4和cdk6、嚢性跨膜調(diào)控因子、一氧化氮合酶等等(Donz6和Picard,1999;McLaughlin等，2002;Chiosis等，2004;Wegele等，2004;http:〃www.pieard.ch/downloads/Hsp90interactors.pdf)。ot匕夕卜，Hsp90在應(yīng)激響應(yīng)和保護(hù)細(xì)胞對(duì)抗突變效應(yīng)方面起著關(guān)鍵作用(Bagatell和Whitesell,2004;Chiosis等，2004)。Hsp卯功能復(fù)雜，參與動(dòng)態(tài)多酶復(fù)合物的形成(Bohen，1998;Liu等，1999;Young等，2001;Takahashi等，2003;Sreedhar等，2004;Wegele等，2004)。Hsp90為抑制劑(Fang等，1998;Liu等，1999;Blagosklonny，2002;Neckers,2003;Takahashi等，2003;Beliakoff和Whitesell,2004;Wegele等，2004)的靶點(diǎn)，引起客戶蛋白降解、細(xì)胞周期失調(diào)/或正常化及細(xì)胞凋亡。最近，Hsp90已被鑒定為肺瘤侵襲的重要胞外介質(zhì)(Eustace等，2004)。Hsp卯被鑒定為癌癥治療的新的主要治療靶點(diǎn)，這反映在對(duì)Hsp90功能所進(jìn)行的深入詳盡研究(Blagosklonny等，1996;Neckers，2002;Workman和Kaye，2002;Beliakoff和Whitesell，2004;Harris等，2004;Jez等，2003;Lee等，2004)和對(duì)高通量篩選測(cè)定所進(jìn)行的研發(fā)(Carreras等，2003;Rowlands等，2004)。Hsp90抑制劑包括諸如安莎霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、噤呤類、吡唑類、香豆素抗生素類等類型的化合物(綜述參見(jiàn)Bagatdl和Whitesell，2004;Chiosis等，2004及其中的參考文獻(xiàn))。苯型安莎霉素類為一類范圍廣泛的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其特征在于與芳香環(huán)結(jié)構(gòu)兩側(cè)連接的長(zhǎng)度不等的脂族環(huán)。天然存在的安莎霉素類包括大貝菌素(macbecin)和18，21-二氬大貝菌素(也分別稱為大貝菌素I和大貝菌素II)(1&2;Tanida等，1980)、格爾德霉素(geldanamycin)(3;DeBoer等，1970;DeBoer和Dietz，1976;WO03/106653及其中的參考文獻(xiàn))和除草霉素(herbimycin)家族(4;5，6，Omura等，1979，Iwai等，1980和Shibata等，1986a，WO03/106653及其中的參考文獻(xiàn))。大貝菌素.118,21-二氫大貝菌素(大貝菌素ll)，2格爾德霉素，3除草霉素A4R尸0CH3，R2=CH3除草霉素B，5R^H，R2=H除草霉余C,6RfOCH3,R2-H安莎霉素類最初因其抗細(xì)菌和抗病毒活性而得以鑒定，然而，近來(lái)其作為抗癌劑的潛在效用已經(jīng)變得更令人感興趣(Beliakoff和Whitesell，2004)。許多Hsp卯抑制劑目前正在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)估(Csermely和Soti，2003;Workman,2003)。特別是格爾德霉素具有納摩爾級(jí)的效力，并對(duì)異常蛋白激酶依賴性腫瘤細(xì)胞具有明顯的特異性(Chiosis等，2003;Workman,2003)。業(yè)已表明用Hsp90抑制劑治療增強(qiáng)放射誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡，并且也已證明Hsp卯抑制劑組合細(xì)胞毒劑提高了細(xì)胞殺傷能力(如乳腺癌、慢性髓細(xì)胞性白血病和非小細(xì)胞肺癌)(Neckers，2002;Beliakoff和Whitesell，2004)。抗血管生成活性潛力也令人感興趣Hsp90客戶蛋白HIF-la在實(shí)體瘤的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用(Hur等，2002;Workman和Kaye,2002;Kaur等，2004)。Hsp卯抑制劑還作為免疫抑制劑發(fā)揮功能，參與Hsp90抑制后補(bǔ)體誘導(dǎo)的數(shù)類腫瘤細(xì)胞的裂解(Sreedhar等，2004)。用Hsp90抑制劑治療還能夠引起誘導(dǎo)的超氧化物生成(Sreedhar等，2004a)，后者與免疫細(xì)胞介導(dǎo)的裂解相關(guān)(Sreedhar等，2004)。Hsp卯抑制劑作為潛在抗瘧疾藥物的用途也已經(jīng)進(jìn)行過(guò)討論(Kumar等，2003)。此外，業(yè)已表明格爾德霉素干擾復(fù)雜糖基化的哺乳動(dòng)物阮蛋白Prpe的形成(Winklhofer等，2003)。如上所述，安莎霉素類作為潛在的抗癌和抗B細(xì)胞惡性病化合物而令人感興趣，然而現(xiàn)有的安莎霉素類呈現(xiàn)出不良的藥理學(xué)或藥物特性，例如，它們表現(xiàn)出差的水溶性、差的代謝穩(wěn)定性、差的生物利用度或差的配制性能(Goetz等，2003;Workman2003;Chiosis2004)。除草霉素A和格爾德霉素均由于其強(qiáng)烈的肝毒性而被鑒定為臨床試驗(yàn)的不良候選藥(參閱Workman,2003)，且格爾德霉素由于肝毒性已撤出I期臨床試驗(yàn)(Supko等，1995;WO03/106653)。格爾德霉素分離自吸水鏈霉菌(A^/7^附w"/^gm^o//cws)培養(yǎng)物濾液，表現(xiàn)出強(qiáng)的體外抗原生動(dòng)物活性以及弱的抗細(xì)菌和真菌活性。在1994年表明了格爾德霉素與Hsp卯間的締合(Whitesell等，1994)。格爾德霉素的生物合成基因簇已被克隆并測(cè)序(Allen和Ritchie,1994;Rascher等，2003;WO03/106653)。其DNA序列可依據(jù)NCBI登錄號(hào)AY179507獲得。最近描述了個(gè)汙生自吸水鏈霉菌二重霉素亞種(S.^^*MCO/7/cw:ysubsp.J""附W^c^)JCM4427的遺傳工程格爾德霉素生產(chǎn)菌林的分離，以及4,5-二氫-7-O-脫氨基甲酰基-7-羥基格爾德霉素和4，5-二氫-7-0-脫氨基甲酰基-7-羥基-17-0-脫甲基格爾德霉素的分離(Hong等，2004)。通過(guò)向除草霉素生產(chǎn)菌林吸水鏈霉菌AM-3672供給格爾德霉素，分離到化合物15-羥基格爾德霉素、三環(huán)格爾德霉素類似物KOSN-1633和格爾德霉素甲酯(methyl-geldanamycinate)(Hu等，2004)。兩種化合物17-甲?；?17-脫曱氧基-18力-21力-二氬格爾德霉素和17-羥甲基-17-脫甲氧基格爾德霉素分離自吸水鏈霉菌K279-78。吸水鏈霉菌K279-78為含有粘粒pKOS279-78的吸水鏈霉菌NRRL3602,所述粘粒具有44kbp的插入片段，含有來(lái)自除草霉素生產(chǎn)菌抹吸水鏈霉菌AM-3672的多個(gè)基因(Hu等，2004)。已對(duì)格爾德霉素生物合成簇聚酮合酶(polyketidesynthase)中四個(gè)模塊的?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了取代(substitution)(Patel等，2004)。對(duì)模塊l、4和5進(jìn)行AT取代，產(chǎn)生完全加工的類似物14-脫曱基-格爾德霉素、8-脫甲基-格爾德霉素和6-脫甲氧基-格爾德霉素，以及非完全加工的類似物4，5-二氫-6-脫甲氧基-格爾德霉素。模塊7中的AT取代導(dǎo)致產(chǎn)生三種2-脫甲基化合物即K()SN1619、KOSN1558和KOSN1559，其中之一(KOSN1559)是格爾德霉素的2-脫甲基-4，5-二氫-17-脫甲氧基-21-去氧基衍生物，以比格爾德霉素大4倍的結(jié)合親和力、而比17-AAG大8倍的結(jié)合親和力與Hsp90結(jié)合。不過(guò)這并不反映為利用SKBr3所測(cè)量的ICso的改進(jìn)。另一類似物即命名為KOS-1806的新的非苯醌型格爾德霉素具有單苯酚結(jié)構(gòu)(Rascher等，2005)。未給出KOS-1806的活性數(shù)據(jù)。在1979年從吸水鏈霉菌菌抹No.AM-3672的發(fā)酵液中分離到安莎霉素類抗生素除草霉素A，并據(jù)其強(qiáng)效除草活性而得名。其抗腫瘤活性通過(guò)使用感染了勞斯肉瘤病毒(RSV)溫度敏感型突變抹的大鼠腎細(xì)胞系細(xì)胞來(lái)篩選使這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)化形態(tài)逆轉(zhuǎn)的藥物而得以確立(綜述參見(jiàn)Uehara,2003)。推定除草霉素A主要通過(guò)與Hsp90伴侶蛋白結(jié)合而起作用，除此也討論了其與保守半胱氨酸殘基的直接結(jié)合以及隨后的激酶失活作用(Uehara，2003)。已經(jīng)分離到許多化學(xué)衍生物，且苯醌母核C19位取代基改變的化合物以及柄型鏈閨化化合物表現(xiàn)出比除草霉素A更低的毒性和更高的抗腫瘤活性(()mura等，1984;Shibata等，1986b)。除草霉素生物合成基因簇的序列在WO03/106653和最近的論文中得以鑒定(Rascher等，2005)。安莎霉素類化合物大貝菌素(l)和18，21-二氫大貝菌素(2)(C-14919E-1和C-14919E-1)因其抗真菌和抗原生動(dòng)物活性而得以鑒定，分離自諾卡氏菌屬(tVocw^Vi)物種No.C-l4919(珍貴束絲放線菌珍貴亞種(H/"，/m柳"/rC》5^附sw力s//7/*CVw/)ATCC31280)的培養(yǎng)物上清液(Tanida等，1980;Muroi等，1980;Muroi等，1981;US4,315,989和US4,187,292)。18，21-二氫大貝菌素的特征在于含有二氫醌形式的母核。大貝菌素和18,21-二氫大貝菌素均顯示擁有相似的抗細(xì)菌和抗癌細(xì)胞系如鼠白血病P388細(xì)胞系的抗腫瘤活性(Ono等，1982)。逆轉(zhuǎn)錄酶和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性不受大貝菌素抑制(Ono等，1982)。大貝菌素的Hsp90抑制功能在文獻(xiàn)中已有報(bào)道(Bohen，1998;Liu等，1999)。在將大貝菌素和18,21-二氫大貝菌素加至微生物培養(yǎng)液后轉(zhuǎn)化為在某一位置或某些位置上帶有羥基而非曱氧基的化合物，這描述在專利US4,421,687和US4,512,975中。在大量多種土壤微生物的篩選中，從屬于鏈霉菌屬的生產(chǎn)菌林中鑒定到了化合物TAN-420A至E(7-11，EP0110710)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>在2000年描述了從鏈霉菌屬菌種S6699的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離的格爾德霉素相關(guān)的非苯醌型安莎霉素類代謝物利布拉霉素(reblastatin)及其在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療中的潛在治療價(jià)值(Stead等，2000)。另一Hsp90抑制劑與該化學(xué)上不相千的苯醌型安莎霉素類截然不同，其為根赤殼菌素(RadicicoI)(單胞菌素(monorden)),最初是因其抗真菌活性而從真菌MwiM/w/"附^朋n/柳中發(fā)現(xiàn)的(綜述參見(jiàn)Uehara，20(B),并且發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)與從A^"/v'tfnw/i"Vw/"中分離的14元大環(huán)內(nèi)酯完全相同。除其抗真菌、抗細(xì)菌、抗原生動(dòng)物和細(xì)胞毒活性之外，后來(lái)它還被鑒定為Hsp卯伴侶蛋白的抑制劑(綜述參見(jiàn)Uehara，2003;Schulte等，1999)。根赤殼菌素的抗血管生成活性(Hur等，2002)及其半合成衍生物(Kurebayashi等，2001)也已有描述。近來(lái)的研究興趣集中在作為新一代安莎霉素類抗癌化合物的格爾德霉素的17-氨基衍生物上(Bagatell和Whitesell，2004)，例如17-(締丙基氨基)-17-脫甲氧基格爾德霉素(17-AAG，12)(Hostein等，2001;Neckers，2002;Nimmanapalli等，2003;Vasileyskaya等，2003;Smith-Jones等，2004)和17-脫甲氧基-17-N，N-二甲基氨基乙基氨基-格爾德霉素(17-DMAG，13)(Egorin等，2002;Jez等，2003)。最近，對(duì)格爾德霉素的17位進(jìn)行衍生，以生成17-格爾德霉素酰胺、氨基曱酸酯、脲和17-芳基格爾德霉素(LeBrazidec等，2003)?，F(xiàn)已報(bào)道了具有超過(guò)六十個(gè)17-烷基M-17-脫甲氧基格爾德霉素類似物的庫(kù)，并測(cè)試了它們對(duì)Hsp卯的親和力以及水溶性(Tian等，2004)。另一減小格爾德霉素毒性的方法是通過(guò)與腫瘤靶向單克隆抗體綴合而進(jìn)行選擇性尋靼，將活性格爾德霉素化合物遞送至惡性細(xì)胞中(Mandler等，2000)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>許多這些衍生物呈現(xiàn)出降低的肝毒性，但它們?nèi)詢H具有有限的水溶性。例如，17-AAG需要使用增溶栽體(如Cremophore,DMSO-卵卵磷脂)，而增溶載體本身可能會(huì)在一些患者中產(chǎn)生副作用(Hu等，2004)。大多數(shù)安莎霉素類Hsp卯抑制劑帶有共同的結(jié)構(gòu)部分苯醌，其為Michael受體，能夠容易地與親核試劑如蛋白質(zhì)、谷胱甘肽(glutithion)等形成共價(jià)鍵。所述苯醌部分還經(jīng)歷與二氫醌的氧化還原平衡，在此期間形成氧自由基，這引起其它非特異性毒性(Dikalov等，2002)。因此，仍需要鑒定新的在癌癥和/或B細(xì)胞惡性病的治療中有用的安莎霉素衍生物，優(yōu)選這樣的安莎霉素類對(duì)于給藥而言，具有改善的水溶性、改善的藥理學(xué)性質(zhì)和減少的副作用。本發(fā)明公開(kāi)了通過(guò)生物轉(zhuǎn)化和任選的親本生產(chǎn)菌林的遺傳工程而產(chǎn)生新的安莎霉素類似物。特別地，本發(fā)明公開(kāi)了新的18，21-二脫氧-安莎霉素類似物及其他安莎霉素類似物，并且與目前可用的安莎霉素類相比，它們通常具有改善的藥物性質(zhì)；特別是，它們預(yù)期在如下的一種或多種性能方面表現(xiàn)出改善抗不同癌癥亞型的活性、毒性、水溶性、代謝穩(wěn)定性、生物利用度和配制性能。優(yōu)選安莎霉素類似物(如18,21-二脫氧-安莎霉素類似物)表現(xiàn)出改善的生物利用度。發(fā)明概述在本發(fā)明中，向格爾德霉素生產(chǎn)菌林供給非天然起始單位(starterunit)，任選地組合尋靶失活或缺失負(fù)責(zé)格爾德霉素后PKS修飾(post-PKSmodification)的基因，和任選地引入適宜的后PKS基因以實(shí)現(xiàn)后PKS修飾，以便生產(chǎn)通過(guò)摻入非天然起始單位而形成的新的安莎霉素類似物，所述非天然起始單位可以例如導(dǎo)致產(chǎn)生可任選地被氟或其他取代基所取代的18，21-二脫氧-安莎霉素化合物。任選地，可以通過(guò)尋靶失活或缺失操縱負(fù)責(zé)起始單位(起始酸)生物合成的基因或調(diào)節(jié)因子，或以其他方式進(jìn)行修飾，例如使細(xì)胞接觸紫外輻射，選擇指示起始單位生物合成已被破壞的表型。所述方法可適用于其他安莎霉素類，如除草霉素和利布拉霉素以及自溶霉素(autolytimycin)。對(duì)后PKS基因的任選打靶可以介由多種機(jī)制進(jìn)行，26例如通過(guò)整合，尋靶缺失格爾德霉素簇中包括所有或一些后PKS基因的區(qū)域，任選地接著插入基因；或者通過(guò)其他方法使后PKS基因或其所編碼的酶無(wú)功能，例如化學(xué)抑制、定點(diǎn)誘變或例如通過(guò)紫外光輻射突變細(xì)胞。另外，可以重新引入來(lái)自格爾德霉素簇或者其他安莎霉素簇例如但不限于大貝菌素、除草霉素、利布拉霉素或者TAN簇的后PKS基因以實(shí)現(xiàn)特異的后PKS修飾。所以本發(fā)明提供了安莎霉素類似物如18,21-二脫氧-安莎霉素類似物，制備這些化合物的方法，以及在醫(yī)療中使用這些化合物的方法或利用它們作為中間體生產(chǎn)更多化合物的方法。因此，本發(fā)明的第一方面提供了格爾德霉素或其他安莎霉素類的類似物，它們?nèi)狈ΤＲ?jiàn)的起始單位，相反卻摻入了例如可導(dǎo)致產(chǎn)生可任選地被氟或其他取代基所取代的18，21-二脫氧-安莎霉素化合物的起始單位。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了式(I)的化合物或其可藥用鹽(i)其中R,代表H、()H、OMe;Rz代表H或Me;R3代表H或CONH2;R4和Rs或者均代表H,或者它們一起代表鍵(即C4至C5為雙鍵)；R6代表H、F、OH、OMe、Br、Cl、CF3、CH3、SH、CH2CH3或R7代表H、F、OH、OMe、Br、Cl、CF3、CH3、SH、CH2CH3或27]\R10bRllb;Rs代表H、F、OH、OMe、Br、Cl、CF3、CH3、SH、CH2CH3或!NRiocRiic;R9代表H、F、OH、OMe、Br、Cl、CF3、CH3、SH、CH2CH3或Rl0a、R"a、Rl0b、R"b、Rl0c、R"c、Rl0d、R"d獨(dú)立地代表H、CH3或CH2CH3;但是，前提是(i)當(dāng)R6代表H，R7代表OH而Rs代表OH時(shí)，則R9不代表H;(ii)當(dāng)R代表OH，Rs代表H而&代表H時(shí)，則不代表H、OH或OMe;和(iii)當(dāng)R7代表OMe，R8代表H而R9代表H時(shí)，則R6不代表OMe。前提(i)的化合物為18,21-二氫格爾德霉素，一種已知的化合物。前提(ii)和(iii)的化合物在WO2005/061461中公開(kāi)。適宜地(iv)當(dāng)&代表H、OH或OMe,R代表H而Rs代表H時(shí)，則R9不4戈表()H、C1或NH2;和(v)當(dāng)R6代表H、OH或OMe，Rs代表H而119代表H時(shí)，則R7不代表NH2。適宜地(vi)當(dāng)R6代表H或OH時(shí)，則R7、Rs和R9不都代表H。前提(vi)的化合物在Kim等ChemBioChem(2007)8,1491-1494中公在一個(gè)更具體的方面，本發(fā)明提供了根據(jù)下式(IA)的18,21-二脫氧-安莎霉素類似物或其可藥用鹽28(IA)其中R代表H、OH、OMe;Rz代表H或Me;R3代表H或CONH2;R4和R5或者均代表H，或者它們一起代表鍵(即C4至C5之間為雙鍵)；R()代表H、OH、()Me或F;R7代表H或F;Rs代表H或F。安莎霉素類似物如18，21-二脫氧-安莎霉素類似物在文中也稱為"本發(fā)明的化合物"，這樣的術(shù)語(yǔ)在文中可互換使用。上面的結(jié)構(gòu)顯示了代表性的互變異構(gòu)體，本發(fā)明涵蓋式(I)化合物的所有互變異構(gòu)體，例如當(dāng)用烯醇式化合物進(jìn)行舉例說(shuō)明時(shí)，還涵蓋其酮式化合物，反之亦然。本發(fā)明涵蓋上文所示式(I)所定義化合物的所有立體異構(gòu)體。另一方面，本發(fā)明提供了用作藥物的安莎霉素類似物，例如式(I)的化合物或其可藥用鹽。定義冠詞"一"、"一個(gè)"、"一種，，在文中是指一個(gè)/種或一個(gè)/種以上(即至少29一個(gè)/種)冠詞的語(yǔ)法對(duì)象。例如"一類似物"指一個(gè)類似物或一個(gè)以上的類<以物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"類似物"指結(jié)構(gòu)上與另一個(gè)化合物相似但在組成上稍有不同(例如一個(gè)原子被另一個(gè)原子所代替，或者存在或缺失特定的官能團(tuán))的化合物。如在本申請(qǐng)中所用，術(shù)語(yǔ)"18，21-二脫氧-安莎霉素類似物"是指根據(jù)式(IA)的化合物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"同源物"是指本文所公開(kāi)基因或基因所編碼蛋白質(zhì)的同源物，它們來(lái)自不同大貝菌素生產(chǎn)菌林的可選大貝菌素生物合成簇，或?yàn)閬?lái)自可選安莎霉素(例如格爾德霉素、除草霉素、自溶霉素或利布拉霉素)生物合成基因簇的同源物。這樣的同源物編碼與所述基因或蛋白質(zhì)在大貝菌素或相關(guān)安莎霉素聚酮化合物合成中執(zhí)行相同功能的蛋白質(zhì)，或者所述同源物自身能夠執(zhí)行相同的功能。優(yōu)選這樣的同源物與本文公開(kāi)的具體基因的序歹'j(表3，SEQIDNO:ll，為簇中所有基因的序列，從中可以推斷出具體基因的序歹ij)具有至少40。/。的序列同一性，優(yōu)選至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的序列同一性。同一性百分比可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何程序進(jìn)行計(jì)算，例如可自NCBI網(wǎng)站獲得的BLASTn或BLASTp。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"癌癥，，是指皮膚或身體器官例如但不限于乳腺、前列腺、肺、腎、胰腺、腦、胃或腸中良性或惡性的細(xì)胞新生長(zhǎng)。癌癥傾向于浸潤(rùn)至鄰近組織并擴(kuò)散(轉(zhuǎn)移)至遠(yuǎn)距離器官例如骨骼、肝臟、肺或腦。如本文所用，術(shù)語(yǔ)癌癥既包括轉(zhuǎn)移性肺瘤細(xì)胞類型，例如但不限于黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和肥大細(xì)胞瘤；又包括組織癌類型，例如但不限于結(jié)直腸癌、前列腺癌、小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、腎癌、胃癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、原發(fā)性肝癌和卵巢癌。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"B細(xì)胞惡性病"包括如下一組紊亂'I"曼性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、多發(fā)性骨髓瘤和非何杰金淋巴瘤(NHL)。它們是血液和30血液生成器官的胂瘤性疾病。它們引起骨髓和免疫系統(tǒng)功能障礙，這致使宿主對(duì)感染和出血有高易感性。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"生物利用度"是指藥物或其它物質(zhì)在給藥后在生物活性位點(diǎn)被吸收或可用的程度或速率。該性質(zhì)取決于許多因素，包括化合物的溶解性、在腸中的吸收速率、蛋白質(zhì)結(jié)合和代謝的程度等。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)熟知的多種生物利用度測(cè)試法描述在Egorin等(2002)中。如在本申請(qǐng)中所用，術(shù)語(yǔ)"水溶性"是指在水性介質(zhì)例如pH7.3的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中的溶解度。如在本申請(qǐng)中所用，術(shù)語(yǔ)"安莎霉素生產(chǎn)菌林"是指這樣的菌林，例如以鏈霉菌為例的野生型菌林，例如格爾德霉素生產(chǎn)菌林、除草霉素生產(chǎn)菌抹、利布拉霉素生產(chǎn)菌林和自溶霉素生產(chǎn)菌林。這樣的實(shí)例包括當(dāng)在合適的條件下、例如供給天然起子物料(starterfeed)3-氨基-5-羥基苯甲酸進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，生產(chǎn)諸如格爾德霉素或除草霉素(如除草霉素A、B或C)的安莎霉素類的吸7K鏈霉菌格爾德亞種(S^77&附y(tǒng)c^/^gmsco尸/cws^Wflrt"s)NRRL3602或鏈霉菌屬菌種DSM4137或紫黑鏈霉菌(5V豐歸戸sv她(麗w^w)DSM40699，以及生產(chǎn)諸如利布拉霉素或自溶霉素的安莎霉素類的鏈霉菌屬菌種S6699或自溶鏈霉菌(A/r/7似附^M"wZ一f7dv)JX-47。因此，如在本申請(qǐng)中所用，術(shù)語(yǔ)"格爾德霉素生產(chǎn)菌株"是指這樣的菌林，例如以鏈霉菌為例的野生型菌抹，例如當(dāng)在合適的條件下、例如供給天然起子物料3-氨基-5-羥基苯甲酸進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，生產(chǎn)格爾德霉素的吸7jc鏈霉菌格爾德亞種NRRL3602或鏈霉菌屬菌種DSM4137或紫黑鏈霉菌DSM40699。如在本申請(qǐng)中所用，術(shù)語(yǔ)"除草霉素生產(chǎn)菌林"是指這樣的菌林，例如以吸水鏈霉菌AM-3672為例的野生型菌林，當(dāng)在合適的條件下、例如供給天然起子物料3-氨基-5-羥基苯曱酸進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，其生產(chǎn)除草霉素如除草霉素A、B或C。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"后PKS基因"是指聚酮化合物的后聚酮合酶修飾所需的基因，例如但不限于單加氧酶、O-甲基轉(zhuǎn)移酶和氨基甲?；D(zhuǎn)移酶(carbamoyltransferase)。具體而言，在大貝菌素系統(tǒng)中，這些修飾基因包如本文所用，術(shù)語(yǔ)"起始單位生物合成基因，，是指生產(chǎn)天然摻入的起始單位即3-氨基-5-羥基苯甲酸(AHBA)所需的基因。具體而言，在大貝菌素系統(tǒng)中，這些起始單位生物合成基因包括爿/^(AHBA激酶)、^Z/i(aDHQ脫氫酶)、^/^(AHBA合酶)、OY(氧化還原酶)、/W(磷酸酶)。具體而言，在格爾德霉素系統(tǒng)中，推測(cè)基因^/附0編碼AHBA合成所需的氨基脫氫奎尼酸(aminodehydr叫uinate)合酶(Rascher等，2003),而在除草霉素系統(tǒng)中，已經(jīng)鑒定到/!/>附(9(Rascher等，2005)。其他生產(chǎn)AHBA的菌4朱也含有AHBA生物合成基因。本發(fā)明化合物如式(I)化合物的可藥用鹽包括由可藥用的無(wú)機(jī)或有機(jī)酸或堿形成的常規(guī)鹽以及季銨酸加成鹽。合適的酸更具體的實(shí)例包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富馬酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、羥基乙酸、曱酸、乳酸、馬來(lái)酸、酒石酸、檸檬酸、棕櫚酸(palmoic)、丙二酸、羥基馬來(lái)酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、7jC楊酸、富馬酸、甲^t酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羥基萘甲酸、氫碘酸、蘋(píng)果酸、類固醇酸(steroic)、鞣酸等。其它酸例如草酸盡管其本身不是可藥用的，但是可用于制備用作中間體的鹽，以獲得本發(fā)明的化合物及其可藥用鹽。合適的堿鹽的更加具體的實(shí)例包括鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鎂鹽、鋁鹽、鈣鹽、鋅鹽、N',1V-二節(jié)基乙二胺鹽、氯普魯卡因鹽、膽堿鹽、二乙醇胺鹽、乙二胺鹽、N-甲基葡糖胺鹽和普魯卡因鹽。下文述及的根據(jù)本發(fā)明的化合物包括式(I)的化合物及其可藥用鹽。附圖的簡(jiǎn)短說(shuō)明圖1:格爾德霉素生物合成的示意圖，顯示了第一個(gè)推斷的酶游離中間體原格爾德霉素(progeldanamycin)以及后PKS加工為格爾德霉素。圖中所列的PKS加工步驟并非旨在表示事件順序。簇中具體32基因使用如下縮寫(xiě)ALO-AHBA荷載結(jié)構(gòu)域；ACP-?；d體蛋白；KS-(5-酮基合酶(p-ketosynthase);AT-?；D(zhuǎn)移酶；DH-脫水酶；ER-烯醇還原酶(enoylreductase);KR-Ji-酮基還原酶(p-ketoreductase)。圖2:由原格爾德霉素產(chǎn)生格爾德霉素的后PKS加工位點(diǎn)的示意圖。圖3:實(shí)施例中所述化合物(14-25)的結(jié)構(gòu)。圖4:實(shí)施例中所述化合物(26-37)的結(jié)構(gòu)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了如上文所述的安莎霉素類似物，制備這些化合物的方法，在醫(yī)療中使用這些化合物的方法，以及利用這些化合物作為中間體或模板進(jìn)行進(jìn)一步的半合成衍生化的方法。適宜地R,代表H或OH。在一個(gè)實(shí)施方案中，R,代表H。在另一個(gè)實(shí)施方案中，R!代表OH。適宜地R2代表H。適宜地R3代表CONH2.在一個(gè)實(shí)施方案中，適宜地R4和Rs—起代表鍵。在另一個(gè)實(shí)施方案中，適宜地R4和Rs各自代表H。在一個(gè)實(shí)施方案中，適宜地R,代表H，R2代表H，R3代表CONH2，而R4和Rs各自代表H。在一個(gè)實(shí)施方案中，適宜地R,代表OH，R2代表H，R3代表CONH2，而H和Rs各自^表H。在一個(gè)實(shí)施方案中，適宜地R,代表H，R2代表H，R3代表CONH2，R4和Rs各自代表H，而R6代表OH。適宜地R6代表H、F、Me、Br、Cl、OH、OMe、NH2,更適宜地代表H、F、Me、Br、Cl、OH或OMe，還更適宜地代表H或F?？蛇x地，適宜地R6代表CF3或CH2CH3。適宜地Ry代表H、F、OH、OMe、Br、Cl或NH2，更適宜地代表H、F、OH、OMe、Br或Cl,還更適宜地代表H、F、OH或OMe，尤其是()H(或H或F)。適宜地Rs代表H、F、Me、Cl、Br、OH或NH2，更適宜地代表H、F、Me、Cl、Br或OH，還更適宜地代表H或F。適宜地R9代表H、F、Me、Cl、Br、OH或NH2,更適宜地代表H、F、Me、Cl、Br或OH，還更適宜地^R表H或F,尤其是H。適宜地R,oa、Rlla、R10b、Rllb、R10c、Rllc、R10d、R^d代表H。適宜地當(dāng)R7代表OH時(shí)，則R6、Rs或R9中的一個(gè)或多個(gè)代表F、Br、Me或NH2，其余的代表H。適宜地如果R6代表Me，則Rz代表OH、H或F，而Rs和R9代表H。適宜地如果R6代表CF3，則R7代表OH、H或F，而Rs和R9代表H。適宜地如果R6代表CH2CH3，則R7代表OH、H或F，而Rs和R9代表H。在本發(fā)明一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R,代表H，R2代表H,&代表CONH2，R4、R5、R^、R7和Rs各自代表H，例如如下列結(jié)構(gòu)所示18、oO-CONH.在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R,代表H，R2代表H，議3代表C()NH"R4和Rs各自代表H，R6代表OH，而R7和Rs各自代表H，例如如下列結(jié)構(gòu)所示34<formula>formulaseeoriginaldocumentpage35</formula>在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R,代表OH,R2代表H，R3代表CONH2,R4和Rs各自代表H，R6代表F，而R7和Rs各自代表H，例如如下列結(jié)構(gòu)所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage35</formula>在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R!代表H，R2代表H，R3代表C()NH2，R4和Rs各自代表H，R6代表F,而R7和Rs各自代表H,例如如下列結(jié)構(gòu)所示18CONK在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R、代表H,R2代表H,&代表CONH2,R4和Rs各自代表H，R6代表H,R/代表F，而Rs代表H,例如如下列結(jié)構(gòu)所示在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R，代表H，R2代表H，R3代表C()NH2，R4和Rs各自代表H，R6代表OH，R7代表F，而Rs代表H，例如如下列結(jié)構(gòu)所示0-CONH.在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R，代表OH,R2代表H，議3代表CONH2,R4和Rs各自代表H，R6代表H,R代表F，而Rs代表H，例如如下列結(jié)構(gòu)所示在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R,代表H，R2代表H，R3代表CONH2，R4和Rs各自代表H,R6和R;各自代表F，而Rg代表H，例如如下列結(jié)構(gòu)所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage38</formula>在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R,代表OH，R2代表H，A代表C()NH2，R4和Rs各自代表H，R6和R/各自代表F，而Rs代表H，例如如下列結(jié)構(gòu)所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage38</formula>在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R,代表H，R2代表H，R3代表CONH2，R4和Rs各自代表H，R^、R7和Rs各自代表F,例如如下列結(jié)構(gòu)所示在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，R6、R7和Rs不都代表H，特別是R6、R7和R8中至少一個(gè)代表F。在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R,代表OH，R2代表H，R3代表CONH2，R4和Rs各自代表H，R6代表F，R7代表OH，而Rs代表H，例如如下列結(jié)構(gòu)所示OH18在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R,代表OH，R2代表H,&代表C()NH2,R4和Rs各自代表H，R6代表Me，R;代表OH，而Rs代表H，例如如下列結(jié)構(gòu)所示H,C、、H3CO0-CONH2在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R代表OH,R2代表H，R3代表C()NH2，Rt和Rs各自代表H，Re代表CF3，R7代表OH，而Rs代表H，例如如下列結(jié)構(gòu)所示H3CO-CONH2在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，Ri代表OH，R2代表H，R3代表C()NH2,R4和Rs各自代表H，R6代表CH2CH3，R7代表OH，而Rs代表H，例如如下列結(jié)構(gòu)所示40<formula>formulaseeoriginaldocumentpage41</formula>在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R,代表H，R2代表H,R3代表C()NH2，R4和Rs各自代表H,R6代表F，R7代表OH，而Rs代表H，例如如下列結(jié)構(gòu)所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage41</formula>在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R,代表H，R2代表H，R3代表(:()NH2,R4和Rs各自代表H，R6代表Me，R7代表OH，而Rs代表H，例如如下列結(jié)構(gòu)所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage42</formula>在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R!代表H，R2代表H，&代表CONH2，R4和Rs各自代表H，R6代表CF3，R7代表OH,而Rs代表H,例如如下列結(jié)構(gòu)所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage42</formula>在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R,代表H,R2代表H，R3代表C()NH2，R4和Rs各自代表H，R6代表CH2CH3，R7代表OH，而Rs代表H，例如如下列結(jié)構(gòu)所示H3COO-CONH2在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R,代表H，R2代表H，&代表CONH2，R4和Rs各自代表H,R6代表OMe，Rz代表H，而Rs代表OH，例如如下列結(jié)構(gòu)所示H3CO，0"-CONH2在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R,代表H，R2代表H，113代表C()NH2,R4和Rs各自代表H，R6代表OH，R;代表H,而Rs代表OH,例如如下列結(jié)構(gòu)所示0-CONH,在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R,代表H，R2代表H，R3代表C()NH"R4和Rs各自代表H，R6代表H，R/代表H，而Rs代表OH,例如如下列結(jié)構(gòu)所示0-CONH2在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R，代表H，R2代表H，&代表CONH2，R4和Rs各自代表H,R6代表H，Ry代表F，而R8代表OH，例如如下列結(jié)構(gòu)所示在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R,代表H，R2代表H，R3代表C()NH"R4和Rs各自代表H，R6代表H，R7代表C1，而Rs代表OH，例如如下列結(jié)構(gòu)所示在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R,代表H,R2代表H，R3代表C()NH2，R4和Rs各自代表H，R6代表H，R7代表OH,而Rs代表F，例如如下列結(jié)構(gòu)所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R,代表H，R2代表H,&代表CONH2，R4和Rs各自代表H，Rfi代表H，R7代表OH，而Rs代表Cl，例如如下列結(jié)構(gòu)所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施方案中，R，代表H，R2代表H,議3代表C()NH2，R4和Rs各自代表H，R6代表OMe，R代表F，而Rs代表OH，例如如下列結(jié)構(gòu)所示在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，R6、R7和Rs均代表H。在另一個(gè)實(shí)施方案中，R7和Rs不代表OH，R9代表H，而R。R/和R8中的一個(gè)或多個(gè)代表F。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)Ri代表H，R2代表H,R3代表CONH2，R4和Rs代表H，R6代表H,而R7代表H時(shí)，則Rs不代表H。更多適宜的實(shí)施方案描述在實(shí)施例中，并圖示于圖3和4。非氫側(cè)鏈相對(duì)于柄型環(huán)的優(yōu)選的立體化學(xué)如下圖1和2所示(也就是說(shuō)，優(yōu)選的立體化學(xué)遵循格爾德霉素的立體化學(xué))。本發(fā)明還提供了安莎霉素類似物作為底物通過(guò)生物轉(zhuǎn)化或通過(guò)合成化學(xué)用于進(jìn)一步修飾的用途。在一方面本發(fā)明提供了用作藥物的安莎霉素類似物。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療癌癥、B細(xì)胞惡性病、瘧疾、真菌感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及神經(jīng)變性疾病、有賴于血管生成的疾病、自身免疫疾病和/或用于預(yù)防性預(yù)處理癌癥的安莎霉素類似物。在另一方面，本發(fā)明提供了安莎霉素類似物在制備藥物中的用途。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了安莎霉素類似物在制備用于治療癌癥、B細(xì)胞惡性病、疾疾、真菌感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及神經(jīng)變性疾病、有賴于血管生成的疾病、自身免疫疾病和/或用于預(yù)防性預(yù)處理癌癥的藥物中的用途。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療癌癥、B細(xì)胞惡性病、瘧疾、真菌感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及神經(jīng)變性疾病、有賴于血管生成的疾病、自身免疫疾病或預(yù)防性預(yù)處理癌癥的方法，所述方法包括向需要的患者給藥治療有效量的安莎霉素類似物。如上文所指出的那樣，本發(fā)明的化合物預(yù)期可用于治療癌癥和B細(xì)胞惡性病。本發(fā)明的化合物、尤其是對(duì)Hsp90具有改善的選擇性和/或毒理性質(zhì)改善和/或藥代動(dòng)力學(xué)文善的那些化合物也可以有效治療其他適應(yīng)癥，例如但不限于癡疾、真菌感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及神經(jīng)變性疾病、有賴于血管生成的疾病、自身免疫疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，或用于預(yù)防性預(yù)處理癌癥。中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及神經(jīng)變性疾病包括但不限于阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥、朊病毒病、脊髓性和延髓性肌萎縮(SBMA)和肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)。有賴于血管生成的疾病包括但不限于年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病和多種其他眼病、動(dòng)脈粥樣硬化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。自身免疫疾病包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、I型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘉和銀屑病。"患者"包括人類和其他動(dòng)物(尤其是哺乳動(dòng)物)受試者，優(yōu)選人類受試者。相應(yīng)地，本發(fā)明的方法及安莎霉素類似物的用途為人類和獸醫(yī)醫(yī)療用途，優(yōu)選為人類醫(yī)療用途。本發(fā)明前述化合物或其制劑可以通過(guò)任何常規(guī)方法施用，例如但不限于其可以胃腸外(包括靜脈內(nèi)給藥)、口服、局部(包括口腔、舌下或經(jīng)皮)、經(jīng)醫(yī)療裝置(例如斯滕特(stent))、經(jīng)吸入或注射(皮下或肌內(nèi))給藥。治療可以是單劑給藥或歷經(jīng)一段時(shí)間的多劑量的治療。盡管本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)給藥，但是優(yōu)選將它與一種或多種可接受的稀釋劑或載體一起作為藥物制劑提供。因此，本文提供了包含本發(fā)明化合物和一種或多種可藥用稀釋劑或載體的藥物組合物。就與本發(fā)明化合物可配伍且對(duì)其受試者無(wú)害的意義而言，稀釋劑或栽體必須是"可接受的"。適宜的栽體的實(shí)例在下面有更詳細(xì)的說(shuō)明。本發(fā)明化合物可以單獨(dú)給藥或與其它治療藥物組合給藥。兩種(或多種)藥物共施用(co-administration)可以使所使用的每種藥物的劑量顯著降低，由此減少可見(jiàn)的副作用。還提供了包含本發(fā)明化合物和另外的治療劑以及一種或多種可藥用稀釋劑或栽體的藥物組合物。在另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明化合物與第二藥劑的治療組合在例如治療癌癥或B細(xì)胞惡性病中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物與另一種治療劑、例如治療癌癥或B細(xì)胞惡性病的治療劑共同給藥。優(yōu)選的藥劑包括但不限于常規(guī)的化療劑，如博來(lái)霉素、卡培他濱、順鉑、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、阿霉素、5-氟尿嘧啶、吉西他濱、亞葉酸、甲氨蝶呤、米托蒽醌(mitoxantone)、紫杉烷類[包括紫杉醇和多西他賽j、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春瑞濱；激素療法，阿那曲唑、戈舍瑞林、醋酸甲地孕酮、prenisone、他莫昔芬和托瑞米芬；單克隆抗體療法，如曲妥珠單抗(trastuzumab，抗Her2)、西妥昔單抗(cetuximab,抗EGFR)和貝伐珠單抗(bevacizumab，抗VEGF);以及蛋白激酶抑制劑，如伊馬替尼(imatinib)、達(dá)沙替尼(dasatinib)、吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erl()tinib)、拉巾自替尼(lapatinib)、坦羅莫司(temsirolimus);蛋白酶體抑制劑，如硼替佐米(bortezomib);組蛋白脫?；?HDAC)抑制劑，如伏林司他(vorinostat);血管生成抑制劑，如舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、來(lái)那度胺(lenalidomide)。另外，可以與其它治療[包括但不限于放療或手術(shù)l組合施用本發(fā)明的化合物。制劑可以方便地以單位劑型提供，并可以通過(guò)藥學(xué)領(lǐng)域眾所周知的任何方法制備。這類方法包括將活性成分(本發(fā)明化合物)與由一種或多種助劑組成的載體混合的步驟。通常這樣制備制劑將活性成分與液體載體或微粉化固體栽體或兩者均勻并緊密地混合，然后，如果需要的話，使產(chǎn)品成形。本發(fā)明化合物通常以在可藥用劑型中包含活性成分的藥物制劑形式口服或經(jīng)任何胃腸外途徑給藥，所述活性成分任選地為無(wú)毒有機(jī)或無(wú)機(jī)的酸或堿加成鹽的形式。根據(jù)待治療的紊亂和患者以及給藥途徑的不同，所述組合物可以以不同的劑量給藥。例如，本發(fā)明化合物可以以片劑、膠嚢劑、印形劑(ovules)、酏劑、溶液劑或混懸劑形式口服、口腔或舌下給藥，上述制劑可以含有矯味劑或著色劑并可用于速釋、緩釋或控釋使用。這樣的片劑可以包含賦形劑，如微晶纖維素、乳糖、檸檬酸鈉、碳酸釣、磷酸氫鈣和甘氨酸；崩解劑，如淀粉(優(yōu)選玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉)、羥基乙酸淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉和某些復(fù)合硅酸鹽類；以及制粒粘合劑，如聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)、蔗糖、明膠和阿拉伯膠。此外，還可以包含潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸、山崳酸甘油酯和滑石粉。相似類型的固體組合物也可以作為明膠膠嚢中的填充物使用。就此而言，優(yōu)選的賦形劑包括乳糖(lactose)、淀粉、纖維素、乳糖(milksugar)或高分子量的聚乙二醇類。對(duì)于水性混懸劑和/或酏劑而言，本發(fā)明化合物可以與多種這樣的物質(zhì)混合甜味劑或矯味劑、著色劑或色素；乳化劑和/或助懸劑；稀釋劑，如水、乙醇、丙二醇和甘油；以及它們的組合。通過(guò)壓制或才莫制可以任選用一種或多種助劑制備片劑?？梢赃@樣制備壓制片劑在適當(dāng)?shù)臋C(jī)器中將自由流動(dòng)形式l如粉末或顆粒j的活性成分壓片，其中活性成分^f壬選與這樣的物質(zhì)混合粘合劑(如聚維酮、明膠、羥丙基甲基纖維素)、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(如羥基乙酸淀粉鈉、交聯(lián)聚維酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或^ft劑。通過(guò)在適備模制片劑。片劑可以任選地進(jìn)行包衣或壓痕，并可以例如使用提供期望釋放模式的不等比例的羥丙基甲基纖維素進(jìn)行配制，以實(shí)現(xiàn)其中的活性成分的緩釋或控釋釋放。根據(jù)本發(fā)明的適于口服給藥的制劑可以以離散單位的形式提供，如膠嚢、扁嚢劑(cachet)或片劑，所述每種含有預(yù)定量的活性成分；粉劑或顆粒劑；在水性液體或非水性液體中的溶液劑或混懸劑；或水包油的液體50乳劑或油包水的液體乳劑?；钚猿煞诌€可以提供為大丸劑(bolus)、煎膏劑(electuary)或糊劑的形式。適于口腔局部給藥的制劑包括錠劑，其包含處于矯味基質(zhì)[通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠I中的活性成分；軟錠劑(pastilles)，其包含處于惰性基質(zhì)l如明膠和甘油，或者蔗糖和阿拉伯膠l中的活性成分；和漱口藥，其包含處于適宜的液體載體中的活性成分。應(yīng)當(dāng)理解，除了上面特別提到的成分外，本發(fā)明制劑還可以包含本領(lǐng)域中與所討論制劑類型相關(guān)的其它常規(guī)物質(zhì)，例如那些適于口服給藥的制劑可以包含矯味劑。適于局部給藥的藥物組合物可以配制成膏劑、霜?jiǎng)?、混懸劑、洗劑、散劑、溶液劑、糊劑、凝膠劑、浸藥的敷料(impregnateddressings),噴霧劑、氣霧劑或油劑、經(jīng)皮給藥裝置(transdermaldevices)、樸粉劑(dustingpowders)等等。這些組合物可以經(jīng)常規(guī)方法制備從而含有活性劑。因此，它們還可以包含可配伍的常規(guī)栽體和添加劑，例如防腐劑、輔助藥物滲透的溶劑、霜?jiǎng)┗蚋鄤┲械能浕瘎?emollient)以及洗劑所用的乙醇或油醇。這樣的載體可以占組合物的約1%至約98%。更通常地，它們將至多占組合物的約80%。僅用于舉例說(shuō)明，這樣制備霜?jiǎng)┗蚋鄤⒆懔康挠H水材料與足量的含有約5-10%(重量)化合物的水混合，以制備具有期望稠度的霜?jiǎng)┗蚋鄤＿m于經(jīng)皮給藥的藥物組合物可以提供為離散的貼劑，旨在與受試者的表皮保持長(zhǎng)時(shí)間緊密接觸。例如，可以通過(guò)電離子透入療法從貼劑中遞送活性劑。對(duì)于外部組織應(yīng)用，例如口腔和皮膚，組合物優(yōu)選以局部膏劑或霜?jiǎng)┦┯?。?dāng)配制在膏劑中時(shí)，活性成分可以與石蠟或水可混;容的軟膏基質(zhì)一起使用。可選地，可以將活性劑配制在含有水包油型乳膏基質(zhì)或油包水型基質(zhì)的霜?jiǎng)┲小?duì)于胃腸外給藥而言，用活性成分和無(wú)菌溶i某(vehicle)制備液體單位劑型，所述溶媒例如為[但不限于j水、醇類、多元醇類、甘油和植物油類，優(yōu)選水。4艮據(jù)所用的溶媒和濃度的不同，活性成分可以混懸或者溶解在該溶媒中。在制備溶液劑時(shí)，可以將活性成分溶解在注射用水中并過(guò)濾除菌，然后裝入適當(dāng)?shù)男∑炕虬碴持胁⒎庋b。可以將諸如局麻藥、防腐劑和緩沖劑等物質(zhì)溶解在溶媒中，這是有利的。為了提高穩(wěn)定性，在裝入小瓶中后可以將組合物冷凍，并在真空下除去水。然后將干燥的冷凍粉末密封在小瓶中，并可以附隨提供裝有注射用水的小齊瓦，以在4吏用前重構(gòu)(reconstitute)上述液體。除了活性成分混懸而非溶解在溶*某中且不能實(shí)行過(guò)濾除菌外，用與溶液劑基本相同的方法制備胃腸外混懸劑。可以在混懸于無(wú)菌溶媒中之前，通過(guò)接觸環(huán)氧乙烷而對(duì)活性成分進(jìn)行滅菌。有利地，在組合物中納入表面活性劑或潤(rùn)濕劑，以使活性成分易于分布均勻。本發(fā)明化合物還可以利用本領(lǐng)域公知的醫(yī)療裝置給藥。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以用無(wú)針頭皮下注射裝置給藥，例如在U.S.5,399,163、U.S.5,383,851、U.S.5,312,335、U,S.5,064,413、U.S.4,941,880、U.S.4，7卯，824或U.S.4,596,556中所公開(kāi)的裝置?？稍诒景l(fā)明中使用的眾所周知的植入物(implants)和組件的實(shí)例包括US4,487,603，其公開(kāi)了以可控速度分配藥物的植入式微量輸注泵；US4,486,194，其公開(kāi)了通過(guò)皮膚給藥藥物的治療裝置；US4,447,233，其公開(kāi)了以精確輸注速率遞送藥物的藥物輸注泵；US4,447,224，其/>開(kāi)了用于連續(xù)藥物遞送的流速可變的植入式輸注裝置；US4,439,196,其公開(kāi)了具有多腔區(qū)室的滲透型藥物遞送系統(tǒng)；和US4,475,196，其公開(kāi)了滲透型藥物遞送系統(tǒng)。許多其它此類植入物、遞送系統(tǒng)和組件對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人而言是/>知的。本發(fā)明化合物的施用劑量將根據(jù)具體化合物、所涉及的疾病、受試者、疾病的性質(zhì)及嚴(yán)重程度、受試者的身體條件以及所選的給藥途徑而變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠很容易地確定適宜的劑量。組合物可以含有以重量計(jì)(U%、優(yōu)選5-60%、更優(yōu)選以重量計(jì)10-30%的本發(fā)明化合物，這取決給藥的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，本發(fā)明化合物個(gè)體劑量的最佳量和范圍將由這樣的因素決定所治療的疾病的性質(zhì)和程度；給藥的劑型、途徑和位置；以及所治療的具體受試者的年齡和狀況，醫(yī)師將最終確定適宜的使用劑量。只要適當(dāng)，可以經(jīng)常重復(fù)給予該劑量。如果副作用出現(xiàn)，可以根據(jù)正常臨床實(shí)踐改變或減少該劑量的量和/或頻率。在另一方面，本發(fā)明提供了制備安莎霉素類似物的方法。安莎霉素類聚酮化合鉤，例如格爾德霉素和除草霉素，是由本領(lǐng)域眾所周知的聚酮生物合成簇合成的。格爾德霉素可^L為是以兩個(gè)階段進(jìn)行生物合成的。在第一階段，核心PKS基因裝配大環(huán)內(nèi)酯母核，其中重復(fù)組裝簡(jiǎn)單的羧酸前體，以產(chǎn)生聚酮鏈，聚酮鏈隨之環(huán)化以形成第一個(gè)酶游離的中間體"原格爾德霉素"，參見(jiàn)圖l。在第二階段，一系列的"后PKS，，裁剪(tailoring)酶(如細(xì)胞色素P450單加氧酶、曱基轉(zhuǎn)移酶、FAD依賴性加氧酶和氨基甲酰基轉(zhuǎn)移酶)發(fā)揮作用，向原格爾德霉素模板添加多種另外的基團(tuán)，得到最終的親本化合物結(jié)構(gòu)，參見(jiàn)圖2。安莎霉素類似物可以以相似的方式進(jìn)行生物合成?？梢岳眠@種生物合成生產(chǎn)，通過(guò)生物轉(zhuǎn)化，任選地組合適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)菌抹的遺傳工程，產(chǎn)生新的化合物。本發(fā)明人已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，向安莎霉素生產(chǎn)菌株供給非天然起始單位(起始酸或其類似物如酯)，則這些起始單位可以摻入到安莎霉素結(jié)構(gòu)中，產(chǎn)生新的安莎霉素類似物。因此，本發(fā)明提供了制備安莎霉素類似物的方法，所述方法包括a)提供在合適條件下培養(yǎng)時(shí)生產(chǎn)安莎霉素例如格爾德霉素、除草霉素(除草霉素A、B或C)或其類似物的菌林；b)向所述菌林供給并非AHBA的起始單位，以便所述起始單位摻入到所述安莎霉素類似物中；c)在適宜條件下培養(yǎng)所述菌抹，進(jìn)行安莎霉素類似物的生產(chǎn)；和d)任選地分離所產(chǎn)生的化合物。適宜地a)中菌林的特征在于一個(gè)或多個(gè)AHBA生物合成基因已被缺失或失活。這可以避免AHBA與非天然起始單位竟?fàn)帗饺雽?dǎo)致產(chǎn)率下降。可選地，可以突變a)中的菌林以降低AHBA生物合成效率。適宜地步驟c)的條件使AHBA生物合成效率為亞最佳水平。因此期望地菌林以仍然允許摻入供給的非天然起始單位的水平生產(chǎn)AHBA。通常，所摻入的供給的非天然起始單位的量大于起始單位總摻入量的20%，優(yōu)選大于50%。適宜地起始單位選自式(II)的化合物或其酸部分進(jìn)行衍生化后的類似物，例如酉旨(如甲基酯或乙基酯)其中R6、R7、Rs和R9如上文所定義。適宜地起始單位不是3，5-二氨基苯甲酸、3-氨基-4-鞋基苯甲酸或3-氨基-4-氯苯曱酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，起始單位是式(II)的化合物，其中R6、R7、Rs和R(,均代表H。在另一個(gè)實(shí)施方案中，起始單位是式(n)的化合物，其中R6、R7、R8和R9不都代表H。更多例示性起始單位包括但不限于下表4和5中第二欄所示的那些化合物以及它們適宜的衍生物(例如鹽和酯等等)。在一個(gè)實(shí)施方案中，菌林為安莎霉素生產(chǎn)菌林(如格爾德霉素或除草霉素生產(chǎn)菌林)，且選擇起始單位以便菌林生產(chǎn)18，21-二脫氧-安莎霉素類似物。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇起始單位，從而菌抹生產(chǎn)任選被氟取代的18，21-二脫氧-安莎霉素類似物。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇起始單位，從而菌林生產(chǎn)被氟取代的18,21-二脫氧-安莎霉素類似物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，菌林為大貝菌素生產(chǎn)菌株，且選擇起始單位，從而菌林生產(chǎn)苯環(huán)的18或21位不被取代的大貝菌素類似物。54適宜地所述方法(i)還包括對(duì)步驟(d)的產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)^f務(wù)飾或生物轉(zhuǎn)化的步驟，任選地之后分離所得化合物的步驟；或者(ii)還包括在步驟(d)之前對(duì)步驟(c)的產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)修飾或生物轉(zhuǎn)化的步驟。本發(fā)明另一方面提供了產(chǎn)生類似物如18，21-二脫氧-安莎霉素類似物的方法，所述方法包括a)提供在合適條件下培養(yǎng)時(shí)生產(chǎn)安莎霉素或其類似物的第一宿主菌林，其中任選地已缺失或失活一個(gè)或多個(gè)后PKS基因，和/或已缺失或失活一個(gè)或多個(gè)起始單位生物合成基因；b)向所述菌抹供給非天然起始單位；c)在適宜條件下培養(yǎng)所述經(jīng)修飾的宿主菌林，進(jìn)行安莎霉素類似物如18，21-二脫氧-安莎霉素類似物的生產(chǎn)；和d)任選地分離所產(chǎn)生的化合物。適宜地所供給的起始單位為起始酸。特別地，本發(fā)明提供了生產(chǎn)18,21-二脫氧-安莎霉素類似物的方法，所述方法包括a)提供在合適條件下培養(yǎng)時(shí)生產(chǎn)安莎霉素例如格爾德霉素、除草霉素(如除草霉素A、B或C)或其類似物的第一宿主菌林；b)向所述菌抹供給非天然起始酸；c)在適宜條件下培養(yǎng)所述菌林，進(jìn)行18，21-二脫氧-安莎霉素類似物的生產(chǎn)；和d)任選地分離所產(chǎn)生的化合物。適宜地所述方法還包括步驟e)缺失或失活一個(gè)或多個(gè)起始單位生物合成基因或其同源物，所述步驟通常在步驟c)之前進(jìn)行。適宜地所述方法另外地或者替代性地包括步驟f)缺失或失活一個(gè)或多個(gè)后PKS基因，所述步驟通常在步驟c)之前進(jìn)行。在步驟(a)中，"生產(chǎn)安莎霉素例如格爾德霉素、除草霉素(如除草霉素A、B或C)或其類似物的宿主菌林"包括在合適條件下培養(yǎng)時(shí)生產(chǎn)安莎霉素例如格爾德霉素、除草霉素(如除草霉素A、B或C)或被Rl-Rll的定義所涵蓋的安莎霉素類化合物的菌林。合適條件(以及步驟(c)中的適宜條件)是公知的，或者可以通過(guò)本身已知的方法予以確定)。例如，在步驟(a)中，第一宿主菌林在合適條件下培養(yǎng)時(shí)可以生產(chǎn)格爾德霉素或其類似物。適宜地非天然起子物料是取代的苯甲酸(不是3-氨基-5-羥基-笨甲酸，其為天然起始酸)，最適為任選在環(huán)周圍進(jìn)一步取代的3-氨基-苯甲酸。適宜地非天然起子物料是未被、或被一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)氟原子取代的3-氨基-苯甲酸。在適宜的實(shí)施方案中，非天然起始酸物料為3-氨基苯曱酸。在另一適宜的實(shí)施方案中，非天然起始酸物料為5-氨基-2-氟苯甲酸。在另一適宜的實(shí)施方案中，非天然起始酸物料為5-氨基-3-氟苯甲酸。在另一適宜的實(shí)施方案中，非天然起始酸物料為5-氨基-2，3-二氟苯甲酸。在另一適宜的實(shí)施方案中，非天然起始酸物料為5-氮基-2，3，6-三氟苯曱酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，存在可以向宿主菌抹供給以生產(chǎn)相同化合物的其他可選的非天然起始單位，例如但不限于取代的苯甲酸的甲基酯、乙基酯、N-乙酰-半胱胺硫酯以及該生物合成中間體的二酮類似物(適當(dāng)?shù)鼗罨?，例如作為N-乙酰-半胱胺硫酯而行摻入)。酸化合物也可以以相應(yīng)的鹽形式供給。宿主菌林可以是例如，安莎霉素生產(chǎn)菌林，如格爾德霉素生產(chǎn)菌株或除草霉素生產(chǎn)菌株?？蛇x地，宿主菌抹為基于安莎霉素生產(chǎn)菌抹如格爾德霉素生產(chǎn)菌林(或除草霉素生產(chǎn)菌林)的工程菌林，其中一個(gè)或多個(gè)起始單位生物合成基因已^皮缺失或失活。在另一實(shí)施方案中，宿主菌林為基于安莎霉素生產(chǎn)菌林的工程菌株，其中一個(gè)或多個(gè)后PKS基因已被缺失或失活。在另一實(shí)施方案中，宿主菌林為基于安莎霉素生產(chǎn)菌林的工程菌林，其中^/附M已^皮缺失或失活。在另一實(shí)施方案中，宿主菌林為基于安莎霉素生產(chǎn)菌株的工程菌林，其中同源物和任選地其他后PKS基因已被缺失或失活。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，宿主菌林為格爾德霉素生產(chǎn)菌林。在可選的實(shí)施方案中，宿主菌林為基于格爾德霉素生產(chǎn)菌林的工程菌株，其中一個(gè)或多個(gè)起始單位生物合成基因已被缺失或失活。在另一實(shí)施方案中，宿主菌林為基于格爾德霉素生產(chǎn)菌抹的工程菌林，其中一個(gè)或多個(gè)后PKS基因已被缺失或失活。在另一實(shí)施方案中，宿主菌林為基于格爾德霉素生產(chǎn)菌株的工程菌抹，其中已被缺失或失活。在另一實(shí)施方案中，宿主菌林為基于格爾德霉素生產(chǎn)菌林的工程菌抹，其中g(shù)"附M和任選地其他后PKS基因已被缺失或失活。在另一實(shí)施方案中，宿主菌林為基于格爾德霉素生產(chǎn)菌林的工程菌株，其中一個(gè)或多個(gè)后PKS基因已被缺失或失活，隨后重新引入后PKS基因以實(shí)現(xiàn)特異的后PKS修飾。可以利用來(lái)自格爾德霉素簇或另外的安莎霉素簇例如但不限于大貝菌素或除草霉素簇的后PKS基因。在另一實(shí)施方案中，宿主菌林為除草霉素(如除草霉素A、B或C)生產(chǎn)菌林。在另一實(shí)施方案中，宿主菌林為自溶霉素生產(chǎn)菌林。在另一實(shí)施方案中，宿主菌林為利布拉霉素產(chǎn)菌林。在另一實(shí)施方案中，宿主菌林為基于除草霉素生產(chǎn)菌林的工程菌林，其中同源物已被缺失或失活。在另一實(shí)施方案中，宿主菌林為基于格爾德霉素生產(chǎn)菌抹的工程菌林，其中^/附M同源物和任選地其他后PKS基因已被缺失或失活。例如，可-皮缺失或失活的起始單位生物合成基因包括格爾德霉素生產(chǎn)菌抹吸水鏈霉菌AM3602(參見(jiàn)Rascher等2005)之a(chǎn)hba-B簇中稱為57ahba-3、ahba-lc、ahba-4、ahba-b、ahba-la、ahba-lb的基因，或者大貝菌素生產(chǎn)菌抹珍貴束絲放線菌ATCC31280(參見(jiàn)表3)中的PH、OX、Ahs、Adh和AHk基因，以及其他菌林中具有相似功能的那些同源物。例如，格爾德霉素生產(chǎn)菌林吸水鏈霉菌AM3602之a(chǎn)hba-B簇中的所有基因均可被缺失或失活。前述的種種缺失可以進(jìn)行組合，例如，宿主菌林可以是基于安莎霉素生產(chǎn)菌抹(如格爾德霉素或除草霉素生產(chǎn)菌抹)的工程菌林，其中^/附M或其同源物和一個(gè)或多個(gè)起始單位生物合成基因以及任選地其他后PKS基因已被缺失或失活。適宜地選擇性地缺失或失活所述一個(gè)或多個(gè)起始單位生物合成基因或后PKS基因。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)在基因中整合DNA從而不生產(chǎn)功能蛋白質(zhì)而使所述工程菌林中的一個(gè)或多個(gè)起始單位生物合成基因或后PKS基因失活。在可選的實(shí)施方案中，通過(guò)一處或多處尋革巴缺失而對(duì)所述工程菌抹中的一個(gè)或多個(gè)所述起始單位生物合成基因或后PKS基因進(jìn)行缺失。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)定點(diǎn)誘變而使所述工程菌林中的一個(gè)或多個(gè)起始單位生物合成基因或后PKS基因失活。在另一實(shí)施方案中，對(duì)格爾德霉素生產(chǎn)宿主菌林進(jìn)行化學(xué)或紫外誘變，并選擇其中一個(gè)或多個(gè)起始單位生物合成酶或后PKS酶無(wú)功能的修飾菌林。本發(fā)明也嚢括對(duì)控制一個(gè)或多個(gè)后PKS基因表達(dá)的調(diào)控因子進(jìn)行突變，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解調(diào)控因子的缺失或失活可以與所述基因的缺失或失活具有相同的結(jié)果。后PKS基因可在合適的啟動(dòng)子下被引入所述宿主細(xì)胞中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以將一個(gè)或多個(gè)所述缺失的基因引入到鏈霉菌噬菌體phiBTl(Gregory等，2003)的染色體嗟菌體附著位點(diǎn)(chromosomalphageattachmentsite)。本領(lǐng)域才支術(shù)人員將會(huì)理解，反式互補(bǔ)作用并不局限于此噬菌體附著位點(diǎn)，或者并不真正局限于附著位點(diǎn)的使用。因此，還可以通過(guò)但不限于例如利用pSET152(Bierman等，1992)衍生物，將一個(gè)或多個(gè)輔助基因在合適的啟動(dòng)子下引入到其他噬菌體附著位點(diǎn)，例如鏈霉菌噬菌體phiC31的附著位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)缺失的輔助基因的互補(bǔ)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，有更多早已公知的噬菌體，且預(yù)期有更多的噬菌體可以含有整合功能，該功能能夠與適宜的啟動(dòng)子一起轉(zhuǎn)移給遞送載體，從而產(chǎn)生能夠用于將基因引入宿主菌林的其它系統(tǒng)(Smovkina等，1990，Matsuura等，1996，VanMellaert等，1998,Lee等，1991)。隨著更多的噬菌體得以表征，人們預(yù)期將會(huì)有更多可利用的整合酶，可以類似地進(jìn)行使用。通過(guò)但不限于同源重組至染色體的中性位置、同源重組至染色體的非中性位置(例如破壞所選的基因)，也能夠?qū)崿F(xiàn)在合適啟動(dòng)子下的后PKS基因的引入。也可使用自主復(fù)制型栽體，例如但不限于含有來(lái)自pSG5(如pKC1139，Bierman等，1992)、pIJ101(如pIJ487，Kieser等，2000)和SCP2*(如pIJ698，Kieser等，2000)的鏈霉菌復(fù)制起點(diǎn)的栽體。在另一實(shí)施方案中，在一個(gè)或多個(gè)后PKS基因如上述已,皮缺失或失活的工程菌抹中，重新引入了一個(gè)或多個(gè)相同的后PKS基因或其來(lái)自另一可選格爾德霉素生產(chǎn)菌林的同源物。在另一實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)基因已被缺失或失活的工程菌林通過(guò)來(lái)自異源PKS簇l包括但不限于指導(dǎo)利福霉素(rifamycin)、柄型菌素(ansamitocin)、大貝菌素或除草霉素生物合成的蔟的一個(gè)或多個(gè)后PKS基因互補(bǔ)。選擇性地缺失或失活后PKS基因的方法包括(i)設(shè)計(jì)基于目的基因序列的特異性寡聚物，利用PCR從適宜的格爾德霉素生產(chǎn)菌株中分離目的基因的內(nèi)部片段；(ii)將含有此片段的質(zhì)粒整合到相同或不同的格爾德霉素生產(chǎn)菌林中，接著進(jìn)行同源重組，導(dǎo)致破壞粑基因；(iii)在適于生產(chǎn)安莎霉素類似物的條件下培養(yǎng)這樣產(chǎn)生的菌林。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，利用上述方法的替代方法可以獲得等同的菌才朱，例如■可以設(shè)計(jì)基于目的基因同源物的簡(jiǎn)并寡聚物(例如來(lái)自利福霉素、大貝菌素或除草霉素生物合成簇和/或其他可利用序列)，并利用PCR從適宜的格爾德霉素生產(chǎn)菌林中分離目的基因的內(nèi)部片段?？梢栽O(shè)計(jì)不同的簡(jiǎn)并寡聚物，以成功擴(kuò)增格爾德霉素生產(chǎn)菌或其同源物生產(chǎn)菌抹的后PKS基因或該基因的同源物的合適區(qū)域。,可以利用吸水鏈霉菌格爾德亞種NRRL3602菌林的基因序列產(chǎn)生可以特異于吸水鏈霉菌格爾德亞種NRRL3602基因的寡聚物，然后可以從任何格爾德霉素生產(chǎn)菌林例如吸水鏈霉菌格爾德亞種NRRL3602或鏈霉菌屬菌種DSM4137或紫黑鏈霉菌DSM40699中擴(kuò)增內(nèi)部片段。國(guó)吸水鏈霉菌格爾德亞種NRRL3602菌林的基因序列可以與同源基因序列(例如來(lái)自鏈霉菌屬菌種DSM4137或紫黑鏈霉菌DSM40699的格爾德霉素生物合成簇)一起用來(lái)產(chǎn)生針對(duì)吸水鏈霉菌格爾德亞種NRRL3602基因的簡(jiǎn)并寡聚物，然后可以從任何格爾德霉素生產(chǎn)菌林例如吸水鏈霉菌格爾德亞種NRRL3602或鏈霉菌屬菌種DSM4137或紫黑鏈霉菌DSM40699中擴(kuò)增內(nèi)部片段。圖2顯示了格爾德霉素生物合成簇中后PKS基因的活性。因而本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒定哪些另外的后PKS基因需要進(jìn)行缺失或失活，以獲得生產(chǎn)目的化合物的菌抹。在這些系統(tǒng)中可能觀察到，當(dāng)由于所述方法之一[包括失活或缺失產(chǎn)生了其中一個(gè)或多個(gè)后PKS基因不再發(fā)揮功能的菌林時(shí)，可以生產(chǎn)不止一種安莎霉素類似物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，這有很多可能的原因。例如，可能存在一個(gè)優(yōu)選的后PKS步驟次序，而除去單個(gè)活性將導(dǎo)致所有后續(xù)步驟在對(duì)于所涉及酶而言非天然的底物上進(jìn)行。這可能導(dǎo)致中間體在培養(yǎng)液中累積，這是因?yàn)獒槍?duì)呈遞給后PKS酶的新底物的效率降低，或者是因?yàn)榭赡苡捎诓襟E次序已#1改變而不再是剩余酶的底物的支路產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，在混合物中所觀察到的化合物比率可以運(yùn)用生長(zhǎng)條件方面的變化進(jìn)行操縱。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，在生物合成簇中有些基因是以操縱子的形式組織的，破壞一個(gè)基因通常會(huì)對(duì)同一操縱子中后續(xù)基因的表達(dá)有影響。當(dāng)觀察到化合物的混合物時(shí)，這些化合物能夠利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)容易地進(jìn)60行分離，其中一些技術(shù)在如下實(shí)施例中予以說(shuō)明。如本文所述，安莎霉素類似物可以通過(guò)許多方法進(jìn)行篩選，在單個(gè)化合物表現(xiàn)出有利特性的情況下，可以改造菌林使之優(yōu)先生產(chǎn)此化合物。在不可能這樣進(jìn)行的不常見(jiàn)情況下，可以產(chǎn)生中間體，隨之對(duì)其進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，以生產(chǎn)期望化合物。本發(fā)明提供了新的安莎霉素類似物，其通過(guò)培養(yǎng)生產(chǎn)安莎霉素聚酮化合物或其類似物、例如格爾德霉素或其類似物的菌抹，并提供用作起始單位而摻入的酸物料而產(chǎn)生，所述菌林任選地被選擇性地缺失或失活一個(gè)或多個(gè)來(lái)自PKS基因簇的后PKS基因。特別地，本發(fā)明涉及新的安莎霉素類似物，通過(guò)向格爾德霉素生產(chǎn)菌林供給非天然起始單位而生產(chǎn)，任選地與選擇性缺失或失活一個(gè)或多個(gè)來(lái)自格爾德霉素PKS基因簇的后PKS基因相組合。另外，還可以重新引入一個(gè)或多個(gè)來(lái)自安莎霉素生物合成簇的后PKS基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，為使基因產(chǎn)物無(wú)功能，無(wú)需完*失基因，因此如本文所用的術(shù)語(yǔ)"缺失的或失活的"涵蓋4吏基因產(chǎn)物無(wú)功能的任何方法，包括但不限于缺失全部基因、缺失部分基因、靶基因的插入失活、導(dǎo)致基因不表達(dá)或雖表達(dá)但生產(chǎn)失活蛋白質(zhì)的定點(diǎn)誘變、導(dǎo)致基因不表達(dá)或雖表達(dá)但生產(chǎn)失活蛋白質(zhì)的宿主菌林誘變(例如通過(guò)輻射或接觸致突變化學(xué)品、原生質(zhì)體融合或轉(zhuǎn)座子誘變)?？蛇x地，活性基因產(chǎn)物的功能可以利用抑制劑進(jìn)行化學(xué)削弱，例如甲基雙吡啶丙酮(metapyrone)(別名2-曱基-1，2-二(3-吡咬基-1-丙酮)，EP0627009)和嘧啶醇(ancymidol)為加氧酶抑制劑，這些化合物可以添加到生產(chǎn)介質(zhì)中以產(chǎn)生類似物。另外，西奈芬凈(sinefungin)為曱基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，可以類似地加以利用，不過(guò)是用于抑制體內(nèi)甲基轉(zhuǎn)移酶活性(McCammon和Parks,1981)。在可選的實(shí)施方案中，可以缺失或失活所有的后PKS基因，然后可以通過(guò)互補(bǔ)重新引入一個(gè)或多個(gè)所述基因(例如，于附著位點(diǎn)(attachmentsite)處，位于自主復(fù)制型質(zhì)粒上，或插入到染色體同源區(qū))。因此，在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生安莎霉素類似物(如18,21-二脫氧安莎霉素類似物)的方法，所述方法包括a)提供當(dāng)在合適條件下培養(yǎng)時(shí)生產(chǎn)格爾德霉素的第一宿主菌林；b)任選選擇性地缺失或失活所有的后PKS基因；c)向所述菌抹供給非天然起始單位；d)在適宜條件下培養(yǎng)所迷經(jīng)修飾的宿主菌林，以生產(chǎn)安莎霉素類似物；和e)任選地分離所產(chǎn)生的化合物。在可選的實(shí)施方案中，重新引入一個(gè)或多個(gè)缺失的后PKS基因。在另一實(shí)施方案中，重新引入來(lái)自不同生產(chǎn)菌林的格爾德霉素簇中的一個(gè)或多個(gè)后PKS基因。在另一實(shí)施方案中，引入選自大貝菌素生物合成簇的一個(gè)或多個(gè)后PKS基因，重新引入的基因選自包括附Adkf、wAdV,附k戶，,m&'MT7、附&'Af72和附&'/^50的組。在另一實(shí)施方案中，重新引入選自/w6c/Vf、柳6ciV、m&P、附6cA/T7、附6cA/T2和附6ciV5C的2個(gè)或更多個(gè)后PKS基因。在另一實(shí)施方案中，重新引入選自w辦cAT、附6dV、附6cP、附力c'yVf77、附&A/T2和附6c/M50的3個(gè)或更多個(gè)后PKS基因。在另一實(shí)施方案中，重新引入選自附6cM、附&'7V、附&尸、附&'A/T7、附6cM77和附6c/^/50的4個(gè)或更多個(gè)后PKS基因。在另一可選的實(shí)施方案中，重新引入選自/w/j('A/,附/jcA^、柳Ac戶、附kAf77、附AcA/T2和柳k/V50的5個(gè)或更多個(gè)后PKS基因。另夕卜，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，可以缺失或失活一個(gè)后PKS基因亞組，且任選地可以重新引入一個(gè)所述后PKS基因的更小亞組，以得到當(dāng)供給非天然起始單位時(shí)生產(chǎn)安莎霉素類似物如18，21-二脫氧-安莎霉素類似物的菌林。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生安莎霉素類似物(如18，21-二脫氧-安莎霉素類似物)的方法，所述方法包括a)提供當(dāng)在合適條件下培養(yǎng)時(shí)生產(chǎn)格爾德霉素的第一宿主菌林；b)選擇性地缺失或失活^/wM;c)向所述菌林供給非天然起始單位；d)在適宜條件下培養(yǎng)所述經(jīng)修飾的宿主菌林，以生產(chǎn)安莎霉素類似物(如18，21-二脫氧-安莎霉素類似物)；和e)任選地分離所產(chǎn)生的化合物。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生安莎霉素類似物(如18,21-二脫氧-安莎霉素類似物)的方法，所述方法包括a)提供當(dāng)在合適條件下培養(yǎng)時(shí)生產(chǎn)格爾德霉素的第一宿主菌抹；b)選擇性地缺失或失活gJmAf;c)任選地選擇性缺失或失活其它后PKS基因；(1)向所述菌抹供給非天然起始單位；e)在適宜條件下培養(yǎng)所述經(jīng)修飾的宿主菌林，以生產(chǎn)安莎霉素類似物(如18，21-二脫氧-安莎霉素類似物)；和f)任選地分離所產(chǎn)生的化合物。本領(lǐng)域^L術(shù)人員眾所周知，聚酮化合物基因簇可以在異源宿主中進(jìn)行表達(dá)(Pfeifer和Khosla，2001)。相應(yīng)地，本發(fā)明包括安莎霉素聚酮化合物生物合成簇、例如格爾德霉素生物合成基因簇帶或不帶抗性及調(diào)控基因，或完整的或含有缺失l向異源宿主的轉(zhuǎn)移。可選地，完整的安莎霉素聚酮化合物生物合成簇、例如完整的格爾德霉素生物合成簇可以轉(zhuǎn)移到異源宿主中，帶或不帶抗性及調(diào)控基因，然后可以通過(guò)本文描述的方法進(jìn)行操縱，以缺失或失活一個(gè)或多個(gè)后PKS基因或起始單位生物合成基因。進(jìn)行上文所定義的如此大片段DNA轉(zhuǎn)移的方法和載體是本領(lǐng)域眾所周知的(Rawlings，2001;Staunton和Weissman,2001)，或在本文所公開(kāi)的方法中提供。在此上下文中優(yōu)選的宿主細(xì)胞菌林為原核生物，更優(yōu)選放射菌類或大腸桿菌(Esc/ien'c/1^1還更優(yōu)選包括但不限于奇跡束絲放線菌(爿"/rt仍j;朋e附fl附/rw附，A附/rw附)、珍貴束絲放線菌珍貴亞種(y4"/"6^/IWe附ft/7,W/asw附s/>s/>./7re,/仍w附，A/7rC/ayw附」、吸水鏈霉菌、吸水鏈霉菌物種(5"./y;g/mcop/c船乎)、吸水鏈霉菌子嚢霉素變種(51./膽mv(。/7/cwsvorr.a5X'o附y(tǒng)c"/c"5")、5^p"附y(tǒng)ces^A:w6"^i57's、紫黑鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌(S&印tomycMcoe/《'cotor)、變鉛青鏈霉菌(5^f印to附j(luò);"s//v,V/"".s)、紅色糖多孑包菌(<y"ccAtfra/7o/y5/7ome/j幼r"e")、弗氏鏈霉菌(S&e/7to附j(luò);ces/md/fle)、除蟲(chóng)鏈霉菌(S^r/7似附j(luò);ces"ver/mY"/s)、肉桂地鏈霉菌(5V/^尸to附y(tǒng)cey"Vmfl附owews/5)、龜裂鏈霉菌(iSy"/7,o附j(luò)^esr/附os"51)、白色鏈霉菌(5Y^/7to/wj;cMfl幼ws)、灰褐鏈霉菌(A/^/7似附j(luò);c^gn、^/i^c附)、黃色長(zhǎng)孢鏈霉菌(5^印to附j(luò);"s/owg/s/70/Zavws)、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(5^^pto附^c^VeWMWe/fl^)、白色鏈霉菌、小單孢菌屬菌種(^//(^0/"0"05/70^5/.)、灰略紅'J、單孑包菌(AfZtro附開(kāi)05/;omgWsfw6,Wfl)、地中海擬無(wú)枝酸菌(v4附^c^"^/w^附^/,^,""^)或游動(dòng)放線菌屬菌種(^"'"°/7/做^5/7.)7V卯2-/跌在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移完整的生物合成簇。在可選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移完整的PKS，而不轉(zhuǎn)移任何相關(guān)的起始單位生物合成基因和/或后PKS基因。在另一實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移完整的格爾德霉素生物合成簇，然后按照本文的說(shuō)明進(jìn)行操作。在另一實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移完整的PKS，而不轉(zhuǎn)移任何相關(guān)的起始單位生物合成基因和/或后PKS基因，并向新宿主中引入選擇的后PKS基因，例^口1旦不卩艮于grf附A^、附6c7V、/^附7V、gd附丄和/或附6c尸450。在本發(fā)明可選的方面，本發(fā)明的安莎霉素類似物可以通過(guò)用合適菌林進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化而進(jìn)一步加工。合適的菌林可以是可得的野生型菌林，例如但不限于奇跡束絲放線菌、珍貴束絲放線菌珍貴亞種、吸水鏈霉菌、吸水鏈霉菌物種、紫黑鏈霉菌。可選地，可以改造合適的菌林，以允許利用特定的后PKS酶[例如但不限于由附&M、附AdV、附&P、柳6dWT7、附&'/^5〃(如本文所定義)、^/附7V、^/附M、^/附l、gd附戶(Rascher等，2003)所編碼的那些酶，格爾德霉素O-甲基轉(zhuǎn)移酶，hbmN、hbmL、hbmP(Rascher等，2005)，除草霉素O-曱基轉(zhuǎn)移酶和其它的除草霉素單加氧酶，《w附7、"5"附70、"5"附//、"s附72、"5"附/9和(Cassady等，2004，Spiteller等，2003)j進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。在基因仍有待鑒定或者序列未公開(kāi)的情況下，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法獲取這樣的序列對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是常規(guī)的。例如，編碼格爾德霉素O-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因的序列不在公眾域，但本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠生成探針對(duì)格爾德霉素生產(chǎn)菌林進(jìn)行Southern印跡，從而獲取該基因以生成生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，其中探針可以是利用相似O-甲基轉(zhuǎn)移酶生成的異源探針，或可以是根據(jù)可得的同源基因通過(guò)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物而生成的同源探針。在具體的實(shí)施方案中，菌林可以全部或部分地缺失其一個(gè)或多個(gè)天然聚酮化合物簇，或以其他方式失活，從而防止由所述天然聚酮化合物簇生產(chǎn)的聚酮化合物。所述工程菌林可以選自例如但不限于奇跡束絲放線菌、珍貴束絲放線菌珍貴亞種、吸水鏈霉菌、吸水鏈霉菌物種、吸水鏈霉菌子嚢霉素變種、5^e/7&附j(luò);wfewA:"Zfl^i^s、紫黑鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌、變鉛青鏈霉菌、紅色糖多孢菌、弗氏鏈霉菌、除蟲(chóng)鏈霉菌、肉桂地鏈霉菌、龜裂鏈霉菌、白色鏈霉菌、灰褐鏈霉菌、黃色長(zhǎng)孢鏈霉菌、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌、小單孢菌屬菌種、灰略紅小單孢菌、地中海擬無(wú)枝酸菌或游動(dòng)放線菌屬菌種7￥9^-/^。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)可，其他安莎霉素聚酮化合物生物合成簇，例如除草霉素、利布拉霉素或TAN簇能夠等同地用于產(chǎn)生本發(fā)明的化合物利用除草霉素生產(chǎn)菌林f例如但不限于吸水鏈霉菌AM3672(Rascher等，2005)1，或者生產(chǎn)除草霉素類似物的菌林[例如但不限于工程化的吸水鏈霉菌AM-3672j，其中一個(gè)或多個(gè)后PKS基因或起始單位生物合成基因已被失活或缺失，任選地重新引入了一個(gè)或多個(gè)同源或異源后PKS基因，并供給如本文所述的起始酸。除草霉素PKS簇的序列存儲(chǔ)在GenBank(登錄號(hào)AY947889)(Rascher等，2005)中。在需要的基因不位于此序列中的情況下，通過(guò)利用同源或異源探針來(lái)定位之，所述探針如本文所述通過(guò)利用同源序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并寡聚物而生成。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)可，利布拉霉素簇能夠等同地用于產(chǎn)生本發(fā)明的化合物，其中利用利布拉霉素生產(chǎn)菌林[例如但不限于鏈霉菌屬菌種S6699(Stead等，2000)]，或者生產(chǎn)利布拉霉素類似物的菌林[例如但不限于工程化的鏈霉菌屬菌種S6699j,其中一個(gè)或多個(gè)后PKS基因或起始單位生物合成基因已被失活或缺失，任選地重新引入了一個(gè)或多個(gè)同源或異源后PKS基因，并供給如本文所述的起始酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)可，當(dāng)適用本發(fā)明的方法時(shí)，有多種其他生產(chǎn)天然產(chǎn)物的菌林可用于生產(chǎn)本發(fā)明的化合物。盡管如上文所述的本發(fā)明制備安莎霉素類似物的方法基本上或完全是生物合成法，但并不排除通過(guò)包括標(biāo)準(zhǔn)合成化學(xué)方法的方法來(lái)生產(chǎn)或相與轉(zhuǎn)換安莎霉素類似物。為了能夠遺傳操縱格爾德霉素PKS基因簇，利用了存儲(chǔ)在GenBank(登錄號(hào)AY179507)中的基因簇序列(Rascher等，2003)。在需要的基因不位于此序列中的情況下，可以通過(guò)利用同源或異源探針來(lái)定位之，所述探針如本文所述通過(guò)利用同源序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并寡聚物而生成。為了利用大貝菌素簇的后PKS基因，對(duì)來(lái)自珍貴束絲放線菌珍貴亞種的大貝菌素基因簇進(jìn)行了測(cè)序，這在實(shí)施例l中予以說(shuō)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，存在生產(chǎn)大貝菌素的替代菌林，例如但不限于奇跡束絲放線菌?？梢匀绫疚乃鲇糜谡滟F束絲放線菌珍貴亞種的方法來(lái)測(cè)序來(lái)自這些菌林的大貝菌素PKS基因簇，并利用所述信息生成等同菌抹。本發(fā)明更多的方面包括-基于安莎霉素生產(chǎn)菌林(如格爾德霉素或除草霉素(如除草霉素A、B或C)生產(chǎn)菌株)的工程菌抹，其中^ZwAf同源物和任選地其它后PKS基因已被缺失或失活，特別是這樣的工程菌林，其中^/wM同源物已被缺失或失活。適宜地所述安莎霉素生產(chǎn)菌林為鏈霉菌，如吸水鏈霉菌格爾德亞種1VRRL3602或鏈霉菌屬菌種DSM4137或紫黑鏈霉菌DSM40699。-基于安莎霉素生產(chǎn)菌林的工程菌林，其中一個(gè)或多個(gè)引起單元生物合成基因已^皮缺失或失活，例如格爾德霉素生產(chǎn)菌林，例如其中g(shù)rfmO缺失或失活，或者除草霉素生產(chǎn)菌林，例如其中；^附o缺失或失活。-基于安莎霉素生產(chǎn)菌林(如格爾德霉素或除草霉素生產(chǎn)菌林)的工程菌抹，其中g(shù)"wM或其同源物和一個(gè)或多個(gè)引起單元生物合成基因和任選地其它后PKS基因已被缺失或失活。例如，格爾德霉素生產(chǎn)菌林吸水鏈霉菌AM3M2之a(chǎn)hba-B蔟中的所有基因(或其他菌林中的同源物)均可被缺66失或失活。或者，格爾德霉素生產(chǎn)菌抹吸水鏈霉菌AM3602之a(chǎn)hba-B簇中的一些(或其他菌林中的同源物)可被缺失或失活，得到其中AHBA生物合成下降或消除的菌林，這可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)當(dāng)對(duì)這樣的菌抹供給AHBA時(shí)，恢復(fù)格爾德霉素或其他安莎霉素的良好生產(chǎn)。-這樣的工程菌抹在制備安莎霉素類似物(如18，21-二脫氧-安莎霉素類似物)中的用途。-通過(guò)任何上述方法獲得或可獲得的安莎霉素類似物。本發(fā)明化合物的優(yōu)勢(shì)在于預(yù)期具有一種或多種如下性質(zhì)與Hsp90緊密結(jié)合，與Hsp90的快速結(jié)合速率(faston-rateofbinding),良好溶解性、良好穩(wěn)定性、良好配制性能、良好口服利用度、良好藥代動(dòng)力學(xué)性能，包括但不限于低葡糖醛酸化作用，良好細(xì)胞吸收，良好腦藥代動(dòng)力學(xué)，與紅細(xì)胞低結(jié)合，良好毒理性質(zhì)，良好肝毒性，良好腎毒性，低副作用和低心臟副作用。實(shí)施例培養(yǎng)基1-MAM在1L蒸餾水中<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>于121。C高壓滅菌20分鐘。培養(yǎng)基2_R6向700mL蒸餾水中添加蔗糖譜g糊精粉10g酪蛋白氨基酸lgMgSO4.7H200.05g*微量元素1mLK2S040.1g瓊脂20g*微量元素FeS04.7H20、MnCl2.4H20和ZnS04.7H20各lg/L。于121。C高壓滅菌20分鐘。滅菌后添加如下無(wú)菌溶液(注意谷氨酸過(guò)濾除菌)L-谷氨酸單鈉鹽(O.MM)100mLCaCl2.2H20(0.48M)100mLMOPS(pH7.2)(0.1M)100mL爽承培#濕以迷/,丄CM51為、浙將培養(yǎng)液(lmL)和乙酸乙酯(lmL)劇烈混合15-30分鐘，然后離心10分鐘。收集0.5mL有機(jī)層，蒸發(fā)至干，然后重溶于0.25mL甲醇中。丄CM^為、^f才法分析性LCMS是在與BrukerDaltonicsEsquire3000+電噴霧質(zhì)i普儀|以正和/或負(fù)離子模式運(yùn)行j聯(lián)用的AgilentHPllOOHPLC系統(tǒng)上利用LCMS方法1進(jìn)4亍的。LCMS方法1:層才斤在PhenomenexHyperclone沖主(C18BI)S,粒徑3nm,150x4.6mm)上完成，利用如下梯度洗脫程序，以流速為1mL/min進(jìn)行洗脫T=0，10%B;T=2，10%B;T=20,100%B;T=22，100%B;T=22.05，10%B;T=25，10%B。流動(dòng)相A"K+0.1%甲酸；流動(dòng)相B二乙腈+0.1。/。曱酸。記錄l卯和400nm之間的紫外光謙，取210、254和276nm處的提取層析語(yǔ)(extractedchromatogram)。記錄100和1500amu之間的質(zhì)語(yǔ)。;v慮錄潛7#才法記錄NMR語(yǔ)，在BrukerAdvance500分光光度計(jì)上298K處對(duì)'H和13C而言分別以500MHz和125MHz運(yùn)行。利用標(biāo)準(zhǔn)Bruker脈沖順序獲取'H-'HCOSY、APT、HMBC和HMQC譜。NMR鐠參照運(yùn)行溶劑中殘留質(zhì)子或標(biāo)準(zhǔn)碳原子的共振。純化的化合物利用所述的LCMS方法2進(jìn)行分析。LCMS方法2:層析在PhenomenexHypercloneC18-BDS柱(4.6xl50mm，粒徑3,)上完成，利用水+0.1%曱酸乙腈+0.1%甲酸(卯:10)至(0:100)的梯度以1mL/min洗脫20分鐘。通過(guò)MS于多個(gè)波長(zhǎng)(210、254和276nm)下對(duì)純度進(jìn)行評(píng)估。所有化合物在所有波長(zhǎng)下的純度大于95%。最后通過(guò)檢查'H和"CNMR譜來(lái)驗(yàn)證純度。^癥話'^參都定在弗萊堡市腫瘤測(cè)試有限公司實(shí)驗(yàn)胂瘤學(xué)研究所的腫瘤測(cè)試實(shí)驗(yàn)室(OncotestTestingFacility,InstituteforExperimentalOncology,OncotestGmbH,Freiburg),以單層增殖測(cè)定法進(jìn)行化合物對(duì)于一組人腫瘤細(xì)胞系的抗癌活性的體外評(píng)價(jià)。所選擇的細(xì)胞系的特征總結(jié)于表1。表l-測(cè)試細(xì)胞系#細(xì)胞系特征1CNXF4謂LCNSCXFHT29結(jié)腸癌3LXF1121L肺癌，大細(xì)胞癌4MCF-7乳腺癌，NCI標(biāo)準(zhǔn)5MEXF394NL黑色素瘤6DU145前列腺癌-PTEN陽(yáng)性所述Oncotest細(xì)胞系按Roth等(1999)所述由人腫瘤異種移植物建立。供體異種移植物的來(lái)源見(jiàn)Fiebig等(1999)說(shuō)明。其他細(xì)胞系獲自NCI(DU145,MCF-7)或購(gòu)自德國(guó)布倫瑞克(Braunschweig)的DSMZ。除非另有說(shuō)明，所有細(xì)胞系于37。C在潮濕空氣(95。/?？諝?，5%C02)中在含RPMI1640培養(yǎng)基、10。/。胎牛血清和0.1mg/mL慶大霉素的"即混"培養(yǎng)基中(PAA，C61be，德國(guó))培養(yǎng)。利用改良的碘化丙錠(propidiumiodide)測(cè)定法評(píng)估測(cè)試化合物對(duì)人肺瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)的影響(Dengler等，(1995)。簡(jiǎn)言之，通過(guò)胰蛋白酶消化收集指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，計(jì)數(shù)并鋪在96孔平底微孔板中，細(xì)胞密度取決于細(xì)胞系(5-10.000存活細(xì)胞/孔)。在24小時(shí)恢復(fù)使細(xì)胞重新開(kāi)始指數(shù)生長(zhǎng)后，向孔中加入0.01mL培養(yǎng)基(每板6個(gè)對(duì)照孔)或含有安莎霉素類似物的培養(yǎng)基。每個(gè)濃度一式三份進(jìn)行鋪板?；衔镆晕宸N濃度使用(100;10;1;0,1和O，OlpM)。在4天連續(xù)接觸后，將含有或不含測(cè)試化合物的細(xì)胞培養(yǎng)基替換為0.2mL硪化丙錠(PI)水溶液(7mg/L)。為了測(cè)定活細(xì)胞的比例，可以冷凍微孔板，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行透化處理。在解凍微孔板后，用Cytofluor4000微孔板讀板儀測(cè)量熒光(激發(fā)光530nm，發(fā)射光620nm),給出與存活細(xì)胞總數(shù)的直接關(guān)系。生長(zhǎng)抑制表達(dá)為處理/對(duì)照x100(%T/C)。實(shí)施例1-大貝菌素PKS基因簇的測(cè)序利用Kieser等(2000)所述的標(biāo)準(zhǔn)方案從珍貴束絲放線菌(ATCC31280)和奇跡束絲放線菌(DSM43827，ATCC29888)中分離基因組DNA。利用標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)位于劍橋CB21QW網(wǎng)J求場(chǎng)路的劍橋大學(xué)生物化學(xué)系(BiochemistryDepartment,UniversityofCambridge,TennisCourtRoad,CambridgeCB21QW)的測(cè)序?qū)嶒?yàn)室進(jìn)行DNA測(cè)序。采用引物BIOSG1045'-GGTCTAGAGGTCAGTGCCCCCGCGTA(CGTCGT-3，(SEQIDNO:l)和BIOSG1055,-GGCATATGCTTGTGCTCGGGCTCAAC-3，(SEQIDNO:2)利用標(biāo)準(zhǔn)才支術(shù)擴(kuò)增了來(lái)自吸水鏈霉菌NRRL3602格爾德霉素生物合成基因簇(序列登錄號(hào)AY179507)的氨基曱?；D(zhuǎn)移酶編碼基因^/附見(jiàn)根據(jù)廠商的說(shuō)明利用DIG試劑和非放射性核酸標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒(羅氏，Roche)進(jìn)行Southern印跡實(shí)驗(yàn)。利用DIG標(biāo)記的^/附7VDNA片段作為異源探針。利用^Z附iV生成的探針和分離自珍貴束絲^L線菌2112的基因組DNA，在Southern印跡分析中鑒定到大約8kb的EcoRI片段。利用標(biāo)準(zhǔn)方法將所述片段克隆到Litmus28中，并通過(guò)菌落雜交鑒定轉(zhuǎn)化林。分離到克隆p3，并對(duì)大約7.7kb的插入片段進(jìn)行了測(cè)序。利用五"RI和￡coRIA9acI消化從克隆p3中分離的DNA，分別分離7.7kb左右和大約1.2kb處的條帶。按照廠商的方案進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。按照廠商的說(shuō)明，利用載體S叩erCos1和GigapackIIIXL包裝試劑盒(Stratagene)建立上文所指的兩個(gè)菌4朱的粘粒文庫(kù)。這兩個(gè)文庫(kù)利用標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行篩選，利用源自克隆p3的7.7kbERI片段的DIG標(biāo)記片段作為探針。從珍貴束絲放線菌的粘粒文庫(kù)中鑒定到粘粒52，并遞交劍橋大學(xué)生物化學(xué)系的測(cè)序?qū)嶒?yàn)室進(jìn)行序列分析。與此類似，從奇跡束絲放線菌的粘粒文庫(kù)中鑒定到粘粒43和粘粒46。如Southern印跡分析所示，所有三個(gè)粘粒都含有7.7kb的E"RI片段。利用引物BIOSG1245，-CCCGCCCGCGCGAGCGGCGCGTGGCCGCCCGAGGGC-3，(SEQIDNO:3)和BIOSG1255，-GCGTCCTCGCGCAGCCACGCCACCAGCAGCTCCAGC陽(yáng)3，(SEQIDNO:4)運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)方案擴(kuò)增了粘粒43中PKS區(qū)大約0.7kbp的片段，克隆，并用作為探針來(lái)篩選珍貴束絲放線菌粘粒文庫(kù)以尋找重疊克隆。還利用粘粒52的序列信息生成了衍生自如下I)NA片段的探針，所述DNA片段利用引物,SGU05，-CCAACCCCGCCGCGTCCCCGGCCGCGCCGAACACG-3，(SEQIDNO:5)和BIOSG1315,-GTCGTCGGCTACGGGCCGGTGGGGCAGCTGCTGT-5，(SEQIDNO:6)以及BIOSG1325，國(guó)GTCGGTGGACTGCCCTGCGCCTGATCGCCCTGCGC-3'(SEQIDNO:7)和BIOSG1335，-GGCCGGTGGTGCTGCCCGAGGACGGGGAGCTGCGG-3，(SEQIDNO:8)擴(kuò)增產(chǎn)生，所述探針用于篩選珍貴束絲放線菌粘粒文庫(kù)。分離到粘粒311和352,并將粘粒352送交測(cè)序。粘津立352與粘粒52含有大約2.7kb的重疊。為篩選更多的粘粒，利用引物BIOSG1365-CACCGCTCGCGGGGGTGGCGCGGCGCACGACGTGGCTGC-3，(SEQIDNO:9)和BIOSG1375，-CCTCCTCGGACAGCGCGATCAGCGCCGCGCACAGCGAG-3，(SEQIDNO:10)，以粘粒311作為模板，運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)方案，擴(kuò)增了大約0.6kb的PCR片段。對(duì)珍貴束絲放線菌的粘粒文庫(kù)進(jìn)行了篩選，并分離到粘粒410。它與粘粒352重疊大約17kb，并送交測(cè)序。對(duì)三個(gè)重疊粘粒(粘粒52、粘粒352和粘粒410)的序列進(jìn)行了裝配。測(cè)序區(qū)域跨度大約100kbp，筌定到23個(gè)開(kāi)放讀框潛在地構(gòu)成大貝菌素生物合成基因簇。各開(kāi)放讀框在SEQIDNO:11內(nèi)的定位示于表3。<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>注1:c表示基因由互補(bǔ)DNA鏈編碼；注2:有時(shí)候情況是可以鑒定到不止一個(gè)潛在的候選起始密碼子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到這種情況，并能夠鑒定替代的可能起始密碼子。我們已對(duì)具有不止一個(gè)可能的起始密碼子的那些基因標(biāo)上了'*，號(hào)。我們始終都標(biāo)出了我們認(rèn)為的起始密碼子，不過(guò)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，利用替代的起始密碼子有可能產(chǎn)生活性蛋白質(zhì)。1實(shí)施例2_產(chǎn)生^/附Af失活菌林如下進(jìn)行^/附Af的符合讀框的缺失2.1克隆與j^/mM上游側(cè)翼區(qū)域同源的DNA利用寡聚物gdmlfor(SEQIDNO:12)和gdmlrev(SEQIDNO:13)在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)中，以基因組DNA為模板，利用PfuDNA聚合酶，擴(kuò)增了吸水鏈霉菌格爾德亞種(NRRL3602)DNA中2268bp的區(qū)域。各寡聚物中的5，延伸引入了限制性位點(diǎn)，以輔助克隆擴(kuò)增的片段。所述PCR產(chǎn)物(PCRgdml)覆蓋^/mM上游的同源區(qū)域直到包括gdmA/的頭兩個(gè)氨基酸。此2268bp的片段克隆到以S附fll線性化且脫磷酸化的pUC18中，得到pUC18gdml。gdmlforTTAAGCTTGGACCGGCGCGAACTCGCGGACACCCACCTJfind工工工(SEQIDNO:12)幼a工(SEQIDNO:13)質(zhì)粒pUC18gdml經(jīng)M/el和5VmzI限制性酶消化鑒定，產(chǎn)生439bp、1687bp和2828bp的三個(gè)片段。2.2克隆與ffdmM下游側(cè)翼區(qū)域同源的DNA利用寡聚物gdm2for(SEQIDNO:14)和gdm2rev(SEQIDNO:15)在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)中，以基因組DNA為才莫板，利用PfuDNA聚合酶，擴(kuò)增了吸水鏈霉菌格爾德亞種(NRRL3602)DNA中2267bp的區(qū)域。各寡聚物中的5，延伸設(shè)計(jì)為引入限制性位點(diǎn)，以輔助克隆擴(kuò)增的片段。所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物(PCRgdm2)覆蓋的區(qū)域從^/附AT處后兩個(gè)氨基酸、終止密碼子到^/附M下游的同源區(qū)域。此2267bp的片段克隆到以S附fll線性化的pUC18中，得到質(zhì)粒pUC18gdm2。gdm2forTTTCTAGACCTTCGTAAGGCTCCCCTGCCTGGGCATGG勸al(SEQIDNO:14)丑coR工(SEQIDNO:15)質(zhì)粒pUC18gdm2經(jīng)yv&I和5"附"I限制性酶消化鑒定，產(chǎn)生440bp、1594bp和2919bp的三個(gè)片段。2.3產(chǎn)生用于實(shí)現(xiàn)g^iM的符合讀框缺失的質(zhì)粒所述產(chǎn)物PCRgdml和PCRgdm2如下一步克隆到pKC1139中。pKC1139以好/"dl11和￡coRI消化，所產(chǎn)生的骨架片段與//i'"din/A7>aI片段上的PCRgdml以及XMI/五coRI片段上的PCRgdm2在單個(gè)的三部分連接反應(yīng)中進(jìn)行連接。利用限制性酶消化來(lái)驗(yàn)證最終的質(zhì)粒pKC1139gdmlgdm2。2.4轉(zhuǎn)化吸水鏈霉菌格爾德亞種(NRRL3602)并選擇jgJwM缺失突變抹用pKC1139gdmlgdm2通過(guò)電穿孔來(lái)轉(zhuǎn)化持有質(zhì)粒pUZ8002的大腸桿菌ET12567,以產(chǎn)生大腸桿菌供體菌林用于接合(conjugation)。此菌林用于通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法利用接合作用來(lái)轉(zhuǎn)化吸水鏈霉菌格爾德亞種(NRRL3602)(Kieser等(2000)PracticalStreptomycesGenetics)。接合后體鋪板于培養(yǎng)基2中，并于28°。孵育。24小時(shí)后用50mg/L阿泊拉霉素(apramycin)和25mg/L萘啶酮酸鋪覆平板?；趐KC1139的栽體于28°C自主復(fù)制，因此轉(zhuǎn)化林預(yù)期含有自主復(fù)制型質(zhì)粒pKC1139gdmlgdm2。4-7天后，將菌落斑轉(zhuǎn)接(patch)至含阿泊拉霉素(50mg/L)和萘咬酮酸(25mg/L)的培養(yǎng)基2板中。然后平板在37。C孵育3-4天一一溫度升高使基于pKC1139的游離質(zhì)粒停止復(fù)制(其復(fù)制子在37。C不發(fā)揮功能)，因此用阿泊拉霉素進(jìn)行繼續(xù)選擇可以篩選出借助同源區(qū)域之一整合到染色體中的事件。然后將菌落斑重新轉(zhuǎn)接至含阿泊拉霉素和萘啶酮酸的培養(yǎng)基2板中，并在37。C孵育3-4天，以確保不再有大腸桿菌細(xì)胞傳代。用于繼代重組株的傳代培養(yǎng)進(jìn)一步孵育3-4天后，利用不含抗生素的培養(yǎng)基2板進(jìn)行傳代培養(yǎng)步驟。為此，刮下各菌斑材料，涂布到培養(yǎng)基2瓊脂板上，并于37。C孵育，直到良好生長(zhǎng)可見(jiàn)，這通常是在第三天。利用相同的技術(shù)進(jìn)行第二、第三和第四傳代培養(yǎng)步驟。第四傳代培養(yǎng)步驟于28。C進(jìn)行孵育，以允許孢子形成。當(dāng)若干天后孢子形成可見(jiàn)時(shí)(通常是7-10天)，利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)孢子懸液進(jìn)行分離和系列稀釋。系列稀釋液等分試樣鋪在培養(yǎng)基l板上，并于28。C進(jìn)行孵育，直至菌落可見(jiàn)。挑取單個(gè)菌落，并平行轉(zhuǎn)接至含有以及不含有阿泊拉霉素的培養(yǎng)基1板上。在無(wú)抗生素板上生長(zhǎng)、但不在阿泊拉霉素板上生長(zhǎng)的菌斑重新轉(zhuǎn)接至+/-阿泊拉霉素板上，以驗(yàn)證抗生素標(biāo)記的丟失。突變菌林編碼失活的GdmM蛋白，其中543個(gè)氨基酸以符合讀框方式缺失。grf附AT缺失突變抹轉(zhuǎn)接在培養(yǎng)基l中，并于28。C培養(yǎng)四天。來(lái)自各菌斑的6mm圓柱狀物分別用來(lái)接種單個(gè)50mLfalcon管，各管含有10mL種子培養(yǎng)基(每升葡萄糖40g,甜菜糖蜜10g，酵母提取物2.5g，蛋白胨2.5g，胰蛋白胨2.5g，燕麥片5g)。這些種子培養(yǎng)物于28。C以300rpm、1英寸的偏心距(throw)孵育36-72小時(shí)。這些隨之用于接種(0.5mL接種至10mL)生產(chǎn)培養(yǎng)基(與種子培養(yǎng)勤目同)，并于28。C培養(yǎng)6天。提取次生代謝物，并如"通用方法"所述通過(guò)LCMS分析格爾德霉素類似物的生產(chǎn)。一個(gè)突變抹命名為吸水鏈霉菌gdmM.,其將生產(chǎn)化合物1，預(yù)期與KOS-1806不能區(qū)分(Rascher等，2005)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地設(shè)計(jì)可選的^/mAT失活策略，例如通過(guò)整合，或通過(guò)插入抗性基因而生成破壞突變抹，如Rascher(2005)所公開(kāi)的那樣。實(shí)施例3-通過(guò)向^/附Af敲除菌林吸水鏈霉菌gdmM—供給AHBA類似物而產(chǎn)生新的格爾德霉素類似物3.1利用吸水鏈霉菌gdm!Vr進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化吸水鏈霉菌gdmM-的產(chǎn)生如上文實(shí)施例2所述，將其菌斑轉(zhuǎn)接到MAM板(培養(yǎng)基1)上，并于28。C培養(yǎng)三天。利用6mm圓柱狀物分別接種單個(gè)的50mLfalcon管，各管含有10mL種子培養(yǎng)基(每升葡萄糖40g,甜菜糖蜜10g，酵母提取物2.5g，蛋白胨2.5g，胰蛋白胨2.5g，燕麥片5g)。這些種子培養(yǎng)物于28。C以300rpm、1英寸的偏心距孵育36-72小時(shí)。這些隨之用于接種(0.5mL接種至10mL)生產(chǎn)培養(yǎng)基(與種子培養(yǎng)勤目同)，并于28。C培養(yǎng)24小時(shí)。向各falcon管中添加0.1mL200mM的物料母液(溶于甲醇-見(jiàn)表4清單)，以得到2mM的終物料濃度。各管于28。C再孵育6天。3.2通過(guò)LCMS在培養(yǎng)物提取物中鑒定新的格爾德霉素類似物如"通用方法"所述產(chǎn)生實(shí)施例3.1中所述發(fā)酵的提取物，并通過(guò)LCMS進(jìn)行測(cè)定。在所有情況下，預(yù)期觀察到的主要安莎霉素類在表4中進(jìn)行了說(shuō)明。該表說(shuō)明了向菌林供給的取代的苯甲酸類似物，主要的LCMS質(zhì)量，和主要化合物的質(zhì)量。圖3和4顯示了預(yù)期生產(chǎn)的化合物的結(jié)構(gòu)。表4-通過(guò)LCMS鑒定的化合物實(shí)驗(yàn)編號(hào)供給的AHBA類似物H〇2CNH2生產(chǎn)的化合物1415質(zhì)量6A155255015026BH〇2C^^^NH216545175186C175435195206D1854351952084<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>實(shí)驗(yàn)編號(hào)供給的AHBA類似物生產(chǎn)的化合物[M+Na+質(zhì)量6SH02C^^^^NH2〇H335415175186TOH345595355366UCI〇H355755515526VOH365595355366WfTYc'〇H37575551552本申請(qǐng)述及的包括專利和專利申請(qǐng)?jiān)趦?nèi)的所有參考文獻(xiàn)在最大可能的程度上并入本文作為參考。在整個(gè)說(shuō)明書(shū)和如下權(quán)利要求書(shū)中，除非上下文另有需求，措辭"包含/包括"('comprise，及其變形如'comprises，和'comprising，)應(yīng)當(dāng)理解為，意指內(nèi)含所述的整體或者步驟或一組整體，但不排除任何其它整體或者步驟或者整體或步驟的組。87參考文獻(xiàn)Allen,I.W.和Ritchie,D.A.(1994)克隆和分析來(lái)自吸水鏈霉菌的編碼格爾德霉素生物合成的DNA序歹'J.Mol.Gen.Genet.243:593-599.Bagatell，R.和Whitesell，L.(2004)癌癥中改變的Hsp卯功能獨(dú)特的治療機(jī)會(huì).MolecularCancerTherapeutics3:1021-1030.Beliakoff，,J.和Whitesell,L.(2004)Hsp90:乳腺癌治療的新興靶標(biāo).Anti-CancerDrugs15:651-662.Bierman，M.，Logan,R.，O'Brien,K.,Seno，ET.,NagarajaRao，R.和Schoner，BE.(1992)"用于自大腸桿菌向鏈霉菌物種接合轉(zhuǎn)移DNA的質(zhì)?？寺≥d體"Gene116:43-49.Blagosklonny，M.V.(2002)Hsp-90-相關(guān)癌蛋白格爾德霉素及其類似物的多個(gè)靼點(diǎn).Leukemia16:455-462.Blagosklonny,M.V.,Toretsky，J"Bohen，S.和Neckers，L.(1996)體外或體內(nèi)翻譯的p53的突變體構(gòu)象需要功能性HSP90.Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8379-8383.Bohen，S.P.(1998)，對(duì)p23和安莎霉素抗生素在Hsp卯-依賴性信號(hào)傳導(dǎo)蛋白的功能中的遺傳和生物化學(xué)分析.MolCellBiol18:3330-3339.Carreras,C.W,Schirmer,A.，Zhong，Z.和SantiD.V.(2003)用于格爾德霉素-熱休克蛋白卯相互作用的過(guò)濾結(jié)合試驗(yàn).AnalyticalBiochemistry317:40-46.Cassady，，I旦，Chan,Floss，H.G，和LeistnerE.(2004)maytansinoid抗肺瘤劑的近期發(fā)展.Chem.Pharm.Bull,52(1)1-26.Chiosis，G.,Huezo，H.，Rosen,N.，Mimnaugh,E.，Whitesell,J.和Neckers，L.(2003)17AAG:低靶結(jié)合親和性和有力的細(xì)胞活性-發(fā)現(xiàn)一個(gè)解釋.MolecularCancerTherapeutics2:123-129.Chiosis,G.,Vilenchik，M"Kim,丄和Solit，D.(2004)，Hsp卯易受攻擊的分子4半4呂.DrugDiscoveryToday9:881-888.Csermdy，P.和Soti,C.(2003)，抑制Hsp卯是一種抑制蛋白激酶的特殊途徑.Cell.Mol.Biol丄ett.8:514-515.l)eBoer，C和Dietz，A.(1976)，吸水鏈霉菌格爾德變種的描述和抗生素生產(chǎn).丄Antibiot.29:1182-1188.I)eBoer，C.,Meulman，P.A.，Wnuk，R丄,和Peterson,D.H.(1970)格爾德霉素，一種新抗生素.丄Antibiot.23:442-447.l)englerW.A.,SchulteJ.，BergerD.P.,MertelsmannR.和FiebigHH.(1995)開(kāi)發(fā)碘化丙錠熒光試驗(yàn)用于增殖和細(xì)胞毒性測(cè)定.」wri-OmcwZ)rMgs，6:522-532.l)ikalov,s.，Landmesser，U.，Harrison，DG.，2002，格爾德審素導(dǎo)致通過(guò)酵促和非酶促氧化還原循環(huán)形成超氧化物，TheJournalofBiologicalChemistry,277(28)，pp25480-25485Donz6O.和Picard，D.(1999)Hsp卯結(jié)合和調(diào)節(jié)真核翻譯起始因子激酶Gcn2的配體誘導(dǎo)型a亞基.MolCellBiol19:8422-8432.Eg()rinMJ，LagattutaTF，HamburgerDR，CoveyJM,WhiteKD，MusserSM,EisemanJL.(2002)"17-(二甲基tt乙基氨基)-17-脫甲氧基格爾德霉素(NSC707545)在CD2F1小鼠和Fischer344大鼠中的藥代動(dòng)力學(xué)、組織分布和代謝."CancerChemotherPharmacol,49(1)，pp7-19.Eustace,B.K.,Sakurai，T.，Stewart,丄K.等(2004)功能性蛋白組學(xué)篩選揭示hsp90a在癌細(xì)胞侵襲中的重要細(xì)胞外作用.NatureCellBiology6:507-514.Fang，Y.,Fliss，A.E.，Rao，丄和CaplanA丄(1998)5^4/編石馬與脊推動(dòng)物p23蛋白同源的酵母Hsp90共分子伴侶.MolCellBiol18:3727-3734.FiebigH.H.，DenglerW.A.和RothT.人肺瘤異種移才直物新抗癌劑的預(yù)見(jiàn)、表征和發(fā)現(xiàn).In:FiebigHH,BurgerAM(eds).RelevanceofT證orModelsforAnticancerDrugDevelopment.Owco/.1999，54:29-50.Gregory,M.A.，TillR，和SmithM.C.M.(2003)鏈霉菌嗟菌體0>BT1的整合位點(diǎn)和定點(diǎn)整合載體的開(kāi)發(fā)./owr""/o/Jfl"enW^y185:5320-5323.(;()etz，M.P.，Toft,D.().,Ames,M.M.和Ehrlich，C.(2003)Hsp卯分子伴倡復(fù)合物是癌癥治療的新革巴點(diǎn).AnnalsofOncology14:1169-1176.Harris,S,F.，ShiauA.K.和AgardD.A.(2004)/i伊G，大腸桿菌Hsp卯，的羧基端二聚化結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)揭示潛在的底物結(jié)合位點(diǎn).Structure12:901087-1097.Hong，Y.-S.，Lee，D.，Kim，W.，Jeong，J.-K.等(2004)失活氨基甲?；D(zhuǎn)移酶可以改進(jìn)抗腫瘤劑格爾德霉素生物合成中后聚酮合酶的修飾步驟.J.Am.Chem,Soc.126:11142-11143.H()stein，I.，Robertson,D.,DiStefano,F.，Workman,P.和Clarke,P,A.(2001)通過(guò)Hsp90抑制劑17-埽丙基氨基-17-脫甲氧基格爾德霉素抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞凋亡.CancerResearch61:4003-4009.Hu，Z.，Liu，Y.,Tian，Z,Q.，Ma，W"Starks，C.M,等(2004)分離和表征新的格爾德霉素類似物.丄Andbiot.57:421-428.Hur，E.，Kim,H.-H.，Choi，S.M.等(2002)通過(guò)利用90kDa熱休克蛋白抑制劑radicicol阻抑低氧誘導(dǎo)型因子la/芳基烴受體核易位物的DNA結(jié)合來(lái)減少低氧誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄.MolecularPharmacology62:975-982.lwaiY，Nakagawa,A.,Sadakane，N.，Omura,S.，Oiwa，H.，Matsumoto，S,，Takahashi,M.，Ikai，T.，Ochiai，Y.(1980)除草霉素B，一種具有抗TMV活性和除草劑活性的新苯琨型安莎霉素.TheJournalofAntibiotics,33(10).ppiii4-ni9.,Jez，雄.，Chen,J.C.國(guó)H.，Rastelli,G.，St削d，R.M.和Santi，D.V.(2003)17-DMAG與人Hsp90的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)和分子模建.ChemistryandBiology10:361-368.Kaur，G.，Belotti，1)，Burger,A.M.,Fisher-Nielson，K.，Borsotti，P.等(2004)17-(二曱基氨基乙基氨基)-17-脫甲氧基格爾德霉素的抗血管生成性質(zhì)口月良的可生物利用熱休克蛋白90調(diào)節(jié)劑.ClinicalCancerResearch10:4813-4821.Kieser，T.,Bibb,M丄，Buttner，M.J"Chater，K.F"和Hopwood，D.A.(2000)實(shí)踐鏈霉菌遺傳學(xué)(PracticalStreptomycesGenetics),JohnlimesFoundation,NorwichKumar,R.，Musiyenko，A.和BarikS.(2003)Plasmodiumfalciparum的熱休克蛋白卯和其抑制劑格爾德霉素的抗瘧疾活性.JMalar2:30.Kurebayashi,J.，Otsuke，T.，Kurosumi,M.，Soga，S.，Akinaga，S.和Sonoo，H.(2001)radicicol衍生物，KF58333，抑制人乳腺癌異種移植物的低氧誘導(dǎo)型因子la和內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)、血管發(fā)生和生長(zhǎng).Jpn.丄CancerRes.92:1342-1351.LcBrazidec，丄-Y.，Kamal,A"Busch,D.，Thao,L.，Zhang,L.等(2003)—類作為hsp90的有效抑制劑的新格爾德霉素衍生物的合成和生物學(xué)評(píng)價(jià)，丄Med.Chem.47:3865-3873.LeeMH，PascopellaL，JacobsWRJr，HatfullGF.(1991)，分斗支桿菌嗟菌體L5的定點(diǎn)整合用于恥垢分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌和卡介苗的整合載體./W淘/顛""'(7SA;88:3111-5.Lee，Y.-S.，Marcu，M.G.和Neckers，L.(2004)量子化學(xué)計(jì)算和突變分析提示熱休克蛋白卯催化-格爾德霉素的順?lè)串悩?gòu)化.Chem.Biol.11:991-998，Liu，X,I).，Mor謹(jǐn)，K.A.和ThieleD丄(1999);酵母Hspl10家族成員，Ssel，是Hsp卯的共分子伴倡.JBiolChem274:26654-26660.Mandler,R.，Wu，C.，SausviHe，E.A.，Roettinger,A.J"Newman,D丄，Ho,D.K.,King,R.，Yang,D.，Lippman，M.E.，Landolfi,N.F.，Dadachova，E.，Brechbiel，M.W.和Waldman，T.A.(2000)格爾德霉素和抗HER2單克隆抗體的免疫綴合物對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系的抗增殖活性.JournaloftheNationalCancerInstitute92:1573-1581.Matsushima，P.，M.C.Broughton等(1994).粘粒DNA自大腸桿菌向刺糖多孢菌的接合轉(zhuǎn)移染色體插入對(duì)大環(huán)內(nèi)酯A83543生產(chǎn)的影響.Gene146(1):39-45.Matsuura，M.，Noguchi,T.，Yamaguchi，D.,Aida,T.，Asayama，M.,Takahashi，H.和Shirai，M.(1996).Sre基因(ORF469)編碼負(fù)責(zé)R4噬菌體基因組整合的位點(diǎn)特異性重組酶./Bfl".178(ll):3374-3376.McLaughlinS.H.，Smith,H.W.和JacksonS.E.(2002)客戶蛋白對(duì)人hsp90的弱ATPase活性的刺激.J.Mol.Biol.315:787-798.McCammon，M.T.和L.W.Parks(1981).S-腺苷高半胱氨酸類俗物對(duì)類固醇轉(zhuǎn)甲基4匕作用的抑制.JBacteriol145(1):106-12.MuroiM，IzawaM，KosaiY，AsaiM.(1981)"大貝菌素I和II的結(jié)構(gòu)"Tetrahedron,37,ppl123-1130.Muroi，M.，IzawaM.，Kosai，Y.，和Asai，M.(1980)大貝菌素I和II，新的抗腫瘤抗生素.II.分離和表征.JAntibiotics33:205-212.Neckers,L(2003)開(kāi)發(fā)小分子Hsp卯抑制劑利用正向和反向化學(xué)基因組93學(xué)用于藥物鑒定.CurrentMedicinalChemistry9:733-739.Neckers,L.(2002)Hsp卯抑制劑作為新的癌癥化療劑.TrendsinMolecularMedicine8:S55-S61.Nimmanapalli，R.，O，Bryan，E.，Kuhn，D.，Yamaguchi，H.，Wang,H.-G.和Bhalla，K.N.(2003)對(duì)17-AAG-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)位于17-AAG-介導(dǎo)的Akt，Raf-l，和Src激酶下調(diào)之下游的Bcl-2，Bcl-x"和Bax的作用.Neoplasia102:269-275.Omura，S.，Iwai，Y.，Takahashi,Y.，Sadakane，N.,Nakagawa，A.，Oiwa，H.，Hasegawa，Y.,Ikai，T.，(1979)，除草霉素，由鏈霉菌產(chǎn)生的一種新的抗生素，TheJournalofAntibiotics,32(4)，pp255-261.Omura，S.，Miyano，K.，Nakagawa，A.，Sano，H.,Komiyama，K.,Umezawa，1"Shibata,K，Satsumabayashi,S.，(1984)，"除草霉素A的化學(xué)修飾和抗腫瘤活性，8，9-環(huán)氧化物，7，9-氨基甲酸酯，和17或19-氨基衍生物".TheJournalofAntibiotics,37(10)，ppl264-1267.()no，Y.,Kozai，Y.和Ootsu,K.(1982)新分離的苯型安莎霉素大貝菌素I的抗肺瘤和殺細(xì)胞活性，Gann.73:938-44.Patel，K.，M.Piagentini，Rascher,A.，Tian，Z.Q.，Buchanan,G.O.，Regentin，R.,Hu，Z"Hutchinson,C.R.和McDaniel，R.(2004).'，用于hsp卯抑制的4^爾德霉素類似物的工程化生物合成."ChemBiol11(12):1625-33.Pfeifer，B.A.和C.Khosla(2001)."在異源宿主中生物合成聚酮化合物"MicrobiologyandMolecularBiologyReviews65(1》106-118.Rascher，A.，Hu，Z.，Viswanathan，N.，Schirmer，A.等(2003)克隆和表征用于吸水鏈霉菌NRRL3602中格爾德霉素產(chǎn)生的基因簇.FEMSMicrobiologyLetters218:223-230.Rascher,A.，Z.Hu,Buchanan,G.O.,Reid，R.和Hutchinson,C.R.(2005).通過(guò)基因測(cè)序和破壞獲得的對(duì)苯琨型安莎霉素格爾德霉素和除草霉素生物合成的i人識(shí).ApplEnvironMicrobiol71(8):4862-71.Rawlings，B.丄(2001)."細(xì)菌中I型聚酮化合物的生物合成(部分B)."NaturalProductR印orts18(3):231-281.RothT,BurgerA.M.,DenglerW.，WillmannH.和FiebigH.H.表現(xiàn)出患者胂瘤特征的人腫瘤細(xì)胞系是用于抗癌藥物篩選的有用模型.In:FiebigHH，BurgerAM(eds).腫瘤才莫型對(duì)于抗癌藥物開(kāi)發(fā)的適用性.1999，54:145-156,Rowlands,M.G.，Newbatt，Y.M.,Prodromou,C.，Pearl,LH.，Workman,P.和Aherne，W.(2004)用于尋找熱休克蛋白90ATPase活性的抑制劑的高通量篩選試驗(yàn).AnalyticalBiochemistry327:176-183Schulte,T.W.，Akinaga,S.，Murakata,T.，Agatsuma，T.等(1999)radicicol與分子伴侶熱休克蛋白90家族成員的相互作用.MolecularEndocrinology13:1435-1488.Shibata,K.,Satsumabayashi，S.，Nakagawa，A"Omura，S.(1986a)除草霉素C的結(jié)構(gòu)和殺細(xì)胞活性.TheJournalofAntibiotics,39(11)，ppl630-1633.Shibata,K.，Satsumabayashi，S.，Sano，H.，Komiyama,K.，Nakagawa,A.，()mura，S.(1986b)對(duì)除草霉素A的化學(xué)修飾除草霉素A的卣化的和其它相關(guān)的f廳生物的合成和體內(nèi)抗腫瘤活性.TheJournalofAntibiotics,39(3)，pp415-423.Shirling,E.B.和Gottlieb,D.(1966)國(guó)際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志(InternationalJournalofSystematicBacteriology)16:313-340Smith-Jones,P.M.,Solit，D.B.，Akhurst，T.，Afroze，F(xiàn).，Rosen,N.和Larson,S.M.(2004)成^f象分析響應(yīng)于Hsp90抑制劑的HER2降解的藥代動(dòng)力學(xué).NatureBiotechnology22:701-706.Smovkina,T.，Mazodier,P.，Boccard，F(xiàn).，Thompson,C.J.和Guerineau，M.(19卯)構(gòu)建一系列用于i文線菌的基于pSAM2的整合載體.Gewe94:53-59.Spiteller，P"Bai，L"Shang，G"Carroll,B.J"Yu，T,W.和Floss,H.G.(2003).在珍貴束絲放線菌生物合成抗腫瘤劑ansamitocin的過(guò)程中后聚酮合酶修飾步驟.JAmChemSoc125(47):14236-7SreedharA.S.,Nardai,G.和Csermely,P.(2004)增強(qiáng)補(bǔ)體誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解Hsp卯抑制劑的抗癌作用的新才凡制.Immunologyletters92:157-161.Srcedhar,A.S.，S6ti,C.和Csermely,P.(2004a)Hsp90的抑制:抑制蛋白激酶的一種新策略，BiochimicaBiophysicaActa1697:233-242.Staunton,J.和K.丄Weissman(2001)."聚酮生物合成千年回顧."96NaturalProductReports18(4):380-416.Stead,P.，Latif，S.，Blackaby，A.P.等(2000)在基于細(xì)胞的制癌蛋白M信號(hào)傳導(dǎo)試驗(yàn)中開(kāi)發(fā)具有有利的抑制活性的新安莎霉素JAntibiotics53:657-663.Supko,丄G.，Hickman,R丄.，Grever，M.R.和Malspeis，L(1995)格爾德霉素作為抗胂瘤劑的臨床前藥理學(xué)評(píng)價(jià).CancerChemother.Pharmacol.36:305-315.Takahashi，A.,Casais，C.，IchimuraK.和Shirasu，K.(2003)擬南芥屬才直物中HSP卯與RAR1和SGTl相互作用且是RPS2-介導(dǎo)的疾病抗性所必需的.Proc.Natl.Acad.Sci.USA20:11777-11782.Tanida，S.，Hasegawa，T.和HigashideE.(1980)大貝菌素I和II，新的抗肝瘤抗生素，1.生產(chǎn)生物、發(fā)酵和抗孩l生物活性.JAntibiotics33:199-204.Tian，Z.-Q.，Liu，Y"Zhang，D.,Wang,Z.等(2004)新17-氨基格爾德霉素衍生物的合成和生物學(xué)活性.BioorganicandMedicinalChemistry12:5317-5329.Uehara，Y.(2003)Hsp90抑制劑的天然產(chǎn)物源.CurrentCancerDrugTargets3:325-330.VanMellaert,L.，Mei,L，Lammertyn，E.，Schacht,S.，和Ann6，J.(1998)噬菌體VWB基因組在委內(nèi)瑞拉鏈霉菌中的位點(diǎn)特異性整合和基于VWB的整合栽體的構(gòu)建.MZcrW^/ogy144:3351-3358.Vasilevskaya，I.A.，Rakitina，T.V.和O，Dwyer，P.J.(2003)格爾德霉素及其17-烯丙基氨基-17-脫甲氧基類似物拮抗順鉑在人結(jié)腸腺癌細(xì)胞中的作用差異caspase激活是相互作用的基J出.CancerResearch63:3241-3246.Watanabe，K.，Okuda,T.，Yokose,K.，F(xiàn)urumai，T.和Mamyama，H.H.(1982)奇異束絲i文線菌，nocardicin抗生素的新生產(chǎn)者.丄Antibiot.3:321-324.Weber，丄M.，Losick，R.(1988)使用染色體整合載體對(duì)紅色糖多孢菌中的紅霉素抗性和生產(chǎn)基因作圖G^we68(2)，173-180Wegek，H.，Miiller，L.和Buchner，丄(2004)Hsp70和Hsp卯-蛋白質(zhì)折疊的接力隊(duì).RevPhysiolBioehemPharmacol151:1-44.Wenzd，S.C.，Gross,F，Zhang,Y.，F(xiàn)u，J"Stewart,A.F.和Miiller，R(2005)通過(guò)Red/ET重組在假單胞菌中異源表達(dá)粘細(xì)菌天然產(chǎn)物裝配線.Chemistry&Biology12:249-356.Whitesell，L.，Mimnaugh，E.G.,DeCosta,B.，Myers,C.E.和Neckers，L.M.(1994)通過(guò)苯琨安莎霉素抑制熱休克蛋白HSP卯-pp6(T『雜種蛋白復(fù)合物形成應(yīng)激蛋白在致癌轉(zhuǎn)化中的重要作用.Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:8324-8328.Winklhofer,K.F"Heller,U.，Reintjes,A.和TatzeltJ.(2003)抑制復(fù)雜糖基化可以增加PrP"形成.Traffic4:313-322.WorkmanP.(2003)稽核Hsp90分子伴侶抑制劑的藥理學(xué)帳簿拆解藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)之間的關(guān)系.MolecularCancerTherapeutics2:131-138.Workman,P.和Kaye，S.B.(2002)基礎(chǔ)癌研究向新癌癥療法的轉(zhuǎn)化.TrendsinMolecularMedicine8:S1-S9.Young,丄C.;Moarefi,I.和Hartl，U.(2001)Hsp90:—種?；匦璧牡鞍?斤疊工具.丄Cell.Biol.154:267-273.權(quán)利要求1.式(I)的化合物或其可藥用鹽其中R1代表H、OH、OMe；R2代表H或Me；R3代表H或CONH2；R4和R5或者均代表H，或者它們一起代表鍵(即C4至C5之間為雙鍵)；R6代表H、F、OH、OMe、Br、Cl、CF3、CH3、SH、CH2CH3或NR10aR11a；R7代表H、F、OH、OMe、Br、Cl、CF3、CH3、SH、CH2CH3或NR10bR11b；R8代表H、F、OH、OMe、Br、Cl、CF3、CH3、SH、CH2CH3或NR10cR11c；R9代表H、F、OH、OMe、Br、Cl、CF3、CH3、SH、CH2CH3或NR10dR11d；R10a、R11a、R10b、R11b、R10c、R11c、R10d、R11d獨(dú)立地代表H、CH3或CH2CH3；但是，前提是(i)當(dāng)R6代表H，R7代表OH，而R8代表OH時(shí)，則R9不代表H；(ii)當(dāng)R7代表OH，R8代表H，而R9代表H時(shí)，則R6不代表H、OH或OMe；和(iii)當(dāng)R7代表OMe，R8代表H，而R9代表H時(shí)，則R6不代表OMe。2.根據(jù)權(quán)利要求l的化合物，其中(iv)當(dāng)R6代表H、OH或OMe，R代表H，而Rs代表H時(shí)，則R9不^R表OH、C1或NH2;和(v)當(dāng)R6代表H、OH或OMe，Rs代表H，而R9代表H時(shí)，則R7不代表NH2。3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的化合物，其中(vi)當(dāng)R6代表H或OH時(shí)，則R7、Rs和R9不都代表H。4.根據(jù)權(quán)利要求l的化合物，其為式(IA)的化合物或其可藥用鹽其中R,代表H、()H、OMe;R2代表H或Me;R3代表H或CONH2;R4和Rs或者均代表H，或者它們一起代表鍵(即C4至C5之間為雙鍵);R6代表H、OH、OMe或F;R;代表H或F;R8代表H或F;R9代表H。5.根據(jù)權(quán)利要求l-4中任一項(xiàng)的化合物，其中R,代表H。6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的化合物，其中R，代表OH。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的化合物，其中R2代表H。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的化合物，其中R3代表CONH2。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的化合物，其中R4和Rs—起代表鍵。10.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的化合物，其中R4和Rs各自代表H。11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的化合物，其中R^、Rz和Rs不都代表H。12.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的化合物，其中R6、R7和Rs均代表H。13.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的化合物，其中當(dāng)R,代表H，議2代表H，R;5代表C()NH2，R4和Rs代表H,R6代表H，而R"、表H時(shí)，則1^不代表H。14.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的化合物，其中！^代表H,R2代表H，R3代表CONH"而R4和Rs各自代表H。15.根據(jù)權(quán)利要求l-4中任一項(xiàng)的化合物，其中R，代表OH,&代表H，R3代表CONH2，而R4和Rs各自代表H。16.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的化合物，其中R6代表H或F。17.根據(jù)權(quán)利要求1-10和16中任一項(xiàng)的化合物，其中R;代表H或F。18.根據(jù)權(quán)利要求1-10和16中任一項(xiàng)的化合物，其中R7代表OH。19.根據(jù)權(quán)利要求1-10和16-18中任一項(xiàng)的化合物，其中Rs代表H或F。20.根據(jù)權(quán)利要求1-10和16-19中任一項(xiàng)的化合物，其中R9代表H。21.根據(jù)權(quán)利要求1-10和16-20中任一項(xiàng)的化合物，其中R,oa、Rna、Riob、Riib、Rioc、'Ruc、Riod、R"d代表H。22.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的化合物，其中R，代表H，R2代表H，R3代表CONH2，R4和Rs各自代表H，而Re代表OH。23.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其中R代表H，R2代表H，議3代表C()NH2，R4、R5、R^、R7和Rs各自代表H。24.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其中R,代表H，R2代表H，&代表C()NH2，R4和Rs各自代表H，R6代表OH，而R7和Rs各自代表H。25.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其中R,代表H,R2代表H，！^代表C()NH2，R4和Rs各自代表H，R6代表F,而R7和Rs各自代表H。26.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其中R，代表OH，R2代表H，R3代表CONH2，R4和Rs各自代表H,R6代表F,而R7和Rs各自代表H。27.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其中R代表H，R2代表H，R3代表CONH2，R4和Rs各自代表H,R6代表H，R7代表F，而Rs代表H。28.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其中R,代表H,&代表H，R;代表C()NH2，R4和Rs各自代表H，R6代表OH，R7代表F,而Rs代表H。29.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其中R，代表OH，R2代表H，&代表CONH2，R4和Rs各自代表H,R6代表H，R/代表F，而Rs代表H。30.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其中R,代表H，R2代表H，&代表C()NH2，R4和Rs各自代表H，R6和R7各自代表F，而Rs代表H。31.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其中R,代表OH，R2代表H，&代表C()NH2，R4和Rs各自代表H，R6和R7各自代表F,而Rs代表H。32.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其中R,代表H，R2代表H，議3代表C()NH2，R4和Rs各自代表H,R6、R7和Rs各自代表F。33.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其為如下化合物或其可藥用鹽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>34.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其選自如下的化合物和其任一個(gè)的可藥用鹽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>35.<image>imageseeoriginaldocumentpage12</image>36.<image>imageseeoriginaldocumentpage12</image>37.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，選自如圖4所示的化合物28、29、30、31、32、36和37及其任一個(gè)的可藥用鹽。38.制備安莎霉素類似物的方法，所述方法包括a)提供在合適條件下培養(yǎng)時(shí)生產(chǎn)安莎霉素或其類似物的菌林；b)向所述菌林供給并非AHBA的起始單位，以便所述起始單位摻入到所述安莎霉素類似物中；c)在適宜條件下培養(yǎng)所述菌林，進(jìn)行安莎霉素類似物的生產(chǎn)；和d)任選地分離所產(chǎn)生的化合物。39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中步驟(b)中供給的起始單位不是3-氨基苯甲酸。40.根據(jù)權(quán)利要求38或39的方法，其中步驟(b)中供給的起始單位不是3，5-二氨基苯甲酸、3-氨基-4-羥基苯曱酸或3-氨基-4-氯苯甲酸。41.根據(jù)權(quán)利要求38至權(quán)利要求40中任一項(xiàng)的方法，其中a)中菌抹的特征在于一個(gè)或多個(gè)AHBA生物合成基因已被缺失或失活。42.根據(jù)權(quán)利要求38至權(quán)利要求40中任一項(xiàng)的方法，其中突變a)中的菌4朱以降〗氐A(chǔ)HBA生物合成效率。43.根據(jù)權(quán)利要求38-40或權(quán)利要求42中任一項(xiàng)的方法，其中步驟c)的條件使AHBA生物合成效率為亞最佳水平。44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中菌林以仍然允許摻入供給的非天然起始單位的水平生產(chǎn)AHBA。45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中摻入的供給的非天然起始單位的量大于起始單位總摻入量的20%,優(yōu)選大于50%。46.根據(jù)權(quán)利要求38-45中任一項(xiàng)的方法，其中起始單位選自如下化合物或其酸部分進(jìn)行衍生化的類似物其中R6、R7、Rs和R9如^又利要求1-37中任一項(xiàng)所定義。47.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中R6、R7、Rs和R9不都代表H。48.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中R。R7、Rs和R9均代表H。49.根據(jù)權(quán)利要求38-48中任一項(xiàng)的方法，其中菌抹為安莎霉素生產(chǎn)菌抹，且選擇起始單位，從而菌林生產(chǎn)18，21-二脫氧-安莎霉素類似物。50.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中選擇起始單位，從而菌林生產(chǎn)任選被氟取代的18,21-二脫氧-安莎霉素類似物。51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中選擇起始單位，從而菌林生產(chǎn)被氟取代的18，21-二脫氧-安莎霉素類似物。52.根據(jù)權(quán)利要求49-51中任一項(xiàng)的方法，其中菌林為安莎霉素生產(chǎn)菌株，且選擇起始單位，從而菌林生產(chǎn)苯環(huán)的18或21位不被取代的安莎霉素類似物。53.根據(jù)權(quán)利要求38-52中任一項(xiàng)的方法，所述方法(i)還包括對(duì)步驟(d)的產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)修飾或生物轉(zhuǎn)化的步驟，任選地之后分離所得化合物的步驟；或者(ii)還包括在步驟(d)之前對(duì)步驟(c)的產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)修飾或生物轉(zhuǎn)化的步驟。54.產(chǎn)生安莎霉素類似物的方法，所述方法包括a)提供在合適條件下培養(yǎng)時(shí)生產(chǎn)安莎霉素或其類似物的第一宿主菌林，其中任選地已缺失或失活一個(gè)或多個(gè)后PKS基因，和/或已缺失或失活一個(gè)或多個(gè)起始單位生物合成基因；b)向所述菌林供給非天然起始單位；c)在適宜條件下培養(yǎng)所述經(jīng)修飾的宿主菌林，進(jìn)行安莎霉素類似物的生產(chǎn)；和d)任選地分離所產(chǎn)生的化合物。55.根據(jù)權(quán)利要求54的方法，其中起始單位不是3，5-二氨基苯曱酸、3-氨基-4-羥基苯甲酸或3-氨基-4-氯苯曱酸。56.根據(jù)權(quán)利要求54或權(quán)利要求55的方法，其中起始單位不是3-氨基苯曱酸。57.根據(jù)權(quán)利要求38-56中任一項(xiàng)的方法，其中供給的起始單位為起始酸。58.可通過(guò)權(quán)利要求38-57中任一項(xiàng)的方法獲得的安莎霉素類似物。59，藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1-37和58中任一項(xiàng)的安莎霉素類似物或其可藥用鹽，和一種或多種可藥用稀釋劑或載體。60.根據(jù)權(quán)利要求1-37和58中任一項(xiàng)的安莎霉素類似物或其可藥用鹽，用作為藥物。61.根據(jù)權(quán)利要求1-37和58中任一項(xiàng)的安莎霉素類似物或其可藥用鹽在制備用于治療癌癥、B細(xì)胞惡性病、瘧疾、真菌感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及神經(jīng)變性疾病、有賴于血管生成的疾病、自身免疫疾病和/或用于預(yù)防性預(yù)處理癌癥的藥物中的用途。62.根據(jù)權(quán)利要求1-37和58中任一項(xiàng)的安莎霉素類似物或其可藥用鹽用作為藥物的用途，所述藥物用于治療癌癥、B細(xì)胞惡性病、瘧疾、真菌感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及神經(jīng)變性疾病、有賴于血管生成的疾病、自身免疫疾病和/或用于預(yù)防性預(yù)處理癌癥。63.治療癌癥、B細(xì)胞惡性病、瘧疾、真菌感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及神經(jīng)變性疾病、有賴于血管生成的疾病、自身免疫疾病或預(yù)防性預(yù)處理癌癥的方法，所述方法包括向需要的患者施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-37和58中任一項(xiàng)的安莎霉素類似物或其可藥用鹽。64.根據(jù)權(quán)利要求1-63中任一項(xiàng)的安莎霉素類似物或其可藥用鹽、組合物、用途或方法，其中與其他治療組合施用安莎霉素類似物或其可藥用鹽。65.根據(jù)權(quán)利要求64的安莎霉素類似物或其可藥用鹽、組合物、用途或方法，其中其他治療從如下組成的組中選擇博來(lái)霉素、卡培他濱、順鉑、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、阿霉素、5-氟尿嘧啶、吉西他濱、亞葉酸、甲氨蝶呤、米托蒽醌、包括紫杉醇和多西他賽的紫杉烷類、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春瑞濱；激素療法，阿那曲唑、戈舍瑞林、醋酸曱地孕酮、prenisone、他莫昔芬和托瑞米芬；單克隆抗體療法，如曲妥珠單抗(抗Her2)、西妥昔單抗(抗EGFR)和貝伐珠單抗(抗VEGF);以及蛋白激酶抑制劑，如伊馬替尼、達(dá)沙替尼、吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼、坦羅莫司；蛋白酶體抑制劑，如硼替佐米；組蛋白脫乙?；?HDAC)抑制劑，如伏林司他；血管生成抑制劑，如舒尼替尼、索拉非尼、來(lái)那度胺；放療和手術(shù)。66.生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1-37和58中任一項(xiàng)的18，21-二脫氧-安莎霉素類似物或其可藥用鹽的方法，所述方法包括a)提供在合適條件下培養(yǎng)時(shí)生產(chǎn)安莎霉素或其類似物的第一宿主菌株，b)向所述菌林供給非天然起始單位；c)在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主菌林，進(jìn)行18，21-二脫氧-安莎霉素類似物的生產(chǎn)；和d)任選地分離所產(chǎn)生的化合物。67.根據(jù)權(quán)利要求66的生產(chǎn)18，21-二脫氧-安莎霉素類似物或其可藥用鹽的方法，所述方法包括a)提供在合適條件下培養(yǎng)時(shí)生產(chǎn)格爾德霉素或其類似物的第一宿主菌抹，b)向所述菌林供給非天然起始單位；c)在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主菌林，進(jìn)行18，21-二脫氧-安莎霉素類似物的生產(chǎn)；和d)任選地分離所產(chǎn)生的化合物。68.根據(jù)權(quán)利要求66或67的方法，其中所述方法另外包括步驟c)缺失或失活一個(gè)或多個(gè)起始單位生物合成基因或其同源物，所述步驟通常在步驟c)之前進(jìn)^f亍。69.根據(jù)權(quán)利要求66-68中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法另外包括步驟f)缺失或失活一個(gè)或多個(gè)后PKS基因，所述步驟通常在步驟c)之前進(jìn)行。70.根據(jù)權(quán)利要求66-69中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)的非天然起始單位為3-氨基苯甲酸。71.根據(jù)權(quán)利要求66-69中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)的非天然起始單位為5-氨基-2-氟苯甲酸。72.根據(jù)權(quán)利要求66-69中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)的非天然起始單位為5-氨基-3-氟苯甲酸。73.根據(jù)權(quán)利要求66-69中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)的非天然起始單位為5-氨基-2，3-二氟苯甲酸。74.根據(jù)權(quán)利要求66-69中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)的非天然起始單位為5-氨基-2，3，6-三氟苯甲酸。75.根據(jù)權(quán)利要求66-74中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)的菌抹為安莎霉素生產(chǎn)菌林。76.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，其中步驟(a)的菌林為格爾德霉素生產(chǎn)菌林。77.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，其中步驟(a)的菌林為除草霉素生產(chǎn)菌林。78.根據(jù)權(quán)利要求66-77中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)的菌林為基于安莎霉素生產(chǎn)菌林的工程菌林，其中一個(gè)或多個(gè)起始單位生物合成基因已被缺失或失活。79.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其中步驟(a)的菌林為基于格爾德霉素生產(chǎn)菌林的工程菌林，其中一個(gè)或多個(gè)起始單位生物合成基因已被缺失或失活。80.根據(jù)權(quán)利要求66-79中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)的菌株為基于安莎霉素生產(chǎn)菌林的工程菌林，其中一個(gè)或多個(gè)后PKS基因已被缺失或失活。81.根據(jù)權(quán)利要求80的方法，其中步驟(a)的菌林為基于格爾德霉素生產(chǎn)菌株的工程菌林，其中一個(gè)或多個(gè)后PKS基因已被缺失或失活。82.根據(jù)權(quán)利要求80的方法，其中步驟(a)的菌林為基于除草霉素生產(chǎn)菌林的工程菌林，其中一個(gè)或多個(gè)后PKS基因已被缺失或失活。83.根據(jù)權(quán)利要求66-82中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)的菌林為基于安莎霉素生產(chǎn)菌林的工程菌林，其中^/附M同源物和任選地其他后PKS基因已被缺失或失活。84.根據(jù)權(quán)利要求83的方法，其中步驟(a)的菌林為基于格爾德霉素生產(chǎn)菌林的工程菌林，其中^/wM和任選地其他后PKS基因已被缺失或失活。85.根據(jù)權(quán)利要求83的方法，其中步驟(a)的菌株為基于除草霉素生產(chǎn)菌抹的工程菌林，其中^/附Af同源物和任選地其他后PKS基因已被缺失或失活。86.根據(jù)權(quán)利要求83的方法，其中步驟(a)的菌林為基于安莎霉素生產(chǎn)菌林的工程菌林，其中^/附M同源物已被缺失或失活。87.根據(jù)權(quán)利要求86的方法，其中步驟(a)的菌抹為基于格爾德霉素生產(chǎn)菌林的工程菌林，其中^/附Af已被缺失或失活。88.根據(jù)權(quán)利要求86的方法，其中步驟(a)的菌林為基于除草霉素生產(chǎn)菌才朱的工程菌4朱，其中^/附M同源物已被缺失或失活。89.基于安莎霉素生產(chǎn)菌林的工程菌抹，其中^/附Af或其同源物和一個(gè)或多個(gè)起始單位生物合成基因以及任選地其他后PKS基因已被缺失或失活。90.b根據(jù)權(quán)利要求89的菌林，其中吸水鏈霉菌AM3602之a(chǎn)hba-B簇中的所有基因或其他菌林中的同源物已被缺失或失活。91.根據(jù)權(quán)利要求89或權(quán)利要求90的菌抹，其為格爾德霉素生產(chǎn)菌株。92.根據(jù)權(quán)利要求89或權(quán)利要求90的菌林，其為除草霉素生產(chǎn)菌抹。93.根據(jù)權(quán)利要求91的菌抹，其中^/附0缺失或失活。94.根據(jù)權(quán)利要求92的菌林，其中M附O缺失或失活。95.根據(jù)權(quán)利要求89-94中任一項(xiàng)的工程菌林，其中安莎霉素生產(chǎn)菌株為鏈霉菌。96.根據(jù)權(quán)利要求95的工程菌林，其中菌林為格爾德霉素生產(chǎn)菌林吸7JC鏈霉菌格爾德亞種NRRL3602或鏈霉菌屬菌種DSM4137或紫黑鏈霉菌DSM40699。97.根據(jù)權(quán)利要求89-96中任一項(xiàng)的工程菌林在制備安莎霉素類似物或其可藥用鹽中的用途。98.根據(jù)權(quán)利要求97的工程菌株用途，其中安莎霉素類似物是18,21-二脫氧安莎霉素類似物。99.根據(jù)權(quán)利要求98的用途，其中18,21-二脫氧安莎霉素類似物由權(quán)利要求1-37中4壬一項(xiàng)所定義。全文摘要本發(fā)明涉及安莎霉素類似物，其可用于例如癌癥、B細(xì)胞惡性病、瘧疾、真菌感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及神經(jīng)變性疾病、有賴于血管生成的疾病、自身免疫疾病的治療或者癌癥的預(yù)防性預(yù)處理。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)這些化合物的方法以及它們的醫(yī)學(xué)用途。文檔編號(hào)C07D225/00GK101578268SQ200780041913公開(kāi)日2009年11月11日申請(qǐng)日期2007年11月9日優(yōu)先權(quán)日2006年11月9日發(fā)明者C·馬丁申請(qǐng)人:百奧帝卡技術(shù)有限公司